CN114917361A - 具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物（adc）和抗体前药缀合物（apdc） - Google Patents

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Abstract

本发明涉及其中抗体与纺锤体驱动蛋白抑制剂的无活性前体化合物缀合的新型抗体前药缀合物(ADC)，和涉及抗体药物缀合物(ADC)，以及涉及用于制备所述APDC或ADC的方法。

Description

具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物(ADC) 和抗体前药缀合 物(APDC)
本申请是申请日为2016年06月20日、申请号为201680048607.4、发明名称为“具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物(ADC)和抗体前药缀合物(APDC)”的中国专利申请(其对应PCT申请的申请日为2016 年06月20日、申请号为PCT/EP2016/064118)的分案申请。
引言和背景技术
本发明涉及其中结合体(binder)与纺锤体驱动蛋白抑制剂的无活性前体化合物缀合的新型结合体-前药缀合物(ADC)，并且涉及结合体-药物缀合物ADC，涉及这些结合体-前药缀合物和结合体-药物缀合物的活性代谢物，涉及用于制备这些APDC和ADC的方法，涉及这些缀合物用于治疗和/或预防疾病的用途，以及涉及这些缀合物用于制备治疗和/或预防疾病(特别是过度增殖性疾病和/或血管生成性疾病如癌症的用途。这样的治疗可以作为单一疗法进行，或者也与其他药物或其他治疗措施组合进行。根据本发明，所述结合体优选地是抗体。
癌症是大多数不同组织不受控制的细胞生长的结果。在许多情况下，新细胞渗入现有组织(侵入性生长)，或者新细胞转移到远端器官。癌症发生在各种各样的器官中，并且经常具有组织特异性过程。因此，术语“癌症”作为上位概念描述了不同器官、组织和细胞类型的大量确定的疾病。
早期的一些肿瘤可以通过外科手术和放射疗法措施去除。一般来说，转移性肿瘤只能通过化学疗法来姑息治疗。这样做的目标是实现改善生活质量和延长寿命的最佳组合。
结合蛋白与一种或多种药物分子的缀合物是已知的，特别是以抗体药物缀合物(ADC)的形式，其中针对肿瘤相关抗原的内化抗体通过接头共价连接至细胞毒性剂。在将ADC引入肿瘤细胞并随后解离缀合物之后，细胞毒性剂本身或由其形成的细胞毒性代谢物在肿瘤细胞内释放，并且可以直接地及选择性地在其中展现其作用。以这种方式，与常规化学疗法相反，对正常组织的损伤被限制在明显更窄的限度内[参见，例如，J.M.Lambert,Curr.Opin.Pharmacol.5,543-549(2005)；A.M.Wu and P.D.Senter,Nat.Biotechnol.23,1137-1146(2005)；P.D.Senter,Curr. Opin.13,235-244(2009)；L.Ducry and B.Stump,Bioconjugate Chem]。因此，WO 2012/171020描述了其中多个毒性基团分子通过聚合的接头连接至抗体的ADC。作为可能的毒性基团，WO 2012/171020尤其提及物质SB 743921、SB715992(伊匹尼塞)、MK-0371、AZD8477、AZ3146 和ARRY-520。
最后提到的物质是纺锤体驱动蛋白抑制剂。纺锤体驱动蛋白(KSP，也称为Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)是一种驱动蛋白样动力蛋白，其对于双极有丝分裂纺锤体发挥功能是必不可少的。对KSP的抑制导致有丝分裂停止，并在相对较长时期内导致细胞凋亡(Taoet al.,Cancer Cell 2005Jul 8(1),39-59)。在发现第一种穿透细胞的KSP抑制剂Monastrol后，KSP抑制剂已经被确认为一类新型化学治疗剂(Mayer et al.,Science 286:971-974,1999)，并且它们是许多专利申请(例如 WO 2006/044825；WO 2006/002236；WO2005/051922；WO 2006/060737； WO 03/060064；WO 03/040979；和WO 03/049527)的主题。然而，由于 KSP仅在有丝分裂期中的相对较短的时期内有活性，所以KSP抑制剂在该阶段中必须以足够高的浓度存在。WO 2014/151030公开了包括某些 KSP抑制剂的ADC。
豆荚蛋白酶(legumain)是与肿瘤相关的天冬酰胺酰内肽酶(S.Ishii, MethodsEnzymol.1994,244,604；J.M.Chen et al.J.Biol.Chem.1997, 272,8090)，并且已被用于处理小细胞毒性分子的前药，例如多柔比星和依托泊苷衍生物等(W.Wu et al.CancerRes.2006,66,970；L.Stern et al.Bioconjugate Chem.2009,20,500；K.M.Bajjuri etal.ChemMedChem 2011,6,54)。
其他溶酶体酶为例如组织蛋白酶或糖苷酶，例如β-葡糖醛酸糖苷酶，其也已经被用于通过酶促裂解前药而释放活性成分。在体内酶促可裂解的基团尤其是2-8-寡肽基团或糖苷类。肽裂解位点公开于 Bioconjugate Chem.2002,13,855-869和Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 8(1998)3341-3346以及Bioconjugate Chem.1998,9,618-626。这些包括例如缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸(任选地具有额外的酰胺基)。
发明内容
为了进一步改善ADC及其代谢物的肿瘤选择性，已经为结合体缀合物提供了可以被肿瘤相关酶(如豆荚蛋白酶或组织蛋白酶)释放的肽衍生物。因此肿瘤选择性不仅由抗体的选择决定，而且还由肽衍生物的酶促裂解(例如通过肿瘤相关酶豆荚蛋白酶)决定。
根据本发明，肽衍生物可以存在于连接结合体与KSP抑制剂的接头中。这些是根据本发明的结合体-药物缀合物(ADC)。
根据本发明使用的纺锤体驱动蛋白抑制剂具有氨基，这对于该作用是必需的。通过用肽衍生物修饰该氨基，对纺锤体驱动蛋白的作用被阻断，因此细胞毒性作用的发生也受到抑制。然而，如果这种肽残基可以被肿瘤相关酶(如豆荚蛋白酶)释放，则该作用可以在肿瘤组织中以受控的方式重建。在这种情况下氨基的修饰不是接头的一部分。因此，本发明涉及具有纺锤体驱动蛋白抑制剂的无活性前体分子的结合体缀合物，所述纺锤体驱动蛋白抑制剂在肿瘤中仅通过肿瘤相关的溶酶体内肽酶豆荚蛋白酶进行处理以得到活性代谢物，因此以便能够在肿瘤中再次以受控的方式显示它们的细胞毒素活性。根据本发明，与KSP抑制剂的结合缀合物(其中它的游离氨基被相应地阻断)也称为APDC。APDC 是特别优选的。
因此，本发明提供了结合体或其衍生物与一种或多种药物分子或其一种或多种前药的具有下式I的缀合物，以及其盐、溶剂合物，所述溶剂合物的盐和差向异构体，
Figure BDA0003554407600000031
其中BINDER代表结合体或其衍生物(优选抗体)，L代表接头， n代表1至50、优选1.2至20、更优选2至8的数字，KSP表示纺锤体驱动蛋白抑制剂或其前药，其中L-KSP具有下式(IIa)：
Figure BDA0003554407600000041
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、 -OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2、
-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、 -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表–L-#1、H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或 -CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，并且Y5代表-H 或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表–L-#1、-H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或
-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，并且Y5代表-H 或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
或R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-或 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-CO-的基团或式 R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C510-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO- 烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、 -COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1而v代表1至 20的数字，并且R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、 -CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸(当存在多于一个的P3时，P3因此可以具有不同的含义)；
或R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、卤素(尤其是F或Cl)、 C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4- 烷基)、-OH，并且其中吡咯烷环中的仲氨基的氢原子可被 R21-CO-P3(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-SIG-替代，其中SIG代表在 CO-SIG键裂解后释放仲胺的自消性基团；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-或-C(＝N-NH2)-；
R3代表–L-#1、-MOD，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，
其可被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(其每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基、1-3 个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-C(＝O)-烷基、1-3个 -O-C(＝O)-NH-烷基、1-3个-NH-C(＝O)-烷基、1-3个 -NH-C(＝O)-NH-烷基、1-3个-S(＝O)n-烷基、1-3个-S(＝O)2-NH- 烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、 -NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，n代表0、1或2，Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘并且Y3代表-H、 -(CH2)0-3-CH(NHC(＝O)CH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或 -(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH，
(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是-F、-Cl、-Br)、-CN、-CF3、 -OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-CO-NY1Y2或 -CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且 Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
代表，
R6和R7彼此独立地代表-H、氰基、(任选地氟代的)C1-10-烷基、 (任选地氟代的)C2-10-烯基、(任选地氟代的)C2-10-炔基、羟基、-NO2、 NH2、-COOH或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表(任选地氟代的)C1-10-烷基、(任选地氟代的)C2-10-烯基、 (任选地氟代的)C2-10-炔基、(任选地氟代的)C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–OH、-CO2H、-NH2或–L-#1取代；
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中取代基R1、R2、R3、R4和R8中的一个代表或(在R8的情况下) 含有–L-#1，
–L代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表H、卤素或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或
Figure BDA0003554407600000071
(其中如果G1代表–NHCO-或
Figure BDA0003554407600000072
则R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；以及
G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、 SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被–NHC(＝O)NH2、-COOH、 -OH、-NH2、-NH-(CH＝N-NH2)、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基) 基团，其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–NHCONH2、 -COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，以及
G3代表-H或-COOH；
其中–MOD基团优选地具有至少一个–COOH基团；
其中满足以下条件(i)至(iii)中的一个或多个：
(i)–L-#1包含式-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-的基团，
其中X代表–NH2或–COOH，优选–NH2；P2为选自以下的氨基酸： Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、 Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
(ii)R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基团或式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、 Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
(iii)R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中吡咯烷环的仲氨基的仲氢原子可被 R21-CO-P3(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-SIG-替代，其中SIG代表在CO-SIG键裂解后释放仲胺的自消性基团。
在本发明的ADC中，–L-#1-包含或为式 -(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-的基团。特别优选的是已被发现在实验部分中所描述的豆荚蛋白酶测定中是可裂解的式 -(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基团。更优选地，R1、 R3或R4取代基中的一个为–L-#1。当R4代表–L-#1时，天冬酰胺或天冬氨酸的羰基直接结合至上式中的与R4结合的氮原子。
在本发明的APDC中，R4为 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-或式R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，或吡咯烷环中的NH 的氢原子被R21-CO-P3(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-SIG-替代。
R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-和 R21-CO-P3-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-SIG-基团在体内可能被豆荚蛋白酶裂解。因此这些基团在下文中也被称为“豆荚蛋白酶可裂解基团”。豆荚蛋白酶可裂解基团具有式 -(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONX)-CO-。在本发明的APDC中，所述基团优选地具有式 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-#，意味着豆荚蛋白酶可裂解基团在一端具有R21基团，而在另一端(-#)其与对应于式IIa中的 R4位的氨基结合。
在这种情况下，NH-CH(CH2COX)-CO-(即天冬酰胺或天冬氨酸) 以天然L构型存在。特别优选的是已被发现在实验部分中所描述的豆荚蛋白酶测定中是可裂解的那些基团。除豆荚蛋白酶-或组织蛋白酶-可裂解的R4基团之外，本发明的APDC可具有含有豆荚蛋白酶-或组织蛋白酶-可裂解基团的接头–L-#1。
豆荚蛋白酶可裂解基团中的-NH-CH(CH2CONH2)-CO-是天冬酰胺；豆荚蛋白酶可裂解基团中的-NH-CH(CH2COOH)-CO-是天冬氨酸。天冬酰胺和天冬氨酸分别以L(-)-天冬酰胺和L-天冬氨酸的形式存在。除了天冬酰胺或天冬氨酸外，豆荚蛋白酶可裂解基团还具有1至3个其他氨基酸(即在天冬酰胺的情况下，为-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-；
-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO；-(P3)(2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-)，并且因此为二肽、三肽或四肽或其衍生物(二肽：
-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-；三肽：-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO；四肽：-(P3)2-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-(其中两个氨基酸P3可以不同)。
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选地选自Ala、Gly、Val、 Leu、Ile、Pro、Ser、Thr、瓜氨酸和Asn。P2通常为天然的L构型。特别优选的是L-Ala。
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、 Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸，或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸。P3优选地选自His、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Gly、Ser、Phe、瓜氨酸和Gln。P3 通常为天然的L构型。特别优选的是L-Ala。当存在多于一个氨基酸P3 时，这些氨基酸在上述定义的范围内可以不同。
更优选地，豆荚蛋白酶可裂解基团为-L-Ala-L-Ala-L-Asn-(即在 APDC的情况下为R21-L-Ala-L-Ala-L-Asn-#)。
R21优选地代表-H、C1-5-烷基-、C5-10-芳烷基-、C1-5-烷氧基-、C6-10- 芳氧基、C5-10-杂烷基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C5-10-杂烷氧基或C5-10-杂环烷氧基，其每一个均可被以下基团取代：--COOH、 COO烷基、COONH2、NH2或N(烷基)2，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且R22为–H、–烷基、 -CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)。在此处“烷基”是指具有至多20个碳原子的烷基基团，优选C1-12-烷基。
组织蛋白酶可裂解基团具有式-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-。在本发明的 APDC中，所述基团具有式R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-#，这意味着组织蛋白酶可裂解基团在一端具有R21基团，而在另一端(-#)其与对应于式 IIa中的R4位的氨基结合。在这种情况下，R21、P2和P3如对于豆荚蛋白酶可裂解基团所定义。式R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2--#的基团是否可以被组织蛋白酶裂解，可以基于实验部分中所描述的组织蛋白酶测定来确定。特别优选的组织蛋白酶可裂解基团为其中P2选自丙氨酸、赖氨酸和瓜氨酸并且P3选自缬氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸的那些基团，尤其是式R21-(CO)(0-1)-P3-P2-的基团。
附图说明
图1：各种物种的TWEAKR富含半胱氨酸的结构域(氨基酸34至68)的比对。(数字示出包含信号序列的全长构建体中的氨基酸位置； SEQ ID NO:169)。
图2：A–TWEAKR(SEQ ID NO:169)的结构的示意图。该图示出包含富含半胱氨酸的结构域(36-67)的胞外结构域(氨基酸28-80)(SEQ ID NO:168)、跨膜结构域-TM(81-101)和胞内结构域(102-129)。 TPP-2202-完整的胞外结构域(28-80)，hIgG1的Fc结构域融合于其上。 TPP-2203-具有N-和C-末端截短的胞外结构域(34-68)，其与hIgG1 的Fc结构域融合。二硫桥Cys36-Cys49、Cys52-Cys67和Cys55-Cys64 用黑条表示。为了确保可观的折叠，与纯的富含半胱氨酸的结构域相比， TPP-2203在N-末端多接受两个氨基酸，而在C-末端多接受一个氨基酸。 TPP-1984-具有C-末端截短的胞外结构域(28-68)，其与HIS6标签融合。所有这三种构建体均显示与本发明的抗体和PDL-192(TPP-1104) 的相当的结合。P4A8(TPP-1324)仅结合全长胞外结构域(TPP-2202)。
B–胞外结构域的氨基酸序列：已经公开了氨基酸64对于TWEAK 配体结合是必需的，并且氨基酸47对于本发明的抗体的结合是必需的，这在本文中已经确定。
图3：非糖基化抗体的转谷氨酰胺酶催化的缀合位点特异性功能化的示意图。
图4：根据Nat.Commun.,2013,4,2735，通过组蛋白脱乙酰酶和组织蛋白酶L的药物释放的连续酶促步骤的图。
具体实施方式
本发明提供了结合体或其衍生物与一种或多种药物分子或其前药的缀合物，所述药物分子是纺锤体驱动蛋白抑制剂(KSP抑制剂)。
接下来描述可根据本发明使用的结合体、可根据本发明使用的KSP 抑制剂或其前药以及可根据本发明使用的接头，其可不受限制地组合使用。更特别地，可以使用在每种情况下描述为优选或特别优选的结合体，其与在每种情况下描述为优选或特别优选的KSP抑制剂或前药组合，任选地与在每种情况下描述为优选或特别优选的接头组合。
KSP抑制剂及其结合体缀合物，
根据本发明，式I中的KSP-L具有下式(IIa)，以及其盐、溶剂合物，所述溶剂合物的盐和差向异构体：
Figure BDA0003554407600000121
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、 -OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、 -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、 -COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或 -(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表–L-#1、-H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或 -CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且 Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或 -COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，并且Y5代表-H 或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表–L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或 -CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，并且Y5代表-H 或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
或R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-或 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-CO-的基团或式 R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C510-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO- 烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、 -COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1而v代表1至 20的数字，并且R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、 -CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
或R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(尤其是F或Cl)、 C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4- 烷基)、-OH，或R21-CO-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-SIG-，其中SIG 代表在CO-SIG键裂解后释放仲胺的自消性基团；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-或-C(＝N-NH2)-；
R3代表–L-#1、-MOD，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，
其可被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(其每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基、1-3 个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、 1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或 -CO-OY3，n代表0、1或2，Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘并且Y3代表-H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、 -(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH
(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、-CF3、 -OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或
-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或-COOH；
代表，
R6和R7彼此独立地代表-H、氰基、(任选地氟代的)C1-10-烷基、 (任选地氟代的)C2-10-烯基、(任选地氟代的)C2-10-炔基、羟基、-NO2、 NH2、-COOH或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表(任选地氟代的)C1-10-烷基、(任选地氟代的)C2-10-烯基、(任选地氟代的)C2-10-炔基、(任选地氟代的)C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–OH、-CO2H、-NH2或–L-#1取代；
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中取代基R1、R2、R3、R4和R8中的一个代表或(在R8的情况下) 含有–L-#1，
–L代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表-H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或
Figure BDA0003554407600000151
(其中如果G1代表
–NHCO-或
Figure BDA0003554407600000152
则R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；以及
G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、 SO2、-NRy-、-NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被NHC(＝O)NH2、-COOH、 -OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、 -C(＝O)-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基) 基团，其中包括任何侧链的烃链可被–NHCONH2、-COOH、 -OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代， G3代表-H或-COOH；
其中–MOD基团优选地具有至少一个–COOH基团；
其中满足以下条件(i)至(iii)中的一个或多个：
(i)–L-#1包含式-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO-的基团，
其中X代表–NH2或–COOH，优选–NH2；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
(ii)R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基团或式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、 Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
(iii)R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中吡咯烷环的仲氨基的仲氢原子可被 R21-CO-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-SIG-替代，其中SIG代表在CO-SIG键裂解后释放仲胺的自消性基团。
定义
术语“取代的”意指在指定原子或指定基团上的一个或多个氢原子已被选自指定基团的基团所替代，条件是在所讨论情况下不超过指定原子的正常化合价。取代基和/或变量的组合是允许的。
术语“任选地取代的”意指取代基的数目可以等于或不等于零。除非另有说明，否则任选地取代的基团可以被所能容纳的多个任选的取代基取代，其是通过在任何可用的碳或氮或硫原子上用非氢取代基替代氢原子来进行。通常，任选的取代基(如果存在的话)的数目可以是1、2、 3、4或5，特别是1、2或3。
如本文所用，表述“单-或多-”，例如在本发明的通式化合物的取代基的定义中，意指“1、2、3、4或5，优选1、2、3或4，更优选1、 2或3，最优选1或2”。
如果本发明的化合物中的基团被取代，则除非另有说明，否则所述基团可以是单取代的或多取代的。在本发明的保护范围内，出现不止一次的所有基团的定义彼此独立。优选用一个、两个或三个相同或不同的取代基的取代。特别优选用一个取代基的取代。
烷基
烷基是具有1至10个碳原子(C1-C10-烷基)，通常1至6个(C1-C6- 烷基)，优选1至4个(C1-C4-烷基)并且更优选1至3个碳原子(C1-C3- 烷基)的直链或支链的饱和一价烃基。
优选的实例包括：
甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、 1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基以及1,2-二甲基丁基。
特别优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基或叔丁基。
杂烷基
杂烷基是具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、 -S(＝O)2-、-NRy-、-NRyC(＝O)-、-C(＝O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2-NRyNRy-、 -C(＝O)-NRyNRy-、-CRx＝N-O-，并且其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在本上下文中，Ry在每种情况下为-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10- 烯基或C2-C10-炔基，其在每种情况下又可被–NH-C(＝O)-NH2、 -C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在本申请的上下文中，Rx为-H、C1-C3-烷基或苯基。
烯基
烯基为具有一个或两个双键和2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子(C2-C10-烯基)，特别是2或3个碳原子(C2-C3-烯基)的直链或支链的一价烃链，其中显而易见的是，当烯基含有多于一个双键时，所述双键可以彼此分离或彼此共轭。烯基为例如乙烯基(ethenyl)(或乙烯基(vinyl))、丙-2-烯-1-基(“烯丙基”)、丙-1-烯-1-基、丁-3- 烯基、丁-2-烯基、丁-1-烯基、戊-4-烯基、戊-3-烯基、戊-2-烯基、戊-1- 烯基、己-5-烯基、己-4-烯基、己-3-烯基、己-2-烯基、己-1-烯基、丙-1- 烯-2-基(或“异丙烯基”)、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2- 甲基丙-1-烯基、1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、 1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯基、1-甲基丁-2-烯基、 3-甲基丁-1-烯基、2-甲基丁-1-烯基、1-甲基丁-1-烯基、1,1-二甲基丙-2- 烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-异丙基乙烯基、4-甲基戊-4- 烯基、3-甲基戊-4-烯基、2-甲基戊-4-烯基、1-甲基戊-4-烯基、4-甲基戊 -3-烯基、3-甲基戊-3-烯基、2-甲基戊-3-烯基、1-甲基戊-3-烯基、4-甲基戊-2-烯基、3-甲基戊-2-烯基、2-甲基戊-2-烯基、1-甲基戊-2-烯基、4- 甲基戊-1-烯基、3-甲基戊-1-烯基、2-甲基戊-1-烯基、1-甲基戊-1-烯基、 3-乙基丁-3-烯基、2-乙基丁-3-烯基、1-乙基丁-3-烯基、3-乙基丁-2-烯基、 2-乙基丁-2-烯基、1-乙基丁-2-烯基、3-乙基丁-1-烯基、2-乙基丁-1-烯基、 1-乙基丁-1-烯基、2-丙基丙-2-烯基、1-丙基丙-2-烯基、2-异丙基丙-2- 烯基、1-异丙基丙-2-烯基、2-丙基丙-1-烯基、1-丙基丙-1-烯基、2-异丙基丙-1-烯基、1-异丙基丙-1-烯基、3,3-二甲基丙-1-烯基、1-(1,1-二甲基乙基)乙烯基、丁-1,3-二烯基、戊-1,4-二烯基或己-1,5-二烯基。更特别地，所述基团为乙烯基或烯丙基。
