TW201720464A - Ksp 抑制劑與抗tweakr抗體的抗體藥物結合物（adc） - Google Patents

Ksp 抑制劑與抗tweakr抗體的抗體藥物結合物（adc） Download PDF

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Abstract

本申請案係關於新穎的結合子藥物結合物(ADC)、此等ADC之活性代謝物、用於製備此等ADC的方法、此等ADC用於治療及/或預防疾病的用途，及此等ADC用於製備供治療及/或預防疾病(特定言之，過度增殖性及/或血管生成病症，諸如癌症疾病)之藥劑的用途。此類療法可作為單一療法或與其他藥劑或其他治療措施組合實施。

Description

KSP抑制劑與抗TWEAKR抗體的抗體藥物結合物(ADC)
本發明係關於驅動蛋白紡錘體蛋白質抑制劑之結合子藥物結合物(ADC)、此等ADC之活性代謝物、用於製備此等ADC的方法、此等ADC用於治療及/或預防疾病的用途，及此等ADC用於製備供治療及/或預防疾病(特定言之，過度增殖性及/或血管生成病症，諸如癌症疾病)之藥劑的用途。此類療法可作為單一療法或與其他藥劑或其他治療措施組合實施。
癌症為大部分多樣化組織之細胞生長不可控的結果。在許多情況下，新細胞滲透至現有組織中(侵入性生長)，或其轉移至遠端器官中。癌症出現於廣泛多種不同的器官中且往往具有組織特異性過程。因此，術語「癌症」作為通用術語係描述不同器官、組織及細胞類型之一大類經定義之疾病。
處於早期階段的一些腫瘤可藉由手術及放射治療措施移除。轉移的腫瘤通常僅可藉由化學治療劑進行姑息治療。本文旨在達成改善生活品質與延長壽命之最佳組合。
結合子蛋白質與一或多個活性化合物分子之結合物已知，特定言之，其呈抗體藥物結合物(ADC)形式，其中針對腫瘤相關抗原的內化抗體經由連接子共價連接至細胞毒性劑。ADC引入腫瘤細胞中且結合物隨後解離之後，細胞毒性劑本身或由其形成的細胞毒性代謝物釋 放於腫瘤細胞內且可在其中直接且選擇性地發揮其作用。與習知化學療法相比，以此方式將對正常組織的損傷侷限於明顯縮窄的界限內[參見例如J.M.Lambert,Curr.Opin.Pharmacol. 5,543-549(2005)；A.M.Wu及P.D.Senter,Nat.Biotechnol. 23,1137-1146(2005)；P.D.Senter,Curr.Opin.Chem.Biol. 13,235-244(2009)；L.Ducry及B.Stump,Bioconjugate Chem. 21,5-13(2010)]。因此，WO2012/171020描述其中多個毒性基團分子經由聚合物連接子連接至抗體的ADC。作為可能的毒性基團，WO2012/171020尤其提及物質SB 743921、SB 715992(伊斯平斯(Ispinesib))、MK-0371、AZD8477、AZ3146及ARRY-520。
最近提及的物質為驅動蛋白紡錘體蛋白質抑制劑。驅動蛋白紡錘體蛋白質(KSP，亦稱為Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)為驅動蛋白樣馬達蛋白，其對於雙極性有絲分裂紡錘體發揮作用為至關重要的。抑制KSP導致有絲分裂阻滯且在相對較長的時期後導致細胞凋亡(Tao等人，Cancer Cell 2005年7月8日(1),39-59)。發現第一種細胞滲透性KSP抑制劑蒙納曲醇(monastrol)之後，KSP抑制劑本身已確立為一類新穎化學治療劑(Mayer等人，Science 286：971-974,1999)且已成為許多專利申請案(例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；及WO03/049527)之標的。然而，由於KSP僅在有絲分裂階段期間、在相對短的時段期間具有活性，因此KSP抑制劑在此階段期間須以足夠高的濃度存在。WO2014/151030揭示包括某些KSP抑制劑的ADC。
根據此背景，本發明之一目標為提供在相對較低的濃度下投與之後發揮細胞凋亡作用且因此可有益於癌症治療的物質。
為了達成此目標，本發明提供具有中等促效作用或不具有促效 作用之抗TWEAKR抗體(諸如來源於小鼠之ITEM-4抗體及此抗體之嵌合或人類化變異體)與下述化合物(I)的結合物，其中式(I)化合物中之一或多者經由連接子L連接至抗體。
本發明顯示對於使用促效作用降低之抗TWEAKR抗體的結合物，觀測到腫瘤選擇性顯著改良。
ITEM-4為Nakayama等人所述的抗TWEAKR抗體(Nakayama等人，2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825)。基於CDR移植之此抗體的人類化變異體描述於Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)及WO 2009/020933中。
抗體較佳為人類化或嵌合單株抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
其中R1表示H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或- (CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示H或OH，其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2表示H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；R4表示H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4'、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中SGlys表示可藉由溶酶體酶裂解的基團，特定言之，由二或三肽組成之基團，R4'表示C1-10烷基、C5-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基、C5-10雜環烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳烷氧基、C1-10烷氧基、C6-10芳氧基或C6-10芳烷氧基、C5-10雜芳烷氧基、C1-10烷基-O-C6-10芳氧基、C5-10雜環烷氧基，其可經以下單取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基團-Ox-(CH2CH2O)y-R4"(其中x表示0或1且v表示數字1至10且R4"表示H、-烷基(較佳為C1-12烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，其中在裂解之後，存在一級胺基團(對應於R4=H)；其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或 -(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H、NH2、SO3H、COOH、SH、鹵素(特定言之，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO(C1-4烷基)或OH；A表示CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；R3表示-L-#1、-MOD或視情況經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為-L-#1或C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中n表示0、1或2，Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'及Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH(其中「烷基」較佳表示C1-10烷基)；R5表示H、NH2、NO2、鹵素(特定而言，F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或 -(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；R6及R7彼此獨立地表示H、氰基、(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、羥基、NO2、NH2、COOH或鹵素(特定言之，F、Cl、Br)，R8表示(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、(視情況氟化)C4-10環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2表示具有至多兩個選自由N、O及S組成之群之雜原子的4員至7員雜環，其中此等基團中之每一者可經-OH、CO2H或NH2取代；R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；其中取代基R1、R3或R4之一表示或(在R8的情況下)含有-L-#1，L表示連接子且#1表示連至結合子或其衍生物的鍵，其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示H或C1-C3烷基；G1表示-NHCO-或-CONH-(其中若G1表示-NHCO-，則R10不表示NH2)；n表示0或1；o表示0或1；及G2表示直鏈及/或分支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-或-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH，且其中基團-MOD較佳具有至少一個基團-COOH； 及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
根據本發明之結合物可具有化學不穩定連接子、酶促不穩定連接子或穩定連接子。尤佳為穩定連接子及可藉由蛋白酶裂解的連接子。
本發明另外提供製備本發明之結合物的方法，以及製備所用的前驅物及中間物。
本發明之結合物的製備通常包含以下步驟：製備連接子前驅物，其視情況帶有保護基且具有能夠與抗體偶聯的反應基；使連接子前驅物與視情況帶有保護基之式(I)(其中在此等式中，當前無連至連接子的鍵)之KSP抑制劑衍生物結合，得到視情況帶有保護基的反應性KSP抑制劑/連接子結合物；移除存在於KSP抑制劑/連接子結合物中的任何保護基，及使抗體與KSP抑制劑/連接子結合物結合，得到本發明之抗體/KSP抑制劑結合物。
反應基的連接亦可在視情況經保護之KSP抑制劑/連接子前驅物結合物建構之後發生。
視連接子而定，丁二醯亞胺連接的ADC可在結合之後，根據流程26轉化成開鏈的丁二醯胺，其具有有利的穩定性概況。
如上文所說明，連接子前驅物與低分子量KSP抑制劑的結合可藉由式(I)中之R1、R3或R4之氫原子經連接子取代來達成。在結合之前的合成步驟中，所存在的任何官能基亦可以經保護的形式存在。在結合步驟之前，藉由已知的肽化學方法移除此等保護基。結合在化學上可藉由不同途徑發生，如實例中之流程20至31以例示性方式所示。特定而言，視情況可修飾供與連接子結合的低分子量KSP抑制劑，例如引入保護基或離去基以促進取代。
特定言之，本發明提供低分子量KSP抑制劑與具有中等作用或不具有中等作用之抗TWEAKR抗體(諸如ITEM-4)的新穎結合物。此等KSP抑制劑或其抗體結合物具有以下通式(II)：
其中R1 表示H、-L-結合子、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2 彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，Y3 表示H或-(CH2)0-3Z'，Z' 表示H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；W 表示H或OH，Y4 表示視情況經-NHC(=O)-NH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2 表示H、-MOD、-C(=O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2及R4 一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-， 其中R11 表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、鹵素(特定而言，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO(C1-4烷基)或-OH；Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；R4表示H、-L-結合子、-SGlys-(CO)0-1-R4'、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中SGlys表示可藉由溶酶體酶裂解的基團，特定言之，由二或三肽組成之基團，R4'表示C1-10烷基、C5-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基、C5-10雜環烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳烷氧基、C1-10烷氧基、C6-10芳氧基或C6-10芳烷氧基、C5-10雜芳烷氧基、C1-10烷基-O-C6-10芳氧基、C5-10雜環烷氧基，其可經以下單取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基團-Ox-(CH2CH2O)v-R4"(其中x表示0或1且v表示數字1至10且R4"表示-H、-烷基(較佳為C1-12烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，其中在裂解之後，存在一級胺基團(對應於R4=H)；其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3， 其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H、NH2、SO3H、COOH、SH、鹵素(特定言之，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO(C1-4烷基)或OH；A表示-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-S(=O)2-NH-或-CNNH2-；R3表示-L-結合子、-MOD或視情況經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為-L-結合子或C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH(其中「烷基」較佳表示C1-10烷基)；n表示0、1或2，R5表示H、NH2、NO2、鹵素(特定而言，F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、- OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；R8表示(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、(視情況氟化)C4-10環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2表示具有至多兩個選自由N、O及S組成之群之雜原子的4員至7員雜環(較佳為氧雜環丁烷)，其中此等基團中之每一者可經-OH、CO2H或NH2取代；R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；其中L表示連接子且結合子表示具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，諸如ITEM-4及ITEM-4之嵌合或人類化變異體，其中該結合子視情況可連接至多個活性化合物分子，其中R1、R3及R4代表性之一表示-L-結合子；R6及R7彼此獨立地表示H、氰基、(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、羥基、NO2、NH2、COOH或鹵素(特定言之，F、Cl、Br)，其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示H或C1-C3烷基；G1表示-NHCO-或-CONH-(其中若G1表示-NHCO-，則R10不表示NH2)；n表示0或1；o表示0或1；及G2表示直鏈及/或分支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之 每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-或-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH，且其中基團-MOD較佳具有至少一個基團-COOH；及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
圖1：抗體之序列註釋。就抗體或抗體片段中之每一者而言，突出顯示CDR區域(HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3)及可變區(VH、VL)。
圖2：序列方案。
本發明提供具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體(諸如ITEM-4及ITEM-4之嵌合或人類化變異體)與一或多種活性化合物分子的結合物，該活性化合物分子為經由連接子L連接至抗體的驅動蛋白紡錘體蛋白質抑制劑(KSP抑制劑)。本發明顯示對於使用促效作用降低之抗TWEAKR抗體的結合物，觀測到腫瘤選擇性顯著改良。
本發明之結合物可由以下通式表示：
其中結合子表示具有中等促效作用或不具有促效作用之抗體，諸如ITEM-4及ITEM-4之嵌合或人類化變異體，L表示連接子，KSP表示KSP抑制劑且n表示數字1至50，較佳為1.2至20且尤佳為2至8。本文中，n為每個結合子之KSP抑制劑/連接子結合物之平均數目。較佳地，KSP-L具有上文所示之式(I)。另外，連接子較佳連接至抗體之不 同胺基酸。尤佳為結合至結合子之不同半胱胺酸殘基。抗體較佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
下文描述可根據本發明使用的抗體、可根據本發明使用的KSP抑制劑及可根據本發明使用的連接子，其可組合使用而無任何限制。詳言之，在各種情況下以較佳或尤佳呈現的結合子可與在各種情況下以較佳或尤佳呈現的KSP抑制劑組合使用，視情況與在各種情況下以較佳或尤佳呈現的連接子組合。
KSP 抑制劑及其結合子結合物
定義
術語「取代」意謂所提及之原子或基團上的一或多個氫經所提及之選定基團置換，其限制條件為不超過所提及之原子在本發明情形下的正常原子價。取代基及/或變數之組合為可容許的。
術語「視情況經取代」意謂取代基之數目可等於或不同於零。除非另有說明，否則視情況經取代之基團可經可容納之多個視情況存在之取代基取代，此藉由非氫取代基置換任何可利用之碳或氮或硫原子上之氫原子而達成。通常，視情況存在之取代基(若存在)的數目可為1、2、3、4或5，特定而言，1、2或3。
如本文所用，術語「一次或超過一次」(例如在本發明通式之化合物之取代基的定義中)意謂「1、2、3、4或5次，較佳為1、2、3或4次，尤佳為1、2或3，極佳為1或2」。
除非另有說明，否則若本發明化合物中之基團經取代，則基團可經單取代或多取代。在本發明範疇中，出現超過一次之所有基團之含義為彼此獨立的。經一個、兩個或三個相同或不同取代基取代為較佳的。經一個取代基取代尤佳。
烷基
烷基表示具有1至10個碳原子(C1-C10烷基)、通常1至6個碳原子(C1-C6烷基)、較佳1至4個碳原子(C1-C4烷基)且尤佳1至3個碳原子(C1-C3烷基)之直鏈或分支鏈飽和單價烴基。
以下可作為實例且作為較佳而提及：甲基-、乙基-、丙基-、丁基-、戊基-、己基-、異丙基-、異丁基-、第二丁基、第三丁基-、異戊基-、2-甲基丁基-、1-甲基丁基-、1-乙基丙基-、1,2-二甲基丙基-、新戊基-、1,1-二甲基丙基-、4-甲基戊基-、3-甲基戊基-、2-甲基戊基-、1-甲基戊基-、2-乙基丁基-、1-乙基丁基-、3,3-二甲基丁基-、2,2-二甲基丁基-、1,1-二甲基丁基-、2,3-二甲基丁基-、1,3-二甲基丁基-及1,2-二甲基丁基-。
尤佳為甲基-、乙基-、丙基-、異丙基-及第三丁基。
雜烷基
雜烷基表示具有1至10個碳原子之直鏈及/或分支鏈烴鏈，其可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-NRy-、-NRyC(=O)-、-C(=O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(=O)2-NRyNRy-、-C(=O)-NRyNRy-、-CRx=N-O-，且其中包括側鏈(若存在)之烴鏈可經-NH-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(=NNH2)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
本文中，Ry在各種情況下表示-H、苯基-、C1-C10烷基、C2-C10烯基-或C2-C10炔基-，就其而言，其各自可經-NH-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(=NNH2)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
本文中，Rx表示-H、C1-C3烷基-或苯基-。
烯基
烯基表示具有一或兩個雙鍵及2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子(C2-C10烯基)、尤其2或3個碳原子(C2-C3烯基)的直鏈或分支鏈 單價烴鏈，應瞭解若烯基含有超過一個雙鍵，則雙鍵可彼此間分隔或彼此間共軛。烯基為例如乙烯基(或乙烯基)、丙-2-烯-1-基(或「烯丙基」)、丙-1-烯-1-基、丁-3-烯基、丁-2-烯基、丁-1-烯基、戊-4-烯基、戊-3-烯基、戊-2-烯基、戊-1-烯基、己-5-烯基、己-4-烯基、己-3-烯基、己-2-烯基、己-1-烯基、丙-1-烯-2-基(或「異丙烯基」)、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯基、1-甲基丁-2-烯基、3-甲基丁-1-烯基、2-甲基丁-1-烯基、1-甲基丁-1-烯基、1,1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-異丙基乙烯基、4-甲基戊-4-烯基、3-甲基戊-4-烯基、2-甲基戊-4-烯基、1-甲基戊-4-烯基、4-甲基戊-3-烯基、3-甲基戊-3-烯基、2-甲基戊-3-烯基、1-甲基戊-3-烯基、4-甲基戊-2-烯基、3-甲基戊-2-烯基、2-甲基戊-2-烯基、1-甲基戊-2-烯基、4-甲基戊-1-烯基、3-甲基戊-1-烯基、2-甲基戊-1-烯基、1-甲基戊-1-烯基、3-乙基丁-3-烯基、2-乙基丁-3-烯基、1-乙基丁-3-烯基、3-乙基丁-2-烯基、2-乙基丁-2-烯基、1-乙基丁-2-烯基、3-乙基丁-1-烯基、2-乙基丁-1-烯基、1-乙基丁-1-烯基、2-丙基丙-2-烯基、1-丙基丙-2-烯基、2-異丙基丙-2-烯基、1-異丙基丙-2-烯基、2-丙基丙-1-烯基、1-丙基丙-1-烯基、2-異丙基丙-1-烯基、1-異丙基丙-1-烯基、3,3-二甲基丙-1-烯基、1-(1,1-二甲基乙基)乙烯基、丁-1,3-二烯基、五-1,4-二烯基或六-1,5-二烯基。特定而言，該基團為乙烯基或烯丙基。
炔基
炔基表示具有參鍵及2、3、4、5、6、7、8、9或10個碳原子(C2-C10炔基)、尤其2或3個碳原子(C2-C3炔基)的直鏈或分支鏈單價烴鏈。C2-C6炔基為例如乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊- 4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-異丙基丙-2-炔基、2,2-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-2-炔基-或3,3-二甲基丁-1-炔基。特定而言，炔基為乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。
環烷基
環烷基表示具有3-12個碳原子(C3-C12環烷基)的飽和單價單環或雙環烴基。
本文中，單環烴基表示通常具有3至10個碳原子(C3-C10環烷基)、較佳3至8個碳原子(C3-C8環烷基)且尤佳3至7個碳原子(C3-C7環烷基)的單價烴基。
以下可提及為單環烴基之較佳實例： 環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基及環辛基。
尤佳為環丙基、環丁基、環戊基、環己基及環庚基。
本文中，雙環烴基表示通常具有3至12個碳原子的烴基(C3-C12環烷基)，其應瞭解為共用兩個直接相鄰原子之兩個飽和環系統的稠合體。以下可提及為雙環烴基之較佳實例：雙環[2.2.0]己基、雙環[3.3.0]辛基、雙環[4.4.0]癸基、雙環[5.4.0]十一烷基、雙環[3.2.0]庚基、雙環[4.2.0]辛基、雙環[5.2.0]壬基、雙環[6.2.0]癸基、雙環[4.3.0]壬基、雙環[5.3.0]癸基、雙環[6.3.0]十一烷基及雙環[5.4.0]十一烷基。
雜環烷基
雜環烷基表示具有一、二、三或四個可相同或不同之雜原子的非芳族單環或雙環環系統。存在的雜原子可為氮原子、氧原子或硫原子。
根據本發明之單環環系統可具有3至8個、較佳4至7個、尤佳5或6個環原子。
以下可提及為具有3個環原子之雜環烷基之較佳實例：氮雜環丙烷基。
以下可提及為具有4個環原子之雜環烷基之較佳實例：氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基。
以下可提及為具有5個環原子之雜環烷基之較佳實例：吡咯啶基、咪唑啶基、吡唑啶基、吡咯啉基、二氧雜環戊烷基及四氫呋喃基。
以下可提及為具有6個環原子之雜環烷基之較佳實例：哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、二噁烷基、四氫哌喃基及硫代嗎啉基。
以下可提及為具有7個環原子之雜環烷基之較佳實例：氮雜環庚烷基、氧雜環庚烷基、1,3-二氮雜環庚烷基、1,4-二氮雜環庚烷基。
以下可提及為具有8個環原子之雜環烷基之較佳實例：氧雜環辛基、氮雜環辛基。
在單環雜環烷基當中，較佳為具有至多2個由O、N及S組成之群之雜原子的4員至7員飽和雜環基。
尤佳為嗎啉基、哌啶基、吡咯啶基及四氫呋喃基。
根據本發明，具有一、二、三或四個可相同或不同之雜原子的雙環環系統可具有6至12個、較佳6至10個環原子，其中一、二、三或四個碳原子可經選自由O、N及S組成之群的相同或不同雜原子置換。
以下可提及為實例：氮雜雙環[3.3.0]辛基、氮雜雙環[4.3.0]壬基、二氮雜雙環[4.3.0]壬基、氧雜雙環[4.3.0]壬基、硫雜氮雜雙環[4.3.0]壬基或氮雜雙環[4.4.0]癸基，以及根據定義衍生自其他可能組合的基團。
尤佳為全氫環戊并[c]吡咯基、全氫呋喃并[3,2-c]吡啶基、全氫吡咯并[1,2-a]吡嗪基、全氫吡咯并[3,4-c]吡咯基及3,4-亞甲基二氧基苯基。
芳基
芳基為由碳原子組成之單價單環或雙環芳族環系統。實例為萘基及苯基；較佳為苯基或苯基。
C 6 -C 10 芳烷基
在本發明之上下文中，C6-10芳烷基表示連接至C1-C4烷基的單環芳族芳基，例如苯基。
例示性C6-10芳烷基為苯甲基。
雜芳基
雜芳基為具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個環系統(「5員至14員雜芳基」)、特定而言5、6、9或10個環原子的單價單環、雙環或三環芳族環系統，其含有至少一個環雜原子且視情況含有一個、兩個或三個選自由N、O及S組成之群之其他環雜原子且經由環碳原子連接或視情況(價數允許)經由環氮原子連接。
雜芳基可為5員雜芳基，諸如噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基或四唑基；或6員雜芳基，諸如吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基；或三環雜芳基，諸如咔唑基、吖啶基或啡嗪基；或9員雜芳基，諸如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚 基、異吲哚基、吲哚嗪基或嘌呤基；或10員雜芳基，諸如喹啉基、喹唑啉基、異喹啉基、啉基、酞嗪基、喹喏啉基或喋啶基。
一般而言，且若未另外提及，則雜芳基包括其所有可能的異構體形式，例如互變異構體及位置異構體(相對於連至分子剩餘部分之連接點)。因此，作為說明性的非包括性實例，術語吡啶基包括吡啶-2-基、吡啶-3-基及吡啶-4-基；或術語噻吩基包括噻吩-2-基及噻吩-3-基。
C 5 -C 10 雜芳基
在本發明之上下文中，C5-10雜芳基表示具有一、二、三或四個可相同或不同之雜原子的單環或雙環芳族環。可存在的雜原子為：N、O、S、S(=O)及/或S(=O)2。結合價可位於任何芳族碳原子或氮原子上。
根據本發明之單環雜芳基具有5或6個環原子。
較佳為具有一或兩個雜原子的雜芳基。本文中尤佳為一或兩個氮原子。
具有5個環原子之雜芳基包括例如以下環：噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、四唑基及噻二唑基。
具有6個環原子之雜芳基包括例如以下環：吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基及三嗪基。
根據本發明之雙環雜芳基具有9或10個環原子。
具有9個環原子之雜芳基包括例如以下環：酞基、硫代酞基、吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、吖辛因基、吲哚嗪基、嘌呤基、吲哚啉基。
具有10個環原子之雜芳基包括例如以下環： 異喹啉基、喹啉基、喹嗪基、喹唑啉基、喹喏啉基、啉基、酞嗪基、1,7-或1,8-啶基、喋啶基、烷基。
雜烷氧基
雜烷氧基表示具有1至10個碳原子之直鏈及/或分支鏈烴鏈，其經由-O-連接至分子剩餘部分且另外可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-NRy-、-NRyC(=O)-、-C(=O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(=O)2-NRyNRy-、-C(=O)-NRyNRy-、-CRx=N-O-，且其中包括側鏈(若存在)的烴鏈可經-NH-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(=NNH2)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
本文中，Ry在各種情況下表示-H、苯基-、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，就其而言，其各自可經-NH-C(=O)-NH2、-C(=O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(=NNH2)-、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
本文中，Rx表示-H、C1-C3烷基或苯基。
在本發明之上下文中，鹵素或鹵素原子表示氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)或碘(-I)。
氟烷基、氟烯基及氟炔基意謂可經氟單取代或多取代的烷基、烯基及炔基。
KSP抑制劑與抗體的結合在化學上可藉由不同途徑發生，如實例之流程20至31中以例示性方式所示。特定而言，視情況可修飾供與連接子結合的低分子量KSP抑制劑，例如引入保護基或離去基以促進取代(使得在反應中，該離去基而非氫原子被連接子取代)。以此方式獲得之KSP抑制劑-連接子分子(其中連接子具有與結合子偶聯的反應基)接著可與結合子反應，得到本發明之結合子結合物。在實驗章節中，以例示性方式、藉由許多實例說明此程序。
其他尤佳化合物具有下式(I)或(Ia)：
其中R1表示H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示H或OH，其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2表示H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；R4表示H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4'、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z， 其中SGlys表示可藉由溶酶體酶的基團，特定言之，由二肽或三肽組成之基團，R4'表示C1-10烷基、C5-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基、C5-10雜環烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基烷氧基、C1-10烷氧基、C6-10芳氧基或C6-10芳烷氧基、C5-10雜芳烷氧基、C1-10烷基-O-C6-10芳氧基、C5-10雜環烷氧基，其可經以下單取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基團-Ox-(CH2CH2O)y-R4"(其中x表示0或1且v表示數字1至10且R4"表示-H、-烷基(較佳為C1-12烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H、NH2、SO3H、COOH、SH、鹵素(特定言之，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO(C1-4烷基)或OH；A表示CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；R3表示-L-#1、-MOD或視情況經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3 個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH((CH2CH2O)1-20H)基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中n表示0、1或2，Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH(其中「烷基」較佳為C1-10烷基)；R5表示H、-MOD、NH2、NO2、鹵素(特定而言，F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；R6及R7彼此獨立地表示H、氰基、(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、羥基、NO2、NH2、COOH或鹵素(特定言之，F、Cl、Br)，R8表示(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、(視情況氟化)C4-10環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2表示具有至多兩個選自由N、O及S組成之群之雜原子的4員至7員雜環(較佳為氧雜環丁烷)，其中此等基團中之每一者可經-OH、CO2H或NH2取代；其中取代基R1、R3及R4之一表示-L-#1；L表示連接子且#1表示連至抗體之鍵，R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中 R10表示H或C1-C3烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或(其中若G1表示-NHCO- 或，R10不表示NH2)；n表示0或1；o表示0或1；及G2表示直鏈及/或分支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-或-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH，且其中基團-MOD較佳具有至少一個基團-COOH；及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
在式(I)之一個較佳實施例中，取代基R1或R3之一表示-L-#1。在此實施例中，若R4表示H或-SGlys-(CO)0-1-R4'，其中SGlys及R4'具有如上相同含義，則尤佳。在式(I)之另一較佳實施例中，取代基R4表示-L-#1，其中連接子為可在氮原子處裂解的連接子，其結合至R4，使得裂解(對應於R4=H)之後存在一級胺基。此類可裂解基團詳細描述如下。
若R1不表示H，則R1所結合的碳原子為可以L及/或D組態、較佳L組態存在的立構中心。
若R2不表示H，則R2所結合的碳原子為可以L及/或D組態存在的立構中心。
式(Ia)：
其中R1表示H、-L-#1或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示H或OH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基。
R2及R4彼此獨立地表示H、-SGlys-(CO)0-1-R4'、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中SGlys表示可藉由溶酶體酶的基團，特定言之，由二肽或三肽組成之基團，R4'表示C1-10烷基、C5-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基、C5-10雜環烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基烷氧基、C1-10烷氧基、C6-10芳氧基或C6-10芳烷氧基、C5-10雜芳烷氧基、C1-10烷基-O-C6-10芳氧基、C5-10雜環烷氧基，其各自可經以下單取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基團-Ox-(CH2CH2O)y-R4"(其中x表 示0或1且v表示數字1至10且R4"表示-H、-烷基(較佳為C1-12烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；或R2與R4一起表示(藉以形成吡咯啶環)-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H、NH2、SO3H、COOH、SH、鹵素(特定而言，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO(C1-4烷基)或OH；或R2表示H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z且R4表示-L-#1，且其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4彼此獨立地表示視情況經-NHCONH2取代之直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代之芳基或苯甲基，其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代之直鏈或分支鏈-6烷基或表示視情況經-NH2取代之芳基或苯甲基且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；A表示CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；R3表示視情況經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為-L-#1或C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中n表示0、1或2，Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'且Y3表示H、-(CH2)0-3- CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH(其中「烷基」較佳表示C1-10烷基)；R5表示H、F、NH2、NO2、鹵素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；R6及R7彼此獨立地表示H、氰基、(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、羥基或鹵素，R8表示(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C4-10環烷基或視情況經取代之氧雜環丁烷；及R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
藉由取代R1、R3或R4之氫原子，可使式(I)或(Ia)化合物(其中取代基R1、R3及R4均不表示-L-#1)以熟習此項技術者已知的方式連接至連接子。由此得到式(I)或(Ia)之結合物，其中取代基R1、R3或R4之一表示-L-#1，L表示連接子且#1表示連至抗體的鍵。若根據式(I)或(Ia)之KSP抑制劑與結合子結合，則取代基R1、R3或R4之一因此表示-L-#1，其中L表示連接子且#1表示連至抗體的鍵。亦即，在結合物的情況下，取代基R1、R3或R4之一表示-L-#1，其中-L-#1表示連至抗體的鍵。結合子較佳為人類、人類化或嵌合單株抗體或其抗原結合片段。在式(I)或(Ia)之一個較佳實施例中，取代基R1或R3之一表示-L-#1。在此實施例中，若R4表示H或-SGlys-(CO)0-1-R4'，其中SGlys及R4'具有如上相同含義，則尤佳。在式(I)之另一較佳實施例中，取代基R4表示-L-#1，其中連接子為可在氮原子處裂解的連接子，其結合至R4，使得裂解(對應於R4=H)之後存在一級胺基。此類可裂解基團詳細描述如 下。較佳為具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體。抗體較佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
化合物中亦可存在基團-L-#3，而非-L-#1，其中L表示連接子且#3表示結合至抗體的反應基。包含-L-#3之化合物為與抗體反應的反應性化合物。#3較佳為與胺基或硫醇基發生反應(經由共價鍵的形成，較佳與蛋白質中之半胱胺酸殘基形成共價鍵)的基團。蛋白質中之半胱胺酸殘基可天然存在於蛋白質中，可藉由生物化學方法引入，或較佳可藉由預先還原結合子之二硫鍵來產生。
A較佳為CO(羰基)。
R1較佳為-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2及-CONZ"CH2COOH，其中Z"表示H或NH2。
R2及R4較佳為H，或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H或F。R4較佳亦為-L-#1，其中-L-#1為可裂解連接子，較佳為可在細胞內藉由酶裂解的連接子。
R3較佳為-L-#1或C1-10烷基-，其視情況可經以下取代：-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基較佳為C1-3烷基)。
R5較佳為H或F。
R6及R7較佳彼此獨立地為H、(視情況氟化)C1-3烷基、(視情況氟化)C2-4烯基、(視情況氟化)C2-4炔基、羥基或鹵素。
R8較佳為分支鏈C1-5烷基，特定言之，式-C(CH3)2-(CH2)0-2-Ry之基團，其中Ry表示-H、-OH、CO2H或NH2，或(視情況氟化)C5-7環烷基。尤佳為式-C(CH3)3之基團或環己基。
R9較佳為H或F。
尤佳為式(I)或(Ia)之化合物，其中A表示CO(羰基)；R1較佳為H、-L-#1、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2及-CONZ"CH2COOH，其中Z"表示H或NH2；R2及R4表示H或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H或F；或R4表示-L-#1且R2表示H；R3表示-L-#1或苯基，其可經鹵素(特定言之，F)或視情況氟化C1-3烷基單取代或多取代，或表示視情況氟化C1-10烷基，其視情況可經以下取代：-OY4、-SY4、-O-CO-Y4、-O-CO-NH-Y4、NH-CO-Y4、-NH-CO-NH-Y4、S(O)n-Y4(其中n表示0、1或2)、-SO2-NH-Y4、NH-Y4或N(Y4)2，其中Y4表示H、苯基(視情況經鹵素(特定言之，F)或視情況氟化C1-3烷基單取代或多取代)或烷基(其中烷基可經-OH、-COOH及/或-NHCO-C1-3烷基取代且其中烷基較佳表示C1-3烷基)；其中尤佳地，R3可經以下取代：-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基較佳意謂C1-3烷基)；R5表示H或F；R6及R7彼此獨立地表示H、(視情況氟化)C1-3烷基、(視情況氟化)C2-4烯基、(視情況氟化)C2-4炔基、羥基或鹵素；R8表示分支鏈C1-5烷基或環己基；及R9表示H或F。
另外，當存在以下情況(單獨或組合)時，為較佳的：R1表示-L-#1、COOH或H，R2及R4表示H或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11- 或-CHR11-CH2-，其中R11表示H；或R4表示-L-#1且R2表示H；A表示CO，R3表示-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、苯基，其可經1-3個鹵素原子、1-3個胺基或1-3個烷基(其可視情況鹵化)取代，或表示-L-#1，R5表示-H，R6及R7彼此獨立地表示H、C1-3烷基或鹵素；特定言之，R6及R7表示F；R8表示C1-4烷基(較佳為第三丁基)或環己基；及/或R9表示H。
另外，根據本發明，當存在以下情況時，為較佳的：R1表示-L-#1、COOH或H，R2及R4表示H，或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H，A表示CO，R3表示-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、苯基，其可經1-3個鹵素原子、1-3個胺基或1-3個烷基(其可視情況鹵化)取代，或表示-L-#1，R5表示H，R6及R7彼此獨立地表示H、C1-3烷基或鹵素；特定言之，R6及R7表示F；R8表示C1-4烷基(較佳為第三丁基)；及R9表示H。
其他尤佳化合物具有下式(II)或(IIa)：式(II)：
其中R1表示H、-L-結合子、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、NH2、SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示H或OH，其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2表示H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；R4表示H、-L-結合子、-SGlys-(CO)0-1-R4'、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中SGlys表示可藉由溶酶體酶的基團，特定言之，由二肽或三 肽組成之基團，R4'表示C1-10烷基、C5-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基、C5-10雜環烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基烷氧基、C1-10烷氧基、C6-10芳氧基或C6-10芳烷氧基、C5-10雜芳烷氧基、C1-10烷基-O-C6-10芳氧基、C5-10雜環烷氧基，其可經以下單取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基團-Ox-(CH2CH2O)y-R4"(其中x表示0或1且v表示數字1至10且R4"表示-H、-烷基(較佳為C1-12烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H、NH2、SO3H、COOH、SH、鹵素(特定而言，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO(C1-4烷基)或OH；A表示CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；R3表示-L-結合子、-MOD或視情況經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為-L-結合子或C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S- 烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH(其中「烷基」較佳表示C1-10烷基)；R5表示H、NH2、NO2、鹵素(特定而言，F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；R6及R7彼此獨立地表示H、氰基、(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、羥基、NO2、NH2、COOH或鹵素(特定言之，F、Cl、Br)，R8表示(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、(視情況氟化)C4-10環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2表示具有至多兩個選自由N、O及S組成之群之雜原子的4員至7員雜環，其中此等基團中之每一者可經-OH、CO2H或NH2取代；R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示H或C1-C3烷基；G1表示-NHCO-或-CONH-(其中若G1表示-NHCO-，則R10不表示NH2)；n表示0或1； o表示0或1；及G2表示直鏈及/或分支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-或-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH，且其中基團-MOD較佳具有至少一個基團-COOH；及其鹽、溶劑合物及溶劑合物之鹽及差向異構體。
在式(II)之KSP抑制劑之結合子結合物的情況下，R1、R3及R4中具代表性的至多一者(或者上文指定之條件之一)可表示-L-結合子，其中L表示連接子且結合子表示抗體，其中抗體視情況可連接至多個活性化合物分子。
其中R1表示-L-結合子、H或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z' 或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示H或OH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2與R4彼此獨立地表示H、-SGlys-(CO)0-1-R4'、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，或R2表示H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z且R4表示-L-#1，其中R11表示H、NH2、SO3H、COOH、SH、鹵素(特定而言，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO(C1-4烷基)或OH；其中SGlys表示可藉由溶酶體酶的基團，特定言之，由二肽或三肽組成之基團，R4'表示C1-10烷基、C5-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基、C5-10雜環烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基烷氧基、C1-10烷氧基、C6-10芳氧基或C6-10芳烷氧基、C5-10雜芳烷氧基、C1-10烷基-O-C6-10芳氧基、C5-10雜環烷氧基，其可經以下單取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基團-Ox-(CH2CH2O)y-R4"(其中x表示0或1且v表示數字1至10且R4"表示-H、-烷基(較佳為C1-12烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基， 或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；A表示CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；R3表示-L-結合子或視情況經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為-L-結合子或C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH(其中「烷基」較佳表示C1-10烷基)；R5表示H、F、NH2、NO2、鹵素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中L表示連接子且結合子表示結合子或其衍生物，其中該結合子可視情況連接至多個活性化合物分子，R6及R7彼此獨立地表示H、氰基、(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、羥基或鹵素，R8表示(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C4-10環烷基或視情況經取代之氧雜環丁烷；及 R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
根據本發明，較佳另外為下述KSP抑制劑/抗體結合物：
其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8及R9具有如式(II)或(IIa)中之相同含義，A表示CO，B表示單鍵、-O-CH2-或-CH2-O-且R20表示NH2、F、CF3或CH3，且n表示0、1或2。
其中A、R1、R3、R6、R7、R8及R9具有如式(II)或(IIa)中之相同含義，其中A較佳表示CO且R3表示-CH2OH、-CH2OCH3、CH(CH3)OH或CH(CH3)OCH3。
式(IId)：
其中A、R3、R6、R7、R8及R9具有如式(II)或(IIa)中之相同含義，其中A較佳表示CO且R3表示-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x表示0或1且Y5表示H或NHY6，其中Y6表示H或-COCH3。
其中A、R2、R3、R4、R6、R7、R8及R9具有如式(II)或(IIa)中之相同含義且R1表示-L-結合子。
其中A、R1、R2、R3、R6、R7、R8及R9具有如式(II)或(IIa)中之相 同含義且R4表示-L-結合子，較佳為酶可裂解結合子，使得裂解之後R4=H。R1或R3尤佳表示-MOD。
其中R3表示-L-#1；A表示CO；及R6、R7、R8及R9具有如式(I)中之相同含義
其中R1表示-L-#1；A表示CO且R3表示-CH2OH；R3、R6、R7、R8及R9具有如式(I)中之相同含義。
另外，在式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)及 (IIk)之化合物中，當出現以下情況(單獨或組合)時，為較佳的：Z表示Cl或Br；R1表示-(CH2)0-3Z，其中Z表示-COOH或-CO-NY1Y2，其中Y2表示-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'且Y1表示H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'；Y1表示H，Y2表示-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'且Z'表示-COOH；Y1表示H，Y2表示-CH2CH2Z'且Z'表示-(CONHCHY4)2COOH；Y1表示H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-(CONHCHY4)2COOH且Y4基團之一表示異丙基且其他表示-(CH2)3-NHCONH2；Y1表示H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-(CONHCHY4)2COOH且Y4基團之一表示-CH3且其他表示-(CH2)3-NHCONH2；Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基；至少一個代表性Y4係選自由異丙基及-CH3組成之群；Y1表示H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-CONHCHY4COOH且Y4表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；Y4表示胺基苯甲基；R2表示-(CH2)0-3Z且Z表示-SY3；R4表示-CO-CHY4-NHY5且Y5表示H；R4表示-CO-CHY4-NHY5且Y5表示-CO-CHY6-NH2；或Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基。
另外，在式(I)或(II)中，當R1、R2或R3表示-MOD時，為較佳的。
尤佳地，R3表示-MOD且R1或R4表示-L-#1或-L-結合子，其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示H或C1-C3烷基；G1表示-NHCO-或-CONH-(其中若G1表示-NHCO-，則R10不表示NH2)； n表示0或1；o表示0或1；及G2表示直鏈及/或分支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-或-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，其中G3表示-H或-COOH，且其中基團-MOD較佳具有至少一個基團-COOH；尤佳地，基團-MOD具有(較佳為末端)-COOH基團，例如在甜菜鹼基團中。較佳地，基團-MOD具有式-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x為0或1，且Y5表示H或NHY6，其中Y6表示H或-COCH3。
其他尤佳化合物具有下式(III)：
其中R1表示-L-結合子、H或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z' 或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2及R4彼此獨立地表示H、-SGlys-(CO)0-1-R4'、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H、NH2、SO3H、COOH、SH、鹵素(特定言之，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO(C1-4烷基)或OH；其中SGlys表示可藉由溶酶體酶的基團，特定言之，由二肽或三肽組成之基團，R4'表示C1-10烷基、C5-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基、C5-10雜環烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基烷氧基、C1-10烷氧基、C6-10芳氧基或C6-10芳烷氧基、C5-10雜芳烷氧基、C1-10烷基-O-C6-10芳氧基、C5-10雜環烷氧基，其可經以下單取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH、-H或基團-Ox-(CH2CH2O)y-R4"(其中x表示0或1且v表示數字1至10且R4"表示-H、-烷基(較佳為C1-12烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6- NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；A表示CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；R3表示-L-結合子或視情況經取代之烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基或-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x表示0或1且Y5表示H或NHY6，其中Y6表示H或-COCH3，較佳為-L-結合子或C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH，(其中「烷基」較佳表示C1-10烷基)；R5表示H、F、NH2、NO2、鹵素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中L表示連接子且結合子表示抗體，其中該結合子視情況可連接至多個活性化合物分子，R6及R7彼此獨立地表示H、氰基、(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、羥基或鹵素，R8表示(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C4-10環烷基或視情況經取代之氧雜環丁烷；及 R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
另外，在式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)、(IIk)或(III)中，當存在以下情況(單獨或組合)時，為較佳的：Z表示Cl或Br；R1表示-(CH2)0-3Z，其中Z表示-CO-NY1Y2，其中Y2表示-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'且Y1表示H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'；Y1表示H，Y2表示-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'且Z'表示-COOH；Y1表示H，Y2表示-CH2CH2Z'且Z'表示-(CONHCHY4)2COOH；Y1表示H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-(CONHCHY4)2COOH且一個代表性Y4表示異丙基且其他表示-(CH2)3-NHCONH2；Y1表示H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-(CONHCHY4)2COOH且一個代表性Y4表示-CH3且其他表示-(CH2)3-NHCONH2；Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基；至少一個代表性Y4係選自由異丙基及-CH3組成之群；Y1表示H，Y2表示-CH2CH2Z'，Z'表示-CONHCHY4COOH且Y4表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；Y4表示胺基苯甲基；R2表示-(CH2)0-3Z且Z表示-SY3；R4表示-CO-CHY4-NHY5且Y5表示H；R4表示-CO-CHY4-NHY5且Y5表示-CO-CHY6-NH2；及/或Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基。
較佳另外為式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)或(III)之化合物其中R1表示H、-L-#1或-L-結合子、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示- H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示H或OH，其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2表示H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4彼此獨立地表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；R4表示H或-L-#1或-L-結合子(其中-L-#1或-L-結合子為酶可裂解連接子，從而使R4轉化成H)；A表示CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；R3表示-L-#1或-L-結合子、-MOD或視情況經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH((CH2CH2O)1-20H)基 團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH(其中「烷基」較佳為C1-10烷基)；R5表示H、-MOD、NH2、NO2、鹵素(特定而言，F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；R6及R7彼此獨立地表示H、氰基、(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基、羥基、NO2、NH2、COOH或鹵素(特定言之，F、Cl、Br)，R8表示(視情況氟化)C1-10烷基、(視情況氟化)C2-10烯基、(視情況氟化)C2-10炔基或(視情況氟化)C4-10環烷基；其中取代基R1及R3之一表示-L-#1或-L-結合子，L表示連接子且#1表示連至抗體的鍵且結合子表示抗體，R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示H或C1-C3烷基；G1表示-NHCO-或-CONH-(其中若G1表示-NHCO-，則R10不表示NH2)；n表示0或1；o表示0或1；及G2表示直鏈及/或分支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、- NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-或-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH，且其中基團-MOD較佳具有至少一個基團-COOH；及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
較佳另外為式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)或(III)之化合物，其中R1表示H、-L-#1或-L-結合子、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W表示H或OH，其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2表示H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；其中Y4表示視情況經-NHCONH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，且Y5表示H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；R4表示H， A表示CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH2；R3表示-L-#1或-L-結合子、-MOD或視情況經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為C1-10烷基、C6-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-CO-烷基、1-3個-O-CO-NH-烷基、1-3個-NH-CO-烷基、1-3個-NH-CO-NH-烷基、1-3個-S(O)n-烷基、1-3個-SO2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH((CH2CH2O)1-20H)基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中Z表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'且Y3表示H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH(其中「烷基」較佳為C1-10烷基)；R5表示H、-MOD、NH2、NO2、鹵素(特定而言，F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1及Y2彼此獨立地表示H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3表示H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'表示H、SO3H、NH2或COOH；R6及R7彼此獨立地表示H或鹵素(特定而言，F、Cl、Br)；R8表示(視情況氟化)C1-10烷基；其中取代基R1及R3之一表示-L-#1或-L-結合子，L表示連接子且#1表示連至抗體的鍵且結合子表示抗體，R9表示H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；其中-MOD表示-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x為0或1，且Y5表示H或NHY6，其中Y6表示H或-COCH3， 及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
較佳另外為以下化合物，其視情況可連同酸(諸如三氟乙酸)一起存在。此等化合物可經由對應於位置R1、R3及R4的位置、經由連接子連接至抗體(其中氫原子經連接子取代)：N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-甲基丁醯胺(1：1)；N-(3-胺基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基乙醯胺；S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸；S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)胺基]乙基}-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸；S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-R/S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}高半胱胺酸；S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯 基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸；S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)己醯基]胺基}乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸；S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)環戊基]羰基}胺基)乙基]-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基}-L-半胱胺酸；S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)-L-半胱胺酸；N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸；N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸；N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-L-離胺酸；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-氟苯甲醯胺； N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲醯胺；(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁酸；(2S)-2-胺基-N-(2-胺基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯胺；4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸；4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-絲胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-丙胺酸；N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}甘胺酸；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲醯胺； N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫基)苯甲醯胺；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基丙醯胺；N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫基)乙醯胺；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-((1R)-1-[4-苯甲基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥基丙醯胺；4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-側氧基丁酸甲酯；4-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-4-側氧基丁酸；(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基]-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)甲基]-4,20-二側氧基-7,10,13,16-四氧雜-3,19-二氮雜二十二烷-1-酸；N-乙醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-L-半胱胺酸；N-乙醯基-S-[2-([3-(L-丙胺醯基胺基)丙基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸；(2S)-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氫呋喃-2-甲醯胺；3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)丙酸； S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}高半胱胺酸；4-胺基-N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲醯胺；4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧基乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸；4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧基乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸。
根據本發明，尤佳為以下式IV化合物，其中R1、R2、R3、R4及R5具有上述含義(如針對例如式(I)或(II)所述)：
尤佳為式IV化合物，其中R1及R5表示H或-L-#1；R2及R4表示H或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H；且R3表示CH2OH、CH(CH3)OH或-L-#1，其中取代基R1及R3之一表示-L-#1。另外，尤佳為式IV化合物，其中R1表示H或COOH；R2及R5表示H；R4表示-L-#1；且R3表示CH2OH或CH(CH3)OH，其中-L-#1為使得R4轉化成H的酶可裂解連接子。
連接子
文獻揭示用於有機分子與結合子(諸如抗體)共價偶聯(結合)的不同選擇方案(參見例如K.Lang及J.W.Chin.Chem.Rev. 2014,114,4764-4806；M.Rashidian等人，Bioconjugate Chem. 2013,24,1277-1294)。根據本發明，較佳為KSP抑制劑經由抗體之半胱胺酸殘基之一或多個硫原子(已以游離硫醇形式存在或藉由二硫橋還原而產生)及/或經由抗體之離胺酸殘基之一或多個NH基團與抗體結合。然而，亦可使KSP抑制劑經由抗體之酪胺酸殘基、經由抗體之麩醯胺酸殘基、經由抗體之非天然胺基酸殘基、經由抗體之游離接基或經由抗體之糖殘基連接至抗體。利用連接子進行偶聯。連接子可分類成可在活體內裂解之連接子群組及在活體內穩定的連接子群組(參見L.Ducry及B.Stump,Bioconjugate Chem. 21,5-13(2010))。可在活體內裂解的連接子具有可在活體內裂解的基團，此又可區分為在活體內化學可裂解基團與活體內酶可裂解基團。「活體內化學可裂解」及「活體內酶可裂解」意謂連接子或基團在循環中穩定且僅在靶細胞處或在靶細胞內，被其中化學上或酶學上之不同環境(較低pH；升高的麩胱甘肽濃度；存在溶酶體酶，諸如蛋白酶，或糖苷酶，諸如β-葡糖醛酸酶)裂解，從而釋放低分子量KSP抑制劑或其衍生物。可在活體內化學裂解的基團特定而言為二硫化物、腙、縮醛及縮醛胺；可在活體內酶裂解的基團特定而言為可藉由溶酶體酶裂解的基團，特定而言，2-8個寡肽基團，尤其三肽或二肽基團或糖苷。肽裂解位點揭示於Bioconjugate Chem. 2002, 13,855-869及Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8(1998)3341-3346以及Bioconjugate Chem. 1998, 9,618-626中。此等位點包括例如纈胺酸-丙胺酸、纈胺酸-離胺酸、纈胺酸-瓜胺酸、丙胺酸-離胺酸及苯丙胺酸-離胺酸(視情況具有其他醯胺基團)。
活體內穩定的連接子依據高穩定性(24小時之後，血漿中之代謝物少於5%)區分且不具有上述活體內化學或酶可裂解基團。
連接子-L-較佳具有下述基本結構(i)至(iv)之一：(i)-(CO)m-SG1-L1-L2-
(ii)-(CO)m-L1-SG-L1-L2-
(iii)-(CO)m-L1-L2-
(iv)-(CO)m-L1-SG-L2
其中m為0或1；SG為活體內(化學或酶)可裂解基團(特定而言，二硫化物、腙、縮醛及縮醛胺；或可藉由蛋白酶裂解的2-8個寡肽基團)，SG1為寡肽基團或較佳為二肽基團，L1彼此獨立地表示活體內穩定的有機基團，且L2表示連至結合子或單鍵的偶聯基團。本文中，偶聯較佳連至抗體之半胱胺酸殘基或離胺酸殘基。或者，偶聯可連至抗體之酪胺酸殘基、麩醯胺酸殘基或非天然胺基酸。非天然胺基酸可含有例如醛基或酮基(諸如甲醯基甘胺酸)或疊氮基或炔基(參見Lan及Chin,Cellular Incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins,Chem.Rev.2014,114,4764-4806)。
根據本發明，尤佳為基本連接子結構(iii)。投與具有基本連接子結構(iii)且使連接子與抗體之半胱胺酸或離胺酸殘基偶聯之本發明結合物，經由代謝，產生下式之半胱胺酸或離胺酸衍生物：
其中L1在各種情況下連接至低分子量KSP抑制劑，例如式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIca)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(III)或(IV)化合物。
根據本發明，較佳亦為基本連接子結構(ii)及(iv)，尤其在位置R1連接時，尤其當基團L1具有以下結構之一時：
(a)-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-Y7，其中Y5表示H或 NHY6，其中Y6表示H或-COCH3，且Y7表示單鍵或-NH-(CH2)0-4-CHNH2-CO-，使得在裂解之後，獲得對應結構-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-COOH或-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-NH-(CH2)0-4-CHNH2-COOH。
(b)-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-CO-，其中x為0或1，且Y5表示H或NHY6，其中Y6表示H或-COCH3，使得在裂解之後，獲得對應結構-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH。
根據本發明，較佳亦為連接至位置R4時的基本連接子結構(i)，尤其若m=0。
