WO2016207094A1 - Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-tweakr-antikörpern - Google Patents

Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-tweakr-antikörpern Download PDF

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Anne-Sophie Rebstock
Yolanda Cancho-Grande
Sven WITTROCK
Beatrix Stelte-Ludwig
Stephan MÄRSCH
Uwe Gritzan
Christoph Mahlert
Simone Greven
Anette Sommer
Sandra Berndt
Lisa Dietz
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    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
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    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • ADCs Antibody-drug conjugates
  • the invention relates to binder-drug conjugates (ADCs) of kinesin spindle protein inhibitors, to active metabolites of these ADCs, to methods of producing these ADCs, to the use of these ADCs for the treatment and / or prevention of diseases, and to the use of these ADCs for the manufacture of drugs for the treatment and / or prevention of diseases, in particular hyperproliferative and / or angiogenic diseases such as, for example, cancer.
  • ADCs binder-drug conjugates
  • Such treatments may be monotherapy or in combination with other medicines or other therapeutic measures.
  • Cancers are the result of uncontrolled cell growth of various tissues. In many cases, the new cells invade existing tissues (invasive growth) or they rnetastasize into distant organs. Cancers occur in various organs and often have tissue-specific disease courses. Therefore, the term cancer as a generic term describes a large group of defined diseases of various organs, tissues and cell types.
  • early stage tumors may be removed by surgical and radiotherapeutic measures.
  • metastatic tumors can only be palliatively treated by chemotherapeutic agents.
  • the goal here is to achieve the optimal combination of improving the quality of life and extending the lifetime.
  • ADCs antibody drug conjugates
  • cytotoxic agent itself or another cytotoxic metabolite formed therefrom is released within the tumor cell, where it can exert its direct and selective action
  • damage to normal tissue could be kept within significantly narrower limits compared to conventional cancer chemotherapy [See, eg, JM Lambert, Curr. Opin.
  • WO2012 / 171020 describes ADCs in which several toxophore molecules are linked to an antibody via a polymeric linker.
  • substances which may be mentioned as possible toxophores in WO2012 / 171020 are the substances SB 743921, SB 715992 (isospinesib), MK-0371, AZD8477, AZ3146 and ARRY-520.
  • Kinesin spindle protein inhibitors Kinesin spindle protein (KSP, also known as Eg5, HsEg5, KNSL1, or KIF1 1) is a kinesin-like motor protein that is essential for the function of the bipolar mitotic spindle. Inhibition of KSP leads to mitotic arrest and apoptosis for a prolonged period (Tao et al., Cancer Cell 2005, 8 (1), 39-59).
  • KSP inhibitors After finding the first cell-derived KSP inhibitor, monastrol, KSP inhibitors have become established as a class of new chemotherapeutic agents (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999) and are the subject of a number of patent applications (eg, WO2006 / 044825 WO2006 / 002236, WO2005 / 051922, WO2006 / 060737, WO03 / 060064, WO03 / 040979, and WO03 / 049527).
  • KSP inhibitors since KSP is active only in a short period of the mitotic phase, KSP inhibitors must be present in a sufficiently high concentration during this phase.
  • WO2014 / 151030 discloses ADCs with certain KSP inhibitors.
  • the invention provides conjugates of a moderately agonistically or non-agonistally active anti-TWEAKR antibody, such as the mouse-derived antibody ITEM-4, as well as chimeric or humanized variants of this antibody, with compounds of the following formula (I) wherein one or more of the compounds of the formula (I) is or are linked to the antibody via a linker L.
  • a moderately agonistically or non-agonistally active anti-TWEAKR antibody such as the mouse-derived antibody ITEM-4
  • chimeric or humanized variants of this antibody with compounds of the following formula (I) wherein one or more of the compounds of the formula (I) is or are linked to the antibody via a linker L.
  • the invention shows that with conjugals using an anti-TWEAKR antibody with reduced agonistic activity, a significantly improved tumor selectivity can be observed - J -
  • ITEM-4 is an anti-TWEAKR antibody of Nakayama et al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res. Comm., 306: 819-825). Humanized variants of this antibody based on CDR grafting are described by Zhou et al., (Ziiou et al., 2013, J. Invest Demiatol., 133 (4): 1052-62) and WO 2009/020933.
  • the antibody is preferably a humanized or ehimeric anti-TWEAKR monoclonal antibody. Particularly preferred are the humanized or chimeric ⁇ -4 variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075, and TPP-7076.
  • R 1 is H, -L- # 1, -MOD or - (CH 2 ) 0 - 3 Z, wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 'and Y 2 independently of one another are H, H 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3Z' (for example - (CH 2 ) o-3Z '), or -CH ( CH 2 W) represents Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o- 3 Z', wherein H, NH 2 , SO 3 H, COOK, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i. 3 represents COOH; where represents WH or OH,
  • Y is linear or branched, optionally substituted by ⁇ NHCONH 2 , CwAlkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z 1 , and Y J is H or -
  • R 4 represents H, -L- # 1, -SG lys - (CO) 0- i-R 4 % -CO-CHY ⁇ NHY 5 or - (CH 2 ) o-3Z,
  • SG j y S represents a grappe cleavable by a lysosome enzyme, in particular a grappe consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a CMO-alkyl, Cs-io-aryl or Ce-jo- araikyl, Cs io-Heteroalkyi, C w o -alkyl-O-Ce-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, Ce-io -Aryloxy or Ce-io-aralkoxy, CS-JO-heteroaralkoxy, Cwo-alkyl-O-Ce-io-aryloxy, Cs-io-heterocycloalkoxy group, which is one or more times with - NH 2 , -NH - alkyl, -N
  • ⁇ 'and Y 2 independently of one another represent H, H 2 , or - (CH 2 ) 0 -3Z i , and Y 3 represents H or - (CH 2 ) O- 3 Z', where Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH represents;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with -NHCONH2, C1-5 alkyl or optionally with M l. represents substituted aliyl or benzyl and Y 5 represents H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 represents linear or branched C w alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 1 '- or -CHR.
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CN H 2 ;
  • R 3 -L- # i, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyi, heterocycloalkyl group, preferably -L- # 1 or a Ci-10-alkyl-, Ce -io-aryl or Ce-io-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-Ce-iö-aryl or C5-10-heterocycloalkyl group, which with 1 -3 -OH Groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1 -3 -SH groups, 1-3-alkyl groups, 3 -3 O-CO-alkyl groups, 1 -3 -O-CO-H-alkyl groups, 3 -3 -NH-CO-alkyl groups, 1 -3 - H-
  • alkyl is preferably Ci-io alkyl
  • R 5 is H, H 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) o- 3 Z wherein Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO- ⁇ 2 , or -CO-OY 3 , wherein Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or "(CH 2 ) o- represents 3 Z ', and Y 3 represents H or - (CH 0 .. 3 Z', wherein Z 'represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -alkenyl, hydroxy, NO 2 , NH 2 , COOH or halogen (especially F, Cl, Br),
  • R 8 is (optionally fluorinated) Ci-io alkyl, (optionally fluorinated) C2 -io-alkenyl, (optionally fluorinated) Cj-io-alkynyl, (optionally fluorinated) C 4-10 Cycloalk.yl OR (CH 2 ) o... 2 - (HZ 2 ) where HZ 2 is a 4 to 7 membered heterocycle having up to two heteroatoms selected from N, O and S, each of which groups being substituted by -OH, C0 2 H or NH 2 may be substituted;
  • R 9 is Ii, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ;
  • R is J or R 4 -L- # 1 or (in the case of R 8 ), L is the linker and # 1 represents the bond to the binder or derivative thereof, where -MOD - (R 10 ) n ⁇ (Eq) o represents -G2-G3, wherein R 10 is H or Ci-C 3 alkyl;
  • G represents -NHCO- or -CONH- (wherein when G represents -NHCO-, R ! 0 is not NH 2 );
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, - SO-, SO2, -NRY-, -NRYCO-, CONRY-, -NR 'NRy-, -SO 2 N> ⁇ ' R> ' -. -CONRyNRy-, (wherein R y is H, phenyl, Ci-Ci0-AlkyL C2-Ci0-alkenyl, or C2-C1 is Q-alkynyl, each with
  • G3 is -H or -COOH, and wherein the group - MOD preferably has at least one -COOH group; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • the conjugates according to the invention may have chemically labile linkers, enzymatically labile linkers or stable linkers. Particularly preferred are stable linkers and cleavable by a protease linker.
  • the invention furthermore provides methods for the preparation of the conjugates according to the invention as well as precursors and intermediates for the preparation.
  • the preparation of the conjugates according to the invention regularly comprises the following steps:
  • the attachment of the reactive group can also take place after the formation of an optionally protected KSP inhibitor-linker precursor conjugate.
  • succinimide-linked ADCs after conjugation according to Scheme 26 can be converted into the open-chain succinic acid amides which have a favorable stability profile.
  • conjugation of the linker precursor to a low molecular weight KSP inhibitor may be accomplished by substitution of a hydrogen atom on R 1 , R 3 or R 4 in formula (I) by the linker.
  • any functional groups present may also be present in protected form. Before the conjugation step, these groups are removed by known methods of peptide chemistry.
  • the conjugation can be carried out chemically in various ways, as exemplified in Schemes 20 to 31 in the Examples. In particular, it is possible to optionally modify the low molecular weight KSP inhibitor for conjugation to the linker, for example by introducing protective groups or leaving groups for easier sorption.
  • the invention provides novel low molecular weight KSP inhibitors which bind to a moderately agonistically or non-agonistally active anti-TWEAKR antibody, such as e.g. ITEM-4 have been conjugated.
  • KSP inhibitors or their antibody conjugates have the following general formula (II):
  • Y 1 and Y 2 are independent of each other Ii, NH 2 , - ( ( . ⁇ ! (. “ ! ⁇ ⁇ )! MC!.) « ⁇ . / '(/ U.
  • R 2 represents H, -MOD, -C ()), CHCHY 4 -NHY 5 or ((CH 2 ) 0 - 3 Z,
  • R 2 and R 4 are unsubstituted (forming a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR 11 -CH 2 -,
  • Ci-4 is aikyl, CM is haloalkyl, CM is alkoxy, hydroxyl-substituted CM is alkyl, COO (Cj- 4 alkyl) or -OH;
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-Y'Y 2 , or -CO-
  • OY 3 represents,
  • Y 1 and Y are independently H, H 2 , or - (CHOo-sZ ', and Y 3 is H or - (CH VsZ' wherein Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • Y 4 is linear or branched optionally NHCONHb-substituted, CM alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 'is H or -CO-CHY ° -NH 2, wherein Y 6 is linear or branched CM alkyl;
  • R 4 is H, -L-BINDER, -SG lys - (CO) 0 .i -R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or ⁇ (CH 2 ) 0 -; Z represents,
  • SG [ys represents a group cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 'de notes a Ci-io-alkyl, Cs-io-Ar l or Ce-io aralkyl, Cs-io-heteroalkyi, Cno-Alk10-Ce-io-aryl, C5.10-Heterocycloalk.yl, heteroaryi, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci -10-alkoxy, ce- io-aryloxy or Ce-io-aralkoxy, C5-10-heteroaralkoxy, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryloxy, Cs-io-heterocycloalkoxy group having one or more times with - NH 2 , -NH-alkyl, -N (alkyl) 2 ,
  • Y ! and Y 2 independently represent H, H 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y J represents H or - i C ' ü ', wherein Z' represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH; wherein Y 4 is linear or branched, optionally substituted by - NHCONH2, C w > alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO "CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched CM represents alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR i] - or -CHR "-CH 2 -, wherein R 1! H, NH 2 , SO 3 H, COOK, SH, halogen (especially F or Cl !.), CM alkyl, Ci 4 Ha oaiky3, CM alkoxy, hydroxy-substituted-C1-4 alkyl, COO (C] 4 alkyl), or OH;
  • a -C (0) -, or -C represents NH 2 -;
  • R 3 represents -L-BINDER, -MOD, or an optionally substituted alkyl, cycloalkyi, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L-BINDER or a C 1-10 -alkyl-, Ce-io -Aryl or Ce-i o-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-0-C6-io-aryl or Cs-io heterocycloalkyl group, which with 1 -3 -OH groups , 1 -3 halogen atoms, 1 -3 halogenated alkyl groups (each having 1 -3 halogen atoms), 1 -3 O-alkyl groups, 1 -3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1 -3 -O -CO- alkyl groups, 1 -3 -O-CO-H-alkyl groups, 1-3 -NH-CO
  • alkyl is preferably CMO-alkyl
  • n 0, 1 or 2
  • R 5 is H, NH 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -C! H .
  • SH or - represents (CH 2 J 0 -3Z, wherein Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 , wherein Y is 1 and Y 2 independently represent H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o-3Z', wherein Z 'represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 8 (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, (optionally fluorinated) C 1-10 -cycloalkyl or - (CH 2) o- 2 - (HZ 2 j represents wherein HZ 2 is a 4 to 7-membered heterocycle having up to two heteroatoms selected from N, O and S is (preferably oxetane), where substituted, each of these groups with -OH, CO 2 H or NH 2 can be;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; where L is a linker and BINDER is an inoderate agonistically or non-agonistically active anti-TWEAK antibody, such as ⁇ -4, and chimeric or humanized variants of ITEM-4, where the binder may possibly be bound to non-zero carbohydrate molecules, wherein a member of R 1 , R represents J and R * represents -L-Binder;
  • R 6 and R ' is independently H, cyano, (optionally fluorinated) Ci-io alkyl, (optionally fluorinated) C2-J0- alkenyl, (optionally fluorinated) C' ⁇ 2-io alkynyl, hydroxy, NO2, NH 2, COOH or halogen (especially F, Cl, Br), wherein -MOD represents - (NR 10 ) n - (GI) o -G 2 -G 3, wherein R 10 represents H or C 1 -C 4 alkyl;
  • n 0 or 1
  • o 0 or 3
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • the invention provides conjugates of a moderately agonistic or non-agonistic anti-T WEAKR-A antibody such as ⁇ -4 and a chiral or humanized variant of ⁇ - 4 with one or more drug molecules, wherein the drug molecule is a kinesin spindle protein inhibitor (KSP Inhibitor) linked to the antibody via a linker L.
  • KSP Inhibitor kinesin spindle protein inhibitor
  • the conjugal according to the invention can be represented by the general formula
  • BINDER for the moderately agonist or non-agonist anti-TWEAKR antibody such as ITEM-4 and chimeric or humanized variants of ITEM-4
  • L for the linker
  • KSP for the KSP inhibitor
  • n for a number from 1 to 50, preferably 1.2 to 20 and particularly preferably 2 to 8 stands.
  • n is an average of the number of KSP inhibitor-linker conjugates per BINDER.
  • KSP-L preferably has the above-mentioned Formet (I).
  • the linker is linked to various amino acids of the antibody. Particularly preferred is a bond to different cysteine residues of the binder.
  • the antibody is preferably a humanized or ebimerized monoclonal ITEM-4 anti-TWEAKR antibody. Particularly preferred are the humanized or chimeric ITEM-4 variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075, and TPP-7076.
  • TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075, and TPP-7076 antibodies which can be used according to the invention, KSP inhibitors which can be used according to the invention and linkers which can be used according to the invention are described which can be used without restriction in combination. In particular, each may be preferred or particularly preferred! Binder shown in combination with the respectively preferred or particularly preferred KSP inhibitors shown, optionally in combination with the respective preferred or particularly preferred linkers shown.
  • substituted means that one or more hydrogens on the designated atom or group are replaced by a selection from the group indicated, provided that the normal valence of the designated atom has not been exceeded under the present circumstances Combinations of substituents and or variables are allowed.
  • optionally substituted means that the number of substituents may be the same or different from 0. Unless otherwise indicated, optionally substituted groups may be substituted by as many optional substituents as may be substituted by replacement of a hydrogen by a non-hydrogen atom. Typically, the number of optional substituents (if present) may be 1, 2, 3, 4 or 5, especially 3, 2 or 3.
  • radicals are substituted in the compounds according to the invention, the radicals can, unless stated otherwise, be monosubstituted or polysubstituted. Within the scope of the present invention, the meanings of all residues that occur multiple times are independent of each other. Substitution by one, two or three identical or different substituents is preferred. Substitution by a substituent is particularly preferred. alkyl
  • Alkyi represents a linear or branched, saturated, monovalent hydrocarbon radical having 1 to 10 carbon atoms (C 1 -C 10 -alkyl), generally 1 to 6 (C 1 -C 6 -alkyl), preferably 1 to 4 (C 1 -C 4 -alkyl), and particularly preferably 1 to 3 carbon atoms (Cj -C alkyl).
  • Particularly preferred is a methyl, ethyl, propyl, isopropyl and tert-butyl radical.
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • R x represents -H, C 1 -C 3 alkyl or phenyl.
  • Alkenyl is a straight-chain or branched monovalent hydrocarbon chain having one or two double bonds and 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms (C -C -alkenyl), in particular 2 or 3 carbon atoms (Ci-Cj Alkenyl), it being understood that when the alkenyl group contains more than one double bond, the double bonds may be isolated from each other or conjugated with each other.
  • the alkenyl group is, for example, an ethenyl (or vinyl), prop-2-en-1-yl (or “allyl”), prop-1-en-1-yl, but 3-enyl, but-2-enyl, but-1-enyl, pent-4-enyl, pent-3-enyl, pent-2-enyl, pent-1-enyl, hexane 5-enyl, hex-4-enyl, hex-3-enyl, hex-2-enyl, hex-1-enyl, prop-1-en-2-yl (or “isopropenyl") ) 2-methylprop-2-enylK 1 -methylprop-2-enyl, 2-methylprop-1-enyl, 1-methylprop-1-enyl,
  • the group is vinyl or ailyl.
  • Alkynyl represents a straight-chain or branched monovalent hydrocarbon chain having a three-membered bond and having 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms (C 2 -C 10 -alkynyl), in particular 2 or 3 carbon atoms
  • C 2 -C 10 -alkynyl 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 carbon atoms
  • Group is, for example, an ethynyl, prop-1-ynyl, prop-2-ynyl (or propargyl), but-1-ynyl, but-2-one inyl, but-3-ynyl, pentyl-1, pent-2-ynyl, pent-3-ynyl, peni-4-ynyl, hex-1-ylinyl, hex-2-ynyl Hex-3-ynyl, hex-4-ynyl, hex-5-ynyl, 1-methyl-2-ynyi, 2-methylbut-3-ynyl, 1-methylbut-3-ynyl, 1-methylbut-2-ynyl, 3-methylbut-1-ynyl, 3-yl-propyl-2-ynyl,
  • alkynyl group is ethynyl, prop-1-ynyl or prop-2-ynyl.
  • Cycloalkyl is a saturated monovalent mono or bicyclic hydrocarbon radical having 3-12 Kohaistoffaiomen (C 3 -C 2 cycloalkyl).
  • a monocyclic hydrocarbon radical is a monovalent
  • Hydrocarbon radical with usually 3 to 10 (Cs-Cio-cycloalkyl), preferably 3 to 8
  • cyclopropyl cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and
  • a bicyclic hydrocarbon radical is a hydrocarbon radical having generally 3 to 12 carbon atoms (C 3 -C 12 -cycloalk I), in which case a fusion of two saturated ring systems is to be understood, which share two atoms directly adjacent to one another.
  • bicyclic hydrocarbon radical bicyclo [2.2.0] hexyl, bicyclo [3.3.0] octyl bicyclo [4.4.0] decyl, bicyclo [5.4.0] undecyl, bicyclo [3.2.0] hepty3 ⁇ , bicyclo [4.2.0] octyl, bicyclo [5.2.0] nonyl, bicyclo [6.2.0] decyl, bicyclo [4.3.0] nonyl, bicycio [5.3.0] decyl, bicycio [ 6.3.03 undecyl and bicyclo [5.4.0] undecyl,
  • Heterocycloalkyl is a non-aromatic mono- or bicyclic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be the same or different. As heteroatoms nitrogen atoms, oxygen atoms or sulfur atoms can occur.
  • a monocyclic ring system according to the present invention may have 3 to 8, preferably 4 to 7, particularly preferably 5 or 6 ring atoms.
  • heterocycloalkyl having 4 ring atoms examples and preferred for a heterocycloalkyl having 4 ring atoms are:
  • heterocycloalkyl with 7 ring atoms examples and preferred for a heterocycloalkyl with 7 ring atoms are:
  • Oxocanyl, azocanyl
  • a bicyclic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be the same or different, may according to the present invention have from 6 to 12, preferably 6 to 10 ring atoms, with one, two, three or four carbon atoms against the same or different heteroatoms from the series O, N and S can be exchanged.
  • Examples include: azabicyclo [3.3.0] octyl, azabicyclo [4.3.0] nonyl,
  • Aiyl means a monovalent, mono- or bicyclic aromatic ring system consisting of carbon atoms. Examples are naphthyl and phenylene; preferred is phenyl or a phenyl radical.
  • Ce-io-Aralkyl- stands in the context of the invention for a monocyclisehes aromatic Aiyl, playable Phenyi, to which a Ci-Cii-Alkylgaippe is bound.
  • An exemplary Ce-io-aralkyl group is benzyl.
  • Heieroaiyl means a monovalent monocyclic, bicyciischen or tricyclisch.es aromatic ring system with 5, 6, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13 or 1.4 ring atoms (a "5- to 14-membered
  • Heteroaryl “group”) in particular 5, 6, 9 or 10 ring atoms, to understand that contains at least one ring heteroatom and optionally one, two or three further ring heteroatoms from the group N, O and S and via a ring carbon atom or optionally (if the valence allowed) via a ring nitrogen atom is bound.
  • the heteroaryl group may be a 5-membered heteroaryl group such as thienyl, furyl, pyrrolyl, oxazolyl, thiazolyl, imidazolyl, pyrazolyl, isoxazolyl, isotliiazoiyl, oxadiazolyi, triazoiyl, thiadiazolyl or tetrazolyl; or a 6-membered heteroarylgrapoe such as pyridinyl, pyridazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl or triazinyl; or a tricyclic heteroaryl group such as carbazolyl, acridinyl or phenazinyl; or a 9-membered heteroaryl group such as benzofuranyl, benzothienyl, benzoxazolyl, benzisoxazolyl, benzimidazolyl, benzothiazolyl, benzotriazolyl,
  • heteroaryl radicals include all possible isomeric forms thereof, e.g. Tautomers and positional isomers with respect to
  • pyridinyl includes pyridin-2-yl, pyridin-3-yl and pyridin-4-yl; or the term thienyl includes thien-2-yl and thien-3-yl.
  • Cs-io-heteroaryl represents in the context of the invention for a mono- or bicyci, aromatic ring system having one, two, three or four heteroatoms, which may be identical or different. As heteroatoms may occur: N, O, S, The binding valence can be located on any aromatic carbon atom or on a nitrogen atom.
  • a monocyclic heteroaryl group according to the present invention has 5 or 6 ring atoms. Preference is given to those heteroaryl radicals having one or two heteroatoms. Particularly preferred are one or two nitrogen atoms.
  • heteroaryl radicals having 5 ring atoms include the rings:
  • Oxadiazolyl triazolyl, tetrazolyl and thiadiazolyl.
  • Heteroaryl radicals with 6 ring atoms include the rings:
  • a bicyclic heteroaryl group according to the present invention has 9 or 10 ring atoms
  • heteroaryl radicals having 9 ring atoms include the rings:
  • Heteroaryl radicals with 10 ring atoms include, for example, the rings:
  • Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • R x is -H, C j -C ⁇ alkyl or phenylene.
  • Fluoroalkyl, fluoroalkenyl and fluoroalkynyl mean that the alkyl, alkenyl and alkynyl may be monosubstituted or polysubstituted by fluorine.
  • the conjugation of the KSP inhibitor to the antibody can be accomplished chemically in a variety of ways, as exemplified in Schemes 20 to 31 in the Examples.
  • it is possible to optionally modify the low molecular weight KSP inhibitor for conjugation to the linker e.g. by introducing protecting groups or leaving groups for easier substitution (so that in the reaction this leaving group is substituted by the linker and not an H atom).
  • the resulting KSP-inhibitor linker molecule (where the linker has a reactive group for coupling to the binder) can then be reacted with the binder to obtain a binding conjugate of the invention.
  • This procedure is exemplarily illustrated in the experimental part by means of a large number of examples.
  • R ' is FI, -L- # 1, --MOD or. (CH 2 3 Z, where Z is -FI, - ⁇ 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-Y ] Y 2 , or Represents -CO-OY 3 ,
  • Y 'and Y 2 are independently H, H 2, - (CH 2 CH 2 0) o-3- (CH2) o-3Z' (for example, - (CH2) o-3Z l), or -CH (CH 2 W )
  • Z 'and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o-3Z', wherein Z 'is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) ) -3 COOH; where represents WH or OH, where Y 4 linear or branched, optionally mif-NHCONFb substituted, C ⁇ -s alkyl or optionally with -NH ?. substituted aryl or benzyi;
  • R 2 is H, -MOD, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) o-3Z,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 4 are independently H, NH 2, or - (CH 2) o-3Z 4 , and Y J is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally with -NHCONH /; substituted C 1 -C 6 alkyl or aryl or benzyl optionally substituted with -NH 2 and Y represents H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 represents linear or branched C 1-6 alkyl;
  • R 4 represents H, -L- # 1, -SG lys ⁇ (CO) 0- i-R 4 -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) o-3Z,
  • SGjy S is a grappe cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a grappe consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a C 1-10 alkyl, Cs-io-aryl or Ce-jo- Araikyl-, Cs- io-heteroalkyl, C 10 -C 10 -alko-coco-aryl, C 3-10 -heterocycloalkyl-, heteroaryl-, heteroaryl-alkyl-, heteroaryl-alkoxy-, C 1-10 -alkoxy-, C 1-10 -aryloxy- or Ce-io-aralkoxy, Cs-io-heteroaralkoxy, Cwo-alkyl-O-Ce-io-aryloxy, Cs-io-heterocycloalkoxy group which is mono- or polysubstituted with - NH 2 , -NH-alkyl
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONHb, C [-6 alkyl or optionally substituted by -NH2 aryl or benzyi and Y 5 is H or •• ⁇ CO-CHY 6 -NH2, wherein Y 6 linear or branched Ci-6 represents alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR i] - or -CHR "-CH 2 -, where R" is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl) , CM is alkyl, CW is haloalkyl, C 1-4 -alkoxy, hydroxyl-substituted C 1-4 -alkyl, COO (C 1-4 -alkyl) or OH;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CNNH 2 ;
  • R ' is L, MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyi, Heierocycloalkyl- group, preferably a Ci-io-alkyl, Ce-io-aryl or Cs ⁇ -aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, C i -o-alkyl-O-Ce-io-aryl or Cs-jo-heterocycloalkyl group, which with 1 -3 -OH groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1-3-SH groups, 1-3-alkyl groups, 1-3-O-CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups, 1-3 -NH-GO-NH-alkyl Grappen, 1-3
  • R 5 is H, -MOD, NH 2 , O 2 , halogen (in particular F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 - 3 represents Z, where Z is -H, -OY 3, -SY 3, halogen, NHY 3, -CO-NY] Y 2, OY 3 or -CO-group,
  • Y ! and Y 2 independently represent H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y J represents H or - (CHa sZ', wherein Z 'represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -jo-alkynyl, hydroxy, N0 2 , NH 2 , COOH or halogen (especially F, Cl, Br),
  • R 8 is (optionally fluorinated) C O- alkyl, (optionally fluorinated) C2 -io-Alkenyi, (optionally fluorinated) C2 -io-alkynyl, (optionally fluorinated) C4-i ⁇ rCycloalkyl or - (CH 2 ) o- 2 - (HZ 2 ), wherein HZ 2 represents a 4- to 7-membered heterocycle having up to two heteroatoms selected from N, O and S (preferably oxetane), each of which is -OH, CO2H or NH 2 may be substituted; wherein one of the substituents R 1 , R 'and R 4 represents -L-'i 1,
  • L is the linker and (i 1 is the bond to the antibody
  • R 9 is H, F, CH 3, CF 3, CH 2 F or CHF 2 ; wherein -MOD - (NR i0 ) n - (Gl) o -G2-G3, wherein
  • R '° represents H or C 1 -C 3 -alkyi
  • G is -NHCO-, -CONH- or ⁇ / (where if G is -NHCO- or
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • NH-C H 2 sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or Suifon720 can be substituted, wherein G3 is -H or -COOH, and wherein the group -MOD preferably has at least one group -COOH; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • the carbon atom to which R 1 binds is a stereocenter which may be in the L and / or D configuration, preferably in the L configuration.
  • R 1 represents H, -L- # 1, or - (CH OJZ wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY ! Y 2 , or -CO-OY 3 represents,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3Z '(for example - (CH 2 ) (M Z'), or -CH ( CH 2 W) represents Z ', and Y 3 represents Ii or - (CH o -sZ', wherein H, NH 2 , SO 3 H, COOK, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i- 3 COOH; wherein represents WH or OH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , Cw alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl.
  • R 2 and R 4 independently of one another H, -SG lys - (CO) o_i-R 4 ', -CO-Cl I V-NHY ' or ⁇ ⁇ ! ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ : /. represent
  • SGi vs represents a group cleavable by a lysosomal enzyme, in particular a group consisting of a di- or tripeptide
  • R 4 ' is a Ci-io-alkyl, Cs-io-aryl or Ce-io aralkyl, Cs io-heteroalkyl, Ci-io-Alk lO-Ce-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, Ce-io- Aryloxy or cocooroalkoxy, C5-10 heteroaralkoxy, Cs-io-Heterocycloalkoxy group, each one or more times with ⁇ NH 2 , -NH-alkyl, -N (alkyl) 2 , NH-CO-alkyl, N (alkyl) -COAlkyl,
  • Y 1 , Y are independently H, NH 2 , or - (CH 2) o-3Z 4 , and Y 3 is H or - (CH o -sZ 'wherein Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • Y 4 is independently linear or branched, optionally with -NHCONH2 substituted, CM alkyl or optionally substituted with --NH2 substituted aryl or benzyl, wherein Y 4 linear or branched, optionally substituted with -NHCONH2, Cw alkyl or optionally substituted with -NH2 Aryl or benzyl and Y 'represents H or -CO-CHY ° -NH2, wherein Y 6 represents linear or branched C e alkyl;
  • A represents CO, SO, SO 2, SO, N, or CNNH 2 ;
  • R 3 represents an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, or helocycloalkyl oro group, preferably -L- # 1 or a C 10 -alkyl, C 20 -aryl or coco-aralkyl, C 5-10 10- heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryl or Cs-io-heterocycloalkyl group having with 1-3 -OH groups, 1-3 halogen atoms, 1 -3 halogenated Alkvi phenomenon (each 1-3 halogen atoms) ,, 1-3 O-alkyl groups, 1-3 -SH groups, 1 -3 -S-alkyl groups, 1 -3 -O-CO alkyl groups, 1 -3 -O-CO -NH-alkyl groups, 1 -3 -NH-CO-alkyl groups, 1 -3 -NH-CO-alkyl groups, 1 -3 -NH-CO-
  • Y 2 or -CO-OY 3 , with Y 1 and Y 2 independently of one another H, NH 2 , or - ( CH2) o-3Z 4 , and Y ⁇ H, - ⁇ (I! ⁇ - Cl Si M iC (X ' l!) /. ⁇ . - ⁇ (I i ⁇ ..: ⁇ ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ) / Represents - or - (CH 2 ) o - 3 Z ', where Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOH,
  • alkyl is preferably Cj-io alkyl
  • R 5 is H, F, NH 2 , NO 2 , halogen, SH or - (CH 2 ) o- 3 Z, wherein Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY ! Y 2 represents or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently represent H, NH 2, or - (CH 2 ) o-3Z 4 , and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o-3Z ', wherein Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOH represents;
  • R 6 and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 12 -C 20 -alkyl, (optionally fluorinated) C 2 -C 10 -alkynyl, (optionally fluorinated) C 2 -C 6 -alkynyl, hydroxyl or halogen, R 8 (optionally, fluorinated) C i-jo-alkyl, (optionally, fluorinated) C -io-cycloalkyl or optionally substituted oxetane thereof; and H, I. CH 3 , C! :.
  • CH 2 represents F or CHF 2 ; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • one of the substituents R ', R 3 or R 4 represents -L- # 1, where L represents the linker and # 1 represents which binds to the antibody. That is, in the case of the conjugates, one of the substituents R 1 , R 'or R 4 represents -L- # 1, wherein -L- # 1 represents the binding to the antibody.
  • the binder is preferably a human, humanized or ehimeric monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof. In a preferred embodiment of the formula (1) or (Ia), one of the substituents R 1 or R 3 represents -L- # 1.
  • R * 1 H or -SGr vs - (CO) oiR 4 ' where SGi vs and R 4 ' have the same meaning as above.
  • R 4 H
  • Corresponding cleavable groups are described below. Preference is given to moderately agonistic or non-agonistic anti-TWEAKR antibodies.
  • the antibody is preferably a humanized or chimeric ok-4 anti-TWEAK monoclonal antibody.
  • Particularly preferred are the humanized or chimeric ITEM-4 variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-7076.
  • the group -L- # 3 may also be present in the compound, where L is the linker and # 3 is the reactive group for binding to antibodies.
  • Compounds with -L- # 3 are reactive compounds that react with the antibody.
  • # 3 is preferably a group that reacts with an amino or thiol group to form a covalent bond, preferably with the cysteine residue in a protein.
  • the cysteine residue in a protein may be present in the protein, introduced by biochemical methods, or preferably generated by prior reduction of disulfides of the binder.
  • CO carbonyl
  • R 1 is preferably -L- # 1, H, -COOK, -CONHNH 2, - (CH 2 ) i.3NH 2 , -CONZ "(CH 2 ) i-3 NH 2 and - CONZ" CH 2 COOH, wherein Z "H or NH 2 .
  • R 2 and R 4 are preferably steep together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 CHR 11 - or -CHR 1! -CH 2 -, wherein R 1 1 represents H or F.
  • R 4 is -L- # 1, where -L- # 1 is a cleavable linker, preferably an intracellular enzymatically cleavable linker.
  • R 3 is preferably -L- # l or a Ci-io-alkyl, optionally with -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-alkyl, NH-CO-alkyl, NH-CO-NH-alkyl, S (0) rl -alkyl, S0 2 -NH-alkyl, NH-alkyl, N (alkyl), or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C1-3 alkyl).
  • R 5 is preferably H or F.
  • R 6 and R 7 are preferably each independently H, (optionally fluorinated) C1-3 alkyl, (optionally fluorinated) C 2 -4 alkenyl, (optionally fluorinated) C2 -4 ⁇ alkynyl, hydroxyl or halogen ,
  • R s is preferably a branched C [.5-alkyl group, in particular a group of the formula - -Ry, where R y is -H, -OH, C0 2 H, or H 2 , or a (optionally fluorinated) C 5-7 -cycloalkyl. Particularly preferred is a group of the formula --- € (013) 3 or a cyclohexyl group ,
  • R 9 is preferably H or F.
  • A is CO (carbonyl);
  • R 1 is H, -L- # 1, -COOK, -CONHNH 2 , - (CH 2 ) i. 3 H 2 , -G ⁇ NZ "(CH 2 ) 1.3 H 2 and -CONZ" is CH 2 COOH, wherein Z "is H or NH 2 ;
  • R and R 4 are H, or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR ! L - or -CHR 1! Represent -CH 2 -, wherein R n represents H or F; or R 4 is -L- # 1 and R 2 is H;
  • R '-L- # l or a phenyl group which may be substituted one or more times with halogen (in particular F) or optionally fluorinated C ⁇ _3 alkyl, or represents an optionally fluorinated C-10-alkyl group.
  • R 3 is particularly preferably substituted by -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-alkyl, NH-CO-alkyl, NH-CO-NH-alkyl, S (0 ) n- alkyl, SO2-NH-alkyl, NH-alkyl, N (alkyl) 2 , or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably Ci-3 alkyl);
  • R s is H or F
  • R 6 and R 7 independently of one another are H, (optionally fluorinated) C 1-3 -alkyl (optionally fluorinated) C 2-4 -alkenyl (optionally fluorinated) C 2-4 -alkynyl, hydroxyl or halogen;
  • R s is a branched Ci-s-alkyl group or cyclohexyl
  • R is i or F is.
  • R represents -L- # i, COOH or H
  • R 2 and R 4 are H or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) --CH 2 -CHR H - or -CHR 1! -CH 2 -, wherein R 1 is 1 H or R 4 is -L- # 1 and R 2 is H;
  • A represents CO
  • R 6 and R ' are independently H, C 1-3 alkyl or halogen, especially that R 6 and R 7 are F;
  • R s is C1- alkyl (preferably tert-butyl) or cyclohexyl; and or
  • R 9 represents H.
  • R represents -L- # 1, COOH or H.
  • R "and R 4 are H or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) --CH 2 -CHR 1! - or
  • A represents CO
  • R "and R 'independently of one another are H, C w -acyl or halogen, in particular that R 6 and R ; F represent;
  • R s is C 1-4 -alkyl (preferably tert-butyl).
  • R 9 represents H.
  • R 1 is H, -L-Binder, -MOD or - (CH 2 ) o- 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-Y'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, H 2 , ⁇ (CH 2 CH 2 O) o. 3 - (CH 2 ) o- 3 Z '(eg - (CH 2 ) o-3Z'), or -CH (CH 2 W) Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o-3Z' where H, NH 2 , SO 3 H, -COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ),. 3 represents COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH 2 , Oe alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted asyl or benzyl;
  • R 2 is H, -MOD, -CO-CHY'-NHY 5 or - (CH 2 ) o -:> Z, wherein Y 4 is linear or branched, optionally substituted with-NHCONH2, C w Alkyi or optionally substituted with - Eb
  • Y 5 is H or -CO-CHY ⁇ Ni-k, where Y 6 is linear or branched C 1 -C 4 alkyl,
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y are independently H, NH 2 , or - (QHbJo-sZ ', and Y J H or -
  • R 4 represents H, -L-binder, -SG lys » (CO) 0 ...] - R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) o- 3 Z,
  • SG ⁇ VS is a group cleavable by lysosoundal enzymes, in particular a group consisting of a di- or tripeptide, Rheine Ci-10-alkyl, Cs-io-aryl or Ce-io-aralkyl, C5-10 heteroalkyl -, C 1-10 -alkyl-O-Cö-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, Ci-io-alkoxy, Ce-io-aryloxy or Ce-io-aralkoxy, Cs-io-heteroaralkoxy, ci-o-alkyl-O-Ce-io-aryloxy, Cs-io-heteroeyeloalkoxy group which is mono- or polysubstituted by -NH, -NH- Alkyl, -N (alkyl) 2 , NH-CO
  • Y 1 and Y "independently of one another are H, H 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 , Cj-6 Alkyi or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched C1-6 represents alkyl;
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR n -CH 2 -, where R n is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl) , CM Alkyi, Cj. 4 is haloalkyl, CM is alkoxy, hydroxyl-substituted CM Alkyi, COO (Cj-4 Alkyi) or OH;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 is -L-Binder, -MOD, or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably -L-BINDER or a Ci-10-alkyl, Ce-io -Aryl or Ce-io-aralkyl, Cs-i o -heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryl or C5-10 heterocycloalkyl group having 1-3 -OH groups , 1-3 halogen atoms, 1 -3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-Alkyi groups, 1 -3 -SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1-3 -O -CO- Alkyi groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO- Alkyi groups, 1-3 -
  • alkyl is preferably Cj-io-alkyl
  • R 5 is H, H 2 , NO 2 , halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3 , -OCF 3 , -CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) o-3Z, wherein Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 , wherein Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , or - (CH 2 ) represents o-3Z ', and Y J represents H or - (CH 2 ) o- 3 Z i , wherein Z' represents H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 0-alkyl, (optionally, fluorinated) C 2 -O-alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -alkynyl, hydroxy, NO 2 , NH 2 , COOH or halogen (especially F, Cl, Br),
  • R 8 (optionally fluorinated) C 1-10 -alkyl, (optionally fluorinated) C 1-10 -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-10 -alkynyl, (optionally fluorinated) C 1-10 -cycloalkyl or - (CH 2 -jo-2- ( HZ 2 ), wherein HZ 2 represents a 4 to 7 membered heterocycle having up to two heteroatoms avas selected from N, O and S, each of which groups may be substituted by --- OH, CO2H or NH 2; H, F , CH 3 , C!: CH 2 F or CHF 2 , wherein -MOD represents - (NR 10 ) n - (Gl) o -G 2 -G 3, wherein
  • R 10 is H or Cj-C, alkyl
  • n 0 or 1
  • o 0 or 3
  • G 2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • R y is H, phenyl, C [-C
  • NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2, NH-CNNH 2, sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted
  • -CO-, or -CR ⁇ NO- (wherein Rx is H, Cj ⁇ -alkyl or phenyl) may be interrupted, wherein the hydrocarbon chain including the side chains, if present, with M ICONi b.
  • G3 is -H or - -COOH, and wherein the group - MOD preferably has at least one -COOH group ; and their salts, solvates and salts of solvates and epimers.
  • R 1 , R J and R 4 may be L-linkers wherein L is a linker and BINDER is the antibody is, the antibody may, if necessary, be bound to several drug molecules.
  • R 1 represents -L-BINDER, H, or - (CH 2 ) ⁇ MZ, wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 represents
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, NH 2 , - (CH 2 CH 2 O) o- (CH 2 ) 0 - 3 Z ', or -CH (CH 2 W) Z', and Y 3 is Ii or - ( 2 ) ⁇ - 3 ⁇ ', wherein Z' is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 --CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY) i. 3 represents COOH; wherein represents WH or OH; wherein Y is linear or branched, optionally substituted with -NHCO H2, Cj-salkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted Ar or bericyl;
  • R 2 and R 4 are independently H, -SG vs -. (CO) 0] -R 4 ', -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2) o- 3 represent Z, or R 2 and R 4 together represent (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 - CHR 11 - or -CHR H -CH 2 -, or R 2 is H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CH 2 ) o- 3 Z represents and R 4 represents --L- # 1 where R 10 is H, H 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl), C M alkyl, C haloalkyl, C 1-4 alkoxy, hydroxyl substituted C 1- 4 is alkyl, COO (Cj-4 alkyl) or OH;
  • SGiy S represents a group cleavable by lysosomal enzymes, in particular a group consisting of a di- or tripeptide, 4 'is a Ci-io-Alkyt-, Cs-io-Aryi- or Cö-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyi, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryl, Cs-io-Heteroeyeloalkyl-, heteroaryl, heteroaryl-alkyl, heteroaryl-alkoxy, cuo-alkoxy, Ce-jo-aryloxy or Ce-io-aralkoxy, Cs-io-heteroaralkoxy, O-lo-alkyl-O-Ce-io-aryloxy, Cs-io-Heterocycioalkoxy group which is one or more times with - H2, - H-alkyl , -N (alkyl
  • R 4 '' represents (wherein x is 0 or 1 and v is a number from 1 to 10, and R 4 is -H, -alkyl (preferably C M2 -alkyl), -CH 2 -COOH, -CH 2 -CH 2 -COOH, or -CH 2 -CH 2 - H 2 represents);
  • Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , HY 3 , -CO- ⁇ 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another denote H, NH 2 , or - (Ci-fcjo-sZ ', and Y ⁇ H or -
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH2, Cw alkyl or optionally substituted by -NH2 aryl or benzyl and Y 'is H or -CO-CHY ° -NH2, wherein Y 6 is linear or branched C ie alkyl;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents --L-BINDER or an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, helerocycloalkyl group, preferably -L-BINDER or a Ci-io-alkyl, Ce-io-Aiyl- or Ce- io-aralkyl, Cs-io-heteroalkyl, Ci-io-alkyl-O-Cö-io-aryl or Cs-io-heterocycloalkyl group having with 1-3 -OH groups, 1 -3 halogen atoms, 3 3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms) ,, 1 -3 O-Alkyi groups, 1-3 -SH groups, 1 -3 -S-alkyl groups, 1 -3 - O-CO alkyl groups, 1 -3 -O-CO-H-alkyl groups, 1 -3 -NH-CO-alkyl groups, 1
  • alkyl is preferably CMO-alkyl
  • R 5 is H, F, H 2 , O 2 , halogen, SH or - (CH 2 V 3 Z, wherein Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , - HY 3 , -CO-Y 1 Y 2 , or -CO Represents -OY 3
  • alkyl is preferably CMO-alkyl
  • R 5 is H, F, H 2 , O 2 , halogen, SH or - (CH 2 V 3 Z, wherein Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , - HY 3 , -CO-Y 1 Y 2 , or -CO Represents -OY 3
  • alkyl is preferably CMO-alkyl
  • R 5 is H, F, H 2 , O 2 , halogen, SH or - (CH 2 V 3 Z, wherein Z is -
  • ⁇ 'and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CEb sZ', and Y 3 is H or - (CH 2 J 0 -3Z ', where Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOK ;
  • L is a linker and BINDER is a binder or derivative thereof, it being possible for the binder to be bound to a plurality of active substance molecules,
  • R "and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) G-jo-alkyl, (optionally fluorinated) CJ-IO-alkenyl, (optionally fluorinated) C 1-10 -alkynyl, hydroxyl or halogen,
  • R 8 represents (optionally fluorinated) C 10 -alkyl, (optionally fluorinated) Gwo-cycloalkyl or optionally substituted oxetane;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • SP-inhibitor-antibody conjugates are preferred according to the invention:
  • R 1 , R 2 , R 4 , R 5 , R 6 , R 7 , R 8 and R 9 have the same meaning as in formula (II) or (IIa),
  • A is CO
  • B is a single bond, -O- CH 2 - or -CH 2 -O-
  • R 20 is NH 2, F, CF 3, or CH 3
  • n is 0, 1, or 2.
  • R 1 , R 3 , R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 have the same meaning as in formula (II) or (IIa), wherein A is preferably CO and R 3 is -CH 2 OH, -CH 2 represents OCH 3 , CH (CH 3 ) OH or CH (CH 3 ) OCH 3 .
  • A, R 3 , R 6 , R ; , R 8 and R 9 have the same meaning as in formula (II) or (IIa), wherein A is preferably CO and R 3 -CH 2 S X - (CH2) ⁇ M-CHY * -COOH, where x is 0 or Is 1 and Y 5 is H or NHY 6 , where Y 6 is H or -COCH 3 .
  • R 1 represents -L-BINDER.
  • R 1 or R 3 particularly preferably represent -MOD.
  • R 3 represents -L- # 1
  • A represents CO
  • R 6 , R 7 , R 8 and R 9 have the same meaning as in formula (I)
  • R : L- # 1 represents
  • R 3 represents CM OH
  • R 3 , R 6 , R 7 , R 8 , and R 9 have the same meaning as in formula (I).
  • Z represents Cl or Br;
  • R 1 is - (CH 2 V 3 Z wherein Z is -COOH or -CO- ⁇ 2 , where Y 2 is - (CH 2 CH 2 O) o-3
  • (CH 2) 3 0 _ Z 'and Y' are H, NH2, or - (CH2 CH20) o-3- (CH 2) () ..Z'dar perpetu;
  • Y [H, Y 2 - (CH 2 CH 2 0) 2 CH 3 -CH 'and Z' 2 Z represents -COOH
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z 'and - (CONHCHY ⁇ COOH represents;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • T represents ⁇ (CONHCHY 4 ) 2 COOH and one represents Y 4 -propyl and the other represents - CH 2 ) j -NHCONH 2 ;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' represents - (CONHCHY 4 ) 2 COOH and one represents Y 4 -CH 3 and the other represents - (CH 2 ); - HCONH 2 ;
  • Y 4 represents linear or branched, optionally substituted with -NHCONH2, C "alkyl; at least one member of Y 4 is selected from i-propyl or -CH 3 .
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' represents -CONHCHY'COOH and optionally Y 4 with
  • -NH 2 represents substituted aryl or benzyl
  • Y 4 represents aminobenzyl
  • R 2 ⁇ Ci! ⁇ ⁇ ) ⁇ . ./ 'and Z represents -SY 3 ;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is H;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is -CO-CHY 6 -NH 2 ;
  • Y represents linear or branched, optionally substituted with -NHCONH2 Ci-6 alkyl.
  • R 1 , R 2 or R 3 in formula (I) or (II) represents -MOD.
  • R 3 represents -MOD and R 1 or R 4 represents -L- # 3 and -L-BTNDER, respectively, wherein -MOD represents - (NR J % - (G 1 ) 0 -G 2 -G 3, wherein
  • R 10 is H or Ci-C, - alkyl
  • Gl represents -NHCO-, or -CONH- (wherein when Gl -NHCO-, R i0 not NH 2);
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • the group -MOD has a (preferably terminal) -COOH group, for example in a betaine group.
  • the group -MOD has the formula -CH 2 -S x - (CH 2 ) o-4 -CHY 5 -COOH, where x is 0 or 1, and Y 5 is H or NHY 6 , where Y 6 is H or - GOCH- represents.
  • R 1 represents -L-BINDER, H, or - (CH 2 ) (wZ, wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO- ⁇ ' ⁇ 2 , or -CO-OY 3 represents
  • Y 'and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) Z' or - CH (CH 2 W) Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) o -3Z l , where Z 'is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, - NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) i. 3 represents COOH;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with -NHCCX H2, Ci-e alkyl or optionally -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 and R 4 are independently II, -SG lys - (CO) 0 -i-R 4 ', -CO-Cl I V-NHY ' or ⁇ (CI-I 2 ) (Z represent
  • R 2 and R 4 together represent (to form a pyi-tolidine ring) -CH 2 -CHR 1 '- or -CHR "- CH 2 -, where R n is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, SH, halogen (especially F or Cl), CM is alkyl, C 1-4 is haloalkyl, CM is alkoxy, hydroxyl-substituted CM is alkyl, COO (C 1-6 alkyl) or OH; wherein SGjyg represents a group cleavable by lysosornale enzymes, in particular a group consisting of a di- or tripeptide, 4 'a Ci-io-alkyl, C $ .10 aryl or Gwo aralkyl, Cs-io heteroalkyl , Ci-io-alkyl-O-Cs-io-aryl, Cs-io-heterocycloalkyl
  • Z represents -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NYY 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, H 2 , or - (CH 2) Z ', and Y 3 is H or - iC! H, ⁇ : /. ⁇ , where Z' is H, SO 3 H, NH 2 or COOH represents;
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted with -NHCONH 2 , Cj-6 alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY * -NH 2 , wherein Y 6 linear or branched Ci- ⁇ is alkyl;
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L-BINDER, an optionally substituted alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, or -CH 2 -S x - (CH 2 ) ⁇ M-CHY 5 -COOH, where x is 0 or Is 1 and Y 5 is H or NHY 6 , where Y 6 is H or -COCH 3.
  • Y 2 or -CO-OY 3 with Y 1 and Y 2 independently of one another being H, NH 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 H, - (CH 2 ) 3 -CH (NHCOCH 3jZ% - (CH 2) o-3-CH (NH 2 ) Z ', or -; ( ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ ; /.', Where H, SO 3 H, NH 2 or COOH,
  • alkyl is preferably Cwo-alkyl
  • R 5 is H, F, NH 2 , NO 2 , halogen, SH or. (CH 2 ) o.jZ, where Z is -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , -NHY 3 , -CO-NY ! Y 2 represents or -CO-OY 3 , wherein Y 1 and Y 2 are independently H, H 2 , or - (CH 2 ) o -: Z L , and Y 3 is H or - (CH 2 ) 0-3 Z ', where Z' is H, SO 3 H Represents NH 2 or COOK; where L is a linker and BINDER is the antibody, where the binder may possibly be bound to several active substance molecules,
  • R 6 and R 'independently of one another are H, cyano, (optionally fluorinated) C 1 -j-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 -O-alkenyl, (optionally fluorinated) C 2 -jo-alkynyl, hydroxyl or halogen,
  • R s represents (optionally fluorinated) C 10 -alkyl, (optionally fluorinated) Gno-cycloalkyl or optionally substituted oxetane;
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; and their salts, solvates, salts of solvates and epimers.
  • Z represents Cl or Br
  • R 1 is - (CH 2 ) O- 3 Z, where Z is -CO-NY'Y 2 , where Y is 2 and Y 1 II, NH 2 , or. ⁇ ⁇ ! ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ > ⁇ »; ⁇ Represents ( ( ! ⁇ ), _ ./ ' :
  • Y [ H represents, Y 2 -! ( ⁇ ⁇ ⁇ M>) : - ⁇ !. ⁇ ! !. / Represents and represents 7 -COOK;
  • ⁇ ' represents H, Y ' represents 2 -CH 2 CH 2 Z 'and Z' - (CONHCHY) 2 COOH;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' - (CONHCHY) 2 represents COOH and represents one representative of Y 4 isopropyl and the other i - ⁇ - f IC ⁇ > ⁇ H; represents;
  • Y 1 represents H
  • Y 2 represents -CH 2 CH 2 Z '
  • Z' represents - (CONHCHY 4 ) 2 COOH and represents one of Y 4 - CH 3 and the other K ⁇ i ; ) - N!
  • K OX H represents;
  • Y 4 is CW alkyl, linear or branched, optionally substituted with --NHCONH 2; at least one member of Y 4 is selected from z ' propyl or -CH 3.
  • Y 1 is H, Y 2 is -CH 2 CH 2 Z ', Z' is -CONHCHY'COOH, and Y is optionally aryl or benzyl substituted with -NH 2;
  • Y 4 represents aminobenzyl
  • R 2 is - (CH 2 ) o- 3 Z and Z is -SY 3 ;
  • R 4 is -CO-CHY 4 -NHY 5 and Y 5 is H;
  • R 4 is -CO-CHY 4 - NHY 5 and V is CO-CH Y ' - NH -;
  • Y 4 is linear or branched optionally substituted with -NHCONH2 Ci- ⁇ alkyl. Furthermore, preference is given to compounds of the formula (I), (Ia), (II), (IIa) or (III)
  • R ' represents H, -L- # l and -L-BINDER, -MOD or - (CH 2 V 3 Z, where Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO-NY 1 Y 2 or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, H 2, - (CH 2 CH 2 0) o-3- (CH2) o-3Z '(for example, - (CH2) o-3Z'), or -CH (CH 2 W ) Z ', and Y 3 represents H or - (CH 2 ) o - 3 Z', wherein 7 is H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO-NH-CHY 4 ) ) -3 COOH; where represents WH or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally with -NHCONH ? substituted, Cj-s alkyl or optionally substituted with -NH 2 substituted Ar l or bericyl;
  • R 2 represents H, -CO-CHY 4 -NHY 5 or - (CW WJ Z,
  • Z represents -H, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NYV, or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 1 are independently H, H 2 , or - (CH 2 ) o-3Z ', and Y 3 is H or -
  • Y 4 is independently linear or branched, optionally substituted by -NHCO H 2 , C 1 - 6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 'is H or -CO-CHY ⁇ Ntb, wherein Y 6 linear or branched Ci-e alkyl;
  • R 4 represents H or -L- # 1 and -L-BINDER, respectively (wherein -L- # 1 and -L-BINDER, respectively, is an enzymatically cleavable linker leading to the conversion of R 4 to H);
  • A represents CO, SO, SO 2 , SO 2 NH or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L-L or -L-BINDER, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably a C 1-10 -alkyl-, Ce -io-aryl or Ce-io-aralkyl, Cs-io-Heteroaikyl-, Ci-io-alkyl-O-Ce-io-aryl or Cs-io-heterocycloalkyl group, with 1-3 -OH Groups, 1-3 halogen atoms, 1 -3 halogenated alkyl groups (each having 1 -3 halogen atoms), 1 -3 O-alkyl groups, 1-3 --SH groups, 1-3 -S-alkyl groups, 1-3 -O-CO- alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl tabs
  • halogen in particular F, Ci, Br
  • -CN CF 3 , OCF 3 , C t I i -CH 2 F, SH or - (CH 2 V 3 Z, where Z is -II, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY 'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH_, or - (CHyo-sZ 4 , and Y 3 is H or - ( ⁇ ⁇ ,; / ⁇ wherein Z 'is H, SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R "and R ' are each independently H, cyano, (optionally fluorinated) G-jo-alkyl, (optionally fluorinated) CJ-IO-alkenyl, (optionally fluorinated) Cj-io-alkynyl, hydroxy, NO ?. , NEfe, COOH or halogen (especially F, CI, Br),
  • R (optionally fluorinated) Ci-i ⁇ -Alky !, (optionally fluorinated) C 2 -io ⁇ alkenyl, (optionally fluorinated) Ci-io-alkynyl, or (optionally fluorinated) CVio-cycloalkyl; where one of the substituents R ! and R 3 represents -L- # 1 or -L-BINDER, respectively,
  • R 9 is H, F, CH 3 , CF 3 , CH 2 F or CHF 2 ; wherein -MOD - represents (NR J % - (G1) 0 -G2-G3, wherein
  • R 10 is II or C 1 -C 3 alkyl
  • Gl represents -NHCO-, or -CONH- (wherein when Gl -NHCO-, R i0 not NH 2);
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched ohlenwassersto ⁇ rappe having 1 to 10 carbon atoms, which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-C NH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid), -CO-, -CR x N-O- (where Rx H, Ci -C'3-alkyl or phenyl) may be interrupted, wherein the hydrocarbon chain including the side chains, if may be substituted with -NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, Suli n, sulfoxide, or sulfonic acid, wherein G3 is -H or -COOH, and wherein the group -MOD preferably at least one group -COOH; and their salts, solvates, salts of solvates and epirners.
  • R 1 represents H, -L- # 1 and -L-BINDER, -MOD or - (CH 2 ) o-3Z, respectively, wherein Z is -H, -NHY 3 , -OY 3 , -SY 3 , halogen, -CO Represents -NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another are H, H 2 , - (CH 2 CH 2 O) o-3- (CH 2 ) o-3Z '(for example - (CH o -sZ'), or -CH (CH 2 W) Z and Y 3 represents H or - (CH 2 Z ', where H, NH 2 , SO 3 H, COOH, -NH-CO-CH 2 -CH 2 -CH (NH 2 ) COOH or - (CO- NH-CHY 4 ), 3 COOH where W is Ii or OH,
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , C 1 -6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl;
  • R 2 represents H, -CO-CHY -NHY 5 or - (Cft ⁇ Z,
  • Z represents -Ii, halogen, -OY 3 , -SY 3 , NHY 3 , -CO-NY'Y 2 , or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 independently of one another represent Ii, NH 2 , or - (CH 2 ) O- 3 Z ', and Y 3 H or
  • Y 4 is linear or branched, optionally substituted by -NHCONH 2 , C 1 -6 alkyl or optionally substituted by -NH 2 substituted aryl or benzyl and Y 5 is H or -CO-CHY 6 -NH 2 , wherein Y ° linear or branched de alkyl;
  • R 4 represents I i
  • A represents CO, SO, SO 2, SO, M i or CNNH 2 ;
  • R 3 represents -L-l or -L-BINDER, -MOD or an optionally substituted alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalkyl, heterocycloalkyl group, preferably a CMO-alkyl, Ce-io -Aryl- or Ce-io-aralkyl, Cs-io-Heteroalk l, C i -o-alkyl-0-C6-io-Ar l- or Cs-jo- Heierocycloalkyl group, which with 1-3- OH groups, 1-3 halogen atoms, 1-3 halogenated alkyl groups (each having 1-3 halogen atoms), 1-3 O-alkyl groups, 1 -3 -SH gels, 1 -3 -S-alkyl groups, 1-3 -O-CO-alkyl groups, 1-3 -O-CO-NH-alkyl groups, 1-3 -NH-CO-alkyl groups
  • R 5 is H, -MOD, NH, NO 2, halogen (especially F, Cl, Br), -CN, CF 3, -OCF 3, ⁇ CH 2 F, -CH 2 F, SH or - (CH 2 ) 0 - 3 Z where Z is -H, -OY 3 , -SY 3 , halogen, NHY 3 , -CO-NY ! Y 2 represents or -CO-OY 3 ,
  • Y 1 and Y 2 are independently H, NH 2 , or - (CH 2 ) ⁇ -3Z ', and Y 3 is H or - (CH 2 ) 0 - 3 Z I , wherein Z' ⁇ , SO 3 H, NH 2 or COOH;
  • R 6 and R 'independently represent H or halogen (especially F, Cl, Br);
  • R 8 represents (optionally fluorinated) CMO alkyl; where one of the substituents R 'and R 3 represents -L- # 1 or -L-BINDER, respectively,
  • L is the linker and # 1 is for binding to the antibody and BINDER is for the antibody, H, F, CH 3 , CT :.
  • CH 2 represents F or CHF 2 ; wherein -MOD is -CH 2 -S x - (CH 2 / V 4 -CHY 5 -COOH on, wherein x is 0 or 1, and Y 5 is H or NHY 6 , wherein Y 6 is H or -COCH 3, and their salts , Solvates, salts of solvates and epimers.
  • R 1, R 2, R J, R 4 and R 5 are as defined above (such as for formula (I) or (II)) that have:
  • R ! and R 5 represents H or -L- # 1
  • R and R 4 are H or R 2 and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR i] - or -CHR i] -CH 2 - where R n is H
  • R 3 is CH 2 OH, CH (CH 3 ) OH or - L - # 1, wherein one of the substituents R ! , and R 3 represents -L- # l.
  • R 1 is H or COOH
  • R z and R * H represent
  • R 4 represents -L- # 1
  • R 3 is CH 2 OH, or CH (CH 3 ) OH, wherein -L- # 1 is an enzymatically cleavable linker which results in the conversion of R 4 into H.
  • linkers fall into the group of in vivo cleavable linkers and into the group of in vivo stable linkers (see L. Ducry and B. Stump, Bioconjiigate Chem. 2_1, 5-13 (2010)).
  • the in vivo cleavable linkers have an in vivo cleavable group, which in turn can be distinguished between chemically in vivo cleavable and enzymatiseb in vivo cleavable groups.
  • “Chemically in vivo cleavable” or “enzymatically cleavable in vivo” means that the linkers or groups in the bloodstream are stable and only at or in the target line by the changed there chemical or enzymatic environment (lower pH; increased glutathione concentration, presence of lysosomal enzymes such as proteases, or glycosidases such as ⁇ -glucuronidases) to cleave to release the low molecular weight KSP inhibitor or a derivative thereof.
  • the chemically in vivo cleavable groups are in particular disulfide, hydrazone, acetal and aminal; the enzymatically in vivo cleavable groups, in particular those which are cleavable by iysosomal enzymes, are in particular 2-8-oligopeptide group, in particular a tri- or dipeptide group or glycosides.
  • Peptide cleavage sites are disclosed in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, and Bioorganic & Medicinal Chemistry Ladders 8 (1998) 3341-3346 and Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626. These include, for example, Vahn alanine, valine lysine, valine ciiruilin, alanine lysine and phenylalanine lysine (possibly with additional amide grape).
  • the in vivo stable linkers are characterized by a high stability (less than 5% metabolites after 24 hours in plasma) and do not have the above-mentioned chemically or enzymatically cleavable groups in vivo.
  • the linker -L- preferably has one of the following basic structures D (i) to (iv):
  • the coupling may be to a tyrosine residue, glutamine residue or an unnatural amino acid of the antibody.
  • the unnatural amino acids may include, for example, aldehyde or keto groups (such as formytglycine) or azide or alkyne groups (see Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem. Rev. 2014, 1.14, 4764-4806 ).
  • Particularly preferred according to the invention is the linker basic structure (iii).
  • a conjugate according to the invention having a linker basic structure (iii) and coupling of the linker to a cysteine or lvsine residue of the antibody leads, by metabolization, to cysteine or lysine derivatives of the following formulas: wherein LI is in each case bound to the low molecular weight KSP inhibitor, for example a compound of the formula (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIca), (III), (He), ( Iii), (III) or (IV).
  • linker basic structure (i) when bound to position R4, in particular when m 0.
  • L2 is preferably derived from a group reactive with the sulfhydryl group of the cysteine.
  • groups include haloacetyls, maleimides, aziridines, acryloyls, arylating compounds, vinylsulfones, pyridyldisulfides, TNB-thiols and disulfide reducing agents.
  • These groups typically react electrophilically with the sulfhydryl bond to form a sulfide (e.g., thioether) or disulfide bridge. Preference is given to stable sulfide bridges.
  • L2 is preferable
  • # 'de notes the point of attachment to the sulfur atom of the antibody, if ⁇ denotes the point of attachment to the group L 1 , and
  • R 2 represents COOH, COOR, COR, CO HR, CONR 2 (with R each represents Cl-3-Aikyi), CONH 2, preferably COOH.
  • L2 is:
  • the bonds to a cysteine residue of the antibody are preferably more than 80%, more preferably more than 90% (in each case based on the total number of links of the linker to the antibody), particularly preferably in one of the two structures of the formula A3 or A4 ago.
  • the structures of the formula A3 or A4 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the antibody. The remaining bonds are then in the structure
  • LI is preferably represented by the formula
  • R 10 is H, NH 2 or C -C -alkenyl; - NN CO. , .
  • G 1 represents -NHCO-, -CONH- or ⁇ /; (R 10 is preferably not NH 2 when G 1
  • n 0 or 1
  • 0 is 0 or 1
  • G 2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms from arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the -O-, -S-, -SO-, SO 2 , -NRY-,
  • NRYCO- -C (NH) NRy-, -CONRY-, -NRYNRY-, -SO 2 NR>'NRy-, -CONRYNRy-, (wherein R y is H, phenyl, C 1 -C 12 -alkyl, C 2 -C i represents Q-alkenyl, or C 2 -C 10 -alkyl, each with
  • hydrocarbon chain including the side chains can be substituted with NHCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , sulfonamide, suifon, sulfoxide, or sulfonic acid.
  • G 2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 5 to
  • aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably
  • G2 is preferably a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups O-, -S-, -SO-, SO 2, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH-, -CR'HN- O- (where Rx is H, C3-C3-alkyl) or phenyl) and a 3 to 10-membered, eg 5 to 10-membered aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from, O and S, -SO- or -S02- may be interrupted (preferably
  • hydrocarbon chain including the side chains if present, with -NHCONH 2 , -COOK, -OH, -NH 2 , NH-C H 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • Rx is H, C j -C -Alkyi or phenyl.
  • n ⁇ is the binding to the KSP inhibitor and eats the binding to the coupling group to the antibody (e.g., L2).
  • a straight-chain or branched hydrocarbon chain comprising arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups generally comprises an .omega.-divalent alkyl radical having the respectively indicated number of carbon atoms.
  • alkylene groups in the hydrocarbon chain can also be branched, ie one or more H atoms of the abovementioned linear alkylene groups can optionally be substituted by C 1-10 -alkyl groups and thus form side chains.
  • the hydrocarbon chain can furthermore contain cyclic alkylene groups (cycloalkanediyl), for example 1,4-cyclohexanediyl or 1,3-cctopentanediyl. These cyclic groups can be unsaturated.
  • aromatic groups (arylene groups) may be present in the hydrocarbon group, for example phenylene.
  • one or more H atoms may optionally be substituted by C 1-10 -alkyl groups. It is thus formed a carbon hydrogen chain, which is optionally branched.
  • This hydrocarbon chain has a total of 0 to 100 carbon atoms, preferably 1 to 50, particularly preferably 2 to 25 carbon atoms.
  • the side chains can, if present, with -NHCONH 2 , -COOK, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 ,
  • the hydrocarbon chain can be mono- or polysubstituted, identically or differently, by -O-, -S-, -SO-, -SO 2, -H-, -CO-, X 1 ⁇ ( ⁇ ) ⁇ .
  • Heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -SO 2 - be interrupted (preferably
  • the linker corresponds to the following forms !:
  • ⁇ represents the binding to the binder peptide or protein
  • LI has the formula -NR 1 J B-, wherein
  • R 11 represents H or H 2 ;
  • B represents - ⁇ (CH 2 ) x - (X 4 ) y ] w - (CH 2 ) 2 -
  • X 4 is -O-, -CONH -, - NHCO- or represents.
  • Linker L preferred according to the invention has the following formula:
  • # 3 represents the binding to the drug molecule
  • # 4 represents binding to the binder peptide or protein
  • R 1 1 represents H or NH 2 ;
  • B represents - (CH 2 ) x - (X 4 ) y ! W - (CH 3 ) z -,
  • linkers are particularly preferred in conjugates of the formula (I) or (II) in which the linker attaches to R4 by substitution of an H atom on R i or in conjunction with a cleavable linker SGI, ie RI-L- # 1 or R4 -SG1-L- # 1, "where ff1 represents the binding to the antibody.
  • the bonds to a cysteine residue of the antibody are preferably more than 80%, particularly preferably more than 90% (in each case based on the total number of linker bonds to the antibody), particularly preferably in one of the two structures of the formula A5 or A6 before:
  • R 22 is COOH, COOR, COR, CONR 2, CONHR (where R is Cl-3-alkyl), CO is H 2 , preferably COOH.
  • the structures of the formula A5 or A6 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the antibody. The remaining bonds are then in the structure
  • linker -L- attached to a cysteine side chain or cysteine residue have the following formula:
  • ⁇ represents the binding to the drug molecule
  • ⁇ represents the binding to the binder peptide or protein
  • n 0, 3, 2, or 3;
  • n 0, 1 or 2;
  • p 0 to 2.0
  • o 0 or 1
  • Arylene groups and / or straight-chain and / or cyclic alkylene groups which are mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, SO 2, -NH-, -CO-, -NHCO-, - CO H, -NMe, -NHNH-, -SO 2 HNH-, -CONHNH- and a 3 to 1 Ogliedriger (preferably 5 to 1 Ogliedriger), aromatic or non-aromatic! Heterocycle may be interrupted with up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -SO 2 - (preferably
  • NH 2 , H-CNNH 2 , sulfonamide, suifon, sulfoxide or sulfonic acid may be substituted.
  • n 1;
  • n 0;
  • G represents """ ;
  • o 0 or 3
  • G 3 - (CH 2 CH 2 O) s (CH 2) t (CONH) u represents CH 2 CH 2 OMCH 2 V,
  • s, t, v and w are each independently 0 to 20, and u is 0 or 1.
  • Li in the above formula S- (CO) m-Ll-L2-Sections are the following, wherein each r independently of one another is a number from 0 to 20, preferably from 0 to 15, particularly preferably from 1 to 20, in particular preferably from 2 to 10:
  • linkers LI indicated in these lines are linked to a linker L2 which is selected from:
  • the bonds to a cysteine residue of the binder are preferably more than 80%, more preferably more than 90% (in each case based on the total number of bonds of the linker to the binder), particularly preferably in one of the two structures of the formula A7 or A8 before.
  • the structures of the formula A7 or A8 are generally present together, preferably in a ratio of 60:40 to 40:60, based on the number of bonds to the binder. The remaining bonds are then in the structure
  • conjugates with corresponding linkers have the following structures, wherein XI is CH, X2 C, and X3 N, and LI has the abovementioned meaning, L2 and L3 have the same meaning as LI, AK1 for a moderately agonistic or non-agonistic anti TWEAKR antibodies such as ITEM-4 and chimeric or humanized variants of ITEM-4 linked via a cysteine residue and n is a number from 1 to 10. More preferably AK 3 is a humanized or ebimeric anti-TWEAKR monoclonal ⁇ -4 antibody. Particularly preferred are the humanized or chimeric en ⁇ -4
  • the linker When the linker is attached to a lysine side chain or a lysine residue, it preferably has the following formula:
  • ⁇ represents the binding to the Wirkstoffrtiolekül
  • ⁇ represents the binding to the binder peptide or protein
  • SG is a cleavable group, preferably a 2-8 oligopeptide, especially, preferably a dipeptide,
  • L4 a single bond or a group! ( ' (>.! .- ⁇ 14-, where y is 0 or 1, and G4 is a straight or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups single or multiple by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, SO2, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHM 1-.
  • -S02NHNH -, -CONHNH- and a 5- to 10-membered aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -S02- may be interrupted (preferably
  • side chains if present, may be substituted by -NHCO H, -COOH, -OH, -H 2, H-CNNH 2, sulfonamide, sulfone, sulfoxide or sulfonic acid.
  • linkers to a lysine residue are given in the following Table B, in the table the preferred coupling site (R ! -R 5 ) is furthermore indicated. In the first column, the example numbers are given, in which find appropriate linker application.
  • conjugates with corresponding linkers have the following structures, wherein XI is CH, X2 C, and X3 N, and L4 have the meanings given above, AK2 for a moderately agonistic or non-agonistic anti-TWEAKR antibody such as ⁇ - 4 and chiral or humanized variants of ITEM-4 linked via a lysine residue and n is a number from 1 to 10. More preferably, AK2 is a humanized or chimeric monoclonal ITEM-4 anti-TWEAKR antibody. Particularly preferred are the humanized or chimeric ITEM-4 variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-7076.
  • X is H, a Ci-io-alkyl group, which may optionally be substituted by -NHCONH2, -COOH, -OH, NH 2 , H-CNNH2, or sulfonic acid.
  • these groups LI can be exchanged for one of the groups L i specified for the above formula ⁇ - (CO) m-L3 -L2- ⁇ . If L2 a Succinic amide is or derived therefrom, can vorleigen all or part of this amide in Fonn of hydroiy wholesome open-ended succinamide, as described above.
  • conjugates having the basic structure (i) have the following structure, where XI is CH, X2C, and X3 is N, L4 has the same meaning as LI, AK1 for a moderately agonist or non-agonist anti-TWEAKR antibody, such as ITEM 4 and chimeric or humanized variants of ⁇ -4 linked via a cysteine residue and n is a number from 1 to 10. More preferably, AK1 is a humanized or chimeric monoclonal ITEM-4 anti-TWEAKR antibody.
  • humamated or chimeric ITEM-4 variants TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-7076.
  • the conjugates according to the invention are prepared by initially providing the low molecular weight KSP inhibitor with a linker. The intermediate thus obtained is then reacted with the binder (preferably antibody).
  • cysteine-containing binder e.g. an antibody that may have been partially reduced, implemented:
  • R represents -H or -COOK
  • K is linear or branched, optionally substituted by Ci-Ce alkoxy or -OH-substituted C ⁇ Ce alkyl, and
  • XI CH, X2 C, and X3 is N, SGI, L I, L2, L3 and L4 have the same meaning as described above.
  • the tert-butyl group may be replaced by cyclohexyl.
  • the compound may be used, for example, in the form of its trifluoroacetic acid salt.
  • the antibody is preferably used in 2 to 12 fold molar excess over the binder.
  • lysine residue For the coupling to a lysine residue, one of the following compounds is preferably reacted with the lysine-containing binder such as an antibody:
  • reaction For an intermediate coupling to a lysine residue, the reaction may be as follows:
  • Siiccinimide-linked ADCs can be converted after conjugation into the open-chain succinic acid amides which have a favorable stability profile.
  • This reaction may be carried out at pH 7.5 to 9, preferably at pH 8, at a temperature of 25 ° C to 37 ° C, e.g. by stirring.
  • the preferred stirring time is 8 to 30 hours.
  • XI represents CH, X 2 C, and X 3 represents N; SG3 and LI have the same meaning as described above, and L2, L3 and L4 have the same meaning as LI; and R and K have the same meaning as described above.
  • AKi is a cysteine-linked, moderately agonist or non-agonist anti-TWEAKR antibody such as ⁇ -4 and chimeric or humanized variants of ITEM-4, and AK2 is a lysine-linked, moderately agonistic or non-agonistic anti-TWEAKR antibody.
  • TWEAK - Antibodies such as ⁇ -4 and chimeric or humanized variants of ITEM-4.
  • AK1 and AK2 are a humanized or chimeric monoclonal ITEM-4 anti-TWEAKR antibody. Particularly preferred are the humanized or chimeric ITEM-4 variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-70.
  • ITEM-4 is an anti-TWEAKR antibody available from Nakayama ei al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res. Comm., 306: 819-825). Humanized variants of this antibody based on CDR conversion are described by Zhou et al., (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol., 133 (4): 1052-62) and WO 2009/020933.
  • the conjugation of the toxophore to the antibody is preferably via one or more sulfur atoms of cysteine residues of the antibody and / or via one or more NH groups of lysine residues of the antibody.
  • the antibody can be linked via a linkage with the linker.
  • the linking of the antibody can be carried out by means of a heteroatom of the binder.
  • Heteroatoms of the invention which can be used for linking are sulfur (in one embodiment via a sulfhydryl group of the antibody), oxygen (according to the invention by means of a carboxyl or hydroxyl group of the antibody), and nitrogen (in a well form via a primary or secondary amine or amide group of the antibody). These heteroatoms may be present in the natural antibody or introduced by chemical or molecular biology methods.
  • the linkage of the antibody with the toxophore has only a small influence on the binding activity of the antibody to the target molecule. In a preferred embodiment, the linkage has no influence on the binding activity of the antibody to the target molecule.
  • an immunoglobulin molecule preferably comprises a molecule having four polypeptide chains, two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains), which are typically linked by disulfide bridges.
  • Each heavy chain comprises a heavy chain variable domain (abbreviated VH) and heavy chain constant domain.
  • the heavy chain constant domain may include three domains CHI, CH2 and CH3.
  • Each light chain comprises a variable domain (abbreviated VL) and a constant domain.
  • the constant domain of the light chain comprises a domain (abbreviated to CL).
  • the VH and VL domains can be further subdivided into regions of hypervariability, also called complementarity determining regions (abbreviated to CDR) and regions of lower sequence variability (FR).
  • CDR complementarity determining regions
  • FR regions of lower sequence variability
  • Each VH and VL region typically consists of three CDRs and up to four FRs.
  • An antibody can be obtained from any suitable species, eg, rabbit, llama, camel, mouse, or rat.
  • the antibody is of human or murine origin.
  • An antibody can be, for example, human, humanized or chiniär.
  • monoclonal antibody refers to antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i. Individual antibodies of the population are identical except for naturally occurring mutations which can occur in small numbers. Monoclonal antibodies recognize with high specificity a single antigenic binding site. The term monoclonal antibody does not refer to a particular manufacturing process,
  • the term "intact" antibody refers to antibodies comprising both an antigen-binding domain and the light and heavy chain constant domain
  • the constant domain may be a naturally occurring domain, or a variant thereof in which multiple amino acid positions are altered were.
  • modified intact antibody refers to intact antibodies that have been fused to another non-antibody polypeptide or protein through their amino acid or carboxy-terminus via a covalent bond (eg, a peptide linkage) modified to introduce reactive cysteines at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008, 26 (8): 925-32),
  • human antibody refers to antibodies that can be obtained from a human or are synthetic human antibodies
  • a "synthetic" human antibody is an antibody, in part or in full, of synthetic sequences available in silico based on the analysis of human antibody sequences.
  • a human antibody may be encoded by a nucleic acid isolated from a library of antibody sequences of human origin.
  • An example of such antibodies is in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18: 853-856.
  • humanized or chimeric antibody describes antibodies consisting of a non-human and a human sequence portion. In these antibodies, part of the sequences of the human immunoglobulin (recipient) is replaced by sequence portions of a non-human immunoglobulin (donor).
  • the donor is a murine immunoglobulin in many cases.
  • amino acids of the CDR of the recipient are replaced with amino acids of the donor. Sometimes amino acids of the framework are replaced by corresponding amino acids of the donor.
  • the humanized antibody contains amino acids that were not contained in either the recipient or the donor and that were inserted during optimization of the antibody.
  • amino acids of the CDR of the donor are replaced by corresponding amino acids of the recipient, if they do not contribute to antibody binding and are potentially immunogenic.
  • the variable domains of the donor immunoglobulin are fused to the constant regions of a human antibody.
  • CDR complete identity determining region
  • Each variable region typically has three CDR regions, referred to as CDR !, CDR2 and CDR3.
  • Each CDR region may comprise amino acids as defined by Kabat and / or amino acids of a hypervariable loop defined by Chotia.
  • the Kabat definition includes, for example, the region of approximately amino acid position 24-34 (CDRi), 50-56 (CDR2) and 89-97 (CDR3) of the variable light chain and 31-35 (CDRI), 50-65 (CDR2).
  • CDR3 variable heavy chain Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
  • the definition according to Chotia includes the region of approximately amino acid position 26-32 (CDRI), 50-52 (CDR2) and 91-96 (CDR3) of the variable light chain and 26-32 (CDRI), 53-55 (CDR2). and 96-101 (CDR3) of the variable heavy chain Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)).
  • a CDR may comprise amino acids from a CDR region as defined by Kabat and Chotia.
  • antibodies can be divided into different classes. There are five major classes of intact antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, with several of them subclassing can be broken down. (Isotypes), eg IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2.
  • the heavy chain constant domain corresponding to the different classes are referred to as [alpha / a], [deita / ⁇ ], [epsilon / ⁇ ], [gamma / ⁇ ] and [my / ⁇ ]. Both the three-dimensional structure and the subunit structure of antibodies are known.
  • the term "functional fragment” or "antigen-binding antibody fragment” of an antibody / antianglobulin is defined as a fragment of an antibody of immunoglobulin (e.g., the variable domains of an IgG) which still comprises the antigen binding domains of the antibody / immunoglobulin.
  • the "antigen binding domain" of an antibody typically comprises one or more hypervariable regions of an antibody, eg the CDR, CDR2 and / or CDR3 region
  • the "framework” or “framework” region of an antibody may also bind to the antibody
  • the antigen binding domain comprises at least amino acids 4 to 103 of the variable light chain and amino acids 5 to 109 of the variable heavy chain, more preferably amino acids 3 to 107 of the variable light chain Chain and 4 to 11 of the variable heavy chain, particularly preferred are the complete variable light and heavy chains, so amino acid 1 - 109 of the VL and 1 to 113 of the VH (numbering according to WO97 / 08320).
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” of the invention include but are not limited to Fab, Fab ', Fiab') and Fv fragments, diabodies, single domain antibodies (DAbs), linearae antibodies, single chain antibodies (single-chain Fv, abbreviated scFv) and multispecific, such as bi- and tri-specific, antibodies formed from antibody fragments CA K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press, R. Kontermann & S.
  • Antibodies other than “multi-specific” or “nuituitive” are those with identical binding sites
  • Mole-specific antibodies may be specific for different epitopes of an antigen or specific for epitopes of more than one antigen (see, for example, WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, WO 92/05793, Tutt, et al, 1991, J. Immunol 147: 60 69, US Pat. 4,474,893; 4,7 14,68 3; 4,925,648; 5,573,920; 5,601.8 19; or Kostelny et al., 1992, 1 Immunol. 148: 1547 1553).
  • An F (ab ') 2 or Fab molecule can be designed to reduce or completely prevent the number of intermolecular disulfide interactions that occur between the Chi and CL domains.
  • Epiopic determinants refers to protein determinants that can specifically bind to an immunoglobulin or T cell receptor Epiopic determinants usually consist of chemically active surface groups of molecules such as amino acids or Sugar side chains, or combinations thereof, and typically have specific 3-dimensional structural properties as well as specific charge characteristics.
  • “Functional fragments” or “antigen-binding antibody fragments” may be fused to another non-antibody polypeptide or protein via their amino terminus or carboxy terminus via a covalent bond (e.g., a peptide linkage). Furthermore, antibodies and antigen-binding fragments can be modified by introducing reactive cis- stes at defined sites to facilitate coupling to a toxophore (see Junutula et al., Nat Biotechnol., 2008 Aug; 26 (8): 925- 32).
  • Polyclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art (Köhler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
  • Humanized human monoclonal antibodies can be prepared by methods known to those of ordinary skill in the art (Olsson et al., Meth Enzymol., 92, 3-16 and Cabilly et al., US 4,816,567 or Boss et al., US 4,816,397).
  • Antibodies of the invention can be obtained from recombinant antibody libraries, e.g. consists of the amino acid sequences of a variety of antibodies generated from a large number of healthy volunteers. Antibodies can also be made by known recombinant DNA technology. The nucleic acid sequence of an antibody can be obtained by routine sequencing, or is available from publicly available databases.
  • an “isolated” antibody or binder has been purified from other components of the cell Contaminating components of a cell which may interfere with a diagnostic or therapeutic use are, for example, enzymes, hormones, or other peptidic or non-peptide components of a cell an antibody or binder that has been purified to more than 95% by weight of the antibody or binder (determined, for example, by Lowry method, UV-Vis spectroscopy, or by SDS capillary gel electrophoresis) and an antibody that has been purified to such an extent at least fifteen amino acids of the amino terminus or an internal amino acid sequence can be determined or purified to homogeneity, the homogeneity being determined by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions (the detection can be carried out using Coomassie Blue Aniarbung or preferably determined by silver staining).
  • an antibody is usually produced by one or more purification steps.
  • ⁇ refers to an antibody or binder that binds to a predetermined antigen / target molecule. Specific binding of an antibody or binder typically describes an antibody or binding with an affinity of at least 10 "7 M als.Kd value ⁇
  • the antibodies preferably have an affinity of at least 10 '' 'M (as Kd value, so preferably those with smaller Kd values as ICR 7 M)., preferably at least 1 0-8 M, particularly preferably in the range of 10 " 9M to 10 " HM.
  • Kd values can be determined by, for example, OberQetzenplasmonresonanzspektroskopie.
  • the Antikö he-drug conjugates according to the invention also have affinities in these areas.
  • the conjugation of the active ingredients preferably does not significantly affect the affinity (as a rule, the affinity is reduced by less than an order of magnitude, that is, for example, maximally from ⁇ "8 M to ⁇ " 7 M).
  • the antibodies used according to the invention are furthermore preferably characterized by a high selectivity.
  • a high selectivity is present when the antibody according to the invention has an affinity to the target protein which is at least a factor of 2, preferably a factor of 5 or more preferably a factor of 10 than of an independent other antigen, e.g. human serum albumin (the affinity can be determined, for example, by surface plasmon resonance spectroscopy).
  • the antibodies used according to the invention are preferably cross-reactive.
  • the antibody used according to the invention binds not only the human target protein but also in the species used for the studies the species target protein binds, in one embodiment the antibody used according to the invention is, in addition to the human target protein, cross-reactive to the target protein of at least one other species.
  • species of the family rodents, dogs and non-human primates are preferably used. Preferred rodent species are mouse and rat.
  • Preferred non-human primates are rhesus monkeys, chimpanzees and long-tailed macaques.
  • the antibody used according to the invention is cross-reactive with the target protein of at least one other species selected from the group of species consisting of mouse, rat and long-tailed macaque (Macaca fascicularis).
  • antibodies used according to the invention which, in addition to the human target protein, are at least cross-reactive with the mouse target protein.
  • the target molecule against which the binder e.g. an antibody or antigen-binding fragment thereof, a rebs target molecule.
  • the term "cancer target molecule” describes a target molecule that is more abundant on one or more types of cancer compared to non-cancerous cells of the same tissue type, Preferably, the cancer targeting molecule is on one or more types of cancer cells compared to non-cancerous cells of the same tissue type selectively present, selectively expressing at least two-fold accumulation on cancer cells compared to non-cancer cells of the same tissue type (a "selective cancer target molecule").
  • selective cancer target molecule allows the selective therapy of cancer cells with the conjugates of the invention.
  • TWEAKR extacellular cancer target molecule
  • the cancer target molecule TWEAKR human ortholog NCBI Gene ID: 51330
  • TNFRSF12A lumor necrosis factor receptor superfamily member 12A
  • FN14 FN14
  • CD266 CD266
  • anti-TWEAKR antibody or "an antibody that specifically binds to TWEAKR” refers to an antibody that contains the cancer target TWEAKR (SEQ ID NO: 101 (protein)) for diagnostic and / or therapeutic use Affinity binds.
  • the binding of an anti-TWEAKR antibody to a TWEAKR-unrelated protein is less than 10% of the binding of the antibody to TWEAKR, as determined, for example, by surface plasmon resonance spectroscopy.
  • the antibody TWEAKR (SEQ ID NO: 101 (protein)) binds with a dissociation constant (K D ) of ⁇ ⁇ , ⁇ 100 nM, ⁇ 10 nM, ⁇ 1 nM, ⁇ 0.1 nM, ⁇ 0.01 nM, or ⁇ 0.001 nM.
  • the anti-TWEAKR antibody binds to an epitope conserved between different species.
  • Antibodies that bind cancer targeting molecules can be prepared by those of ordinary skill in the art by known methods such as chemical synthesis or recombinant expression. Cancer target binders can be purchased commercially or can be prepared by one of ordinary skill in the art by known methods such as chemical synthesis or recombinant expression.
  • Harlow et al. (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881, Paul [Ed.]), Fundamental irnunnology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)), and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998).)
  • Those skilled in the art are familiar with the corresponding vectors, promoters and signal peptides necessary for the expression of a protein / antibody.
  • an anti-TWEA R antibody or an antigen-binding fragment thereof is used, preferably one selected from those described below or modified by a suitable mutation.
  • those skilled in the art are aware of antibodies that bind to TWEA R, see e.g. Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res. Comm., 306: 819-825; Zhou et al, 2013, J luvest Dermatol. 133 (4): 1052-62; WO2009 / 020933 (A2), WO2009140177 (A2) or WO2014 / 198817 (AI).