炔基
炔基为具有一个三键且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子(C2-C10-炔基)，尤其是2或3个碳原子(C2-C3-炔基)的直链或支链的一价烃链。C2-C6-炔基为例如乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己 -5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2- 甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、 4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、 2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、 1-异丙基丙-2-炔基、2,2-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-3-炔基、1,1- 二甲基丁-2-炔基或3,3-二甲基丁-1-炔基。更特别地，所述炔基为乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。
环烷基
环烷基是具有3-12个碳原子的饱和一价单环或双环烃基(C3-C12- 环烷基)。
在本申请的上下文中，单环烃基为通常具有3至10个碳原子 (C3-C10-环烷基)，优选3至8个碳原子(C3-C8-环烷基)并且更优选 3至7个碳原子(C3-C7-环烷基)的一价烃基。
单环烃基的优选实例包括：
环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。
特别优选的是环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
在本申请的上下文中，双环烃基为通常具有3至12个碳原子的烃基(C3-C12-环烷基)，其在本文中应理解为意指一起共享两个直接相邻原子的两个饱和环体系的稠合。双环烃基的优选实例包括：双环[2.2.0] 己基、双环[3.3.0]辛基、双环[4.4.0]癸基、双环[5.4.0]十一烷基、双环[3.2.0] 庚基、双环[4.2.0]辛基、双环[5.2.0]壬基、双环[6.2.0]癸基、双环[4.3.0] 壬基、双环[5.3.0]癸基和双环[6.3.0]十一烷基。
杂环烷基
杂环烷基为具有一个、两个、三个或四个可以相同或不同的杂原子的非芳族单环或双环体系。所述杂原子可以是氮原子、氧原子或硫原子。
本发明的单环体系可具有3至8个，优选4至7个，且更优选5或 6个环原子。
具有3个环原子的杂环烷基的优选实例包括：
氮丙啶基。
具有4个环原子的杂环烷基的优选实例包括：
氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基。
具有5个环原子的杂环烷基的优选实例包括：
吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、二氧戊环基和四氢呋喃基。
具有6个环原子的杂环烷基的优选实例包括：
哌啶基、哌嗪基、吗啉基、二噁烷基、四氢吡喃基和硫代吗啉基。
具有7个环原子的杂环烷基的优选实例包括：
氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、1,3-二氮杂环庚烷基、1,4-二氮杂环庚烷基。
具有8个环原子的杂环烷基的优选实例包括：
氧杂环辛烷基、氮杂环辛烷基。
在单环杂环烷基中，优选的是具有至多两个选自O、N和S的杂原子的4-至7元饱和杂环基。
特别优选的是吗啉基、哌啶基、吡咯烷基和四氢呋喃基。
根据本发明具有一个、两个、三个或四个可以相同或不同的杂原子的双环体系可具有6至12个且优选6至10个环原子，其中一个、两个、三个或四个碳原子可被交换为相同或不同的选自O、N和S的杂原子。
实例包括：氮杂双环[3.3.0]辛基、氮杂双环[4.3.0]壬基、二氮杂双环[4.3.0]壬基、噁嗪双环[4.3.0]壬基、噻唑双环[4.3.0]或氮杂双环[4.4.0] 癸基，以及根据定义源自其他可能的组合的基团。
特别优选的是全氢环戊烷并[c]吡咯基、全氢呋喃并[3,2-c]吡啶基、全氢吡咯并[1,2-a]吡嗪基、全氢吡咯并[3,4-c]吡咯基和3,4-亚甲二氧基苯基。
芳基
芳基是由碳原子组成的一价单环或双环芳族环体系。实例为萘基和苯基；优选的是苯基或苯基基团。
C6-C10-芳烷基
本发明上下文中的C6-10-芳烷基为单环芳族芳基，例如苯基，其上键合有C1-C4-烷基。
举例说明性的C6-10-芳烷基为苄基。
杂芳基
杂芳基为具有5、6、8、9、10、11、12、13或14个环原子(“5- 至14元杂芳基”)，尤其是5、6、9或10个环原子的一价单环、双环或三环芳族环体系，并且含有至少一个环杂原子和任选地一个、两个或三个选自N、O和S的其他环杂原子，并且通过环碳原子或任选(当被化合价允许时)通过环氮原子键合。
杂芳基可为5元杂芳基，例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基或四唑基；或6元杂芳基，例如吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基；或三环杂芳基，例如咔唑基、吖啶基或吩嗪基；或9元杂芳基，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、吲嗪基或嘌呤基；或10元杂芳基，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹喔啉基或蝶啶基。
一般而言，且除非另有说明，否则杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如与该分子的其余部分的连接点相关的互变异构体和位置异构体。因此，作为举例说明性的而非排他性实例，术语吡啶基包括吡啶-2- 基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；或术语噻吩基包括噻吩-2-基和噻吩-3-基。
C5-C10-杂芳基
本发明上下文中的C5-10-杂芳基为具有一个、两个、三个或四个可以相同或不同的杂原子的单环或双环芳族环体系。可以出现的杂原子为：N、O、S、S(＝O)和/或S(＝O)2。键合价可以在任何芳族碳原子上或在氮原子上。
本发明的单环杂芳基具有5或6个环原子。
优选的是具有一个或两个杂原子的杂芳基。本文特别优选的是一个或两个氮原子。
具有5个环原子的杂芳基包括例如以下环：
噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、恶二唑基、三唑基、四唑基和噻二唑基。
具有6个环原子的杂芳基包括例如以下环：
吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基和三嗪基。
根据本发明的双环杂芳基具有9或10个环原子。
具有9个环原子的杂芳基包括例如以下环：
苯酞基(phthalidyl)、硫代苯酞基(thiophthalidyl)、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基、二氢吲哚基。
具有10个环原子的杂芳基包括例如以下环：
异喹啉基、喹啉基、喹嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基、酞嗪基、1,7-和1,8-萘啶基、蝶啶基、苯并二氢吡喃基。
杂烷氧基
杂烷氧基为具有1至10个碳原子且通过-O-与分子的其余部分键合的直链和/或支链烃基链，并且还可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NRy-、-NRyC(＝O)-、 -C(＝O)-NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2-NRyNRy-、-C(＝O)-NRyNRy-、 -CRx＝N-O-，并且其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在本申请的上下文中，Ry在每种情况下为-H、苯基、C1-C10-烷基、 C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其中在每种情况下又可被–NH-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-OH、-OH、-NH2、-NH-C(＝NNH2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在本申请的上下文中，Rx为-H、C1-C3-烷基或苯基。
本发明上下文中的卤素或卤素原子是氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br) 或碘(-I)。
氟代烷基、氟代烯基和氟代炔基意指烷基、烯基和炔基可被氟单取代或多取代。
纺锤体驱动蛋白抑制剂前药优选地具有下式(III)，以及其盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐：
Figure BDA0003554407600000221
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表-H、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、 -SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2、 -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-NH2、-SO3H、 -COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或 -(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表-H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或 -CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且 Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或 -COOH；
其中Y4代表任选地被–NHC(＝O)NH2取代的直链或支链C1-6- 烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，并且Y5代表 -H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-或 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-CO-的基团或式 R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C510-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO- 烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1而v代表1至 20的数字，并且R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、 -CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-或-C(＝NNH2)-；
R3代表-MOD，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，
其可被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(其每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基、1-3 个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或 -CO-OY3，n代表0、1或2，Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘并且Y3代表-H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、 -(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH，
(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、-CF3、 -OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-CO-NY1Y2或 -CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且
Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或 -COOH；
R6和R7彼此独立地代表-H、氰基、(任选地氟代的)C1-10-烷基、 (任选地氟代的)C2-10-烯基、(任选地氟代的)C2-10-炔基、羟基、-NO2、 NH2、-COOH或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表(任选地氟代的)C1-10-烷基、(任选地氟代的)C2-10-烯基、 (任选地氟代的)C2-10-炔基、(任选地氟代的)C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–OH、-CO2H或-NH2取代；
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表-H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-或
Figure BDA0003554407600000251
(其中如果G1 代表–NHCO-或
Figure BDA0003554407600000252
则R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；以及
G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、 SO2、-NRy-、-NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被–NHCONH2、-COOH、-OH、 -NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、 -CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)基团，其中包括任何侧链的烃链可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、 -NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，以及
G3代表H或COOH；
其中–MOD基团优选地具有至少一个–COOH基团。
通过以本领域普通技术人员已知的方式取代在R1、R2、R3、R4、R5或R8处的氢原子或取代在由R2和R4形成的吡咯烷环(R10)处的氢原子，可将式(III)的化合物连接到接头上。这得到式(IIa)的缀合物，其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8或R10中的一个代表–L-#1，L代表接头，而#1代表键合至结合体或其衍生物的键。如果式(IIa)的KSP 抑制剂(或KSP-L)与结合体缀合，则取代基R1、R2、R3、R4、R5、 R8或R10中的一个因此代表–L-#1，其中L代表接头而#1代表键合至结合体或其衍生物的键。换言之，在缀合物的情况下，取代基R1、R2、 R3、R4、R5、R8和R10中的一个代表–L-#1，其中–L-#1连接至结合体，例如抗体。特别优选地，取代基R1、R3或R4中的一个代表–L-#1。所述结合体优选地为人类、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗TWEAKR的抗体或其抗原结合片段，或抗EGFR的抗体或其抗原结合片段或抗HER2的抗体。特别优选的是特异性结合至TWEAKR (SEQ ID NO:169)的第47位中的氨基酸D(D47)的抗TWEAKR的抗体，特别是抗TWEAKR的抗体TPP-2090和TPP-2658，或抗EGFR 的抗体西妥昔单抗(cetuximab)或尼妥珠单抗(nimotuzumab)或HER-2 抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)。
代替–L-#1，在式IIa中，基团–L-#3也可以存在于化合物中，其中 L代表接头，而#3代表结合至结合体或其衍生物的反应性基团。包含–L-#3的化合物是与结合体或其衍生物反应的反应性化合物。#3优选地为与氨基或巯基反应形成共价键的基团，优选与蛋白质中的半胱氨酸残基反应的基团。蛋白质中的半胱氨酸残基可以天然存在于蛋白质中，可以通过生物化学方法引入，或优选地可通过事先还原结合体的二硫键来产生。
当R1不为H时，与R1结合的碳原子是立体中心，其可为L和/或D 构型，优选L构型。
当R2不为H时，与R2结合的碳原子是立体中心，其可为L和/或D 构型。
特别优选的是其中取代基R1、R3和R4中的一个代表–L-#1的式(IIa) 的化合物，并且其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C，
尤其是其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或X1代表CH，X2代表C且 X3代表N的那些化合物。特别优选的是其中X1代表CH，X2代表C且 X3代表N的化合物。
对于A，优选的是CO(羰基)。
对于R1优选的是–L-#1、-MOD、-H、-COOH、-CONHNH2、 -(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1- 3NH2和–CONZ“CH2COOH，其中Z“代表-H或-NH2。如果R4代表–L-#1，则R1优选地为–MOD(尤其是如果 R3不代表–MOD)。
对于R2优选的是-H。
对于R4优选的是-H、–L-#1或式 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的豆荚蛋白酶可裂解基团。如上所述，在这种情况下，–L-#1含有式 -(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COX)-CO*-的基团，其中(L-)天冬酰胺或(L-)天冬氨酸的羰基(由*标识)的羰基直接结合至上式中的与R4结合的氮原子。如果R4代表–L-#1，则R1或R3优选地为-MOD。
对于R3优选的是–L-#1、-MOD或C1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：–OH、-O-烷基、-SH、-S-烷基、-O-CO-烷基、-O-C(＝O)-NH- 烷基、NH-C(＝O)-烷基、NH-C(＝O)-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2，n代表0、1或2(其中烷基优选地为C1-3-烷基)。如果R4代表–L-#1，则R3优选地为–MOD(尤其是如果 R1不代表–MOD)。
对于R5优选的是-H或-F。
对于R6和R7优选的是彼此独立地为-H、(任选地氟代的)C1-3-烷基、(任选地氟代的)C2-4-烯基、(任选地氟代的)C2-4-炔基、羟基或卤素。
对于R8优选的是支链C1-5-烷基，特别是式–C(CH3)2-(CH2)0-2–Ry的基团，其中Ry代表–H、–OH、-CO2H或-NH2。特别优选的是式–C(CH3)2-(CH2)–Ry的基团，其中Ry代表–H。
对于R9优选的是-H或-F。
对于–MOD优选的是HOOC-(CHX)x-AM-CH2-CH2-NH-CO-，其中x 代表2至6的数字，X代表-H、-NH2或-COOH，并且代表AM-CO-NH- 或-NH-CO-(特别优选的是 HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-)。
尤其优选的是其中取代基R1和R3中的一个代表–L-#1的式(IIa) 的化合物，并且
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A代表–C＝(O)-；
R1代表-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和–CONZ“CH2COOH，其中Z“代表-H或NH2；
R2代表-H；
R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的豆荚蛋白酶可裂解基团；
R3代表可被卤素(特别是F)或任选地氟代的C1-3-烷基单取代或多取代的苯基，或代表任选地氟代的C1-10-烷基，其可任选地被以下基团取代：–OY4、-SY4、-O-CO-Y4、-O-CO-NH-Y4、NH-CO-Y4、 -NH-CO-NH-Y4、S(O)n-Y4(其中n代表0、1或2)、-SO2-NH-Y4、NH-Y4或N(Y4)2，其中Y4代表H、苯基(任选地被卤素(特别是F)或任选地氟代的C1-3-烷基单取代或多取代)或烷基(其中烷基可被–OH、-COOH 和/或-NHCO-C1-3-烷基取代并且其中烷基优选地代表C1-3-烷基)，
其中特别优选地，R3可被以下基团取代：–OH、-O-烷基、-SH、-S- 烷基、-O-CO-烷基、-O-CO-NH-烷基、-NH-CO-烷基、-NH-CO-NH-烷基、-S(O)n-烷基、-SO2-NH-烷基、-NH-烷基、-N(烷基)2或-NH2，n代表 0、1或2(其中烷基优选地表示C1-3-烷基)，
R5为-H或–F；
R6和R7彼此独立地代表-H、(任选地氟代的)C1-3-烷基、(任选地氟代的)C2-4-烯基、(任选地氟代的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8为支链C1-5-烷基；以及
R9代表-H或-F。
尤其优选地还为其中取代基R4代表–L-#1的式(IIa)的化合物，并且
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A代表CO(羰基)；
R1代表-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3 NH2、–CONZ“CH2COOH，其中Z“代表-H或-NH2，或 HOOC-(CHX)x-AM-CH2-CH2-NH-CO-，其中x为2至6的数字，X代表 -H、-NH2或-COOH，并且AM代表-CO-NH-或-NH-CO-，(特别优选的是HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-)。
R2代表-H；
R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、 -CH(CH3)OCH3，可被1-3个卤原子、1-3个氨基或1-3个烷基(其可任选地被卤代)取代的苯基，或HOOC-(CHX)x-AM-CH2-CH2-NH-CO-，其中x为2至6的数字，X代表H、NH2或COOH，并且AM代表-CO-NH- 或-NH-CO-(特别优选的是 HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-)或–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，并且Y5代表-H或 -NHY6，其中Y6为-H或-COCH3；
R5为-H或–F；
R6和R7彼此独立地代表-H、(任选地氟代的)C1-3-烷基、(任选地氟代的)C2-4-烯基、(任选地氟代的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8为支链C1-5-烷基；以及
R9代表-H或-F。
此外，优选的是(单独或组合地)
●R1代表–L-#1、-COOH、 HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-或-H，
●R2代表-H，
●R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的豆荚蛋白酶可裂解基团；
●A代表–C＝(O)-；
●R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、 -CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、可被1-3个卤原子、 1-3个氨基或1-3个烷基(其可任选地被卤代)取代的苯基， HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-、–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，并且Y5代表-H或 -NHY6，其中Y6为-H或-COCH3，或代表–L-#1；
●R5代表-H，
●R6和R7彼此独立地代表-H、C1-3-烷基或卤素；特别地，R6和 R7代表-F；
●R8代表C1-4-烷基(优选叔丁基)；和/或
●R9代表-H，
●其中取代基R1和R3中的一个代表–L-#1。
此外，根据本发明还优选
●R1代表–L-#1、-COOH、 HOOC-CH2-CH2-CH(COOH)-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-；HOOC-CH(NH2)-CH2-CH2-CO-NH-CH2-CH2-NH-CO-； HOOC-CH(NH2)-(CH2)4-NH-CO-CH2-CH2-NH-CO-或-H，
●R2代表-H，
●R4代表-H或式 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的豆荚蛋白酶可裂解基团；
●A代表–C＝(O)-，
●R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、 -CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3，可被1-3个卤原子、 1-3个氨基或1-3个烷基(其可任选地被卤代)取代的苯基，或代表–L-#1；
●R5代表-H，
●R6和R7彼此独立地代表-H、C1-3-烷基或卤素；特别地，R6和 R7代表-F；
●R8代表C1-4-烷基(优选叔丁基)；和
●R9代表-H，
●其中取代基R1和R3中的一个代表–L-#1。
另外，根据本发明优选以下ADC或APDC：
式(IIb)：
Figure BDA0003554407600000311
其中X1、X2、X3具有与式(IIa)中相同的含义(其中优选X1代表 CH，X2代表C且X3代表N)，R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8和R9具有与式(IIa)中相同的含义，A代表–C(＝O)-，B代表单键、–O-CH2–或–CH2-O-，以及R20代表NH2、F、CF3或CH3并且n代表0、1或2。
式(IIc)：
Figure BDA0003554407600000321
其中X1、X2、X3具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义(其中优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)，A、R1、R3、R6、R7、R8和 R9具有与式(IIa)中相同的含义，其中A优选地代表–C(＝O)-以及R3代表–CH2OH、-CH2OCH3、-CH(CH3)OH或-CH(CH3)OCH3，并且LEG 代表豆荚蛋白酶可裂解的 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-基团，其中R21、P2和 P3具有与式(IIa)中相同的含义。
式(IId)：
Figure BDA0003554407600000322
其中X1、X2、X3具有与式(IIa)中相同的含义(其中优选X1代表 CH，X2代表C且X3代表N)，A、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(IIa) 中相同的含义，其中A优选地为–C(＝O)-以及R3为–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1并且Y5代表-H或 -NHY6，其中Y6代表-H或-COCH3，并且LEG代表豆荚蛋白酶可裂解的R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-基团，其中R21、P2 和P3具有与式(IIa)中相同的含义。
式(IIe)：
Figure BDA0003554407600000331
其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，A、R3、R6、R7、R8和 R9具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义，并且R1代表-L–#。
此外，优选的是在式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)和(IIe) 的化合物中(单独或组合地)：
●Z代表-Cl或-Br；
●R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表 -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘并且Y1代表-H、-NH2或 -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z’；
●Y1代表-H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z‘并且Z‘代表–COOH；
●Y1代表-H，Y2代表-CH2CH2Z‘并且Z‘代表 -(CONHCHY4)2COOH；
●Y1代表-H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH 并且Y4基团中的一个代表异丙基而另一个代表–(CH2)3-NHCONH2；
●Y1代表-H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH 并且Y4基团中的一个代表–CH3而另一个代表–(CH2)3-NHCONH2；
●Y4代表任选地被–NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基；
●至少一个代表性Y4选自异丙基和–CH3。
●Y1代表-H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-CONHCHY4COOH并且Y4代表任选地被–NH2取代的芳基或苄基；
●Y4代表氨基苄基；
●R2代表–(CH2)0-3Z并且Z代表–SY3；
●R4代表-CO-CHY4-NHY5并且Y5代表H；
●R4代表-CO-CHY4-NHY5并且Y5代表–CO-CHY6-NH2；
●Y4代表任选地被–NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基。
此外，优选的是式(IIa)中的R1、R2或R3代表-MOD，特别是当 R4代表–L-#1时(特别是当–L为直接在–N-R4或–N—L-#1处裂解的可裂解接头，以使得R4或L被H替代时)。
特别优选地，R3代表-MOD并且R1或R4代表–L-#1或–L-BINDER，其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表-H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或
Figure BDA0003554407600000341
(其中如果G1代表
–NHCO-或
Figure BDA0003554407600000342
则R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；以及
G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、 SO2、-NRy-、-NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被–NHCONH2、-COOH、-OH、 -NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-C(＝O)-、 -CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任何侧链的烃链可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、 -NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
G3代表-H或-COOH；以及
其中–MOD基团优选地具有至少一个–COOH基团。
特别优选地，基团–MOD具有(优选末端)-COOH基团，例如在甜菜碱基团中。优选地，基团–MOD具有式–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，并且Y5代表-H或 -NHY6，其中Y6代表-H或-COCH3。
此外，优选的是在式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIIe) 中(单独或组合地)：
●Z代表-Cl或-Br；
●R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表 -(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘并且Y1代表-H、-NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z’；
●Y1代表-H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z‘并且Z‘代表–COOH；
●Y1代表-H，Y2代表-CH2CH2Z‘并且Z‘代表 -(CONHCHY4)2COOH；
●Y1代表-H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH 并且一个代表性Y4代表异丙基而另一个代表–(CH2)3-NHCONH2；
●Y1代表-H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH 并且一个代表性Y4代表–CH3而另一个代表–(CH2)3-NHCONH2；
●Y4代表任选地被–NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基；
●至少一个代表性Y4选自异丙基和–CH3。
●Y1代表-H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-CONHCHY4COOH并且Y4代表任选地被–NH2取代的芳基或苄基；
●Y4代表氨基苄基；
●R2代表–(CH2)0-3Z并且Z代表–SY3；
●R4代表-CO-CHY4-NHY5并且Y5代表H；
●R4代表-CO-CHY4-NHY5并且Y5代表–CO-CHY6-NH2；
●Y4代表任选地被–NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基。
此外还优选的是式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIIe)的化合物，以及其盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐：
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH或CF，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、 -OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、NH2、-SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表-H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表 -H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，并且Y5代表-H或 -CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表-H或豆荚蛋白酶可裂解基团 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-或-C(＝NNH2)-；
R3代表–L-#1、-MOD或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、 C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可任选地被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S- 烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、 1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3 个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、 1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中n代表0、1或2，其中 Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中 Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘并且Y3代表H、 -(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中 Z‘代表H、SO3H、NH2或-COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表-H、-MOD、-NH2、-NO2、卤素(特别是-F、-Cl、-Br)、 -CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、 -OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表 -H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