若連接子連接至半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基，則L2較佳衍生自與半胱胺酸之硫氫基反應的基團。此等基團包括鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺、氮丙啶、丙烯醯基、芳族化化合物、乙烯碸、吡啶基二硫化物、TNB硫醇及二硫化物還原劑。此等基團通常以親電子方式與硫氫鍵發生反應，形成硫橋(例如硫醚)或二硫橋。較佳為穩定的硫橋。L2較佳為
其中 #1表示連至抗體之硫原子的連接點，#2表示連至基團L1之連接點，及R22表示COOH、COOR、COR、CONHR、CONR2(其中R在各種情況下表示C1-3烷基)、CONH2，較佳表示COOH。
L2尤佳為： 或
其中#1表示連至抗體之硫原子的連接點，#2表示連至活性化合物的連接點，x表示1或2，且R22表示COOH、COOR、COR、CONR2、CONHR(其中R在各種情況下表示C1-3烷基)、CONH2，較佳為COOH。當x=1且R22表示COOH時，為較佳的。
在本發明之結合物中或在本發明之結合物之混合物中，存在連至抗體之半胱胺酸殘基的鍵，其存在的範圍較佳超過80%，尤佳超過90%(在各種情況下，以連接子連至抗體之鍵的總數計)，作為兩種結構式A3或A4之一時尤佳。本文中，式A3或A4之結構通常以60：40至40：60之比率(以連至抗體之鍵的數目計)一起存在。剩餘鍵則以如下結構存在：
根據本發明，L1較佳由下式表示：#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示H、NH2或C1-C3烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或；(若G1表示NHCO或 ，則R10較佳不為NH2)。
n表示0或1；o表示0或1；及G2表示具有1至100個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)及/或3員至10員芳族或非芳族雜環，該雜環具有至多4個選自由以下組成之群的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-(較佳為 )，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2表示具有1至100個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5員至10員芳族或非芳族雜環，該雜環具有至多4個選自由以下組成之群 的雜原子：N、O及S或-SO-(較佳為)，其中側鏈若存在，則可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2較佳表示具有1至100個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)及3員至10員(例如5員至10員)芳族或非芳族雜環，該雜環具有至多4個選自由以下組成之群的 雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-(較佳為)，其中包括側鏈(若存在)的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2中之其他間雜基團較佳為
其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基。
本文中，#1為連至KSP抑制劑的鍵且#2為連至抗體之偶聯基團(例如L2)的鍵。
伸芳基之直鏈或分支鏈烴鏈及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基包含具有所述相應數目個碳原子的α,ω-二價烷基。可提及以下作為較佳實例：亞甲基、乙烷-1,2-二基(1,2-伸乙基)、丙烷-1,3-二基(1,3- 伸丙基)、丁烷-1,4-二基(1,4-丁烯)、戊烷-1,5-二基(1,5-伸戊基)、己烷-1,6-二基(1,6-伸己基)、庚烷-1,7-二基(1,7-伸庚基)、辛烷-1,8-二基(1,8-伸辛基)、壬烷-1,9-二基(1,9-伸壬基)、癸烷-1,10-二基(1,10-伸癸基)。然而，烴鏈中之伸烷基亦可為分支鏈，亦即上述直鏈伸烷基中的一或多個氫原子可視情況經C1-10烷基取代，從而形成側鏈。烴鏈另外可含有環狀伸烷基(環烷二基)，例如1,4-環己烷二基或1,3-環戊烷二基。此等環狀基團可為不飽和的。特定而言，烴基中可存在芳族基團(伸芳基)，例如伸苯基。繼而，亦在環狀伸烷基及伸芳基中，一或多個氫原子可視情況經C1-10烷基取代。以此方式形成視情況分支之烴鏈。此烴鏈具有總共0至100個碳原子，較佳為1至50個、尤佳2至25個碳原子。
側鏈若存在，則可相同或不同地經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸單取代或多取代。
烴鏈可相同或不同地經-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5員至10員芳族或非芳族雜環間雜一次或超過一次，該5員至10員芳族或非芳族雜環具有至多4個選自由以下組成之群之雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-(較佳為)。
G2中之其他間雜基團較佳為
較佳地，連接子對應於下式：§-(CO)m-L1-L2-§§
其中m表示0或1；§表示連至活性化合物分子的鍵，及§§表示連至結合子肽或蛋白質的鍵，及 L1及L2具有上文指定之含義。
尤佳地，L1具有式-NR11B-，其中R11表示H或NH2；B表示-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，w=0至20；x=0至5；y=0或1；z=0至5；及 X4表示-O-、-CONH-、-NHCO-或。
根據本發明較佳的連接子L具有下式：
其中#3表示連至活性化合物分子的鍵，#4表示連至結合子肽或蛋白質的鍵，R11表示H或NH2；B表示-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，w=0至20；x=0至5；y=0或1；z=1至5；及 X4表示-O-、-CONH-、-NHCO-或。
上述連接子在式(I)或(II)之結合物中尤佳，其中連接子藉由取代R1之氫原子而偶合，或與R4之可裂解連接子組合，亦即R1表示-L-#1或R4表示-SG1-L-#1，其中#1表示連至抗體的鍵。
根據本發明，較佳另外為下述連接子：在本發明之結合物中或在本發明之結合物之混合物中，存在連至抗體之半胱胺酸殘基的鍵，其存在的範圍較佳超過80%、尤佳超過90%(在各種情況下，以連至抗體之連接子之鍵的總數計)，尤佳作為式A5或A6之兩種結構之一：
其中#1表示連至抗體之硫原子的連接點，#2表示連至基團L1之連接點，及R22表示COOH、COOR、COR、CONR2、CONHR(其中R在各種情況下表示C1-3烷基)、CONH2，較佳表示COOH。
本文中，式A5或A6之結構通常以60：40至40：60之比率(以連至抗體之鍵的數目計)一起存在。剩餘鍵則以如下結構存在：
連接至半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基的其他連接子-L-具有下式：
其中§表示連至活性化合物分子的鍵，及§§表示連至結合子肽或蛋白質的鍵，m表示0、1、2或3；n代表0、1或2；p表示0至20；及L3表示 其中o表示0或1；及G3表示具有1至100個碳原子之直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或環狀伸烷基且可經以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及3員至10員(較 佳為5員至10員)芳族或非芳族雜環，該雜環具有至多4個選自由以下組成之群的雜原子：N、O及S、-SO-或SO2(較佳為)，其中側鏈若存在，則可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
在上式中，較佳的是，m表示1；p表示0；n表示0；且L3表示 其中o表示0或1；及G3表示-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)uCH2CH2O)v(CH2)w-，其中s、t、v及w彼此獨立地各自為0至20且u為0或1。
上式§-(CO)m-L1-L2-§§中之較佳基團L1為下述彼等基團，其中r在各種情況下彼此獨立地表示數字0至20，較佳為0至15，尤佳為1至20，特別較佳為2至10：
L1之其他實例提供於表C中，其中此基團突出顯示於方框中。
連接子部分L1之實例提供於下文表A及A'中。表另外陳述較佳與L1之此等實例組合的基團L2，以及較佳偶聯點(R1或R3或R4)及m之較佳值，L1之前面是否存在羰基(參見§-(CO)m-L1-L2-§§)。此等連接子較佳與半胱胺酸殘基偶聯。若L2為丁二醯亞胺或衍生物，則此醯亞胺亦可完全或部分地呈水解開鏈的丁二醯胺形式，如上文所述。視L1而定，使丁二醯胺開鏈的此水解作用可較明顯或不太明顯或根本不存在。
**在特別較佳的情況下，此等列中所提供的連接子L1連接至選自以下的連接子L2： 及/或
其中#1表示連至結合子之硫原子的連接點，#2表示連至基團L1的連接點，R22較佳表示COOH。在本發明之結合物中或在本發明之結合物之混合物中，存在連至結合子之半胱胺酸殘基的鍵，其存在的範圍較佳超過80%，尤佳超過90%(在各種情況下，以連接子連至結合子之鍵之總數計)，尤佳作為兩種結構式A7或A8之一。本文中，式A7或A8之結構通常一起存在，較佳以60：40至40：60之比率存在(以連至結合子之鍵數目計)。剩餘鍵則以如下結構存在：
**：參見表A註釋**。
***：存在此結構L2時，可同時存在下式之結構L2：
具有相應連接子之結合物之實例具有以下結構，其中X1表示CH，X2表示C且X3表示N且L1具有上文指定的含義，L2及L3具有與 L1相同的含義，AK1表示經由半胱胺酸殘基連接的具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，諸如ITEM-4及ITEM-4之嵌合或人類化變異體，且n為數字1至10。AK1尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
若連接子連接至離胺酸側鏈或離胺酸殘基，則其較佳具有下式：-§-(SG)x-L4-CO-§§
其中§表示連至活性化合物分子的鍵，及§§表示連至結合子肽或蛋白質的鍵，x表示0或1，SG表示可裂解基團，較佳為2-8寡肽，尤佳為二肽，及L4表示單鍵或基團-(CO)y-G4-，其中y表示0或1，及G4表示具有1至100個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且其可經以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-及5員至10員芳族或非芳族雜環，該雜環具有至多4個選自由以下組成之群 的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-(較佳為)，其中側鏈若存在，則可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
下表B提供連至離胺酸殘基之連接子實例。該表另外提供較佳偶聯點(R1-R5)。第一欄另外陳述所用對應連接子之實例編號。
具有相應連接子之結合物之實例具有以下結構，其中X1表示CH，X2表示C且X3表示N且L4具有上文指定的含義，AK2表示經由離胺酸殘基連接的具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，諸如ITEM-4及ITEM-4之嵌合或人類化變異體，且n為數字1至10。AK2尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
根據本發明，較佳另外為基本結構(i)、(ii)或(iv)，其中SG1或SG表示可藉由蛋白酶裂解的基團且L1及L2具有上文指定的含義。以下基團尤佳：-Val-Ala-CONH-(在此，丙胺酸之C端醯胺的醯胺鍵發生裂解)
-NH-Val-Lys-CONH-(離胺酸之C端醯胺的醯胺鍵發生裂解)
-NH-Val-Cit-CONH-(瓜胺酸之C端醯胺的醯胺鍵發生裂解)
-NH-Phe-Lys-CONH(離胺酸之C端醯胺的醯胺鍵發生裂解)
-NH-Ala-Lys-CONH-(離胺酸之C端醯胺的醯胺鍵發生裂解)
-NH-Ala-Cit-CONH-(瓜胺酸之C端醯胺的醯胺鍵發生裂解)
SG1或SG尤佳為 或
其中X表示H或視情況可經-NHCONH2、-COOH、-OH、NH2、-NH-CNNH2或磺酸取代的C1-10烷基。
下表C提供連接子部分-SG1-L1-或-L1-SG-L1-之實例，其中SG1及SG為可藉由蛋白酶裂解的基團。表C另外陳述與-SG1-L1-及-L1-SG-L1-之此等實例組合的較佳基團L2，以及較佳偶聯點(R1-R5)及m之較佳值，由此，L1之前面是否存在羰基(參見§-(CO)m-L1-L2-§§)。此等連接子較佳與半胱胺酸殘基偶聯。L1基團突出顯示於方框中。然而，此等基團L1可經針對上文式§-(CO)m-L1-L2-§§所指定之基團L1之一置換。若L2為丁二醯胺或其衍生物，則此醯胺亦可完全或部分地呈水解開鏈的丁二醯胺形式，如上文所述。
具有基本結構(i)之結合物之實例具有以下結構，其中X1表示CH，X2表示C且X3表示N，L4具有與L1相同的含義，AK1表示經由半胱胺酸殘基連接之具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，諸如ITEM-4及ITEM-4之嵌合或人類化變異體，且n為數字1至10。AK1尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
KSP抑制劑-連接子-中間物及結合物製備
本發明之結合物如下製備：首先提供低分子量KSP抑制劑及連接子。接著使以此方式獲得的中間物與結合子(較佳為抗體)反應。
較佳地，為了與半胱胺酸殘基偶聯，使下述化合物之一與含有半胱胺酸之結合子(諸如抗體)反應，其視情況部分地還原用於此目 的：
其中R表示-H或-COOH，其中K表示直鏈或分支鏈C1-C6烷基，其視情況經C1-C6烷氧基或-OH取代，及其中X1表示CH，X2表示C且X3表示N，SG1、L1、L2、L3及L4具有如上文所述的相同含義。
在上述化合物之每一者中及在下述化合物中，第三丁基可經環己基置換。
化合物可以例如其三氟乙酸鹽形式使用。為了與諸如抗體之結合子發生反應，化合物的使用濃度相對於結合子為較佳2倍至12倍莫耳濃度過量。
較佳地，為了與離胺酸殘基偶聯，使下述化合物之一與含有離胺酸之結合子(諸如抗體)反應：
其中X1表示CH，X2表示C且X3表示N且L4具有與L1相同之含義且L1具有如上文所述之相同含義。
對於與半胱胺酸殘基偶聯的中間物而言，反應可說明如下：
其他中間物及其他抗體可相應地發生反應。
對於與離胺酸殘基偶聯的中間物而言，反應可說明如下：
根據本發明，由此產生以下結合物：
視連接子而定，經丁二醯亞胺連接的ADC可在結合之後轉化成開鏈的丁二醯胺，其具有有利的穩定性概況。
此反應(開環)可在pH 7.5至9、較佳在pH 8、在25℃至37℃之溫度下進行，例如藉由攪拌進行。較佳攪拌時間為8至30小時。
在上述式中，X1表示CH，X2表示C且X3表示N，SG1及L1具有如上文所述的相同含義且L2、L3及L4具有與L1相同的含義；且R及K具有如上文所述的相同含義。AK1為經由半胱胺酸殘基偶聯之具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，諸如ITEM-4及ITEM-4之嵌合或人類化變異體，且AK2為經由離胺酸殘基偶聯之具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，諸如ITEM-4及ITEM-4之嵌合或人類化變異體。AK1及AK2尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
ITEM-4及其人類化或嵌合變異體
ITEM-4為Nakayama等人所述的抗TWEAKR抗體(Nakayama等人，2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825)。基於CDR移植之此抗體的人類化變異體描述於Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)及WO 2009/020933中。
文獻亦揭示有機分子與抗體共價偶聯(結合)的不同選擇方案。根據本發明，較佳為毒性基團與抗體經由抗體之半胱胺酸殘基之一或多個硫原子及/或經由抗體之離胺酸殘基之一或多個NH基團結合。然而，亦可使毒性基團經由抗體之游離羧基或經由抗體之糖殘基結合至抗體。
抗體可經由一鍵連接至連接子。抗體可經由結合子之雜原子連接。根據本發明，可用於連接之抗體中的雜原子為硫(在一個實施例中，經由抗體之硫氫基)、氧(根據本發明，藉助於抗體之羧基或羥基)及氮(在一個實施例中，經由抗體之一級或二級胺基或醯胺基)。此等雜原子可存在於天然抗體中或藉由化學方法或分子生物學方法引入。根據本發明，相對於標靶分子，抗體連接至毒性基團對抗體之結合活 性僅產生較小影響。在一個較佳實施例中，相對於標靶分子，連接對抗體之結合活性無影響。
根據本發明，術語「抗體」以其最廣泛含義理解且包含免疫球蛋白分子，例如完整或經修飾之單株抗體、多株抗體或多特異性抗體(例如雙特異性抗體)。免疫球蛋白分子較佳包含具有四條多肽鏈的分子：兩條重鏈(H鏈)及兩條輕鏈(L鏈)，其典型地經二硫橋連接。各重鏈包含重鏈可變域(簡稱為VH)及重鏈恆定域。重鏈恆定域可包含例如三個域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含可變域(簡稱為VL)及恆定域。輕鏈恆定域包含域(簡稱為CL)。VH及VL域可進一步再分成具有高變性之區域，亦稱為互補決定區(簡稱為CDR)，及具有低序列可變性之區域(構架區，簡稱為FR)。典型地，各VH及VL區域係由三個CDR及至多四個FR組成。舉例而言，自胺基端至羧基端依以下次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗體可獲自任何適合物種，例如兔、大羊駝、駱駝、小鼠或大鼠。在一個實施例中，抗體具有人類或鼠類來源。抗體可為例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
術語「單株」抗體係指自大體上均質抗體群獲得的抗體，亦即該群體之個別抗體除天然存在之可能少數突變之外其他一致。單株抗體以高特異性識別單一抗原結合位點。術語單株抗體並非指特定製備製程。
術語「完整」抗體係指包含抗原結合域與輕鏈及重鏈恆定域的抗體。恆定域可為天然存在之域或其具有多個經修飾之胺基酸位置的變異體。
術語「經修飾之完整」抗體係指胺基末端或羧基末端藉助於共價鍵(例如肽鍵)與不來源於抗體之另一多肽或蛋白質融合成完整抗體。另外，抗體可經修飾，使得反應性半胱胺酸在定義位置引入以促 進與毒性基團偶聯(參見Junutula等人，Nat Biotechnol.2008,26(8)：925-32)。
術語「人類」抗體係指可自人類獲得的抗體或作為合成人類抗體的抗體。「合成」人類抗體為基於人類抗體序列之分析，可經由電腦模擬而部分地或完全地自合成序列獲得的抗體。人類抗體可由例如自人類來源之抗體序列文庫分離的核酸編碼。此類抗體之實例可見於Söderlind等人，Nature Biotech.2000,18：853-856中。
術語「人類化」或「嵌合」抗體描述由序列之非人類及人類部分組成的抗體。在此等抗體中，人類免疫球蛋白(受體)之一部分序列經非人類免疫球蛋白(供體)之序列部分置換。在許多情況下，供體為鼠類免疫球蛋白。在人類化抗體的情況下，受體CDR胺基酸經供體胺基酸置換。有時，構架胺基酸亦經供體之對應胺基酸置換。在一些情況下，人類化抗體含有既不存在於受體中、亦不存在於供體中的胺基酸，該等胺基酸係在抗體最佳化期間引入。在一些情況下，若受體之相應胺基酸不引起抗體結合且具有潛在免疫原性，則供體之CDR中之胺基酸經受體之相應胺基酸置換。在嵌合抗體的情況下，供體免疫球蛋白之可變域與人類抗體之恆定區融合。
如本文所用之術語互補決定區(CDR)係指結合至抗原所必需之抗體可變域的彼等胺基酸。典型地，各可變區具有三個CDR區域，稱為CDR1、CDR2及CDR3。各CDR區域可包括根據Kabat定義之胺基酸及/或根據Chotia定義之高變環胺基酸。根據Kabat之定義包含例如可變輕鏈之約胺基酸位置24-34(CDR1)、50-56(CDR2)及89-97(CDR3)及可變重鏈之31-35(CDR1)、50-65(CDR2)及95-102(CDR3)之區域(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.公眾健康服務中心(Public Health Service)，美國國家衛生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,MD.(1991))。根據Chotia之 定義包含例如可變輕鏈之約胺基酸位置26-32(CDR1)、50-52(CDR2)及91-96(CDR3)及可變重鏈之26-32(CDR1)、53-55(CDR2)及96-101(CDR3)的區域(Chothia及Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。在一些情況下，CDR可包含來自根據Kabat及Chotia定義之CDR區域的胺基酸。
視重鏈恆定域胺基酸序列而定，抗體可分成不同類別。存在五種主要類別之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之重鏈恆定域稱為[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε]、[gamma/γ]及[my/μ]。抗體之三維結構與次單元結構均已知。
術語抗體/免疫球蛋白之「功能片段」或「抗原結合抗體片段」定義為抗體/免疫球蛋白之片段(例如IgG之可變域)，其仍然包含抗體/免疫球蛋白之抗原結合域。抗體之「抗原結合域」典型地包含抗體之一或多個高變區，例如CDR、CDR2及/或CDR3區域。然而，抗體之「構架」或「骨架」區域在抗體結合至抗原期間亦可作用。構架區形成CDR之骨架。較佳地，抗原結合域包含可變輕鏈之至少胺基酸4至103及可變重鏈之胺基酸5至109，更佳包含可變輕鏈之胺基酸3至107及可變重鏈之胺基酸4至111，尤佳包含完整可變輕鏈及重鏈，亦即VL之胺基酸1至109及VH之1至113(根據WO97/08320編號)。
本發明之「功能片段」或「抗原結合抗體片段」非決定性地涵蓋Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、雙功能抗體、單域抗體(DAb)、線性抗體、抗體之個別鏈(單鏈Fv，簡稱為scFv)；及多特異性抗體，諸如二特異性抗體及三特異性抗體，例如由抗體片段形成的多特異性抗體(C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R. Kontermann & S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。除「多特異性」或「多官能性」抗體之外的抗體為具有相同結合位點的彼等物。多特異性抗體可特異性針對抗原之不同抗原決定基可特異性針對超過一種抗原之抗原決定基(參見例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人，1991,J.Immunol.147：60 69；美國專利第4,474,893號；第4,714,681號；第4,925,648號；第5,573,920號；第5,601,819號；或Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547 1553)。F(ab')2或Fab分子可構築成使得Ch1與CL域之間的分子間二硫鍵相互作用之數目可減少或完全阻止。
「抗原決定基」係指能夠特異性結合至免疫球蛋白或T細胞受體的蛋白質決定子。抗原決定基決定子通常由分子之化學上活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈或其組合)組成，且通常具有特定的3維結構特性以及特定電荷特性。
「功能片段」或「抗原結合抗體片段」可藉助於共價鍵(例如肽鍵聯)、經由其胺基末端或羧基末端與不來源於抗體的另一多肽或蛋白質融合。另外，抗體及抗原結合片段可藉由在定義位置引入反應性半胱胺酸來修飾，以便促進與毒性基團偶聯(參見Junutula等人，Nat Biotechnol.2008年8月；26(8)：925-32)。
多株抗體可藉由一般技術者已知的方法製備。單株抗體可藉由一般技術者已知的方法製備(Köhler及Milstein,Nature,256,495-497,1975)。人類及人類化單株抗體可藉由一般技術者已知的方法製備(Olsson等人，Meth Enzymol.92,3-16或Cabilly等人之US 4,816,567或Boss等人之US 4,816,397)。
一般技術者瞭解用於製備人類抗體及其片段的多種方法，諸如藉助於轉殖基因小鼠(N Lonberg及D Huszar,Int Rev Immunol.1995； 13(1)：65-93)或噬菌體呈現技術(Clackson等人，Nature.1991年8月15日；352(6336)：624-8)。本發明抗體可自重組抗體文庫獲得，重組抗體文庫係由例如自許多健康自願者彙集之多種抗體之胺基酸序列組成。抗體亦可藉助於已知重組DNA技術產生。抗體之核酸序列可藉由常規測序獲得或獲自公開可獲得的資料庫。
「經分離」抗體或結合子已純化以移除細胞之其他成分。可干擾診斷或治療用途之細胞之污染成分為例如酶、激素或細胞之其他肽或非肽成分。較佳抗體或結合子為已純化者，相對於抗體或結合子，其純化的程度大於95重量%(例如藉由洛瑞方法(Lowry method)、UV-Vis光譜法或藉由SDS毛細管凝膠電泳所測定)。此外，抗體已純化至可確定胺基末端或內部胺基酸序列之至少15個胺基酸之程度或已純化至均質的程度，藉由SDS-PAGE、在還原或非還原條件下測定均質性(可藉助於庫馬斯藍染色(Coomassie Blau staining)或較佳藉由銀著色測定偵測)。然而，抗體通常藉由一或多個純化步驟製備。
術語「特異性結合」或「特異性地結合」係指結合至預定抗原/標靶分子的抗體或結合子。抗體或結合子的特異性結合典型地描述具有至少10-7M之親和力(作為Kd值；亦即較佳為Kd值小於10 -7 M的彼等物)的抗體或結合子，該抗體或結合子對預定抗原/標靶分子的親和力為非特異性抗原/標靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)的至少兩倍，該非特異性抗原/標靶分子不為預定抗原/標靶分子或緊密相關的抗原/標靶分子。抗體較佳具有至少10-7M之親和力(作為Kd值；換而言之，較佳為Kd值小於10-7M的彼等物)，較佳為至少10-8M、更佳在10-9M至10-11M範圍內之親和力。Kd值可藉助於例如表面電漿子共振光譜法測定。
本發明之抗體-藥物結合物同樣展現此等範圍內之親和力。親和力較佳不受藥物結合的實質性影響(一般而言，親和力降低小於一個 數量級，換而言之，例如至多10-8M至10-7M)。
根據本發明使用的抗體較佳亦因高選擇性而值得注意。當本發明抗體對靶蛋白展現的親和力為針對其他獨立抗原(例如人類血清白蛋白)之親和力的至少2倍、較佳5倍或更佳10倍時，存在高選擇性(親和力可藉助於例如表面電漿子共振光譜法測定)。
另外，所用的本發明抗體較佳具有交叉反應性。為了能夠促進及較好地解釋臨床前研究，例如毒理學或活性研究(例如異種移植小鼠)，根據本發明使用的抗體不僅結合人類靶蛋白，而且結合研究所用之物種中之物種靶蛋白，則為有利的。在一個實施例中，除人類靶蛋白之外，根據本發明使用的抗體對至少一個其他物種中的靶蛋白具有交叉反應性。在毒理學及活性研究中，較佳為使用嚙齒動物、犬及非人類靈長類動物家族之物種。較佳嚙齒動物物種為小鼠及大鼠。較佳非人類靈長類動物為恆河猴、黑猩猩及長尾獼猴。
在一個實施例中，除人類靶蛋白之外，根據本發明使用的抗體對選自由小鼠、大鼠及長尾獼猴(食蟹獼猴)組成之物種之群之至少一個其他物種的靶蛋白具有交叉反應性。除人類靶蛋白之外，尤佳為至少對小鼠靶蛋白具有交叉反應性之根據本發明使用的抗體。較佳為對其他非人類物種之靶蛋白之親和力與對人類靶蛋白之親和力相差不超過50倍、更特定言之不超過十倍的交叉反應性抗體。
針對癌症標靶分子之抗體
結合子(例如抗體或其抗原結合片段)所針對的標靶分子較佳為癌症標靶分子。術語「癌症標靶分子」描述一種標靶分子，其存在於一或多個癌細胞物種上的豐度大於存在於相同組織類型之非癌細胞上的豐度。相較於相同組織類型的非癌細胞，癌症標靶分子較佳選擇性地存在於一或多個癌細胞物種上，其中選擇性地描述癌細胞上的富集為相同組織類型之非癌細胞的至少兩倍(「選擇性癌症標靶分子」)。使 用癌症標靶分子允許使用本發明之結合物選擇性治療癌細胞。
在此，尤佳為細胞外癌症標靶分子TWEAKR(SEQ ID NO：101(蛋白質)；SEQ ID NO：102(DNA))。癌症標靶分子TWEAKR(人類直系同源物NCBI基因ID：51330)亦以名稱TNFRSF12A(腫瘤壞死因子受體超家族成員12A)、FN14及CD266已知。
術語「抗TWEAKR抗體」或「特異性結合至TWEAKR之抗體」係指一種以足以用於診斷及/或治療應用之親和力結合癌症標靶分子TWEAKR(SEQ ID NO：101(蛋白質))的抗體。在一個實施例中，抗TWEAKR抗體對與TWEAKR無關之蛋白質的結合小於抗體對TWEAKR之結合的10%，例如藉由表面電漿子共振光譜法所測定。在某些實施例中，抗體以1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM之解離常數(KD)結合TWEAKR(SEQ ID NO：101(蛋白質))。在某些實施例中，抗TWEAKR抗體結合至在不同物種之間具保守性的抗原決定基。
結合癌症標靶分子的抗體可由一般技術者使用已知方法(諸如化學合成或重組表現)製備。針對癌症標靶分子之結合子可在商業上獲得或可由一般技術者使用已知方法(諸如化學合成或重組表現)製備。用於製備抗體或抗原結合抗體片段的其他方法描述於WO 2007/070538中(參見第22頁「抗體」)。熟習此項技術者已知如何可彙編諸如噬菌體呈現文庫(例如Morphosys HuCAL Gold)之方法及用於發現抗體或抗原結合抗體片段(參見WO 2007/070538，第24頁及以下及第70頁上之AK實例1、第72頁上之AK實例2)。使用得自B細胞之DNA文庫製備抗體的其他方法描述於例如第26頁(WO 2007/070538)。抗體人類化方法描述於WO2007070538之第30-32頁上且詳細描述於Queen等人，Pros.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033,1989或描述於WO 90/0786中。另外，重組表現蛋白質(一般而言)及抗體(特定而言) 的方法已為熟習此項技術者所知(參見例如Berger及Kimrnel(Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press,Inc.)；Sambrook等人，(Molecular Cloning：A Laboratory Manual,(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)第1-3卷)；Current Protocols in Molecular Biology,(F.M.Ausabel等人[編],Current Protocols,Green Publishing Associates,Inc./John Wiley & Sons,Inc.)；Harlow等人，(Monoclonal Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(19881,Paul[編輯])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins(1998))；及Harlow等人，(Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。熟習此項技術者已知表現蛋白質/抗體所必需之對應載體、啟動子及信號肽。常見方法亦描述於WO 2007/070538中之第41-45頁。IgG1抗體製備方法描述於例如WO 2007/070538第74頁及以下之實例6中。測定結合至其抗原之抗體內化的方法已為熟習此項技術者所知且描述於例如WO 2007/070538第80頁上。熟習此項技術者能夠使用WO 2007/070538中所述之方法，類似於製備具有不同標靶分子特異性之抗體，該等方法已用於製備碳酸酐酶IX(Mn)抗體。
抗TWEAKR抗體
根據本發明，使用抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段，較佳為選自下述彼等物或經適合突變修飾之彼等物的抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段。另外，熟習此項技術者熟悉結合至TWEAKR之抗體，參見例如Nakayama等人，2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825；Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62：WO 2009/020933(A2),WO2009140177(A2)或WO2014/198817(A1)。
本發明尤其係關於來源於小鼠之抗體ITEM-4(Nakayama等人， 2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825)所衍生之具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體或其抗體片段或其變異體的結合物。ITEM-4為Nakayama等人所述的抗TWEAKR抗體(Nakayama等人，2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825)。ITEM-4之可變區(VH及VL)之序列揭示於Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)中。基於CDR移植於人類構架區中之此抗體的人類化變異體已描述於Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)及WO 2009/020933中。
視所用分析系統而定，ITEM-4及此抗體之人類化或嵌合變異體為起促效作用或具有中等促效作用之抗體。拮抗作用僅在Tweak存在下呈現。
術語「中等促效」或「具有中等促效作用」的抗TWEAKR抗體係指一種抗體，當使該抗體在Tweak不存在下與表現TWEAKR的細胞接觸時，該抗體結合至TWEAKR且誘導NFκB信號轉導級聯(NFκB信號傳導)至僅很小的程度。誘導NFκB信號轉導級聯(NFκB信號傳導)至較小程度意謂在NFκB分析中，抗TWEAKR抗體在至多30μg/ml之抗TWEAKR抗體使用濃度下顯示的活化為以200ng/ml使用之人類Tweak(100%值)的小於80%、小於50%、小於25%、小於20%或小於15%。熟習此項技術者熟悉此類NFκB分析。舉例而言，一種此類分析顯示於實施例中。
術語「不促效」或「不具有促效作用」之抗TWEAKR抗體係指一種抗體，在此類NFκB分析中，在所用至多30μg/ml濃度下顯示0%活性。熟習此項技術者熟悉此類NFκB分析。舉例而言，此類分析顯示於實施例中。
此外，若此類分析在Tweak(配位體)存在下進行，則抗TWEAKR抗體較佳起促效作用。
產生抗TWEAKR抗體
基於Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)中之ITEM-4之可變區(VH及VL)之序列的公開案及Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)及WO 2009/020933中之基於CDR移植於人類構架區中之此抗體之人類化變異體的公開案，獲得以下抗體序列：「TPP-7007」、「TPP-7053」、「TPP-7005」、「TPP-7073」、「TPP-7075」及「TPP-7076」。
ITEM-4之可變區VH及VL連接至人類IgG1 κ亞型之恆定區(CL、CH1、CH2、CH3)，獲得嵌合抗體「TPP-7006」及「TPP-7074」之序列。
ITEM-4之L-CDR1中之潛在去醯胺化位點之修飾產生抗體「TPP-7073」、「TPP-7074」、「TPP-7075」及「TPP-7076」。
ITEM-4抗體之其他人類化變異體可藉由此項技術中已知的人類化方法產生。
關於其產生方法的評述可見於Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，且另外可見於Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述表面再塑)；Dall' Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述FR改組)；及Osboum等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述用於FR改組之導引選擇方法)。
抗TWEAKR抗體之特定實施例
在本申請案中，使用如下表所示的以下較佳抗體：「ITEM-4」、「TPP-7006」、「TPP-7007」、「TPP-7053」、「TPP-7005」、「TPP- 7073」、「TPP-7074」、「TPP-7075」及「TPP-7076」。
ITEM-4為Nakayama等人所述的小鼠IgG2b抗體(Nakayama等人，2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825)。ITEM-4可在商業上獲自多個公司(尤其以13-9018獲自eBioscience)。
TPP-7006及TPP-7074為ITEM-4之嵌合變異體，其中可變區VH及VL連接至人類IgG1 κ亞型之恆定區(CL、CH1、CH2、CH3)。
抗體TPP-7007、TPP-7053、TPP-7005、TPP-7073、TPP-7075及TPP-7076為ITEM-4之人類化變異體，其為人類IgG1 κ亞型。
此等上述抗TWEAKR抗體(「ITEM-4」、「TPP-7006」、「TPP-7007」、「TPP-7053」、「TPP-7005」、「TPP-7073」、「TPP-7074」、「TPP-7075」及「TPP-7076」)無關於其非促效或中等促效作用，亦代表根據本發明與連接子及/或毒性基團偶合之抗TWEAKR抗體的較佳實施例。較佳地，抗TWEAKR抗體在配位體Tweak存在下可充當拮抗劑。
TPP-7005為包含對應於SEQ ID NO：9之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：10之輕鏈區域的抗體。
TPP-7006為包含對應於SEQ ID NO：19之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：20之輕鏈區域的抗體。
TPP-7007為包含對應於SEQ ID NO：29之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：30之輕鏈區域的抗體。
TPP-7053為包含對應於SEQ ID NO：39之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：40之輕鏈區域的抗體。
TPP-7065為包含對應於SEQ ID NO：49之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：50之輕鏈區域的抗體。
TPP-7073為包含對應於SEQ ID NO：59之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：60之輕鏈區域的抗體。
TPP-7074為包含對應於SEQ ID NO：69之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：70之輕鏈區域的抗體。
TPP-7075為包含對應於SEQ ID NO：79之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：80之輕鏈區域的抗體。
TPP-7076為包含對應於SEQ ID NO：89之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：90之輕鏈區域的抗體。
TPP-7077為包含對應於SEQ ID NO：99之重鏈區域及對應於SEQ ID NO：100之輕鏈區域的抗體。
TPP-7005為：包含對應於SEQ ID NO：1之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：5之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7006為：包含對應於SEQ ID NO：11之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：15之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7007為：包含對應於SEQ ID NO：21之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：25之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7053為：包含對應於SEQ ID NO：31之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：35之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7065為：包含對應於SEQ ID NO：41之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：45之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7073為：包含對應於SEQ ID NO：51之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：55之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7074為：包含對應於SEQ ID NO：61之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：65之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7075為：包含對應於SEQ ID NO：71之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：75之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7076為：包含對應於SEQ ID NO：81之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：85之輕鏈可變區的抗體。
TPP-7077為：包含對應於SEQ ID NO：91之重鏈可變區及對應於SEQ ID NO：95之輕鏈可變區的抗體。
根據本發明與連接子及/或毒性基團偶聯之具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體的尤佳實施例為下述抗體：
1.抗體ITEM-4，Nakayama等人所述的小鼠IgG2b抗體(Nakayama等人，2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825)。
2.抗體或抗原結合片段，其結合至TWEAKR且為抗體ITEM-4之嵌合或人類化變異體(Nakayama等人，2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825)。
3.結合至TWEAKR的抗體或抗原結合片段，其包含：包含如SEQ ID NO：2中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：3中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：4中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：6中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：7中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：8中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：12中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：13中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：14中所示之重鏈 可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：16中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：17中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：18中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：22中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：23中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：24中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：26中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：27中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：28中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：32中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：33中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：34中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：36中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：37中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：38中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：52中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：53中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：54中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：56中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：57中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：58中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：62中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：63中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：64中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：66中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：67中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：68中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：72中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：73中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：74中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：76中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：77中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：78中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：82中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：83中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：84中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：86中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：87中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：88中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈。
4.根據實施例2之抗體或其抗原結合片段，包含：如SEQ ID NO：1中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：5中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：11中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：15中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：21中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：25中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：31中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：35中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：51中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：55中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：61中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：65 中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：71中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：75中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：81中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：85中所示之輕鏈可變序列。
5.根據任一前述實施例的抗體，其為IgG抗體。
6.根據任一前述實施例之抗體，包含：如SEQ ID NO：9中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：10中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：19中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：20中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：29中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：30中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：39中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：40中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：59中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：60中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：69中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：70中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：79中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：80中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：89中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：90中所示的輕鏈序列。
7.根據任一前述實施例的抗體，包含：根據任一前述實施例之抗原結合片段或根據任一前述實施例之抗體之抗原結合片段，其為scFv、Fab、Fa片段或F(ab)2片段。
8.根據任一前述實施例之抗體或抗原結合片段，其為單株抗體或其抗原結合片段。
9.根據任一前述實施例之抗體或抗原結合片段，其為人類、人類化或嵌合抗體或抗原結合片段。
尤佳為抗TWEAKR抗體「TPP-7005」、「TPP-7006」、「TPP-7007」、「TPP-7053」、「TPP-7073」、「TPP-7074」、「TPP-7075」及「TPP-7076」。
同位素、鹽、溶劑合物、同位素變異體
本發明亦涵蓋本發明化合物之所有適合同位素變異體。本發明化合物之同位素變異體在此理解為意謂本發明化合物內之至少一個原子已與原子數相同、但原子質量與自然界中通常或主要存在之原子質量不同之另一原子交換的化合物。可併入本發明化合物中之同位素之實例為氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴及碘之彼等同位素，諸如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I及131I。本發明化合物之特定同位素變異體，尤其其中一或多個放射性同位素已併入的彼等物，可為有益的，例如用於檢查作用機制或體內活性成分分佈；由於可製備性及可偵測性相對容易，因此經3H或14C同位素標記的化合物尤其適於此目的。另外，由於化合物之代謝穩定性增大，例如體內半衰期延長或需要的活性劑量減少，因此同位素(例如氘)之併入可產生特定治療益處；本發明化合物之此類修飾因此在一些情況下亦可構成本發明之一個較佳實施例。本發明化合物之同位素變異體可藉由熟習此項技術者已知之方法製備，例如藉由下文進一步描述的方法及實施例中所述的程序、藉由使用相應試劑及/或起始化合物之對應同位素修飾。
在本發明的情形下，較佳鹽為本發明化合物之生理學上可接受 之鹽。亦涵蓋本身不適於醫藥應用、但可使用(例如用於本發明化合物之分離或純化)的鹽。
本發明化合物之生理學上可接受之鹽包括無機酸、羧酸及磺酸之酸加成鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、萘二磺酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽及苯甲酸鹽。
本發明化合物之生理學上可接受之鹽亦包括習知鹼之鹽，例如較佳為鹼金屬鹽(例如鈉及鉀鹽)、鹼土金屬鹽(例如鈣及鎂鹽)及衍生自氨或具有1至16個碳原子之有機胺的銨鹽，例如較佳為乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己胺、二甲胺基乙醇、普魯卡因(procaine)、二苯甲基胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、精胺酸、離胺酸及1,2-乙二胺。
在本發明之情形下，藉由與溶劑分子配位而形成固態或液態之複合物的本發明化合物之彼等形式稱為溶劑合物。水合物為與水發生配位之溶劑合物的特定形式。在本發明之情形下，溶劑合物較佳為水合物。
本發明另外亦涵蓋本發明化合物之前藥。在本上下文中，術語「前藥」係指本身可具生物活性或非活性，但在其體內滯留時間期間轉化(例如代謝或水解)成本發明化合物之化合物。
特定實施例
以下實施例尤佳：
實施例A：
下式之ADC
其中KSP-L-表示下述式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(iii)、(IIj)、(IIk)或下述式(IIf)之化合物，結合子為具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體(尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體，特定而言：人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076)，且n表示數字1至10：
較佳為具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體。抗體較佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
其中A表示CO(羰基)；R1較佳為-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2及-CONZ"CH2COOH，其中Z"表示H或NH2；R2及R4表示H，或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H或F；R3表示-L-#1或C1-10烷基-，其視情況可經以下取代：-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH- CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基較佳為C1-3烷基)；R5表示H或F；R6及R7彼此獨立地表示H、(視情況氟化)C1-3烷基、(視情況氟化)C2-4烯基、(視情況氟化)C2-4炔基、羥基或鹵素；R8表示分支鏈C1-5烷基；及R9表示H或F，其中取代基R1及R3之一表示-L-#1，及-L-表示連接子且#1表示連至抗體之鍵，及ADC之鹽、溶劑合物及溶劑合物之鹽。
連接子較佳為如下連接子§-(CO)m-L1-L2-§§
其中m表示0或1；§表示連至KSP的鍵，及§§表示連至抗體的鍵，及L2表示
其中#1表示連至抗體之硫原子的連接點，#2表示連至基團L1之連接點，且L1由下式表示： #1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示H、NH2或C1-C3烷基；G1表示-NHCO-或；n表示0或1；o表示0或1；及G2表示具有1至100個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-；及3員至10員芳族或非芳族雜環，其具有至多4個選自由以下組成之群的 雜原子：N、O及S或-SO-(較佳為)，其中側鏈若存在，則可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
本文中，#1為連至KSP抑制劑的鍵且#2為連至抗體之偶聯基團(例如L2)的鍵。
實施例B：
下式之ADC
其中KSP-L-表示下述式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIi)、(IIj)、(IIk)或下述式(IIg)之化合物，結合子為具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體(尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體，特定而言，人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076)，且n表示數字1至10：
其中A表示CO(羰基)；R1較佳為-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ"(CH2)1-3NH2及-CONZ"CH2COOH，其中Z"表示H或NH2；R2及R4表示H，或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H；R3表示-L-#1或C1-10烷基-，其視情況可經以下取代：-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基較佳為C1-3烷基)；R5表示H或F；R6及R7彼此獨立地表示H、(視情況氟化)C1-3烷基、(視情況氟化)C2-4烯基、(視情況氟化)C2-4炔基、羥基或鹵素；R8表示分支鏈C1-5烷基；及R9表示H或F，其中取代基R1及R3之一表示-L-#1，及-L-表示連接子且#1表示連至抗體之鍵，其中-L-由以下表示： §-(CO)m-L1-L2-§§
其中m表示0或1；§表示連至KSP的鍵，及§§表示連至抗體的鍵，及L2表示
其中#1表示連至抗體之硫原子的連接點，#2表示連至基團L1之連接點，且L1由下式表示：#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示H、NH2或C1-C3烷基； G1表示-NHCO-或；n表示0或1；o表示0或1；及G2表示具有1至100個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-；及3 員至10員芳族或非芳族雜環，其具有至多4個選自由以下組成之群的雜原子：N、O及S或-SO-(較佳為)，其中側鏈若存在，則可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代， #1為連至KSP抑制劑的鍵且#2為連至抗體之偶聯基團(例如L2)的鍵， 及ADC之鹽、溶劑合物及溶劑合物之鹽。
實施例C：
下式之ADC
其中KSP-L-表示下述式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIi)、(IIj)、(IIk)或下述式(IIh)之化合物，結合子為具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體(尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體，特定而言，人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076)，且n表示數字1至10：
其中 A表示CO(羰基)；R1表示-L-#1；R2及R4表示H，或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11表示H；R3表示C1-10烷基-，其視情況可經以下取代：-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2(其中烷基較佳為C1-3烷基)，或-MOD；其中-MOD表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10表示H或C1-C3烷基；G1表示-NHCO-或-CONH-(其中若G1表示-NHCO-或，則R10不表示NH2)；n表示0或1；o表示0或1；及G2表示直鏈或分支鏈烴基，其具有1至10個碳原子且可被一或多個以下基團間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-或-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3表示-H或-COOH，且其中基團-MOD較佳具有至少一個基團-COOH；R5表示H或F；R6及R7彼此獨立地表示H、(視情況氟化)C1-3烷基、(視情況氟 化)C2-4烯基、(視情況氟化)C2-4炔基、羥基或鹵素；R8表示分支鏈C1-5烷基；及R9表示H或F，其中-L-表示連接子且#1表示連至抗體之鍵，其中-L-由以下表示：§-(CO)m-L1-L2-§§
其中m表示0或1；§表示連至KSP的鍵，及§§表示連至抗體的鍵，及L2表示
其中#1表示連至抗體之硫原子的連接點，#2表示連至基團L1之連接點，且L1由下式表示：#1-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示H、NH2或C1-C3烷基；G1表示-NHCO-或；n表示0或1； o表示0或1；及G2表示具有1至100個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)及3員至10員芳族或非芳族雜環，該雜環具有至多4個選自由以下組成之群的雜原子：N、O及 S、-SO-或-SO2-(較佳為)，其中包括側鏈(若存在)的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，#1為連至KSP抑制劑的鍵且#2為連至抗體之偶聯基團(例如L2)的鍵，及ADC之鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
實施例D：
水發明亦提供下文通式之結合子/活性化合物結合物：
其中結合子表示具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體(尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體，特定而言，人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076)，L表示連接子，WS表示活性化合物，較佳為KSP抑制劑，諸如式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIh)、(IIi)之一之本發明KSP抑制劑，m表示數字1至2，較佳為1，且n表示數字1至50，較佳為1.2至20且尤佳為2至8，其中L具有下文結構之一。本文 中，m表示每個連接子之活性化合物分子數目且n表示每個結合子之活性化合物/連接子結合物之平均數目。結合物分子中存在之所有WS之總和因此為m與n之乘積。
WS為對動物、較佳人類具有局域或全身性治療作用的活性化合物。此等活性化合物通常具有低於5kDa、較佳低於1.5kDa之分子量。較佳活性化合物為長春花生物鹼、奧瑞他汀(auristatins)、妥布賴森(tubulysins)、倍癌黴素(duocarmycins)、激酶抑制劑、抑制劑及KSP抑制劑。
本文中，L表示下式A3及A4之一
其中#1表示連至結合子之硫原子的連接點，#2表示連至活性化合物的連接點，x表示1或2，且R22表示COOH、COOR、COR(其中R在各種情況下表示C1-3烷基)、CONH2、Br，較佳為COOH。
L1具有如上相同含義。較佳地，-L1-#2由下式表示：#3-(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中#3指示連至氮原子之連接點；R10表示H、NH2或C1-C3烷基； G1表示-NHCO-、-CONH-或(其中若G1表示NHCO 或，則R10不表示NH2)，n表示0或1；o表示0或1；及G2表示具有1至100個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)及/或3員至10員芳族或非芳族雜環，該雜環具有至多4個選自由以下組成之群的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-(較佳為 )，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
G2中之其他間雜基團較佳為
其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基。
在本發明之結合物中或在本發明之結合物之混合物中，存在連至抗體之半胱胺酸殘基的鍵，其存在的範圍較佳超過80%，尤佳超過90%(在各種情況下，以連接子連至抗體之鍵的總數計)，其為式A3或 A4之兩種結構之一。
具有式A3或A4之連接子的結合物可藉由使抗體分別與下式A3'及A4'之適當溴衍生物偶聯而獲得：
式A3'或A4'之此等溴衍生物可藉由使R22CH2CHBrCOOH或R22CHBrCH2COOH與結合子之胺基反應而獲得，如下文流程30至32中以例示性方式所說明。
[a)：2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽(BEP)，DCM，吡啶，室溫；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4當量之TCEP，PBS緩衝液；d)PBS緩衝液，20小時，室溫]
[a)：2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽(BEP)，DCM，吡啶，室溫；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4當量之TCEP，PBS緩衝液；d)PBS緩衝液，20小時，室溫]
實施例E：
本發明亦提供下文通式之結合子/活性化合物結合物：
其中結合子表示具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體(尤佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體，特定而言，人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076)，L表示連接子，WS表示活性化合物，較佳為KSP抑制劑，諸如式(I)、(Ia)、(II)或(IIa)之一之本發明KSP抑制劑，m表示數字1至2，較佳為1，且n表示數字1至50，較佳為1.2至20且尤佳為2至8，其中L具有下文結構之一。本文中，m表示每個連接子之活性化合物分子數目且n表示每個結合子之活性化合物/連接子結合物之平均數目。結合物分 子中存在之所有WS之總和因此為m與n之乘積。
本文中，L表示：
其中#1表示連至抗體之硫原子的連接點，#2表示連至活性化合物的連接點且R22表示COOH、COOR、COR(其中R在各種情況下表示C1-3烷基)、CONH2、Br，較佳為COOH；連至結合子之硫原子的連接子因此可具有下文結構之一：
在每個抗體藥物結合物含有超過一個活性化合物分子WS之抗體藥物結合物的情況下，式A1及/或A2之結構均可存在於抗體藥物結合物中。由於本發明之抗體藥物結合物可為不同抗體藥物結合物之混合物，因此此混合物亦可包含式A1或式A2之抗體藥物結合物及式A1與A2之彼等物。
L5為選自-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-之基團，其中m、n、o、p及q彼此獨立地具有以下值：m=0-10；n=0或1；o=0-10；p=0或1；及q=0-10，其中m+n+o=1-15，較佳為1-6。X表示5員或6員芳族或非芳族雜環或同素環，較佳為-C6H4-或-C6H10-。RS表示酸 基，較佳為-COOH或SO3H。
L6為選自以下之基團：-CONH-、-OCONH-、-NHCO-、- NHCOO-、及，其中r為1、2或3。
L7為單鍵或選自具有1至100(較佳1至10)個碳原子之直鏈或分支鏈烴鏈之基團，該烴鏈衍生自伸芳基及/或直鏈及/或分支鏈及/或環狀伸烷基且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry表示H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可經以下取代：NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸)、-CO-、-CRx=N-O-(其中Rx表示H、C1-C3烷基或苯基)及/或3員至10員(較佳5員至10員)芳族或非芳族雜環，該雜環具有至多4個選自由以下組成之群 的雜原子：N、O及S、-SO-或-SO2-(較佳為)，其中包括任何側鏈的烴鏈可經-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代。
L5較佳為基團-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m=1-3，n=0，o=0-7，p=0及q=0或1。尤佳為基團-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m=1或2，n=0，o=0或1，p=0及q=0或1。
L6較佳為選自-CONH-及-NHCO-之基團。
L7較佳為單鍵或-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，其中w=0至20；x=0至5； y=0至1；z=1至5；及 X4表示-O-、-CONH-、-NHCO-或。
L7尤佳為單鍵或基團-[(CH2)x-NHCO-)]，其中x=1至5。
-L5-L6-L7-尤佳表示-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q--NHCO--[(CH2)x-NHCO-)]，其中m=1或2，n=0，o=0或1，p=0，且q=0或1，且x=1-5。
然而，此等兩種結構亦可共同存在於本發明之結合物中。
根據本發明，此等抗體藥物結合物可由下式化合物製備
其中L具有下式A'：
較佳地，A'轉化成A如下進行：在低於37℃之溫度(較佳為10至25℃)下，在pH 7.5至8.5、較佳為8的pH緩衝液中，攪拌至多40個小時、較佳1至15個小時之時間段。
實施例I：
一種抗體藥物結合物，其具有下式：
其中R2、R4及R5表示H；R3表示-CH2OH；R1表示-L1-L2-結合子，其中L1表示
其中#2表示連至L2的連接點且#1表示連至其他連接物的連接點。
且L2表示下式A5及A6之結構中之一或兩者：
其中#1表示連至抗體之硫原子的連接點，#2表示連至基團L1之連接點，及R22表示COOH、COOR、COR、CONHR(其中R在各種情況下表 示C1-3烷基)、CONH2，較佳表示COOH。
在本發明之結合物中或在本發明之結合物之混合物中，存在連至抗體之半胱胺酸殘基的鍵，其存在的範圍較佳超過80%，尤佳超過90%(在各種情況下，以連接子連至抗體之鍵的總數)，作為式A5或A6之兩種結構之一時尤佳。
本文中，式A5或A6之結構通常以60：40至40：60之比率(以連至抗體之鍵的數目計)一起存在。剩餘鍵則以如下結構存在：
抗體較佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
特定實施例
提供根據下式之一的以下尤佳抗體結合物，其中n為數字1至20且AK1(以及AK1a、AK1b等)及AK2(以及AK2a、AK2b等)為抗體。AK1為經由半胱胺酸連接的抗體，AK2為經由離胺酸連接的抗體。下式之一中的抗體(AK1或AK2)較佳為人類化或嵌合單株ITEM-4抗TWEAKR抗體。尤佳為人類化或嵌合ITEM-4變異體：TPP-7005、TPP-7006、TPP-7007、TPP-7053、TPP-7073、TPP-7074、TPP-7075及TPP-7076。
其他結合物
其他結合物可具有下式之一：
其中AK1 表示經由半胱胺酸連接的具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，且AK2表示經由離胺酸連接的具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，n 表示數字1至20；及L1 表示具有1至30個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其相同或不同地可被-O-、-S-、-C(=O)-、-S(=O)2-、-NH-、環戊基、哌啶基、苯基間雜一次或超過一次，其中該直鏈或分支鏈烴鏈可經-COOH或-NH2取代，及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
本文中，連接子L1較佳表示以下基團：§-NH-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)6-§§； §-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§ §-NH-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-O-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(CH3)-§§；§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(C2H4COOH)-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-((CH2)2-O)3-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH(CH2COOH)-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(C2H4COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH(CH2OH)-NH-C(=O)-CH2-§§； §-NH-CH[C(=O)-NH-(CH2)2-O)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-CH(CH3)-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NHC(=O)-NH-(CH2)2-§§； §-NHC(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NHC(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§； §-NHC(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§； §-NHC(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(異C3H7)-C(=O)-NH-CH[(CH2)3-NH- C(=O)-NH2]-C(=O)-OC(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(異C3H7)-C(=O)-NH-CH(CH3)-C(=O)- OC(=O)-CH2-§§； §-NH-(CH2)2-NH-C(=O)§§； §-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(CH3)-C(=O)-NH-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-C(=O)-NH§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§； §NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2)2-§§； §-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(C2H4COOH)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§； §-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-CH3]-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-(CH2)2-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[C(=O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[C(=O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；或§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§，其中§ 表示連至活性化合物模組的鍵，及§§ 表示連至抗體的鍵，及異C3H7 表示異丙基。
此等結合物亦包括其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構 體。
治療用途
可使用本發明化合物治療的增殖性疾病，尤其包括癌症及腫瘤疾病之群組。在本發明的情形下，此應理解為尤其意謂以下疾病(但對其無任何限制)：乳腺癌及乳腺腫瘤(乳腺癌包括乳腺管及小葉形式，以及原位癌)、呼吸道腫瘤(小細胞及非小細胞肺癌、支氣管癌)、腦腫瘤(例如腦幹及下丘腦之腫瘤、星形細胞瘤、室管膜瘤、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤及神經外胚層及松果體腫瘤)、消化器官腫瘤(食道癌、胃癌、膽囊癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌及肛門癌)、肝臟腫瘤(尤其肝細胞癌、膽管癌及混合型肝細胞膽管癌)、頭頸區腫瘤(喉、下嚥、鼻咽、口咽、嘴唇及口腔癌瘤、口部黑色素瘤)、皮膚腫瘤(基底細胞癌、脊椎瘤、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、惡性黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌、梅克爾細胞皮膚癌(Merkel cell skin cancer)、肥大細胞腫瘤)、基質及結締組織之腫瘤(尤其軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、軟骨肉瘤、纖維肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤及橫紋肌肉瘤)、眼腫瘤(尤其眼內黑色素瘤及視網膜母細胞瘤)、內分泌及外分泌腺體之腫瘤(例如甲狀腺及副甲狀腺腺體之腫瘤、胰腺及唾液腺癌瘤、腺癌)、泌尿道腫瘤(膀胱、陰莖、腎臟、腎盂及輸尿管之腫瘤)及生殖器官之腫瘤(女性之子宮內膜、子宮頸、卵巢、陰道、外陰及子宮之癌瘤及男性之前列腺及睪丸之癌瘤)。此等疾病亦包括呈實體形式及循環中之細胞形式的血液、淋巴系統及脊髓增殖性疾病，諸如白血病、淋巴瘤及骨髓增殖性疾病，例如急性骨髓白血病、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病及毛細胞白血病，及AIDS相關淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas)、非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、伯 基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphomas)及中樞神經系統中之淋巴瘤。