  • the invention particularly relates to conjugates with moderately agonistically or non-agonistally active anti-TWEA antibodies or antigen-binding antibody fragments thereof or variants thereof which are based on mouse-derived antibody ITEM-4 (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res. 306: 819-825).
  • ⁇ -4 is an anti-TWEAKR antibody of Nakayama et al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res. Comm., 306: 819-825).
  • the sequences of the variable regions (VH and VL) of ITEM-4 were described in Zhou et al. (Zhou et al., 2013, I luvest Dermatol., 133 (4): 1052-62).
  • the ITEM-4 and the humanized or chimeric variants of this antibody are, depending on the assay system used, an antagonist or a moderately agonistic antibody.
  • the antagonistic effect is unfolded only in the presence of Tweak.
  • NFKB signal transduction cascade NFKB signal transduction cascade
  • an anti-TWEAKR antibody compared to human tweak present at 200 ng / ml (100% value) is used in a ⁇ assay less than 80%, less than 50%, less than 25%, less than 20% or less than 15% of activation at a maximum of 30 ng / ml anti-TWEAKR antibody concentration shows.
  • ⁇ assays The person skilled in the art knows such ⁇ assays.
  • non-agonistic or “non-agonist” ⁇ - ⁇ ⁇ - ⁇ ⁇ is intended to refer to an anti-body exhibiting 0% of the activation at a maximum of 30 ⁇ / ⁇ 1 concentration in such an ⁇ ⁇ assay.
  • NFxB assays By way of example, such an assay is shown in the exemplary embodiments.
  • the anti-TWEAKR antibody also acts antagonistically when such an assay is performed in the presence of Tweak (the ligand).
  • variable regions VH and VL of the ITEM-4 linking the variable regions VH and VL of the ITEM-4 with the constant regions (GL, CHI, CH2, CH3) of a human IgG1 of the kappa subtype yields the sequences of the chimeric antibodies "TPP-7006" and "TPP-7074".
  • ITEM-4 is a mouse TgG2b antibody from vo akayama et al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res. Comm., 306: 819-825). ITEM-4 can be obtained commercially from several Finns (inter alia from eBioscience as 13-901 8).
  • TPP-7006 and TPP-7074 are chimeric variants of ITEM-4 in which the VH and VL variable regions are linked to the constant regions (CL, CHI, CH2, CH3) of a human kappa subtype IgG1.
  • TPP-7007, TPP-7053, TPP-7005, TPP-7073, TPP-7075 and TPP-7076 are humanized variants of ITEM-4 as a subtype of human IgG1 kappa.
  • antigenic anti-TweakR antibodies (ITEM-4", “TPP-7006”, “TPP-7007”, “TPP-7053”, “TPP-7005", “TPP-7073”, “TPP-7074”, “ TPP-7075 “and” TPP-7076 "), irrespective of their non-agonistic or mederat agonistic activity, represent a preferred embodiment of the anti-TWEAKR antibody for coupling with linkers and / or toxophores according to the invention.
  • the anti-TWEAKR antibodies can be used.
  • Antibody act as antagonists in the presence of the ligand tweak.
  • TPP-7005 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 9 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 10.
  • TPP-7006 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 19 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 20.
  • TPP-7007 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 29 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 30.
  • TPP-7053 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 39 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 40.
  • TPP-7065 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 49 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 50.
  • TPP-7073 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 59 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 60.
  • TPP-7074 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 69 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 70.
  • TPP-7075 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 79 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 80.
  • TPP-7076 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 89 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 90.
  • TPP-7077 is an antibody comprising a heavy chain region corresponding to SEQ ID NO: 99 and a light chain region corresponding to SEQ ID NO: 300.
  • TPP-7005 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 5.
  • TPP-7006 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 11 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 15.
  • TPP-7007 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 21 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 25.
  • TPP-7053 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 31 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 35.
  • TPP-7065 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 41 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 45.
  • TPP-7073 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 51 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 55.
  • TPP-7074 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 61 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 65.
  • TPP-7075 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 71 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 75.
  • TPP-7076 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 81 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 85.
  • TPP-7077 is an antibody comprising a heavy chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 91 and a light chain variable region corresponding to SEQ ID NO: 95.
  • Toxophores are the following antibodies:
  • the antibody ⁇ -4 a mouse IgG2b antibody described by Nakayama et al. (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res. Comm., 306: 819-825).
  • An antibody or antigen-binding fragment that binds to TWEAKR comprising: a variable heavy chain comprising the heavy chain variable CDR1 sequence as represented by SEQ ID NO: 2, the heavy chain CDR2 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 3 and the heavy chain variable CDR3 sequence as represented by SEQ ID NO: 4, and a variable light chain comprising the variable CDR1 light chain variable sequence represented by SEQ ID NO: 6, the variable CDR2 sequence of the light chain represented by SEQ ID NO: 7 and the light chain variable CDR3 sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a variable heavy chain comprising the variable CDR1 heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 12, the heavy chain CDR2 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 13 and the CDR3 heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 14, and a variable light chain comprising light chain variable CDR1 sequence represented by SEQ ID NO: 16, the light chain variable CDR2 sequence represented by SEQ ID NO: 17, and the light chain variable CDR3 sequence represented by SEQ ID NO
  • the CDR1 light chain sequence is represented by SEQ ID NO: 56, the light chain variable CDR2 sequence represented by SEQ ID NO: 57, and the light chain variable CDR3 sequence represented by SEQ ID NO: 58 or a variable heavy Chain comprising the heavy chain variable CDRI sequence as shown by.
  • SEQ ID NO: 62 the heavy chain CDR2 variable sequence as represented by SEQ ID NO: 63 and the CDR3 heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 64, and a variable light chain comprising the variable
  • the antibody or antigen binding fragment thereof according to Embodiment 3 comprising: a heavy chain variable sequence; as represented by SEQ ID NO: i, and a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 5 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 11, as well as a variable light chain sequence, as shown by SEQ ID NO: 15 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 21, as well as a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 25 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 31 and a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 35 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 51, as well as a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 55 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 61 and a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 65 or a heavy chain variable sequence as represented by SEQ ID NO: 71, and a light chain variable sequence as represented by SEQ ID NO:
  • the antibody according to any of the preceding embodiments comprising: a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 9, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 10 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 19, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 20 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 29, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 30 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 39, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 40 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 59, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 60 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 69, and a sequence of the present invention light chain as represented by SEQ ID NO: 70 or a heavy chain sequence as represented by SEQ ID NO: 79, and a light chain sequence as represented by SEQ ID NO: 80 or a heavy chain sequence such as represented by SEQ ID NO: 89, and
  • the antibody according to one of the preceding embodiments comprising: the antigen-binding fragment according to one of the preceding embodiments or an antigen-binding fragment of an antibody according to one of the preceding embodiments which contains an scFv, Fab, Fab * fragment or an F (ab) 2 fragment is.
  • the antibody or antigen-binding fragment according to any one of the preceding embodiments which is a human, humanized or chimeric antibody or antigen-binding fragment.
  • anti-TWEAK antibodies "TPP-7005", “TPP-7006", “TPP-7007", “TPP-7053”, “TPP-7073”, “TPP-7074”, “TPP-7075” and “TPP-7076”.
  • the present invention also includes all suitable isotopic variants of the compounds of the invention.
  • An isotopic variant of a compound according to the invention is understood here to mean a compound in which at least one atom within the compound according to the invention acts against another atom of the same atomic number, but with a different atomic mass than usual or predominantly occurring in nature
  • isotopes which can be incorporated into a compound of the invention are those of hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, phosphorus, sulfur, fluorine, chlorine, bromine and iodine, such as ⁇ (deuterium), 3 H (tritium ), 13 C, 14 C, N ,!
  • Certain isotopic variants of a compound of the invention may be useful, for example for the study of the mechanism of action or drug distribution in the body; because of the comparatively easy production and detectability, compounds labeled with H or 14 C isotopes are particularly suitable for this purpose.
  • isotopes such as deuterium may result in certain therapeutic benefits as a result of greater metabolic stability of the compound, such as prolonging the body's half-life or reducing the required effective dose;
  • isotopic variants of the compounds according to the invention can be prepared by the methods known to those skilled in the art, for example by the methods described below and reproduced in the Auslanderangsbeiard regulations by appropriate isotopic modifications of the respective reagents and / or starting compounds are used.
  • Salts used in the context of the present invention are physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention. Also included are salts which are themselves unsuitable for pharmaceutical applications but can be used, for example, for the isolation or purification of the compounds of the invention.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds of the invention include acid addition salts of mineral acids, carboxylic acids and sulfonic acids, e.g. Salts of hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, phosphoric, methanesulfonic, ethanesulfonic, benzenesulfonic, toluenesulfonic, naphthalenedisulfonic, acetic, trifluoroacetic, propionic, lactic, tartaric, malic, citric, fumaric, maleic and benzoic acids.
  • Salts of hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, phosphoric, methanesulfonic, ethanesulfonic, benzenesulfonic, toluenesulfonic, naphthalenedisulfonic acetic, trifluoroacetic, propionic, lactic, tartaric, malic, citric, fumaric, maleic and benzoic acids.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention also include salts of customary bases, by way of example and by way of preference alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts) and ammonium salts derived from ammonia or organic amines having 1 to 16 C atoms, as exemplified and preferably ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, Diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, A'-methylpiperidine, jV-methylmorpholine, arginine, lysine and 1,2-ethylenediamine.
  • alkali metal salts for example sodium and potassium salts
  • alkaline earth salts for example calcium and magnesium salts
  • ammonium salts derived from ammonia or organic amines having 1 to
  • Solvates in the context of the invention are those forms of the compounds according to the invention which form a complex in the solid or liquid state by coordination with solvent molecules. Hydrates are a special form of solvates that coordinate with water. As solvates, hydrates are preferred in the context of the present invention.
  • the present invention also includes prodrugs of the compounds of the invention.
  • prodrugs refers to compounds which themselves may be biologically active or inactive, but are converted during their residence time in the body to compounds of the invention (for example metabolically or hydrolytically).
  • the binder is a moderately agonistically or non-agonistally active anti-TWEAKR antibody (most preferably a humanized or chimeric monoclonal ITEM-4 anti-TWEAKR antibody, especially the humanized or chimeric ITEM Variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-7076), and n is a number from 1 to 10:
  • the antibody is preferably a humanized or chimeric monoclonal ITEM-4 anti-TWEAKR anticoiper. Particularly preferred are the humanized or chimeric ⁇ -4 variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-70.
  • A is CO (carbonyl);
  • R and R 4 are H, or R and R 4 are genieninsam (to form a pyrrolidine ring) -CH 2 -CHR 11 - or -CHR U -CH 2 - represent, wherein R 10 is H or F;
  • R 3 -L- # 1 or a Cl-10-alkyl which if necessary, with -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-alkyl, NH-CO Alkyl, NH-CO-NH-alkyl, S (0) n- alkyl, SO 2 -NH-alkyl, NH-alkyl, N (alkyl) 2 , or NH2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C1-3 alkyl );
  • R ⁇ is H or F
  • R 6 and R ? represent -A -alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-4 Aikinyl, hydroxy or halogen - independently of one another H, (optionally fluorinated) Ci-3-Alkyi, (optionally fluorinated) C 2;!
  • R 8 is a branched Ci-s-AUcyl group
  • R 9 is H or F, where one of the substituents R ! and R 3 represents -L- # 1, and L is the linker and ff l is the bond to the antibody, as well as salts, solvates and salts of the solvates of the ADCs.
  • the linker is preferably a linker
  • n 0 or 1
  • ⁇ represents the binding to KSP
  • ⁇ represents the binding to the antibody
  • R 3 0 H, M i. or C 1 -C 3 -alkyl
  • G represents -NHCO- or ⁇ ?? /; n is 0 or 3;
  • 0 is 0 or 1
  • G 2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH- and a 3 to
  • - NN CO selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably ⁇ /), the side chains, if present, with - HCONH 2 , -COOH, -OH, -NH 2 , NH-CNNH 2 , Sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted.
  • the binding is to the KSP inhibitor and eats the binding to the coupling group to the antibody (e.g., L2).
  • the antibody e.g., L2
  • KSP-L- is a compound of the following formula (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (31c), (Ild), (He), (IIIf), (Iii) (Ilj), (Ilk) or the following formula (IIa)
  • the binder is a moderately agonistically or non-agonistally active anti-TWEAKR antibody (more preferably a humanized or chimeric anti-TWEAKR monoclonal antibody, in particular the humanized or chimeric ⁇ -4 variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-7076), and n is a number from 1 to 10 : Forme! (Hg):
  • A is CO (carbonyl);
  • R and R 4 are H, or R 2 and R 4 together represent (to form a pyi-tolidine ring) -CH 2 -CHR i [ - or -CHR n -CH 2 -, wherein R "represents H;
  • R 3 -L- # l or a Ci- 10 alkyl which optionally with OH, O-alkyl, SH, S-Alkyi, O-CO--alkyl, O-CO- NH-CO- H-alkyl Alkyl, NH-CO-NH-A Ikyl, S (0) n- alkyl, S0 2 - H-Aikyl, NH-alkyl, N (alkyl) 2 , or H 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C1-3 alkyl means);
  • R 5 is H or F
  • R 6 and R 7 are independently H, (optionally fluorinated) Ci-3-alkyl, (optionally fluorinated) C 2 -4-A! -Alkenyl, (optionally fluorinated) C2 -4 alkynyl, hydroxy or halogen ;
  • R 8 is a branched Ci-s-alkyl group
  • n 0 or 1
  • ⁇ represents the binding to the antibody
  • R 10 is LiX or C 1 -C 3 alk-1
  • n 0 or 3;
  • G 2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or eyklic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -Me-, -NHNH-, -SO 2 HNH-, -CO HNH-, and a 3 to 10-membered, aromatic or non-aromatic heterocycle of up to 4 heteroatoms
  • N-CO- selected from N, O and S, or -SO- may be interrupted (preferably ⁇ /), the side chains, if present, with -NHCONH 2 , -COOK, -OH, -NH 2 , NH-CMNH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid may be substituted,
  • # 1 is the binding to the KSP inhibitor and # ⁇ the binding to the coupling group to the antibody
  • KSP-L- is a compound of the following formula (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IM), (Ile), (III), (IIg); (III), (IIj), (ILK) or the following formula (IIh)
  • the binder is a moderately agonistic or non-agonistic anti-TWEAKR antibody (most preferably a humanized or chimeric monoclonal ITEM-4 anti-TWEAKR antibody in particular the humanized or chimeric ⁇ -4 variants: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-7076), and n is a number of 1 to 10 is:
  • A is CO (carbonyl); -L- # l is;
  • R 2 and R 4 are H, or R and R 4 together (to form a pyrrolidine ring) represent -CEb-CHR 1 '- or -CHR 1 [ -CH 2 -, wherein R 1 1 represents H;
  • R 3 is a Ci-io-Aikyl-, optionally with -OH, O-alkyl, SH, S-alkyl, O-CO-alkyl, O-CO-NH-Aikyl, NH-CO-alkyl, NH-CO -NH-alkyl, S (0) n -alkyl, S0 2 -NH-alkyl, ⁇ -alkyl, N (A! Kyl) 2 , or NH 2 may be substituted (wherein alkyl is preferably C> -j Aikyl), or -MOD is;
  • R '° is H or Ci-C r alkyl
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain and / or branched hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -
  • R 5 is H or F
  • R 6 and R ? independently of one another are H, (optionally fluorinated) C 1-3 -alkenyl (optionally fluorinated) C 2-6 alkenyl, (optionally fluorinated) C 2-4 -alkynyl, hydroxyl or halogen;
  • R 8 is a branched Ci-s-alkyl group
  • R 9 is H or F, where -L is the linker and # 1 is the bond to the antibody,
  • n 0 or 1
  • ⁇ represents the binding to KSP
  • ⁇ represents the binding to the antibody
  • n 1 denotes the point of attachment to the group L 1
  • LI represents the formula
  • R 10 is H, NH 2 or C 1 -C 3 alkyl
  • gl represents:
  • n 0 or 1
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which is mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO 2 NHNH-, -CONHNH-, -CR 'NO- (where Rx is H, C 1 -C 4 alkyl or phenyl) and a 3 to 10-membered, aromatic or non-aromatic heterocycle having up to 4 heteroatoms selected from N, O and S, -SO- or -
  • S02- can be interrupted (preferably ⁇ /), wherein Kohienwasserstofikette including, the side chains, if any, substituted with -NHCONH 9 , -COOH, -OH, - H 2 , H-C NH 2 , sulfonamide, sulfone, sulfoxide, or sulfonic acid could be,
  • # '- the binding to the SP inhibitor and / - the binding to the coupling group to the antibody is (e.g., L2),
  • the invention also provides binder-drug conjugates of the following general formula: BINDER Lr-fWS
  • BINDER is for the moderately agonistically or non-agonistically active anti-TWEAKR antibody (particularly preferably a humanized or chimeric monoclonal ITEM-4 anti-TWEAKR antibody, in particular the humanized or chimeric ITEM-4 variants: TPP-7005, TPP- 7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 and TPP-7076), L for the linker, WS for the active ingredient, preferably a KSP inhibitor, such as an inventive KSP inhibitor of one of the formulas (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (iid), (He), (Ilf), (ilg), (Ilh ) (Iii), m is a number from 1 to 2, preferably 1, and n is a number from 1 to 50, preferably 1.2 to 20 and more preferably 2 to 8, wherein L has one of the following structures.
  • m is the
  • WS is an active substance which shows therapeutic effect in animals, preferably humans, a local or systemic effect.
  • active ingredients generally have a molecular weight of less than 5 kDa, preferably less than 1.5 kDa.
  • Preferred active ingredients are vinca alkaloids, auristatins, tubuiysines, duocarmycins, kinase inhibitors, MEK inhibitors and KSPTnhibitoren,
  • Formula A4 where # 'denotes the linkage site with the sulfur atom of the binder, # denotes the linking site with the active ingredient, x represents 1 or 2, and R 22 denotes COOK, COOR, COR (with R in each case denotes Cl-3-alkyl), CONH 2, Br , preferably COOK represents.
  • ⁇ Ll - # 2 is represented by the following formula:
  • R 10 is H, NH 2 or Ci-C alkyl
  • G represents -NHCO-, -CONH- or ____J; (where if Gl NHCO or
  • ⁇ / represents, RIO is not NH2)
  • n 0 or 3;
  • o 0 or 1
  • G2 is a straight-chain or branched hydrocarbon chain having 1 to 100 carbon atoms of arylene groups and / or straight-chain and / or branched and / or cyclic alkylene groups which are mono- or polysubstituted by one or more of the groups -O-, -S-, -SO- , SO?., -NR? -, -
  • Rx is H, C-C ⁇ -alkyl or phenyl.
  • the bonds to a cysteine residue of the antibody are preferably more than 80%, particularly preferably more than 90%, particularly preferably (based on the total number of linker bonds to the antibody) one of the two structures of the formula A3 or A4 ago.
  • conjugals with the linkers of the forms! A3 or A4 can be obtained by coupling the antibodies to the corresponding bromo derivatives of the following formulas A3 'or A4':
  • bromo derivatives of formula A3 'and A4' may be 22 CHB1 H2COOH obtained with an amine group of the binder by the reaction of R22CH2CHB1-COOH or R, as illustrated by way of example in the following schemes 30 to 32.
  • the invention also provides B-drug conjugates of the following general formula

Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft neue Binder- Wirkstoff-Konjugate (ADCs), wirksame Metabolite dieser ADCs, Verfahren zur Herstellung dieser ADCs, die Verwendung dieser ADCs zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser ADCs zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.

Description

Antiköiper-Wirkstoff-Konj ugate (ADCs) von KSP-Inhifoitoren mit an ti-TWEAKR- Antikörpern
Einleitung und Stand der Technik
Die Erfindung betrifft Binder- Wirkstoff-Konjugate (ADCs) von Kinesin Spindel Protein- Inhibitoren, wirksamer Metabolite dieser ADCs, Verfahren zur Herstellung dieser ADCs, die Verwendung dieser ADCs zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser ADCs zur Herstellung von Arzneirnittein zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen. Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.
Krebserkrankungen sind die Folge unkontroll ierten Zellwachstums verschiedenster Gewebe. In vielen Fällen dringen die neuen Zellen in bestehende Gewebe ein (invasives Wachstum), oder sie rnetastasieren in entfernte Organe. Krebserkrankungen treten in verschiedensten Organen auf und haben oft gewebespezifische Krankheitsverläufe. Daher beschreibt die Bezeichnung Krebserkrankung als Oberbegriff eine große Gruppe definierter Erkrankungen verschiedener Organe, Gewebe und Zelltypen.
Tumore früher Stadien lassen sich gegebenenfalls durch chirurgische und radiotherapeutische Maßnahmen entfernen. Metastasierte Tumore können im Regelfall durch Chemotherapeutika nur palliativ therapiert, werden. Ziel hierbei ist, die optimale Kombination aus einer Verbesserung der Lebensqualität und der Verlängerung der Lebenszeit zu erreichen.
Konjugale von Bmderproleinen mit einem oder mehreren Wirkstoffniolekülen sind bekannt, insbesondere in Form sogannter „antibody drug conjugates" (ADCs), in welchen ein internalisierender, gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichteter Antikörper auf kovalente Weise über eine Verknüpfongseinheit ("linker") mit einem zytotoxisch wirkenden Agens verbunden ist. Nach Einschleusung des ADCs in die Tumorzelle und anschließender Spaltung des Konjugats wird dann innerhalb der Tumorzelle entweder das zytotoxische Agens selbst oder ein anderer daraus gebildeter zytotoxisch wirksamer Metabolit freigesetzt, und kann dort seine Wirkung direkt und selektiv entfalten. Auf diesem Wege könnte die Schädigung von normalem Gewebe im Vergleich zu einer konventionellen Chemotherapie der Krebserkrankung in signifikant engeren Grenzen gehalten werden [siehe z.B. J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu und P. D. S enter, Nat. Biotechnol. 23, 1 137- 3 146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Cnern. 21, 5-13 (2010)1, So beschreibt WO2012/171020 ADCs, bei denen mehrere Toxophormoleküle über einen polymeren Linker mit einem Antikörper verknüpft ist. Als mögliehe Toxophore werden in WO2012/171020 unter anderem die Substanzen SB 743921, SB 715992 (Ispinesib), MK-0371 , AZD8477, AZ3146 und ARRY-520 erwähnt.
Die zuletzt genannten Substanzen sind sogenannte Kinesin Spindel Protein-Inhibitoren. Kinesin Spindel Protein (KSP, auch bekannt als Eg5, HsEg5, KNSL1 oder KIF1 1) ist ein Kinesin-ähnliches Motorprotein, welches für die Funktion der bipolaren mitotischen Spindel essentiell ist. Die Inhibierung von KSP fuhrt zum mitotischen Stillstand und über einen längeren Zeitraum zur Apoptose (Tao et al., Cancer Cell 2005 lul 8(1), 39-59). Nach dem Auffinden des ersten zellgängigen KSP -Inhibitors, Monastrol, haben sich KSP-Inhibitoren als eine Klasse neuer Chemotherapeutika etabliert (Mayer et al., Science 286: 971 -974, 1999) und sind Gegenstand einer Reihe von Patentanmeldungen (z.B. WO2006/044825; WO2006/002236; WO2005/051922; WO2006/060737; WO03/060064; WO03/040979; und WO03/049527). Da KSP jedoch nur in einem kurzen Zeitraum der Mitosephase aktiv ist, müssen KSP-Inhibitoren in ausreichend hoher Konzentration während dieser Phase vorliegen. WO2014/151030 offenbart ADCs mit bestimmten KSP-Inhibitoren.
Zusammenfassung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Substanzen bereitzustellen, die nach Verabreichung in relativ geringer Konzentration eine apoptotische Wirkung zeigen und damit für die Krebstherapie nützlich sein können.
Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung Konjugate eines moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR -Antikörpers, wie dem aus der Maus stammenden Antikörper ITEM-4, sowie chimären oder humanisierten Varianten von diesem Antikörper, mit Verbindungen der folgenden Formel (I) bereit, wobei eine oder mehrere der Verbindungen der Fonnel (I) mit dem Antikörper über einen Linker L verbunden ist bzw. sind.
Die Erfindung zeigt, dass mit Konjugalen unter Verwendung eines anti-TWEAKR -Antikörpers mit reduzierter agonistischer Wirkung eine signifikant verbessserte Tumorselektivität zu beobachten - J -
ITEM-4 ist ein anti-TWEAKR-Antikörper der von Nakayama ei al. besehrieben wurde (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). Humanisierte Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR-Urnseizung („CDR grafting") werden von Zhou et al. (ZIiou et al., 2013, J Invest Demiatol. 133(4):1052-62) sowie in WO 2009/020933 beschrieben.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein humanisierter oder ehimärer monoklonaler anti-TWEAKR- Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimäreren ίΤΕΜ-4-Varianten: TPP- 7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-7076.
Formel (I):
Figure imgf000004_0001
(I) wobei
R1 H, -L-#l, -MOD oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z. -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darsteilt,
wobei Y' und Y2 unabhängig voneinander H, H2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH2)o-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei H, NH2, SO3H, COOK, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i.3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit~NHCONH2 substituiertes, CwAlkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R I I . -MOD, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)0-3Z darsteilt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Zl darstellen, und YJ H oder -
(CH2)o-3Zi darstellt, wobei Z' Η, SO3H, NH2 oder COOK darstellt; wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C ι-s Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes CM Alkyl darstellt;
R4 H, -L-#l, -SGlys-(CO)0-i -R4% -CO-CHY^NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt,
wobei SGjyS eine durch ein lysosomaies Enzym spaltbare Grappe darstellt, insbesondere eine Grappe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine CMO- Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-jo- Araikyl- , Cs-io-Heteroalkyi-, C w o-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- , Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl- alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, CS-JO- Heteroaralkoxy-, Cwo-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH- Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO- Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, -SO2NH2, ~S02~N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)y-R4" darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise C Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt), wobei nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R = H); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -S Y3, NHY3, -CO-ΝΥΎ2, oder -CO-OY' darstellt,
wobei Υ ' und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)0-3Z i darstellen, und Y3 H oder - (CH2)Ö..3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, C1-5 Alkyl oder gegebenenfalls mit M l. substituiertes Aiyl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C w Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR1 '- oder -CHR." -CH2- darstellen, wobei R" -H, -NH2, -SO3H, -COOH, -SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, C1-4 Haloalkyl, CM Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes CM Alkyl, COO(CM Alkyl) oder OH darstellt;
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CN H2 darstellt;
R3 -L-#i , -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyi-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine Ci-10-Alkyl-, Ce-io- Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-iö-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Aikylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 3 -3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO- H- Alkyl Gruppen, 3 -3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 - H-CO- H- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n-Alkyl Gruppen, 1-3 -SO2- H- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)o- 3Z Gruppen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- Y Ύ2, oder - CO-OY"' darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CBbJo-sZ' darstellen, und Y3 H, ·: ( ! ! )o : ·(.Ί ί( Μ !( ·< K. I h .Xv i CH.-),, : ·( ! ! \Ί I )/ ·. oder -(CH2)„..3Z' darstellt, wobei 7 H, SO3H, H2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Ci-io- Alkyl bedeutet);
R5 H, H2, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder - (CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-ΝΥΎ2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder "(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H oder - (CH 0..3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
darstellt,
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy, NO2, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) Ci-io- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) Cj-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C4.10-Cycloalk.yl oder-(CH2)o..2-(HZ2) darsieilt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt, wobei jede dieser Gruppen mit -OH, C02H oder NH2 substituiert sein kann;
R9 Ii, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt;
wobei einer der Substiiuenien R! , RJ oder R4 -L-#l darstellt bzw. (im Falle von R8) aufweist, L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Binder bzw. Derivat hiervon stellt, wobei -MOD -- ( R10)n~(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei R10 H oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO-, oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R!0 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, - SO-, SO2, -NRY-, -NRYCO-, CONRY-, -NR 'NRy-, -S02N > \'R>'-. -CONRyNRy-, (wobei Ry H, Phenyl, Ci-Ci0-AlkyL C2-Ci0-Alkenyl, oder C2-C1 Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx=N-0- (wobei Rx H, Cj-Cß-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit M ICOM b. -COOK, -OH, -NH2, NH-C H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe - MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können chemisch labile Linker, enzymatisch labile Linker oder stabile Linker aufweisen. Besonders bevorzugt sind stabile Linker und durch eine Protease spaltbare Linker.
Die Erfindung stellt femer bereit Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugale sowie Vorstufen und Intermediate zur Herstellung.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate umfasst regelmäßig die folgenden Schritte:
Herstellen einer ggf. Schutzgruppen tragenden Linkervorstufe mit einer reaktiven Gruppe, die an den Antikörper koppeln kann;
Konjugieren der Linkervorstufe an das ggf. Schutzgiuppen tragende Derivat eines KSP-Inhibitors der Formel (I) , wobei in diesen Formeln eine Bindung an einen Linker noch nicht vorliegt), wobei ein ggf. Schutzgruppen tragendes reaktives KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat erhalten wird;
Abspaltung der ggf. vorhandenen Schutzgruppen im KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat und
Konjugieren des Antikörpers an das KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat, wobei das erfindungsgemäße Antikö er-KSP■Inhibitor-Konjugat erhalten wird.
Die Anknüpfung der reaktiven Gruppe kann auch nach Aufbau einer ggf. geschützt vorliegenden KSP-Inhibitor-Linkervorstufe Konjugats erfolgen.
In Abhängigkeit vom Linker können Succinimid-verknüfte ADCs nach der Konjugation nach Schema 26 in die offenkettige en Bernsteinsäureamide überführt werden, die ein vorteilhaftes Stabilitätsprofil aufweisen. Wie oben erläutert, kann das Konjugieren der Linkervorstufe an einen niedermolekularen KSP- Inhibiior durch Substitution eines Wasserstoffatoms an R1, R3 oder R4 in Formel (I) durch den Linker erfolgen. In den Synthesesehriiten vor der Konjugation können ggf. vorhandene funktionelle Gruppen auch in geschützter Form vorliegen. Vor dem Konjugationsschritt werden diese Schuizgruppen nach bekannten Methoden der Peptid chemie entfernt. Die Konjugation kann chemisch auf verschiedenen Wegen erfolgen, wie in den Schemata 20 bis 31 in den Beispielen exemplarisch dargelegt. Es ist insbesondere möglich, den niedermolekularen KSP-Inhibitor für die Konjugation an den Linker ggf. zu modifizieren, z.B. durch Einführen von Schutzgruppen oder Abgangsgruppen zur- einfacheren Suhsiituierung.
Insbesondere stellt die Erfindung neue niedermolekulare KSP-Inhibitoren bereit, die an einen moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR- Antikörper wie z.B. ITEM-4 konjugiert worden sind. Diese KSP-Inhibitoren bzw. ihre Antikörper-Konjugate weisen die folgende allgemeine Formel (II) auf:
Figure imgf000008_0001
H, -L-BINDER, -MOD oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, - OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei
Y1 und Y2 unabhängig voneinander Ii, NH2, -((. ί ! (." ! ! ·< ) !» MC! !. )« ·./ '(/ U.
(CH2)o-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen,
Y3 H oder -Κ Ί Ι.·}.; ·./ · darstellt
'.- i L NI-I2, SO3H, COOK, -\ H-C< !.(·} ·; .( ·! ! .. <:.·| {(\. π . ;.<. ·( )( >} !
oder -(CO-NH-CHY4)i.3COOH darstellt;
W H oder OH darstellt. Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH~C(==0)-NH2 substituiertes, Ci.& Aikyl oder gegebenenfalls mit --NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -MOD, -C(<))~CHY4-NHY5 oder ~(CH2)0-3Z darstellt,
oder
R2 und R4 geineinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder-CHR 11 -CH2- darstellen,
wobei
R!i -H, - H2, -SO3H, -COOH, -SH, Halogen (insbesondere F oder Ci),
Ci-4 Aikyl, CM Haloalkyl, CM Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes CM Alkyl, COO(Cj-4 Alkyl) oder -OH darstellt;
Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO- Y'Y2, oder -CO-
OY3 darstellt,
Y1 und Y unabhängig voneinander H, H2, oder -(CHOo-sZ' darstellen, und Y3 H oder -(CH VsZ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONHb substituiertes, CM Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ' H oder -CO-CHY°-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes CM Alkyl darstellt;
R4 H, -L-BINDER, -SGlys-(CO)0.i -R4', -CO~CHY4-NHY5 oder ~(CH2)0-;Z darstellt,
wobei SG[ys eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine Ci-io-Alkyl-, Cs-io-Ar l- oder Ce-io- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyi-, Cno-Alk l-O-Ce-io-Aryl-, C5.10-Heterocycloalk.yl-, Heteroaryi-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci -10- Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, C5-10- Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH- Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO- Alkyl, (Aikyl)-COA3kyl, -SO3H, -S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)y- 4" darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" I i. -Alkyl (vorzugsweise Ci-12-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt), wobei nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 = H); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NYV, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y! und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und YJ H oder - i C'ü ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt; wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit--NHCONH2 substituiertes, C w> Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryi oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO"CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes CM Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRi]- oder -CHR"-CH2- darstellen, wobei R1! H, NH2, SO3H, COOK, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, Ci-4 Ha!oaiky3, CM Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C1-4 Alkyl, COO(C].4 Alkyl) oder OH darstellt;
A -C(0)-,
Figure imgf000010_0001
oder -C NH2- darstellt;
R3 -L-BINDER, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycioalkyi-, Aryi-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Ci- 10- Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-i o-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder Cs-io- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweiis 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO- H- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)n-Alkyl Gruppen, 1 -3 -S02-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1 -3 -(CH2)o- 3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-ΝΥ' Υ2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H, -(CH2)a-:rCH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2V3Z' darstellt, wobei 7 H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMO- Alkyl bedeutet);
n für 0, 1 oder 2 steht,
R5 H, NH2, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -C ! H . SH oder - (CH2J0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
darstellt,
R8 (ggf. fluoriertes) Ci-io- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkenyi, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) Cii-io-Cycloalkyi oder -(CH2)o-2-(HZ2j darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt (vorzugsweise Oxetan), wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH2 substituiert sein kann;
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei L für einen Linker steht und BINDER für einen inoderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAK - Antikörper, wie ΠΈΜ-4 sowie chimäre oder humanisierte Varianten von ITEM-4, steht, wobei der Binder ggf. an nieirrere Wkkstoffmoleküle gebunden sein kann, wobei ein Vertreter von R1, RJ und R* -L-Binder darstellt;
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-J0- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C'2-io~Alkinyl, Hydroxy, NO2, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen, wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei R10 H oder Ci-C Alkyl darstellt;
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 3 ist; und
G2, eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit I bis 10 Kohlensioffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SO2, -NR>'~, -NRYCO-, CONR>'-, -NRYNR -, -S02NRyNR>'~, -CONRWRy-, (wobei Ry II, Fhetryl, C \ -C\ 0-Aikyl, C2-C{ Q-Alkenyl, oder C2-C1 Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH~CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CR"=N-0- (wobei Rx H, Cj-C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -M i;. NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere. Beschreibung der Figuren
Fi ur 1: Annotierte Sequenzen der Antikörper. Es sind jeweils zu den Antikörpern oder Antikörperfragmenten die CDR-Bereiche (HCDRl, HCDR2, HCDR3, LCDRl, LCDR2, LCDR3) und variablen Bereiche (VH, VL) hervorgehoben.
Figssr 2:Sequenzlisting.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Konjugate eines moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti- T WEAKR- A tikörpers wie ΓΤΕΜ-4 sowie einer chirnären oder humanisierten Variante von ΠΈΜ- 4 mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen bereit, wobei das Wirkstoffmolekül ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor (KSP-Inhibitor) ist, das mit dem Antikörper über einen Linker L verbunden ist. Die Erfindung zeigt, dass mit onjugaten unter Verwendung eines anti-T'WEAKR- Antikörpers mit reduzierter agonistischer Wirkung, eine signifikant verbessserte Tumorselektivität zu beobachten ist.
Das erfindungsgemäße Konjugal kann durch die allgemeine Formel
BINDER t—KSP
n dargestellt werden, wobei BINDER für den moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR- Antikörper, wie z.B. ITEM-4 sowie chimäre oder humanisierte Varianten von ITEM-4, L für den Linker, KSP für den KSP-Inhibitor, und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht. Hierbei ist n ein Mittelwert der Anzahl an KSP-Inhibitor-Linker-Konjugate pro BINDER. KSP-L weist vorzugsweise die oben aufgeführte Formet (I) auf. Weiterhin ist es bevorzugt, dass der Linker an verschiedene Aminosäuren des Antikörpers gebunden ist. Besonders bevorzugt ist eine Bindung an unterschiedliche Cysteinreste des Binders. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humanisierter oder ebimärer monoklonaler ITEM-4 anti-TWEAKR-Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimäreren ITEM-4- Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-7076. Im Folgenden werden erfindungsgemäß verwendbare Antikörper, erfindungsgemäß verwendbare KSP-Inhibitoren sowie erfindungsgemäß verwendbare Linker beschrieben, die ohne Einschränkung in Kombination verwendet werden können. Insbesondere können die jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzug! dargestellten Binder in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten KSP-Inhibitoren, ggf. in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Linkern verwendet werden.
KSP-Inhibitoren und deren Binderkonjugate
Definitionen
Der Begriff„substituiert" bedeutet, dass ein oder mehrere Wasserstoffe an dem bezeichneten Atom bzw. der bezeichneten Gruppe durch eine Auswahl aus der angegebenen Gruppe ersetzt ist/sind, mit der Maßgabe, dass die normale Wertigkeit des bezeichneten Atoms unter den vorliegenden Umständen nicht überschritten wird. Kombinationen von Substituenten und oder Variablen sind zulässig.
Der Begriff„gegebenenfalls substituiert" bedeutet, dass die Anzahl an Substituenten gleich oder verschieden von Null sein kann. Wenn nicht anders angegeben, können gegebenenfalls substituierte Gruppen durch so viele fakultative Substituenten substituiert sein, wie sich durch Ersetzen eines Wasserstoffatoms durch einen Nicht- Wasserstoff-Substituenten an einem beliebigen verfügbaren Kohlenstoff- oder Stickstoff- oder Schwefelatom unterbringen lassen. Normalerweise kann die Anzahl an fakultativen Substituenten (falls vorhanden) 1, 2, 3, 4 oder 5, insbesondere von 3 , 2 oder 3 sein.
So, wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "ein- oder mehrfach", zum Beispiel in der
Definition der Substituenten der Verbindungen der allgemeinen Formeln der vorliegenden Erfindung, "1, 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 1, 2, 3 oder 4, besonders bevorzugt 1, 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt 1 oder 2".
Sind Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert, so können die Reste, wenn nicht anders angegeben, ein- oder mehrfach substituiert sein. Im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind die Bedeutungen aller Reste, die mehrfach auftreten, unabhängig voneinander. Eine Substitution durch einen, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Substituenten ist bevorzugt. Die Substitution durch einen Substituenten ist besonders bevorzugt. Alkyl
Alkyi steht für einen linearen oder verzweigten, gesättigten, monovalenten Kohienwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio-Alkyl), in der Regel 1 bis 6 (Ci-Ce-Alkyl), bevorzugt 1 bis 4 (Ci- GrAlkyl), und besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (Cj -C Alkyl).
Beispielhaft und bevorzugt seien genannt:
Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, iso-Propyl-, iso-Butyl-, sec-Buiyl, tert-Butyl-, iso-Pentyl-, 2-Meihylbutyl-, i -Methyibuiyl-, 1-Ethylpropyl-, 1,2-Dimethylpropyl, neo-Pentyl-, 1,1-Dimethylpropyl-, 4-Methylpentyl-, 3-Methylpentyl-, 2-Methylpentyl-, 1 -Methylpentyl-, 2-Ethyibutyl-, l-Ethylbutyl-, 3,3-Dimethylbuiyl-, 2,2-Dimethylbutyl-, 1,1 -Dimethylbutyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, 1,3-Dimethylbutyl- und 1,2-Dimethylbutyl-.
Besonders bevorzugt ist ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl- und tert-Bulylrest.
Heteroalkyl
Heteroalkyl steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohienwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)-, -S(0)2-, -NRy-, -NR C(=0 , -C(0)-NRy-, - Ry Ry-, -S(=0)2-N yNRy-, -C(=0)-NRy Ry-, -CR^N-O- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seiterike iten, sofern vorhanden, mit ~ H-C(=0)-NH2, -C(=0)-OH, -OH, -NH2,
Figure imgf000014_0001
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
Hierbei steht W jeweils für -H, Phenyl-, C I -C I Q- Alkyl-, C^-Q Q- Alkenyl- oder C -C ] Q-Alkinyl-, die wiederum jeweils mit - H-C(=0)- H2, -C(0)-OH, -OH, -NH2, -NH-C(-NNH2)-,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei stellt Rx für -H, C1-C3-Alkyl- oder Phenyl-.
Alkenyl
Alkenyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoffkette mit einer oder zwei Doppelbindungen und 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C -Cio- Alkenyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (Ci-Cj-Alkenyl), wobei es sich versteht, dass, wenn die Alkeny lgruppe mehr als eine Doppelbindung enthält, die Doppelbindungen isoliert voneinander oder miteinander konjugiert sein können. Bei der Alkenylgruppe handelt es sich zum Beispiel um eine Ethenyl- (bzw. Vinyl-), Prop-2-en-l-yl- (bzw.„Allyl-"), Prop-l-en-l-yl-, But-3-enyl-, But-2-enyl-, But-i-enyl-, Pent-4-enyl-, Pent-3-enyl-, Pent-2-enyi-, Pent-l-enyl-, Hex-5-enyi-, Hex-4-enyl-, Hex-3-enyl-, Hex-2-enyi-, Hex-l -enyl-, Prop-l-en-2-yl- (bzw.„Isopropenyl-"), 2- Methylprop-2-enyK 1 -Methylprop-2-enyl-, 2-Methylprop- 1 -enyl -, 1-Methylprop-l -enyl-,
3- Methylbut-3-enyl-, 2-Methylbut-3-enyl-, 1 -Methylbut-3-enyl-, 3-Methylbut-2-enyl-,
2- Metbylbut-2-enyl-, l-Methylbut-2-enyl-, 3-Meihylbut- 1 -enyl-, 2-Metbylbui-l-enyl-,
1 -Methyäbut- 1 -enyl-, 1 ~, 1 -Dimetbylprop-2-enyl-, 1 -Ethylprop- 1 -enyl-, 1 -Propylvinyl-,
1-Isopropylvinyl-, 4-Methylpent-4-enyl-, 3-Methylpent-4-enyl-, 2-Methylpent-4-enyl-,
1 -Methylpent-4 - enyl-, 4-Methylpent-3 - enyl-, 3-Methylpent-3 - enyl-, 2-Methylpent-3 - enyl-, 1 -Methylpeni-3-enyl-, 4-Methylpeni-2-enyl-, 3-Methylpeni-2-enyl-, 2-Methylpent-2-enyl-, 1 -Methylpeni-2-enyl-, 4-Methylpeni- 1 -enyl-, 3-Methylpeni-l -enyl-, 2-Methylpent- 1 -enyl-, i-Methylpeni- 1-enyl-, 3-Ethylbut-3-enyl-, 2-Ethylbut-3-enyl-, l-Ethylbut-3-enyl-,
3- Ethylbut-2-enyl-, 2-Ethylbut-2-enyl-, i-Ethylbut-2-enyl-, 3-Ethylbut- 1 -enyl-, 2-Ethylbut-l-enyl-, 1 -Ethytbut- 1-enyl-, 2-Propyiprop-2-enyl-, 1 -Propytprop-2-enyl-, 2-Isopropylprop-2-enyl-,
1 -Isopropylprop-2-enyl-, 2-Propylprop- 1-enyl-, 1 -Propylprop- 1-enyl-, 2-lsopropylprop- 1 -enyl-, 1 -Isopropylprop- 1 -enyl-, 3,3-Dimethytprop- 1 -enyl-, 1 -(1 , 1-Dimetb.ylefhyl)ethenyl-,
Buta-1 ,3-dienyl-, Penta- 1 ,4-dienyl- oder Hexa-1 -5-dienylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Gruppe um Vinyl oder Ailyl.
Alkinyl
Alkinyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstofikette mit einer Dreitachbindung und mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-C10- Alkinyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen
Figure imgf000015_0001
Bei der C2-C6-A3kiny!gruppe handelt es sieh zum Beispiel um eine Ethinyl-, Prop-l-inyl-, Prop-2-inyl- (bzw. Propargyl-), But-l-inyl-, But-2-inyl-, But-3-inyl-, Pent- l -inyl-, Pent-2-inyl-, Pent-3-inyl-, Peni-4-inyl-, Hex-l -inyl-, Hex-2-inyl-, Hex-3-inyl-, Hex-4-inyl-, Hex-5-inyl-, l -Methyiprop-2-inyi-, 2-Methylbut-3-inyl-, 1 -Methylbut-3-inyl-, l-Methylbut-2-inyl-, 3-Methylbut- 1 -inyl-, 3 -Eihylprop-2-inyl-,
3-Methy3pent-4-inyi-, 2-Methylpent-4-inyl-, l -Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-3-inyl-, 1 -Methylpeni-3 -inyl-, 4-Methylpent-2-inyl-, 1 -Methylpent-2-inyl-, 4-Methylpent- 1-inyk
3-Methylpent-l -inyl-, 2-Etliylbut-3-inyl-, 1 -Etliylbut-3-inyl-, 1 -Ethylbuf-2-inyl-,
1 -Propylprop-2-inyl-, 1 -Isopropylprop-2-inyl-, 2,,2,-Dime1hylbut-3-inyi-, 1 , 1 -Dimethylbut-3 -inyl-, 1 , 1 -Dimethylbut-2-inyl- oder 3,3-Dimetliylbut-i - inylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei der Alkinylgruppe um Ethinyl, Prop-l-inyl oder Prop-2-inyl. Cycloalkyl
Cycloalkyl steht für einen gesättigten einwertigen mono oder bicyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 3-12 Kohienstoffaiomen (C3-Ci2-Cycloalkyl).
Hierbei steht ein monocyciischer Kohlenwasserstoffrest für einen monovalenten
Kohlenwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 10 (Cs-Cio-Cycloalkyl), bevorzugt 3 bis 8
(Cj-Cs-Cycloalkyl), und besonders bevorzugt 3 bis 7 (Cj-Cv-Cyeloalkyl) Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und bevorzugt für einen monocyclischen Kohlenwasserstoffrest seien genannt:
Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl- und Cyciooctyl-.
Besonders bevorzugt ist ein Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cylopentyl-, Cyclohexyl- und
Cycloheptyl-.
Hierbei steht ein bicyclischer Kohlenwasserstoiirest für einen Kohlenwasserstofi est mit in der Regel 3 bis 12 Kohlenstoffatomen (C3-Ci2-Cycloalk I), wobei hierbei eine Fusion aus zwei gesättigten Ringsystemen zu verstehen ist, die sich gemeinsam zwei direkt benachbarte Atome teilen. Beispielhaft sind bevorzugt für einen bicyclischen Kohlenwasserstoffrest seien genannt: Bicyclo[2.2.0]hexyl-, Bicyclo[3.3.0]octyk Bicyclo[4.4.0]decyl-, Bicyclo[5.4.0]undecyl-, Bicyclo[3.2.0]hepty3~, Bicyclo[4.2.0]octyl-, Bicyclo[5.2.0]nonyl-, Bicyclo[6.2.0]decyl-, Bicyclo[4.3.0]nonyl-, Bicycio[5.3.0]decyi-, Bicycio[6.3.03undecyl- und Bicyclo[5.4.0]undecyl-,
Heterocycloalkyl
Heterocycloalkyl steht für ein nicht aromatisches mono- oder bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können Stickstoffatome, Sauerstoffatome oder Schwefelatome vorkommen.
Ein monocyclisches Ringsystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann 3 bis 8, bevorzugt 4 bis 7, besonders bevorzugt 5 oder 6 Ringatome aufweisen.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 3 Ringatomen seien genannt:
Aziridinyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 4 Ringatomen seien genannt:
Azetidinyl-, Oxetanyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 5 Ringatomen seien genannt:
Pyrrolidinyl-, Imidazolidinyl- , Pyrazolidinyl-, Pyrroiinyi-, Dioxoianyl- und Tetrahydrofuranyl-, Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloaikyl mit 6 Ringatomen seien genannt:
Piperidinyi-, Piperazinyl-, Morpholinyi-, Dioxanyl-, Tetrahydropyranyl- und Thiomoiphoi inyl- .
Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloaikyl mit 7 Ringatomen seien genannt:
Azepany Oxepanyl-, 1 ,3-Diazepanyl-, 1,4-Diazepanyl-.
Beispielhaft und bevorzugt für ein HeteiOcycloaikyl mit 8 Ringatonien seien genannt:
Oxocanyl-, Azocanyl-.
Unter monocyclisc'hem Heterocycloaikyl sind 4 bis 7-gliedrige, gesättigte Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S bevorzugt.
Besonders bevorzugt sind Morpholinyi-, Piperidinyi-, Pyrrolidinyl- und Tetrahydrofaranyl-.
Ein bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können, können gemäß der vorliegenden Erfindung 6 bis 12, bevorzugt 6 bis 10 Ringatome aufweisen, wobei ein, zwei, drei oder vier Kohlenstoffatome gegen gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe O, N und S ausgetauscht sein können.
Beispielhaft seien genannt: Azabicyclo[3.3.0]octyl-, Azabicyclo[4.3.0]nonyl-,
Diazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Oxazabicyclo[4,3.0]nonyK Thiazabicyclo[4.3.0]nonyl- oder
Azabicyclo[4.4.0]decyl- sowie aus weiteren möglichen Kombinationen gemäß Definition abgeleitete Reste.
Besonders bevorzugt ist Perhydrocyclopenta[c]pyrrolyi-, Perhydrofdro[3,2-c]pyridinyl-,
Perhydropyrrolo[ 1 ,2-a]pyrazmyl-, Perhydropyrrolo[3,4-c]pyrrolyl- und 3,4-Metliylenedioxyphenyl.
Aiyl bedeutet ein monovalentes, mono- oder bicyclisches, aus Kohlenstoffatomen bestehendes aromatisches Ringsystem. Beispiele sind Naphthyl- und Phenyi-; bevorzugt ist Phenyl- beziehungsweise ein Phenylrest.
Cfc-Cio-Aralkyl
Ce-io-Aralkyl- steht im Rahmen der Erfindung für ein monocyclisehes aromatisches Aiyl, bespielhaft Phenyi, an das eine Ci-Cii-Alkylgaippe gebunden ist. Eine beispielhatte Ce-io-Aralkyl-Gruppe ist Benzyl.
Heteroaryl
Heieroaiyl bedeutet ein einwertiges monocyclisches, bicyciisches oder tricyclisch.es aromatisches Ringsystem mit 5, 6, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13 oder 1.4 Ringatomen (eine„5- bis 14- gliedrige
Heteroaryl"gruppe), insbesondere 5, 6, 9 oder 10 Ringatomen, zu verstehen, das mindestens ein Ringheteroatom und gegebenenfalls ein, zwei oder drei weitere Ringheteroatome aus der Gruppe N, O und S enthält und das über ein Ringkohlenstoffatom oder gegebenenfalls (wenn es die Wertigkeit erlaubt) über ein Ringstickstoffatom gebunden ist.
Bei der Heteroarylgruppe kann es sich um eine 5-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Thienyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isotliiazoiyl, Oxadiazolyi, Triazoiyl, Thiadiazolyl oder Tetrazolyl; oder eine 6-gliedrige Heteroarylgrapoe wie zum Beispiel PyridinyL Pyridazinyl, Pyrimidinyi, Pyrazinyl oder Triazinyl; oder eine tricyclische Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Carbazolyl, Acridinyl oder Phenazinyl; oder eine 9-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Benzofuranyl, Benzothienyl, Benzoxazolyl, Benzisoxazolyl, Benzimidazolyl, Benzothiazolyl, Benzotriazolyl, Indazolyl, Indolyl, Isoindolyl, Indoiizinyi oder Purinyl; oder eine 10-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Chinolinyl, Chinazolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Chinoxalinyl oder Pteridinyl handeln.
Im Allgemeinen, und wenn nicht anders erwähnt, schließen die Heteroarylreste alle möglichen isomeren Formen davon ein, z. B. Tautomere und Positionsisomere in Bezug auf den
Anbindungspunkt zum Rest des Moleküls. Somit schließt, als erläuterndes, nicht einschließendes Beispiel, der Begriff Pyridinyl Pyridin-2-yi, Pyridin-3-yl und Pyridin-4-yl ein; oder der Begriff Thienyl schließt Thien-2-yl und Thien-3-yl ein.
Cv-Cn-Heieroarvi
Cs-io-Heteroaryl stellt im Rahmen der Erfindung für ein mono-oder bicyciisches, aromatisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatome, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können vorkommen: N, O, S,
Figure imgf000018_0001
Die Bindungsvalenz kann sich an einem beliebigen aromatischen Kohlenstoffatom oder an einem Sticksioffatom befinden.
Ein monocyciischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 5 oder 6 Ringatome. Bevorzugt sind solche Heteroarylreste mit ein oder zwei Heteroatomen. Besonders bevorzugt sind hierbei ein oder zwei Stickstoffatome.
Heteroarylreste mit 5 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Thienyi, Thiazolyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolvl, Imidazolyl, Pyrazolvl, Isoxazolyl, Isothiazolyl,
Oxadiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl und Thiadiazolyl.
Heteroarylreste mit 6 Ringatomen unifassen beispielsweise die Ringe:
Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl und Triazinyl.
Ein bicyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 9 oder 10 Ringatome,
Heteroarylreste mit 9 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
PhthalidyL Thiophthalidyl, Indolyl, isoindolyl, Indazolyl, Benzothiazolyl, Benzofüryl,
Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzoxazolyl, Azocinyi, Indoiizinyl, Purinyl, Tndolinyl.
Heteroarylreste mit 10 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:
Isochinolinyl, Chinolinyl, Chinolizinyl, Chmazolinyl, Cliinoxalinyl, Cinnolinyl, Phthalazinvl, 1,7- und 1,8-Naphthyridinyl, Pteridinyl, Chromanyl.
Heteroalkoxy
Heieroalkoxy steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die über -O- an den Res! des Moleküls gebunden ist und die weiterhin einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O, -S-, -C(=0)-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NR>'-,
-NRyC(=0)-, -C(=0)- Ry-, -NRJNR.V-, -S< 0> - N > N > -. -C(=0)-NR.VNRy-, -CR '' VO- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -C(K))-OH, -OH, -NH2, -NH-C<=NNH2)-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,
Hierbei steht Ry jeweils für H, Phenyi-, C \ -C \ Q-Alkyl-, C2-C 1 Q-Alkenyl- oder C2-C| o-Alkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH2, -C(=0)-OH, -OH, -NH2, -NH-C(-NNH2)-,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei steht Rx für -H, Cj -C^-Alkyl- oder Phenyi-. Halogen beziehungsweise Haiogenatom steht im Rahmen der Erfindung für Fluor (-F), Chlor (-C1), Brom (-Br), oder iod (-T).
Fluor-Alkyl, Fluor-Alkenyl und Fluor- Alkinyl bedeutet, dass das Alkyl, Alkenyl und Alkinyl ein oder mehrfach durch Fluor substituiert sein kann.
Die Konjugation des KSP-Inhibitors an den Antikörper kann chemisch auf verschiedenen Wegen erfolgen, wie in den Schemata 20 bis 31 in den Beispielen exemplarisch dargelegt. Es ist insbesondere möglich, den niedermolekularen KSP-Inhibitor für die Konjugation an den Linker ggf. zu modifizieren, z.B. durch Einführen von Schutzgruppen oder Abgangsgruppen zur einfacheren Substituierung (so dass in der Reaktion diese Abgangsgruppe durch den Linker substituiert wird, und nicht ein H-Atom). Das so erhaltene KSP-Tnhibitor - Linker - Molekül (wobei der Linker eine reaktive Gruppe zur Ankopplung an den Binder aufweist) kann dann mit dem Binder umgesetzt werden, um ein erfindungsgemäßes Binderkonjugat zu erhalten. Diese Vorgehensweise ist im experimentellen Teil anhand einer Vielzahl von Beispielen exemplarisch veranschaulicht.
Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (I) oder (Ia) auf:
Formel (I):
Figure imgf000020_0001
wobei
R' FI, -L-#l, --MOD oder .(CH2 3Z darstellt, wobei Z -FI, -ΝΗΎ3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- Y] Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y' und Y2 unabhängig voneinander H, H2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH2)o-3Z l), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z ' darstellt, wobei Z' H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4))-3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt, wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mif-NHCONFb substituiertes, C ι-s Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH?. substituiertes Aryl oder Benzyi darstellt;
R2 H, -MOD, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darsieilt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y4 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z4 darstellen, und YJ H oder -
(CH o-aZ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH/; substituiertes, C ι-s Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyi darstellt und Y* H oder -CO~CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyl darstellt;
R4 H, -L-#l, -SGlys~(CO)0-i -R4\ -CO-CHY4~NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt,
wobei SGjyS eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Grappe darsteilt, insbesondere eine Grappe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4'eine Ci- 10- Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-jo- Araikyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Cno-Alk l-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-10-Alfcoxy-, Cc-iö-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io- Heteroaralkoxy-, Cwo-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, -NH- Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO- Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, -SO2NH2, ~S02~N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe --Ox-(CH2CH20)Y-R"^ darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 1 0 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise C n2- Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2- CH2-NH2 darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONHb substituiertes, C [-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyi darstellt und Y5 H oder••■CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes Ci-6 Alkyl darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHRi]- oder -CHR"-CH2- darstellen, wobei R" H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, Cw Haloaikyl, Ci-4 Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C1-4 Alkyl, COO(Ci-4 Alkyl) oder OH darstellt;
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R' -L-#l, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyi-, Heierocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine Ci-io-Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Cs- ιο-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, C i-io- Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs-jo-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Aikylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 - O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-GO- NH-Alkyl Grappen, 1-3 -S(C))„-Alkyl Gruppen, 1-3 -S02-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(A3kyl)2 Gruppen, 1-3 -NH((CH2CJH20)1_2oH)-Gruppen, 1-3 - H2 Gruppen oder 3 -3 -(CH2)o-;-,Z Gruppen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- ΝΥ'Υ2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH )o-3Z ' darstellen, und Y3 H, -(CH2)0.3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)0.-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei „Alkyl" bevorzugt Ci-io-Alkyl bedeutet);
R5 H, -MOD, NH2, 02, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY]Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y! und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und YJ H oder - (CHa sZ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-jo-Alkinyl, Hydroxy, N02, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) C O- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkenyi, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C4-i<rCycloalkyl oder -(CH2)o-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt (vorzugsweise Oxetan), wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH2 substituiert sein kann; wobei einer der Substituenten R1, R' und R4 -L-'i 1 darstellt,
L für den Linker steht und (i 1 fiir die Bindung zum Antikörper steht,
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -(NRi0)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R'° H oder Ci-C3-Alkyi darstellt; N N C G
Gl -NHCO- , -CONH- oder \ / darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- oder
— H H CO ,n
\ / darstellt, R"* nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SO2, - R>'-, -NRyCO-, CONRY-, -NR 'NRy-, -S02N > \'R>'-. ~CONRyN y~, (wobei Ry H, Phenyl, C1 -Ci Q-Alkyl, C2-C1 Q-Alkenyl, oder C2-C1 Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Suifonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CRx=N-0- (wobei Rx H, Cj-Cß-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, ~M !.. NH-C H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Suifonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
In einer bevorzugten Ausführungsfomi der Formel (I) stellt einer der Substituenten R] oder RJ -L- #1 dar. In dieser Auslührangsform ist es besonders bevorzugt, wenn R4 H oder -SG[yS-(CO)o -R4' darstellt, wobei SG[ys und R^dieselbe Bedeutung haben wie oben. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Formel (I) stellt der Substituenten R4-L-#l dar, wobei der Linker ein Linker ist, der am Stickstoffatom, das an R4 bindet, spaltbar ist, so dass nach Spaltung eine primäre Ammgruppe vorliegt (entsprechend R4 = H). Entsprechende spaltbare Gruppen werden unten näher beschrieben.
Wenn R1 nicht H darstellt, ist das Kohlenstoffatom, an das R1 bindet, ein Stereozentrum, weiches in der L- und/oder D-Konfiguration vorliegen kann, vorzugsweise in der L— Konfiguration.
Wenn R2 nicht H darstellt, ist das Kohlenstoffatom, an das R2 bindet, ein Stereozentrum, weiches in der L- und/oder D-Konfiguration vorliegen kann. Forme! (la):
Figure imgf000024_0001
(la) wobei
R1 H, -L-#l, oder -(CH OJZ darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z' (z.B. -(CH2)(MZ'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 Ii oder -(CH o-sZ' darstellt, wobei H, NH2, SO3H, COOK, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i-3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Cw Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt.
R2 und R4 unabhängig voneinander H, -SGlys-(CO)o_i-R4', -CO-Cl I V- N H Y ' oder · Π ! · ίο■:/. darstellen,
wobei SGivs eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R4' eine Ci-io-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alk l-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, C5-10- Heteroaralkoxy-,
Figure imgf000024_0002
Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die jeweils ein oder mehrfach mit ■ NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, - S02NH2, -S02-N(Alkyl)2, -COOK, -CO H2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe - Ox-(CH2CH20)v-R4 darstellt (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und 4" -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-i2-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder - CH2-CH2-NH2 darstellt); , oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrroiidinringes) -CH2-CHR1 '- oder -CHR1 '- CH2- darstellen, wobei R" H, NH?, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Aikyl, C1-4 Haloalkyl, GV, Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes CM Alkyl, COO(Cw Alkyl) oder OH darstellt; oder R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)<MZ darstellt und R4 -L-#l darstellt, wobei Z - H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 sind Y unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z4 darstellen, und Y3 H oder - (CH o-sZ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 unabhängig voneinander lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, CM Alkyl oder gegebenenfalls mit --NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt, wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Cw Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ' H oder -CO-CHY°-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C e Alkyl darstellt;
A CO, SO, SO2, SO N i l oder CNNH2 darstellt;
R3 eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Helerocycloalkyl- Oruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine Ci-10-Alkyl-, Cwo-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocyeloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkvigruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1-3 O- Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1 -3 -S-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1-3 -SO2-NH -Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 - N(Aikyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2J0-3Z Gruppen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z4 darstellen, und Y~ H, -· ( I ! ·}.. -Cl Si M iC ( X 'l ! . )/.·. -· ( I i }.. :·( Ί Ι{ Ν Π )/ ·. oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Cj-io- Alkyl bedeutet);
R5 H, F, NH2, NO2, Halogen, SH oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z4 darstellen, und Y3 H oder - (CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-J0- Aikenyl, (ggf. fluoriertes) Cz-jo-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen, R8 (ggf, fluoriertes) C i-jo-Alkyl, (ggf, fluoriertes) C -io-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darsteiit; und H, I . CH3, C! :. CH2F oder CHF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Durch Substitution eines H-Atoms an R1, R3 oder R4 kann in einer dem Durchschnittsfachmann bekannten Weise eine Verbindung der Formel (I) oder (la), in der keiner der Substituenten R!, RJ und R4 -L-#l darstellt, mit einem Linker verbunden werden. Hierdurch werden Konjugate der Formel (I) oder (la) erhalten, wobei einer der Substituenten Rs, R3 oder R4 -L-#l darstellt, L itir den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht. Wenn der KSP-lnhibitor nach Formel (I) oder (la) mit einem Antikörper konjugiert ist, stellt einer der Substituenten R', R3 oder R4 also -L-#l dar, wobei L für den Linker stellt und #1 für die Bindung zum Antikörper stellt. D.h. im Falle der Konjugate stellt einer der Substituenten R1, R' oder R4 -L-#l dar, wobei -L-#l die Bindung an den Antikörper darstellt. Der Binder ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder ehimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. In einer bevorzugten Ausführungsform der Formel (1) oder (la) stellt einer der Substituenten R1 oder R3 -L- #1 dar. In dieser Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, wenn R*1 H oder -SGrvs-(CO)o-i-R4' darstellt, wobei SGivs und R4'dieselbe Bedeutung haben wie oben. In einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform der Formel (I) stellt der Substituenten R4--L-#l dar, wobei der Linker ein Linker ist, der am Stickstoffatom, das an R4 bindet, spaltbar ist, so dass nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R4 = H). Entsprechende spaltbare Gruppen werden unten näher beschrieben. Bevorzugt sind moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkende anti-TWEAKR- Antikörper. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ΪΊΈΜ- 4 anti-TWEAK -Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimäreren ITEM- 4-Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-7076.
Anstelle von -L-#l kann auch die Gruppe -L-#3 in der Verbindung vorhanden sein, wobei L für den Linker steht und #3 für die reaktive Gruppe zur Bindung an Antikörper steht. Verbindungen mit -L-#3 sind reaktive Verbindungen, die mit dem Antikörper reagieren. #3 ist vorzugsweise eine Gruppe, die mit einer Amino- oder Thiolgruppe unter Bildung einer kovalenten Bindung reagiert, vorzugsweise mit dem Cysteinrest in einem Protein. Der Cysteinrest in einem Protein kann natürlich im Protein vorliegen, durch biochemische Methoden eingebracht werden oder vorzugsweise durch vorherige Reduktion von Disulfiden des Binders generiert werden kann. Als A ist CO (carbonyl) bevorzugt.
Ais R1 ist bevorzugt -L-#l, H, -COOK, -CONHNH2, -(CH2)i.3NH2, -CONZ"(CH2)i-3 NH2 und - CONZ"CH2COOH, wobei Z" H oder NH2.
Als R2 und R4 sind bevorzugt H oder R2 und R4 steilen gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHR1!-CH2- darstellen, wobei R1 1 H oder F darstellt. Als R4 ist zudem -L-#l bevorzugt, wobei -L-#l ein spaltbarer Linker ist, vorzugsweise ein intrazellulär enzymatisch spaltbarer Linker.
Als R3 ist bevorzugt -L-#l oder eine Ci-io-Alkyl-, die ggf. mit -OH, O- Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO- Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH- Alkyl, S(0)rl-Alkyl, S02-NH-Alkyl, NH- Alkyl, N( Alkyl)?, oder NH2 substituiert, sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet).
Als R5 ist bevorzugt H oder F.
Als R6 und R7 sind unabhängig voneinander bevorzugt H, (ggf. fluoriertes) C1-3- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4~Alkinyl, Hydroxy oder Halogen.
Als Rs ist bevorzugt eine verzweigte C [.5- Alkyl-Gruppe, insbesondere eine Gruppe der Formel -
Figure imgf000027_0001
-Ry, wobei Ry -H, - OH, C02H, oder H2, oder eine (ggf. fluoriertes) C5-7- Cycloalkyi Besonders bevorzugt ist eine Gruppe der Formel ---€(013)3 oder eine Cyclohexylgruppe.
Als R9 ist bevorzugt H oder F.
Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen der Formel (i) oder (ia), in der
A CO (carbonyl) ist;
R1 H, -L-#l , -COOK, -CONHNH2, -(CH2)i.3 H2, -GÖNZ "(CH2) 1.3 H2 und -CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder NH2;
R und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR!l- oder -CHR1 !-CH2- darstellen, wobei Rn H oder F darstellt; oder R4 -L-#l ist und R2 H ist;
R' -L-#l oder eine Phenylgruppe, die ein oder mehrfach mit Halogen (insbesondere F) oder ggf. fluoriertes C^_3 Alkyl substituiert sein kann, oder eine ggf. fluorierte Ci-10-Alkylgruppe darstellt. die ggf. mit -OY4, -SY4, -O-CO-Y4 -0··(. 0- Π - Υ4. NH-CO-Y4, -NH-CO-NH-Y4, S(0)n- Y4(wobei n 0, 1 oder 2 darstellt), -SO2-NH-Y4, H-Y4, oder N(Y4)2, substituiert sein kann, wobei Y4 H, Phenyi (ggf. ein oder mehrfach rnii Halogen (insbesondere F) oder ggf. fluoriertes C1 ..3 Alkyl substituiert), oder Alkyi (wobei die Alkylgruppe mit -OH, -COOK, und/oder -NHCO-C1-3- Alkyl substituiert sein kann, und wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet) darstellt;
wobei insbesondere bevorzugt R3mit -OH, O- Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, SO2-NH- Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise Ci-3 Alkyl bedeutet);
Rs H oder F ist;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci-3-AlkyL (ggf. fluoriertes) C2-4-AlkenyL (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
Rs eine verzweigte Ci-s-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl ist; und
R I i oder F ist.
Weiterhin sind bevorzugt (allein oder in Kombination), wenn R -L-#i , COOH oder H darstellt,
R2 und R4 H sind oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) --CH2-CHRH- oder -CHR1!-CH2- darstellen, wobei R1 1 H darstellt, oder R4 -L-#l ist und R2 H ist;
A CO darstellt,
R3 -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -C H SC H 'S i(C( )! i )M K < Κ Ή .. -CHf Cl h K Κ Ί Ι .. eine Phenylgruppe, die mit 1-3 Halogenatomen, 1 -3 Aminogruppen oder 1-3 Alkylgruppen (die ggf. lialogeniert sein können, substituiert sein kann, oder -L-#l darstellt,
R" H darstellt,
R6 und R ' unabhängig voneinander H, C 1-3- Alkyl oder Halogen darstellen, insbesondere dass R6 und R7 F darstellen;
Rs C1- - Alkyl (vorzugsweise tert-butyl) oder Cyclohexyl darstellt; und' oder
R9 H darstellt.
Zudem ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn
R -L-#l, COOH oder H darstellt. R" und R4 H oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) --CH2-CHRl!- oder
CHR1 '-CH2- darsteilen, wobei R" H darstellt,
A CO darstellt,
R3 -(CH2)OH, -CH(CH3)OH, -C ' l 1 SC! '! Ιί Ο H )ί I }M !( '< Κ.Ί ί .. -CH(CH3)OCH3, eine Phenylgruppe, die mit 1-3 Halogenatomen, 1 -3 Aminogruppen oder 1-3 Alkylgruppen (die ggf. lialogeniert sein können, substituiert sein kann, oder -L-#l darstellt,
R" H darstellt,
R" und R' unabhängig voneinander H, C w-Aikyl oder Halogen darstellen, insbesondere dass R6 und R; F darstellen;
Rs Ci-4-Alkyl (vorzugsweise tert-bulyl) darstellt; und
R9 H darstellt.
Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (II) oder (IIa) auf:
Formel (II):
Figure imgf000029_0001
wobei
R1 H, -L-Binder, -MOD oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- Y'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, ■(CH2CH20)o.3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH2)o-3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei H, NH2, S03H, - COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4),.3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, O-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Asyl oder Benzyl darstellt; R2 H, -MOD, -CO-CHY'-NHY5 oder -(CH2)o-:>Z darstellt, wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C w Alkyi oder gegebenenfalls mit - Eb substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY^Ni-k darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C« Alkyi darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y unabhängig voneinander H, NH2, oder -(QHbJo-sZ' darstellen, und YJ H oder -
(CH2)0-3Zi darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R4 H, -L-Binder, -SGlys »(CO)0..] -R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt,
wobei SG}VS eine durch lysosornale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, Rheine Ci-10-Alkyi-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, C 1-10- Alkyl-O-Cö-io- Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, Ci- lo-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heteroeyeloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit -NH , -NH- Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(A3kyl)-COAlk:yl, -SO3H, -SO2 H2, -S02-N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Aikyl)2, oder OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)y- darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R^" -H, -Alkyi (vorzugsweise Ci-n-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NYV, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y" unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H oder -
(CH 0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Cj -6 Alkyi oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C1-6 Alkyi darstellt;
oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei Rn H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), C M Alkyi, Cj. 4 Haloalkyl, CM Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes CM Alkyi, COO(Cj-4 Alkyi) oder OH darstellt;
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-Binder, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyi-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Ci-10-Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-i o-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O- Alkyi Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO- Alkyi Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyi Gruppen, 1-3 - H-CO- H-Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)n-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SC)2-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(AIkyl)2 Gruppen, 1-3 -NKb Gruppen oder 1 -3 -(CH_V iZ Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY?, -ΝΗΥ', -CO-ΝΥ'Υ2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2J0-3Z ' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o.3-CH(NHCOCH3)Zi,-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Cj-io-Alkyl bedeutet);
R5 H, H2, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, -CH2F, ~CH2F, SH oder - (CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und YJ H oder - (CH2)o-3Zi darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) C O- Alkyl, (ggf, fluoriertes) C2-J0- Alkenyl, (ggf, fluoriertes) C2-io-Alkinyl, Hydroxy, NO2, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) Ci-io- Alkyl, (ggf. fluoriertes) CVio-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C io-Cycloalkyl oder-(CH2jo-2-(HZ2) darstellt, wobei HZ2 ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen avasgewählt aus N, O und S darstellt, wobei jede dieser Gruppen mit ---OH, CO2H oder NH2 substituiert sein kann darstellt; H, F, CH3, C! :. CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -(NR10)n-(Gl)o-G2-G3 darstellt, wobei
R 10 H oder Cj-C,- Alkyl darstellt;
Gl -NHCO-, oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R10 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 3 ist; und
G2, eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit I bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SO2, -NR '-, -NRYCO-, CONR -, -NRWR -, -S02NRyNR>'-, -C< !\ R> \ R> -. (wobei Ry H, Phenyl, C [ -C| Q-Aikyl, C2-C [ Q-Aikeny3, oder C2-C] g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR^N-O- (wobei Rx H, Cj^-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit M ICONi b. -COOK, -OH, ~NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert, sein kann, G3 -H oder - -COOH darstellt, und wobei die Gruppe - MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate und Salze der Solvate und Epimere.
Im Falle von Binderkonjugaten der KSP-Inhibitoren der Formel (II) kann maximal ein Vertreter von R1, RJund R4 (alternativ zu einer der oben angegebenen Bedeutungen) -L-Binder darstellen, wobei L für einen Linker steht und BINDER für den Antikörper steht, wobei der Antikörper ggf, an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann.
Formel (IIa):
Figure imgf000032_0001
wobei
Rl -L-BINDER, H, oder -(CH2)<MZ darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, -(CH2CH20)o- (CH2)0_3Z', oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 Ii oder -(ΟΗ2)ο-3Ζ' darstellt, wobei Z' H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2- CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY )i.3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt; wobei Y lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCO H2 substituiertes, Cj-sAlkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Ar l oder Berizyl darstellt;
R2 und R4 unabhängig voneinander H, -SG!vs-(CO)0.] -R4', -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellen, darstellen, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2- CHR11- oder -CHRH-CH2- darstellen, oder R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt und R4 --L-#l darstellt, wobei R10 H, H2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, C Haloalkyl, C1-4 Aikoxy, Hydroxyl-substituiertes C 1-4 Alkyl, COO(Cj-4 Alkyl) oder OH darstellt;
wobei SGiyS eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, 4'eine Ci-io-Alkyt-, Cs-io-Aryi- oder Cö-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyi-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heteroeyeloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Cuo-Alkoxy-, Ce-jo-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, O- lo-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycioalkoxy-Gruppe darstellt, die ein oder mehrfach mit - H2, - H-Alkyl, -N(Alkyl)2, H-CO-Alkyl, N(Alkyl)-€OAlkyl, ~S03H, -SO-M I;. -SO2- N(Alkyl)2, -COOH, -CONH2, -CON(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox-(CH2CH20)yR4' ' darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise CM2- Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder ~CH2-CH2- H2darstelit);
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, HY3, -CO-ΝΥΎ2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(Ci-fcjo-sZ' darstellen, und Y} H oder -
(CH2J0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Cw Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ' H oder -CO-CHY°-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes C i-e Alkyl darstellt;
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R3 --L-BINDER oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Helerocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Ci-io-Alkyl-, Ce-io-Aiyl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 3 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1 -3 O- Alkyi Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1 -3 -S- Alkyl Gruppen, 1 -3 - O-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO- H- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO- NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1 -3 -SO2-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NYV, oder -CO-OY3 darstellt, mit Ys und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3 darsteilen, und Y"
H, -(CH2) -3-CH(NHCOCH3)ZI,-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMO- Alkyl bedeutet); R5 H, F, H2, O2, Halogen, SH oder -(CH2V3Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - HY3, -CO- YlY2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Υ ' und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CEb sZ' darstellen, und Y3 H oder - (CH2J0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt;
wobei L für einen Linker steht und BINDER für Binder bzw. Derivat hiervon steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann,
R" und R ' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) G-jo-Alkyl, (ggf. fluoriertes) CJ-IO- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,
R8 (ggf. fluoriertes) Ci-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) Gwo-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Weiterhin sind erfindungsgemäß bevorzugt folgende SP-inhibitoren-Antikörper-Konjugate:
Formel (IIb):
Figure imgf000034_0001
wobei R1, R2, R4, R5, R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, A CO darstellt, B eine Einfachbindung, -O-CH2- oder -CH2-O- darstellt, und R20 NH2, F, CF3, oder CH3, und n 0, 1, oder 2 darstellt. Formel (IIc):
Figure imgf000035_0001
wobei A, R1, R3, R6, R7, R8, und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aulweisen, wobei A vorzugsweise CO und R3 -CH2OH, -CH2OCH3, CH(CH3)OH oder CH(CH3)OCH3 darstellt.
Formel (Ild):
Figure imgf000035_0002
wobei A, R3, R6, R;, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, wobei A vorzugsweise CO und R3 -CH2-SX-(CH2)<M-CHY*-COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt.
Formel (Ile):
Figure imgf000036_0001
wobei A, R2, R3, R4, R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, und R1 -L-BINDER darstellt.
Formel (Iii):
Figure imgf000036_0002
wobei A, R1, R2, R3, R6, R ', R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, und -L-BINDER darstellt, vorzugsweise einen enzymatisch spaltbaren Binder, so dass nach Spaltung =H. R1 oder R3 stellen besonders bevorzugt -MOD dar.
Formel (ITj):
Figure imgf000037_0001
wobei
R3 -L-#l darstellt;
A CO darstellt; und
R6, R7, R8 und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) aufweisen
Formel (Ilk):
Figure imgf000037_0002
(Ilk) wobei
R: L-#l darstellt;
Ä CO und R3 CM OH darstellt;
R3, R6, R7, R8, und R9die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) aufweisen.
Weiterhin sind bevorzugt in den Verbindungen der Formeln (TT), (IIa), (IIb), (Tic), (IM), (lie), (Iii), (Tlj) und (Ilk) (allein oder in Kombination), wenn:
Z Cl oder Br darstellt; R1 -(CH2V3Z darstellt wobei Z -COOH oder -CO-ΝΥΎ2 darstellt, wobei Y2 -(CH2CH20)o-3-
(CH2)0_3Z' und Y' H, NH2, oder -(CH2CH20)o-3-(CH2)() ..Z'darstellt;
Y[ H darstellt, Y2 -(CH2CH20)3-CH2CH2Z' darstellt und Z' -COOH darstellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt und -(CONHCHY^COOH stellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, T ~(CONHCHY4)2COOH stellt und eine Y4 i-propyl darstellt und der andere ein - CH2)j-NHCONH2 darstellt ;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und eine Y4 -CH3 darstellt und der andere ein - (CH2);;- HCONH2 darstellt ;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, C« Alkyl darstellt; mindestens ein Vertreter von Y4 ausgewählt wird aus i-propyl oder -CH3.
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -CONHCHY'COOH darstellt und Y4 gegebenenfalls mit
-NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
Y4 Aminobenzyl darstellt;
R2 {Ci !.·)<. ./' darstellt und Z -SY3 darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5 H darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5-CO-CHY6-NH2 darstellt; oder
Y lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls substituiertes mit -NHCONH2 Ci-6 Alkyl darstellt.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn R1, R2 oder R3 in Formel (I) oder (II) -MOD darstellt.
Besonders bevorzugt stellt R3 -MOD und R1 oder R4 -L-#3 bzw. -L-BTNDER dar, wobei -MOD -(NRJ%-(G1)0-G2-G3 darstellt, wobei
R10 H oder Ci-C,- Alkyl darstellt;
Gl -NHCO-, oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, Ri0 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch, eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SO2, -NRY-, -NRYCO-, CONRJ-, -NRYNRY-, .SU2NR> N R -. -CO RY Ry-, (wobei Ry H, Phenyl, C -C I Q- Alkyl, C2-C Q-Alkenyl, oder C2-C1 Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR*=N-0- (wobei Rx H, Cj-Cß-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfbxid, oder Sulionsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;
Besonders bevorzugt weist die Gruppe -MOD eine (vorzugsweise terminale) -COOH-Gruppe auf, z.B. in einer Betaingruppe. Vorzugsweise weist die Gruppe -MOD die Formel -CH2-Sx-(CH2)o-4- CHY5-COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -GOCH-, darstellt.
Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (III) auf:
Figure imgf000039_0001
wobei
Rl -L-BINDER, H, oder -(CH2)(wZ darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO- ΝΥ'Υ2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y' und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2CH20)o-3-(CH2) Z' oder - CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z l darstellt, wobei Z' H, NH2, SO3H, COOH, - NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4)i.3COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCCX H2 substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 und R4 unabhängig voneinander II, -SGlys-(CO)0-i -R4', -CO-Cl I V- N H Y ' oder ~(CI-I2)( Z darstellen,
, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines PyiTolidinringes) -CH2-CHR1 '- oder -CHR"- CH2- darstellen, wobei Rn H, NH2, SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, C 1-4 Haloalkyl, CM Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes CM Alkyl, COO(Ci- Alkyl) oder OH darstellt; wobei SGjyg eine durch lysosornale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, 4'eine Ci-io-Alkyl-, C$.10- Aryl- oder Gwo-Aralkyl-, Cs-io- Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cs-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Aikoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, Ci- lo-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heteroeyeloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH2, - NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, -SO2NH2, -S02-N(Alkyl)2, - COOH, -CONH2, -CON(Alkyi)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -Ox- (CH2CH20)y-R4" darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R4" - H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-w-Alkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt);
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NYY2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH^Z' darstellen, und Y3 H oder - iC! H, ■:/.■ darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Cj-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY*-NH2 darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes Ci-β Alkyl darstellt;
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-BINDER, eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe, oder-CH2-Sx-(CH2)<M-CHY5-COOH darstellt, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3. darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine CV10- Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-ic-Aiyl- oder Cs- 10-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1 -3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Grappen, 3 -3 -S-Aikyl Gruppen, 1 -3 -O-CO- lkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH- Alkyl Gruppen, 3 -3 - NH-CO-Alkyl Grappen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyl Grappen, 1 -3 -S(0)n-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SO2- NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder I - 3 -(CH2y3Z Grappen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z ' darstellen, und Y3 H, -(CH2) .3-CH(NHCOCH3jZ%-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -;( Ί ί ·},· ;/.' darstellt, wobei H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,
substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Cwo-Alkyl bedeutet);
R5 H, F, NH2, NO2, Halogen, SH oder .(CH2)o.jZ darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt, wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-:;ZL darstellen, und Y3 H oder - (CH2)0-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOK darstellt; wobei L für einen Linker steht und BINDER für den Antikörper steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann,
R6 und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-ur-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-J0- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-jo-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,
Rs (ggf. fluoriertes) Cno-Alkyl, (ggf. fluoriertes) Gno-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Weiterhin sind bevorzugt (allein oder in Kombination), wenn in Formel (I), (la), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (I ), (He), (Iii), (Ilj), (Ilk) oder (III):
Z Cl oder Br darstellt;
R1 -(CH2)O-3Z darstellt, wobei Z -CO-NY'Y2 darstellt, wobei Y2
Figure imgf000041_0001
und Y1 II, NH2, oder .· Π ! ·Π ί < >}» ; ·((. ! { ·),_ ./ 'darstellt:
Y[ H darstellt, Y2 - ! ( Ί ΙΛ Ί M >) : -Π !.< ! !. /· darstellt und 7 -COOK darstellt;
Υ' H darstellt, Y'2 -CH2CH2Z' darstellt und Z' -(CONHCHY )2COOH stellt;
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY )2COOH stellt und ein Vertreter von Y4 i- propyl darstellt und der andere iCH -} -\ f IC< >\H; darstellt ;
Yl H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -(CONHCHY4)2COOH stellt und ein Vertreter vonY4 - CH3 darstellt und der andere K Ί i;) ;- N! K OX H darstellt ;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit - -NHCONH2 substituiertes, C w Alkyl darstellt; mindestens ein Vertreter von Y4 ausgewählt wird aus z'-propyl or -CH3.
Y1 H darstellt, Y2 -CH2CH2Z' darstellt, Z' -CONHCHY'COOH darstellt und Y gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryt oder Benzyl darstellt;
Y4 Aminobenzyl darstellt;
R2 -(CH2)o-3Z darstellt und Z -SY3 darstellt;
R4 -CO-CHY4-NHY5 darstellt und Y5 H darstellt;
R4 -CO-CHY4~NHY5 darstellt und V CO-CH Y' - N H - darstellt; und/Oder
Y4 lineares oder verzweigtes gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes Ci-β Alkyl darstellt. Weiterhin sind bevorzugt Verbindungen der Formel (I), (Ia), (II), (IIa) oder (III),
wobei
R' H, -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder -(CH2V3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY1 Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH2)o-3Z '), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH2)o-3Z' darstellt, wobei 7 H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4))-3COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH? substituiertes, Cj-s Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Ar l oder Berizyl darstellt;
R2 H, -CO-CHY4-NHY5 oder -(CWWJZ darstellt,
wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NYV, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y1 unabhängig voneinander H, H2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH O-BZ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 unabhängig voneinander lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCO H2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ' H oder -CO-CHY^Ntb darstellt, wobei Y6 lineares oder verzweigtes Ci-e Alkyl darstellt;
R4 H oder -L-#l bzw. -L-BINDER darstellt (wobei -L-#l bzw. -L-BINDER ein enzymatisch spaltbarer Linker ist, der zur Umwandlung von R4 zu H führt);
A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine C1-10- Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroaikyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs-io- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 O- Alkyl Gruppen, 1-3 --SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gappen, 1-3 -NH-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0)n-Alkyl Grappen, 1-3 -SO2-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH((CH2CH20) .2oH)-Gruppen, 3 -3 -NH2 Gruppen oder 1 -3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- ΝΥ'Υ"2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y1 und Y2 unabhängig voneirjander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)o.3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder -(CH2)o-3Z ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt CMÖ- Alkyl bedeutet); R5 Ii, -MOD, \ H . NO2, Halogen (insbesondere F, Ci, Br), -CN, CF3, ~OCF3, C t I i -CH2F, SH oder -(CH2V3Z darstellt, wobei Z -II, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY 'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH_, oder -(CHyo-sZ4 darstellen, und Y3 H oder - (Π Η, ;/· darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R" und R ' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) G-jo-Alkyl, (ggf. fluoriertes) CJ-IO- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) Cj-io-Alkinyl, Hydro xy, NO?., NEfe, COOH oder Halogen (insbesondere F, CI, Br) darstellen,
R (ggf. fluoriertes) Ci-i©-Alky!, (ggf. fluoriertes) C2-io~Alkenyl, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkinyl, oder (ggf. fluoriertes) CVio-Cycloalkyl; wobei einer der Substituenten R! und R3 -L-#l bzw. -L-BINDER darstellt,
L für den Linker sieht und #1 für die Bindung zum Antikörper und BINDER für den Antikörper steht,
R9 H, F, CH3, CF3, CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -(NRJ%-(G1)0-G2-G3 darstellt, wobei
R10 II oder Ci-C3-Alkyl darstellt;
Gl -NHCO-, oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, Ri0 nicht NH2 ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte ohlenwasserstoögrappe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
SO-, SO2, - RY-, -NRYCO-, CONRJ-, -NRYNRY-, .SU2NR> N R -. -CONRYNRy-, (wobei Ry H, Phenyl, Ci -Ci Q-Alkyl, C2-C iQ-Alkenyl, oder C2~Ci 0-Alki yi darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -C'3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Ko lenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Suli n, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epirnere.