R6和R7彼此独立地代表-H、氰基、(任选地氟代的)C1-10-烷基、 (任选地氟代的)C2-10-烯基、(任选地氟代的)C2-10-炔基、羟基、-NO2、NH2、-COOH或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表(任选地氟代的)C1-10-烷基、(任选地氟代的)C2-10-烯基、 (任选地氟代的)C2-10-炔基或(任选地氟代的)C4-10-环烷基；
其中取代基R1和R3中的一个代表–L-#1或均不代表–L-#1，
L代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-G3，其中
R10代表-H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或
Figure BDA0003554407600000371
(其中如果G1代表
–NHCO-或
Figure BDA0003554407600000372
则R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；以及
G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、 SO2、-NRy-、-NRyCO-、-CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被–NHCONH2、-COOH、-OH、 -NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、 -CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任何侧链的烃链可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
G3代表-H或-COOH；
其中–MOD基团优选地具有至少一个–COOH基团。
此外还优选的是式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)或(IIIe)的化合物，以及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体，其中：
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH或CF，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、 -OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，并且Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或 -(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表-H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表 -H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，并且Y5代表-H或-CO-CHY6 -NH2，其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表-H或豆荚蛋白酶可裂解基团 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-或-C(＝NNH2)-；
R3代表–L-#1、-MOD或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、 C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可任选地被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个-O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S- 烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、 1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3 个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、 1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中n代表0、1或2，其中Z 代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘并且Y3代表H、 -(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中 Z‘代表H、SO3H、NH2或-COOH(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表-H、-MOD、-NH2、-NO2、卤素(特别是-F、-Cl、-Br)、 -CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，并且Y3代表 -H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
R6和R7彼此独立地代表H或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表(任选地氟代的)C1-10-烷基；
其中取代基R1和R3中的一个代表–L-#1或均不代表–L-#1，
L代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中–MOD代表–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，并且Y5代表-H或-NHY6，其中Y6代表-H或-COCH3。
根据本发明特别优选的是以下式V、VI和VII的化合物，其中R1、 R2、R3、R4和R5具有上述含义(例如对于式(IIa)所述的)：
Figure BDA0003554407600000391
Figure BDA0003554407600000401
特别优选的是式V、VI、VII的化合物，其中R1和R5代表H或–L-#1； R2代表H；R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO- 或式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、 Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、 Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中取代基R1和R3中的一个代表–L-#1。尤其优选的是对应的式 VI的化合物。
本发明的抗体-药物缀合物(ADC)优选地具有以下式VIII：
Figure BDA0003554407600000402
其中
m为0至2的数字；
n为0或1；
X为–CONH2或–COOH；
La代表自消性接头；
Lc代表接头；
A1为衍生自以下氨基酸之一的基团：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、 Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
A2为衍生自以下氨基酸之一的基团：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、 Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸(当存在多于一个的P3时，P3因此可以具有不同的含义)；
D1为III的化合物；
R代表Z1-(CO)q-，其中q为0或1并且Z1代表C1-10-烷基、C5-10- 芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C5-10-杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10- 芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、 C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、 -N(烷基)2、-NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R1基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且R1代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或 -CH2-CH2-NH2)，以及AB代表抗体，并且s为1至20的数字，优选2 至8，更优选3至5，例如4。
本发明的抗体-前药缀合物(APDC)优选地具有以下式IX：
Figure BDA0003554407600000411
其中
m为0至2的数字；
n为0或1；
o为0或1；
X为–CONH2或–COOH；
La代表自消性接头；
Lb代表接头；
A1为衍生自以下氨基酸之一的基团：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、 Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His；
A2为衍生自以下氨基酸之一的基团：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、 Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸(当存在多于一个的P3时，P3因此可以具有不同的含义)；
D1为III的化合物；
R代表Z1-(CO)q-，其中q为0或1并且Z1代表C1-10-烷基、C5-10- 芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C5-10-杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10- 芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、 C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、 -N(烷基)2、-NH-CO-烷基、N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R1基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且R1代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或 -CH2-CH2-NH2)，以及AB代表抗体，并且s为1至20的数字，优选2 至8，更优选3至5，例如4。
接头
文献公开了用于将有机分子共价偶联(缀合)到结合体(例如抗体) 的各种选择(参见例如K.Lang and J.W.Chin.Chem.Rev.2014,114, 4764-4806,M.Rashidian etal.Bioconjugate Chem.2013,24,1277-1294)。根据本发明优选的是KSP抑制剂或前药通过已经作为游离硫醇存在或通过还原二硫桥产生的一个或多个抗体的半胱氨酸残基的硫原子与抗体缀合，和/或通过一个或多个抗体的赖氨酸残基的NH基团与抗体缀合。然而，也可以通过酪氨酸残基、通过谷氨酰胺残基、通过非天然氨基酸残基、通过游离羧基或通过抗体的糖残基将KSP抑制剂或前药与抗体连接。
根据本发明，还可以将药物分子缀合到结合体的特定缀合位点，这提高了产品的均一性。文献描述了各种缀合位点特异性缀合的方法 (Agarwal et al.,Bioconjug.Chem.26,176-192(2015)；Cal et al.,Angew. Chem.Int.Ed.Engl.53,10585-10587(2014)；Behrens et al.,MAbs6, 46-53(2014)；Panowski et al.,MAbs 6,34-45(2014))。这些方法还特别包括使用例如转谷氨酰胺酶(TGase)、糖基转移酶或甲酰甘氨酸生成酶((Sochaj et al.,Biotechnology Advances 33,775-784,(2015))的酶促缀合方法。
根据本发明，可以提供纺锤体驱动蛋白抑制剂的缀合位点特异性结合体缀合物，其中纺锤体驱动蛋白抑制剂缀合至结合体的谷氨酰胺侧链。
当结合体是抗体时，其含有受体谷氨酰胺，优选在恒定区。这样的受体谷氨酰胺可以通过将合适位置突变为谷氨酰胺引入(例如重链的突变N297Q，Kabat EU编号)或通过产生去糖基化或非糖基化抗体引入 (例如通过借助于PNGaseF的酶促去糖基化或通过重链的突变N297X， Kabat EU编号(此处X可以是除N之外的任何氨基酸))。在去糖基化或非糖基化抗体的后一种情况下，重链的谷氨酰胺残基Q295(Kabat EU编号)变成受体谷氨酰胺。特别优选的是含有N297A或N297Q突变(Kabat EU编号)的抗体。因此，本发明中描述的所有抗体同样包括这些抗体的非糖基化变体，其是通过借助于PNGaseF的去糖基化或通过将重链的N297(Kabat EU编号)(抗体的Kabat编号体系，参见Kabat et al.,Sequences of Proteinsof Immulological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))突变为除N以外的任何其他氨基酸来产生。此外，本文所述的所有抗体同样包含所述抗体的变体，其凭借工程改造而含有用于转谷氨酰胺酶催化的反应的一个或多个受体谷氨酰胺残基。
用于这种缀合位点特异性缀合的一种方法是文献中描述的涉及借助转谷氨酰胺酶进行的结合体的缀合位点特异性缀合的方法。还包括细菌转谷氨酰胺酶(BTG)(EC2.3.2.13)的转谷氨酰胺酶(TGase)是催化谷氨酰胺的γ-羰基-酰胺基团与赖氨酸的伯胺基团之间形成共价键的酶家族。由于此类转谷氨酰胺酶也接受除赖氨酸以外的底物作为胺供体，所以其被用于在合适的受体谷氨酰胺处修饰蛋白质(包括抗体) (Jeger et al.,Angewandte Chemie Int.Ed.Engl49,9995-9997(2010)； Josten et al.,J.Immunol.Methods 240,47-54(2000)；Mindt et al., Bioconjugate Chem.19,271-278(2008)；Dennler et al.,in Antibody Drug Conjuagtes(Ducry,L.,Ed.),pp 205-215,Humana Press.(2013))。一方面，转谷氨酰胺酶已经用于将药物缀合至含有人工谷氨酰胺标签的抗体，所述人工谷氨酰胺标记是已通过基因工程引入至抗体中的受体谷氨酰胺残基(Strop et al.,Chem.Biol.20,161-167(2013))。另一方面，已经指出抗体重链恒定区的保守谷氨酰胺残基Q295(Kabat EU编号)是非糖基化IgG1分子的骨架中用于细菌转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13)的唯一γ- 羰基-酰胺供体，因此是受体谷氨酰胺，而当抗体已在重链的N297位 (Kabat EU编号)处被糖基化时，则在IgG1的骨架中不存在受体谷氨酰胺(Jeger etal.,Angewandte Chemie Int.Ed.Engl49,9995-9997 (2010))。总之，细菌转谷氨酰胺酶可以用于在抗体的受体谷氨酰胺残基处缀合胺-供体底物，例如药物-接头构建体。这样的受体谷氨酰胺可以通过以下方式引入：通过突变来工程改造抗体或通过产生非糖基化抗体。可以通过使用N-糖苷酶F(PNGase F)的去糖基化或通过将重链的糖基化位点的N297(KabatEU编号)突变为除N以外的任何其他氨基酸来引入这样的非糖基化抗体。对于含有突变N297D、N297Q(Jeger et al.,Angewandte Chemie Int.Ed.Engl49,9995-9997(2010))或N297S(参见专利申请WO 2013092998A1 and WO 2013092983A2)的非糖基化抗体变体，已经记载了使用细菌转谷氨酰胺酶进行的这种非糖基化抗体的酶促缀合。通过转谷氨酰胺酶进行的这种非糖基化抗体的酶缀促合通常提供DAR为2的ADC，其中两条重链在位置Q295(Kabat EU编号)处均被特异性地功能化。只有重链的N297Q突变为每个重链提供额外的缀合位点。这种变体的缀合产生ADC为4的DAR，其中两条重链在位置Q295和Q297处均被特异性功能化。
其中重链携带突变Q295N和N297Q的抗体变体在每个重链的位置 Q297(Kabat编号)仅具有一个受体谷氨酰胺残基(Simone Jeger,Site specific conjugation oftumour targeting antibodies using transglutaminase, Thesis at ETH Zurich(2009))。在文献中有几个实例描述了使用细菌转谷氨酰胺酶进行的非糖基化抗体的缀合位点特异性缀合(例如Dennler et al.,Bioconjugate Chemistry 19,569-578(2014)；Lhospice et al., Molecular Pharmaceutics 12,1863-1871(2015))。图3总结了非糖基化抗体的转谷氨酰胺酶催化的缀合位点特异性功能化的策略。
偶联——以缀合位点特异性和以缀合位点非特异性方式——都是使用所谓的接头完成的。可以将接头分为可在体内裂解的接头组和在体内稳定的接头组(参见L.Ducryand B.Stump,Bioconjugate Chem.21, 5-13(2010))。可在体内裂解的接头具有可在体内裂解的基团，其中又可区分可在体内化学裂解的基团和可在体内酶促裂解的基团。“可在体内化学裂解”和“可在体内酶促裂解”意指接头或基团在循环中稳定并且仅在靶细胞处或靶细胞内被其中不同的化学或酶促环境(较低的pH；升高的谷胱甘肽浓度；存在溶酶体酶如豆荚蛋白酶、组织蛋白酶或纤溶酶，或糖苷酶如例如β-葡糖醛酸糖苷酶)裂解，从而释放低分子量KSP 抑制剂或其衍生物。可在体内化学裂解的基团特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；可在体内酶促裂解的基团特别是2-8-寡肽基团，特别是二肽基团或糖苷。肽裂解位点公开于Bioconjugate Chem.2002,13,855-869 和Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters 8(1998)3341-3346，以及 Bioconjugate Chem.1998,9,618-626。这些包括例如丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺、缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸以及苯丙氨酸-赖氨酸(任选地具有额外的酰胺基团)。
为了确保游离药物的有效释放，任选地也可以在酶促裂解位点与药物之间掺入所谓的自消性接头元件(例如在上式IIa中的SIG或在上式VIII和IX中的La)(AnticancerAgents in Medicinal Chemistry,2008,8, 618-637)。药物可以通过各种机制释放，例如在初始酶促释放亲核基团之后，随后通过经由电子级联进行消除(Bioorg.Med.Chem.,1999,7, 1597；J.Med.Chem.,2002,45,937；Bioorg.Med.Chem.,2002,10,71) 或通过环化相应的接头元件(Bioorg.Med.Chem.,2003,11,2277；Bioorg. Med.Chem.,2007,15,4973；Bioorg.Med.Chem.Lett.,2007,17,2241)或通过两者的组合(Angew.Chem.Inter.Ed.,2005,44,4378)。图中示出了这样的接头元件的实例：
Figure BDA0003554407600000461
用于药物释放的连续酶促步骤的实例，例如借助组蛋白脱乙酰酶和组织蛋白酶L，记载于Nat.Commun.,2013,4,2735(参见图4)。
在体内稳定的接头的特征为高稳定性(在血浆中24小时后少于5％的代谢物)，并且不具有上述可在体内化学或酶促裂解的基团。
接头-L-(如式VIII中的Lc和式IX中的Lb)优选地具有以下基础结构(i)至(iv)中的一种：
(i)–(C＝O)m–SG1-L1-L2-
(ii)–(C＝O)m–L1-SG-L1-L2-
(iii)–(C＝O)m–L1-L2-
(iv)–(C＝O)m–L1-SG-L2
其中m为0或1；SG是一种可在体内(化学或酶促)裂解的基团 (特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；或可被豆荚蛋白酶、组织蛋白酶或纤溶酶裂解的2-8-寡肽基团)，SG1是寡肽基团或优选地为二肽基团，L1代表在体内稳定的有机基团，而L2代表与结合体的偶联基团或单键。此处，偶联优选地为连接至抗体的半胱氨酸残基或赖氨酸残基。或者，偶联可以连接至抗体的酪氨酸残基、谷氨酰胺残基或非天然氨基酸。非天然氨基酸可以含有例如醛或酮基(例如甲酰甘氨酸)或叠氮基或炔基(参见Lan&Chin,Cellular Incorporation ofUnnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins,Chem.Rev.2014,114, 4764-4806)。
根据本发明特别优选的是基础接头结构(iii)。通过代谢，具有基础接头结构(iii)的本发明缀合物的给药以及接头与抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基的偶联得到下式的半胱氨酸或赖氨酸衍生物：
Figure BDA0003554407600000471
其中L1在每种情况下均连接至低分子量KSP抑制剂，例如式(III) 或(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)或(IV)的化合物，其中–L-#1代表分别衍生自赖氨酸和半胱氨酸的上述两个基团之一。
根据本发明还优选的是基础接头结构(ii)和(iv)，特别是当在位置R1处连接时，特别是当基团L1具有以下结构之一时：
(a)–NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-Y7，其中Y5代表-H或 -NHY6，其中Y6代表-H或-COCH3，并且Y7代表单键或–NH-(CH2)0-4–CHNH2-CO-，以使得在裂解后获得对应的结构–NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-COOH或–NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-NH-(CH2)0-4-CHNH2-COOH。
(b)–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-CO-，其中x为0或1，并且Y5代表-H 或-NHY6，其中Y6代表-H或-COCH3，以使得在裂解后获得对应的结构–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH。
当连接至位置R4时，特别是如果m＝0时，根据本发明还优选的是基础接头结构(i)。
如果接头连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上，则L2优选地衍生自与半胱氨酸的巯基反应的基团。这些包括卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化化合物、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB 硫醇和二硫化物还原剂。这些基团通常以亲电子方式与巯基键反应，形成硫化物(例如硫醚)或二硫桥。优选的是稳定的硫桥。L2优选地为
Figure BDA0003554407600000472
Figure BDA0003554407600000481
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，并且
R22代表-COOH、-COOR、-COR、-CONHR、-CONR2(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、-CONH2，优选-COOH。
对于L2特别优选的是：
Figure BDA0003554407600000482
或
Figure BDA0003554407600000483
其中#1表示与抗体的硫原子的连接点，#2表示与药物的连接点，x 代表1或2，并且R22代表-COOH、-COOR、-COR、-CONR2、-CONHR (其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、-CONH2，优选-COOH。优选 x＝1并且R22代表-COOH。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选大于90％ (在每种情况下均基于接头与抗体连接的键的总数计)，特别优选作为式A3或A4的两种结构之一。在本文中，式A3或A4的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比例，基于连接至抗体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在
Figure BDA0003554407600000491
根据本发明，L1优选由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或
Figure BDA0003554407600000492
(其中如果G1代表–NHCO- 或
Figure BDA0003554407600000493
则R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；以及
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、 CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被 NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基) 和/或具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2-(优选
Figure BDA0003554407600000494
)，其中包括任何侧链的烃链可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和 /或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、 -NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-以及具有至多4个选自N、 O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-SO-(优选
Figure BDA0003554407600000501
)，其中侧链(如果存在的话)可被–NHCONH2、-COOH、 -OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2优选地代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/ 或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、 -CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)以及具有至多4个选自N、O和S 的杂原子的3-至10-元(例如5-至10-元)芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2- (优选
Figure BDA0003554407600000502
)，其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中的其他间断基团优选地为
Figure BDA0003554407600000503
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
在本文中，#1是与KSP抑制剂或前药连接的键，而#2是与抗体的偶联基团(例如L2)连接的键。
亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链通常包括具有所述的各个数目的碳原子的α,ω-二价烷基。优选的实例包括：亚甲基、乙烷-1,2-二基(1,2-亚乙基)、丙烷-1,3-二基(1,3-亚丙基)、丁烷-1,4-二基(1,4-亚丁基)、戊烷-1,5-二基(1,5-亚戊基)、己烷-1,6- 二基(1,6-亚己基)、庚烷-1,7-二基(1,7-亚庚基)、辛烷-1,8-二基(1,8- 亚辛基)、壬烷-1,9-二基(1,9-亚壬基)、癸烷-1,10-二基(1,10-亚癸基)。然而，烃链中的亚烷基还可为支链的，即上述直链亚烷基的一个或多个氢原子可任选地被C1-10-烷基取代，从而形成侧链。此外，烃链还可含有环状亚烷基(环烷二基)，例如1,4-环己烷二基或1,3-环戊烷二基。这些环状基团可以是未饱和的。特别地，在烃基中可以存在芳族基团(亚芳基)，例如亚苯基。而且，也在环状亚烷基和亚芳基中，一个或多个氢原子还可任选地被C1-10-烷基取代。以此方式，形成任选地支化的烃链。该烃链具有总共0至100个碳原子，优选1至50个，特别优选2 至25个碳原子。
侧链(如果存在的话)可以相同或不同地被-NHCONH2、-COOH、 -OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸单取代或多取代。
烃链可被一个或多个以下基团相同或不同地间断一次或多于一次： -O-、-S-、-SO-、-SO2-、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、 -SO2NHNH-、-CONHNH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的 5-至10元芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2-(优选
Figure BDA0003554407600000511
)。
G2中的其他间断基团优选地为
Figure BDA0003554407600000521
优选地，接头对应于下式：
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m为0或1；
§代表与药物分子或前药连接的键以及
§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，并且
L1和L2具有以上给出的含义。
特别优选地，L1具有式–NR11B-，其中
R11代表-H或-NH2；
B代表–[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w＝0至20；
x＝0至5；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝0至5；并且
X4代表–O-、-CONH-、–NHCO-或
Figure BDA0003554407600000531
根据本发明优选的接头L具有下式：
Figure BDA0003554407600000532
其中
#3代表与药物分子或前药连接的键，
#4代表与结合肽或蛋白质连接的键，
R11代表-H或-NH2；
B代表–[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝1至5；并且
X4代表–O-、-CONH-、–NHCO-或
Figure BDA0003554407600000533
进一步优选的是其中接头L1是以下基团之一的接头：
§-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)6-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-§§
§-NH-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-O-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(CH3)-§§；
§-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-(CH2)4-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)3-(CH2)2-§§；
§-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)3-NH-C(＝O)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2COOH)-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH(C2H4COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH(CH2OH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-O)4-(CH2)2COOH]-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(isoC3H7)-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(isoC3H7)-NH- C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)- CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)- CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)- CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)- CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-CH(CH3)-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)- CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-NH-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)4-CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)3-NH-C(＝O)-NH2]-NH-C(＝O)-CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
Figure BDA0003554407600000551
Figure BDA0003554407600000552
Figure BDA0003554407600000553
Figure BDA0003554407600000554
Figure BDA0003554407600000555
Figure BDA0003554407600000556
Figure BDA0003554407600000557
Figure BDA0003554407600000561
Figure BDA0003554407600000562
Figure BDA0003554407600000563
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(isoC3H7)-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(isoC3H7)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
Figure BDA0003554407600000564
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)5-C(＝O)-NH-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(NH2)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)5-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-(CH2)2-CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-(CH2)2- §§；