此等經充分表徵之人類疾病亦可以類似病因出現於其他哺乳動物中，且同樣可用本發明之化合物治療。
本發明化合物治療上述癌症疾病包含治療實體腫瘤與治療其轉移或循環形式。
在本發明之上下文中，術語「治療」係以習知意義使用且意謂護理、照護及哺育患者，其目的在於對抗、減少、減弱或緩解疾病或健康異常，及改善受此疾病損害的生活狀況，例如在癌症情況下。
本發明因此進一步提供本發明化合物用於治療及/或預防病症、尤其前述病症的用途。
本發明進一步提供本發明化合物用於製造供治療及/或預防病症、尤其前述病症之藥劑的用途。
本發明進一步提供本發明化合物用於治療及/或預防病症、尤其前述病症之方法中的用途。
本發明進一步提供一種使用有效量之至少一種本發明化合物治療及/或預防病症、尤其前述病症的方法。
本發明化合物可單獨使用或必要時與一或多種其他藥理學活性物質組合使用，其限制條件為此組合不會產生非所要及不可接受的副作用。因此，本發明進一步提供包含至少一種本發明化合物及一或多種其他活性成分的藥劑，尤其用於治療及/或預防前述病症。
舉例而言，本發明之化合物可與已知抗過度增殖物質、細胞抑制物質或細胞毒性物質組合用於治療癌症疾病。適合組合活性化合物之實例包括：131I-chTNT、阿巴瑞克(abarelix)、阿比特龍(abiraterone)、阿克拉黴素(aclarubicin)、阿法替尼(afatinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿地白介素(aldesleukin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿立塞替 (alisertib)、亞利崔托寧(alitretinoin)、艾法雷啶(alpharadin)(氯化鐳-223)、六甲蜜胺(altretamine)、胺魯米特(aminoglutethimide)、AMP-514、胺柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿格拉賓(arglabin)、三氧化二砷、天冬醯胺酶、AT9283、阿西替尼(axitinib)、阿紮胞苷(azacitidine)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝洛替康(belotecan)、苯達莫司汀(bendamustine)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝瑟羅汀(bexarotene)、比卡魯胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博萊黴素(bleomycin)、BMS-936559、伯舒替尼(bosutinib)、硼替佐米(bortezomib)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、卡巴利他索(cabazitaxel)、卡博替尼(cabozantinib)、亞葉酸鈣(calcium folinate)、左醛葉酸鈣(calcium levofolinate)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡非佐米(carfilzomib)(蛋白酶體抑制劑)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、卡托莫西單抗(catumaxomab)、塞內昔布(celecoxib)、西莫白介素(celmoleukin)、西妥昔單抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯地孕酮(chlormadinone)、雙氯乙基甲胺(chlormethine)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯膦酸(clodronic acid)、氯法拉濱(clofarabine)、考班昔布(copanlisib)、克立他酶(crisantaspase)、克卓替尼(crizotinib)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、CYC116、環丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素d(dactinomycin)、阿法達貝泊汀(darbepoetin alfa)、達拉菲尼(dabrafenib)、達魯舍替(danusertib)、達沙替尼(dasatinib)、道諾黴素(daunorubicin)、地西他濱(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素迪夫托斯(denileukin diftitox)、德諾單抗(denosumab)、德舍瑞林(deslorelin)、二溴螺氯銨(dibrospidium chloride)、多西他賽 (docetaxel)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、小紅莓(doxorubicin)、小紅莓+雌酮(doxorubicin+estrone)、艾庫組單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依利醋銨(elliptinium acetate)、艾曲波帕(eltrombopag)、內皮生長抑素(endostatin)、ENMD-2076、依諾他濱(enocitabine)、表柔比星(epirubicin)、環硫雄醇(epitiostanol)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、倍他依泊汀(epoetin beta)、依鉑(eptaplatin)、艾日布林(eribulin)、埃羅替尼(erlotinib)、雌二醇(estradiol)、雌氮芥(estramustine)、依託泊苷(etoposide)、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、法屈唑(fadrozole)、非格司亭(filgrastim)、氟達拉賓(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、福美司坦(formestane)、福莫司汀(fotemustine)、氟維司群(fulvestrant)、硝酸鎵(gallium nitrate)、加尼瑞克(ganirelix)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、氧化型谷胱甘肽(glutoxim)、戈舍瑞林(goserelin)、組織胺二鹽酸鹽、組胺瑞林(histrelin)、羥基脲(hydroxycarbamide)、I-125晶種、伊班膦酸(ibandronic acid)、異貝莫單抗泰澤坦(ibritumomab tiuxetan)、依魯替尼(ibrutinib)、艾達黴素(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊馬替尼(imatinib)、咪喹莫特(imiquimod)、INCB24360、英丙舒凡(improsulfan)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、伊匹單抗(ipilimumab)、伊立替康(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、拉立珠單抗(lambrolizumab)、蘭瑞肽(lanreotide)、拉帕替尼(lapatinib)、來那度胺(lenalidomide)、來格司亭(lenograstim)、蘑菇多醣(lentinan)、來曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、左旋咪唑(levamisole)、麥角乙脲(lisuride)、洛鉑(lobaplatin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼達明(lonidamine)、馬索羅酚(masoprocol)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、 美雄烷(mepitiostane)、巰基嘌呤(mercaptopurine)、甲胺喋呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、胺基乙醯丙酸甲酯(methyl aminolevulinate)、甲睾酮(methyltestosterone)、米伐木肽(mifamurtide)、米替福新(miltefosine)、米鉑(miriplatin)、二溴甘露醇(mitobronitol)、丙脒腙(mitoguazone)、二溴衛矛醇(mitolactol)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、MLN-8054、Mps1抑制劑(揭示於WO2013/087579中，特定而言，實例01.01；WO2014/131739，特定而言，實例2)、奈達鉑(nedaplatin)、奈拉濱(nelarabine)、奈莫柔黴素(nemorubicin)、尼羅替尼(nilotinib)、尼魯胺(nilutamide)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼莫司汀(nimustine)、二胺硝吖啶(nitracrine)、納武單抗(nivolumab)、NMS-P715、NMS-P937、奧伐木單抗(ofatumumab)、奧美拉唑(omeprazole)、奧普瑞白介素(oprelvekin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、p53基因療法、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕博西里(palbociclib)、帕利夫明(palifermin)、鈀-103晶種、帕米膦酸(pamidronic acid)、帕尼單抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、培門冬酶(pegaspargase)、PEG-倍他依泊汀(PEG-epoetin beta)(甲氧基-PEG-倍他依泊汀)、派非格司亭(pegfilgrastim)、聚乙二醇化干擾素α2b、培美曲塞(pemetrexed)、戊唑星(pentazocine)、噴司他汀(pentostatin)、培洛黴素(peplomycin)、培磷醯胺(perfosfamide)、畢西巴尼(picibanil)、吡柔比星(pirarubicin)、普樂沙福(plerixafor)、普卡黴素(plicamycin)、聚胺葡糖(poliglusam)、聚磷酸雌二醇(polyestradiol phosphate)、多醣-K(polysaccharide-K)、普納替尼(ponatinib)、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、普拉曲沙(pralatrexate)、潑尼氮芥(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、喹高利特(quinagolide)、R763、雷諾昔酚(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷莫司汀(ranimustine)、雷佐生(razoxane)、瑞法美替尼 (refametinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、利塞膦酸(risedronic acid)、利妥昔單抗(rituximab)、羅米地辛(romidepsin)、羅米司亭(romiplostim)、羅寧克里(roninciclib)、盧佐替尼(ruxolitinib)、沙格司亭(sargramostim)、西普亮塞-T(sipuleucel-T)、西佐喃(sizofiran)、索布佐生(sobuzoxane)、甘胺雙唑鈉(sodium glycididazole)、SNS-314、索拉非尼(sorafenib)、鏈脲菌素(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、他拉泊芬(talaporfin)、他米巴羅汀(tamibarotene)、他莫昔芬(tamoxifen)、他索那明(tasonermin)、替西白介素(teceleukin)、喃氟啶(tegafur)、喃氟啶+吉美拉西+奧特拉西(tegafur+gimeracil+oteracil)、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺(temozolomide)、坦羅莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、睪固酮(testosterone)、替曲膦(tetrofosmin)、沙立度胺(thalidomide)、噻替派(thiotepa)、胸腺法新(thymalfasin)、TKM-PLK1、硫鳥嘌呤(tioguanine)、托西利單抗(tocilizumab)、拓朴替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫單抗(tositumomab)、陶紮色替(tozasertib)、曲貝替定(trabectedin)、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)、曲奧舒凡(treosulfan)、維甲酸(tretinoin)、曲洛司坦(trilostane)、曲普瑞林(triptorelin)、曲洛磷胺(trofosfamide)、色胺酸、烏苯美司(ubenimex)、伐柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、伐普肽(vapreotide)、維羅非尼(vemurafenib)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春氟寧(vinflunine)、長春瑞賓(vinorelbine)、沃納瑟替(volasertib)、伏立諾他(vorinostat)、伏羅唑(vorozole)、XL228、釔-90玻璃微球體、淨司他丁(zinostatin)、淨司他丁司他美(zinostatin stimalamer)、唑來膦酸(zoledronic acid)、佐柔比星(zorubicin)。
另外，本發明之化合物可與例如結合子組合，該等結合子可結 合至例如以下標靶：OX-40、CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3、CD40。
此外，本發明化合物亦可與放射療法及/或手術干預組合使用。
通常，可藉由本發明之化合物與其他細胞抑制或細胞毒性活性劑之組合實現以下目標：相較於個別活性化合物之治療，達成延緩腫瘤生長、減小其尺寸或甚至使其完全消除之功效改良；與單一療法之情況相比，可使用使用劑量更低的化學治療劑；相較於個別投藥，可實現副作用更少、耐受性更強的療法；可治療更廣範圍之贅生性病症；對療法達成較高反應率；相較於現有標準療法，延長患者之存活時間。
此外，本發明化合物亦可與放射療法及/或手術干預組合使用。
本發明進一步提供包含至少一種本發明化合物、典型地連同一或多種惰性、無毒、醫藥學上適合之賦形劑一起的藥劑，及其用於前述目的之用途。
本發明化合物可全身性及/或局部起作用。為此目的，其可以適合方式投與，例如非經腸、可能之吸入方式或植入或血管內支架方式。
本發明化合物可以適於此等投藥途徑之投藥形式投與。
非經腸投藥可繞過吸收步驟(例如靜脈內、動脈內、心內、脊椎內或腰內)或包括吸收(例如肌肉內、皮下、皮內、經皮或腹膜內)。適於非經腸投藥之投藥形式包括呈溶液、懸浮液、乳液、凍乾物形式之注射及輸注用製劑。較佳為非經腸投藥，尤其靜脈內投藥。
一般而言，已發現在非經腸投藥之情況下，每公斤體重約0.001至1mg，較佳每公斤體重約0.01至0.5mg之投藥量可有利地實現有效 結果。
然而，在一些情況下，可能需要偏離所述量，尤其根據體重、投藥途徑、對活性成分之個別反應、製劑性質及投藥進行時間或間隔時間而變化。因此，在一些情況下，小於上述最小量可為足夠的，而在其他情況下必須超過提及的上限。在較大量投藥之情況下，將其分成一天中的若干個別劑量可為合理的。
實例
以下實例說明本發明。本發明不限於實例。
除非另外說明，否則在以下測試及實例中，百分比為重量百分比；份數為重量份。液體/液體溶液之溶劑比、稀釋比及濃度資料在各情況下均以體積計。
若在實驗之描述中，未陳述反應進行的溫度，則可假定為室溫。
合成途徑：
為了舉例說明實施例，下文流程顯示產生實施例的例示性合成途徑：
[a)：例如三乙醯氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM，室溫；b)例如乙醯氧基乙醯氯，NEt3，DCM，室溫；c)例如LiOH，THF/水，室溫；d)例如H2，Pd-C，EtOH，室溫；e)例如Teoc-OSu，NEt3，二噁烷， 室溫；f)例如Fmoc-Cl，二異丙基乙胺，二噁烷/水2：1，室溫]
[a)：例如苯甲基溴，Cs2CO3，DMF，室溫；b)例如Pd(dppf)2Cl2，DMF，Na2CO3，85℃；c)例如LiAlH4，THF，0℃；MnO2，DCM，室溫；d)例如Ti(iOPr)4，THF，室溫；e)例如tBuLi，THF，-78℃；MeOH，NH4Cl；f)例如HCl/1,4-二噁烷]
流程26：經由丁二醯胺水解來合成經半胱胺酸連接之ADC 此方法特定地用於ADC，其中L1=CH2或其中L1=CH-CH3或其中L1=苯基，以將此等ADC轉化成開鏈連接形式。
[a)：三乙醯氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM，室溫；b)乙醯氧基乙醯氯，二異丙基乙胺，DCM，室溫；c)LiOH，MeOH，室溫；d)三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)，HATU，DMF，二異丙基乙胺，室溫；e)氯化鋅，三氟乙醇，50℃，EDTA]
[a)：HATU，DMF，二異丙基乙胺，室溫；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃，EDTA]
[a)：三乙醯氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM，室溫；b)乙醯氧基乙醯氯，三乙胺，DCM，室溫；c)LiOH，MeOH，室溫；d)三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)，HATU，DMF，二異丙基乙 胺，室溫；e)氯化鋅，三氟乙醇，50℃，EDTA]
[a)：2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽(BEP)，DCM，吡啶，室溫；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4當量之TCEP，PBS緩衝液；d)PBS緩衝液，20小時，室溫]
[a)：2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽(BEP)，DCM，吡啶，室溫；b)氯化鋅，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4當量之TCEP，PBS緩衝液；d)PBS緩衝液，20小時，室溫]
[a)例如二甲基鋅，環己基MgCl，THF，-78℃；NH4Cl；b)例如HCl/1,4-二噁烷]
[a)：三乙醯氧基硼氫化鈉，乙酸，DCM，室溫；b)乙醯氧基乙醯氯，三乙胺，DCM，室溫；c)L-半胱胺酸，NaHCO3，DBU，異丙醇/水，室溫；d)3-硫基丙酸，K2CO3，室溫；e)連接子，HATU，DMF，二異丙基乙胺，室溫；e)氯化鋅，三氟乙醇，50℃，EDTA]
A.實例
縮寫及首字母縮寫：
HPLC及LC-MS方法：
方法1(LC-MS)：
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC系統；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50×1mm；移動相A：1l水+0.25ml 99%濃度甲酸，移動相B：1l乙腈+0.25ml 99%濃度甲酸；梯度：0.0min 90% A→1.2min 5% A→2.0min 5% A；烘箱：50℃；流速：0.40ml/min；UV偵測：208-400nm。
方法2(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I級；管柱：Waters，BEH300，2.1×150mm，C18 1.7μm；移動相A：1l水+0.01%甲酸；移動相B：1l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 2% B→1.5min 2% B→8.5min 95% B→10.0min 95% B；烘箱：50℃；流速：0.50ml/min；UV偵測：220nm
方法3(LC-MS)：
MS儀器：Waters(Micromass)QM；HPLC儀器：Agilent 1100系列；管柱：Agilent ZORBAX延長型C18 3.0x50mm 3.5微米；移動相A：1l水+0.01mol碳酸銨，移動相B：1l乙腈；梯度：0.0min 98% A→0.2min 98% A→3.0min 5% A→4.5min 5% A；烘箱：40℃；流速：1.75ml/min；UV偵測：210nm
方法4(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I級；管柱：Waters，HSST3，2.1×50mm，C18 1.8μm；移動相A：1l水+0.01%甲酸；移動相B：1l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 10% B→0.3min 10% B→1.7min 95% B→2.5min 95% B；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：210nm
方法5(LC-MS)：
儀器：Waters ACQUITY SQD UPLC系統；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50×1mm；移動相A：1l水+0.25ml 99%濃度甲酸，移動相B：1l乙腈+0.25ml 99%濃度甲酸；梯度：0.0min 95% A→6.0min 5% A→7.5min 5% A；烘箱：50℃；流速：0.35ml/min；UV偵測：210-400nm。
方法6(LC-MS)：
儀器：Micromass Quattro Premier聯合Waters UPLC Acquity；管柱：Thermo Hypersil GOLD 1.9μ 50×1mm；移動相A：1l水+0.5ml 50%濃度甲酸，移動相B：1l乙腈+0.5ml 50%濃度甲酸；梯度：0.0min 97% A→0.5min 97% A→3.2min 5% A→4.0min 5% A；烘箱：50℃；流速：0.3ml/min；UV偵測：210nm。
方法7(LC-MS)：
儀器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；管柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ 50×2.1mm；移動相：1l水+0.25ml 99%濃度甲酸，移動相B：1l乙腈+0.25ml 99%濃度甲酸；梯度：0.0min 90% A→0.3min 90% A→1.7min 5% A→3.0min 5% A；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：205-305nm。
方法8(LC-MS)：
MS儀器類型：Waters Synapt G2S；UPLC儀器類型：Waters Acquity I級；管柱：Waters，HSST3，2.1×50mm，C18 1.8μm；移動相A：1l水+0.01%甲酸；移動相B：1l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 2% B→2.0min 2% B→13.0min 90% B→15.0min 90% B；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV偵測：210nm
方法9：實例181-191之LC-MS-Prep純化方法(方法LIND-LC-MS-Prep)
MS儀器：Waters，HPLC儀器：Waters(管柱Waters X-Bridge C18，19mm×50mm，5μm，移動相A：水+0.05%氨，移動相B：具有梯度之乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV偵測：DAD；210-400nm)。
或
MS儀器：Waters，HPLC儀器：Waters(管柱Phenomenex Luna 5μ C18(2)100A，AXIA Tech.50×21.2mm，移動相A：水+0.05%甲酸，移動相B：具有梯度的乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV偵測：DAD；210-400nm)。
方法10：實例181-191之LC-MS分析方法(LIND_SQD_SB_AQ)
MS儀器：Waters SQD；HPLC儀器：Waters UPLC；管柱：Zorbax SB-Aq(Agilent)，50mm×2.1mm，1.8μm；移動相A：水+0.025%甲酸，移動相B：乙腈(ULC)+0.025%甲酸；梯度：0.0min 98% A-0.9min 25% A-1.0min 5% A-1.4min 5% A-1.41min 98% A-1.5min 98% A；烘箱：40℃；流速：0.600ml/min；UV偵測：DAD；210nm。
方法11(HPLC)：
儀器：HP1100系列
管柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e，50-4.6mm，目錄號1.51450.0001，前置管柱Chromolith保護濾筒套組，RP-18e，5-4.6mm，目錄號1.51470.0001
梯度：流速5ml/min注射體積5μl溶劑A：HClO4(70%濃度)於水中(4ml/l)溶劑B：乙腈起始20% B 0.50min 20% B 3.00min 90% B 3.50min 90% B 3.51min 20% B 4.00min 20% B管柱溫度：40℃
波長：210nm
方法12(LC-MS)：
MS儀器類型：Thermo Scientific FT-MS；UHPLC+儀器類型：Thermo Scientific UltiMate 3000；管柱：Waters，HSST3，2.1×75mm，C18 1.8μm；移動相A：1l水+0.01%甲酸；移動相B：1l乙腈+0.01%甲酸；梯度：0.0min 10% B→2.5min 95% B→3.5min 95% B；烘箱：50℃；流速：0.90ml/min；UV偵測：210nm/最佳積分路徑210-300nm
方法13：(LC-MS)：
MS儀器：Waters(Micromass)Quattro Micro；儀器Waters UPLC Acquity；管柱：Waters BEH C18 1.7μ 50×2.1mm；移動相A：1l水+0.01mol甲酸銨，移動相B：1l乙腈；梯度：0.0min 95% A→0.1min 95% A→2.0min 15% A→2.5min 15% A→2.51min 10% A→3.0min 10% A；烘箱：40℃；流速：0.5ml/min；UV偵測：210nm
方法14：(LC-MS)：
MS儀器類型：ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL；HPLC儀器類型：Agilent 1200SL；管柱：Agilent，POROSHELL，120，3×150mm，SB-C18 2.7μm；移動相A：1l水+0.1%三氟乙酸；移動相B：1l乙腈+0.1%三氟乙酸；梯度：0.0min 2% B→0.3min 2% B →5.0min 95% B→10.0min 95% B；烘箱：40℃；流速：0.75ml/min；UV偵測：210nm
其製備在下文中未明確描述的所有反應物或試劑均市購自通常可獲得的來源。對於其製備在下文中未描述且在商業上不可獲得或其來源通常不可獲得之所有其他反應物或試劑而言，參考描述有其製備 之公開文獻。
起始物質及中間物：
中間物C2
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸第三丁酯
將4.22g(14.5mmol)N-(第三丁氧基羰基)-L-高絲胺酸第三丁酯溶解於180ml二氯甲烷中，且接著添加3.5ml吡啶及9.2g(21.7mmol)1,1,1-三乙醯氧基-1λ5,2-苯并碘氧雜環戊-3(1H)-酮。混合物在室溫下攪拌1小時且接著用500ml二氯甲烷稀釋且用10%濃度硫代硫酸鈉溶液萃取兩次且接著依次用5%濃度檸檬酸萃取兩次且用10%濃度碳酸氫鈉溶液萃取兩次。分離出有機相，經硫酸鎂乾燥且接著在減壓下濃縮。將殘餘物溶解於DCM中且添加乙醚與正戊烷之混合物。濾出沈澱物且接著濃縮濾液且自乙腈/水中凍乾。由此得到3.7g(93%)(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-側氧基丁酸第三丁酯，其不經進一步純化即用於下一步驟。(Rf值：0.5(DCM/甲醇95/5))。
將3.5g(9.85mmol)中間物C1溶解於160ml DCM中，且添加3.13g(14.77mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及0.7ml乙酸。在室溫下攪拌5分鐘之後，添加3.23g(11.85mmol)(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-側氧基丁酸第三丁酯且混合物在室溫下再攪拌30分鐘。接著在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於乙腈/水中。濾出沈澱固體且乾燥，得到 5.46g(84%)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.5min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=613(M+H)+。
中間物C11
R/S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-高半胱胺酸/三氟乙酸鹽(1：1)
首先將990.0mg(2.79mmol)(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺饋入15.0ml二氯甲烷中，且添加828.8mg(3.91mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及129.9mg(3.21mmol)乙酸，且混合物在室溫下攪拌5分鐘。添加698.1mg(3.21mmol)溶解於15.0ml二氯甲烷中的(3-側氧基丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物L58)，且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相分別用飽和碳酸鈉溶液及飽和NaCl溶液洗滌兩次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物在矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇=100：2)。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到1.25g(理論值之73%)化合物[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸2- (三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=556(M+H)+。
將151.4mg(1.5mmol)三乙胺及161.6mg(1.43mmol)氯乙醯氯添加至400.0mg(0.65mmol)[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯中。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相用水洗滌三次且用飽和NaCl溶液洗滌一次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由矽膠層析(移動相：環己烷/乙酸乙酯=3：1)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到254.4mg(理論值之57%)化合物{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIneg)：m/z=676(M+HCOO-)-。
將117.4mg(0.19mmol){3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於10.0ml異丙醇中，且添加928.4μl 1M NaOH及50.2mg(0.37mmol)DL-高半胱胺酸。在50℃下攪拌反應混合物4.5小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到75.3mg(理論值之48%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.24min；MS(ESIpos)：m/z=731(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.40(m,1H),0.75-0.91(m,11H),1.30(m,1H),1.99-2.23(m,2H),2.63-2.88(m, 4H),3.18-3.61(m,5H),3.79-4.10(m,3H),4.89(d,1H),4.89(d,1H),5.16(d,1H),5.56(s,1H),6.82(m,1H),6.91(s,1H),6.97(m,1H),7.13-7.38(m,6H),7.49(s,1H),7.63(m,1H),8.26(s,3H)。
中間物C12
R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基]高半胱胺酸
使用(2S)-4-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯(中間物L57)及中間物C52作為起始物質，類似於中間物C11的合成來進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=1.18min；MS(ESIpos)：m/z=775(M+H)+。
中間物C52
(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
首先將10.00g(49.01mmol)4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯饋入100.0ml DMF中，且添加20.76g(63.72mmol)碳酸銫及9.22g(53.91mmol)苯甲基溴。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。使反應混合物分配於水與乙酸乙酯之間且水相用乙酸乙酯萃取。合併之有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。使用90.0g 4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯重複進行反應。
合併之兩次反應物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Daiso 300x100；10μ，流速：250ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到125.15g(理論值之87%)化合物1-苯甲基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.18min；MS(ESIpos)：m/z=295[M+H]+。
在氬氣下，首先將4.80g(16.32mmol)1-苯甲基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯饋入DMF中，且添加3.61g(22.85mmol)(2,5-二氟苯基)酸、19.20ml飽和碳酸鈉溶液及1.33g(1.63mmol)[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]-二氯鈀(II)：二氯甲烷。在85℃攪拌反應混合物隔夜。經由矽藻土過濾反應混合物且用乙酸乙酯洗滌濾餅。有機相用水萃取且接著用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由矽膠層析(移動相：環己烷/乙酸乙酯=100：3)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到3.60g(理論值之67%)化合物1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。
LC-MS(方法7)：Rt=1.59min；MS(ESIpos)：m/z=328[M+H]+。
首先將3.60g(11.00mmol)1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯饋入90.0ml THF中，且在0℃添加1.04g(27.50mmol)氫化鋰鋁(2.4M，於THF中)。在0℃攪拌反應混合物30分鐘。在0℃，添加飽和酒石酸鉀鈉溶液，且將乙酸乙酯添加至反應混合物中。有機相用飽和酒石酸鉀鈉溶液萃取三次。有機相用飽和NaCl溶液洗滌一次且經 硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於30.0ml二氯甲烷中。添加3.38g(32.99mmol)氧化錳(IV)，且混合物在室溫下攪拌48小時。另外添加2.20g(21.47mmol)氧化錳(IV)，且混合物在室溫下攪拌隔夜。經由矽藻土過濾反應混合物且用二氯甲烷洗滌濾餅。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物2.80g(1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)不經進一步純化即用於合成的下一步驟中。
LC-MS(方法7)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=298[M+H]+。
首先將28.21g(94.88mmol)1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛連同23.00g(189.77mmol)(R)-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺一起饋入403.0ml無水THF中，且添加67.42g(237.21mmol)異丙醇鈦(IV)且混合物在室溫下攪拌隔夜。添加500.0ml飽和NaCl溶液及1000.0ml乙酸乙酯，且混合物在室溫下攪拌1小時。經由矽藻土過濾混合物且濾液用飽和NaCl溶液洗滌兩次。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且使用Biotage Isolera(矽膠，管柱1500+340g SNAP，流速200ml/min，乙酸乙酯/環己烷1：10)純化殘餘物。
LC-MS(方法7)：Rt=1.63min；MS(ESIpos)：m/z=401[M+H]+。
首先在氬氣下將25.00g(62.42mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺饋入無水THF中且冷卻至-78℃。接著在-78℃添加12.00g(187.27mmol)第三丁基鋰(1.7M於戊烷中之溶液)且在此溫度下攪拌混合物3小時。在-78℃，接著依次添加71.4ml甲醇及214.3ml飽和氯化銨溶液，且允許反應混合物升溫至室溫且在室溫下攪拌1小時。混合物用乙酸乙酯稀釋且用水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物(R)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
LC-MS(方法6)：Rt=2.97min；MS(ESIpos)：m/z=459[M+H]+。
首先將28.00g(61.05mmol)(R)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺饋入186.7ml 1,4-二噁烷中，且接著添加45.8ml含HCl之1,4-二噁烷溶液(4.0M)。反應混合物在室溫下攪拌2小時且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Kinetix 100x30；流速：60ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發乙腈且向含水殘餘物中添加二氯甲烷。有機相用碳酸氫鈉溶液洗滌且經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到16.2g(理論值之75%)標題化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.10min；MS(ESIpos)：m/z=338[M-NH2]+,709[2M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.87(s,9H),1.53(s,2H),3.59(s,1H),5.24(d,2H),6.56(s,1H),6.94(m,1H),7.10(d,2H),7.20(m,1H),7.26(m,2H),7.34(m,2H),7.46(m,1H)。
中間物C53
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
首先，類似於中間物C58，使用(2S)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸苯甲酯使中間物C52發生還原性烷基化。接著使用乙酸2-氯-2-側氧基乙酯使二級胺基發生醯基化，如針對中間物C58所述，且接著使用2M氫氧化鋰於甲醇中之溶液使兩個酯基發生水解。將以此方式獲得的中間物溶解於乙醇中，添加鈀/碳(10%)且將混合物在室溫下、在氫氣下、在標準壓力下氫化1小時。將脫除保護基的化合物溶解於二噁烷/水2：1中且在最後步驟中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使用氯甲酸9H-茀-9-基甲酯引入Fmoc保護基。
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=734(M-H)-。
中間物C54
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁醯基]-β-丙胺酸
首先，類似於中間物C2，使用N-[(2S)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁醯基]-β-丙胺酸苯甲酯使中間物C52發生還原性烷基化。接著使用乙酸2-氯-2-側氧基乙酯使二級胺基發生醯基化，如針對中間物C58所述。將以此方式獲得的中間物溶解於甲醇中，添加鈀/碳(10%)且將混合物在室溫下、在氫氣下、在標準壓力下氫化1小時。接 著使用2M氫氧化鋰於甲醇中之溶液使酯基發生水解。將脫除保護基的化合物溶解於二噁烷/水2：1中且在最後步驟中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使用氯甲酸9H-茀-9-基甲酯引入Fmoc保護基。獲得48mg標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=807(M+H)+。
中間物C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸
首先，類似於中間物C2，使用(2S)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸苯甲酯使中間物C52發生還原性烷基化。接著使用乙酸2-氯-2-側氧基乙酯使二級胺基發生醯基化，如針對中間物C27所述，且接著使用2M氫氧化鋰於甲醇中之溶液使兩個酯基發生水解。將以此方式獲得的中間物溶解於乙醇中，添加鈀/碳(10%)且將混合物在室溫下、在氫氣下、在標準壓力下氫化1小時。
將500mg(0.886mmol)之此完全脫除保護基之中間物溶解於60ml二噁烷中，且添加253mg(0.975mmol)1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮及198μl三乙胺。在室溫下攪拌24小時 之後，濃縮反應物且殘餘物藉由製備型HPLC純化。合併適當溶離份，在減壓下濃縮且在高真空下乾燥，得到312mg(理論值之50%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.61min；MS(ESIpos)：m/z=658(M+H)+。
或者，中間物C58藉由以下路徑製備：
將4.3g(12.2mmol)中間物C52溶解於525ml DCM中，且添加3.63g(17.12mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及8.4ml乙酸。在室溫下攪拌5分鐘之後，添加溶解於175ml DCM中的8.99g(24.5mmol)中間物L57且反應物在室溫下進一步攪拌45分鐘。反應物接著用300ml DCM稀釋且用100ml碳酸氫鈉溶液洗滌兩次且用飽和NaCl溶液洗滌一次。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物接著藉由製備型RP-HPLC(管柱：Chromatorex C18)純化。合併適當溶離份之後，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.6g(理論值之61%)(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯。
LC-MS(方法12)：Rt=1.97min；MS(ESIpos)：m/z=614(M+H)+。
首先將2.06g(3.36mmol)此中間物饋入76ml DCM中且在2.1ml三乙胺存在下、用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-側氧基乙酯發生醯基化。在室溫下攪拌20小時之後，添加0.36ml乙酸2-氯-2-側氧基乙酯及0.94ml三乙胺且反應物在室溫下進一步攪拌15分鐘。混合物接著用500ml乙酸乙酯稀釋且依次用300ml 5%濃度檸檬酸萃取兩次，用300ml飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次且用100ml飽和氯化鈉溶液萃取一次且接著經硫酸鎂乾燥且濃縮。在高真空下乾燥，得到2.17g(理論值之79%)之經保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=714(M+H)+。
將2.17mg(2.64mmol)此中間物溶解於54ml THF及27ml水中，且添加26ml之2莫耳濃度氫氧化鋰溶液。混合物在室溫下攪拌30分鐘且接著使用1.4ml TFA調節至pH 3與pH 4之間。在減壓下濃縮混合物。一旦大部分THF已餾出，則用DCM萃取水溶液兩次且接著在減壓下濃縮至乾燥。殘餘物藉由製備型HPLC(管柱：Chromatorex C18)純化。合併適當溶離份之後，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物自乙腈/水中凍乾。由此得到1.1g(理論值之63%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=656(M-H)-。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.58(m,1H),0.74-0.92(m,11H),1.40(m,1H),3.3(m,2H),3.7(m,1H),3.8-4.0(m,2H),4.15(q,2H),4.9及5.2(2d,2H),5.61(s,1H),6.94(m,2H),7.13-7.38(m,7H),7.48(s,1H),7.60(m,1H),12.35(s,1H)。
中間物C59
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
首先，在三乙胺存在下，使用(2S)-2-甲氧基丙醯氯(中間物C53之中間物)使(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}丁酸苯甲酯之二級胺基發生醯基化，如針對中間物C53所述。將所得中間物溶解於乙醇中，添加鈀/碳(10%)且混合物在室溫下、在標準壓力下用氫氣氫化1小時。將脫除保護基的化合物溶解於二噁烷/水2：1中且在最後步驟中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使用氯甲酸9H-茀-9-基甲酯引入Fmoc保護基。
LC-MS(方法1)：Rt=1.39min；MS(ESIpos)：m/z=764(M-H)-。
中間物C60
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-2-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}丁酸
類似於中間物C53進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=750(M+H)+。
中間物C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-β-丙胺酸
標題化合物藉由使60mg(0.091mmol)中間物C58與β-丙胺酸甲酯偶合、隨後使用2M氫氧化鋰溶液進行酯裂解來製備。由此經2個步 驟得到67mg(理論值之61%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.29min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+。
中間物C62
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-D-丙胺酸
類似於中間物C61，由中間物C58及D-丙胺酸甲酯製備標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+。
中間物C64
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-胺基乙基)胺基]-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
類似於中間物C63，由中間物C58製備標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=2.4min；
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m/z=700(M+H)+。
中間物C65
(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二側氧基-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸
首先將215mg(0.59mmol)中間物L66饋入25ml二氯甲烷中，且 添加377mg(0.89mmol)戴斯-馬丁高碘烷(Dess-Martin periodinane)及144μl(1.78mmol)吡啶。在室溫下攪拌混合物30分鐘。反應物接著用300ml二氯甲烷稀釋且有機相分別用10%濃度Na2S2O3溶液、10%濃度檸檬酸溶液及飽和碳酸氫鈉溶液洗滌兩次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。有此得到305mg醛，其不經進一步純化即進行反應。
將175mg(0.49mmol)中間物C52溶解於50ml二氯甲烷中，且添加147mg(0.69mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及32.5μl乙酸。在室溫下攪拌5分鐘之後，添加214mg(0.593mmol)上述醛，且反應物在室溫下攪拌隔夜。在此，形成[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-1-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)丁-2-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯，而非預期產物。由於此醯亞胺亦可轉化成標題化合物，因此濃縮反應物且殘餘物藉由製備型HPLC純化。合併適當含醯亞胺溶離份之後，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。有此得到195mg(58%)上文命名的醯亞胺。
LC-MS(方法5)：Rt=3.32min；MS(ESIpos)：m/z=667(M+H)+。
將65mg(97.5μmol)此醯亞胺溶解於15ml二氯甲烷中，且添加367μl(3.4mmol)乙醯氧基乙醯氯及595μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌30分鐘之後，在減壓下、在不加熱的情況下濃縮反應物且殘餘物藉由製備型HPLC純化。合併適當溶離份，蒸發溶劑且在高真空下乾燥之後，得到28mg(理論值之37%)乙酸(8S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=767(M+H)+。
將28mg(37μmol)此中間物溶解於3ml甲醇中，且添加548μl之2 M氫氧化鋰為。在室溫下攪拌10分鐘之後，反應物用三氟乙酸調節至pH 4且接著濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份，蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥，得到26mg(理論值之96%)呈白色固體狀之標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=743(M+H)+。
中間物C66
[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-{[2-(甘胺醯基胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
首先，根據經典的肽化學方法(HATU偶合及Boc移除)，由N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺酸及(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯製備三氟乙酸/{2-[(2-胺基乙基)胺基]-2-側氧基乙基}胺基甲酸苯甲酯(1：1)。將13mg(0.036mmol)此中間物及25mg(0.033mmol)中間物C58溶解於3ml DMF中，且添加19mg(0.05mmol)HATU及17μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌10分鐘之後，濃縮混合物且殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到17.8mg(理論值之60%)中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=891(M+H)+。
將17mg(0.019mmol)此中間物溶解於10ml乙醇中，添加鈀/碳(10%)且混合物在室溫下、在標準壓力下用氫氣氫化2小時。濾出催化劑，在減壓下蒸發溶劑，且殘餘物在高真空下乾燥。此得到9mg(理論值之62%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=757(M+H)+。
中間物C67
[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸9H-茀-9-基甲酯
首先將605.3mg(1.71mmol)(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中間物C52)饋入10.0ml二氯甲烷中，且添加506.7mg(2.39mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及117.9mg(1.96mmol)乙酸且混合物在室溫下攪拌5分鐘。添加580.0mg(1.96mmol)溶解於10.0ml二氯甲烷中的胺基甲酸9H-茀-9-基甲基(3-側氧基丙基)酯(中間物L70)且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相分別用飽和碳酸鈉溶液及飽和NaCl溶液洗滌兩次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由矽膠層析(移動相：環己烷/乙酸乙酯3：1)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到514.7mg(理論值之46%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.10min；MS(ESIpos)：m/z=634(M+H)+。
中間物C69
11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸
首先將117.0mg(0.19mmol){3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸(2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C70)及21.6mg(0.20mmol)3-硫基丙酸饋入3.0ml甲醇中，添加89.5mg(0.65)碳酸鉀且混合物在50℃攪拌4小時。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。由此得到106.1mg(理論值之73%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.42min；MS(ESIneg)：m/z=700(M-H)-。
中間物C70
{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸(2-(三甲基矽烷基)乙酯
首先將908.1mg(1.63mmol)[3-({(1R)-1-[1苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(參見中間物C11之合成)及545.6mg(5.39mmol)三乙胺饋入10.0ml二氯甲烷中，且將混合物冷卻至0℃。在此溫度下，添加590.5mg(5.23mmol)氯乙醯氯且在室溫下攪拌混合物隔夜。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相分別用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化銨溶液洗滌三次。有機相用飽和NaCl溶液洗滌且經硫酸鎂乾燥。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到673.8mg(理論值之65%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53min；MS(ESIneg)：m/z=676(M+HCOO-)-。
中間物C71
S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將536.6mg(4.43mmol)L-半胱胺酸連同531.5mg(6.33mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於2.5ml水中。添加溶解於25.0ml異丙醇中的400.0mg(0.63mmol){3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C70)及1.16g(7.59mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一烷-7-烯。在50℃攪拌反應混合物1.5小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液反覆洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌一次。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到449.5mg(理論值之86%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.20min；MS(ESIpos)：m/z=717(M+H)+。
中間物C72
(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二側氧基-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸
首先將90mg(0.212mmol)中間物L72饋入6ml二氯甲烷中，且添加86μl(1.06mmol)吡啶及135mg(0.318mmol)戴斯-馬丁高碘烷。在室溫下攪拌混合物30分鐘。接著用30ml二氯甲烷稀釋反應物且有機相用10%濃度Na2S2O3溶液洗滌兩次且用5%濃度檸檬酸溶液洗滌一次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。以此方式獲得的醛不經進一步純化即進行反應。
將63mg(0.177mmol)中間物C52溶解於15ml二氯甲烷中，且添加52.4mg(0.247mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及20.2μl乙酸。在室溫下攪拌5分鐘之後，添加89.6mg(0.212mmol)上述醛，且在室溫下攪拌反應物20分鐘。在減壓下濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份之後，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物自乙腈/水中凍乾。由此得到71mg(理論值之53%，經2個步驟)(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二側氧基-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m/z=761(M+H)+。
將70mg(92μmol)此中間物溶解於15ml二氯甲烷中，冷卻混合 物至10℃且添加54μl三乙胺及25.5μl(0.23mmol)乙醯氧基乙醯氯。在室溫下攪拌1小時之後，添加相同量的酸氯化物及三乙胺，且在室溫下再攪拌1小時之後，再次添加。接著在室溫下再攪拌反應物30分鐘且接著在減壓下濃縮，且殘餘物藉由製備型HPLC純化。合併適當溶離份，蒸發溶劑且殘餘物自乙腈/水中凍乾之後，得到46.5mg(理論值之59%)醯基化中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53min；MS(ESIpos)：m/z=861(M+H)+。
將46mg(53μmol)此中間物溶解於5ml甲醇中，且添加2.7ml之2M氫氧化鋰溶液。在室溫下攪拌10分鐘之後，反應物用乙酸調節至pH 3-4且接著用15ml水稀釋。水相用乙酸乙酯萃取且有機相經硫酸鎂乾燥且濃縮。殘餘物自乙腈/水中凍乾，殘餘物在高真空下乾燥之後，得到37mg(理論值之90%)呈白色固體狀之標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(ESIpos)：m/z=729(M+H)+。
中間物C73
S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基矽烷基)丙醯基]-L-半胱胺酸
首先將619mg(0.86mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟 苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)饋入8.8ml二氯甲烷中，且添加87mg(0.86mmol)三乙胺及224mg(0.86mmol)N-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基氧基]吡咯啶-2,5-二酮。1小時之後，添加45mg(0.17mmol)N-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基氧基]吡咯啶-2,5-二酮。在室溫下攪拌反應混合物1小時。在減壓下濃縮混合物，將殘餘物溶解於二氯甲烷中且有機相接著用水及飽和碳酸氫鈉溶液洗滌兩次。有機相經硫酸鎂乾燥，經旋轉式蒸發器濃縮且在高真空下乾燥。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到602mg(71%，純度87%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.58min；MS(ESIpos)：m/z=861(M+H)+。
中間物C74
三氟乙酸/3-胺基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
將75mg(0.114mmol)中間物C58溶解於12.5ml DMF中且在65mg(0.11mmol)HATU及79μl N,N-二異丙基乙胺存在下、與78mg(0.171 mmol)中間物L75偶合。藉由製備型HPLC純化之後，將中間物溶解於20ml乙醇中且在室溫下、在氫氣標準壓力下、在10%鈀/活性碳上氫化1小時。接著濾出催化劑，在減壓下移除溶劑且藉由製備型HPLC純化產物。自乙腈/水1：1中凍乾，得到63mg(理論值之64%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.16min；MS(EIpos)：m/z=844[M+H]+。
中間物C75
(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯
將4.3g(12.2mmol)中間物C52溶解於525ml DCM中，且添加3.63g(17.12mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及8.4ml乙酸。在室溫下攪拌5分鐘之後，添加溶解於175ml DCM中之3.23g(11.85mmol)(2S)-4-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯(由(3S)-3-胺基-4-甲氧基-4-側氧基丁酸藉由經典方法製備)，且混合物在室溫下再攪拌45分鐘。混合物接著用DCM稀釋且用100ml飽和碳酸氫鈉溶液且接著用飽和氯化鈉溶液萃取兩次。有機相用硫酸鎂乾燥，過濾且濃 縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份，濃縮且在高真空下乾燥殘餘物，得到4.6g(理論值之61%)中間物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.97min；MS(ESIpos)：m/z=614.32(M+H)+。
將200mg(0.33mmol)此中間物溶解於10ml DCM中，且接著添加105μl三乙胺及77μl(0.717mmol)乙醯氧基乙醯氯。在室溫下攪拌混合物隔夜且接著在減壓下濃縮。將殘餘物溶解於乙酸乙酯中且用飽和碳酸氫鈉溶液且接著用飽和氯化鈉溶液萃取兩次。有機相經硫酸鎂乾燥且接著濃縮。由此得到213mg(75%)呈米色泡沫狀之標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=714(M+H)+。
中間物C76
N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧丙基-L-丙胺醯胺
標題化合物係由中間物C75根據經典的肽化學方法製備(利用氯化鋅移除Teoc保護基，在HATU存在下用N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸發生醯化，且在THF/水中用氫氧化鋰進行酯裂解)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.23min；MS(ESIpos)：m/z=818(M+H)+。
中間物C77
S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-側氧基丁醯基)-L-半胱胺酸
首先將4-第三丁氧基-4-側氧基丁酸(8.39mg，48.1μmol)饋入1.0ml DMF中，添加7.37mg(48.1μmol)水合1-羥基-1H-苯并三唑、15.5mg(48.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)雙二甲基胺基甲基鎓氟硼酸鹽及8.60μl(48.1μmol)N,N-二異丙基乙胺且混合物在室溫下攪拌10分鐘。首先將40.0mg(0.048mmol)S-(11-{(1R)-1-[1苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸三氟乙酸(1：1)(中間物C71)饋入1.0ml DMF中，添加25.4μl(141.9μmol)N,N-二異丙基乙胺中，向反應物中添加混合物且在室溫下攪拌反應混合物4小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到35.0mg(理論值之83%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.76min；MS(ESIpos)：m/z=873[M+H]+
中間物C78
11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸
首先將197mg(0.354mmol)[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(參見中間物C11之合成)饋入5.0ml二氯甲烷中，且將混合物加熱至40℃。在此溫度下，添加240μl(3.0mmol)吡啶及220μl(1.8mmol)4-氯-4-側氧基丁酸甲酯，且在室溫下攪拌混合物1小時。接著添加240μl(3.0mmol)吡啶及220μl(1.8mmol)4-氯-4-側氧基丁酸甲酯，且在室溫下攪拌混合物1小時。接著添加240μl(3.0mmol)吡啶及220μl(1.8mmol)4-氯-4-側氧基丁酸甲酯，且在室溫下攪拌混合物1小時。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相分別用5%濃度KHSO4溶液萃取三次。有機相用飽和NaCl溶液洗滌且經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到74.1mg(理論值之31%)11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.49min；MS(ESIpos)：m/z=670[M+H]+
首先將78.3mg(117μmol)11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15酸甲酯饋入4.0ml THF中，且添加800 μl甲醇、160μl水及230μl(230μmol)LiOH水溶液(1M)。反應混合物在室溫下攪拌3小時，用乙酸淬滅且藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)直接純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到64.8mg(理論值之85%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.61min；MS(ESIneg)：m/z=654[M-H]-
中間物C79
三氟乙酸/3-胺基-N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
首先將57.4mg(81.8μmol)11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-烷酸(中間物C69)饋入5.7ml DMF中，添加74.0mg(164μmol)三氟乙酸/3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)(中間物L75)、43μl(250μmol)N,N-二異丙基乙胺及62.2mg(164μmol)HATU且在室溫下攪拌 混合物1小時。反應混合物在室溫下攪拌1小時，用乙酸淬滅且藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)直接純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到52.4mg(理論值之63%)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.64min；MS(ESIpos)：m/z=1022[M]+
在氬氣下，首先將6.23mg(27.7μmol)乙酸鈀(II)饋入3.0ml二氯甲烷中，添加12μl(83μmol)三乙胺及89μl(550μmol)且攪拌混合物5分鐘。接著添加含有56.7mg(55.5μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯的3.0ml二氯甲烷，且混合物在室溫下攪拌隔夜。將混合物濃縮至幾乎乾燥，添加乙腈/水，且過濾混合物且藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到37.4mg(理論值之67%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：)：Rt=2.15min；MS(ESIpos)：m/z=888[M+H]+
中間物C80
S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-(甘胺醯基胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
在氬氣下，首先將43.4mg(95.1μmol)1-({N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15烷酸(中間物L90)饋入2.5ml DMF中，添加14.6mg(95.1μmol)水合1-羥基-1H-苯并三唑、30.5mg(95.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)雙二甲基胺基甲基鎓氟硼酸鹽及16.5μl(95.1μmol)N,N-二異丙基乙胺且攪拌混合物10分鐘。將79.0mg(95.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)溶解於2.5ml DMF中，添加49.5μl(285.3μmol)N,N-二異丙基乙胺且將混合物添加至反應物中。反應混合物在室溫下攪拌2小時且藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)直接純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到44.2mg(理論值之40%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法12)：Rt=2.57min；MS(ESIpos)：m/z=1156[M+H]+
將60.2mg(52.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)- 1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸懸浮於3.0ml乙醇，添加6.0mg鈀/活性碳(10%)且混合物在室溫及標準壓力下用氫氣1小時。兩次添加6.0mg鈀/活性碳(10%)且混合物在室溫及標準壓力下用氫氣氫化1小時。濾出催化劑且使反應混合物在減壓下脫除溶劑且在高真空下乾燥。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到29.4mg(理論值之50%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=3.77min；MS(ESIpos)：m/z=1021[M+H]+
中間物C81
(R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-環己基甲胺
在氬氣下及在-78℃，將含有18.7ml(37.45mmol)氯化環己基鎂的乙醚(2M)添加至3.12ml(6.24mmol)二甲基鋅於甲苯(2.0M)中之溶液中，且混合物在-78℃攪拌30分鐘。接著在-78℃添加5.0g(12.48mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺於THF中之溶液，且反應混合物在此溫度下攪拌1小時且接著在室溫下攪拌4小時。在-78℃，接著添加飽和氯化銨溶液且允許反應混合物升溫至室溫。混合物用乙酸乙酯稀釋且用 水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。使用Biotage Isolera(矽膠，乙酸乙酯/環己烷25：75)純化殘餘物。由此得到1.59g(理論值之26%)中間物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.76min；MS(ESIneg)：m/z=483[M-H]-
在氬氣下，首先將264.0mg(0.54mmol)此中間物饋入0.5ml 1,4-二噁烷中，且接著添加1.36ml HCl之1,4-二噁烷溶液(4.0M)。在室溫下攪拌反應混合物1小時。添加二氯甲烷，且反應混合物用1M氫氧化鈉水溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。使用Biotage Isolera(矽膠，甲醇/二氯甲烷98：2)純化殘餘物。在減壓下蒸發溶劑且將為溶解於二氯甲烷中，用碳酸氫鈉溶液洗滌且經硫酸鈉乾燥。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到148mg(理論值之72%)標題化合物。
LC-MS(方法13)：Rt=2.07min；MS(ESIpos)：m/z=364[M-NH2]+
中間物C82
(3-{[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]胺基}丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
在氬氣下，將392.2mg(1.85mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及91.29mg(1.52mmol)乙酸添加至503.0mg(1.32mmol)1-[1-苯甲基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-環己基甲胺(中間物C81)於1.4ml二氯甲烷中之溶液中，且在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。接著添加574.6(2.38mmol)(3-側氧基丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯於二氯甲烷中的溶液，且在室溫下攪拌混合物隔夜。添加143mg(0.66mmol)(3-側氧基丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯之後，混合物進一步攪拌2小時。反應混合物用二氯甲烷稀釋且有機相分別用飽和碳酸鈉溶液及飽和NaCl溶液洗滌兩次，經硫酸鈉乾燥且濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到488g(理論值之63%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.89min；MS(ESIpos)：m/z=582(M+H)+.