Weiterhin sind bevorzugt Verbindungen der Formel Formel (I), (la), (II), (IIa) oder (III), in denen
R1 H, -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder -(CH2)o-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, H2, -(CH2CH20)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH o-sZ'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen, und Y3 H oder -(CH^Z' darstellt, wobei H, NH2, SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH oder -(CO-NH-CHY4),.3COOH darstellt; wobei W Ii oder OH darstellt,
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;
R2 H, -CO-CHY -NHY5 oder -(Cft^Z darstellt,
wobei Z -Ii, Halogen, -OY3, -SY3, NHY3, -CO-NY'Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander Ii, NH2, oder -(CH2)Ö..3Z' darstellen, und Y3 H oder -
(CH2)0-3Zi darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
wobei Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y5 H oder -CO-CHY6-NH2 darstellt, wobei Y° lineares oder verzweigtes d-e Alkyl darstellt;
R4 I i darstellt,
A CO, SO, SO2, SO M i oder CNNH2 darstellt;
R3 -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine CMO- Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalk l-, C i-io-Alkyl-0-C6-io-Ar l- oder Cs-jo- Heierocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gnippen, 1 -3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -S(0)n- Alkyl Gruppen, 1 -3 -SO2-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 ~NH((CH2CH20) [ .2oH) -Gruppen, 1 -3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)o-3Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, -NHY3, -CO- Y'Y2, oder -CO-OY3 darstellt, mit Y 1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2V3Z' darstellen, und Y3 H, -(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z',-(CH2)Ö..3-CH(NH2)Z', oder - ί I I. >,5■ : darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Ci-10-Alky] bedeutet);
R5 H, -MOD, NH , NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF3, -OCF3, ~CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)0-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, NHY3, -CO-NY!Y2, oder -CO-OY3 darstellt,
wobei Y1 und Y2 unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)Ö-3Z' darstellen, und Y3 H oder - (CH2)0-3ZI darstellt, wobei Z' Η, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;
R6 und R' unabhängig voneinander H oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen;
R8 (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl darstellt; wobei einer der Substituenten R' und R3-L-#l bzw. -L-BINDER darstellt,
L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper und BINDER für den Antikörper steht, H, F, CH3, C T :. CH2F oder CHF2 darstellt; wobei -MOD -CH2-Sx-(CH2/V4-CHY5-COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt, sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Weiterhin sind die folgenden Verbindungen bevorzugt, die ggf. gemeinsam mit einer Säure wie z.B. Trifluoressigsäure vorliegen können. Diese Verbindungen können über die Positionen entsprechend den Positionen R!, R3 und R4 über einen Linker an den Antikörper gebunden werden (wobei ein Wasserstoffatom durch den Linker substituiert wird):
Ν-(3-ΑΓθϊηορΓοργ1)-Ν-{(^)-1-[1-0εηζγ1-4-(2,5-άϊιΊυοφ3ΐ6ηγ1)-1Η-ργιτο1-2-γ1]-2^- di methy Ipropy 1 } - 2 -hydroxy ac etamid;
(2S)-2-arIlino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-dffluo herlyl)■lH■ yrro3-2■yί]-2,2■
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-methylbutanamid(l : l); N-(3-Aminopropyl)-N- {(lS)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyiTol-2yl]-2,2- dime thylpropy 1 } ac etamid ;
N■(3■AϊDino ro l)-N-{(lS)-l■[l■benzyM■(2,5■difluo henyί)-lH- yπ·oί-2- l]-2,2■
dimethy lpropy i } -2 - hy droxy ac etamid ;
S-(l-{2-[(N-{(2S)-2-Amko-4-[{(lR) ^
dimethylpropyl} (glycoloyl)aroino3butanoyl} -beta-alanyl)amino]ethyl} -2,5-dioxopyirolidin-3-yl)- L-cystein;
S~(i~ {2~[(N~{(2S)~2-Amino-4~[ {ilRH^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -beta-alanyl)ammo]elhyl}-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)- L-cystein;
S-[l-(2-{[2 {(2S)-2-Amino-4-[ {(^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl}aniino)ethyl]aiiiino}-2-oxoethyl)-2,5-dioxopyrrolidiri- 3-yl]-L-cystein;
N-[ 19-(3(R/S)- {[(2R)-2- Amino-2-carboxyethyl]sulfan.yi } -2,5-dioxopyrrolidii!- 1 -yl)- 17-oxo- 4,7, 10, 13-tetraoxa- 16-azanonadecan- 3 -oyl]-R/S- {2-[(3-aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5- difluoφhen l) H yrroi-2- l]-2,2-dimethyl Γo ί}amino]-2-o oethyl} homocysίem^
S- {(3R S)-H2<{(2S)-2-Ammo^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} aniino)ethyl]-2,5-dioxopyrrolidiii-3-yl} -L-cystein; S-[(3R/SH-(2-{[6-({2^(3-Aminopropy
2,2-dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)hexanoyl]amino} ethyl)-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl]- L-cy stein;
S- { 1 -[2-( {[(1 R,3S)-3-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)cyclopentyl]carbonyl } amino)ethyl]-2,5- dioxopyrrolidin-3 -yl } -L- cyste in;
S-{2- {[2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glyeoloyl)aminolbutanoyl} amino)ethyl]amino} -2-oxoethyl)-L-cystein;
6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)- i -[ 3 -benzyl-4-(2,5-diiluorpheny3)-lH-pyrrol-2-y^
dimethylpropyl} {glycoloyl)aniino]butanoyl} -beta-alanyl -N"
carboxyethyi]sulfanyl}-2,5-dioxopyrroiidin-l-yl)hexanoyl]-L-vaiyl-L-alanyl}-^
N-[2-( {(2S)-2-Ainino-4-[ {(1R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}ammo)ethyl]-L-glutamiri;
*-( r- {(2S)-2-Amino-4 {(lR)-Hl-be^
dimethylpropyl} (gly coloyl)amino] butanoyl} -beta-alanyl)-L-ly sin; Ν-(3-ΑιώηορΓοργί)-Ν-{(1 )-1-[1^ηζγ1-4-(2,5-άίΑυοφΛοηγί)-1Η-ργπτο1-2-γ1]-2^- dimethy]piOpyl}-3,3,3-trifluorpropanamid;
N-(3-Aminopropyl)-N- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-4-fluorbenzamid;
N-(3-Aminopropyl)-N- {(1R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynOl-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} acetamid;
N-(3-AminopiOpyl)-N- {(l R)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -4-(trifluoromethyl)benzamid;
(28)-2-Αιιιίηο-4-[ {(^)-1-[1 ^6ηζγ1-4-(2,5-άίΑπο Η6ηγ1)-1Η-ρ> το1-2-γ1]-2,2-άίιιιεύιγ1ρΓοργ1} (glycoloyl)amino]butansäure;
Figure imgf000047_0001
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanamid;
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[
Figure imgf000047_0002
dimethylpropyl}(glycoloyl)arnino]butano
amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure;
4-[(2-{[2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l-be^^
dimethylpropyl}(glycoloyl)aimno]butanoyi}aniino)ethyl]aniino f[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure;
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( i R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyi)ammo]butanoyl } -beta-alanin;
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -L-serin;
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorplienyl)-lH-pyrrol-2-yi3-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -L-alanin;
N- {(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)- l -[ l -benzyl-4-(2,5-difluoφheny])-lH-pyπΌl-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (g]ycoloyl)amino]butanoyl } glycin;
N-(3-ammopropyl)-N- {(1R)-1 -[ I -ber!zyi-4-(2,5-difl!ioroher!yl)-lH-pynOl-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } -4-methylbenzamid; N-(3-amirtopropyl)-N- {(1R)-1 -[ I -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimetliylpropyl } -4-(methylsulfanyl)benzamid;
(2S)-N-(3-ammopropyl)-N-{(lRH-[1 >e^^
dimethylpropyi} -2-hydroxypropanamid;
N-(3-aminopropyl)-N- {(1R)-1 -[ 1 -benzyi-4-(2,5-difluorphei!yl)-lH-pyrrol-2-yl]-2y2- dimethylpropyl} -2-(methylsulfanyl)acetamid;
(2S)-N-(3-aminopΓopyl)- - {(lR) 4-beIlzyl -(2,5-dinuo henyl) H yrazol-3- l]-2,2- dimethylpropyl} -2-hydroxypropanamid;
Meihyl-4-[(3-arninopropyl) {(iR)-l-[l^^
dimethylpropyi} amino]-4-oxobutanoat;
4- [(3-Aminopropyl) {(lR)-l -[l-berlzyl-4-(2,5-difluo herlyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-4-oxobutansäure;
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-Amino-2-carboxyeihyl]sulfanyl}-2,5-dioxopy^
aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difhH^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino]-2-oxoethy] } sulfanyl)methyl]-4,20-dioxo-7, 10, 13, 36-tetraoxa-3 Λ 9- diazadocosan- 1 -säure;
N-Acetyl-S- {2-[(3-annnopropyl) {(lR)- l -[l-benzy^^
dimethylpropyi} amino] -2-oxoethyä } -L-cystein;
N-Acetyl-S-[2-([3 L-alanylammo)^^^^
yl]-2,2-dimethylpropyl} amino)-2-oxoethyl]-L-cystein;
(2S)-N-(3-aminoprop l)-N- {(lR)-l-[l -bellzyl-4-(2,5-diflυoφhenyl)-m-pyrrol-2-yl]-2,2- dirne thy lpropy 1 } telr ahydrofur an-2 - e arboxarnid:
3- ( {2-[(3-Aminopropyl) {(1R)- 1 -[ 1 -benzyt-4-(2,5-difluo llenyi)-lH- yrrot-2-y!]-2,2- dime thy lpropy 1 } amino] -2 -oxoethyl } sulfanyl)propansäure;
5- {2-[(3-Aminopropyl) {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difliiorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2^
dimethylpropyi }amino]-2-oxoethyl}homocystein;
4- amino-N-(3-aminopropy])-N- {(lR)- l -[l-be^
dimethylpropyi }benzamid;
4-[(2» {[(2R)-2-({(2S)»2-Animo-4-[ {(^
dimethylpropyi} (glycoloyl)amino]butanoyi} amino)-2-carboxyethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-3-
{[(2R)-2-aniino-2-carboxyethyl]sulfanyi}-4-oxobi[iansäure;
4-[(2- {[(2R)-2-( {(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)-l -^
dimethylpropyi} (glycoloyl)amino]butanoyi} araino)-2-carboxyethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-2- {[(2R)-2-amirjo-2-carboxyethy]]sulfanyl}-4-oxobutarjsäure. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen der Formel IV, wobei R1, R2, RJ, R4 und R5 die oben genannten Bedeutungen (wie z.B. für Formel (I) oder (II) angegeben) haben:
Figure imgf000049_0001
Formel IV
Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der Formeln IV, wobei R! und R5 H oder -L-#l darstellen; R und R4 H oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2- CHRi]- oder -CHRi]-CH2- darstellen, wobei Rn H darstellt; und R3 CH2OH, CH(CH3)OH oder - L-#l darstellt, wobei einer der Substituenten R!, und R3 -L-#l darstellt. Zudem sind besonders bevorzugt die Verbindungen der Formeln IV, wobei R1 H oder COOH darstellt; Rz und R* H darstellen; R4 -L-#l darstellt; und R3 CH2OH, oder CH(CH3)OH darstellt, wobei-L-#l ein enzymatisch spaltbarer Linker ist, der zur Umwandlung von R4 zu H führt darstellt.
Linker
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Binder wie z.B. Antikörper bekannt (siehe z.B. K. Lang and J. W. Chili. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian et al. Bioconjiigate Chem. 2013, 24, 1277- 1294). Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der KSP-Inhibitoren an einen Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers, die entweder als freie Thiole bereits vorliegen oder durch Reduktion von Disulfidbrücken generiert werden, und/oder über eine oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, den KSP-Inhibitor an den Antikörper über Tyrosinreste, über Giulaminreste, über Reste unnatürlicher Aminosäuren, über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden. Zur Kopplung werden sogenannte Linker verwendet. Linker lassen sich in die Gruppe der in vivo spaltbaren Linker und in die Gruppe der in vivo stabilen Linker unterteilen (siehe L. Ducry und B. Stump, Bioconjiigate Chem. 2_1, 5-13 (2010)). Die in vivo spaltbaren Linker weisen eine in vivo spaltbare Gruppe auf, wobei wiederum zwischen chemisch in vivo spaltbaren und enzymatiseb in vivo spaltbaren Gruppen unterschieden werden kann. „Chemisch in vivo spaltbar" bzw. „enzymatiseb. in vivo spaltbar" bedeutet, dass die Linker bzw. Gruppen im Blutkreislauf stabil sind und erst an bzw. in der Zielzeile durch die dort veränderte chemische bzw. enzymatische Umgebung (niedrigerer pH-Werl; erhöhte Glutathion-Konzentration; Vorliegen lysosomaler Enzyme wie Proteasen, oder Glyosidasen wie beispielsweise ß-Glucuronidasen) sich spalten, um so den niedermolekularen KSP-Inhibitor oder ein Derivat davon freizusetzen. Die chemisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; die enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen, insbesondere solche, die durch iysosomale Enzyme spaltbar sind, sind insbesondere 2-8-Oligopeptidgruppe, insbesondere eine Tri- oder Dipeptidgruppe oder Glycoside. Peptidspaltstellen sind in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, sowie Bioorganic & Medicinal Chemistry Leiters 8 (1998) 3341-3346 sowie Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626 offenbart. Hierzu gehören z.B. Vahn- Alanin, Valin-Lysin, Valin-Ciiruilin, Alanin-Lysin und Phenylalanin- Lysin (ggf. mit zusätzlicher Amidgrappe).
Die in vivo stabilen Linker zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus (weniger als 5 % Metabolite nach 24 Stunden in Plasma) und weisen die oben genannten chemisch oder enzymatisch in vivo spaltbaren Gruppen nicht auf.
Der Linker -L- weist vorzugsweise eine der folgenden GrundstruktureD (i) bis (iv) auf:
(i) -(CO)rn-SGl~Ll~L2- (ü) -(CO)m -L 3 -SG-L 3 -1,2- (iü) -(CO) -L1-L2-
(iv) ·( ·< )).. ι I - SG - I :> wobei m 0 oder 1 ist; SG eine (chemisch oder enzymatisch) in vivo spaltbare Gruppe (insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit einer Protease spaltbare 2-8- Oligopeptidgruppe) ist, SGI eine Oligopeptidgruppe oder vorzugsweise eine Dipeptidgruppe ist, LI unabhängig voneinander für in vivo stabile organische Gruppen stehen, und L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder oder eine Einfachbindung steht. Die Kopplung erfolgt hierbei vorzugsweise an einen Cysteinrest oder einen Lysinrest des Antikörpers. Alternativ kann die Kopplung an einen Tyrosinrest, Glutaminrest oder an eine unnatürliche Aminosäure des Antikörpers erfolgen. Die unnatürlichen Aminosäuren können beispielsweise Aldehyd- oder Ketogruppen (wie z.B. Formytglycin) oder Azid- oder Alkingruppen enthalten (siehe hierzu Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem.Rev. 2014, 1.14, 4764-4806). Erfindungsgemäß bevorzugt ist insbesondere die Linker-Grundstruklur (iii). Die Verabreichung eines erfmdungsgernäßen Konjugats mit einer Linker-Grundstruktur (iii) und Kopplung des Linkers an einen Cyste n- oder Lvsinrest des Antikörpers führt durch Metabolisierung zu Cystein- bzw. Lysinderivaten der folgenden Formeln:
Figure imgf000051_0001
wobei LI jeweils an den niedermolekularen KSP-Inhibitor gebunden ist, z.B. einer Verbindung der Formel (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (Ilca), (IM), (He), (Iii), (III) oder (IV).
Erfindungsgemäß bevorzugt sind auch die Linker-Grun<3stn_kturen (ii) and (iv), insbesondere bei Anbindung an die Position R^ , insbesondere wenn die Gruppe LI eine der folgenden Strukturen aufweist:
(a) --NH-(CH2)o -(CHCH3)w-CHY5-CO-Y7 , wobei Y5 II oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder■ COCH3 darstellt, und Y'' eine Einfachbindung oder -NH -(CH2)o-4 -CHNH2-CO- darstellt, so dass nach der Spaltung die entsprechende Struktur -NH-(CH2)( -(CHCH3)< -CHY5-COOH bzw. -NH- (CH2)o-4-(CHCH3)o-4-CHY5-CO-NH -(CH2)o-4 -CHNH2-COOH erhalten wird.
(b) -CH2-SX-(CH2)<M-CHY5-CO- auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y5 H oder NHY6 darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt, so dass nach der Spaltung die entsprechende Struktur -CH2-SX- ί ί Π ):, .:- 'H Y · (.·( X )l l erhalten wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch die Linker-Grundsiruktur(i) bei Anbindung an die Position R4, insbesondere wenn m=0.
Wenn der Linker an eine Cystein -Seitenkette bzw. einen Cysteinrest gebunden ist, leitet sich L2 vorzugsweise von einer mit der Sulfhydryl-Gruppe des Cysteins rea.ktiven Gruppe ab. Hierzu zählen Haloacetyle, Maleimide, Aziridine, Acryloyle, Aryiierende Verbindungen, Vinylsulfone, Pyridyldisuifide, TNB-thiole and Disulfid-reduzierende Mittel. Diese Gruppen reagieren in der Regel elektrophil mit der Sulfhychyl-Bindung unter Bildung einer Sulfid (z.B. Thioether)- oder Disulfid-Brücke. Bevorzugt sind stabile Sulfidbrücken. L2 ist vorzugsweise
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000052_0002
wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, if~ die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
R22 COOH, COOR, COR, CO HR, CONR2 (mit R jeweils Cl-3-Aikyi), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt.
Besonders bevorzugt als L2 ist:
Figure imgf000052_0003
Formel A3
bzw.
Figure imgf000053_0001
Formel A4 wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, fr die Verknüpfungsstelle mit dem Wirkstoff kennzeichnet, x 1 oder 2 darstellt, und R^2 COOH, COOR, COR, CÖNR2, CONHR (mit R jeweils Ci-3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt. Bevorzugt ist es, wenn x=l und R~ COOH darstellt.
In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A3 oder A4 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000053_0002
vor.
Erfindungsgemäß wird LI vorzugsweise durch die Formel
#L_(NR 10)n-(Gl )o~G2-#2
dargestellt, wobei
R10 H, NH2 oder C -C .-Ai kyi darstellt; — N N CO . . ,
G 1 -NHCO- , -CONH- oder \ / darstellt; (R 10 ist vorzugsweie nicht NH2 , wenn G 1
— CO
NHCO oder \___J ),
n 0 oder 1 ist;
0 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatonien aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gappen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NRY-, -
NRYCO-, -C(NH)NRy-, -CONRY-, -NRYNRY-, -S02NR>'NRy-, -CONRYNRy-, (wobei Ry H, Phenyl, C1 -Ci Q-Alkyl, C2-C i Q-Alkenyl, oder C2~Ci 0-Alki yi darstellt, die jeweils mit
NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -Cß-Alkyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozykius mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
/ \
— N-CO—
\ / ), wobei die Kohlenwasserstoffl ette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH~CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohienwasserstoifkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/Oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis
1 Ogiiedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozykius mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
/ \
— N-CÖ—
V / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -
OH, -NH2, NH-CN H2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
G2, ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen - O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH-, -CR'HN-O- (wobei Rx H, C \ -C3-Alky] oder Phenyl darstellt) und einen 3 bis 10-gliedriger, z.B. 5 bis lOgliedriger aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus , O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
/ \
- --N N CO
\ / ), wobei Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-C H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise
Figure imgf000055_0001
wobei Rx H, C j -C ^-Alkyi oder Phenyl darstellt.
Hierbei ist n\ die Bindung zum KSP-Inhibitor und iß die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).
Eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen umfasst in der Regel einen ,ω-divalenten Alkylrest mit der jeweils angegebenen Zahl von Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-l ,2,-diy! (1,2-Ethylen), Propan-1,3- diyl (1,3-Propylen), Butan- 1,4-diyl (1,4-Butylen), Pentan-l,5-diyl (1,5-Pentylen), Hexan- 1 ,6-diyl (1,6-Hexylen), Ηφί8η-1,7-<Ηγ1 (1,7-Hexylen), Ocian-l ,8-diyl (1,8-Octylen), Nonan-l,9-diyl (1,9- Nonylen), Decan-l,10-diyl (1,10-Decylen). Die Alkylengruppen in der Kohlenwasserstoffkette können jedoch auch verzweigt sein, d.h. ein oder mehrere H- Atome der oben genannten linearen Alkylengruppen können ggf. durch Cl-10-Alkylgruppen substituiert sein und so Seitenketten bilden. Die Kohlenwasserstoffkette kann weiterhin cyclische Alkylengruppen (Cycloalkandiyl) enthalten, z.B. 1 ,4-Cyclohexandiyl oder 1 ,3-Cyctopentandiyl. Diese cyclischen Gruppen können ungesättigt sein. Insbesondere können in der Kohlenwasserstoffgruppe aromatische Gruppen (Arylengruppen) vorliegen, z.B. Phenylen. Auch in den cyclischen Alkylengruppen und den Arylengruppen können wiederum ein oder mehrere H-Atome ggf. durch Cl-10-Alkylgruppen substituiert sein. Es wird so eine Kohlen wasserstoffkette gebildet, die ggf. verzweigt ist. Diese Kohlenwasserstoffkette weist insgesamt 0 bis 100 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 50, besonders bevorzugt 2 bis 25 Kohlenstoffatome auf.
Die Seitenketten können, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-CNNH2,
Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden substituiert sein.
Die Kohlenwasserstoffkette kann einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, - SO-, S02, - H-, -CO-, · X I {( < )·. -CONH-, - Me-, - HNH-, -S02 HNH-, -CO HNH- und einen 5 bis lOgiiedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4
Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder --S02- unterbrochen sein (vorzugsweise
/ \
N N CO
\ / ).
Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise
Figure imgf000057_0001
Vorzugsweise entspricht der Linker der folgenden Forme!:
§-(CO)m-Ll-L2-§§ wobei
m 0 oder 1 ist; § die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt, und
LI und L2 die oben genannten Bedeutungen aufweisen.
Besonders bevorzugt weist LI die Formel -NR1 JB- auf, wobei
R11 H oder H2 darstellt;
B -{(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)2- darstellt,
w = 0 bis 20 ist;
x = 0 bis 5 ist;
y = 0 oder 1 ist;
z = 0 bis 5 ist; und
NH
X4 -O-, -CONH-,-NHCO- oder
Figure imgf000058_0001
darstellt.
Erfindungsgemäß bevorzugte Linker L weisen die folgende Formel auf:
Figure imgf000058_0002
wobei
#3 die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt,
#4 die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,
R 1 1 H oder NH2 darstellt;
B -{(CH2)x-(X4)y]w-(CH3)z-- darstellt,
w = 0 bis 20 ist;
x = 0 bis 5 ist;
y = 0 oder 1 ist;
z = 1 bis 5 ist; und
Figure imgf000058_0003
darstellt. Die oben genannten Linker werden insbesondere bevorzugt in Konjugaten der Formel (I) oder (II), in denen der Linker durch Substitution eines H- Atoms an R i oder in Verbindung mit einem spaltbaren Linker SGI an R4 ankoppelt, d.h. Rl-L-#1 darstellt oder R4 -SG1-L-#1, "wobei ff l die Bindung an den Antikörper darstellt.
Weiterhin sind die folgenden Linker erfindungsgemäß bevorzugt: In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A5 oder A6 vor:
Figure imgf000059_0001
Formel A5
Figure imgf000059_0002
Formel A6 wobei
(i 1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, # die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
R22 COOH, COOR, COR, CONR2, CONHR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CO H2, vorzugsweise COOH darstellt. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A5 oder A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000060_0001
vor.
Andere Linker -L-, die an eine Cystein-Seitenkette bzw. Cysteinrest gebunden sind, weisen die folgende Formel auf:
Figure imgf000060_0002
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,
m 0, 3 , 2, oder 3 ist;
n 0, 1 oder 2 ist;
p 0 bis 2,0 beträgt; und
L3
G3
O o darstellt;
wobei
o 0 oder 1 ist;
und
eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus
Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, - CO H-, -NMe-, -NHNH-, -S02 HNH-, -CONHNH- und einen 3 bis 1 Ogliedriger (vorzugsweise 5 bis 1 Ogliedriger), aromatischen oder nicht aromatischer! Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder --S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
— N CO
v...../ ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -- HCO H2, -COOH, -OH, -
NH2, H-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Bevorzugt ist in der obigen Forme!
m 1 ist;
p 0 ist;
n 0 ist;
und L3
G """" darstellt;
wobei
o 0 oder 3 ist; und
G3 -(CH2CH20)s(CH2)t(CONH)u CH2CH2OMCH2V darstellt, wobei
s, t, v und w jeweils unabhängig voneinander 0 bis 20 betragen, und u 0 oder 1 beträgt.
Bevorzugte Gruppen Li in der obigen Formel §-(CO)m-Ll-L2-§§ sind die folgenden, wobei r jeweils unabhängig voneinander eine Zahl von 0 bis 20, vorzugsweise von 0 bis 15, besonders bevorzugt von 1 bis 20, insbesondere bevorzugt von 2 bis 10 aufweist:
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000069_0002
0
✓ NH NH ^
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
,N o O
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000073_0002
Figure imgf000073_0003
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Weitere Beispiele fiir LI sind in Tabelle C angegeben, in denen diese Gruppe in einem Kasten hervorgehoben ist.
In den folgenden Tabellen A und A' sind Beispiele für einen Linkerteil LI angegeben. In der Tabelle ist weiterhin angegeben, mit welcher Gruppe L2 diese Beispiele für LI vorzugsweise kombiniert werden, sowie die bevorzugte Ankopplungsstelle (R1 oder R3 oder R4) sowie der bevorzugte Wert für m, also ob vor L I eine Carbonyigruppe vorliegt oder nicht (vgl. §-(CO)m-Ll- L2-§§). Diese Linker werden vorzugsweise an einen Cysteinrest gekoppelt. Wenn L2 ein Bemsteinsäureiniid ist bzw. sich hiervon ableitet, kann dieses Irnid ganz oder teilweise auch in Form des hydiOiysierien offenkettigen Bemsiemsäureamids vorliegen, wie oben beschlieben. In Abhängigkeit von LI kann diese Hydrolyse zu offenkettigen Bemsteinsäureamiden mehr oder weniger stark oder gar nicht ausgeprägt sein.
Tabelle A
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
**Besonders bevorzugt werden die in diesen Zeilen angegebenen Linker LI mit einem Linker L2 verknüpft, der ausgewählt ist aus:
Figure imgf000081_0002
Formel A7
und/oder
Figure imgf000082_0001
Formel A8 vor, wobei #l die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, #2 die
Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, R.22 vorzugsweise COOH darstellt. In einem erfindungsgemäßen Konjugal bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugale liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Binders vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamlanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A7 oder A8 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A7 oder A8 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Binder. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000082_0002
vor.
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000086_0001
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Figure imgf000100_0001
Figure imgf000101_0001
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Figure imgf000106_0001
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Figure imgf000108_0001
Figure imgf000109_0001
Figure imgf000110_0001
Figure imgf000111_0001
- III -
Figure imgf000112_0001
**: Siehe Anmerksing ** zu Tabelle A.
***: Bei Vorhandensein dieser Struktur L2 kann zugleich eine Struktur L2 der folgenden Formel vorliegen:
Figure imgf000113_0001
Beispiele für Konjugate mit entsprechenden Linkem weisen folgende Strukturen auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, und LI die oben angegebenen Bedeutung aufweist, L2 und L3 dieselbe Bedeutung wie LI hat, AK1 für einen moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR- Antikörper wie ITEM-4 sowie chimäre oder humanisierte Varianten von ITEM-4 steht, der über einen Cysteinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Besonders bevorzugt ist AK 3 ein humanisierter oder ebimärer monoklonaler ΪΤΕΜ-4 anti- TWEAKR-Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimärer en ΪΤΕΜ-4-
Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-
7076.
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Wenn der Linker an eine Lysin- Seitenkette bzw. einen Lysinrest gebunden ist, weist er vorzugsweise die folgende Formel aufweist:
-§-(SG)x-L4-CO-§§, wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffrtiolekül darstellt und
§§ die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,
x 0 oder 1 darstellt. SG eine spaltbare Gruppe, vorzugsweise ein 2-8 Oligopeptid, besonders, bevorzugt ein Dipeptid darstellt,
und
L4 eine Einfachbindung oder eine Gruppe ! ( '( >.!.-< 14- darstellt, wobei y 0 oder 1 darstellt, und G4 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigte und/oder cyclisehen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHM 1-. -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis 10- gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
— N -CO— -
\ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCO H , -COOH, -OH, - H2, H-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.
In der folgenden Tabelle B sind Beispiele für Linker an einen Lysinrest angegeben, in der Tabelle ist weiterhin die bevorzugte Ankopplungsstelle (R!-R5) angegeben. In der ersten Spalte sind weiterhin die Beispielnummern angegeben, in denen entsprechende Linker Anwendung finden.
Tabelle B: Lysin-Linker
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Beispiele für Konjugale mit entsprechenden Linkern weisen folgende Strukturen auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, und L4 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, AK2 für einen moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR-Antikörper wie ΙΤΈΜ- 4 sowie chiroäre oder humani ierte Varianten von ITEM-4 steht, der über einen Lysinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Besonders bevorzugt ist AK2 ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ITEM-4 anti-TWEAKR- Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimäreren ITEM-4- Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP- 7074, TPP-7075 und TPP-7076.
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Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt die Grandstruktur (i), (ii), oder (iv), wobei SGI bzw. SG eine durch eine Protease spaltbare Gruppe darstellt, und LI und L2 die oben aufgeführtem Bedeutungen aufweisen. Besonders bevorzugt sind die folgenden Gruppen:
-Val-Aia-CONH- (hierdurch Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Alanin) -NH-Val-Lys-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)
-NH-Val-Cit-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citruliin) -NH-Phe-Lys-CONH (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)
-NH-Ala-Lys-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)
-NH-Ala-Cit-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citruliin)
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bzw.
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wobei X H, eine Ci-io-Alkylgruppe ist, die gegebenenfaUs mit -NHCONH2, -COOH, -OH, NH2, H-CNNH2, oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
In der folgenden Tabelle C sind Beispiele für einen Linkerteil -SGI -LI- bzw. -Ll-SG-Ll- angegeben, wobei SGI bzw. SG eine durch eine Protease spaltbare Gruppe ist. In der Tabelle C ist weiterhin angegeben, mit welcher Gruppe L2 diese Beispiele für - SGI -LI- bzw. -Ll-SG-Ll- vorzugsweise kombiniert werden, sowie die bevorzugte Ankopplungsstelle (R'-R5) sowie der bevorzugte Wert für m, also ob vor Li eine Carbonylgruppe vorliegt oder nicht (vgl. §-(CO)m-Ll - L2-§§). Diese Linker werden vorzugsweise an einen Cysteinrest gekoppelt. Die LI -Gruppe ist in einem Kasten hervorgehoben. Diese Gruppen LI können jedoch durch eine der Gruppe L i , die für die obige Formel §-(CO)m-L3 -L2-§§ angegeben ist, ausgetauscht werden. Wenn L2 ein Bernsteinsäureamid ist bzw. sich hiervon ableitet, kann dieses Amid ganz oder teilweise auch in Fonn des hydroiy ierten offenketiigen Bemsteinsäureamids vorleigen, wie oben beschrieben.
Tabelle C
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Beispiele für Konjugale mit der Grundstruklur (i) weisen die folgende Struktur auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, L4 dieselbe Bedeutung wie LI hat, AK1 für einen moderat agonisiiseh oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR-Antikörper wie ITEM-4 sowie chimäre oder humanisierte Varianten von ΏΈΜ-4 steht, der über einen Cysteinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Besonders bevorzugt ist AK1 ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ITEM-4 anti-TWEAKR-Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humamsierten oder chimäreren ITEM-4-Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-7076.
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KSP-Inhibitor - Linker-Intermediate und Herstellung der Konjugale
Die erfindungsgemäßen Konjugale werden hergestellt, in dem zunächst der niedermolekulare KSP- Inhibitor mit einem Linker versehen wird. Da so erhaitene intermediat wird dann mit dem Binder (vorzugsweise Antikörper) umgesetzt.
Für die Kopplung an einen Cystemrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Cystein-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper, der dazu ggf. partiell reduziert wurde, umgesetzt:
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TFA
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wobei R -H oder -COOK darstellt,
wobei K lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit Ci-Ce Alkoxy oder -OH substituiertes C<~ Ce Alkyl darstellt, und
wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, SGI, L I , L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben.
In jeder der obigen Verbindungen wie auch den folgenden Verbindungen kann die tert.-butyl- Gruppe durch Cyclohexyl ersetzt sein.
Die Verbindung kann z.B in Form ihres Trifluoressigsäuresalzes verwendet werden. Zur Reaktion mit dem Binder wie z.B. dem Antikörper wird die Verbindung vorzugsweise in 2 bis 12 fächern molaren Überschuss gegenüber dem Binder verwendet.
Für die Kopplung an einen Lysinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Lysin-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper umgesetzt:
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Für ein an einen Cysteinrest ankoppelndes Mermediat können die Reaktionen wie folgt veranschaulicht werden:
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Die anderen Intermediate und andere Antikörper können entsprechend umgesetzt werden.
Für ein an einen Lysinrest ankoppelndes Intermediat kann die Reaktion wie folgt veranscliaulicht werden:
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Erfmdungsgemäß werden so die folgenden Konjugale erhalten:
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In Abhängigkeit vom Linker können Siiccinimid-verknüfte ADCs nach der Konjugation in die offenkettigen Bemsteinsäureamide überführt werden, die ein vorteilhaftes Stabilitätsprofil aufweisen.
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Diese Umsetzung {Ringöffnung) kann bei pH 7.5 bis 9, vorzugsweise bei pH 8, bei einer Temperatur von 25 ° C bis 37 °C erfolgen, z.B. durch Rühren. Die bevorzugte Rührzeit beträgt 8 bis 30 Stunden.
In den obigen Formeln stellen X I CH, X2 C, und X3 N dar; haben SG3 und LI die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben, und L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung wie LI; und R und K haben die gleiche Bedeutung wie oben beschrieben. AKi ist ein über einen Cysteinrest gekoppelter, moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR-Antikörper wie ΓΓΕΜ-4 sowie chimäre oder humanisierte Varianten von ITEM-4, und AK2 ist ein über einen Lysinrest gekoppelter, moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAK - Antikörper wie ΠΈΜ-4 sowie chimäre oder humanisierte Varianten von ITEM-4. Besonders bevorzugt ist AK1 und AK2 ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ITEM-4 anti- TWEAKR --Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimärer en ITEM-4- Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-
7076.
ITEM-4 sowie humanisierte oder chimäre Varianten desselben
ITEM-4 ist ein anti-TWEAKR-Antikörper, der von Nakayama ei al. beschrieben wurde (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). Humanisierte Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR- Umsetzung („COR graiting") werden von Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4): 1052-62) sowie in WO 2009/020933 beschrieben.
Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Antikörper bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der Toxophore an den Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers und/oder über ein oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, das Toxophor an den Antikörper über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerresle des Antikörpers zu binden.
Der Antikörper kann über eine Bindung mit dem Linker verknüpft werden. Die Verknüpfimg des Antikörpers kann mittels eines Heteroatoms des Binders erfolgen. Erfindungsgemäße Heteroatome des Antikörper, die zur Verknüpfung verwendet werden können, sind Schwefel (in einer Ausführungsform via einer Sulfhydrylgruppe des Antikörper), Sauerstoff (erfindungsgemäß mittels einer Carboxyl oder Hydroxylgruppe des Antikörper) und Stickstoff (in einer Ausruhrungsform via einer primären oder sekundären Amingruppe oder Amidgruppe des Antikörper). Diese Heteroatome können im natürlichen Antikörper vorhanden sein oder durch chemische oder moiekuiarbiologische Methoden eingeführt werden. Erfindungsgemäß hat die Verknüpfung des Antikörpers mit dem Toxophor nur einen geringen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörper zum Zielmolekül. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform hat die Verknüpfung keinen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörpers zum Zielmolekül.
Der Begriff "Antikörper" wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und umfasst Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper). Ein Immunglobulinmolekül umfasst bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten, zwei schwere Ketten (H Ketten) und zwei leichte Ketten (L Ketten), welche lypischerweise durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne der schweren Kette (abgekürzt VH) und konstante Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der schweren Kette kann beispielsweise drei Domänen CHI, CH2 und CH3 umfassen. Jede leichte Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VL) und eine konstante Domäne. Die konstante Domäne der leichten Kette umfasst eine Domäne (abgekürzt CL). Die VH und VL Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch Komplementaritäts-bestimmende Regionen genannt („complementarity determining region", abgekürzt CDR) und Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität („framework region", abgekürzt FR). Jede VH und VL Region setzt sich typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen. Beispielsweise vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge FRl , CDRl , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ein Antikörper kann aus jeder dafür geeeigneten Spezies erhalten werden z.B. Kaninchen, Lama, Kamel, Maus, oder Ratte. In einer Ausführungsform ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chiniär sein.
Der Begriff „monoklonaler'' Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einer Population substantiell homogener Antikörper erhalten wurde, d.h. individuelle Antikörper der Population sind bis auf natürlich auftretende Mutationen, welche in geringfügiger Anzahl auftreten können, identisch. Monoklonale Antikörper erkennen mit hoher Spezifität eine einzige antigene Bindestelle. Der Begriff monoklonaler Antikörper bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Herstellungsverfahren,
Der Begriff„intakter" Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die sowohl eine Antigen-bindende Domäne als auch die konstante Domäne der leichten und schweren Kette umfassen. Die konstante Domäne kann eine natürlich vorkommende Domäne sein, oder eine Variante davon, bei der mehrere Aminosäurepositionen verändert wurden.
Der Begriff „modifizierter intakter" Antikörper bezieht sich auf intakte Antikörper, die mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoierrninus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert wurden. Des Weiteren können Antikörper dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008, 26(8):925-32),
Der Begriff „humaner" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einem Menschen erhalten werden können oder synthetische humane Antikörper sind. Ein „synthetischer" humaner Antikörper ist ein Antikörper, der in Teilen oder schweren als ganzes von synthetischen Sequenzen in silico erhältlich ist, die auf der Analyse humaner Antikörpersequenzen basieren. Ein humaner Antikörper kann z.B. durch eine Nukleinsäure kodiert sein, die aus einer Bibliothek von Antikörpersequenzen, die humanen Ursprungs sind, isoliert wurde. Ein Beispiel solcher Antikörper ist in Söderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856 zu finden.
Der Begriff „humanisierter" oder„chimärer" Antikörper beschreibt Antikörper, die aus einem nicht-humanen und einem humanen Sequenzanteil bestehen. Bei diesen Antikörpern wird ein Teil der Sequenzen des humanen Immunoglobulins (Rezipient) durch Sequenzanteile eines nicht- humanen Immunoglobulins (Donor) ersetzt. Der Donor ist in vielen Fällen ein murines Immunoglobulin. Bei humanisierten Antikörpern werden Aminosäuren der CDR des Rezipienten durch Aminosäuren des Donors ersetzt. Manchmal werden auch noch Aminosäuren des Frameworks durch korrespondierende Aminosäuren des Donors ersetzt. In machen Fällen enthält der humanisierte Antikörper Aminosäuren, die weder im Rezipient noch im Donor enthalten waren und die während der Optimierung des Antikörpers eingefügt wurden. In manchen Fällen werden Aminosäuren der CDR des Donors durch korrespondierende Aminosäuren des Rezipienten ersetzt, wenn diese zur Antikörpebindung nicht beitragen und potentiell immonogen sind. Bei chimären Antikörpern werden die variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers fusioniert.
Der Begriff Komplernentaritäts-bestimmende Region (CDR), wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Aminosäuren einer variablen
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die für die Bindung an das Antigen notwendig sind. Jede variable Region hat typischerweise drei CDR Regionen, welche als CDR!, CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede CDR Region kann Aminosäuren nach der Definition von Kabat und/oder Aminosäuren eines Hypervariablen Loops definiert nach Chotia umfassen. Die Definition nach Kabat umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 24 - 34 (CDRi), 50 - 56 (CDR2) und 89 - 97 (CDR3) der variablen leichten Kette und 31 - 35 (CDRI), 50 - 65 (CDR2) und 95 - 102 (CDR3) der variablen schweren Kette (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologica! Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Die Definition nach Chotia umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 26 - 32 (CDRI), 50 - 52 (CDR2) und 91 - 96 (CDR3) der variablen leichetn Kette und 26 - 32 (CDRI), 53 - 55 (CDR2) und 96 - 101 (CDR3) der variablen schweren Kette Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901 -917 (1987)). In manchen Fällen kann eine CDR Aminosäuren aus einer CDR Region definiert nach Kabat und Chotia umfassen.
Abhängig von der Aminosäure-Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette können Antikörper in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Es gibt fünf Hauptkiassen von intakten Antikörpern: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei mehrere davon in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. (Isotypen), z.B. IgGl , IgG2, IgG3, IgG4, IgAl und IgA2. Die konstante Domäne der schweren Kette, die zu den unterschiedlichen Klassen korrespondieren, werden als [alpha/a], [deita/δ], [epsilon/ε], [gamma/γ] und [my/μ] bezeichnet. Sowohl die dreidimensionale Struktur als auch die Untereinheitenstrukt r von Antikörpern sind bekannt.
Der Begriff „funktionales Fragment" oder „antigen-bindendes Antikörperfragment" eines Antiköipers/Iiranunoglobulins ist definiert als ein Fragment eines Antikörpers Immvinoglobuiins (z.B. die variable Domänen eines IgG), welches die Antigen-Bindedomänen des Antikö 3ers/Immunoglobulins noch umfasst. Die „Antigen-Bindedomäne" eines Antikörpers umfasst typischerweise eine oder mehrere Hypervariable Regionen eines Antikörpers, z.B. die CDR, CDR2 und/oder CDR3 Region. Allerdings kann auch die„Framework" oder die„Gerüst" Region eines Antikörpers zur Bindung des Antikörpers an das Antigen eine Rolle spielen. Die Framework Region bildet das Gerüst für die CDRs. Vorzugsweise umfasst die Antigen- Bindedomäne mindestens die Aminosäuren 4 bis 103 der variablen leichten Kette und Aminosäure 5 bis 109 der variablen schweren Kette, bevorzugter die Aminosäure 3 bis 107 der variablen leichten Kette und 4 bis 1 11 der variablen schweren Kette, besonders bevorzugt sind die kompletten variablen leichten und schweren Ketten , also Aminosäure 1 - 109 der VL und 1 bis 113 der VH (Nummerierang nach WO97/08320).
„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antikörperfragmente'' der Erfindung umfassen nicht abschliessend Fab, Fab', Fiab')? und Fv Fragmente, Diabodies, Single Domain Antibodies (DAbs), linerae Antikörper, Einzelketten Antikörper (single-chain Fv, abgekürzt scFv); und multispezifische, wie z.B. bi- und tri-spezifische, Antikörper, gebildet aus Antikörperfragmenten C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001 ) Antibody Engineering (Springer Laborator Manual), Springer Verlag). Andere Antikörper als„multi-spezifische" oder „niuiti- funktionale" sind solche mit identischen Bindestellen. Mulüspezifische Antikörper können spezifisch für unterschiedliche Epitope eines Antigens sein oder spezifisch für Epitope von mehr als einem Antigen sein (siehe z.B. WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91 /00360; WO 92/05793; Tutt, et al, 1991 , J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 3 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,8 19; oder Kostelny et al., 1992, 1 Immunol. 148: 1547 1553). Ein F(ab')2 oder Fab Molekül kann so konstruiert werden, dass die Zahl der intermolekularen Disulfidinteraktionen, die zwischen den Chi und den CL Domänen stattfindet, reduziert oder oder komplett verhindert werden kann.
„Epitope" bezeichnen Proteindeterminanten, die eine spezifische Bindung mit einem Immunglobulin oder T-Zell-Rezeptoren eingehen können. Epiiopische Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten, oder Kombinationen hiervon, und weisen normalerweise spezifische 3- dimensionale Struktureigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften auf.
„Funktionale Fragmente" oder „antigen-bindende Antikörperfragmente" können mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carbox terminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüprung) fusioniert werden. Des Weiteren können Antikörper und antigen-bindende Fragmente dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive C steine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).
Polyklonale Antikörper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Humane bzw. humanisierte monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Olsson et al, Meth Enzymol. 92, 3-16 bzw. Cabilly et al US 4,816,567 oder Boss et al US 4,816,397).
Der Durchschnittsfachmann kennt vielfältige Methoden, um humane Antikörper und deren Fragmente herzustellen, wie beispielsweise mittels transgener Mäuse (N Lonberg und D Huszar, Int Rev Tmmunol. 1995; 13(l):65-93) oder Phage Display Technologien (Clackson et al, Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Antikörper der Erfindung können aus rekombinanten Antikörperbibliotheken erhalten werden, die z.B. auf den Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von Antikörpern besteht, die aus einer großen Anzahl gesunder Freiwilliger erstellt wurden. Antikörper können auch mittels bekannter rekombinanter DNS-Technologien hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenz eines Antikörpers kann durch Routinesequenzierung erhalten werden, oder ist aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich.
Ein„isolierter" Antikörper oder Binder wurde von anderen Bestandteilen der Zelle gereinigt. Kontaminierende Bestandteile einer Zelle, welche mit einer diagnostischen oder therapeutischen Verwendung interferieren können, sind z.B. Enzyme, Hormone, oder andere peptidische- oder nicbt-peptidische Bestandteile einer Zelle. Bevorzugt ist ein Antikörper oder Binder, der zu mehr als 95 Gew-% bezogen auf den Antikörper bzw. Binder aufgereinigt wurde (bestimmt durch z.B. Lowry Verfahren, UV-Vis Spektroskopie oder durch SDS-Kapillargelelektrophorese). Ausserdem ein Antikörper, der soweit aufgereinigt wurde, dass mindestens 15 Aminosäuren des Aminoterminus oder einer internen Aminosäuresequenz bestimmt werden können, oder zur Homogenität aufgereinigt wurde, wobei die Homogenität bestimmt wird durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen (die Detektion kann mittels Coomassie Blau Aniarbung oder bevorzugt durch Silberfärbung bestimmt werden). Jedoch wird ein Antikörper normalerweise durch einen oder mehrere Reinigungsschritte hergestellt.
Der Begriff„spezifische Bindung" oder„bindet spezifisch" bezieht sich auf einen Antikörper oder Binder, der an ein vorbestimmtes Antigen/Zielmolekül bindet. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders beschreibt typischerweise einen Antikörper bzw. Binder mit einer Affinität von mindestens 10"7 M als.Kd-Wert^
als 10" ; M . wobei der Antikörper bzw. Binder eine mindestens zweifach höhere Affinität zum vorbestimmten Antigen/Zielmolekül als zu einem nicht-spezifischen Antigen/Zielmolekül hat (z.B. Rinder Serumalbumin, oder Casein), welches nicht das vorbestimmte Antigen/Zielmolekül oder ein eng verwandtes Antigen/Zielmolekül ist. Die Antikörper weisen vorzugsweise eine Affinität von mindestens 10" '' M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd- Werten als ICr7 M), vorzugsweise von mindestens 1 0-8 M, besonders bevorzugt in dem Bereich von 10"9 M bis 10" H M auf. Die Kd- Werte können durch z.B. OberQächenplasmonresonanzspektroskopie bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikö er-Wirkstoff-Konju ate weisen ebenfalls Affinitäten in diesen Bereichen auf. Durch die Konjugation der Wirkstoffe wird die Affinität vorzugsweise nicht wesentlich beeiniiusst (in der Regel wird die Affinität weniger als eine Größenordnung verringert, also z.B. maximal von ΙΟ"8 M auf ΙΟ"7 M).
Die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper zeichnen sich weiterhin vorzugsweise durch eine hohe Selektivität aus. Eine hohe Selektivität liegt vor, wenn der erfindungsgemäße Antikörper eine mindestens um den Faktor 2, bevorzugt Faktor 5 oder insbesondere bevorzugt Faktor 10 bessere Affinität am Zielprotein aufweiset als an einem unabhängigen anderen Antigen, z.B. humanem Serumalbumin (die Affinität kann z.B. durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden).
Zudem sind die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper vorzugsweise kreuzreaktiv. Um präklinische Studien, z.B. toxikologische oder Wirksamkeitsstudien (z.B. in Xenograft-Mäusen), zu erleichtern und besser interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn der erfindungsgemäß verwendete Antikörper nicht nur das humane Zielprotein bindet, sondern auch in der für die Studien verwendeten Spezies das Spezies-Zielprotein bindet, in einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies. Für toxikologische und Wirksamkeitsstudien werden bevorzugt Spezien der Familien Nager, Hunde und nicht-humane Primaten, verwendet. Bevorzugte Nager Spezien sind Maus und Ratte. Bevorzugte nicht-humane Primaten sind Rhesusaffen, Schimpansen und Langschwanzmakaken. In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies ausgewählt aus der Gruppe von Spezien bestehend aus Maus, Ratte und Langschwanzmakak (Macaca fascicularis). Insbesondere bevorzugt sind erfindungsgemäß verwendete Antikörper, die zusätzlich zum humanen Zielprotein mindestens kreuzreaktiv zum Maus-Zielprotein sind. Bevorzugt sind kreuzreaktive Antikörper, deren Affinität zum Zielprotein der weiteren nicht-humanen Spezies sich nicht um mehr als den Faktor 50, insbesondere nicht mehr als den Faktor zehn von der Affinität zum humanen Zielprotein unterscheidet.
Gegen ein Krebs-Zielmolekül gerichtete Antikörper
Bevorzugt ist das Zielmolekül, gegen das der Binder, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, gerichtet ist, ein rebs-Zielmolekül. Der Begriff„Krebs-Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszeilarten im Vergleich zu nicht- Krebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs- Zielmolekül auf einer oder mehreren Rrebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus selektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein „selektives Krebs-Zielmolekül"). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugaten.
Besonders bevorzugt ist hierbei das extazelluiäre Krebs Zielmolekül TWEAKR (SEQ ID NO: 101 (Protein); SEQ ID NO: 102 (DNA)). Das Krebs Zielmolekül TWEAKR (humanes Ortholog NCBI Gene ID: 51330) ist auch bekannt unier den Namen TNFRSF12A (lumor necrosis factor receptor superfamily member 12A), FN14 und CD266.
Der Begriff „anti-TWEAKR Antikörper" oder „ein Antikörper, der spezifisch an TWEAKR bindet" bezieht sich auf einen Antikörper, der das Krebs Zielmolekül TWEAKR (SEQ ID NO: 101 (Protein)) mit für eine diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung genügenden Affinität bindet. In einer Ausführungsform ist die Bindung eines anti-TWEAKR Antikörpers zu einem mit TWEAKR nicht verwandten Protein weniger als 10% der Bindung des Antiköipers an TWEAKR, wie z.B. mit Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden kann. In bestimmten Ausführungsformen bindet der Antikörper TWEAKR (SEQ ID NO: 101 (Protein)) mit einer Dissotiationskonstante (KD) von < Ι μΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, or < 0.001 nM. In bestimmten Ausführungsformen bindet der anti-TWEAKR Antikörper an ein Epitop, das zwischen verschiedenen Spezies konserviert ist. Antikörper, die Krebs-Zielmoleküle binden, können vom Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Binder für Krebs-Zielmoleküle können kommerziell erworben werden oder können durch den Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestellt werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder antigen- bindenden Antikörperfragmenten sind in WO 2007/070538 beschrieben (siehe Seite 22 „Antibodies"). Der Fachmann kennt Verfahren wie sogenannte Phage-Display Bibliotheken (z.B. Morphosys HuCAL Gold) erstellt und zur Auffindung von Antikörpern oder antigen-bindenden Antikörperfragmenten verwendet werden können (siehe WO 2007/070538, Seite 24 ff und AK- Beispiel 1 auf Seite 70, AK-Beispiel 2 auf Seite 72). Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörper, die DNA Bibliotheken aus B-Zellen verwenden, sind zum Beispiel auf Seite 26 (WO 2007/070538) beschrieben. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind auf Seite 30-32 von WO2007070538 und im Detail in Queen, et al.,.Pros. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029- 10033,1989 oder in WO 90/0786 beschrieben. Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zur rekombinanten Expression von Proteinen im allgemeinen und im speziellen von Antikörpern bekannt (siehe z.B. in Berger and Kimrnel (Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol . 152, Academie Press, Inc.); Sambrook, et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Cokl Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Molecular Biolony, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Harlow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881, Paul [Ed.]); Fundamental irnrnunology, (Lippincott Williams & Wilkins (1998)); and Harlow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Der Fachmann kennt die entsprechenden Vektoren, Promotoren und Signalpeptide die zur Expression eines Proteins/Antikörpers notwendig sind. Gebräuchliche Verfahren sind auch in WO 2007/070538 auf den Seiten 41 - 45 beschrieben. Verfahren zur Herstellung eines IgGl- Antikörpers sind z.B. in WO 2007/070538 in Beispiel 6 auf Seite 74 ff beschrieben. Verfahren, mit denen die Internalisierung eines Antikörpers nach Bindung an sein Antigen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in WO 2007/070538 auf Seite 80 beschrieben. Der Fachmann kann die in WO 2007/070538 beschriebenen Verfahren, die zur Herstellung von Carboanhydrase IX (Mn)- Antikörpern verwendet wurden, anlog zur Herstellung für Antikörper mit anderer Zielmolekülspezifität verwenden. Ami- TWEAKR-Aniikörper
Erfmdungsgernäß wird ein anti-TWEA R- Antikörper oder ein aniigenbindendes Fragment davon verwendet, vorzugsweise einer, der unter den nachfolgend beschriebenen ausgewählt bzw. durch geeignete Mutation verändert vorliegt. Darüber hinaus sind dem Fachmann Antikörper, die an TWEA R binden bekannt, siehe z.B. Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825; Zhou et al, 2013, J luvest Dermatol. 133(4): 1052-62; WO2009/020933(A2), WO2009140177 (A2) oder WO2014/198817 (AI).
Die Erfindung betrifft insbesondere Konjugate mit moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEA -Antikörpem oder antigenbindende Antikörperfragmente davon oder Varianten davon, die auf den aus der Maus stammenden Antikörper ITEM-4 (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825) zurückgehen. ΓΓΕΜ-4 ist ein anti-TWEAKR- Antikörper der von Nakayama et al. beschrieben wurde (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). Die Sequenzen der variablen Regionen (VH und VL) von ITEM-4 wurden in Zhou et al. (Zhou et al., 2013, I luvest Dermatol. 133(4): 1052-62) offenbart. Humanisierte Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR- Umsetzung („CDR grafting") in humane„framework regions" werden von Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4): 1052-62) sowie in WO 2009/020933 beschrieben.
Beim ITEM-4 sowie bei den humanisierten oder chimären Varianten dieses Antikörpers handelt es sich je nach verwendetem Assay-System um einen antagonistisch oder um einen moderat agonistisch wirkenden Antikörper. Die antagonistische Wirkung wird nur in Anwesenheit von Tweak entfaltet.
Der Begriff „moderat agonistischer" oder „moderat agonistisch. wirkender" anti-TWEAKR- Antikörper bezieht sich auf einen Antikörper, welcher an TWEAKR bindet und nur im geringen Umfang die NFKB-Signaltransduktionskaskade („NFi B-Signaiiing") induziert, wenn der Antikörper mit einer TWEAKR exprimierenden Zelle in Abwesenheit von Tweak in Kontakt gebracht wird. Im geringen Umfang die NF KB -Signal transduktionskaskade („NFKB-Signalling") zu induzieren bedeutet, dass ein anti-TWEAKR-Antikörper im Vergleich zu humanem Tweak, welches bei 200 ng/ml (100% Wert) eingesetzt wird, in einem ΝΓκΒ-Assay weniger als 80%, weniger als 50%, weniger als 25%, weniger als 20% oder weniger als 15% der Aktivierung bei maximal 30,ng/ml eingesetzter anti-TWEAKR-Antikörper-Konzentration zeigt. Der Fachmann kennt derartige ΝΡκΒ-Assays. Exemplarisch ist ein derartiger Assay in den Ausführungsbeispielen Der Begriff „nicht agonistischer" oder„nicht agonistiscli wirkender" αοΐϊ-Τ νΈΑΚΚ-ΑηίίΙίθ βΓ bezielit sich auf einen Antilräper, der in einem solchen ΝΡ Β-Assay 0% der Aktivierung bei maximal 30μ /τη1 eingesetzter Konzentration zeig!. Der Fachmann kennt derartige NFxB-Assays. Exemplarisch ist ein derartiger Assay in den Ausführungsbeispielen gezeigt.
Bevorzugt wirkt der anti-TWEAKR- Antikörper zudem antagonistisch, wenn ein solcher Assay in Anwesenheit von Tweak (dem Liganden) durchgeführt wird.
Erzeugung der anti-TWEAKR-Antikörper
Basierend auf der Veröffentlichimg der Sequenzen der variablen Regionen (VH und VL) von ITEM-4 wurden in Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermaiol. 133(4): 1052-62) sowie der Veröffentlichung der humanisierten Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") in humane „framework regions" Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4): 1052-62) und WO 2009/020933 folgende Antikörper-Sequenzen erhalten:„TPP- 7007",„TPP-7053",„TPP-7005",„TPP-7073",„TPP-7075" und„TPP-7076".
Durch. Verbindung der variablen Regionen VH und VL des ITEM-4 mit den konstanten Regionen (GL, CHI, CH2, CH3) eines humanen IgGl des kappa Subtyps erhält man die Sequenzen der Chimären Antikörper„TPP-7006" und„TPP-7074".
Durch Veränderung einer potentiellen Deamidierungsstelle in der L-CDR1 des ITEM-4 erhält man die ΑηίΜ βΓ„TPP-7073",„TPP-7074",„TPP-7075" und„TPP-7076".
Weitere humanisierte Varianten des Anülkräpers ITEM-4 können durch fachbekannte Verfahren der Humanisierung erzeugt werden.
Methoden zur Erzeugung dieser sind übersichtsartig beschrieben in Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619- 1633 (2008), und weiter beschrieben in Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); Queen et al, Proc. atl Acad. Sei. USA 86: 10029-10033 (1989); US Patent Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409: Rashmiri ei al, Methode 36:25-34 (2005) (beschrieben wird das "speeificity determining region (SDR)" Grafting); Padlan, Mol. lmmunol. 28:489-498 (1991) (beschrieben wird das "resurfacing"); Dali' Acqua et al, Methode 36:43-60 (2005) (beschrieben wird das "FR shuffling"); and Osboum et al, Methods 36:61-68 (2005) and Klinika et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (beschrieben wird das "guided selection" Ansatz zum FR Shuffling). Besondere Ausführungs formen von anti-TWEAKR- Antikörpern
In dieser Anmeldung wird auf die folgenden bevorzugten Antikörper Bezug genommen, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt:„ITEM-4",„TPP-7006",„TPP-7007",„TPP-7053",„TPP-7005", „TPP-7073",„TPP-7074",„TPP-7075" und„TPP-7076".
ITEM-4 ist ein Maus TgG2b Antikörper der vo akayama et al. beschrieben wurde (Nakayama, et al., 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). ITEM-4 kann von mehreren Finnen kommerziell bezogen werden (unter anderem von der Firma eBioscience als 13-901 8).
TPP-7006 und TPP-7074 sind chimäre Varianten des ITEM-4, bei welchen die variablen Regionen VH und VL mit den konstanten Regionen (CL, CHI, CH2, CH3) eines humanen IgGl des kappa Subtyps verbunden sind.
Bei den Antikörpern TPP-7007, TPP-7053, TPP-7005, TPP-7073, TPP-7075 und TPP-7076 handelt es sich um humanisierte Varianten des ITEM-4 als Subtyp humaner IgGl kappa.
Diese geneannten anti-TweakR Antikörper („ITEM-4",„TPP-7006",„TPP-7007",„TPP-7053", „TPP-7005",„TPP-7073",„TPP-7074",„TPP-7075" und„TPP-7076") stellen auch unabhängig von ihrer nicht-agonistisch oder mederat agonistischen Wirkung eine bevorzugte Ausfuhrungsformen des anti-TWEAKR- Antikörpers zur Kopplung mit erfindungsgemäßen Linkern und / oder Toxophoren dar. Vorzugsweise können die anti-TWEAKR-Antikörpers in Anwesenheit des Liganden Tweak als Antagonisten wirken.
Tabelle: Proteinsequenzen der Antikörper
Figure imgf000153_0001
TPP-7005 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 10.
TPP-7006 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 20.
TPP-7007 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 30.
TPP-7053 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 40.
TPP-7065 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 49 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 50.
TPP-7073 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 59 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 60.
TPP-7074 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 69 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 70.
TPP-7075 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 79 sowie eme Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 80. TPP-7076 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 89 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 90.
TPP-7077 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 99 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 300.
TPP-7005 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 5.
TPP-7006 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 11 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 15.
TPP-7007 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 25.
TPP-7053 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ TD NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 35.
TPP-7065 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 41 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 45.
TPP-7073 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 51 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 55.
TPP-7074 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 61 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 65.
TPP-7075 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 71 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 75.
TPP-7076 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 81 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 85.
TPP-7077 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 91 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 95.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen des moderat agonistisch bzw. nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR-Antikörpers zur Kopplung mit erfindungsgemäßen Linkern und / oder
Toxophoren sind die folgenden Antikörper:
1 . Der Antikörper ΤΤΈΜ-4, ein Maus IgG2b Antikörper, der von Nakayama et al. beschrieben wurde (Nakayama, et al, 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819- 825). Ein Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon, welcher an TWEAKR bindet und eine chimäre oder humanisierte Variante des Antikörpers ΓΓΈΜ-4
(Nakayama, et al, 2003, Biochem Biophy Res Comrn, 306:819-825) ist.
Ein Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment, welcher an TWEAKR bindet, umfassend: eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 8 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 18 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 28 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestelit durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 38 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestelit durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 58 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch. SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 68 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 72, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 73 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 74, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 76, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 77 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 78 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 82, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 83 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 84, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 86, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 87 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 88. Der Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon gemäß Ausführungsform 3 umfassend: eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: i , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:5 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 11 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:21 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:25 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:31 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:35 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:51 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 55 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:61 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 65 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:71 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 75 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 81 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 85. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, der ein IgG Antikörper ist.
Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausffihiimgsformen, umfassend: eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:20 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:40 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:59 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:69 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:70 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:79 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 80 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 89 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:90.
7. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausföhrungsformen, unifassend: Das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen oder ein antigenbindendes Fragment eines Antikörpers gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, das ein scFv-, Fab-, Fab * -Fragment oder ein F(ab )2-Fragment ist.
8. Der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, der ein monoklonaler Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon ist.
9. Der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einem der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, der ein humaner, humanisierter oder chimärer Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment ist.
Besonders bevorzugt sind die anti-TWEAK - Antikörper„TPP-7005",„TPP-7006",„TPP-7007", „TPP-7053",„TPP-7073",„TPP-7074",„TPP-7075" und„TPP-7076".
Isotope, Salze, Solvate, isotopische Varianten
Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen. Unter einer isotopischen Variante einer erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in welcher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist, Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie Ή (Deuterium), 3H (Tritium), l3C, 14C, N, !70, l8C), 32P, 33P, 33S, 34S, 5S, 36S, l8F, 36C1, 82Br, !23I, !24I, 129I und i3,I. Bestimmte isotopische Varianten einer erfindungsgemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff- Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit H- oder 14C- Isotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellen. Isotopische Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführangsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagenzien und/oder Ausgangs verbindungen eingesetzt werden .
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifiuoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atornen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylarnin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, A'-Methyipiperidin, jV-Methylmorpholin, Arginin, Lysin und 1 ,2-Ethylendiamin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.
Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beispielsweise metabolisch oder hydrolytisch).
Besondere Ausführungsformen
Die folgenden Aus hrungsformen sind besonders bevorzugt:
Ausführungsform A:
Ein ADC der Formel
BiNDER- ■L— KSP
n wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IM), (He), (Iii), (IIj), (Ilk) oder der folgenden Formel (Ilf) ist, der Binder ein moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkender anti-TWEAKR-Antikörper (besonders bevorzugt ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ITEM-4 anti-TWEAKR- Antikörper, insbesondere die humanisierten oder chimäreren ITEM-4- Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-7076), und n eine Zahl von 1 bis 10 ist:
Bevorzugt sind moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkende anti-TWEAKR-Antikörper. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ITEM-4 anti- TWEAKR-Antikoiper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimäreren ΠΈΜ-4- Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP- Formel (Iii):
Figure imgf000162_0001
wobei
A CO (carbonyl) ist;
R' -L-#l, H, -COOH, -CO HNH2, -(CH2)i-3NH2, -CONZ"(CH2)i-3 H2 und -CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder H2;
R und R4 H ist, oder R und R4 genieinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR11- oder -CHRU-CH2- darstellen, wobei R10 H oder F darstellt;
R3 -L-# l oder eine Cl-10-Alkyl-, die ggf, mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO- NH-Alkyi, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH- Alkyl, S(0)n-Alkyl, SO2-NH- Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet) ist;
R~ H oder F ist;
R6 und R? unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci-3-Alkyi, (ggf. fluoriertes) C2- -A!kenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4- Aikinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
R8 eine verzweigte Ci-s-AUcyl-Gruppe ist; und
R9 H oder F ist, wobei einer der Substiluenlen R! und R3-L-#l darstellt, und -L-den Linker und ff l die Bindung zum Antikörper darstellt, sowie Salze, Solvate und Salze der Solvate des ADCs. Der Linker ist vorzugsweise ein Linker
§-(CO)m-Ll-L2-§§
wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und
Figure imgf000163_0001
Figure imgf000163_0002
darstellt, wobei ff 1 die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und L i durch die Formel
#1--(N"R10)n-(Gl)o-G2-«2
dargestellt wird,
wobei
R3 0 H, M i. ode Cl-C3-Alkyl darstellt;
M N CO
Gl -NHCO- oder \....../ darstellt; n 0 oder 3 ist;
0 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohienstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Aikylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 3 bis
1 Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen
— N N CO ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit - HCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.
Hierbei ist - die Bindung zum KSP-Inhibitor und iß die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).
Ausführungsform B:
Ein ADC der Fonne
BINDER- ■L— KSP
wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (I), (la), (II), (IIa), (IIb), (31c), (Ild), (He), (Ilf), (Iii), (Ilj), (Ilk) oder der folgenden Formel (IIa) ist, der Binder ein moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkender anti-TWEAKR-Antikörper (besonders bevorzugt ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ΙΊΈΜ-4 anti-TWEAKR-Antikörper, insbesondere die humanisierten oder chimäreren ΠΈΜ-4- Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP- 7074, TPP-7075 und TPP-7076), und n eine Zahl von 1 bis 10 ist: Forme! (Hg):
Figure imgf000165_0001
(Hg) wobei
A CO (carbonyl) ist;
R1 -L-# 1 , H, -COOH, -CONHNH2, -(CH2)i-3NH2, -CONZ' YCH2)j-3 H2 und -CONZ"CH2COOH ist, wobei Z" H oder H2;
R und R4 H ist, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines PyiTolidinringes) -CH2-CHRi [- oder -CHRn-CH2- darstellen, wobei R" H darstellt;
R3 -L-#l oder eine Ci-10-Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyi, O-CO-Aikyl, O-CO- H-AlkyL NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH- A Ikyl , S(0)n-Alkyl, S02- H-Aikyl, NH-Alkyl, N(Alkyl)2, oder H2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet) ist;
R5 H oder F ist;
R6 und R7 unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci-3-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-A!kenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
R8 eine verzweigte Ci-s-Alkyl-Gruppe ist; und
R I i oder F ist, wobei einer der Substituenten R! und R3-L-#l darstellt, und
-L-den Linker und #3 die Bindung mm Antikörper darstellt, wobei ~L- dargestellt wird durch
§-(CO)m-Ll- wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstelit und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und
Figure imgf000166_0001
darstellt, wobei ff 1 die Verknü fungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und LI durch die Formel
#i-(NR10)n-(Gl )o-G2-#2
dargestellt wird,
wobei
R10 i L \ Π oder Cl-C3-Alk l darstellt;
/ \
N CO
Gl N i iCi i- oder \ / darsielh;
n 0 oder 3 ist;
o 0 oder 1 ist; und G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder eyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, - Me-, -NHNH-, -S02 HNH-, -CO HNH- und einen 3 bis lOgiiedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen
N— CO— ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-CMNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
#l die Bindung zum KSP-Inhibitor und #~ die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper ist
(z.B. L2),
sowie Salze, Solvale und Salze der Solvate des ADCs.
Ausführungsform C:
Ein ADC der Formel
BiNDER- ■L— KSP
wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (II), (IIa), (IIb), (llc), (IM), (Ile), (Iii), (Ilg); (Iii), (Ilj), (ilk) oder der folgenden Formel (Ilh) ist, der Binder ein moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkender anti-TWEAKR-Antikörper (besonders bevorzugt ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ITEM-4 anti-TWEAKR-Antikörper, insbesondere die humanisierten oder chimäreren ΠΈΜ-4-Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-7076), und n eine Zahl von 1 bis 10 ist:
Formel (11h):
Figure imgf000168_0001
wobei
A CO (carbonyl) ist; -L-#l ist,;
R2 und R4 H ist, oder R und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrroiidinringes) -CEb-CHR1'- oder -CHR1 [-CH2- darstellen, wobei R1 1 H darstellt;
R3 eine Ci-io-Aikyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO-NH-Aikyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, S02-NH-Alkyl, ΝΉ-Alkyl, N(A!kyl)2, oder NH2 substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C>-j Aikyl bedeutet), oder -MOD ist;
wobei -MOD --(NRi0)n-(Gi)o-G2-G3 darstellt, wobei
R'° H oder Ci-CrAlkyl darstellt;
— N N-CO—
Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- oder darstellt, R10 nicht NH? ist);
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -Ö-, -S-, -
SO-, S02, -NRY-, -NRYCO-, CONR.V-, -NRYNRY-, -S02NR>'NRy-, -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C\ -C Q-Alkyl, C -Ci Q-Alkenyl, oder C2-C1 Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Ci -Cß-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;
R5 H oder F ist;
R6 und R? unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) C1.3-Alk.yL (ggf. fluoriertes) C2- -Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-4- Aikinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;
R8 eine verzweigte Ci-s-Alkyl-Gruppe ist; und
R9 H oder F ist, wobei -L-den Linker und #1 die Bindung zum Antikörper darstellt,
wobei -L- dargestellt wird durch
§-(CO)m-Ll-L2-§§
wobei
m 0 oder 1 ist;
§ die Bindung an KSP darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und
Figure imgf000169_0001
darstellt, wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Sciiwefeiatom des Antiköipers kennzeichnet, n1 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und LI durch die Formel
# 1 -(NR10)n-(Gl)o-G2-#2
dargestellt wird,
wobei
R10 H, NH2 oder Cl-C3-Alkyi darstellt;
Gl
Figure imgf000170_0001
darstellt:
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohienwasserstofikette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/Oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH-, -C R ' N-O- (wobei Rx H, Ci -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) und einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -
— N N CO
S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei Kohienwasserstofikette einschließlich, der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH9, -COOH, -OH, - H2, H- C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,
#'- die Bindung zum SP -Inhibitor und / - die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper ist (z.B. L2),
sowie Salze, Solvate, Salze der Solvate sowie Epimere des ADCs.
Ausführungsform D:
Die Erfindung stellt auch Binder- Wirkstoff-Konjugate der folgenden allgemeinen Formel bereit: BINDER Lr-fWS
m
n wobei BINDER für den moderat agonisiisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR- Antikörper (besonders bevorzugt einen humanisierten oder chimären monoklonalen ITEM-4 anti- TWEAKR-Antikörper, insbesondere die humanisierten oder chimäreren ITEM-4- Varianten: TPP- 7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-7076), L für den Linker, WS für den Wirkstoff, vorzugsweise einen KSP-Inhibitor, wie z.B. ein erfindungsgemäßer KSP-Inhibitor einer der Formeln (I), (Ia), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (iid), (He), (Ilf), (ilg), (Ilh) (Iii) ist, m für eine Zahl von 1 bis 2, vorzugsweise 1, und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, wobei L eine der folgenden Strukturen aufweist. Hierbei ist m die Zahl der Wirkstoffmoleküle pro Linker und n ein Mittelwert der Anzahl an Wirkstoff-Linker-Konjugaten pro BINDER. Die Summe alle-' WS, die in einem Konjugatmolekül vorliegen, ist also das Produkt von m und n.
WS ist ein Wirkstoff, der in Tieren, bevorzugt Menschen, eine lokale oder systemische Wirkung therapeutische Wirkung zeigt. Diese Wirkstoffe haben in der Regel ein Molekulargewicht von unter 5 kDa, bevorzugt unter 1.5 kDa. Bevorzugte Wirkstoffe sind Vinca-Alkaloide, Auristatine, Tubuiysine, Duocarmycine, Kinase- Inhibitoren, MEK -Inhibitoren und KSPTnhibitoren,
Hierbei stehi L für eine der folgenden Formeln A3 oder A4
Figure imgf000171_0001
Formel A3
Figure imgf000171_0002
Formel A4 wobei #' die Verknüpfangsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, # die Verknüpfungssielle mit dem Wirkstoff kennzeichnet, x 1 oder 2 darstellt, und R22 COOK, COOR, COR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, Br, vorzugsweise COOK darstellt,.
LI weist dieselbe Bedeutung wie oben auf Vorzugsweise wird ~Ll -#2 durch die folgende Formel dargestellt:
#3- R10)11-(Gl)o-G2-#2
dargestellt, wobei
#3 die Verknüpfungsstelle mit dem Stickstoffatom kennzeichnet
R10 H, NH2 oder Ci-C -Alkyl darstellt;
N CG
Gl -NHCO-, -CONH- oder ____J darstellt; (wobei wenn Gl NHCO oder
/ \
— N N co
\ / darstellt, RIO nicht NH2 ist),
n 0 oder 3 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach, durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO?., -NR?-, -
NRYCO-, -C(NH)NRY-, -CO RY-, -NRYNRY-, -S02NRYNRY-, -CO RYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C] -Cj 0-A3kyl, C2-C ] 0-A3kenyl, oder C ? -C j 0- A ik inyl darstellt, die jeweils mit HCONH2, -COOK, -OH, - H2, NH-CNNH , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, C3 -C3- Alkyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise
Figure imgf000172_0001
), wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOK, -OH, -NH2, NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können. Weitere unterbrec Gru en in G2 sind vorzugsweise
Figure imgf000173_0001
wobei Rx H, C\ -Cß-Alkyl oder Phenyl darstellt.
In dem erfindungsgemäßen Konjugal bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugale liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers liegen vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 %, besonders bevorzugt (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper) in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor.
Die Konjugale mit den Linkern der Forme! A3 bzw. A4 können durch Kupplung der Antikörper an die entsprechenden Bromderivate der folgenden Formeln A3' bzw. A4' erhalten werden:
Figure imgf000173_0002
Formel A3 '
Figure imgf000173_0003
Formel A4'
Diese Bromderivate der Formel A3' bzw. A4' können durch Reaktion von R22CH2CHB1-COOH bzw. R22CHB1 H2COOH mit einer Amingruppe des Binders erhalten werden, wie in den folgenden Schemata 30 bis 32 beispielhaft veranschaulicht.
Schema 30:
Figure imgf000174_0001
[a): 2-Brom- 1 -ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]
Schema 33 :
Figure imgf000175_0001
[a): 2-Brom-l -ethylp ridmium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, T; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer: d) PBS Puffer, 20h RT.]
Ausführungsfbrm E:
Die Erfindung stellt auch B inder- Wirkstoff- Konjugate der folgenden allgemeinen Formel bereit
BINDER WS
m
n wobei BINDER für den moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR- Antiköiper (besonders bevorzugt einen humanisierten oder chimären monoklonalen ITEM- anti- TWEAKR -Antikörper, insbesondere die humanisierten oder chimäreren ITEM-4- Varianten: TPP- 7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP-7076), L fin¬ den Linker, WS für den Wirkstoff, vorzugsweise einen KSP-Inhibitor, wie z.B. ein erfindungsgemäßer KSP-Inhibitor einer der Formeln (I), (la), (II), oder (IIa), m für eine Zahl von 1 bis 2, vorzugsweise 1, und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 ,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, wobei L eine der folgenden Strukturen aufweist. Hierbei ist m die Zahl der Wirkstoffmoleküle pro Linker und n ein Mittelwert der Anzahl an Wirkstoff-Linker-Konjugaten pro BINDER. Die Summe ler WS, die in einem Konjugatmolekül vorliegen, ist also das Produkt von m und n.
Hierbei steht L für:
Figure imgf000176_0001
Formel A wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, #2 die
Verknüpfungssteile mit dem Wirkstoff kennzeichnet, und R^2 COOH, COOR, COR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, Br, vorzugsweise COOH darstellt. Die Verknüpfung mit dem Schwefelatom des Binders kann somit eine der folgenden Strukturen aufweisen:
Figure imgf000176_0002
Forme
Figure imgf000176_0003
Formel A2 Bei Antikörper- Wirkstoff-Konjugateti, die mehr als ein Wirkstoffmolekül WS pro Wirkstoff- Antikörper -Konjugal enthalten, können beide Strukturen gemäß den Formeln AI und/oder A2 in einem
Figure imgf000177_0001
vorliegen. Da es sich bei den erfindungsgemäßen Antikö^er-Wirkstoff-Konjugaten um eine Mischung unterschiedlicher Antikörper— Wirkstoff- Konjugale handeln kann, ist es auch möglich, dass in dieser Mischung Antikörper— Wirkstoff- Konjugale sowohl mit der Formel AI oder Formel A2 als auch mit der Formel AI und A2 enihalten sind.
L5 ist eine Gruppe ausgewählt aus -(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)0-( )p-(CH2)a-, wobei m, n, o, p und q unabhängig voneinander die folgenden Werte aufweisen: m=0-10; n=0 oder 1 ; 0=0-10; p=0 oder 1 ; und q=0-10, wobei m+n+o=l-15, vorzugsweise 1-6 ist. X stellt einen 5- oder 6-gliedrigen, aromatischen oder nicht-aromatischen Hetero- oder Homocyclus dar, vorzugsweise -C5H4- oder -
CgHi Q- . R.S stellt eine Säuregruppe, vorzugsweise -COOH oder SO3H dar. O H-, -OCONH-, -NHCO-, -NHCOO-,
Figure imgf000177_0002
wobei r 1, 2 oder 3 ist.
L? ist eine Einfachbindung oder eine Gruppe ausgewählt aus einer geradkettige oder verzweigten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 10) Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, - RY-, - RYCO-, -C(NH) Ry-, -CONRY-, -NRYNRY-, -S< )2\ R>'\ R.V-. -CONRYNRY-, (wobei Ry H, Phenyl, C -Cj Q-Alkyl, C2-C 1 Q-Alkenyl, oder C2-C] Q-Alki yi darstellt, die jeweils mit HCONH2, -COOH, -OH, -NH2, NH-C NH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CRx=N-0- (wobei Rx H, Cj -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, vorzugsweise 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -
— N. N— CO—
S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei die
Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -
COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können. L5 ist bevorzugt eine Gruppe -(CH2)m-(CHRs)n-(OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q-, wobei m=l-3, n=0, o=0-7, p=0, und q=0 oder 1 darstellt. Besonders bevorzugt ist eine Gruppe -(CH2)m-(CHRS)n- (OCH2CH2)0-( )p-(CH2)q-, wobei m=l oder 2, n=0, O=0 oder 1, p=0, und q-0 oder 1 darstellt.
Le ist bevorzugt eine Gruppe ausgewählt aus ---CONH- und -NHCO-.
L? ist bevorzugt eine Einfaehbindung oder -[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)2- wobei x = 0 bis 5 ist;
y = 0 oder 1 ist;
z = 1 bis 5 ist; und
X4 -O-, -CONH-, -NHCO- oder
Figure imgf000178_0001
darstellt.
Besonders bevorzugt ist L? eine Einfaehbindung oder eine Grappe -[(CH2)x-NHCO-)], wobei x = 1 bis 5 ist.
Besonders bevorzugt stellt ~L5-L6-L7- -(CH2)m-(CHRs)n-(OCH2CH2)0-(X)p-(CH2)q-NHCO--
[(CH2)x-NHCO-)] dar, wobei m=l oder 2, n=0, o=0 oder 1, p=0, und q=0 oder 1 , und x=i-5 darstellt.
Es ist jedoch auch möglich, dass diese beiden Strukturen gemeinsam in dem erfindungsgemäßer! Konjugal vorliegen.
Diese Antikörper-Wirkstoft-Konjugate können erfindungsgemäß aus den Verbindungen der Formel
BINDER- WS
m wobei L die folgende Formel A' aufweist, hergestellt werden:
Figure imgf000179_0001
Formel A'
Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung von A' zu A durch Rühren in einem pH-Puffer mit einem pH- Wert von 7.5 bis 8.5, vorzugsweise 8, bei einer Temperatur unterhalb 37°C, vorzugsweise 10 bis 25 °C, über einen Zeitraum von bis zu 40 Stunden, vorzugsweise 1 bis 15 Stunden.
Ausfülirangs brm 1:
Ein Antikörper- Wirkstoff-Konjugat der Formel
Figure imgf000179_0002
wobei
R2, R4 und R5H darstellen;
R3 -CH20H darstellt;
Rl -L1-L2 -BINDER darstellt, wobei
Figure imgf000179_0003
darstellt, wobei #2 die Verkrustung mit der L2 darstellt, und #1 die Verknüfung mit die andere Verknüpfung darstellt; und L2 eine oder beide der folgenden Strukturen der Formeln A5 und A6 darstellt:
Figure imgf000180_0001
Formel A5
Figure imgf000180_0002
Formel A6 wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatorn des Antikörpers kennzeichnet, #2 die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet, und
R22 COOK, COOR, COR, CONHR (mit R jeweils Cl -3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOK darstellt.
In einem erfindungsgemäßen Konjugal; bzw. in einem Gemisch, der erfindungsgemäßen Konjugale liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A5 oder A6 vor: Hierbei liegen die Strukturen der Formel A5 oder A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur
Figure imgf000181_0001
vor.
Der Antikörper ist vorzugsweise ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ΠΈΜ-4 anti- TWEAKR-Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimärer en ΠΈΜ-4- Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP-7074, TPP-7075 und TPP- 7076.
Spezielle Ausfiihrungsformen
Es werden folgende besonders bevorzugte Antikörper-Konjugate gemäß einer der folgenden Formeln bereitgestellt, wobei n eine Zahl von 1 bis 20 ist und AK1 (wie auch AKla, AKlb, usw.) bzw. AK2 (wie auch AK2a, AK2b usw.) einen Antikörper darstellen. AK1 stellt einen über Cy stein verknüpften Antikörper, AK2 einen über Lysin verknüpften Antikörper dar. Der Antikörper (AK1 oder AK2) in einer der der folgenden Formeln ist vorzugsweise ein humanisierter oder chimärer monoklonaler ITEM-4 anti-TWEA R-Antikörper. Besonders bevorzugt sind die humanisierten oder chimäreren ITEM-4- Varianten: TPP-7005, TPP-7006, TPP-7007, TPP-7053, TPP-7073, TPP- 7074, TPP-7075 und TPP-7076.
Figure imgf000182_0001
Figure imgf000183_0001
Figure imgf000184_0001
Figure imgf000185_0001
Figure imgf000186_0001
Figure imgf000187_0001
Weitere Konjugate
Weitere Konjugale können eine der folgenden Formeln aufweisen:
Figure imgf000188_0001
Figure imgf000189_0001
Figure imgf000191_0001
Figure imgf000192_0001
und
Figure imgf000193_0001
wobei
AK.1 einen über Cysteirt verknüpften und AK.2 einen über Lysin verknüpften nioderat agonistiscli oder nicht agonistiscli wirkenden anti-TWEAKR- Antikörper darstellt, n eine Zahl von 1 bis 20 darstellt; und
Li eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 30
Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=0)2-, -NH-, Cyelopentyl, Piperidinyl, Phenyl unterbrochen sein kann,
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -COOH, oder -NH2 substituiert sein kann,
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Hierbei steht der Linker Li vorzugsweise für die Gruppe
§- H-(CH2)2-§§;
Figure imgf000193_0002
§-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-§ § ;
§-NH-CH(COOH)-(CH
Figure imgf000193_0003
§-NH-(CH2)2-C »-0-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-C )-NH-(CH2)2-§§;
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-ΝΠ-( (Ί !; ) .-ΝΠ-( ·( 0)-( Ί Ι.- ^:
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH(CH3)-§§; §-NH-(CH2)2-0-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(0)-CH2-§§;
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§- H-(CH2)2- H-C(=0)-CH(C2H4COOH)-§§;
§-NH-(CH2)2-NH ;(K))-((CH2)2-0)3-(CH2)2-§§:
§-NH-(CH2)2-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH ;(K))-CH2-NH-C(==0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2)3-NH ;(K))-CH2-NH-C(==0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-CK))-CH(CH2COOH)-§§;
§-NH CH2)2-NH-C( ))-CH(C2H4COOH)-NH-C(K))-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH CH2)2-NH-C( ))-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(K))-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2OH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH[CH^)-NH-{CH2)2-0)4 CH2)2COOH]-CH2-NH-C(-0)-CH2-§§;
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§- H-(CH2)4-CH(COOH)- H-C(K))-CH(CH3)- H-C(=0)-CH(isoC3H7)-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)- H-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-
C(=0)-(CH2)5-§§;
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CH(isoC3H7)-NH-C(K))-(CH2)5-§§;
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C(=0)-CH2-§§;
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§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0) ^
§-NH-(CH2)3-C(=0)- H-CH(CH3)-C(=O)-NH-CH[(CH2)3- H-C(=O)-NH2]-
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§-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)-§§;
§-CH(CH3)-NH-C(K))-CH(isoC3H7)-NH-C(=<))-CH2-§§;
(. ίΙ ·Χίί·{·{ <)K ll:isuC:l{ )-\fl-C{ <)!·{(.Ί{·),.^;
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§-CH(CH3)- H-C(=0)-CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-((CH2) -0 -(CH2)2- H-C(=0)-
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~
§ ^ NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)- H-C(=0)-((CH2)2-
Figure imgf000195_0004
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-§§; §-CH2-S-(CH2)5-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
H ii-SC il C iUCt >()M) \M (.( Oi-ii, !}.),.^:
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)- H-((CH2)2-0)2-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)- H-((CH2)2-0)2-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)- H-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-Cfti-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(=0)- H-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)5-§§:
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)-NH-((CH2)2-0)2-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(K))-]SO (CH2)2-0)4-(CH2)2-N
§-CH2-S-(CH2)2 ;^
§-CH2-S-(CH2)2 ;^
§ :H2-S-CH2CH(C(X)H)-^
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§ :H2-S-CH2CH(C(X)H)-N^
§-CH2-S-(CH2)2-CH(C^
§§;
§-CH2-S CH2)2-C(=0)-NH-CH(C2H4COOH)-C'( ))- H-(CH2)2- H-C(==0)-CH2-
§§;
^•Cii-.S-fli ΠΙίΜί-Ο; (>}·((·!! } ·(·ίΗ)Ιί|·ί·· θ!-\Ι i-ίΠ !. } -\i 1-U ΟΚΊί.··
§§;
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-CH3]-C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-
CH2-§§;§-CH2-S-CH2CH(C(X)H)-NH-C(K))-CH(CH3)-m-C( ))-CH(^
NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH|T^-C(=0)-(CH2)2-COOH]-C(=0)-NH-(CH2)2-S(=0)2-(CH2)2- NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S %CH[NH :(<^^^
C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)- H-(CH2)2-COOH]- H-C(0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2- H-
Figure imgf000196_0002
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)- H-(CH2)2-COOH]- H-C(0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2- H- C(=0)-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)2CH(COOH)- H-C(=0)-((CH2)2-0)4-
(CH2)2-NH-C(-0)-CH2-§§ §-CH2-S-CH2CH[C(=0)-NH-((CH2)2-0)4-(CH2)2-COOH]- H-C(=0)-((CH2)2-0)4- ί( Ή } ··Χ ί ί·( ·{ OK 1 1.- § § ;
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wooei
§ die Bindung an das Wirksloffrnolekül darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt und
1S0C3H7 einen isoPropyl-Rest darstellt.
Diese Konjugale umfassen auch ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
Therapeutische Verwendung
Zu den hyperproliferaiiven Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumorerkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brusttumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegstumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchialkarzinome), Hirntumore (z.B. des Hirnstamms und des Hypothalamus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medulloblastoma, Meningiome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speiseröhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Analkarzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt-hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypopharynx-, Nasophar nx-, Oropharynx-, Lippen- und Mundhöhienkarzinome, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliome, Plattenepithelkarzinome, Kaposi-Sarkom, maligne Melanome, nicht-meianomartiger Hautkrebs, Merkelzell-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome, Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome, Hämangiosarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retinoblastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und parathyroiden Brösen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheldrüsenkarzinome, Adenokarzinome), Tumore des Harntrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Harnleite rtumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovaria!-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute myeloide, akute ly phoblastische, chronisch- lymphozytische, chronisch- myelogene und Haarzell-Leukämie, sowie AIDS -korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell- Lymphome, Burkitt-Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem.
Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden.
Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfmdungsgemäßen Verbindungen umiasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung metastasierter oder zirkulierender Formen hiervon.
Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessern, die durch diese Krankheit beeinträchtigt werden, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen fuhrt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention der zuvor genannten Erkrankungen.
Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti- hyperproliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:
1311-ehTNT, Abarelix, Abirateron, Aclarubicin, Afatinib, Aflibercept, Aldesleukin, Alemtuzumab, Alisertib, Alitretinoin, Alpharadin (Radiurn-223-ehlorid), Altretamin, Aminogluteihirnid, AMP- 514, Amrubiein, Amsacrin, Anastrozol, Arglabin, Arsentrioxid, Asparaginase, AT9283, Axitinib, Azaeitidin, Basiiiximab, Belotecan, Bendamustin, Bevacizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Bisantren, Bleomycin, BMS-936559, Bosutinib, Bortezomib, Brentuximab vedotin, Buserelin, Busulfen, Cabazitaxel, Cabozantinib, Calciumfolinat, Calciumlevofolinat, Capecitabin, Carboplatin, Carfilzomib (proteasome Inhibitor), Carmofttr, Carmustin, Catumaxomab, Celecoxib, Ceimoleukin, Cetuximab, Chlorambucil, Chlormadinon, Chlormethin, Cisplatin, Cladribin, Clodronsäure, Clofarabin, Copanlisib , Crisantaspase, Crizotinib, Cyclophosphamid, CYC116, Cyproteron, Cytarabin, Dacarbazin, Dactinomycin, Darbepoetin-alfa, Dabrafenib, Danusertib, Dasatinib, Daunorubicin, Decitabin, Degarelix, Denileukin-Diftitox, Denosumab, Deslorelin, Dibrospidiumchlorid, Docetaxel, DoxiQuridin, Doxorubicin, Doxorubicin + Esiron, Eculizumab, Edrecolomab, Elliptiniuniacetat, Eltrombopag, Endostatrn, ENMD-2076, Enocitabin, Epirubicin, Epitiostanoi, Epoetin-alfa, Epoetin-beta, Epiaplatin, Eribulin, Erlotinib, Estradiol, Estramustin, Etoposid, Everolimus, Exemestan, Fadrozol, Filgrastim, Fludarabin, Fluoruracil, Flutamid, Formestan, Fotemustin, Fuivestrant, Galliumnitrat, Ganireiix, Gefitinib, Gemcitabin, Gemtuzumab, Glutoxim, Goserelin, Histamindihydrochlorid, Histrelin, Hydroxycarbamid, ί-125-Seeds, Ibandronsäure, Ibritumomab-Tiuxetan, Ibrutinib, Idarubicin, lfosfamid, Imatinib, imiquimod, fNCB24360, Improsuifan, Interferon-alfa, Interferon-beta, Interferon -gamma, Ipiiimumab, Irinotecan, Ixabepiion, Lambroiizumab, Lanreotid, Lapatinib, Lenaiidomid, Lenograstim, Lentinan, Letrozol, Leuprorelin, Levamisol, Lisurid, Lobaplatin, Lomustin, Lonidamin, Masoprocol, Medroxyprogesteron, Megestrol, Melphalan, Mepitiostan, Mercaptopurin, Methotrexat, Methoxsalen, Methylaminolevulinat, Methyltestosteron, Mifamurtid, Miltefosin, Miriplatin, Mitobronitol, Mitoguazon, Mitolactol, Mitomycin, Mitotan, Mitoxantron, MLN-8054, Mpsl- Inhibitoren (offenbart in WO2013/087579, insbesondere Beispiel 01.01, WO2014/131739, insbesondere Beispiel 2), Nedaplatin, Nelarahin, Nemorubicin, Nilotinib, Nilutamid, Nimoiuzumab, Nimustin, Nitracrin, Nivolumab, NMS-P715, NMS-P937, Ofatumumab, Omeprazol, Oprelvekin, Oxaliplatin, p53-Gentherapie, Paclitaxel, Palbociclib, Palifennin, Palladium- 103 -Seed, Pamidronsäure, Panitumumab, Pazopanib, Pegaspargase, PEG-epoetin-beta (Methoxy-PEG-epoetin-beta), Pegfiigrastim, Peg-interferon-aäfa-2b, Pemetrexed, Pentazocin, Pentostatin, Peplomycin, Perfosfamid, Picibanil, Pirarubicin, Plerixafor, Plicamycin, Poliglusam, Polyestradiolphosphat, Polysaccharid- , Ponatinib, Porfimer-Natriurn, Pralatrexat, Prednimusiin, Procarbazin, Quinagolid, , R763, Raloxifen, Raltitrexed, Ranirnusiin, Razoxan, Refametinib (, Regorafenib, Risedronsäure, Rituxiinab, Rornidepsin, Roinipiostiin, Roninciclib, Riixolitmib, Sargramostim, Siputeucet-T, Sizofiran, Sobuzoxan, Natriumglycididazol, S S-314, Sorafenib, Streptozocin, Sunitinib, Talaporfin, Tamibaroten, Tamoxifen, Tasonermin, Teeeleukin, Tegailrr, Tegafüi- + Gimeracil + Oteracil, Temoporfin, Temozolomid, Temsirolimus, Teniposid, Testosteron, Teirofosmin, Tiialidomid, Thiotepa, Thy alfasin, T M-PLK1, Tioguanin, Tocilizumab, Topotecan, Toremifen, Tosituroomab, Tozasertib, Trabeciedin, Trametinib, Trastuzumab, Trastuzumab emtansine, Treosulfan, Tretinoin, Trilostan, Triptorelin, Trofosfamid, Ti ptophan, Ubenimex, Valrabiein, Vandetanib, Vapreotid, Vemurafenib, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinflunin, Vinorelbin, Volasertib, Vorinostat, Vorozol, XL228, Ytlrium-90-GlasmikiOkugeln, Zinostatin, Zinostatin-Stimalanier, Zoledronsäure, Zorubicin.
Darüber hinaus können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung beispielsweise mit Bindern kombiniert werden, die beispielhaft an die folgenden Targeis binden können: OX-40, CD 137/4- 1BB, DR3, ID01/TD02, LAG-3, CD40.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch oder zytotoxisch wirksamen Agenzien folgende Ziele verfolgt werden: eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff; die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen; die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe; die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tuniorerkrankungen; das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie; eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardiherapie.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise, parenteral, möglicherweise inhalativ oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Reso^ionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intra spinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. . intramuskulär, subkutan, intrakutan, perkutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Tnjektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen oder Lyophilisaten. Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg/kg, vorzugsweise etwa ö.öl bis 0.5 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger' als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen.
Wenn bei Versuchsbeschreibungen keine Angaben bzgl. einer Temperatur gemacht werden, bei der die Reaktion durchgefurht wird, ist von Raumtemperatur auszugehen.
Synthesewege:
Exemplarisch für die Au fühaingsbeispiele sind in folgenden Schemata beispielhafte Synthesewege zu den Ausfuhrungsbeispielen dargestellt:
Schema 20: Synthese von Cystein- verknüpften ADCs
Figure imgf000202_0001
Figure imgf000203_0001
[a): beispielsweise Natriumtriacetoxyborliydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) beispielsweise Acetoxyaeetylchiorid, NEt3, DCM, RT; c) beispielsweise LiOH, THF/Wasser, RT; d) beispielsweise l , Pd-C, EtOH, RT; e) beispielsweise Teoc-OSu, Et3, Dioxan, RT; ) beispielsweise Fmoc-Cl, Diisopropylethyiamin, Dioxan/Wasser 2: 1 , RT]
Figure imgf000204_0001
[a): beispielsweise Benzylbromid, CS2CO3, DMF, RT; b) beispielsweise Pd/dppf Cl?., DMF, a2CO:i, 85 °C; c) beispielsweise LiAlHt, THF, 0 °C; Mn02, DCM, RT; d) beispielsweise Ti(iOPr)4, THF, RT; e) beispielsweise tBuLi, THF, -78 °C; MeOH, NH4CI; f) beispielsweise HCl/1, 4-Dioxan]
Figure imgf000204_0002
Schema 26: Synthese von Cystem- verknüpften ADCs über hydrolysierte Bernsteinsäureamide
Dieses Verfahren wurde insbesondere bei ADCs mit LI = CH2 oder mit LI = CH-CH3 oder mit en.
Figure imgf000205_0001
chema 27: Synthese von ADC-Precurser Molekülen
Figure imgf000206_0001
[a): N atriumtria cetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyaeetyichlorid, Diisopropylethylamin, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) Trifiuoressigsäure-- 1 -(2-aminoethyl)- l H-pyrrol~2,5-dion (1 : 1) HA TU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.]
Figure imgf000207_0001
[a): HATU, DMF, D sopropylethylamin, RT; b) Zinkchlorid, Trifiuorethanol, 50°C, EDTA.] Schema 29: Synthese von ADC-Precurser Molekülen
Figure imgf000207_0002
[a): Natriumtriacetoxyborhydxid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacelylchlorid, Triethylamin, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) Trifluoressigsäure--l -(2-ammoe l)-lH-pyrrol-2,5-dioi! (1 : 1) HATU, DMF, Diisopropylelhylarmn, RT; e) Zinkchlorid, Trifiuorethanol, 50°C, EDTA.]
Figure imgf000208_0001
[a): 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Tritliiorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.] hemaJ^^^^
Figure imgf000208_0002
[a): 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.] chema 32: Synthese von Intermediaten
Figure imgf000209_0001
[a) beispielsweise Dimethylzink, CyhexylMgCl, THF, -78 °C; NH4CI; b) beispielsweise HCl/1, 4- Dioxan]
Schema 33: Synthese von ADC-Precurser Molekülen
Figure imgf000209_0002
[a): Natriumtriacetoxyborhydxid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylchlorid, Triethylamin, DCM, RT; c) L-Csytein, NaHCOs, DBU, isopropanol/Wasser , RT; d) 3-Sulfanylpropansäure, K -i 'i ) -..)■'. Γ: e) Linker, HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.] chema 34: Synthese von Lysin- verknüpften ADCs
Figure imgf000210_0001
Schema 35: Synthese von Lysin-verknüpftcn ADCs
Figure imgf000210_0002
A, Beispiele Abkürzungen und Akronyme;
A498 humane Tumorzelllinie
ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Synonym für P-gp und MDR1 )
abs. Absolut
Ac Acetyl
ACN Acetonitril
aq. wässrig, wässrige Lösung
ATP Adenosintriphosphat BCRP Brastkrebs-Resisteoz-Protein, ein Efflux-Transporter
BEP 2-Brom- 1 -ethylpyridiDium-Tetrafiuoroboi-at
Boc fer/.-Butoxycarbonyl
br. breit (bei NMR)
Bsp. Beispiel
BxPC3 humane Tumorzelllinie
ca. circa, ungefälrr
CI chemische Ionisation (bei MS)
d Dublett (bei NMR)
d Tag(e)
DC Dünnschichtchromatographie
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DCM Dichlormethan
dd Dublett von Dublett (bei NMR)
DMAP 4-N, .Y-Dimdhylaminopyridin
DME 1,2-Dimethoxyethan
DMEM Duibecco's Modified Eagle Medium (standardisiertes Nährmedium für die Zellkuttur)
DMF NN-Dimethylformamid
DMSO Dimethyls lfoxid
DPBS, D-PBS, PBS Duibecco's Phosphai-gepufferie Salz-Lösung
PBS - DPBS = D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No D8537
Zusammensetzung:
0,2 g KCl
0,2 g Ki f PO . (anhyd)
8,0 g aCl
l ,15 Na:HP()4 (anhyd)
ad 1 1 mit H20 auffüllen
dt Dublett von Triplett (bei NMR)
DTT DL-D ithiothreitol
d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute)
EDC N'-(3-Dimetbylauiinoprc)pyi)-Ar-ethy]carbodiitnid-Hydrochlorid
EGFR Epidemial growth factor receplor = Epidermaier Wachstumsfaktor
Rezeptor
EI Elekironenstoß-Ionisation (bei MS) ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay
eq. Äquivalente)
ESI Elektrospr y- Ionisation (bei MS)
ESI-MicroTofq ESI- MicroTotq (Name des Massenspektrometer mit Tof = Time Of
Fligbt und q = Quadrupel)
FCS fötales Kälberserum
Fmoc {911 -F luoren-9 -y lmelhoxy) c arbonyl
ges. Gesättigt
GTP Guanosin-5'-triphosphat
h Stunde(n)
HATU 0-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-A^Ar,A'',A''-tetraniethyluronium- hexafluorophosphat
HEPES 4-(2-Hydroxycthyl)piperazin- 1 -ethansulloTisäure
HOAc Essigsäure
HOAt 1 -Hydroxy-7-azahenzotriazol
HOBt I -Hydroxy- 1 /7 -benzotriazol -Hydrat
HO S u N-Hydroxy su c cinimid
HPLC Hochdiuck-, Hochleistungsflüssigchromalographie
IC50 halbmaximale Inhibitionskonzentration
i.rn. intramuskulär, Applikation in den Muskel
i.v. intravenös, Applikation in die Vene
KEP -4 humane Tumorzelllinie
konz. Konzentriert
KU-19-19 humane Tumorzelllinie
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie
LLC-PK 1 -Zellen Lewis hing Carcinoma pork kidney cell line
L-MDR human MDRl transnzierte LLC-PK i Zeilen
L0V0 humane Tutnorzelllin ie
M Mu liplett (bei NMR)
MDRl Mullid-Tug resistence protein 1
MeCN Aeetonüril
Me Methyl
min Minute(n) MS Massenspektrometrie
MIT 3 -{4,5 -Dimethylt azol-2 -yl)-2 ,5 -diphenyl-2//-tetrazol iumbromid 3
NCI-H292 humane Tumorzelllinie MM N-Methylmorpholin
MP N-Methyi-2-pyrrolidinon
NMR Kernresonanzspeklrometrie
NMRI Mausslamm, Herkunft aus dem Naval Medicai Research Institute
(NMRI)
Nude Mäuse Nacktmäuse (Versuchstiere)
NSCLC Non small cell lung Cancer (Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom)
PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung
Pd/'C Palladium auf Aktivkohle
P-gp P-Glycoprotein, ein Transporterprotein
PNGaseF Enzym zur Zuckerabspaltung
quant. quantitativ (bei Ausbeute)
quart Quartett (bei NMR)
quint Quintett (bei NMR)
Rf Retentionsindex (bei DC)
RT Raumtemperalur
Rt Retentionszeit (bei HPLC)
s Singulett (bei NMR)
s.c. subcutan, Applikation unter die Haut
SC1D Mäuse Versuchsmäuse mit einem schweren kombinierten Immundefekt
(severe combined immunodeficiency)
SK-HEP-1 humane Tumorzelllinie
t Triplett (bei NMR)
TBAF Tetra-n-butylammoniumfluorid
TEMPO (2,2,6,6-Tetramethyl-piperidin- 1 -yl)oxyl
ieri. Tertiär
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofuran
T3P® 2,4,6-Tripropyi-i ,3,5,2,4,6-trioxat-iphosphiriari-2,4,6-trioxid
UV Ultraviolett-Spelrtrometrie
v/v Volumen zu Volumen-Verhältnis (einer Lösung) Z Benzyloxycarbonyl
786-0 Humane Tumorzelllinie
HPLC- smd LC-MS-Methoden:
Methode 1 (LC-MS):
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Aequity UPLC HSS T3 1 .8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99 ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A —► 1.2 min 5% A— * 2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 mL/min; UV-Detektion: 208 - 400 nm.
Methode 2 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Aequity I-CLASS; Säule: Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 .um; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B— * 1.5 min 2% B -* 8.5 min 95% B -> 10.0 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.50 mL/min; UV-Detektion: 220 nm
Methode 3 (LC-MS):
Instrument MS: Waters (Mieromass) QM; Instrument HPLC: Agilent 1 100 Serie; Säule : Agient ZORBAX Extend-C18 3.0x50mm 3.5-Micron; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mot Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98% A— > 0.2min 98% A—>■ 3.0 min 5% A-> 4.5 min 5% A ; Ofen: 40°C; Fluss: 1.75 mL/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 4 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Aequity I-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.03 % Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.03 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B -> 0.3 min 10% B -> 1.7 min 95% B -» 2.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 3 .20 mL/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 5 (LC-MS):
Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Aequity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: I 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0,25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A -+ 6.0 min 5% A —► 7.5 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.35 niL/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.
Methode 6 (LC-MS ):
Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Säule: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: I 1 Wasser + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure, Eluent B: I 1 Acetonitril + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A — 0.5 min 97% A --> 3.2 min 5% A -» 4.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.3 mL min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 7 (LC-MS):
Instrument: Agilent MS Quad 6150;HPLC: Agilent 1290; Säule: Waiers Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A — * 0.3 min 90% A—► 1.7 min 5% A ~> 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1,20 mL/min; UV-Detektion: 205 - 305 nm.
Methode 8 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μηι; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.03 % Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B 2.0 min 2% B -> 13.0 min 90% B -» 15.0 min 90% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 ml/min; UV-Detektion: 21 0 nm
Methode 9: LC-MS-Prep Reinigungsmethode für die Beispiele 181-191 (Methode LIND-LC-MS- Prep)
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Waters X-Bridge Cl 8, 19 mm x 50 mm, 5 μιη, Eluent A: Wasser + 0.05% Ammoniak, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). bzw.
Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 2,1.2 mm, Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). Methode 10: LC-MS-Analytik-Methode für die Beispiele 181-191 (LIND_SQD_SB_AQ)
Instrument MS: Waters SQD; Instrument HPLC: Waters UPLC; Säule: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 mm x 2.3 mm, 1 .8 μπι; Eluent A: Wasser + 0.025% Ameisensäure, Eiuent B: Acetonitril (ULC) + 0.025% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A - 3 .0 min 5%A - 1.4 min 5%A - 1.43 min 98%A ·· 1.5 min 98%A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.600 ml/min; UV-Detekiion: DAD; 210 nm.
Methode 11 (HPLCi:
Gerät: HP1100 Serie
Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP~18e, 50-4,6mm, Best.-
Nr.l .51450.0001, Vorsäule Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4,6mm, Best.-Nr. 1.51470.0001
Gradient: Flow 5mL/ Min
Injection Volume 5μ,1
Solvent A: HCL04 (70%ig) in Wasser (4mL/ 1)
Solvent B: Acetonitril
Start 20% B
0.50 Min 20% B
3.00 Min 90% B
3.50 Min 90% B
3.53 Min 20% B
4.00 Min 20% B
Säulentemperatur: 40°C
W eilenlänse: 21 Onm
Metliode 32 (LC-MS):
Gerätetyp MS: Thermo Scientific FT-MS; Gerätetyp UHPLC+: Thermo Scientific UltiMate 3000; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, CI 8 1.8 μιτι; Eluent A: I 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eiuent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B --> 2.5 min 95% B 3.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.90 ml/min; UV-Detektion: 210 nm/ Optimum Integration Path 230-300 nm
Methode 13: (LC-MS):
Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument Waters UPLC Acquity; Säule : Waters BEH C 18 1 .7 μ 50 x 2.3 mm; Eluent A: 1 3 Wasser + 0.01 mol Ammoniumformiat, Eluent B: 1 3 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 95% A -» 0.1 min 95% A -> 2.0 min 15% A -> 2.5 min 15% A- 2.51 min 30% A— > 3.0 min 10% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.5 ml/min; UV-Detektion: 210 nm
Methode 14: (LC-MS):
Gerätetyp MS: ThermoFis erScientific LTQ-Orhitrap-XL; Gerätetyp HPLC: Agilent 1200SL; Säule: Agilent, POROSHELL 320, 3 x 150 mm, SB - C3 8 2.7 μ.ηι; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.1 % Trifluoressigsäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.1% Trifluoressigsäure; Gradient: 0.0 min 2% B—> 0.3 min 2% B -> 5.0 min 95% B — > 1 0.0 min 95% B; Ofen: 40°C; Fluss: 0.75 ml/min; UV- Detektion: 210 nm
Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die veröffentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.
Ausgangsverbindungen und Intermediate:
Intermediär C2 tert-Butyl-(2S)-4-({(lR) -[l -b^^
dimethylpropyl}amino)-2-[(te -butoxycarrjonyl)amino]butanoat
Figure imgf000217_0001
4.22 g (34.5 mmol) tert-Butyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-homoserirjat wurden in 180 mL Dichiormethan gelöst und dann mit 3.5 mL Pyridin sowie mit 9.2 g (21.7 mmol) 3 , 3 , 3 -Triacetoxy- llambda'5,2-benziodoxol-3(lH)-OD versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt, anschließend mit 500 mL Dichlormetlian verdünnt und zweimal mit 10%-iger Natriumtiosulfatlösung und dann nacheinander zweimal mit 5%-iger Zitronensäure und zweimal mit 10%-iger atriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in DCM aufgenommen und mit einer Mischung aus Diethylether und n-Pentan versetzt. Der Niederschlag wurde abtillriert und das Filtral anschließend einggengt und aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. Es wurden 3.7 g (93%) tert-Butyl-(2S)-2-[(teit-butoxycarbonyl)ainino]-4-oxobutanoat erhalten, die ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt wurden. (Rf-Wert: 0.5 (DCM/Methanol 95/5).
3.5 g (9.85 mmol) von Intermedia! Cl wurden in 160 mL DCM gelöst und mit 3.13 g (14.77 mmol) Natriunitriacetoxyborhydrid sowie mit 0,7 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (11.85 mmol) tert-Butyl-(2S)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-oxobutanoat zugegeben und der Ansatz weitere 30 min bei RT gerührt. Dann wurde das Lösunsgmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Acetonitril/Wasser aufgenommen. Der ausgefallene Feststoff wurde ab filtriert und getrocknet und man erhielt 5.46 g (84%) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 2.5 min;
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.13 min; MS (ESI os): m z - 613 (M+H)+. Intermediat Cll
R/S-(l l-{(lR)-l-[l -Ben2yl-4-(2,5-^^^
dimethyi-6,12-dioxo-5-oxa-7 l l-diaza-2-siia1ridecan-13-yl)-homocy
Figure imgf000218_0001
990.0 mg (2.79 mmol) (1 )-1-[1-Βεηζγ1-4-(2,5-άίΑυο 1ιειιν1)-1 Η-ρνΓτο1-2-ν3]-2,2- dimethy]piOpan-l -amin "wurden in 15.0 ml, Dichlormethan vorgelegt und mit 828.8 mg (3.91 mmol) Natriumtriacetoxyborliydrid und 129.9 mg (3.21 mmol) Essigsäure versetzt und 5 min bei RT grührt. Es wurden 698.1 mg (3.21 mmol) 2-(Trimethylsilyi)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat (Intermediat L58) gelöst in 15.0 niL Dichlormethan zugegeben und die Reaktionsmischung über Nach! bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung "wurde mit Eihyiaceiat verdünnt und die organische Phase je zweimal mit ges. atriumcarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmiitel: Dichlormethan/Methanoi 100:2) gereinigt. Die Lösemittel wui'den im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.25 g (73 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-({(lR)-l - [l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pym">l-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} ami
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.09 min; MS (ESIpos): m/z - 556 (M+H)+.
400.0 mg (0.65 mmol) 2-(TriBle1 ylsilyl)et yί 3-({(l R) -[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-l H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propy]]carbamat wurden mit 351.4 mg (1.5 mmol) Triethylamin und mit 163 .6 mg (1.43 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase dreimal mit Wasser und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Es wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 3: 1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 254.4 mg (57 % d. Th.) der Verbindung 2-(Tnmethylsilyl)ethyl- {3-[ {(iR)-l -[l-benzyl-4-(
pyrrol-2 -yl 1 -2 ,2 -dimethylpropy 1 } ( chloracetyl) amino Ipropyl } carbamat .
LC-MS (Methode 1): R, - 1.49 min; MS (ESlneg): m/z - 676 (M+HCOOy.
11 7.4 mg (0.39 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl- {3-[ {(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH- pynOl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(chloraeetyl)amino]piOpyl}earbamat wurde in 1 0.0 mL Isopropanol gelöst und mit 928.4 μ,Ι. I M NaOH und 50.2 mg (0.37 mmol) DL-Homoeystein versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 4.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 75.3 mg (48 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.24 min; MS (ESIpos): m/z - 733 (M+H)+.
'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.40 (m, 1H), 0.75-0.91 (m, 1 I H), 1.30 (m, 1H), 1.99-2.23 (m, 2H), 2.63-2.88 (m, 4H), 3.18-3.61 (rn, 5H), 3.79-4.10 (m, 3H), 4.89 (d, 1H), 4.89 (d, 1H), 5.16 (d, 1H), 5.56 (s, 1H), 6.82 (m, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.97 (ni, 1H), 7.13-7.38 (ni, 6H), 7.49 (s, I i i ). 7.63 (m, 1H), 8.26 (s, 3H).
Intermediat C12
R/S-[(8S)- 1 1 -{(1R)- 1-[1 -Benz i-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-p rrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -8- carboxy-2,2-dimeth l-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecar!- 13-yljhomocystein
Figure imgf000220_0001
Die Synthese erfolgte in Analogie zur Synthese von Intemiediat Cl 1 mit
Methyl-(2S)-4-oxo-2-( { 2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoat (Intemiediat L57) und Intermediat C52 als Edukten.
LC-MS (Methode 1): R, = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z - 775 (M+H)+. Intgrmgdjat_C52
(1R)-I -[I -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrroi-2-yl]-2^-dimethylpropan- 1 -amin
Figure imgf000221_0001
30.00 g (49.01 mmol) Meihyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylai wurden in 100.0 mL DMF vorgelegt und mit 20.76 g (63.72 mmol) Cäsiumcarbonat und 9.22 g (53.91 mmol) Benzylbromid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei RT. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Wasser und Ethylacetat verieilt und die wässrige Phase mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wiffden über Magnesiunisuifai getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Ansatz wurde mit 90,0 g Methyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat wiederholt. Die Reinigung der vereinigten beiden Ansätze erfolgte mittles präp. RP-HPLC (Säule: Daiso 300x100; 10μ, Fluss: 250 mL/min, MeCN/W asser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 125.15 g (87 % d. Th.) der Verbindung Methyl-l-benzyl-4-brom-lH-pyrro!-2-earboxylat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.18 min; MS (ESIpos): m/z - 295 [M+H]+.
Unter Argon wurden 4.80 g (16.32 mmol) Methyl- l-benzyl-4-bro m- lH-pyrrol-2-carboxylat in DMF vorgelegt und mit 3.61 g (22.85 mmol) (2,5-Difluorpb.enyl)boronsäure und 19.20 mL ges. Natriumcarbonat-Lösung und 1.33 g (1.63 mmol) [1,1 '-Bis-(dipheny3phosphino)-ferrocen3- dichlorpalladium(II):Dichlomiethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 85 °C gerütrrt. Die Reaktionsmischung wurde über Ceiite filtriert und der Filterkuchen mit Ethylacetat gewaschen. Die organische Phase wurde mit Wasser extahiert und dann mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmitiel: Cyclohexan/Ethylaeetat 100:3) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.60 g (67 % d. Th.) der Verbindung Methyl- i-benzy 1-4- (2,5-difiuorphenyl)-lH-pyrrol-2-carboxy3at.
LC-MS (Methode 7): Rt - 1.59 min; MS (ESIpos): m/z - 328 [M+H]+.
3.60 g (11.00 mmol) Methyl- 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-carboxylat wurden in 90.0 mL THF vorgelegt und bei 0 °C mit 1.04 g (27.50 mmol) Lithiumaluminiumhydrid (2.4 M in THF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Es wurde bei 0 °C ges. aliumtiatriumtartrat-LösuBg zugegeben und die Reaktionsmischung mit Ethylacetat versetzt. Die organische Phase wurde dreimal mit ges. Katiumnatriu tartrat-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 30.0 mL Dichlormethan gelöst. Es wurden 3.38 g (32.99 mmol) Ma.ngan(IV)oxid zugegeben und 48 h bei RT gerührt. Es wurden nochmals 2.20 g (2,1.47 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Ceiite filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethan gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand 2.80 g (l-Benzyl-4-(2,5- difluo henyl)-lH- yrrol-2-earbaldehyd) wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode. 7): R, - 1.48 min; MS (ESIpos): m/z - 298 [M+H]+.
28.21 g (94.88 mmol) 1 -Benzyi-4-(2,5-difluorpheny!)- lH-pyrroi-2-carbaidehyd wurden zusammen mit 23.00 g ( 1 89.77 mmol) (R)-2-Metliylpropan-2-sulfinamid in 403.0 L absol. THF vorgelegt und mit 67.42 g (237.23 mmol) Titan(IV)isopropyiat versetzt, und über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 500.0 mL ges. NaCl-Lösung und 1000.0 mL Ethylacetat zugegeben und 1 bei RT gerührt. Es wurde über Kieselgur filtriert und das Filtrat zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die org. Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isoiera gereinigt (Kieselgel, Säule 1500+340 g SNAP, Fiuss 200 niL/min, Ethylacetat/Cyclohexan 1 : 10).
LC-MS (Methode 7): Rt - 1.63 min; MS (ESIpos): m/z - 401 [M+Hf,
25.00 g (62.42 mmol) ( )- - {(E/Z)- l-Be zyl-4-(2,5-diί^uo llenyl)-lH-pyπ l-2-yl]methyle }-2- methylpropan-2-su!finamid wurden in absol. THF unter Argon vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurden 12.00 g (187.27 mmol) tert.-Butyllithium (1.7 M Lösung in Pentan) bei -78 °C zugegeben und 3 h bei dieser Temperatur gerührt. Dann wurden bei -78 °C 71.4 mL Methanol und 214.3 mL ges. Ammoniumchlorid-Lösung nacheinander zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen und 1 h bei RT gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (R)-N-{(lR)-l-[l-Benzyt-4-(2,5- difluo henyl)-lH-p πΌl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2-methylpropan-2-sulflnamid wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 6): R, - 2.97 min; MS (ESIpos): m/z = 459 [M+Hf. 28.00 g (61.05 mmol) (Κ)-Ν-{(1 )-1-[1-ΒοηζγΙ-4-(2,5-<ϋΑυο 1ιοηγί)-1Η-ργτΓθ1-2-γ1]-2,2- dimethy]piOpyl}-2-methy]propan-2-sulfmamid wurden in 186.7 mL 1,4-Dioxan vorgelegt und dann mit 45.8 L HCl in 1 ,4-Dioxan -Lösung (4.0 M) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2, h bei RT gerührt und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Kinetix 100x30; Fluss: 60 L/min, MeCN/Wasser). Das Acetonitril wurde im Vakuum verdampft und der wässrige Rückstand wurde mit Dichlormethan versetzt. Die organische Phase wurde mit Natriunihydrogencarbonat-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 16.2 g (75 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 6): Rt - 2.10 min; MS (ESIpos): m/z - 338 [M-NH2f, 709 [2M+H]*.
I I - WIK (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 3 H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 3 H).
Intermediat C53
(2S)-4-[{(iRH-[l-Benzyl-4-(2,5-difm^^
dimethylpropy!}(glycoloy!)amino]-2^
Figure imgf000223_0001
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2- { [(benzyloxy)carbonyl]aroino} -4-oxobutarioat in Analogie zu Intermediat C58 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C58 beschrieben acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. Das so erhaltene Intermediat wurde in Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck I h hydriert. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2: 1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9- ylmethylchlorocarboriat in Gegenwart von N, N-Diisopropylethylamin wurde im letzten Sehritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.37 min; MS (ESlpos): m/z - 734 (M-H)". InterjnedMtjC54
N-[(2S)-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2 dif luorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]~2- {[(9H-fluoren- - lrnethox carbon l amino butanoyl]-beta-alanin
Figure imgf000224_0001
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl- -[(2S)-2- {[(benzyloxy)carbonyl]ammo} -4- oxobutanoyi]-beta-alaninat in Analogie zu Intermediat C2 redulrtiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Arninogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C58 beschrieben acyliert. Das so erhaltene Intermediat wurde in Methanol geiöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Anschließend wurde mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanoi die Hydrolyse der Estergrappe durchgeführt. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2: 1 aufgenommen und mit 9H~Fiuoren~9- ylmethylchlorocarbonat in Gegenwart von , N-Diisopropylethylamin wurde im letzten Schritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt. Es wurden 48 mg der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.38 min; MS (ESlpos): m/z - 807 (M+H)+. Intgrmgdjat_C58
(2S)-4^{(lR) ^1-Benzyl-4-(2,5-d^
amino]-2 -( {[2-(trimethyisiiyl)ethoxy]carbonyl} amino)butansäure
Figure imgf000225_0001
Zunächst wurde Intermedia! C52 mit Benzyl-(2S)-2- {[(benzyloxy)carboiiyi]amino} -4-oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C27 beschrieben acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. Das so erhaliene Intermediat wurde in Ethanol gelöst mit Pailadium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert.
500 mg (0.886 mmol) von diesem vollständig entschützten Intermediat wurden in 60 ml Dioxan aufgenommen und mit 253 mg (0.975 mmol) l -({[2-(Trimethy]silyl)ethoxy]carbonyl}oxy) pyrrolidin-2,5-dion sowie 198 μΕ Triethylamin versetzt. Nach 24 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen im Vakuum und Trocknen im Hochvakuum wurden 312 mg (50% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.61 min; MS (ESIpos): m/z - 658 (M+H)+.
Alternativ wurde Intermediat C58 auf folgendem Weg hergestellt:
4.3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL. DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 8.99 g (24.5 mmol) von intermediat L57 gelöst in 175 mL DCM hinzugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit 300 mL DCM verdünnt und zweimal mit 1 00 ml, Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde anschließend mittels präparativer RP-HPLC (Säule: Chromatorex C18) gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. So wurden 4.6 g (61 % d. Th.) Methyl-(2S)-4-({(lR)- l -[l- benz l-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropy!} amino)-2-( { [2- (triniethylsilyl)ethoxyjcarbonyl}ammo)butanoat erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.97 mm; MS (ESIpos): m/z - 614 ·>! · 1 1 } .
2.06 g (3.36 mmol) von diesem Tntermediat wurden in 76 mL DCM vorgelegt und mit 0.81 L (7.17 mmol) 2-Chlor-2-oxoethylacetat in Gegenwart von 2.1 ml Triethylamin acyliert. Nach 20 h Rühren bei RT wurden weitere 0.36 mL 2-Chlor-2-oxoethylacetat und 0.94 ml Triethylamin zugegeben und der Ansatz weitere 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde mit 500 mL Ethylacetat verdünnt und nacheinander zweimal mit 300 mL 5%-iger Zitronensäure, zweimal mit 300 mL gesättigter NatriumhydrogencarbonaÜösimg und einmal mit 100 mL gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 2.17 g (79% d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.48 min; MS (ESIpos): m/z - 714 (M+H)+.
2.17 g (2.64 mmol) dieses Intermediats wurden in 54 mL THF und 27 mL Wasser gelöst und mit 26 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung versetzt. Der Ansatz wurde 30 min bei RT geröhrt und dann mit 1.4 mL TFA auf einen pH- Wert zwischen 3 und 4 eingestellt. Der Ansatz wurde im Vakuum aufkonzentriert. Nachdem THF weitgehend abdestilliert war wurde die wäßrige Lösung zweimal mit DCM extrahiert und anschließend im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC (Säule: Chromatorex C 3 8) gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand und aus Acetonitril/W asser lyophilisiert. So wurden 1.1 g (63% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m z - 656 (M-H)\
! i NM R (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.58 (m, 1 H), 0.74-0.92 (m, I I B), 1.40 (m, I i i ). 3.3 (m, 2H), 3.7 (m, 1H), 3.8-4.0 (rn, 2H), 4.15 (q, 2H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 5.61 (s, 1H), 6.94 (m, 2H), 7.13-7.38 (m, 7H), 7.48 (s, 1H), 7.60 (m, 1H), 12.35 (s, 1H). Intermediat C59
(2S)-4-( {(1 R)-l -[ 1 -Βεηζγ1-4-(2,5-άίί1υο 1ιεηνί)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } [{2S)-2- methoxypropanoy]]aniino)-2- {[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]a]Timo}butansäure
Figure imgf000227_0001
Zunächst wurde die sekundäre Aminogruppe von Benzyl-(2S)-4~( {(lR)-l -[l~benzyl-4~(2,5~ diÜuo henyl)~l H- yrrol~2~yί]~2,2~dim
butanoat mit (2S)-2-Metboxypropanoylcblorid (Zwischenstufe aus intermediat C53) in Gegenwart von Triethylamin wie in Intermediat C53 beschrieben acyiiert. Das erhaltene Intermediat wurde in Ethanol aufgenommen, mit Palladium auf Kohle (10 ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/W asser 2: 1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9-ylmethylchlorocarbonat in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin wurde im letzten Schritt die Fmoe-Sehutzgruppe eingeführt.
LC-MS (Methode 1 ): , = 1.39 min; MS (ESTpos): m/z - 764 (M-H) .
Intermediat C60
(2S)-4-({(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-dii]uo 3henyl)-m-pyiTol-2-yl]-2,2-dime^
metboxypropanoy]]aniino)-2- {[(9H-fluoren-9-ylmetboxy)carbonyl]a]Tiirio}butarisäure
Figure imgf000228_0001
Die Synthese erfolgte in Analogie zu Intennediat C53.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.41 min; MS (ESIpos): m/z - 750 (M+H)+.
Intermediat C61 »[(2S)-4-[{(!R)- i -[l»Benzy^^
dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-({[2-(fr^
alanin
Figure imgf000228_0002
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 60 mg (0.091 mmol) Tntermediat C58 mit ß- Alaninmethylester und anschließender Esterspaltung mit 2m Lithiumhydroxidlösung hergestellt. Es wurden 67mg (61% d.Th.) der Titel erbindung über 2 Stufen erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.29 min; MS (ESIpos): m/z - 729 (M+H)+.
Int£EmediaLC62
N-[(2S)-4-[ { (1 R)- 1 -[ 1 ~Benzyl~4~(2 diÜiK^henyl)~ 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]-2-( {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl } amino)butanoyl]-D- alanin
Figure imgf000229_0001
Die Tiielverbindung wurde in Analogie zu Intemiediat C61 aus Intermediat CS8 und Methyl-D- alaninat hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.32 min; MS (ESIpos): m/z - 729 (M+H)+. Intgnnediat_C64
Trifluoressigsäure --2-(trimethy3sily3)ethyl- {(2S)- 3 -[(2-ami:noethyl)amino]-4~[ {(iR)-l^
(2,5^ίΓ^θ ηεηγ1) Η νΓτο1-2-ν1]-2,2^ώ6ΐ1^
yl}carbamat (1 : 1)
Figure imgf000230_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intemiediat C58 in Analogie zu Intemiediat C63 hergestellt.
HPLC (Methode 1 1): R, - 2.4 min;
LC-MS (Methode 1): R* - 1.01 min; MS (ESIpos): m z - 700 (M+H)+.
Intermedi t C^S
(8S)-8- {2-[{(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]ethyl } -2,2-dimethyl-6, 11 -dioxo-5-oxa-7, 10-diaza-2-silateteadecan-l 4-säure
Figure imgf000231_0001
215 mg (0.59 mmol) von Interniediat L66 wurden in 25 mL Dichiormethan vorgelegt und mit 377 mg (0.89 mmol) Dess-Martin Periodinan und 144 μΐ, (1 .78 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte 30 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 300 ml Dichiormethan verdünnt und die organische Phase je zweimal mit 10%iger
Figure imgf000231_0002
30 iger Citronensäure-Lösung und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Man erhielt 305 mg des Aldehyds, der ohne weitere Reinigung umgesetzt wurde.
175 mg (0.49 mmol) von Interniediat C52 wurden in 50 ml Dichiormethan gelöst und mit 147mg (0.69 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie 32.5 μΐ, Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 214 mg (0.593 mmol) vom oben beschriebenen Aldehyd hinzugegeben und der Ansatz über Nachi bei RT gerührt. Dabei ist anstelle erwarteten Produktes 2-(Trimelhylsilyl)ethyl- [(2S)-4-({(lR)-l-[l-ben2yl-4-(2,5-&^
(2,5-dioxopyrroHditi- 1 -yl)butan-2-yl]carbamat entstanden. Da auch dieses Imid sich weiter zur Titelverbindung umsetzen lassen sollte, wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Imid-enthaltenden Fraktionen wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. So wurden 195 mg (58%) des oben benannten Imids erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 3.32 min; MS (ESIpos): m z - 667 (M+H)+.
65 mg (97.5 μηιοΐ) dieses Imids wurden in 15 ml Dichiormethan aufgenommen und mit 367 μί, (3.4 mmol) Acetoxyaeetylehlorid sowie 595 μ,Ε NN-Diisopropylethylamin versetzt. Nach 30 min Rühren bei RT wurde der Ansatz ohne Erwärmung im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und nach Abdampfen der Lösungsmittel und Trocknung im Hochvakuum verblieben 28 mg (37% d. Th.) (8SH i - {(lR) -{L-Benzyl-4^
dioxopyrrolidm -yl)me1hyl]-2,2-dimetiiyl-6,l2-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan- 13-yl- aceiat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.44 min; MS (ESlpos): m/z = 767 (M+H)+.
28 mg (37 μηιοί) von diesem Intermedia! wurden in 3 ml, Methanol gelöst und mit 548 μΐ, einer 2M Lithiumhydroxidiösung versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit Trifluoressigsäure auf pH 4 gebracht und dann eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Abdampfen des Lösungsmittels und Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum wurden 26 mg (96% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.33 min; MS (ESTpos): m/z - 743 (M+H)
Intermediat C66
Figure imgf000232_0001
dimethylpropyl} lycoioyl)amino]- 1 - { [2-(glycylamino)ethyl]amino} - 1 -oxobutan-2-yljcarbamat
Figure imgf000232_0002
Zuächst "wurde aus N-[(benzyloxy)carbonyl]glycin und tert-Buty] (2-aminoethyl)carbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie (HATU-Kupplurtg und Boc-Spaltung) Trifluoressigsäure - benzyl- {2-[(2-aniinoeihyl)amii!o]-2-oxoeihyl}carbamat (1 : 1) hergestellt.
13 mg (0.036 mmol) von diesem Intermedia! sowie 25 mg (0.033 mmol) von Intermedia! C58 wurden in 3 ml, DMF aufgenommen und mit 19 mg (0.05 mmol) HATU und 17 \x\ N,N- Diisoprop lethylamm versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 17.8 mg (60% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt - 1.36 min; MS (ESIpos): m/z - 891 (M+H)+.
17 nig (0.019 mmol) dieser Zwischenstufe wurden in 10 ml Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 2 h hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, die Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 9 mg (62% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.03 min; MS (ESIpos): m/z - 757 (M+Hf.
IntennedMtjC67
9H-Fluoren-9-ylmethyH3
dimethy Ipropyl amino)propyl] carbamat
Figure imgf000233_0001
605.3 mg (1.71 mmol) (l.R)-l -[ l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan- 1 -amin (Intermediat C52) wurden in 10.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 506.7 mg (2.39 mmol) Natriumtriaeetoxyborhydrid und 1 3 7.9 mg (1.96 mmol) Essigsäure versetzt und 5 min bei RT gerührt. Es wurden 580.0 mg (1.96 mmol) 9H-Fluoren-9-ylmethyl-(3- oxopropyl)carbamat (Intermediat L70) gelöst in 10.0 mL Dichlormethan zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase je zweimal mit ges, Natriu earbonat-Lösung und ges. NaCl- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesium ui tat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Etiiylacetat 3: 1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 514.7 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R, - 1.10 min; MS (ESIpos): m/z = 634 (M+H)+.
Intermediat C69
11-{(1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difiuo henyl)- 1 H-pyrroi-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7 1 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure
Figure imgf000234_0001
117.0 mg (0.19 mmol) (2-(Trimemylsilyl)ethyl- {3-[ {(1R)-1 -[l-benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy3propyl}(chloracetyi)amino]propyl}carbamat (Intermediat C70) und 21.6 mg (0.2,0 mmol) 3-Sulfanylpropansäure wurden in 3.0 ml, Methanol vorgelegt und mit 89.5 mg (0.65 mmol) Kaliumcarbonat versetzt und 4 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt. Man erhieli 106.1 mg (73 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.42 min; MS (ESIneg): m/z - 700 (M~H)\ Intermediat C70
(2-(Trimethylsilyl)ethyl- {3-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (chloracetyl)arnino]propyl) carbamat
Figure imgf000235_0001
908.1 mg (1.63 mmol) 2-(Tiräe lyl)e l-[3-( {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-diiluorplienyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-cümethylpropyl}ammo)propyl]carbamat (siehe Synthese intermediat Cl l) und 545.6 mg (5.39 mmol) Triethylamin wurden in 10.0 mL Dichlormethan vorgelegt und auf 0 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurden 590.5 mg (5.23 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je dreimal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 673.8 mg (65 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.53 min; MS (ESIneg): m/z = 676 (M+HCOCQ". Ilttgnnediat_C71
Figure imgf000235_0002
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yi)-L- cystein-trifluoressigsäure (1: 1)
Figure imgf000236_0001
536.6 mg (4.43 mmol) L-Cystein wurden in 2.5 mL Wasser zusammen mit 531.5 mg (6.33 mmol) atriumhydrogenearbonat suspendiert. Dazu wurden 400.0 mg (0.63 mmol) (2- (Trimethylsilyl)ethyl- {3-[ {(3 R)-l -[ ! -benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-].H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)an!ino]propyl}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 25.0 mL iso- Propanol und 1.16 g (7.59 mmol) l,8-Diazabieyelo(5.4.0)undee-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 .5 h bei 50 °C geröhrt Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiunisuifat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 449.5 mg (86 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.20 min; MS (ESIpos): m/z - 717 (M+H)+. Intermediat C72
(98)-9-{[{^Η-[1-Ββηζν1-4-(2,5^ιΓίυο
arnino]methyl} -2,2-dimethy 1-6,1 l-dioxo-5-oxa-7,10-diaza-2-silatetradecan-14-säure
Figure imgf000237_0001
90 mg (0.212 mmol) von Intermediat L72 wanden in 6 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 86 ,uL (1.06 mmol) Pyridin sowie 135 mg (0.318 mmol) Dess-Martin Periodinan versetzt. Man rührte 30 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 30 ml Dichlormethan verdünnt und die organische Phase zweimal mit 10%iger Na2S203-Lösung und einmal mit 5%iger Citronensäure-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Der so erhaltene Aldehyd wurde ohne weitere Reinigung umgesetzt.
63 mg (0.177 mmol) von Intermediat C52 wurden in 15 ml Dichlormethan gelöst und mit 52.4 mg (0.2,47 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie 20.2, μΐ, Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 89.6 mg (0.212 mmol) vom oben beschriebenen Aldehyd hinzugegeben und der Ansatz 20 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Acetonitril/W asser lyophilisiert. So wurden 71 mg (53% d. Th. Über 2 Stufen) Benzyl-(9R)-9-[( {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl) amino)methyl]-2,2-dimethyl-6,l l-dioxo-5- oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan- 14-oat erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.21 min; MS (ESlpos): m/z - 761 (M+H .
70 mg (92 μπιοΐ) dieses Intermediats wurden in 15 ml Dichlormethan aufgenommen, auf 10°C abgekühlt und mit 54 L Triethylamin sowie mit 2,5.5 uL (0.23 mmol) Acetoxyacetylchlorid versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurden nochmals gleiche Mengen an Säurechlorid und Triethylamin zugegeben und nach einer weiteren Stunde Rühren bei RT erneut. Der Ansatz wurde anschließend für weitere 30 min bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und nach Abdampfen der Lösungsmittei und Lyophilisation des Rückstandes aus Acetonitril/W asser verblieben 46,5 mg (59% d. Th,) des acylierten Intermediats.
LC-MS (Methode 1): R* = 1.53 min; MS (ESIpos): m/z = 861 (M+H)+.
46 mg (53 μηιοΐ) von diesem Intermediai wurden in 5 mL Methanoi gelöst und mit 2,7 mL einer 2M Lithiumhydroxidlösung versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit Essigsäure auf pH 3-4 gebracht und dann mit 15 ml Wasser verdünnt. Die wäßrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde aus Acetronitril/Wasser lyophilisiert und nach Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum wurden 37 mg (90% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z - 729 (M+H)+, Intermediat C73
S-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl - 6,12-dioxo-5- xa-7,l i -diaza-2-silairidecan-13-yl)-N-[3-(trimethykilyl)propanoyl]-L-cystein
Figure imgf000238_0001
619 mg (0.86 mmol) S-( l l- {(l.R)-l -[ l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein- trifiuoressigsäure (1: 1) (Intermediat C71 ) wurden in 8.8 ml Dichlormethan vorgelegt und mit 87 mg (0.86 mmol) Triethyiamin und 224 mg (0,86 mmol) N-[2-(Trimethylsilyl)-ethoxycarbor!yioxy]- pyrroiidin-2,5-dion versetzt. Nach lh wurden 45 mg (0.17 mmol) N-[2-(Trimethylsilyl)- ethoxycarbonyloxy]-pyrrolidin-2,5-dion zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und dann wurde die organische Phase zweimal mit Wasser und einer gesättigten Natriumhydrogenkarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 602 mg (71%, Reinheit 87%) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.58 min; MS (ESIpos): m/z - 861 (M+H . Intermediat C74
Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-3-ammo-N-[(2S)-4-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4- difluo he yl)-l H- yπ·ol-2-yί]-2,2-dimethyl ro yί}(glycoloyl)ami o]-2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyi]-D-alaDinat ( 1 : 1 )
Figure imgf000239_0001
75mg (0.1 14 mmol) von Intermediat C58 wurden in 12.5 ml DMF aufgenommen und mit 78 mg (0.171 mmol) von Intermediat L75 in Gegenwart von 65 mg (0.11 mmol) HA TU und 79 xL N,N- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 20 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 wurden 63 mg (64% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): R: 1 . 16 min; MS (EIpos): m/z - 844 [M+Hf. Intermediat C75
Methy1-(2S)-4 (acetoxyacetyl){(lRH ^
dimethylpropyl} amino]-2~({[
Figure imgf000240_0001
4,3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (1 1.85 mmol) Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsily1)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat (hergestellt aus (3S)-3-Amino-4-methoxy-4-oxobutansäure nach klassischen Methoden) gelöst in 175 mL DCM zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen und Trocknen des Rückstandes im Hochyakuum erhieit man 4.6 g (61 % d. Th.) des Intermediats.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.97 min; MS (ESIpos): m/z = 614.32 (M+H)+.
200 mg (0.33 mmol) dieses Intermediats wurden in 10 mL DCM gelöst und dann mit 105 μ!> Triethylamin sowie mit 77 μί. (0.717 mmol) Aceioxyacetylchlorid versetzt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Es wurden 213 mg (75%) der Titel Verbindung als beiger Schaum erhalten. LC-MS (Methode 1): R, - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+.
Figure imgf000241_0001
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N- {(1 S)-3-[ {(1R)-1 -[ i -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amiiio]-l -carboxypiOpyl}-L-alaiiinaniid
Figure imgf000241_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C75 nach klassischen Methoden der Peptidehemie hergestellt (Spaltung der Teoe-Schutzgruppe mit Zinkchlorid, Acylierung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und Esterspaltung mit Lithiumhydroxid in THF/Wasser).
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.23 min; MS (ESIpos): m/z - 818 (M+H)4'. Intermediat C77
S-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyi - 6, 32-dioxo-5-oxa-7,l l -diaza-2-sila1xidecan-l3-yi)-N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein
4 ert-Butoxy-4-oxobutansäure (8,39 mg, 48.1 μιτιοΐ) wurde in 1.0 niL DMF vorgelegt, mit 7.37 mg (48.1 μηιοΐ) i -Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat, 15.5 mg ((48.1 μηϊοί) Benzotriazoi-I - yk xy)bisdimetliylammorneihylii!mfluoiOborat und 8.60 μ! (48.1 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylarnin versetzt und 10 Minuten bei RT gerührt. 40.0 mg (0.048 mmol) S-(11-{(1R)-
I -[ 1 -Benzyi~4-(2,5-difluorphenyl)- lH~pyiTol-2-yl]~2,2-dimethylpropyl} ~2,2-dimethyl~6,12-dioxo- 5-oxa-7,3 l -diaza-2-siiatridecan-13-yl)-L-eystein -trifluoressigsäure (3 : 1) (Intermediat C71) wurden in 1.0 ml, DMF vorgelegt, mit 25.4 μΐ (141.9 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylami-n versetzt, zum Ansatz gegeben und 4 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprostl 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 35.0 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): R* - 2.76 min; MS (ESlpos): m/z - 873 [M+H]+
Intermediat C78
I I - {(1R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6,12-dioxo-5-oxa-7 l l-diaza-2-silapentadecan-15-säure
Figure imgf000242_0001
197 mg (0.354 mmol) 2-(TrmieÜiyisiiyi)e i-[3-( {(lR) 1-ben-^l-4-(2,5-dmuorplienyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} amino)propyl]carbamat (siehe Synthese Intermediat O l) wurden in 5.0 mL Dichlormethan vorgelegt und auf 40°C erhitzt. Bei dieser Temperatur wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 220 μ] (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4-oxobutanoat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Dann wurden 240 μί (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4- oxobutanoat zugegeben und 1 hbei RT gerührt. Dann wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 2,20 μΐ (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4-oxobutanoat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je dreimal mit 5%iger HSCVLösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit ges. NaCi-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /W asser, 0.3 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 74.1 mg (31 % d. Th.) Methyl-i l- {(lR)-l-[l- benzyl-4-(2,5-difiuo^henyl)-lH^^
7,1 1 -diaza-2-silapen tadecan- 15-oat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.49 min; MS (ESIpos): m/z - 670 [M+H]+
78.3 mg (117 μχηοί) Methyl- 1 l - {(lR)- l-[l -benz l-4-(2,5-difluo hen l)-l H-pyΓrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silapentadecan- 15 -oat wurden in 4.0 mL THF vorgelegt, mit 800 μΐ Methanol, 160 μί Wasser und 230 μΐ (230 μηιοί) wässriger LiOH- Lösung (IM) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 64.8 mg (85 % d. Th.) der Titel Verbindung. LC-MS (Methode 12): Rt - 2.61 min; MS (ESIneg): m/z - 654 [M-H]"
Intermedia! C79
Triöuoressigsäure 2-(1ximethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(l 3 - {(1 )-1.-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12,1 7-trioxo-5-oxa- 34-thia-7, 11 -diaza-2- silaheptadecan- 37- l)-D-alaninat ( 1 : 1 )
Figure imgf000243_0001
57.4 mg (81.8 μηιοί) l l-{(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5-d!f3uo hen l)-ίH- τrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-djmeihyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (inlermediat C69) wurden in 5.7 rnL DMF vorgelegt, mit 74.0 mg (164 μταοϊ) Trifluoressigsäure 2- (time lsüyl)e i-3-
Figure imgf000244_0001
-D-alamnat (1 : 1) (Inlermediat L75), 43 μΐ (250 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 62.2 mg (1 64 μητοΐ) HATU versetzt und 1 h bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 52.4 mg (63 % d. Th.) der Verbindung 2- (Trimethy lsily l)e thy l-N-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl 1-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-3- {[(berizyloxy)carbonyl]arnino}-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.64 min; MS (ESIpos): m z - 1 22 [Mf
Unter Argon wurden 6.23 mg (27.7 μιηοΐ) Palladium(II)acetat: in 3.0 ml Dichloromethan vorgelegt, mit 12 μΕ (83 μηιοΐ) Triethylamin und 89 μΐ^ (550 μιηοΐ) Triethylsilan versetzt und 5 Minuten, gerührt. Dann wurden 56.7 mg (55.5 μηιοΐ) 2-(Trimethylsiiyi)ethyl-N-(l l-{(lR)-l-[l- berlzyl-4-(2,5-difluoφhenyi)- lH^yn-ot^-ylj^^-dimethyipropyt} -2,2-chmethyl-6, 12, 17-trioxo-5- oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-si!aheptadecan- 17-yl)-3- {[(benzyloxy)carbonyl]amino} -D-a!aninat in 3.0 ■nL Dichloromethan zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wurde bis fast zur Trockene eingeengt, mit Acetonitril/Wasser versetzt, filtriert und mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; ίθμ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 37.4 mg (67 %■ d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): ): Rt - 2.15 min; MS (ESIpos): m/z - 888 [M+Hf Intermediat C80
S-(l l-{(lR)-l-[l-Berr2yl-4-(2,5-dffl^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-siiatridecan-13-yl)-N-[l 5-(glycylamino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadecan- 1 -oy l]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000245_0001
Unter Argon, wurden 43.4 mg (95.1 μηιοί) l-({N-[(Benzylox )carbonyl]glycyl}amino)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan- 15-säure (Intennediat L90) in 2.5 mi DMF vorgelegt, mit 14.6 mg (95.1 μιτιοΐ) l -Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat, 30.5 mg (95.3 μιτιοΐ) (Benzotriazol-1 - yloxy)bisdimethylaminomethyliumfluoroborat und 16.5 μΐ (95.1 μηωί) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt und 10 min gerührt. 79.0 mg (95.1 μηιοΐ) S-(l l - {(lR)-l -[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimetliylpropyl} -2,2-dimetlwl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13- yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1: 1) (Intennediat C71) wurden in 2.5 ml DMF gelöst mit 49.5μ1 (285.3 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt und zum Ansatz gegeben. Die Reactionmischung wurde 2 h bei RT gerührt und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeC AV asser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 44.2 mg (40 % d. Th.) der Verbindung S-(l l-{(lR)-l-[l-Berizyl-4-(2,5-d!fluo^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-siiatridecan- 13-yi)-N-[l 5-( {N- [(benzyloxy)carbonyl]glycyl} amino)-4,7, 10, 13-tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.57 min; MS (ESIpos): m/z - 1 156 [M+H]+
60.2 mg (52.3 μηιοΐ) S-( i l- {(].R)-l -[ l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[15-({N-
[(benzyloxy)carbonyl]glycyl}amino)-4,7, 10,13-tetraoxapentadecan- l-oyl]-L-cystein wurden in 3.0 mL Ethanol suspendiert und mit 6.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 1 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Zweimal wurden 6.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 1 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Reaktionsmischung im Vakuum vom Lösemittel befreit und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 29.4 mg (50 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt - 3.77 min; MS (ESIpos): m/z - 1021 [M+Hf
Intermediat C81
(R)- 1 -[ 1 -Benzy l-4- 2,5-difίuo 1 -cyelohexy Imethanamin
Figure imgf000246_0001
Eine Lösung von 3.12 ml (6.24 mmol) Dimethylzink in Toluol (2.0 M) unter Argon bei -78 °C wurde mit 18.7 ml (37.45 mmol) Cyclohexylmagnesiumchlorid in Diethylether (2M) versetzt und die Mischung wurde 30 Minuten bei -78 °C gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 5.0 g (12.48 mmol) (R)- - { (E/Z)- [ 1 ~Benzyl-4~(2,5~difiuorphenyi)~ 1 H-p rrol-2-yi]methylen} -2- methylpropan-2-su!fmamid in THF bei -78 °C zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei dieser Temperatur gerührt und dann 4 h bei RT. Dann wurde bei -78 ° C gesättigte Ammoniumchlorid-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (KieselgeL Ethylacetaf'Cyclohexan 25:75). Man erhielt 1.59 g (26% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.76 min; MS (ESIneg): m/z - 483 [M-H]"
264.0 mg (0.54 mmol) dieser Zwischenstufe wurden in 0.5 niL 1,4-Dioxan unter Argon vorgelegt und dann mit 1.36 mL HCl in 1 ,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan versetzt und mit einer was. IM Natriumhydroxid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Methanol/Dichlomethan 98:2). Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Dichlormetban gelöst und mit einer Natriumhydrogenearbonat-Lösung gewaschen und über Nafriurnsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 148 mg (72% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 13): Rt - 2.07 min; MS (ESIpos): m/z - 364 [M~NH2]+ IntermedfoitjCjK
2-(Trimethylsilyl)ethyl~(3- { [(R)-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2- yl](cyelohexy])methyl]amino}propyl)carbamat
Figure imgf000247_0001
Eine Lösung von 503.0 mg (1.32 mmol) i -[ l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrroi-2-yl]-i - cyclohexylmethanamin (Tntermediat C81) in 1 .4 ml Dichlormethan unter Argon wurde mit 392.2 mg (1.85 mmol) Natriumtoiacetoxyborhydrid und 91.29 mg (1 .52 mmol) Essigsaure versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 574.6 (2.38 mmol) 2-(Trimetiiylsilyl)eihyl-(3-oxopropyl)carbamat in Dichlormethan hinzugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Zugabe von 143 mg (0.66 mmol) 2- (Trrmethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat wurde die Mischung noch 2 h weiter gerührt. Das Reaktionsnigeniisch wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde je zweimal mit ges. Naüiumcarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 488 g (63 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): R, - 1.89 min; MS (ESIpos): m/z - 582 (M+HV Intermediat C83
2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3- { [(R)-[ 1 -0βηζγ1-4-(2,5-<3ΐί1αο 1ιβηγί)- lH-p rrol-2- yl](cyclohexyl)meüiyl](chloracetyl)arnino}propyl)carbamat
Figure imgf000248_0001
Zur eine Lösung von 487.9 mg (0.84 mmol) 2-(Trimethylsilyl)etliyl-(3- { [(R)-[ 1 -benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrroi-2 -yl](cyclohexyl)methyl]amino}propyl)carbamat (Intermediat C82) in 8.40 ml Dichloraiethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 280.0 mg (2.77 mmol) Triethylamin und 397.8 mg (3.52 mmol) C oracetylchlorid zugegeben und das ReaMonsgemisch wurde 6 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniurnchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 470 mg (85 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.88 min; MS (ESIpos): m/z - 680 (M+Na)4.
Intermediat C84
S- { 1 l-[(R)-[ l -Bemzy]-4-(2,5-difluorphemyl)-lH-pyiTo]-2-yl](cyclohexyl)methy]]-2,2-dimethyl- 6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-siiatridecan-l 3-yl} -L-cystein
Figure imgf000249_0001
322.1 mg (2.66 mmol) L-Cystem wurden in 0.19 mL Wasser zusammen mit 319.0 mg (3.80 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 250.0 mg (0.38 mmol) 2- (Trime1hylsilyI)e 3-(3- {^^^^
yl](eyclohexyl):inetliyl](chloracetyi)amino}propyl)ca.rbamat (Intermediat C83) gelöst in 1.90 mL Lvo-Propanol und 693.8 mg (4.56 mmol) L8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3,5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 276 mg (97 % d. Th.) der 'Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.34 min; MS (ESIpos): m/z = 744 (M+H)\
Inteijgediat_C85
8-{11-[(Κ)-[1-Ββτ^1-4-(2,5^ϊΠΗθφη^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yi} -N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)hexanoyl]-L-cy stein
Figure imgf000250_0001
Zu einer Mischung von 100 mg (0.13 mmol) S- { l l-[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrro!-2~yl](cyciohexyl)me
L-cystein (1 : 1) (Intermediat C84) und 41.5 mg ( 0.13 mmol) l -{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]- 6-oxohexyl} -lH-pyrrol-2,5-dion in 4.0 ml DMF wurden 34.8 mg ( 0.27 mmol) N,N- diisopropylethylamin hinzugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitimg mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 88 mg (70% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.71 min; MS (ESIpos): m/z - 936 (M+H)+.
Intermediat C86 l H( )-[l-Benzyl-4-(2 difluo ίlenylH
dioxo-5-oxa- 14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure
Figure imgf000251_0001
Eine Mischung von 220.0 mg (0.33 mmol) 2-(Tritnethylsilyl)ethyi-(3- {[(R)-[l -benzyl-4-(2,5- difluo hen l) H Iτol-2-yl](cyclohexyl)meti]yl](chlor£ιcetyl)amino}propyl)caΓbamat
(Intermedia! C83) und 39.02 mg (0.37 mmol) 3-Sulfanylpropansättre in 7.45 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 161.65 mg (1.17 mmol) aliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Etirylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriurnmsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhieli 201 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.72 min; MS (ESIneg): m/z - 726 (M-HY. Inteijgediat_C87
2-(Trimethylsilyl)ethyl- { 13-[(R)-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrroi-2- yl](cyclohexyl)methyl]- 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)-2,7 , 12-trioxo-l 0-thia-3,6, 13- triazariexadecan-16-yl} carbarnat
Figure imgf000252_0001
Zu einer Lösung von 300 mg (0.14 mmol) l l-[(R)-[ l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-].H-pyiTo]-2- yl](cyclohexyl)methyl]-2»2-d!metiiyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,11 -diaza-2-silaheptadecan- 17- säure (Intermedia! C86) in 1.37 ml DMF wurden 54.18 mg (0.28 mmol) N-(2-Aminoethyl)-2- (2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l -yl)acetamid (Intemiediat LI), 71.01 mg (0.50 mmol) N,N- diisopropylethylamin, 104.46 mg (0.27 mmol) HATU und 0.23 ml (0.14 mmol) l -Hydoxy-7- Azabenzotriazole 0.5 M in DMF hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei RT gerührt. Die Mischung wurde ohne weitere Aufarbeitung mittels wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 41 mg (33 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.61 min; MS (ESlpos): m/z - 907 (M+H)+.
Intermediat C88 iert-Butyl-3-[({(lR)-l -[l -benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- iH-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethylpropyi}amino)methyi]pyCT (1 : 1)
Mischung aus Stereoisomeren
Figure imgf000253_0001
Eine Lösung von 2,04 g (5,75 mmol) (lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyr [)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimeth ipropan- 1 -atrdii (Intermediat C52) in 51 ml Dichlormethan wurde mit 1.71 g (8.05 mmol) Natriurnüiacetoxyborhydrid und 0,40 g (6.61 mmol) Essigsaure versetzt und die Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 1.32 g (6.61 mmol) terl- Butyl-3-ibrmylpyrroridin-l -carboxylat in 20 ml Dichlormethan hinzugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.86 g (50% d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.99 min; MS (ESIpos): m/z - 538 (M+H-CFsCChH .
Intermedia* C89
?e^Butyl-3- {[ {(lR)-i-[i-benzyl-4-^
dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]methyl} Pyrrolidin- 1 -carboxyiat
Figure imgf000254_0001
Eine Lösung von 2.89 g (4.19 mmol, 80 Reinheit) von tert-Butyl-3-[({(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-
Figure imgf000254_0002
(Intermediat C88) in 42 rni Dichiorrnethan mit Molsieb 4 Ä wurde mit 1.36 g (13.42 mmol) Triethylamin und 2.13 g (18.87 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT 5 h gerührt. Die Mischung wurde einroiieri und der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 449 mg (17 % d. Tri.) von Isomere 1 und 442 mg (17 % d. Th) von Isomere 2 der Titel verbindung.
Isomer 1 LC-MS (Methode 1): R, - 2.74 min; MS (ESIpos): nv'z - 614 (M+H)+.
Isomer 2 LC-MS (Methode 1): R, - 2.78 min; MS (ESIpos): m/z - 614 (M+H)+. Intermediat C9Ö
S-[2-({(lR)-i-[i-Benzyi-4-(2,5-difli^ {[l-(tert- butoxycai onyl)p nolidin-3-yl]methyl} ammo)-2-oxoe1hyl]-L-cystem (Isomer 1)
Figure imgf000255_0001
357.3 mg (0.58 mmol) L-Cystein wurden in 2.3 mL Wasser zusammen mit 488.7 mg (4.07 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 357.0 mg (0.58 mmol tert-Bulyl-3- {[ {(IR)-l - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethyipropyl} (c oracetyl)amino]methyl}pyrrolidin- 1 -carboxylat (Isomer 1)
(Iniermediat C89, Isomer 1 ) in 23.0 L «o-Propanol gelöst und 1.06 g (6.98 mmol) 1,8- Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Etlrylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Nalriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 255.0 mg (62 % d. Tb..) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 1): R, - 1.09 min; MS (ESIpos): m/z - 699 (M+H)+. Intermediat C91
S 2-({(]RH- i-Beiizyl-4-(2^d^^
butoxycai oi!yl)pyrroi!din-3-yl]methyl}amiDo)-2-oxoethyl]-L-cystein (isomer 2)
Figure imgf000256_0001
453.5 mg (3.74 mmol) L-Cystein wurden in 2.1 mL Wasser zusammen mit 449.2 mg (5.35 mmol) atriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 3287.4 mg (0.54) mmol tert-Butyl-3-{[{(lR)- l-[l-benz}4-4-(2,5-difiuorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } (chloracetyl)amino]methyl}pyrrolidin- 1 -carboxyiat (Intermediat C89, Isomer 2) in 2,1.1 mL «o-Propanol gelöst und 0.98 g (6.42 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Losung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 221.0 mg (59 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.12 min; MS (ESIpos): m/z - 699 (M+H)+. Intermediat C92
S-[2-({(lR)-i-[i-BenzyI-4-(2 difli^^ {[l-(tert- butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]memyl} ami^^
pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-cystein (isomer 1)
Eine Mischung v
Figure imgf000257_0001
2-yl]-2,2-dimethylpropyl) { i-(teri-butoxycarbonyl)pyn iidin-3-yl]meihyi}amino)-2-oxoethyl]-L- cysiein (Intermedial C90) und 22.06 mg (0.07 mmol) l - {6-[(2,5-Dioxopyirolidin-l-yl)oxy]-6- oxohexyl) -lH-pyrrol-2,5-dion in 3.3 ml DMF wurde mit 18.49 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei RT 45 Minuten gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels mittels präparative HPLC geremigt. Man erhielt 65 mg (100 % d. Th, 71 % Reinheit) der Titeiverbindung.
LC-MS (Methode 1): R: 1.31 min; MS (ESIpos): m/z - 892 ·>! · I i ) .
Intermediat C93
S-[2 {(lR)-l-[l-Ber^l-4^2,5-difl^ {[l-(tert- butoxycarbonyl)pyrrolidm-3-yl]memyl} amino^
pyrrol- l-yl)hexanoyl]-L-cystein (Isomer 2)
Figure imgf000258_0001
Eine Mischung von 50,0 mg (0.07 mmol) S-[2-( {(1 )-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1H- pyrroi-2-yl]-2,2-dimethylpr pyl} {[ i -(teTt-butoxycarbony^pyn-oKdin-S-ylJmethylJamii!o)^- oxoethyl]-L-cystem (Intermediat C91 ) und 22.06 mg (0.07 mmol) l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-I - yl)oxy]-6-oxohexyl} -lH-pyrrol-2,5-dioii in 3.0 ml DMF wurde mit 18.49 mg (0,14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei RT 90 Minuten gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 63 mg (98 % d. Th, 73 % Reinheitjder Titelverbindung.
LC-MS (Methode l ): Rt = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 892 (M+H)+. Intermediat C94
S-[2-({(lR)- 1 -[ 1 -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynOl-2-yl]-2,2-dimethylpiOpyl} {[(l-(tert- butox "carbonyl)pyiTolidin-3 - yljrnethyi } amino)-2 -oxoethyl]-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- i-yl)acetyl]-L-cystein (Isomer 1)
Figure imgf000259_0001
Eine Mischung von 50.0 mg (0.07 mmol) S-[2-({(l )-l-[l-BeDzyl-4-(2,5-difluorplieDyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl } { [(3R)- 1 - (tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl } amino)-2 - oxoethyl]-L-cystein (Intermediat C90) und 18.0 mg (0.07 mmol) 1- {2-[(2,5-Dioxopyrrolidm-l- yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in 3.3 ml DMF wurde mit 18.5 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropyiethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit ges. NRtCl-Lösung und rnii ges. NaCl-Losung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemitiei im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 57 mg (81 % d. Th, 85 % Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.96 min; MS (ESIpos): m/z - 836 (M+H) . Intermediat C95
3- {[2-( {(1RH 1 -Benzyl»4-(2 diflu^^^
butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]rneihyl}a^ (Isomer 1)
Figure imgf000260_0001
Eine Mischung von 384.0 mg (0.62 mmol) tm-Butyl-3-{[ {(lR) ^1-benzyt-4-(2,5-&^ lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimeihylpropyl}(ehloracetyl)amino]meÜiyl}pyrror
(Iniermediat C89, isomer 1) und 73.0 mg (0.69 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 14 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 302.5 mg (2.19 mmol) Kaliu carbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt Die Reaktionsmisehung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 358,0 mg (84 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.33 min; MS (ESIpos): m/z - 684 (M+H .
Intermedia! C96
3- {[2-({(lR) ^1-Berizyl-4-(2,5-difiu^ {[l-(tert- butoxycarbonyi)pyirolidm-3-yi]methyl} am (Isomer 2)
Figure imgf000261_0001
Eine Mischung von 287.0 mg (0.45 mmol) teri-Butyl~3- {[ {(lR)-l-[l-benzyi-4~^
lH-pyiTol-2-y1]-2,2-dimeihylpropy1}(ehloracetyi)amino]meÜiyl}pyrro^
(Intermediat C89, Isomer 2) und 54.6 mg (0.51 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 14 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 226.0 mg ( 1 .64 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt Die Reaktionsmisehung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsuifat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 318.7 mg (88 % d. Th., 88 % Reinheit) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.36 min; MS (ESIpos): m/z - 684 (M+H)+.
Intermediat C97 tert-Butyl-3-[2- {(lR)-1 1-benz l-4-(2,5-difluo henyl)-lH-p πΌl-2-yl]-2,2-dimethylpro yl} 4^
(2,5~dioxo-2,5-dihydro~lH-pyr^^^
1-carboxylat (Isomer 2)
Figure imgf000262_0001
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3-{[2-({(1 )-1-[1-ΒοηζγΙ-4-(2,5-<ϋΑυο 1ιοηγί)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy]propyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyrroliditi-3-yl]methyl}amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Intermediat C96) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.37 mg (0.1 1 mmol) Ν,Ν-diisopr lethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU Innzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 22.75 mg (0.07 mmol) N 2-Aminoe l)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^ rrol -yl)acetamid -ethan (1: 1) Trifluoressigsäure (Intermediat Li) in 1.4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) N,N- diisopropylethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde ü.N bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 26 mg (84 % d. Th.) der Titelverbindung.3 (M+H)+.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.39 min; MS (ESTpos): m/z - 86
Intermediat C98
Figure imgf000262_0002
(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-3,8, 13 -trioxo-5 -thia-2,9, 12-triazaoetadee- 1 -yl jpyrrolidin- 1 - carboxylat (isomer 2)
Figure imgf000263_0001
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3- {[2-({(1 )-1-[1-Βειιζγ1-4-(2,5-ί1ιΑαο 1ιε.ηνί)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy]propyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyrroliditi-3-yl]methyl}amino)-2- oxoethyl]sul anyl}propansäure (Intermediat C96) in 2.81 ml DMF unter Argon würden 14.17 mg (0.1 1 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HAITI hinzugegeben. Das Reaktionsgemiseh wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 37.30 mg (0.07 mmol) N-(2-Aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-diiiydro-lH-pyiTol- 1 -yl)hexanamid -ethan (1:1) Trifluoressigsäure in 1.4 ml DMF und 5 rng (0.04 mmol) N.N-diisopropyiethyiamin hinzugegeben und das Gemisch winde ÜN bei RT gerührt Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 22 mg (63 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.54 min; MS (ESIpos): m/z = 919 (M+H)+.
Intermediat C99 lert-Butyl-3^2-{(lRH-[l-ben^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-3^
yl]pyrrolidin-i -earboxyiat (Isomer 2)
Figure imgf000264_0001
Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3- {[2-({(1 ) 1-Βειιζγ1-4-(2,5-ί1ιί^θ 1ιε.ηνί)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxyearbonyi)pyrrolidin-3-yi]metliyl} amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Tntermediat C96) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.1 1 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemiseh wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 35.05 mg (0.07 mmol) N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethy] } -6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)hexanamid -ethan (l : l)Trifluoressigsäure (Intermediat L82) in 1.4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) Ν,Ν-diisopropylethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde ÜN bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Die idorm ethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurdemittels präp. HPLC gereinigt Man erhielt 25 mg (60 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 4.52 min; MS (ESIpos): m/z - 1007 (M+H)+.
Figure imgf000264_0002
2 Trimethylsilyl)ethyl- {(2S)-4-^
2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino] - 1 - [(2- { [(2R)-2-(2,5-dioxo-2,5-diliydro- 1 H-pyrrol- l -yl)propanoyl]amino} ethyl)amino]- l-oxobutan-2-yl} carbamat
Figure imgf000265_0001
Zu einer Lösung von 45 mg (0.068 mmol) (2S)-4- [ {(lR)- l-[l -Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl) - 1 H-pyrro 1-2 - yl] -2,2- dimethylpropyl } ( giyco loyl)amino] - 2 - ( { [2 - (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butansäure (Intermediat C58) in 5.8 ml DMF wurden 22.2 mg (0.068 mmol) (2R)-N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydxo-lH-py]Tol-I - yljpropanainid (1: 1) Trifluoressigsäure zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei RT die Mischung wurde mit 39 mg (0.10 mmol) HATU und 36 mg (0.27 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT geriihrt. Das Gemisch wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 7 mg (12 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): R- 1.41 min; MS (ESIpos): m/z 851 s M H ) . Intermediat C101
Trifluoressigsäure -methyl-(2S)-4-[(acetoxyacetyl) {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyIpropyl} amino]-2-aminobutanoat (1 : 1)
Figure imgf000266_0001
4,3 g (12.2 mmol) von Intermedia! C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g ( 17.12 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (11.85 mmol) Meth 4-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat (hergestellt aus (3S)-3-Amino-4-methoxy-4-oxobutansäure nach klassischen Methoden) gelöst in 175 mL DCM zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen und Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum erhielt man 4.6 g (61% d. Th.) des intermediats.
LC-MS (Methode 12): R* - 1.97 min; MS (ESIpos): m/z - 614.32 (M+H)+.
2.06 g (3.36 mmol) von diesem Intermediat wurden in 76 mL DCM vorgelegt und mit 0.81 mL (7.17 mmol) 2~Chlor-2-oxoethylacetat in Gegenwart von 2.1 ml Triethylamin acyliert. Nach 20 Ii Rühren bei RT wurden weitere 0.36 mL 2-Chlor-2-oxoethylacetat und 0.94 ml Triethylamin zugegeben und der Ansatz weitere 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde mit 500 mL Ethylacetat verdünnt und nacheinander zweimal mit 300 mL 5%-iger Zitronensäure, zweimal mit 300 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und einmal mit 100 mL gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 2.17 g (79% d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 1.48 min; MS (ESTpos): m/z - 714 (M+H)+.
321 mg (0.342 mmol) von diesem Intermediat wurde in 7 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 279.5 mg (2.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 599 mg (2.05 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure und 2 mL einer 0.1%igen Trifluoressigsä relösung in Wasser hinzugegeben und der Ansatz anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mitteis präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 60 mg (26% d.Th.) der Titelverbindung erhalten, die noch einen Teil der de-acetylierten Verbindung enthielt.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 0.91 min und 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 528 und 570 (M+H .
Intermediat C102
(2S)-4-[ {(1R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- lH-pynOl-2-yl]-2,2-dimethylpiOpyl}
(glycoloyl)amino]-2- {[(benzylo
Figure imgf000267_0001
Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-(2S)-2-{[(benzyloxy)earbonyl]amino}-4-oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgerührt.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 646 (M-H)".
Intermediat C103
2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-[2-({(2S)-2-amino-4-[{(ni)- l-[l-benzyl-4- pyrrol-2-y 1] -2,2-dimethylpropyl} (glycoloyi)amino jbutanoyl} amino)ethy 1J-N2- { [2-(trimethylsilyl) ethoxyjcarbonyl} -L-glutaminat tS-;
Figure imgf000268_0001
Die Titel Verbindung wurde zunächst durch Kupplung von 151 mg (0.23 mmol) Interrnediat C102, mit 12,8 mg (0.2,34 mmol) Intermedia! L98 in DMF in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin hergestellt. Ansehließend wurde die Z-Schutzgruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt, wobei die Titelverbindung erhalten wurde.
Ausb.: 30% d. Th. über 2 Stufen
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.14 min; MS (ESTpos): m/z - 929 (M+H)4, Intermedia! C104
2-(Trimelliylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3-[({(lR)- 1 -[1. -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimeihylpropyl}amino)methyl]-4-fluorpyrrolidin- i -carboxylat
Figure imgf000269_0001
Eine Lösung von 2.2,4 g (6.31 mmol) (1R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-p rrol-2-yl]-2y2- dimethylpropati- 1 -amin in 56.0 ml Diclilormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurde mit 1.87 g (8.84 mmol) Natriumtriaeetoxyborhydrid versetz, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 2.20 g (7.58 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4S)-3-fluor-4- formylpyrrolidin- 1 -earboxylat (Ref: WO 2014/151030A1) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3.5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Diclilormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurdemittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 1.39 g (24 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.15 min; MS (ESIpos): m/z - 600 (M+H)+. liiierraediai C105
2-(Trimemy yl)emyl-(3R,4R)-3-{[{(lRH 1-b^
dimethylpropyl} (chloracetyl)amino]rnethyl}-4-fluoipynOlidin-l -earboxylat
Figure imgf000270_0001
Zur eine Lösung von 692,8 mg (0.88 mmol) I i IYin»;ih> Kii> ! k-t > i- H! )- : c 1 ΐ ? * i | i - benz l-4-(2,5-dMuo^henyl)-lH^yrrol-2-yl]-2,2-dimethyipropyl} ainm
fluorpyrrolidin- 1 -carboxylat (Intermedia! C104) in 8.7 ml Dichiormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 295.0 mg (2.91 mmol) Triethylamin und 418.9 mg (3.71 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 2.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichiormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde nochmal in 8.7 ml Dichiormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 295.0 mg (2.91 mmol) Triethylamin und 418.9 mg (3.71 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichiormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 69 1 mg (74 % d. Th., 64% Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.78 min; MS (ESIpos): m/z - 676 (M+H)+. 3-{[2-( {(lR)-l-[l ~Benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyi } { [(3R,4R)-4- fluor- 1 - { [2-(trimethy lsilyl)ethoxy]carbonyl } pyrrolidin-3-yl]methy 1 } amino)-2 - oxoetiryl]sulfanyl}propansäu
Figure imgf000271_0001
Eine Mischung von 691.0 mg (0.65 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3R,4R)-3- {[ {(lR)-l- [l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]methyl}-4-fluorpyrrolidin- l-carboxylat (Intermediat C105) und 76.3 mg (0.72 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 15 ml Methanol und einige Tropfen Wasser -wurde mit 316 mg (2.29 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsuifat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 502 mg (67 % d. Th., 65% Reinheit) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.48 min; MS (ESIneg): m/z - 744 (M-H)\ Intermediat C107
S-[2-({(lR)-l -[1 -Benz5d-4-(2,5-difluo^henyl)-lH^yrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R,4R)-4- fluor- 1 - {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl } pyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein
Figure imgf000272_0001
203.6 mg (3 .68 mmol) L-Cystein wurden in 0.95 ml, Wasser zusammen mit 201.7 mg (2.40 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 170.0 mg (0.24 mmol 2- (Trimethylsilyl)ethy3^3R,4R ^
dimethylpropyl} (chlorace1 l)amino]methyl}-4-fluo yrΓolidin-l -carboxylat (Intermediat 105) gelöst in 9.5 mL /so-Propanot und 438.5 mg (2.40 mmol) und l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 152 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.26 min; MS (ESIpos): m/z - 762 (M+H)+. Intermediat C115
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dmyclro-m-pyrroM
difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dirnethylpropyl} {[(2- carboxyeth l)siilfenyl]acetyl}ammo)propyl]-L-alar]mamid
Figure imgf000273_0001
11-{(1 R)- ! -[ ! -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- ! H-pyrrol-2 -yl]-2^-dimethylpropyl} -2,2-dimethyi- 6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l I -diaza-2-silaheptadecan- i 7-säure (200 mg, 285 μηιοϊ) (Intermediat C69) wurde in 10 ml Trifluorethanoi gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (233 mg, 1.71 mmol) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischimg wurde noch zweimal mit Zinkchlorid (233 mg, 1.71 mmol) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (1.50 g, 5,13 mmol) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 162 mg (85 % d. Th.) der Verbindung 3-({2-[(3- Amirlo ro yl) {(lR)-l -[l-berlzyl-4-(2,5-difluo herl l)- lH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } amino]-2-oxoethyl } sulf anyl propansäure -trifluoressigsäure (1 : 1).
LC-MS (Methode 3 ): Rt - 0.94 min; MS (ESIneg): m z - 556 [M-H]"
3-({2-[(3-Aminopropyl) {(3 R -i -[1 -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)- lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimeihylpiOpyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)propansäure -trifluoressigsäure (1 : 1) (80.0 mg, 1 19 μηιοΐ) wurde in 5.0 ml DMF gelöst und mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yi-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (69.4 mg, 82 % Reinheit, 119 μιηοΐ) (interrnediat L88) und N,N-Diisopropylethylamin (41 μΐ, 240 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2h30 bei RT gerührt und mit Wasser (0.1%TFA) versetzt. Der Ansatz wurde aufkonzentriert und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Rcprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 82.2 mg (75 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.17 min; MS (ESIpos): m/z - 921 [M+Hf
Intermediat C116
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro H-pyrrol-l-yl^^
difluo henyl)-lH-p rrol-2-yl]-2,2-dimethyl ro yl} [( {3-[(2-carboxyet yl)amino]-3- oxopropyl}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninamid
Figure imgf000274_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-( {(1R)- l-[l-benzyl-4-(2,5-dii!Uo 3henyl)-lH-pyiTol-2-y1]-2,2-dimethylpropyl} {[(2- carboxyethyl)suifanyl]acetyi}amino)propyl]-L-alaninamid (56.7 mg, 61.6 μπιοΐ) (Intermediat C115) und tert-Buiyl-beta-aianinathydrochiorid (1 : 1) (ϊ3.4 mg, 73.9 μτηο!) in 3.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (28.1 mg, 73.9 μηιοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (32 μΐ, 180 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Rcprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 41.4 mg (64 % d. Th.) der Verbindung N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro lH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-
Figure imgf000274_0002
4,8,13-trioxo-3-oxa- 11 -thia-7, 14-diazaheptadecan- 17-yl)-L-alaninamid.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.28 min; MS (ESIpos): m/z - 1048 [M+Hf
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-m-pyiTol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-N-(14- {(lR)-l -[l-benz dii]uo 3henyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimeihylpropyl}-2,2-dimethyl-4,8,13-trioxo-3-oxa-l 1 -thia- . ΊΊΙ
7,14-diazaheptadecan-17-yl)-L-alaninamid (39.3 mg, 37.5 μτηοΐ) wurde in 2.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (30.7 mg, 225 μηιοί) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (30.7 mg, 2,25 μπιοΐ ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsaeure (131 mg, 450 μηιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 30 mg (81 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.12 min; MS (ESI os): m/z - 992 [M+Hf
Intermediat LI
Trifluoressigsäure--N-(2-arrflnoeth^
Figure imgf000275_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidehemie aus kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydrol H-pyrrol-1 -yl)essigsäure und tert-Butyl-(2-aminoethyl) carbamat hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt - 0.19 min;
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.17 min; MS (ESTpos): m/z - 198 (M+H)4, Intermediat L2
Trifluoressigsäure--rel-(lR,2S)-2-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1- yl)ethyl]cyclopentancarboxamid(l : 1)
Figure imgf000276_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0,214 mmol) von kommerziell erhältlicher eis- 2-[(tert-Butoxycaibonyl)aniino]-i -cyclopen.taricarboi!säure mit 60 mg (0.2,35 mmol) von ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure-- 1 -(2-aminoethyl)- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 : 1 ) durch Kupplung mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 36 rng (38% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt - 0.2 nun;
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.17 min; MS (ESTpos): m/z - 252 (M+H)4, Intermedi t L3
Trifluoressigsäure--(l S,2R)-2-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- l H-pyiTo]-l - yl)ethyl]cyclopentancarboxamid(l : 1)
Figure imgf000276_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.214 mmol) von kommerziell erhältlicher (lS,2R)-2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure mit 72 mg (0.283 mmol) von ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure- 1 -(2-aminoethyl)- lH-pyrrol-2,5-dion(l : l) durch Kupplung mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 13 mg (16% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): R, - 0.2 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.2 min; MS (ESIpos): m/z - 252 (M+H)+. Ilttgnnediat_L4
Trifluoressigsäure--N-(2-ammoethy^
yl)cyclohexancarboxamid(l : 1)
Figure imgf000277_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidehemie aus kommerziell erhältlichem l-[(4- {[(2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl)oxy]carbonyl} cyclohexyl)methyl]-lH-pynOl-2,5- dion und tei1-Butyl-(2-aminoethyl) carbamat hergestellt.