§-CH2-S-(CH2)2-C(＝O)-NH-CH(C2H4COOH)-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2- §§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2- §§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-CH3]-C(＝O)-NH-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH(CH3)-NH-C(＝O)-CH(isoC3H7)-NH- C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-(CH2)2-S(＝O)2-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[NH-C(＝O)-(CH2)2-COOH]-C(＝O)-NH-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH- C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH- C(＝O)-CH2-§§；
§-CH2-S-CH2CH[C(＝O)-NH-(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH- C(＝O)-(CH2)2-§§；
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-(CH2)2CH(COOH)-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝O)-CH2-§§
或
§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(＝O)-CH[(CH2)2-COOH]-NH-C(＝O)-((CH2)2-O)4-(CH2)2-NH-C(＝0)-(CH2)2-§§，
其中
§ 代表连接至活性成分分子的键
§§ 代表连接至抗体的键并且
isoC3H7 代表异丙基。
在其中接头是通过R1处的氢原子的取代偶联或在R4处与可裂解的接头SG1组合偶联的式(IIa)的缀合物中，尤其优选上述接头，即R1 代表-L-#1或R4代表-SG1-L-#1，其中#1代表与抗体连接的键。
此外根据本发明还优选的是以下接头：在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选地大于90％(在每种情况下均基于接头与抗体连接的键的总数计)，特别优选地作为式A5或A6的两个结构之一：
Figure BDA0003554407600000581
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，并且
R22代表-COOH、-COOR、-COR、-CONR2、-CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、-CONH2，优选-COOH。
在本文中，式A5或A6的结构通常一起存在，优选地以60:40至 40:60的比例，基于连接至抗体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在
Figure BDA0003554407600000582
其他连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基的接头-L-具有下式：
Figure BDA0003554407600000583
其中
§代表与药物分子或前药连接的键以及
§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，
m代表0、1、2或3；
n代表0、1或2；
p代表0至20；并且
L3代表
Figure BDA0003554407600000591
其中
o为0或1；
并且
G3代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、 -NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-以及具有至多4个选自N、O和S 的杂原子的3-至10元(优选5-至10元)芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2- (优选
Figure BDA0003554407600000592
)，其中侧链(如果存在的话)可被–NHCONH2、 -COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在上式中，优选地
m为1；
p为0；
n为0；
并且L3代表
Figure BDA0003554407600000593
其中
o为0或1；并且
G3代表-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)uCH2CH2O)v(CH2)w-，其中
s、t、v和w每一个均彼此独立地为0至20而u为0或1。
上述式§-(CO)m-L1-L2-§§中的优选基团L1如下所示，其中r代表0 至20的数字，优选0至15，特别优选1至20，尤其优选2至10：
Figure BDA0003554407600000601
Figure BDA0003554407600000611
Figure BDA0003554407600000621
Figure BDA0003554407600000631
Figure BDA0003554407600000641
Figure BDA0003554407600000651
Figure BDA0003554407600000661
Figure BDA0003554407600000671
Figure BDA0003554407600000681
Figure BDA0003554407600000691
Figure BDA0003554407600000701
Figure BDA0003554407600000711
Figure BDA0003554407600000721
表C中给出了L1的其他实例，其中该基团在框中突出显示。
下表A和A'中给出了接头部分L1的实例。此外该表还说明了这些 L1的实例优选地与哪个基团L2组合，还有优选的偶联点(R1或R3或 R4)和m的优选值，这是L1前面是否存在羰基(参见§-(CO)m-L1-L2-§§)。这些接头优选地与半胱氨酸残基偶联。如果L2是琥珀酰亚胺或由其衍生，则该酰亚胺也可以完全或部分地为水解的开链琥珀酰胺的形式，如上所述。根据L1，这种向开链琥珀酰胺的水解可能或多或少是显著的或根本不存在。
表A
Figure BDA0003554407600000722
Figure BDA0003554407600000731
Figure BDA0003554407600000741
Figure BDA0003554407600000751
Figure BDA0003554407600000761
Figure BDA0003554407600000771
**特别优选的，在这些行中给出的接头L1连接到选自以下的接头 L2上：
Figure BDA0003554407600000772
和/或
Figure BDA0003554407600000773
其中#1表示与结合体的硫原子的连接点，#2表示与基团L1的连接点，R22优选地代表-COOH。在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与结合体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选地大于90％(在每种情况下均基于接头与结合体连接的键的总数计)，特别优选作为式A7或A8的两种结构之一。此处，式A7或A8的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比例，基于连接至结合体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在
Figure BDA0003554407600000774
表A‘
Figure BDA0003554407600000781
Figure BDA0003554407600000791
Figure BDA0003554407600000801
Figure BDA0003554407600000811
Figure BDA0003554407600000821
Figure BDA0003554407600000831
Figure BDA0003554407600000841
Figure BDA0003554407600000851
Figure BDA0003554407600000861
Figure BDA0003554407600000871
Figure BDA0003554407600000881
Figure BDA0003554407600000891
Figure BDA0003554407600000901
Figure BDA0003554407600000911
Figure BDA0003554407600000921
Figure BDA0003554407600000931
Figure BDA0003554407600000941
Figure BDA0003554407600000951
Figure BDA0003554407600000961
Figure BDA0003554407600000971
Figure BDA0003554407600000981
Figure BDA0003554407600000991
Figure BDA0003554407600001001
**:参见表A的注**。
***:当存在该结构L2时，可同时存在下式的结构L2：
Figure BDA0003554407600001002
具有相应接头的缀合物的实例具有以下结构，其中X1代表CH， X2代表C且X3代表N，并且L1具有以上给出的含义，L2和L3具有与L1相同的含义，AK 1代表通过半胱氨酸残基连接的抗体并且n为1 至10的数字。更优选地，AK 1优选地是人类、人源化或嵌合单克隆抗体。特别优选的是与TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位中的氨基酸D(D47)特异性结合的非糖基化的抗TWEAKR的抗体，特别是抗 TWEAKR的抗体TPP-2658。
Figure BDA0003554407600001011
当接头连接到赖氨酸侧链或赖氨酸残基时，可以使用与上述接头相同的接头来偶联至半胱氨酸侧链，除了L2优选地为羰基(例如通过相应的活化羧酸进行偶联)。
具有基础结构(i)的缀合物的实例具有以下结构之一，其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，L4具有与L1相同的含义，AK1为通过半胱氨酸残基连接的非糖基化的抗TWEAKR的抗体，并且n为1至 10的数字，并且式IIa的位置R4中(即在-NH2基团中)的氢原子被式 R21-CO-P3-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的豆荚蛋白酶可裂解基团替代：
Figure BDA0003554407600001021
其中R21代表C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或 C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被-NH2、-SO3H、-COOH、-SH或–OH单取代或多取代： P2为单键或选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、 Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg和 His；
P3为单键或选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg 和His。
特别优选的是与TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位中的氨基酸D(D47)特异性结合的抗TWEAKR的抗体，特别是非糖基化的抗 TWEAKR的抗体TPP-2658。
在转谷氨酰胺酶催化的缀合的情况下，文献公开了以缀合位点特异性方式将有机分子共价偶联(缀合)至结合体(例如抗体)的各种选择(参见例如Sochaj et al.,Biotechnology Advances,33,775-784,(2015), Panowski et al.,MAbs 6,34-45(2014))。根据本发明优选的是使用转谷氨酰胺酶通过抗体的受体谷氨酰胺残基将KSP抑制剂或前药缀合至所述抗体。这种受体谷氨酰胺残基可以通过抗体的工程改造或通过产生非糖基化的抗体的突变来生成。抗体中的这些受体谷氨酰胺的数目优选地为2或4。使用合适的接头用于偶联(缀合)。合适的接头结构是具有游离胺供体官能度的那些接头，所述游离胺供体官能度构成转谷氨酰胺酶的合适底物。所述接头能够以多种方式连接到所述抗体。
优选地，在转谷氨酰胺酶催化的缀合的情况下，接头具有上述基础结构(i)至(iv)中的一种，其中L1、SG、SG1和m具有以上给出的含义，但L2优选地为以下基团中的一种：
Figure BDA0003554407600001031
其中Ry为-H、NHCO烷基、-NH2
或
Figure BDA0003554407600001032
其中Ry为-CONH烷基、-CONH2，
其中
#1代表与L1的连接点
#2代表与结合体的谷氨酰胺残基的连接点。
优选地，Ry为H或-NHCOMe。
相应的缀合物的实例具有以下结构，其中X1、X2、X3、Ry和L1 具有与上述相同的含义，AK代表结合体，优选抗体，其中n优选地为 2或4：
Figure BDA0003554407600001041
特别优选的KSP抑制剂缀合物
根据本发明特别优选的是如下的KSP抑制剂缀合物，其中AK (AK1；AK2；AK3)代表结合体或其衍生物(优选抗体)，并且n为1 至50的数字，优选1.2至20且更优选地为2至8。AK1优选地为通过半胱氨酸残基键合至KSP抑制剂的抗体；AK2；优选地为通过赖氨酸残基键合至KSP抑制剂的抗体；AK3优选地为通过谷氨酰胺残基键合至 KSP抑制剂的抗体。本文所使用的结合体或抗体优选地为说明书中优选描述的结合体和抗体。
Figure BDA0003554407600001051
Figure BDA0003554407600001061
Figure BDA0003554407600001071
Figure BDA0003554407600001081
Figure BDA0003554407600001091
Figure BDA0003554407600001101
Figure BDA0003554407600001111
Figure BDA0003554407600001121
Figure BDA0003554407600001131
Figure BDA0003554407600001141
Figure BDA0003554407600001151
Figure BDA0003554407600001161
Figure BDA0003554407600001171
Figure BDA0003554407600001181
Figure BDA0003554407600001191
Figure BDA0003554407600001201
Figure BDA0003554407600001211
Figure BDA0003554407600001221
Figure BDA0003554407600001231
Figure BDA0003554407600001241
Figure BDA0003554407600001251
Figure BDA0003554407600001261
Figure BDA0003554407600001271
KSP抑制剂-接头中间体或前体-接头中间体以及缀合物的制备
本发明的缀合物是通过首先提供低分子量的KSP抑制剂或其前药与接头来制备。然后将以此方式获得的中间体与结合体(优选抗体)反应。
优选地，为了与半胱氨酸残基偶联，将以下化合物中的一种与含半胱氨酸的结合体(如抗体)反应，所述抗体任选地为此目的而被部分还原：
Figure BDA0003554407600001272
Figure BDA0003554407600001281
Figure BDA0003554407600001291
Figure BDA0003554407600001301
Figure BDA0003554407600001311
其中R代表-H或–COOH，
其中K代表任选地被C1-C6-烷氧基或–OH取代的直链或支链C1-C6烷基，并且
其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，SG1、L1、L2、L3和 L4具有与上述相同的含义。
在上述式中，同样也在下面的反应方案和结构式中，式IIa的位置 R4中(即在-NH2基团中)的氢原子可以被式 R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基团或式R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团替代
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、 Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中R21代表C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或 C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被-NH2、-SO3H、-COOH、-SH或–OH单取代或多取代。
在每一个上述化合物以及下述化合物中，叔丁基可以被环己基替代。
该化合物可以例如以其三氟乙酸盐的形式使用。对于与结合体(例如抗体)的反应，所述化合物优选地以相对于所述结合体来说2至12 倍摩尔过量来使用。
优选地，为了与赖氨酸残基偶联，使以下化合物中的一种与含赖氨酸的结合体(例如抗体)反应：
Figure BDA0003554407600001321
其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，并且L4与L1具有相同的含义，而L1具有与上述相同的含义。
对于与半胱氨酸残基的中间体偶联，所述反应可以如下所示：
Figure BDA0003554407600001331
其他中间体和其他抗体可以相应地反应。
对于与赖氨酸残基的中间体偶联，所述反应可以如下所示：
Figure BDA0003554407600001341
根据所述接头，在缀合后，琥珀酰亚胺连接的ADC可以转化为开链琥珀酰胺，其具有有利的稳定性特征。
Figure BDA0003554407600001351
该反应(开环)可以在pH 7.5至9(优选在pH 8)，在25℃至37 ℃的温度下进行，例如通过搅拌。优选的搅拌时间是8至30小时。
在上式中，X1代表CH、X2代表C且X3代表N，SG1和L1具有与上述相同的含义，L2、L3和L4具有与L1相同的含义；R和K具有与上述相同的含义。AK1是通过半胱氨酸残基偶联的非糖基化抗 TWEAKR的抗体，AK2是通过赖氨酸残基偶联的非糖基化抗TWEAKR 的抗体。更优选地，AK1和AK2是与TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位中的氨基酸D(D47)特异性结合的非糖基化抗TWEAKR的抗体，特别是非糖基化抗TWEAKR的抗体TPP-2658。
其他定义
表述“转谷氨酰胺酶”，也可互换地用作“TGase”或“TG”，其应被理解为是指具有通过酰基转移反应连接蛋白质的能力的酶，所述酰基转移反应是在肽结合的谷氨酰胺的γ-羧酰胺基与赖氨酸的ε-氨基或结构上相关的伯胺(例如氨基戊基)或例如肽结合的赖氨酸的ε-氨基之间的进行，其生成8-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽键。TGase包括细菌转谷氨酰胺酶 (BTG)，例如具有EC参考号2.3.2.13的酶(蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶)。
当涉及抗体的氨基酸残基时，表述“受体谷氨酰胺”是指这样的谷氨酰胺残基，即其在合适的条件下被转谷氨酰胺酶识别，并且可以在转谷氨酰胺酶催化下通过该特定谷氨酰胺和赖氨酸或结构上相关的伯胺(例如氨基戊基)之间的反应与其相连。受体谷氨酰胺可以是表面暴露的谷氨酰胺。
本文的“氨基酸修饰”或“突变”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文优选的氨基酸修饰是取代。本文的“氨基酸取代”或“取代”是指在蛋白序列的给定位置处的氨基酸被替代为另一个氨基酸。例如，取代Y50W描述了其中第50位的酪氨酸已被替代为色氨酸的亲本多肽的变体。多肽的“变体”描述了具有与参考多肽(通常是天然多肽或“亲本”多肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体可以在天然氨基酸序列中的特定位置处具有一个或多个氨基酸替代、缺失和/或插入。
表述“缀合位点特异性缀合物”描述了结合体(优选抗体)和残基(优选接头-药物残基)的缀合物，其中所述结合体在一个或多个限定位置(优选谷氨酰胺残基)处被官能化。转谷氨酰胺酶(TGase)(包括细菌转谷氨酰胺酶(BTG)(EC 2.3.2.13))在识别谷氨酰胺-蛋白质底物方面表现出强的特异性，并且可以催化“缀合位点特异性缀合”。
表述“均一缀合物”或“均一ADC”描述了缀合位点特异性缀合物的混合物，其中至少60％、70％、80％或90％的结合体的每个结合体具有相同数量的缀合残基。在抗体的情况下，该数目应该是偶数，优选2或 4。
结合体(binder)
从广义上讲，术语“结合体”被理解为是指结合至存在于待由结合体 -药物缀合物解决的某个靶细胞群处的靶分子的分子。术语结合体应理解为以其最广泛的含义，并且还包括例如凝集素、能够结合某些糖链的蛋白质和磷脂结合蛋白。这样的结合体包括例如高分子量蛋白(结合蛋白)、多肽或肽(结合肽)、非肽(例如由Keefe AD.,et al.,Nat.Rev.Drug Discov.2010；9:537-550综述的适体(US5,270,163)或维生素)以及所有其他细胞结合分子或物质。例如，结合蛋白是抗体和抗体片段或抗体模拟物，例如亲和体(affibody)、阿德奈汀(adnectin)、抗运载蛋白 (anticalin)、DARPins、高亲合性多聚体(avimer)、纳米抗体(nanobody) (由Gebauer M.et al.,Curr.Opinion inChem.Biol.2009；13:245-255； Nuttall S.D.et al.,Curr.Opinion in Pharmacology2008；8:608-617综述)。结合肽是例如配体的配体/受体对，例如配体的VEGF/受体对 VEGF/KDR，如配体的转铁蛋白/受体对转铁蛋白/转铁蛋白受体或细胞因子/细胞因子受体，如配体的TNFα/受体对TNFα/TNFα受体。
“结合体”可以含有受体谷氨酰胺残基，其可以通过转谷氨酰胺酶 (TGase)(包括细菌转谷氨酰胺酶(BTG)(EC2.3.2 0.13))官能化。该受体谷氨酰胺可以以天然形式存在于结合体中，或者以特别方式产生。受体谷氨酰胺可以通过在合适的位置插入谷氨酰胺残基(例如通过含有受体谷氨酰胺的融合标签，或通过适当位置的突变产生谷氨酰胺残基)产生，或受体谷氨酰胺是由任何氨基酸的突变产生的，所述突变导致事先未被转谷氨酰胺酶识别的特定谷氨酰胺残基转化为受体谷氨酰胺，或者受体谷氨酰胺是通过翻译后修饰中的修饰(例如糖基化)产生的，这种改变具有使事先未被转谷氨酰胺酶识别的天然存在的谷氨酰胺成为受体谷氨酰胺的作用。当结合体是抗体时，它含有受体谷氨酰胺，优选地在恒定区。这样的受体谷氨酰胺可以通过将合适的位置突变为谷氨酰胺(例如突变N297Q KabatEU编号)产生或通过产生去糖基化或非糖基化的抗体(例如通过借助PNGase F的去糖基化或通过突变 N297X，Kabat EU编号)产生。在去糖基化或非糖基化抗体的后一种情况中，重链的谷氨酰胺残基Q295(Kabat EU编号)变成受体谷氨酰胺。特别优选含有N297A或N297Q突变(Kabat EU编号)的抗体。
术语“非糖基化抗体”或“去糖基化抗体”在本文中用于定义含有FC 区的抗体或抗体衍生物，所述FC区缺少连接至CH2结构域中的保守性 L-糖基化位点的聚糖。例如，非糖基化抗体可以通过重链的糖基化位点 N297(Kabat Eu编号)的突变或通过在缺少糖基化能力的表达系统中表达抗体来产生。抗体去糖基化的方法是公知常识(例如Winkelhake&Nicolson(1976),J Biol Chem.251(4):1074-80))。去糖基化抗体可以例如通过借助PNGase F进行的酶促去糖基化来产生。在本发明的一个实施方案中，可以通过在原核宿主中表达来获得去糖基化抗体。合适的原核宿主包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus genera)的一些种。在本发明的另一个实施方案中，去糖基化抗体可以通过使用哺乳动物细胞表达系统以及糖基化抑制剂衣霉素来获得(Nose &Wigzell(1983),Proc Natl Acad Sci USA,80(21):6632-6)。此时，所述修饰是防止抗体的Fc部分的CH2结构域中的重链的保守性N-糖基化位点N297处的糖基化(Kabat编号)。
所述文献还公开了有机分子与抗体的缀合位点特异性共价偶联(缀合)的各种选择。关于本发明特别关注的是毒性基团与抗体通过抗体的两个或四个受体谷氨酰胺残基的缀合。
所述文献还公开了有机分子与抗体共价偶联(缀合)的各种选择。根据本发明优选的是通过抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/ 或通过抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团将毒性基团与抗体缀合。然而，还可以通过游离羧基或通过抗体的糖残基将毒性基团与抗体结合。
最广义上的“靶分子”应理解为是指存在于靶细胞群中的分子，其可以是蛋白质(例如生长因子的受体)或非肽类分子(例如糖或磷脂)。其优选地是受体或抗原。
术语“细胞外”靶分子描述了附着于细胞上的靶分子，其位于细胞外部，或位于细胞外部的靶分子的一部分，即结合体可以在完整细胞上结合其细胞外靶分子。细胞外靶分子可以锚定在细胞膜中或者是细胞膜的组分。本领域技术人员会知道鉴定细胞外靶分子的方法。对于蛋白质，这可以通过确定所述蛋白质的跨膜结构域和所述蛋白质在膜中的定向来鉴定。这些数据通常被存储在蛋白质数据库(例如SwissProt)中。
术语“癌症靶分子”描述了这样的靶分子，与非癌细胞相比，其更大量地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上。优选地，与非癌细胞相比，癌症靶分子选择性地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上，其中与非癌细胞相比，选择性地描述了在相同组织类型的癌细胞上至少两倍的富集(“选择性癌症靶分子”)。使用癌症靶分子允许使用本发明的缀合物选择性治疗癌细胞。
结合体可以通过键连接至接头。结合体的连接可以通过结合体的杂原子。根据本发明的可用于连接的结合体的杂原子是硫(在一个实施方案中通过结合体的巯基)、氧(根据本发明借助于结合体的羧基或羟基) 和氮(在一个实施方案中通过结合体的伯胺或仲胺基团或酰胺基团)。这些杂原子可以存在于天然结合体中或通过化学方法或分子生物学方法引入。根据本发明，所述结合体与所述的毒性基团的连接对结合体相对于靶分子的结合活性仅具有很小的影响。在优选的实施方案中，连接对结合体相对于靶分子的结合活性没有影响。
根据本发明，术语“抗体”应理解为其最广泛的含义并包含免疫球蛋白分子，例如完整或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。免疫球蛋白分子优选地包括具有四条多肽链的分子，通常通过二硫键连接的两条重链(H链)和两条轻链(L链)。每条重链包含重链的可变域(缩写为VH)和重链的恒定域。例如，重链的恒定域可以包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含可变域(缩写为VL)和恒定域。轻链的恒定域包含结构域(缩写为CL)。VH和 VL结构域可以进一步细分成具有超变性(hypervariability)的区域，也称为互补决定区(缩写为CDR)和具有低序列变异性的区域(框架区，缩写为FR)。通常，每个VH和VL区由三个CDR和最多四个FR组成。例如从氨基末端到羧基末端按以下顺序：FR、CDR1、FR2、CDR2、 FR3、CDR3、FR4。抗体可以从任何合适的物种获得，例如，兔、骆马 (llama)、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，抗体是人源的或鼠源的。抗体可以例如是人的、人源化的或嵌合的。
术语“单克隆”抗体是指从基本上均一的抗体群获得的抗体，即所述群体的单个抗体除了天然发生的突变之外是相同的，突变可以是小数目。单克隆抗体以高特异性识别单个抗原结合位点。术语单克隆抗体不是指特定的制备过程。
术语“完整”抗体是指包含抗原结合结构域以及轻链和重链的恒定域的抗体。恒定域可以是天然存在的结构域或其具有许多修饰的氨基酸位置的变体，并且也可以是非糖基化的。
术语“修饰的完整”抗体是指这样的完整抗体，其是通过其氨基末端或羧基末端借助于共价键(例如肽键)与不来源于抗体的另外的多肽或蛋白质融合。此外，抗体可以被修饰以便在确定的位置引入反应性半胱氨酸以促进与毒性基团的偶联(参见Junutula etal.，Nat Biotechnol.2008 Aug；26(8):925-32)。
术语“人”抗体是指这样的抗体，其可以从人获得的或者是合成的人抗体。“合成的”人抗体是基于对人抗体序列的分析通过计算机部分或完全地从合成序列获得的抗体。例如，人抗体可以由从人源的抗体序列文库分离的核酸编码。这样的抗体的实例可以发现于
Figure BDA0003554407600001401
et al., Nature Biotech.2000,18:853-856。这样的“人”和“合成”抗体还包括通过由PNGaseF进行的去糖基化或重链的N297(Kabat编号)突变成任何其他氨基酸而产生的非糖基化变体。
术语“人源化”或“嵌合”抗体描述了由序列的非人的部分和人的部分组成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白(受体)的部分序列被非人免疫球蛋白(供体)的序列部分取代。在很多情况中，供体是鼠免疫球蛋白。在人源化抗体的情况下，受体的CDR的氨基酸被供体的氨基酸替代。有时，框架的氨基酸也被供体的相应氨基酸替代。在一些情况下，人源化抗体含有在抗体优化期间引入的，既不存在于受体中也不存在于供体中的氨基酸。在嵌合抗体的情况下，供体免疫球蛋白的可变域与人抗体的恒定区融合。此类“人源化”和“嵌合”抗体还包括通过由PNGaseF 进行的去糖基化或重链的N297(Kabat编号)突变成任何其它氨基酸而产生的非糖基化变体。
如本文所用，术语互补决定区(CDR)是指与抗原结合所需的可变抗体结构域的那些氨基酸。通常，每个可变区具有称为CDR1、CDR2 和CDR3的三个CDR区。每个CDR区可以包含根据Kabat的定义的氨基酸和/或根据Chotia定义的超可变(hypervariable)环的氨基酸。根据 Kabat的定义包含例如可变轻链的约氨基酸位置24-34(CDR1)、50-56 (CDR2)和89-97(CDR3)的区域以及可变重链的31-35(CDR1)、 50–65(CDR2)和95–102(CDR3)的区域(Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。根据Chotia的定义包含例如可变轻链的约氨基酸位置26-32(CDR1)、50-52(CDR2)和91-96 (CDR3)的区域以及可变重链的26-32(CDR1)、53-55(CDR2)和 96-101(CDR3)的区域(Chothia and Lesk；J MolBiol 196:)。在一些情况下，CDR可包含来自根据Kabat和Chotia定义的CDR区的氨基酸。
根据重链的恒定区的氨基酸序列，可将抗体分为不同的类别。完整抗体主要有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的重链的恒定区称为[阿尔法/α]、[德耳塔/δ]、[伊普西隆/ε]、[伽马/γ]和[谬/μ]。抗体的三维结构和亚基结构都是已知的。
将抗体/免疫球蛋白的术语“功能片段”或“抗原结合抗体片段”定义为仍然包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合结构域的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变结构域)。抗体的“抗原结合结构域”通常包含抗体的一个或多个超可变区，例如CDR、CDR2和/或CDR3区。
然而，在抗体与抗原的结合过程中，抗体的“框架”或“骨架”区也可起作用。框架区形成CDR的骨架。优选地，抗原结合结构域至少包含可变轻链的第4至103位的氨基酸和可变重链的第5至109位的氨基酸，更优选可变轻链的第3至107位的氨基酸和可变重链的第4至111位的氨基酸，特别优选完全的可变轻链和重链，即VL的第1-109位的氨基酸和VH的第1-113位的氨基酸(根据WO 97/08320编号)。
本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”非排他性地包括Fab、 Fab'、F(ab')2和Fv片段，双抗体，单域抗体(Dab)，线性抗体，抗体的单个链(单链Fv，缩写为scFv)；以及多特异性抗体，例如双特异性抗体和三特异性抗体，例如从抗体片段形成的多特异性抗体C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in MolecularBiology),牛津大学出版社；R.Kontermann&S.Duebel,editor (2001)AntibodyEngineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag。除了“多特异性”或“多功能性”抗体以外的抗体是具有相同结合位点的那些抗体。多特异性抗体可以对抗原的不同表位具有特异性，或者可以对多于一种抗原的表位具有特异性(参见例如WO 93/17715； WO92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt et al.,1991,J.Immunol. 147:60 69；U.S.专利号4,474,893；4,7 14,68 1；4,925,648；5,573,920； 5,601,8 19；或Kostelny et al.,1992,J.Immunol.148:1547 1553)。可以构建F(ab')2或Fab分子，使得Ch1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用的数量可以减少或完全防止。
“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链或其组合)组成，并且通常具有特定的三维结构特性和特定的电荷特性。
“功能片段”或“抗原结合抗体片段”可以经由其氨基末端或羧基末端通过共价键(例如肽键)与不来源于抗体的另一种多肽或蛋白质融合。此外，抗体和抗原结合片段可以通过在确定的位置引入反应性半胱氨酸来修饰，以促进与毒性基团的偶联(参见Junutulaet al.Nat Biotechnol. 2008Aug；26(8):925-32)。
多克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备。单克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(
Figure BDA0003554407600001421
and Milstein, Nature,256,495-497,1975)。人单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(Olsson et al.,Meth Enzymol.92, 3-16或Cabilly et al.US 4,816,567或Boss etal.US 4,816,397)。
本领域普通技术人员知晓用于制备人抗体及其片段的多种方法，例如通过转基因小鼠(N Lonberg and D Huszar,Int Rev Immunol.1995； 13(1):65-93)或噬菌体展示技术(Phage Display Technologien)(Clackson et al.,Nature.1991年8月15日；352(6336):624-8)。本发明的抗体可以从重组抗体文库获得，所述重组抗体文库例如由大量健康志愿者收集的多种抗体的氨基酸序列组成。抗体也可以通过已知的重组DNA技术产生。抗体的核酸序列可以通过常规测序获得，或者可以从公众可获得的数据库获得。
已经纯化了“分离的”抗体或结合体以移除细胞的其它成分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞的污染成分例如是细胞的酶、激素或其他肽或非肽成分。优选的抗体或结合体是与抗体或结合体相比纯化程度超过95 重量％的抗体或结合体(例如通过Lowry法、UV-Vis光谱法或通过SDS 毛细管凝胶电泳测定)。此外，纯化程度使得可以确定氨基末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的抗体或已经纯化至均一的抗体，均一性(homogeneity)是通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下测定(检测可通过考马斯亮蓝染色或优选通过银显色来测定)。然而，抗体通常是通过一个或多个纯化步骤来制备。