中間物C83
(3-{[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基](氯乙醯基)胺基}丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
將280.0mg(2.77mmol)三乙胺及397.8mg(3.52mmol)氯乙醯氯經由4Å分子篩添加至487.9mg(0.84mmol)(3-{[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]胺基}丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C82)於8.40ml二氯甲烷中之溶液中，且在室溫下攪拌反應混合物6小時。反應混合物用二氯甲烷稀釋且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化銨溶液洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。 殘餘物不經純化即進一步使用。由此得到470mg(理論值之85%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.88min；MS(ESIpos)：m/z=680(M+Na)+。
中間物C84
S-{11-[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基}-L-半胱胺酸
將322.1mg(2.66mmol)L-半胱胺酸連同319.0mg(3.80mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於0.19ml水中。添加溶解於1.90ml異丙醇中的250.0mg(0.38mmol)(3-{[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環已基)甲基](氯乙醯基)胺基}丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C83)及693.8g(4.56mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一烷-7-烯。反應混合物在50℃攪拌3.5小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液反覆洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌一次。有機相經硫酸鈉乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到276mg(理論值之97%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.34min；MS(ESIpos)：m/z=744 (M+H)+。
中間物C85
S-{11-[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸
將34.8mg(0.27mmol)N,N-二異丙基乙胺添加至100mg(0.13mmol)S-{11-[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基}-L-半胱胺酸(1：1)(中間物C84)與41.5mg(0.13mmol)1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮於4.0ml DMF中之混合物中，且在室溫下攪拌反應混合物3小時。混合物不經處理即藉由製備型HPLC純化。由此得到88mg(理論值之70%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.71min；MS(ESIpos)：m/z=936(M+H)+。
中間物C86
11-[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2- 二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-烷酸
將161.65mg(1.17mmol)碳酸鉀添加至220.0mg(0.33mmol)(3-{[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基](氯乙醯基)胺基}丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C83)及39.02mg(0.37mmol)3-硫基丙酸於7.45ml甲醇及幾滴水中之混合物中。在50℃攪拌反應混合物4小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物不經處理即進一步使用。由此得到201mg(理論值之83%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.72min；MS(ESIneg)：m/z=726(M-H)-。
中間物C87
{13-[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-16-基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
將54.18mg(0.28mmol)N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(中間物L1)、71.01mg(0.50mmol)N,N-二異丙基乙胺、104.46mg(0.27mmol)HATU及0.23ml(0.14mmol)1-羥基-7-氮雜苯并三唑0.5M之DMF溶液添加至100mg(0.14mmol)11-[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-烷酸(中間物C86)於1.37ml DMF中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物5小時。混合物不經進一步處理即藉由製備型HPLC純化。由此得到41mg(理論值之33%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.61min；MS(ESIpos)：m/z=907(M+H)+。
中間物C88
3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯/三氟乙酸(1：1)
立體異構體混合物
將1.71g(8.05mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及0.40g(6.61mmol)乙酸添加至2.04mg(5.75mmol)(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中間物C52)於51ml二氯甲烷中之溶液中，且且在室溫下攪拌反應混合物5分鐘。接著添加1.32g(6.61mmol)3-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯於20ml二氯甲烷中之溶液，且在室溫下攪拌混合物隔夜。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相分別用飽和碳酸鈉溶液及飽和NaCl溶液洗滌兩次，經硫酸鎂乾燥且濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到1.86g(理論值之50%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=538(M+H-CF3CO2H)+。
中間物C89
3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
將1.36g(13.42mmol)三乙胺及2.13g(18.87mmol)氯乙醯氯經由4Å分子篩添加至2.89g(4.19mmol，80%純)3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(中間物C88)於42ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物5小時。混合物經旋轉式蒸發器濃縮，且藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到標題化合物之449mg(理論值之17%)異構體1及442mg(理論值之17%)異構體2。
異構體1 LC-MS(方法1)：Rt=2.74min；MS(ESIpos)：m/z=614(M+H)+。
異構體2 LC-MS(方法1)：Rt=2.78min；MS(ESIpos)：m/z=614(M+H)+。
中間物C90
S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸(異構體1)
將357.3mg(0.58mmol)L-半胱胺酸連同488.7mg(4.07mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於2.3ml水中。添加溶解於23.0ml異丙醇中的357.0mg(0.58mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(異構體1)(中間物C89，異構體1)及1.06g(6.98mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯。在50℃攪拌反應混合物3小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液反覆洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌一次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物不經純化即進一步使用。由此得到255.0mg(理論值之62%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=699(M+H)+。
中間物C91
S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸(異構體2)
將453.5mg(3.74mmol)L-半胱胺酸連同449.2mg(5.35mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於2.1ml水中。添加溶解於21.1ml異丙醇中的3287.4mg(0.54mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(中間物C89，異構體2)及0.98g(6.42mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯。在50℃攪拌反應混合物3小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液反覆洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌一次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物不經純化即進一步使用。由此得到221.0mg(理論值之59%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m/z=699(M+H)+。
中間物C92
S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(異構體1)
將18.49mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺添加至50mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸(中間物C90)與22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮於3.3ml DMF中之混合物中，且在室溫下攪拌反應混合物45分鐘。混合物不經處理即藉由製備型HPLC純化。由此得到65mg(理論值之100%，71%純)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.31min；MS(ESIpos)：m/z=892(M+H)+。
中間物C93
S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(異構體2)
將18.49mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺添加至50.0mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸(中間物C91)與22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮於3.0ml DMF中之混合物中，且在室溫下攪拌反應混合物90分鐘。混合物不經處理即藉由製備型HPLC純化。由此得到63mg(理論值之98%，73%純)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=892(M+H)+。
中間物C94
S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸(異構體1)
將18.5mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺添加至50.0mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸(中間物C90)與18.0mg(0.07mmol)1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮於3.3ml DMF中之混合物中，且在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相用飽和NH4Cl溶液反覆洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌一次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物不經進一步純化即使用。由此得到57mg(理論值之81%，85%純)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=836(M+H)+。
中間物C95
3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙酸(異構體1)
將302.5mg(2.19mmol)碳酸鉀添加至384.0mg(0.62mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(中間物C89，異構體1)及73.0mg(0.69mmol)3-硫基丙酸於14ml甲醇及幾滴水中之混合物中。在50℃攪拌反應混合物2.5小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物不經處理即進一步使用。由此得到358.0mg(理論值之84%)題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=684(M+H)+。
中間物C96
3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙酸(異構體2)
將226.0mg(1.64mmol)碳酸鉀添加至287.0mg(0.45mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(中間物C89，異構體2)及54.6mg(0.51mmol)3-硫基丙酸於14ml甲醇及幾滴水中之混合物中。在50℃攪拌反應混合物2.5小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物不經處理即進一步使用。由此得到318.7mg(理論值之88%，88%純)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=684(M+H)+。
中間物C97
3-[2-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三側氧基-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十四烷-1-基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(異構體2)
在氬氣下，將14.17mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺及27.80mg(0.07mmol)HATU添加至25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙酸(中間物C96)於2.81ml DMF中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。接著添加22.75mg(0.07mmol)N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺-乙烷(1：1)三氟乙酸(中間物L1)於1.4ml DMF及5mg(0.04mmol)N,N-二異丙基乙胺中之溶液，且混合物在室溫下攪拌隔夜。添加水且用二氯甲烷萃取混合物。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物不經處理即進一步使用。由此得到26mg(理論值之84%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.39min；MS(ESIpos)：m/z=863(M+H)+。
中間物C98
3-[2-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三側氧基-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十八烷-1-基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(異構體2)
在氬氣下，將14.17mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺及27.80mg(0.07mmol)HATU添加至25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙酸(中間物C96)於2.81ml DMF中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。接著添加37.30mg(0.07mmol)N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺-乙烷(1：1)三氟乙酸於1.4ml DMF中之溶液及5mg(0.04mmol)N,N-二異丙基乙胺，且混合物在室溫下攪拌隔夜。添加水且用二氯甲烷萃取混合物。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物不經進一步純化即使用。由此得到22mg(理論值之63%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.54min；MS(ESIpos)：m/z=919(M+H)+。
中間物C99
3-[2-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,19-三側氧基-12,15-二氧雜-5-硫雜-2,9,18-三氮雜二十四烷-1-基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯 (異構體2)
在氬氣下，將14.17mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺及27.80mg(0.07mmol)HATU添加至25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙酸(中間物C96)於2.81ml DMF中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。接著添加35.05mg(0.07mmol)N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺-乙烷(1：1)三氟乙酸(中間物L82)於1.4ml DMF及5mg(0.04mmol)N,N-二異丙基乙胺中之溶液，且在室溫下攪拌混合物隔夜。添加水且用二氯甲烷萃取混合物。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到25mg(理論值之60%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=4.52min；MS(ESIpos)：m/z=1007(M+H)+。
中間物C100
{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
將22.2mg(0.068mmol)(2R)-N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(1：1)三氟乙酸添加至45mg(0.068mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸(中間物C58)於5.8ml DMF中之溶液中。在室溫下攪拌30分鐘後，向混合物中添加39mg(0.10mmol)HATU及36mg(0.27mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌反應混合物1小時。混合物不經處理即藉由製備型HPLC純化。由此得到7mg(理論值之12%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z 851(M+H)+。
中間物C101
三氟乙酸/(2S)-4-[(乙醯氧基乙醯基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-胺基丁酸甲酯(1：1)
將4.3g(12.2mmol)中間物C52溶解於525ml DCM中，且添加3.63g(17.12mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉及8.4ml乙酸。在室溫下攪拌5分鐘之後，添加溶解於175ml DCM中的3.23g(11.85mmol)(2S)-4-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯(使用經典方法，由(3S)-3-胺基-4-甲氧基-4-側氧基丁酸製備)，且混合物在室溫下進一步攪拌45分鐘。混合物接著用DCM稀釋且用100ml飽和碳酸氫鈉溶液且接著用飽和氯化鈉溶液萃取兩次。有機相經硫酸鎂乾燥，過濾且接著濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份，濃縮且在高真空下乾燥殘餘物，得到4.6g(理論值之61%)中間物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.97min；MS(ESIpos)：m/z=614.32(M+H)+。
首先將2.06g(3.36mmol)此中間物饋入76ml DCM中且在2.1ml三乙胺存在下、用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-側氧基乙酯發生醯基化。在室溫下攪拌20小時之後，再添加0.36ml乙酸2-氯-2-側氧基乙酯及0.94ml三乙胺，且混合物在室溫下再攪拌15分鐘。混合物接著用500ml乙酸乙酯稀釋且依次用300ml 5%濃度檸檬酸萃取兩次，用300ml飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次且用100ml飽和氯化鈉溶液萃取一次且接著經硫酸鎂乾燥且濃縮。在高真空下乾燥，得到2.17g(理論值之79%)之經保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIpos)：m/z=714(M+H)+。
將321mg(0.342mmol)此中間物溶解於7ml 2,2,2-三氟乙醇中。 添加279.5mg(2.05mmol)氯化鋅，且混合物在50℃攪拌2小時。接著添加599mg(2.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸及2ml 0.1%濃度三氟乙酸水溶液，且混合物隨後在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到60mg(理論值之26%)標題化合物，其仍含有一些去乙醯化化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min及0.95min；MS(ESIpos)：m/z=528及570(M+H)+。
中間物C102
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}丁酸.
首先，類似於中間物C2，使用(2S)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸苯甲酯使中間物C52發生還原性烷基化。隨後，用乙酸2-氯-2-側氧基乙酯使二級胺基發生醯基化，且最後使用氫氧化鋰於甲醇中之2M溶液使兩個酯基發生水解。
LC-MS(方法1)：Rt=1.31min；MS(ESIpos)：m/z=646(M-H)-。
中間物C103
N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-{[2-(三 甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-麩胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
標題化合物如下製備：首先，在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下、在DMF中使151mg(0.23mmol)中間物C102與128mg(0.234mmol)中間物L98偶合。接著藉由在室溫下、在標準氫氣壓力下、在10%鈀/活性碳上加氫30分鐘來移除Z保護基，得到標題化合物。
產率：理論值之30%，經2個步驟
LC-MS(方法1)：Rt=1.14min；MS(ESIpos)：m/z=929(M+H)+。
中間物C104
(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-氟吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
1.87g(8.84mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉經由4Å分子篩添加至2.24g(6.31mmol)(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺於56.0ml二氯甲烷中之溶液中，且在室溫下攪拌混合物15分鐘。接著添加2.20g(7.58mmol)(3R,4S)-3-氟-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(文獻：WO 2014/151030A1)，且在室溫下攪拌反應混合物3.5小時。混合物用二氯甲烷稀釋且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液及水洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到1.39g(理論值之24%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.15min；MS(ESIpos)：m/z=600(M+H)+。
中間物C105
(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}-4-氟吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
將295.0mg(2.91mmol)三乙胺及418.9mg(3.71mmol)氯乙醯氯經由4Å分子篩添加至692.8mg(0.88mmol)(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)甲基]-4-氟吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C104)於8.7ml二氯甲烷中之溶液中，且在室溫下攪拌反應混合物2.5小時。反應混合物用二氯甲烷稀釋且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化銨溶液洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。再次，將295.0mg(2.91mmol)三乙胺及418.9mg(3.71mmol)氯乙醯氯經由4Å分子篩添加至含有殘餘物之8.7ml二氯甲烷中，且在室溫下攪拌反應混合物3小時。反應混合物用二氯甲烷稀釋且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化銨溶液洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。有機相經硫酸鈉乾燥，濃縮且不經純化即進一步使用。由此得到691mg(理論值之74%，64%純)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.78min；MS(ESIpos)：m/z=676(M+H)+。
中間物C106
3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙酸
將316mg(2.29mmol)碳酸鉀添加至691.0mg(0.65mmol)(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}-4-氟吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C105)與76.3mg(0.72mmol)3-硫基丙酸於15ml甲醇及幾滴水中之混合物中。在50℃攪拌反應混合物1.5小時。向反應混合物中添加乙酸乙酯，且有機相反覆地用水洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物不經處理即進一步使用。由此得到502mg(理論值之67%，65%純)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.48min；MS(ESIneg)：m/z=744(M-H)-。
中間物C107
S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基 丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸
將203.6mg(1.68mmol)L-半胱胺酸連同201.7mg(2.40mmol)碳酸氫鈉一起懸浮於0.95ml水中。添加溶解於9.5ml異丙醇中的170.0mg(0.24mmol)(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]甲基}-4-氟吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物105)，及438.5mg(2.40mmol)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一烷-7-烯。在50℃攪拌反應混合物3小時。向混合物中添加乙酸乙酯且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液反覆洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到152mg(理論值之83%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.26min；MS(ESIpos)：m/z=762(M+H)+。
中間物C115
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3- ({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(2-羧基乙基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]-L-丙胺醯胺
將11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-烷酸(200mg，285μmol)(中間物C69)溶解於10ml三氟乙醇中。添加氯化鋅(233mg，1.71mmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。分兩次以上添加氯化鋅(233mg，1.71mmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(1.50g，5.13mmol)，隨後添加水(0.1% TFA)，且混合物接著在減壓下濃縮。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此產生162mg(理論值之85%)化合物3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)丙酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIneg)：m/z=556[M-H]-
將3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)丙酸/三氟乙酸(1：1)(80.0mg，119μmol)溶解於5.0ml DMF中，且添加N-[6-(2,5-二側 氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(69.4mg，82%純，119μmol)(中間物L88)及N,N-二異丙基乙胺(41μl，240μmol)。反應混合物在室溫下攪拌2小時30分鐘，且添加水(0.1% TFA)。濃縮混合物且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到82.2mg(理論值之75%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.17min；MS(ESIpos)：m/z=921[M+H]+
中間物C116
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)胺基]-3-側氧基丙基}硫基)乙醯基]胺基)丙基]-L-丙胺醯胺
在氬氣下，首先將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(2-羧基乙基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]-L-丙胺醯胺(56.7mg，61.6μmol)(中間物C115)及β-丙胺酸第三丁酯鹽酸鹽(1：1)(13.4mg，73.9μmol)饋入3.0ml DMF中，且添加HATU(28.1 mg，73.9μmol)及N,N-二異丙基乙胺(32μl，180μmol)。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘且接著直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到41.4mg(理論值之64%)化合物N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-(14-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,8,13-三側氧基-3-氧雜-11-硫雜-7,14-二氮雜十七烷-17-基)-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法1)：Rt=1.28min；MS(ESIpos)：m/z=1048[M+H]+
將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-(14-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,8,13-三側氧基-3-氧雜-11-硫雜-7,14-二氮雜十七烷-17-基)-L-丙胺醯胺(39.3mg，37.5μmol)溶解於2.5ml三氟乙醇中。添加氯化鋅(30.7mg，225mmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。再次添加氯化鋅(30.7mg，225μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(131mg，450μmol)，隨後添加水(0.1% TFA)，且接著在減壓下濃縮混合物。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到30mg(理論值之81%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m/z=992[M+H]+
中間物L1
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)
標題化合物係藉由經典的肽化學方法、由市售(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸及(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯製備。
HPLC(方法11)：Rt=0.19min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=198(M+H)+。
中間物L2
三氟乙酸/rel-(1R,2S)-2-胺基-N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係由50mg(0.214mmol)市售順-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-環戊烷甲酸及60mg(0.235mmol)同樣市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)經與EDC/HOBT偶合及隨後用TFA脫除保護基而製備。由此得到36mg(理論值之38%，經2個步驟)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L3
三氟乙酸/(1S,2R)-2-胺基-N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係由50mg(0.214mmol)市售順(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷甲酸及72mg(0.283mmol)同樣市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)經與EDC/HOBT偶合及隨後用TFA脫除保護基而製備。由此得到13mg(理論值之16%，經2個步驟)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.2min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L4
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)環己烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售1-[(4-{[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]羰基}環己基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮及(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯藉由經典的肽化學方法製備。
HPLC(方法11)：Rt=0.26min；
LC-MS(方法1)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=280(M+H)+。
中間物L5
三氟乙酸/N-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-β-丙胺醯胺(1：1)
標題化合物係由市售1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮及N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸藉由經典的肽化學方法製備。
HPLC(方法11)：Rt=0.22min； LC-MS(方法1)：Rt=0.22min；MS(ESIpos)：m/z=260(M+H)+。
中間物L6
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物如下製備：首先，在EDC/HOBT存在下，使市售6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸與經部分保護的肽L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸第三丁酯(藉由經典的肽化學方法製備)偶合。隨後為在溫和條件下、在室溫下、在含有5%濃度三氟乙酸的DCM中攪拌來脫除胺基上的保護基，得到標題化合物，產率37%。
HPLC(方法11)：Rt=1.29min； LC-MS(方法1)：Rt=0.62min；MS(ESIpos)：m/z=566(M+H)+。
中間物L7
三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧基- 2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係根據經典的肽化學方法、由市售1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮如下製備：依序與N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸在HATU存在下偶合，用TFA脫除保護基，與N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合，用TFA脫除保護基，與N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合且再用TFA脫除保護基。獲得32mg標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.31min； LC-MS(方法1)：Rt=0.47min；MS(ESIpos)：m/z=516(M+H)+。
中間物L8
三氟乙酸/L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係根據經典的肽化學方法、由市售1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮如下製備：依序與N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯 基-L-鳥胺酸在HATU存在下偶合，用TFA脫除保護基，與N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合且再用TFA脫除保護基。獲得171mg標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.23min； LC-MS(方法7)：Rt=0.3min；MS(ESIpos)：m/z=417(M+H)+。
中間物L9
三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-側氧基乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
類似於中間物L7，由市售(4-胺基苯基)乙酸甲酯製備標題化合物。獲得320mg標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.45min； LC-MS(方法1)：Rt=0.48min；MS(ESIpos)：m/z=493(M+H)+。
中間物L10
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-rel-N6-{[(1R,2S)-2-胺基環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：2)
標題化合物係由中間物L6如下製備：在EDC/HOBT存在下，與順-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1-環戊烷甲酸偶合，且隨後用TFA脫除保護基。由此得到12mg(理論值之52%，經2個步驟)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.45min； LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+。
中間物L11
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{[(1S,2R)-2-胺基環戊基]羰基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：2)
標題化合物係由中間物L6如下製備：在EDC/HOBT存在下，與(1S,2R)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷甲酸偶合，且隨後用TFA脫 除保護基。由此得到11mg(理論值之39%，經2個步驟)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.45min； LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+。
中間物L12
三氟乙酸/1-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
將381mg(2.46mmol)2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-甲酸甲酯添加至228mg(1.12mmol)溶解於7ml二噁烷/水1：1中的[2-(2-胺基乙氧基)乙基]胺基甲酸第三丁酯。接著添加1.2ml飽和碳酸氫鈉溶液且在室溫下攪拌反應物。攪拌總共5天且2次進一步添加相同量的碳酸氫鈉溶液之後，藉由三氟乙酸酸化來處理反應物，在旋轉式蒸發器上濃縮且藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份，在減壓下移除溶劑且殘餘物自乙腈/水1：1中凍乾。
將殘餘物溶解於3ml二氯甲烷中，且添加1ml三氟乙酸。在室溫下攪拌15分鐘之後，在減壓下移除溶劑且殘餘物自乙腈/水1：1中凍乾。由此得到70mg(理論值之67%，經2個步驟)呈樹脂殘餘物狀之標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min； LC-MS(方法1)：Rt=0.18min；MS(ESIpos)：m/z=185(M+H)+。
中間物L13
三氟乙酸/N2-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-離胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物如下製備：使(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸與N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸第三丁酯鹽酸鹽(1：1)在EDC/HOBT存在下偶合，且隨後類似於中間物L6來溫和移除第三丁氧基羰基保護基。
HPLC(方法11)：Rt=0.42min； LC-MS(方法1)：Rt=0.43min；MS(ESIpos)：m/z=340(M+H)+。
中間物L14
三氟乙酸/1-[2-(4-胺基哌嗪-1-基)-2-側氧基乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
類似於中間物L2，由哌嗪-1-基胺基甲酸第三丁酯及(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸經2個步驟製備標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min； LC-MS(方法3)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=239(M+H)+。
中間物L15
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙醯胺(1：1)
將2.93g(10.58mmol)3-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙 酸第三丁酯溶解於100ml二噁烷/水1：1中，且添加3.28g(21.15mmol)2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-甲酸甲酯及飽和碳酸氫鈉溶液直至達到pH 6-7。在室溫下攪拌溶液30分鐘且接著在減壓下蒸發1,4-二噁烷。接著添加200ml水，且混合物分別用300ml乙酸乙酯萃取三次。合併有機萃取物，經硫酸鎂乾燥且過濾。濃縮得到呈褐色油狀之3-(2-{2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸第三丁酯，接著在高真空下乾燥。
HPLC(方法11)：Rt=1.5min； LC-MS(方法3)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=375(M+NH4)+。
此中間物藉由標準方法(用TFA脫除保護基，與(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯偶合且用TFA再脫除保護基)轉化成標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min； LC-MS(方法3)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=344(M+H)+。
中間物L16
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
將535mg(1.73mmol)市售1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮及930ml N,N-二異丙基乙胺添加至266mg(1.33mmol)L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸於24ml DMF中之溶液中。反應物於超音波浴中處理24小時且接著在減壓下濃 縮至乾燥。保留的殘餘物藉由製備型HPCL純化且在濃縮適當溶離份及在高真空下乾燥殘餘物之後，得到337mg(理論值之50%)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.4min； LC-MS(方法3)：Rt=0.58min；MS(ESIpos)：m/z=468(M+H)+。
中間物L17
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-L-離胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物如下製備：首先使172mg(0.37mmol)中間物L16與125mg(0.37mmol)N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸第三丁酯鹽酸鹽(1：1)在EDC/HOBT及N,N-二異丙基乙胺存在下偶合且接著在溫和條件下、在室溫下、在含有10%濃度三氟乙酸的DCM中攪拌2小時來脫除胺基保護基。自乙腈/水中冷凍乾燥，經2個步驟得到194mg(理論值之49%)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.1min； LC-MS(方法1)：Rt=0.58min；MS(ESIpos)：m/z=652(M+H)+。
中間物L18
三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2-甲氧基-2-側氧基乙基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係根據經典的肽化學方法、類似於中間物L7、由(4-胺基苯基)乙酸甲酯如下製備：依序在HATU存在下連接N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸，用TFA脫除保護基，與N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合，用TFA脫除保護基，與N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合且再用TFA脫除保護基。獲得330mg標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.29min； LC-MS(方法1)：Rt=0.41min；MS(ESIpos)：m/z=465(M+H)+。
中間物L19
三氟乙酸/L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-(4-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}苯基)-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係由1,4-苯二胺、依序根據經典的肽化學方法製備。在第一步驟中，942mg(8.72mmol)1,4-苯二胺在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下用0.8g(2.9mmol)N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸發生單醯基化。在第二步驟中，以類似方式，在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，用(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸使第二苯胺胺基發生醯基化。用TFA脫除保護基，與N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合且用TFA再脫除 保護基，接著以3個另外的合成步驟得到標題化合物，藉由此路徑獲得148mg。
LC-MS(方法1)：Rt=0.21min；MS(ESIpos)：m/z=474(M+H)+。
LC-MS(方法4)：Rt=0.2min；MS(ESIpos)：m/z=474(M+H)+。
中間物L20
三氟乙酸/L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係根據經典的肽化學方法、類似於中間物L8、由市售1-(4-胺基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮製備：依序地，在HATU存在下，與N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸偶合，用TFA脫除保護基，與N-(第三丁氧基羰基)-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合且再用TFA脫除保護基。獲得171mg標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.28min； LC-MS(方法1)：Rt=0.39min；MS(ESIpos)：m/z=445(M+H)+。
中間物L21
L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-側氧基乙基)苯基]-L-離胺酸醯胺
標題化合物係根據經典的肽化學方法、由市售0.42g(2.56mmol)(4-胺基苯基)乙酸甲酯如下製備：依序地，與N6-(第三丁氧基羰基)-N2-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-離胺酸在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下偶合，用哌啶脫除保護基，在N,N-二異丙基乙胺存在下與N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合且隨後在10%鈀/活性碳上氫解移除苯甲氧羰基保護基。由此得到360mg(理論值之32%，經4個步驟)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.5min； LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m/z=493(M+H)+。
中間物L22
三氟乙酸/N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N-{4-[(2S)-2-胺基-3-甲氧基-3-側氧基丙基]苯基}-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物係依序根據經典的肽化學方法、由N-(第三丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯丙胺酸製備。在第一步驟中，首先將2.5g(8.06mmol)此起始物質轉化成銫鹽且接著使用含有碘甲烷的DMF轉化成甲酯。
在10%鈀/活性碳上，在甲醇中發生氫解，接著將硝基轉化成胺基。
以此方式產生的胺基接著使用N5-胺甲醯基-N2-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-鳥胺酸、在DMF中、在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下發生醯基化。在下一步驟中，在DMF中使用哌啶移除Fmoc基團。
接著在DMF中，在1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽、水合1-羥基-1H-苯并三唑及N,N-二異丙基乙胺存在下，使用N-[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]-L-纈胺酸進行偶合且最後使用三氟乙酸移除第三丁氧基羰基。
HPLC(方法11)：Rt=1.6min； LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m/z=673(M+H)+。
中間物L23
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-β-丙胺醯胺(1：1)
標題化合物係由市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由在EDCI/HOBT及N,N-二異丙基乙胺存在下與N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸偶合且隨後用三氟乙酸脫除保護基來製備。
HPLC(方法11)：Rt=0.19min.
中間物L24
三氟乙酸/1-胺基-N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環丙烷甲醯胺(1：1)
將114mg(0.67mmol)市售1-[(第三丁氧基羰基)胺基]環丙烷-甲酸溶解於25ml DCM中，添加110mg(0.623mmol)市售三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)及395μl N,N-二異丙基乙胺且將混合物冷卻至-10℃。接著添加217mg(0.793mmol)2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽，且在室溫下攪拌混合物2小時。混合物接著用乙酸乙酯稀釋且依次用10%濃度檸檬酸、飽和碳酸氫鈉溶液及飽和氯化鈉溶液萃取，接著經硫酸鎂乾燥且濃縮。在高真空下乾燥，得到152mg經保護的中間物。
接著將此等物溶解於10ml DCM中且用1ml三氟乙酸脫除保護基。自乙腈/水中凍乾，得到158mg(理論值之71%，經2個步驟)標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=0.19min。
LC-MS(方法3)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=224(M+H)+。
中間物L25
N-[31-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
將31.4mg(0.17mmol)纈胺醯基-L-丙胺酸溶解於3.0ml DMF中，且添加115.0mg(0.17mmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)- N-{27-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-1-基}丙醯胺及33.7mg(0.33mmol)三乙胺。在室溫下攪拌混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到74.1mg(理論值之58%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.61min；MS(ESIpos)：m/z=763[M+H]+。
中間物L26
L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
將600.0mg(1.58mmol)N2-[(苯甲氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸懸浮於25.0ml水/乙醇/THF(1：1：0.5)中，添加鈀/碳(10%)且混合物在標準壓力下、在室溫下用氫氣氫化5小時。濾出催化劑且在減壓下蒸發溶劑。所得化合物不經進一步純化即用於下一步驟中。
LC-MS(方法1)：Rt=0.42min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+。
180mg(0.73mmol)N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解於5.0ml DMF中，且添加74.0mg(0.73mmol)三乙胺。接著添加254.6mg(0.73mmol)N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯及74.0mg(0.73mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物3.5小時。反應溶液直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物 在高真空下乾燥。由此得到294.1mg(理論值之76%)N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480[M+H]+。
首先將272.2mg(0.57mmol)N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸饋入20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中，且添加27.2mg鈀/活性碳。混合物在室溫下、在標準壓力下用氫氣氫化5小時。藉助於矽藻土(R)過濾混合物且用乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)洗滌濾餅。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。標題化合物(182mg，理論值之72%)不經進一步純化即用於下一反應步驟中。
LC-MS(方法1)：Rt=0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+。
中間物L27
N-[31-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
首先將30mg(0.07mmol)L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸(中間物L26)及46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-1-基}丙醯胺饋入於1.5ml DMF中，且添加6.8mg(0.07mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應溶液 隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到55.6mg(理論值之90%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m/z=920[M+H]+。
中間物L28
3-甲醯基-4-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
首先將461.7mg(1.15mmol)4-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)吡咯啶-1,3-二甲酸1-第三丁酯3-乙酯(此化合物根據WO 2006/066896之文獻程序製備)饋入5.0ml無水二氯甲烷中且將混合物冷卻至-78℃。接著緩慢逐滴添加326.2mg(2.29mmol)二異丁基氫化鋁溶液(1M，於THF中)且混合物在-78℃攪拌2小時(藉由薄層層析(石油醚/乙酸乙酯=3：1)監測)。逐滴添加溶解於60ml水中的1.3g(4.59mmol)酒石酸鉀鈉且允許反應混合物升溫至室溫。向反應混合物中添加乙酸乙酯且水相用乙酸乙酯萃取三次。合併之有機相用飽和NaCl溶液洗滌一次且經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到629.0mg呈粗產物形式之標題化合物，其不經進一步純化即緊接著用於下一反應步驟中。
中間物L29
3-甲醯基-4-[({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
非對映異構體之混合物。
首先將807.1mg(2.34mmol)3-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(根據WO 2006/100036之文獻程序製備)饋入8.0ml二氯甲烷中，且添加236.4mg(2.34mmol)三乙胺。在0℃，逐滴添加267.6mg(2.34mmol)甲烷磺醯氯，且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。再添加133.8mg(1.17mmol)甲烷磺醯氯及118.2mg(1.17mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。混合物用二氯甲烷稀釋且有機相分別用飽和碳酸氫鈉溶液、5%濃度硫酸氫鉀溶液及飽和NaCl溶液洗滌一次。經硫酸鎂乾燥之後，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在Biotage Isolera(矽膠，管柱50g SNAP，流速66ml/min，環己烷/乙酸乙酯)上純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到402.0mg(理論值之41%)化合物3-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲磺醯基)氧基]甲基}吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=424[M+H]+。
首先將400.0mg(0.94mmol)3-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧 基}甲基)-4-{[(甲磺醯基)氧基]甲基}吡咯啶-1-甲酸第三丁酯饋入5.0ml DMF中，且添加98.2mg(1.51mmol)疊氮化鈉。反應混合物40℃攪拌10小時。接著再添加30.7mg(0.47mmol)疊氮化鈉，且混合物在40℃再攪拌10小時。添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥之後，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到309.5mg(理論值之89%)化合物3-(疊氮基甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。化合物不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
LC-MS(方法1)：Rt=1.50min；MS(ESIpos)：m/z=371[M+H]+。
將250mg(0.68mmol)3-(疊氮基甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯溶解於10.0ml乙酸乙酯/乙醇(1：1)中，且添加25.0mg鈀/活性碳(10%)。混合物在室溫下、在標準壓力下用氫氣氫化8小時。經由矽藻土(R)過濾反應物且用乙酸乙酯充分地洗滌濾餅。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到226.2mg(理論值之82%)化合物3-(胺基甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。化合物不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=345[M+H]+。
將715.0mg(2.08mmol)3-(胺基甲基)-4-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯溶解於15.0ml THF中，且添加2.28ml(2.28mmol)TBAF溶液(1M於THF中)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物(1.54g)不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
LC-MS(方法1)：Rt=0.41min；MS(ESIpos)：m/z=231[M+H]+。
首先將1.54g(4.88mmol)3-(胺基甲基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯饋入1,4-二噁烷中，且添加541.8mg(4.88mmol)氯化鈣(無 水)及488.6mg(4.88mmol)碳酸鈣且劇烈攪拌混合物。接著添加592.8mg(5.86mmol)三乙胺及1.52g(5.86mmol)1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加644.9mg(10.7mmol)HOAc及乙酸乙酯。有機相用水洗滌兩次且用飽和NaCl溶液洗滌一次。經硫酸鎂乾燥之後，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇=100：1)。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到346.9mg(理論值之19%)化合物3-(羥基甲基)-4-[({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=375[M+H]+。
首先將804.0mg(2.15mmol)3-(羥基甲基)-4-[({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)甲基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯饋入20.0ml氯仿及20.0ml 0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。接著添加59.7mg(0.22mmol)氯化肆正丁基銨、429.9mg(3.22mmol)N-氯丁二醯亞胺及33.5mg(0.22mmol)TEMPO且反應混合物在室溫下劇烈攪拌隔夜。分離有機相且在減壓下脫除溶劑。殘餘物藉由矽膠層析(移動相：環己烷/乙酸乙酯=3：1)純化。由此得到517.0mg(理論值之46%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.13min；MS(ESIpos)：m/z=373[M+H]+。
中間物L30
3-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-4-甲醯基吡咯啶-1-甲酸第三丁酯
立體異構體混合物
首先將250.0mg(0.72mmol)3-({[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}甲基)-4-(羥甲基)吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(該化合物根據WO2006/100036之文獻程序製備)饋入12.5ml二氯甲烷/DMSO(4：1)中，且添加219.6mg(2.17mmol)三乙胺。在2℃，逐進添加345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶複合物且混合物在2℃攪拌3小時。再漸進添加345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶複合物且在室溫下攪拌混合物17小時。將反應混合物分配於二氯甲烷與水之間。水相用二氯甲烷萃取三次且合併之有機相用水洗滌一次且經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物不經進一步純化即用於合成之下一步驟(薄層層析：石油醚/乙酸乙酯7：3)。
中間物L31
{[(第三丁氧基羰基)胺基]甲基}丙二酸二第三丁酯
將57.2g(488.27mmol)胺基甲酸第三丁酯、51.2ml(683.57mmol)37%濃度甲醛水溶液及25.9g(244.13mmol)碳酸鈉添加至600ml水中。溫熱混合物直至形成溶液且接著在室溫下攪拌16小時。所形 成的懸浮液用500ml二氯甲烷萃取且分離有機相，用飽和氯化鈉溶液洗滌且經硫酸鈉乾燥。混合物經旋轉式蒸發器濃縮且殘餘物在高真空下乾燥，得到結晶固體。將殘餘物溶解於1000ml無水THF中，且在室溫下逐滴添加322ml(3.414mol)乙酸酐與138ml(1.707mol)吡啶之混合物。反應混合物在室溫下攪拌16小時且接著經旋轉式蒸發器濃縮(在室溫下，使用水浴)。將殘餘物溶解於乙醚中且用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌三次且用飽和氯化鈉溶液洗滌一次。有機相經硫酸鈉乾燥且經旋轉式蒸發器濃縮且殘餘物在高真空下乾燥2天。將殘餘物溶解於2000ml無水THF中，且在冰冷卻下添加456ml(456.52mmol)之1M第三丁醇鉀於THF中之溶液。在0℃攪拌混合物20分鐘，且接著逐滴添加100.8g(456.52mmol)溶解於200ml無水THF中的丙二酸二第三丁酯。在室溫下攪拌混合物48小時，且接著添加水。反應混合物經旋轉式蒸發器濃縮且溶解於500ml乙酸乙酯中。混合物用500ml水及100ml飽和氯化鈉溶液洗滌且有機相經硫酸鈉乾燥。有機相經旋轉式蒸發器濃縮且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物藉由矽膠過濾來純化(移動相：環己烷/乙酸乙酯，梯度=30：1→5：1)。由此得到37.07g(理論值之22%)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.87min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+。
中間物L32
[3-羥基-2-(羥基甲基)丙基]胺基甲酸第三丁酯
將37.0g(107.11mmol)(乙醯氧基甲基)丙二酸二第三丁酯溶解於 1000ml無水THF中，且在冰冷卻下逐滴添加535.5ml(1071.10mmol)2M硼氫化鋰於THF中之溶液。逐滴添加19.3ml(1071.10mmol)水且在室溫下攪拌混合物4.5小時。反應混合物經旋轉式蒸發器濃縮且在高真空下乾燥。將殘餘物溶解於1500ml乙酸乙酯中，添加100ml水且混合物在水冷卻下攪拌(稍微放熱)30分鐘。分離有機相且用500ml乙酸乙酯萃取水相兩次。有機相經旋轉式蒸發器濃縮且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到20.7g(理論值之94%)目標化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=1.49min；MS(EIpos)：m/z=106[M-C5H8O2]+。
中間物L33
[3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-2-(羥基甲基)丙基]胺基甲酸第三丁酯
將20.00g(97.44mmol)[3-羥基-2-(羥基甲基)丙基]胺基甲酸第三丁酯溶解於1000ml無水二氯甲烷中，且在室溫下添加6.63g(97.44mmol)咪唑及16.16g(107.18mmol)第三丁基(氯)二甲基矽烷。反應混合物在室溫下攪拌16小時且用半濃縮氯化鈉溶液洗滌。水相用乙酸乙酯萃取且合併之有機相經硫酸鈉乾燥，經旋轉式蒸發器濃縮且在高真空下乾燥。由此得到28.50g(理論值之92%)目標化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.02(s,6H),0.86(s,9H),1.37(s,9H),1.58-1.73(m,1H),2.91(q,2H),3.33-3.36[m,(2H， 隱藏)]，3.53-3.58(m,2H),6.65-6.72(m,1H)。
中間物L34
(3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-2-甲醯基丙基)胺基甲酸第三丁酯
將12.65g(39.591mmol)[3-{[第三丁基(二甲基)矽烷基]氧基}-2-(羥基-甲基)丙基]胺基甲酸第三丁酯溶解於200ml二氯甲烷中，且在室溫下逐滴添加19.31g(45.53mmol)溶解於150ml二氯甲烷中的戴斯-馬丁高碘烷。在室溫下攪拌混合物2小時，接著添加250ml半濃縮碳酸氫鈉溶液及250ml 10%濃度硫代硫酸鈉溶液且攪拌混合物20分鐘。分離有機相，且用乙酸乙酯萃取水相。合併之有機相用300ml水洗滌，經硫酸鈉乾燥，經旋轉式蒸發器濃縮且在高真空下乾燥。由此得到11.35g(理論值之90%)目標化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.02(s,6H),0.84(s,9H),1.36(s,9H),1.48-1.51(m,1H),3.08-3.32[m,(1H，隱藏)]，3.50-3.58(m,2H),3.81-3.91(m,1H),6.71(t,1H),9.60(d,1H)。
中間物L35
(3-側氧基丙基)胺基甲酸第三丁酯
標題化合物係根據自文獻已知之方法製備(例如Jean Bastide等人，J.Med.Chem. 2003,46(16),3536-3545)。
中間物L36
N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
將100mg(0.57mmol)N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸溶解於4.0ml DMF中，且添加0.08ml(0.57mmol)三乙胺。接著添加199.0mg(0.57mmol)2,5-二側氧基吡咯啶-1-基-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺酸及0.08ml(0.57mmol)三乙胺。在室溫下攪拌混合物48小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/含0.1% TFA的水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到75.7mg(理論值之33%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.69min；MS(ESIpos)：m/z=409[M+H]+。
中間物L37
L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
將75.7mg(0.19mmol)中間物L36懸浮於25ml水/乙醇/THF中， 且添加7.5mg鈀/活性碳(10%)且混合物在室溫下、在標準壓力下用氫化4.5小時。濾出催化劑且使反應混合物在減壓下脫除溶劑且在高真空下乾燥。殘餘物不經進一步純化即用於下一步驟。由此得到64.9mg(理論值之93%)標題化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=275[M+H]+。
中間物L38
N-[31-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
首先將38.3mg(0.14mmol)中間物L37饋入3.0ml DMF中，且添加96.4mg(0.14mmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-1-基}丙醯胺及39.0μl(0.28mmol)三乙胺。在室溫下攪拌混合物隔夜。接著添加16.0μl(0.28mmol)HOAc，且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到58.9mg(理論值之45%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.61min；MS(ESIpos)：m/z=849[M+H]+。
中間物L39
(2-硫基乙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
首先將300mg(2.64mmol)2-.胺基乙烷硫醇鹽酸鹽(1：1)饋入3.0ml二氯甲烷中，且添加668.0mg(6.60mmol)三乙胺及719.1mg(2.77mmol)1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮。在室溫下攪拌混合物2天(藉由薄層層析監測：二氯甲烷/甲醇=100：1.5)。添加乙酸乙酯且反應混合物用水洗滌三次。有機相用飽和NaCl溶液洗滌兩次且經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。化合物不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
中間物L40
N-[31-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-29-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧雜-28-氮雜三十一烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
在室溫下，在標準壓力下，使用鈀/碳(10%)，使用氫氣將600mg(1.58mmol)N2-[(苯甲氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸在25.0ml水/乙醇/THF(1：1：0.5)中氫化。化合物N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+。
180.0mg(0.73mmol)N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解於5.0ml DMF中，且添加74.0mg(0.73mmol)三乙胺。添加254.6mg(0.73 mmol)N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯及74.0mg(0.73mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物3.5小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到294.1mg(理論值之76%)化合物N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480[M+H]+。
將272.2mg(0.57mmol)N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解於20ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中，添加27.2mg鈀/活性碳且混合物在標準壓力下及在室溫下用氫氣氫化。混合物經由矽藻土(R)過濾且濾餅用乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)充分地洗滌。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到182.0mg(理論值之72%)化合物L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+。
將30.0mg(0.07mmol)L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸及46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-27-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-1-基}丙醯胺溶解於1.5ml DMF中，且添加6.8mg(0.07mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到55.6mg(理論值之90%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.77min；MS(ESIpos)：m/z=920[M+H]+。
中間物L41
N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四 氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸
在室溫下，在標準壓力下，使用鈀/碳(10%)，使用氫氣將600mg(1.58mmol)N2-[(苯甲氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸在25.0ml水/乙醇/THF(1：1：0.5)中氫化。化合物N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIpos)：m/z=247[M+H]+。
180.0mg(0.73mmol)N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解於5.0ml DMF中，且添加74.0mg(0.73mmol)三乙胺。添加254.6mg(0.73mmol)N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯及74.0mg(0.73mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物3.5小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到294.1mg(理論值之76%)化合物N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=0.97min；MS(ESIpos)：m/z=480[M+H]+。
將272.2mg(0.57mmol)N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸溶解於20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)中，添加27.2mg鈀/活性碳且混合物在標準壓力下及在室溫下用氫氣氫化。混合物經由矽藻土(R)過濾且濾餅用乙酸乙酯/乙醇/THF(1：1：1)充分地洗滌。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到182.0mg(理論值之72%)化合物L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=0.53min；MS(ESIpos)：m/z=346[M+H]+。
將30.0mg(0.07mmol)L-纈胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸及34.3mg(0.07mmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-1-基}丙醯胺溶解於1.5ml DMF中，且添加6.8mg(0.07mmol)4-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到40.6mg(理論值之82%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m/z=744[M+H]+。
中間物L42
N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
首先將50.0mg(0.18mmol)L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L37)饋入DMF中，且添加93.6mg(0.18mmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-1-基}丙醯胺及36.9mg(0.37mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加21.9mg(0.37mmol)HOAc且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到20.6mg(理論值之14%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.55min；MS(ESIpos)：m/z=673[M+H]+。
中間物L43
N-[67-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-65-側氧基-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧雜-64-氮雜六十七烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸
首先將11.3mg(0.04mmol)L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸(中間物L37)饋入DMF中，且添加50.0mg(0.04mmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-63-側氧基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二 十氧雜六十三烷-1-基}丙醯胺及8.3mg(0.08mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加4.9mg(0.08mmol)HOAc且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到15.8mg(理論值之20%)標題化合物。
LC-MS(方法4)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1377[M+H]+。
中間物L44
N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
將73.3mg(0.39mmol)L-纈胺醯基-L-丙胺酸溶解於7.0ml DMF中，且添加200.0mg(0.39mmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-1-基}丙醯胺及78.8mg(0.78mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到103.3mg(理論值之45%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.58min；MS(ESIpos)：m/z=587[M+H]+。
中間物L45
(2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-側氧基丁酸第三丁酯
將2.00g(7.26mmol)N-(第三丁氧基羰基)-L-高絲胺酸第三丁酯溶解於90ml二氯甲烷中，且接著添加1.76ml吡啶及4.62g(10.90mmol)1,1,1-三乙醯氧基-1λ5,2-苯并碘氧雜環戊-3(1H)-酮(戴斯-馬丁高碘烷)。反應物在室溫下攪拌2小時且接著用200ml二氯甲烷稀釋且用10%濃度硫代硫酸鈉溶液萃取兩次且接著依次用5%濃度檸檬酸萃取兩次且用飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次。分離有機相，經硫酸鈉乾燥且接著在減壓下濃縮。向殘餘物中添加100ml乙醚及環己烷(v/v=1：1)且稍微濃縮混合物，形成白色沈澱物。將此物在抽吸下濾出。濾液經旋轉式蒸發器濃縮且在高真空下乾燥，得到1.74g(理論值之88%)呈淡黃色油狀之目標化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=274[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.38(s,18H),2.64-2.81(m,2H),4.31-4.36(m,1H),7.23(d,1H),9.59(s,1H)。
中間物L46
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-麩胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物如下製備：首先，在EDC/HOBT及N,N-二異丙基乙胺存在下，使200mg(0.79mmol)三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)與263mg(0.87mmol)(4S)-5-第三丁氧基-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-側氧基戊酸/三氟乙酸(1：1)發生偶合，且接著在溫和條件下、在室溫下、在含有10%濃度三氟乙酸的DCM中攪拌1小時來脫除胺基保護基。自乙腈/水中冷凍乾燥，經2個步驟得到85mg(理論值之20%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.37min；MS(ESIpos)：m/z=326[M+H]+。
中間物L47
三氟乙酸/β-丙胺醯基-L-丙胺醯基-N5-胺甲醯基-N-[4-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鳥胺醯胺(1：1)
標題化合物如下製備：使中間物L8與N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯偶合且隨後用TFA脫除保護基。
LC-MS(方法3)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=488(M+H)+。
中間物L48
三氟乙酸/(1R,2S)-2-胺基-N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷甲醯胺(1：1)
類似於中間物L2，由市售(1R,2S)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷甲酸製備標題化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=1.22min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L49
三氟乙酸/N-(溴乙醯基)-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物如下製備：首先，在二氯甲烷中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使市售溴乙酸酐與經部分保護的肽L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸第三丁酯(根據經典的肽化學方法製備)偶合。隨後為在溫和條件下、在室溫下、在含有10%濃度三氟乙酸的DCM中攪拌來脫除胺基上的保護基，得到標題化合物(產率49%，經2個步驟)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.09min；MS(ESIpos)：m/z=593及595(M+H)+。
中間物L50
三氟乙酸/(1S,3R)-3-胺基-N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售(1S,3R)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷甲酸及同樣市售的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由在N,N-二異丙基乙胺存在下與HATU偶合且隨後用TFA脫除保護基來製備。
HPLC(方法11)：Rt=0.2min；
LC-MS(方法3)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L51
三氟乙酸/(1R,3R)-3-胺基-N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售(1R,3R)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷甲酸及同樣市售的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由在N,N-二異丙基乙胺存在下與HATU偶合且隨後用TFA脫除保護基來 製備。
LC-MS(方法3)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=250(M-H)-。
中間物L52
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-溴乙醯胺(1：1)
將420mg(2.62mmol)(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯溶解於50ml二氯甲烷中，且添加817mg(3.15mmol)溴乙酸酐及913μl(5.24mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌反應物1小時且接著在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。
由此得到577mg經保護的中間物，接著將其溶解於50ml二氯甲烷中，且添加10ml三氟乙酸。在室溫下攪拌1小時之後，在減壓下濃縮反應物且殘餘物自乙腈/水中凍乾。由此得到705mg(理論值之65%)標題化合物。
LC-MS(方法3)：Rt=0.34min；MS(ESIpos)：m/z=181及183(M+H)+。