HPLC (Methode 11): Rt = 0.26 min;
LC-MS (Methode 1 ): R, = 0.25 min; MS (ESTpos): m/z - 280 (M+H)+. Intermediat L5
Trifluoressigsäure— N-[4-( -beta-alaninamid(l : 1 )
Figure imgf000277_0002
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidehemie aus kommerziell erhältlichem 1 -(4-Aminopliertyl)-lH-pyrrol-2,5-dioD und N-(tert-Butoxycarbonyi)-beta-alanin hergestellt.
HPLC (Methode 1 1): R, - 0.22 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.22 min; MS (ESlpos): m z = 260 (M+H)+.
Intermediat L6
Trifluoressigsäure--tert-butyl^
alanyl-L-lysinat(l : 1)
Figure imgf000278_0001
Die Titel Verbindung wurde zunächst durch Kupplung von kommerziell erhältlicher 6-(2,5-Dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexansäure mit dem nach klassischen Methoden der Peptidcnemie hergestellten partiell geschützten Peptid tert-Butyl-L-valyl-L-alanyl-N^-^ert-butoxycarbonyli-L- lysinat in Gegenwart von EDC/HOBT hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch Runren in 5%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT, wobei in 37%iger Ausbeute die Titeiverbindung erhalten wurde.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 1.29 min;
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.62 min; MS (ESIpos): m/z - 566 (M+H)+. liitermediai; L7
Trifluoressigsäure--beta-alanyl-L-valyl-N'-carbamoyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-di^
yl)phenyl]-L-ornithinamid(l : 1)
Figure imgf000278_0002
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidcnemie ausgehend von kommerziell erhältlichem 1 -(4- Aminophenyl)- 1 H-pyrro!-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N2-(tert-Butoxycarbony!)-N5-carbamoyt-L-ornithiri in Gegenwart von HATiJ, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yt-N-(tert-butoxycarbonyi)-L-valinat, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidiri- 1 -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 32 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): t - 0.31 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.47 min; MS (ESipos): m/z = 516 (M+H . IntennedM LS
Trifluoressigsäirre~~L-alanyl~N5-carbamoy
L-omithinamid( 1 : 1)
Figure imgf000279_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidcheinie ausgehend von kommerziell erhältlichem l-(4-AminophenyI)-lH-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N2-(tert-Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L-oraithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidm- 1 -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alanii!at und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 171 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 0.23 min;
LC-MS (Methode 7): Rt = 0.3 min; MS (ESipos): m/z - 417 (M+H)*. Intermediat L9
Trifluoressigsäuie--beta-alanyl-L-valyl-N'-carbamoyl-N-[4-(2-methoxy-2-oxoethyl)ph orni thinamid( 1 : 1)
Figure imgf000280_0001
Die Titelverbindimg in Analogie zu Intermediat L7 ausgehend von kommerziell erhältlichem Methyl-(4-aminophenyl)acetat hergestellt. Es wurden 320 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt - 0.45 min:
LC-MS (Methode 1): R, - 0.48 min; MS (ESIpos): m/z - 493 (M+H)+.
N^6-(2,5-Dioxo-2,5-d y<rro-m-pyr^
ammocyclopentyTJcarbonyl} -L-lysin-trifluoressigsäure( i :2)
Figure imgf000280_0002
Die Titel Verbindung wurde ausgehend von Intermediat L6 durch Kupplung mit cis-2-[(tert- Butoxycarrxmyi)amino]- 1 -cyclopentancarbonsäure mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 12 mg (52% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten .
HPLC (Methode 11): Rt - 1.45 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.73 min; MS (ESIpos): m/z - 677 (M+H)+. Intermediat LH
N- [6-(2, 5 -Dioxo-2 , 5 -dihy dro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L- v al
atrdnocyclopentyl]carbonyl}-L-lysin-trifluoressigsäure(l:2)
Figure imgf000281_0001
Die T'iteiverbindung wurde ausgehend von Interaiediat L6 durch Kupplung mit (lS,2R)-2-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäuie mit EDC/HOBT und anschließender Entsehützung mit TFA hergestellt. Es wurden 1 1 mg (39% d.TTi. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten, HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 1.45 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)+. Intermediat L12
Trifluoressigsäuie--l-[2-(2-ammoemoxy)e1hyl]-lH-pyrrol-2,5-dion(l:l)
Figure imgf000281_0002
Zu 228 mg (1.12 mmol) tert-Butyl-[2-(2-ammoethoxy)ethyl]carbamat gelöst in 7 rnL Dioxan Wasser 1 : 1 gelöst wurden 381 mg (2.46 mmol) Methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1-carboxyiat gegeben. Dann wurden 1.2 mL einer gesättigten Natriijmhydrogencarbonat Lösung zugesetzt und der Ansatz bei RT gerührt. Nach insgesamt 5-tägigem Rühren bei 2 weiteren Zugaben von gleichen Mengen der Natriumhydrogencarbonat Lösung wurde der Ansatz durch Ansäuern mit Trifluoressigsäure, Einrotieren und Reinigung des Rückstandes durch präparative HPLC aufgearbeitet. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 lyophilisiert.
Der Rückstand wurde in 3 mL Dichlonnethan aufgenommen und mit 1 mL Trifluoressigsäure versetzt. Nach 15 min Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 lyophilisiert. So wurden 70 mg (67% d.Th. über 2, Stufen) der Titel Verbindung als harziger Rückstand erhalten.
HPLC (Methode 11): Rt - 0.2 min;
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.18 min; MS (ESIpos): m/z - 185 (M+H)+. Iratermediat LI
Trifluoressigsäme--tert-butyl-N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-i H-pyrroL
Figure imgf000282_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)essigsäure mit tert-Buty1-N&-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinathydroch3orid(l : l) in Gegenwart von EDC/HOBT und anschließender schonender Abspaltung der tert-Butoxycarbonyl Schutzgruppe in Analogie zu Intermediat L6 hergestellt.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.42 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.43 min; MS (ESIpos): m/z = 340 (M+H)+. Intermediat LI 4
Trifluoressigsäure— 1 -[2-(4-arninopiperazin- 1 -yl)-2-oxoelhyi]- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 : 1)
Figure imgf000282_0002
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu intermediat L2 über 2 Stufen aus tert-Butyl-piperazin-1- ylcarbamat und (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 3 -yl)essigsäure ergestellt. HPLC (Methode 1 1): R, - 0.2 min;
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.25 min; MS (ESIpos): m/z - 239 (M+H)+. Intermediat LI 5
Trifluoressigsäure--N-(2-arrinoeth^^
yl)etlioxy]etlioxy}ethoxy)propanamid(l : l)
Figure imgf000283_0001
2.93 g ( 10.58 mmol) tert-But l-3- {2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethoxy} propanoat wurden in 100 mL Dioxan/Wasser 1: 1 gelöst und mit 3.28 g (21.15 mmol) Methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1H- pyrrol- 1 -carboxy tat sowie einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 6-7 versetzt. Die Lösung wurde 30 min bei RT gerührt und anschließend wurde das 1 ,4-Dioxan im Vakuum abgedampft. Dann wurden 200 mL Wasser zugegeben und die Mischung dreimal mit jeweils 300 mL Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach Einengen wurde tert-Butyl-3-(2- {2- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)ethoxy]ethoxy}ethoxy)propanoat als braunes Öl erhalten, das anschließend im Hochvakuum getrocknet wurde.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 1.5 min;
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 375 (M+ H«)+.
Dieses Intermediat wurde nach Standardverfahren (Entschützung mit TFA, Kupplung mit tert- Butyl-(2-armnoethyl)carbamat und erneute Entschützung mit TFA) in die Titelverbindung überführt.
HPLC (Methode 11 ): Rt - 0.2 min;
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.25 min; MS (ESIpos): m/z - 344 (M+H)+. Intermediat L 16
N-[6~(2,5~Dioxo-2,5~dihydro-IH-pyrrol-l-y3)hexanoy3]-L-valyl-rN J
Figure imgf000284_0001
Zu einer Lösung von 266 rng (1.33 mmol) L-Val l-N5-earbanio l-L-orniihin in 24 mL DMF wurden 535 mg (1.73 mmol) von kommerziell erhältlichem 1 - {6-[(2,5-33ioxop rrolidin- 1 -yl)oxy]- 6-oxohexyI} - lH-pyrrol-2,5-dion sowie 930 mL N V-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Der Ansatz wurde 24 h im Uitraschalibad beliandelt und anschließend im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde mittels präparativer HPCL gereinigt und nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum verblieben 337 mg (50% d.Th.) der Titelverbindung.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.4 min;
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.58 min; MS (ESIpos): m/z = 468 (M+H)+.
Intmn<ajfo|LL17
Trifluoressigsäure--tert-butyl-N ^
carbamoyl-L-omithyl-L-lysinat(l : 1)
Figure imgf000284_0002
Die Titelverbindung wurde zunächst duxcli Kupplung von 172 mg (0.37 mmol) Intermedia!; L16 und 12.5 mg (0.37 mmol) tei"t-Butyl-N6-(tei1-butoxycai"bonyl)-L-lysinat hydrochlorid(l : l) in Gegenwart von EDC/HOBT und NN-Düsopropylethylamin und anschließende Entschützung der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 2h Rühren in 10%iger Trifluoressigsättre in DCM bei RT hergestellt. Nach Gefriertrocknung aus AcetonitriV Wasser wurden 194 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten.
HPLC (Methode i 1): Rt = 1.1 min;
LC-MS (Methode 1): R, = 0.58 min; MS (ESlpos): m/z - 652 (M+H .
Intermediat L18
Trifluoressigsäure— beta-alanyl-L-alanyl-N -carbamoyl-N-[4-(2-methoxy-2-oxoethyl)phenyl]-L- omithmamidf 1 : 1 )
O CK
Figure imgf000285_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Methyl-(4-aminophenyl)acetat analog Intermediat L7 sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchernie durch Anknüpfung von N2-(iert- Butoxycarbony^-N^-carbarnoyl-L-omithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-DioxopynOlidm-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestelit. Es wurden 330 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.29 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.41 min; MS (ESlpos): m/z - 465 (M+H)+
Trifluoressigsäure--L-a!any!-N5-carbamoy!-N^
yl)acetyl]amino}phenyl)-L-omithinamid(l : 1 )
Figure imgf000285_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 1,4 Phenylendiamin sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidc emie hergestellt. Im ersten Schritt wurden 942 mg (8.72 mmol) 1,4 Phenylendiamin mit 0.8 g (2.9 mmol) 2~(te:rt-Eiutoxycarbo:nyl)-N5"Carbainoyl"L-ornithin in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropyäethylamin monoacyliert. Im zweiten Schritt wurde in analoger Weise die zweite anilinische Aminogruppe mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yi)essigsäure in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin acyliert. Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat und erneute Entschützung mit TFA führten dann in 3 weiteren Syntheseschlitten zur Titelverbindung, von der auf diesem Weg 148 rng erhallen wurden.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.21 min; MS (ESIpos): m/z - 474 (M+H)+. LC-MS (Methode 4): R, = 0.2 min; MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)4. Iratermediat ;2ö
Triüuoressigsäure--L-valyl-N5-carbanw
omilhinamid(l : 1 )
Figure imgf000286_0001
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie analog zu Intermediat L8 ausgehend von kommerziell erhältlichem l -(4-Aminophenyi)-lH-pyrrot-2,5-dion durch sequentieile Kupplung mit N2-(tert-Butoxycarbonyl)-N5-earbamoyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrroridin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)- L-valinat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 173 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 0.28 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.39 min; MS (ESIpos): m/z - 445 (M+H)4. Intermediat L21
L-Valyl-N6-(tert-butoxycarboriyl)-N-[4-(2-meihoxy-2-oxoethyl)ph
Figure imgf000287_0001
Die Titelverbmdung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem 0.42 g (2,56 mmol) Methyl-(4-amiiiophenyl)acetat durch sequentielle Kupplung mit N6-(tert-Butoxycarbonyl)-N2-[(9H-fluorea-9-ylmethoxy)carbonyl]-3-^lysiii in Gegenwari von HATU, und NN-Diisopropylethylamin, Entschützung mit Piperidin, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[(benzy'loxy)carbonyl]-L-valinai in Gegenwart von N,N- Diisopropylethylamin und anschließende hydrogenolytische Abspaltung der Benzyloxycarbonylschutzgrappe über 10%-Palladium- Aktivkohle. Es wurden 360 mg (32% d.'T'h. über 4 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 1.5 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H)+. Intermediat L22
Trifluoressigsäure--N (9H-fluoren-9-ylm
methoxy-3-oxopropyl]phenyl}-N5-carbamoyl-L-ornithinamid(l : l)
Figure imgf000287_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von N-(tert-Butoxycarbonyl)-4-nitro-L-phenylalanin sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. 2.5 g (8.06 mmol) von diesem Edukt wurde im ersten Schritt zunächst in das Caesiumsalz und dann mit lodmethan in DMF in den Methylester überfuhrt. Hydrogenoly isch wurde dann in Methanol über 10% Palladium-Aktivkohle die Nitrograppe in eine Aminograppe überführt.
Die so generierte Aminograppe wurde dann mit N5-Carbamoyl-N2-[(9H-fluoren-9- ylmethoxy)carbonyl]-L-ornithin in DMF in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropyietiiylamin acyliert. Im nächsten Schritt wurde die Fmoc-Gruppe mit Piperidin in DMF abgespalten.
Anschließend erfolgte in DMF die Kupplung mit N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyi]-L-vaiin in Gegenwart von l-(3-Dirnethyiaminopropyl)-3-eihylcarbodiimid-Hydrochlorid, l-Hydroxy-lH- benzotriazol-Hydrat und N,N-Diisopropylethylamin und schließlich die Abspaltung der tert- Buloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure.
HPLC (Methode 11): Rt = 1.6 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.77 min; MS (ESIpos): m/z - 673 (M+H)+.
Iratermediat L;^
Trifluoressigsäuxe--N-[2-^
Figure imgf000288_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure— 1 -(2- aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l : l) durch Kupplung mit N-(tert-Butoxycarbonyl)-beta-alanin i n Gegenwart von EDCI/HOBT und NN-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.19 min.
IntennedM L24 lnfluoressigsäiire--l-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTol-l-yl)ethyl]
cyclopropancarboxamid( 1 : 1)
Figure imgf000288_0002
1 1 4 mg (0.67 mmol) von kommerziell erhältlicher 3 -[(tert-Butox earbonyl)amino]cyclopropa-n carbonsäure wurden in 25 mL DCM gelöst und mit 1 10 mg (0.623 mmol) von kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure-- 1 -(2-aminoethyl)- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 : 1) sowie mit 395 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt und auf - 10°C abgekühlt. Dann wurden 217 mg (0.793 mmol) 2- Brom- 1 -ethylpyridiniumtetrafluoroborat zugegeben und der Ansatz 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde mit Ethylacetat verdünnt und nacheinander mit i 0%-iger Zitronensäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung un gesättigter Natriumchloridlösubng ausgeschüttelt, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 152 mg des geschützten Intermedia ts erhalten.
Diese wurden anschließend in 10 mL DCM aufgenommen und mit 1 mL Trifluoressigsäure entschützt, Nach Lyophilisation aus Acetonitnl/Wasser wurden 1 58 mg (71% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt - 0.19 min.
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 224 (M+H)+. Intermediat L25
N-[31-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyixol-l -yl)-29-oxo-4,7,10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriaconlan-i -oyl]-L-valyl-L-aianin
Figure imgf000289_0001
31.4 mg (0.17 mmol) Valyl-L-alanin wurden in 3.0 mL DMF gelöst und mit 1 1 5.0 mg (0.17 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- l H^yrrol-l -y])-N- {27-[(2,5-dioxopyrrolidin- l -yl)oxy]-27-oxo-
3,6,9,12,I 5,18,21,24-octaoxaheptacos -yl}propanamid und mit 33.7 mg (0.33 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 74.1 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.61 min; MS (ESIpos): m/z - 763 [M+H]+.
Intermediat L26
L~Valyl-N6-(tert~butoxycarbonyl)-L-rysin
Figure imgf000290_0001
600.0 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Etiianol THF (1 : 1 :0.5) suspendiert und mit Palladium auf Kohle (30 ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 5 h hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Lösemittel im Vakuum verdampft. Die erhaltene Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.42 min; MS (ESIpos): m/z - 247 [M+H]+.
1 80 mg (0.73 mmol) N6~(tert-Butoxyearbonyi)~L~lysin wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Dann wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5-Dioxopyrrolidin- l-yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktionsmischimg wurde 3.5 h bei RT geröhrt. Die Reaktionslösung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.3 mg (76 % d. Th.) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysin.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.97 min; MS (ESIpos): m/z - 480 [M+H]+. 272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20.0 ml. Eihylacetai/Ethanol/THF (1 : 1 : 1) vorgelegt und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt. Man hydrierte mit Wasserstoff bei RT unter Normaldruck 5 h. Es wurde mit Hilfe von CeliteiR) abfiltriert und der Filterkuchen mit Ethylacetat Ethanol/THF (1: 1:1) nachgewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Titelverbindung (182 mg, 72 % d. Th.) wurde in der nächsten Reaktionsstufe ohne weitere Reinigung eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.53 min; MS (ESIpos): m/z - 346 [M+Hf.
Intermediat L27
N 31-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-29-oxo-4,7,10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontim-l-oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysin
Figure imgf000291_0001
30 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin (Intermediat L26)
und 46.1 mg (0.07 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro H-pyrrol-l -yl)-N-{27-[(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]-27-oxo-3,6,9, 12,15, 18,21 ,24-octaoxaheptacos- 1 -yl}propanamid wurden in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 6.8 mg (0.07 mmol ) 4-Methylmoipholin versetzt. Die Reaktionslösung rührte bei RT über Nacht. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fiuss: 50 niL/min, MeCN/W asser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 55.6 mg (90 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.77 min; MS (ESIpos): m z - 920 [M+H]+. Intermediat L28 tert-Butyl-3-formyl-4-( |[2-(trimethyisiiyi)ethoxy]carbonyl}ainino)pyrroUdin-l-carboxylat
Figure imgf000292_0001
461.7 mg (1.15 mmol) 1 ert^Bu1yl-3-ethyl-4-({[2-
(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)pyrrolidin-l ,3-dicarboxylat (Diese Verbindung wurde gemäß Literaturvorschri t WO 2006/066896 hergestelli) wurden in 5.0 mL absol. Dichlormethan vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurde langsam 326.2 mg (2.29 mmol) Diisobutylalurniniumhydrid-Lösung (1 M in THF) zugetropft und 2 h bei -78 °C gerührt (Dünnschiehtcliromatographische Kontrolle (Petrolether/Ethylacetat = 3: 1). Es wurden 1.3 g (4.59 mmol) Kaliumnatriumtartrat gelöst in 60 mL Wasser zugetropft und die Reaktionsmischung auf RT kommen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethytacetat versetzt und die wässrige Phase dreimal mit Ethylacetat extrahiert Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit ges. aCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet, Man erhielt 629.0 mg der Titelverbindung als Rohprodukt, welches ohne weitere Reinigung sofort in der nächsten Reaktionsstufe eingesetzt wurde.
Figure imgf000292_0002
tert-But} -3-fomiyi-4-[({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)methy
Mischung aus Diastereomeren.
Figure imgf000293_0001
807.1 mg (2.34 mmol) tert-Buty]-3-({[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}rnethyl)-4- (hydroxymethyi)p rrolidin- 1 -carboxylat (Die Herstellung erfolgte gemäß der Literatun/orschrift WO 2006/100036) wurden in 8.0 niL Dichlormethan vorgelegt und 236.4 mg (2.34 mmol) Triethylamin zugegeben. Bei 0 °C wurden 267.6 mg (2.34 mmol) Methansuifonsäurechlorid zugetropft und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Es erfolgte eine weitere Zugabe von 133.8 mg (1.17 mmol) Methansuifonsäurechlorid und 118.2 mg (1.17 mmol) Triethylamin, Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je einmal mit ges. NaüiumliydiOgencarbonat-Lösung, 5%iger Kaliumhydrogensulfat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Tsolera gereinigt (Kieselgel, Säule 50 g SN AP, Fluss 66 mL/ in, Cyelohexan/Ethylacetat). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 402.0 mg (41 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3-({[tert- buty l(dimethyl)silyl]oxy } methyi)-4 - { [(niethyisulfonyl)oxy]methyi } Pyrrolidin- 1 - carboxylat LC-MS (Methode 1): R, - 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 424 [M+H]+.
400.0 mg (0.94 mmol) tert-Butyl-3~({[te:rt-butyl(diniethyl)silyl]oxy} methyl)-4- {[(methylsislfonylioxyjmethyl) Pyrrolidin- 1 -carboxylat wurden in 5.0 mL DMF vorgelegt und mit 98.2 mg (1.51 mmol) Natriumazid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 h bei 40 °C gerührt. Dann wurden nochmals 30.7 mg (0.47 mmol) Natriumazid zugegeben und weitere 10 h bei 40 °C gerührt. Es wurde Ethylaceiat zugegeben und die organsiche Phase mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach der Trocknung der organischen Phase über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 309.5 mg (89 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3-(azidomethyl)-4-( {[tert- butyl(dime1hyl)silyl]oxy}metliyi)pyrrolidiD-l-carbox iat. Die Verbindung wurde ohne weitere
Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.50 min; MS (ESIpos): m/z = 371 [M+H]+.
250 mg (0.68 mmol) tert-Butyl-3-(azidomethyi)-4-({[tert-butyl(dimethyl) silyl]oxy} methyl) Pyrrolidin- 1 -carboxylat wurden in 10.0 ml, Ethylacetat/Ethanol (1 :1) gelöst und mit 25.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt. Man hydrierte mit Wasserstoff bei RT unter Normaldruck 8 h. Die Reaktion wurde über Celite(&J filtiert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 226.2 mg (82 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3- (armnomethyl)-4-({[tert-bu1yl(dimethyl)silyl]oxy}memyl)pyiTolidin-l -carboxylat. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 345 [M+H]+.
715.0 mg (2.08 mmol) tert-Butyl-3-(aminomethyl)-4-({[tert-butyl(dimethyl) silyl]oxy}methyl) Pyrrolidin- 1 -carboxylat wurden in 15.0 mL THF gelöst und mit 2.28 mL (2.28 mmol) TBAF- Lösung (IM in THF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht geröhrt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand (1.54 g) ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.41 min; MS (ESIpos): m/z - 231 [M+Hf,
1.54 g (4.88 mmol) tert-Butyi-3-(aminomethyl)-4-(hydroxymethyl)pyrrolidin-l-carbox /lat wurden in 1 ,4-Dioxan vorgelegt mit 541.8 mg (4.88 mmol) Calciumchlorid (wasserfrei) und 488.6 mg (4.88 mmol) Calciumcarbonat versetzt und kräftig gerührt. Dann wurden 592.8 mg (5.86 mmol) Triethylamin und 1.52 g (5.86 mmol) 1 -({[2-(Trimethylsilyl)ethoxyjcarbonyl}oxy)pyri lidin-2,5- dion zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 644.9 mg (10.7 mmol) HOAc und Ethylacetat zugegeben. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lsöemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormeth .an/Methanol = 100: 1 ) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 346.9 mg (19 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3 -(hydroxymethyl)-4-[( { [2-(lximelhylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)melhyl]pyrrolidin- 1 - carboxylat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.08 min; MS (ESIpos): m/z - 375 [M+H]+. 804.0 mg (2.15 mmol) tert-Butyl-3-(hydroxymethyl)-4-[({[2-(trime is!iyl) ethoxy] carbonyl}amino) methyl]pyrrolidin-l -carboxylat wurden in 20.0 mL Chloroform und 20.0 niL 0.05 N Kaliumcarbonat/0.05 N Natriumhydxogencarbonat-Lösung (1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 59.7 mg (0.2,2 mmol) Tetra-n-butylammoniumchlorid, 42,9.9 mg (3.22, mmol) N-Chlorsuccinimid und 33.5 mg (0.22 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und im Vakuum vom Lösemittel befreit. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Lausfmittel: Cyclohexan/Ethylacetat = 3: 1) gereinigt. Man erhielt 517.0 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.13 min; MS (ESI os): m/z - 373 [M+Hf.
Intermediat L30 tert-Buty 1-3 -( { [tert-butyl(dimethy l)süyl]oxy } methyl)-4-formylpyrro lidin- 1 -carboxy lat
Mischung aus Stereoisomeren
Figure imgf000295_0001
250.0 mg (0.72 mmol) tert-Butyl-3-({[tert-buty](dimetlryl)silyl]oxy} methyl)-4- (hydroxymethyl)pyrrolidin-l -carboxylat (Die Verbindung wurde gemäß der Literaturvorschrift WO2006/100036 hergestellt.) wurde in 12.5 mL Dichlonnethan/DMSO (4: 1) vorgelegt und mit 219.6 mg (2.17 mmol) Triethylamin versetzt. Bei 2 °C wurde 345.5 mg (2.17 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex portionsweise zugegeben und 3 h bei 2 °C gerührt. Es wurden nochmals 345.5 mg (2.17 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex portionsweise zugegeben und 17 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Dichlorrneihan und Wasser verteilt. Die wässrige Phase wurde dreimal mit Dichlomiethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen einmal mit Wasser gewaschen und über Magnesiunisulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt (Dünnsehichtchroniatographie: Petrolether/Ethylacetat 7:3).
Di-tert-butyl- { [(tert-butoxycarbonyl)amino]methyl } malonat
Figure imgf000296_0001
Zu 600 mL Wasser wurden 57.2 g (488.27 mmol) tert-Butylcarbamat, 51.2 inL (683.57 mmol) einer 37%-igen Lösung von Formaldehyd in Wasser und 25.9 g (244,13 mmol) Natriumcarbonat addiert. Das Gemisch wurde erwärmt, bis eine Lösung entstand und dann bei RT für 16 h geröhrt. Die entstandene Suspension wurde mit 500 mL Dichlormethan extrahiert, die organische Phase abgetrennt, mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Es wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet, wobei ein kristalliner Feststoff anfällt. Der Rückstand wurde in 1000 mL absoluten THF aufgenommen und bei RT ein Gemisch aus 322 mL (3.414 mol) Essigsäureanhydrid und 138 mL (1.707 mol) Pyridin zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde bei RT für 16 h gerührt und anschließend am Rotationsverdampfer eingenegt, wobei das Wasserbad Raumtemperatur hatte. Der Rückstand wurde in Diethylether aufgenommen und drei mal mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung sowie ein mal mit einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Nalriunisulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand 2 d im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 2000 mL absolutem THF aufgenommen und unter Eiskühlung mit 456 mL (456.52 mmol) einer 1 M Lösung von Kalium-tert-butanolat in THF versetzt. Es wurde 20 Min. bei 0°C gerührt und anschließend 100.8 g (456.52 mmol) Di-tert-butylmalonat gelöst in 200 mL absolutem THF zugetropft. Es wurde 48 h bei RT gerührt und anschließend Wasser addiert. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und in 500 mL- Essigsäureethylester aufgenommen. Das Gemisch wurde mit 500 mL Wasser und 100 mL einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewaschen und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels Filtration über Kieselgel (Eluent: Cylohexan/Essigsäureethylester, Gradient = 30: 1 — *· 5: 1) gereinigt. Es wurden 37.07 g (22% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 6): R, = 2.87 min; MS (ESlpos): m/z - 346 [M+H]+.
Intermediat L32 tert-Buty 1- [ 3 -hydroxy-2 - (hydroxymethy l)propy 1 ] c arbamat
Figure imgf000297_0001
37.0 g (107.11 mmol) Di-tert-butyl-(acetoxymethyl)malonat wurden in 1000 mL absolutem THF gelöst und unter Eiskühlung mit 535.5 mL ( 1071.10 mmol) einer 2 M Lösung von Lithiumborhydrid in THF tropfenweise versetzt. Es wurden 19.3 mL ( 1071.10 mmol) Wasser zugetropft und 4.5 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 1 00 mL Essigsäureethylester aufgenommen und mit 100 mL Wasser versetzt und 30 Min. unter Wasserkühlung gerührt (leicht exotherm). Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase zwei mal mit 500 mL Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 20.7 g (94% d. Th.) der Zeilverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 6): Rt - 1.49 min; MS (EIpos): m/z - 106 [M-CsHgC f . Intermediat L33 tert-Butyi-[3- { [tert-butyl(dimelhyi)silyl]oxy} -2-(hydroxymethyl)propyl]carbamat
Figure imgf000298_0001
20.00 g (97.44 mmol) tert-Butyl-[3-hydroxy-2-(hydroxymeüiyl)propyl]carbamat wurden in 1000 mL absolutem Dichlormethan gelöst und bei RT mit 6.63 g (97.44 mmol) Imidazol sowie 16.16 g (107.18 mmol) tert-Butyl(chlor)dimethylsilan versetzt. Es wurde 16 h bei RT gerührt und das Reaktionsgemisch mit halbkonzentrierter Natriumc orid-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Essigsäureethyiester extrahiert und die vereinigten oranisehen Phasen über Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 28.50 g (92% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 0.02 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 1.37 (s, 9H), 1.58-1.73 (m, 1H), 2.91 (q, 2H), 3.33-3.36 [m, (2H, verdeckt)], 3.53-3.58 (m, 2H), 6.65-6.72 (m, 1 H).
Intermediat L34 tert-Butyl-(3-{[tert-butyl(dimethyl)sily]]oxy}-2-formylpropyl)earbamat
Figure imgf000298_0002
12.65 g ( 39.591 mmol) tert-Butyl-[3- {'[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy} -2-
(hydroxymethyl)propyljcarbamat wurden in 200 mL Dichlormethan gelöst und bei RT mit und mit 19.31 g (45.53 mmol) Dess-Martin-Periodinan gelöst in 150 mL Dichlormethan tropfenweise versetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 250 mL einer Imlbkonzentrierten NatriumhydrogencarboDat-Lösvmg sowie mit 250 mL einer 10%-igen Natriumthiosulfat-Lösvmg versetzt, und für 20 Min. gerührt Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 300 mL Wasser gewaschen, über Natriumsuifat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 1 1.35 g ( 90% d. Th.) der Zielverbindung erhalten. l i-N M (400 MHz, DMSO-ck): δ [ppm] - 0.02 (s, 6H), 0.84(s, 9H), 1.36 (s, 9H), 1.48-1.51 (m, 3 H), 3.08-3.32 [m, (1H, verdeckt)], 3.50-3.58 (m, 2H), 3.81 -3.91 (m, 1H), 6.71 (t, 1H), 9.60 (d, ΠΙ),
Intermediat L3S tert-Butyi-(3-oxopropyl)carbamat
Figure imgf000299_0001
Die Titelverbindung wurde nach iiteraturbekannten Verfahren hergestellt (z.B. Jean Basiide Med. Chem. 2003, 46(16), 3536-3545).
Intermediat L36 -[(Benzyloxy)carbonyi]-L-vaiyi-N5-carbamoyi-L-omithin
Figure imgf000299_0002
100 mg (0.57 mmol) N5-Carbamoyl-L-ornithin wurden in 4.0 mL DMF aufgenommen und mit 0.08 mL (0.57 mmol) Triethylamin versetzt. Dann wurden 199.0 mg (0.57 mmol) 2,5- Dioxop rrolidin- 1 -yi-N-[(benzyloxy)carbonyl] -L-valin und 0.08 mL (0.57 mmol) Triethylamin zugesetzt. Es wurde 48 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeC /Wasser mit 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 75.7 mg (33 % d. ri.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.69 min; MS (ESIpos): m/z - 409 [M+Hf.
Intermediat L37
L - Valyl-N 5 - c arb amoy 1-L -Ornithin
Figure imgf000300_0001
75.7 mg (0.19 mmol) von Intermediat L36 wurden in 25 mL Wasser/Ethanol/THF suspendiert und mit 7.5 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 4.5 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Reaktionsmischung im Vakuum vom Lösemittel befreit und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.. Man erhielt 64.9 mg (93 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 6): Rt - 0.25 min; MS (ESIpos): m/z - 275 [M+H]+.
IptennedMjLL38
N-[31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-29-oxo-4,7,10,13,I 6,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan-l-oyl]-L-valyl-N5-carbamoyl-L-omithin
Figure imgf000301_0001
38.3 mg (0.14 mmol) von Tntermediat L37 wurden in 3.0 mL DMF vorgelegt und mit 96.4 mg (0.14 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)-N- {27- [(2,5-dioxop rrolidin- 1 -yl)oxyj- 27-oxo-3,6,9, 12, 15, 18,21 ,24-octaoxaheptacos- 1 -yl}propanamid und mit 39.0 uL (0.28 mmol) Trietliylamin versetzt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit 16.0 μΐ, (0.28 mmol) HOAc versetzt und direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 58.9 mg (45 % d. ri.) der Tiielverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.61 min; MS (ESIpos): m/z - 849 [M+H]+.
Intermediat L39
2-(Trimethy]si]yl)ethyl-(2-sulfany]ethyl)carbamat
Figure imgf000301_0002
300 mg (2.64 mmol) 2-Aminoeüianüiiolhydrochlorid (1 : 1) wurden in 3.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 668.0 mg (6.60 mmol)Triethylamin mit 719.1 mg (2.77 mmol) l-({[2- (Trimethyisiiyi)ethoxy]carbonyl} oxy)pyiTolidin-2,5-dion versetzt. Es wurde 2 Tage bei RT gerührt. (Dünnschiehtchromatographische Kontrolle: Dichlormethan Methanol = 100: 1.5) Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Einsatz der Verbindung ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe.
Intermedia* L40
N 31-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-29-oxo-4,7,10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriaeontan-l -oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysin
Figure imgf000302_0001
600 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol/THF (1 : 1 :0.5) mittels Palladium auf Kohle (10 %) bei RT unter Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Die Verbindung N6~(tert-Butoxyearhonyi)~L~lysin wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.99 min; MS (ESIpos): m/z - 247 [M+H]+.
180.0 mg (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L- lysin wurden in 5.0 L DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethyiamin versetzt. Es wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5- Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[(benzyloxy)carbonyl] -L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethyiamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0, 1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) der Verbindung N- [(Benzylox/)carbonyi]-L-valyi-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.97 min; MS (ESIpos): m/z - 480 j Xi - ü i . 272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20 rnL Ethylaceta Ethanol THF (1 : 1: 1) gelöst und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt und unter Normaldruck und bei RT mit Wasserstoff hydriert. Es wurde über Celite(R) filtriert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat/Ethanol/THF (1: 1: 1) gewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 182.0 mg (72 % d. Th.) der Verbindung L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.53 min; MS (ESI os): m/z - 346 [M+Hf.
30.0 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L -lysin und 46.1 mg (0.07 mmol) 3-(2,5- Dioxo-2,5-dihycho-lH-pyrrol-l -yl)-N- {27-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-27-oxo-
3,6,9,12,15,18,21 ,24~octaoxaheptacos-l ~yl}propanamid wurden in 1.5 mL DMF gelöst und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4-Methylmorpholin versetzt. Dir Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt, mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 1 0μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 55.6 mg (90 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R - 0.77 min; MS (ESIpos): m/z - 920 [M+H]+. Inteijgedjatj-41
N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7,l 0, 13-tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin
Figure imgf000304_0001
600 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyioxy)carbonyl]-N6-(ieri-buioxycarbonyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol/THF (1 : 1:0.5) mittels Palladium auf Kohle (10 %) bei RT unter Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Die Verbindung N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.99 min; MS (ESTpos): m/z - 247 [M+Hf ,
1 80.0 mg (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyi)-L-iysin wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5- Dioxopyrroäidin- 1 -yl-N-[(benzyloxy)carbony3]-L- valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT geröhrt. Die Reakiionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) der Verbindung N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.97 min; MS (ESlpos): m/z - 480 [M+H]+.
272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 20.0 mL Ethylacetat/Ethanoi/THF (1 : 1 : 1) gelöst und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt und unter Normaldruck und bei RT mit Wasserstoff hydriert. Es wurde über Celite'R) filtriert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat/Ethanol/THF (1 : 1 : 1) gewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 182.0 mg (72 % d. Th.) der Verbindung L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.53 min; MS (ESIpos): m/z - 346 [M+H]+.
30.0 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L4ysin und 34.3 mg (0.07 mmol) 3-(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-15-oxo-3,6,9,12- letraoxapentadec - 1 -yl} ropanamid wurden in LS mL DMF gelöst und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4- Methylmoipholin versetzt. Dir Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 ml/min, MeC /Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 40.6 mg (82 % d. Th.) der Titel verbindung. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.73 min; MS (ESIpos): m/z - 744 [M+H]+.
Intermediat L42
N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7,l 0, 13-tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oy 1] -L- valyl-N5 - carbamoy l-L-omithin
Figure imgf000305_0001
50.0 mg (0.18 mmol) L-Valyl-NS-carbamoyl-L-omithin (Intermediat L37) wurden in DMF vorgelegt und mit 93.6 mg (0.18 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l-yl)-N-{ 15-[(2,5- dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]- 15-oxo-3,6,9, 12-tetraoxapeniadec- l-yl}propanamid und 36.9 mg (0.37 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT über Nacht. Es wurden 21.9 mg (0.37 mmol) HOAc hinzugefügt und die Reaktionsmischung direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser). Die Löseinittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 20.6 mg (14 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.55 min; MS (ESIpos): m/z = 673 [M+H]+.
Intermediat L43
N-[67-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- l H-pyrrol-l-yl)-65-oxo-
4,7,10,13,16,19,22^5,28,31 ,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-icosaoxa-64-azaheptahexacont oyi] -L- valyl -N5 - carbamoy 1-L-oraithin
Figure imgf000306_0001
11.3 mg (0.04 mmol) L-Valyl- 5-carbamoyl-L-orniihin (Intermediat L37) wurden in DMF vorgelegt und mit 50.0 mg (0.04 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N- {63-[(2,5- choxopyirolidm-l-yl)oxy3-63-oxo-3,W
icosaoxatrihexacont- 1 -yl) ropanamid und 8.3 mg (0.08 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT über Nacht. Es wurden 4.9 mg (0.08 mmol) HOAc hinzugefügt und die Reaktionsmischung direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 15.8 mg (20 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 4): R, - 0.94 min; MS (ESIpos): m/z - 1377 [M+H]+. N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-p^
oyl]-L-valyl-L-alanin
Figure imgf000307_0001
73.3 mg (0.39 mmol) L-Valyl-L-alanin wurden in 7.0 rnL DMF gelöst und mit 200.0 mg (0.39 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]- 15-oxo- 3,6,9, 12-tetraoxapentadec- 1 -yl} ropanamid und 78.8 mg (0.78 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 3.3 mg (45 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.58 min; MS (ESTpos): m/z - 587 [M+Hf ,
Intermediat L45 tert-Butyl-(2S)-2-[(tert-butoxycarbonyi)aminoj-4-oxobutanoat
Figure imgf000307_0002
2.00 g (7.26 mmol) tert-Bi!tyl-N-(tert-butox /carbo /l)-L-homoserinat wurden in 90 ml Dichlormethan gelöst und dann mit 1.76 ml Pyridin sowie mit 4.62 g (10.90 mmol) 1 ,1,1- Triacetoxy- 1 lambda5,2-betiziodoxol-3(lH)-on (Dess-Martin-Periodinan) versetzt. Der Ansatz wurde 2 h bei RT gerührt, anschließend mit 200 ml Dichlormethan verdünnt und zweimal mit 10%- iger Natriumtiosulfat-Lösung und dann nacheinander zweimal mit 5%- iger Zitronensäure und zweimal mit gesättigter Natrium ydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt Die organische Phase wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit 100 ml Diethyiether und Cyclohecan (v/v=l : l) versetzt, etwas eingeengt, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel. Dieser wurde abgesaugt. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet, wobei 1.74 g (88% d. Th.) der Zielverbindung als hellgelbes Öl erhalten wurden.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.85 min; MS (ESIpos): m/z - 274 [M+Hf.
1H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 1.38 (s, 18H), 2.64-2.81 (m, 2H), 4.31 -4.36 (m, 1H), 7.23 (d, 1H), 9.59 (s, Iii).
Intermediat L46
Trifluoressigsäirre--tert-butyl-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)ethyl]-L-glutaminat(l : l)
Figure imgf000308_0001
Die Titel Verbindung wurde zunächst durch Kupplung von 200 mg (0.79 mmol) Trifluoressigsäure- -l-(2-aminoethyl)-lH-pyrrol-2,S-dion(l : l) mit 263 mg (0.87 mmol) (4S)-5-tert-Butoxy-4-[(tert- butoxycarbonyl)amino]-5-oxopentansäure-trifluoressigsäure(l :l) in Gegenwart von EDC/HOBT und /v.iV-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch lh Rühren in 1 0%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. Nach Gefriertrocknung aus Acetonitril/ Wasser wurden 85 mg (20% d.Th.) der Titel Verbindung über 2 Stufen erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.37 min; MS (ESIpos): m/z - 326 [M+H]4'. Isitermedisit L47
Trifluoressigsäure--beta-alanyl-L-alanyl-N5-carbamoyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihy(fr
yl)phenyl]-L-ornithinamid(l : 1)
Figure imgf000309_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Interaiediat L8 mit 2,5-Dioxopyrrolidin- (tert-butoxycarbonyl)-beta-alaninat und anschließender Enischüizung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): R, - 1.36 min; MS (ESIpos): m/z - 488 (M+H)+.
Intermediat L48
Trifluoressigsäure~(l R,2S)-2-amino-N- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)ethyl]cyclopentancarboxamid(l : 1 )
Figure imgf000309_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher ( 1 R, 2S)-2-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure in Analogie zu Intermediat L2 hergestellt.
LC-MS (Methode 3): R, - 1.22 min; MS (ESIpos): m/z - 252 (M+H)+
Intermediat 1.49
Trifluoressigsäuxe--tert-butyl-N^
Figure imgf000310_0001
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von kommerziell erhältlichem
Bromessigsäureanhydrid mit dem nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellten partiell geschützten Peptid tert-Butyi-L-valyl-L-alanyl-N*-(tert-butoxycarboriyl)-L- lysinat in Gegenwart von NN-Diisopropylemylamin in Dichlormethan hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Ammogruppe unter schonenden Bedingungen durch Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT, wobei in 49%-iger Ausbeute über 2 Stufen die Titel Verbindung erhalten wurde.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.09 min; MS (ESIpos): m/z - 593 und 595 (Μ+Η)+.
Intermcdiat L50
Trifluoressigsäirre--(lS,3R)-3-amino-N-[2-(2,5-(üoxo-2,5-(ühydro-lH^yrrol-l- yl)ethyl]cyclopentancarboxamid(l : 1)
Figure imgf000310_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lS,3R)-3-[(tert- Butoxycarrx»nyi)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure--l-(2-aminoeihyi)-lH-pynOl-2,5-dion( l: l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von N,N-I3iisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit ITA hergestellt. HPLC (Methode 11): R, - 0.2 min;
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 252 (M+H)+. Intermediat L51
Trifluoressigsäitre--(lR,3R)-3-amino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-di'hydro- lH-pyrrol- 1 - yi)ethyI]cyclopentancarboxamid(l : 1)
Figure imgf000311_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lR,3R)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure- 1 -(2-aminoethyl)- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1: 1) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart, von NJV-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): R, - 0.98 min; MS (ESIpos): m/z - 250 (M-H)\
Trifluoressigsäure --N-(2-aminoethyi)-2-bromacetarDid (1: 1)
Figure imgf000311_0002
420 mg (2.62 mmol) tert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat wurden in 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 81 7 mg (3.15 mmol) Bromessigsäureanhydrid sowie 913 μΐ (5.24 mmol) N,N-Diisopropylethylamin versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde duch präparative HPLC gereinigt Es wurden 577 mg der geschützten Zwischenstufe erhalten, die anschließend in 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 10 ml Trifluoressigsäure versetzt wurde. Nach 1 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Acenlonitril/Wasser lyophüisert. So wurden 705 mg (65% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 3): Rt - 0.34 min; MS (ESlpos): m/z - 181 und 183 (M+H)+. Intermediat 1.53
Trifluoressigsäure--(lS,3S)-3-amino-N-[2-(2,5-dioxo
yl)emyl]cyclopentancarboxarnid(l : 1)
Figure imgf000312_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lS,3S)-3-[(lert- ButoxycarbonyI)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure- 1 -(2-aminoethyl)- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1: 1) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NjV-Düsopropyletbylarnin und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.
HPLC (Methode 1 3 ): Rt - 0.19 min;
LC-MS (Methode 3): R, - 0.88 min; MS (ESlpos): m/z - 250 (M-H)\ Intermedia* L54
Trifli!oressigsäiire--(lR,3S)-3-am!no-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-py
yl)ethyl]cyclopentanearboxarnid(i : 1)
Figure imgf000313_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lR,3S)-3-[(tert- Butoxyca.rbonyi)aniino]cyclopenta.ncarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifli!oressigsäiire--l-(2-aniinoethyl)-lH-pyrrol-2,S-dion(l : l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Dnsopropylethylamin und anschließender Enischützung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 3): R, - 0.89 min; MS (ESlpos): m/z - 252 (M+H)+.
In ter media 1 1.55
Trifluoressigsäure--lert >ulyl-^
yljhexanoyl ]-L-valyl-L-alanyl} -L-lysinat (1 : 1)
Figure imgf000313_0002
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von Intermediat L6 mit N-(tert- Butoxycarbonyl)~D-aianin in Gegenwart von HATU und anschließender Entschützung an der Aminograppe unter schonenden Bedingungen durch 90 minütiges Rühren in 5%iger
Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. HPLC (Methode i 1): Rt - 1.35 min;
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.67 min; MS (ESIpos): m/z = 637 (M+H)+. Intermediat L56
Trifluoressigsäure -tert-bu1yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-diliydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl-N°- {[(lR,3S)-3-aminocyclopentyl]carbonyl}-L-lysinat (1 : 1)
Figure imgf000314_0001
Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von Intermediat L6 mit (lR,3S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyck)pentancarbonsäiire in Gegenwart von HATÜ und anschließender Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 15 minütiges Rühren in 25 -iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt.
HPLC (Methode 1 1 ): Rt = 1.4 min;
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.7 min; MS (ESIpos): m/z - 677 (M+H)\ Intermediat L57
Methyl-(2S)-4-oxo-2-( { 2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoat
Figure imgf000314_0002
500.0 mg (2.72 mmol) L-Asparaginsäuremethylester Hydroc orid und 706.3 mg (2.72 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl-2,5-dioxopyiTOlidin- 1 -carboxyiat wurden in 5.0 mL 1 ,4-Dioxan vorgelegt und mit 826.8 mg (8.17 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 583.9 mg (74 % d. Th.) der Verbindung (3S)-4-Methoxy-4-oxo-3-( {[2-(trimethykiiyl)ethoxy]carbonyl}amino) butansäure.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.89 min; MS (ESIneg): m/z - 290 (M-HV.
592.9 mg (3S)-4-Methoxy-4-oxo-3-( f[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butansäure wurden in 10,0 niL 1,2-Dimethoxyethan vorgelegt und auf -15 °C abgekühlt und mit 205.8 mg (2.04 mmol) 4-Methylmorpholin und 277.9 mg (2.04 mmol) lsobutyichlorformiat versetzt. Der Niederschlag wird nach 15 min abgesaugt und zweimal mit je 10.0 mL 1,2-Dimethoxyethan gewaschen. Das Filtrat wird auf -10 °C abgekühlt und mit 115.5 mg (3.05 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 10 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase je einmal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet, Man erhielt 53 5.9 mg (91 % d. Th.) der Verbindung Methyl-N- { [2-(trimethylsiiyl)ethoxy]carbonyl}-L-homoserinat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.87 min; MS (ESIpos): m/z - 278 (M+H)4'.
554.9 mg (2.00 mmol) Methyi-N- { [2-(trimethylsilyl)e1hoxy]carbonyl} -L-homoserinat wurden in 30.0 mL Dichiormethan vorgelegt und mit 1.27 g (3.0 mmol) Dess-Martin periodinan und 474.7 mg (6.00 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte über Nacht bei RT. Nach 4 h wurde der Ansatz mit Dichiormethan verdünnt und die organische Phase je dreimal mit 10%iger
Figure imgf000315_0001
10%iger Citronensäure-Lösung und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft, Man erhielt 565.7 mg (97 % d, Th.) der Titelverbindung.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 211), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, III).
2-(Trimethylsilyl)ethy!-(3-oxopropyi)carbamat
Figure imgf000316_0001
434.4 mg (5.78 mmol) 3-Amino-l-propanol und 1.50 g (5.78 mmol) 2-(Trimeihylsilyl)ethyl-2,5- dioxopyrrolidin-l-carboxylat wurden in 10.0 mL Dichlormethan gelöst und mit 585.3 mg (5.78 mmol) Triethylamin versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet, Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft, Der Rückstand 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-hydroxypropyl)carbaraat (996.4 mg, 79 % d. Th.) wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
807.0 mg (3.68 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-hydroxypropyl)carbamat wurden in 15.0 mL Chloroform und 15.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonat/0.05 N Natriumhydrogencarbonat-Lösung ( 1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 102.2 mg (0.37 mmol) Tetra-n-butylammoniumchlorid, 736.9 mg (5.52, mmol) N-Chlorsuccinimid und 57.5 mg (0.37 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt (890.3 mg).
Intermediat L59
Trifluoressigsäure--l- {2-[2-(2-ammoethoxy)emoxy]eÜiyi}-lH^yrrol-2,5-dion(l: l)
Figure imgf000316_0002
300.0 mg (0.91 mmol) tm-Butyl-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethoxy]ethoxy} ethyl)carbamat wurden in Dichlormethart vorgelegt und mit 4.2 g (36.54 mmol) TFA versetzt und 1 h bei RT gerührt (DC-Kon trolle: Dichlonnethan/Metlianol 10: 1). Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand viermal mit Dichlormethan kodestilliert. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.19 min; MS (ESIpos): m/z - 229 (M+H)+.
Intermediat L60
6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yijhexanoykhlorid
Figure imgf000317_0001
200.0 mg (0.95 mmol) 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexansäure wurden in 4.0 rnL Dichlorrneihan gelöst und mit 338.0 mg (2.84 mmol) Thionylchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei RT geröhrt und dann mit 1 Tropfen DMF vesetzt. Es wurde nochmal 1 h geröhrt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und es wurde dreimal mit Dichlormethan kodestilliert. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
Intermediat L61
Trifluoressigsäure --2-(trimethylsib/l)ethyl- -[6-(2,5-dioxo-2,5-dihyciro-lH-pyrrol- L-valyl-L-alanyl-L-lysinat (1 : 1)
Figure imgf000317_0002
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Befrzyloxy)earhonyl]-N6-(tert-butoxyearhonyl)-L-lysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-(Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Hydrogenolyse, Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und erneute Hydrogenolyse) das Tripeptidderivat 2 rimethylsilyl)ethyl-L- valy3-L-alanyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinat hergestellt. Die Titelverbindung wurde durch Kupplung dieses partiell gesciiützten Peptidderivats mit kommerziell erhältlicher 6-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexansäure in Gegenwart von HATU und iV,/v-Diisopropylethylamin hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 2.5 stündiges Rühren in 5%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT unter Erhalt der Esterschutzgruppe. Nach Aufarbeitung und Reinigung durch präparaiive HPLC wurden 438 mg der Titelverbindung erhalten.
HPLC (Methode 11 ): Rt - 1.69 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.78 min; MS (ESIpos): m/z - 610 (M+H)+.
Intermed^ L62
Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexa L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithyt-L-!ysinat (1:1)
Figure imgf000318_0001
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(ter{-butoxycarbonyl)-L-iysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie 2-(Trimelhylsilyl)ethyl-N6-(tert-buioxycarbonyi)-L- lysinat hergestellt. 148 mg (0.43 mmol) von diesem Intermediat wurden dann in Gegenwart von 195 mg (0.51 mmol) HATU und 149 μΕ NN-Diisopropylethylamin mit 200 mg (0.43 mmol) von Intermediat LI 6 gekuppelt. N ch Einengen und Reinigung des Rückstandes mittels präparativer HPLC wurde das geschützte Tntermediat in 20 mL DCM aufgenommen und durch Zugabe von 2 mL Trifluoressigsäure und 1 h Rühren bei RT die teil. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe abgelöst. Nach Einengen und LyOphiiisation des Rückstandes aus Acetonilril/ Wasser wurden 254 mg (63% d. Th. über 2 Stufen) erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 1.51 min;
LC-MS (Methode 1): R, - 0.68 min; MS (ESlpos): m/z = 696 (M+H)+.
IittgrinedMt_L63
(4S)-4- {[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-moxo-2,5-dihydro-lH-p rrol -yl)hexanoyl]amm
■ nethy lbutanoy 1] amino } propanoy 3 j amino } -5 - oxo -5 - [2 - (triniethylsilyl)ethoxyjpentansäure
Figure imgf000319_0001
Zunächst wurde ausgehend von (2S)-5-(Benzyloxy)-2-[(teri-butoxycarbonyl)aniino]-5- oxopentansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Abspaltung der Boc-Sehutzgruppe mit Trifluoressigsäure, Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und Hydrogenolyse in Methanol über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle) das Tripeptidderivat (4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-AroiDO-3-methylbuteDoyl]amino}propanoyl]ammo}-5- oxo-5-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]pentansäure hergestellt. Die Titelverbindung wurde durch Kupplung dieses partiell geschützten Peptidderivats mit kommerziell erhältlichem l - {6-[(2,5- Dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]-6-oxohexyl } - 1 H-pyrrol-2,5 -dion hergestellt. Nach Aufarbeitung und Reinigung durch präparative HPLC wurden 601 mg der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.96 min; MS (ESlpos): m/z - 611 (M+H . (4S)-4-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihyc^
penlansäure
Figure imgf000320_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von (2S)-5-(Benzyloxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5- oxopentansäure nach klassischen Methoden der Peptidcheroie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI DMAP, Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure, hydrogenolytische Spaltung des Benzylesters in Methanol über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle und Kupplung mit i - {2- [(2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]-2-oxoethyl} - lH-pyrro3-2,5-dion in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): t - 0.84 min; MS (ESIpos): tu/z = 385 (M+H)4'.
Intermedia* L65
Trifluoressigsäure— 2-(trimethylsilyl)ethyl-3- {[(benzyloxy)carbonyljamino} -L-alaninat (1 : 1)
Figure imgf000320_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 3- {[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-N-(tert- butoxycarbony!)-L-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. Man erhielt 373 mg (79 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R, - 0.72 min; MS (ESIpos): m/z - 339 (M+H)+.
In ter media t L66
Memyl-(8S)-8-(2-hydroxyethyl)-2,2<limeth^
Figure imgf000321_0001
1000 mg (2.84 mmol) (3S)-3-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-4-[(tert-butoxycarbonyi)ammo] butansäure wurden in 10.0 mL 1 ,2-Dimethoxyethan vorgelegt und mit 344.4 mg (3.4 mmol) 4- Methylmorpholm und 504 mg (3.69 mmol) Isobutylchlorfonniat versetzt. Nach 10min Rühren bei RT wurde der Ansatz auf 5°C abgekühlt und portionsweise mit 161 mg (4.2,6 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 3 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Nach 1 h erfolgte nochmals eine Zugabe der gleichen Menge an Natriumborhydrid und der Ansatz wurde anschließend langsam auf RT erwärmt. Es wurden 170 ml Wasser zugegeben und der Ansatz dann viermal mit jeweils 200 ml Ethylaeetat extrahiert. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase einmal mit Citronensäure und anschließend mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 760 mg (78 % d. Tb.) der Verbindung Benzyl-tert-butyl-[(2S)-4-hydroxybutan- 1 ,2-diyl]biscarbamat LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.84 min; MS (ESTpos): m/z - 339 (M+H)4,
760 mg (2.16 mmol) von diesem Tnter mediat wurden in 13 mi Chlonvasserstoff/Dioxan gelöst 20 min bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz auf 5 ml aufkonzentriert und mit Diethylether versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und aus Acetonitril/W asser 1 : 1 lyophilisiert.
Das so erhaltene Produkt wurde in 132 ml DMF gelöst und mit 345.5 mg (2.35 mmol) 4-Methoxy- 4-oxobutansäure, 970 mg (2.55 mmol) HATU und 1025 μΐ NN-Diisopropylethylamin versetzt. Die Mischung wurde 5 min bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der verbliebene Rückstand mittels präparativer HPLC gereinigt.. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Acetonitril im Vakuum abgedampft. Die verbleibende wässrige Phase wurde zweimal mit Etbylacetat extrahiert und die organische Phase anschließend einggengt und im Hochvakuum getrocknet.
Das so erhaltene Zwischenprodukt wurde in Methanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstof -Normaldraek hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiitriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.
247 mg von dieser entschützten Verbindung wurden in 2,0 ml DMF aufgenommen und mit 352 mg (1.36 mmol) l-({[2-(Trimemylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidiri-2,5-diori sowie 592 μΐ, Ν,Ν- Diisopropylethyiamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1h bei RT gerührt, anschließend eingeengt und der Rückstand mittles präparaliver HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt über diese 5 Reaktionsschritte in einer 21%-igen Gesamtausbeute 218 mg der Titelverbindung,
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.74 min; MS (ESTpos): m/z - 363 (M+H)4,
Intermediat L67
Trifluoressigsäure --2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)ethyl-beta-alaninat (1 : 1)
Figure imgf000322_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.354 mmol) von kommerziell erhältlichem 1- (2-Hydroxyethyl)-lH-py]Tol-2,5-dion durch Kupplung mit 134 mg (0.71 mmol) N-(tert- Butoxycarbonyl)-beta-alanin in 10 ml Dichlormethan in Gegenwart von 1 .5 Equivalenten EDCI und 0.1 Equivalent 4-N, Λ-Dimethylaminopyridin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.
Ausbeute: 56 mg (48% d. Th. über 2 Stufen)
LC-MS (Methode 3): Rt - 1 .1 5 min; MS (ESTpos): m/z - 213 (M+H)" Trifluoressigsäure--N-(2-ammoe1h^
Figure imgf000323_0001
Die Titelverbindimg wurde in Analogie zu Intermediat LI nach klassischen Methoden der Peptideheniie aus kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-di ydro- lH-pyrrol- 1 -yl)propansäure und tert-Butyl-(2-aminoethyl) carbamat hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.17 min; MS (ESlpos): m/z = 212 (M+H)+.
Trifluoressigsäure--l-[(benzyloxy)car^ (1: 1)
H. N /; 0
O
HN .
F
ΌΗ
F
O
o
H
H..C O o
Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptideheniie aus kommerziell erhältlichem Benzyl-4-hydroxypiperidin- 1 -carboxy lat durch Veresterung mit 2-(tert- Butoxycarbonyl)-N5-carbamoyl-L-oraithii! mittels EDCI/DMAP, anschließende Boc-Spaltung mit TFA, dann folgende Kupplung mit -[(tert.-Butoxy)carbonyll-L-valin in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin und schließlich erneute Boc- Abspaltung mit TFA hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): R, - 0.62 min; MS (ESlpos): m/z - 492 (M+H)"
Figure imgf000324_0001
1000.0 mg (3.36 mmol) 9H-F!uoren-9-ylmethyl-(3-liydroxypropyl)carbamat wurden in 35.0 mL Chloroform und 15.0 mL 0.05 N Kanumcarbonai/0.05 N Natriumhyxlrogenearbonat-Lösung (1: 1) vorgelegt. Dann wurden 93.5 mg (0.34 mmol) Tetra-n-butylammoniumchlorid, 673.6 mg (5.04 mmol) N-Chlorsuccinimid und 52.5 mg (0.34 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die Reakiionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCI-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyelohexan/Ethylaeetat 3: 1-1 :1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hociwakuum getrocknet. Man erhielt 589.4 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 6): Rt - 2.15 min; MS (ESTpos): m/z - 296 (M-H)\
Intermediat L71 tert-Butyl-[4-(chlorcarbonyl)phenyl]carbamat
Figure imgf000324_0002
100.0 mg (0,42 mmol) 4-[(tert-Butoxycarbonyl)annno]benzoesäure wurden in 2.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 64.2 mg (0.51 mmol) Oxalsäuredichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT 30 min (DC-Kontrolle: Dichlormethan/Methanol). Dann wurden nochmals 192.6 mg (1.53 mmol) Oxalsäuredichlorid und 1 Tropfen DMF zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand mehrmals mit Dichlormethan kodestilliert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.
Benzyl-(9S)-9-(hydroxymethyl)-2,2-dimethyl-6, 3 1 -dioxo-5-oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan- 14-oat
O H
N . ^OH
O
O CH,
H„C .
: si
O ' O CH,
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem Benzyl-tert-butyl-[(2S)-3- hydroxypropan- 1 ,2-diyl]biscarbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch hydrogenolytische Abspaltung der Z-Sehutzgruppe, anschließende Kupplung mit 4-(Benzyloxy)-4- oxobutansäure in Gegenwart von EDCI/HOBT, dann Abspaltung der Boe-Sehutzgruppe mit TFA und schließlich durch Umsetzung mit l -({[2-(Trimethylsilyl)ethoxyjcarbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5- dion in Gegenwart von Triethylamin hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.94 min; MS (ESIpos): m/z - 425 [M+H]+.
N-(2-aminoethyl)-6-(2,
Figure imgf000325_0001
Zu einer Lösung von 300 mg (1.87 mmol) tert-butyl (2-aminoetliyl)carbamat in 20 ml Dimethylformamid wurden 395.5 mg (1.87 mmol) 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1■ yl)hexansäure, 1.21 g ( 9.36 mmol) ,Ν-Diisopropyletliylamin und 854.3 mg (2.25 mmol) HATU zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 5 Minuten bei Rt gerührt. Nach Einengen der Mischung wurde der Rückstand in DCM aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abnitriert und eingeengt. Man erhielt 408 mg (33%, Reinheit 53%) der Titelverbindung, die ohne weitere Reinigung eingesetzt wurden.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.75 min; MS (ESlpos): m/z - 354 (M+H)+.
Zu einer Lösung von /eri-butyi (2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-i - yl)hexanoyl]ammo} ethyl)carbamat (408 mg, 0.365 mmol) in 7 ml dichlormethan wurde 1 ml ITA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 0.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde zweimal mit Dichlormethan kodestiiliert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 384 mg (94%, Reinheit 57%) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.26 min; MS (ESlpos): m/z - 254 (M+HV , Intermediat L74
Figure imgf000326_0001
107 mg (0.335 mmol) iert-bulyl 3-[2-[2-[2-(2-aminoetlioxy)eÜioxy]eÜioxy]eÜioxy]propanoat und 93 mg (0.369 mmol) (2,5-dioxopyrroiidin-l-yl) 2-(2,5-dioxopyrrol-l-yl)acetate wurden in 5 ml Dimethylfomiamid gelöst und mit 0.074 mL (0.671 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosü 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.i %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Ma erhielt 133 mg (86%, Reinheit 100%) tert-butyl 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l- yl)acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]etlioxy]propanoate.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.82 min; MS (ESlpos): m/z - 459 (M+H)+. Zu einer Lösung von ierf-butyl 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l- yl)ace1yl]ainino]e1hoxy]e1hoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate ( 130 mg, 0,284 mmol) in 5 ml dichlormethan wurde 0.5 ml TFA zugegeben. Das Reakiionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 102 mg (90%, Reinheit 100%) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.52 min; MS (ESIpos): m/z - 402 (M+H)+. Intermediat L75
Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-3- {[(benzyloxy)carbonyl]amino} -D-alaninat ( 1 : 1 )
Figure imgf000327_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 3- {[(Benzyioxy)carbonyl]amino} -N-(tert- butoxycarbonyl)-D-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. Man erhielt 405 mg (58 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.75 min; MS (ESIpos): m/z - 339 (M+H)+.
Intermediat L76
(2S)-2-Brom-4-oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]butansäure
Figure imgf000327_0002
Zunächst wurde ein geeignet geschütztes Asparaginsäurederivat ausgehend von (3S)-4- (Benzyloxy)-3-{[(benzyioxy)carboDyl]amino} -4-oxobutansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP und liydrogenolytisehe Abspaltung der Z-Schutzgrappe und des Benzylesters hergestellt),
470 mg (1.8 mmol) der so erhaltenen (2S)-2-Amino-4-oxo-4-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]butai!säure wurden in 10 ml Wasser suspendiert und mit 1.8 mL einer 1 molaren Salzsäure sowie 0.5 ml konzentrierter Schwefelsäure und anschließend mit 863 mg (7.25 mmol) Kaliumbromid versetzt. Dann wurden bei 10°C über einen Zeitraum von 30 min eine Lösung aus 150 mg (2.175 mmol) Natriumnitrii in 1 ml Wasser zugetropft und der Ansatz 2 h bei 10-15°C gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 50 mL Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit gesättigter Naüiumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch präparative HPLC mirden 260 mg (48% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 1.03 min; MS (ESIneg): m/z - 295 und 297 (M-H)\
'H-NMR (400 MHz, CDCb): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.95 (t, 2H), 2.94 und 3.2 (2dd, 2H), 4.3 8 (t, 2H), 4.57 (t, 1H).
Intermediat L77
Trifluoressigsäure --N-[2-(2-armnoethoxy)ethyl]-2-bromacetamid (1 : 1)
Figure imgf000328_0001
Zunächst wurden 418 mg (2.05 mmol) tert-Butyl~[2-(2-aminoethoxy)ethyl]carbamat mit 638 mg (2.46 mmol) Bromessigsäureanhydrid umgesetzt und anschließend die Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure entfernt. Man erhielt 551 mg (63 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode ): R, - 0.32 min; MS (ESIpos): m z - 227 und 225 (M+H)+. Intermediat L78 lS-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro H^yrro3-l-yl)acetyl]-beta-alanin
Figure imgf000329_0001
Die Titeiverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1H- pyrrol- 1 -yl)essigsäure durch Kupplung mit ert-Butyl-beta-alaninathydroclilorid (1: 1) i Gegenwart von EDCI/HOBt und NN-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäuie hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): , = 0.32 min; MS (ESTpos): m/z - 227 (M+H)+. Intermediat L79
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l -yl)hexanoyl]-beta-alanii
Figure imgf000329_0002
64.8 mg (0.357 mmol) ieri-Butyl-beta-alaDinathydrochlorid (1 : 1) und 1 00 mg (0.324 mmol) i- {6- [(2,5-Dioxopyrro]idin- l -yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst und mit 65.6 mg (0.649 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/Wasser/0.i TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 84.5 mg (77%, Reinheit 100%) ter^Butyl-N 6-(2,5-dioxo-2,5^ych(>lH^yrrol-l-yi)hexanoyi3-beta- alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.78 min; MS (ESIpos): m/z - 339 (M+H)+.
Zu einer Lösung von igr/-Bu1yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5^mydro-lH^yrrol-l-yl)hexanoyl3-beta- alaninat (82.8 mg, 0.244 mmol) in 8 ml dichlormethan wurde 1.62 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 62.7 mg (87%, Reinheit 95%) der Titeiverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.75 min; MS (ESIpos): m/z - 283 (M+H)+.
Intermediat L80
2-(Trimethylsilyl)ethyl-3-[(15-amino-4,7,l 0, 13-tetraoxapentadecan- 1 -oyl)amino]-lSä - (tert- butoxycarbonyl)-D-alanin
Figure imgf000330_0001
Die Titeiverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem 3- {[(Benzyloxy)carbonyl] amino) -N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanin --N-cyclohexylcyclohexanamin (1 : 1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Freisetzung aus dem Salz und Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCi/DMAP, hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, Kupplung mit kommerziell erhältlicher 3-Oxo- 1 -phenyl-2,7, 1 0,13, 16-pentaoxa-4-azanonadecan- 19-säure in Gegenwart von HATU und N, -Diisopropylethylamin und erneute hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.70 min; MS (ESIpos): m/z - 552 (M+H)4'. In ter media t L81
Trifluoressigsäure -benzyl- {2-[(2-aminoethyl)sulfonyl]ethyl} carbamat (1 : 1)
Figure imgf000330_0002
250 mg (1 ,1 1 mmol) 2,2'-Sulfonyldiethanamin wurden mit 92.3 mg (0.37 mmol) 1- {[(Benzyloxy)earbonyi] oxy}pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von , N-Diisopropylethylaniin in DMF gekuppelt. Nach anschließender HPLC Reinigung wurden 70 mg (47% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 257.11 (M+H)+.
Trifluoressigsäure N- {2-[2-(2-aminoethox )ethox ]ethyt} -6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - ylj exanamid (1 : 1 )
NH2
Figure imgf000331_0001
88.6 mg (0.357 mmol) N-Boe-2,2'-(ethylenedioxy)diethylamine und 100 mg (0.324 mmol) N- Succinimidyl 6-maleimidohexanoate wurden in 4.0 ml EHmethylformamid gelöst und mit 0.071 rnL (0.650 mmol) N-Methylmojpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosii 125x30; Ι Ομ, Fluss: 75 niL/min, MeC /Wasser/0.3 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 127 mg (81% d. Th) tert-Butyl- {2-[2-(2- {[6-(2,5-dioxo-2,5- dihydro- IH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]amino} ethoxylethoxyjethyl} carbamat.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.78 min; MS (ESIpos): m/z = 442 (M+H .
Zu einer Lösung von 123 mg (2,25 μηωΐ) tert-Butyl- {2-[2-(2- {[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)hexanoyl]amino} ethoxy)ethoxy]ethyl} carbamat in 7.5 ml dichlormethan wurde 2.0 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 1 1 1 mg (100% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.31 min; MS (ESIpos): m/z = 342 (M+H)+.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-4): δ [pp ] = 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.04 (m, 2H), 2.98 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.39 (m, 4H), 3,56 i m. 6H), 7.01 (s, 2H), 7.72 (bs, 3H), 7.80 (m, I i ! ). Intermediat L83
Trifluoressigsäuie N- {2-[2-(2-aminoetlioxy)eilioxy]eiliyl} -2-(2,5-dioxo-2,5-dihydio- lH-pyrroi- 1 - yl)acetamid (1 : 1)
Figure imgf000332_0001
200 mg (0.805 mmol) tert-Butyl-{2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl} carbamat, 150 mg (0.966 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydrolH-pyrrol- i -yl)essigsäure und 560 μί (3.2 mmol) N,N- Diisopropylethylamin wurden in 10 ml Dimethyiformamid gelöst und mit 459 mg (1,21 mmol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichloromethan gelöst. Die organische Phase wurde zweimal mit 5%iger Citronensäure -Lösung gewaschen, über Magnesium sulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, Dischloromethan: Methanol 98:2). Man erhielt 276 mg (89 % d. Th) tert-Butyl- {2-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l - y 1) ac ety 1 ] am ino } ethoxy) ethoxy] ethy 1 } c arbam at.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.67 min; MS (ESIpos): m/z - 386 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-Butyl- {2-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]ethyl}carbamat (275 mg, 714 μηιοΐ) in 15 ml dichiormetlian wurde 4 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei RT gerührt Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 281 mg (99% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.17 min; MS (ESIpos): m/z - 286 (M+H)+.
Intermediat L84
Trifluoressigsäure N-(14-amino-3, 6,9,12-tetraoxatetradec- 1 -yl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H- pyrrol- 1 -yl)hexanamid (1 : 1)
Figure imgf000333_0001
200 mg (0.594 mmol) tert-Butyl-(14-ainino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yi)carbamat und 202 mg (0.654 mmol) 1- {6-[(2,5-Dioxopyirolidin-l-yl)oxy]-6-oxohexyl} -lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 4.0 ml Dimethylfoimamid gelöst und mit 0.130 mL (1.2 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.085 ml (1.5 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/ in, MeCN/W asser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 275 mg (73% d. Tli) tert-Buryl-[21 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)- 16-oxo-3,6,9,l 2-teiraoxa- 15- azahenicos- 1 -yljearbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.81 min; MS (ESipos): m/z - 530 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-Butyl-[21 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-l 6-oxo-3,6,9, 12- tetraoxa-15-azahenicos-l-yl]carbamat (268 mg, 505 μιηοΐ) in 5.0 ml dichlormeihan wurde 780 μΐ (10 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aulgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 266 mg (97% d. Th) der Titel Ver indung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.46 min; MS (ESipos): m/z - 430 (M+HV ,
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 1.17 ( , 2H), 1.47 (m, 4H), 2.03 (m, 2H), 2.99 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 3.38 (m, 4H), 3,52 (rn, 8H), 3,58 (m, 6H), 7.01 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 7.80 (m, 1H).
Intermediat L8S
Trifluoressigsäure N-( 14-amino-3,6,9, 12-tetraoxatetradec- 1 -yl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H- pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 : 1)
Figure imgf000334_0001
200 mg (0.594 mmol) tm-Bu1yl-(14-airrino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)carbamat, I i i mg (0.713 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yi)essigsäure und 410 μΐ (2.4 mmol) N,N- Diisopropylethylamin wurden in 6 ml Dimethylformamid gelöst und mit 339 mg (0.892 mmol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/miri, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 130 mg (43% d. Th) tert-Bulyl-[17-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-p rrol- 1-yl)- 16-oxo- 3,6,9, 12-tetraoxa- 15-azaheptadec- 1 -yljcarbamal,
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.71 min; MS (ESIpos): m/z - 474 (M+H)+.
Zu einer Lösung tert-Bu1yi-[ 17-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-l 6-oxo-3 ,6,9,12-tetraoxa- 15-azaheptadec-l -yl]carbamat (126 mg, 267 μηιοΐ) in 4.0 ml Diclilormethan wurde 410 μί (5.3 mmol) ITA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 124 mg (95% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 33): Rt - 0.74 min; MS (ESIpos): m/z - 374 (M+H)+.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 2.99 (m, 2H), 3.22 ( , 2H), 3.41 (m, 2H), 3,53 (m, 8H), 3,58 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 7.09 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 8.21 (m, 1H).
Intermediat L86
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-
Figure imgf000334_0002
100 mg (0.531 mmol) L-Valyl-L-alaniri und 134 mg (0.531 mmol) l- {2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.150 mL (I .I mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 8 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; ίθμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 71.5 mg (41 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.42 min; MS (ESIpos): m/z - 326 (M+H)+.
Intermcdiat L87
3-[2-(2- {[(2,5-Dioxo-2,5-dihyd 1 -yl)acetyl]arriino} ethoxy)ethoxy]propansäure
Figure imgf000335_0001
250 mg (1 .07 mmol) tert-Butyl-3-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]propanoat, 151 mg (0.974 mmol) 2- (2,5-Dioxo-2,5-dihyciro-lH-pyrrol-l-yl)acetic acid, 224 mg (1.46 mmol) 1-Hydroxy-lH- benzotriazol Hydrat und 224 mg (1.17 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid wurden in 5.0 ml Dimethylformamid gelöst. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylacetat versetzt, zweimal mit 5%iger Citronensäure-LösuDg und mit ges. Natriumliydrogencarbonat-Lösung extrartiert. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen,, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde über die präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wassei7'0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 267 mg (64% d: Th) tert-Buty -3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino} ethoxy)ethoxy]propanoat.
LC-MS (Methode 3 ): Rt - 0.73 min; MS (ESIpos): m z = 371 (M+H)+.
Zu einer Lösung von tert-Butyl-3-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoat (263 mg, 710 μιηοί) in 10 ml diehlormethan wurde 1.1 ml (34 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 240 mg (94% d: Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 0.57 min; MS (ESIpos): m/z = 315 (M+H)+. Intermedia! L88
2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- aianinat
Figure imgf000336_0001
350 mg (0.797 mmol) L-Valyl-L-alanin und 246 mg (0.797 mmol) l - {6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl)oxy]-6-oxohexyl}-l H-pyrrol-2,5-dion wurden in 4.0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.220 rnL (1.6 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 302 mg (97 % d. Th.) N~[6~(2,5~Dioxo~2,5- dihydro-1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoylj~L~valyl-L-alanin.
LC-MS (Methode 32): Rt - 3.02 min; MS (ESIpos): m/z - 382 (M+H)+.
ί I N M (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 0.82 (dd, 6H), 3 .37 (m, 2H), 1.27 (d, 3H), 1.48 (m, 4H), 1.94 (m, 1H), 2.13 (m, 2H), 3.38 (t, 2H), 4.17 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 7.75 (d, 1H), 8.19 (d, 1H).
130 mg (0.531 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-va!yI-L-alanin wurden in 6.5 ml Dichloromethan gelöst und mit 58.8 mg (0.51 3 mmol) l -Hydroxypyrrolidm-2,5- dion und 78.4 mg (0.409 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid versetzt. 58.8 mg (0.51 1 mmol) l-Hydroxypyrrolidin-2,5-dion und 78.4 mg (0.409 mmol) l-(3- Dimethylamiriopropyl)-3-ethylcarbodiiniidl]ydrochlorid wurden nocheinmal zugegeben. Der Ansatz wurde mit Dichloromethan versetzt une dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 172 mg (87 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 12): Rt - 1.28 min; MS (ESIpos): m/z = 479 (M+H)+.
Intermedia* L89 l-Benzyl-5-[2-(trimethylsilyl)ethyl]-L-glutamathydrochlorid (1 : 1)
Figure imgf000337_0001
, Ci
H '
1.00 g (2.96 mmol) (4S)-5-(Benz loxy)-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5-oxopentai!säure wurden in 13.0 ml THF vorgelegt und mit 510 μΐ (3.6 mmol) 2-(Triniethylsilyl)ethanol und 109 mg (889 μηιοΐ)
4-Dimethylaminopyridin versetzt. Die Reaetionmisehung wurde auf 0°C gekühlt und mit 682 mg (3.56 mmol) N-Ethyl-N'-3-(dimethylamiDopropyl)carbodiimid hydrochlorid versetzt. Die Reaetionmisehung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die organische Phase wurde zweimal mit 0.1N HCi-Losung und ges. Natriumchlorid-Lösunggewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, CyclohexamEthylacetat 80:20). Man erhielt 649 mg (50 % d. Th) der Verbindung l-Benzyl-5-[2-(üimethylsily1)ethyl]-N-(tert-butoxycarbonyl)-L- LC-MS (Methode 1): R, - 4.6 min; MS (ESTpos): m/z - 438 (M+H)4.
649 mg (1.48 mmol) 1 -Benzyi-5-[2-(tiimethylsilyl)ethyl3-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-glutamat wurden in 7.0 ml Dioxan gelöst und unter Eisbadkühlung wurden 14 ml (59 mmol) 4N HCl in Dioxan dazugegeben. Die Reaetionmisehung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet und mittels Biotage isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, Dischloromethan:Methanol 90: 10). Man erhielt 320 mg (57 % d. Th) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.79 min; MS (ESIpos): m/z = 338 (M+H)4,
Intermediat L90
1 -({N-[(Benzyloxy)carbonyl]giycyi}amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-säure
Figure imgf000337_0002
118 mg (566 μηιοΐ) - [(Benzyloxy)carbonyl]glycin wurden in 5,0 ml DMF vorgelegt, mit 200 mg (622 μη-οΐ) tert-Buiyl-l -amino-3,6,9,i2-tetraoxapentadecan-i 5-oat, 130 mg (849 μπιοΐ) 1 - Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat und 130 mg (679 μηϊοί) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylearbodiimidhydrochlorid versetzt und 1 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylaeetat versetzt, zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung und mit ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung extrartiert. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen und. über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 274 mg (95% d. Th) tert-Butyä-l -( {N- [(benzyioxy)carbonyi]glycyl} amino)-3,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat.
LC-MS (Methode 12): Rt = 1.69 min; MS (ESIpos): m/z = 13 (M+H)+.
Zu einer Lösung von 274 mg (535 μmo!)tert-Bu1yl-l -({N-[(ber_^ylo y)carbonyl]glycyl}aImno)- 3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat in 5.0 ml dichlormethan wurde 820 μί (1 1 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.. Man erhielt 262 mg (100% d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.12 mm; MS (ESIpos): m z - 457 ·>'· · I i ) .
Intermediat L91
Trifluoressigsäure --2-(trimethykUyi)ethyl -{[3-amino-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanyl3amin^ 3,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat (1 : 1)
Figure imgf000338_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher 3-Oxo- 1 -phenyl-2,7, 1 0, 13,16- pentaoxa-4-azanonadecan-19-säure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-Trimethylsiiyletha.nol mittels EDCI/DMAP, hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, Kupplung mit kommerziell erhältlichem N -(tert-Butoxycarbonyl)-3-{[(9H-fluoren-9-ylmethoxy) carbonyl]ammo}-D-alanin und Abspaltung der Fmoc -Schutzgruppe) hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 552 (M+H)+.
N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin
Figure imgf000339_0001
Dieses intermediat wurde ausgehend von N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valin und tert-Butyl-L- alaninathydrochlorid (1:1) mit klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 323.16 (M+H)+.
Figure imgf000339_0002
Dieses intermediat wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt beginnend mit der Kupplung von 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L- valinat mit N5- Carbamoyl-L-ornithin, dann folgender hydrogenolytischer Abspaltlung der Z-Schutzgruppe über 10% Palladium/ Aktivkohle in Ethanol und schließlich, durch Umsetzung des erhaltenen Dipeptids mit 1 -Acetoxypyrrolidin-2,5-dion.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.25 min; MS (ESIpos): m/z - 317 (M+H)+.
1 -(2,5 -Dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yi)-2-oxo-6,9,l 2, 15,18,21 ,24,27-octaoxa-3-aza1xiacontan-
30-säure
Figure imgf000340_0001
Tert-But l- 1 -amino-3,6,9, 12, i 5, 18,21 ,24-octaoxaheptacosan-27-oat ( 100 mg, 201 μιηοΐ) wurde in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi- 1 -yl)essigsäure (46.8 mg, 301 μηιοί), 1 -Hydroxy- 1 H-benzotriazol Hydrat (76.9 mg, 502 μηιοΐ) und 1 -(3-Dimethylaminopropyi)- 3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (77.0 mg, 402 μτηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit Ethylacetat versetzt. Die organische Phase wurde zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung, mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und dann mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 19.1 mg (13% d. Th.) der Verbindung tert-Butyl- 1 -(2,5-dioxo-2,5-dibydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2-oxo 6,9, 12,15, 3 8,21 ,24,27-octaoxa-3-azatriacontari-30-oat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.87 min; MS (ESIpos): m/z - 635 [M+Hf
Zu einer Losung von tert-Butyl- 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)-2-oxo-
6,9,i2,15,18,21,24,27-ociaoxa-3-azatriacontan-30-oat (19.1 mg, 30.1 μηιοΐ) in 1.0 ml DCM wurde TFA (62 μΐ, 600 μηιοΐ) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt.
Man erhielt 1 0.8 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.55 min; MS (ESIneg): m/z - 577 [M-H]".
Intermcdiat L98
2,2-Diniethylpropansäure--2-(triniethy3si3y3)etliyi-N-(2-arninoetl
ethoxy]earbonyl} -L-glutaminat (3 : 1 )
Figure imgf000341_0001
Zunächst wurde (4S)-5-tert-Butoxy-4-[(tert-l3Utoxycarbonyl)airiino]-5-oxopentansäure in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin mit Benzyl-(2-aminoethyl)carbamat gekuppelt. Anschließend wurden mitteis Trifluoressigsäure in DCM die Boc-Schutzgruppe sowie der tert.-Butylester abgespalten. Dann wurde zunächst die Aminogruppe durch Umsetzung mit 1 - ({[2-(Trimethy]sily])ethoxy]carbonyl}oxy)pyiTo]idin-2,5-dion in DMF/'Wasser in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin und anschließend die Carboxygruppe durch Umsetzung mit 2- (Trimethylsilyl)ethanol in DCM in Gegenwart von F.DCI /DMAP erneut geschützt. Im letzten Schritt erfolgte die Entschützung der terminalen Aminogruppe mittels Hydrogenolyse über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in Ethanol unter Normaldruck. Nach Abfiltrieren des Katalysators, Einengen, Reinigung durch präparative HPLC und Gefriertrocknung des Rückstandes aus Acetomtril/Wasser wurde die Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.82 min; MS (ESIpos): m z = 434 (M+H)4'.
Intermediat L99
Trifluoressigsäure --2-(trimeihylsilyi)ethyl-N- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lIl-pyiTol-i-y valyl-L-alanyl-beta-alanyl-L-lysinat (1 : 1)
Figure imgf000342_0001
Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butox earbonyl)-L-iysir! nach klassischen Methoden der Peptidchemie 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N6-(tert-butoxycarbonyi)-L- lysinat hergestellt. Dieses Interrnediat wurde dann in Gegenwart von HA TU und NN-Diisopropyl- efhylamin mit dein nach Standardmethoden hergesteilten Tripeptidbaustein N-[(BenzyIoxy) carbonyi]-L-valyi-L-aianyi-beta-alanin gekuppelt. Die Z-Schutzgruppe wurde anschließend durch Hydrogenolyse in Methanol entfernt und das erhaltene Interrnediat mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- i -yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethyiamin gekuppelt. Im letzten Schritt erfolgte die Entschützung der Seitenkettenaminograppe unter schonenden Bedingungen durch ih Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT. Nach Einengen und GefHertrocknung aus AcetonitrilAVasser wurde die Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 625 (M+H)+.
Interrnediat LIPO
Figure imgf000342_0002
Zu einer Lösung von Methyl-3-cyanpropanoat Lösung (500 mg, 4.42 mmol) in 40 ml Ethanol was added 461 mg (6.60 mmol) Hydroxylammehydrochlorid und 1341.86 mg (13.26 mmol) Triethyla in. Das Reaktionsgemisch wurde bei 50 °C 3h gerühr Das Gemischt wurde eingeengt und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst und anschließend mit Wasser und Brine gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 400 mg (62% d. Th) der Titel Verbindung.
Zu einer Lösung von MeÜiyl-(4E)-4- {[N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alanyl]amino}-4- (hydroxyimino)butanoat (4.85 g, 33.19 mmol) in 120.0 ml ml Dioxan wurde 6.91 g (36,50 mmol) N-(tert-Butoxycarbonyl)-beta-alanin und 8.22 g (39.82 mmol) 1,3-Dicycioxexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 3h gerührt. Das Gemisch wurde eingeengt und der Rückstand wurde in Wasser gelöst und mit Ethylacetat extrahiert. Die organisch Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeent. Der Rückstand wurde mittels Flash- Chromatographie. Man erhielt 6.0 g (57% d.Th) der Titelverbindung.
Eine Lösung von Methyl-(4E)-4- {[N-(tert-butoxycarbonyl)-beta-alanyl]amino}-4- (hydroxyimino)butanoat ( 6.0g, 18.91 mmol) in 100 ml DMF wurde 5h bei 120 °C gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser versetzt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Nairiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 4 g (71% d. Th.) der Titel Verbindung.
Zur eine Lösung von 3-(5- {2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]ethyl}-l,2,4-oxadiazol-3- yl)propansäure ( 2.0 g, 7.01 mmol) in 30 ml Dichlormethan wurden 2.96 g (25.96 mmol) Trifluoressigsäure zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde lh bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser versetzt und extrahiert mit Diciilormethan. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne weitere reinigung eingesetzt. Man erhielt 3 .50 g (72% d. Tu.) der Titel Verbindung.
Zur eine Lösung von 3-[5-(2-Aminoethyi)-l»2,4-oxadiazoi-3-yl]proparisäure ( 1.5 g, 5.01 mmol) in 25 ml DMF wurden 1 .30 g (5.52 mmol) l-[2-(2,5-DioxopyrroHdin-l -yl)-2-oxoethyl]- lH-pyrrol- 2,5-dion und 1.52 g (15.04 mmol) Triethylmin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde lh bei rt gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser versetzt und extrahiert mit Dichlormethan. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 774 m g (47% d. Th.) der Titel Verbindung.
'H-NMR (300 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 2.67 (t, 2H), 2.91 i t. 2H), 3.03 (t, 2H), 3.46 (q, 2! i L 4.28 (s, 2H), 7.01 (s, 2H), 8.37 (t, IH), 32.28 (bs, IH).
Intermediat LI 23
Tert-Butyl-[ 1 -fluor-4-oxobutan-2-yl]carbamat
Figure imgf000344_0001
Unter Argon wurde Ethyl-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-fluorbutanoat (150 mg, 602 μηιοΐ) (Synth. Com., 1985, 15(5), 377) in 12.0 ml DCM vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde auf - 78°C abgekühlt, mit Diisobut lalumiaiumhydrid IM in Toluoi ( 1.2. ml, 1.0 M, 1.2 mmol) versetzt und 2 Stunde nachgerührt Der Ansatz wurde vorsichtig mit Methanol gequencht, 10min. nachgerührt und mit Ethylacetat verdünnt. Die organische Phase wurde dreimal mit ges. aliumnatriumtartrat-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 86, 1 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.
Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 1.37 (s, 9H), 2.58 (m, 2H), 4.18 (m, 1H), 4.31 (dd, 2H), 7.05 (d, 1H), 9.60 (s, 1H)
Interroediat LI 24
Tert-Butyl-N- {(2R)-2-amino-3-ox( 3-[2-(trimethyisiiyl)ethoxy]propyl}-Ni-(tert
L-asparaginat
Figure imgf000344_0002
4.0 g (13.8 mmol) Boc-Asp-OtBu und 1.8 g (15.2 mmol) N-hydroxysuccinimid wurden in 100 mL Ethyl Acetate gelöst und bei 0°C mit 3.1 g ( 15.2, mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei 0°C gerührt und dann über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann filtriert und im Vakuum verdampft. Man erhielt 4.1 g (77 % d. Th.) der Verbindung 1 -tert-Butyi-4-(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-aspartat. 3-Amino-N-[(benzyloxy)carbonylj-D-alanin (2,53 g, 10.6 mmol) wurde in 30 mL DMF gelöst und mit N,N-Diisopropylethylamin (2.74 g, 21.2 mmol) und l-tert-Butyl-4-(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)- N-(tert-butox carbonyl)-L-aspartat (4.10 g, 1 0.6 mmol) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und im Vakuum verdampft. Man erhielt 4.9 g (90 % d. Th.) der Verbindung (2R)-2-{[(Benz loxy)carbonyi]ammo}-3-({(3S)-4-tert-butoxy-3-[(tert- butox "carbonyl)amino] -4 - oxobutanoy 1 } amino)propansäure .
(2R)-2- {[(Benzyloxy)carbonyl]^
oxobutanoyl}amino)propansäure (4.90 g, 9.62 mmol) wurde in 100 ml of Acetonilril gelöst und mit Pyridin (1.6 ml, 19 mmol), 2-(Trimethylsilyl)ethanol (1.7 ml, 12 mmol) und Dicyclohexylcarbodiirnid (2.38 g, 1 1.5 mmol) bei RT versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 0°C gerührt und dann über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann filtriert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.9 g (66 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-N- {(2R)-2- {[(benzyloxy)carbonyl]armno}-3-oxo-3-[2-(trimetliylsilyl)ethoxy]propyl} -N2-(tert- butoxyearbonyl)-L-asparaginat,
Tert-Bu1y]-N-{(2R)-2- {[(benzyloxy)carbonyl]amino} -3-oxo-3-[2-(üimethylsilyl)ethoxy]propyl} -
N2-(tert-butoxycarbonyl)-L-asparaginat (3.80 g, 6.23 mmol) wurde in 3 20 ml Methanol gelöst und mit 380 mg Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 2 Stunde hydriert und dann filtriert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Man erhielt 2.9 g (84 % d. Th.) der Titel Verbindung
ί ί N M R (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 0.04 (s, 9H), 0.97 (m, 2H), 1.38 (s, 91 I i. 1.39 (s, 9H), 1.89 (bs, 2H), 2.43 (m, 1H), 3.18 (m, 3H), 3.38 (m, 1H), 4.1 1 (m, 3H), 6.93 (d, 1H), 7.91 (bt, 1H)
Intermediat L125
Trifluoressigsäure --tert-bi!tyl-N-(2-aminoethyl)-N2-(bromacetyl)-D-alpha-glutaniinat (1 : 1)
Figure imgf000345_0001
Dieses Intermediat wurde ausgehend von (2R)-2- {[(Benzyloxy)carbonyl]anrino} -5-tert-butoxy-5- oxopentansäure und tert-Butyl (2-arrnnoetrj.yl)carbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.49 min; MS (ESIpos): m/z - 366 und 368 (M+H)+.
Intermediat Fl 04
Trifluoressigsäure--(2S)-2-amino-4-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5 liflu^hen^^
dimethylpropyl} (glycoloyl)ammo]-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}eth l)butanamid(l : l)
Figure imgf000346_0001
30 mg (0.014 mmol) von intermediat C53 wurden in 3.3 mL DMF gelöst und mit 8.5 mg (0.027 mmol) von Intermediat LI sowie mit 7.8 mg (0.02 mmol) HATU und 12 μ! Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt. Der Ansatz wurde 1 5 min bei RT gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt und nach Lyophilisation wurden 5.6 mg (38% d. Th.) der geschützten Zwischsfufe erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 915 (M+HV ,
5.6 mg (0.006 mmol) dieses Intermediats wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 69 mg (0.61 mmol) 1 ,4-Diazahicyclo(2,2.2)octan versetzt. Der Ansatz wurde 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurden 35 μΐ Essigsäure zugegeben und der Ansatz im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 2.4 mg (48% d. Th.) der Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.84 min; MS (Elpos): m/z = 693 [M+Hf. HPLC (Methode i 1): Rt - 1.91 min;
Alternativ wurde die Titelverbindung auch ausgehend von Intermediat C58 hergestellt. 15 mg (0.023 mmol) von Intermediat C58 wurden zunächst mit 11 mg (0.036 mmol) Intermediat LI in Gegenwart von 13 mg ( 0.034 mmol) HATU sowie 10 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin umgesetzt. Nach 60 min Runren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 12.3 mg (63% d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten. ί C MS (Methode 3 ): Rt - 1.3 min; MS (EIpos): m/z = 837 [M+Hf.
Im zweiten Schritt wurde dieses Intermediat in 3 L 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiami:n-N,N,N',N!-tetraessigsäure sowie 2 mL einer 0.1%-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyopliilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 8.1 mg (68% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 693 (M+H)+. Intermediat Fl 19
Trifiuoressigsäure--(2S)-2-amino-4-[ {(i^
dimeuiylpropyl} (g 1 : 1)
Figure imgf000347_0001
29 mg (0.044 mmol) von Intermediat C58 wurden in 3.4 mL DMF aufgenommen und mit 36 mg (0.087 mmol) von Intermediat L52 sowie mit 25 mg ( 0.065 mmol) HATU und 19 μ] Ν,Ν- Diisopropylethyiamin versetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 26.4 mg (73% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten. LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 820 und 822 (M+H)+.
Dieses Intermediat wurde in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanot gelöst. Es wurden 6.5 mg (0.048 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C geröhrt. Dann wurden 13.9 mg (0.048 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N' etraessigsäuxe sowie 2 mL einer 0.1%-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus AcetonitrilAVasser wurden 14.4 mg (58% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 676 und 678 (M+H)+. Intermediat Fl 27
Trifluoressigsäure— (2S)-2-amino-4-( {(1R)- 1 -[ 1 -benz l-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl]-2,2- dimethylpropyl} [(2S)-2-meth^
yl)acetyl]amino}ethyl)butanamid (1: 1)
Figure imgf000348_0001
12 mg (0.015 mmol) von intermediat C59 wurden in 2.4 mL DMF gelöst und mit 14.6 mg (0.046 mmol) von intermediat Li sowie mit 6 mg (0.031 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylearbodiimid-Hydrochlond, 5.9 mg (0.039 mmol) 1 -Hydroxy- 3 //-benzotriazol- Hydrat und 8 μΐ
NN-Diisopropylethylamin versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. 11 mg (70% d. Th.) dieser Zwischenstufe wurden erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 942 (M+H) .
3 1 mg (0.01 1 mmol) dieses Intennediats wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 123 mg (1.1 mmol) 1 ,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan versetzt. Der Ansatz wurde 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurden 63 μΐ Essigsäure zugegeben und der Ansatz im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 2 mg (22% d, Th.) der Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ETpos): m/z - 721 [M+Hf .
HPLC (Methode 1 1): Rt = 1.95 min;
Intgrmgdjat j 53
Trifluoressigsäure --(2S)-2-arrnno-4-( {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo^
diniethylpropyl} [(2S)-2-hydroxypropanoyl]arnino)-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-d
yl)acetyl]ammo}ethyl)hutanamid (1 : 1)
Figure imgf000349_0001
Die Synthese erfolgte in Analogie zu Intennediat Fi 04 ausgehend von Intermediat C60.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.1 min; MS (ESIpos): m/z - 707 (M+H)+.
Intermediat F155 6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-i-[i-benzyi-4-(2,5-dinuoiphenyl)-iH-pyrrol-2-yl]-2
dimethylpropyl} (glycoloyl)aminojbutanoyl} -beta-alanyl)-N2- { -[6-(2,5-dioxo-2,S-dihydro- pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl } -L-lysin -trifluoressigsäure (1 : 1 )
Figure imgf000350_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 14 mg (0,019 mmol) des Intermedia!« C61 mit 15 mg (0.021 mmol) von Intermediat L61 in Gegenwart von 8,7 mg (0.023 mmol) HATU sowie 17 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben liergestelll. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 13 mg (59% d. Th. über 2 Stufen) der Titeiverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 3 ): Rt - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z - 1076 (M+H)+.
Intermediat F173
N 6-(2,5 >;oxo-2,5-dihydro-lH-pynOl -yl)hexanoyl] -valyl-L-alany
[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pw
butanoyl} amino)ethyl]-L-glutamin -tritluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000350_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von 15 mg (0.018 mmol) Intermediat C64 durch Kupplung mit 12 mg (0.02 mmol) von Intermediat L63 in Gegenwart von 7.7 mg ( 0.02, mmol) HATU sowie 16 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mittels Zirtkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat F I 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 12 mg (58% d. Th. über 2 Stufen) der Tiielverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.91 min; MS (EIpos): m/z - 1048 [M+Hf ,
Intermediat F178
Trifluoressigsäure--( ! R,2S)-2-({(2S)-2-amino^
p rrol-2-yl]-2,2-dimethy3propyl}(g3yco3oyl)ammo]butarjoyl}amirio)-N- {2-[(bromacetyl)amino] ethyl } cyclopentancarboxamid (1:1 )
Figure imgf000351_0001
Die Titelverbindung wurde in Anlogie zu Intermediat Fl 77 hergestellt, wobei an Stelle von Intermediat Li das Intermediat L52 eingesetzt wurde.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.89 min: MS (EIpos): m/z - 787 und 789 ; \M i i . Intermediat F180
N-[2-({(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)-l-[i-benzyi-4-^
dimethylpropyl} (glycoioyl)aminojbutanoyl} amino)ethyl]-N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]-L-glutamin -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000352_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 9.6 mg (0.012 mmol) Iniermediat C64 mit 5 mg (0.013 mmol) von Tntermediat L64 in Gegenwart von 7 mg ( 0.018 mmol) HA TU sowie 6 μ.1 Ν,Ν- Diisopropylethylamin und anschließender Entsc ützung mitteis Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat F l 19 besclirieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 3.1 mg (28% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.85 min; MS (EIpos): m/z - 822 [M+Hf .
Intermediat Fl 92
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( l R)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo hen l)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyi} -3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino} -L-
Figure imgf000352_0002
60mg (0.091 mmol) von Intermediat C58 wurden in 8 ml DMF aufgenommen und mit 45 mg (0.100 mmol) von Inlemiediat L65 in Gegenwart von 42 mg (0.11 mmol) HATU und 64 μΐ, Ν,Ν- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 10 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 45 min lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das
Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produict durch präparative HPLC gereinigt. Nach
Lyophilisation aus Aceionitril/Wasser 1 : 1 wurden 24.5 mg (31% d.Tli. über 2, Stufen) von 2-
(Trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-[(2S)-4-[ ^
yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)anrino]-2-(^
butanoylj-L-alaninat erhallen.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.17 min; MS (Elpes): m/z - 844 [M+Fff .
Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung von 10 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats mit 2 mg (0.013 mmol) von kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 - yl)essigsäure Intermediat in Gegenwart von 5.4 mg ( 0.014 mmol) HATU sowie 8 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanoi wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 3.5 mg (33% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.81 min; MS (ESlpos): m/z - 737 (M+H)+.
IntennedJfcjtJ 3
N- {"(2S)-2-Amino-4-[ { (1 R)- 1 -[ 1 ~benzyl~4~(2 difiuorphenyl)~ lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino} -D-alanin -trifluoressi säure (1 : 1)
Figure imgf000353_0001
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intermediat F192 ausgehend von 3- {[(Benzyloxyicarbonyljammo) -N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanin - N-cyclohexylcyclohexanamine (1 : 1).
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.87 min; MS (ESlpos): m/z - 737 (M+H)+. N-{5 (2,5-DioxopyrroHdm -yl)oxy]-5-oxo
difluoi henyl)-lH-pyrroI-2-yl]-2,2-dirnethylpropyl} (glycoloyl)amino]propyl}-L-alaninamid
Figure imgf000354_0001
Die Titelverhindung wurde ausgehend von Beispiel M9 zunächst durch Kupplung mit N- [(BeDzyloxy)carbonyi]-L-valyi-L-alanin in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropyiethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Sehutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt und das entschützte Interrnediat anschließend durch Umsetzung mit 1 ,Γ-[( 1 ,5-Dioxopentan- 1 ,5- diyl)bis(oxy)] dipyrrolidin-2,5-dion in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.19 min; MS (ESIpos): m/z - 851 [M+H
Interrnediat F207 6-(N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluo!phenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dirneihyipropyl}(giycoioyl)amino]butanoyl} "beia-alanyl)-N2- {N-[(
pyrrol-l-yl)acetyi]-L-valyl-L-alanyl}-L-lysin -trifluoressigsäure (1: 1)
Figure imgf000354_0002
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat F155 hergestellt. LC-MS (Methode 1): R, - 0.81 min; MS (ESIpos): m/z - 1020 (M+H)+.
S- {2-[(3-Aminopropyl) {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yll-2^
dimethylpropyl} ammo]-2-oxoethyl} -N-[ 19-(2,5-dioxo-2,5-dihydro IH-pyrrol- 1 -yl)-l 7-oxo- 4,7,10, 33-tetraoxa-16-azanonadeean-l-o l -L-c stein 3-beta-aianin -trifluoressi säure 1 : 1)
Figure imgf000355_0001
Unter Argon wurden 30.2 mg (0.06 mmol) N,N'-Bis[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystin in 2.0 mL Wasser und 2.0 mL wo-Propanol vorgelegt und mit 56.7 mg (0.20 mmol) TCEP versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Es wurden dann 50.0 mg (0.08 mmol) 2- (lYimethy1sily1)ethyl- {3-[ {(lR)-l-[l-benzy -4-(2,5-d
dimethytpropyl}(chloracetyl)arnino]propyl}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 2.0 mL iso- Propanol und 122.2 mg (0.48 mmol) l ,8-Diazabieyelo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmiscliung wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Dan wurden nochmals 122.2 mg (0.48 mmol) l ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lsg. extrahiert und mit ges. NaCi-Lsg. gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL,/nrin, MeC /W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.1 mg (64 % d. Th.) der Verbindung S-(l i- {(lR)-i-[i-Benzyl-4-(2,5-d!fluorohenyl)-lH-pynOl-2-yl]-2,2-dnneÜiylpropyl} -2,2-d
dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystein. LC-MS (Methode 1): R, - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z - 853 (M+H)+.
16.5 mg (0.05 mmol) 4-Methy1be:nzolsulfonsäure-benzy -beta-alaninat (1:1) wurden zusammen mit 14.0 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 1.5 ml, Acetonitril vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde 3 min bei RT gerührt und dann wurden 30.8 mg (0.04 mmol) S-(l l- {(1 R)- 1 -[l-Benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2^-dimethylpropyl } -2 dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystein gelöst in 1.5 mL Acetonitril, 23.4 mg (0.18 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethyiamin und 29.9 mg (0.05 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Benzyi-S-(11- { ( 1 R)~ H i -benzyi~4- (2,5 -dif luoq3heny^
dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cysteinyi-beta-alatnnat wurde als Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.59 min; MS (ESTpos): m/z - 1012 (M+H)+.
43.8 mg (43.3 μηιοί) Benzyl-S-(i l- {(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N- [(benzyloxy)carbonylj-L-cysteinyl-beia-alaninat wurden in 8.0 mL Ethanol gelöst, mit 4.4 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt und bei RT und Normaldruck über Nacht hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen wurde mit einem Ethanol nachgewaschen. Das Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde noch zweimal wie soeben beschrieben behandelt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 14.5 mg (37 % d. Th.) der Verbindung S-(l l -{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH- pyrrol-2-yll-2,2-dimethyipropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)- L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1 : 1 ).
LC-MS (Methode 1): R, - 1.08 min; MS (ESIpos): m/z - 788 (M+H)+.
14.5 mg (16.1 μη-οί) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5-d!f3uo henyl)-ίH-p rroί-2-y3]-2,2- dimethylpropyl}-2y2-dimetliyl-6,i2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cysteinyl-beta- alanin-trifluoressigsäure (1:1) wurden zusammen mit 9.1 mg (17.7 μιηοΐ) 3-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-N- (15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy3-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadec- l-yl}propanamid in 1 .0 rnL DMF vorgelegt und mit 4.9 mg (48.2 μηιοΐ) 4-Mefhylmorpholin versetzt. Die Reaktionsnuschung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 3.4 mg (0.06 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; ίθμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.9 mg (50 % d. Th.) der Verbindung S-(l l-{(iR)-l-[l-Benz i-4-(2,5-difluorpheriyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6 ,12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cysteinyl-beta- alanin-trifluoressigsäure (1 : 1).
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.28 min; MS (ESIpos): m/z = 1186 (M+H)+.
14.1 mg (11.9 μηιοί) S-(l l- {(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethytpropyl} ~2,2~dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silairidecan- 13-yl)-N-[ 19-(2,5- dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yi)-l 7~oxo-4,7, 10, 13-tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L- cysteinyl-beta-alanin-trifluoressigsäure (1 : 1) wurden in 3 .5 mL Trifluorethanol gelöst und mit 9.7 mg (71 .3 μ-ηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Es wurden nochmals 9.7 mg (71.3 μιτιοΐ) Zinkdichlorid zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Es wurden nochmals 9.7 mg (71 .3 μmol) Zinkdichlorid zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 70 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 2,0.8 mg (0.07 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 6.2 mg (44 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, = 0.82 min; MS (ESIpos): m z - 1042 (M+H)+.
Irctermeriiat F239
S- {2-[(3-Ammopropyl){(lR) -[l-benzyl-4-(2,5-difl^
dimeihylpropyl}amino]-2-oxoethyl) -N-[(2,5-dioxo-2,5-dihycho-lH-pyrroh - trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000358_0001
Unter Argon wurden 7.5 mg (0.05 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-I -yl)essigsäure in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 7.5 mg (0.05 mmol) HOB!, 35.5 mg (0.05 mmol) TBTU und 6.2 mg (0.05 mmol) Ν,Ν-Diisopropyletliylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. Es wurden dann 40.0 mg (0.05 mmol) S-(l l- {(lR)-l -[l -Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl) -2,2-dimethy 1-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-y 1)- L-cystein-trifluoressigsäure (1 : 1) (Intennediat C71) gelöst in 1.5 L DMF und 18.7 mg (0.14 mmol) N,N-Diisopropyiethylamin zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 1 .2 mg (25 % d. Th.) der Verbindung S-( l l- {(lR)-l -[ l -BOTzyl-4-(2,5-difluorp
2,2-dimethy -6,12-dioxo-5-oxa-7,1 3 -diaza-2-silatridecan-13-y )-N-[(2
pyrrol- 1 -yl)acetyl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.37 min; MS (ESIpos): m/z - 854 (M+H)+.
10.9 mg ( 12.8 μιηοΐ) S^l l- (lRH-[l-Ben^l^2^-difh^^
dimemylrtfopyl}-2,2-dimemyl-6,12-dioxo
2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)aceryl]-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluoretiianoi gelöst und mit 10.4 mg (76.6 umol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischling rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 22,4 mg (0.08 mmol) Ethylendiamm-N,N,N',N'-tetraessigsäi!re versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 7.5 mg (65 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 0.92 min; MS (ESTpos): m/z - 730 (M+H)+. Intermediat F240
Trifliioressigsäure--3-({2-[(3-anm
/lj-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoeÜiyl} sulfar.yl)-N-(2-{[(2
y 1) ac ety 1 ] amino ethy l)propan amid (1: 1)
Figure imgf000359_0001
27,5 mg (0.04 mmol) 1 l-{(lR)-l-[ I -Berizyi-4-(2,5-difluorpher!yl)-lH-pyrroi-2-yll-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden zusammen mit 15.9 mg (0.05 mmol) Trifluoressigsäure — N-(2- aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetamid (1:1) (Intermediat LI) in 1.8 l., Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 32.4 mg (0.31 mmol) ,N-Diisopropylethylamin zugegeben und 32.4 mg (0.05 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 L/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rücksiand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.9 mg (35 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[ 13- {(1 )-1-[1 -benzyl-4-(2,5-diQuorphenyl)- 1 H- pyrrol-2 -yl] -2 ,2 -dimethylpropyl } - 1 -(2 ,5 -dioxo-2 ,5 -dihydro- 1 H-pyiTol- 1 -yl)-2,7,12-trioxo-10-thia- 3 ,6, 13 -tri azahexadecan- 16-yl ] carbamat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.39 min; MS (ESIpos): m/z - 883 (M+H)+. 11.9 mg (0.01 mol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[13- {(1R)-1 -[l-benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH- pyrrol-2-yl]-2,2 iimethylpropy1}- I -^
3,6, 13-triazahexadecan- i 6-yl]carbamai wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.5 mg (0.04 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 11.8 mg (0.04 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäi!re versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.4 mg (60 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.75 min; MS (ESIpos): m z - 737 (M+H)+.
Intermediat F241
Trifluoressigsäure --(2S)■2-ammo■4-[{(lR)-l-[l-beΏz l-4-(2,5-difluoφhealyl)- iH- yrroi-2-yl]· dimethylprop l} (glycoioyl)amino]-N-(2- {[N-(broniacetyl)glycyl]amino} ethyl)butanarnid (1 : 1)
Figure imgf000360_0001
Die Titel Verbindung wurde aus Intermediat C66 durch Kupplung mit kommerziell erhältlichem 1 - (2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion und anschließender Deblockierung mit Zinkclorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.84 min; MS (ETpos): m/z - 733 und 735 [M+H]+. Intermediat F242
Trifluoressigsäure --(2S)-2-amino-4-[
Figure imgf000360_0002
dimethylpropyl} (glycoloyl)ammo]-N-(3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydiO-lH-pyriOl-l- yl)acetyl]amino}propyl)butanamid (1 : 1 )
Figure imgf000361_0001
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Interaiediat Fl 04. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 707 (M+H)4'. Intermediat F243
Trifluoressigsäure — (2S)-2-amino-4- [ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 dimethylpropyl} (giycoioyl)amino]-N-[2-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- IH-pyrroi- 1 - yl)acetyl]amino} ethoxy)ethyl]butanamid (1 : 1)
Figure imgf000361_0002
Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intermediat F242. LC-MS (Methode 1): R, - 0.81 min; MS (ESIpos): m/z - 737 (M+H)+. Intermediat F245
Trifluoressigsäure -->^{(2S)-2-ammo-4 {(lR) 1-benzyl-4-(2,5 h^^
2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]bu1yl } -N'~(2~ { [(2,5-dioxo-2,5-di ydro- lH-pyrrol-1 - y 1) ac ety 1 ] am in o } ethyl) suc ci n amid (1 : 1)
Figure imgf000362_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.0135 mmol) von Intermediat C65 mit 8 mg (0.027 mmol) von Intermediat LI in 8 ml DMF in Gegenwart von 15 mg ( 0.04 mmol) HATU sowie 9 μΐ N,N-DiisopropyleÜiylamin und anschließender Entschützung mit Zinkehlorid in Trifluorelhanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 8.8 mg (58% d. 'Iii. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 778 (M+H)+.
Intermediat F247
Trifluoressigsäure -methyl-4-[(2-{[2-({(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l^
lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino3bulanoyl}amino)ethy
oxoethyl)amino]-2-brom-4-oxobutanoat (1 : 1)
Figure imgf000362_0002
14 mg (0.03 8 mmol) von Intermediat C66 wurden in 14 ml. DCM gelöst und mit 10.1 mg (0.037 mmol) 2-Brom- 1 -etliylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP) sowie portionsweise mit insgesamt 250 μΐ Pyridin versetzt, wobei der pH-Wert zwischen 5 und 6 gehalten wurde. Dann wurde mit Essigsäure ein pH-Wert von 4 eingestellt, der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Lyophilisation und Trocknung wurden 4 mg (21% d.Th.) der geschützten Zwischenstufe erhalten, die anschließend mit Zinkchlorid an der Aniinofunktion entschützt wurde. Nach HPLC-Reinigung und Lyophilisation wurden 3 mg ( 72% d.Th.) der Titeiverbindung als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 805 und 807(M+H)+.
Intermediat F248
Trifluoressigsäure --(2S)-2-am!n()-4-[{(lR)-l -[l -·be z ί-4-·(2,5-·difluoφhe yl)■·lH··pyπΌί-2··yl]-2,2-· dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N- {2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l.H-pyrrol- 1 - yl)ethoxy]ethyl} tanamid ( 1 : 1 )
Figure imgf000363_0001
Die Titel Verbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.035 mmol) Intermediat C58 mit 5 mg (0.017 mmol) Intermediat L12 in Gegenwart von HATU und anschließende Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt. Es wurden 6.5 mg (52% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 680 (M+H)4'. Intermediat F254
Trifluoressigsäuie -methyl-(3S)-4-[(2- |[2-({(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-diQuor phenyl)-lH-pym)i-2-yI]-2,2-dimethylpro^ amino}-2- oxoethyl)ami -3-brom-4-oxobutanoat (1 : 1)
Figure imgf000364_0001
Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Interaiediat 247 durch Kupplung von 15 mg (0.02 mmol) intermediat C66 mit 21 mg (0.099 mmol) (2S)-2-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure, die wie in (J.Org.Chem. 200, 65, 517-522) beschrieben aus (2S)-2-Amino-4-methoxy-4- oxobutansäurehydrochlorid (1 : 1) synthetisiert wurde, hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 805 und 807(M+H)+.
IratermediatJ"25S
R'S-(N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10,13-tefraoxa-16-azanoDadecan- l -oy]]-L-alpha-glutamyl-S- {2-[(3-ammopropyl) {(lR)-l -[ l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrTol-2-y3]-2,2-dimetl"iylpropyl}amino]-2-oxoethy3})- homocystein-trifluoressigsäure (3 : 1 )
Figure imgf000365_0001
13.1 mg (0.04 mmol) (2S)-5-(Benzyloxy)-2- {[(benzyloxy)carbonyl]amino} -5-oxopentansäure wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt und mit 5.4 mg (0.04 mmol) HOBt, 1 1.4 mg (0.04 mmol) TBTU und 4.6 mg (0.04 mmol) N,N-Diisopropylethy3amin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 30.0 mg (0.04 mmol) R/S-(l l- {(lR)-l -[l -Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dime&ylpropyl}-2,2
homocystein-trifluoressigsäure(l : l) (Intermediat Cl l) gelöst in 12.9 mg (0.1 mmol) N,N~ Diisopropylethylamin und 1 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN ' Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 32 mg (73 %) der Verbindung 4-[2-[[(lR)- 3 -[l-benzyl-4-(2,5-difluoropheriyl)pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl- propyl]-[3-(2-1ximethy]sily]ethoxycarbonylamino)propyl]amino]-2-oxo-ethy]]sulfanyl-2-[[(2S)-5- ben_yloxy-2-(ber!zyloxycarbonylammo)-5-oxo-pentanoyl]amino]butansäure.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.53 min; MS (ESIpos): m/z - 1084 (M+H)\
41.4 mg (0.038 mmol) 4-[2-[[(lR) -[l-ben.yl-4-(2,5-difluorophenyl)pyrrol-2-yl]-2y2-dimetliy3- propyl]-[3-(2-trimethylsilylethoxycarbonylamino)propyl]amino]-2-oxo-ethyl]sulfanyl-2-[[(2S)-5- benzyloxy-2-(benzyloxycarbonylamino)-5-oxo-pentanoyl]aminojbi[tansäure wurde in 10 mL Ethanol, mit 4.2 mg Pd/C versetzt und mit Normaldruck hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen mit Ethanol nachgewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum ohne Erwärmen verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x40; ίθμ, Fluss: 50 mL min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 21 .1 mg (56 %) der Verbindung R/S-(L-alpha-Glutamyl-S-(l 1 - {(1R)-J .-[l-benzyl-4-(2,5- difluo^henyl)-lH-p rrol-2-yl3-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5 l -diaza-2- silatridecan- 13-yl))-homocystem -trifluoressigsäure (1 : 1 ).
LC-MS (Methode 1): R, - 1.11 min; MS (ESIpos): m/z - 860 (M+H)+.
20.4 mg (20.94 μηιοΐ) R/S-(L-aipha-Glutamyl-S-(l 1- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl))- homocystein -trifluoressigsäure (1 : 1) wurden zusammen mit 11.8 mg (23.04 μηιοΐ) 3-(2,5-Dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l -yl)oxy]- 15-oxo-3,6,9,12- tetraoxapentadec-l-yl}propanamid in 1.0 mL DMF vorgelegt und mit 4.2 mg (41.88 μιηοΐ) 4- Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 3.1 mg (0.05 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (36 %) der Verbindung R S-(N-[ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo 4,7, 10, 13-tetraoxa- 1 6-azanonadecan- 3 -oyl]-L-alpha-glutamyl-S-(l 1 - {(1R)- 1 -[1 -benzyl-4-(2,5- di fiuorphenyi) - 1 H-pyrroi-2 -yl]-2,2-dimethylpropyi} -2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5 - oxa-7, 11 -diaza-2- silatridecan- 13 -yl))-homocystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.66 min; MS (ESIpos): m/z - 1259 (M+H)+.
9.4 mg (7.47 μιηοΐ) R/S-(N 19-(2,5-33ioxo-2,5-^ydro-lH-pyrrol-l-yi)-17-oxo-4,7,10,13- tetraoxa-16-azanonadecan- l-oyl]~L~alpha~glutamyl-S~(l 1- 1(1 R)-i-[i-benzy l-4-(2, 5- dif!Uo 3henyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2- silatridecan-13-yl))-homocystein wurden in 1.5 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.1 mg (44.81 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.1 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 30 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; Ι Ομ, Fiuss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.9 mg (75 %) der Titelverbindung
LC-MS (Methode 1): R, - 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 1 1 14 (M+H)+. Trifluoressigsäure --N-{(2S)-2-amino-4-[{(lR) 1-benzyl-4-(2,5-^
2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)aminojbuiyl } -N'-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - y 1) ac etyl ] ami n o } ethoxy) ethy 1] suc ci n arnid (1: 1)
Figure imgf000367_0001
Die Tiielverbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.014 mmol) von Mermediat C65 und 9.6 mg (0.027 mmol) Trifluoressigsäure— -[2-(2-aminoethoxy)ethyl]-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-p rrol - 1 -yl)acet amid (1: 1) in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Düsopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat F l 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 8 mg (64% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 822 (M+H)+. IntgQnedjat F257
R- {2-[(3-Airdnopropyl) {(lR)-1 1-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl) H^yrrol-2-yl]-2,2- dimeihylpropyl) arnino]-2-oxoethyl} -N-[l 8-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yi)- 17-oxo- 4,7,10, 13-tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cystein- trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000368_0001
50.0 mg (0.06 mmol) R-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-dffl^^
dimethylpropyl} ~2,2~dimethyl-6 ,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2~silatridecan~13-yl)-L~eystein- trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermedia! C71) und 29 mg (0.07 mmol) 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5- dioxopyrrol- 1 -yl)acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]etrioxy]etrioxy]propansäure (Intermediat L74) wurden in 3.0 mL DMF gelöst und mit 27.3 mg (0.07 mmol) HATU und 23.3 mg (0.1 8 mmol)
Ν,Ν-Diisopropyiethyiamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde hei RT gerührt. Die
Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ,
Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 17.4 mg (26 %) der Verbindung R-(l I -
Figure imgf000368_0002
dioxo-5-oxa-7,l
Figure imgf000368_0003
oxo-4,7, 10, 3 3 -tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl]-L-cystem.
LC-MS (Methode 6): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 1101 (M+H)+.
17 mg (0.02 mmol) -(i l- {(l )-l- i-Benzyl-4-(2,5-dlfluo hellyl)-lH-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethyipropy!} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)- -[ 18-(2,5- dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yt)-l 7-oxo-4,7, 10, 13-tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-eystein wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.3 mg (0.05 mmol) Zinkdiclilorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 33.5 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-N.N.N'.N'-tetraessigsäuie versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.6 mg (46 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 957 (M+H)+. Intermediat F258
Trifluoressigsäure --(2S)~2-amino-4-[ {(lR)-l~[l ~benzyl-4~(2,5~di^^^^
dmiethylpropyl} (glycoloyl)amm^
oxopropyljbutanamid (1 : 1 )
Figure imgf000369_0001
Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Intermediat C58 mit Trifluoressigsäure -bertzyl- [2-(beta-alanylamino)ethyl]carbamat (1 : 1) mittels HATU, anschließender Hydrogenolyse, dann folgender Kupplung mit 1 -(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z - 747 und 749(M+H . Intermediat F259
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2 difluorphenyl)- 3 H-pyiTol-2-yl]-2,2-dimethyl propyi}(glycoloyi)ammo]butanoyl}-3- {P f-(bromacetyl)glycyl]amino}-D-alarii!i -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000369_0002
75mg (0.1 14 mmol) von Intermedia! C58 wurden in 12.5 ml DMF aufgenommen und mit 78 mg (0.171 mmol) von Intermediat L75 in Gegenwart, von 65 mg (0.3 1 mmol) HATU und 79 μΕ Ν,Ν- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 20 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Kataly sator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 wurden 63 mg (64% d.Th. über 2 Stufen) von 2-(Trimethylsilyl)ethyl-3- ammo-N-[(2S)-4-[ {(lR) -[l-benzyl-4-(2 d^^^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]c butanoyI]-D- alaninat erhalten,
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.16 min; MS (EIpos): m/z - 844 [M+Hf.
40 mg (0.047 mmol) von diesem Intermediat wurden dann wie oben beschrieben mit N- [(Benzyioxy)carbonyl]glycm in Gegenwart von HATU gekuppelt und anschließend erneut hydrogenolytisch entschützt.
Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung von 10 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats mit 7.7 mg (0.032 mmol) von kommerziell erhältlichem 1.-(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 4 μ.1 Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 1.3 mg der Titel Verbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.83 min; MS (ESlpos): m/z - 777 und 779 (M+H)+. IntennedMtJ360
N6-(N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)-1-[1 -benzyl-4 2,5-dmorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl } -beta-alany 1)-N2- {N- [(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l -yl)acetyl]-L-va]y]-L-alanyl}-L- lysin -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000371_0001
Die Tiielverbindung wurde in Analogie zu interniediat F155 hergestellt. LC-MS (Methode 1): Rt - 0.81 min; MS (ESIpos): m/z - 1020 (M+H)+. Intermediat F261
Trifluoressigsäure --(2S)-2-ainino-4-[{(lR) -[1 >eiizyl-4-(2,5^
dirnethylpiOpyl}(giy (1 : 1)
Figure imgf000371_0002
Die Titel Verbindung wurde durch Kupplung von 20 mg (0.03 mmol) Interniediat C58 mit 25.8 mg (0.061 mmol) Interniediat L77 in Gegenwart von HATÜ und anschließende Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt. Es wurden 11.9 mg (47% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 722 und 720 (M+H . Intermediat F262
S - {2- [(3 - Aminopropyl) { ( 1 R)-l - [ 1 -benzyi-4-(2 ,5 -difluoiphenyl)-lH-pyiTol-2-ylj-2,2- dimethylpropyi}amino]-2-oxoethyl} -N- {3-[2-(2- {[3-(2,5-dioxo-2,5-dmydro-lH-pyrrol-l- l)propanoyl]amino} ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000372_0001
30 mg (36 μτηοΐ) S- {2-[(3-Aminopropyl) {(1 )-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyiTol-2-yi]- 2,2-dimethylpr pyl}amino]-2-oxoethyi} -L-cystein -trifluoressigsäure ( 1 : 1 ) (Intermediat C71) wurden zusammen mit 16,9 mg (40 μηιοΐ) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydrolH-pyrrol- l-yl)-N-[2-(2- {3- [(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -y l)oxy ]-3 -oxopropoxy } ethoxy)ethy ijpropanamid in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 10,9 mg (108 μιηοΐ) 4-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 7.58 mg (0.13 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 33,4 mg (80 % d. Th.) der Verbindung S- ( 1 1 - {( 1 R)~ 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6,12~dioxo-5~oxa-7,l l
Figure imgf000372_0002
pyrrol- 1 -yl)propanoyl]amino} ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 1027 (M+H)+.
32.8 mg (32 μηιοί) S-(l 1- {(1R)-1■[ 1 -Ββιΐ2 1-4-(2,5^ίίΐΗθ ΐ!6ΐ!^)-1Η-ρ^οί-2-^]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N- {3-[2-(2-{[3- (2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)pro
wurden in 3.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 26.1 mg (192 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 h bei 50 °C, Die Reaktionsmischung wurde mit 56.0 mg (0.192 mmol) Ethyiendiamin-N,N,N',N'~teiraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 2,50x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 2,2.9 mg (71 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 883 (M+H)+.
Intermediat F263
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 3 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]-beta-aianyl-S- {2-[(3-amiriopropyl) {( 1 R)- 1 -[ 1 - benzyl-4-(2,5-difmo^lienyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimetliylpropyl} - trifiuoressigsäur
Figure imgf000373_0001
30.0 mg (0.036 mmol) R-( l l- {(l.R)-l -[ l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-eystein- trifiuoressigsäure (1 : 1 ) (intermediat C71) und 9.8 mg (0.04 mmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 3 H- pyrrol-l-y3)acetyl]~beta-aianin (Intermediat 1,78) wurden in 1.0 mJL DMF gelöst und mit 16.4 mg (0.04 mmol) HATU und 14.0 mg (0.1 1 mmol) NJM-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.2 mg (13 %) der Verbindung N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)acetyl]-beta-alanyl-S-(l i- {(iRH-^
dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatrideean- 13-yl)-L-cystein.
LC-MS (Methode 6): Rt = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 925 (M+H)+. 11.3 mg (0.01 1 mmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-diiiydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-beta-alanyl-S-(l W(1R)- l-[l -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimeihylOT
5-oxa-7,l I -diaza-2-siiatridecan-13-yl)-L-cystem wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.0 mg (0.04 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 Stunde bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 10.7 mg (0.04 mmol) FAljy3endiamin- ,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.4 mg (40 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 781 (M+H)+.
Intermediat F264
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydrolH-pyrroi- 1 -yl)hexanoyl] -beta-alanyl-S- {2-[(3-aminopropyl) {(1R)- 1^1 -benzyM-(2,5-difluc^henyl)- lH^yrrol-2-yi]-2,2-dimeihylpropyi}araino]-2-oxoethyl} -L- cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000374_0001
30.0 mg (0.036 mmol) R-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo hen l)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6 ,12-dioxo-5-oxa- 7, 11 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein- triiluoressigsäure (1:1) (Intermediat C71) und 12.2 mg (0.04 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yi)hexanoyl]-beta-a!anin (intermediat L79) wurden in 1.0 mL DMF gelöst und mit 16.4 mg (0.04 mmol) HATU und 14.0 mg (0.1 1 mmol) Ν, -Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 8.9 mg (24 %) der Verbindung N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- l H-pyrrol-l - yl)hexanoyl]-beta-alanyl-S-(l 1 -{(1 )-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difiuoφhenyί)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethy]-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatridecan- 13-y])-L-cystein.
LC-MS (Methode 6): R, - 1.38 min; MS (ESIpos): m/z - 983 (M+H)+.
15.3 mg (0.015 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro H^y^
{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5 -difluo henyl) H yIτol-2-yl]-2,2-dimeth lpropyl} -2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.3 mg (0.045 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 Stunde bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.5 mg (0.045 mmol) Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % ITA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/ Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.1 mg (62 %>) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1 ): R. = 0.92 min; MS (ESTpos): m/z - 837 (M+H)+.
Intermediat F265
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyi)-N- {(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl} -22-(2,5-dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-6, 17-dioxo- 30, 13-dioxa-3-thia- 7, 16-diazadocosa - 1 -amid (1 : 1)
Figure imgf000375_0001
30.0 tng (42.7 μηιοΐ) i l- {(lR)-l -[ l -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pynΌl-2- l]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimeihyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) und 25.3 mg (55.6 μηιοΐ) Trifluoressigsäure N- {2-[2-(2- aminoethoxy)ethoxy]ethy] } -6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanamid ( 1 : 1 ) (Intermediat L82) wurden in 1 .9 mL Aceton itril vorgelegt und mit 60 μί (340 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 33 μ! (56 μηιοί) 2,4,6-Tripropyl- 1 ,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid 50 % in Ethylacetat versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nach! bei RT nachgerührt Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben und die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 26.7 mg (60 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pynOl-2-y 1] -2,2 hmethylpropyH -26
dioxa-7-thia-4,l l ,20-triazahexacos-l-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.40 min; MS (ESIpos): m/z - 1025 (M+H)+.
25.3 mg (24.7 μιτιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 3 -yl)-5, 10,21 -trioxo- 14,17- dioxa-7-thia-4,l 1 ,20-triazahexacos-l -yljcarba at wurden in 2.0 mL TrifJuorethanol gelöst und mit 20.2 mg (348 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 43.3 mg (148 μηιοί) Etfiylendiamin- ,N,N!,N!-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 23.4 mg (95 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 881 (M+H)+.
Intennedjat F2 6
Trifluoressigsäure N~(3~aminopropyl)-N~ {(lR)~l~[l -benzyl~4-^
2,2-dimemylpropyl}-l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l-yl)-2,13-dioxo-6,9-dioxa-16-thia-3,1.2- diazaoctadecan- 1 8-amid (1 : 1 )
Figure imgf000377_0001
30.0 mg (0.043 mmol) 11- {(1 ) -[1-ΒβηζγΙ-4-(2 -άίηυο Κβην1) Η-ρνπ·οί-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza-2-silaheptadecan-17-säure (Intermediat C69) wurden zusammen mit 22.2 mg (0.056 mmol) Trifluoressigsäure N- (2-[2-(2- aminoethox )ethox ]ethyl} -2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 : 1) (Intermediat L83) in 1.9 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 60 μί (0.34 mmol) N,N-Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μ] (0.056 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 20.5 mg (49 % d. Th.) der Verbindung 2-
(Trme lsilyl)e 3-[19-{(1R)-H
dimethylpropyl) - l-(2,5-dioxo-2,5-di ydro-lH-pyrroi- 1 -yl)-2,l 3, 18-trioxo-6,9-dioxa- 16-thia- 3,12,19-iriazadocosan-22-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.38 min; MS (ESIpos): m/z - 969 (M+H)+.
19.1 mg (19.7 μηιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[19- {(1R)-1 -[l-benzyl-4-(2,5-dif]uorphenyl)-lH- pyrrol~2-yl]~2,2-dimethylpropy1} ~I ^^^^
dioxa-16-thia-3,12,19-triazadocosan-22-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 16.1 mg (1 18 μπιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 34.6 mg (3 18 μ-ηοΐ) Ethy3endiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerülirt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mlv'min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA), Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 13.9 mg (75 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 825 (M+H)+.
Int_^3B£dj tjF2iiZ
S-{2-[(3-Aminopropyl) {(1R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5-diflu^henyl) H^yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amitio]-2-oxoethyl} -N-[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-
6,9J2,15 etraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyl-beia-alanin -trifluoressigsäure 1: 1)
Figure imgf000378_0001
Unter Argon wurden 13.4 mg (33.3 μηιοΐ) l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-2-oxo- 6,9,12,35-tetraoxa-3-azaoctadecan-l 8-säure (Intermediat 1,74) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 9.3 μΐ (54.4 μηιοΐ) N,N-Diisopropyiethylamin und 12.6 mg (33.3 μηιοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. 25.0 mg (27.7 μηιοϊ) S-(i 1-{(1R)-1-[1-Benzyl- 4-(2,5-difluo henyί)-lH- rrol-2-yl]-2,2-d!memyί ro yl -2^-dimethyί-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 - diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1:1) (siehe Synthese Intermediat F216) gelöst in 4,7 μΐ (27.7 μτηοί) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 90 Minuten bei RT gerührt Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; Ι Ομ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.90 mg (19 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {(1R)-1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-m yrrol-2-yl]-2,2-dmleth lpropyl} -2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)-2,l 8- dioxo-6,9, 12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18~yi]-L-cysteinyi-beta-aianin.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.44 min; MS (ESIpos): m/z - 1 372 (M+H)+. 6,70 mg (5.71 μπιο3) S-(i 1 - {(1Κ)-1-[1-Βς·ηζγΙ-4-(2,5-(1ϊί1υο 1ις.ηγ1)-1 Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimetliylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 3 1 -diaza-2-silatrideean- 33-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo- 2,5-dihydro- I H-pyrroi- 1 -yl)-2,l 8-dioxo-6,9, i 2, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-yl]-L-cysteinyl- beta-alarrin wurden in 1.0 mL Trifluorethano! gelöst und mit 4.67 mg (34.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte I h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 10 mg (34.3 μπιοΐ) Ethyiendiamin- , ,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.4 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 1028 (M+H)+. Intermediat F268
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyi)-N- {(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl} -28-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 3 H-pyrrol- 1 -yl)-6,23-dioxo- 10.13,16, 19-tetraoxa- 3 -tili a-7,22-di azaoctacosan- 1 -amid (1 : 1)
Figure imgf000379_0001
30.0 mg (0.043 mmol) 1 1 - {( 3 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimeihyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l i -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermedia! C69) wurden zusammen mit 30.2 mg (0.056 mmol) Trifluoressigsäure N-(14-amino- 3,6,9, 32-tetraoxatetradec- 3 -yl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 3 -yl)hexanamid ( 3 : 3 ) (Intermediat L84) in 2.0 mL Aceloniüü vorgelegt. Dann wurden 60 μί (0,34 mmol) N,N- Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μΐ (0.056 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss:
50 mL min, MeC /W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wu den im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 27.9 mg (59 % d. Th.) der Verbindung
2-(Trimethylsilyl)e l-[4^
dmethylpropy!} -32-(2,5-diox< 2,5-dih^
7-thia-4, 11 ,26-triazadotriacont- 1 -yljcarbamat
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.41 min; MS (ESI os): m z - 1114 ( \M I ) .
25.6 mg (23.0 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[4- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pynOl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-32-^
14, r7,20,23-tetraoxa-7-thia-4,l 1 ,26-triazadotriacont-l -yljcarbamat wurden in 2.5 mL Trifluorethanol gelöst und mit 18.8 mg (138 μηιοΐ) Zmkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 40.3 mg (138 μτηοΐ) Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.3 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 22.2 mg (88 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.94 min; MS (ESIpos): m/z - 969 (M+H)+.
Intermediat F269
4- {[(8R,14R)-13-(3-Aminopropyl)-14-[l-benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-l-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)- 15,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10-ihia-3,6, 13-triazahexadecan-8- yljamino} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1: 1)
Figure imgf000381_0001
O
17.0 mg (0.0195 mmol) S-(l 1- {(1R)-1■[ 1 -Ββηζγ1-4-(2,5-<3ϊΑαο ΐ!αιγ1)-1Η-ργΓΓθ1-2- ΐ]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat C77) wurden zusammen mit 4.99 mg (0.0253 mmol) N-(2- Aminoetliyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-iH-pyiTol-i-yl)acetamid (Intemiediat LI) in 1.0 inL Acetonitril vorgelegt. Dann mirden 27 μΐ (0.16 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und 15 μΐ (0.025 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 L) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % T'FA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (46 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-4- {[(16R)-11- {(1R)-1-[1- be zyl-4-(2,5-diί!UOφhe yί)-lH- yπΌl-2-yl]-2,2-dimethyί ro yl}-23-(2
pyrrol- 3 -yl)-2,2-dimethyl-6,12, 17,22-tetraoxo-5-oxa- 14-thia-7,l 1 , 18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 16- yil amino } -4 - oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.47 min; MS (ESIpos): m/z = 1052 (M+H)+.
8.3 mg (7.89 μηιοΐ) tert-L utyi-4- {[(16R)-l l- {(lR)-l-[l-benz l-4-(2,5-difmo henyΓ)-lH-pym ί-2- ylj-2,2-dimethylpropyl} -23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-iH-pyiTol-l-yl)-2,^
tetraoxo-5 -oxa- 14-thia-7, 11 , 18,21 -teiraaza-2-silairicosan- 16-yi]amino} -4-oxobutanoat wurden in 1 ,0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.45 mg (47.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 6 h hei 50 °C. 6.45 mg (47.3 μ.ηιοί) Zinkdichiorid wurden zugegeben und die Reaktionsmisehung rührte über Nacht bei 50 °C Die Reaktionsmisehung wurde mit 27.7 mg (94.6 μηιοΐ) F.thylendia.niin-N, , ', '"tetraessigsäui'e versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.10 mg (14 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 852 (M+H)+.
Intermediat F270
Trifluoressigsäure --N-(3-aminopropyl)-N- {(l R)-l-[ l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyiTol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl} -N'-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTol-l - y 1) ac etyi] amino e thyl) suc cinamid (1 : 1 )
Figure imgf000382_0001
Unter Argon wurden 15.0 mg (22.9 μηιοί) 11- {(!Ι1)
Figure imgf000382_0002
2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2^-dimethyi-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silapentadeean- 15-säure (Intermediat C78) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.0 μΐ (45.8 μτηοΐ) N,N-Diisopropyleihylarnin und 10.4 mg (27.4 μηιοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT geröhrt. 8.54 mg (27.4 μητοΐ) Trifluoressigsäure -(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyri l-l- yl)acetamid (1 : 1) (intermediat LI) gelöst in 4.0 μΐ (22.9 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 Ii bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 14.7 mg (77 % d. Th.) der Verbindung 2- (Trimethylsilyl)emyl-[3-({(lR)- l -[ l -betizyl-4-(2,5-difluorphetiyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} {4-[(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiTOl- l -yl)ace1yl]a]Tiino}ethyl)amiiio]-4- oxobutanoyl}ammo)propyl]carbamat.
LC-MS (Methode 5): R, - 1.33 min; MS (ESIpos): m/z - 835 (M+H)+.
13.2 mg (15.8 μπιοΐ) 2-(Trime lsilyl)eihyl 3-({(lR) 1-benzyl-4-(2,5^fluoiphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {4-[(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino} eihyl)ammo]-4-oxobuianoyl} amino)propyljcarbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 12.9 mg (94.8 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 27.7 mg (94.6 μτηοΐ) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.9 mg (83 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.83 mim MS (ESTpos): m/z - 691 (M+H)+.
Intermediat F271
4- {[(20R,26R)-25-(3-Aminopropyl)-26-[l-ber^l-4-(2,5-dLfluoφhenyl) H yΓrol-2-yl] -(2,5- dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-27,27-dimethyl-2, 19,24-trioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-22-thia- 3, 18,25-iriazaoctacosan-20-yl]amino} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000383_0001
Unter Argon wurden 19.4 mg (22.2 μηιοΐ) S-(l 1 -{(l )-l-[l-BeDzyl-4-(2,5-difluorpheDyl)-lH- pynOl-2-yl]-2,2-dimethylp!Opyl}-2,2-dime1l!yl-6,l2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)- N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein (Interaiediat C77) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit 21.7 mg (44.4 μιηοΐ) Trifluoressigsäure --N-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l-yl)acetamid (1 : 1) (Intermediat L74), 12 μΐ (67 μη-οί) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 16.9 mg (44.4 μηιοΐ) HA TU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Ii bei RT gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.1 mg (66 % d. TL) der Verbindung tert-Butyl-4-{[(16R)-l l-{(lR)-l-[l-^^
dimethylpropyl} -35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-6, 12,17,34-tetraoxo- 5,21,24,27,30~pentaoxa-14-thia~7,l 1,18,33-tetraaza-2-siiapentetriacontan- 16-yl]amino} -4- oxobutanoat.
LC-MS (Methode 4): Rt - 1.79 min; MS (ESTpos): m/z - 1250 (M+ a)+.
3 8.1 mg ( 14.7 μ/mol) tert-Butyl-4-{[(16R)-l l-{(lR)-l -[l -beDzyl-4-(2,5-difluorplieDyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-6, 12,17,34- tetraoxo-5,21,24,27,30-pentaoxa- 14-thia-7,l 1 , 18,33 etraaza-2-silapenta1riacontan-l 6-yl]ammo} -4- oxobutanoat wurden in 2.0 rnL. Trifiuorethanol gelöst und mit 12.0 mg (88.4 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmisehung wurde mit 25.8 mg (88.4 μηιοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/ asser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 12.3 mg (73 % d. TL) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.87 min; MS (ESIpos): m z = 1 28 (M+H)+. Intermediat F272
Trifluoressigsäure — N-(3-aminopropyl)-N- {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorplienyl)- 1 H-pyrrol-2- yij-2,2-dimethy3propyi} -N'-[ 17^^
15-azalieptadec-i -yl]succinamid (1 : 1 )
Figure imgf000385_0001
Unter Argon wurden 15,0 mg (2,2.9 .umol) 11 - {(1R)- i -[l-Benzyl-4-(2,5-difluorpiienyl)-lH-p rrol- 2-yl]-2,2-dimeÜ!yipropyl}-2^-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,11 -diaza-2-si!aperitadecari- 15-säure (Intermediat C78) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.0 μ! (45.8 μπιοΓ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 10.4 mg (2,7.4 μηωΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 13.4 mg (27.4 μιηοΐ) Trifluoressigsäure N-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxateiradec-i-yl)-2-(2,5-dioxo-2,5- dihydro 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 : 1) (Intermediat L85) gelöst in 4.0 μΐ (22.9 μηιοί) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmisehung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAV asser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 15.8 mg (68 % d. Th.) der Verbindung
Figure imgf000385_0002
2,2-dimethylpropyi}-i -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyiTol-i-y
3,18,23 -triazahexacosan-26-yl]carbamat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.35 min; MS (ESIpos): m/z - 103 1 (M+H)+.
15.1 mg (14.9 μτηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[23- {(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l-yl)-2,19,22-trioxo-
6,9,i2,15-tetraoxa-3,18,23-triazahexacosan-26-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 12.2 mg (89.6 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmisehung röhrte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 26.2 mg (89.6 μιηοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.3 mg (70 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 0.88 min; MS (ESTpos): m/z - 867 (M+H)+. Intermediat F273
Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyl)-N-{(l )-l -[I -benz l-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-
2,2-dimethylpropyl}-l-(2,5-dioxo-2,5-dihy^
thia-3, 3 8-diazatetracosan-24-amid (1 : 1)
Figure imgf000386_0001
Unter Argon wurden 20.0 mg (28.5 μηιοί) 11 - {( i R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5 -dif-uoiphenyl)- lH-pyrroä- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2»2-dimethyi-6,I2-dioxo-5-oxa-14-thia-7,11 -diaza-2-silaheptadecan- 17- säure (Intermediai C69) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 10.0 μ! (57.0 μηιοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 13.0 mg (34,2 μιηοί) HATU versetzt. Die Reaktionsmischimg wurde 10 min bei RT gerührt. 16.7 mg (34.2 μηιοΐ) Trifluoressigsäure N-(14-amino-3,6,9,12- tetraoxatetradec- 1 -yl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yliacetamid (1 : 1) (intermediat L85) gelöst in 5.0 μΐ (28.5 μπιοΐ) Ν, -Diisopropylethyiamin und 1.0 ml, DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmisehung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.6 mg (62 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)etiiyl-[25- {(1R)-1 -[1 -benzyl-4- (2,,5 lifίuo henyl)■lH y:ίτo3"2■ylj"2,2 lirnethyl :ro^ - yl)-2,19,24-trioxo-6,9,12,15-teiraoxa-22-thia-3,i 8,25-triazaoctacosan-28-yl]carbamat
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.37 min; MS (ESIpos): m/z = 1057 (M+H)+.
17.1 mg (16.2 μπιοΐ) 2-(Trime1hyisiiyl)e i-[25- {(lR) ^l-ber^l-4-(2,5-dmuorphenyl)-lH- pyiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 6,9,12, 35-tetraoxa-22-thia-3, 1 8,25-triazaoctacosan-28-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifiuorethanol gelöst und mit 13.2 mg (97.0 μηιοί) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 28.4 mg (97.0 μηιοΐ) Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 3 Ομ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.80 mg (59 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.88 min; MS (ESI os): m/z - 913 (M+FTf .
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pynOl-l-yl)ace1yl]-L-valyl-L-alanyl-S-{2-[(3-ammopropyl) {
1 -[ 1 -henzyl-4-(2,5-difTuorphenyl)- lH~pyrrol-2~yl]-2,2-dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} -L- cystein -trifluoressi säure (1 : 1
Figure imgf000387_0001
33.9 mg (0.0167 mmol) S-( 3 l- {(lR)-l -[ l -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2- l]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dirnethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermedia! C71) wurden zusammen mit 7.07 mg (0.0217 mmol) N-[(2,5- Dioxo-2,5-di]iydro-lH-pyn"ol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L-alanin (Intermediat L86) in 2.0 mL Aceionitrii vorgelegt. Dann wurden 23 μΐ (0.13 mmol) Ν,Ν-Diisopropyiethylamin zugegeben und 13 μΐ (0.022 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die eaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säuie: Reprosü 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.70 mg (19 % d. Tli.) der Verbindung N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L- alanyl-S-(l 1 - {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-d!fluo hen l)-ί H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2- dimethyi-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silairidecan- 13-yl)-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 1024 (M+H)\
10.6 mg (10.3 pmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl-S-(l l-
{(lR)-l-[l-benzyI-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-py
dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluoreihanol gelöst und mit 8.46 mg (62.1 μηιοΐ) Zrnkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 18.1 mg (62.1 μηιοΐ) Ethy endiamin-lS^NjN^N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.60 mg (54 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 32): Rt - 1.69 min; MS (ESIpos): m/z - 880 (M+H)+. lütcrmcdiat F275
N-[3-({2-[(3-Ar nopiOpyl) {(lR)-l-[l^
dimeihylpiOpyl}amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)propanoylj-N-(2- {[(2,5
l-yl)acetyi]amino}ethyl)-L-aipha-glutamin -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000389_0001
39.0 tng (55.6 μπιοΐ) 1 1- {(1R)-1 -[ 1 -Ββηζγ1-4-(2,5-<3ϊΑαο ΐ!αιγ1)-1Η-ργπ·οί-2- ΐ]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-djmeihyl-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l i -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermedia! C69) wurden in 4.0 ml, DMF vorgelegt, mit 41.6 mg ( I I I μπϊοί) l -Benzyl-5-[2- (trimetliylsilyl)ethyl]-L-glutamathydrochiorid (1 : 1) (Iniermediat L89), 29 μΐ (170 μτηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 42.3 mg (I i i μηιοΐ) HATU versetzt und 1 Stunde bei RT nachgerührt. Die Reaktionsniischung wurde 1 Stunde bei RT geröhrt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 53.1 mg (93 % d. Th.) der Verbindung l-Benzyl-5-[2- (trimethylsilyl)e l]-N-^
dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 1 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-L- glutamat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.71 min; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+H]+
Unter Argon wurden 7.60 mg (33,9 μηιοΐ) Palladium(II)acetat in 3.0 ml Dichloromethan vorgelegt und mit 14 μΐ (100 μιηοΐ) Triethylarnin und 110 μί (680 μιηοΐ) Triethylsilan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min bei RT geröhrt und mit 69.2 mg (67.7 μιηοΐ) l-Benzyl-5-[2- (triniethylsilyl)eihyl]-N-(i 1 - {( 1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,1 7 -trioxo-5-oxa- 14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-L- glutamat gelöst in 3.0 mL Dic ormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischimg wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen mit DicMormethan nachgewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 38.4 mg (61 % d. Th.) der Verbindung (19S)-11-{(1R)-1-[1- Benzy l-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-p rrol-2-yl3-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12, 17-trioxo- 19- {3-oxo-3-[2-(üimethylsilyl)ethoxy]propyl} -5-oxa-14-thia-7,l l,18-triaza-2-silaicosan-20-säure. LC-MS (Methode 1): Rt - 1.53 min; MS (ESIpos): m/z - 931 (M+H)+.
10.0 mg (10.7 μηιοΐ) (19S)-1 l- {(lR)-l -[l -Benz d-4-(2,5-difluo hen l)-lH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2~dimethyl-6,12 ,17-trioxo-19- {3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl}-5- oxa-14-thia-7,l l,18-triaza-2-silaicosan-20-säure wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt, mit 6.73 mg (21.5 μιτιοΐ) N-(2-Aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l -yl)acetamid 2,2,2- trifluorethan-1 , 1 -diol (1 : 1 ) (Intermediat LI), 5.6 μΐ (32 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 8.3 7 mg (21.5 μηιοΐ) FLA TU versetzt und 1 Stunde bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunde bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.90 mg (58 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimeüiylsilyl)ethyl-N2-(l l- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difiuoiphenyl)-lFI-pyrrol-2-yl]-2,2-diniethylpropyl} -2,2-dimethy 1-6,12, 17-trioxo-5-oxa-14-thia- 7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)ac ety 1 ] amino } ethyt) -L - alpha- glutaminat .
LC-MS (Methode 1): R, - 1.57 min; MS (ESIpos): m z - 1 110 [M+Hf
6.90 mg (6.23 μιτιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N2-(l i - {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy3propyl}-2,2-dimethyl-6,12,3 7-trioxo-5-oxa- 34-thia-7,l 3 -diaza-2 - silaheptadecan- 37-yl)-N-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]amino} ethyl)-L-alpha- glutaminat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.1 mg (37.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 5.1 mg (37.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 5.1 mg (37.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 10.1 mg (74.4 μηιοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C und 72 h bei RT. Die Reaktionsmischung wurde mit 54.5 mg (186 μηιοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeC /Wasser, 0, 1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.4 mg (39 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 866 (M+H)+.
Int_^3B£dj tjF27
S- {2-[(3-Am!nopropyl) {(lR)-l-[l -benzyl-4^
dimethylpropyl}ammo]-2-oxoethyl}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihyd^
yl)acetyl]aniino}eihox eihoxy]propanoyl}-L-cystein -tri luoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000391_0001
Linter Argon wurden 9.08 mg (28.9 μπιοΐ) 3-[2-(2- {[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-py!Tol-l - yl)acetyl]amino} ethoxy)ethoxy]propansäure (Intermedia! L87) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.33 μΐ (48.2 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 11.0 mg (28.9 μιηοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 20.0 mg (27.7 μιηοΐ) S-(l 1 -{(1R)- 1-[1-Benzyl- 4-(2,5-difluorohenyl)-lH-pyCT^
diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1: 1) (Intermediat C71) gelöst in 4,67 μΐ (24.1 μτηοΓ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.70 mg (19 % d. Th.) der Verbindung S-(l l - {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yll-2,2-dimethylpropy1}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecaD- 13~yl)- N- {3-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l-yl)acetyl]aniino}e
cyste in. LC-MS (Methode 12): R, - 2.47 min; MS (ESIpos): xalz - 1013 (M+H)4
13.9 mg ( 13.7 μιηοΐ) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluo^
dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 liaza-2-silatridecan- 13-yl)-N- {3-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]ammo} ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein wurden in 2.0 ml, Trifluorethanol gelöst und mit 5.6 mg (41.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 Ii bei 50 °C. 5.6 mg (41.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 30 Minuten bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.1 mg (82.4 μηιοί) Ethylendiamin- ,N,N',N'-teiraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.8 mg (80 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 32): Rt - 1.58 min; MS (ESIpos): m/z - 869 (M+H)4. Intermediat F277
N 3-({2-[(3-Annnopropyl) {XlR)-1 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl) H^yrrol-2-yl]-2,2- dmethylpropyl}ammo]-2-oxoethyl}sxilf
trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000392_0001
8,90 mg (8.88 μηιοΐ) Trifiuoressigsäure 2-(trimetliyisiiyl)ethyl-3-amiDO-N-(l l-{(I R)-l-[l-benz l- 4-(2,5-difluorphenyr)-l H-pyrrol-2-yl ]-2,2-dirnethylpropy] }-2,2-dimethyl-6,l 2,17-trioxo-5-o a-14- lllia-7, l l -diaza-2-silahq)tadecan- 17-yl)-D-alanΓnat (1:1) (Intermediat C80) und 2.31 mg (9.77 μιηοΐ) I -(2-Bromacetoxy)pynolidin-2,5-dion wurden in 1 ml Dimethyifomiamid gelöst und mit 2.9 μΐ (27 μηιοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/O, l%TFA), Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.80 mg (65% d. Th.) der Verbinfung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1-{(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyTroi-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17 -trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-3- [(bromacetyl)aminoj-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.57 min; MS (ESIpos): m/z - 1008 (M+H)+.
5.80 mg (5.75 μπιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1- {(1 R)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-l H- pyrrol-2-yl]-2,2-d!methylpropyl}-2y2-dimethyi-6,12,17-teioxo-5-oxa-14-thia-7, l l-diaza-2- silabeptadecaD-17-yl)-3-[(bromace1yl)ami-no]-D-aianinat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 4.70 mg (34.5 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 4.70 mg (34.5 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 5 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 20.2 mg (69.0 μηιοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/mm, MeCN/Wasser, 0.1%, TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.70 mg (34 %> d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.90 min; MS (ESIpos): m/z - 764 (M+H)+.
Irctermeriiat F278
-[3-( {2-[(3- Aminopropyl) {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethy]propyl} ammo]-2-oxoethyl}sulfany])piOpanoyl]-3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- IH-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}-D-alanin -trifiuoressigsäure (1 : 1 )
Figure imgf000394_0001
30,0 mg (9.98 μιηοΐ) Trifluoressigsäure 2~(iriniethylsilyi)ethyi~3-a!riino-N-(l l -{(lR)-3 -[1-benzyl- 4-(2,5-difluorphe:nyl) H-pyrroW^^
thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-D-alaninat (1:1) (Intemiediat C80) und 2.77 mg (11.0 μηιοΓ) l-{2-[(2,5-ESoxopyrrolidin-i-yl)ox ]-2-oxoethyl}-lH-p rrol-2,5-dion wurden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3.3 μΐ (30 μηιοΐ) N-Methylmorpholm versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde mit 2.0 μΐ (35 μηιοΐ) Essigsaeure versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 rnL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.50 mg (54% d. Th.) der Verbinrung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1 - {(1 R)- 1-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2- yl]-2,2-cümethylpropyl}-2,2-dimethyl-^^
17-yl)-3-{[(2,5 lioxcH2,5-dihydro-lH^yrrol-l-yl)ace1yl]amino}-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): R, = 1.51 min; MS (ESIpos): m/z - 1 24 (M+H)+.
5.50 mg (5.36 μηιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyi-N-(l 1■ {(1R)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yi]-2,2,-dimethy3propyi -2,,2 liinethyl-6,12,17 r l-diaza-2- silaheptadecan- 17-yl ) -3 - { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)acetyl]amino} -D-alaninat wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 4.39 mg (32.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmisehung rührte 1 h bei 50 °C. 4.39 mg (32.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmisehung rührte 1 h bei 50 °C. . 4.39 mg (32.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischimg röhrte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 28.2 mg (96.5 μτηοΐ) Ethyiendiamin-N, , ', '-tetraessigsäure versetzt, 10 min geriihrt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.70 mg (56 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 781 (M+H)+. Intermediat F279
N 6-(2,5-Dioxo-2,5-dmydro H^yrrol-l-yl)te^
difiuo he yl)-l H yrrol-2-yί]-2,2-dimeΐhyl ro yί} [( {(2R)-2-c rboxy'-2-[(3
earbox ropanoyi)amino]ethyi}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-aianinamid
Figure imgf000395_0001
12.2 mg (14 μτηοΐ) 8-(11 -{(^)-1-[1-Β6ηζγΙ-4-(2,5-ώΑυο Λεηγί)-1Η-ργιτο1-2-γ1]-2,2- dimethyipropyi} -2y2-dimethyl-6,I2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystem (Intermedia! C77) wurden in 2.0 inL Trifluorethanol gelöst und mit 11.4 mg (83.8 μχηοί) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.5 mg (83.8 μηιοί) Ethylendiamm-N,N,N',N'-tetraessigsäi!re versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.60 mg (42 % d. Th.) der Verbindung 4-{[(lR)-2-({2-[(3- Amino ro yl) {(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluo hen l)- lH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)- 1 -carboxyethy]]amino} -4-oxobutansäure trifluoressigsäure ( 1 : 1 ).
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 673 (M+H)+.
10.0 mg (12.7 μιηοΐ) 4- {[(iR)-2-({2-[(3-Ammopropy
lH-pyrrol-2-ylj-2,2<iimethylpropyl}a
oxobutansäure -trifluoressigsäure ( 1 : 1) und 7.41 rng (12.7 μηιοΐ) 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yi)liexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (Intermedia! L88) wurden in 1 ,5 ml Dimethylformamid gelöst und mit 4.4 μΐ (25 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerülrri. Die Reaktionsmischung wurde mit 2.0 μΐ (35 μηιοΐ) Essigsaeure versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.20 mg (39% d. Th.) der Titel Verbinfung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.11 min; MS (ESTpos): m/z - 1036 (M+H)+.
Intermediat F280
Trifluoressigsäure ~N-[2-( {(2S)-2-amino-4-[ {(1 R)- 1 -[ 1
Figure imgf000396_0001
yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)e1hyl]-3
pyrrol- 1 -yl)benzamid (1 : 1 )
Figure imgf000396_0002
Die Titelverbindung wurde ausgehend von intermediat C64 durch Kupplung mit kommerziell erhältlichem l -(3- {[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]earbonyl}pheny])-lH-pyrrol-2,5-diori und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 755 (M+H)+. Intermediat F281 ~ {(2S)-2~Ammo~4 {(iR)~Hl-henzyl-4-(2
dimemylpropyl}(glycoloyl)amino]ta
trifluoressigsäure
Figure imgf000397_0001
Zunächst wurden die modifizierten Aminosäurebausteine N-(Bromacetyl)-beta-aianin sowie 2- ( rimethyisiiyi)ethyl-3-amino-N-(tert-butoxycarbonyi)-D-alaninat nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Anschließend wurden diese in Gegenwart von HATU und Morpholin miteinander gekuppelt. Dann wurde mittels 10%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgxuppe abgelöst und so das intermediat 2-(Trimethy1sily1) ethyl-3-{[N- (bromacetyl)-beta-a]any]]amino} -D-alaninat erhalten.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Enlschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.87 min; MS (ESIpos): m z = 791 und 793 (M+H)+.
Intermediat F282
Trifluoressigsäure --(2S)-2-amino-4-[ {(lR)-I -[I -benzyi-4-(2,5-difluoiphenyl)-iH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropy!}(glycoioy!)atm^o]^ (1 : 1)
Figure imgf000398_0001
Zunächst wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von tert-Butylglycinat und Bromessigsäureanhydrid das Intermediat Trifluoressigsäure ~~ -(3-aminopropyl)- 2~ (bromacetyl)giycinairiid (1 :1) hergestellt.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Entschuldung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): R* = 0.83 min; MS (ESIpos): m z - 747 und 749 (M+H)"
Intermediat F283
N-[(2R)~2~( { (2S)-2-Amino-4-[ {( 1 R)~ 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloy l)amino]butanoyl}amino)-2-carboxyethyl]-N'-(bromacetyl)-L-alpha- asparagin -trifluoressigsäure (1: 1)
Figure imgf000398_0002
Zunächst wurde ausgehend von (2S)-2-Ainin<>4-oxo-4-[2-(irimeli!ylsilyi)ethoxy]butansäure und Bromessigsäureanhydrid der modifizierten Aminosäurebaustein (2S)-2-[(Bromacetyl)amino] -4- oxo-4-[2-(triniethylsilyl)ethox /]butansäure sowie ausgehend von komnierzieli erhältlichem 3- {[(Benzyioxy)carbonyI]aniino} - -(tert-butoxycarbonyI)-D-alanm ~ N-cyclohexyicyciohexanamin (1 : 1) der Aminosäurebaustein 2-(TrimethyLsüyt)ethyl-3-amin^
hergestellt. Beide Bausteine wurden in Gegenwart von HATU und Morpholin miteinander gekuppelt und anschließend wurde mittels 5%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgrappe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppen abgelöst und so das Interrnediat Trifluoressigsäure -2-(trimethylsiiyi)ethyl-N-{(2R)-2-am!no-3-oxo-3-[2-
(trimethylsilyl)ethoxy] propyl}-N2-(bromacetyl)-L-alpha-asparaginat (1: 1) erhalten.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses lntermediats mit interrnediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.84 min; MS (ESTpos): m/z - 835 und 837 (M+H)+.
Interrnediat F284
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)- i -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yi3-2,2- dimethylpropyl} (glycoloy Daminojbutanoy 1} -3- { [ 1 -(2,5 -dioxo-2, 5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18- dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]ammo) -D-alanin -trifluoressigsäure (1:1)
Figure imgf000399_0001
Zunächst wurde Interrnediat L80 mit kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- l-yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin gekuppelt und anschließend wurde mittels 16%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgrappe unter Erhalt der Siiyiethytester-Schutzgrappe abgelöst. Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediai C58 in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 12): R, - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 984.45 (M+H)+.
Intermediat F285
N- {'(2S)-2-Amino-4-[ { (1 R)- 1 -[ 1 -berizyl-4-(2,5-difluorphenyl)- l H-pyrrol~2-yi]~2,2~
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3-[( 1 8-brom- 17-oxo-4,7, 10, 13-tetraoxa- 16- azaoctadecan-1 -oyl)amino] -D-alanin -trifluoressigsäure ( 1 : 3 )
Figure imgf000400_0001
Zunächst wurde Intermediat L80 mit kommerziell erhältlichem Bromessigsäureanhydrid acylieri und anschließend wurde mittels 20%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppe abgelöst.
Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.85 min; MS (ESIpos): m/z - 967 und 969 (M+H)+. Intermediat F286 l-[(N-{(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l -[l -bra^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3- {[(2,5-dioxo-2,5-di ydro-lH-pyrrol-l -yl) acelyljami -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000401_0001
Zunächst wurde Intermediat L91 mit (2,5-Dioxo-2,5-di ydro- lH-pyrrol- 1 -yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin gekuppelt und anschließend wurde mit 12.5%-iger TFA in DCM die Boc-Schutzgruppe abgelöst. Das so erhaltene Intermediat wurde mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin gekuppelt und anschlieiknd durch Entschützung mit Zinkchlorid in die Titelverbindung überfuhrt.
LC-MS (Methode 3 ): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): m/z - 984 (M+H)4'.
Intermediat F288
N- {(2S)-2-Ammo-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl3-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3 -( {N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 - yl)acetyl]-L-seryl} amino)-D-alanin -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000402_0001
35 mg (39 μηιοΐ) von Inlermediat C74 wurden in Gegenwart von HATÜ und N, N- Diisopropyethylamin mit N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydiO-lH-pyrrol-i-yI)aceiyl]-L-serin gekuppelt, das zuvor ausgehend von tert-Butyl-O-tert-butyl-L-serinat und (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)essigsäure hergestellt wurde. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 14 mg (38% d. T'h.) der 'T'itelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.43 min; MS (ESIpos): m/z - 824.34 (M+H)+. Intermediat F289
N (2S)-2-Amino-4 {(iRH-[l-benzyl-4-(2 d^
dimethylpropyl}(gly oloyl)amino]buto
lysin -trifluoressigsäure (1: 1)
Figure imgf000402_0002
Zunächst wurde Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-N°-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l-yl)acetyl]-D-lysinat (1 :1) nach klassischen Methoden der Peptidchenrie ausgehend von N6- [(Berizyloxy)carbonyl]-N''-(tert-butoxycarbonyl)-D-iysin hergestellt,
12.5 mg (25 μτποΐ) von diesem intermediat wurden in Gegenwart von HATU und 4- ΜεύιγΙΐΉθ ΙιοΙίη mit 15 mg (23 μτηοΐ) von intermediat C58 gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 14 mg (53% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.83 min; MS (ESIpos): m/z - 779 (M+H)4'.
Intermediat F290
N X2S
dimethy (1:1)
Figure imgf000403_0001
Zunächst wurde Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-N6-(brorDacetyl)-D-lysmat (1:1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von N6-[(Benzyioxy)carbonyi]-N''-(tert- butoxyca bonyl)-D-lysin hergestellt
12 mg (25 μτηοΐ) von diesem intermediat wurden in Gegenwart von HATU und 4- ΜεύιγΙΐΉθφΙιοΙίη mit 15 mg (23 μηιοΐ) von intermediat C58 gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 7 mg (36% d. Th.) der Titelve bindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.86 mm; MS (ESIpos): m z = 762 und 764 (M+H)4". N (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyiroH^
difluo henyl)-lH-p Iτol-2-yl]-2,2-dime1hyl ro yl}(glycoloyl)amino] ro yl} -L-alanmamid
Figure imgf000404_0001
Die Titeiverbindung wurde ausgehend von Beispiel M9 zunächst durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)earhonyl]-L-valyi-L-alanin in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igeni Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin in die Titeiverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.21 min; MS (ESIpos): m/z = 777 (M+H)+.
Intermediat F293
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl3-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)ammo]butenoyl}-3- {[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yljbenzoyljarnino} -D-alanin -trifluoressigsäure (1: 1)
Figure imgf000405_0001
35 mg (39 μπιοΐ) von Intermedia! C74 wurden in 4 ml DMF gelöst und in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin mit i 3.5 mg (43 μηιοΐ) kommerziell erhältlichem l-(3 - {[(2,5- Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy] carbonyl) phenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 12 mg (34% d. Th.) der Titelverbindung erhallen.
LC-MS (Methode 32): Rt - 0.93 min; MS (ESIpos): m/z - 799 (M+H)+.
Intermediat F294
N- {5-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-5-oxopentanoyl} -L-valyl-N- {(lS)-3-[{(lR)- l-[l-benzyl-4- (2,5-diQuo^henyi)- lH^yrrol-2-yl]-2^-dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]- 1 -carboxypropyl} -L- al
Figure imgf000405_0002
41 mg (0.05 mmol) von Intermediat C76 gelöst in 12 mL Methanol wurden über 10 mg 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 32 mg (92% d.Th.) des entschützten Intermediats.
15 mg (0.022 mmol) von diesem Intermediat wurden in DMF gelöst und mit 13 mg (0.039 mmol) l,l'-[(l,5-DioxopenlBn-l,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidiri-2,5-dion und 7 N, N-Diisopropylethyl amin versetzt. Nach 1 Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand mittels HPLC gereinigt. So wurden 9 mg (45% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.08 min; MS (ESIpos): m/z - 895 (M+HV
Intermediat F295
N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-m^
difluo henyl)-lH yrrol-2- l]-2,2-dimethylprop l}(glycolo l)amino]-l-carbox propyl} -L- alaninami
Figure imgf000406_0001
41 mg (0.05 mmol) von Intermediat C76 gelöst in 12 mL Methanol wurden über 10 mg 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 32 mg (92% d.Th.) des entschützten Intermediats.
15 mg (0.022 mmol) von diesem Intermediat wurden in 4 mL DMF gelöst und mit 10 mg (0.039 mmol) l- {2-[(2,5-Dioxopyrroiidin- 3 -yl)oxy]-2-oxoethyl}-i H-pyrrol-2,5-dion und 7 xL N, N- Diisopropylethyl amin versetzt. Nach 2 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand mittels HPLC gereinigt. So wurden 10 mg (56% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.08 min; MS (ESIpos): m/z - 821 (M+H)+. Intermediat F296
Trifluoressigsäure --(2S)~2-amino-4-[ {(lR)-l-[l ~benzy1-4~(2,5~dif^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-{2-[(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyjToi- 1 - y 1) ac ety 1 ] am in o } ethy 1) sulfony 1] ethyl } butan amid ( 1 : 1 )
Figure imgf000407_0001
Die Titelveibindung wurde ausgehend von Inlennediat L81 durch Kupplung mit Intermediat C58 in Gegenwart von HA.TU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10 -igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/MethanoI 1 : 1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)essigsä re in Gegenwart von HA TU und N, N Diisopropylethylamin und schließlich durch Entschützung mit Zrnkchlorid in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.83 mm; MS (ESlpos): m z = 785 (M+H)+. Intermediat F297
8- {2-[ {(1Κ) -[Γ·Βε ζν1-4-(2,5^ί0υοφΙιε ^^^^^
ylinethyl)a ino]-2-oxoethyl}-N-[6-(2,5-dtoxo-2,5-dthydro-lH-pyTro
trifluoressigsäure (1 : 1) (Isomer 1)
Figure imgf000408_0001
Eine Lösung von 36 mg (0.03 mmol, 68% Reinheit) S-[2-({(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5- difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yljmethyl } amino)-2-oxoethyl]-N~[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-cystein (intermediat C92) in 0.74 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 15 mg (0.11 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 7 Ii bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 32 mg (0.11 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmiscliung wurde mit Ethvlacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 6,4 mg (25 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.95 min; MS (ESIpos): m/z - 792 QA+H-CFz X H)*.
InterjnedM F298
S- {2-[ {(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yt] -2,2-dimethylpropy! } (pyrrolidin-3 - ylmethyl)amino]-2-oxoethyl} -N-[6-(2,5-diox
trifluoressigsäure (1 : 1) (Isomer 2)
Figure imgf000409_0001
Eine Lösung von 45 mg (0.04 mmol, 71 % Reinheit) S-[2-({(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5- difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy]propyl} {[l -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yljmethyl } amino)-2-oxoethyl]-N~[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-cystein (Tntermediat C91) in 0.94 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 1 9 mg (0.14 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 42 mg (0.14 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethvlacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 5,7 mg (18 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.96 min; MS (ESIpos): m/z - 791 QA+H-CFz X H)*. Intgrmgdjat F299
S-(2- {(3-AminopropyI)[(R)-[l -benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl) - 1 H-pyrrol-2- yl](cyclohexyl)melhyl]amino} -2-oxoethyl)-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-p rrol-1 - yl)hexanoyl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000410_0001
Eine Lösung von 88.0 mg (0.09 mmol) S- { 11 -[(R)-[ 1 -Benzyl-4-(2,5-di£luorphenyl)- lH-pyrrol-2- yl](cyc!ohexyl)me l]-2,2-di^
dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yi)hexanoyll-L-eysiein (Intermediat C84) in 3 .88 ml 2,2,2- Trifluoroetlianol wurde mit 76.8 mg (0.57 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgetnisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 164.6 mg (0.57 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 31 mg (35 % d. Th ) der Titel v erbindung .
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.82 min; MS (ESIpos): m/z - 792 (M+H)+. Intermediat F300
(2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-y]]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)ammo]-N 2-{[(2R)-2 2,5-dioxo-2,5-dihydiO-lH-pyrrol- l- yl)propanoyl]amino} ethyl)butanamid
Figure imgf000411_0001
Eine Lösung von 7 mg (0.08 mmol)) 2-(Trimetiiylsilyl)eihyl-{(2S)-4-[ {( 1 )-1 -[1 -bertzyl-4-(2,5- difίuo henyl)■3 H y:ίτo3~2■yl]~2,2 lim.ethyl ro yl}(glycolo l)
2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)propanoyl]amino} ethyDamino]- 1 -oxobutan-2-yl} carbamat
(Intermediai C100) in 0.2 ml 2,2,2-Trifluoroeihanol unter Argon wurde mit 11 mg (0.08 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 14 mg (0.05 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mitteis präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 1 ,6 mg (27 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R* = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z - 707 (M+H-CFsCChH)4. Intermediat F302
S-{2-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoropheny!)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dim
ylmethyl)aminoj~2-oxoethyl} ~N^
trifluoroacetate (1 : 1) (Isomer I
Figure imgf000412_0001
Eine Mischung von 56.9 mg (58.2 mmol, 85 % Reinheit) S-[2-({(lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5- difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy]piOpyl } {[(l~(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yl]me1hyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydiO-lH-pyiTol- l -yl)acetyl]-L-cystein (intermediat C94) in 1.4 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 31 .7 mg (0.23 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 68.0 mg (0.23 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 7 mg (13 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 736 (M+H-CFsCOiHT .
Intermediat F3Q4
N-(2- {[3~({2 {(lR) 1~benzyl-4~(2,5~dffl
dimethylpropyl}(pyrrolidin-3-ylmethyl)amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)proparjoyl]amino}ethyl)-6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanamid (1 : 1) Trifluoressigsäure (isomer 2)
Figure imgf000413_0001
Eine Lösung von 22.3 mg (0.02 mmol) tert-Butyl-3-[2-{(l R)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluorp enyl)- l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropylH8
thia-2,9,12-iriazaoctadec- 1 -yl]pyrrolidin-l -carboxylat (intermediat 98) in 0.64 ml 2,2,2- Trifluoroethanol wurde mit 13.2, mg (0.10 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 28.36 mg (0.10 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 5 mg ( 24 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): R, 3.05 min; MS (ESIpos): m/z = 819 (M+H-CF3C02H)+.
Intermediat F3Q5
Figure imgf000413_0002
2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-6,l 7-dioxo-N-(pyriOlidin-3-ylmethyl)-l 0,13-dioxa-3-thia-7,l 6- diazadocosan- 1 -amid (1:1) Trifluoressigsäure (isomer 2)
Figure imgf000414_0001
Eine Lösung von 24.80 mg (0.02 mmol) tert-Bulyl-3-[2-{(lR)-l-[l-ben^^
iH-pyirol-2-yi]-2,2-dimethylpropyi} -2^
12,15-dioxa-5 -thia-2,9, 18-triazatetracos- 1 -y Ijpyrrolidin- 1 -carboxylat (Intermediat C99) in 0.65 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 13.42 mg (0.10 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 28.78 mg (0.10 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 1 mg (44 % d. Th) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 5): R, - 3.11 min; MS (ESIpos): m z - 907 (M+H-CF3CO2H) . Intermediat F306 6-(N-{(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)- l H-pylτol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -beta-alanyl)-N2- {N- [(2,5-dioxo2,5-dihydro- 1 H- pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl-beta-alanyl}-L-iysin -trifluoressigsäure (1: 1)
Figure imgf000415_0001
Die Tiielverbindung wurde durch Kupplung von 24 mg (0.029 mmol) des Inlermediats C61 mit 30 mg (0.035 mmol) von Intermediat L99 in Gegenwart von 16.7 mg (0.044 mmol) HATU sowie 15 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC mirden 19 mg (52% d. Th. über 2 Stufen) der Tiielverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.84 min; MS (ESIpos): πχ/z - 1091 (M+H)+. Intermediat F307
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyirol-l-yl)te^
aminopropyl)-14-[ i -benz ί-4-(2,5-difluo henyl)-lH-p rrol■2- l]-5-caΓbo y 5,15-dimeth ί- 2,7,12-trioxo 0 hia-3,6,13-triazahexadec-i-yl}-L-cyste!n -irifluoressigsäure (1:1)
Figure imgf000415_0002
8,90 mg (8.88 μτηοΐ) Trifiuoressigsäure 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(l l- {( I R)-l -[l -benzyi-
4- (2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl ]-2,2-dirnethylpropy] }-2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa-14- ihia-7, 3 1 liaza-2,-silalieptadecan- i 7-yl)-D-alartinat (1:1) (Intermediat C80) und 2.31 mg (9.77 μιηοΐ) 1 -(2-Bromacetoxy)pynolidin-2,5-dion wurden in 1 ml Dimethyifomiamid gelöst und mit 2.9 μΐ (27 μηιοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wuixien im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.80 mg (65% d. Th.) der Verbinfung 2- (Trimethylsilyl)ethyl- -(l 1-{(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,1 7 -trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-3- [(bromacetyl)aminoj-D-alaninat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.57 min; MS (ESIpos): m/z - 1008 (M+H)+. 2-(Trimetbylsilyl)e l-N-(l ! -{^^
dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12,l 7-trioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan-l 7-yl)-3- [(bromacetyl)amino]-D-alaninat (31.9 mg, 31.6 μηιοί) und L-Cystein (7.66 mg, 63.2 μ/mol) wurden in 3.0 ml DMF gelöst und über Nacht bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 28.1 mg (76% d. Th.) der Verbinfung S-[(19R)-11- {(1R)-1- [ 1 -Berizyl-4-(2,5-difiuo^henyi)-lH-py^^ 17,22- tetraoxo-19- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -5-oxa-14-thia- 7,11,18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 23-ylj-L-cysiein -trifiuoressigsäure (1 : 1).
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.52 min; MS (ESIpos): m/z - 1049 [M+Hf
5- [(19R)- l l- {(l R)-l -[l -Benzj -4-(2,5-difiuorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]- dimethyl-6, 12, 17,22-tetraoxo- 19- {[2-(trimethyisilyl)etl oxy]carbonyl} -5-oxa- 14-thia-7, 3 1 , 18,21 - tetraaza-2-silatricosan-23-yl]-L-cystein -trifiuoressigsäure ( 1 : 1 ) (13.5 mg, 1 1.6 μη οΐ) wurde in 1.0 ml DMF gelöst, mit 2,5-IMoxopyrrolidin-l -yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (6.76 mg, 11.6 μηιοΓ) (Intermediat L88) und N,N- Diisopropylethylamin (4.0 μΐ, 23 μιηοΐ) versetzt und 1h bei RT nachgerührt gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 rnL/min, MeC /Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.1 mg (68% d. Th.) der Verbinfung N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi-l-yi)hexanoyi]-L-vaiyl-L-alanyl-S-[(19R)^ benz l-4-(2,5-difluorplienyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyipropyl} -2,2-dimethyl-6,l 2, 17,22- tetraoxo-19- { [2-(trimethylsi3y3)ethoxy]earbonyl } -5-oxa- 34-thia-7, 11,18,21 -tetraaza-2-silatrieosan- 23~yij-L-cystei:n.