术语“特异性的结合(specific binding)”或“特异性地结合(bindsspecifically)”是指结合预定抗原/靶分子的抗体或结合体。抗体或结合体的特异性结合通常描述亲和力至少为10-7M的抗体或结合体(称为Kd值；即优选Kd值小于10-7M的那些抗体 或结合体)，其中抗体或结合体对预定抗原/靶分子的亲和力比对不是预定抗原/靶分子或紧密相关抗原/靶分子的非特异性抗原/靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)高至少两倍。抗体优选地具有至少10-7M的亲和力(称为Kd值；换言之，优选Kd值小于10-7M的那些抗体)，优选至少10-8M，更优选10-9M 至10-10M。例如，可以通过表面等离子体共振光谱法来确定Kd值。
本发明的抗体-药物缀合物同样表现出在这些范围内的亲和力。亲和力优选地基本上不受药物缀合的影响(通常，亲和力降低小于一个数量级，换言之，例如至多10-8M至10-7M)。
根据本发明使用的抗体还明显优选地具有高选择性。当本发明的抗体对靶蛋白表现出的亲和力比对于独立的其他抗原高至少2倍，优选5 倍或更优选10倍，则存在高选择性，例如人血清白蛋白(亲和力可以例如通过表面等离子体共振光谱法来测定)。
此外，所使用的本发明的抗体优选地是交叉反应性的。为了能够促进且更好地解释临床前研究，例如毒理学或活性研究(例如在异种移植小鼠中)，如果根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白而且还结合用于研究的物种中的物种靶蛋白，那么这是有利的。在一个实施方案中，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还与至少一种其他物种的靶蛋白交叉反应性。对于毒理学和活性研究，优选使用啮齿动物、狗和非人灵长类科的种。优选的啮齿动物的种是小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物是猕猴、黑猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还与选自鼠、大鼠和长尾猕猴(成束猴(Macaca fascicularis))的至少一种其他物种的靶蛋白交叉反应。特别优选的是，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还至少与小鼠靶蛋白交叉反应。优选交叉反应性抗体，其对其他非人物种的靶蛋白的亲和力与对人的靶蛋白的亲和力相差不超过50倍，更特别是不超过10倍。
针对癌症靶分子的抗体
结合剂(如抗体或其抗原结合片段)所针对的靶分子优选地是癌症靶分子。术语“癌症靶分子”描述了这样的靶分子，即与非癌细胞相比，其更大量地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上。优选地，与非癌细胞相比，癌症靶分子选择性地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上，其中与非癌细胞相比，选择性地描述了在相同组织类型的癌细胞上至少两倍的富集(“选择性癌症靶分子”)。使用癌症靶分子允许使用根据本发明的缀合物选择性治疗癌细胞。
对抗原(例如癌细胞抗原)特异性的抗体，可由本领域普通技术人员通过他或她熟悉的方法(例如重组表达)制备或可以商购(例如来自 Merck KGaA,Germany)。癌症治疗中已知的可商购抗体的实例是
Figure BDA0003554407600001441
(西妥昔单抗，Merck KGaA)、
Figure BDA0003554407600001442
(贝伐单抗，Roche) 和
Figure BDA0003554407600001443
(曲妥珠单抗，Genentech)。曲妥珠单抗是IgG1κ型的重组的人源化单克隆抗体，其在基于细胞的测定(Kd＝5nM)中以高亲和力结合人表皮生长受体的细胞外结构域。该抗体在CHO细胞中重组产生。所有这些抗体也可以作为这些抗体的非糖基化变体产生，通过由 PNGase F进行的去糖基化或者通过重链的N297(Kabat编号)突变为任何氨基酸来产生。
在优选的实施方案中，靶分子是选择性癌症靶分子。
在特别优选的实施方案中，靶分子是蛋白质。
在一个实施方案中，靶分子是细胞外靶分子。在优选的实施方案中，细胞外靶分子是蛋白质。
癌症靶分子是本领域技术人员已知的。下面列出了这些实例。
癌症靶分子的实例是：
(1)EGF受体(NCBI参考序列NP_005219.2)，SEQ ID NO:213(1210 个氨基酸)：
>gi|29725609|ref|NP_005219.2|EGFR受体前体[智人(Homo sapiens)]
Figure BDA0003554407600001451
细胞外结构域由下划线标出。
(2)间皮素(SwissProt参考Q13421-3)，SEQ ID NO:214(622个氨基酸)：
>sp|Q13421-3|MSLN_HUMAN间皮素的亚型2OS＝智人GN＝MSLN
Figure BDA0003554407600001452
其中间皮素由氨基酸296-598编码。氨基酸37-286编码巨核细胞促进因子。间皮素通过GPI锚锚定在细胞膜上并位于细胞外。
(3)碳酸酐酶IX(SwissProt参考Q16790)，SEQ ID NO:215(459 个氨基酸)：
>sp|Q16790|CAH9_HUMAN碳酸酐酶9OS＝智人GN＝CA9 PE＝1SV＝2
Figure BDA0003554407600001461
细胞外结构域由下划线标出。
(4)C4.4a(NCBI参考序列NP_055215.2；同义词LYPD3)，SEQ ID NO:216(346个氨基酸)：
>gi|93004088|ref|NP_055215.2|含有ly6/PLAUR结构域的蛋白3前体[智人]
Figure BDA0003554407600001462
成熟的细胞外结构域由下划线标出。
(5)CD52(NCBI参考序列NP_001794.2)，SEQ ID NO:217
>gi|68342030|ref|NP_001794.2|CAMPATH-1抗原前体[智人]
Figure BDA0003554407600001463
(6)Her2(NCBI参考序列NP_004439.2)，SEQ ID NO:218
>gi|54792096|ref|NP_004439.2|受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2亚型a[智人]
Figure BDA0003554407600001464
(7)CD20(NCBI参考序列NP_068769.2)，SEQ ID NO:219
>gi|23110987|ref|NP_068769.2|B淋巴细胞抗原CD20[智人]
Figure BDA0003554407600001471
(8)淋巴细胞活化抗原CD30(SwissProt ID P28908)，SEQ ID NO:220
>gi|68348711|ref|NP_001234.2|肿瘤坏死因子受体超家族成员8亚型1前体[智人]
Figure BDA0003554407600001472
(9)淋巴细胞粘附分子CD22(SwissProt ID P20273)，SEQ ID NO:221
>gi|157168355|ref|NP_001762.2|B细胞受体CD22亚型1前体[智人]
Figure BDA0003554407600001473
(10)骨髓细胞(myloid cell)表面抗原CD33(SwissProt ID P20138)， SEQ IDNO:222
>gi|130979981|ref|N P_001763.3|骨髓细胞表面抗原CD33亚型1前体[智人]
Figure BDA0003554407600001481
(11)跨膜糖蛋白NMB(SwissProt ID Q14956)，SEQ ID NO:223
>gi|52694752|ref|NP_001005340.1|跨膜糖蛋白NMB亚型a前体[智人]
Figure BDA0003554407600001482
(12)粘附分子CD56(SwissProt ID P13591)，SEQ ID NO:224
>gi|94420689|ref|NP_000606.3|神经细胞粘附分子1亚型1[智人]
Figure BDA0003554407600001483
(13)表面分子CD70(SwissProt ID P32970)，SEQ ID NO:225
>gi|4507605|ref|NP_001243.1|CD70抗原[智人]
Figure BDA0003554407600001484
(14)表面分子CD74(SwissProt ID P04233)，SEQ ID NO:226
>gi|10835071|ref|NP_004346.1|HLA II类组织相容性抗原γ链亚型b[智人]
Figure BDA0003554407600001485
(15)B淋巴细胞抗原CD19(SwissProt ID P15391)，SEQ ID NO:227
>gi|296010921|ref|NP_001171569.1|B淋巴细胞抗原CD19亚型1前体[智人]
Figure BDA0003554407600001491
(16)表面蛋白粘蛋白1(SwissProt ID P15941)，SEQ ID NO:228 >gi|65301117|ref|NP_002447.4|粘蛋白1亚型1前体[智人]
Figure BDA0003554407600001492
(17)表面蛋白CD138(SwissProt ID P18827)，SEQ ID NO:229
>gi|29568086|ref|NP_002988.3|多配体蛋白聚糖1前体[智人]
Figure BDA0003554407600001493
(18)整联蛋白αV(Genbank登记号：NP_002201.1)，SEQ ID NO:230
>gi|4504763|ref|NP_002201.1|整联蛋白αV亚型1前体[智人]
Figure BDA0003554407600001501
(19)畸胎癌源性生长因子1蛋白TDGF1(Genbank登记号： NP_003203.1)，SEQ IDNO:231
>gi|4507425|ref|NP_003203.1|畸胎癌源性生长因子1亚型1前体[智人]
Figure BDA0003554407600001502
(20)前列腺特异性膜抗原PSMA(Swiss Prot ID：Q04609)，SEQ ID NO:232
>gi|4758398|ref|NP_004467.1|谷氨酸羧肽酶2亚型1[智人]
Figure BDA0003554407600001503
(21)酪氨酸蛋白激酶EPHA2(Swiss Prot ID：P29317)，SEQ ID NO: 233
>gi|32967311|ref|NP_004422.2|肝配蛋白A型受体2前体[智人]
Figure BDA0003554407600001511
(22)表面蛋白SLC44A4(Genbank登记号：NP_001171515)，SEQ ID NO:234
>gi|295849282|ref|NP_001171515.1|胆碱转运蛋白样蛋白4亚型2[智人]
Figure BDA0003554407600001512
(23)表面蛋白BMPR1B(SwissProt：O00238)
(24)转运蛋白SLC7A5(SwissProt：Q01650)
(25)上皮前列腺抗原STEAP1(SwissProt：Q9UHE8)
(26)卵巢癌抗原MUC16(SwissProt：Q8WXI7)
(27)运输蛋白SLC34A2(SwissProt：O95436)
(28)表面蛋白SEMA5b(SwissProt：Q9P283)
(29)表面蛋白LYPD1(SwissProt：Q8N2G4)
(30)内皮素受体B型EDNRB(SwissProt：P24530)
(31)环指蛋白RNF43(SwissProt：Q68DV7)
(32)前列腺癌相关蛋白STEAP2(SwissProt：Q8NFT2)
(33)阳离子通道TRPM4(SwissProt：Q8TD43)
(34)补体受体CD21(SwissProt：P20023)
(35)B细胞抗原受体复合体相关蛋白CD79b(SwissProt：P40259)
(36)细胞粘附抗原CEACAM6(SwissProt：P40199)
(37)二肽酶DPEP1(SwissProt：P16444)
(38)白细胞介素受体IL20Rα(SwissProt：Q9UHF4)
(39)蛋白聚糖BCAN(SwissProt:Q96GW7)
(40)肝配蛋白受体EPHB2(SwissProt：P29323)
(41)前列腺干细胞相关蛋白PSCA(Genbank登记号：NP_005663.2)
(42)表面蛋白LHFPL3(SwissProt：Q86UP9)
(43)受体蛋白TNFRSF13C(SwissProt：Q96RJ3)
(44)B细胞抗原受体复合体相关蛋白CD79a(SwissProt：P11912)
(45)受体蛋白CXCR5(SwissProt：P32302)
(46)离子通道P2X5(SwissProt：Q93086)
(47)淋巴细胞抗原CD180(SwissProt：Q99467)
(48)受体蛋白FCRL1(SwissProt：Q96LA6)
(49)受体蛋白FCRL5(SwissProt：Q96RD9)
(50)MHC II类分子Ia抗原HLA-DOB(Genbank登记号： NP_002111.1)
(51)T细胞蛋白VTCN1(SwissProt：Q7Z7D3)
(52)TWEAKR(SEQ ID NO:169(蛋白)；SEQ ID NO:170(DNA)。
(53)淋巴细胞抗原CD37(Swiss Prot：P11049)
(54)FGF受体2；FGFR2(基因ID：2263；官方代号：FGFR2)， FGFR2受体以不同的剪接变体(α、β、IIIb、IIIc)形式存在。所有剪接变体可以作为靶分子。
(55)跨膜糖蛋白B7H3(CD276；基因ID：80381)
(56)B细胞受体BAFFR(CD268；基因ID：115650)
(57)受体蛋白ROR 1(基因ID：4919)
(58)表面受体IL3RA(CD123；基因ID：3561)
(59)CXC趋化因子受体CXCR5(CD185；基因ID 643)
(60)受体蛋白合胞素(syncytin)(基因ID 30816)
在本发明优选的主题中，癌症靶分子选自癌症靶分子(1)-(60)，特别是(1)、(6)和(52)。
在本发明另一个特别优选的主题中，结合体结合至细胞外癌症靶分子，所述细胞外癌症靶分子选自癌症靶分子(1)-(60)，特别是(1)、(6)和 (52)。
在本发明另一个特别优选的主题中，结合体特异性结合至细胞外癌症靶分子，所述细胞外癌症靶分子选自癌症靶分子(1)-(60)，特别是(1)、 (6)和(52)。在一个优选的实施方案中，结合体在与靶细胞上的其细胞外靶分子结合后，由于结合而被靶细胞内化。这导致可以是免疫缀合物或 ADC的结合体-药物缀合物被靶细胞摄取。然后优选地在细胞内，使用优选的溶酶体方法处理结合体。
在一个实施方案中，结合体是结合蛋白。在优选的实施方案中，结合体是抗体、非糖基化抗体、抗原结合抗体片段、多特异性抗体或抗体模拟物。
优选的抗体模拟物是亲和体(affibody)、阿德奈汀(adnectin)、抗运载蛋白(anticalin)、DARPins、高亲合性多聚体(avimer)或纳米抗体(nanobody)。优选的多特异性抗体是双特异性抗体和三特异性抗体。
在优选的实施方案中，结合体是抗体或抗原结合抗体片段，更优选分离的抗体或分离的抗原结合抗体片段。
优选的抗原结合抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双抗体、 DAb、线性抗体以及scFv。特别优选的是Fab、双抗体和scFv。
在特别优选的实施方案中，结合体是抗体。特别优选的是单克隆抗体或其抗原结合抗体片段。进一步特别优选的是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合抗体片段。
结合癌症靶分子的抗体或结合抗原的抗体片段可由本领域普通技术人员使用已知的方法(例如化学合成或重组表达)来制备。癌症靶分子的结合体可以商购获得或可以由本领域普通技术人员使用已知的方法(例如化学合成或重组表达)来制备。用于制备抗体或抗原结合抗体片段的其它方法记载于WO 2007/070538(参见第22页“抗体”)。本领域技术人员已知如何编译诸如噬菌体展示文库(例如Morphosys HuCAL Gold)的方法并将其用于发现抗体或抗原结合抗体片段(参见WO 2007/070538，第24页以及第70页上的AK实施例1、第72页上的AK 实施例2)。用于制备使用来自B细胞的DNA文库的抗体的其他方法例如记载于第26页(WO 2007/070538)。人源化抗体的方法记载于 WO 2007070538的第30-32页并详细记载于Queen et al.,Pros.Natl.Acad. Sci.USA 8610029-10033,1989或WO 90/0786中。此外，一般来说，用于重组表达蛋白质的方法并且特别是用于重组表达抗体的方法是本领域技术人员已知的(参见例如Berger and Kimrnel(Guide to Molecular CloningTechniques,Methods in Enzymology,Vo1.A Laboratory Manual, (第二版,Cold SpringHarbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor,N.Y.； 1989)Vol.1-3)；CurrentProtocols in Molecular Biology,(F.M.Ausabel et al.[Eds.],Current Protocols,Green Publishing Associates,Inc./John Wiley &Sons,Inc.)；Harlow et al.,(Monoclonal Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1988,Paul[Ed.])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams&Wilkins(1998))；以及Harlow et al., (Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1998))。本领域技术人员已知表达蛋白质/抗体所必需的相应载体、启动子和信号肽。常见的方法也记载于WO 2007/070538的第41-45页。制备IgG1抗体的方法记载于例如WO 2007/070538的第74页的实施例6 ff中。允许测定与其抗原结合后的抗体内化的方法是本领域技术人员已知的，并且例如记载于WO 2007/070538的第80页。本领域技术人员能够使用记载于WO 2007/070538中的方法，其已经被用于以与制备具有不同靶分子特异性的抗体的类似方式制备碳酸酐酶IX(Mn)抗体。
抗EGFR的抗体
结合癌症靶分子EGFR的抗体的实例是西妥昔单抗(INN号7906)、帕尼单抗(INN号8499)和尼妥珠单抗(INN号8545)。西妥昔单抗 (药品注册号DB00002)是嵌合的抗EGFR1的抗体，其是在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中产生，并由ImClone Systems Inc/Merck kgaA/Bristol-Myers Squibb Co.销售。西妥昔单抗被标明用于治疗具有野生型K-Ras基因的转移性、表达EGFR的结肠直肠癌。它的亲和力为 10-10M。
序列：
西妥昔单抗轻链(κ)，SEQ ID NO:235：
Figure BDA0003554407600001551
西妥昔单抗重链，SEQ ID NO:236：
Figure BDA0003554407600001552
帕尼单抗(INN号8499)(药品注册号DB01269)是重组单克隆人IgG2抗体，其特异性结合人EGF受体1并由Abgenix/Amgen销售。帕尼单抗源自转基因小鼠(XenoMouse)的免疫。这些小鼠能够产生人免疫球蛋白(轻链和重链)。选择产生针对EGFR的抗体的特异性B细胞克隆，并用CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)永生化该克隆。这些细胞现在用于生产100％的人抗体。帕尼单抗用于治疗表达EGFR的转移性结肠直肠癌，其对氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康的化学疗法有抗性。它的亲和力为10-11M。
序列：
帕尼单抗轻链(κ)，SEQ ID NO:237：
Figure BDA0003554407600001553
帕尼单抗重链，SEQ ID NO:238：
Figure BDA0003554407600001554
尼妥珠单抗(INN号8545)(EP 00586002、EP 00712863)是特异性结合人EGF受体1的人源化单克隆IgG1抗体并由YM BioScienecs Inc. (Mississauga Canada)销售。它是在非分泌NSO细胞(哺乳动物细胞系)中产生。尼妥珠单抗被批准用于治疗头部和颈部肿瘤、高度恶性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤(不在欧盟和美国)和胰腺癌(孤儿药，EMA)。它的亲和力为10-8M。
尼妥珠单抗轻链(SEQ ID NO:239)：
Figure BDA0003554407600001561
尼妥珠单抗重链(SEQ ID NO:240)：
Figure BDA0003554407600001562
EGFR抗体的其他实施方案如下：
·扎鲁木单抗/2F8/HuMax-EGFr，来自Genmab A/S(WO 02/100348、 WO 2004/056847，INN号8605)
·奈昔木单抗/11F8，ImClone/IMC-11F8，来自ImClone Systems Inc. [EliLilly&Co](WO 2005/090407(EP 01735348-A1、US 2007/0264253-A1、US 7,598,350、WO2005/090407-A1)，INN号9083)
·马妥珠单抗/抗EGFR MAb、Merck KGaA/抗EGFR MAb、 Takeda/EMD 72000/EMD-6200/EMD-72000和EMD-55900/MAb 425/单克隆抗体425，来自Merck KGaA/Takeda(WO 92/15683，INN号8103 (马妥珠单抗))
·RG-7160/GA-201/GA201/R-7160/R7160/RG7160/RO-4858696/RO- 5083945/RO4858696/RO5083945，来自Glycart Biotechnology A G(Roche Holding AG)(WO 2010/112413-A1、WO 2010/115554)
·GT-MAB 5.2-GEX/CetuGEX来自Glycotope GmbH(WO 2008/028686-A2(EP01900750-A1、EP 01911766-A1、EP 02073842-A2、 US 2010/0028947-A1)
·ISU-101，来自Isu Abxis Inc(ISU Chemical Co Ltd)/Scancell(WO 2008/004834-A1)
·ABT-806/mAb-806/ch-806/抗EGFR单克隆抗体806，来自Ludwig Institute forCancer Research/Abbott/Life Science Pharmaceuticals(WO 02/092771、WO 2005/081854和WO 2009/023265)
·SYM-004(由两种嵌合的IgG1抗体(992和1024)组成)，来自 Symphogen A/S(WO2010/022736-A2)
·MR1-1/MR1-1KDEL，来自IVAX Corp(Teva Pharmaceutical Industries Ltd)(Duke University)，(专利：WO 2001/062931-A2)
·针对缺失型突变体的抗体，EGFRvIII，来自Amgen/Abgenix(WO 2005/010151、US7,628,986)
·SC-100，来自Scancell Ltd(WO 01/088138-A1)
·MDX-447/EMD 82633/BAB-447/H 447/MAb，EGFR， Medarex/Merck KgaA，来自Bristol-Myers Squibb(US)/Merck KGaA(DE) /Takeda(JP)，(WO 91/05871、WO 92/15683)
·抗EGFR-Mab，来自Xencor(WO 2005/056606)
·DXL-1218/抗EGFR单克隆抗体(癌症)，InNexus，来自InNexus BiotechnologyInc，Pharmaprojects PH048638
在优选的实施方案中，抗EGFR的抗体选自：西妥昔单抗 (cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、RG-716、GT-MAB5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
在特别优选的实施方案中，抗EGFR的抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奈昔木单抗和马妥珠单抗。
本领域技术人员知道可以用于从上述抗体的CDR区通过序列变异的方式制备其他抗体的方法，这些其他的抗体对靶分子具有相似或更好的亲和力和/或特异性。
在另一个实施方案中，抗EGFR的抗体或抗原结合抗体片段选自包含以下抗体之一的轻链的三个CDR区和重链的三个CDR区的抗体或抗原结合抗体片段：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
在另一个实施方案中，抗EGFR的抗体或抗原结合抗体片段选自包含以下抗体之一的轻链的三个CDR区和重链的三个CDR区的抗体或抗原结合抗体片段：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗碳酸酐酶IX抗体
结合癌症靶分子碳酸酐酶IX的抗体的实例描述于WO 2007/070538-A2(例如权利要求1-16)。
在优选的实施方案中，抗碳酸酐酶IX抗体或抗原结合抗体片段选自抗碳酸酐酶IX抗体或抗原结合抗体片段3ee9(WO 2007/070538-A2 中的权利要求4(a))、3ef2(WO 2007/070538-A2中的权利要求4(b))、 1e4(WO 2007/070538-A2中的权利要求4(c))、3a4(WO2007/070538-A2 中的权利要求4(d))、3ab4(WO 2007/070538-A2)中的权利要求4(e))、3ah10(WO 2007/070538-A2中的权利要求4(f))、3bb2(WO 2007/070538-A2中的权利要求4(g))、1aa1(WO 2007/070538-A2中的权利要求4(h))、5a6(WO 2007/070538-A2中的权利要求4(i))和5aa3 (WO 2007/070538-A2中的权利要求4(j))。
抗C4.4a抗体：
根据本发明，可以使用C4.4a抗体。
C4.4a抗体和抗原结合片段的实例记载于WO 2012/143499A2。通过引用的方式，将WO 2012/143499A2的所有抗体由此纳入本发明的说明书，并且它们可以用于本发明中。抗体的序列在WO 2012/143499A2的表1中给出，其中每行示出了列1中列出的抗体的可变轻链或可变重链的各自的CDR氨基酸序列。
在一个实施方案中，在与表达C4.4a的细胞结合后，抗C4.4a抗体或其抗原结合抗体片段被细胞内化。
在另一个实施方案中，抗C4.4a抗体或抗原结合抗体片段包含在 WO 2012/143499A2的表1或WO 2012/143499A2的表2中列出的抗体的至少一个、两个或三个CDR氨基酸序列。这样的抗体的优选实施方案同样列于WO 2012/143499A2中并且通过引用的方式纳入本文。
抗HER2的抗体
结合癌症靶分子Her2的抗体的实例是曲妥珠单抗(trastuzumab， Genentech)。曲妥珠单抗是特别用于治疗乳腺癌的人源化抗体。
除了曲妥珠单抗(INN7637，CAS号：RN：180288-69-1)和帕妥珠单抗(CAS号：380610-27-5)之外，与HER2结合的抗体的其它实例是WO 2009/123894-A2、WO 200/8140603-A2或WO 2011/044368-A2 中公开的抗体。抗HER2缀合物的一个实例是曲妥珠单抗-美坦新 (emtansine)(INN-No.9295)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。另外，可以使用通过由PNGaseF进行的去糖基化或通过重链的N297(Kabat编号)突变成任何氨基酸而产生的曲妥珠单抗的非糖基化变体。另外，还可以使用所述抗体的变体，其已经改造以含有一个或多个用于转谷氨酰胺酶介导的反应的受体谷氨酰胺。
抗CD20的抗体
结合癌症靶分子CD20的抗体的实例是利妥昔单抗(Genentech)。利妥昔单抗(CAS号：174722-31-7)是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗体。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗CD52的抗体
结合癌症靶分子CD52的抗体的实例是阿仑珠单抗(Genzyme)。阿仑珠单抗(CAS号码：216503-57-0)是一种用于治疗慢性淋巴细胞白血病的人源化抗体。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗间皮素的抗体：
抗间皮素的抗体的实例记载于例如WO 2009/068204。通过引用的方式，将WO2009/068204中记载的所有抗体由此纳入本说明书中，使得这些抗体可以用于本文公开的本发明的上下文中。
根据本发明使用的抗间皮素的抗体也显著优选地与间皮素不变结合。不变结合的特征在于例如根据本发明使用的抗体结合至间皮素的表位，所述表位不能被另外的细胞外蛋白掩蔽。这种另外的细胞外蛋白是例如蛋白质卵巢癌抗原125(CA125)。优选地使用的抗体的特征在于它们与间皮素的结合不被CA125阻断。
抗CD30的抗体
结合癌症靶分子CD30并可用于治疗癌症(例如霍奇金淋巴瘤)的抗体的实例是本妥昔单抗(brentuximab)，伊妥木单抗(iratumumab) 和WO 2008/092117、WO 2008/036688或WO 2006/089232中公开的抗体。抗CD30缀合物的实例是本妥昔单抗-维多汀(brentuximab vedotin) (INN编号9144)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗CD22的抗体
结合癌症靶分子CD22并可用于治疗癌症(例如淋巴瘤)的抗体的实例是依托珠单抗(inotuzumab)和依帕珠单抗(epratuzumab)。抗 CD22缀合物的实例是依托珠单抗-奥唑米星(inotuzumab ozagamycin) (INN号8574)或抗CD22-MMAE和抗CD22-MC-MMAE(CAS RN分别为139504-50-0和474645-27-7)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗CD33的抗体
与癌症靶分子CD33结合并可用于治疗癌症(例如白血病)的抗体的实例是吉妥珠单抗(gemutuzumab)和林妥珠单抗(lintuzumab)(INN 7580)。抗CD33缀合物的实例是吉妥珠单抗 (gemutuzumab-ozagamycin)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗NMB的抗体
结合癌症靶分子NMB并可用于治疗癌症(例如黑素瘤或乳腺癌) 的抗体的实例是格列姆巴妥木单抗(glembatumumab)(INN 9199)。抗NMB缀合物的实例是格列姆巴妥木单抗-维多汀(glembatumumab vedotin)(CAS RN：474645-27-7)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗CD56的抗体
结合癌症靶分子CD56并可用于治疗癌症(例如多发性骨髓瘤、小细胞肺癌、MCC或卵巢癌)的抗体的实例是罗佛珠单抗(lorvotuzumab)。抗CD57缀合物的实例是罗佛珠单抗-美登素(lorvotuzumab mertansine) (CAS RN：139504-50-0)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗CD70的抗体
结合癌症靶分子CD70并可用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤或肾细胞癌)的抗体的实例公开于WO 2007/038637-A2和WO 2008/070593-A2中。抗CD70缀合物的实例是SGN-75(CD70MMAF)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗CD74的抗体
结合癌症靶分子CD74并可用于治疗癌症(例如多发性骨髓瘤)的抗体的实例是米拉珠单抗。抗CD74缀合物的实例是米拉珠单抗-多柔比星(CAS RN：23214-92-8)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗CD19的抗体
结合癌症靶分子CD19并可用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤) 的抗体的实例公开于WO 2008/031056-A2中。其他抗体和抗CD19缀合物(SAR3419)的实例公开于WO 2008/047242-A2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗粘蛋白的抗体
结合癌症靶分子粘蛋白-1并可用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤)的抗体的实例是克莱维足单抗(clivatuzumab)和WO 2003/106495-A2、WO 2008/028686-A2中公开的抗体。抗粘蛋白缀合物的实例公开于WO 2005/009369-A2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗CD138的抗体
结合癌症靶分子CD138及其缀合物的抗体的实例公开于WO 2009/080829-A1、WO2009/080830-A1中，所述抗体可用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗整联蛋白-αV的抗体
结合癌症靶分子整联蛋白αV的抗体并可用于治疗癌症(例如黑素瘤、肉瘤或癌)的抗体的实例为英妥木单抗(intetumumab)(CAS RN： 725735-28-4)、阿昔单抗(abciximab)(CAS RN：143653-53-6)、埃达珠单抗(etaracizumab)(CAS RN：892553-42-3)和公开于US7,465,449、 EP 719859-A1、WO 2002/012501-A1和WO 2006/062779-A2中的抗体。抗整联蛋白αV缀合物的实例是英妥木单抗-DM4和在WO 2007/024536-A2中公开的其他ADC。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗TDGF1的抗体
结合癌症靶分子TDGF1并可用于治疗癌症的抗体的实例是WO 02/077033-A1、US7,318,924、WO 2003/083041-A2和WO 2002/088170-A2中公开的抗体。抗TDGF1缀合物的实例公开于WO 2002/088170-A2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗PSMA的抗体
结合癌症靶分子PSMA并可用于治疗癌症(例如前列腺癌)的抗体的实例是WO 97/35616-A1、WO 99/47554-A1、WO 01/009192-A1和 WO2003/034903中公开的抗体。抗PSMA缀合物的实例公开于WO 2009/026274-A1和WO 2007/002222中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文下。
抗EPHA2的抗体
结合癌症靶分子EPHA2、可用于制备缀合物并可用于治疗癌症的抗体的实例公开于WO 2004/091375-A2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗SLC44A4的抗体
结合癌症靶分子SLC44A4、可用于制备缀合物并可用于治疗癌症 (例如胰腺癌或前列腺癌)的抗体的实例公开于WO 2009/033094-A2和 US2009/0175796-A1中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗HLA-DOB的抗体
结合癌症靶分子HLA-DOB的抗体的实例是抗体Lym-1(CAS RN： 301344-99-0)，其可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤。抗HLA-DOB 缀合物的实例例如公开于WO 2005/081711-A2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。
抗VTCN1的抗体
结合癌症靶分子VTCN1、可用于制备缀合物并可用于治疗癌症(例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌或乳腺癌)的抗体的实例公开于WO 2006/074418-A2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。
抗FGFR2的抗体
根据本发明，可以使用抗FGFR2的抗体。
抗FGFR2的抗体和抗原结合片段的实例记载于WO 2013076186中。通过引用的方式，将WO 2013076186的所有抗体由此纳入本发明的说明书中，并且它们可以用于本发明中。抗体的序列示于WO 2013076186的表9和表10中。优选衍生自称为M048-D01和M047-D08的抗体、抗原结合片段和抗体的变体。优选的抗FGFR2与已知的FGFR2的各种剪接变体结合。