中間物L53
三氟乙酸/(1S,3S)-3-胺基-N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售(1S,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷甲 酸及同樣市售的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由在N,N-二異丙基乙胺存在下與HATU偶合且隨後用TFA脫除保護基來製備。
HPLC(方法11)：Rt=0.19min； LC-MS(方法3)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=250(M-H)-。
中間物L54
三氟乙酸/(1R,3S)-3-胺基-N-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙基]環戊烷甲醯胺(1：1)
標題化合物係由市售(1R,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷甲酸及同樣市售的三氟乙酸/1-(2-胺基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)藉由在N,N-二異丙基乙胺存在下與HATU偶合且隨後用TFA脫除保護基來製備。
LC-MS(方法3)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=252(M+H)+。
中間物L55
三氟乙酸/N6-D-丙胺醯基-N2-{N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物如下製備：首先使中間物L6與N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸在HATU存在下偶合，隨後在室溫下，在溫和條件下，在含有5%濃度三氟乙酸的DCM中攪拌90分鐘來脫除胺基上的保護基。
HPLC(方法11)：Rt=1.35min； LC-MS(方法1)：Rt=0.67min；MS(ESIpos)：m/z=637(M+H)+。
中間物L56
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-{[(1R,3S)-3-胺基環戊基]羰基}-L-離胺酸第三丁酯(1：1)
標題化合物如下製備：首先使中間物L6與(1R,3S)-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]環戊烷甲酸在HATU存在下偶合，隨後在溫和條件下，在室溫下，在含有25%濃度三氟乙酸的DCM中攪拌15分鐘來脫除胺基上的保護基。
HPLC(方法11)：Rt=1.4min； LC-MS(方法1)：Rt=0.7min；MS(ESIpos)：m/z=677(M+H)+。
中間物L57
(2S)-4-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸甲酯
首先將500.0mg(2.72mmol)L-天冬胺酸甲酯鹽酸鹽及706.3mg(2.72mmol)2,5-二側氧基吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯饋入5.0ml 1,4-二噁烷中，且添加826.8mg(8.17mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到583.9mg(理論值之74%)化合物(3S)-4-甲氧基-4-側氧基-3-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIneg)：m/z=290(M-H)-。
首先將592.9mg(3S)-4-甲氧基-4-側氧基-3-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁酸饋入10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷中，將混合物冷卻至-15℃且添加205.8mg(2.04mmol)4-甲基嗎啉及277.9mg(2.04mmol)氯甲酸異丁酯。15分鐘之後抽吸濾出沈澱物且分別用10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷過濾兩次。將濾液冷卻至-10℃，且在劇烈攪拌下添加115.5mg(3.05mmol)溶解於10ml水中的硼氫化鈉。分離各相且有機相分別用飽和碳酸氫鈉溶液及飽和NaCl溶液洗滌一次。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到515.9mg(理論值之91%)化合物N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}- L-高絲胺酸甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=278(M+H)+。
首先將554.9mg(2.00mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-高絲胺酸甲酯饋入30.0ml二氯甲烷中，且添加1.27g(3.0mmol)戴斯-馬丁高碘烷及474.7mg(6.00mmol)。在室溫下攪拌混合物隔夜。4小時之後，反應物用二氯甲烷稀釋且有機相分別用10%濃度Na2S2O3溶液、10%濃度檸檬酸溶液及飽和碳酸氫鈉溶液洗滌三次。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。由此得到565.7mg(理論值之97%)標題化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.91(m,2H),2.70-2.79(m,1H),2.88(dd,1H),3.63(s,3H),4.04(m,2H),4.55(m,1H),7.54(d,1H),9.60(t,1H)。
中間物L58
(3-側氧基丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙基酯
將434.4mg(5.78mmol)3-胺基-1-丙醇及1.50g(5.78mmol)2,5-二側氧基吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於10.0ml二氯甲烷中，添加585.3mg(5.78mmol)三乙胺且在室溫下攪拌混合物隔夜。反應混合物用二氯甲烷稀釋且有機相用水及飽和碳酸氫鈉溶液洗滌且接著經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑。在高真空下乾燥殘餘物(3-羥丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(996.4mg，理論值之79%)且不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
首先將807.0mg(3.68mmol)(3-羥丙基)胺基甲酸2-(三甲基矽烷 基)乙酯饋入15.0ml氯仿及15.0ml 0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。接著添加102.2mg(0.37mmol)氯化肆正丁銨、736.9mg(5.52mmol)N-氯丁二醯亞胺及57.5mg(0.37mmol)TEMPO且反應混合物在室溫下劇烈攪拌隔夜。反應混合物用二氯甲烷稀釋且有機相用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物在高真空下乾燥且不經進一步純化即用於合成之下一步驟中(890.3mg)。
中間物L59
三氟乙酸/1-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1：1)
首先將300.0mg(0.91mmol)(2-{2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基甲酸第三丁酯饋入二氯甲烷中，添加4.2g(36.54mmol)TFA且在室溫下攪拌混合物1小時(藉由TLC監測：二氯甲烷/甲醇10：1)。揮發性組分在減壓下蒸發且殘餘物與二氯甲烷共蒸餾四次。殘餘物在高真空下乾燥且不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
LC-MS(方法1)：Rt=0.19min；MS(ESIpos)：m/z=229(M+H)+。
中間物L60
6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯氯
將200.0mg(0.95mmol)6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸溶解於4.0ml二氯甲烷中，且添加338.0mg(2.84mmol)亞硫醯 氯。在室溫下攪拌反應混合物3小時，且接著添加1滴DMF。混合物再攪拌1小時。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物與二氯甲烷共蒸餾三次。粗產物不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
中間物L61
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-L-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
首先，三肽衍生物L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯係根據經典的肽化學方法、由N2-[(苯甲氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸製備(使用EDCI/DMAP，與2-(三甲基矽烷基乙醇發生酯化反應，氫解，在HATU存在下與N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶合且再發生氫解)。標題化合物係藉由在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下使此經部分保護的肽衍生物與市售6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸偶合來製備。隨後在溫和條件下、在室溫下、在含有5%濃度三氟乙酸的DCM中攪拌2.5小時來脫除胺基上的保護基，同時保留酯保護基。處理且藉由製備型HPLC純化，得到438mg標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.69min； LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m/z=610(M+H)+。
中間物L62
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺 醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯基-L-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
首先，N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯係根據經典的肽化學方法、由N2-[(苯甲氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸製備。接著在195mg(0.51mmol)HATU及149μl N,N-二異丙基乙胺存在下，使148mg(0.43mmol)此中間物與200mg(0.43mmol)中間物L16偶合。濃縮且殘餘物藉由製備型HPLC純化之後，將經保護的中間物溶解於20ml DCM中且藉由添加2ml三氟乙酸且在室溫下攪拌1小時來移除第三丁氧基羰基保護基。濃縮且殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到254mg(理論值之63%，經2個步驟)。
HPLC(方法11)：Rt=1.51min； LC-MS(方法1)：Rt=0.68min；MS(ESIpos)：m/z=696(M+H)+。
中間物L63
(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}-5-側氧基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]戊酸
首先，根據經典的肽化學方法，由(2S)-5-(苯甲氧基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-側氧基戊酸製備三肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-胺基-3-甲基丁醯基]胺基}丙醯基]胺基}-5-側氧基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]戊酸(使用EDCI/DMAP，與2-(三甲基矽烷基乙醇發生酯化反應，用三氟乙酸移除Boc保護基，在HATU存在下與N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶合且在甲醇中，在10%鈀/活性碳上氫解)。標題化合物係藉由使此經部分保護的肽衍生物與市售1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶合來製備。處理且藉由製備型HPLC純化，得到601mg標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=611(M+H)+。
中間物L64
(4S)-4-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-5-側氧基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]戊酸
標題化合物係根據經典的肽化學方法，由(2S)-5-(苯甲氧基)-2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-側氧基戊酸製備(使用EDCI/DMAP，與2-(三甲基矽烷基乙醇發生酯化反應，利用三氟乙酸移除Boc保護基，在甲醇中、在10%鈀/活性碳上使苯甲酯發生氫解裂解，且在N,N-二異丙基乙胺存在下，與1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮發生偶合)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=385(M+H)+。
中間物L65
三氟乙酸/3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-L-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
標題化合物係根據經典的肽化學方法、由3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-L-丙胺酸製備(使用EDCI/DMAP，與2-(三甲基矽烷基乙醇發生酯化反應且利用三氟乙酸移除Boc保護基)。由此得到373mg(理論值之79%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.72min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+。
中間物L66
(8S)-8-(2-羥乙基)-2,2-二甲基-6,11-二側氧基-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸甲酯
首先將1000mg(2.84mmol)(3S)-3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]丁酸饋入10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷中，且添加344.4mg(3.4mmol)4-甲基嗎啉及504mg(3.69mmol)氯甲酸異丁酯。在室溫下攪拌10分鐘之後，將反應物冷卻至5℃且在劇烈攪拌下，漸進地添加溶解於3ml水中的161mg(4.26mmol)硼氫化鈉。1小時之後，再次添加相同量的硼氫化鈉且接著緩慢升溫反應物至室溫。添加170ml水且接著分別用200ml乙酸乙酯萃取反應物四次。分離各相且有機相用檸檬酸洗滌一次且接著用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。有機 相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到760mg(理論值之78%)化合物[(2S)-4-羥基丁烷-1,2-二基]雙胺基甲酸苯甲酯第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+。
溶解於13ml鹽酸/二噁烷中的760mg(2.16mmol)此中間物在室溫下攪拌20分鐘。接著濃縮反應物至5ml，且添加乙醚。濾出沈澱物且自乙腈/水1：1中凍乾。
將以此方式獲得的產物溶解於132ml DMF中，且添加345.5mg(2.35mmol)4-甲氧基-4-側氧基丁酸、970mg(2.55mmol)HATU及1025μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌混合物5分鐘。在減壓下移除溶劑且保留的殘餘物藉由製備型HPLC純化。合併適當溶離份且在減壓下蒸發乙腈。保留的水相用乙酸乙酯萃取兩次且接著濃縮有機相且在高真空下乾燥。
將以此方式獲得的中間物溶解於甲醇中且在室溫下、在標準壓力氫氣下、在10%鈀/活性碳上氫化1小時。接著濾出催化劑且在減壓下移除溶劑。
將247mg之此脫除保護基的化合物溶解於20ml DMF中，且添加352mg(1.36mmol)1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮及592μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌反應混合物1小時且接著濃縮，且殘餘物藉由製備型HPLC純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。經此等5個反應步驟，得到218mg標題化合物，總產率21%。
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m/z=363(M+H)+。
中間物L67
三氟乙酸/β-丙胺酸2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酯(1：1)
標題化合物係由50mg(0.354mmol)市售1-(2-羥乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮藉由在10ml二氯甲烷中、在1.5當量EDCI及0.1當量4-N,N-二甲基胺基吡啶存在下與134mg(0.71mmol)N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸偶合且隨後用三氟乙酸脫除保護基來製備。
產量：56mg(理論值之48%，經2個步驟)
LC-MS(方法3)：Rt=1.15min；MS(ESIpos)：m/z=213(M+H)+。
中間物L68
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(1：1)
標題化合物係類似於中間物L1、根據經典的肽化學方法、由市售(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸及(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯製備。
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=212(M+H)+。
中間物L69
三氟乙酸/L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸1-[(苯甲氧基)羰基]哌啶-4-基酯(1：1)
標題化合物係根據經典的肽化學方法，由市售4-羥基哌啶-1-甲酸苯甲酯如下製備：使用EDCI/DMAP，與N2-(第三丁氧基羰基)-N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸發生酯化反應，隨後用TFA移除Boc，隨後在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，與N-[(第三丁氧基)羰基]-L-纈胺酸偶合，且最後再用TFA移除Boc。
LC-MS(方法1)：Rt=0.62min；MS(ESIpos)：m/z=492(M+H)+。
中間物L70
胺基甲酸9H-茀-9-基甲基(3-側氧基丙基)酯
首先將1000.0mg(3.36mmol)(3-羥丙基)胺基甲酸9H-茀-9-基甲酯饋入15.0ml氯仿及15.0ml 0.05N碳酸鉀/0.05N碳酸氫鈉溶液(1：1)中。接著添加93.5mg(0.34mmol)氯化肆正丁銨、673.6mg(5.04mmol)N-氯丁二醯亞胺及52.5mg(0.34mmol)TEMPO且反應混合物在室溫下劇烈攪拌隔夜。反應混合物用二氯甲烷稀釋且有機相用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘 物在高真空下乾燥且藉由矽膠層析(移動相：環己烷/乙酸乙酯3：1-1：1)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到589.4mg(理論值之58%)標題化合物。
LC-MS(方法6)：Rt=2.15min；MS(ESIpos)：m/z=296(M-H)+。
中間物L71
[4-(氯羰基)苯基]胺基甲酸第三丁酯
首先將100.0mg(0.42mmol)4-[(第三丁氧基羰基)胺基]苯甲酸饋入2.0ml二氯甲烷中，且添加64.2mg(0.51mmol)乙二醯二氯。反應混合物在室溫下攪拌30分鐘(藉由TLC監測：二氯甲烷/甲醇)。接著再添加192.6mg(1.53mmol)乙二醯二氯及1滴DMF且混合物在室溫下攪拌1小時。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物與二氯甲烷反覆共蒸餾。殘餘物不經進一步純化即用於合成之下一步驟中。
中間物L72
(9S)-9-(羥基甲基)-2,2-二甲基-6,11-二側氧基-5-氧雜-7,10-二氮雜-2-矽雜十四烷-14-酸苯甲酯
標題化合物係根據經典的肽化學方法，由市售[(2S)-3-羥基丙-1,2-二基]雙胺基甲酸苯甲酯第三丁酯如下製備：氫解移除Z保護基，隨後在EDCI/HOBT存在下與4-(苯甲氧基)-4-側氧基丁酸偶合，隨後利用TFA移除Boc保護基且最後在三乙胺存在下與1-({[2-(三甲基矽烷基) 乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮反應。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=425[M+H]+。
中間物L73
N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺
將395.5mg(1.87mmol)6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸、1.21g(9.36mmol)N,N-二異丙基乙胺854.3mg(2.25mmol)HATU添加至300mg(1.87mmol)(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯於20ml二甲基甲醯胺中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌5分鐘。濃縮混合物之後，將殘餘物溶解於DCM中且用水洗滌。有機相用飽和鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥，濾出且濃縮。由此得到408mg(33%，純度53%)標題化合物，其不經進一步純化即使用。
LC-MS(方法1)：Rt=0.75min；MS(ESIpos)：m/z=354(M+H)+。
將1ml TFA添加至(2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}乙基)胺基甲酸第三丁酯(408mg，0.365mmol)於7ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物0.5小時。在減壓下濃縮反應混合物且殘餘物與二氯甲烷共蒸餾兩次。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到384mg(94%，純度57%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.26min；MS(ESIpos)：m/z=254(M+H)+。
中間物L74
3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸
將107mg(0.335mmol)3-[2-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸第三丁酯及93mg(0.369mmol)2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯溶解於5ml二甲基甲醯胺中，且添加0.074ml(0.671mmol)N-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加0.048ml(0.838mmol)乙酸且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到133mg(86%，純度100%)之3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=459(M+H)+。
將0.5ml TFA添加至3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸第三丁酯(130mg，0.284mmol)於5ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物在減壓下濃縮且將殘餘物溶解於水中且凍乾。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到102mg(90%，純度100%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.52min；MS(ESIpos)：m/z=402(M+H)+。
中間物L75
三氟乙酸/3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
標題化合物係根據經典的肽化學方法、由3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸製備(使用EDCI/DMAP，與2-(三甲基矽烷基乙醇發生酯化反應且利用三氟乙酸移除Boc保護基)。由此得到405mg(理論值之58%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.75min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+。
中間物L76
(2S)-2-溴-4-側氧基-4-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丁酸
首先，經適合保護的天冬胺酸衍生物係根據經典的肽化學方法，由(3S)-4-(苯甲氧基)-3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-4-側氧基丁酸製備(使用EDCI/DMAP，與2-三甲基矽烷基乙醇發生酯化反應，且氫解移除Z保護基及苯甲酯)。
將以此方式獲得的470mg(1.8mmol)(2S)-2-胺基-4-側氧基-4-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丁酸懸浮於10ml水中，且添加1.8ml之1莫耳濃度鹽酸及0.5ml濃硫酸，隨後添加863mg(7.25mmol)溴化鉀。在10℃，接著歷時30分鐘逐滴添加150mg(2.175mmol)亞硝酸鈉於1ml水中之溶液，且混合物在10-15℃攪拌2小時。混合物接著用50ml乙酸乙酯萃取。有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌且經硫酸鎂乾燥。蒸發溶劑且藉由製備型HPLC純化產物，得到260mg(理論值之48%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIneg)：m/z=295及297(M- (M-H)-。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)：δ[ppm]=0.03(s,9H),0.95(t,2H),2.94及3.2(2dd,2H),4.18(t,2H),4.57(t,1H)。
中間物L77
三氟乙酸/N-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]-2-溴乙醯胺(1：1)
首先使418mg(2.05mmol)[2-(2-胺基乙氧基)乙基]胺基甲酸第三丁酯與638mg(2.46mmol)溴乙酸酐反應，且接著用三氟乙酸移除Boc保護基。由此得到551mg(理論值之63%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法)：Rt=0.32min；MS(ESIpos)：m/z=227及225(M+H)+。
中間物L78
N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-β-丙胺酸
標題化合物係由市售(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸藉由在EDCI/HOBt及N,N-二異丙基乙胺存在下與β-丙胺酸第三丁酯鹽酸鹽(1：1)偶合且隨後利用三氟乙酸脫除保護基來製備。
LC-MS(方法1)：Rt=0.32min；MS(ESIpos)：m/z=227(M+H)+。
中間物L79
N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙胺酸
將64.8mg(0.357mmol)β-丙胺酸第三丁酯鹽酸鹽(1：1)及100mg(0.324mmol)1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解於4ml二甲基甲醯胺中，且添加65.6mg(0.649mmol)N-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加0.048ml(0.838mmol)乙酸且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到84.5mg(77%，純度100%)之N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙胺酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m/z=339(M+H)+。
將1.62ml TFA添加至N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙胺酸第三丁酯(82.8mg，0.244mmol)於8ml二氯甲烷中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌2小時。反應混合物在減壓下濃縮且將殘餘物溶解於水中且凍乾。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到62.7mg(87%，純度95%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.75min；MS(ESIpos)：m/z=283(M+H)+。
中間物L80
3-[(15-胺基-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基)胺基]-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯
標題化合物係根據經典的肽化學方法，由市售3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸/N-環己基環己胺(1：1)製備(自鹽中釋放且使用EDCI/DMAP，與2-(三甲基矽烷基)乙醇發生酯化反應，氫解移除Z保護基，在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與市售3-側氧基-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸偶合且再氫解移除Z保護基)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.70min；MS(ESIpos)：m/z=552(M+H)+。
中間物L81
三氟乙酸/{2-[(2-胺基乙基)磺醯基]乙基}胺基甲酸苯甲酯(1：1)
在DMF中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使250mg(1.11mmol)2,2'-磺醯基二乙胺與92.3mg(0.37mmol)1-{[(苯甲氧基)羰基]氧基}吡咯啶-2,5-二酮偶合。隨後藉由HPLC純化，得到70mg(理論值之47%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=0.64min；MS(ESIpos)：m/z=257.11(M+H)+。
中間物L82
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
將88.6mg(0.357mmol)N-Boc-2,2'-(伸乙二氧基)二乙胺及100mg(0.324mmol)6-順丁烯二醯亞胺己酸N-丁二醯亞胺酯溶解於4.0ml二甲基甲醯胺中，且添加0.071ml(0.650mmol)N-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加0.048ml(0.838mmol)乙酸且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：75ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到127mg(理論值之81%){2-[2-(2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(ESIpos)：m/z=442(M+H)+。
將2.0ml TFA添加至123mg(225μmol){2-[2-(2-{[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯於7.5ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物2小時。反應混合物在減壓下濃縮且將殘餘物溶解於水中且凍乾。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到111mg(理論值之100%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.31min；MS(ESIpos)：m/z=342(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.17(m,2H),1.47(m,4H),2.04(m,2H),2.98(m,2H),3.19(m,2H),3.39(m,4H),3,56(m, 6H),7.01(s,2H),7.72(bs,3H),7.80(m,1H)。
中間物L83
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)
將200mg(0.805mmol){2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯、150mg(0.966mmol)(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸及560μl(3.2mmol)N,N-二異丙基乙胺溶解於10ml二甲基甲醯胺中，且添加459mg(1.21mmol)HATU。反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於二氯甲烷中。有機相用5%濃度檸檬酸溶液洗滌兩次且經硫酸鎂乾燥，且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物係使用Biotage Isolera(矽膠，管柱25g SNAP，二氯甲烷：甲醇98：2)純化。由此得到276mg(理論值之89%){2-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.67min；MS(ESIpos)：m/z=386(M+H)+。
將4ml TFA添加至{2-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}胺基甲酸第三丁酯(275mg，714μmol)於15ml二氯甲烷中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌30分鐘。反應混合物在減壓下濃縮且將殘餘物溶解於水中且凍乾。由此得到281mg(理論值之99%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.17min；MS(ESIpos)：m/z=286(M+H)+。
中間物L84
三氟乙酸/N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)-6-(2,5-二側氧基- 2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
將200mg(0.594mmol)(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲酸第三丁酯及202mg(0.654mmol)1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6-側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解於4.0ml二甲基甲醯胺中，且添加0.130ml(1.2mmol)N-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加0.085ml(1.5mmol)乙酸且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到275mg(理論值之73%)[21-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-側氧基-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜二十一烷-1-基]胺基甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=530(M+H)+。
將780μl(10mmol)TFA添加至[21-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-側氧基-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜二十一烷-1-基]胺基甲酸第三丁酯(268mg，505μmol)於5.0ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物在減壓下濃縮且將殘餘物溶解於水中且凍乾。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到266mg(理論值之97%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.46min；MS(ESIpos)：m/z=430(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=1.17(m,2H),1.47(m,4H),2.03(m,2H),2.99(m,2H),3.18(m,2H),3.38(m,4H),3,52(m, 8H),3,58(m,6H),7.01(s,2H),7.73(bs,3H),7.80(m,1H)。
中間物L85
三氟乙酸/N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)
將200mg(0.594mmol)(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)胺基甲酸第三丁酯、111mg(0.713mmol)(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸及410μl(2.4mmol)N,N-二異丙基乙胺溶解於6ml二甲基甲醯胺中，且添加339mg(0.892mmol)HATU。反應混合物在室溫下攪拌1小時且藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)直接純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。此得到130mg(理論值之43%)之[17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-側氧基-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜十七-1-基]胺基甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.71min；MS(ESIpos)：m/z=474(M+H)+。
將410μl(5.3mmol)TFA添加至[17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-側氧基-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜十七-1-基]胺基甲酸第三丁酯(126mg，267μmol)於4.0ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。在減壓下濃縮反應混合物且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到124mg(理論值之95%)標題化合物。
LC-MS(方法13)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m/z=374(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=2.99(m,2H),3.22(m,2H),3.41(m,2H),3,53(m,8H),3,58(m,6H),4.02(s,2H),7.09(s,2H),7.73(bs,3H),8.21(m,1H)。
中間物L86
N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
將100mg(0.531mmol)L-纈胺醯基-L-丙胺酸及134mg(0.531mmol)1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解於3ml二甲基甲醯胺中，且添加0.150ml(1.1mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物8小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到71.5mg(理論值之41%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.42min；MS(ESIpos)：m/z=326(M+H)+。
中間物L87
3-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙酸
將250mg(1.07mmol)3-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]丙酸第三丁酯、151mg(0.974mmol)2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸、224mg(1.46mmol)水合1-羥基-1H-苯并三唑及224mg(1.17mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽溶解於5.0ml二甲基甲醯胺中。在室溫下攪拌反應混合物1小時。添加乙酸乙酯且混合物用5%濃度檸檬酸溶液及飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次。有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌兩次且經硫酸鎂乾燥，且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到267mg(理論值之64%)之3-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.73min；MS(ESIpos)：m/z=371(M+H)+。
將1.1ml(14mmol)TFA添加至3-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙酸第三丁酯(263mg，710μmol)於10ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。在減壓下濃縮反應混合物且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到240mg(理論值之94%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=0.57min；MS(ESIpos)：m/z=315(M+H)+。
中間物L88
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯
將150mg(0.797mmol)L-纈胺醯基-L-丙胺酸及246mg(0.797mmol)1-{6-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-6側氧基己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解於4.0ml二甲基甲醯胺中，且添加0.220ml(1.6mmol)三乙胺。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到302mg(理論值之97%)N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸。
LC-MS(方法12)：Rt=1.02min；MS(ESIpos)：m/z=382(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.82(dd,6H),1.17(m,2H),1.27(d,3H),1.48(m,4H),1.94(m,1H),2.13(m,2H),3.38(t,2H),4.17(m,2H),7.00(s,2H),7.75(d,1H),8.19(d,1H)。
將130mg(0.531mmol)N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸溶解於6.5ml二氯甲烷中，且添加58.8mg(0.511mmol)1-羥基吡咯啶-2,5-二酮及78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。再添加58.8mg(0.511mmol)1-羥基吡咯啶-2,5-二酮及78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。添加二氯甲烷且混合物用水洗滌三 次。有機相經硫酸鎂乾燥，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到172mg(理論值之87%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.28min；MS(ESIpos)：m/z=479(M+H)+。
中間物L89
1-苯甲基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙基]-L-麩胺酸酯鹽酸鹽(1：1)
首先將1.00g(2.96mmol)(4S)-5-(苯甲氧基)-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-側氧基戊酸饋入13.0ml THF中，且添加510μl(3.6mmol)2-(三甲基矽烷基)乙醇及109mg(889μmol)4-二甲胺基吡啶。將反應混合物冷卻至0℃，且添加682mg(3.56mmol)N-乙基-N'-3-(二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於乙酸乙酯中。有機相用0.1N HCl溶液及飽和氯化鈉溶液洗滌兩次且經硫酸鎂乾燥，且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物係使用Biotage Isolera(矽膠，管柱25g SNAP，環己烷：乙酸乙酯80：20)純化。由此得到649mg(理論值之50%)化合物1-苯甲基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙基]-N-(第三丁氧基羰基)-L-麩胺酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=4.6min；MS(ESIpos)：m/z=438(M+H)+。
將649mg(1.48mmol)1-苯甲基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙基]-N-(第三丁氧基羰基)-L-麩胺酸酯溶解於7.0ml二噁烷中，且在冰浴冷卻下，添加14ml(59mmol)4N HCl之二噁烷溶液。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物在減壓下濃縮且殘餘物在高真空下乾燥且藉由Biotage Isolera(矽膠，管柱25g SNAP，二氯甲烷：甲醇90：10)純 化。由此得到320mg(理論值之57%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min；MS(ESIpos)：m/z=338(M+H)+。
中間物L90
1-({N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸
首先將118mg(566μmol)N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺酸饋入5.0ml DMF中，添加200mg(622μmol)1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯、130mg(849μmol)水合1-羥基-1H-苯并三唑及130mg(679μmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽且混合物在室溫下攪拌1小時。添加乙酸乙酯且混合物用5%濃度檸檬酸溶液及飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次。有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌兩次且經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到274mg(理論值之95%)1-({N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯。
LC-MS(方法12)：Rt=1.69min；MS(ESIpos)：m/z=513(M+H)+。
將820μl(11mmol)TFA添加至274mg(535μmol)1-({N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺醯基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯於5.0ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物3小時。反應混合物在減壓下濃縮且將殘餘物溶解於水中且凍乾。由此得到262mg(理論值之100%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.12min；MS(ESIpos)：m/z=457(M+H)+。
中間物L91
三氟乙酸/1-{[3-胺基-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺醯基]胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
標題化合物係根據經典的肽化學方法，由市售3-側氧基-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧雜-4-氮雜十九烷-19-烷酸製備(使用EDCI/DMAP，與2-三甲基矽烷基乙醇發生酯化反應，氫解移除Z保護基，與市售N-(第三丁氧基羰基)-3-{[(9H-茀-9-基甲氧基)羰基]胺基}-D-丙胺酸偶合且移除Fmoc保護基)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.74min；MS(ESIpos)：m/z=552(M+H)+。
中間物L95
N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸
此中間物係使用經典的肽化學方法，由N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺酸及L-丙胺酸第三丁酯鹽酸鹽(1：1)製備。
LC-MS(方法12)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=323.16(M+H)+。
中間物L96
N-乙醯基-L-纈胺醯基-N5-胺甲醯基-L-鳥胺醯胺
此中間物係根據經典的肽化學方法如下製備：初始使N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯與N5-胺甲醯基-L-鳥胺酸偶合，隨後在乙醇中、在10%鈀/活性碳上氫解移除Z保護基，且最後使所得二肽與1-乙醯氧基吡咯啶-2,5-二酮發生反應。
LC-MS(方法1)：Rt=0.25min；MS(ESIpos)：m/z=317(M+H)+。
中間物L97
1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-酸
首先將1-胺基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜二十七烷-27-酸第三丁酯(100mg，201μmol)饋入1.0ml DMF中，且添加(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸(46.8mg，301μmol)、水合1-羥基-1H-苯并三唑(76.9mg，502μmol)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(77.0mg，402μmol)。反應混合物在室溫下攪拌隔夜，且接著添加乙酸乙酯。有機相用5%濃度檸檬酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液且接著用飽和氯化鈉溶液洗滌兩次。有機相經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發 溶劑且殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到19.1mg(理論值之13%)化合物1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=635[M+H]+
將TFA(62μl，600μmol)添加至1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-酸第三丁酯(19.1mg，30.1μmol)於1.0ml DCM中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物3小時。反應混合物在減壓下濃縮且將殘餘物溶解於水中且凍乾。殘餘物不經進一步純化即進一步使用。由此得到10.8mg(理論值之46%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.55min；MS(ESIneg)：m/z=577[M-H]-。
中間物L98
2,2-二甲基丙酸/N-(2-胺基乙基)-N2-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-麩胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
首先，在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，使(4S)-5-第三丁氧基-4-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5-側氧基戊酸與(2-胺基乙基)胺基甲酸苯甲酯偶合。接著，在DCM中，使用三氟乙酸使Boc保護基與第三丁酯裂解。隨後，首先藉由在DMF/水中、在N,N-二異丙基乙胺存在下與1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮反應而再 次對胺基進行保護，且接著藉由在DCM中、在EDCI/DMAP存在下與2-(三甲基矽烷基)乙醇反應而對羧基進行保護。在最後步驟中，藉由在乙醇中、在標準壓力下、在10%鈀/活性碳上氫解而脫除末端胺基的保護基。藉由過濾移除催化劑，濃縮，藉由製備型HPLC純化且殘餘物自乙腈/水中冷凍乾燥，得到標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=434(M+H)+。
中間物L99
三氟乙酸/N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-β-丙胺醯基-L-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)
首先，以N2-[(苯甲氧基)羰基]-N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸為起始物，根據經典的肽化學方法製備N6-(第三丁氧基羰基)-L-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。此中間物接著在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下使用已藉由標準方法製備的三肽結構單元N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-β-丙胺酸偶合。隨後藉由氫解及甲醇移除Z保護基且所得中間物在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶合。在最後步驟中，在室溫下，在溫和條件下，藉由在含有10%濃度三氟乙酸的DCM中攪拌1小時來脫除側鏈胺基的保護基。濃縮且自乙腈/水中冷凍乾燥，得到標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.64min；MS(ESIpos)：m/z=625(M+H)+。
中間物L100
3-[5-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)- 1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸
將461mg(6.60mmol)羥胺鹽酸鹽及1341.86mg(13.26mmol)三乙胺添加至3-氰基丙酸甲酯(500mg，4.42mmol)於40ml乙醇中之溶液中。在50℃攪拌反應混合物3小時。濃縮混合物且將殘餘物溶解於乙酸乙酯中且接著用水及鹽水洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且濃縮。殘餘物不經純化即進一步使用。由此得到400mg(理論值之62%)標題化合物。
將6.91g(36.50mmol)N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺酸及8.22g(39.82mmol)1,3-二環己基碳化二亞胺添加至(4E)-4-{[N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺醯基]胺基}-4-(羥亞胺基)丁酸甲酯(4.85g，33.19mmol)於120.0ml二噁烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物3小時。濃縮混合物且將殘餘物溶解於水中且用乙酸乙酯萃取。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。殘餘物藉由急驟層析純化。由此得到6.0g(理論值之57%)標題化合物。
(4E)-4-{[N-(第三丁氧基羰基)-β-丙胺醯基]胺基}-4-(羥亞胺基)丁酸甲酯(6.0g，18.91mmol)於100ml DMF中之溶液在120℃攪拌5小時。添加水且用乙酸乙酯萃取混合物。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到4g(理論值之71%)標題化合物。
將2.96g(25.96mmol)三氟乙酸添加至3-(5-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(2.0g，7.01mmol)於30ml二氯甲烷中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物1小時。添加水且用二氯甲 烷萃取混合物。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。殘餘物不經純化即進一步使用。由此得到1.50g(理論值之72%)標題化合物。
將1.30g(5.52mmol)1-[2-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)-2-側氧基乙基]-1-吡咯-2,5-二酮及1.52g(15.04mmol)三乙胺添加至3-[5-(2-胺基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(1.5g，5.01mmol)於25ml DMF中之溶液中。在室溫下攪拌反應混合物1小時。添加水且用二氯甲烷萃取混合物。有機相經硫酸鈉乾燥且濃縮。殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到774mg(理論值之47%)標題化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=2.67(t,2H),2.91(t,2H),3.03(t,2H),3.46(q,2H),4.28(s,2H),7.01(s,2H),8.37(t,1H),12.28(bs,1H)。
中間物L123
[1-氟-4-側氧基丁-2-基]胺基甲酸第三丁酯
在氬氣下，首先將3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-氟丁酸乙酯(150mg，602μmol)(Synth.Com.,1985,15(5),377)饋入12.0ml DCM中。將反應混合物冷卻至-78℃，添加含有1M二異丁基氫化鋁的甲苯(1.2ml，1.0M，1.2mmol)且攪拌混合物2小時。混合物小心地用甲醇淬滅，再攪拌10分鐘且用乙酸乙酯稀釋。有機相用飽和酒石酸鉀鈉溶液萃取三次。有機相用飽和NaCl溶液洗滌一次且經硫酸鎂乾燥。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到86.1mg(理論值之67%)標題化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ[ppm]：1.37(s,9H),2.58(m,2H),4.18(m,1H),4.31(dd,2H),7.05(d,1H),9.60(s,1H)
中間物L124
N-{(2R)-2-胺基-3-側氧基-3-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丙基}-N2-(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸第三丁基酯
將4.0g(13.8mmol)Boc-Asp-OtBu及1.8g(15.2mmol)N-羥基丁二醯亞胺溶解於100ml乙酸乙酯中，且在0℃添加3.1g(15.2mmol)1,3-二環己基碳化二亞胺。反應混合物在0℃攪拌2小時且接著在室溫下攪拌隔夜。隨後過濾反應混合物且在減壓下濃縮。由此得到4.1g(理論值之77%)化合物4-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)-N-(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸1-第三丁酯。
將3-胺基-N-[(苯甲氧基)羰基]-D-丙胺酸(2.53g，10.6mmol)溶解於30ml DMF中，且添加N,N-二異丙基乙胺(2.74g，21.2mmol)及4-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)-N-(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸1-第三丁酯(4.10g，10.6mmol)。反應混合物在室溫下攪拌隔夜且在減壓下濃縮。由此得到4.9g(理論值之90%)化合物(2R)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-3-({(3S)-4-第三丁氧基-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-側氧基丁醯基}胺基)丙酸。
將(2R)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-3-({(3S)-4-第三丁氧基-3-[(第三丁氧基羰基)胺基]-4-側氧基丁醯基}胺基)丙酸(4.90g，9.62mmol)溶解於100ml乙腈中，且在室溫下添加吡啶(1.6ml，19mmol)、2-(三甲基矽烷基)乙醇(1.7ml，12mmol)及二環己基碳化二亞胺(2.38g，11.5mmol)。反應混合物在0℃攪拌1小時且接著在室溫下攪拌隔夜。 隨後過濾反應混合物且在減壓下濃縮。殘餘物藉由製備型RP-HPLC純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到3.9g(理論值之66%)化合物N-{(2R)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-3-側氧基-3-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丙基}-N2-(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸第三丁酯。
將N-{(2R)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-3-側氧基-3-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丙基}-N2-(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸第三丁酯(3.80g，6.23mmol)溶解於120ml甲醇中，且添加380mg鈀/碳(10%)。反應混合物在室溫下、在標準壓力下用氫氣氫化2小時且接著過濾。在減壓下移除溶劑。由此得到2.9g(理論值之84%)標題化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ[ppm]=0.04(s,9H),0.97(m,2H),1.38(s,9H),1.39(s,9H),1.89(bs,2H),2.43(m,1H),3.18(m,3H),3.38(m,1H),4.11(m,3H),6.93(d,1H),7.91(bt,1H)
中間物L125
三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-N2-(溴乙醯基)-D-α-麩胺酸第三丁酯(1：1)
此中間物係以(2R)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-5-第三丁氧基-5-側氧基戊酸及(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯為起始物，根據經典的肽化學方法製備。
LC-MS(方法1)：Rt=0.49min；MS(ESIpos)：m/z=366及368(M+H)+。
中間物F104
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
將10mg(0.014mmol)中間物C53溶解於3.3ml DMF中，且添加8.5mg(0.027mmol)中間物L1、7.8mg(0.02mmol)HATU及12μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌反應物15分鐘且接著濃縮。殘餘物藉由製備型HPLC純化，凍乾之後，得到5.6mg(理論值之38%)經保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.32min；MS(ESIpos)：m/z=915(M+H)+。
將5.6mg(0.006mmol)此中間物溶解於2ml DMF中，且添加69mg(0.61mmol)1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷。反應物於超音波浴中處理2小時。接著添加35μl乙酸且在高真空下濃縮反應物。藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到2.4mg(理論值之48%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(EIpos)：m/z=693[M+H]+。
HPLC(方法11)：Rt=1.91min；
或者，標題化合物亦由中間物C58製備。首先使15mg(0.023mmol)中間物C58與11mg(0.036mmol)中間物L1在13mg(0.034mmol)HATU及10μl N,N-二異丙基乙胺存在下反應。在室溫下攪拌60分鐘之 後，濃縮混合物且殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到12.3mg(理論值之63%)經保護的中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.3min；MS(EIpos)：m/z=837[M+H]+。
在第二步驟中，將此中間物溶解於3ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加12mg(0.088mmol)氯化鋅，且反應物在50℃攪拌2小時。接著添加26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸及2ml 0.1%濃度三氟乙酸水溶液。藉由製備型HPLC純化反應物。濃縮適當溶離份且殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到8.1mg(理論值之68%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=693(M+H)+。
中間物F119
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}丁醯胺(1：1)
將29mg(0.044mmol)中間物C58溶解於3.4ml DMF中，且添加36mg(0.087mmol)中間物L52、25mg(0.065mmol)HATU及19μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌60分鐘之後，濃縮混合物且殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到26.4mg(理論值之73%)中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=820及822(M+H)+。
將此中間物溶解於3ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加6.5mg(0.048mmol)氯化鋅，且在50℃攪拌反應物4小時。接著添加13.9mg(0.048mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸及2ml 0.1%濃度三氟乙酸水溶液。藉由製備型HPLC純化反應物。濃縮適當溶離份且殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到14.4mg(理論值之58%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=676及678(M+H)+。
中間物F127
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙醯基]胺基)-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
將12mg(0.015mmol)中間物C59溶解於2.4ml DMF中，且添加14.6mg(0.046mmol)中間物L1、6mg(0.031mmol)1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽、5.9mg(0.039mmol)水合1-羥基-1H-苯并三唑及8μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌1小時之後，濃縮混合物且殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到11mg(理論值之70%)此中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=942(M+H)+。
將11mg(0.011mmol)此中間物溶解於2ml DMF中，且添加123 mg(1.1mmol)1,4-二氮雜雙環[2.2.2]辛烷。反應物於超音波浴中處理2小時。接著添加63μl乙酸且在高真空下濃縮反應物。藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到2mg(理論值之22%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(EIpos)：m/z=721[M+H]+。
HPLC(方法11)：Rt=1.95min；
中間物F153
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-羥基丙醯基]胺基胺基)-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
類似於中間物F104，由中間物C60進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=1.1min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H)+。
中間物F155
N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2-{N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物如下製備：在8.7mg(0.023mmol)HATU及17μl N,N-二異丙基乙胺存在下，使14mg(0.019mmol)中間物C61與15mg(0.021mmol)中間物L61偶合，且隨後在三氟乙醇中用氯化鋅脫除保護基，如針對中間物F119所述。藉由製備型HPLC純化，得到13mg(理論值之59%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=1076(M+H)+。
中間物F173
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物如下製備：在7.7mg(0.02mmol)HATU及16μl N,N-二異丙基乙胺存在下，使15mg(0.018mmol)中間物C64與12mg(0.02mmol)中間物L63偶合，且隨後在三氟乙醇中用氯化鋅脫除保護基， 如針對中間物F119所述。藉由製備型HPLC純化，得到12mg(理論值之58%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(EIpos)：m/z=1048[M+H]+。
中間物F178
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-N-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}環戊烷甲醯胺(1：1)
類似於中間物F177，使用中間物L52而非中間物L1來製備標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(EIpos)：m/z=787及789[M+H]+。
中間物F180
N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物如下製備：在7mg(0.018mmol)HATU及6μl N,N-二異丙基乙胺存在下，使9.6mg(0.012mmol)中間物C64與5mg(0.013mmol)中間物L64偶合，且隨後在三氟乙醇中用氯化鋅脫除保護基，如針對中間物F119所述。藉由製備型HPLC純化，得到3.1mg(理論值之28%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(EIpos)：m/z=822[M+H]+。
中間物F192
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二側氧基-2，5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-L-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
將60mg(0.091mmol)中間物C58溶解於8ml DMF中且在42mg(0.11mmol)HATU及64μl N,N-二異丙基乙胺存在下與45mg(0.100 mmol)中間物L65偶合。藉由製備型HPLC純化之後，將中間物溶解於10ml乙醇中且在室溫下、在標準壓力氫氣下、在10%鈀/活性碳上氫化45分鐘。接著濾出催化劑，在減壓下移除溶劑且產物藉由製備型HPLC純化。自乙腈/水1：1中凍乾，得到24.5mg(理論值之31%，經2個步驟)之3-胺基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-L-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.17min；MS(EIpos)：m/z=844[M+H]+。
接著如下製備標題化合物：在5.4mg(0.014mmol)HATU及8μl N,N-二異丙基乙胺存在下，使10mg(0.012mmol)此中間物與2mg(0.013mmol)市售(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸中間物偶合且隨後在三氟乙醇中，用氯化鋅脫除保護基，如針對中間物F119所述。藉由製備型HPLC純化，得到3.5mg(理論值之33%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
中間物F193
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
類似於中間物F192，由3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸/N-環己基環己胺(1：1)合成標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
中間物F194
N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
標題化合物由實例M9如下製備：首先在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶合。在下一步驟中，藉由在室溫下、在標準壓力氫氣下、在10%鈀/活性碳上加氫1小時來移除Z保護基且接著將脫除保護基的中間物藉由與1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮反應而轉化成標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.19min；MS(ESIpos)：m/z=851[M+H]+。
中間物F207
N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2-{N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
類似於中間物F155來製備標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+。
中間物F216
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
在氬氣下，首先將30.2mg(0.06mmol)N,N'-雙[(苯甲氧基)羰基]-L-胱胺酸饋入2.0ml水及2.0ml異丙醇中，且添加56.7mg(0.20mmol)TCEP。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。將50.0mg(0.08mmol)之{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C70) 溶解於2.0ml異丙醇中，且接著添加122.2mg(0.48mmol)之1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一烷-7-烯，且反應混合物在50℃攪拌7小時。接著再添加122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一烷-7-烯，且反應混合物在50℃攪拌1小時。混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相用水及飽和碳酸氫鈉溶液萃取且用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到43.1mg(理論值之64%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=851(M+H)+。
首先將16.5mg(0.05mmol)4-甲基苯磺酸/β-丙胺酸苯甲酯(1：1)連同14.0mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺一起饋入1.5ml乙腈中。反應混合物在室溫下攪拌3分鐘，且接著添加30.8mg(0.04mmol)溶解於1.5ml乙腈中的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-半胱胺酸、23.4mg(0.18mmol)N,N-二異丙基乙胺及29.9mg(0.05mmol)T3P(50%於乙酸乙酯中)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加水，且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。所得化合物為S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸苯甲酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.59min；MS(ESIpos)：m/z=1012(M+H)+。
將43.8mg(43.3μmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸苯甲酯溶解於8.0ml乙醇中，添加4.4mg鈀/活性碳(10%)且混合物在室溫及標準壓力下氫化隔夜。反應混合物經由卡紙板過濾器過濾且用乙醇洗滌濾餅。在減壓下蒸發溶劑。殘餘物如剛剛所述處理兩次以上。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到14.5mg(理論值之37%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=788(M+H)+。
首先將14.5mg(16.1μmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)連同9.1mg(17.7μmol)之3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-1-基}丙醯胺一起饋入1.0ml DMF中，且添加4.9mg(48.2μmol)4-甲基嗎啉。反應混合物在室溫下攪拌隔夜，且接著添加3.4mg(0.06mmol)乙酸。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.9mg(理論值之50%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.28min；MS(ESIpos)：m/z=1186(M+H)+。
將14.1mg(11.9μmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)溶解於1.5ml三氟乙醇中，且添加9.7mg(71.3μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物3小時。再添加9.7mg(71.3μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃攪拌3小時。再添加9.7mg(71.3μmol)二氯化鋅且反應混合物在70℃攪拌4小時。添加20.8mg(0.07mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且凍乾殘餘物。由此得到6.2mg(理論值之44%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.82min；MS(ESIpos)：m/z=1042(M+H)+。
中間物F239
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
在氬氣下，首先將7.5mg(0.05mmol)(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸饋入1.5ml DMF中，且添加7.5mg(0.05mmol)HOBt、15.5mg(0.05mmol)TBTU及6.2mg(0.05mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。將40.0mg(0.05mmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)，溶解於1.5ml DMF中，且接著添加18.7mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺，且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到11.2mg(理論值之25%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=854(M+H)+。
將10.9mg(12.8μmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加10.4 mg(76.6μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物4小時。添加22.4mg(0.08mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且凍乾殘餘物。由此得到7.5mg(理論值之65%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=710(M+H)+。
中間物F240
三氟乙酸/3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丙醯胺(1：1)
首先將27.5mg(0.04mmol)之11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-烷酸(中間物C69)連同15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L1)一起饋入1.8ml乙腈中。接著添加32.4 mg(0.31mmol)N,N-二異丙基乙胺，且逐滴添加32.4mg(0.05mmol)T3P(50%於乙酸乙酯中)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到11.9mg(理論值之35%)化合物[13-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-16-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.39min；MS(ESIpos)：m/z=881(M+H)+。
將11.9mg(0.01mol)[13-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-16-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於1.0ml三氟乙醇中，且添加5.5mg(0.04mmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物隔夜。添加11.8mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到7.4mg(理論值之60%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.75min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
中間物F241
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[N-(溴乙醯基)甘胺醯基]胺基}乙基)丁醯胺(1：1)
標題化合物係由中間物C66藉由與市售1-(2-溴乙醯基)吡咯啶-2,5-二酮偶合且隨後用氯化鋅解塊來製備。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(EIpos)：m/z=733及735[M+H]+。
中間物F242
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}丙基)丁醯胺(1：1)
標題化合物類似於中間物F104進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H)+。
中間物F243
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙基]丁醯胺(1：1)
標題化合物類似於中間物F242進行合成。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=737(M+H)+。
中間物F245
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁基}-N'-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁二醯胺(1：1)
標題化合物如下製備：在15mg(0.04mmol)HATU及9μl N,N-二異丙基乙胺存在下，使10mg(0.0135mmol)中間物C65與8mg(0.027mmol)中間物L1偶合，且隨後在三氟乙醇中用氯化鋅脫除保護基，如針對中間物F119所述。藉由製備型HPLC純化，得到8.8mg(理論值之 58%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=778(M+H)+。
中間物F247
三氟乙酸/4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-2-溴-4-側氧基丁酸甲酯(1：1)
將14mg(0.018mmol)中間物C66溶解於14ml DCM中，且添加10.1mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡錠四氟硼酸鹽(BEP)及漸進添加總共250μl吡啶，pH保持在5與6之間。接著用乙酸調節pH至4，濃縮反應物且殘餘物藉由製備型HPLC純化。合併適當溶離份，凍乾且乾燥，得到4mg(理論值之21%)經保護的中間物，接著用氯化鋅脫除胺基官能基上的保護基。HPLC純化及凍乾，得到3mg(理論值之72%)呈無色泡沫狀之標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=805及807(M+H)+。
中間物F248
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁醯胺(1：1)
標題化合物係藉由在HATU存在下使10mg(0.015mmol)中間物C58與5mg(0.017mmol)中間物L12偶合且隨後用氯化鋅脫除保護基來製備。由此得到6.5mg(理論值之52%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=680(M+H)+。
中間物F254
三氟乙酸/(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-3-溴-4-側氧基丁酸甲酯(1：1)
標題化合物係類似於中間物247，使15mg(0.02mmol)中間物C66與21mg(0.099mmol)(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-側氧基丁酸偶合來製備，該(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-側氧基丁酸已如(J.Org.Chem.200,65,517-522)中所述，由(2S)-2-胺基-4-甲氧基-4-側氧基丁酸鹽酸鹽(1：1)合 成。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=805及807(M+H)+。
中間物F255
R/S-(N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-α-麩胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基})高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先將13.1mg(0.04mmol)(2S)-5-(苯甲氧基)-2-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-5-側氧基戊酸饋入1.0ml DMF中，且添加5.4mg(0.04mmol)HOBt、11.4mg(0.04mmol)TBTU及4.6mg(0.04mmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。接著添加溶解於12.9mg(0.1mmol)N,N-二異丙基乙胺及1ml DMF中的30.0mg(0.04mmol)R/S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C11)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱： Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到32mg(73%)化合物4-[2-[[(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基矽烷基乙氧基羰基胺基)丙基]胺基]-2-側氧基乙基]硫基-2-[[(2S)-5-苯甲氧基-2-(苄氧羰基胺基)-5-側氧基-戊醯基]胺基]丁酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53min；MS(ESIpos)：m/z=1084(M+H)+。
將41.4mg(0.038mmol)4-[2-[[(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基矽烷基乙氧基羰基胺基)丙基]胺基]-2-側氧基乙基]硫基-2-[[(2S)-5-苯甲氧基-2-(苯甲氧基羰基胺基)-5-側氧基-戊醯基]胺基]丁酸溶解於10ml乙醇中，添加4.2mg Pd/C且混合物在標準壓力下氫化。反應混合物經由卡紙板過濾器過濾且用乙醇洗滌濾餅。在減壓下無加熱來蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到21.1mg(56%)化合物R/S-(L-α-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.11min；MS(ESIpos)：m/z=860(M+H)+。
首先將20.4mg(20.94μmol)R/S-(L-α-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基))高半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)連同11.8mg(23.04μmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-15-側氧基- 3,6,9,12-四氧雜十五烷-1-基}丙醯胺一起饋入1.0ml DMF中，且添加4.2mg(41.88μmol)4-甲基嗎啉。反應混合物在室溫下攪拌隔夜，且接著添加3.1mg(0.05mmol)乙酸。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到9.5mg(36%)化合物R/S-(N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-α-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基))高半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.66min；MS(ESIpos)：m/z=1259(M+H)+。
將9.4mg(7.47μmol)R/S-(N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-α-麩胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基))高半胱胺酸溶解於1.5ml三氟乙醇中，且添加6.1mg(44.81μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物3小時。添加13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到6.9mg(75%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=1114(M+H)+。