LC-MS (Methode 14): Rt - 7.38 min; MS (ESIpos): m/z - 1412 [M+Hf
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-p rroi- 1 -yl)hexanoyl]i-valyl-L-alanyl-S-[(19R)- 11- {(1R)-1 -[ 1 - benzyl-4-(2,5-difluo^henyl)-lH^^
tetraoxo- 19- { [2-(trimethyIsiIyl)ethoxy Jcarbonyl} - 5-oxa- 14-thia -7,11,18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 23-yl]-L-c stein (9.40 mg, 6,65 μηιοί) wurde in 2.0 ml Trifiuorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (5.44 mg, 39.9 μτηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (5.44 mg, 39.9 μηιοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (23.4 mg, 79.8 μητοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.60 mg (66 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode l): Rt = 0.93 min; MS (ESTpos): m/z - 1 168 (M+H)+.
Intermediat F308
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dmydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[(12R,19R)-19-amino-4- {(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5-difiuo henyl)-iH- yr ol-2-yί]-2,2-dimethylpropyI} -12,19-di
trioxo-7, 17-dithia -4, 11 , 14-triazanonadec- 1 -yl] -L-alaninamid -trifluoressigsäure (1: 1)
Figure imgf000418_0001
N-[3-( {2-[(3-Aminopropyl) {(lR)-l -[l-benzyl-4-^^^
dimeihylpropy!}amino]-2~ox
trifluoressigsäure (1 : 1) (12.7 mg, 14.5 μπιοΐ) und N-{[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L- cystein (3.84 mg, 14.5 μηιοΐ) wurden in 1.5 ml DMF gelöst und über Nacht bei RT nachgerührt. Dann wurde NJSf-Diisopropylethylamin (2.5 μΐ, 14
Figure imgf000418_0002
Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei RT und wurde dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mUmin, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.40 mg (48 % d. Th.) der Verbindung S-{(5R,14R)-13-(3-Aminopropyl)-
Figure imgf000418_0003
thia-3,6, 13-triazahexadec- 1 -yl} -N- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carboiiyl} -L-cystein
trifluoressigsäure (1 : 1).
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.03 min; MS (ESIpos): m/z - 949 [M+Hf
S- {(5R,14R)-13-(3-Aminopropyl)~14~[l~benzyM^
15,15-dimethyl-2,7,12-trioxo 0-thia-3,6,13 riazaliexadec -yl}-N-{[2-
(trimethylsilyl)ethoxyjcarbonyl} -L-cystein -trifluoressigsäure (1: 1) (7.50 mg, 7.05 μπιοΐ) wurde in 1.0 ml DMF gelöst und mit 2,5-Dioxopynolidin- 1 -yi-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 - yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alaninat (4.1 1 mg, 82 % Reinheit, 7.05 μιηοΐ) (Intermediat L88) und N,N- Diisopropylethylamin (2.5 μί, 14 μπιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT geröhrt und dann direkt mittles präp. P-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.30 mg (46 %) der Verbindung N-[6-(2,5- Dioxo-2,5~dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-v
difluorpiienyl)-lH-p rrol-2-yl3-2,2-dimethylpropyl}-8, i 5-dica boxy-2,2-dimethyl-6,12,17,22- tetraoxo-5-oxa- 10,20-dithia-7,l 3,16,23-te1raaza-2-silahexacosan-26-yl]-L-alaninamid.
LC-MS (Methode 14): R - 6.47 mm; MS (ESIpos): m z - 1312 ; Vi ! i |
N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-d!liydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[(8R45R)-23- beiizyl-4-(2,5-dffluo^henyi)-lH-pyrro^^
6, 12,17,22-tetraoxo-5-oxa-l 0,20-dithia-7, 13,16,23-tetraaza-2-silahexacosan-26-yl]-L-alaninamid (4.00 mg, 3.05 μπιοΐ) wurde in 1.0 ml Trifluorethanol gelöst und mit Zinkdichlorid (2.49 mg, 18.3 μταοϊ) versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C und wurde dann mit Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (5.34 mg, 18.3 μ.ηιοί) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.50 mg (64 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.00 min; MS (ESIpos): m/z - 1168 [M+H]+ Intermediat F3Q9
4- { [( 11 R, 17R)~ 16~(3~ Aminopropyl)- 17-[ 1 -benzyM^
dioxo-2,5-dihydro- I H-pyrrol- 1 -yl)-l 8, 18-dimethyl-6,6-dioxido-2, 10, 15-trioxo-61ambda6, 13-dithia- 3,9, 36-triazanonadecan-l l-yl]amino} -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000420_0001
S-(3 l -{(].R)-l -[l -Benzy]-4-(2,5-difluorphenyl)-l^
6,12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cysteiü (50.0 mg, 57.3 μιτιοϊ) (Intermediat C77) und Trifluoressigsäure -benzyl- {2-[(2- aminoethyi)sulfonyl]ethyl} carbamat (1 : 1) (2,7.5 mg, 68.7 μηιοΐ) (Intermediat L81) wurden in 4.0 ml DMF vorgelegt, mit HATU (26.1 mg, 68.7 μηωΐ) und N,N-Diisopropylethylamin: (30 μ], 170 μιηοί) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 % TFA) gereinigt Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 53.9 mg (81 %) der Verbindung tert-Butyl-4-{[(12R)-17-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- d fluo henyl)- lH^yrrol-2-yl3-2,2-dimethylpropyl} -26,26-dimethyl-7,7-dioxido-3,l 1 , 16,22- ietraoxo- 1 -pheny l-2,23-dioxa-71ambda6, 14-dithia-4, 10, 17,21 -tetraaza-26-silaheptacosan- 12- yljamino} -4-oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.54 min; MS (ESTpos): m/z - 1 341 [M+H]+
Unter Argon, wurde Pailadium(TI)acetat (5.32 mg, 22.8 μ-ηοΐ) in 3.0 ml DCM vorgelegt, mit Triethylamin (9.5 μΐ, 68 μ-ηοΐ) und Triethylsilan (73 μΐ, 460 μιηοΐ) versetzt und 5 min. gerührt. Dann wurde tert-Butyl-4- { [( 12R)- 17- {(1 )- 1 -[1 -benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2- diinethylpropyl}~2 ),26 innethyl-7,7~dioxido-3,l 1 , 16,22-tetraoxo-l -phenyl-2,23-dioxa- 71ambda6, 14-dithia-4, 10,17,2, 1 -tetraaza-26-silaheptacosan- 12-y3]amino} -4-oxobutanoat (52.1 mg, 45.6 μηιοΐ) in 2.0 ml DCM zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerühri und mit 2.0 ml Wasser versetzt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mit Acetonitril versetzt, filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdariiptt. und der Rückstand im Hochvakuum getrocknei. Man erhieli 43.4 mg (85 %) der Verbindung †iifluoressigsaure-iert-butyi-4- {[(16R)-23-arnino-l 1 - {(1R)-1 -[l-benzyl-4-(2,5- ctifiuorphenyl)- lH-pyrrol-2-ylj-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12, 17~trioxo~5 - oxa- 14,21 lambda6-dithia-7, 11 ,18-triaza-2-silatricosan- i 6-yl]amino} -4-oxobutanoat (1 : 1).
LC-MS (Meihod 1): Rt - 1.21 min; MS (ESIpos): m z - 1007 [M+Hf
Trifluoressigsäure-te3rt-butyi-4- { [( 16R)-23-amino- 11 - { ( 1 R)- 1 -[ 1 -benzy l-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14,21 lambda6- d hia-7,l l,18-lr!aza-2-silalJ!eosan-16-yl]amino} -4-oxobutanoai (1 : 1) (20.0 mg, 17.8 μιηοΐ) und (2,5-dioxo-2,5-dihydro-iH-pyrrol-l -yi)essigsäure (3.32 mg, 21.4 μιηοΐ) wurden in 2.0 ml DMF vorgelegt, und mit HATU (8.14 mg, 21.4 μπιοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (9.3 μΐ, 54 μηιοΐ) versetzt.
Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 ml/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 17.4 mg (85 %) der Verbindung tert-Butyl-4- {[(16R)- l 1- {(1R)~ 1 -[ I - benzyi-4-(2 ,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2 ,2-dimethylpropyl}-26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-21 ,21 -dioxido-6, 12,17,25-ietraoxo-5-oxa- 14,21 lambdao-diihia-
7.11.18.24- tetraaza-2-silahexacosan- 16-yl]amino} -4-oxobutanoat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z - 1144 [M+Hf
Ter t-Butyl-4- { [( 16R 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl j-2,2- dimethyipropy!} -26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yi)-2,2-dimethyt-21 ,21 -dioxido-
6.12.17.25- teti-aoxo-5-oxa-14,211ambda6-dithia-7,l 1 ,18,24-tetraaza-2-silahexacosan-16-yl]amino} - 4-oxobutanoat (15.9 mg, 13.9 μιηοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (1 1 .4 mg, 83.4 μηιοΐ) versetzt.. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (1 1.4 mg, 83.4 μιηοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Zinkdichlorid (1 1 .4 mg, 83.4 μητοΐ) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin- , ,N',N'-tetraessigsäure (73.2 mg, 250 μηιοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; ί θμ, Fluss: 50 rnL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10 mg (68 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.45 mm; MS (ESIpos): m/z - 944 [M+Hf Intermediat F310
Trifluoressigsäure-N-[(8R, 14R)- 13-(3-aminopropyl)- 14-[ 1 -benzyl-4-(2,5-difiuorplien.yl)-lH- p rrol-2-yl]- l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-p rrol- 1-yl)- 15,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- i 0-thia- 3,6,13-triazahexadecan-8-yi]-2,5,8,l 1 -tetraoxatetradecan- 14-amid (1 : 1)
Figure imgf000422_0001
S-( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Βειιζγ1-4-(2,5-άίί1υο: 1ιειιν1)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl - 6,12-dioxo-5-oxa-7,l l -diaza-2-s!iatridecan-13-yi)-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1 ) ( 100 mg, 120 μηιοΐ) (intermediat C70) und !-[(! .4-Oxo-2,5,8,l l-tetraoxatetradecan-i 4-yi)oxylpyrrolid'ni-2,5- dion (44,1 mg, 132 μπιοΐ) wurden in 3.0 ml DMF vorgelegt und mit 4-Mefhylmorpholin (40 μΐ, 360 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt, mit Essigsäure (420 μηιοΓ) gequencht und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; ΙΟμ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 69.4 mg (62 % d. Th.) der Verbindung S- ( 11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yi] -2,2-dimethylpropy 1} -2,2-diniethy 1- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silalridecan- 13-yl)-N-( 14-oxo-2,5,8, 11 -tetraoxatetradecan- 14-yl)-L- cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.61 min; MS (ESIneg): m/z = 933 [M-H]'
S-(l l.-{(iR)-l·■ l~BeΓίz l-4~(2, ~dit]uo: he yl)-iH-p rrol-2~yl]-2,2~d
6, 12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-siiatridecan- 13-yl)-N-(14-oxo-2,5,8, 11 -tetraoxatetradecan- 14-yl)-L- cystein (27.0 mg, 28.9 μιηοί) wurde in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit N-(2-Aminoethyl)-2-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yi)acetamid (11.4 mg, 57.7 μηιοΐ) (Intermediat Li), N,N- Diisopropylethylamin (15 μΐ, 87 μ/mol) und HATU (22.0 mg, 57.7 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3h bei RT geröhrt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 13.7 mg (43 % d. Th.) der Verbindung 2■(Trimethylsilyl)eth ί- {(16R)-21-{(lR)■l-[l-benz l-4-(2,5-d!f3uo hen ί)- lH-pyrrol-2-ylj-2,2-ctimethylpropyl}- i 6-[(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-i - yl)acetyl]amino} ethyl)carbamoyl]-14,20-dioxo-2,5,8,l l-tetraoxa-18-lhia- 15,21 -diaza tetracosan-24- yl}carbamat.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.54 min; MS (ESIpos): m/z - 1114 [M+Hf
2-(Trimethylsilyl)ethyl- { ( 16R)-21 - {( 1 R)-l -[ 1 -benzy 1-4-(2,5^Αυοφηε^1)-1Η-ρνιτο1-2^1]-2,2- dimethylpropyl} - 16-[(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -y!)aeetyl]amino} ethyl)carbamoy!]- l4,20-dioxcn2,5,8,nHetraoxa-l 8-tiiia-l5,2l^iazate1iacosan-24-yl}carbarnat (13.7 mg, 12.3 μηιοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (10.1 mg, 73.8 μηιοΐ) versetzt, Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin- ,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (21.6 mg, 73.8 μηιοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.30 mg (47 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.01 min; MS (ESIpos): m/z - 970 [M+Hf Intermediat F311
S-{2 (3-Ammopropyl) {(lR)-l-[l-berizyM
dimemylrjropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dmydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2,30-dioxo-
6,9,12,i5,18,21,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-yl]-L-cystein-trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000424_0001
1 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -y l)-2-oxo-6,9, 12, 15, 18,21 ,24,27-octaoxa-3-aza1xiacontan- 30-säure (10.8 mg, 18.7 μιιιοί) (Intermediat L97) wurde in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit N,N- Diisopropylethylamin (5.4 μί, 31.2 μηιοί) und HAITI (7.10 mg, 18.7 μιηοΐ) versetzt und 10min. nachgerührt. Dann wurde S-(l l- {(lR)-1 1-Benzyi-4-(2,5-difluoiphenyl) H-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein trifluoressigsäure (1 : 1) (12.9 mg, 15.6 μπιοΐ) (Intermediat C71) in 1.0 ml DMF und N,N- Diisopropylethylamin (2.7 μΐ, 15.6 μηιοΐ) gelöst, zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 325x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.5 mg ( 1 8 %) der Verbindung S-( 1 1 - {(lR)- l -[ l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTOl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6,12- dioxo-5-oxa-7,l lHjiaza-2-silalxidecan-13-yl)-N-[l-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yiTol-l-yl^ dioxo-6,9,12,15,18,21 ^4,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-yl]-L-cystein.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.30 min; MS (ESIneg): nv'z - 1276 [M-H]"
S-(l 1- {(1ίΙΗ- 1-Βεηζν1-4-(2,5^ιΠαο ^
6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 2,3ö-dioxo-6,9,i2,15,18,21 ,24,27-octaoxa-3-azatriacontan-30-yl]-L-cystein (3.50 mg, 2.74 μτηοΐ) wurde in 1.0 ml Trifluorethanol gelöst, mit Zinkdichlorid (6.25 mg, 16.4 μηιοΐ) versetzt, Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure (47 μΐ, 16 μιηοΐ) versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.3 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.0 mg (59 % d. Th.) der Titel Verbindung. LC-MS (Methode 1): R, - 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 1 133 (M+H)\
Intermediat F312 -[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- l H-pyrroi-l-yl)acetyl]-L-valyi-N-[(2S)-4-[ {(lR)- i -[3 ^
difluorphenyi)- 3 ^^yiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-l - {[2-(L-gamma- glutamyianiino)ethyl]aniino} -1 -oxobutan-2-ylj-L-alamrjamid -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000425_0001
Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C103 durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und N^ -Diisopropylethylamin hergestellt, im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methano! 1 : 1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte Intermediat wurde arischließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)essigsäure in Gegeriwart von HATU und N, N Diisopropylethylamin und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid und Reinigung durch präparative HPLC in die Titelverbindung überfuhrt.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 0.9 min; MS (ESIpos): m/z - 992 (M+Hf . S 2-i{(lR)~] -[] -Benzyl~4-i2,5-diü^
Üuorpyrrolidin~3-yl]methyl} amino)-2-oxoethyi]-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-di]iydro-lH-pyrrol-l-yl)- 2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan-l 8-ylJ-L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1)
Figure imgf000426_0001
Zu einer Lösung von 55.0 mg (0.14 mmol) von l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yi)-2-oxo- 6,9,12,15 -tetraoxa-3-azaoctadecan-18-säure in 2.60 ml DMF unter Argon wurden 16.9 mg (0.13 mmol) Ν,Ν-diisopryleihylaniin und 50.0 mg (0.13 mmol) HATÜ hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 40.0 mg (0.05 mmol) 5-[2-({(1 )-1-[1-Ββηζγ1-4-(2,5^ϊΑϋθ 1ιβηγ1)-1Η-ργπ·ο!-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} {[(3R,4R)-4-fluor-l-{[2-(lrimethy]si]y])ethoxy]carbonyl}pyrrolidiri-3- yl]methyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein (Intermediat C107) Irinzugegeben und das Gemisch über Nacht bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand Wurdemittels präp. HPLC gereinigt Man erhielt 10 mg (13 % d. Th., Reinheit 82%) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt = 1.36 min; MS (ESlpos): m/z - 1145 (M+H)+.
Eine Lösung von 10.9 mg (7.8 mmol, 82% Reinheit) S-[2-({(l R)-l~[l -Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} { [(3R,4R)-4-fluor- 1 - { [2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}py^
dioxo-2,5-dihydiO - 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-6,9, 12,15 -tetraoxa-3 -azaoctadecan- 18 -yl] - L-cystein in 0.85 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 4.3 mg (0.03 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C geröhrt. Anschließend wurden 9.1 mg (0.03 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 2.3 mg ( 26 % d. Th ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt 0.89 min; MS (ESIpos): m z - 781 (M+H-CF3C02H)+.
Intermediat F314
Trifluoressigsäure -3- {[2-({(l R)- 1-[1 -Berizyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]- dimeihylpropyl} { [(3S,4R)-4-fluoroyrrolidin-3-yl]methyl) armno)-2-oxoethyl]suIfanyl} -N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pym i-l-yl)acetyl]ammo} ethyl)propanamid
Figure imgf000427_0001
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.04 mmol, ) von 3-{[2-({(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorp enyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethy]propyl} {[(3R, 4R)-4-fluor-l- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} pyrroiidin-3-yi]methyl}ammo)-2-oxoethyl]sulfanyi}propansä«re (Intermediat 106) in 3.14 ml DMF unter Argon wurden 16.89 mg (0.13 mmol) ,Ν-diisoprylethylamin und 33.13 mg (0.087 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 27.29 mg (0.09 mmol) N-(2-Aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 : l)Trifluoressigsäure (Intemediat LI) hinzugegeben und das Gemisch 1 5 Minuten bei RT gerührt Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlonnethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurdemitteis präp. HPLC gereinigt Man erhielt 41 mg (68 % d. Th, Reinheit 66%.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt = 2.55 min; MS (ESIneg): m/z = 959 (M-H+Na)". Eine Lösung von 41.1 mg (0.03 mmol, Reinheit 66%) 2-(Trimethylsiiyi)ethyl-(3R,4R)-3-[2- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 14-(2,5- dioxo-2,5-dihydiO- lH-pyrrol- 1 -yl)-3,8, 13 -trioxo-5-thia-2,9, 12-triazatetradec- 1 -yl]-4- fluorpyrrolidin- 1 -carboxylat in 2.54 rnl 2,2,2-TrifluoroethanoI wurde mit 24.7 mg (0.18 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 53.0 mg (0.18 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die ReaJktionsmischung mittels präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 30 mg ( 36 % d. Th ) der Titel v erbindung .
ί C MS (Methode 1): Rt 0.89 min; MS ! l S ipos); m/z = 781 (M+H-CF3C02H) ". Iratennediat F3J5
S- {2-[(3-Ammo ro l){(l ) -[l-benzyl-4-(2,5-difluo hen ί)-ίH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} ammo]-2-oxoethyl} -N- {3-[5-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino} ethyl)-i,2,4-oxadiazol-3-yljpropanoyl}-L-cystein
Figure imgf000428_0001
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.07 mmol) von 3-[5-(2- {[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- y])acetyl]amino}ethy])-l,2,4-oxadiazol-3-yl]propansäure (Intermediat LI 00) in 3.5 ml DMF unter Argon wurden 18.02 mg (0.14 mmol) Ν,Ν-diisopiylethylamin und 31.82 mg (0.09 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 50.0 mg (0.07 mmol) N-(2-Aminoeli!yl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanamidacetat (1: 1) (Intermediat C107) hinzugegeben und das Gemisch 2h bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsuifat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 49 mg (21 % d. Th, Reinheit 31 .) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.30 min; MS (ESIpos): m/z - 1022 (M+H)+.
Eine Lösung von 49.0 mg (0.035 mmol, 31% Reinheit) S-(i 1 - {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difiuorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yi]-2,2-dm
siiatrid.eca.n43-yl) -N- {3-[5-(2- { [(2,5 -dioxo-2,5-dihydro 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyl]amino} ethyl)- 1 ,2,4- oxadiazol-3-yl]propanoyl} -L-cystein_in 0.5 ml 2,2,2-Trifluoroetha.noI wurde mit 8.0 mg (0.06 mmol) ZinkcMorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2h bei 50 °C gerülrrt. Anschließend wurden 17.2 mg (0.06 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mitteis präp. HPLC gereinigt. Man erhielt 3 mg ( 21 % d. Th.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode l ): t = 0.91 min; MS (ESTpos): m/z - 877 (M+H-CF3C02H)+.
Intermediat F316
Triüuoressigsäuxe-N-{2-^
dimethylpropyl} {[(3S,4R)-4-rluoφyrrolidin-3-yl]methyl}amino)-2- oxoetiiyl]sulfanyl}propanoyl)amino]ethyl} -6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- i -yl)hexanamid (1 : 1)
Figure imgf000430_0001
Zu einer Lösung von 50.0 mg (0.04 mmol, 65% Reinheit) von 3- {[2-({(lR)-l-[i-BenzyI-4-(2,5- difluorpheoyl)-lH-pyrrol-2-yt]-2,2-dimetliylpropy!} {[(3R, 4R)-4-fluor-l - {[2-(trimethylsilyl) ethoxy]earhonyi}pynOlidin-3-yl]methyi}amino)-2-oxoethyl]sulfany (Intermediat 106) in 3.0 ml DMF unier Argon wurden 16.89 mg (0.13 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 33.13 mg (0.087 mmol) HA TU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 37.2 mg (0.09 mmol, Reinheiete 70%) N-(2- Aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)hexanamidacetat (1 : 1) (Intermediat L73) hinzugegeben und das Gemisch 7 Minuten bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 57 mg (77 % d. Th, Reinheit 59%.) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.60 min; MS (ESIpos): m/z - 981 (M+H)\
Eine Lösung von 56.0 mg (0.03 mmol, 59% Reinheit) 2-(Trime lsilyl)ethyl-(3R,4R)-3-[2-{(lR)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-dif!Uo 3henyl) Hi7yrrol-2-y1]-2,2-dimethylpi pyl} - 18-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH^yrroM~y1)-3,8,13~trioxo-5 hia-2,9,12 riaza in
2.8 ml 2,2,2-Trifluoroethanol wurde mit 36.0 mg (0.27 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 2h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 78.3 mg (0.27 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung mittels präp.
HPLC gereinigt. Man erhielt 16 mg ( 44 % d. Th., 85% Reinheit ) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 837 (M+H-AcOH) .
Intgrmgdjat F317
3 -[(S- {2-[(3vAminopropyl) {(lR)- 3 -[l-benzyl-4~(2,5-difl
drmethylpropyl } amino]-2-oxoethyl} -N-[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-
6,9,12J5-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cysteinyl)amino]-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15- säure -trifluoressi säure (1 : 1)
Figure imgf000431_0001
Unter Argon wurden 30.2 mg (0.06 mmol) ,N'-Bis[(benzyloxy)carbonyll-L-cystin in 2.0 mL Wasser und 2.0 mL i'.so-Propanol vorgelegt und mit 56.7 mg (0.20 mmol) TCEP versetzt. Die Reaktionsmisehung wurde 30 min bei RT gerührt. Es wurden dann 50.0 mg (0.08 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl- {3 -[ { ( 3 R)~ 1 - [ 1 -benzyl-4- (2,5^ϊίΊ^ 1ΐ6ηγ1)-1Η-ρνηΌΐ-2^1]-2,2- dimethyipropyi}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat (Intennediat C70) gelöst in 2.0 mL iso- Propanol und 122.2 mg (0.48 mmol) i ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Dann wurden nochmals 122.2 mg (0.48 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Eihylacelai verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lsg. extrahiert und mit ges. NaCl-Lsg. gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft, Der Rückstand wurde mittles präp, RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.1 mg (64 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {(1 R)- 1 -[l-Benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H^yrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7,i 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyi]-L-cysteiri.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 851 (M+H)+.
Unter Argon wurde S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N- [(benzyloxy)carbonylj-L-cysiein (50.0 mg, 59 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF gelöst und mit N,N- Diisopropylethylamin (20.5 μΐ, 117 μηιοΐ) und HATU (26.8 mg, 70 μιτιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min nachgeröhrt. Tert-Butyl-1 -amino-3,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-oat (22.6 mg, 70 μηιοί) wurde dann gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde nachgeröhrt und dann direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; Ι Ομ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 59.3 mg (87.5 % d. Th.) der Verbindung tert- Butyl- 1 -({S-(l 1 - {(1 R)-l -[ 1 -berizyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-y] ]-2,2-dimethylpropyl } - 2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7, 1 l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L- cysteinyl} amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.97 mm; MS (ESIpos): m/z - 1154 [M+HJ+
Unter Argon wurde Palladium(II)acetat (6.74 mg, 30.0 μηιοΐ) in 3.0 ml Diehlorrnethan vorgelegt und mit Triethylamin (13 μΐ, 90 μτποΐ) und Triethylsilan (96 μΐ, 600 μπιοι) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min geröhrt und dann, mit tert-Butyl-l-( {S-(l l- {(lR)-l-[l -benzyl-4- (2,5-dii!Uo 3henyl)-lH-pyiTol-2-ylj-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-di^ 1- diaza-2-süatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-cysteinyl} amino)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-oat (69.3 mg, 60.0 μηιοί) in 3 .0 ml Diehlorrnethan versetzt, Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT nachgerührt und dann mit Triethylsilan (48 μ.1, 300 μιηοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT naehgerährt und mit 2.0 mi Wasser (0,1%TF A) versetzt. Das Lösemittel wurde im Vakuum ohne Erwärmen verdampft. Der Rückstand wurde in Aceonitril aufgenommen, durch einen Spritzenfilter filtriert und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mlv'min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 65.9 mg (97 % d. Th.) der Verbindung Trifluoressigsäure tert-butyl-1- f [S-(l 1-{(1R)-1-[1- benz l-4-(2,5-difluorplienyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyIpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-eystemyl]amino} -3,6,9, 12-tetraoxapentadecan- 15-oat (1 : 1). LC-MS (Methode 1): R, - 1.22 min; MS (ESIpos): m/z - 1020 [M+H]+
Unter Argon wurde 1 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-2-oxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3- azaoctadecan- 18-säure (4.26 mg, 10.6 μιηοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit N,N- Diisopropylethylamin (3.2 μΐ, 18 μτηοΐ) und HATU (4.02 mg, 10.6 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min gerührt und dann mit Trifluoressigsäure tert-bulyl-l- {[S-(l l- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dim dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cysteinyl]amino} -3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15- oat (1:1) (10.0 mg, 8.82 μπιοΐ) in 1.0 ml DMF und N,N-Diisopropyiethytamin (1 ,5 μΐ, 8.8 μmoί)gelöst versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei RT nachgerährt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosit 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/W asser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.9 mg (93 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyi-i -({S-( i 1- {(1R)-1 -[ 1 - benzyl-4-(2,5-äifiuorphenyl)-lH-pyrroi-2-yi]-2,2-dm
7, 3 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- IH-pyrrol- 1 -yl)-2,l 8-dioxo-
6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-yi]-L-cysteinyl} amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15-oat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.44 min; MS (ESIpos): m/z - 1404 [M+Hf
Tert-Butyl -({S-(l l- {(lR)-l-[l-ber^l-4-(2,5-dmuo llenyi)-lH-pyrrol-2- l]-2^- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)- -[ 1 -(2,5-dioxo- 2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18~yl]~L~
cysteinyl} amino)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oat (8.20 mg, 5.84 μτηοΐ) wurde in 2.0 Trifluorethanol gelöst und mit Zinkchlorid (4.77 mg, 35.0 μητοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 50°C gerährt.
Zinkchlorid (4.77 mg, 35.0 μ.ηιοί) wurde versetzt und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei 50°C nacligerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure (10.2 mg, 35.0 μηιοΐ) versetzt, 10 min geröhrt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 1 0μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.1 mg (53 % d. Th.) der Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 1204 [M+Hf Intermediat F318
Trifluoressigsäure 3- {[2-([3-ainmo-4-fluorbutyl] {(lR)-l-[l-beiizyl-4-(2,5-difluoiplienyi)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2 hmemylpropyl} air]m^
pyrrol-l-yl)acet l]amino}ethyl)propanamid (1 : 1)
Figure imgf000434_0001
(1R)-1-[1 -Benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl ]-2,2-dimethylpropan- 1 -amin (124 mg, 350 μηιοΐ) (Intermediat C52) wurde in 5.0 ml Diehlormethan vorgelegt und mit Natriumtriacetoxyborhydrid (104 mg, 491 μηιοΐ) und Essigsäure (23 μΐ, 400 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min bei RT gerührt und dann, mit tert-Butyl-[l -fluor-4-oxobutan-2- yljcarbamat (82.7 mg, 403 μιηοΐ) (Intermediat L123) in 3.0 ml Diehlormethan gelöst versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt und dann, mit Ethylacetat versetzt. Der Ansatz wurde zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösimg und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie über Biotage/Isolera (SNAP 25g) mit Cycionexan/Ethyiacetat 95:5 als Eiuent gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhieit 146 mg (77 % d. Th.) der Verbindung tm-Butyl-[4-({(lR) -[l-benz l-4-(2,5-difluoφhenyί)-lH rrot-2- yl]-2,2-dimethy]propyl}amino)-l -fluorbutan-2-y]]carbamat.
LC-MS (Methode 13): Rt - 2.57 min; MS (ESIneg): m/z - 588 [M+CHOOH-H]"
Teri-Butyl-[4-({(lR) ^1 -benzy3- -(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yi]-2,2- dimethylpropyl}amino)-l-fJuorbutan-2-yl]carbamat (100mg, 184 μηιοΐ ) wurde in 6.0 ml DCM gelösi und mit Triethylamin (85 μί, 610 μπιοΐ) und Chloracetylchlorid (47 μΐ, 590 μιτιοΐ) bei 0°C versetzt. Die Reaktionsmi sehung wurde über Nacht bei RT gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Aceonitril/Wasser aufgenommen und mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCNAVasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 80 mg (70 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-{4-[{(lR)- l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (chloracetyl)aminoj-l-fluorbutan-2- yl}carbamat.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.67 min; MS (ESlneg): m/z - 664 [M-H+COOH]"
Teri-Butyl- {4-[ {(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluo 3henyl)-lH-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethylpropyl}(chloraceiyl)amino]-l -fluorbutan-2-yl}carbamat (79.2 mg, 128 μπιοΐ) und 3- Sulfanyipropansäure (12 μΐ, 340 μηιοί) wurden in 3.0 ml Methanol mit einem Tropfen Wasser vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde mit Kaliumcarbonat (61.8 mg, 447 μ.ηιοΐ) versetzt und 4h bei 50°C nachgerührt. Der Ansatz wurde mit Ethyl Acetat versetzt und mehrmals mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 68.6 mg (78 % d. Th.) der Verbindung 9- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-6-(fluormethyl)-2,2-dimethy1
diazapentadecan-15-säure.
LC-MS Methode 12): R, - 2.46 min; MS (ESlneg): m/z - 688 [M-H]"
9- {(1R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -6-(fluoraiethyl)- 2,2-dimethy3-4,10-dioxo-3-oxa- 12-thia-5,9-diazapentadecan-1 5-säure (15.0 mg, 21.7 μπιοΐ) und Triftuoressigsäure N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yi)acetamid (1 : 1) (8.12 mg, 26.1 μηιοΐ) (Intermediat LI) wurden in 1.6 ml DMF vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde mit HATU (9.92, mg, 26.1 μηιοΐ) und mit N,N-Diisopropylethyiamin (11 μΐ, 65 μιηοΐ) versetzt und 5 min bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser (0, 1 %TFA) versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; Ι Ομ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.6 mg (98 % d. Th.) der Verbindung teri-Butyl-[13- {(lR)-l-[l-benzyl-4- (2,5-difluorpheny 1)- 1 ii-p n"ol-2^
yl)- 17-fluor-2,7, 12-trioxo- 10-ihia-3 ,6,13-triazaheptadecan- 16-yl jcarbamai.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.36 min; MS (ESIpos): m/z - 869 [M+H]+ Tert-Bulyl-[13- {(lR)-l-[l-ben-yl-^
(2,5-dioxo-2,5-dihydro- l H-pyrrol-l -yl)-17-fl^^
yljcarbamat (17.0 mg, 19.6 umol) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (16.0 mg, 1 17 μπιοΐ) versetzt und 1 Stande bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (16.0 mg, 117 μπιοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin- ,N,N',N'-tetraessigsaeure (68.6 mg, 234 μηιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0, 1 %TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 2,50x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /W asser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 10.7 mg (60 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 14): Rt - 5.51 min; MS (ESIpos): m/z = 769 [M+H]+
Intermediat F319
N-(3-{[2-({(lRH -[ l -Ber^M-(2,5-difluo
(2,5-dioxo-2,5-dihy<fco H^yrrol-l -yl)hexan^^
oxoetii l]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-asparaginsäure
Figure imgf000436_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-( {(1R)- 1 -[ 1 -berlzyl-4 2,5-difluo henyl)-lH rlΏl-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [({3-[(2- carboxyethyl)amino]-3-oxopropyl}sulfanyl)acetyl]amino)propyl]-L-alaninamid (9.80 mg, 9.88 μ-ηοΐ) (Intermedia! Cl 16) und Di-tert-butyl-L-aspartathy\iroehlorid (1 : 1) (3.34 mg, 1 1.9 μηιοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 1 1.9 μιτιοΐ) und Ν,Ν-Diisopropylethylamin (5.2 μΐ, 30 μπιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT nachgerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.5 mg (87 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyi-N-(3- {[2-({(lR)-l-[l- beiiz l-4-(2,5-dffluo^henyi)-lH^^
dihyxiro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} amino)propyl]arnino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-aspartat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.33 min; MS (ESIpos): m/z - 1219 [M+H]+
Di~tert~butyl-N~(3~ {[2-(^^
dimethylpropyl} [3-( {N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-va!y!-L- alanyl}amino)propyl]amino)-2-oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-aspartat (9.70 mg, 7.95 μηιοί) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (6.50 mg, 47.7 μ.ηιοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (6.50 mg, 47.7 μπιοΓ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin- ,N,N',N'-tetraessigsaeure (2,7.9 mg, 55.4 μπιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 4.10 mg (47 % d. Th.) der tilel Verbindung. LC-MS (Methode 1): R, = 1.07 min; MS (ESIpos): m/z = 1107 [M+Hf
Intermediat F320
N-[6- (2,5 -Dioxo-2,5 - dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-N-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluo henyl)-lH- yrrol-2-yί]-2,2-dimeΐhylpropyί} {[(3- {[(lS)-l ,3-dicarboxypropyl]amino}-3- oxopropyl)sulfanyl]acetyl} amino)propyl]-L-alaninamid
Figure imgf000438_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-d!hydro-IH-pyrrol-l-yl)hexanoyi]-L-valyl-N-[3-( {(lR)- i-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimeihylpropyl} {[(2- carboxyethyI)suifanyljacetyi} amino)propyi]-L-alaninamid (20.0 mg, 21.7 μιηοΐ) (Intermediat C115) und di-tert-butyl~L~glutamathydrochlorid (1 : 1) (7.71 mg, 26.1 μηιοΐ) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (9.91 mg, 26.1 μηιοΐ) und N,N~Diisopropylethylamin (11 μί, 65 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und dann direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 36.4 mg (65 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyl-(2S)-2- {[(13S, 1 6S)-7-{(lR)-l -[ l - benzyl-4-(2 ,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2 ,2-dimethylpropyl}-23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrroi- 1 -yl)- 16-isopropyl- 13-methyl-6,12, 15,18-tetraoxo-4-thia-7,l 1 ,14,17-tetraazatricosan-I - oyl] amino } pentandioat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.40 min; MS (ESIpos): m/z = 1 162 [M+Hf Di-tert-butyl-(2S)-2- {[(13S,16S)-7- {(lR)-l -[^^^
dimethylpropyl} -23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)- 16-isopropyl- 13-methy 1-6,12, 15,18- tetraoxo-4-thia-7,i i,14,17-tetraazatricosan-l-oyl]amino}peniandioat (14.7 mg, 12.6 μιηοΐ) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (10.3 mg, 75.9 μηιοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (1 .3 mg, 75.9 μηιοί) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (44.4 mg, 152 μηιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend ini Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: eprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 6.0 mg (45 % d. Th.) der tttel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.10 min; MS (ESIneg): m/z = 1048 [M-H]"
Intermediat F321 -(3-{[2-({(lR)-i -[ i -Benzyi-4-(2,5^
(2,5-dioxo-2,5-dihy<fco H^yrroä-l -yl)hexanoyl^
oxoeth ljsulfanyl } propanoyl)-beta-alanyl-D-glutaminsäure
Figure imgf000439_0001
Unter Argon wurden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihych-o-lH^yrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-( {(1R)- i-[l-henzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH^^
earboxyethyl)amino]-3-oxopropyl}suifanyl)aeetyi]amino)propyl]-L-alaninamid (9.80 mg, 9.88 μπιοΓ) (intermediat Ci 16) und Di-tert-butyl-D-glutamathydiOchlorid (1 : 1) (3.51 mg, 11.9 μιηοΐ) in 1 .0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 1 1.9 μπιοΐ) und N,N-Diisopropylethy!amin (5.2 μΐ, 30 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 1.7 mg (96 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyi-N-(3- {[2-({(lR)-i -[i - benzy3"4-(2,5 iifluorphenyl)- lH-pyrrol-2- dihydro- lH-p rrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl } amino)propyl]amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoy])-beta-alanyl-D-glutamat.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.34 min; MS (ESIpos): m/z - 1233 [M+H]+
Di4ert-bu!yLN-(3- {[2-({ü^^^^
dimethylpropyl} [3-( {N- [6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl}amino)propyl]ammo)-2-oxoethyl]siiifanyl}propanoyl)-beta-alanyl-D-glutamat (11.5 mg, 9.32 μηιοΐ) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmisehung wurde mit (7.62 mg, 55.9 μτηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (7.62 mg, 55.9 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin- .lSijN'jN'-tetraessigsaeure (32.6 mg, 112 μιτιοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1 'T'FA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisier Man erhielt 6.5 mg (62 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.07 min; MS (ESTpos): m/z - 1 121 [M+H]+
Intermediat F322
N-(3-{[2-({(lR)-l -[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl) H-pyiToi-2-yl]-2,2-d^
(2,5-dioxo-2,5-dihyxaO-lH-pyrrol-l -yi)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} amino)propy
oxoeth ljsulfanyl } propanoyl)-beta-alanyl-L-glutaminsäure
Figure imgf000440_0001
Unter Argon würden N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-N-[3-( {( 1R)- l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [({3-[(2- carboxyethyl)amino]-3-oxopropyl}sulfanyl)ace1yl]a]Timo)propyl]-L-a]amnamid (9.80 mg, 9.88 μ-ηοΐ) (Intermediat C116) und Di-tert-buiyl-L-glutamathydrochlorid (1 : 1) (3.51 mg, 11.9 μηιοΐ) in 1.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (4.51 mg, 1 1.9 μηιοΐ) und N,N»Diisopropylethylamin (5.2 μΐ, 30 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Repros 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wui'den im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 1.3 mg (93 % d. Th.) der Verbindung Di-tert-butyl-N-(3- {[2-({(lR)-l -[l - benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-p>™l-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [3-({N-[
dihydro-lH-pyirol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl} amino)propyl]amino)-2- oxoethyl]sulfanyl}propanoyl)-beta-alanyl-L-glutamat.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.34 min; MS (ESTpos): m/z - 1233 [M+H]+
Di-tert-bu1yl-N-(3 - { [2-( { ( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} [3-({N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alanyl} amino)propyi]amino)-2-oxoethyl]suifanyl } propanoyl)-beta-alanyl-L-glutamat ( 1 1.0 mg, 8.92 μηιοΐ) wurde in 1.5 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid (7.29 mg, 53.5 μηιοί) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (7.29 mg, 53.5 μηιοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendia.inin-N,N,N',N'-tetraessigsaeure (31.2 mg, 107 μητοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0, 1 %TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 5.10 mg (51 % d. Th.) der titel Verbindung. LC-MS (Methode 1 ): Rt - 1.07 min; MS (ESIpos): m/z - 1121 [M+H]+
Ilttgnnediat_F323
N-[6- (2,5 -Dioxo-2,5 - dihydro- IH-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valy l-N-[3-({[(3- {[( l R)-2-(L-beta- asparagylamino)-l-carboxyethyl]amino} -3-oxopropyl)sulfanyl]acetyl} {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluo henyl)-lH- rrol-2-yl3-2^-dimethylpropyl}ammo) ro yί]-L-aίanm trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000442_0001
Figure imgf000442_0002
Unter Argon wurden 'N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihy -lH- yrrol-l-yl)hexano l]-L-valyl-N-[3-( {(lR)- l-[l-benzyl-4 2,5-difluo henyl)-lH-p rrol-2-yl]-2,2-dime lrJro yl} {[(2- carboxyethyl)sulfanyl]acetyl} amino)propyl]-L-alaninamid (10,0 mg, 7.05 μηιοΐ) (Intermediat Cl 15) und tert-Butyl-N- {(2R)-2-ammo-3-oxo-3-[2-(trimetiiylsilyl)ethoxy]propyl} -N2-(tert- butoxycarbonyl)-L-asparaginat (4.02, mg, 8.46 μηιοΐ) (Intermediat LI 24) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit HATU (3.22, mg, 8.46 μπιοΐ) und Ν,Ν-Diisopropyletiiylamin (3.7 μΐ, 21 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und direki mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 4.3 mg (32 % d. Th.) der Verbindung 6-tert-Butyl-l l-[2- (trimethylsilyl)ethy^
y 1] - 2 , 2 - dimethy lpro y 1 } - 35 - (2 , 5 -dw^
4,8,13,18,24,27,30-heptaoxo-3-oxa-16-thia-5,9,12,19,23,26,29-heptaazapentatriacontan-6,l 1- dicarboxylat.
LC-MS (Methode 5): R, - 5.32 min; MS (ESTpos): m/z - 1379 [M+H]+
6-tert-Butyl- 3 1 -[2-(trimetiiylsilyl)ethyl]-(6S,l lR,25S,28S)-19- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl3-2y2-dimethylpropyl} -35 -(2,5 -dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 28-isopropyi-2,2^5-1rimethyl-4,8,l3,l8^4,27,30-heptaoxo-3-oxa 6-thia-5,9,l 2,l9,23,26,29- heptaazapentatriacoritan-6,1 1-dicarboxylat (4, 10 mg, 73 % Reinheit, 2.37 μ/moi) wurde in 2.0 ml Trifluorethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wurde mit Zinkchlorid ( 1.77 mg, 13.0 μηιοΐ) versetzt und 3 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmiscliung wurde noch fünfmal mit Zinkchiorid (1.77 mg, 13.0 μιηοΐ) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethy3e:ndiamin-N,N,N',N' etraessigsaeure (22.0 mg, 78 μιηοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: SO mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 2.1 mg (69 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.98 min; MS (ESIpos): m/z - 1122 [M+H]+
Intermediat F324
S-[2-({(lR)- 3 -[ 3 -Benzyl-4-(2,5-difluo^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} [pyrrolidm ylmethyl]amino)-2-oxoethyl]-N-[ 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol- 1 -yl)-2, 18-dioxo-6,9,l 2,15- ietraoxa-3-azaociadecan-18- l]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (Isomer 1)
Figure imgf000443_0001
Unter Argon wurde l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pynOl-i-yl)-2-oxo-6,9,12,l 5~tetraoxa-3~ azaoctadecan- 18-säure (99.6 mg, 247 μηιοΐ) (intermedia! L74) in 1.4 ml DMF vorgelegt und mit HATU (90.4 mg, 238 μηιοΐ) und N,N-Diisopropylethylamin (41 μΐ, 240 μηιοΐ) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt und mit S-[2-( {(1 R)- 1 -[1 -Benzyl-4-(2,5- difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yl]methy3} amino)-2-oxoethy3]-L-cystein (70.0 mg, 95.2 μπ >1) (Intermediat C90) in 1.4 ml DMF gelöst versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt und direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL rnin, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in wenig Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 19.0 mg ( 18.4 % d. Th.) der Verbindung S-[2- ({(1R)- 1 1-Β6ηζγ1-4-(2,5^ΑυοφΚ6ηγ1) Η- ττο1-2-γί]-2,2-άΐ™β ί Γο γ1} {[(3R)- 1 -(tert- butoxycarbonyl pyrroiidin-3 -yl]methyl} amino)-2-oxoethyl]-N- [ i -(2,5-dioxo-2,5-dihydro 1H- pyrrol- 1 -yl) -2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3- azaoctadecan- 18-ylj-L-cystein.
LC-MS (Methode 12): Rt - 2.29 mm; MS (ESIpos): m z - 1082 [M+H
S-[2-({(lR)~l -[l -Benzyl~4-(2,5-diüuorpte
butoxyearbonyl)pyrrolidin-3-yi]methyl} amino)-2-oxoethyi]-]Si-[l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH~ pyrrol- 1 -yl)-2,l 8-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-yl]-L-cystein (17.0 mg, 15.7 μιτιοΐ) wurde in 2.0 ml Trifluorefhanol gelöst. Die Reaktionsmiscliung wurde mit Zinkchlorid (8.56 mg, 62.8 μηιοί) versetzt und 1 Stunde bei 50°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde noch einmal mit Zinkchlorid (8.56 mg, 62.8 umol) versetzt und 2 Stunde bei 50°C gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylendiamin- ,N,N',N'~tetraessigsaeure (36.7 mg, 126 μητοΐ) versetzt, dann mit Wasser (0,1%TFA) versetzt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.90 mg (22 % d. Th.) der titel Verbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.89 min; MS (ESIpos): m/z - 983 [M+H]+
Intermediat F325
N-[2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(IR)-i -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl]-N2-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]-D-alpha-glutamin -triiluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000444_0001
30 mg (0.046 mmol) von Intermediat C58 wurden mit 2,9 mg (0.055 mmol) Trifluoressigsäure - benzyl-N-(2-aminoethyl)-N2 (benzyloxy)carbon^ (1 : 1) in Gegenwart von
1.5 Equiv. HATU und 3 Equiv. NN-Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 39.5 mg (82% d.Th.) des geschützten Intennediats erhalten. Von diesem wurden zunächst hydrogenolytisch die Benzylestergrappen abgespalten. Die anschließende Kupplung mit ].- {2-[(2,5-DioxopyiTolidin- l -yl)oxy]-2-oxoethy] }-lH-pynOl-2,5-dion in DMF in Gegenwart von 3 Equiv. N,N-Diisopropylethyiamin sowie die Abspaltung der Teoc-Schutzgrappe mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intemiediat Fl 19 führte dann in 2, weiteren Schritten zur Titel Verbindung.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.44 mm; MS (ESIpos): m z - 822 ·>! · I i ) .
Intermediat F326
N 2-({(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)-l -[l -benzyi-4 2,5-difluorphenyl) H^yrrol-2-ylj
dimethylpropyl}(glycoloyl)atnino]butano
trifluoressigsäure ( 1 : 1 )
Figure imgf000445_0001
43 mg (0.066 mmol) von Intemiediat C58 wurden mit 57 mg (0.077 mmol) Intemiediat L125 in Gegenwart von 1.5 Equiv. HATU und 4 Equiv. 4-Methylmorpholin gekuppelt. Nach Reinigung mittels präparativer HPLC wurden 27 mg (34% d.Th.) des geschützten Intennediats erhalten. Dieses wurde anschließend mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben in die Titelverbindung überführt.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 805 und 807 (M+H)" . Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADO
Figure imgf000446_0001
ganten von H ί· 1 -4
ITEM-4 ist ein anti TWEAKR Antikörper, der von Nakayama et al. besehrieben wurde (Nakayama, et al, 2003, Biochem Biophy Res Comm, 306:819-825). Die Sequenzen der variablen Regionen (VH und VL) von ITEM-4 wurden in Zhou et al. (Zhou et al, 2013, J Invest Dermatol. 133(4): 1052-62) offenbart. Humanisierte Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR- Umsetzung („CDR grafting") in humane„framework regions" werden von Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4): 1052-62) sowie in WO 2009/020933 beschrieben.
Basierend auf der Veröffentlichung der Sequenzen der variablen Regionen (VH und VL) von ITEM-4 wurden in Zhou et al. (Zhou et al., 2013, J Invest Dermatol. 133(4): I052-62) sowie der Veröffentlichung der humanisierten Varianten dieses Antikörpers basierend auf CDR-Umsetzung („CDR grafting") in humane „framework regions" Zhou et al. (Zhou ei al, 2013, J Invest Dermatol. 133(4): 1052-62) und WO 2009/020933 wurden folgende Antikörper-Sequenzen erhalten:„TPP-7007",„TPP-7053",„TPP-7005",„TPP-7073",„TPP-7075" und„TPP-7076".
Durch Verbindung der variablen Regionen VH und VL des ITF.M-4 mit den konstanten Regionen (CL, CHI , CH2, CH3) eines humanen IgGi des kappa Subtyps erhält man die Sequenzen der Chimären Antikörper„TPP-7006" und„TPP-7074".
Durch Veränderung einer potentiellen Deamidierungssteiie in der L-CDR1 des ITEM-4 erhält man die Antikörper„TPP-7073",„TPP-7074",„TPP-7075" und„TPP-7076".
Weitere humanisierte Varianten des Antikörpers ITEM-4 können durch fachbekannte Verfahren der Humanisierung erzeugt werden.
ITEM-4 wurde kommerziell bezogen (unter anderem von der Firma eBioscience® als 13-9018 (Ref 7016-9018 MO 10)
B-2. All emeines Verfahren zur Expression von anti-TWEA R- Antikörpern in Säugerzellen
Die Antikörper können in transienten Säugerzeilkulturen produziert werden, wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 (siehe AK-Beispiel 1) beschrieben. B-3. Ali gemeines Verfahren zur Aufreinigung von Ant ikörpern aus Zellüberständen.
Die Antikörper, können aus den Zellkulturüberständen gewonnen werden. Dazu werden die Zellüberstände durch Zentrifugaiion von Zellen geklärt. Anschließend wird der Zellüberstand durch Affinitätschromatographie auf einer MabSelect Sure (GE Healthcare) Chromatographiesäule gereinigt. Dazu wird die Säule in DPBS pH 7.4 (Sigma/Aldrich) equillibriert, der Zellüberstand aufgetragen und die Säule mit ca 10 Säulenvolumina DPBS pH 7.4 + 500 mfvl Natriumchlorid gewaschen. Die Antikörper werden in 50 mM Natriumacetat pH 3.5 + 500 mfvl Natriumchlorid eluiert und anschliessend durch Gelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Healthcare) in DPBS pH 7.4 weiter gereinigt.
B-4. Allgemeines Verfahren zur Kupplung an Cystein-Seitenketten In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt: anti-TWEAKR AK1A (ITEM-4) anti-TWEAKR AKiB (TPP-7005) anti-TWEAKR A ic (TPP-7006) anti-TWEAKR AK1D (TPP-7007)
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxyethyl)phosphin-Hydrochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und lh bei RT gerührt. Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antikörpers in der in den Ausführungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 12 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5- 10 Äquivalente der zu kuppelnden Malemimid- Vorläufer- Verbindung oder Halogenid- Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde bei Maleinirnid-Precursern 60-240 min bei RT und bei Halogenid-Precursern zwischen 8 und 24 h bei RT gerührt und anschließend über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 mL PBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgefühlt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausruhrungsbeispieten jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.
Die in den Beispielen dargestellten ADCs können in Abhängigkeit vom Linker gegebenenfalls auch mehr oder weniger stark ausgeprägt in Form der hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegen.
Insbesondere die KSP-I-ADCs, die über die Linker-Substruktur
Figure imgf000448_0001
mit Thiolgruppen der Antikörper verknüpft sind, können auch ggf. durch Umpuffern im Anschiuss an die Kupplung und ca. 20-24-stündiges Rühren bei pH 8 gemäß Schema 26 gezielt in die die über offenkettige Bersteinsäureamide verknüpften ADCs hergestellt werden.
#1 stellt die Schwefelbrücke zum Antikörper dar und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-Inhibitor
Solche ADCs, bei denen der Linker über hydrolysierte offenkettige Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegt, können gegebenenfalls auch gezielt nach einer exemplarischen Vorschrift wie folgt dargestellt werden: Small Scale upptasig:
Zu einer Lösung von 2-5 rng des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 5 mg/ml bis 15 mg/ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2~carboxyethyl)phosphin~ Hydro- chlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 30 min bis lh bei RT gerührt. Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antikörpers in der in den Ausf lirungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 12 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5- 10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid- Vorl auf er -Verbindung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 1 0% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde 60-240 min bei RT gerührt und anschließend mit PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, auf ein Volumen von 3-7 ml verdünnt und über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Diese Lösung wurde dann über eine mit PBS-Puffer pH7.2 equiliibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH7.2 eiuiert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifügation aufkonzentriert und ■iickverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2).
Medium scale Kupplung:
60 mg des betreffenden Antikörpers in 5 ml PBS-Puffer (c~12 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0,344mg TCEP in ΙΟΟμΙ PBS-Puffer versetzt.. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.003 mmol einer Maleinimid-Voriäuferverbindung gelöst in 600μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 1 .5h-2,h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1075μ1 PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equiliibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf ein Gesamtvolumen von 14 ml verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Dann erfolgte ggf. wieder ein Umpuffern auf pH 7.2. Die ADC-Lösung wurde durch Ultrazentrifügation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH7.2) und dann ggf. erneut bis auf eine Konzentration von e twa 1 Omg/mL aufkonzentriert.
Weitere potentiell hydrolyse-sensitive Thianylsuccinimid-Brücken zum Antikörper in den Ausfülirungsbeispielen enthalten folgende Linker-Suhstrukturen, wobei #1 die Thioetherverknüpfung zum Antikörper und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP- Inhibitor darstel It:
Figure imgf000450_0001
Diese Linker-Substrukturen stellen die Verknüpfungseinheit zum Antikörper dar und haben (neben der weiteren Linkerzusammensetzung) einen signifikanten Einfluß auf die Struktur und das Profil der in Tumorzellen gebildeten Metabolite.
In den dargestellten Strukturformeln haben dabei AK IA, AKJB, AKJC und AKio,die Bedeutung: AKIA = anti-TWEA R AK1A (ITEM-4) (partiell reduziert)- S§ '
AKJB - anti-TWEAKR AKJB (TPP-7005) (partiell reduziert)- S§' AKic = anti-TWEAKR AKiC (TPP-7006) (partiell reduziert)- S§' AK,D - anti-TWEAKR AK)D (TPP-7007) (partiell reduziert)- S§!
wobei § ' die Verknüpfung mit der Suceinimid-Gruppe oder mit ggf. daraus entstandenen isomeren hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamiden bzw. des Alkylenrest.es bedeutet, und
S für das Schwefelatom eines Cystein-Restes des partiell reduzierten Antikörpers steht.
Figure imgf000451_0001
Diese Kupplungen sind beispielsweise in den Ausführungsbeispielen 194k und 294k beschrieben. Solche Verknüpfungen mit dem Antikörper können in ADCs mit KSP-Inhibitoren insbesondere in Verbindung mit einer in vivo spaltbaren 2-8 Oligopeptidgruppe SG I , die über CO mit R4 verknüpft ist, zum Einsatz kommen.
In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt: anti-TWEAK AKiA (ITEM-4) anti-TWEAKR AK1B (TPP-7005) anti-TWEAKR AK!C (TPP-7006) anti-TWEAKR AKiD (TPP-7007)
Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt etwa 10 mg mL, wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 8 Äquivalente der zu kuppelnden Vorläufer- Verbindung als Lösung in DMSO gegeben. Nach 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge an Vorläufer- Verbindung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Nach weiteren 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde der Ansatz über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 mL PBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt.
Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers ( rug mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.
In den dargestellten Strukturformeln haben dabei AK2A, AKJB, AKTC und AK?D die Bedeutung AK.2A - anti-TWEAKR AK1A(ITEM-4) - NH§2 AK2B = anti-TWEAKR AK,y (TPP-7005) - NH§2 AK2C = anti-TWEAKR AKic (TPP-7006) - NH§2 AK20 - anti-TWEAKR AK1D (TPP-7007) - H§2
wobei
§2 die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe bedeutet, und
NH für die Seitenketten- Arninogruppe eines Lysin-Restes des Antikörpers steht.
B-6a. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von geschlossenen Succinimid-Cystein-Addukten:
In einer beispielhaften Ausführung wurden 10 μχηοΐ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen wurden in 3-5 mL DMF aufgenommen und mit 2.1 mg (20 μχηοΐ) L- Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen 2h und 24 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. B-6aa, Allgemeines Verfahren zur Herstellung von isomeren geöffneten Bemstemsäureamid-
Cvstein-Addukten:
In einer beispielhaften Ausführung mirden 68 μιηοΐ der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen in 15 mL DMF aufgenommen und mit 36 mg (136 μηιοΐ) N~{[2- (Trimetliylsilyl)ethoxy]earbonyl}-L-cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde ~2öh bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF/ Wasser 1: 1 gelöst. Es wurden 131 μΕ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden -50% d. Th. der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
Im letzten Schritt wurden 0.023 mmol von diesen regiosisomeren Hydrolyseprodukten in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Aeetonitril W asser wurden die hydrolysierten offenen Sulfanylbemsteinsäure- amide als Regioisomerengemisch erhalten.
Weitere Aufreinigung und Charakterisierung der erfindungsgemäßen Konjugale
Nach erfolgter Umsetzung wurde in einigen Fällen das Reaktionsgemisch beispielsweise durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Chromatographie, beispielsweise mittels einer Sephadex® G-25, entsalzt und gereinigt. Die Elution erfolgte beispielsweise mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und eingefroren. Alternativ kann das Konjugal lyophylisiert werden.
B-7, Bestimmung des Antikörpers, der Toxophorbe ladung und des Anteils geöffneter Cyste in- Addukte
Zur Protein-Identifizierung wurde neben der Molekulargewichtsbestimmung nach Deglykosilierung und/oder Denaturierung ein tryptischer Verdau durchgeführt, der nach Denaturierung, Reduktion und Derivat isierung die Identität des Proteins anhand der nachgewiesenen tryptisehen Peptide bestätigt, Von den erhaltenen Lösungen der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Konjugale in PBS Puffer wurde die Toxophorbeladung wie folgt bestimmt:
Die Bestimmung der Toxophor Beladung von Lysin-verknüpften ADCs erfolgte nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies. Hierbei wurden vorab die Antikörperkonjugate mittels PNGaseF deglycosyliert, die Probe angesäuert und nach HPLC-Trennung/Entsalzung massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTofQ (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt Deconvolution kalkuliert. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (=Drug/ Antibody Ratio) berechnet.
Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein-verknüpften Konjugalen wurde über Reversed-Phase-Chromatographie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimnit. Zur ADC- Lösung (I mg/mL, 50μΤ) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCl) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μΤ) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analysiert.
Die HPLC- Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.1 xl 50 mm, 8 μηι particie size, 1000 Ä) bei einer Flussrate von 1 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 25 B; 3 min, 25 %B; 28 min, 50 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Triiluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril.
Die detektierten Peaks wurden durch Retentionszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (HO) des nicht konjugierten Antikörpers zugeordnet. Peaks, die ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurden, wurden der leichten Kette mit einem Toxophor (LI) und den schweren Ketten mit einem, zwei und drei Toxophoren (Hl, 332, 333) zugeordnet.
Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnet, und wobei sich die HC-load aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC -Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnet In vereinzelten Fällen kann es vorkommen, dass die Toxopliorbeladung aufgrund von Ko-Elutionen einiger Peaks nicht exakt möglich ist.
In den Fällen, in denen keine ausreichende HPLC-Trennung von leichter und schwerer Kette möglich war, erfolgte die Bestimmung der Toxopliorbeladung von Cystein verknüpften Konjugaten mittels massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette.
Zur ADC-Lösung (img/mL, 50μΕ) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCl) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithioihreitoi (DTT) (500mM, 3 μΐ,) gegeben. Die Miscln-ng wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und rnassenspektrometrisch nach online Entsaltzung mittels ESI- MicroTofq (Brillier Daltonik) analysiert.
Zur DAR-Bestimmung wurden alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Die durchschnittliche Beladung des Antiköipers mit Toxopiioren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakfiäciien als die zweifache Summe der HC-Beladung und der LC-Beladung bestimmt, wobei sich die LC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller LC-Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller LC- Peaks berechnet, und wobei sich die HC-Beladung aus der Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller HC -Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller HC- Peaks berechnet.
Zur Bestimmung des Anteils des geöffneten Cystein- Addukts wurde das Molekulargewichtsflächenverliältnis vom geschlossenen und offenen Cystein-Addukt (Molekulargewichtsdelta lSDalton) aller einfach konjugierten leichten und schweren Kettenvarianten bestimmt. Der Mittelwert über alle Varianien ei'gab den Anieil des geöffneten Cystein- Addukts.
B-8. Überprüfung der Antigen-Bindung des ADCs
Die Bindefähigkeit des Binders an das Zielmolekül wurde nach erfolgter Kopplung überprüft. Dazu sind dem Fachmann vielfältige Methoden bekannt, beispielsweise kann die Affinität des Konjugats mittels ELISA-Technologie oder Oberftächenplasmonresonanzanalyse (BIAcore™ Messungen) überprüft werden. Die Konjugatkonzentration kann der Fachmann mit gängigen Methoden messen, beispielsweise füi Antiköiper-K<mjiigate mittels Proteinbestimmuaig. (siehe auch Doronina et al.; Nature Biotechnol, 2003; 21 :778-784 und Polson et al,, Blood 2007; 1 302:616-623).
Ausführungsbeispiele Metabolite
S-[i-(2- {[2-({(2S)-2-Amino-4-[ {(l^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl ]amino}-2-oxoethyl)-2,5-dioxopyrrolidiri- 3-yl]-L-cystem -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000457_0001
1.8 mg (2 μηιοΐ) von Intermediat Fl 04 wurden in 1 ml DMF aufgenommen und mit 2.7 mg (22 ■imol) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Es verblieben 0.6 mg (26% d. Tb..) der Titelverbindung als farbloser Schaum.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.80 min; MS (EIpos): m/z - 814 [M+Hf.
Beispiel M2
4-[(2- {[2-({(2S)-2-Aii]iii^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl]amino}-2-oxoe1hyl)amino]-3- {[(2 amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobuiansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
und
4-[(2- {[2-( { (2S)-2-Amino-4-[ { (1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butooyl} araino)ethyl]araino} -2-oxoethyI)amino]-2- { [(2R)-2- amino-2-earboxyethyl]suifaDyl } -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1 )
Figure imgf000458_0001
LC-MS (Methode 1): Rt = 0.80 min; MS (EIpos): m/z - 814 [M+H]'
Zunächst wurde L-Cystein mit l -( {[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin in N- {[2-(Trimethylsilyl)et oxy]carbonyl}-L- cystein überführt.
406 mg (1.53 mmol) N- {[2-(Trimethykilyl)eihoxy]carbonyl}-L-cystein wurden in 10 ml DMF gelöst und mit 157.5 mg (1.606 mmol) Maleinsäureanhydrid versetzt und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. 130 μΕ dieser Lösung wurden mit 7.5 mg (0.01 mmol) von Intermediat C66 versetzt und der Ansatz 5 min bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Das Lösemeittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 10 mg (89%) des geschützten Intermediats erhalten, wobei weder im HPLC noch im LC-MS die Regioisomere aufgetrennt werden konnten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.38 min; MS (EIpos): m/z - 1 120 [M+H]+.
Im letzten Schritt wurden die 10 mg von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2 -Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 30 min bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiamin-N,N,NYN'-tetraessigsäiire zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus AcetonitrilAVasser wurden 8.3 mg (99% d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 87: 13 erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 2.3 min und 2.43 min; MS (ESIpos): m/z = 832 (M+H)+.
Ή-NMR Hauptregioisomer: (500 MHz, DMSO-de): δ - 8.7 (m, IH), 8.5 (m, 2H), 8.1 (m, 1H), 7.6 (m, 3 H), 7.5 (s, 1 H) 7.4-7.15 (m, 6H), 6.9-7.0 (m, 3 H), 6.85 (s, 1H), 5.61 (s, 1 H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 4.26 und 4.06 (2d, 2H), 3.5-3.8 (m, 5H), 3.0-3.4 (m, 5H), 2.75-3.0 (m, 3H), 2.58 und 2.57 (dd, IH), 0.77 und 3 ,5 (2m, 2H), 0.81 (s, 9H). Alternativ wurden die regioisomeren Titelverbindungen wie folgt hergesteilt:
Zunächst wurde dazu L-Cystein mit i-({[2-(TVimethyisiiyI)ethoxy]carbonyI} oxy)pyiToiidine-2,5- dion in DMF in Gegenwart von Λ',Λ'-Diisopropylethyiarnin in N-{[2- (Trimet ylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein überfuhrt.
55 mg (0.068 mmol) von Intennediat F104 und 36 mg (0.136 mmol) N- {[2-(Trimethylsüyl) ethoxy]carbonyl} -L-cystein 15 ml DMF gelöst und der Ansatz 20 h bei RT gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entspreciienden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 niL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 131 μΙ_ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 37 mg (50% d. Th.) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 3.33 min und 3.36 min; MS (ESIpos): m/z - 976 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 25 mg (0.023 mmol) von diesem Intennediat in 3 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril Wasser wurden 18.5 mg (85% d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 21 :79 erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 2.37 min und 3.44 min; MS (ESIpos): m/z - 832 (M+H)+. Beispiel M3
4 (2- {[(2R)-2-({(2S)-2-Amino-4-[ {(l.R)-l -[ l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyi} (glycoloyi)amino3butanoyl} a!riino)-2-carboxye yljamino} -2-oxoethyl)ammo]-3■ {[(2R)-2-ammo-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1) und
4-[(2- { (2 )-2-( {(2S)-2-Amino-4- {(l )-l - i-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-l H- y
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyi} amino)-2-carboxyethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-2-
{[(2R)-2-amino-2-carboxyethyi]suifanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000460_0001
Zunächst wurde L-Cystein mit l-({[2-(TrimeÜiylsüyl)ethoxy]cai onyl}oxy)pyiTOlidme-2,5-dioii in DMF in Gegenwart von NN-Düsopropyle&ylamin in N- {[2-(Trimeüiylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L- cystein überführt.
1 1 mg (0.013 mmol) von Intermediat F193 und 8 mg (0.016 mmol) N-{[2-(Tnmethylsilyl) ethoxy]earbonyl} -L-cystein wurden 3 ml DMF gelöst und der Ansatz 20 h bei T gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparaüve HPLC gereinigt.
Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 2 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 19 μΐ, einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Dann wurden nochmals 19 ,L L der 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde mit einer I M Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 4.1 mg (38% d. Th.) der regioisomeren geschützten Tntermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.03 min (breit); MS (ESIpos): m/z - 1020 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 4.1 mg (0.004 mmol) von diesem Intermediat in 3 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurde 3 mg (0.022 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 6 mg (0.022 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure und 2 ml einer 0.1%-igen wässrigen Trifluoressigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/'Wasser wurden 5 mg (quant.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch im Verhältnis 20:80 erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 0.78 min (breit); MS (ESIpos): m/z - 876 (M+H)+.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.36 min und 2.39 min; MS (ESIpos): m/z - 876 (M+H)+. Beispie! M4
S-(i- {2-[2-({(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)-i-[i-henzyi-4-(2 d
dimethylpropyl} (giycoioyl)aminojbutanoyl} amino)ethoxy]ethyl} -2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)-L- cystein -trifluoressigsäure (1 : 1 )
Figure imgf000461_0001
3 nig (4 μηιοΐ) von intemiediai F248 wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 0.9 mg (8 jimol) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 8 h bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingeengt und nach Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/W asser verblieben 1.1 mg (32% d. Th.) der Titel verbindung als weißer Feststoff.
LC-MS (Methode 1 ): Rt - 0.78 min; MS (Elpos): m/z = 801 [M+Hf.
Beispiel M5
(3R,7S)-7-Amino- 17- { [(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]sulfanyt} -3-[l -benzyl-4-(2,5-di£luorphenyi)- lH-pyrrol-2-yt]-4-glycotoyl-2^2-dimethyl-8,l 6-dioxo- 12-oxa-4,9, 15-triazanonadecan- 19-säure trifluoressigsäure ( 1 : 3 )
und
(3R,7S)-7-Amino-18- {[(2R)-2-amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-3-[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH~pyrrol-2-yl]-4-glycoloyl-2,2-di!nethyl-8,i6~dioxo-12-oxa~4,9,15-tri
trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000461_0002
8 mg (0.030 mmol) von der geschützten Zwischenstufe von Intermediat F248 und 5.1 mg (0.02 mmol) N- {[2-(Trimetliylsilyl) ethoxyjcarbonyl } -L-cystein 3 ml DMF gelöst und der Ansatz 1 8 h bei RT gerührt und anschließend 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 2 ml, THF/W asser 1 : 1 gelöst. Es wurden 15 μΐ, einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure auf einen pH-Wert von ~3 eingestellt, mit 20 ml Kochsalzlösung verdünnt und zweimal mit 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. Es wurden 8.4 mg (78% d. Th. über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 1.44 min und 3.43 min; MS (ESIpos): m/z = 1107 ( +H)+.
Im letzten Schritt wurden 8 mg (0.007 mmol) von diesem intermediat in 5 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 9.8 mg (0.072 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1.5 Ii bei 50°C gerührt. Anschließend wurde Ethylendiamin-N,N,N',N!-tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 4 mg (59% d. Th.) der Titel Verbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 31 :67 erhalten.
LC-MS (Methode 1 ): R, = 0.79 min und 0.81 min; MS (ESIpos): m/z - 839 (M+H)+. Beispiel M6
2- {[(2R)-2-Ammo-2-carboxyemyl]sulfanyl}-4-({(14R)-13-(3-aminopropyl)-14-[l-benzyl-4-(2,5- difiuorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-3 5,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo- 10-thia-3,6,l 3-triazahexadee- 1 - yl}amino)-4-oxobutansäure -triftuoressigsäure (1:2) und
3- {[(2R)-2-Amino-2-carboxyethy!]sulfanyl^
difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-15,l 5-dime1hyl-2,7, l 2-üioxo 0 hia-3,6,l3-triazahexadec- l- yl}amino)-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :2)
Figure imgf000463_0001
18 mg (0.021 mmol) von Intermediat F213 und 11.2 mg (0.04 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxyjcarhonyl} -L-cy siein 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (21.2 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 0.04 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunden bei RT gerührt, Es wurden 0.02 mL einer 2M wässrigen LithiumhydroxidiösuDg zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 7.2 mg (0.12 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; ΙΟμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 13 mg (57% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.03 min; MS (ESIpos): m/z - 1020 (M+H)+.
Im letzten Schritt wurden 13 mg (0.01 mmol) von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.2 mg (0.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 7 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 13.3 mg (0.05 mmol) Ethylendiamm-Ν,Ν,Ν',Ν'- letraessigsäure zugesetzt und das Produkt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser worden 10.3 mg (81.4%) der Titel Verbindung als Regioisomerengemisch erhalten.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.03 min; MS (ESIpos): m/z - 875 (M+H)+. Beispiel M7
S-(2- {[2-({(2S)-2-Amino^-[{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5^fluo^henyl) H-p iTol-2-yi]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)etiiyl]amino} -2-oxoethyl)-L-cystein trifluoressigsäu
Figure imgf000464_0001
6 mg (8 jxmol) von Tntermediat Fl 39 wurden in 3 mL DMF aufgenommen und mit 1 .8 mg ( 35 μηιοί) L-Cystein versetzt. Das Rcaictionsgemisch wurde 6 h bei RT gerührt und dann 3 Tage bei RT stehen gelassen. Anschließend wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.81 min; MS (ESIpos): m/z - 717 (M+H)+. Beispiel M8
(3R)-6- { ( 11 S, 15R)- 11 -Amino- 15-[ 1 -benzyl-4-(2,5-dif uorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] - 14-giyeoioyl- 36, 16-dimethyl-2,5,l O-trioxo-3,6,9, 14-tetraazaheptadec- 1 -yl } -5οχοΐη1θ!ηοφηοί!η-3-θ3Γ^η8§ΐ!Τ6 - trifluoressigsäure ( 1 : 3 )
Figure imgf000464_0002
4 mg (0,004 mmol) der Verbindung aus Beispiel 135 wurden in 4 L THF/Wasser gelöst und mit 48 \xL einer 2moiaren wässrigen Lithiumhydroxidlösung versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend eingeengt und mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung, Einengen und Lyophil] sation aus Acetonitril/W asser der entsprechenden Fraktionen wurden 2.4 mg (60% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (EIpos): m/z - 814 [Μ+Η . Beispiel M9
N-(3-Aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethy lpropy 1 } - 2 - hy droxy ac etamid
Figure imgf000465_0001
150.0 mg (0.42 mmol) (lR)-l-[l-Benz l-4-(2,5-d!f3uo hen l)-lH-p rrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan- 1 -amin (Mermediat C52) wurden in 2.0 ml, Dichlormethan vorgelegt und mit 29.2 mg (0.49 mmol) HOAc und 125.6 mg (0.59 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid versetzt und 5 min bei RT gerührt. Es wurden 98.9 mg (0.49 mmol) 3-(l,3-Dioxo-l,3-dihydro-2H-isoindoi-2- yljpropanal zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylaceiat verdünnt und die organische Phase zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol 100: 1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 188.6 mg (74 %) der Verbindung 2-[3-( {(lR)-l-[l~Benzyl-4~(2,5~dif
aminojpropyll- 3 H-isoindol- 1 ,3(2H)-dion.
LC-MS (Methode 1 ): Rt = 1.00 min; MS (ESTpos): m/z - 541 [M+Hf, 171.2 mg (0.32 mmol) 2-[3-({(1 )-1-[1-ΒοηζγΙ-4-(2,5-ά!Αυο 1ιβηγί)-1Η-ργτΓθ1-2-γ1]-2,2- dirnethy]piOpyl}arnirio)propyl]-lH-isoindol-l ,3(2H)-diori wurden in 5.0 ml. Dichlormethan vorgelegt und mit 73.6 mg (0.73 mmol) Trietliylamin versetzt. Bei 0 °C wurden 94.9 mg (0.70 mmol) Acetoxyessigsäurechiorid zugegeben und die Reaküonsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase zweimal mit ges. Nalxiumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaQ-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Valcuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 10 g SN AP, Fluss 12 L/min, Ethylacetaf'Cyclohexan 1 :3) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 159.0 mg (77 %) der Verbindung 2-({(lR)-l- [ 1 -Β6ηζγ1-4-(2,5 ΜυοφΚβηγ1) Η γ™^ [3-(l ,3-dioxo- 1 ,3-dihydro-
2H-isoindol-2-yi)propyl]amino)-2-oxoethylacetat.
LC-MS (Methode 1): Rt - 1.35 min; MS (ESIpos): m/z - 642 [M+H]+.
347.2 mg (0.23 mmol) 2-({(lR)-l -[ l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrroi-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} [3-(l,3-dioxo-l,3-dihydro-2H-^
wurden in 4.0 ml. Ethanol vorgelegt und mit 356.2 mg (4.59 mmol) Methanamin (40 % in Wasser) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nach! bei 50 °C gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand dreimal mit Toluol kodestiUiert. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmiltel: Dichionnethary Methanol 10: 1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 67.4 mg (63 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.91 min; MS (ESIpos): m/z - 470 [M+Hf .
Beispiel MIO
(2R,28R)-28-Amino-2~[( {2-[(3-aminopropyl) {(^
2 -yl] -2 ,2 -dimethylpropyl } amino] ~2-oxoetlw^
7, 10, 13, 16-tetraoxa-26-thia-3, 19,23 -triazanonacosan- 1 ,29-di säure -trifluoressigsäure (1 :2) und (l R,28R,34R)-l-Amino-33-(3-a inopropyl)^
35,35 limetliyi-6, 10,26,32-telTaoxo-14,17,20,23-te ^xa-3,30-dit a-7,l ly27,33- tetraazahexatriacontan-l ,4,28-tricarbonsäure -trifluoressigsäure (1:2)
Figure imgf000467_0001
20 mg (0.018 mmol) -{2-[(3-ABiinopropyl){(l ) -[l-benzyl-4-(2,5-difluo^lienyi)-lH^ rrol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} -N-[ 39-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17- oxo-4,7,10,13 eteaoxa-16-azanoDadecan-l-oyi]-L-cystem-trifiuoressigsäure (1 : 1 ) (Iniermediat F209) und 9.78 mg (0.036 mmol) N- {[2-(Trimethylsilyi) ethoxyjcarbonyl} -L-cystein wurden in 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (47.7 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 0.08 mL einer 2M wässrigen Liihiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt Anschließend wurde der Ansatz mit 9.26 mg (0.15 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von -7 eingestellt. Die Reaktionsmisehung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 15.3 mg (29% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.
LC-MS (Methode 6): Rt - 12.26 min und 12.30min; MS (ESIpos): m/z - 1254 (M+H) +.
Im letzten Schritt wurden 15.3 mg (0.01 mmol) von diesem Iniermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanoi gelöst. Es wurden 6.1 mg (0.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 13.1 mg (0.05 mmol) Ethylendiamm-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Produkt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophil isation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 1 i .9 mg (79.5%) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.85 min; MS (ESIpos): m/z - 1110 (M+H)+. Beispiel MM.
S- {2-[(3-Aminopropyl){(lR) -[l-benzyl-4-(2,5-diflu(Mphenyi)-iH-pyrrol-2-y3]-2,2^
dimethylpropyl } amino]-2-oxoeth l} -L-cystein -trifluoressigsäure (1 :2)
Figure imgf000468_0001
15.0 mg (0.018 mmol) S-(l 1 - {(^)-1-[1-Βς·Γ^Ι-4-(2,5-άϊί1υο 1ις^1)-1 Η-ρνιτο1-2-^]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 3 1 -diaza-2-silatridecan- 33-yl)-L-cystein trifluoressigsäure (3 : 3 ) (Intermediat C71) wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 7.4 mg (0.054 mmol) Zinkdiclilorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 15.8 mg (0.054 mmol) Ethylendiamin-N,N,N\N'-tetiaessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; ΙΟμ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.1 mg (77 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode 1): Rt - 0.83 min; MS (ESIpos): m/z - 573 (M+H)+. Beispiel M12
Figure imgf000469_0001
dimethylpropyl} amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)- 1 -carboxye yljamino} -4-oxobutansäure trifluoressigsäure (1 : 1
Figure imgf000469_0002
12.2 sng (0.014 mmol) 8-(11-{(1Κ)-1-[1-Ββηζγ1-4-(2,5-<ϋί3υοφ1ιβηγ1)-1Η-ργτΓθ1-2-γ1]-2,2- dimethyipropyi} -2y2-dimetliyl-6,I2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat C77) wurden in 2.0 ml. Trifluorethanoi gelöst und mit 11.4 mg (0.084 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.5 mg (0.084 mmol) Etlwlendiamin-N,N,N',N'-telraessigsäi!re versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosit 125x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeCN/W asser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.6 mg (42 %) der Titelverbindung.
LC-MS (Methode l ): Rt = 0.88 min; MS (ESTpos): m/z - 673 (M+H)+.
Beispiel M13
4-[(2- {[2-( { (2S)-2-Amino-4-[ { (1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-dirtaphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]^
ammo-2-carboxyethyl]suifaDyl } -4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1 )
Regioisomer 1, Epimer 1 (2R) oder (2S)
Figure imgf000470_0001
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.44 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H]'
Zunächst wurde Methyl-L-cysteinathydrochlorid (1 : 1) mit l -({[2-(T'rimethylsilyl)ethoxy] carhonyl}oxy)pyrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NNDiisopropylethylamin in Methyl-N- {[2-(trimethy]sily])ethoxy]carbony] }-L-cysteinat überführt.
408 mg (1.93 mmol) von kommerziell erhältlicher 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure und 180 mg (0.644 mmol) Methyl-N- {[2-(irimeihyisilyi)ethoxy']carboriyi} -L-cysteinat wurden in 8 ml DMF gelöst und mit 147 mg (0.97 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 18 h Rühren bei RT wurden nochmals 136 mg (0.64 mmol) 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure sowie 147 mg (0.97 mmol) l ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en hinzugefügt und der Ansatz weitere 12 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 153 mg (57% d. Th.) 4-Methoxy-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethy3si3y3)etlioxy]carbonyl}aniino)propyl] sulfanyl} -4-oxobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1 .74 min; MS (ESlneg): m/z - 408 (M-H)".
Von diesem Intermediat wurden 145 mg mittels überkritischer Fluide liromatographie über chirale Säulen in die Einzeldiastereomere aufgetrennt (SFC; Säule: DAICEL, AD-H 5u 2,50x20 mm; Fluss: 80 mL/min; Methode: AD-25%ETOH-80ml; Druck: 100 bar; Wellenlänge: 210 nM) und dabei wurden von Epimer 1 63 mg (43%) und von Epimer 2 58 mg (40%) erhalten.
Epimer 1 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.94 min; MS (ESlneg): m z - 408 (M-H)". 4H-NMR: (400 MHz, DMSO-ds): δ - 7.57 (d, I H), 4.24 (m, I H), 4.05 (t, 2H), 3.67 (t, IH), 3.65 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.05 (dd, IH), 2.70-2.88 (m, 2H), 2.59 (dd, I H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
Epimer 2 wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): R, - 2.95 min; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H)\
!H-NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ - 7.58 (d, IH), 4.16-4.23 (m, IH), 4.05 (t, 2H), 3.67 (dd, IH), 3.65 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 3.04 (dd, IH), 2.88 (dd, I H), 2.77 (dd, IH), 2.61 (dd, I H), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
32.5 mg (0.079 mmol) von Epimer I wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HAT'iJ und 13.4 mg (0.132 mmol) 4~Methylmorpholm mit 50 mg (0.066 mmol) von intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 43 mg (57% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Methyl-4- {[(8S)-8-{2-[ {(3 R)-l -[I -benzy]-4-
Figure imgf000471_0001
i5-yljamirio}-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2-(irimethyisiiyi)ethoxy]carbor^
sulfanyl} -4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 40 mg (0.035 mmol) dieses intermeaiats mit 0.9 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 11 ml Methanol 20 min lang bei RT gerührt, wobei beide Metbylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC -Reinigung wurden 12 mg (31% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt = 4.74 min; MS (ESIpos): m/z = 1 120 [M+H]4'.
10 mg (0.009 mmol) dieses Intermediate wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophil] sation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 2.6 mg (30% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 2.44 min; MS (ESIpos): m/z - 832 [M+Hf.
Beispiel M14
4~[(2~{[2-({(2S)-2~Amino~4-[ {(IR)~l-^
dime1hylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]aniino} -2-oxoe1hyl)arnino]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -triiluoressigsäure (1 : 1) Regioisomer 1, Epimer 2 (2R oder 2S)
Figure imgf000472_0001
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.44 min; MS (EIpos): m/z - 832 [ VI I i ;
Das in Beispiel Mi 3 beschriebene Interaiediat Epimer 2 wurde in Analogie zu der Beschreibung in Beispiel Ml 3 umgesetzt:
32.5 mg (0.079 mmol) von Epimer 2 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit SO mg (0.066 mmol) von Inierrnediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 43 mg (57% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Methyl-4- {[(8S)-8-{2-[ {(3 R)-l -[i -benzy^
p]Opyl} (glycoioyl)aminolethyl}-2,2-diinethyl-6,9 ,14-trioxo-5-oxa-7,10, 33-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amino} -2- {[(2R)-3 -methoxy-3-oxo-2-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyi} amino)propyi] sulfanyl} - 4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 40 mg (0.035 mmol) dieses Inlermediats mit 0.9 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 11 ml Methanoi 20 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergappen abgespalten wurden. Nach HPLC-Reinigung wurden 1 1 mg (28% d. Th.) des Di c arbo n säur ederivats erhalten .
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.74 min; MS (ESIpos): m/z - 1 120 [M+Hf ,
10 mg (0.009 mmol) von diesem Intermediat wui'den schließlich mit Zinkchlorid in Trifiuorethanol wie oben beschrieben vollständig enischüizt. Der Rückstand wurde mittels präparaliver HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 4.4 mg (52% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.44 min; MS (ESIpos): m/z - 832 [M+Hf. Beispiel M15
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4^
dimethylpropyl} (glycoloyl)airdno]butooyl} ainino)ethyl]ainino} -2-oxoethy i)atrrino]-3- { [(2R)-2- amiDo-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutai!säure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Regioisomer 2, Epimer 1 (3R oder 3S)
Figure imgf000473_0001
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.45 min; MS (Eipos): m/z - 832 [M+Hf.
742.8 mg (3.3 mmol) von kommerziell erhältlicher 2-Brom-4-ethoxy-4-oxobutansäure und 802 mg (2.87 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethyisiiyi)ethoxy]carbonyl}-L-cystemat wurden in 32 ml DMF gelöst und mit 655.4 mg (4.31 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 521 mg (43% d. Th.) 4-Ethoxy-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trhnethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)propyl3sulfanyi } -4-oxobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 3.13 min; MS (ESIpos): m/z - 424 (M+H)+.
Von diesem Intennediat wurden 510 mg mittels überkritischer Fluidchromatographie über durale Säulen in die Einzeldiastereomere aufgetrennt (SFC; Säule: DAICEL, AD-H 5u 250x20 mm; Fluss: 80 mL/mm; Methode: AD-10%ETOH-80ml; Druck: 100 bar; Wellenlänge: 210 nM) und dabei wurden von Epimer 1 100 mg (20%) und von Epimer 2 141 mg (28%) erhalten.
Epimer I wurde wie folgt charakterisiert: LC-MS (Methode 1): R, - 0.99 min; MS (ESIneg): m/z - 422 (M-H)\
Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.60 (d, 1H), 4.18-4.26 (m, 1H), 4.01-4.08 (m, 4H), 3.63 (s, 3H), 3.59 (dd, 1H), 3.04 (dd, 1H), 2.92 (dd, 1H), 2.80 (dd, 1H), 2.63 (dd, 1 H), 1.17 (t, 3H), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
Epimer 2 "wurde wie folgt charakterisiert:
LC-MS (Methode 5): R, - 2.95 min; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H)\
Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-ds): δ - 7.56 (d, 1H), 4.21 -4,29 (m, 1H), 4.03 -4.1 (m, 4H), 3.64 (s, 3H), 3.58 (dd, 1H), 3.08 (dd, 1H), 2.85 (dd, 1H), 2.78 (dd, 1H), 2.60 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).
33.6 mg (0.079 mmol) von Epimer 1 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und
33.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 51 mg (63% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat
Ethyl-4- {[(8S)-8- {2-[ {(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-iH-pyiTol-2-yl]-2
propyl} (glycoloyl)aminojethyl} -2,2-dimethyl-6,9, 14-trioxo-5-oxa-7, 10, 13-triaza-2-silapentadecan-
15-yl]amino} -3- { [(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl } amino)propyi] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 49 mg (0.042 mmol) dieses Intermediats mit 0.5 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 12 ml THF/ Wasser 1 : 1 30 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methyiestergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC-Reinigung wurden 11 mg (24% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.68 min; MS (ESipos): m/z - 1 120 [M+H]+.
I i mg (0.01 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril Wasser wurden 3.7 mg (39% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.45 min; MS (ESipos): m/z - 832 [M+Hf. Beispiel M16
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[
Figure imgf000475_0001
dimethylpropyl} (glycoloyl)airdno]butooyl} ainino)ethyl]ainino} -2-oxoethyI)amino]-3- { [(2R)-2- amiDo-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutai!säure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Regioisomer 2, Epimer 2 (3R oder 3S)
Figure imgf000475_0002
LC-MS (Methode 5): R, - 2.44 min; MS (EIpos): m/z - 832 [M+Hf.