在一个实施方案中，抗FGFR2的抗体或其抗原结合抗体片段在与表达FGFR2的细胞结合后被细胞内化。
在另一个实施方案中，抗FGFR2的抗体或抗原结合抗体片段包含 WO 2013076186的表9或表10中列出的抗体的至少一个、两个或三个 CDR氨基酸序列。
抗TWEAKR的抗体
在优选的实施方案中，当抗TWEAKR的抗体或其抗原结合片段用于本发明的方法中时，该抗体或片段选自下文记载的那些(同样公开于 WO 2014/199817(A1)中)。另外，结合TWEAKR的抗体是本领域技术人员已知的，参见例如WO 2009/020933(A2)或WO 2009140177(A2)。另外，可以使用所述的抗TWEAKR的抗体的非糖基化变体，其是通过由 PNGaseF进行的去糖基化或通过重链的N297(Kabat编号)突变为任何氨基酸而产生。另外，还可以使用已经改造以含有一个或多个用于转谷氨酰胺酶介导的反应的受体谷氨酰胺的抗体的变体。
本发明具体涉及与抗体或其抗原结合抗体片段或其变体的缀合物，其导致TWEAKR(SEQ ID NO:169(蛋白质)；SEQ ID NO:170(DNA)) 的强烈活化，导致在过表达TWEAKR的各种癌细胞中强烈诱导细胞凋亡。
已经描述的抗TWEAKR的抗体(例如PDL-192)对TWEAKR的激动活性(在诱导细胞凋亡和抑制增殖的方面)是有限的并且达不到内源性配体TWEAK的效力。这种激动活性的缺乏不是基于亲和力的降低，因为这些抗体在TWEAKR上结合的亲和力与内源性配体TWEAK 相比处于相似的范围内(Michaelson JS et al.,MAbs.2011年7月-8 月；3(4):362-75；Culp PAet al.,Clin Cancer Res.2010年1月15 日；16(2):497-508)，甚至具有更高结合亲和力的抗体不一定显示更有效的信号传导活性(Culp PA et al.,Clin Cancer Res.2010年1月15日；16(2):497-508)。此外，已经证明已经记载的抗体的抗肿瘤活性取决于Fc效应子功能，并且证明ADCC在小鼠模型中的体内效力中起重要作用。
抗TWEAKR的抗体的生成
使用完整的人抗体噬菌体文库(Hoet RM et al.,Nat Biotechnol 2005；23(3):344-8)通过蛋白淘选来分离本发明的TWEAKR特异性人单克隆抗体(Hoogenboom HR,NatBiotechnol 2005；23(3):1105-16)，使用人和小鼠TWEAKR的二聚Fc融合的细胞外结构域作为固定的靶。鉴定了11种不同的Fab噬菌体，并将相应的抗体克隆到哺乳动物EgG表达载体中，其提供在可溶性FAb中缺失的CH2-CH3结构域。鉴定优选的抗体后，将这些表达为全长IgG。已经通过在各个抗体的重链中引入突变N297A或N297Q来产生所述抗体的非糖基化变体。例如，如Tom et al.,Methods Express:Expression Systems edited by MichealR.Dyson and Yves Durocher,Scion Publishing Ltd,2007中的第12章所述(参见AK- 实施例1)，在哺乳动物细胞中瞬时表达这些构建体。如在AK-实施例 2中所述，通过蛋白质-A色谱法纯化抗体并进一步使用ELISA和 BIAcore分析通过它们与可溶性单体TWEAKR的结合亲和力来进行表征。为了确定抗TWEAKR的抗体的细胞结合特性，通过流式细胞术测试了对许多细胞系(HT29、HS68、HS578)的结合。进行NFκB报告基因测定以检查所鉴定的所有11种抗体(人IgG1)的激动活性。选择具有最高体外活性的抗体(TPP-883)用于进一步的活性和亲和力成熟(详见AK-实施例1)。检测到具有改善的激动活性的单一取代变体：CDR-H3 的G102T。最后，基于与最佳单一取代变体G102T相比的提高的亲和力选择了7种变体。将其相应的DNA克隆到哺乳动物IgG表达载体中，并在上述NF-κB报道基因测定中检查功能活性。最后，将获得的序列与人种系序列进行比较，并且修改对亲和力和效力没有任何显著影响的偏差。通过抗体文库筛选以及通过亲和力和/或活性成熟获得以下抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”和“TPP-1858”。
本发明的抗体还可以通过本领域已知的方法获得，如抗体噬菌体展示筛选(参见例如Hoet RM et al.,Nat Biotechnol 2005；23(3):344-8)、公认的杂交瘤技术(参见例如
Figure BDA0003554407600001651
and Milstein Nature.1975年8月7日； 256(5517):495-7)或小鼠的免疫，特别是hMAb小鼠(例如VelocImmune
Figure BDA0003554407600001652
)的免疫。
抗TWEAKR的抗体的具体实施方案
本发明的一个实施方案是提供在一种或多种表达TWEAKR的细胞系中强烈诱导半胱天冬酶3/7的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。在优选的实施方案中，一种或多种表达TWEAKR的细胞系存在于 WiDr、A253、NCI-H322、HT29和786-O中。可通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些方法)测量“半胱天冬酶3/7的诱导”。在一个实施方案中，根据本发明使用以capase 3/7溶液(Promega，#G8093) 进行的活性测定并读取VICTOR V(Perkin Elmer)上的发光来测定“半胱天冬酶3/7的诱导”。在孵育时间结束时，测定半胱天冬酶3/7活性，并与未处理的细胞比较确定半胱天冬酶3/7的诱导因子。当诱导因子大于1.2、优选大于1.5、甚至更优选大于1.8、甚至更优选大于2.1、甚至更优选大于2.5时，称抗体表现出半胱天冬酶3/7的“强烈诱导”。所提供的是抗TWEAKR的抗体，其与已经记载的激动性抗体[例如PDL-192 (TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]相比并且还与300ng/ml重组人TWEAK相比，在HT29细胞中导致更强烈的半胱天冬酶3/7的诱导。在WiDr、A253、NIC-H322和786-O细胞中也观察到这种在癌细胞中诱导胱天蛋白酶3/7的强烈活性，其中在大多数实验中，与参照抗体[PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)]相比并且与300ng/ml TWEAK相比，所检查的本发明的抗体诱导了更高的变化因子。本发明的一些抗体仅以中等亲和力(>10nM)与TWEAKR结合，其明显小于内源性配体TWEAK的亲和力，并且与其他已知的激动性抗体相比也更小。这种性质提供了其他可能的优点，例如，可能更深入地渗透肿瘤。
就此而言，本发明的一个实施方案是提供在新的表位特异性结合 TWEAKR的抗体或其抗原结合抗体片段，其特征在于选择性结合 TWEAKR(SEQ ID NO:169；也参见图1)的第47位的天冬氨酸(D) (D47)。所鉴定的某些TWEAKR氨基酸对于抗体相互作用来说的依赖性与针对这些抗体确定的激动活性相关。天然配体TWEAK表现出 TWEAKR的有效活化，并依赖于亮氨酸46结合在TWEAKR的半胱氨酸富集结构域中(Pellegrini et al.,FEBS 280:1818-1829)。P4A8显示出非常低的激动活性并且至少部分与TWEAKR的半胱氨酸富集结构域以外的结构域相互作用。PDL-192表现出中等的激动活性，并且依赖于 R56结合至半胱氨酸富集结构域，但与TWEAK配体位点相对。本发明的抗体(例如TPP-2090)依赖于D47进行结合，TWEAK依赖于L46 进行结合。因此，TWEAK结合到相似但不同的结合位点因此，本发明表现出强烈激动活性的抗体结合至抗体的新表位(D47-依赖性)，其与非常高的激动活性相关。
TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位处的氨基酸(D47)被认为对于本发明的抗体结合来说是关键性的，这意味着当抗体通过将该残基修饰成丙氨酸而损失超过20％、或者超过30％、或者超过40％、或者超过50％、或者超过60％、或者超过70％、或者超过80％、或者超过 90％、或者100％的其ELISA信号时，抗体特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位处的D(D47)，如AK-实施例2中所描述的。或者，与TPP-2203相比，对于TPP-2614来说，当抗体损失超过 20％、或者超过30％、或者超过40％、或者超过50％、或者超过60％、或者超过70％、或者超过80％、或者超过90％、或者100％的其ELISA 信号时，抗体特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位处的D(D47)。优选地，与TPP-2203相比，对于TPP-2614来说，当抗体损失超过80％的其ELISA信号时，抗体特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位处的D(D47)。
在本申请中，参考下列本发明的优选抗体，如下表所示：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”、“TPP-1858”、“TPP-2658”。
表：抗体的蛋白序列：
Figure BDA0003554407600001671
TPP-2090是：包含对应于SEQ ID NO:2的重链的区域和对应于SEQ ID NO:1的轻链的区域的抗体。
TPP-2658是：包含对应于SEQ ID NO:241的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:1的轻链的区域的抗体。
TPP-5442是：包含对应于SEQ ID NO:242的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:1的轻链的区域的抗体。
TPP-8825是：包含对应于SEQ ID NO:243的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:1的轻链的区域的抗体。
TPP-2149是：包含对应于SEQ ID NO:12的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:11的轻链的区域的抗体。
TPP-2093是：包含对应于SEQ ID NO:22的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:21的轻链的区域的抗体。
TPP-2148是：包含对应于SEQ ID NO:32的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:31的轻链的区域的抗体。
TPP-2084是：包含对应于SEQ ID NO:42的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:41的轻链的区域的抗体。
TPP-2077是：包含对应于SEQ ID NO:52的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:51的轻链的区域的抗体。
TPP-1538是：包含对应于SEQ ID NO:62的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:61的轻链的区域的抗体。
TPP-883是：包含对应于SEQ ID NO:72的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:71的轻链的区域的抗体。
TPP-1854是：包含对应于SEQ ID NO:82的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:81的轻链的区域的抗体。
TPP-1853是：包含对应于SEQ ID NO:92的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:91的轻链的区域的抗体。
TPP-1857是：包含对应于SEQ ID NO:102的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:101的轻链的区域的抗体。
TPP-1858是：包含对应于SEQ ID NO:112的重链的区域和对应于 SEQ ID NO:111的轻链的区域的抗体。
TPP-2090是：包含对应于SEQ ID NO:10的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。
TPP-2658是：包含对应于SEQ ID NO:10的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。
TPP-5442是：包含对应于SEQ ID NO:10的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。
TPP-8825是：包含对应于SEQ ID NO:10的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。
TPP-2149是：包含对应于SEQ ID NO:20的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:19的轻链可变区的抗体。
TPP-2093是：包含对应于SEQ ID NO:30的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:29的轻链可变区的抗体。
TPP-2148：是包含对应于SEQ ID NO:40的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:39的轻链可变区的抗体。
TPP-2084：是包含对应于SEQ ID NO:50的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:49的轻链可变区的抗体。
TPP-2077：是包含对应于SEQ ID NO:60的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:59的轻链可变区的抗体。
TPP-1538：是包含对应于SEQ ID NO:70的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:69的轻链可变区的抗体。
TPP-883：是包含对应于SEQ ID NO:80的重链可变区和对应于SEQ ID NO:79的轻链可变区的抗体。
TPP-1854：是包含对应于SEQ ID NO:90的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:89的轻链可变区的抗体。
TPP-1853：是包含对应于SEQ ID NO:100的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:99的轻链可变区的抗体。
TPP-1857：是包含对应于SEQ ID NO:110的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:109的轻链可变区的抗体。
TPP-1858：是包含对应于SEQ ID NO:120的重链可变区和对应于 SEQ ID NO:119的轻链可变区的抗体。
表：抗体的DNA序列
Figure BDA0003554407600001701
抗TWEAKR的抗体的优选实施方案如下：
非糖基化的抗TWEAKR的抗体或其抗原结合片段，其与TWEAKR (SEQ ID NO:169)的第47位处的D(D47)特异性结合。
根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是激动性抗体。
根据实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段，其包含：
可变重链，其包含：
由包含式PYPMX的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)编码的重链的 CDR1，其中X是I或M；
由包含式YISPSGGXTHYADSVKG的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172)编码的重链的CDR2，其中X是S或K；和
由包含式GGDTYFDYFDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:173)编码的重链的CDR3；
以及可变轻链，其包含：
由包含式RASQSISXYLN的氨基酸序列(SEQ ID NO:173)编码的轻链的CDR1，其中X是G或S；
由包含式XASSLQS的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)编码的轻链的CDR2，其中X是Q，A或N；和
由包含式QQSYXXPXIT(SEQ ID NO:176)的氨基酸序列编码的轻链的CDR3，其中第5位的X是T或S，第6位的X是T或S且第8 位的X是G或F。
前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合片段，其包含：
可变重链，其包含如SEQ ID NO:6所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:7所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:8所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:3所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:4所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:5所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:16所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:17所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:18所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:13所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:14所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:15所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:26所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:27所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:28所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:23所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:24所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:25所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:36所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:37所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:38所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:33所示的轻链的可变CDR1序列、SEQ ID NO:34所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:35所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:46所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:47所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:48所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:43所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:44所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:45所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:56所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:57所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:58所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:53所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:54所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:55所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:66所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:67所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:68所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:63所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:64所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:65所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:76所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:77所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:78所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:73所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:74所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:75所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:86所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:87所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:88所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:83所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:84所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:85所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:96所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:97所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:98所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:93所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:94所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:95所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:106所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:107所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO: 108所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:103所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:104所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:105所示的轻链的可变CDR3序列，或
可变重链，其包含如SEQ ID NO:116所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:117所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO: 118所示的重链的可变CDR3序列，以及
可变轻链，其包含SEQ ID NO:113所示的轻链的可变CDR1序列、 SEQ ID NO:114所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:115所示的轻链的可变CDR3序列。
前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链的可变序列，如SEQ ID NO:10所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:9所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:20所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:19所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:30所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:29所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:40所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:39所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:50所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:49所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:60所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:59所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:70所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:69所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:80所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:79所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:90所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:89所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:100所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:99所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:110所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:109所示，或
重链的可变序列，如SEQ ID NO:120所示，以及轻链的可变序列，如SEQ ID NO:119所示。
前述实施方案中任一个的抗体，其是IgG抗体。
前述实施方案中任一个的抗体，其包含：
如SEQ ID NO:2所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:1所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:12所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:11所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:22所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:21所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:32所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:31所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:42所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:41所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:52所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:51所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:62所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:61所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:72所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:71所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:82所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:81所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:92所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:91所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:102所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:101所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:112所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:111所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:241所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:1所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:242所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:1所示的轻链序列，或
如SEQ ID NO:243所示的重链序列，以及如SEQ ID NO:1所示的轻链序列。
前述实施方案中任一个的抗原结合片段或前述实施方案中任一个的抗体的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab'片段或F(ab')2片段。
前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或其抗原结合片段。
前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或抗原结合片段。
特别优选抗TWEAKR的抗体TPP-2685。
本发明的一个实施方案是提供适用于纺锤体驱动蛋白抑制剂的转谷氨酰胺酶介导的缀合的抗体。
人的野生型全长抗体亚型在重链的第295位(Kabat EU编号)处具有保守的受体谷氨酰胺，其在存在转谷氨酰胺酶的情况下是可接近且反应性的，这导致当抗体处于非糖基化形式时形成抗体和合适化合物的缀合物。此类非糖基化抗体或去糖基化抗体缺少与Fc区的CH2结构域中的保守糖基化位点N297连接的聚糖。例如，可以通过重链的糖基化位点N297(Kabat Eu编号)的突变或通过在缺少糖基化能力的表达系统中表达抗体来产生非糖基化抗体。抗体去糖基化的方法是公知常识(例如Winkelhake&Nicolson(1976),J BiolChem.251(4):1074-80))。去糖基化抗体可以例如通过借助PNGase F进行酶促去糖基化来产生。在本发明的一个实施方案中，可以通过在原核宿主中表达来获得去糖基化抗体。合适的原核宿主包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属 (Staphylococcus genera)的一些种。在本发明的另一个实施方案中，去糖基化抗体可以通过使用哺乳动物细胞表达系统以及糖基化抑制剂衣霉素来获得(Nose&Wigzell(1983),Proc Natl Acad Sci USA, 80(21):6632-6)。此时，所述修饰是防止抗体的Fc部分的CH2结构域中的重链的保守N-糖基化位点N297处的糖基化(Kabat编号)。
在本发明的另一个实施方案中，通过突变重链中的糖基化位点 N297(Kabat编号)产生非糖基化抗体。已经针对含有突变N297D、N297Q (Jeger et al.,Angewandte ChemieInt.Ed.Engl 49,9995-9997(2010))或 N297S(参见专利申请WO 2013092998A1和WO2013092983A2)的抗体变体描述了这种经改造的去糖基化抗体的酶促缀合。此外，本发明证明了转谷氨酰胺酶可以有效地催化具有N297A突变(Kabat EU编号)的非糖基化抗体变体的缀合。
在存在转谷氨酰胺酶的情况下，可以通过抗体工程来产生额外的或替代的反应性残基。本发明化合物包括谷氨酰胺改造的抗体，其中野生型或亲本抗体的一个或多个氨基酸已被谷氨酰胺替代，或其中谷氨酰胺残基，任选地与另一种氨基酸(例如含有受体谷氨酰胺的标签)一起被引入亲本或野生型分子中。
在存在转谷氨酰胺酶的情况下，具有反应性的抗体的谷氨酰胺残基位于重链中，通常在恒定域中。在一个实施方案中，N297位置处的天冬酰胺(Kabat编号)已被换为除谷氨酰胺外的残基。优选N297D、 N297Q、N297S或N297A，甚至更优选N297A。因此，具有N297X取代以及在第295位(Kabat编号)处具有谷氨酰胺的抗体每条重链具有一个受体谷氨酰胺。因此完整的IgG每个抗体具有两个缀合位点。
在存在转谷氨酰胺酶的情况下，具有反应性的抗体的谷氨酰胺残基位于重链中，通常在恒定域中。在一个实施方案中，N297位置处的天冬酰胺(Kabat编号)已被换为谷氨酰胺。因此所述抗体具有N297Q取代。因此，具有N297Q取代和在第295位(Kabat编号)具有谷氨酰胺的抗体每条重链具有两个受体谷氨酰胺，并且因此具有两个偶联位点。因此完整的IgG每个抗体具有四个缀合位点。
在存在转谷氨酰胺酶的情况下，具有反应性的抗体的谷氨酰胺残基在重链中，通常在恒定域中。在一个实施方案中，N297位置处的天冬酰胺(Kabat编号)已被换为谷氨酰胺，并且在第295位的谷氨酰胺已被替换。因此所述抗体具有N297Q和Q295X取代。优先Q295N取代。因此，具有N297Q取代且在295位(Kabat编号)没有谷氨酰胺的抗体每条重链具有一个受体谷氨酰胺，并且因此具有一个缀合位点。因此，完整的IgG每个抗体具有两个缀合位点。
因此，适用于转谷氨酰胺酶介导的缀合的优选抗体包括：
i.N297X取代，其中X是除天冬酰胺以外的任何氨基酸；更优选的是N297D、N297Q、N297S或N297A，甚至更优选的是N297A和N297Q。
ii.N297Q取代和Q295X取代，其中X是除谷氨酰胺以外的任何氨基酸，优选Q295N。
同位素、盐、溶剂合物、同位素变体
本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体在此应理解为是指其中本发明化合物中的至少一个原子已被替换为具有相同原子序数但具有不同于自然界中通常或主要存在的原子质量的另一个原子的化合物。可纳入本发明化合物的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的那些同位素，例如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I和131I。本发明化合物的特定同位素变体(尤其是其中已经掺入一种或多种放射性同位素的那些化合物的同位素变体)可能是有益的，例如用于检查作用机制或体内的药物分布；由于相对容易的可制备性和可检测性，特别是用3H或14C同位素标记的化合物适合于此目的。另外，掺入同位素(例如掺入氘)，可能由于化合物具有更高的代谢稳定性(例如体内半衰期延长或所需活性剂量降低)而导致特定的治疗益处；因此，本发明化合物的这些修饰在一些情况下也可构成本发明的优选实施方案。本发明化合物的同位素变体可以通过本领域技术人员已知的方法制备，例如通过下文进一步描述的方法和工作实施例中描述的操作、通过使用相应的同位素修饰各个试剂和/或起始化合物。