中間物F256
三氟乙酸/N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁基}-N'-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙基]丁二醯胺(1：1)
該標題化合物係藉由在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下使10mg(0.014mmol)中間物C65與9.6mg(0.027mmol)三氟乙酸/N-[2-(2-胺基乙氧基)乙基]-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)偶合且隨後在三氟乙醇中用氯化鋅脫除保護基，如針對中間物F119所述。藉由製備型HPLC純化，得到8mg(理論值之64%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=822(M+H)+。
中間物F257
R-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-[18-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十八烷-1-醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將50.0mg(0.06mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)及29mg(0.07mmol)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二側氧基吡咯-1-基)乙醯基]胺基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(中間物L74)溶解於3.0ml DMF中，且添加27.3mg(0.07mmol)HATU及23.3mg(0.18mmol)N,N-二異丙基乙胺。反應混合物在室溫下攪拌2小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到17.4mg(26%)化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十八烷-1-醯基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法6)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1101(M+H)+。
將17mg(0.02mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十八烷-1-醯基]-L-半 胱胺酸溶解於1.0ml三氟乙醇中，且添加6.3mg(0.05mmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物隔夜。添加13.5mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到7.6mg(46%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=957(M+H)+。
中間物F258
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-[3-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙基}胺基)-3-側氧基丙基]丁醯胺(1：1)
標題化合物如下製備：使用HATU使中間物C58與三氟乙酸/[2-(β-丙胺醯基胺基)乙基]胺基甲酸苯甲酯(1：1)偶合，隨後氫解，隨後與1-(2-溴乙醯基)吡咯啶-2,5-二酮偶合且最後用氯化鋅脫除保護基。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=747及749(M+H)+。
中間物F259
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[N-(溴乙醯基)甘胺醯基]胺基}-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
將75mg(0.114mmol)中間物C58溶解於12.5ml DMF中且在65mg(0.11mmol)HATU及79μl N,N-二異丙基乙胺存在下、與78mg(0.171mmol)中間物L75偶合。藉由製備型HPLC純化之後，將中間物溶解於20ml乙醇中且在室溫下、在標準壓力氫氣下、在10%鈀/活性碳上氫化1小時。接著濾出催化劑，在減壓下移除溶劑且產物藉由製備型HPLC純化。自乙腈/水1：1中凍乾，得到63mg(理論值之64%，經2個步驟)之3-胺基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丁醯基]-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.16min；MS(EIpos)：m/z=844[M+H]+。
接著如上文所述，在HATU存在下使40mg(0.047mmol)此中間物與N-[(苯甲氧基)羰基]甘胺酸偶合且接著再次以氫解方式脫除保護基。
接著如下製備標題化合物：在4μl N,N-二異丙基乙胺存在下，使10mg(0.012mmol)此中間物與7.7mg(0.032mmol)市售1-(2-溴乙醯基)吡咯啶-2,5-二酮偶合，且隨後在三氟乙醇中用氯化鋅脫除保護基，如針對中間物F119所述。藉由製備型HPLC純化，得到1.3mg標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=777及779 (M+H)+。
中間物F260
N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2-{N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
類似於中間物F155來製備標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+。
中間物F261
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{2-[(溴乙醯基)胺基]乙氧基}乙基)丁醯胺(1：1)
標題化合物係藉由在HATU存在下使20mg(0.03mmol)中間物 C58與25.8mg(0.061mmol)中間物L77偶合且隨後用氯化鋅脫除保護基來製備。由此得到11.9mg(理論值之47%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=722及720(M+H)+。
中間物F262
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先將30mg(36μmol)S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)連同16.9mg(40μmol)3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-N-[2-(2-{3-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-3-側氧基丙氧基}乙氧基)乙基]丙醯胺饋入1.5ml DMF中，且添加10.9mg(108μmol)4-甲基嗎啉。反應混合物在室溫下攪拌隔夜，且接著添加7.58mg(0.13mmol)乙酸。反應混合物直接藉由製備 型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到33.4mg(理論值之80%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1027(M+H)+。
將32.8mg(32μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸溶解於3.0ml三氟乙醇中，且添加26.1mg(192μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物2小時。添加56.0mg(0.192mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且凍乾殘餘物。由此得到22.9mg(理論值之71%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=883(M+H)+。
中間物F263
N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-β-丙胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將30.0mg(0.036mmol)之R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)及9.8mg(0.04mmol)之N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-β-丙胺酸(中間物L78)溶解於1.0ml DMF中，且添加16.4mg(0.04mmol)HATU及14.0mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺。反應混合物在室溫下攪拌2小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.2mg(13%)化合物N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-β-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法6)：Rt=1.31min；MS(ESIpos)：m/z=925(M+H)+。
將11.3mg(0.011mmol)之N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-β-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加5.0mg(0.04mmol)二氯化鋅。反應混合物在50℃攪拌2小時。添加10.7mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物 10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.4mg(40%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=781(M+H)+。
中間物F264
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將30.0mg(0.036mmol)之R-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)及12.2mg(0.04mmol)之N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙胺酸(中間物L79)溶解於1.0ml DMF中，且添加16.4mg(0.04mmol)HATU及14.0mg(0.11mmol)N,N-二異丙基乙胺。反應混合物在室溫下攪拌2小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到8.9mg(24%)化合物N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法6)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=981(M+H)+。
將15.3mg(0.015mmol)之N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加6.3mg(0.045mmol)二氯化鋅。反應混合物在50℃攪拌2小時。添加13.5mg(0.045mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到9.1mg(62%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.92min；MS(ESIpos)：m/z=837(M+H)+。
中間物F265
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-6,17-二側氧基-10,13-二氧雜-3-硫雜-7,16-二氮雜二十二烷-1-醯胺(1：1)
首先將30.0mg(42.7μmol)11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)及25.3mg(55.6μmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)(中間物L82)饋入1.9ml乙腈中，且添加60μl(340μmol)N,N-二異丙基乙胺及33μl(56μmol)含有50% 2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三磷雜環己烷2,4,6-三氧化物之乙酸乙酯。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加水(2.0ml)，且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到26.7mg(理論值之60%)化合物[4-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三側氧基-14,17-二氧雜-7-硫雜-4,11,20-三氮雜二十六烷-1-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.40min；MS(ESIpos)：m/z=1025(M+H)+。
將25.3mg(24.7μmol)[4-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三側氧基-14,17-二氧雜-7-硫雜-4,11,20-三氮雜二十六烷-1-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加20.2mg(148μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加43.3mg(148μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到23.4mg(理論值之95%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=881(M+H)+。
中間物F266
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,13-二側氧基-6,9-二氧雜-16-硫雜-3,12-二氮雜十八烷-18-醯胺(1：1)
首先將30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)連同22.2mg (0.056mmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L83)一起饋入1.9ml乙腈中。接著添加60μl(0.34mmol)N,N-二異丙基乙胺，且逐滴添加33μl(0.056mmol)T3P(50%於乙酸乙酯中)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加水(2.0ml)。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到20.5mg(理論值之49%)化合物[19-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三側氧基-6,9-二氧雜-16-硫雜-3,12,19-三氮雜二十二烷-22-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(ESIpos)：m/z=969(M+H)+。
將19.1mg(19.7μmol)之[19-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三側氧基-6,9-二氧雜-16-硫雜-3,12,19-三氮雜二十二烷-22-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加16.1mg(118μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加34.6mg(118μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到13.9mg(理論值之75%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=825(M+H)+。
中間物F267
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二 氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
在氬氣下，首先將13.4mg(33.3μmol)之1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-酸(中間物L74)饋入1.0ml DMF中，且添加9.3μl(54.4μmol)N,N-二異丙基乙胺及12.6mg(33.3μmol)HATU。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。將25.0mg(27.7μmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)(參見中間物F216之合成)溶解於4.7μl(27.7μmol)之N,N-二異丙基乙胺中且接著添加1.0ml DMF。反應混合物在室溫下攪拌90分鐘。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到6.90mg(理論值之19%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸。
LC-MS(方法5)：Rt=4.44min；MS(ESIpos)：m/z=1172 (M+H)+。
將6.70mg(5.71μmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺醯基-β-丙胺酸溶解於1.0ml三氟乙醇中，且添加4.67mg(34.3μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加10mg(34.3μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.4mg(理論值之67%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=1028(M+H)+。
中間物F268
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-28-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-6,23-二側氧基-10,13,16,19-四氧雜-3-硫雜-7,22-二氮雜二十八烷-1-醯胺(1：1)
首先將30.0mg(0.043mmol)之11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)連同30.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)(中間物L84)一起饋入2.0ml乙腈中。接著添加60μl(0.34mmol)N,N-二異丙基乙胺，且逐滴添加33μl(0.056mmol)T3P(50%於乙酸乙酯中)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加水(2.0ml)。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。此得到27.9mg(理論值之59%)化合物[4-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三側氧基-14,17,20,23-四氧雜-7-硫雜-4,11,26-三氮雜三十二烷-1-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=1114(M+H)+。
將25.6mg(23.0μmol)之[4-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯- 1-基)-5,10,27-三側氧基-14,17,20,23-四氧雜-7-硫雜-4,11,26-三氮雜三十二烷-1-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於2.5ml三氟乙醇中，且添加18.8mg(138μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加40.3mg(138μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到22.2mg(理論值之88%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=969(M+H)+。
中間物F269
4-{[(8R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-8-基]胺基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
首先將17.0mg(0.0195mmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-側氧基丁醯基)-L-半胱胺酸(中間物C77)連同4.99mg(0.0253mmol)之N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(中間物L1)一起饋入1.0ml乙腈中。接著添加27μl(0.16mmol)N,N-二異丙基乙胺，且逐滴添加15μl(0.025mmol)T3P(50%於乙酸乙酯中)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加水(2.0ml)。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到9.5mg(理論值之46%)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-16-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.47min；MS(ESIpos)：m/z=1052(M+H)+。
將8.3mg(7.89μmol)之4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-16-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯溶解於1.0ml三氟乙醇中，且添加6.45mg(47.3μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物6小時。添加6.45mg(47.3μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃攪拌隔夜。添加27.7mg(94.6mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘 物在高真空下乾燥。由此得到1.10mg(理論值之14%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=852(M+H)+。
中間物F270
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丁二醯胺(1：1)
首先，在氬氣下，將15.0mg(22.9μmol)之11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸(中間物C78)饋入1.0ml DMF中，且添加8.0μl(45.8μmol)N,N-二異丙基乙胺及10.4mg(27.4μmol)HATU。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。接著添加溶解於4.0μl(22.9μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0ml DMF中的8.54mg(27.4μmol)三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L1)。在室溫下攪拌反應混合物1小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到14.7mg(理論值之77%)化合物[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙 基}{4-[(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-4-側氧基丁醯基}胺基)丙基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法5)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=835(M+H)+。
將13.2mg(15.8μmol)[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺基]-4-側氧基丁醯基}胺基)丙基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加12.9mg(94.8μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到10.9mg(理論值之83%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=691(M+H)+。
中間物F271
4-{[(20R,26R)-25-(3-胺基丙基)-26-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-27,27-二甲基-2,19,24-三側氧基-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,18,25-三氮雜二十八烷-20-基]胺基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
首先，在氬氣下，將19.4mg(22.2μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-側氧基丁醯基)-L-半胱胺酸(中間物C77)饋入2.0ml DMF中，且添加21.7mg(44.4μmol)三氟乙酸/N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L74)、12μl(67μmol)N,N-二異丙基乙胺及16.9mg(44.4μmol)HATU。在室溫下攪拌反應混合物1小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到18.1mg(理論值之66%)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四側氧基-5,21,24,27,30-五氧雜-14-硫雜-7,11,18,33-四氮雜-2-矽雜三十五烷-16-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯。
LC-MS(方法4)：Rt=1.79min；MS(ESIpos)：m/z=1250(M+Na)+。
將18.1mg(14.7μmol)之4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四側氧基-5,21,24,27,30-五氧雜-14-硫雜-7,11,18,33-四氮雜-2-矽雜三十五烷-16-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加12.0mg(88.4μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物4小時。添加25.8mg(88.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到12.3mg(理論值之73%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=1028(M+H)+。
中間物F272
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-[17-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-側氧基-3,6,9,12-四氧雜-15-氮雜十七-1-基]丁二醯胺(1：1)
首先，在氬氣下，將15.0mg(22.9μmol)之11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二 側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十五烷-15-酸(中間物C78)饋入1.0ml DMF中，且添加8.0μl(45.8μmol)N,N-二異丙基乙胺及10.4mg(27.4μmol)HATU。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。接著添加溶解於4.0μl(22.9μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0ml DMF中的13.4mg(27.4μmol)三氟乙酸/N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L85)。在室溫下攪拌反應混合物1小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到15.8mg(理論值之68%)化合物[23-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3,18,23-三氮雜二十六烷-26-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.35min；MS(ESIpos)：m/z=1011(M+H)+。
將15.1mg(14.9μmol)之[23-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3,18,23-三氮雜二十六烷-26-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於2.0ml三氟乙醇中中，且添加12.2mg(89.6μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加26.2mg(89.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到10.3mg(理論值之70%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=867(M+H)+。
中間物F273
三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,18-二氮雜二十四烷-24-醯胺(1：1)
首先，在氬氣下，將20.0mg(28.5μmol)11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)饋入1.0ml DMF中，且添加10.0μl(57.0μmol)N,N-二異丙基乙胺及13.0mg(34.2μmol)HATU。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。接著添加溶解於5.0μl(28.5μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0ml DMF中的16.7mg(34.2μmol)三氟乙酸/N-(14-胺基-3,6,9,12-四氧雜十四烷-1-基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(中間物L85)。在室溫下攪拌反應混合物1小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到18.6mg(理論值之62%)化合物[25-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三側氧基-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,18,25-三氮雜二十八烷-28-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.37min；MS(ESIpos)：m/z=1057(M+H)+。
將17.1mg(16.2μmol)之[25-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三側氧基-6,9,12,15-四氧雜-22-硫雜-3,18,25-三氮雜二十八烷-28-基]胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加13.2mg(97.0μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加28.4mg(97.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到9.80mg(理論值之59%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=913(M+H)+。
中間物F274
N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先將13.9mg(0.0167mmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)連同7.07mg(0.0217mmol)之N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸(中間物L86)一起饋入2.0ml乙腈中。接著添加23μl(0.13mmol)N,N-二異丙基乙胺，且逐滴添加13μl(0.022mmol)T3P(50%於乙酸乙酯中)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到3.70mg(理論值之19%)化合物N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1024(M+H)+。
將10.6mg(10.3μmol)之N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加8.46mg(62.1μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加18.1mg(62.1μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到5.60mg(理論值之54%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.69min；MS(ESIpos)：m/z=880(M+H)+。
中間物F275
N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)丙醯基]-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-L-α-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先將39.0mg(55.6μmol)之11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-酸(中間物C69)饋入4.0ml DMF中，添加41.6mg(111μmol)之1-苯甲基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙基]-L-麩胺酸酯鹽酸鹽(1：1)(中間物L89)、29μl(170μmol)N,N-二異丙基乙胺及42.3mg(111μmol)HATU且混合物在室溫下攪拌1小時。反應混合物在室溫下攪拌1小時，用乙酸淬滅且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到53.1mg(理論值之93%)化合物1-苯甲基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-L-麩胺酸酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.71min；MS(ESIpos)：m/z=1021[M+H]+
首先，在氬氣下，將7.60mg(33.9μmol)乙酸鈀(II)饋入3.0ml二 氯甲烷中，且添加14μl(100μmol)三乙胺及110μl(680μmol)三乙基矽烷。反應混合物在室溫下攪拌5分鐘，且添加溶解於3.0ml二氯甲烷中的69.2mg(67.7μmol)之1-苯甲基-5-[2-(三甲基矽烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-L-麩胺酸酯。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物經由卡紙板過濾器過濾且用二氯甲烷洗滌濾餅。在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到38.4mg(理論值之61%)化合物(19S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-19-{3-側氧基-3-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丙基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18-三氮-2-矽雜二十烷-20-酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.53min；MS(ESIpos)：m/z=931(M+H)+。
首先，將10.0mg(10.7μmol)之(19S)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-19-{3-側氧基-3-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丙基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18-三氮-2-矽雜二十烷-20-酸(中間物C69)饋入1.0ml DMF中，添加6.73mg(21.5μmol)之N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺/2,2,2-三氟乙烷-1,1-二醇(1：1)(中間物L1)、5.6μl(32μmol)N,N-二異丙基乙胺及8.17mg(21.5μmol)HATU，且在室溫下攪拌混合物1小時。反應混合物在室溫下攪拌3小時，用乙酸淬滅且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到6.90mg(理論值之58%)化合物N2-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二 甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-L-α-麩胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.57min；MS(ESIpos)：m/z=1110[M+H]+
將6.90mg(6.21μmol)之N2-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-L-α-麩胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加5.1mg(37.2μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物3小時。添加5.1mg(37.2μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃攪拌3小時。添加5.1mg(37.2μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃攪拌3小時。添加10.1mg(74.4μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃下攪拌隔夜且在室溫下攪拌72小時。添加54.5mg(186μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到2.4mg(理論值之39%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=866(M+H)+。
中間物F276
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，在氬氣下，將9.08mg(28.9μmol)3-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙酸(中間物L87)饋入1.0ml DMF中，且添加8.33μl(48.2μmol)N,N-二異丙基乙胺及11.0mg(28.9μmol)HATU。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。接著添加溶解於4.67μl(24.1μmol)N,N-二異丙基乙胺及1.0ml DMF中的20.0mg(27.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)。在室溫下攪拌混合物1小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.70mg(理論值之19%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法12)：Rt=2.47min；MS(ESIpos)：m/z=1013(M+H)+。
將13.9mg(13.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙氧基)乙氧基]丙醯基}-L-半胱胺酸溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加5.6mg(41.2μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加5.6mg(41.2μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃攪拌30分鐘。添加24.1mg(82.4mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到10.8mg(理論值之80%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.58min；MS(ESIpos)：m/z=869(M+H)+。
中間物F277
N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)丙醯基]-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
將8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/3-胺基-N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)(中間物C80)及2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙醯基)吡咯啶-2,5-二酮溶解於1ml二甲基甲醯胺中中，且添加2.9μl(27μmol)N-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物1小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到5.80mg(理論值之65%)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.57min；MS(ESIpos)：m/z=1008(M+H)+。
將5.80mg(5.75μmol)之N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5- 氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加4.70mg(34.5μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物3小時。添加4.70mg(34.5μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃攪拌5小時。添加20.2mg(69.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到1.70mg(理論值之34%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m/z=764(M+H)+。
中間物F278
N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)丙醯基]-3-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
將10.0mg(9.98μmol)三氟乙酸/3-胺基-N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基- 4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)(中間物C80)及2.77mg(11.0μmol)1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解於1ml二甲基甲醯胺中，且添加3.3μl(30μmol)N-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。添加2.0μl(35μmol)乙酸且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到5.50mg(理論值之54%)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.51min；MS(ESIpos)：m/z=1024(M+H)+。
將5.50mg(5.36μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯溶解於1.0ml三氟乙醇中，且添加4.39mg(32.2μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加4.39mg(32.2μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃攪拌1小時。添加4.39mg(32.2μmol)二氯化鋅且反應混合物在50℃攪拌4小時。添加28.2mg(96.5μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真 空下乾燥。由此得到2.70mg(理論值之56%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=781(M+H)+。
中間物F279
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({(2R)-2-羧基-2-[(3-羧基丙醯基)胺基]乙基}硫基)乙醯基]胺基)丙基]-L-丙胺醯胺
將12.2mg(14μmol)之S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-側氧基丁醯基)-L-半胱胺酸(中間物C77)溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加11.4mg(83.8μmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物3小時。添加24.5mg(83.8μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.60mg(理論值之42%)化合物4-{[(1R)-2-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4- (2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)-1-羧基乙基]胺基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=673(M+H)+。
將10.0mg(12.7μmol)4-{[(1R)-2-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)-1-羧基乙基]胺基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)及7.41mg(12.7μmol)N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(中間物L88)溶解於1.5ml二甲基甲醯胺中，且添加4.4μl(25μmol)N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌反應混合物2小時。添加2.0μl(35μmol)乙酸且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到5.20mg(理論值之39%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.11min；MS(ESIpos)：m/z=1036(M+H)+。
中間物F280
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯甲醯胺(1：1)
標題化合物係由中間物C64藉由與市售1-(3-{[(2,5-二側氧基吡咯 啶-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶合且隨後用氯化鋅脫除保護基來製備。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=755(M+H)+。
中間物F281
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[N-(溴乙醯基)-β-丙胺醯基]胺基}-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，經修飾之胺基酸結構單元N-(溴乙醯基)-β-丙胺酸及3-胺基-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯係根據經典的肽化學方法製備。此等物接著在HATU及嗎啉存在下偶合。接著使用含有10%濃度三氟乙酸的二氯甲烷移除第三丁氧基羰基保護基，得到中間物3-{[N-(溴乙醯基)-β-丙胺醯基]胺基}-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
最後，藉由使此中間物與中間物C58在HATU及4-甲基嗎啉存在下偶合、隨後用氯化鋅脫除保護基來製備標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.87min；MS(ESIpos)：m/z=791及793(M+H)+。
中間物F282
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(3-{[N-(溴乙醯基)甘胺 醯基]胺基}丙基)丁醯胺(1：1)
首先，根據經典的肽化學方法，由甘胺酸第三丁酯及溴乙酸酐製備中間物三氟乙酸/N-(3-胺基丙基)-N2-(溴乙醯基)甘胺醯胺(1：1)。
最後，藉由使此中間物與中間物C58在HATU及4-甲基嗎啉存在下偶合、隨後用氯化鋅脫除保護基來製備標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=747及749(M+H)+。
中間物F283
N-[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧基乙基]-N2-(溴乙醯基)-L-α-天冬醯胺/三氟乙酸(1：1)
首先，由(2S)-2-胺基-4-側氧基-4-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丁酸 及溴乙酸酐製備經修飾之胺基酸結構單元(2S)-2-[(溴乙醯基)胺基]-4-側氧基-4-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丁酸及溴乙酸酐且由市售3-{[(苯甲氧基)羰基]胺基}-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸/N-環己基環己胺(1：1)製備胺基酸結構單元3-胺基-N-(第三丁氧基羰基)-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。兩種結構單元在HATU及嗎啉存在下偶合且接著使用含有5%濃度三氟乙酸的二氯甲烷移除第三丁氧基羰基保護基，得到矽烷基乙酯保護基且從而得到中間物三氟乙酸/N-{(2R)-2-胺基-3-側氧基-3-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丙基}-N2-(溴乙醯基)-L-α-天冬胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)。
最後，藉由使此中間物與中間物C58在HATU及4-甲基嗎啉存在下偶合、隨後用氯化鋅脫除保護基來製備標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=835及837(M+H)+。
中間物F284
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]胺基}-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，使中間物L80與市售(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下偶合，且接著使用含有 16%濃度三氟乙酸的二氯甲烷移除第三丁氧基羰基保護基，得到矽烷基乙酯保護基。
最後，藉由使此中間物與中間物C58在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下偶合、隨後用氯化鋅脫除保護基來製備標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=984.45(M+H)+。
中間物F285
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-[(18-溴-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十八烷-1-醯基)胺基]-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，用市售溴乙酸酐使中間物L80發生醯基化，且接著使用含有20%濃度三氟乙酸的二氯甲烷移除第三丁氧基羰基保護基，得到矽烷基乙酯保護基。
最後，藉由使此中間物與中間物C58在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下偶合、隨後用氯化鋅脫除保護基來製備標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=967及969(M+H)+。
中間物F286
1-[(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}-D-丙胺醯基)胺基]-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸/三氟乙酸(1：1)
首先，在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，使中間物L91與(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶合，且接著使用含有12.5%濃度TFA的DCM移除Boc保護基。使所得中間物在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與中間物C58偶合且接著藉由氯化鋅脫除保護基而轉化成標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=984(M+H)+。
中間物F288
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-({N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-絲胺醯基}胺基)-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，使35mg(39μmol)中間物C74與預先已由O-第三丁基-L-絲胺酸第三丁酯及(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸製備的N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-絲胺酸偶合。用氯化鋅脫除保護基且藉由HPLC純化，得到14mg(理論值之38%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.43min；MS(ESIpos)：m/z=824.34(M+H)+。
中間物F289
N2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-N6-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-離胺酸/三氟乙酸鹽(1：1)
首先，由N6-[(苯甲氧基)羰基]-N2-(第三丁氧基羰基)-D-離胺酸根據經典的肽化學方法製備三氟乙酸/N6-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)。
接著在HATU及4-甲基嗎啉存在下使12.5mg(25μmol)此中間物與15mg(23μmol)中間物C58偶合。用氯化鋅脫除保護基且藉由HPLC純化，得到14mg(理論值之53%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=779(M+H)+。
中間物F290
N2-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-N6-(溴乙醯基)-D-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，由N6-[(苯甲氧基)羰基]-N2-(第三丁氧基羰基)-D-離胺酸根據經典的肽化學方法製備三氟乙酸/N6-(溴乙醯基)-D-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)。
接著在HATU及4-甲基嗎啉存在下使12mg(25μmol)此中間物與15mg(23μmol)中間物C58偶合。用氯化鋅脫除保護基且藉由HPLC純化，得到7mg(理論值之36%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=762及764(M+H)+。
中間物F291
N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丙基}-L-丙胺醯胺
標題化合物由實例M9如下製備：首先在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶合。在下一步驟中，在室溫下，在標準壓力氫氣下，在10%鈀/活性碳上藉由加氫1小時來移除Z保護基且接著藉由在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶合而將脫除保護基的中間物轉化成標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m/z=777(M+H)+。
中間物F293
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-3-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)苯甲醯基]胺基}-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)
將35mg(39μmol)中間物C74溶解於4ml DMF中，且在N,N-二異丙基乙胺存在下，與13.5mg(43μmol)市售1-(3-{[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶合。用氯化鋅脫除保護基且藉由HPLC純化，得到12mg(理論值之34%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=799(M+H)+。
中間物F294
N-{5-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-5-側氧基戊醯基-L-纈胺醯基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧丙基-L-丙胺醯胺
在室溫下，在標準壓力氫氣下，在10mg 10%鈀/活性碳上，使溶解於12ml甲醇中的41mg(0.05mmol)中間物C76氫化1小時。接著濾出催化劑且在減壓下移除溶劑。由此得到32mg(理論值之92%)脫除 保護基的中間物。
將15mg(0.022mmol)此中間物溶解於DMF中，且添加13mg(0.039mmol)1,1'-[(1,5-二側氧基戊烷-1,5-二基)雙(氧基)]二吡咯啶-2,5-二酮及7μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌1小時之後，濃縮反應物且殘餘物藉由HPLC純化。由此得到9mg(理論值之45%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=895(M+H)+。
中間物F295
N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-羧丙基-L-丙胺醯胺
在室溫下，在標準壓力氫氣下，在10mg 10%鈀/活性碳上，使溶解於12ml甲醇中的41mg(0.05mmol)中間物C76氫化1小時。接著濾出催化劑且在減壓下移除溶劑。由此得到32mg(理論值之92%)脫除保護基的中間物。
將15mg(0.022mmol)此中間物溶解於4ml DMF中，且添加10mg(0.039mmol)1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮及7μl N,N-二異丙基乙胺。在室溫下攪拌2小時之後，濃縮反應物且殘餘物藉由HPLC純化。由此得到10mg(理論值之56%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.08min；MS(ESIpos)：m/z=821(M+H)+。
中間物F296
三氟乙酸/(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-{2-[(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)磺醯基]乙基}丁醯胺(1：1)
標題化合物係由中間物L81在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與中間物C58偶合來製備。在下一步驟中，在室溫下，在標準壓力氫氣下，在DCM/甲醇1：1中，在10%鈀/活性碳上藉由氫化30分鐘來移除Z保護基。脫除保護基的中間物接著藉由在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶合且最後用氯化鋅脫除保護基而轉化成標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=785(M+H)+。
中間物F297
S-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯啶-3-基甲基)胺基]-2-側氧基乙基}-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(異構體1)
在氬氣下，將15mg(0.11mmol)氯化鋅添加至36mg(0.03mmol，68%純)S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(中間物C92)於0.74ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，且反應混合物在50℃攪拌7小時。接著添加32mg(0.11mmol)EDTA且攪拌混合物15分鐘。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水洗滌且用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到6.4mg(理論值之25%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.95min；MS(ESIpos)：m/z=792(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F298
S-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯啶-3-基甲基)胺基]-2-側氧基乙基}-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(異構體2)
在氬氣下，將19mg(0.14mmol)氯化鋅添加至45mg(0.04mmol，71%純)S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(中間物C91)於0.94ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，且反應混合物在50℃攪拌3小時。接著添加42mg(0.14mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到5.7mg(理論值之18%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.96min；MS(ESIpos)：m/z=791(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F299
S-(2-{(3-胺基丙基)[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]胺基}-2-側氧基乙基)-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將76.8mg(0.57mmol)氯化鋅添加至88.0mg(0.09mmol)S-{11-[(R)-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](環己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-半胱胺酸(中間物C84)於1.88ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，且反應混合物在50℃攪拌3小時。接著添加164.6mg(0.57mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。向反應混合物中添加乙酸乙酯，且有機相反覆地用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鈉乾燥且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到31mg(理論值之35%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.82min；MS(ESIpos)：m/z=792(M+H)+。
中間物F300
(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙基)丁醯胺
在氬氣下，將11mg(0.08mmol)氯化鋅添加至7mg(0.08mmol){(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯基]胺基}乙基)胺基]-1-側氧基丁-2-基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C100)於0.2ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，且反應混合物在50℃攪拌8小時。接著添加14mg(0.05mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到1.6mg(理論值之27%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=707(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F302
S-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯啶-3-基甲基)胺基]-2-側氧基乙基}-N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸鹽(1：1)(異構體1)
在氬氣下，將31.7mg(0.23mmol)氯化鋅添加至56.9mg(58.2mmol，85%純)S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-半胱胺酸(中間物C94)於1.4ml 2,2,2-三氟乙醇中的混合物中，且反應混合物在50℃攪拌3小時。接著添加68.0mg(0.23mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到7mg(理論值之13%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=736(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F304
N-(2-{[3-({2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯啶-3-基甲基)胺基]-2-側氧基乙基}硫基)丙醯基]胺基}乙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)三氟乙酸(異構體2)
將13.2mg(0.10mmol)氯化鋅添加至22.3mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三側氧基-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十八烷-1-基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(中間物98)於0.64ml 2,2,2-三氟乙醇中之溶液中，且反應混合物在50℃攪拌8小時。接著添加28.36mg(0.10mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。向反應混合物中添加乙酸乙酯且有機相反覆地用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到5mg(理論值之24%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt 3.05min；MS(ESIpos)：m/z=819(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F305
N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-6,17-二側氧基-N-(吡咯啶-3-基甲基)-10,13-二氧雜-3-硫雜-7,16-二氮雜二十二烷-1-醯胺(1：1)三氟乙酸(異構體2)
將13.42mg(0.10mmol)氯化鋅添加至24.80mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,19-三側氧基-12,15-二氧雜-5-硫雜-2,9,18-三氮雜二十四烷-1-基]吡咯啶-1-甲酸第三丁酯(中間物C99)於0.65ml 2,2,2-三氟乙醇中之溶液中，且反應混合物在50℃攪拌8小時。接著添加28.78mg(0.10mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。向反應混合物中添加乙酸乙酯，且有機相反覆地用水及飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。由此得到10mg(理論值之44%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=3.11min；MS(ESIpos)：m/z=907(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F306
N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-N2-{N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-β-丙胺醯基}-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
標題化合物如下製備：在16.7mg(0.044mmol)HATU及15μl N,N-二異丙基乙胺存在下，使24mg(0.029mmol)中間物C61與30mg(0.035mmol)中間物L99偶合，且隨後在三氟乙醇中用氯化鋅脫除保護基，如針對中間物F119所述。藉由製備型HPLC純化，得到19mg(理論值之52%，經2個步驟)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.84min；MS(ESIpos)：m/z=1091(M+H)+。
中間物F307
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-{(5R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-1-基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/3-胺基-N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)(中間物C80)及2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙醯基)吡咯啶-2,5-二酮溶解於1ml二甲基甲醯胺中，且添加2.9μl(27μmol)N-甲基嗎啉。在室溫下攪拌反應混合物1小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1%TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到5.80mg(理論值之65%)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.57min；MS(ESIpos)：m/z=1008(M+H)+。
將N-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14-硫雜-7,11-二氮 雜-2-矽雜十七烷-17-基)-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(31.9mg，31.6μmol)及L-半胱胺酸(7.66mg，63.2μmol)溶解於3.0ml DMF中且在室溫下攪拌隔夜。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1%TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到28.1mg(理論值之76%)化合物S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四側氧基-19-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-23-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法12)：Rt=2.52min；MS(ESIpos)：m/z=1049[M+H]+
將S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四側氧基-19-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-23-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(13.5mg，11.6μmol)溶解於1.0ml DMF中，添加2,5-二側氧基吡咯啶-1-基N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸酯(6.76mg，11.6μmol)(中間物L88)及N,N-二異丙基乙胺(4.0μl，23μmol)且混合物在室溫下攪拌1小時。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1%TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到11.1mg(理論值之68%)化合物N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四側氧基-19-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-23-基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法14)：Rt=7.38min；MS(ESIpos)：m/z=1412[M+H]+
將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四側氧基-19-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-5-氧雜-14-硫雜-7,11,18,21-四氮雜-2-矽雜二十三烷-23-基]-L-半胱胺酸(9.40mg，6.6 5μmol)溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加二氯化鋅(5.44mg，39.9μmol)。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加二氯化鋅(5.44mg，39.9μmol)，且反應混合物在50℃攪拌1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(23.4mg，79.8μmol)，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到5.60mg(理論值之66%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.93min；MS(ESIpos)：m/z=1168(M+H)+。
中間物F308
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[(12R,19R)-19-胺基-4-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-12,19-二羧基-5,10,15-三側氧基-7,17-二硫雜-4,11,14-三氮雜十九烷-1-基]-L-丙胺醯胺/三氟乙酸(1：1)
將N-[3-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)丙醯基]-3-[(溴乙醯基)胺基]-D-丙胺酸/三氟乙酸(1：1)(12.7mg，14.5μmol)及N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸(3.84mg，14.5μmol)溶解於1.5ml DMF中，且在室溫下攪拌混合物隔夜。
接著添加N,N-二異丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。在室溫下攪拌反應混合物3小時，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到7.40mg(理論值之48%)化合物S-{(5R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=949[M+H]+
將S-{(5R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13- 三氮雜十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(7.50mg，7.05μmol)溶解於1.0ml DMF中，且添加N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(4.11mg，82%純，7.05μmol)(中間物L88)及N,N-二異丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。反應混合物在室溫下攪拌1小時且接著直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.30mg(46%)化合物N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四側氧基-5-氧雜-10,20-二硫雜-7,13,16,23-四氮雜-2-矽雜二十六烷-26-基]-L-丙胺醯胺。
LC-MS(方法14)：Rt=6.47min；MS(ESIpos)：m/z=1312[M+H]+
將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四側氧基-5-氧雜-10,20-二硫雜-7,13,16,23-四氮雜-2-矽雜二十六烷-26-基]-L-丙胺醯胺(4.00mg，3.05μmol)溶解於1.0ml三氟乙醇中，且添加二氯化鋅(2.49mg，18.3μmol)。反應混合物在50℃攪拌1小時，接著添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(5.34mg，18.3μmol)，攪拌混合物10分鐘且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到2.50mg(理論值之64%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.00min；MS(ESIpos)：m/z=1168[M+H]+
中間物F309
4-{[(11R,17R)-16-(3-胺基丙基)-17-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-18,18-二甲基-6,6-二氧離子基-2,10,15-三側氧基-6λ6,13-二硫雜-3,9,16-三氮雜十九烷-11-基]胺基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
首先將S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-側氧基丁醯基)-L-半胱胺酸(50.0mg，57.3μmol)(中間物C77)及三氟乙酸/{2-[(2-胺基乙基)磺醯基]乙基}胺基甲酸苯甲酯(1：1)(27.5mg，68.7μmol)(中間物L81)饋入4.0ml DMF中，且添加HATU(26.1mg，68.7μmol)及N,N-二異丙基乙胺(30μl，170μmol)。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘且接著直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到53.9mg(81%)化合物4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26,26-二甲基-7,7-二氧離子基-3,11,16,22-四側氧基-1-苯基-2,23-二氧雜-7λ6,14-二硫雜- 4,10,17,21-四氮雜-26-矽雜二十七烷-12-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.54min；MS(ESIpos)：m/z=1141[M+H]+
在氬氣下，首先將乙酸鈀(II)(5.12mg，22.8μmol)饋入3.0ml DCM中，添加三乙胺(9.5μl，68μmol)及三乙基矽烷(73μl，460μmol)且攪拌混合物5分鐘。接著添加含有4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26,26-二甲基-7,7-二氧離子基-3,11,16,22-四側氧基-1-苯基-2,23-二氧雜-7λ6,14-二硫雜-4,10,17,21-四氮雜-26-矽雜二十七烷-12-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯(52.1mg，45.6μmol)的2.0ml DCM。在室溫下攪拌反應混合物隔夜，且添加2.0ml水。在減壓下蒸發溶劑。向殘餘物中添加乙腈，過濾混合物且產物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到43.4mg(85%)化合物三氟乙酸/4-{[(16R)-23-胺基-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧離子基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14,21λ6-二硫雜-7,11,18-三氮-2-矽雜二十三烷-16-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.21min；MS(ESIpos)：m/z=1007[M+H]+
首先將三氟乙酸/4-{[(16R)-23-胺基-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧離子基-6,12,17-三側氧基-5-氧雜-14,21λ6-二硫雜-7,11,18-三氮雜-2-矽雜二十三烷-16-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯(1：1)(20.0mg，17.8μmol)及(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸(3.32mg，21.4μmol)饋入2.0ml DMF中，且添加HATU(8.14mg，21.4μmol)及N,N-二異丙基乙胺(9.3μl，54μmol)。
在室溫下攪拌反應混合物10分鐘。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1%TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到17.4mg(85%)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧離子基-6,12,17,25-四側氧基-5-氧雜-14,21λ6-二硫雜-7,11,18,24-四氮雜-2-矽雜二十六烷-16-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=1144[M+H]+
將4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧離子基-6,12,17,25-四側氧基-5-氧雜-14,21λ6-二硫雜-7,11,18,24-四氮雜-2-矽雜二十六烷-16-基]胺基}-4-側氧基丁酸第三丁酯(15.9mg，13.9μmol)溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加二氯化鋅(11.4mg，83.4μmol)。在50℃攪拌反應混合物1小時。添加二氯化鋅(11.4mg，83.4μmol)，且反應混合物在50℃攪拌1小時。添加二氯化鋅(11.4mg，83.4μmol)，且反應混合物在50℃攪拌1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(73.2mg，250μmol)，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到10mg(理論值之68%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.45min；MS(ESIpos)：m/z=944[M+H]+
中間物F310
三氟乙酸/N-[(8R,14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-15,15-二 甲基-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-8-基]-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-醯胺(1：1)
首先將S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(100mg，120μmol)(中間物C70)及1-[(14-側氧基-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-基)氧基]吡咯啶-2,5-二酮(44.1mg，132μmol)饋入3.0ml DMF中，且添加4-甲基嗎啉(40μl，360μmol)。反應混合物在室溫下攪拌隔夜，用乙酸(420μmol)淬滅且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1%TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到69.4mg(理論值之62%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(14-側氧基-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-基)-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法12)：Rt=2.61min；MS(ESIneg)：m/z=933[M-H]-
首先將S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]- 2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(14-側氧基-2,5,8,11-四氧雜十四烷-14-基)-L-半胱胺酸(27.0mg，28.9μmol)饋入2.0ml DMF中，且添加N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(11.4mg，57.7μmol)(中間物L1)、N,N-二異丙基乙胺(15μl，87μmol)及HATU(22.0mg，57.7μmol)。反應混合物在室溫下攪拌3小時且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到13.7mg(理論值之43%)化合物{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺甲醯基]-14,20-二側氧基-2,5,8,11-四氧雜-18-硫雜-15,21-二氮雜二十四烷-24-基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯。
LC-MS(方法12)：Rt=2.54min；MS(ESIpos)：m/z=1114[M+H]+
將{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)胺甲醯基]-14,20-二側氧基-2,5,8,11-四氧雜-18-硫雜-15,21-二氮雜二十四烷-24-基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(13.7mg，12.3μmol)溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加二氯化鋅(10.1mg，73.8μmol)。在50℃攪拌反應混合物4小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(21.6mg，73.8μmol)，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到7.30mg(理論值之47%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.01min；MS(ESIpos)：m/z=970[M+H]+
中間物F311
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,30-二側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，將1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-酸(10.8mg，18.7μmol)(中間物L97)饋入1.0ml DMF中，添加N,N-二異丙基乙胺(5.4μl，31.2μmol)及HATU(7.10mg，18.7μmol)且攪拌混合物10分鐘。接著添加溶解於1.0ml DMF及N,N-二異丙基乙胺(2.7μl，15.6μmol)中的S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(12.9mg，15.6μmol)(中間物C71)。反應混合物在室溫下攪拌2小時且接著直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水 /0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到3.5mg(18%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,30-二側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.30min；MS(ESIneg)：m/z=1276[M-H]-
將S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,30-二側氧基-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧雜-3-氮雜三十烷-30-基]-L-半胱胺酸(3.50mg，2.74μmol)溶解於1.0ml三氟乙醇中，且添加二氯化鋅(6.25mg，16.4μmol)。在50℃攪拌反應混合物4小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(47μl，16μmol)，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到2.0mg(理論值之59%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.94min；MS(ESIpos)：m/z=1133(M+H)+。
中間物F312
N-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-L-纈胺醯基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]-1-{[2-(L-γ-麩胺醯基胺基)乙基]胺基}-1-側氧基丁-2-基]-L-丙胺醯胺/三氟乙酸(1：1)
標題化合物係由中間物C103在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下與N-[(苯甲氧基)羰基]-L-纈胺醯基-L-丙胺酸偶合來製備。在下一步驟中，在室溫下，在標準壓力氫氣下，在DCM/甲醇1：1中，在10%鈀/活性碳上藉由氫化1小時來移除Z保護基。脫除保護基的中間物接著如下轉化成標題化合物：在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，與(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸偶合且最後用氯化鋅脫除保護基且藉由製備型HPLC純化。
LC-MS(方法1)：Rt=0.9min；MS(ESIpos)：m/z=992(M+H)+。
中間物F313
S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
在氬氣下，將16.9mg(0.13mmol)N,N-二異丙基乙胺及50.0mg(0.13mmol)HATU添加至55.0mg(0.14mmol)1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-酸於2.60ml DMF中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。接著添加溶液40.0mg(0.05mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸(中間物C107)，且在室溫下攪拌混合物隔夜。添加水且用二氯甲烷萃取混合物。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到10mg(理論值之13%，純度82%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.36min；MS(ESIpos)：m/z=1145(M+H)+。
將4.3mg(0.03mmol)氯化鋅添加至10.9mg(7.8mmol，82%純)S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸 於0.85ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，且反應混合物在50℃攪拌2.5小時。接著添加9.1mg(0.03mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。藉由製備型HPLC純化反應混合物。由此得到2.3mg(理論值之26%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt 0.89min；MS(ESIpos)：m/z=781(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F314