Das in Beispiel M15 beschriebene Intermediat Epimer 2 wurde in Analogie zu der Beschreibung in Beispiel Ml 5 umgesetzt:
33.6 mg (0.079 mmol) von Epimer 2 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 51 mg (63% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Elhyl-4- {[(8S)-8-{2 {(lRH -[ l
Figure imgf000475_0003
propyl (glycoksyl)ami:nojethyl -2^njime1hyl-6,9,l4-lxioxo-5-oxa-7,l0,l3-triaza-2-silapeniadecan- 15-yl]amino} -3 - {[(2R)-3 -methoxy-3-oxo-2-( {[2-(trimethylsilyl)ethoxy3 carbonyi} amino)propyl] sulfanyl} -4-oxobutanoat erhalten wurden.
Anschließend wurden 49 mg (0,042 mmol) dieses Iniermediats mit 0.5 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 12 ml THF/W asser 1 : 1 30 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC-Reinigung wurden 13.4 mg (28% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.66 min; MS (ESIpos): m z - 1120 [M+H]+. 13.4 mg (0.012 mmol) dieses Intemiediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/W asser wurden 7.5 mg (66% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 2.44 min; MS (ESIpos): m/z - 832 [M+H]+.
Beispiel Ml 7
(2S)~2-Amino-4~[ {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butansäui- hydrochlorid (1 : 1)
Figure imgf000476_0001
150 mg (0.2, mmol) von Intermediat C53 wurden in 15 ml., DMF gelöst und mit 2.29 g (20.39 mmol) DABCO versetzt. Der Ansatz wurde 30 min im Ultraschallbad behandelt. Durch Zugabe von 1.17 ml Essigsäure wurde der Ansatz dann auf pH 3-4 gebracht und im Vakuum eingeengt Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt und die entsprechenden Fraktionen wurden bei RT im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Acetonitril Wasser 1 : 1 aufgenommen, mit 5 L einer 4N Salzsäure versetzt und anschließend lyophilisiert. So wurden 81 mg (68% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 2.69 min; MS (EIpos): m/z = 514 [M+Hf.
Beispiel M18
N 2-({(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH^yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)aniino]butanoyi} amino)ethyl]-L-glutamrn -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000477_0001
Zunächst wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie Trifiuoressigsäure -benzyl-N-(2- aniinoeÜiyl)-N2-[(berizyloxy)carbonyl]-L-glutarninat (1 : 1) hergestellt. Diese Interrnediat wurde dann in Gegenwart von HATU mit Interrnediat C58 gekuppelt. Anschließend wurde zunächst durch hydrogenolytische Spaltung die Berizyloxycarbonyl-Schutzgruppe sowie der Benzylester entfernt und anschiießend mit Zinkchlorid die 2-('T'rimethylsilyl)ethoxycarbonyl-Schutzgape. LC-MS (Methode 6): Rt = 1.91 min; MS (Eipos): m/z = 685 [M+Hf.
Beispiel Ml 9 6-(N-{(2S)-2-Amino-4 {(lR)-1 1-benzyl-4 2,5-clifluo henyl)-lH-pyπ·ol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (gl e (1 : 1)
Figure imgf000477_0002
Zunächst wurde nach in der Peptidchemie bekannten klassischen Schutzgruppenoperationen Trifiuoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-N2-[(benzyloxy)carbonyl]-L-lysinat (1 : 1) hergestellt. Dieses Interrnediat wurde dann in Gegenwart von HATU mit Interrnediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde zunächst mit Zinkchlorid die 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-Schutzgrupe sowie der 2-(Trimethylsilyl)ethyIester gespalten. Schließlich wurde die Titeiverbindung durch hydrogenolytische Spaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe und Reinigung durch präparative HPLC erhalten.
HPLC (Methode 1 1): Rt = 1.65 min; Beispiel M20
(lR,4R,27R,33RH-Aiimo-32-(3-anm^^
yl]-34,34-dimethyl-6,9,25,31 -tetraoxo- 13,16,19,22-ielraoxa-3,29-dithia-7, 10,26,32- tetraaza entatriacontan- 1 ,4,27-tricarbonsäure -trifluoressigsäure (1:2)
Figure imgf000478_0001
Zunächst wurde Methyl-L-cystemathydrochlorid (1 : 1) niit 1 -( {[2-(Trimethyäsiäyl)ethoxy] carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von NN-Diisopropyie&ylamin in Melhyl-N- {[2-(trimethylsilyl)eÜioxy]carbonyl}-L-cysteiiiat überfuhrt.
408 mg (1.93 mmol) von kommerziell erhältlicher 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure und 180 mg (0.644 mmol) Methyl-N-{[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carboriyl}-L-cysteiriat wurden in 8 ml DMF gelöst und mit 347 mg (0.97 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 18 h Rühren bei RT wurden nochmals 136 mg (0.64 mmol) 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure sowie 147 mg (0.97 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en hinzugefügt und der Ansatz weitere 12 Ii bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 151 mg (57% d. Th.) 4-Methoxy-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (triniethylsilyl)eihoxyjcarbonyl} amino)propylj sulfanyl} -4-oxobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.74 min; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H)~. 3,66 mg (8.93 μτηοΐ) von 4-Methoxy-3■ {[(2R)-3 -methoxy-3-oxo-2-( {[2- (trimethylsi3yl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl] sulfany!} -4-oxobutansäure wurden in Gegenwart von 3.66 rng (8.93 μιηοΐ) HATU und 1.6 μΐ (15 μηιοί) 4-Μ6 1ιηο 1ιο1ίη mit 13.0 rng (7.44 μτηοΐ) von S-(i l- {(lR) 1-Benzyl-4-(2,5-difluo hen l) H yτrol-2-yl]-2,2-dimeth lpro yl} - 2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 15-(glycylamino)-4,7, 10,13- tetraoxapeDtadecaD- 1 -oyl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat C80) gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 3.9 mg (37% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat S-(3 1 - {(1R)- 1 -[ 1 - Benzyl-4-(2,5-difluo^henyl)-lH-pyro^
Figure imgf000479_0001
dimethy 1-6,13-dioxo-5-oxa- 10-thia-7-aza-2-silatridecan- 13-yl]glycyl} amino)-4, 7, 10,13- tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cystein erhalten wurden.
Anschließend wurden 3.90 mg (2.76 μηιοΐ) dieses Intermediats mit 35 μΐ einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 1.0 ml THF/Wasser 3: 1 15 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC-Reinigung wurden 3.60 mg (94% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.83 min; MS (ESIpos): m/z - 1385 [M+H]4".
3,6 rng (2.6 μηιοΐ) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und LyophiKsation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 1.92 mg (55% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.72 min; MS (ESIneg): m/z - 1094 [M-H]".
BcispieLMll
(2R,24S,27R)-27-Amino-2-[({2-[(3-amrnopropyl) {(lR)-l-[l-benz l-4-(2,5-difluo henyl)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} amino] -2-oxoethyl } sulf anyl)methylj-24-(carboxymethyl)-4,20,23- trioxo-7,10, 13,16-tetraoxa-25-thia-3, 19,22-!riazaoctacosan- 1 ,28-disäure -trifluoressigsäure (1 :2)
Figure imgf000480_0001
742.8 mg (3.3 mmol) von kommerziell erhältlicher 2-Brom-4-ethox -4-oxobutansäure und 802 mg (2.87 mmol) Methyl-N-{[2-(trimetliyisiiyi)ethoxy]carbonyl}-L-cystemat wurden in 32 ml DMF gelöst und mit 655.4 mg (4.31 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 521 mg (43% d. Th.) 4-Ethoxy-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (toimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl3sulfanyi}-4H)xobutansäure erhalten.
LC-MS (Methode 5): R, - 3.13 min; MS (ESlpos): m/z - 424 (M+H)+.
4.36 mg (10.3 μιηοΐ) von 4-Elhoxy-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimetliylsilyl)ethoxyjcarbonyl) amino)propyl]sulfanyl} -4-oxobutansäure wurden in Gegenwart von 3.92 mg (10.3 μηιοΐ) HATU und 1.9 μί (17 μηιοΐ) 4-Meihylmorpholin mit 15.0 mg (8.59 μηιοΐ) von S-(l l- {(lR) -[l -Benzyl-4-(2,5-difluo henyl) H-p ^τol-2-yl]-2,2-dimeth lpro yl} - 2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 15-(glycylammo)-4,7, 10, 13- tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-cystein -trilluoressigsäure (1 : 1) (intermediat C80) gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 3.6 mg (26% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat S~(l l- {(lR)-i~[i~ Benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)-iH-pyrroi-2-yll-2,2- oxa-7,1 l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[15-({N-[(8R,l l S)-I l-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-8- (methoxycarbonyl)-2,2-dimethyl-6, l 2-dioxo-5-oxa-10-thia-7-aza-2-siladodecan-12- yljglycyl} amino)-4,7, 10, 33-tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-cystein erhalten wurden.
Anschließend wurden 6.20 mg (2.82 μηιοΐ) dieses Intermediats mit 35 μΐ einer 2 molaren Lithiumhydroxidiösung in 1.0 ml THF/Wasser 1: 1 15 min lang bei RT gerührt, wobei beide Estergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC- einigung wurden 3.60 mg (92% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 4.71 min; MS (ESIpos): m/z - 1385 | M · 1 1 i .
3,60 rng (1.69 μιηοΐ) dieses Intermediats wurden schließlieh mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschlieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus AcetonitrilAV asser wurden 0.88 mg (39% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.72 min; MS (ESTneg): m/z - 1094 [M-H]".
Beispiel M22
(2R,27R)-27-Amino-2-[( {2-[(3-aminopropyl) {(1R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfanyl)methyl]-24-(carboxymethyl)-4,20,23-h"ioxo- 7, 10, 13, 16-tetraoxa-25-thia-3, 19,22-triazaoctacosan- 1 ,28-disäure~trifiuor essigsaure (1 :2) und (lR,27R,33R)-l-Amino-32-(3-aminopropyl)-33-[l-berlzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-
34,34-dimethyl-6,9,25,31 -tetraoxo- 13, 16, 19,22-tetraoxa-3,29-dithia-7,l 0,26,32- tetraazapentatriacontan- 1 ,4,27-tricarbonsäure-trifluoressigsäure (1 :2)
Figure imgf000481_0001
36.5 mg (0.015 mmol) S- {2-[(3-Aminopropyl) {(lR)- l -[].-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-p πΌl- 2-yl]-2,2-dime1hylpropyl}am!no]-2-oxoethyi}-N-[i -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l^ 8- dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-18-yl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat F257) und 8.18 mg (0.031 mmol) N- {[2-(Trimethylsilyl) etlioxyjcarbonyl } -L-cystein wurden in 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 Ii bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (28.9 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 0.046 mL einer 2,M wässrigen Liihiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunde bei RT gerührt Anschließend wurde der Ansatz mit 5,2 μϊ (0.092, mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/rnin, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 12.1 mg (58% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediale erhalten.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.82 mm; MS (ESIpos): m/z - 1240 (M+H .
Im letzten Schritt wurden 12, 1 mg (0.009 mmol) von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 7.3 mg (0.054 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 15.7 mg (0.054 mmol) Elhylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemitte wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 6.4 mg (59%) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch erhalten.
LC-MS (Methode 1): R, - 0.86 min; MS (ESIpos): m/z - 1096 (M+H)\ Beispiel M23
N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l -berrzyl-4-(2,5^^
propyl}(glycoloyl)amino]butanoyl} -beta-alanyl-L-glutaminsäure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000482_0001
Zunächst wurde Di-tert-butyl L-glutamate hydrochloride (1 : 1) in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin mit Intermediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde das geschützte Intermediat in Trifluorethanot aufgenommen und durch Rühren über Nacht bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.45 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+H]+. Beispiel M24
N- {(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)- l -[ l -benzyl-4-(2,5-difluorpheny])-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dime1hylpropyi}(glycoloyi)aDimo]butanoyi}-beta-alrayl-D-giutamii!säure -trifluoressigsäure (1 : 1)
Figure imgf000483_0001
Zunächst wurde Di-tert-bu1yl D-glutamat Hydrochlorid (1 : 1) in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethylamin mit Tnterniediat C61 gekuppelt. Ansehließend wurde das geschützte Intermediat in Tr fJuorethanol aufgenommen und durch Rühren bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.41 min; MS (ESIpos): m/z - 714 [M+H]+. Beispiel M25
N- {(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)- l -[ l -benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -L-glutaminsävtre -trifluoressigsäure (1 : 1 )
Figure imgf000483_0002
Zunächst wurde Di-tert-butyl L-glutamat Hydrochioride (1 : 1) in Gegenwart von HATIJ und N,N- Diisopropylethylamin mit Intermedia! C61 gekuppelt. Im nächsten Sehritt wurde die Z- Schutzgruppe durch 45-minütige Hydrierung über 10 -igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Anschließend wurde das partiell geschützte Intermediat in Trifiuorethanol aufgenommen und durch 7 stündiges Rühren bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.
LC-MS (Methode 12): Rt - 1.44 mm; MS (ESIpos): m/z - 643 [M+Hf.
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Ammo-4-[ {(lR)^
dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]hutanoyl) amino)ethyl]amino} -2-oxoethyl)amrno]-2-{[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäi!re -trifluoressigsäure (1: 1)
Regioisomer 1, Epimerengemisch
Figure imgf000484_0001
Dieses Beipiel beschreibt das Epimerengemisch der Verbindungen aus Beispiel 13 und Beispiel 14. Die Synthese erfolgte in Analogie zu Beispiel 33, wobei auf die Auftrennung der beiden Epimere durch überkritische Fluid-Chromatograpie verzichtet wurde und die Titelverbindung als Epimerengemisch hergestellt wurde.
LC-MS (Methode 5): R, = 2.43 min; MS (ESIpos): m z = 832 [M+Hf. Beispiel M27
4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l-ber^
dime1hylpropyi}(gly<x)loyi)amino]butanoyi}amino)ethyl]amino}-2-oxoe1hyl)amiD
amiDo-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1: 1)
Regioisomer 2, Epimerengemisch
Figure imgf000485_0001
Dieses Beipiel beschreibt das Epimerengemisch der Verbindungen aus Beispiel 15 und Beispiel 16, Die Synthese erfolgte in Analogie zu Beispiel 15, wobei auf die Auftrennung der beiden Epimere durch überkritische Fluid-Chromatograpie verzichtet wurde und die Titelverbindung als Epimerengemisch hergestellt wurde.
LC-MS (Methode 5): Rt - 2.45 min; MS (Elpos): m/z - 832 [M+Hf.
Anisführniigsbeispieie ADCs
Die in den Strukturfonrien der Ausiührungsbeispiele dargestellten ADCs, die über Maleinimid- Reste an Cysteinseitenketten der Antikörper gekuppelt Wiarden, liegen in Abhängigkeit vom Linker und von dem Kupplungsprotokoll zum überwiegenden Teil in den jeweils dargestellten ringgeöffneten bzw. ring-geschlossenen Formen vor. Zu einem kleinen Anteil kann jedoch die jeweils andere Form in der Präparation enthalten sein.
Figure imgf000486_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F194 2,5 mg anti-TWEAKR AKIA (ITEM-4) in PBS (c = 10 nig/niL), Zunächst wurden 4Eq von Intermediat F194 gelöst in 25μΕ DMSO zugesetzt und nach l h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerühr Anschließend wurde der Ansatz über eine Sephadex- Säule gereinigt und dann durch Ulirazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS,
Protein Konzentration: 1.22 mg'mL
Drug/mAb Ratio: 2.8
Beispiel 208n
Figure imgf000487_0001
5 mg anti-TWEAKR AKiA (1TEM-4) in 0.450 ml PBS (c=l l.l mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50 μΐ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.19 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F l 04 gelöst in 50 μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G~ 25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ullrazentrifugation aufkonzentriert und lückverdünni mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.78 mg/mL
Drug/m Ab Ratio: 1.7
50 mg anti-TWEAKR AKJA (ITEM-4) in 5 ml PBS (c=10 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.287 mg TCEP in 0.5 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 2.15 mg (0.00267 mmol) von Intermediat F l 04 gelöst in 500 μ! DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 4 ml PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde durch Ullrazentrifugation aufkonzentriert, lückverdünni mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 16.2 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 1.4
70 mg anti-TWEAKR AK)C (TPP-7006) in 7.4 mi PBS (e=9.5 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.4 mg TCEP in 0.6 mi PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 2.64 mg (0.00327 mmol) von Intermediat F104 gelöst in 800 uA DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1.2 ml PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden mit PBS Puffer (pH8) auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt und dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH- Wert von 7.2 umgepuffert Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 12.2 mg mL
Drug/mAb Ratio: 2.7
Bei dieser ADC-Präparation wurde ein Anteil der ring-geöffneten Berosteinsäureamid-Form von 84.1% ermittelt.
Beispiel 208s
70 mg anti-TWEAKR AKra (TPP-7005) in 7.4 ml PBS (c=9.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.4 mg TCEP in 0.6 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 2.64 mg (0.0032,7 mmol) von Intermediat Fl 04 gelöst in 800 μ! DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1 .2, ml PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepuffert. Die vereinigten Eluate wurden mit PBS Puffer (pH8) auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt und dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH- Wert von 7.2 umgepuffert Anschließend wurde durch Ultrazenfrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 10.99 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.4
Bei dieser ADC-Präparation wurde ein Anteil der ring-geöffneten Bernsteinsäureamid-Form von 84.4% ermittelt. Beispiel 208(8
70 mg anti-TWEAKR AKu> (TPP-7007) in 7.4 ml PBS (c=9.5 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.4 mg TCEP in 0.6 mi PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT geröhrt und anschließend wurden 2.64 mg (0.00327 mmol) von Intennediat Fl 04 gelöst in 800 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 3 .2 ml PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und dann mittels PD-10 Säulen auf pH 8 umgepufferi. Die vereinigten Eluale wurden mit PBS Puffer (pH8) auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt und dann über Nacht bei RT unter Argon gerührt.
Dann wurde mittels PD-10 Säulen mit PBS Puffer auf einen pH-Wert von 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 12.01 mg mL
Drag/m Ab Ratio: 2.8
Bei dieser ADC-Präparation wurde ein Anteil der ring-geöffneten Bernsteinsäureamid-Form von 85.2% ermittelt.
Figure imgf000489_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intennediat F240 5 mg anti-TWEAKR AKic (TPP-7006) in 450 μΐ, PBS bei pH 7.2 (c=l l.l mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurden 0.20 mg (0.23 μηιοΐ) F240 in 50 μΐ, DMSO hinzugegeben und weitere 90 min Rühren bei RT geröhrt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS-Puffer (pH 8) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch foigendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.55 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.8
Beispiel 257n
Figure imgf000490_0001
5 mg anti-TWEAKR AK!A (ITEM-4) in 319 μ3_ PBS (c=15.7 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 2031 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerülirt. Anschließend wurden 0.250 mg (0.00023 mmol) von Intermedia! F257 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ulirazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde fol gende rmaß e n charakterisi ert :
Protein Konzentration: 1.44 mg/mL
Drug'mAb Ratio: 1.0 Beispiel 257p
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F257 5 mg anti-TWEAKR AKm (TPP-7005) in 450 μΕ PBS bei pH 7.2 (c=l l.l mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurden 0.25 mg (0.23 μηιοΐ) F257 in 50 μΕ DMSO hinzugegeben und weitere 90 min Rühren bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS-Puffer (pH 8) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerühit. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentriiligation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.67 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 4.7
Figure imgf000491_0001
2.5 mg anti-TWEAKR AKiA (ITF.M-4) in 250 μΕ PBS (c= 10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Losung aus 0,014 mg TCEP in 25μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0,151 mg (0.00013 mmol) von Intermediat F260 gelöst in 25μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 2200 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und riickverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unier diesen Bedingungen auch in der ringgeschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.49 mg/ml, Drug/mAb Ratio: 2.2
Beispiel 274a
Figure imgf000492_0001
2.5 mg anti-TWEAKR AKIA (ΠΈΜ-4) in 208 μΕ PBS (c-12.0 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.014 mg TCEP in 25μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 967 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.1 16 mg (0.00012 mmol) von Intermediat F274 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Röhren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der Ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.31 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 1.5 Beispiel 275H
Figure imgf000493_0001
2.5 mg anti-TWEAKR AKIA (ITEM-4) in 208 μί_. PBS (c=12.0 rng/inL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.014 mg TCEP in 25μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 967 μ! PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.1 36 mg (0.00012 mmol) von Intermediat F275 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der Ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.29 nig/mL
Drug/m Ab Ratio: 1.8 BeissMe! 281n
Figure imgf000494_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intennediat F281 2.5 mg anti-TWEAKR AKIA (ITEM-4) in 208 μΐ, PBS bei pH 7.2 (c=12 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.014 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.1 1 mg (0.12 μιτιοΐ) F281 in 25 μΕ DMSO 20 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rüekverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 0.59 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 1.3
Beispiel 281p
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intemiediat F281 5 mg anti-TWEAKR AKIB (TPP-7005) in 500 μΐ, PBS bei pH 7.2 (c=10 mg mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.25 mg (0.27 μτηοΓ) F281 in 50 μΕ DMSO 20 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.9 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.4
Beispiel 281q
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F281 5 mg anti-TWEAKR AKID (TPP-7007) in 500 μΐ. PBS bei pH 7.2 (c=10 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0,029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.2,5 mg (0.27 μηιο! ) F281 in 50 μΕ DMSO 2.0 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 2.55 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.8
Figure imgf000495_0001
5 mg anti-TWEAKR AKIA (ΠΈΜ-4) in 417 μί_. PBS (c=12 mg mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt und 45 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0,29 mg (0.7 μηιοΐ) von Interaiediat F284 gelöst in 50μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equilhbrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation auflionzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.81 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.0
Beispiel 284o
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Interaiediat F284 5 mg anti-TWEAKR AK1 C (TPP-7006) in 400 μί. PBS bei pH 7.2 (c=12.5 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrag 30 min. Dann wurden 0.26 mg (0.23 μτηοΐ) F284 in 50 p.L DMSO hinzugegeben und weitere 90 min Rühren bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS-Puffer (pH 8) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentriiligation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.88 mg/ml,
Drag/m Ab Ratio: 3.1
Beispiel 284p
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Interaiediat F284 5 mg anti-TWEAKR AKJB (TPP-7005) in 450 μ,Ι, PBS bei pH 7.2 (c=l l .1 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCF.P betrug 30 min. Dann wurden 0.26 mg (0.23 μηιοΐ) F284 in 50 μΐ, DMSO hinzugegeben und weitere 90 min Rühren bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS-Puffer (pH 8) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 2.11 mg/mL
Drag/m Ab Ratio: 2.5
Figure imgf000496_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F294 2,5 mg anti-TWEAKR AKIA (ITEM-4) in PBS (c = 10 mg/mL). Zunächst wurden 4Eq von Intermediat F294 gelöst in 25μΕ DMSO zugesetzt und nach I ii Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml, verdünnt, über eine Sephadex-Säuie gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 1.52 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 4.0
Figure imgf000497_0001
2,5 mg anti-TWEAKR AKi A (ITEM-4) in 250 μΕ PBS (e=10 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.014 mg TCEP in 25 μΐ PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.105 mg (0.12 μηιοΐ) von Intermediat F296 gelöst in 25 ΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT mffde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon geröhrt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 0.74 mg mL
Drug/mAb Ratio: 1.4 Beispiel 296o
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Interaiediat F296 5 mg anti-TWEAKR AK1 C (TPP-7006) in 500 μΕ PBS bei pH 7.2 (c-10 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCF.P betrag 30 min. Dann wurden 0.23 mg (0.23 μτηοΐ) F296 in 50 μΐ, DMSO hinzugegeben und weitere 90 min Rühren bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS-Puffer (pH 8) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pFI 8 eluieri und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.74 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.0
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F296 5 mg anti-TWEAKR AKIB (TPP-7005) in 500 μΐ, PBS bei pH 7.2 (c=10 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurden 0.21 mg (0.23 μιηοΐ) F296 in 50 μΕ DMSO hinzugegeben und weitere 90 min Rühren bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit PBS-Puffer (pH 8) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10- Säule (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eluieri und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.92 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 2.6
Beispiel 297n
Figure imgf000499_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Inte mediat F297 2.5 mg anti-TWEAKR AKJA ΠΈΜ-4) in 208 ,LIL PBS hei pH 7.2 (c= 12.0 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.014 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.12 mg (0.13 μιηοΐ) F297 in 25 \iL DMSÖ, 90 Minuten bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 0.79 mg mL
Diu g/mAb Ratio: 1.6
Beispiel 322(8
Figure imgf000500_0001
Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermedia! F322 5 mg anii-TWEAKR AKro (TPP-7007) in 450 xL PBS bei pH 7.2 (c= 1 1.1 mg mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrag 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.262 mg (0.23 μηιοΐ) F322 in 50 μΙ_. DMSO, 90 min bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels IJltrazenlrifügation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.
Protein Konzentration: 2.14 m /mL
Drug/mAb Ratio: 4.2
Beispiel 325p
Figure imgf000501_0001
5 mg anti-TWEAKR AK1B (TPP-7005) in 0.450 ml PBS (c=l l .l mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50 μΐ PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F325 gelöst in 50 μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G- 25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS-Puffer pH 8 eruiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 2.09 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 3.3
Beispiel 326p
Figure imgf000502_0001
5 mg anti-TWEAKR A !B (TPP-7005) in 0,450 ml PBS (c=l 1.1 rng/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50 μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.22 mg (0.00023 mmol) von Intemiediat F326 gelöst in 50 μΐ DMSO zugegeben. Der Ansatz wurde anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt, dann mit PBS Puffer (pH7.2) auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH7.2 equülibrierte PD 10-Säule (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 1.88 mg/mL
Drug/mAb Ratio: 4.4
C: Bewer mg der biologisches Wirksamkeit
Die biologische Wirkung der erfindungsgernäßen Verbindungen kann durch die nachstehend beschriebenen Assays gezeigt werden: a. C-la Bestimmung der cytotoxisehen Wirkung der gegen TWEAKRgerichieten ADCs
Die Analyse der cytototoxisctien Wirkung der ΙΤΕΜ-4-ADCs erfolgt auf verschiedenen Zelllinien:
NCI-H292: humane mukoepidermoide Lungenkarzinonizellen, ATCC-CRL-18 8, Slandardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% PCS (Sigma #F2442), TWEAKR-positiv, EGFR-positiv.LoVo humane kolorektale Krebszellen, ATCC No. CCL-229, Kultivierung für MTT-Assay: Standardmedium: Kaig n's + L-Glutamin (Invitrogen 21127) + 10% lieat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064). Kultivierung für CTG-Assay: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442). TWEAKR-positiv.
BxPC3: humane Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, ATCC-CRL- 1687, Standardmedium: RPMI 1640 (Biochrom; #FG1215, stab. Glutamin) + 10% FCS (Sigma #F2442)), TWEAKR-positiv.
KPL4: humane Brustkrebszelllinie, Bayer Pharma AG (identity checked and confirmed on 19.7.2012 at DSMZ), Slandardmedium: RPMI 1640 (Fa. Gibco; «21875- 059, stab. L-Glutamin) + 10% heat inactivaied FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); HER2 -positiv.
A498: humane Nierenkrebszeiien, ATCC No. HTB-44, Standardmedium: MEM mit Earle's Salzen + Glutamax I (Invitrogen 41090) + 10% heat inactivaied FCS (Fa. Gibco, No. 10500- 064),TWEAKR-positiv.
786-0: humane Nierenkrebszellen, ATCC No. CRL- 1932, Standardmedium: RPMI 1640 + Glutamax I (invitrogen 63 870) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064),, TWEAKR-positiv.
SK-HEP-1: humane Leberkrebszelllinie, ATCC No. HTB-52, Standardmedium: MEM mit Earle's Salzen + Glutamax I (Invitrogen 41090) + 10% heat inactivated FCS (Fa. Gibco, No. 10500-064); TWEAKR positive.
Kultivierung der Zellen erfolgt nach Standard-Methode, wie bei der American Tissue Culture Collection (ATCC) für die jeweiligen Zelllinien angegeben. MTT-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardmethode, mit den unter C-1 angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Accutase in PBS (Fa. Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (NC! H292: 2500 Zellen/well, KPL-4: 1200 Zellen/well, SK-HEP-1: 1500 Zellen/well in Ι ΟΟμΙ Gesamtvolumen). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 48h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt Dann wurden die Metaboliten in 10-xL Kulturmedium in Konzentrationen von 10"5M bis 30""M zu den Zellen (Tripiikate) pipettiert, bevor der Ansatz im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubierte. Nach 96h erfolgte die Detektion der Zellproliferation mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-1010K). Hierzu wurde das MTT Reagens für 4h mit den Zellen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergenzes die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffs erfolgte bei 570nm (Infinite Ml 000 pro, Fa. Tecan). Aus den gemessenen Daten wurde der ICso- Werl der Wachstumshemmung unter Verwendung der DRC (Dose Response Curve) berechnet. Die Proliferation ohne Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelten Zellen, wird als 100% Wert definiert.
CTG-Assay
Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach StandardMethode, mit den unter C-1 angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Trypsin (0.05%) und EDTA (0.02%) in PBS (Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weissem Boden (Costar #3610) ausgesät (in 75(.ii/Loch, folgende Zellzahlen je Loch: NCT-H292: 2500 Zellen/ Loch, BxPC3 2500 Zellen / Loch) und im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 24h wurden die Antikörper- Wirkstoffkonjugate in 25 ΐ Kulturmedium (vierfach konzentriert) auf die Zellen gegeben, so dass finale Konzentrationen der Antikörper- Wirkstoffkonjugate von 3 x 10"' M bis 3 x 10"" M auf den Zellen erreicht wurden (Tripiikate). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. In einer parallelen Platte wurde die ZelJvitalität zu Beginn der Wirkstoffbehandlung (Tag 0) mit dem Cell Titer Glow (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega #G7573 und #G7571) bestimmt. Dazu wurden pro Zellansatz ΙΟΟμΙ des Substrats hinzugefügt, die Platten anschließend mit Alufolie abgedeckt, für 2 Minuten mit dem Plattenschüttler bei 180 rpm geschüttelt, für 8 Minuten auf der Laborbank stehen gelassen und dann mit einem Luminometer (Victor X2, Perkin Elmer) gemessen. Das Substrat deiektiert den ATP-Gehalt in den lebenden Zeilen, wobei ein Lumineszenz-Signal erzeugt wird, dessen Höhe direkt proportional zur Vitalität der Zellen ist. Nach 72h Inkubation mit den Antikörper- Wirkstoffkonjugaten wurde nun auch in diesen Zellen die Vitalität mit dem Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay wie oben beschrieben bestimmt. Aus den gemessenen Daten wurde die ICso der Wachstumshemmung im Vergleich zum Tag 0 unter Verwendung des DRC (Dose Response Curve) Anaiysis Spreadsheets anhand einer 4-Parameter Anpassung berechnet. Das DRC Anaiysis Spreadsheet ist ein von Bayer Pharma AG und Bayer Business Services auf der Plattform IDBS E-WorkBook Suite entwickeltes Biobook Spreadsheet (1DBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK).
In den folgenden Tabellen la und lb sind die TCso-Werte repräsentativer Austuhrungsbeispiele mit den anti-TWEAKR- Antikörpern aufgeführt:
Tabelle la
Figure imgf000505_0001
Tabelle lb
NCI-H292 SK-Hep- !
Beispiel ICso [Ml ICso [M]
MTT MTT
208o 7.25E-11 3.05E-11
208p 1.25E- 10 2.07E-11
208q 1 .14E- 30 2.17E-1 1 NCI-H292 SK-Hep-1
Beispiel ICso [M] ICso [M]
MTT MTT
240o 5.66E-11 I .36E-11
257p 2.43E-11 1.13E-11
281p 1.87E- 11 1.10E-11
281 q 4.3 I E- 11 1.59E-11
284o 2,26E-10 3.80E- 3 1
284p 2,16E- 30 2.72E-1 1
296ο 2.80E-10 5.61E-11
296p 2.58E-10 7.61E-3 1
322q 2.62E-11 1.32E-11
325p 2.47E- 3 1 2.30E-1 1
326p 8.81E-11 2.60E-11
Die angegebenen Wirkdaien beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausfülirungsbeispieie mit den angegebenen Drug rnAB-Ratios. Die Werte können bei anderen Drug/mAB-Ratios gegebenenfalls abweichen. Bei den TC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Exprimenten oder um Einfachwerte. Die Wirkung der aDti-TWEAK -Antiköφer-Wirkstoffkonjugate war selektiv versus der jeweiligen Isotypkontrolle, die den jeweils entsprechenden Linker und Toxophor enthielt.
Crib... Bestonm^
Beispiele
Die Motordomäne des humanen Kinesinspindelproteins KSP /Eg5 (Fa. tebu-bio/ Cvtoskeieton Inc, o. 027EG01-XL) wurde in einer Konzentration von ΙΟηΜ mit 50^ig/mL Taxol (Fa. Sigma No. T7191 -5MG) stabilisierten Microtubuli (bovine oder porcine, Fa. tebu-bio/ Cvtoskeieton Inc) für 5 min bei RT in 15mM PIPES, pH 6,8 (5mM MgCl2 und lOmM DTT, Fa. Sigma) inkubiert. Die frisch hergestellte Mischung wurde in eine 384 MTP (Fa. Coming) aliquotiert. Es folgte die Zugabe der zu untersuchenden Inhibitoren in Konzentration von 1.0 xlO-6M bis l .Ox 10-13M und ATP (finale Konzentration 500μΜ; Fa. Sigma). Die Inkubation erfolgte über 2h bei RT. Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des entstehenden anorganischen Phosphats mit Malachit-Grün detektiert (Fa. Biomol). Nach der Zugabe des Reagenz erfolgte eine 50 min Inkubation bei RT, bevor die Detektion der Absorption bei einer Wellenlänge von 620nm erfolgte. Als Positivkontrolle wurden Monastro! (Fa. Sigma, M8515-lmg) und Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience A I 0486) verwendet Die Einzeldaten der Dosis- Wirkungskurve steilen achtfach Bestimmungen dar. Bei den ICso- Werten handelt es sieh um Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Als 100% Kontrolle diente die nicht mit Inhibitoren behandelte Probe.
In der folgenden Tabelle 2 sind die lCso-Werte repräsentativer Ausfiihrungsbeispiele aus dembeschriebenen Assay und die korrespondierenden zytotoxischen Daten (MTT-Assay) zusammengefasst:
Tabelle 2
NCI-H292 KPL4
Beispiele KSP-Assay
ICso [M] ICso [M]
ICso [M]
MTT Assay MTT Assay
Ml 2.01 E-09 5.00E-07 5.00E-07
M2 2.45E-09 2.04E-07 1.63E-07
M3 1.52E-09 3.21E-08 9.00F.-08
M4 2.7 I E- 10 4.43E-08 1.76E-07
M5 4.57E-10 7.94E-08 2.22E-07
M6 1.78E-09 4.63E-08 3 .93E-07
M7 6.21E-10 2.22E-08 9.25E-08
M9 1.07E-09 7J4E-10 2.57E-10
MIO 4.70E-10 3.03E-07 2.26E-07
Ml 1 1.11 E-09 4.32E- 11
Ml 2 4.46E-10 3.3E-08
MI 3 1.50E-09 1.52E-07 1.69E-07
M14 2.16E-09 1.74E-07 3 .82E-07
Ml 5 9.64E- 10 1.33E-07 1.69E-07
MI 6 1.48E-09 1.43E-07 1.95E-07
Ml 7 4.17E-09 7.35E-09
Ml 8 5.17E-09 3.55E-08
MI 9 2.58E-09 1.21E-07
M20 1.50E-09 1.49E-07 2.13E-07
M21 2.31E-09
M22 8.27E- 10 2.89E-08 1.82E-07
M23 1.26E-09 5.00E-07 5.00E-07
M24 2.90E-09 1.67E-07 5.00E-07 NCI-H292 KPL4
Beispiele KSP-Assay
ICso {M} ICso [M]
ICso [M]
MTT Assay MTT Assay
M25 2.91 E-09 5.00E-07 5.00E-07
M26 9.441E-10 6.38E-08
M27 2.03E-09 2.76E-07
Die angegebenen Wirkdaten beziehen sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausfiihrungsbeispiele.
C-2 Internalisierungsassay
Internalisierung ist der Schüsselprozess, um eine spezifische und effiziente Bereitstellung der zytotoxischen Payload in Antigen-exprimierenden Krebszellen durch Antikörper-Drug-Konjugate (ADC) zu ermöglichen. Dieser Prozess wird über Fluoreszenzmarkierung von spezifischen anti- TWEAKR-Antikörpern und einen Isotyp-Kontrollantikörper verfolgt. Hierzu wurde zunächst die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffes an Lysine des Antikörpers durchgeführt. Die Konjugation erfolgte mit zweifach molarem Überschuss von CypHer 5E mono HS ester (Batch 357392, GE Healthcare) bei pH 8, 3. Nach erfolgter Kupplung wurde die Reaktionsmischung gelchromatographiseh aufgereinigt (Zeba Spin Desalting Columns, 40K, Fa. Thermo Scientific, No. 87768; Elutionspuffer: DULBECCO'S PBS, Fa. Sima-Aldrich, No. D8537), um überschüssigen Farbstoff zu eliminieren und den pH-Wert zu adjustieren. Die Ankonzentrierung der Proteinlösung erfolgte mittels VIVASPFN 500 Säulen (Fa Sartorius stedim biotec). Die Bestimmung der dye load des Antikörpers erfolgte mittels spektrophotometrischer Analyse (Fa. NanoDrop) und anschließender Berechnung (D: P = Adye eprotem: ( 28o-0,i 6Adye)sdye).
Die dye load des hier untersuchten anti-TWEAKR -Antikörpers sowie der Isotyp-Kontrolle lagen in vergleichbarer Größenordnung, in Zellbindungs-Assays wurde getestet, dass die Konjugation zu keiner Affinitäisänderung des Antikörpers fühlte.
Die markierten Antikörper wurden im Tnternalisierungs-Assays eingesetzt.
Vor dem Behandlungsstart wurden Zellen (2xl04/well) in ΙΟΟμΙ, Medium in einer 96-MTP ausgesät (Tat, black, clear bottom No 4308776, Fa. Applied Biosystems). Nach 18h Inkubation bei 37°C/5%CO_ wurde das Medium gewechselt und markierte anti-TWEA R-Antikörper in variierender Konzentraiion hinzugefügt (10, 5, 2.5, 1, O. Hig/mL). Das gleiche Behandlungsschema erfolgte mit der markierten Isotyp-Kontrolle (negative control). Die gewählten Inkubationszeiten waren Oh, 0,25h, 0,5h, 1 h, 1 ,5h 2h, 3h, 6h and 24h. Die Fluoreszenz- Messung wurde mit Hilfe des InCellAnalyzer 3000 (Fa. GE Healthcare) durchgeführt. Es erfolgte eine kinetische Evaluierung über die Messung der Parameter granule counts/cell und totale granule intensity/cell. anti-TWEAKR- Antikörper wurden nach Bindung an den TWEAKR auf ihre Intemalisierungsfähigkeit hin untersucht. Hierzu wurden humane Tumorzellen mit verschiedenen Expressionsleveln des TWEAKR gewählt (z.B NC1 H292, 786-0, A498). Es konnte Targetvermittelte spezifische Internalisierang mit den anti-TWEAKR-Antikörpem in den verschiedenen Zelllinien beobachtet werden, wohingegen die Isotyp-Kontrolle keine internal isierung zeigte.
C-3 In vitro Tests zur Bestimmung der Zell-Permeabilität
Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in v/iro-Testung in einem Flux-Assay unter Verwendung von Caco-2-Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R. Tiiakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)1. Hierzu wurden die Zeilen auf 24-Loch-Filterplatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem HEPES- Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach. 2 Ii wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase- Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Qua- dropol-Massenspektrometer API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Dannstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp- Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et cd. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et ed., ,]. Med. Chem. 46, 1716- 1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von Papp (B-A) zu Papp (A-B) (efflux ratio) >2 oder <0.5 war.
Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, sind die Permeabilität von B nach A [Papp (B-A)] und das Verhältnis von Papp (B-A) zu PapP (A-B) (efflux ratio): Je niedriger diese Permeabilität ist, desto langsamer sind die aktiven und passiven Transportvorgänge der Substanz durch die Monoschicht von Caco-2-Zeilen. Gibt das efflux ratio zudem keine Hinweise auf aktiven Transport, kann die Substanz nach intrazellulärer Freisetzung länger in der Zelle verweilen. Damit steigt auch die Zeit, die für eine Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Kinesin-Spindelprotein, KSP / Eg5) zur Verfügung steht.
In der folgenden Tabellen sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausfuhrungsbeispiele aus diesem Assay aufgeführt: Ausführungsbeispiel Papp (B-A) Efflux ratio
[um/s]
Ml 7,8 4
M2 4.8 6.4
M3 3.4 3.3
M4 21.3 18.7
M5 20.3 26.5
M6 3.7 0.7
M7 5.6 2.2
M9 16
Mll 24.3 277
M32 .3..3 3.8
M13 7.1 3.6
M14 12.7 6.6
Ml 5 6.4 4.4
M36 9.0 7.0
M17 93.6 81.5
Ml 8 1.6 2.9
M39 3.9 2.9
M21 0.5 1.5
M22 0.9 0.9
M23 2.8 2.0
M24 3.9 3.0
M25 8.1 3.6
M26 13.0 9.6
M27 13.2 11.9 C-4 Tn vitro Tests zur Bestimmung der Substrateigenschaften für P-Glycoprotein (P-gp)
Viele Tumorzellen exprimieren Transport erproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Transporterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen.
Die Substrate igenschaften einer Substanz für P-gp (ABCBi) wurden mittels eines Flux-Assays unter Verwendung von LLC-PK1 -Zellen, die P-gp überexprimieren (L-MDRI -Zellen), bestimmt [A.H. Schinkel et ed., J. Clin. Invest. 96, 1 698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PK1 - oder L-MDRi -Zellen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermeetin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompar- timenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase- Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Qua- dropoi-Massenspektrometer API 3000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Papp- Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et cd. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab ei ed., J. Med. Chem. 46, 1716- 1725 (2003)1. Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux-Verhältnis Papp (B-A) zu Papp (A-B) >2 war.
Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Substrateigenschaften können die Efflux- Verhältnisse in L-MDRI - und LLC-PKI -Zellen oder das Efflux-Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp-Substrat.
C-5 Pharmakokinetik
Nach i.v. Applikation von 3-30 mg/kg verschiedener ADCs können die Plasma- und Tumorkonzentrationen der Antikörperteile der ADCs mittels ELISA gemessen (siehe Kapitel: Analytik zur Quantifizierung von Antikörpern) und die pharmakokinetischen Parameter wie Clearance (CL), Fläche unter der Kurve (AUG) und Halbwertszeit berechnet werden. Analog dazu können die potentiell auftretenden Metabolitkonzentrationen der ADCs in Plasma, Tumor und Gewebe gemessen werden. Nach Applikation von 5 mg/kg i.v. des ADC Beispiels 208o in männliche Ratten konnten folgende Parameter für das ADC bestimmt werden:
Figure imgf000512_0002
Figure imgf000512_0001
Der Antikörperteil der ADCs wurde mittels Liganden-Bindungs-Assay (ELISA) als Gesamt-TgG- Konzentration in Plasmaproben und Tumorlysaten bestimmt. Dabei wurde das Sandwieb-ELISA- Format verwendet. Dieser ELISA war qualifiziert und validiert für die Bestimmung in Plasma- und Tumorproben. Die ELISA-Platten wurden mit anti-human-IgG-Fe-Antikörpern der Ziege beschichtet. Nach Inkubation mit der Probe wurden die Platten gewaschen und mit einem Detektor- Konjugal aus anti-hunran-IgG(H+L)- Antikörper des Affen und Meeixettichperoxidase (HRP) inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wurde das HRP-Substrat OPD hinzugegeben und die Farbentwicklung über die Absorption bei 490 nm verfolgt. Standardproben mit bekannter IgG- Konzentration wurden mittels 4-Parameler-Gleichung gefiltet. Innerhalb der unteren (LLOQ) und oberen (ULOQ) Quantifizierungsgrenzen wurden die unbekannten Konzentrationen über Interpolation ermittelt. C5a: Identifizierung der ADC-Metabolite nach Tnternalisieiinig in vitro Methodenbeschreibung:
Internalisierungsuntersuchungen mit immunkonjugaten wurden durchgeführt, um intrazellulär entstandene Metabolite zu analysieren. Hierzu wurden humane Lungentumorzellen NCT H292 (SxlOVwell) in 6 -well Platten ausgesät und über Nacht inkubiert (37 °C, 5% C02). Es erfolgte eine Behandlung mit 10 .iig/niL (66 ILM) des zu untersuchenden ADCs. Die Intemalisierung wurde bei 37 °C und 5% CO. durchgeführt. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 4, 24, 48, 72h) wurden Zellproben zur weiteren Analyse genommen. Zunächst wurden die Überstände (ca. 5 mL) geerntet und nach erfolgter Zentrifugation (2 min, RT, 1000 rpm Heraeus Variofüge 3.0R) bei -80 °C gelagert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit Accutase abgelöst und die Zellzahl bestimmt. Nach erneutem Waschen wurde eine definierte Zellzahl (2x 3 ο5) mit 300 mL Lysis Puffer (Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma MCL1) versetzt und unter ständigem Schütteln (Thermomixer, 15min, 4°C, 650 rpm) in Protein LoBind tubes (eppendorf Cat.No. 0030 108.116) inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Lysat zenirifugiert (10min, 4°C, 12000g, eppendorf 5415R) und der Überstand geerntet. Der gewonnene Überstand wurde bei -80 °C gelagert. Alle Proben wurden anschließend wie folgt analysiert.
Die Messung der Verbindungen im Kulturüberstand bzw. Zellysat erfolgte nach Fällung der Proteine mit Methanol oder Acetonitril durch eine Hochdrack-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
Zur Aufarbeitung von 50 μΐ, Kulturüberstand Zelllysat wurden diese mit 150 μί. Fällungsreagenz (in der Regel Acetonitril) versetzt und für 10 Sekunden geschüttelt. Das Fällungsreagenz enthielt einen internen Standard (1STD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 ng/mL). Nach dem 3minütigen Zentrifugieren bei 16000 g wurde der Überstand in ein Autosampier- Viai überführt, mit 500 μΐ, eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt.
Die Messung beider Matrixproben erfolgte schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple- Quadrupol-Massenspektrometer API6500 der Firma AB SCIEX Deutschland GmbH.
Zur Kalibrierung wurden Plasmaproben mit Konzentrationen von 0.5 - 2000 g L versetzt. Die Nachweisgrenze (LOQ) lag bei ca. 2 \xwL, Der lineare Bereich erstreckte sich von 2 bis 1000 μg/L.
Zur Kalibrierung der Tumorproben wurde der Überstand unbehandelter Tumore mit Konzentrationen von 0.5 - 200 μg/L versetzt. Die Nachweisgrenze lag bei 4
Figure imgf000513_0001
Der lineare Bereich erstreckte sich von 4 bis 200 μg L,
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthielten 5 und 50 ug/L. C5b: Identifizierung der ADC-Metabolite in vivo
Als Referenzbeispiel (RIOk) wurde ein ADC mit dem agonistischen Antikörper TPP-2658 hergestellt:
ReferenzbeisgHel RIOk
Figure imgf000514_0001
150 mg anti-TWEAKR Antikörper TPP-2658 in 10.5 mL ml PBS (c=14.28 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.86 mg TCEP in 2 ml PBS-Puffer versetzt. Der Antikörper TPP-2658 und dessen Herstellung sind in WO 2015/189143 AI im Detail beschrieben.
Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 6.63 mg (0.008 mmol) von Irrtermediat F l 04 gelöst in 1250 μΐ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1250 μ] PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.
Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH 8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuiert. Das Eluat wiffde mit PBS-Puffer pH8 auf ein Gesamtvolumen von 22.5 ml verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend wieder mittel PD-10 Säulen auf pH 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut auf konzentriert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:
Protein Konzentration: 14.06 mg/mL
Drag/mAb Ratio: 3.4 Analytik zur Quantifizierung der potentiell auftretenden Metabolite
Die Messung der Verbindungen in Plasma, Tumor und Gewebe erfolgte nach Fällung der Proteine mit Methanol oder Acetonitril durch eine Hochdi"uck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) gekoppelt an ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
Zur Aufarbeitung von 50 xL Plasma wurden diese mit 250 uL Fällungsreagenz (in der Regel Acetonitril) versetzt und für 10 Sekunden geschüttelt. Das Fällungsreagenz enthielt einen internen Standard (ISTD) in geeigneter Konzentration (in der Regel im Bereich 20-100 ng/mL). Nach dem Sminütigen Zentrifu gieren bei 16000 g wurde der Überstand in ein Autosampier- Vial überführt, mit 500 \xL eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt.
Bei der Aufarbeitung eines Tumors oder Gewebes wurde dieser mit der 3 fachen Menge an Extraktionspuffer versetzt. Der Extraktionspuffer enthielt 50 mL Tissue Protein Extraction Reagent (Pierce, Rockford, TL), zwei Pellets Complete-Protease-Trihibitor-Cocktail (Roche Diagnosties GmbH, Mannheim, Deutschland) und Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma, St. Louis, MO) in einer finaler Konzentration von 1 mM. Im Tissuelyser II (Qiagen) wurde die Probe zweimal 20 Minuten bei maximaler Schlagzahl homogenisiert. 50 μΐ, des Homogenats wurde in ein Autosampier- Vial überführt und mit 150 μΕ Methanol inklusive ISTD aufgefüllt. Nach 3minütigem Zentrifugieren bei 16000 g wurden 10 μΐ, des Liberstands mit 180 μΐ eines auf das Laufmittel abgestimmten Puffers aufgefüllt und erneut geschüttelt. Danach war die Tumor- oder Gewebeprobe messfertig.
Die Messung der Matrixproben erfolgte schließlich an dem mit einer HPLC gekoppelten Triple- Quadrupol-Massenspektrometer API6500 der Finna AB SCIEX Deutschland GmbH.
Zur Kalibrierung wurden Plasmaproben mit Konzentrationen von 0.5 - 2000 μκ ί versetzt. Die Nachweisgrenze (LOQ) lag bei ca. 2
Figure imgf000515_0001
Der lineare Bereich erstreckte sich von 2 bis 1000 g/L.
Zur Kalibrierung der Tumor- und Gewebeproben wurde der Überstand unbehandelter Tumore oder Gewebe mit Konzentrationen von 0.5 - 200 μg/L versetzt. Die Nachweisgrenze lag zwischen 3-6 μg/L. Der lineare Bereich erstreckte sich von 3 bis 200 μg/L.
Qualitätskontrollen zur Gültigkeitsprüfung enthielten 5 und 50 μg/L, in Plasma zusätzlich 500 μ8/Ε.
Tabelle: Katabolitkonzenirationen in NCI H292 Xenograft Maus -Tumor, -Leber und -Niere 24 h nach Applikation von 10 mg kg des ADCs aus Beispiel 208o bzw. von 10 mg/kg des ADCs aus Referenzbeispiel RIOk (gemessener Katabolit in beiden Fällen: M26).
Figure imgf000516_0001
Beispiel 208o 13.0 2.2
Nach Applikation des erfindungsgemäßen ADC Beispiels 208o mit einem moderat agonistischen Antikörper wurden im Tumor vergleichbare Konzentrationen vom aktiven Katabolit M26 gemessen als nach Applikation des ADCs RIOk mit gleicher Payload und einem sehr agonistischen Antikörper (die agonistische Aktivität des Antikörpers TPP-2658 ist in WO 2015/189143 AI im Detail beschrieben). Im Gegensatz dazu lagen die gemessenen Konzentrationen des aktiven Metaboliten in Leber und Niere nach Gabe des ADCs aus Beispiel 208o deutlich niedriger als nach Gabe des Referenz- ADCs RIOk. Es kommt zu einer deutlich selektivere Freisetzung des Wirkstoffes am Zielgewebe (Tumor) im Vergleich zu anderen Organen bei Verwendung eines nicht-agonistisch oder nur moderat agonistisch wirkenden anti-TWEAKR-Antikörpers im Konjugal
C-6 Wirksamkeitstest in vivo
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugate können in vivo beispielsweise mittels Xenograft-Modellen getestet werden. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, anhand derer die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen getestet werden kann (siehe z.B. WO 2005/081711; Polson et al, Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358-64). Beispielsweise werden hierzu Nagern (z.B. Mäusen) eine Tumorzelllinie, welche das Zielmolekül des Binders exprimiert, implantiert. Anschließend werden den Implantat-Tieren entweder ein erfindungsgeniäßes Konjugal, ein Isotyp-Antikörper-Kontrollkonjugate oder ein Kontrollantikörper oder isotonische Salzlösung appliziert. Die Applikation erfolgt einmalig oder öfter. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen werden die Tumorgröße im Vergleich von Konjugat- behandelten Tieren und der Kontrollgruppe bestimmt. Die Konjugat-behandelten Tiere zeigten eine geringere Tumorgröße. C-6a. Waehstamshemmung / Kegression von experimentellen Tumoren in der Maus
Humane Tumorzellen, die das Antigen für das
Figure imgf000517_0001
exprimieren, wurden subkutan in die Flanke von immunsupprimierten Mäusen inokuliert, beispielsweise NMRi Nudeoder SCID-Mäuse. 1 - 10 Millionen Zellen werden aus der Zellkultur abgelöst, zentrifugiert und mit Medium oder Medium / Matrigel resuspendiert. Die Zeilsuspension wurde unter die Haut der Maus gespritzt.
Innerhalb von einigen Tagen wuchs ein Tumor heran. Die Behandlung begann nach Etablierung des Tumors, ungefähr bei einer Tumorgröße von 40 mm2. Um die Wirkung auf größere Tumoren zu untersuchen, kann die Behandlung auch erst bei einer Tumorgröße von 50-100 mm2 begonnen werden.
Die Behandlung mit den ADCs erfolgte über die intravenöse (i.v.) Route in die Schwanzvene der Maus. Das ADC wurde mit einem Volumen von 5 mL / kg appliziert.
Das Behandlungsschema richtete sich nach der Pharmakokinetik des Antikörpers-Konjugates. Als Standard wurde drei Mal in Folge jeden siebten Tag behandelt. Für eine zeitnahe Beurteilung kann sich auch ein Schema mit einer Einmalbehandlung eignen. Die Behandlung kann aber auch weiter fortgesetzt werden oder es kann sich zu einem späteren Zeitpunkt ein zweiter Zyklus mit drei Behandlungstagen anschließen.
Standardmäßig werden 8 Tiere pro Behandlungsgruppe eingesetzt. Neben den Gruppen, die die Wirksubstanzen bekommen, wird eine Gruppe als Kontrollgruppe nur mit dem Puffer nach dem gleichen Schema behandelt.
Im Verlauf des Experiments wurde die Tumorfläche regelmäßig mit einer Schieblehre in zwei Dimensionen (Länge / Breite) gemessen. Die Tumorfläche wurde mittels Länge x Breite bestimmt. Der Vergleich der mittleren Tumorfläche der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C area angegeben.
Werden alle Gruppen des Experimentes nach Behandlungsende gleichzeitig beendet, können die Tumore entnommen und gewogen werden. Der Vergleich, der mittleren Tumorgewichte der Behandlungsgruppe mit der Kontrollgruppe wird als T/C weight angegeben.
C-6b. Wirksamkeit in humanen Tumor-Xenograftmodellen
Die jeweiligen Tumorzellen wurden subkutan in die Flanke von weiblichen NMRI-nude Mäusen (Janvier) inokuliert. Bei einer Tumorgröße von -40 mm2 wurde intravenös mit dem Antikörper- Wirkstoftkonjugat behandelt. Im Anschluss an die Behandlung wurde das Tumorwachstan ggf. weiterverfolgt.
Die Behandlung mit den anii-TWEAKll-Aritüiöroer-Wirkstofflionjugaten führte zu einer deutlichen und lang anhaltenden Wachstumshemmung der Tumore im Vergleich zur Kontrollgruppe und den Isotyp-Wirkstoffkonjugaten (die Unwirksamkeit letzterer wurde in vorangehenden Experimenten nachgewiesen). Die Tabelle 8 gibt die T/C Werte an, ermittelt über die Tumorfläche am Tag mit dem letzten Messwert der Kontrollgruppe gerechnet nach Inokulation.
Tabelle 8:
Figure imgf000518_0001
Ausführungsbeispiele für anti-TWEAKR-Antikörper
Bestimmung der Bindungsaffinität der Antikörper mittels Oberflächenplasmonenresonanz:
Oberflächenplasmonenresonanz-Experimente zur quantitativen Bindungsanalyse wurden mit einem Biacore T200 Instrument (GE Healthcare Biacore, Inc.) durchgeführt. Hierbei wurden die zu untersuchenden Antikörper mithilfe eines an die Sensorchipoberfläche amingekoppeiten antihuman Fe Antikörpers ("Human Antibody Capture Kit", BR- 1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.") fixiert. Die Aminkopplung wurde nach den Herstellervorschriften mit l -ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS) und Ethanolamin-HCl pH 8.5 („Amine Couplmg Kit" BR-1000-50, GE Healthcare Biacore, Inc.) durchgeführt. Für die Analysen wurden Series S Sensor Chips CM5 (GE Healtchare Biacore, Inc.) mit dem Laufpuffer HBS-EP+ verwendet (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % Surfactant P20). Alle experimentellen Schritte erfolgten bei 25 °C, Nach erfolgter Fixierung der zu untersuchenden anti-TWEA R Antikörper wurden Injektionen der extrazellulären Domäne von TWF.AKR (Analyt, 30R-AT080, Fitzgerald) im Konzentrationsbereich von 3,9 bis 500 DM vorgenommen, wobei nach jeder Antigeninjektion die Sensoroberfläche mit Glycin-HCl pH 2.0 regeneriert wurde. Vor einer erneuten Analytinjektion wurden jeweils Antikörper unter identischen Bedingungen wie zuvor fixiert. Bei allen Messungen diente eine vorgeschaltete Flusszeile, in der lediglich ainingekoppelter anti-human Fe Antikörper immobilisiert vorlag, als Referenzzelle. Die Auswertung der erhaltenen Sensorgramme erfolgte nach Doppeireferenzierung (Subtraktion des Referenzfiusszellensignals und einer Pufferinjektion) durch die in der Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare Biacore, Inc.) implementierten „steady-state" Affinitätsauswertemethode.
Tabelle Sa : Rekombinantes Antigen, das für die Affinitätsmessung verwendet wurde
Figure imgf000519_0001
Table 5b: Kommerziell erhältlicher Antikörper
Figure imgf000519_0002
Figure imgf000519_0003
Bestimmung der Bindungsaffinität der Antikörper an TWEÄKR exprimierenden Krebzellen mittels FA CS-Analyse Die Bindung der anti-TWEAKR- Antikörper wurde mittels Durchflusszytometrie an verschiedenen humanen Tumorzelllinien untersucht. Hierzu wurden die Zeilen (5x1 ( cells/well) in FACS Buffer (PBS ohne Ca/Mg, 3% FCS, Biochrom) mit ! 0,i g/niL Primärantikörperlösung (Startkonzentration) auf Eis für 30-45min lichtgesehützt inkubiert. Es wurde eine Dosiswirkungskurven (1 :5 Verdünnung) erhoben. Nach erfolgter Inkubation wurden 200μΕ eiskalten FACS Puffer zupipettiert und die Zellsuspension bei 4°C 400g, für 4min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 300μΙ, eiskaltem FACS-Puf er gewaschen, bevor das gewonnen Pellet in ΙΟΟμΙ, FACS-Puffer resuspendiert und mit Sekundärantikörper (monoclonal Anti-Kappa light chains-FITC antibody, Fa. Sigma, No. SAB4700605) in einer 1 : 10 Verdünnung erneut 30min auf Eis inkubiert wurde. Danach wurden die Zellen mit eiskaltem FACS-Puffer gewaschen und auf eine Zellkonzentration von 0.5x10° cells/mL eingestellt, bevor die Durchflusszytometrie mit einem Guava flow cytometer (Fa. Millipore) durchgeführt wurde. Propidium lodid (finale Konzentration l \ig/mL) wurde zur Lebendfärbung genutzt. Die Ergebnisse wurden als Hintergrund bereinigte Geo Mean der Fluoreszenz des zu untersuchenden Antiköpers bestimmt ( Tab.6a) oder es wurde der EC50 Wert mitteis Dosis-Wirkungskurve ermittelt (Tab 6b).
Table 6a: FACS Analyse: Bindung des anti-TWEAKR Antikörper an verschiedene Krebszell linien..
Figure imgf000520_0002
(Geo Mean-Geo Mean des Sekundärantikörpers >5: +, >50: ++, >500: +++, >5000: ++++
Table 6b: FACS Analyse: Bindung der humanisierten anti-TWEAKR Antikörper an die Lungenkarzinoma Zeälmie NCI-H292 und Leberkrebszelle SK-HEP-1
Figure imgf000520_0001
Figure imgf000521_0001
Bestimmung der agonistischen / antagonistischen Aktivität der anü-TWEÄKR-Antikörper mittels NFkappaB Reportergen-Ässay
NF-kappaB -Reportergenassays wurden durchgeführt, um die agonistische Aktivität der Antikörper (humanes IgOl) zu beurteilen. HEK293 Zeilen wurden transient mit einem NF-kappaB- Reporterkonstrukt (BioCat, Kat.-Nr. LR-0051-PA) unter Verwendung von 293fectin gemäß Herstellerangabe transfiziert. Weiße Poly-Lysin-beschichtete 384-Loch-Ptatten (BD) wurden mit transfizierten Zellen in F17-Medien (serum-free; Tnvitrogen) bei 37C, 5% CO2 ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit gereinigten Antikörpern bei verschiedenen Konzentrationen für 6h stimuliert, und anschließend wurde ein Luciferase-Assay nach Standardverfahren durchgeführt. Es wurde z.B. für 1TEM-4 moderat agonistische Aktivität gemessen, die 14% des Agonismus des natürlichen Liganden (bei 200 ng mL) TWEAK zeigte. Um die antagonistische Aktivitäten zu untersuchen, wurde in Gegenwart des natürlichen Liganden Tweak (200ng/mL) der Assay durchgeführt. In diesem Assay Design konnte für ITEM-4 potente antagonistische Aktivität nachgewiesen werden .
Tabelle?: Agonistische und antagonistische der anti-TWEAKR-Antikörper
Ago siische Aktivität Antagonistische Aktivität [%1 des TWEAK-ind.Agonismus IC50 [M]
ITEM-4 14 2.8E- 30
TPP-7005 0.1 2.0Ε- Π
TPP-7006 1.7E- 30
TPP-7007 4 1.9E-09
TPP-7075 15 2.4E-08

Claims

Konjugal eines Antikörpers mit einem oder nieirreren Wirkstoftmolekülen der folgenden Formel:
BINDER- L— KSP wobei
BENDER für einen moderat agonistiscii oder nicht agonistiscii wirkenden anti-
TWEAKR-Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment von diesem,
L für einen Linker, n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, und
KSP für eine Verbindung der folgenden Formel (I) ste t:
Formel (I):
Figure imgf000522_0001
wobei
R1 -H, -L-#l, -MOD oder -(CH2)o-3Z darstellt,
wobei
Z -H, -NHY3, -OY3, -SY3, Halogen, -C(0)-NY'Y2, oder
( '·; 0)··ΟΥ ! darstellt, Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2,
•{(.Ίί·( !-{);., ;·((, Ii in ./· (z.B.
-(CH2V3Z'), oder -CH(CH2W)Z' darstellen
Y3 -H oder -ΚΊΙ.·),, :/· darstellt,
/· -H, - Ϊ-Ϊ2, -SO3H, -COOK,
-Ml-C i Ο Ίί -Ci! •Cii(\i! iCOOii
oder -(CO-NH-CHY)i.3COOH darstellt;
W H oder OH darstellt,
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NH-C(=0)-
NH2 substituiertes C« Alkyl oder gegebenenfalls mit - NH2 substituiertes Aryi oder Benz l darstellt;
R2 H, -MOD, -C(-0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)o-3Z darstellt,
wobei
Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - HY3, -C(=0)-NY!Y2 oder
-C(-0)-OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2 oder -(CH2J0--3Z'
darstellen,
Y3 -H oder -(CH2)0-3Z' darstellt,
Z 1 -H, -SO3H, -NH2 oder -COOK darstellt;
Y4 lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit
- H-C(=0)- H2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit - H2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und
Y5 -H oder C{ ΟΚ !!Υ'-\Π darstellt,
Y° lineares oder verzweigtes Cj-6 Alkyl darstellt;
R4 -H, -L-#l, -SGlys-(C>O)0-i-R4', -C(-0)-CHY4-NHY5 oder -(CH2)(wZ darstellt,
wobei eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid,
eine Ci-io-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-jo-Alkyl-O-Ce-io-Aiyl-, C5-io- Heterocyeloaikyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Cj-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs- io-Heteroaraikoxy-, C O- Alkyi-O-C6-i0-Aryloxy-, Cs-irHeterocycloalkoxy- Gruppe, die ein oder mehrfach mit -NH2, -NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, -NH-C(=0)-Alkyl, -N(Alkyl)-C(=0)-Alkyl, -SO3H, -S(=0)2-NH2, -S(=0)2-N(Alkyl)2, -COOH, -C(=0)- H2, -C(=0)-N(Alkyl)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe < ) ·{(.Ί { · ( ! :!( )), - R4" darstelit,
wobei x 0 oder 1 ist,
wobei v eine Zahl von I bis 10 darstelit, wobei R4" -H, -Alkyl (vorzugsweise
Cj-n-AIkyl), -CH2-COOH, •( Ί ! · (.Ί { ··( ·< M )l oder
-CH2 -CH2- H2 darstellt;
•i L Halogen, -OY3, -SY3, HY3, -C(-0)- Y!Y2, oder -C(=0)-OY3 darstellt,
unabhängig voneinander -H, -NH2, oder
-(CH2)o.3Zl darstellen,
-H oder -(CH2)0-3Z' darstellt,
-H, -SO3H, -NH2 oder -COOH darstellt;
lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit
-NH-C(=0)-NH2 substituiertes, Cw Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder
Benzyl darstellt,
-H oder -C( >)-CJEr^-NH2 darstellt und lineares oder verzweigtes Ci-e Alkyl darstellt; oder
und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR1'- oder
-Ci l R ·(. I L - darstellen,
wobei
R! -H, - H2, -SO3H, -COOH, -SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), CM Alkyl, C M Haloalkyl, C Alkoxy, Hydroxyl- substituiertes G-, Alkyl, COO(C,.4 Alkyl) oder -OH darstellt;
A -C(= ))-, -Si ( ))■·. -S( < !) ... -S(=0)2NH- oder -C(=N- H2)- darstellt:
R3 -L-# 1 , -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-,
Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine CMO- Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl- oder Cs-io-Heterocycloalkyl- Gruppe, die jeweils substituiert sein können mit 1 -3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkyl gruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 -O-Alkyl Grappen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -0-C(=0)-Alkyl Gruppen, 1-3 -0-C(=0)-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -M l-Cl ( )}· A lkyl Gruppen, 1-3 - H-C(=0)-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -S( ))„- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(=0)2-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1-3 -NH2 Gruppen oder 1-3 -(CH2)o-3Z Gruppen,
wobei
n für 0, 1 oder 2 steht,
Z -H, Halogen, -OY3, -SY3, - HY3, ·( '( ( ))-NV V oder
-C(=0)-OY3 darstellt,
Y1 und Y2 unabhängig voneinander -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen,
Y3 -H, -(Ci i. V. - C H{ \ ! i -C< ( >)·
CH:.)Z', -(CH2)o-3-CH(NH2)Z', oder
•{(.Ί ί - ίο =/.· darstellt,
Z' -H, -SO3H, - H2 oder -COOH darstellt, R5 -H, -NH2, -NO2, Halogen (insbesondere F, CI, Br), -CN, CF3,
-OCF3, -CH2F, -CH2F, SH oder -(CH2)<MZ darstellt, wobei
Z -H, -OY3, -SY3, Halogen, \ ! ! Y ;. -Ci ( );- N V ^ \. oder
-C(=0)-OY3 darstellt,
Y' und Y unabhängig voneinander -H, -NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen,
Y3 -H oder -(CH2)0.3Z ' darstellt,
Z' -H, -SO3H, -NH2 oder -COOH darstellt;
R6 und R'' unabhängig voneinander -H, Cyano, Cno-Alkyl, Fluor- Ci-io-Alkyl,C2-io-
Alkenyl, Fluor- C2-io-Alkenyl, C2-io-Alkinyl, Fluor- C2-io~Alkmyl, Hydroxy,
Figure imgf000526_0001
- H2, -COOH oder Halogen darstellen,
R8 Ci-io-Alkyl, Fluor-Ci- io-Alkyl, C2- io-Alkenyl, Fluor-C2-[o-Alkenyl, C2-JO-
Alkinyl, Fluor-C2-i o-Alkinyl, C4-)o-Cycloalkyl, Fluor-C io-Cvcioalkyl oder ■(CH2)o~2-(HZ2) darstellt, welche ein- oder zweifach, gleich oder verschieden mit -OH, -COOH oder -NH2 substituiert sein können und wobei
HZ2 einen 4 bis 7-giiedrigen Heterocyclus mit bis zu zwei
Heieroatornen ausgewählt aus N, O und S darstellt,
R9 -H, -F, -CH3, -CF3, -CH2F oder -CHF2 darstellt; wobei
einer der Substituenten R1, R3 und R4 -L-# l darstellt,
L für den Linker stellt und #1 für die Bindung zum Antikörper stellt,
-MOD --( Ri0)n-(Gi)o-G2-G3 darstellt,
wobei
R10 H oder C i-C -Alkyl darstellt; M iC{ Ο)·- , ··{ ·,; θ)-\Ή- darstellt
(wobei wenn Gl - HC(=0)- darstellt, R10 nicht NH2
0 oder 1 ist;
0 oder 1 ist; und
eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach, oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -
S( Ol-. -S< ( >)· ·. -NR5'-,
• xirc; < ;·) ·. ·( ·· O;~\ R:' - . -\ R N R; - .
Figure imgf000527_0001
wobei
Ry -H, Phenyl, Cj -C1 ( Aikyl, C2-C10-Aikenyl oder C2~Ci0-Alkinyi darstellt, die jeweils ein- oder mehrfach., gleich oder verschieden mit
- H-C(-0)-NH2, -COOK, -OH, -NH2, - H-CNNH?., Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Suifonsäure substituiert sein können, und/ oder die ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -C(=0)-, -CR^N-O- unterbrochen sein können,
wobei
Rx -H, C -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt und wobei
die Kohlenwasserstoffkette einschließlich einer gegebenenfalls an der Kohlenwasserstoffgruppe substituierten Ci-Cio-Alkylgruppe als Seitenkette, mit - NH-C(=0)-NH2, -COOH, -OH,
-NH2, -NH-CNNHz, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder
Suifonsäure substituiert sein kann,
G3 -H oder -COOH darstell t, und
wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine
Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate,Salze der Solvate und Epimere
2. Konjugal nach Anspruch 1, wobei A für -C(=0)- sieht.
3. Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei R1 für -H, -L-#! , -COOK, -C(=0)-NHNH2, ~(CH2)].3 H2,
Figure imgf000528_0001
ist, wobei Z" für -H oder -NH2 steht.
4. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R und R4 für -H stehen, oder R2 und R4 gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes)
-CHRn-CH2- oder -CH2-CHR1 1 - darstellen; wobei R1! H, COOH, F, Me, CH2F, OMe, CH2OH, COO(C Alkyl) oder OH darstellen. .
5. Konjugal nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R3 für -L- #\ steht oder für eine Phenylgruppe, die ein- oder mehrfach mit Halogen, C 3..3 Alkyl oder Fluor-C ; _3 Alkyl substituiert, sein kann, oder eine Ci-io-Alkylgruppe oder Fluor-
Ci-10-Alkylgruppe darstellt, die gegebenenfalls mit -OY4, -SY4,
-O -Cl 0)- Y :. -0-C(=0)- H-Y4, - X U Ci < >)- V. Λ Η -C·; OiM l - S". .-S(0)n-Y4 , -
S(0)2- H-Y4, - H-Y4, oder -N{Y4)2, substituiert sein kann,
wobei
n 0, 1 oder 2 darstellt,
Y4für -H Phenyl, welches gegebenfalls ein- oder mehrfach mit Halogen, Cj ..3 Alkyl oder Fluor- C j ..3 Alkyl substituiert ist, steht oder für Alkyl steht, weiches mit -OH, - COOH, und/oder
Figure imgf000528_0002
substituiert sein kann.
6. Konjugat nach Anspruch 5, wobei das Konjugat die folgende Formel (Ilj) aufweist:
Figure imgf000529_0001
wooei
> 3 -L-#l darstellt;
■i i ( >)- darstellt; und
R . R . und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) in Anspruch
7. Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Substituent R1 L-#i darstellt.
8. Koniugat n ilk) aufweist:
Figure imgf000529_0002
(Ilk) wooei
R! -L-#l darstellt;
A -C(=0)- und
R3 -CH2OH- darstellt;
R6, R7, \ und R9 die gleiche Bedeutung wie in Formel (1) in Ansprach 1 aurweisen. 9, Konjugat nach einem oder melireren der vorhergehenden Anspräche, wobei R5 -H oder -F ist.
10. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R6 und R'' unabhängig voneinander -H, Ci-3-Alkyl, Fluor- Cw-Alkyl, C2-4-AlkenyL Fluor- C *- Alkenyl, C2-4-Alkinyl, Fluor C2-4-Alkinyl, -Hydroxy oder Halogen darstellen.
11. Konjugat nach einem oder melireren der vorhergehenden Ansprüche, wobei R8 eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl ist.
12. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei Ry -H oder Fluor ist.
13. Konjugal, nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, wobei der Linker -L- eine der folgenden Grandstrakturen (i) bis (iv) aufweist:
(i) -(CO)m-SGl-Ll-L2-
(ii) -(COV--L1 -SG-L1 -L2-
(iii) -(CO)m -Ll-L2-
(iv) -(CO)m -Ll-SG-L2
wobei m 0 oder 1 ist, SG und SGI eine in vivo spaltbare Gruppe ist, LI unabhängig voneinander für in vivo nicht spaltbare organische Gruppen stehen, und L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder steht.
14. Konjugat nach Anspruch 13, wobei die in vivo spaltbare Gruppe SG eine 2-8
Oligopeptidgrappe, bevorzugt eine Tri- oder Dipeptidgruppe oder ein Disulfid, ein Hydrazon, ein Acetal oder ein Aminal ist und SGI eine 2-8 Oligopeptidgrappe, bevorzugt eine Dipeptidgruppe ist.
15. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche,
wobei der Linker L an eine Cystein-Seitenkette bzw. Cysteinrest gebunden ist und die folgende Formel aufweist:
§-(C(=0)-)m-Ll-L2-§§
wobei 0 oder 1 ist;
die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
die Bindung an den Antikörper darstellt, und
Figure imgf000531_0001
steht, wobei
#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers
kennzeichnet,
# die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L1 kennzeichnet,
L' -(NR10)n-(Gl)o-G2- darstellt,
wobei
Ri0 -H, -NH2 oder CVCs-Alkyl darstellt;
Gl -NH-C(=0)- darstellt;
n 0 oder 1 ist;
o 0 oder 1 ist; und
G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 25) Kohlenstoffatomen aus Arylgruppen, und/oder geradkettigen und/oder verzweigten Alkylgruppen, und/oder cyclischen Alkylgruppen ist, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=OK -S(=0)2-, -NH-, -C(=0)-, -N-CH;-, -NHNH-,
-Sf ( ! ) · ΝΠ\Π· . -NH-C(=0)-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NHNH- und einen 5 bis 1 Ogliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozykius mit 1 bis 4 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen und'' oder Heterogruppen, ausgewählt aus N, O und S, -S(=0)- oder -S( ))2-, unterbrochen sein kann
wobei geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette gegebenenfalls mit
-\l i-C( ( ))··% } !;. -COOH, -OH, -NH2, -NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann, oder eine der folgenden Gruppen darsteilt:
Figure imgf000532_0001
wobei Rx -H, Ci-Cj-Alkyl oder Phenyl darstellt.
Konjugal nach Anspruch 15, wobei L2 dargestellt wird durch eine oder beide folgenden Formeln:
Figure imgf000532_0002
wobei #' die Verknüpf ngsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, # die Verknüpfungssteile mit der Gruppe L1 kennzeichnet,
R22 -COOK darstellt, und die Bindungen an das Sclrwefelatoni des Binders zu über 80 %, (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder) in einer dieser beiden Strukturen vorli egen .
Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 15 oder 16, wobei L1 die folgenden Formeln aufweist:
Figure imgf000533_0001
in denen
r eine Zahl von 0 bis 8 ist. Lach einem oder mehreren der vorherg enden Anspräche, wobei der an eine Cystein-Seitenkette bzw. Cysieinrest gebunden ist und die ormel aufweist:
Figure imgf000534_0001
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt,
m 0, 1, 2, oder 3 ist;
:n 0, 1 oder 2 ist;
P 0 bis 20 beträgt; und
L3
Figure imgf000534_0002
wobei
o 0 oder 1 isi;und
eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 25) Kohlenstoffatomen aus Arylgruppen, und/Oder geradkettigen und/oder verzweigten Alkylgruppen, und/Oder cyclischen Alkylgruppen ist, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -S(=0)-, -S(=0)2-, -NH~, -C(=0)-, -N-CH3-, -NH H-, -S(=0)2-NHNH-, •Xi l -C 'i O ·( ( 0}-\Ί !-. -C(<))-NH H- und einen 5 bis i Ogliedrigen, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit 1 bis 4 gleichen oder verschiedenen Heteroatomen und/ oder Heterogruppen, ausgewählt aus N, O und S,
Figure imgf000535_0001
unterbrochen sein kann, wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette gegebenenfalls mit -NH-C ))»NH2, -COOH, -OH, N U -. -NH-C H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein kann.
Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprach Konjugal eine der folgenden Formeln aufweist:
Figure imgf000535_0002
Figure imgf000536_0001
Figure imgf000536_0002
Figure imgf000536_0003
Figure imgf000537_0001
Figure imgf000537_0002
Figure imgf000537_0003
Figure imgf000537_0004
Figure imgf000538_0001
Figure imgf000538_0002
Figure imgf000539_0001
Figure imgf000539_0002
Figure imgf000539_0003
Figure imgf000540_0001
Figure imgf000540_0002
wobei
AKi einen über Cystein verknüpften und AK2 einen über Lysin verknüpften moderat agooistisch oder nicht agonistisch wirkenden aiiti-TWEA R-Antikörper darstellt, n eine Zahl von 1 bis 20 darstellt; und
Li eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -C(=0)-, -S(=Q)2-, -NH-, Cyelopentyl, Piperidinyl, Phenyl unterbrochen sein kann,
wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -COOH, oder -NH substituiert sein kann,
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
20. Konjugat nach Ansprach 19, wobei der Linker Li für die Grappe §-NH-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH3)6-§§;
§-NH-(CH2)2-0-(CH2)2-§§;
§- H-CH(COOH)-(CH2) -§§
§-NH-NH-C(-0)-(CH2)5-§§;
§-Nil-(CH;):-C(-0)-O-(CH2)2"§§;
§_NH-(CH2)2-C(-0)-NH-(CH2)2-§§;
Figure imgf000541_0001
§-NH-(CH2)2-NH-C( ))-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)s-§§;
§-NH-(CH2)2-NH-C( ))-CH(CH3)-§§;
§- H-(CH2)2-0-(CH2)2- H-C(0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2- § § ;
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-§§;
§ -NH-(CH2)2-NH-C(=0) -CHiCÄCOOH)- § § ;
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-((CH2)2-0)3-(CH2)2-§§;
§-NH-(CH2.)2-S(=0)2-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-(CH2.)2-NH-C(=0)-CH2-NH-C(0)-CH2-§§;
§- H-(CH2)3- H-C(<)-CH2-NH-C(K))-CH2-§§;
§-NH-CH(CXH)-CH2-NH-C(=0)-CH(CH2COOH)-§§;
§-NH-(CH2)2- iH-C(=0)-CH(C2H4COOH)-NH-C( ))-CH2-§§;
§-NH-CH(CXH)-CH2-m-C( ))-(CH2)2-NH-C(K))-CH
§-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-NH-CH(C(X)H)-CH2-NH-C( ))-CH(CH2OH)-NH-C(<))-CH2-§§;
§-NH H[C(<})-NH-(CH^^
§-ΝΗ ;Η(ΟΟΟΗΚΉ^ Η-0^^
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)- H-C(K)) H(m)-NH-C( ))-CH(isoC3H7)-§§;
§-MHCH2)4-CH(COOH)-NH-C(<)
C(=0)-(CH2)i-§§;
§-NH-(CH:)2-C(==0)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)- H-C( ))- CH(isoC3H7)- H-C(=0)-CH2-§§; ί·Μ !-(( i;) -Ci {);·Ν!!·{(.Ί{·ί,(.Ί{{(;(Κ)1Μ·\!ί·{·{ < > s Π( Π ) Π <. ( <>)· CH(isoC3H7)-NH-C(0)-(CH2)5-§§;
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)- CH[(CH2)3-NH-C( J)-NH2]-NH-C(-0)- CH( i C;ll }·ΝίΙ·(. i <>) · (CH2)5 - § § ;
Η·) X!!-Cs OHCll !-fUiCnOi!!-M!-Ci (); C Π(ί Π .)· Ni i (.( < >)- CH(isoC3H7)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH-CH(CH3)-CK))-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH3)-NH-C( ^)-
CH(isoC3H7)-NH-C(K))-(CH2)5-§§;
i-N!{-(CH.);-Ci 0)·Χίί·ί(Ή }:·('!Ιί('<Κί!!}·ΝΠ·( ί (>}-CHji('il. };-Xim <))- NH2]- H-C(=0)-CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
C( ))-NH-(CH2)2-§§;
Figure imgf000542_0001
C( ))- H-(CH2)2-NH-C( ))-CH2-§
§- Η' / C{ <)!Λ1Ι·( Ι1 ) ·( 1!ί( )(>!{)· XI {·(.·( < ) ) -C !) [ = C 11 ) = - - C ( <)!·
NH2]-NH-C(-0)-CH(isoC3H7)-NH-C(==0)-(CH2)5-§§;
§-NH Q ^C( ))-NH-(CH2)4-CH(C(X)H)-m-C(<))-CH[(CH2)3-NH-C(K))^ H2]- H-C(=0)-CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-NH ' P ^ C(<))-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(-0)-CH(CH3)-NH-C( ))- CH(isoC3H7)- H-C(=0)-(CH2)5-§§;
Figure imgf000542_0002
C(=0)-0 v-/ C(=0)-CH2-§§; i-Nil-(CH;).-C( (};·ΧΠ !liiso( Ji )·( ( (>}-X!l- ΠΚ ü )·('{ OH)
Figure imgf000542_0003
§-NH-CH(COOH)-CH2- H-C(=0) 7 §§;
Figure imgf000542_0004
C(=0)-NH W §§;
Figure imgf000543_0001
§-(CH2)2-C(=0)-NH-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-§§;
§-CH(CH3)- H-C(=0)-CH(isoC3H7)-§§;
§ -CH(CH3) ·'% !·:·(·{ <)! -CH(isoC3H7) -\fl-C{ Ο Π· - § § ;
(. ilf(. ίΙ;)·\ίί·{·{ (»-CiiiisoCMI )-\fl-C{ < )!·((.'!{· ) ^;
. ·(·(! !··(·( <)ί·\1Ι·ί((. U-) ·<)):·{(.Ίί-ί .Μ!·( ί (>}·{ ! ·ίί:
§-CH(CH3)- H-C(K))-CH(isoC3H7)-NH ;(K)) (CH2 -0 -(CH2)2-N^
(CH2)2-§§;
§ '^=^NH-CX=0)-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)- H-C(=0)-((CH2)2-
Figure imgf000543_0002
§-CH2-S-(CH2)2-C(0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)5-C(=0)-NH-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)- H-((CH2)2-0)2-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(=0)- H-((CH2)2-0)2-(CH2)5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2 :(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(==0)-CH2-§§;
§-CH2-S-(CH2)2 :(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(==0)-CH5-§§;
§-CH2-S-(CH2)2-C(-0)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(==0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(-0)-NH-(CH2)2-NH ;(-0)-(CH2)5-§§;
^ I -S C S ! ) -C · ( ))· Ι !·(·ΓΙ ί·)·· )ί ··!(·;{ )-.Νί!·(·( (>)-(Ί !.·->·?:
§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-0)4 -(CH2)2-NH-C( ))-CH2-§§;
Figure imgf000543_0003
§-CH2-S-(CH2)2-CH))-NH^
§-CH2-S^2CH(C<X)H)-N^
§-CH2-S^2CH(C<X)H)-N^
H il-S-CH ( !!:( <)( >ί!)·\Π·(·( <)!·({( ·Π·ί ·Οί,ί(·ίί-! ·Νί|.(. ; <>).;('! Ι.}··^: §-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0 -(CH2)2-NH-C(=0)-(CH2)2-
§§;
§-CH2-S CH2)2-C(=0)- H-CH(C2H4COOH)-C( )- H-(CH2)2- H-C(=0)-CH2
§§;
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(-0)-(CH2)2-COOH]-C(-0)-NH-(CH2)2- H-C(-0)-CH2-
§§; §-CH2-S^2CH[NH-C(<
CH2-§§;
H il-S-CH (·!!ί(0(>ί!)·\Π·(;( 0)-(Ή!(Ή.)-Ν!Κ ! ( >}·( 'ί is isoi.';} I }·ΝΠ· C( OK Π-iS:
§-CH2-S H2CH| rH-C(==0)-(CH2)2-COOH]-C(==0)-NH-(CH2)2-S(==0)2-(CH2)2- H-C(=0)-CH2-§§;
H'li-S-CII.-nijMi-CC (>)-(Π1 ·).·-<·'( >01I|-Cf t > )- N ί I -( ( Π . ) -i >}. -(C i ί. > -·χ =
C(=0)-CH2-§§;
§-CH2-S-CH2CH[C(=0)- H-(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-(CH2)2- H-
C(=0)-CH2-§§;
§-CH2~S-CH2CH[C(<))~^
C(=0)-(CH2)2-§§;
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-
(CH2)2- H-C ))-CH2-§§
oder
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=0)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(=0)-((CH2)2-0)4-
(CH2)2- H-C ))-(CH2)2-§§,
stellt,
wobei
§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt
§§ die Bindung an den Antikörper darstellt und
isoCaH?
Figure imgf000544_0001
sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.
21. Konjugal; nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 18, wobei das Konjugat eine der folgenden Formeln aufweist:
Figure imgf000544_0002
Figure imgf000545_0001
Figure imgf000546_0001
wobei
AK1 einen über Cystein verknüpften und A 2 einen über Lysin verknüpften moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkenden anti-TWEAKR-Antikörper darstellt und
n eine Zahl von I bis 20 darstellt.
22. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkende anti-TWEAKR-Antikörper ΠΈΜ-4 oder eine chimäre oder humanisierte Variante des Antikörpers ΓΓΈΜ-4 oder ein antigenbindendes Fragment von diesem ist.
23. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkende anti-TWEAKR-Antikörper oder das antigenbindende Fragment davon umfässt: eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID 1 O: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 8 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3~Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 18 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 28 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 38 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 52, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 53 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 54, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 56, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 57 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 58 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 62, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 63 und die variable CDR3 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 64, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 66, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 67 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 68 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 72, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 73 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 74, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 76, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 77 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 78 oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 82, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 83 und die variable CDR3-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ TD NO: 84, sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ TD NO: 86, die variable CDR2- Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 87 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 88.
24, Konjugal; nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, wobei der moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkende anti-TWEAKR-Airtikörper oder das antigenbindende Fragment davon umfasst: eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NÖi i , sowie eine variable Sequenz der leichten Keite, wie dargestellt durch SEQ ID NO:5 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 11 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:21 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:25 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch. SEQ ID NO:31 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 35 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:51 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ TD NO: 55 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:61 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 65 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:71 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:75 oder eine variable Sequenz, der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 81 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:8.5.
25, Konjugal gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche, wobei der moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkende anti-TWEAKR - Antikörper ein IgG Antikörper
26. Konjugat nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der moderat agonistisch oder nicht agonistisch wirkende anti-TWEAKR-Antikörper umfasst: eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:20 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 30 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO.-40 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:59 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 60 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:69 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 70 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 79 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 80 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID ]NO:89 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID O:90.
27. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche I bis 26 in Kombination mit einem inerten, nicht-toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
28. Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 26 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
29. Konjugat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 26 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von hyperproliferativen und/oder angiogenen Erkrankungen.
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