本发明上下文中优选的盐是本发明化合物的生理上可接受的盐。还包括本身不适用于药物应用，但可用于例如分离或纯化本发明化合物的盐。
本发明化合物的生理学上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。
本发明化合物的生理学上可接受的盐还包括常规碱的盐，例如且优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及由氨或有机胺衍生的具有1至16个碳原子的铵盐，例如且优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2-乙二胺。
在本发明的上下文中命名为溶剂合物的是通过与溶剂分子配位而形成固体或液体状态的复合体的本发明化合物的那些形式。水合物是与水配位的溶剂合物的具体形式。在本发明上下文中优选的溶剂合物是水合物。
此外，本发明还包括本发明化合物的前药。本申请上下文中的术语“前药”是指本身可以是具有生物活性或无活性的，但在其体内停留时间内被转化(例如代谢或水解方式)成本发明化合物的化合物。
具体实施方案
以下实施方案是特别优选的：
实施方案A：
下式的APDC及APDC的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐
Figure BDA0003554407600001781
其中KSP-L-是式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)或下式(IIf)的化合物，所述结合剂是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段(优选抗HER2的抗体、抗EGFR的抗体或抗TWEAKR的抗体，更优选与在TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位中的氨基酸D(D47)特异性结合的抗TWEAKR的抗体，特别是抗TWEAKR的抗体TPP-2658)，并且n是1至10的数字：
式(IIf)：
Figure BDA0003554407600001791
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A是-C(＝O)-(羰基)；
R1代表–L-#1、-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、 -CONZ“(CH2)1-3NH2和–CONZ“CH2COOH，其中Z“代表-H或-NH2；
R2是-H；
R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CO)NH2)-CO-的基团或式R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C510-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10- 烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基 -O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代： -NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、 -SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
R3代表–L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：–OH、 O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、 NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或 NH2，n代表0、1或2，(其中烷基优选地为C1-3-烷基)；
R5为-H或-F；
R6和R7彼此独立地代表-H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8是支链的C1-5-烷基；且
R9是-H或-F，
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1，且
-L-表示接头且#1表示与抗体连接的键。
接头优选地为接头
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中m为0或1；
§代表与KSP连接的键，
§§代表与抗体连接的键，且
L2
Figure BDA0003554407600001811
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
并且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1表示-NHCO-或
Figure BDA0003554407600001812
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和 /或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、 -NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环，或-SO-(优选
Figure BDA0003554407600001813
)，其中侧链(如果存在的话)可被–NHCONH2、-COOH、 -OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
此处，#1是与KSP抑制剂连接的键，#2是连接偶联基团与结合体(例如L2)的键。
实施方案B：
下式的APDC及APDC的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐
Figure BDA0003554407600001821
其中KSP-L-是式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)或下式(IIg) 的化合物，所述结合剂是抗体，并且n是1至10的数字：
式(IIg)：
Figure BDA0003554407600001822
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A是CO(羰基)；
R1是–L-#1、-H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3 NH2和–CONZ“CH2COOH，其中Z“代表-H或-NH2；
R2是-H；
R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的豆荚蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C510-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10- 烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基 -O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代： -NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、 -SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、 -CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、 Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg和 His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、 Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg和 His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
R3代表–L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：–OH、 O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、 NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或 NH2，n代表0、1或2，(其中烷基优选地为C1-3-烷基)；
R5为-H或-F；
R6和R7彼此独立地代表-H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8是支链的C1-5-烷基；且
R9是-H或-F，
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1，且
-L-表示接头且#1表示与抗体连接的键。
-L-优选地由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中m为0或1；
§代表与KSP连接的键，
§§代表与抗体连接的键，且
L2
Figure BDA0003554407600001841
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
并且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2，
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1表示-NHCO-或
Figure BDA0003554407600001842
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和 /或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、 -NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-以及具有至多4个选自N、 O和S的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环，或-SO-(优选
Figure BDA0003554407600001843
)，其中侧链(如果存在的话)可被–NHCO-NH2、 -COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
#1是与KSP抑制剂连接的键，#2是连接偶联基团与结合体(例如L2)的键。
或者，接头可以与赖氨酸侧链或赖氨酸残基键合。
实施方案C：
下式的APDC及APDC的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐
Figure BDA0003554407600001851
其中KSP-L-是式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或下式 (IIh)的化合物，结合剂是抗体，并且n是1至10的数字：
式(IIh)：
Figure BDA0003554407600001852
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A是-C(＝O)-(羰基)；
R1是–L-#1；
R2是-H；
R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基团或R21-(CO)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C510-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10- 烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基 -O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代： -NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、 -CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
R3为C1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：–OH、-O-烷基、-SH、 -S-烷基、-O-CO-烷基、-O-CO-NH-烷基、-NH-CO-烷基、-NH-CO-NH- 烷基、-S(O)n-烷基、-SO2-NH-烷基、-NH-烷基、-N(烷基)2或-NH2，n代表0、1或2，(其中烷基优选地为C1-3-烷基)，或-MOD；
其中-MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10表示-H或C1-C3-烷基；
G1表示–NHCO-、-CONH-或
Figure BDA0003554407600001861
(其中，如果G1代表–NHCO-或
Figure BDA0003554407600001862
R10不是NH2)；
n是0或1；
o是0或1；且
G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、 -NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任何侧链的烃链可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、 -NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中–MOD基团优选地具有至少一个–COOH基团；
R5为H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8是支链的C1-5-烷基；且
R9是H或F，
其中-L-表示接头且#1表示与抗体连接的键，
其中-L-由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中m为0或1；
§代表与KSP连接的键，
§§代表与抗体连接的键，且
L2
Figure BDA0003554407600001871
其中
#1表示与抗体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
并且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1表示-NHCO-或
Figure BDA0003554407600001872
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和 /或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、 -NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环，-SO-或SO2-(优选
Figure BDA0003554407600001881
)，其中包括侧链的烃链(如果存在的话)可被–NHCONH2、-COOH、-OH、 -NH2,NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
此处，#1是与KSP抑制剂连接的键，#2是连接偶联基团与结合体(例如L2)的键。
实施方案D：
具有下式的抗体缀合物
Figure BDA0003554407600001882
其中
R2和R5代表-H；
R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基团或式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C510-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10- 烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基 -O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代： -NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、 -SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、 Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
R3代表-CH2OH；
R1代表–L1-L2-BINDER，其中
L1代表
Figure BDA0003554407600001891
其中#2代表与L2的连接，#1代表与L1的连接；
并且L2代表下式A5和A6的结构中的一种或两种：
Figure BDA0003554407600001892
其中
#1表示与结合体的硫原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，且
R22代表-COOH、-COOR、-COR、-CONHR(其中R在每种情况下均代表C1-3-烷基)、-CONH2，优选-COOH。
在根据本发明的缀合物中或在根据本发明的缀合物的混合物中，存在与结合体的半胱氨酸残基连接的键，其达到优选超过80％、特别优选超过90％(在每种情况下基于接头与结合体的键的总数)的程度，所述键特别优选地作为式A5或A6的两种结构中的一种。
此处，式A5或A6的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60 的比率，基于与结合体连接的键的数目计。然后，其余键以以下结构存在
Figure BDA0003554407600001901
结合体优选地为结合蛋白或肽，特别优选人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗TWEAKR的抗体或其抗原结合片段或者抗EGFR的抗体或其抗原结合片段。特别优选这样的抗TWEAKR 的抗体，其特异性结合TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位中的氨基酸D(D47)，特别是抗TWEAKR的抗体TPP-2658或抗EGFR的抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。作为结合体的替代物，还可以存在半胱氨酸残基。
实施方案E：
下式的APDC及APDC的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐
Figure BDA0003554407600001902
其中KSP-L-是式(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIh) 或下式(IIi)的化合物，所述结合剂是抗体，并且n是1至10的数字：
式(IIi)：
Figure BDA0003554407600001911
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A是CO(羰基)；
R1是-H或-COOH，
R2是-H；
R4代表式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基团或式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C5-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10- 烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基 -O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代： -NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、-N(烷基)-CO烷基、-SO3H、 -SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、 -CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
R3为–L-#1；
R5为H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选地氟化的)C1-3-烷基、(任选地氟化的)C2-4-烯基、(任选地氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8是支链的C1-5-烷基；且
R9是-H或-F，
其中-L-表示接头且#1表示与抗体连接的键。
其中-L-由下式表示
§-(C＝O)m-L1-L2-§§
其中
m为0或1；
§代表与KSP连接的键，
§§代表与抗体连接的键，且
L2
Figure BDA0003554407600001921
其中
#1表示与抗体的硫原子或氮原子的连接点，
#2表示与基团L1的连接点，
并且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中R10表示-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1表示-NHCO-或
Figure BDA0003554407600001931
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和 /或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、 -NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环、-SO-或-SO2-(优选
Figure BDA0003554407600001932
)，其中包括侧链的烃链(如果存在的话)可被–NHCONH2、-COOH、-OH、 -NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
#1是与KSP抑制剂连接的键，#2是连接偶联基团与结合体(例如L2)的键。
治疗用途
可采用本发明化合物治疗的过度增殖性疾病特别包括癌症和肿瘤疾病。在本发明的上下文中，这些癌症和肿瘤疾病被理解为特别指以下疾病，但不限于此：乳腺癌和乳腺肿瘤(包括导管和小叶形式的乳腺癌，也是原位的)、呼吸道的肿瘤(小细胞癌或非小细胞癌、支气管癌)、脑肿瘤(例如脑干的肿瘤和下丘脑的肿瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤以及神经外胚层和松果体瘤)、消化道器官的肿瘤(食道癌、胃癌、胆囊癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝肿瘤(尤其是肝细胞癌、胆管上皮癌和混合肝细胞胆管上皮癌)、头部和颈部的肿瘤(喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和口腔癌、口腔黑素瘤)、皮肤肿瘤(基底细胞癌、棘细胞癌(spinalioma)、鳞状细胞癌、Kaposi氏肉瘤、恶性黑色素瘤、非黑色素皮肤癌、Merkel细胞皮肤癌、肥大细胞肿瘤)、软组织的肿瘤(尤其是软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤)、眼睛的肿瘤(特别是眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、内分泌腺和外分泌腺的肿瘤(例如甲状腺和甲状旁腺的肿瘤、胰腺和唾液腺癌、腺癌)、泌尿道的肿瘤(膀胱、阴茎、肾脏、肾盂和输尿管的肿瘤)和生殖器官的肿瘤(子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、女性的外阴癌和子宫癌以及男性的前列腺癌和睾丸癌)。这些癌症和肿瘤疾病还包括血液、淋巴系统和脊髓的增殖性疾病，其以固体形式且为循环细胞，例如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，例如急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病，以及AIDS相关淋巴瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、非Hodgkin氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤和中枢神经系统中的淋巴瘤。
这些在人类中被充分特征的疾病也可以在其他哺乳动物中以相似的病因发生，在其他哺乳动物中同样可以用本发明的化合物进行治疗。
用本发明的化合物治疗上述癌症疾病包括治疗实体瘤和治疗实体瘤的转移或循环形式。
在本发明的上下文中，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”以常规意义使用，意指照料、照顾、护理患者，目的是对抗、减轻、减弱或缓解疾病或健康异常，改善由该疾病所损害的生活状态，例如在癌症的情况下。
因此，本发明还提供了本发明化合物用于治疗和/或预防病症，特别是上述病症的用途。
本发明还提供了本发明化合物在制备用于治疗和/或预防病症，特别是上述病症中的用途。
本发明还提供了本发明化合物在治疗和/或预防病症，特别是上述病症的方法中的用途。
本发明还提供了使用有效量的至少一种本发明的化合物治疗和/或预防病症，特别是上述病症的方法。
本发明化合物可以单独使用，或者如果需要的话，与一种或多种其他药理学活性物质组合使用，条件是该组合不会导致不合乎需要的和不可接受的副作用。因此，本发明还提供了药物，其包含至少一种本发明化合物和一种或多种其他药物，特别用于治疗和/或预防上述病症。
例如，本发明化合物可以与已知的抗过度增殖物质、细胞抑制物质或细胞毒性物质组合用于治疗癌症疾病。合适的组合药物的实例包括：
131I-chTNT、阿巴瑞克(abarelix)、阿比特龙(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)-美坦新、阿法替尼(afatinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑珠单抗 (alemtuzumab)、阿仑膦酸(alendronic acid)、阿利维A酸(alitretinoin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、 5-氨基乙酰丙酸已基酯(hexyl 5-aminolevulinate)、氨柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、安西司亭(ancestim)、茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮(anethole dithiolethione)、血管紧张素II (angiotensin II)、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin III)、阿瑞吡坦(aprepitant)、阿西莫单抗(arcitumomab)、阿格拉滨(arglabin)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、天冬酰胺酶(asparaginase)、阿昔替尼(axitinib)、阿扎胞苷 (azacitidine)、贝洛替康(belotecan)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝林司他(belinostat)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米 (bortezomib)、布舍瑞林(buserelin)、波舒替尼(bosutinib)、本妥昔单抗- 维多汀(brentuximab vedotin)、白消安(busulfan)、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡博替尼(cabozantinib)、亚叶酸钙(calcium folinate)、左亚叶酸钙(calcium levofolinate)、卡培他滨(capecitabine)、卡罗单抗(capromab)、卡铂(carboplatin)、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀 (carmustine)、卡妥索单抗(catumaxomab)、塞来考昔(celecoxib)、西莫白介素(celmoleukin)、赛立替尼(ceritinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯地孕酮(chlormadinone)、氮芥(chlormethine)、西多福韦(cidofovir)、西那卡塞(cinacalcet)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺 (cladribine)、氯膦酸(clodronic acid)、氯法拉滨(clofarabine)、库潘里昔布(copanlisib)、克立他酶(crisantaspase)、克里唑替尼(crizotinib)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、达拉菲尼(dabrafenib)、达沙替尼(dasatinib)、柔红霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素2(denileukin-diftitox)、地舒单抗 (denosumab)、地普奥肽(depreotide)、地洛瑞林(deslorelin)、右雷佐生(dexrazoxane)、二溴螺氯铵(dibrospidium chloride)、环氧乳醇 (dianhydrogalactitol)、双氯芬酸(diclofenac)、多西紫杉醇(docetaxel)、多拉司琼(dolasetron)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星+雌酮(doxorubicin+oestrone)、屈大麻酚(dronabinol)、依决洛单抗(edrecolomab)、依利醋铵(elliptinium acetate)、内皮他丁(endostatin)、依诺他滨(enocitabine)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、表柔比星(epirubicin)、环硫雄醇(epitiostanol)、α依伯汀(epoetin-alfa)、β依泊汀(epoetin-beta)、ζ依泊汀(epoetin-zeta)、依他铂(eptaplatin)、艾立布林(eribulin)、埃罗替尼(erlotinib)、艾美拉唑(esomeprazole)、雌氮芥(estramustine)、依托泊甙 (etoposide)、依维莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、法倔唑 (fadrozole)、芬太尼(fentanyl)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟尿苷 (floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺 (flutamide)、叶酸(folic acid)、福美坦(formestane)、福沙匹坦 (fosaprepitant)、福莫司汀(fotemustine)、氟维司群(fulvestrant)、钆布醇(gadobutrol)、钆特醇(gadoteridol)、钆特酸葡甲胺盐(gadoteric acid megluminesalt)、钆弗塞胺(gadoversetamide)、钆塞酸(gadoxetic acid)二钠盐(gd-EOB-DTPA二钠盐)、硝酸镓(gallium nitrate)、加尼瑞克 (ganirelix)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、吉妥珠单抗 (gemtuzumab)、谷卡匹酶(glucarpidase)、氧化型谷胱甘肽(glutoxim)、戈舍瑞林(goserelin)、格拉司琼(granisetron)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor(G-CSF))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor(GM-CSF))、二盐酸组胺(histamine dihydrochloride)、组氨瑞林(histrelin)、羟基脲 (hydroxycarbamide)、I-125种子、伊班膦酸(ibandronic acid)、替伊莫单抗(ibritumomab-tiuxetan)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、咪喹莫特(imiquimod)、英丙舒凡(improsulfan)、吲地司琼(indisetron)、英卡膦酸(incadronic acid)、丁烯英酯(ingenol mebutate)、干扰素-α(interferon-alfa)、干扰素-β(interferon-beta)、干扰素-γ(interferon-gamma)、碘比醇(iobitridol)、碘苄胍(123I)(iobenguane (123I))、碘美普尔(iomeprol)、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊立替康 (irinotecan)、伊曲康唑(itraconazole)、伊沙匹隆(ixabepilone)、兰瑞肽(lanreotide)、兰索拉唑(lansoprazole)、拉帕替尼(lapatinib)、lasocholine、来那度胺(lenalidomide)、香菇多糖(lentinan)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、左旋咪唑(levamisole)、左炔诺孕酮(levonorgestrel)、左甲状腺素钠片(levothyroxin-sodium)、利培非格司亭(lipegfilgrastim)、利舒脲(lisuride)、洛铂(lobaplatin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明 (lonidamine)、马索罗酚(masoprocol)、甲羟孕酮(medroxyprogesteron)、甲地孕酮(megestrol)、美拉胂醇(melarsoprol)、美法仑(melphalan)、美雄烷(mepitiostan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、美沙酮 (methadone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、甲氨基酮戊酸盐(methylaminolevulinate)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、甲睾酮(methyltestosterone)、甲酪氨酸(metirosine)、米法莫肽(mifamurtide)、米替福新(miltefosine)、米铂(miriplatin)、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇(mitolactol)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫加珠单抗(mogamulizumab)、莫拉司亭(molgramostim)、莫哌达醇(mopidamol)、盐酸吗啡(morphine hydrochloride)、硫酸吗啡(morphine sulfate)、大麻隆(nabilone)、 nabiximols、那法瑞林(nafarelin)、纳洛酮+喷他佐辛(naloxone+ pentazocine)、纳曲酮(naltrexone)、那托司亭(nartograstim)、奈达铂 (nedaplatin)、奈拉滨(nelarabine)、奈立膦酸(neridronicacid)、纳武单抗喷曲肽(nivolumab pentetreotide)、尼洛替尼(nilotinib)、尼鲁米特(nilutamide)、尼莫唑(nimorazole)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼莫司汀(nimustine)、硝氨丙吖啶(nitracrine)、纳武单抗(nivolumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥曲肽(octreotide)、奥法木单抗(ofatumumab)、美琥他辛(omacetaxin mepesuccinate)、奥美拉唑(omeprazole)、昂丹司琼 (ondansetron)、奥古蛋白(orgotein)、orilotimod、奥沙利铂(oxaliplatin)、羟可酮(oxycodone)、羟甲烯龙(oxymetholone)、奥佐米星(ozogamicin)、p53基因治疗、紫杉酚(paclitaxel)、钯-103晶种(palladium-103seed)、帕洛诺司琼(palonosetron)、帕米磷酸(pamidronic