三氟乙酸/3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丙醯胺
在氬氣下，將16.89mg(0.13mmol)N,N-二異丙基乙胺及33.13mg(0.087mmol)HATU添加至50.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙酸(中間物C106)於3.14ml DMF中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。接著添加27.29mg(0.09mmol)N-(2-胺基 乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)三氟乙酸(中間物L1)溶液，且混合物在室溫下攪拌15分鐘。添加水且用二氯甲烷萃取混合物。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到41mg(理論值之68%，純度66%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.55min；MS(ESIneg)：m/z=959(M-H+Na)-。
將24.7mg(0.18mmol)氯化鋅添加至41.1mg(0.03mmol，純度66%)(3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三側氧基-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十四烷-1-基]-4-氟吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯於2.54ml 2,2,2-三氟乙醇中，且反應混合物在50℃攪拌2.5小時。接著添加53.0mg(0.18mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。藉由製備型HPLC純化反應混合物。由此得到10mg(理論值之36%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt 0.89min；MS(ESIpos)：m/z=781(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F315
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙醯基}-L-半胱胺酸
在氬氣下，將18.02mg(0.14mmol)N,N-二異丙基乙胺及31.82mg(0.09mmol)HATU添加至50.0mg(0.07mmol)3-[5-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(中間物L100)於3.5ml DMF中的溶液中。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。接著添加50.0mg(0.07mmol)N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺乙酸鹽(1：1)(中間物C107)，且在室溫下攪拌混合物2小時。添加水且用二氯甲烷萃取混合物。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物不經純化即進一步使用。由此得到49mg(理論值之21%，純度31%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.30min；MS(ESIpos)：m/z=1022(M+H)+。
將8.0mg(0.06mmol)氯化鋅添加至49.0mg(0.015mmol，31%純)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺 基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙醯基}-L-半胱胺酸於0.5ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，且反應混合物在50℃攪拌2小時。接著添加17.2mg(0.06mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。藉由製備型HPLC純化反應混合物。由此得到3mg(理論值之21%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=877(M+H-CF3CO2H)+。
中間物F316
三氟乙酸/N-{2-[(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)胺基]乙基}-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺(1：1)
在氬氣下，將16.89mg(0.13mmol)N,N-二異丙基乙胺及33.13mg(0.087mmol)HATU添加至50.0mg(0.04mmol，65%純度)3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙 基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙酸(中間物106)於3.0ml DMF中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘。接著添加37.2mg(0.09mmol，純度70%)N-(2-胺基乙基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺乙酸鹽(1：1)(中間物L73)溶液，且混合物在室溫下攪拌7分鐘。添加水且用二氯甲烷萃取混合物。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。殘餘物不經純化即進一步使用。由此得到57mg(理論值之77%，純度59%)標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=2.60min；MS(ESIpos)：m/z=981(M+H)+。
將36.0mg(0.27mmol)氯化鋅添加至56.0mg(0.03mmol，59%純)(3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三側氧基-5-硫雜-2,9,12-三氮雜十八烷-1-基]-4-氟吡咯啶-1-甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯於2.8ml 2,2,2-三氟乙醇中之溶液中，且反應混合物在50℃攪拌2小時。接著添加78.3mg(0.27mmol)EDTA，且攪拌混合物15分鐘。藉由製備型HPLC純化反應混合物。由此得到16mg(理論值之44%，85%純)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=837(M+H-AcOH)+。
中間物F317
1-[(S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺醯基)胺基]-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸/三氟乙酸(1：1)
在氬氣下，首先將30.2mg(0.06mmol)N,N'-雙[(苯甲氧基)羰基]-L-胱胺酸饋入2.0ml水及2.0ml異丙醇中，且添加56.7mg(0.20mmol)TCEP。在室溫下攪拌反應混合物30分鐘。將50.0mg(0.08mmol)之{3-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]丙基}胺基甲酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(中間物C70)溶解於2.0ml異丙醇中，且接著添加122.2mg(0.48mmol)之1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一烷-7-烯，且反應混合物在50℃攪拌7小時。接著再添加122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一烷-7-烯，且反應混合物在50℃攪拌1小時。混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相用水及飽和碳酸氫鈉溶液萃取且用飽和NaCl溶液洗滌。有機相經硫酸鎂乾燥且在減壓下蒸發溶劑。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到43.1mg(理論值之64%)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法1)：Rt=1.46min；MS(ESIpos)：m/z=851(M+H)+。
在氬氣下，將S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-半胱胺酸(50.0mg，59μmol)溶解於1.0ml DMF中，且添加N,N-二異丙基乙胺(20.5μl，117μmol)及HATU(26.8mg，70μmol)。攪拌反應混合物10分鐘。接著添加1-胺基-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯(22.6mg，70μmol)。攪拌反應混合物1小時且接著直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到59.3mg(理論值之87.5%)化合物1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-半胱胺酸基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯。
LC-MS(方法12)：Rt=2.97min；MS(ESIpos)：m/z=1154[M+H]+
在氬氣下，首先將乙酸鈀(II)(6.74mg，30.0μmol)饋入3.0ml二氯甲烷中且添加三乙胺(13μl，90μmol)及三乙基矽烷(96μl，600μmol)。攪拌反應混合物5分鐘，且接著添加含有1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[(苯甲氧基)羰基]-L-半胱胺酸基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯(69.3mg，60.0μmol)的1.0ml二氯甲烷。反應混合物在室溫下攪拌2小時，且接著添加三乙基矽烷(48μl，300μmol)。反應混合物在室溫下攪拌2小時，且添加2.0ml水(0.1% TFA)。在減壓下無加熱來蒸發溶劑。將殘餘物溶解於乙腈中，經由針筒過濾器過濾且藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到65.9mg(理論值之97%)化合物三氟乙酸/1-{[S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基]胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯(1：1)。
LC-MS(方法1)：Rt=1.22min；MS(ESIpos)：m/z=1020[M+H]+
在氬氣下，首先將1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-酸(4.26mg，10.6μmol)饋入1.0ml DMF中，且添加N,N-二異丙基乙胺(3.2μl，18μmol)及HATU(4.02mg，10.6μmol)。攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加溶解於1.0ml DMF中的三氟乙酸/1-{[S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺醯基]胺基}-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯(1：1)(10.0mg，8.82μmol)，及N,N-二異丙基乙胺(1.5μl，8.8μmol)。在室溫下攪拌反應混合物1小時且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到10.9mg(理論值之93%)化合物1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=1404[M+H]+
將1-({S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽 雜十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸基}胺基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-酸第三丁基酯(8.20mg，5.84μmol)溶解於2.0三氟乙醇中，且添加氯化鋅(4.77mg，35.0μmol)。在50℃攪拌反應混合物1小時。
添加氯化鋅(4.77mg，35.0μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(10.2mg，35.0μmol)，攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.1mg(理論值之53%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.90min；MS(ESIpos)：m/z=1204[M+H]+
中間物F318
三氟乙酸/3-{[2-([3-胺基-4-氟丁基]{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-2-側氧基乙基]硫基}-N-(2-{[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]胺基}乙基)丙醯胺(1：1)
首先將(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(124mg，350μmol)(中間物C52)饋入5.0ml二氯甲烷中，且添加三乙醯氧基硼氫化鈉(104mg，491μmol)及乙酸(23μl，400μmol)。在室溫下攪拌反應混合物5分鐘，且接著添加溶解於3.0ml二氯甲烷中的[1-氟-4-側氧基丁-2-基]胺基甲酸第三丁酯(82.7mg，403μmol)(中間物L123)。反應混合物在室溫下攪拌隔夜，且接著添加乙酸乙酯。混合物用飽和碳酸氫鈉溶液且接著用飽和氯化鈉溶液洗滌兩次。有機相經硫酸鎂乾燥且接著濃縮。使用移動相環己烷/乙酸乙酯95：5，在Biotage/Isolera(SNAP 25g)上藉由管柱層析純化殘餘物。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到146mg(理論值之77%)化合物[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-1-氟丁烷-2-基]胺基甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法13)：Rt=2.57min；MS(ESIneg)：m/z=588[M+CHOOH-H]-
將[4-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)-1-氟丁烷-2-基]胺基甲酸第三丁酯(100mg，184μmol)溶解於6.0ml DCM中，且在0℃添加三乙胺(85μl，610μmol)及氯乙醯氯(47μl，590μmol)。在室溫下攪拌反應混合物隔夜。在減壓下蒸發溶劑。將殘餘物溶解於乙腈/水中且藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到80mg(理論值之70%)化合物{4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]-1-氟丁烷-2-基}胺基甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法12)：Rt=2.67min；MS(ESIneg)：m/z=664[M-H+COOH]-
首先將{4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙醯基)胺基]-1-氟丁烷-2-基}胺基甲酸第三丁酯(79.2mg，128μmol)及3-硫基丙酸酸(12μl，140μmol)及一滴水饋入3.0ml甲醇中。添加碳酸鉀(61.8mg，447μmol)且反應混合物在50℃攪拌4小時。添加乙酸乙酯且反覆地用水洗滌混合物。有機相用飽和氯化鈉溶液洗滌，經硫酸鎂乾燥且接著濃縮。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到68.6mg(理論值之78%)化合物9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(氟甲基)-2,2-二甲基-4,10-二側氧基-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十五烷-15-酸。
LC-MS(方法12)：Rt=2.46min；MS(ESIneg)：m/z=688[M-H]-
首先將9-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(氟甲基)-2,2-二甲基-4,10-二側氧基-3-氧雜-12-硫雜-5,9-二氮雜十五烷-15-烷酸(15.0mg，21.7μmol)及三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(1：1)(8.12mg，26.1μmol)(中間物L1)饋入1.6ml DMF中。添加HATU(9.92mg，26.1μmol)及N,N-二異丙基乙胺(11μl，65μmol)，且在室溫下攪拌反應混合物5分鐘。添加水(0.1% TFA)且反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到18.6mg(理論值之98%)化合物[13-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氟-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十七烷-16-基]胺基甲酸第三丁酯。
LC-MS(方法12)：Rt=2.36min；MS(ESIpos)：m/z=869[M+H]+
將[13-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-氟-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十七烷-16-基]胺基甲酸第三丁酯(17.0mg，19.6μmol)溶解於2.0ml三氟乙醇中。添加氯化鋅(16.0mg，117μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。再次添加氯化鋅(16.0mg，117μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。向混合物中添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(68.6mg，234μmol)，接著添加水(0.1% TFA)且隨後在減壓下濃縮混合物。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到10.7mg(理論值之60%)標題化合物。
LC-MS(方法14)：Rt=5.51min；MS(ESIpos)：m/z=769[M+H]+
中間物F319
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-L-天冬胺酸
在氬氣下，首先將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)胺基]-3-側氧基丙基}硫基)乙醯基]胺基)丙基]-L-丙胺醯胺(9.80mg，9.88μmol)(中間物C116)及L-天冬胺酸二第三丁酯鹽酸鹽(1：1)(3.34mg，11.9μmol)饋入1.0ml DMF中，且添加HATU(4.51mg，11.9μmol)及N,N-二異丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到10.5mg(理論值之87%)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-L-天冬胺酸二第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.33min；MS(ESIpos)：m/z=1219[M+H]+
將N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-L-天冬胺酸二第三丁酯(9.70mg，7.95μmol)溶解於1.5ml三氟乙醇中。添加氯化鋅(6.50mg，47.7μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。再次添加氯化鋅(6.50mg，47.7μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。向混合物中添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(27.9mg，55.4μmol)，接著添加水(0.1% TFA)且隨後在減壓下濃縮混合物。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到4.10mg(理論值之47%)標 題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=1107[M+H]+
中間物F320
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]胺基}-3-側氧基丙基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]-L-丙胺醯胺
在氬氣下，首先將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(2-羧基乙基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]-L-丙胺醯胺(20.0mg，21.7μmol)(中間物C115)及L-麩胺酸二第三丁酯鹽酸鹽(1：1)(7.71mg，26.1μmol)饋入2.0ml DMF中，且添加HATU(9.91mg，26.1μmol)及N,N-二異丙基乙胺(11μl，65μmol)。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘且接著直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到16.4mg(理論值之 65%)化合物(2S)-2-{[(13S,16S)-7-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-異丙基-13-甲基-6,12,15,18-四側氧基-4-硫雜-7,11,14,17-四氮雜二十三烷-1-醯基]胺基}戊二酸二第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.40min；MS(ESIpos)：m/z=1162[M+H]+
將(2S)-2-{[(13S,16S)-7-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-16-異丙基-13-甲基-6,12,15,18-四側氧基-4-硫雜-7,11,14,17-四氮雜二十三烷-1-醯基]胺基}戊二酸二第三丁酯(14.7mg，12.6μmol)溶解於1.5ml三氟乙醇中。添加氯化鋅(10.3mg，75.9μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。再次添加氯化鋅(10.3mg，75.9μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。向混合物中添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(44.4mg，152μmol)，接著添加水(0.1% TFA)且隨後在減壓下濃縮混合物。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到6.0mg(理論值之45%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.10min；MS(ESIneg)：m/z=1048[M-H]-
中間物F321
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-D-麩胺酸
在氬氣下，首先將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)胺基]-3-側氧基丙基}硫基)乙醯基]胺基)丙基]-L-丙胺醯胺(9.80mg，9.88μmol)(中間物C116)及D-麩胺酸二第三丁酯鹽酸鹽(1：1)(3.51mg，11.9μmol)饋入1.0ml DMF中，且添加HATU(4.51mg，11.9μmol)及N,N-二異丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到11.7mg(理論值之96%)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1233[M+H]+
將N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]- 2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-D-麩胺酸二第三丁酯(11.5mg，9.32μmol)溶解於1.5ml三氟乙醇中。添加(7.62mg，55.9μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。再次添加氯化鋅(7.62mg，55.9μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。向混合物中添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(32.6mg，112μmol)，接著添加水(0.1% TFA)且隨後在減壓下濃縮混合物。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到6.5mg(理論值之62%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=1121[M+H]+
中間物F322
N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-L-麩胺酸
在氬氣下，首先將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({3-[(2-羧基乙基)胺基]-3-側氧基丙基}硫基)乙醯基]胺基)丙基]-L-丙胺醯胺(9.80mg，9.88μmol)(中間物C116)及L-麩胺酸二第三丁酯鹽酸鹽(1：1)(3.51mg，11.9μmol)饋入1.0ml DMF中，且添加HATU(4.51mg，11.9μmol)及N,N-二異丙基乙胺(5.2μl，30μmol)。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到11.3mg(理論值之93%)化合物N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-L-麩胺酸二第三丁酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.34min；MS(ESIpos)：m/z=1233[M+H]+
將N-(3-{[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]- 2,2-二甲基丙基}[3-({N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-L-丙胺醯基}胺基)丙基]胺基)-2-側氧基乙基]硫基}丙醯基)-β-丙胺醯基-L-麩胺酸第三丁基酯(11.0mg，8.92μmol)溶解於1.5ml三氟乙醇中。添加氯化鋅(7.29mg，53.5μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。再次添加氯化鋅(7.29mg，53.5μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。向混合物中添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(31.2mg，107μmol)，接著添加水(0.1% TFA)且隨後在減壓下濃縮混合物。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到5.10mg(理論值之51%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.07min；MS(ESIpos)：m/z=1121[M+H]+
中間物F323
N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({[(3-{[(1R)-2-(L-β-天冬胺醯基胺基)-1-羧基乙基]胺基}-3-側氧基丙基)硫基]乙醯基}{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-L-丙胺醯胺/三氟乙酸(1：1)
在氬氣下，首先將N-[6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯基]-L-纈胺醯基-N-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(2-羧基乙基)硫基]乙醯基}胺基)丙基]-L-丙胺醯胺(10.0mg，7.05μmol)(中間物C115)及N-{(2R)-2-胺基-3-側氧基-3-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]丙基}-N2-(第三丁氧基羰基)-L-天冬胺酸第三丁酯(4.02mg，8.46μmol)(中間物L124)饋入2.0ml DMF中，且添加HATU(3.22mg，8.46μmol)及N,N-二異丙基乙胺(3.7μl，21μmol)。在室溫下攪拌反應混合物10分鐘且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到4.3mg(理論值之32%)化合物(6S,11R,25S,28S)-19-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-28-異丙基-2,2,25-三甲基-4,8,13,18,24,27,30-七側氧基-3-氧雜-16-硫雜-5,9,12,19,23,26,29-七氮雜三十五烷-6,11-二甲酸6-第三丁酯11-[2-(三甲基矽烷基)乙基]酯。
LC-MS(方法5)：Rt=5.32min；MS(ESIpos)：m/z=1379[M+H]+
將(6S,11R,25S,28S)-19-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-28-異丙基-2,2,25-三甲基-4,8,13,18,24,27,30-七側氧基-3-氧雜-16-硫雜-5,9,12,19,23,26,29-七氮雜三十五烷-6,11-二甲酸6-第三丁酯11-[2-(三甲基矽烷基)乙基]酯(4.10mg，73%純，2.17μmol)溶解於2.0ml三氟乙醇中。添加氯化鋅(1.77mg，13.0μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。氯化鋅(1.77mg，13.0μmol)分五次以上添加且反應混合物在50℃攪拌1小時。向混合物中添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(22.0mg，78μmol)，接著添加水(0.1% TFA)且隨後在減壓下濃縮混合物。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到2.1mg(理論值之69%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.98min；MS(ESIpos)：m/z=1122[M+H]+
中間物F324
S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[吡咯啶-3-基甲基]胺基)-2-側氧基乙基]-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(異構體1)
在氬氣下，首先將1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2-側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-酸(99.6mg，247μmol)(中間物L74)饋入1.4ml DMF中，且添加HATU(90.4mg，238μmol)及N,N-二異丙基乙胺(41μl，240μmol)。反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，且添加溶解於1.4ml DMF中的S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-L-半胱胺酸(70.0mg，95.2μmol)(中間物C90)。反應混合物在室溫下攪拌隔夜且直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且將殘餘物溶解於很少的水中且凍乾。由此得到19.0mg(理論值之18.4%)化合物S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R)-1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基乙基]-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸。
LC-MS(方法12)：Rt=2.29min；MS(ESIpos)：m/z=1082[M+H]+
將S-[2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(第三丁氧基羰基)吡咯啶-3-基]甲基}胺基)-2-側氧基 乙基]-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸(17.0mg，15.7μmol)溶解於2.0ml三氟乙醇中。添加氯化鋅(8.56mg，62.8μmol)且反應混合物在50℃攪拌1小時。再次添加氯化鋅(8.56mg，62.8μmol)且反應混合物在50℃攪拌2小時。向混合物中添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(36.7mg，126μmol)，接著添加水(0.1% TFA)且隨後在減壓下濃縮混合物。殘餘物藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到3.90mg(理論值之22%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.89min；MS(ESIpos)：m/z=983[M+H]+
中間物F325
N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-[(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯基]-D-α-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
在1.5當量HATU及3當量N,N-二異丙基乙胺存在下，使30mg(0.046mmol)中間物C58與29mg(0.055mmol)三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-N2-[(苯甲氧基)羰基]-D-α-麩胺酸苯甲酯(1：1)偶合。藉由製備型 HPLC純化，得到39.5mg(理論值之82%)經保護的中間物。首先，利用氫解方式移除此中間物的苯甲酯基。隨後在3當量N,N-二異丙基乙胺存在下，在DMF中與1-{2-[(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)氧基]-2-側氧基乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶合且在三氟乙醇中用氯化鋅移除Teoc保護基(如針對中間物F119)，接著以2個其他步驟得到標題化合物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=822(M+H)+。
中間物F326
N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-N2-(溴乙醯基)-D-α-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
在1.5當量HATU及4當量4-甲基嗎啉存在下，使43mg(0.066mmol)中間物C58與57mg(0.077mmol)中間物L125偶合。藉由製備型HPLC純化，得到27mg(理論值之34%)經保護的中間物。此物接著在三氟乙醇中使用氯化鋅轉化成標題化合物，如針對中間物F119所述。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=805及807(M+H)+。
B：製備抗體藥物結合物(ADC)
B-1. 用於產生ITEM-4及ITEM-4之嵌合及人類化變異體的通用方法
ITEM-4為Nakayama等人所述的抗TWEAKR抗體(Nakayama等人，2003,Biochem Biophy Res Comm,306：819-825)。ITEM-4之可變區(VH及VL)之序列揭示於Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)中。基於CDR移植於人類構架區中之此抗體的人類化變異體已描述於Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)及WO 2009/020933中。
基於Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)中之ITEM-4之可變區(VH及VL)之序列的公開案及Zhou等人(Zhou等人，2013,J Invest Dermatol.133(4)：1052-62)及WO 2009/020933中之基於CDR移植於人類構架區中之此抗體之人類化變異體的公開案，獲得以下抗體序列：「TPP-7007」、「TPP-7053」、「TPP-7005」、「TPP-7073」、「TPP-7075」及「TPP-7076」。
ITEM-4之可變區VH及VL連接至人類IgG1 κ亞型之恆定區(CL、CH1、CH2、CH3)，獲得嵌合抗體「TPP-7006」及「TPP-7074」之序列。
ITEM-4之L-CDR1中之潛在去醯胺化位點之修飾產生抗體「TPP-7073」、「TPP-7074」、「TPP-7075」及「TPP-7076」。
ITEM-4抗體之其他人類化變異體可藉由此項技術中已知的人類化方法產生。
ITEM-4在商業上獲得(尤其以13-9018獲自eBioscience®(Ref 7016-9018 M010)。
B-2. 用於哺乳動物細胞表現抗TWEAKR抗體的通用方法
抗體可在哺乳動物細胞之短暫培養基中產生，如Tom等人，Methods Express：Expression Systems第12章所述，Micheal R.Dyson及Yves Durocher編，Scion Publishing Ltd,2007(參見AK-實例1)。
B-3. 用於自細胞上清液純化抗體的通用方法
抗體可獲自細胞培養上清液。為此目的，藉由細胞離心來澄清細胞上清液。接著藉由在MabSelect Sure(GE Healthcare)層析管柱上進行親和層析來純化細胞上清液。為此目的，管柱在DPBS pH 7.4(Sigma/Aldrich)中平衡，施加細胞上清液，且管柱用約10個管柱體積之DPBS pH 7.4+500mM氯化鈉洗滌。抗體於50mM乙酸鈉pH 3.5+500mM氯化鈉中溶離且接著藉由在DPBS pH 7.4中、在Superdex 200管柱(GE Healthcare)上進行凝膠過濾層析來進一步純化。
B-4. 用於與半胱胺酸側鏈偶聯的通用方法
偶合反應使用以下抗體：
抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)
抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)
抗TWEAKR AK1C(TPP-7006)
抗TWEAKR AK1D(TPP-7007)
將2當量與5當量之間的溶解於PBS緩衝液中之三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)添加至適當抗體於PBS緩衝液中之溶液中，該抗體的濃度範圍在1mg/ml與20mg/ml之間，較佳在約5mg/ml至15mg/ml之範圍內，且在室溫下攪拌混合物1小時。為此目的，所用相應抗體的溶液可在實施例中所述的濃度下使用，或其亦可視情況用PBS緩衝液稀釋至約所述起始濃度之一半以便達成較佳濃度範圍。隨後，視預定負載量而定，添加待偶合的2至12當量(較佳約5-10當量)之順丁烯二醯亞胺前驅化合物或鹵化物前驅化合物於DMSO中之溶液。在此，DMSO之量不應超過總體積之10%。反應物在順丁烯二醯亞胺前驅物的情況下，在室溫下攪拌60-240分鐘且在鹵化物前驅物的情況下，在室溫下攪拌8小時至24小時，且接著施加至經PBS平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上且用PBS緩衝液溶離。一般而言，除非另外指明，否則使用PBS緩衝液中之5mg相關抗體進行還原且隨 後偶合。在PD10管柱上純化，從而分別得到相應ADC於3.5ml PBS緩衝液中的溶液。接著藉由超速離心來濃縮樣品且視情況用PBS緩衝液再稀釋。必要時，為了更好地移除低分子量組分，在用PBS緩衝液再稀釋之後，重複超濾濃縮。在生物測試中，必要時，視情況藉由再稀釋將最終ADC樣品的濃度調節至0.5-15mg/ml範圍。測定實施例中所述的ADC溶液中之相應蛋白質濃度。另外，使用B-7下所述的方法測定抗體負載量(藥物/mAb比率)。
視連接子而定，實例中所示的ADC亦可以連接至抗體之水解開鏈丁二醯胺形式、以較低或較高的含量存在。
特定而言，經由連接子次結構連接至抗體硫醇基的KSP-I-ADC
根據流程26、經由開鏈丁二醯胺連接的ADC、在偶合且在pH 8攪拌約20-24小時之後，視情況亦可藉由再緩衝而以靶向方式製備。
#1表示連至抗體的硫橋，且#2表示連至經修飾之KSP抑制劑的連接點。
其中連接子經由水解開鏈丁二醯胺連接至抗體的此類ADC亦可視情況藉由如下例示性程序、以靶向方式製備：
小規模偶合：
將2當量至5當量之溶解於PBS緩衝液中的三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)添加至2-5mg相關抗體於PBS緩衝液中之溶液中，該抗體的濃度範圍為1mg/ml至20mg/ml，較佳在約5mg/ml至15mg/ml範圍內，且在室溫下攪拌混合物30分鐘至1小時。為此目的，所用相應抗體的溶液可以實施例中指定的濃度使用或視情況亦用PBS緩衝液稀釋至約所述起始濃度的一半以達成較佳濃度範圍。隨後，視預定饋料比 而定，添加待偶合之2至12當量(較佳約5-10當量)順丁烯二醯亞胺前驅化合物於DMSO中的溶液。在此，DMSO之量不應超過總體積之10%。混合物在室溫下攪拌60-240分鐘且接著用預先已調節至pH 8的PBS緩衝液稀釋至3-7ml之體積且在室溫下、在氬氣下攪拌隔夜。接著使此溶液通過經PBS緩衝液pH 7.2平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)且用PBS緩衝液pH 7.2溶離。隨後藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)反向稀釋。
中規模偶合：
在氬氣下，將0.344mg TCEP於100μl PBS緩衝液中的溶液添加至含有60mg相關抗體的5ml PBS緩衝液(濃度約12mg/ml)中。在室溫下攪拌反應物30分鐘，且接著添加溶解於600μl DMSO中的0.003mmol順丁烯二醯亞胺前驅化合物。在室溫下再攪拌1.5小時至2小時之後，反應物用預先已調節至pH 8的1075μl PBS緩衝液稀釋。
接著將此溶液施加至已經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，且用PBS緩衝液pH 8溶離。溶離液用PBS緩衝液pH 8稀釋至14ml總體積。此溶液在室溫下，在氬氣下攪拌隔夜。必要時，接著將溶液再緩衝至pH 7.2。ADC溶液藉由超速離心來濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋且接著視情況再次濃縮至約10mg/ml之濃度。
實施例中連至抗體的其他潛在水解敏感性噻烷基丁二醯胺橋含有以下連接子子結構，其中#1表示連至抗體的硫醚鍵且#2表示連至經修飾之KSP抑制劑的連接點：
此等連接子子結構表示連至抗體的連接單元且(除連接子組成之外)對腫瘤細胞中所形成之代謝物的結構及概況具有顯著影響。
在所示結構式中，AK1A、AK1B、AK1C及AK1D具有以下含義：
AK1A=抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)(部分還原)-S§1
AK1B=抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)(部分還原)-S§1
AK1C=抗TWEAKR AK1C(TPP-7006)(部分還原)-S§1
AK1D=抗TWEAKR AK1D(TPP-7007)(部分還原)-S§1
其中§1 表示連至丁二醯亞胺基團或連至任何異構體水解開鏈丁二醯胺的鍵聯或由其所產生的伸烷基，及S 表示部分還原抗體之半胱胺酸殘基中的硫原子。
B-5. 用於與離胺酸側鏈偶合的通用方法
此等偶合描述於例如實施例194k及294k中。與抗體發生的此類鍵聯可用於具有KSP抑制劑的ADC，尤其關於活體內可裂解的2-8個 寡肽基團SG1，其經由CO與R4連接。
偶合反應使用以下抗體：
抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)
抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)
抗TWEAKR AK1C(TPP-7006)
抗TWEAKR AK1D(TPP-7007)
將待偶合之2當量至8當量前驅化合物於DMSO中的溶液添加至相關抗體於PBS緩衝液中之溶液中，該抗體濃度範圍為1mg/ml至20mg/ml，較佳為約10mg/ml，此視預定負載量而定。在室溫下攪拌30分鐘至6小時之後，再次添加含有相同量之前驅化合物的DMSO。在此，DMSO之量不應超過總體積之10%。在室溫下再攪拌30分鐘至6小時之後，將反應物施加至經PBS平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上且用PBS緩衝液溶離。一般而言，除非另外指明，否則使用PBS緩衝液中之5mg相關抗體進行還原且隨後偶合。在PD10管柱上純化，從而分別得到相應ADC於3.5ml PBS緩衝液中的溶液。接著藉由超速離心來濃縮樣品且視情況用PBS緩衝液再稀釋。必要時，為了更好地移除低分子量組分，在用PBS緩衝液再稀釋之後，重複超濾濃縮。在生物測試中，必要時，視情況藉由再稀釋將最終ADC樣品的濃度調節至0.5-15mg/ml範圍。
測定實施例中所述的ADC溶液中之相應蛋白質濃度。另外，使用B-7下所述的方法測定抗體負載量(藥物/mAb比率)。
在所示結構式中，AK2A、AK2B、AK2C及AK2D具有以下含義
AK2A=抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)-NH§2
AK2B=抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)-NH§2
AK2C=抗TWEAKR AK1C(TPP-7006)-NH§2
AK2D=抗TWEAKR AK1D(TPP-7007)-NH§2
其中§2 表示連至羰基的鍵聯及NH表示抗體之離胺酸殘基中的側鏈胺基。
B-6a. 用於製備閉鏈丁二醯亞胺-半胱胺酸加合物的通用方法：
在一個例示性實施例中，將10μmol上述順丁烯二醯亞胺前驅化合物溶解於3-5ml DMF中，且添加2.1mg(20μmol)L-半胱胺酸。反應混合物在室溫下攪拌2小時至24小時，接著在減壓下濃縮且接著藉由製備型HPLC純化。
B-6aa. 用於製備異構型開鏈丁二醯胺-半胱胺酸加合物的通用方法：
在一個例示性實施例中，將68μmol上述順丁烯二醯亞胺前驅化合物溶解於15ml DMF中，且添加36mg(136μmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。反應混合物在室溫下攪拌約20個小時，接著在減壓下濃縮且接著藉由製備型HPLC純化。合併適當溶離份且在減壓下蒸發溶劑，且接著將殘餘物溶解於15ml THF/水1：1中。添加131μl 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪拌反應物1小時。接著用1M鹽酸中和反應物，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到理論值之約50%的經保護之區位異構型中間物，其呈無色泡沫狀。
在最後步驟中，將0.023mmol此等區位異構型水解產物溶解於3ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加12.5mg(0.092mmol)氯化鋅，且反應物在50℃攪拌4小時。接著添加27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到水解開鏈的硫基丁二醯胺，其呈區位異構體混合物形式。
本發明之結合物的進一步純化及表徵
反應之後，在一些情況下，濃縮反應混合物，例如藉由超濾濃縮反應混合物，且接著脫鹽且藉由層析(例如使用Sephadex® G-25管柱)純化。溶離係使用磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)進行。接著將溶液無菌過濾且冷凍。或者，可將結合物凍乾。
B-7. 抗體、毒性基團負載量及開鏈半胱胺酸加合物之比例的測定
去糖基化及/或變性之後，除分子量測定之外，在蛋白質鑑別中，進行胰蛋白酶消化，其在變性、還原及衍生化之後，經由所發現之胰蛋白酶肽證實蛋白質的身分。
實施例中所述之結合物中所得之PBS緩衝溶液的毒性基團負載量如下測定：
藉由個別結合物物質之分子量的質譜測定來進行經離胺酸連接之ADC中之毒性基團負載量的測定。在此，首先使用PNGaseF使抗體結合物發生去糖基化，且將樣品酸化且在HPLC分離/脫鹽之後，使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)、藉由質譜進行分析。將TIC(總離子層析圖)中之相對於信號的所有光譜相加且基於MaxEnt解迴旋來計算不同結合物物質的分子量。不同物質之信號積分之後，接著計算DAR(=藥物/抗體比率)。
藉由還原及變性ADC之逆相層析來測定經半胱胺酸連接之結合物中的毒性基團負載量。將鈲鹽酸鹽(GuHCl)(28.6mg)及DL-二硫蘇糖醇(DTT)溶液(500mM，3μl)添加至ADC溶液(1mg/ml，50μl)中。混合物在55℃培育一小時且藉由HPLC加以分析。
在Agilent 1260 HPLC系統上進行HPLC分析，其中在220nm偵測。聚合物實驗室PLRP-S聚合物逆相管柱(目錄號PL1912-3802)(2.1x150mm，8μm粒度，1000Å)係在1ml/min流速下、在以下梯度下使用：0min，25% B；3min，25% B；28min，50% B。移動相A由0.05%三氟乙酸(TFA)/水組成，移動相B由0.05%三氟乙酸/乙腈組成。
所偵測峰藉由非結合抗體之輕鏈(L0)與重鏈(H0)之滯留時間比較來指定。所結合樣品中排他性偵測出的峰指定給具有一個毒性基團的輕鏈(L1)及具有一、兩及三個毒性基團(H1、H2、H3)的重鏈。
抗體中之毒性基團平均負載量係根據以HC負荷及LC負荷雙倍總和積分形式所測定的峰面積計算，其中LC負荷係利用所有LC峰之毒性基團數均加權積分結果之總和除以所有LC峰之單個加權積分結果之總和來計算，且其中HC負荷係利用所有HC峰之毒性基團數均加權積分結果之毒性基團之總和除以所有HC峰之單個加權積分結果之總和來計算。在個別情況中，由於一些峰出現共溶離，因此不可能準確測定毒性基團負荷。
在輕鏈與重鏈無法藉由HPLC充分分離的情況下，藉由輕鏈及重鏈層面之個別結合物物質之分子量之質譜測定來進行經半胱胺酸連接之結合物之毒性基團負載量之測定。
將鈲鹽酸鹽(GuHCl)(28.6mg)及DL-二硫蘇糖醇(DTT)溶液(500mM，3μl)添加至ADC溶液(1mg/ml，50μl)中。混合物在55℃培育一小時且在線上脫鹽之後，使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)、藉由質譜加以分析。
為了測定DAR，在TIC(總離子層析圖)中，將相對於信號的所有光譜相加，且基於MaxEnt解迴旋來計算輕鏈及重鏈層面上的不同結合物物質之分子量。抗體中之毒性基團平均負載量係根據以HC負荷及LC負荷雙倍總和積分形式所測定的峰面積計算，其中LC負荷係利用所有LC峰之毒性基團數均加權積分結果之總和除以所有LC峰之單個加權積分結果之總和來計算，且其中HC負荷係利用所有HC峰之毒性基團數均加權積分結果之毒性基團之總和除以所有HC峰之單個加權積分結果之總和來計算。
為了測定開鏈半胱胺酸加合物之比例，測定所有單個結合輕鏈 及重鏈變異體之閉鏈半胱胺酸加合物相對於開鏈半胱胺酸加合物(分子量δ 18道爾頓)的分子量面積比率。所有變異體之平均值產生開鏈半胱胺酸加合物之比例。
B-8. 檢查ADC之抗原結合
偶合已發生之後，檢查結合子結合至標靶分子的能力。熟習此項技術者熟悉可用於此目的之多種方法，例如結合物之親和力可使用ELISA技術或表面電漿子共振分析(BIAcoreTM量測)來檢查。熟習此項技術者可使用抗體結合物之慣用方法(例如蛋白質測定)來量測結合物濃度。(亦可參見Doronina等人；Nature Biotechnol.2003；21：778-784及Polson等人，Blood 2007；1102：616-623)。
代謝物實施例
實例M1
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將1.8mg(2μmol)中間物F104溶解於1ml DMF中，且添加2.7mg(22μmol)L-半胱胺酸。反應混合物在室溫下攪拌20個小時，接著在 減壓下濃縮且接著藉由製備型HPLC純化。得到呈無色泡沫狀之0.6mg(理論值之26%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.80min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+。
實例M2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)及4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
LC-MS(方法1)：Rt=0.80min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+。
首先，在DMF中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使用1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮將L-半胱胺酸轉化成N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將406mg(1.53mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解於10ml DMF中，添加157.5mg(1.606mmol)順丁烯二酸酐且在室溫下攪拌反應物1小時。將7.5mg(0.01mmol)中間物C66添加至130μl此溶液中，且在室溫下攪拌反應物5分鐘。接著在減壓下 濃縮混合物，且藉由製備型HPLC純化殘餘物。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到10mg(89%)經保護的中間物；既不能藉由HPLC、亦不能藉由LC-MS分離區位異構體。
LC-MS(方法1)：Rt=1.38min；MS(EIpos)：m/z=1120[M+H]+。
在最後步驟中，將10mg此中間物溶解於2ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加12mg(0.088mmol)氯化鋅，且在50℃攪拌反應物30分鐘。接著添加26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到8.3mg(理論值之99%)標題化合物，其為87：13比率之區位異構體混合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.3min及2.43min；MS(ESIpos)：m/z=832(M+H)+。
1H-NMR主要區位異構體：(500MHz,DMSO-d6)：δ=8.7(m,1H),8.5(m,2H),8.1(m,1H),7.6(m,1H),7.5(s,1H)7.4-7.15(m,6H),6.9-7.0(m,1H),6.85(s,1H),5.61(s,1H),4.9及5.2(2d,2H),4.26及4.06(2d,2H),3.5-3.8(m,5H),3.0-3.4(m,5H),2.75-3.0(m,3H),2.58及2.57(dd,1H),0.77及1,5(2m,2H),0.81(s,9H)。
或者，如下製備區位異構型標題化合物：
為此目的，首先，在DMF中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使用1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮將L-半胱胺酸轉化成N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將55mg(0.068mmol)中間物F104及36mg(0.136mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解於15ml DMF中，且在室溫下攪拌混合物20小時。接著濃縮混合物且藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份且在減壓下蒸發溶劑，且接著將殘餘物溶解於15ml THF/水1：1中。添加131μl 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪 拌反應物1小時。接著用1M鹽酸中和反應物，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到37mg(理論值之50%)經保護之區位異構型中間物，其呈無色泡沫狀。
LC-MS(方法5)：Rt=3.33min及3.36min；MS(ESIpos)：m/z=976(M+H)+。
在最後步驟中，將25mg(0.023mmol)此中間物溶解於3ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加12.5mg(0.092mmol)氯化鋅，且在50℃攪拌反應物4小時。接著添加27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到18.5mg(理論值之85%)標題化合物，其為21：79比率之區位異構體混合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.37min及3.44min；MS(ESIpos)：m/z=832(M+H)+。
實例M3
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧基乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)及4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)-2-羧基乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
首先，在DMF中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使用1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮將L-半胱胺酸轉化成N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸。
將11mg(0.013mmol)中間物F193及8mg(0.016mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解於3ml DMF中，且在室溫下攪拌混合物20小時。接著濃縮混合物且藉由製備型HPLC純化殘餘物。
合併適當溶離份且在減壓下蒸發溶劑，且接著將殘餘物溶解於2ml THF/水1：1中。添加19μl 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪拌反應物1小時。接著再添加19μl 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪拌反應物隔夜。接著用1M鹽酸中和混合物，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物藉由製備型HPLC純化。由此得到4.1mg(理論值之38%)經保護之區位異構型中間物，其呈無色泡沫狀。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min(breit)；MS(ESIpos)：m/z=1020(M+H)+。
在最後步驟中，將4.1mg(0.004mmol)此中間物溶解於3ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加3mg(0.022mmol)氯化鋅，且反應物在50℃攪拌1小時。接著添加6mg(0.022mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸及2ml 0.1%濃度三氟乙酸水溶液，且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到5mg(定量)標題化合物，其為20：80比率之區位異構體混合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min(breit)；MS(ESIpos)：m/z=876(M+H)+。
LC-MS(方法5)：Rt=2.36min及2.39min；MS(ESIpos)：m/z=876(M+H)+。
實例M4
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙氧基]乙基}-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將3mg(4μmol)中間物F248溶解於2ml DMF中，且添加0.9mg(8μmol)L-半胱胺酸。反應混合物在室溫下攪拌18小時，且接著在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份，使殘餘物自乙腈/水中凍乾之後，得到1.1mg(理論值之32%)呈白色固體狀之標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.78min；MS(EIpos)：m/z=801[M+H]+。
實例M5
(3R,7S)-7-胺基-17-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-3-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙二醇醯基-2,2-二甲基-8,16-二側氧基-12-氧雜-4,9,15-三氮雜十九烷-19-酸/三氟乙酸(1：1)及(3R,7S)-7-胺基-18-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-3-[1-苯甲基-4- (2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙二醇醯基-2,2-二甲基-8,16-二側氧基-12-氧雜-4,9,15-三氮雜十九烷-19-酸/三氟乙酸(1：1)
將8mg(0.010mmol)中間物F248之經保護中間物及5.1mg(0.02mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解於3ml DMF中，且混合物在室溫下攪拌18小時且接著在超音波浴中處理2小時。接著濃縮混合物且藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份且在減壓下蒸發溶劑，且接著將殘餘物溶解於2ml THF/水1：1中。添加15μl 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪拌反應物15分鐘。反應物接著用1M鹽酸調節至約pH 3，用20ml氯化鈉溶液稀釋且用20ml乙酸乙酯萃取兩次。有機相經硫酸鎂乾燥且濃縮，且殘餘物自乙腈/水中凍乾。由此得到8.4mg(理論值之78%，經2個步驟)經保護之區位異構型中間物，其呈無色泡沫狀。
LC-MS(方法1)：Rt=1.44min及3.43min；MS(ESIpos)：m/z=1107(M+H)+。
在最後步驟中，將8mg(0.007mmol)此中間物溶解於5ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加9.8mg(0.072mmol)氯化鋅，且在50℃攪拌反應物1.5小時。接著添加乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且在減壓下蒸發溶劑。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到4mg(理論值之59%)標題化合物，其為31：67比率之區位異構體混合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.79min及0.81min；MS(ESIpos)：m/z=819(M+H)+。
實例M6
2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-({(14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-1-基}胺基)-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：2)及3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-({(14R)-13-(3-胺基丙基)-14-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三側氧基-10-硫雜-3,6,13-三氮雜十六烷-1-基}胺基)-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：2)
將18mg(0.021mmol)中間物F213及11.2mg(0.04mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解於2ml DMF中，且在室溫下攪拌混合物18小時。在減壓下濃縮反應混合物。將殘餘物(21.2mg)溶解於3ml THF/水1：1中。添加0.04ml 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪拌反應物3小時。添加0.02ml 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪拌反應物1小時。接著使用7.2mg(0.12mmol)乙酸將反應物調節至約pH 7。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到13mg(57%，經2個步驟)經保護的區位異構型中間物。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=1020 (M+H)+。
在最後步驟中，將13mg(0.01mmol)此中間物溶解於2ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加6.2mg(0.05mmol)氯化鋅，且在50℃攪拌反應物7小時。接著添加13.3mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且藉由製備型HPLC純化產物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到10.3mg(81.4%)標題化合物，其呈區位異構體混合物形式。
LC-MS(方法1)：Rt=1.03min；MS(ESIpos)：m/z=875(M+H)+。
實例M7
S-(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)
將6mg(8μmol)中間物F119溶解於3ml DMF中，且添加1.8mg(15μmol)L-半胱胺酸。反應混合物在室溫下攪拌6小時且接著在室溫下靜置3天。接著在減壓下濃縮反應物，且藉由製備型HPLC純化產物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.81min；MS(ESIpos)：m/z=717(M+H)+。
實例M8
(3R)-6-{(11S,15R)-11-胺基-15-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-14-乙二醇醯基-16,16-二甲基-2,5,10-三側氧基-3,6,9,14-四氮雜十 七烷-1-基}-5-側氧基硫嗎啉-3-甲酸/三氟乙酸(1：1)
將實例135之4mg(0.004mmol)化合物溶解於4ml THF/水中，且添加48μl 2莫耳濃度氫氧化鋰水溶液。在室溫下攪拌反應物1小時且接著濃縮且藉由製備型HPLC純化。合併適當溶離份，濃縮且自乙腈/水中凍乾，得到2.4mg(理論值之60%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(EIpos)：m/z=814[M+H]+。
實例M9
N-(3-胺基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羥乙醯胺
首先將150.0mg(0.42mmol)(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中間物C52)饋入2.0ml二氯甲烷中，且添加29.2mg(0.49mmol)HOAc及125.6mg(0.59mmol)三乙醯氧基硼氫化鈉且在室溫下攪拌混合物5分鐘。添加98.9mg(0.49mmol)3-(1,3-二側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙醛。在室溫下攪 拌反應混合物隔夜。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相用飽和碳酸鈉溶液洗滌兩次且用飽和NaCl溶液洗滌一次。經硫酸鎂乾燥之後，在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇=100：1)。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到188.6mg(74%)化合物2-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮。
LC-MS(方法1)：Rt=1.00min；MS(ESIpos)：m/z=541[M+H]+。
首先將171.2mg(0.32mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基)丙基]-1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮饋入5.0ml二氯甲烷中，且添加73.6mg(0.73mmol)三乙胺。在0℃，添加94.9mg(0.70mmol)乙醯氧基乙醯氯，且在室溫下攪拌反應混合物隔夜。反應混合物用乙酸乙酯稀釋且有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌兩次且用飽和NaCl溶液洗滌一次。經硫酸鎂乾燥之後，在減壓下蒸發溶劑且使用Biotage Isolera(矽膠，管柱10g SNAP，流速12ml/min，乙酸乙酯/環己烷1：3)純化殘餘物。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到159.0mg(77%)化合物乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-側氧基乙酯。
LC-MS(方法1)：Rt=1.35min；MS(ESIpos)：m/z=642[M+H]+。
首先將147.2mg(0.23mmol)乙酸2-({(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二側氧基-1,3-二氫-2H-異吲哚-2-基)丙基]胺基)-2-側氧基乙酯饋入4.0ml乙醇中，且添加356.2mg(4.59mmol)甲胺(40%於水中)。在50℃攪拌反應混合物隔夜。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物與甲苯共蒸餾三次。殘餘物在矽膠上純化(移動相：二氯甲烷/甲醇=10：1)。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到67.4mg(63%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.91min；MS(ESIpos)：m/z=470[M+H]+。
實例M10
(2R,28R)-28-胺基-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)甲基]-25-(羧甲基)-4,20,24-三側氧基-7,10,13,16-四氧雜-26-硫雜-3,19,23-三氮雜二十九烷-1,29-二元酸/三氟乙酸(1：2)及(1R,28R,34R)-1-胺基-33-(3-胺基丙基)-34-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35,35-二甲基-6,10,26,32-四側氧基-14,17,20,23-四氧雜-3,30-二硫雜-7,11,27,33-四氮雜三十六烷-1,4,28-三甲酸/三氟乙酸(1：2)
將20mg(0.018mmol)R-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-[19-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-17-側氧基-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物F209)及9.78mg(0.036mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解於2ml DMF中，且在室溫下攪拌混合物18小時。在減壓下濃 縮反應混合物。將殘餘物(47.7mg)溶解於3ml THF/水1：1中。添加0.08ml 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪拌反應物1小時。接著使用9.26mg(0.15mmol)乙酸將反應物調節至約pH 7。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到15.3mg(29%，經2個步驟)經保護的區位異構型中間物。
LC-MS(方法6)：Rt=12.26min及12.30min；MS(ESIpos)：m/z=1254(M+H)+。
在最後步驟中，將15.3mg(0.01mmol)此中間物溶解於2ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加6.1mg(0.05mmol)氯化鋅，且在50℃攪拌反應物2小時。接著添加13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且藉由製備型HPLC純化產物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到11.9mg(79.5%)標題化合物，其呈區位異構體混合物形式。
LC-MS(方法1)：Rt=0.85min；MS(ESIpos)：m/z=1110(M+H)+。
實例M11
S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：2)
將15.0mg(0.018mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C71)溶解於1.0ml三氟乙醇中，且添加7.4mg(0.054mmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物隔夜。添加15.8mg(0.054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到11.1mg(77%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.83min；MS(ESIpos)：m/z=573(M+H)+。
實例M12
4-{[(1R)-2-({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)-1-羧基乙基]胺基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
將12.2mg(0.014mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-(4-第三丁氧基-4-側氧基丁醯基)-L-半胱胺酸(中間物C77)溶解於2.0ml三氟乙醇中，且添加11.4mg(0.084mmol)二氯化鋅。在50℃攪拌反應混合物3小時。添加24.5mg(0.084mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且攪拌反應混合物10分鐘，且接著添加水(0.1% TFA)。直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1% TFA)進行純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在高真空下乾燥。由此得到4.6mg(42%)標題化合物。
LC-MS(方法1)：Rt=0.88min；MS(ESIpos)：m/z=673(M+H)+。
實例M13
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
區位異構體1，差向異構體1(2R)或(2S)
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
首先，在DMF中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使用1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮將L-半胱胺酸甲酯鹽酸鹽(1：1)轉化成N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯。
將408mg(1.93mmol)市售3-溴-4-甲氧基-4-側氧基丁酸及180mg(0.644mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯溶解於8ml DMF中，且添加147mg(0.97mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯。在室溫下攪拌18小時之後，再添加136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-側氧基丁酸及147mg(0.97mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯，且混合物在室溫下再攪拌12小時且接著在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份且在減壓下蒸發溶劑，得到151mg(理論值之57%)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸。
LC-MS(方法12)：Rt=1.74min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
經由對掌性管柱、藉由超臨界流體層析將145mg此中間物分離成個別非對映異構體(SFC；管柱：DAICEL，AD-H 5u 250x20mm；流速：80ml/min；方法：AD-25% ETOH-80ml；壓力：100巴；波長：210nM)，得到63mg(43%)差向異構體1及58mg(40%)差向異構 體2。
差向異構體1表徵如下：
LC-MS(方法5)：Rt=2.94min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz,DMSO-d6)：δ=7.57(d,1H),4.24(m,1H),4.05(t,2H),3.67(t,1H),3.65(s,3H),3.62(s,3H),3.05(dd,1H),2.70-2.88(m,2H),2.59(dd,1H),0.93(t,2H),0.02(s,9H)。
差向異構體2表徵如下：
LC-MS(方法5)：Rt=2.95min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz,DMSO-d6)：δ=7.58(d,1H),4.16-4.23(m,1H),4.05(t,2H),3.67(dd,1H),3.65(s,3H),3.64(s,3H),3.04(dd,1H),2.88(dd,1H),2.77(dd,1H),2.61(dd,1H),0.92(t,2H),0.02(s,9H)。
在30mg(0.079mmol)HATU及13.4mg(0.132mmol)4-甲基嗎啉存在下，使32.5mg(0.079mmol)差向異構體1與50mg(0.066mmol)中間物C66偶合，在HPLC純化之後，得到43mg(理論值之57%)經完全保護的中間物4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三側氧基-5-氧雜-7,10,13-三氮雜-2-矽雜十五烷-15-基]胺基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸甲酯。
接著在室溫下將40mg(0.035mmol)此中間物與0.9ml 2莫耳濃度氫氧化鋰溶液於11ml甲醇中攪拌20分鐘，使得兩個甲酯基均裂解。藉由HPLC純化，得到12mg(理論值之31%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.74min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
最後，在三氟乙醇中，用氯化鋅將10mg(0.009mmol)此中間物 完全脫除保護基，如上文所述。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到2.6mg(理論值之30%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M14
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
區位異構體1，差向異構體2(2R或2S)
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(EIpos)：m/z=832[M+H]+。
類似於實例M13中的描述使實例M13中所述的中間物差向異構體2發生反應：
在30mg(0.079mmol)HATU及13.4mg(0.132mmol)4-甲基嗎啉存在下，使32.5mg(0.079mmol)差向異構體2與50mg(0.066mmol)中間物C66偶合，在HPLC純化之後，得到43mg(理論值之57%)經完全保護的中間物4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三側氧基-5-氧雜-7,10,13-三氮雜-2-矽雜十五烷-15-基]胺基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基) 丙基]硫基}-4-側氧基丁酸甲酯。
接著在室溫下將40mg(0.035mmol)此中間物與0.9ml 2莫耳濃度氫氧化鋰溶液於11ml甲醇中攪拌20分鐘，使得兩個甲酯基均裂解。藉由HPLC純化，得到11mg(理論值之28%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.74min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
最後，在三氟乙醇中，用氯化鋅將10mg(0.009mmol)此中間物完全脫除保護基，如上文所述。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到4.4mg(理論值之52%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M15
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
區位異構體2，差向異構體1(3R或3S)
LC-MS(方法5)：Rt=2.45min；MS(EIpos)：m/z=832[M+H]+。
將742.8mg(3.3mmol)市售2-溴-4-乙氧基-4-側氧基丁酸及802mg(2.87mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯溶解於32ml DMF中，且添加655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯。在室溫下攪拌20小時之後，在減壓下濃縮反應物且藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份且在減壓下蒸發溶劑，得到521mg(理論值之43%)4-乙氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸。
LC-MS(方法5)：Rt=3.13min；MS(ESIpos)：m/z=424(M+H)+。
經由對掌性管柱、藉由超臨界流體層析將510mg此中間物分離成個別非對映異構體(SFC；管柱：DAICEL，AD-H 5u 250x20mm；流速：80ml/min；方法：AD-10% ETOH-80ml；壓力：100巴；波長：210nM)，得到100mg(20%)差向異構體1及141mg(28%)差向異構體2。
差向異構體1表徵如下：
LC-MS(方法1)：Rt=0.99min；MS(ESIneg)：m/z=422(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz,DMSO-d6)：δ=7.60(d,1H),4.18-4.26(m,1H),4.01-4.08(m,4H),3.63(s,3H),3.59(dd,1H),3.04(dd,1H),2.92(dd,1H),2.80(dd,1H),2.63(dd,1H),1.17(t,3H),0.92(t,2H),0.02(s,9H)。
差向異構體2表徵如下：
LC-MS(方法5)：Rt=2.95min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
1H-NMR：(400MHz,DMSO-d6)：δ=7.56(d,1H),4.21-4.29(m,1H),4.01-4.1(m,4H),3.64(s,3H),3.58(dd,1H),3.08(dd,1H),2.85(dd,1H),2.78(dd,1H),2.60(dd,1H),1.17(t,3H),0.93(t,2H),0.02(s,9H)。
在30mg(0.079mmol)HATU及13.4mg(0.132mmol)4-甲基嗎啉 存在下，使33.6mg(0.079mmol)差向異構體1與50mg(0.066mmol)中間物C66偶合，在HPLC純化之後，得到51mg(理論值之63%)經完全保護的中間物4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三側氧基-5-氧雜-7,10,13-三氮雜-2-矽雜十五烷-15-基]胺基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸乙酯。
接著在室溫下將49mg(0.042mmol)此中間物與0.5ml 2莫耳濃度氫氧化鋰溶液於12ml THF/水1：1中攪拌30分鐘，使得兩個甲酯基均裂解。藉由HPLC酸化及純化，得到11mg(理論值之24%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.68min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
最後，在三氟乙醇中，用氯化鋅將11mg(0.01mmol)此中間物完全脫除保護基，如上文所述。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到3.7mg(理論值之39%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.45min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M16
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
區位異構體2，差向異構體2(3R或3S)
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(EIpos)：m/z=832[M+H]+。
類似於實例M15中的描述使實例M15中所述的中間物差向異構體2發生反應：
在30mg(0.079mmol)HATU及13.4mg(0.132mmol)4-甲基嗎啉存在下，使33.6mg(0.079mmol)差向異構體2與50mg(0.066mmol)中間物C66偶合，在HPLC純化之後，得到51mg(理論值之63%)經完全保護的中間物4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三側氧基-5-氧雜-7,10,13-三氮雜-2-矽雜十五烷-15-基]胺基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸乙酯。
接著在室溫下將49mg(0.042mmol)此中間物與0.5ml 2莫耳濃度氫氧化鋰溶液於12ml THF/水1：1中攪拌30分鐘，使得兩個甲酯基均裂解。藉由HPLC酸化及純化，得到13.4mg(理論值之28%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.66min；MS(ESIpos)：m/z=1120[M+H]+。
最後，在三氟乙醇中，用氯化鋅將13.4mg(0.012mmol)此中間 物完全脫除保護基，如上文所述。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到7.5mg(理論值之66%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.44min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M17
(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁酸鹽酸鹽(1：1)
將150mg(0.2mmol)中間物C53及2.29g(20.39mmol)DABCO溶解於15ml DMF中。反應物於超音波浴中處理30分鐘。接著藉由添加1.17ml乙酸將反應物調節至pH 3-4，且在減壓下濃縮混合物。藉由製備型HPLC純化殘餘物且在室溫下、在減壓下濃縮適當溶離份。將殘餘物溶解於乙腈/水(1：1)中，添加5ml 4N鹽酸且接著凍乾混合物。由此得到81mg(理論值之68%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.69min；MS(EIpos)：m/z=514[M+H]+。
實例M18
N-[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]-L-麩醯胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先使用經典的肽化學方法製備三氟乙酸/N-(2-胺基乙基)-N2-[(苯甲氧基)羰基]-L-麩胺酸苯甲酯(1：1)。在HATU存在下，接著使此中間物與中間物C58偶合。隨後，首先藉由氫解裂解移除苯甲氧羰基保護基及苯甲酯，且接著使用氯化鋅移除2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基保護基。
LC-MS(方法6)：Rt=1.91min；MS(EIpos)：m/z=685[M+H]+。
實例M19
N6-(N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基)-L-離胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，使用肽化學中已知的經典保護基操作，製備三氟乙酸/N2-[(苯甲氧基)羰基]-L-離胺酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(1：1)。在HATU存在下，接著使此中間物與中間物C61偶合。隨後，首先使用氯化鋅將2-(三甲基矽烷基)乙氧基羰基保護基及2-(三甲基矽烷基)乙酯裂解。最後，藉由苯甲氧羰基保護基的氫解裂解及藉由製備型HPLC純化來獲 得標題化合物。
HPLC(方法11)：Rt=1.65min；
實例M20
(1R,4R,27R,33R)-1-胺基-32-(3-胺基丙基)-33-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四側氧基-13,16,19,22-四氧雜-3,29-二硫雜-7,10,26,32-四氮雜三十五烷-1,4,27-三甲酸/三氟乙酸(1：2)
首先，在DMF中，在N,N-二異丙基乙胺存在下，使用1-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯啶-2,5-二酮將L-半胱胺酸甲酯鹽酸鹽(1：1)轉化成N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯。
將408mg(1.93mmol)市售3-溴-4-甲氧基-4-側氧基丁酸及180mg(0.644mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯溶解於8ml DMF中，且添加147mg(0.97mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯。在室溫下攪拌18小時之後，再添加136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-側氧基丁酸及147mg(0.97mmol)1,8-二氮雜雙環 [5.4.0]十一碳-7-烯，且混合物在室溫下再攪拌12小時且接著在減壓下濃縮。藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份且在減壓下蒸發溶劑，得到151mg(理論值之57%)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸。
LC-MS(方法12)：Rt=1.74min；MS(ESIneg)：m/z=408(M-H)-。
在3.66mg(8.93μmol)HATU及1.6μl(15μmol)4-甲基嗎啉存在下，使3.66mg(8.93μmol)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸與13.0mg(7.44μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-(甘胺醯基胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C80)偶合，HPLC純化之後，得到3.9mg(理論值之37%)經完全保護的中間物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11R)-8,11-雙(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,13-二側氧基-5-氧雜-10-硫雜-7-氮雜-2-矽雜十三烷-13-基]甘胺醯基}胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸。
接著在室溫下將3.90mg(2.76μmol)此中間物與35μl 2莫耳濃度氫氧化鋰溶液於1.0ml THF/水3：1中攪拌15分鐘，使得兩個甲酯基均裂解。藉由HPLC純化，得到3.60mg(理論值之94%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.83min；MS(ESIpos)：m/z=1385[M+H]+。
最後，在三氟乙醇中，用氯化鋅將3.6mg(2.6μmol)此中間物完全脫除保護基，如上文所述。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適 當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到1.92mg(理論值之55%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.72min；MS(ESIneg)：m/z=1094[M-H]-。
實例M21
(2R,24S,27R)-27-胺基-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)甲基]-24-(羧甲基)-4,20,23-三側氧基-7,10,13,16-四氧雜-25-硫雜-3,19,22-三氮雜二十八烷-1,28-二酸/三氟乙酸(1：2)
將742.8mg(3.3mmol)市售2-溴-4-乙氧基-4-側氧基丁酸及802mg(2.87mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸甲酯溶解於32ml DMF中，且添加655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯。在室溫下攪拌20小時之後，在減壓下濃縮反應物且藉由製備型HPLC純化殘餘物。合併適當溶離份且在減壓下蒸發溶劑，得到521mg(理論值之43%)4-乙氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2-({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸。
LC-MS(方法5)：Rt=3.13min；MS(ESIpos)：m/z=424(M+H)+.
在3.92mg(10.3μmol)HATU及1.9μl(17μmol)4-甲基嗎啉存在下，使4.36mg(10.3μmol)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-側氧基-2- ({[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}胺基)丙基]硫基}-4-側氧基丁酸與15.0mg(8.59μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-(甘胺醯基胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物C80)偶合，HPLC純化之後，得到3.6mg(理論值之26%)經完全保護的中間物S-(11-{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-7,11-二氮雜-2-矽雜十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11S)-11-(2-乙氧基-2-側氧基乙基)-8-(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,12-二側氧基-5-氧雜-10-硫雜-7-氮雜-2-矽雜十二烷-12-基]甘胺醯基}胺基)-4,7,10,13-四氧雜十五烷-1-醯基]-L-半胱胺酸。
接著在室溫下將6.20mg(2.82μmol)此中間物與35μl 2莫耳濃度氫氧化鋰溶液於1.0ml THF/水1：1中攪拌15分鐘，使得兩個甲酯基均裂解。藉由HPLC酸化及純化，得到3.60mg(理論值之92%)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5)：Rt=4.71min；MS(ESIpos)：m/z=1385[M+H]+。
最後，在三氟乙醇中，用氯化鋅將3.60mg(1.69μmol)此中間物完全脫除保護基，如上文所述。藉由製備型HPLC純化殘餘物。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到0.88mg(理論值之39%)標題化合物。
LC-MS(方法5)：Rt=2.72min；MS(ESIneg)：m/z=1094[M-H]-。
實例M22
(2R,27R)-27-胺基-2-[({2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}硫基)甲基]-24-(羧甲基)-4,20,23-三側氧基-7,10,13,16-四氧雜-25-硫雜-3,19,22- 三氮雜二十八烷-1,28-二酸/三氟乙酸(1：2)及(1R,27R,33R)-1-胺基-32-(3-胺基丙基)-33-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四側氧基-13,16,19,22-四氧雜-3,29-二硫雜-7,10,26,32-四氮雜三十五烷-1,4,27-三甲酸/三氟乙酸(1：2)
將16.5mg(0.015mmol)S-{2-[(3-胺基丙基){(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}胺基]-2-側氧基乙基}-N-[1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-2,18-二側氧基-6,9,12,15-四氧雜-3-氮雜十八烷-18-基]-L-半胱胺酸/三氟乙酸(1：1)(中間物F257)及8.18mg(0.031mmol)N-{[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱胺酸溶解於2ml DMF中，且在室溫下攪拌混合物18小時。在減壓下濃縮反應混合物。將殘餘物(28.9mg)溶解於3ml THF/水1：1中。添加0.046ml 2M氫氧化鋰水溶液且在室溫下攪拌混合物3小時。接著使用5.2μl(0.092mmol)乙酸將混合物調節至約pH 7。反應混合物直接藉由製備型RP-HPLC(管柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1% TFA)純化。在減壓下蒸發溶劑且殘餘物在 高真空下乾燥。由此得到12.1mg(58%，經2個步驟)經保護的區位異構型中間物。
LC-MS(方法12)：Rt=1.82min；MS(ESIpos)：m/z=1240(M+H)+。
在最後步驟中，將12.1mg(0.009mmol)此中間物溶解於2ml 2,2,2-三氟乙醇中。添加7.3mg(0.054mmol)氯化鋅，且在50℃攪拌混合物2小時。接著添加15.7mg(0.054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，且藉由製備型HPLC純化溶劑。濃縮適當溶離份且使殘餘物自乙腈/水中凍乾，得到6.4mg(59%)標題化合物，其呈區位異構體混合物形式。
LC-MS(方法1)：Rt=0.86min；MS(ESIpos)：m/z=1096(M+H)+。
實例M23
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-L-麩胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，使L-麩胺酸二第三丁酯鹽酸鹽(1：1)與中間物C61偶合。接著將經保護的中間物溶解於三氟乙醇中且藉由在50℃、在氯化鋅存在下攪拌隔夜來完全脫除保護基。添加EDTA之後，藉由製備型HPLC純化來進行處理。
LC-MS(方法12)：Rt=1.45min；MS(ESIpos)：m/z=714[M+H]+。
實例M24
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-β-丙胺醯基-D-麩胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，使D-麩胺酸二第三丁酯鹽酸鹽(1：1)與中間物C61偶合。接著將經保護的中間物溶解於三氟乙醇中且藉由在50℃、在氯化鋅存在下攪拌來完全脫除保護基。添加EDTA之後，藉由製備型HPLC純化來進行處理。
LC-MS(方法12)：Rt=1.41min；MS(ESIpos)：m/z=714[M+H]+。
實例M25
N-{(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}-L-麩胺酸/三氟乙酸(1：1)
首先，在HATU及N,N-二異丙基乙胺存在下，使L-麩胺酸二第三丁酯鹽酸鹽(1：1)與中間物C61偶合。在下一步驟中，藉由在室溫下、在標準氫氣壓力下、在甲醇中、在10%鈀/活性碳上氫化45分鐘來移除Z保護基。接著將部分經保護的中間物溶解於三氟乙醇中且藉由在50℃、在氯化鋅存在下攪拌7小時來完全脫除保護基。添加EDTA之後，藉由製備型HPLC純化來進行處理。
LC-MS(方法12)：Rt=1.44min；MS(ESIpos)：m/z=643[M+H]+。
實例M26
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-2-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
區位異構體1，差向異構體混合物
此實例描述實例13及實例14之化合物的差向異構體混合物。類似於實例13進行合成，其中省去藉由超臨界流體層析分離兩種差向異構體且標題化合物以差向異構體混合物形式製備。
LC-MS(方法5)：Rt=2.43min；MS(ESIpos)：m/z=832[M+H]+。
實例M27
4-[(2-{[2-({(2S)-2-胺基-4-[{(1R)-1-[1-苯甲基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙二醇醯基)胺基]丁醯基}胺基)乙基]胺基}-2-側氧基乙基)胺基]-3-{[(2R)-2-胺基-2-羧基乙基]硫基}-4-側氧基丁酸/三氟乙酸(1：1)
區位異構體2，差向異構體混合物
此實例描述實例15及實例16之化合物的差向異構體混合物。類似於實例15進行合成，其中省去藉由超臨界流體層析分離兩種差向異構體且標題化合物以差向異構體混合物形式製備。
LC-MS(方法5)：Rt=2.45min；MS(EIpos)：m/z=832[M+H]+。
實施例ADC
視連接子及偶合程序而定，實施例之結構式中所示的ADC(經由順丁烯二醯亞胺基團與抗體之半胱胺酸側鏈偶合)主要存在於在各種情況下所示的開環或閉環形式中。然而，製備可包含小比例的相應其他形式。
實例194n
在此，使用存在於PBS中的2.5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)(c=10mg/ml)與中間物F194偶合。首先，添加溶解於25μl DMSO中的4當量中間物F194，且在室溫下攪拌1小時之後，再次添加相同量且在室溫下攪拌反應物另一小時。反應物隨後在葡聚糖凝膠管柱上純化，接著藉由超速離心來濃縮且用PBS再稀釋。
蛋白質濃度：1.22mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例208n
在氬氣下，將0.029mg TCEP於50μl PBS緩衝液中的溶液添加至含有5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)的0.450ml PBS中(c=11.1 mg/ml)。在室溫下攪拌反應物30分鐘，且接著添加溶解於50μl DMSO中的0.19mg(0.00023mmol)中間物F104。在室溫下再攪拌90分鐘之後，用PBS緩衝液pH 8將反應物補足至2.5ml且施加至經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在室溫下、在氬氣下攪拌隔夜。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.78mg/ml
藥物/mAb比率：1.7
在氬氣下，將0.287mg TCEP於0.5ml PBS緩衝液中的溶液添加至含有50mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)的5ml PBS中(c=10mg/ml)。在室溫下攪拌反應物30分鐘，且接著添加溶解於500μl DMSO中的2.15mg(0.00267mmol)中間物F104。在室溫下再攪拌90分鐘之後，反應物用預先已調節至pH 8的4ml PBS緩衝液稀釋，且在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。
溶液接著使用PD-10管柱、用PBS緩衝液再緩衝至pH 7.2。溶離液接著藉由超速離心來濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋且再次濃縮。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：16.2mg/ml
藥物/mAb比率：1.4
實例208o
在氬氣下，將0.4mg TCEP於0.6ml PBS緩衝液中的溶液添加至含有70mg抗TWEAKR AK1C(TPP-7006)的7.4ml PBS中(c=9.5mg/ml)。在室溫下攪拌混合物30分鐘，且接著添加溶解於800μl DMSO中的2.64mg(0.00327mmol)中間物F104。在室溫下再攪拌90分鐘之後，混合物用預先已調節至pH 8的1.2ml PBS緩衝液稀釋，且接 著使用PD-10管柱再緩衝至pH 8。合併之溶離液用PBS緩衝液(pH 8)稀釋至15ml之總體積且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。
混合物接著使用PD-10管柱及PBS緩衝液再緩衝至pH 7.2。溶離液接著藉由超速離心來濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋且再次濃縮。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：12.2mg/ml
藥物/mAb比率：2.7
在此ADC製備中，開環丁二醯胺形式的比例經測定為84.1%。
實例208p
在氬氣下，將0.4mg TCEP於0.6ml PBS緩衝液中的溶液添加至含有70mg抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)的7.4ml PBS中(c=9.5mg/ml)。在室溫下攪拌混合物30分鐘，且接著添加溶解於800μl DMSO中的2.64mg(0.00327mmol)中間物F104。在室溫下再攪拌90分鐘之後，混合物用預先已調節至pH 8的1.2ml PBS緩衝液稀釋，且接著使用PD-10管柱再緩衝至pH 8。合併之溶離液用PBS緩衝液(pH 8)稀釋至15ml之總體積且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。
混合物接著使用PD-10管柱及PBS緩衝液再緩衝至pH 7.2。溶離液接著藉由超速離心來濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋且再次濃縮。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：10.99mg/ml
藥物/mAb比率：2.4
在此ADC製備中，開環丁二醯胺形式的比例經測定為84.4%。
實例208q
在氬氣下，將0.4mg TCEP於0.6ml PBS緩衝液中的溶液添加至含有70mg抗TWEAKR AK1D(TPP-7007)的7.4ml PBS中(c=9.5mg/ml)。在室溫下攪拌混合物30分鐘，且接著添加溶解於800μl DMSO中的2.64mg(0.00327mmol)中間物F104。在室溫下再攪拌90分鐘之後，混合物用預先已調節至pH 8的1.2ml PBS緩衝液稀釋，且接著使用PD-10管柱再緩衝至pH 8。合併之溶離液用PBS緩衝液(pH 8)稀釋至15ml之總體積且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。
混合物接著使用PD-10管柱及PBS緩衝液再緩衝至pH 7.2。溶離液接著藉由超速離心來濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋且再次濃縮。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：12.01mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
在此ADC製備中，開環丁二醯胺形式的比例經測定為85.2%。
實例240o
在此，使用存在於450μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1C(TPP-7006)與中間物F240在pH 7.2偶合(c=11.1mg/ml)。在0.029mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。接著添加含有0.20mg(0.23μmol)F240的50μl DMSO，且混合物在室溫下再攪拌90分鐘。混合物接著使用PBS緩衝液(pH 8)補足至2.5ml且施加至經PBS緩衝液pH 8平衡的PD10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。溶離液隨後藉由超速離心來濃縮且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.55mg/ml
藥物/mAb比率：3.8
實例257n
在氬氣下，將0.029mg TCEP於50μl PBS緩衝液中的溶液添加至含有5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)的319μl PBS中(c=15.7mg/ml)。反應物用預先已調節至pH 8的2031μl PBS緩衝液稀釋且在室溫下攪拌1小時。接著添加溶解於100μl DMSO中的0.250mg(0.00023mmol)中間物F257。在室溫下再攪拌90分鐘之後，將反應物施加至已用PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上且用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氣下、在室溫下攪拌溶離液隔夜且接著藉由超速離心來濃縮且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。在此等條件下，一些ADC亦可以閉環形式存在。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.44mg/ml
藥物/mAb比率：1.0
實例257p
在此，使用存在於450μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)與中間物F257在pH 7.2偶合(c=11.1mg/ml)。在0.029mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。接著添加含有0.20mg(0.23μmol) F257的50μl DMSO，且混合物在室溫下再攪拌90分鐘。混合物接著使用PBS緩衝液(pH 8)補足至2.5ml且施加至經PBS緩衝液pH 8平衡的PD10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。溶離液隨後藉由超速離心來濃縮且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.67mg/ml
藥物/mAb比率：4.7
實例260n
在氬氣下，將0.014mg TCEP於25μl PBS緩衝液中的溶液添加至含有2.5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)的250μl PBS中(c=10mg/ml)。在室溫下攪拌反應物30分鐘，且接著添加溶解於25μl DMSO中的0.151mg(0.00013mmol)中間物F260。在室溫下再攪拌90分鐘之後，反應物用預先已調節至pH 8的2200μl PBS緩衝液稀釋。
接著將此溶液施加至已經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，且用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氣下、在室溫下攪拌溶離液隔夜且接著藉由超速離心來濃縮且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。在此等條件下，一些ADC亦可以閉環形式存在。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.49mg/ml
藥物/mAb比率：2.2
實例274n
在氬氣下，將0.014mg TCEP於25μl PBS緩衝液中的溶液添加至含有2.5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)的208μl PBS中(c=12.0mg/ml)。反應物用預先已調節至pH 8的967μl PBS緩衝液稀釋且在室溫下攪拌1小時。接著添加溶解於50μl DMSO中的0.116mg(0.00012mmol)中間物F274。在室溫下再攪拌90分鐘之後，將反應物施加至已用PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上且用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氣下、在室溫下攪拌溶離液隔夜且接著藉由超速離心來濃縮且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。在此等條件下，一些ADC亦可以閉環形式存在。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.31mg/ml
藥物/mAb比率：1.5
實例275n
在氬氣下，將0.014mg TCEP於25μl PBS緩衝液中的溶液添加至含有2.5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)的208μl PBS中(c=12.0mg/ml)。反應物用預先已調節至pH 8的967μl PBS緩衝液稀釋且在室溫下攪拌1小時。接著添加溶解於50μl DMSO中的0.116mg(0.00012mmol)中間物F275。在室溫下再攪拌90分鐘之後，將反應物施加至已用PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上且用PBS緩衝液pH 8溶離。在氬氣下、在室溫下攪拌溶離液隔夜且接著藉由超速離心來濃縮且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。在此等條件下，一些ADC亦可以閉環形式存在。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.29mg/ml
藥物/mAb比率：1.8
實例281n
在此，使用存在於208μl PBS(pH 7.2)中的2.5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)(c=12mg/ml)與中間物F281偶合。在0.014mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。添加含有0.11mg(0.12μmol)F281的25μl DMSO之後，接著在室溫下攪拌反應物20小時且隨後在葡聚糖凝膠上純化。溶離液最後藉由超速離心來濃縮且用PBS再稀釋。
蛋白質濃度：0.59mg/ml
藥物/mAb比率：1.3
實例281p
在此，使用存在於500μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)與中間物F281在pH 7.2偶合(c=10mg/ml)。在0.029mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。添加含有0.25mg(0.27μmol)F281的50μl DMSO之後，混合物接著在室溫下攪拌20小時且隨後在葡聚糖凝膠上純化。混合物最後藉由超速離心來濃縮且用PBS再稀釋。
蛋白質濃度：1.9mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
實例281q
在此，使用存在於500μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1D(TPP-7007)與中間物F281在pH 7.2偶合(c=10mg/ml)。在0.029mg TCEP存 在下，抗體還原時間為30分鐘。添加含有0.25mg(0.27μmol)F281的50μl DMSO之後，混合物接著在室溫下攪拌20小時且隨後在葡聚糖凝膠上純化。反應物最後藉由超速離心來濃縮且用PBS再稀釋。
蛋白質濃度：2.55mg/ml
藥物/mAb比率：2.8
實例284n
在氬氣下，將0.029mg TCEP於50μl PBS緩衝液中之溶液添加至含有5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)的417μl PBS(c=12mg/ml)中，且混合物在室溫下攪拌45分鐘。接著添加0.29mg(0.7μmol)溶解於50μl DMSO中的中間物F284。在室溫下再攪拌90分鐘之後，用PBS緩衝液pH 8將混合物補足至2.5ml且傳遞通過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在室溫下、在氬氣下攪拌隔夜。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.81mg/ml
藥物/mAb比率：2.0
實例284o
在此，使用存在於400μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1C(TPP- 7006)與中間物F284在pH 7.2偶合(c=12.5mg/ml)。在0.029mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。接著添加含有0.26mg(0.23μmol)F284的50μl DMSO，且反應物在室溫下再攪拌90分鐘。混合物接著使用PBS緩衝液(pH 8)補足至2.5ml且施加至經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.88mg/ml
藥物/mAb比率：3.1
實例284p
在此，使用存在於450μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)與中間物F284在pH 7.2偶合(c=11.1mg/ml)。在0.029mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。接著添加含有0.26mg(0.23μmol)F284的50μl DMSO，且混合物在室溫下再攪拌90分鐘。混合物接著使用PBS緩衝液(pH 8)補足至2.5ml且施加至經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：2.11mg/ml
藥物/mAb比率：2.5
實例294n
在此，使用存在於PBS中的2.5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)(c=10mg/ml)與中間物F294偶合。首先，添加溶解於25μl DMSO中的4當量中間物F294，且在室溫下攪拌1小時之後，再次添加相同量且在室溫下攪拌反應物另一小時。反應物隨後用PBS緩衝液(pH 7.2)稀釋至2.5ml，在葡聚糖凝膠管柱上純化，接著藉由超速離心來濃縮且用PBS再稀釋。
蛋白質濃度：1.52mg/ml
藥物/mAb比率：4.0
實例296n
在氬氣下，將0.014mg TCEP於25μl PBS緩衝液中之溶液添加至含有2.5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)的250μl PBS(c=10mg/ml)中， 且混合物在室溫下攪拌30分鐘。接著添加溶解於25μl DMSO中的0.105mg(0.12μmol)中間物F296。在室溫下再攪拌90分鐘之後，用PBS緩衝液pH 8將混合物補足至2.5ml且傳遞通過經PBS緩衝液pH 8平衡的PD 10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在室溫下、在氬氣下攪拌隔夜。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：0.74mg/ml
藥物/mAb比率：1.4
實例296o
在此，使用存在於500μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1C(TPP-7006)與中間物F296在pH 7.2偶合(c=10mg/ml)。在0.029mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。接著添加含有0.21mg(0.23μmol)F296的50μl DMSO，且混合物在室溫下再攪拌90分鐘。混合物接著使用PBS緩衝液(pH 8)補足至2.5ml且施加至經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.74mg/ml
藥物/mAb比率：3.0
實例296p
在此，使用存在於500μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)與中間物F296在pH 7.2偶合(c=10mg/ml)。在0.029mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。接著添加含有0.21mg(0.23μmol)F296的50μl DMSO，且混合物在室溫下再攪拌90分鐘。混合物接著使用PBS緩衝液(pH 8)補足至2.5ml且施加至經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，用PBS緩衝液pH 8溶 離且接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.92mg/ml
藥物/mAb比率：2.6
實例297n
在此，使用存在於208μl PBS(pH 7.2)中的2.5mg抗TWEAKR AK1A(ITEM-4)(c=12.0mg/ml)與中間物F297偶合。在0.014mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。添加含有0.12mg(0.13μmol)F297的25μl DMSO之後，接著在室溫下攪拌反應物90分鐘且隨後在葡聚糖凝膠上純化。溶離液最後藉由超速離心來濃縮且用PBS再稀釋。
蛋白質濃度：0.79mg/ml
藥物/mAb比率：1.6
實例322q
在此，使用存在於450μl PBS中的5mg抗TWEAKR AK1D(TPP-7007)與中間物F322在pH 7.2偶合(c=11.1mg/ml)。在0.029mg TCEP存在下，抗體還原時間為30分鐘。添加含有0.262mg(0.23μmol)F322的50μl DMSO之後，混合物接著在室溫下攪拌90分鐘且隨後在葡聚糖凝膠上純化。混合物接著藉由超速離心來濃縮且用PBS再稀釋。
蛋白質濃度：2.14mg/ml
藥物/mAb比率：4.2
實例325p
在氬氣下，將0.029mg TCEP於50μl PBS緩衝液中的溶液添加至 含有5mg抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)的0.450ml PBS中(c=11.1mg/ml)。在室溫下攪拌混合物30分鐘且接著添加溶解於50μl DMSO中的0.22mg(0.00023mmol)中間物F325。在室溫下再攪拌90分鐘之後，用PBS緩衝液pH 8將混合物補足至2.5ml且施加至經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)，用PBS緩衝液pH 8溶離且接著在室溫下、在氬氣下攪拌隔夜。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：2.09mg/ml
藥物/mAb比率：3.3
實例326p
在氬氣下，將0.029mg TCEP於50μl PBS緩衝液中的溶液添加至含有5mg抗TWEAKR AK1B(TPP-7005)的0.450ml PBS中(c=11.1mg/ml)。混合物在室溫下攪拌30分鐘且接著添加溶解於50μl DMSO中的0.22mg(0.00023mmol)中間物F326。混合物接著在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜，用PBS緩衝液(pH 7.2)補足至2.5ml且傳遞至經PBS緩衝液pH 7.2平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上。接著藉由超速離心來濃縮溶離液且用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋。所 得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：1.88mg/ml
藥物/mAb比率：4.4
C：生物學功效之評估
本發明化合物之生物活性可顯示於下述分析中：
a. C-1a測定針對TWEAKR之ADC的細胞毒性作用
利用多種細胞株分析ITEM-4 ADC之細胞毒性作用：
NCI-H292：人類黏液表皮樣肺癌細胞，ATCC-CRL-1848，標準培養基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，穩定化麩醯胺酸)+10% FCS(Sigma；#F2442)；TWEAKR陽性、EGFR陽性。LoVo人類結腸直腸癌細胞，ATCC編號CCL-229，培育用於MTT分析：標準培養基：凱恩氏(Kaighn's)+L-麩醯胺酸(Invitrogen 21127)+10%熱不活化FCS(得自Gibco，編號10500-064)。培育用於CTG分析：RPMI 1640(Biochrorn；#FG1215，穩定化麩醯胺酸)+10% FCS(Sigma #F2442)。TWEAKR陽性。
BxPC3：人類胰臟癌細胞，ATCC-CRL-1687，標準培養基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，穩定化麩醯胺酸)+10% FCS(Sigma #F2442)，TWEAKR陽性。
KPL4：人類乳癌細胞株，Bayer Pharma AG(在19.7.2012之DSMZ上檢查且確認身分)，標準培養基：RPMI 1640(得自Gibco；#21875-059，穩定化L-麩醯胺酸)+10%熱不活化FCS(得自Gibco，編號10500-064)；HER2陽性。
A498：人類腎臟癌細胞，ATCC編號HTB-44，標準培養基：具有厄勒氏鹽(Earle's salts)之MEM+Glutamax I(Invitrogen 41090)+10%熱不活化FCS(得自Gibco，編號10500-064)，TWEAKR陽性。
786-O：人類腎臟癌細胞，ATCC編號CRL-1932，標準培養基： RPMI 1640+Glutamax I(Invitrogen 61870)+10%熱不活化FCS(得自Gibco，編號10500-064)，TWEAKR陽性。
SK-HEP-1：人類肝癌細胞株，ATCC編號HTB-52，標準培養基：具有厄勒氏鹽之MEM+Glutamax I(Invitrogen 41090)+10%熱不活化FCS(得自Gibco，編號10500-064)；TWEAKR陽性。
細胞藉由標準方法培育，如美國組織培養收藏中心(American Tissue Culture Collection；ATCC)針對相關細胞株所述。
MTT分析
使用C-1下所列之生長培養基，根據標準方法培育細胞。測試如下進行：使用阿庫酶(Accutase)於PBS中之溶液(Biochrom AG #L2143)拆離細胞，離心集結，再懸浮於培養基中，計數且接種於具有白色底部的96孔培養盤(Costar #3610)中(NCI H292：2500個細胞/孔；KPL-4：1200個細胞/孔；SK-HEP-1：1500個細胞/孔；總體積為100μl)。細胞接著在保溫箱中、在37℃及5%二氧化碳下培育。48小時之後，置換培養基。接著將存在於10μl培養基中之濃度為10-5M至10-13M之代謝物吸移至細胞中(一式三份)，且接著在保溫箱中、在37℃及5%二氧化碳下培育分析物。96小時之後，使用MTT分析(ATCC,Manassas,Virginia,USA；目錄號30-1010K)偵測細胞增殖。為此目的，將MTT試劑與細胞一起培育4小時，隨後藉由添加清潔劑來溶解細胞隔夜。在570nm(Infinite M1000 pro,Tecan)偵測所形成的染料。使用DRC(劑量反應曲線)、利用所量測的資料計算生長抑制IC50。未經測試物質處理、但以其他方式相同地經處理之細胞的增殖定義為100%數字。
CTG分析
使用C-1下所列之生長培養基，根據標準方法培育細胞。如下進行測試：用胰蛋白酶(0.05%)及EDTA(0.02%)於PBS(Biochrom AG #L2143)中的溶液拆離細胞，離心集結，再懸浮於培養基中，計數且接種於具有白色底的96孔培養盤(Costar #3610)(75μl/孔，每孔細胞數目如下：NCI-H292：2500個細胞/孔，BxPC3 2500個細胞/孔)中，且在保溫箱中、在37℃及5%二氧化碳下培育。24小時之後，向細胞中添加含有抗體藥物結合物的25μl培養基(四倍濃縮)，使得細胞上的抗體藥物結合物濃度達到3×10-7M至3×10-11M(一式三份)。細胞接著在保溫箱中、在37℃及5%二氧化碳下培育。在一並行培養盤中，在藥物處理開始時(第0天)，使用Cell Titer Glow(CTG)發光細胞存活率分析(Promega #G7573及#G7571)測定細胞活力。為此目的，每批細胞中添加100μl受質，接著用鋁箔覆蓋培養盤，在盤振盪器上以180rpm振盪2分鐘，在實驗台上擱置8分鐘且接著使用光度計(Victor X2,Perkin Elmer)量測。受質偵測活細胞中之ATP內容物，產生發光信號，其高度與細胞活力成正比。與抗體藥物結合物一起培育72小時之後，亦使用如上文所述的Cell Titer Glow發光細胞存活率分析來測定此等細胞的活力。根據量測資料，使用DRC(劑量反應曲線)分析試算表、經由4參數擬合來計算相較於第0天之生長抑制IC50。DRC分析試算表為Bayer Pharma AG及Bayer Business Services在IDBS E-WorkBook套件平台(IDBS：ID Business Solutions Ltd.,Guildford,UK)上所開發的Biobook試算表。
下述表1a及1b列舉抗TWEAKR抗體之代表性實施例的IC50值：
實例1b
所報導之活性資料係關於本發明實驗章節中所述的實施例，其中指示有藥物/mAB比率。該等值可能因藥物/mAB比率不同而偏離。IC50值為若干個獨立實驗或個別值之平均值。抗TWEAKR抗體藥物結合物之作用相對於包含相應連接子及毒性基團之相應同型對照物而言具有選擇性。
C-1b 測定所選實例對驅動蛋白紡錘體蛋白質KSP/Eg5的抑制作用
在室溫下，將人類驅動蛋白紡錘體蛋白質KSP/Eg5(tebu-bio/Cytoskeleton Inc，編號027EG01-XL)之馬達域在10nM之濃度下與經50μg/ml紫杉醇(Sigma，編號T7191-5MG)穩定化之微管(牛科動物或豬科動物，tebu-bio/Cytoskeleton Inc)一起在15mM PIPES pH 6.8(5mM MgCl2及10mM DTT，Sigma)中培育5分鐘。將新鮮製備的混合物等分試樣至384 MTP(Corning)中。接著添加濃度為1.0×10-6M至 1.0×10-13M的待檢查之抑制劑及ATP(最終濃度500μM，Sigma)。在室溫下培育2小時。藉由使用孔雀綠(Biomol)偵測所形成的無機磷酸鹽來偵測ATP酶活性。添加試劑之後，分析物在室溫下培育50分鐘，隨後在620nm波長下偵測吸收。所用陽性對照物為蒙納曲醇(Sigma，M8515-1mg)及伊斯平斯(AdooQ Bioscience A10486)。劑量活性曲線之個別資料為八倍測定。IC50值為兩次獨立實驗之平均值。100%對照物為尚未經抑制劑處理的樣品。
下表2概述利用所述分析及相應細胞毒性資料(MTT分析)所得之代表性實施例的IC50值。
所報導之活性資料係關於本發明實驗章節中所述的實施例。
C-2 內化分析
內化為能夠經由抗體藥物結合物(ADC)特異性且有效提供細胞毒性有效負載於表現抗原之癌細胞中的關鍵過程。經由特異性抗TWEAKR抗體之螢光標記及同型對照抗體來監測此過程。首先，使螢光染料與抗體之離胺酸結合。使用兩倍莫耳濃度過量之CypHer 5E單NHS酯(批次357392，GE Healthcare)，在pH 8.3進行結合。偶聯之後，反應混合物藉由凝膠層析(Zeba旋轉脫鹽管柱，40K，Thermo Scientific，編號87768；溶離緩衝液：DULBECCO′S PBS，Sigma-Aldrich，編號D8537)純化，以消除過量染料及調節pH。使用VIVASPIN 500管柱(Sartorius stedim biotec)濃縮蛋白質溶液。藉由分光光度法分析(NanoDrop)測定抗體之染料負荷且隨後使用(D：P=A染料ε蛋白質：(A280-0.16A染料)ε染料)計算。
在此所檢查之抗TWEAKR抗體及同型對照物的染料負荷具有類似數量級。在細胞結合分析中，證實結合不會引起抗體親和力發生變化。
內化分析中使用經標記之抗體。
此處理開始之前，將存在於100μl培養基中的2×104個細胞/孔接種於96-MTP(油脂，黑色，透明底第4308776號，得自Applied Biosystems)中。在37℃/5% CO2下培育18小時之後，置換培養基且添加多種濃度(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)之經標記抗TWEAKR抗體。對經標記之同型對照物(陰性對照物)使用相同處理方案。所選培育時間為0小時、0.25小時、0.5小時、1小時、1.5小時、2小時、3小時、6小時及24小時。使用InCellAnalyzer 1000(得自GE Healthcare)進行螢光量測。經由量測參數顆粒數/細胞及總顆粒強度/細胞來進行動力學評價。
結合至TWEAKR之後，檢查抗TWEAKR抗體的內化能力。為此 目的，選擇具有多種TWEAKR表現量的人類腫瘤細胞(例如NCI H292、786-0、A498)。可觀測到抗TWEAKR抗體在不同細胞株中之標靶介導性特異性內化，而同型對照物顯示無內化。
C-3 用於測定細胞滲透性的活體外測試
物質之細胞滲透性可藉助於活體外測試、在使用Caco-2細胞的流動分析[M.D.Troutman and D.R.Thakker,Pharm.Res.20(8),1210-1224(2003)]中研究。為此目的，將細胞在24孔過濾盤上培養15-16天。為了測定滲透，將相應測試物質於HEPES緩衝液中施加於細胞頂端(A)或基底(B)上且培育2小時。0小時之後及2小時之後，自順式及反式隔室中獲取樣品。藉由使用逆相管柱的HPLC(Agilent 1200,Böblingen,Germany)分離樣品。HPLC系統經由Turbo離子噴霧介面與Triple Quadropol質譜儀API 4000(AB SCIEX Deutschland GmbH,Darmstadt,Germany)耦聯。基於Papp值來評價滲透性，其係使用Schwab等人公開的公式計算[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]。當Papp(B-A)相對於Papp(A-B)的比率(流出比率)>2或<0.5時，物質歸類為主動轉運。
對於細胞內釋放的毒性基團而言，至關重要的是B至A之滲透率[Papp(B-A)]及Papp(B-A)相對於Papp(A-B)的比率(流出比率)：此滲透率愈低，物質通過Caco-2細胞單層之主動及被動轉運過程則愈慢。若流出比率未另外指示任何主動轉運，則細胞內釋放之後，物質可較長時間保留於細胞中。因此，可供與生物化學標靶(在此情況下：驅動蛋白紡錘體蛋白質，KSP/Eg5)發生相互作用的時間亦愈多。
下表3列出此分析所得之代表性實施例的滲透率資料：
C-4 用於測定P-糖蛋白(P-gp)之受質特性的活體外測試
許多腫瘤細胞表現用於藥物之轉運蛋白，且此頻繁伴有針對細胞抑制劑之開發阻力。舉例而言，不為此類轉運蛋白(諸如P-糖蛋白(P-gp)或BCRP)之受質的物質因此可展現改良之活性概況。
針對P-gp之物質(ABCB1)的受質特性係藉助於使用過度表現P-gp之LLC-PK1細胞(L-MDR1細胞)的流動分析[A.H.Schinkel等人，J.Clin.Invest.96,1698-1705(1995)]來測定。為此目的，將LLC-PK1細胞或L-MDR1細胞在96孔過濾盤上培養3-4天。測定滲透率時，將單獨或在抑制劑(諸如伊維菌素(ivermectin)或維拉帕米(verapamil))存在下的相應測試物質於HEPES緩衝液中施加於細胞頂端(A)或基底(B)且培育2小時。0小時之後及2小時之後，自順式及反式隔室中獲取樣品。藉由使用逆相管柱的HPLC分離樣品。HPLC系統經由Turbo離子噴霧介面與Triple Quadropol質譜儀API 3000(Applied Biosystems Applera, Darmstadt,Germany)耦聯。基於Papp值來評價滲透性，其係使用Schwab等人公開的公式計算[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]。當Papp(B-A)相對於Papp(A-B)的流出比率>2時，物質歸類為P-gp受質。
作為評價P-gp受質特性的另一準則，可比較L-MDR1及LLC-PK1細胞的流出比率或在抑制劑存在或不存在下的流出比率。若此等值相差大於2倍，則相關物質為P-gp受質。
C-5 藥物動力學
靜脈內投與3-30mg/kg不同ADC之後，可藉助於ELISA(參見章節：用於定量抗體的分析)量測ADC之抗體部分的血漿及腫瘤濃度且可計算藥物動力學參數(諸如清除率(CL)、曲線下面積(AUC)及半衰期(t1/2)。與其類似地，可量測ADC於血漿、腫瘤及組織中潛在出現之代謝物濃度。
靜脈內投與5mg/kg實例208o之ADC至雄性大鼠之後，能夠測定ADC之以下參數：
用於定量所用抗體的分析
使用配位體結合分析(ELISA)，以血漿樣品及腫瘤溶解物中的總IgG濃度測定ADC中的抗體部分。在此，使用夾心ELISA形式。此ELISA就在血漿及腫瘤樣品中進行的測定而言為合格且經驗證的。將抗人類山羊IgG Fc抗體塗佈於ELISA盤上。與樣品一起培育之後，洗滌培養盤且與猿猴抗人類IgG(H+L)抗體及辣根過氧化酶(HRP)之偵測 結合物一起培育。進一步洗滌步驟之後，向OPD中添加HRP受質且經由490nm之吸收來監測顯色。具有已知IgG濃度之標準樣品使用4參數方程式擬合。在定量下限(LLOQ)與定量上限(ULOQ)之範圍內，藉由內插法確定未知濃度。
C5a：鑑別活體外內化之後的ADC代謝物
方法描述：
對免疫結合物進行內化研究以分析細胞內形成的代謝物。為此目的，將人類肺腫瘤細胞NCI H292(3x105孔)接種於6孔培養盤中且培育隔夜(37℃，5% CO2)。細胞用10μg/ml(66nM)之待檢查ADC處理。內化在37℃及5% CO2下進行。在不同時間點(0、4、24、48、72小時)，獲取細胞樣品用於進一步分析。首先，收集上清液(約5ml)且在離心(2分鐘，室溫，1000rpm Heraeus Variofuge 3.0R)之後，在-80℃儲存。細胞用PBS洗滌且用阿庫酶拆離，且測定細胞數目。另外洗滌之後，將限定數目個細胞(2×105)用100ml溶胞緩衝液(哺乳動物細胞溶解套組(Sigma MCL1))處理且於Protein LoBind管(Eppendorf，目錄號0030 108.116)中、在連續振盪(熱混合器，15分鐘，4℃，650rpm)下培育。培育之後，將溶胞物離心(10分鐘，4℃，12000g，Eppendorf 5415R)且收集上清液。所得上清液在-80℃儲存。所有樣品接著如下分析。
用甲醇或乙腈使蛋白質沈澱之後，藉由高壓液相層析(HPLC)耦聯三重四極質譜儀(MS)來量測培養物上清液或細胞溶胞物中的化合物。
處理50μl培養物上清液/細胞溶胞物時，添加150μl沈澱試劑(通常為乙腈)且振盪混合物10秒。沈澱試劑含有適合濃度(通常在20-100ng/ml範圍內)的內標物(ISTD)。以16000g離心3分鐘之後，將上清液轉移至自動取樣瓶中，補充500μl適於移動相的緩衝液且再次振盪。
接著使用HPLC耦聯三重四極質譜儀API6500(得自AB SCIEX Deutschland GmbH)量測兩個基質樣品。
為了校準，添加0.5-2000μg/l濃度至血漿樣品中。偵測極限(LOQ)為約2μg/l。線性範圍自2μg/l延伸至1000μg/l。
為了校準腫瘤樣品，添加0.5-200μg/l濃度至未治療腫瘤之上清液中。偵測極限為4μg/l。線性範圍自4μg/l延伸至200μg/l。
用於測試有效性之品質對照物含有5μg/l及50μg/l。
C5b：鑑別活體內ADC代謝物
作為參考實例(R10k)，用促效抗體TPP-2658產生ADC：
參考實例R10k
在氬氣下，將0.86mg TCEP於2ml PBS緩衝液中的溶液添加至含有150mg抗TWEAKR抗體TPP-2658的10.5ml PBS中(c=14.28mg/ml)。抗體TPP-2658及其製備詳細地描述於WO 2015/189143 A1中。
在室溫下攪拌混合物30分鐘，且接著添加溶解於1250μl DMSO中的6.63mg(0.008mmol)中間物F104。在室溫下再攪拌90分鐘之後，混合物用預先已調節至pH 8的1250μl PBS緩衝液稀釋。
接著將此溶液施加至已經PBS緩衝液pH 8平衡的PD-10管柱(Sephadex® G-25,GE Healthcare)上，且用PBS緩衝液pH 8溶離。溶離液用PBS緩衝液pH 8稀釋至22.5ml總體積。此溶液在氬氣下、在室溫下攪拌隔夜且接著再次使用PD-10管柱再緩衝至pH 7.2。混合物接著藉由超速離心來濃縮，用PBS緩衝液(pH 7.2)再稀釋且再次濃縮。所得ADC批料表徵如下：
蛋白質濃度：14.06mg/ml
藥物/mAb比率：3.4
用於定量所出現之任何代謝物的分析
用甲醇或乙腈使蛋白質沈澱之後，藉由高壓液相層析(HPLC)耦聯三重四極質譜儀(MS)來量測血漿、腫瘤及組織中的化合物。
處理50μl血漿時，添加250μl沈澱試劑(通常為乙腈)且振盪混合物10秒。沈澱試劑含有適合濃度(通常在20-100ng/ml範圍內)的內標物(ISTD)。以16000g離心3分鐘之後，將上清液轉移至自動取樣瓶中，補充500μl適於移動相的緩衝液且再次振盪。
在腫瘤或組織處理期間，腫瘤或組織用3倍的萃取緩衝液之量處理。萃取緩衝液含有50ml組織蛋白質萃取試劑(Pierce,Rockford,IL)、兩粒完整蛋白酶抑制劑混合物(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)及最終濃度為1mM的苯基甲基磺醯氟(Sigma,St.Louis,MO)。樣品在Tissuelyser II(Qiagen)中以最大行程數均質化兩次歷時20分鐘。將50μl勻漿轉移至自動取樣瓶中且補充150μl包括ISTD之甲醇。以16000g離心3分鐘之後，向10μl上清液中補充180μl適於移動相之緩衝液且再次振盪。接著準備好腫瘤或組織樣品供量測。
接著使用HPLC耦聯三重四極質譜儀API6500(得自AB SCIEX Deutschland GmbH)量測基質樣品。
為了校準，添加0.5-2000μg/l濃度至血漿樣品中。偵測極限(LOQ)為約2μg/l。線性範圍自2μg/l延伸至1000μg/l。
為了校準腫瘤及組織樣品，添加0.5-200μg/l濃度至未治療腫瘤或組織之上清液中。偵測極限在3μg/l與6μg/l之間。線性範圍自3μg/l延伸至200μg/l。
用於測試有效性的品質對照物含有5μg/l及50μg/l，在血漿中另外含有500μg/l。
將具有中等促效抗體之本發明之ADC實例208o投與腫瘤之後投與，所量測之活性分解代謝物M26的濃度類似於投與具有相同有效負載及高促效抗體(抗體TPP-2658之促效活性詳細描述於WO 2015/189143 A1中)之ADC R10k之後的活性分解代謝物M26濃度。相比之下，投與得自實例208o之ADC之後，肝臟及腎臟中之活性代謝物的量測濃度明顯低於投與參考ADC R10k之後的濃度。當結合物中使用不具有促效作用或僅具有中等促效作用之抗TWEAKR抗體時，藥物在靶組織(腫瘤)處的釋放明顯多於其他器官。
C-6 活體內功效測試
本發明之結合物之功效可使用例如異種移植模型活體內測試。熟習此項技術者熟悉可用於測試本發明化合物之功效的先前技術方法 (參見例如WO 2005/081711；Polson等人，Cancer Res.2009 Mar 15；69(6)：2358-64)。為此目的，例如，將表現結合子之標靶分子的腫瘤細胞株植入嚙齒動物(例如小鼠)中。隨後，接著將本發明之結合物、同型抗體對照結合物或對照抗體或等張生理鹽水投與植入動物。投藥進行一次或超過一次。若干天培育時間之後，藉由比較經結合物處理之動物與對照組來測定腫瘤尺寸。經結合物處理之動物顯示較小的腫瘤尺寸。
C-6a. 小鼠中之實驗腫瘤的生長抑制/消退
將表現抗體藥物結合物之抗原的人類腫瘤細胞皮下接種於免疫抑制小鼠(例如NMRi裸小鼠或SCID小鼠)的側腹中。自細胞培養物中拆離1-10百萬個細胞，離心且再懸浮於培養基或培養基/基質膠中。 細胞懸浮液注射於小鼠皮下。
在數天內，腫瘤生長。腫瘤已建立(腫瘤尺寸約40mm2)之後，開始處理。為了檢查對較大腫瘤的作用，亦可僅在50-100mm2之腫瘤尺寸時開始處理。
ADC經由小鼠尾靜脈之靜脈內(i.V.)路徑處理小鼠。ADC以5ml/kg之體積投與。
處理方案係依據抗體結合物之藥物動力學。作為標準，每第7天存在三次連續處理。為了快速評估，亦可使用單一處理方案。然而，亦可繼續處理，或後期可為第二輪之三個處理日。
作為標準，每個處理組使用8隻動物。除接受活性物質之群組之外，作為對照組的一個組僅用緩衝液、依據相同方案處理。
在實驗過程中，使用測徑規定期量測腫瘤的二維面積(長度/寬度)。腫瘤面積係以長度×寬度測定。處理組之平均腫瘤面積與對照組之平均腫瘤面積的比較係以T/C面積陳述。
若實驗之所有群組在處理結束時的相同時間終止，則可移出腫 瘤且稱重。處理組之平均腫瘤重量與對照組之平均腫瘤重量的比較係以T/C重量陳述。
C-6b. 在人類腫瘤異種移植模型中之功效
相關腫瘤細胞皮下接種於雌性NMRI裸小鼠(Janvier)之側腹中。腫瘤尺寸為約40mm2時，用抗體藥物結合物靜脈內處理動物。處理之後，視情況進一步監測腫瘤生長。
相較於對照組及同型藥物結合物，用抗TWEAKR抗體藥物結合物處理對腫瘤產生明顯且持久的生長抑制作用(在先前實驗中已證明後者無活性)。接種之後計算的T/C值(利用對照組的最後量測值，在當天相對於腫瘤面積所測定)陳述於表8中。
抗TWEAKR抗體之實施例
藉由表面電漿子共振來測定抗體之結合親和力：
用於定量結合分析的表面電漿子共振實驗係使用Biacore T200儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)進行。在此，待檢查的抗體係藉助於與感測晶片表面發生胺偶合的抗人類Fc抗體(「人類抗體捕捉套組」，BR-1008-39，GE Healthcare Biacore,Inc.)固定。胺偶合係使用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)及乙醇胺HCl pH 8.5(「胺偶合套組」BR-1000-50，GE Healthcare Biacore,Inc.)、根據製造商說明書進行。在分析中，使用S系列感測晶片CM5(GE Healthcare Biacore,Inc.)及流動緩衝液HBS-EP+(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%界面活性劑P20)。所有實驗步驟均在25℃進行。待檢查之抗TWEAKR抗體 固定之後，注射3.9至500nM濃度範圍內之TWEAKR之胞外域(Analyt,30R-AT080,Fitzgerald)，且在每次抗原注射之後，用甘胺酸HCl pH 2.0使感測器表面再生。在另一次分析物注射之前，抗體在各種情況下、在相同條件下如上固定。就所有量測而言，僅含有經固著之胺偶合抗人類Fc抗體的上游流動池用作參考池。雙重參考(扣除參考流動池信號及緩衝液注射)之後，藉由Biacore T200評價軟體(GE Healthcare Biacore,Inc.)中所執行之「穩態」親和力評價方法來評價所得感測圖譜。
藉助於FACS分析來測定抗體對表現TWEAKR之癌細胞的結合親和力
使用不同的人類腫瘤細胞株，藉由流式細胞術檢查抗TWEAKR抗體的結合。為此目的，將細胞(5x105個細胞/孔)與10μg/ml一級抗體溶液(初始濃度)一起於FACS緩衝液(不含Ca/Mg之PBS，3% FCS，Biochrom)中、在冰上避光培育30-45分鐘。繪製劑量活性曲線(1：5稀釋度)。培育之後，使用移液管添加200μl冰冷FACS緩衝液，且細胞懸浮液在4℃以400g離心4分鐘。細胞集結粒用300μl冰冷FACS緩衝 液洗滌且獲得離心塊接著再懸浮於100μl FACS緩衝液中且再次與二級抗體(單株抗κ輕鏈-FITC抗體，Sigma，編號SAB4700605)一起在冰上以1：10稀釋度培育30分鐘。細胞接著用冰冷FACS緩衝液洗滌且調節至0.5x106個細胞/毫升之細胞濃度，隨後使用Guava流式細胞儀(Millipore)進行流式細胞術。使用碘化丙錠(最終濃度1μg/ml)進行活體染色。結果係以待檢查之抗體之背景校正幾何平均值(表6a)測定或EC50值藉助於劑量/作用曲線(表6b)測定。
(幾何平均值-二級抗體之幾何平均值>5：+，>50：++，>500：+++，>5000：++++
藉助於NFkappaB報導基因分析測定抗TWEAKR抗體的促效/拮抗活性
進行NF-κB報導基因分析以評估抗體(人類IgG1)的促效活性。使用293fectin，根據製造商說明書，用NF-κB報導子構築體(BioCat，目錄號LR-0051-PA)短暫轉染HEK293細胞。在37℃、5% CO2，將F17培 養基(無血清；Invitrogen)中之經轉染的細胞接種於經聚離胺酸塗佈之白色盤(BD)。次日，細胞用不同濃度的純化抗體刺激6小時，且隨後根據標準方法進行螢光素酶分析。量測例如ITEM-4之中等促效活性，其顯示天然配位體(200ng/ml)TWEAK之促效作用的14%。為了檢查拮抗活性，在天然配位體Tweak(200ng/ml)存在下進行分析。在此分析設計中，證明ITEM-4具有強拮抗活性。
<110> 德商拜耳製藥公司
<120> KSP抑制劑與抗TWEAKR抗體的抗體藥物結合物(ADC)
<130> BHC 15 1 033
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<212> PRT
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<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-7053-LCDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> TPP-7075-重鏈
<400> 79
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-7075-輕鏈
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> TPP-7076-VH
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<210> 82
<211> 5
<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-7076-HCDR2
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-7076-LCDR3
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<211> 449
<212> PRT
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<220>
<223> TPP-7076-重鏈
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-7076-輕鏈
<400> 90
<210> 91
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<211> 16
<212> PRT
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
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<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-7077-LCDR3
<400> 98
<210> 99
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-7077-重鏈
<400> 99
<210> 100
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-7077-輕鏈
<400> 100
<210> 101
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
<210> 102
<211> 959
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102

Claims (29)

  1. 一種抗體與一或多種藥物分子的結合物，該等藥物分子具有下式： 其中結合子 表示具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段，L 表示連接子，n 表示數字1至50，較佳為1.2至20且尤佳為2至8，及KSP 表示下式(I)化合物： 其中R1 表示-H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、-NHY3、-OY3、-SY3、鹵素、-C(=O)-NY1Y2或-C(=O)-OY3，Y1及Y2 彼此獨立地表示-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'(例如-(CH2)0-3Z')或-CH(CH2W)Z'，Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'， Z' 表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-C(=O)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；W 表示H或OH，Y4 表示視情況經-NHC(=O)-NH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基；R2 表示H、-MOD、-C(=O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2或-C(=O)-OY3，Y1及Y2 彼此獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；Y4 表示視情況經-NHC(=O)-NH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，及Y5 表示-H或-C(=O)-CHY6-NH2，Y6 表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；R4 表示-H、-L-#1、-SGlys-(C=O)0-1-R4'、-C(=O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中SGlys 表示可藉由溶酶體酶裂解的基團，特定言之，由二肽或三肽組成的基團，其中R4'表示C1-10烷基、C5-10芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基、C5-10雜環烷基、雜芳基、雜芳基烷基、雜芳基烷氧基、C1-10烷氧基、C6-10芳氧基或C6-10芳烷氧基、C5-10雜芳烷氧基、C1-10烷基-O-C6-10芳氧基、C5-10雜環烷氧基，其可經以下單取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(=O)-烷基、-N(烷基)-C(=O)-烷基、-SO3H、- S(=O)2-NH2、-S(=O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(=O)-NH2、-C(=O)-N(烷基)2或-OH、-H或基團-Ox-(CH2CH2O)y-R4"，其中x 表示0或1，其中v 表示數字1至10；其中R4" 表示-H、-烷基(較佳為C1-12烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2；其中Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2或-C(=O)-OY3，其中Y1及Y2 彼此獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，其中Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，其中Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；其中Y4 表示視情況經-NHC(=O)-NH2取代的直鏈或分支鏈C1-6烷基，或表示視情況經-NH2取代的芳基或苯甲基，其中Y5 表示-H或-C(=O)-CHY6-NH2，其中Y6 表示直鏈或分支鏈C1-6烷基；或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11 表示-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、鹵素(特定而言，F或Cl)、C1-4烷基、C1-4鹵烷基、C1-4烷氧基、經羥基取代之C1-4烷基、COO-(C1-4烷基)或-OH；A 表示-C(=O)-、-S(=O)-、-S(=O)2-、-S(=O)2-NH-或-C(=N-NH2)-；R3 表示-L-#1、-MOD或視情況經取代之烷基、環烷基、芳基、雜芳基、雜烷基、雜環烷基，較佳為-L-#1或C1-10烷基、C6-10 芳基或C6-10芳烷基、C5-10雜烷基、C1-10烷基-O-C6-10芳基或C5-10雜環烷基，其分別可經以下取代：1-3個-OH基團、1-3個鹵素原子、1-3個鹵化烷基(各自具有1-3個鹵素原子)、1-3個O-烷基、1-3個-SH基團、1-3個-S-烷基、1-3個-O-C(=O)-烷基、1-3個-O-C(=O)-NH-烷基、1-3個-NH-C(=O)-烷基、1-3個-NH-C(=O)-NH-烷基、1-3個-S(=O)n-烷基、1-3個-S(=O)2-NH-烷基、1-3個-NH-烷基、1-3個-N(烷基)2基團、1-3個-NH2基團或1-3個-(CH2)0-3Z基團，其中n 表示0、1或2，Z 表示-H、鹵素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2或-C(=O)-OY3，Y1及Y2 彼此獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，Y3 表示-H、-(CH2)0-3-CH(NH-C(=O)-CH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH，R5 表示-H、-NH2、-NO2、鹵素(特定而言，F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z 表示-H、-OY3、-SY3、鹵素、-NHY3、-C(=O)-NY1Y2或-CO-OY3，Y1及Y2 彼此獨立地表示-H、-NH2或-(CH2)0-3Z'，Y3 表示-H或-(CH2)0-3Z'，Z' 表示-H、-SO3H、-NH2或-COOH；R6及R7彼此獨立地表示-H、氰基、C1-10烷基、氟-C1-10烯基、C2-10烯基、氟-C2-10烯基、C2-10炔基、氟-C2-10烯基、羥基、-NO2、-NH2、-COOH或鹵素， R8 表示C1-10烷基、氟-C1-10烯基、C2-10烯基、氟-C2-10烯基、C2-10炔基、氟-C2-10烯基、C4-10環烷基、氟-C4-10環烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其可相同或不同地經-OH、-COOH或-NH2單取代或二取代，及其中HZ2 表示具有至多兩個選自N、O及S之雜原子的4員至7員雜環，R9 表示-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；其中取代基R1、R3及R4之一表示-L-#1，L 表示該連接子且#1表示連至該抗體之鍵，-MOD 表示-(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中R10 表示H或C1-C3烷基；G1 表示-NHC(=O)-、-C(=O)NH-(其中若G1表示-NHC(=O)-，則R10不表示-NH2)；n表示0或1；o表示0或1；及G2 表示直鏈或分支鏈烴鏈，其具有1至10個碳原子且可被以下基團中之一或多者間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-S(=O)-、S(=O)2、-NRy-、-NRyC(=O)-、C(=O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(=O)2-NRyNRy-、-C(=O)-NRyNRy-其中Ry 表示-H、苯基、C1-C10烷基、C2-C10烯基或C2-C10炔基，其中之每一者可相同或不同地被以下單取代或二取代：-NH-C(=O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH- CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸，及/或其可相同或不同地被-C(=O)-、-CRx=N-O-間雜一次或超過一次，其中Rx 表示-H、C1-C3烷基或苯基，及其中在該烴基上包括視情況經取代之C1-C10烷基作為側鏈的該烴鏈可經-NH-C(=O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NHCNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸取代，G3 表示-H或-COOH，及其中該基團-MOD較佳具有至少一個基團-COOH；及其鹽、溶劑合物、溶劑合物之鹽及差向異構體。
  2. 如請求項1之結合物，其中A表示-C(=O)-。
  3. 如請求項1或2之結合物，其中R1表示-H、-L-#1、-COOH、-C(=O)-NHNH2、-(CH2)1-3NH2、-C(=O)-NZ"(CH2)1-3NH2或-C(=O)-NZ"CH2COOH，其中Z"表示-H或-NH2。
  4. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中R2及R4表示-H或R2與R4一起(藉以形成吡咯啶環)表示-CHR11-CH2-或-CH2-CHR11-；其中R11表示H、COOH、F、Me、CH2F、OMe、CH2OH、-COO(C1-4烷基)或-OH。
  5. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中R3表示-L-#1或表示可經鹵素、C1-3烷基或氟-C1-3烷基單取代或多取代的苯基，或表示視情況可經以下取代的C1-10烷基或氟-C1-10烷基：-OY4、-SY4、-O-C(=O)-Y4、-O-C(=O)-NH-Y4、-NH-C(=O)-Y4、-NH-C(=O)-NH-Y4、-S(O)n-Y4、-S(=O)2-NH-Y4、-NH-Y4或-N(Y4)2，其中n表示0、1或2， Y4表示-H、視情況經鹵素單取代或多取代之苯基、C1-3烷基或氟-C1-3烷基，或表示可經-OH、-COOH及/或-NH-C(=O)-C1-3烷基取代之烷基。
  6. 如請求項5之結合物，其中該結合物具有下式(IIj)： 其中R3 表示-L-#1；A 表示-C(=O)-；及R6、R7、R8及R9 具有與請求項1中之式(I)相同的含義。
  7. 如請求項1至5中一或多項之結合物，其中該取代基R1表示-L-#1。
  8. 如請求項7之結合物，其中該結合物具有式(IIk)： 其中R1 表示-L-#1；A 表示-C(=O)-及 R3 表示-CH2OH-；R6、R7、R8及R9 具有與請求項1中之式(I)相同的含義。
  9. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中R5表示-H或-F。
  10. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中R6及R7彼此獨立地表示-H、C1-3烷基、氟-C1-3烷基、C2-4烯基、氟-C2-4烯基、C2-4炔基、氟-C2-4炔基、羥基或鹵素。
  11. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中R8表示分支鏈C1-5烷基或環己基。
  12. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中R9表示-H或氟。
  13. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中該連接子-L-具有下文基本結構(i)至(iv)之一：(i)-(CO)m-SG1-L1-L2-(ii)-(CO)m-L1-SG-L1-L2-(iii)-(CO)m-L1-L2-(iv)-(CO)m-L1-SG-L2其中m表示0或1，SG及SG1表示活體內可裂解基團，L1彼此獨立地表示活體內不可裂解的有機基團，且L2表示連至該結合子的偶合基團。
  14. 如請求項13之結合物，其中該活體內可裂解基團SG為2-8個寡肽基團，較佳為三肽或二肽基團或二硫鍵、腙、縮醛或縮醛胺且SG1為2-8個寡肽基團，較佳為二肽基團。
  15. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中該連接子L連接至半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基且具有下式：§-(C(=O)-)m-L1-L2-§§其中 m 表示0或1；§ 表示連至該活性化合物分子的鍵，及§§ 表示連至該抗體的鍵，及-L2- 表示 其中#1 表示連至該抗體中之硫原子的連接點，#2 表示連至基團L1之連接點，L1 表示-(NR10)n-(G1)o-G2-，其中R10 表示-H、-NH2或C1-C3烷基；G1 表示-NH-C(=O)-；n 表示0或1；o 表示0或1；及G2 表示具有1至100(較佳為1至25)個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自芳基及/或直鏈及/或分支鏈烷基及/或環狀烷基且可相同或不同地被以下間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-S(=O)-、S(=O)2-、-NH-、-C(=O)-、-N-CH3-、-NHNH-、-S(=O)2-NHNH-、-NH-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-C(=O)-NHNH-及5員至10員芳族或非芳族雜環，該雜環具有1至4個選自以下組成之群的相同或不同雜原子及/或雜基團：N、O及S、-S(=O)-或-S(=O)2-， 其中直鏈或分支鏈烴鏈視情況可經以下取代：-NH-C(=O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸，或表示下述基團之一： 其中Rx表示-H、C1-C3烷基或苯基。
  16. 如請求項15之結合物，其中L2係由下述式中之一或兩者表示： 其中#1 表示連至該結合子中之硫原子的連接點，#2 表示連至基團L1之連接點，R22 表示-COOH及超過80%(以該連接子連至該結合子之鍵的總數計)之連至該結合子中硫原子之鍵存在於此等兩個結構之一中。
  17. 如請求項15及16中一或多項之結合物，其中L1具有下式： 其中r表示數字0至8。
  18. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中該連接子-L-係連接至半胱胺酸側鏈或半胱胺酸殘基且具有下式： 其中§ 表示連至該活性化合物分子的鍵，及§§ 表示連至該抗體的鍵，m 表示0、1、2或3；n 表示0、1或2；p 表示0至20；及L3 表示 其中o表示0或1；及 G3表示具有1至100(較佳為1至25)個碳原子的直鏈或分支鏈烴鏈，其衍生自芳基及/或直鏈及/或分支鏈烷基及/或環狀烷基且可相同或不同地被以下間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-S(=O)-、S(=O)2-、-NH-、-C(=O)-、-N-CH3-、-NHNH-、-S(=O)2-NHNH-、-NH-C(=O)-、-C(=O)-NH-、-C(=O)-NHNH-及5員至10員芳族或非芳族雜環，該雜環具有1至4個選自以下組成之群的相同或不同雜原子及/或雜基團：N、O及S、-S(=O)-或-S(=O)2-，其中該直鏈或分支鏈烴鏈視情況可經以下取代：-NH-C(=O)NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺醯胺、碸、亞碸或磺酸。
  19. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中該結合物具有下式之一： 其中AK1 表示經由半胱胺酸連接的具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，且AK2表示經由離胺酸連接的具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，n 表示數字1至20；及 L1表示直鏈或分支鏈烴鏈，其具有1至30個碳原子且可相同或不同地被以下間雜一次或超過一次：-O-、-S-、-C(=O)-、-S(=O)2-、-NH-、環戊基、哌啶基、苯基，其中該直鏈或分支鏈烴鏈可經-COOH或-NH2取代，及其鹽、溶劑合物、該等溶劑合物之鹽及差向異構體。
  20. 如請求項19之結合物，其中該連接子L1表示基團§-NH-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)6-§§；§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§；§-NH-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-O-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(CH3)-§§；§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(C2H4COOH)-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-((CH2)2-O)3-(CH2)2-§§；§-NH-(CH2)2-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§； §-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)3-NH-C(=O)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH(CH2COOH)-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH(C2H4COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH(CH2OH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH[C(=O)-NH-(CH2)2-O)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-CH(CH3)-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)- CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NHC(=O)-NH-(CH2)2-§§； §-NHC(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-NHC(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NHC(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)3-NH-C(=O)-NH2]-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§； §-NHC(=O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(異C3H7)-C(=O)-NH-CH[(CH2)3- NH-C(=O)-NH2]-C(=O)-OC(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(異C3H7)-C(=O)-NH-CH(CH3)- C(=O)-OC(=O)-CH2-§§；§-NH-(CH2)2-NH-C(=O)§§； §-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)§§；§-NH-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(CH3)-C(=O)-NH-CH[(CH2)3-NH- C(=O)-NH2]-C(=O)-NH§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-§§； §-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§； §NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)5-C(=O)-NH-(CH2)2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§； §-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)5-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§；§-CH2-S-(CH2)2-C(=O)-NH-CH(C2H4COOH)-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-CH3]-C(=O)-NH-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH(CH3)-NH-C(=O)-CH(異C3H7)-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-(CH2)2-S(=O)2-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[NH-C(=O)-(CH2)2-COOH]-C(=O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[C(=O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§；§-CH2-S-CH2CH[C(=O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§； §-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-§§或§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(=O)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(=O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(=O)-(CH2)2-§§，其中§ 表示連至該活性組分分子的鍵，及§§ 表示連至該抗體的鍵，及異C3H7 表示異丙基，及其鹽、溶劑合物、該等溶劑合物之鹽及差向異構體。
  21. 如請求項1至18中一或多項之結合物，其中該結合物具有下式之一： 其中AK1 表示經由半胱胺酸連接的具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，且AK2表示經由離胺酸連接的具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體，及n 表示數字1至20。
  22. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中具有中等促效作用或不具有促效作用之該抗TWEAKR抗體為ITEM-4或該ITEM-4抗體之嵌合或人類化變異體或其抗原結合片段。
  23. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中該具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段包含：包含如SEQ ID NO：2中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：3中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：4中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：6中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：7中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：8中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：12中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：13中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：14中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：16中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：17中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：18中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：22中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：23中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：24中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：26中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：27中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：28中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：32中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：33中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：34中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及 包含如SEQ ID NO：36中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：37中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：38中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：52中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：53中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：54中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：56中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：57中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：58中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：62中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：63中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：64中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：66中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：67中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：68中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：72中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：73中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：74中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：76中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：77中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：78中所示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈，或包含如SEQ ID NO：82中所示之重鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：83中所示之重鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：84中所示之重鏈可變CDR3序列的可變重鏈，及包含如SEQ ID NO：86中所示之輕鏈可變CDR1序列、如SEQ ID NO：87中所示之輕鏈可變CDR2序列及如SEQ ID NO：88中所 示之輕鏈可變CDR3序列的可變輕鏈。
  24. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中該具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體或其抗原結合片段包含：如SEQ ID NO：1中所示的重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：5中所示的輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：11中所示的重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：15中所示的輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：21中所示的重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：25中所示的輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：31中所示的重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：35中所示的輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：51中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：55中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：61中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：65中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：71中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：75中所示之輕鏈可變序列，或如SEQ ID NO：81中所示之重鏈可變序列，以及如SEQ ID NO：85中所示之輕鏈可變序列。
  25. 如前述請求項中任一項之結合物，其中該具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體為IgG抗體。
  26. 如前述請求項中一或多項之結合物，其中該具有中等促效作用或不具有促效作用之抗TWEAKR抗體包含：如SEQ ID NO：9中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：10中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：19中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：20中 所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：29中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：30中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：39中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：40中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：59中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：60中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：69中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：70中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：79中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：80中所示的輕鏈序列，或如SEQ ID NO：89中所示的重鏈序列，以及如SEQ ID NO：90中所示的輕鏈序列。
  27. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至26中一或多項之結合物與醫藥學上適合之惰性無毒性助劑之組合。
  28. 如請求項1至26中一或多項之結合物，其用於治療及/或預防疾病之方法中。
  29. 如請求項1至26中一或多項之結合物，其用於治療過度增殖病症及/或血管生成病症的方法中。
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