acid)、帕木单抗 (panitumumab)、泮托拉唑(pantoprazole)、帕唑帕尼(pazopanib)、培门冬酶(pegaspargase)、帕母单抗(pembrolizumab)、培干扰素α-2b (Peg-interferon alfa-2b)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、全氟丁烷(perflubutane)、培磷酰胺(perfosfamide)、培妥珠单抗(pertuzumab)、毕西巴尼(picibanil)、毛果芸香碱(pilocarpine)、吡柔比星(pirarubicin)、匹杉琼(pixantron)、普乐沙福(plerixafor)、普利霉素(plicamycin)、聚氨葡糖(poliglusam)、聚磷酸雌二醇(polyoestradiolphosphate)、聚维酮+玻璃酸钠(polyvinylpyrrolidone+sodium hyaluronate)、多糖-K(polysaccharide-K)、泊马度胺(pomalidomide)、普纳替尼(ponatinib)、卟吩姆钠(porfimer-sodium)、普拉曲沙(pralatrexate)、泼尼氮芥(prednimustine)、泼尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、丙考达唑(procodazole)、普萘洛尔(propranolol)、喹高利特(quinagolide)、雷贝拉唑(rabeprazole)、雷妥莫单抗(racotumomab)、氯化镭 -233(radium-223chloride)、雷多替尼(radotinib)、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷莫司琼(ramosetron)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷莫司汀(ranimustine)、雷莫司汀(rasburicase)、雷佐生(razoxan)、(refametinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、利塞膦酸(risedronic acid)、羟乙磷酸铼-186(rhenium-186etidronate)、利妥昔单抗(rituximab)、罗米地新 (romidepsin)、罗莫肽(romurtid)、罗尼昔利布(roniciclib)、来昔决南钐 (153Sm)(samarium(153Sm)lexidronam)、沙妥莫单抗(satumomab)、胰泌素(secretin)、西普鲁塞-T(sipuleucel-T)、西佐喃(sizofiran)、索布佐生 (sobuzoxane)、甘氨双唑钠(sodium glycididazole)、索拉非尼(sorafenib)、司坦唑醇(stanozolol)、链脲菌素(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、他拉泊芬(talaporfin)、他米巴罗汀(tamibarotene)、他莫昔芬(tamoxifen)、他喷他多(tapentadol)、他索那敏(tasonermin)、替西白介素(teceleukin)、巯诺莫单抗锝(99mTc)(technetium(99mTc)nofetumomab merpentan)、 99mTc-HYNIC-[Tyr3]-奥曲肽(99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotide)、喃氟啶 (tegafur)、喃氟啶+吉美嘧啶+奥替拉西(tegafur+gimeracil+oteracil)、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺(temozolomide)、坦西莫司(temsirolimus)、替尼泊甙(teniposide)、睾酮(testosterone)、替曲膦(tetrofosmin)、沙立度胺(thalidomide)、噻替派(thiotepa)、胸腺法新(thymalfasin)、促甲状腺素α(thyrotropin alfa)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、托珠单抗(tocilizumab)、托泊替坎(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲贝替定(trabectedin)、曲马朵(tramadol)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲奥舒凡(treosulfan)、维A酸(tretinoin)、曲氟尿苷+替吡嘧啶(trifluridine+tipiracil)、曲美替尼(trametinib)、曲洛司坦(trilostane)、曲普瑞林 (triptorelin)、曲磷胺(trofosfamide)、血小板生成素(thrombopoietin)、乌苯美司(ubenimex)、戊柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、伐普肽(vapreotide)、伐他拉尼(vatalanib)、维罗非尼(vemurafenib)、长春碱 (vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春氟宁 (vinflunine)、长春瑞滨(vinorelbine)、维莫德吉(vismodegib)、伏林司他 (vorinostat)、钇-90玻璃微球体(yttrium-90glass microbeads)、净司他丁(zinostatin)、净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)、唑来膦酸(zoledronic acid)、佐柔比星(zorubicin)。
此外，所述抗体可以选自MPS1类抑制剂或针对靶标OX-40、 CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3和CD40的抗体。
另外，本发明化合物还可以与放射疗法和/或外科手术干预组合使用。
通常，以下目标可以通过本发明化合物与其他细胞抑制活性剂或细胞毒性活性剂的组合来实现：
·与使用单独活性成分的治疗相比，在减缓肿瘤生长、减小肿瘤尺寸或甚至完全消除肿瘤方面功效提高；
·以比单一疗法情况下的剂量更低的剂量使用化学疗法药物的可能性；
·与单独给药相比，副作用更少的更可耐受的疗法的可能性；
·治疗更广谱的肿瘤的可能性；
·获得更高的治疗反应率；
·与当前的标准疗法相比，患者的存活时间更长。
此外，本发明化合物还可以与放射疗法和/或外科手术干预组合使用。
本发明还提供了药物，其包含至少一种通常与一种或多种惰性的、无毒的、药学上合适的赋形剂一起的本发明化合物，以及其用于上述目的的用途。
本发明化合物可以全身地和/或局部地起作用。为此目的，它们可以以合适的方式给药，例如肠胃外给药，可能吸入地或作为植入物或支架给药。
本发明化合物可以以适合于这些给药途径的给药形式给药。
肠胃外给药可以绕过吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰内)或者可以包括吸收(例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)。适于胃肠外给药的给药形式包括以溶液剂、悬液剂、乳剂或冻干剂形式的用于注射和输注的制品。优选肠胃外给药，尤其是静脉内给药。
通常，已发现在胃肠外给药的情况下，给药约0.001至1mg/kg体重，优选约0.01至0.5mg/kg体重的量有益于达到有效的结果。
然而，在某些情况下，有必要偏离所述的量，具体地根据体重、给药途径、个体对药物的反应、制品的性质以及进行给药的时间或间隔。因此，在一些情况下，小于上述最小量时可能就足够了，而在其他情况下，必须超过所提到的上限。在给药更大量的情况下，可以建议在一天中将它们分成几个单独剂量。
本发明提供了包括但不限于以下实施方式：
1.一种结合体或其衍生物与一种或多种药物分子或其一种或多种前药的具有下式的缀合物，以及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体
Figure BDA0003554407600002001
其中
BINDER代表结合体或其衍生物，优选抗体，
L代表接头，
n代表1至50的数字，优选1至20并且更优选2至8，以及
KSP代表纺锤体驱动蛋白抑制剂或其前药，其中-L-KSP具有下式 (IIa)：
Figure BDA0003554407600002002
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表-H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-C(＝O)-NY1Y2或 -CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2、
-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，
Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、NH2、SO3H、-COOH、
-NH-C(＝O)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或
-(C(＝O)-NH-CHY4)1-3COOH，
其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷
基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表–L-#1、-H、-MOD、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6- 烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，
其中Y5代表-H或-CO-CHY6-NH2，
其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表–L-#1、-H、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6- 烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，
其中Y5代表-H或-C(＝O)-CHY6-NH2，
其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
或
R4代表式 R21-(C(＝O))(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)NH2)-C(＝O)-或 R21-(C(＝O))(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-C(＝O)-的基团或式 R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C5-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、 NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2NH2、 -S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团
其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、 -CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2。
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、 Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、 Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸；
或
R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)–CH2-CHR10-或#-CHR10-CH2-，其中R10代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、卤素(尤其是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)、-OH，或
R21-C(＝O)-P3-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-SIG-，
其中SIG代表在C(＝O)-SIG键裂解后释放仲胺的自消性基团；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-或-C(＝N-NH2)-；
R3代表–L-#1、-MOD，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其在每种情况下均可被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(每个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、 1-3个-S-烷基、1-3个-O-C(＝O)-烷基、1-3个-O-C(＝O)-NH-烷基、1-3个 -NH-C(＝O)-烷基、1-3个-NH-C(＝O)-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3 个-S(＝O)2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中n代表0、1或2，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘
其中Y3代表-H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、 -(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH，(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是-F、-Cl、-Br)、-CN、-CF3、 -OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
R6和R7彼此独立地代表-H、氰基、C1-10-烷基、氟代-C1-10-烷基、 C2-10-烯基、氟代-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟代-C2-10-炔基、羟基、-NO2、 NH2、-COOH或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表C1-10-烷基、氟代-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟代-C2-10-烯基、 C2-10-炔基、氟代-C2-10-炔基、C4-10-环烷基、氟代-C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，
其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7 元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–OH、-COOH、-NH2或–L-#1取代；
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中取代基R1、R2、R3、R4和R8中的一个代表或(在R8的情况下)含有–L-#1，
–L代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-G3，
其中R10代表-H或C1-C3-烷基；
G1代表–NH-C(＝O)-、-C(＝O)NH-或
Figure BDA0003554407600002041
(其中如果G1 代表–NH-C(＝O)-或
Figure BDA0003554407600002042
R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；
以及
其中G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、 -S(＝O)-、S(＝O)2、-NRy-、-NRyC(＝O)-、C(＝O)NRy-、-NRyNRy-、 -S(＝O)2NRyNRy-、-C(＝O)NRyNRy-、-C(＝O)-、-CRx＝N-O-，其中Ry代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、 -NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代
其中Rx代表-H、C1-C3-烷基或苯基，
其中在烃基上包括任选地取代的C1-C10-烷基作为侧链(如果存在的话)的烃链可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、 -NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
其中G3代表-H或-COOH；
其中–MOD优选地具有至少一个–COOH基团；
其中满足以下条件(i)至(iii)中的一个或多个：
(i)–L-#1包含式
-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-X)-C(＝O)-的基团，
其中X代表–NH2或–COOH，优选–NH2；
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、 Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、 Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、 Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、 Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
(ii)R4代表式 R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)NH2)-C(＝O)-或R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-C(＝O)-的基团或式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10- 杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、 C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、 -N(烷基)2、-NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2-NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、 -C(＝O)-N(烷基)2或-OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团，其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、 -CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、 Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、 Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、 Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸；
(iii)R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)–CH2-CHR10-或 -CHR10-CH2-，其中吡咯烷环的仲胺基的仲氢原子被 R21-C(＝O)-P3-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-SIG-替代，
其中SIG代表在C(＝O)-SIG键裂解后释放仲胺的自消性基团；并且
其中R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10- 杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、 C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、 -N(烷基)2、-NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2-NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、 -C(＝O)-N(烷基)2或-OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团，
其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、 -CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、 Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、 Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、 Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸。
2.实施方式1的缀合物，其中R4代表式 R21-(C(＝O))(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)NH2)-C(＝O)-的基团。
3.实施方式1或2的缀合物，其中P2选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、 Pro、Ser、Thr和Asn。
4.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中P3选自Pro、Ala、Val、 Leu、Ile、Gly、Ser和Gln。.
5.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中P2为Ala。
6.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中P3为Ala。
7.前述实施方式中一项或多项的缀合物，
其中R21代表-H、C1-5-烷基-、C5-10-芳烷基-、C1-5-烷氧基-、C6-10-芳氧基、C5-10-杂烷基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C5-10-杂烷氧基或C5-10-杂环烷氧基，其每一个均可被以下基团取代：-COOH、-C(＝O)-O 烷基、-C(＝O)O-NH2、-NH2或-N(烷基)2，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团，
其中x为0或1，
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22为–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、
-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)。
8.前述实施方式中一项或多项的缀合物，
其中R4代表–L-#1并且包含式–(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-的基团，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、 Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；并且
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸。
9.实施方式1至7中一项或多项的缀合物，其中所述缀合物为结合体 -前药缀合物，
其中R4代表式 R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-的基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、 -NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2-NH2、 -S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-N(烷基)2或-OH、或-H，或–Ox-(CH2CH2O)v-R22基团，
其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、 -CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、 Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为在每种情况下独立地选自以下的氨基酸：Gly、Pro、 Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、 Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸。
10.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中R1或R3代表–L-#1。
11.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中X1为CH，X2为C且 X3为N。
12.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中R6和R7彼此独立地代表-H、C1-3-烷基或卤素。
13.实施方式12的缀合物，其中R6和R7代表–F。
14.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中R8代表C1-4-烷基，优选叔丁基或环己基。
15.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中R9代表H。
16.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中所述结合体或其衍生物为结合肽或蛋白质或者结合肽或蛋白质的衍生物。
17.实施方式16的缀合物，其中每个药物分子均通过所述接头连接至所述结合肽或蛋白质或其衍生物的不同氨基酸。
18.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中所述缀合物具有平均 1.2至20个药物分子或前药/结合体。
19.实施方式16至18中一项或多项的缀合物，其中所述结合肽或蛋白质代表抗体或所述结合肽或蛋白质的衍生物
Figure BDA0003554407600002091
20.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中所述结合体与癌症靶分子结合。
21.实施方式20的缀合物，其中所述结合体与胞外靶分子结合。
22.实施方式21的缀合物，其中所述结合体在与所述胞外靶分子结合后，被表达所述靶分子的细胞内化并在细胞内加工(优选通过溶酶体)。
23.实施方式16至22中一项或多项的缀合物，其中所述结合肽或蛋白质是人类、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段。
24.实施方式23的缀合物，其中所述结合肽或蛋白质是抗HER2的抗体、抗EGFR的抗体、抗TWEAKR的抗体或其抗原结合片段。
25.实施方式24的缀合物，其中所述抗TWEAKR的抗体特异性结合至TWEAKR(SEQ IDNO:169)的第47位的氨基酸D(D47)，优选抗 TWEAKR的抗体TPP-2090。
26.实施方式24和25中一项或多项所述的缀合物，其中所述抗 TWEAKR的抗体特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的第47位的氨基酸D(D47)，优选抗TWEAKR的抗体TPP-2658。
27.实施方式24的缀合物，其中所述结合肽或蛋白质是抗-EGFR的抗体，且R3代表–L-#1。
28.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中所述接头-L-具有以下基础结构(i)至(iv)中的一种：
(i)–(C＝O)m–SG1-L1-L2-
(ii)–(C＝O)m–L1-SG-L1-L2-
(iii)–(C＝O)m–L1-L2-
(iv)–(C＝O)m–L1-SG-L2
其中m为0或1，SG和SG1代表在体内可裂解的基团，L1彼此独立地代表在体内不可裂解的有机基团，而L2代表连接至所述结合体的偶联基团。
29.实施方式28的缀合物，其中所述在体内可裂解的基团SG为2-8- 寡肽基团，优选地为二肽基团或二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺，而SG1为寡肽基团，优选地为二肽基团。
30.前述实施方式中一项或多项的缀合物
其中所述接头连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基，并具有下式：
§-(C＝O)m-L1-L2-§§
其中
m为0或1；
§代表与药物分子连接的键以及
§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，并且
-L2-代表
Figure BDA0003554407600002101
其中
#1代表与结合体的硫原子的连接点，
#2代表与基团L1的连接点，
L1代表–(NR10)n-(G1)o-G2-，
其中
R10代表-H、-NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NH-C(＝O)-或
Figure BDA0003554407600002102
n为0或1；
o为0或1；以及
G2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和 /或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-SO-、S(＝O)2、-NH-、-C(＝O)-、-NMe-、 -NHNH-、-S(＝O)2NHNH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NHNH- 以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-S(＝O)-或-S(＝O)2-(优选
Figure BDA0003554407600002111
)，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
或代表以下基团之一：
Figure BDA0003554407600002112
其中Rx代表-H、-C1-C3-烷基或苯基。
31.实施方式30的缀合物，其中L2由以下一个或两个式子表示：
Figure BDA0003554407600002113
其中
#1代表与结合体的硫原子的连接点，
#2代表与基团L1的连接点，
R22代表-COOH，并且与结合体的硫原子连接的键在这两种结构之一中的存在的程度大于80％(基于接头与结合体连接的键的总数计)。
32.实施方式30或31中一项或多项的缀合物，其中L1具有下式：
Figure BDA0003554407600002114
Figure BDA0003554407600002121
其中
r为0至8的数字。
33.实施方式30至32中一项或多项的缀合物，其中所述烃链被以下基团之一间断：
Figure BDA0003554407600002122
其中X代表-H或C1-10-烷基，其可任选地被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、 -OH、-NH2、-NH-CN-NH2、砜、亚砜或磺酸取代。
34.实施方式30的缀合物，其中所述接头具有下式：
Figure BDA0003554407600002123
其中
#3代表与药物分子连接的键，
#4代表与结合肽或蛋白质连接的键，
R11代表-NH2；
B代表–[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w为0至20；
x为0至5；
y为0或1；
z为1至5；并且
X4代表–O-、-C(＝O)-NH-、–NH-C(＝O)-或
Figure BDA0003554407600002131
35.实施方式26至30中一项或多项的缀合物，其中所述缀合物满足下式之一：
Figure BDA0003554407600002132
Figure BDA0003554407600002141
Figure BDA0003554407600002151
其中
X1、X2和X3具有与实施方式1中相同的含义，
AK1代表通过结合体的硫原子结合的结合肽或蛋白质；
n代表1至20的数字，并且
L1为具有1至70个碳原子的任选的支链烃基，或者为具有1至100 个碳原子的由亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基组成的直链或支链烃链，其可被一个或多个以下基团间断一次或多次：–O-、-S-、-SO-、 -SO2-、-NH-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-NMe-、-NHNH-、 -S(＝O)2-NHNH-、-C(＝O)-NHNH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-S(＝O)-或-S(＝O)2-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
并且
SG1为2-8-寡肽，优选二肽；
L4代表单键或–(C＝O)y-G4-基团，
其中y代表0或1，并且
其中G4为具有1至100个碳原子的由亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基组成的直链或支链烃链，其可被一个或多个以下基团间断一次或多次：–O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、 -C(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-Nme-、-NHNH-、 -S(＝O)2-NHNH-、-C(＝O)-NHNH-以及具有至多4个选自N、O和 S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-S(＝O)-或-S(＝O)2-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、 -OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代；其中式IIa的位置R4中(即在-NH2基团中)的氢原子可以被式
R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-的豆荚蛋白酶可裂解基团替代，
其中
R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、 C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(＝O)- 烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)v-R22基团
其中x为0或1，
其中v代表1至20的数字，
并且
R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、
-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg 和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg 和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸。
36.结合体或其衍生物与一种或多种药物分子的缀合物，其中所述缀合物具有下式中的一个或两个：
Figure BDA0003554407600002171
其中
AK1或AK1A代表通过结合体的硫原子结合的结合肽或蛋白质；
n代表1至20的数字，并且
L1为具有1至100个碳原子的由亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基组成的直链或支链烃链，其可被一个或多个以下基团间断一次或多次：–O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、 -NMe-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-C(＝O)-NHNH-以及具有至多4个选自 N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-S(＝O)-或-S(＝O)2-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、 -NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
其中式IIa的位置R4中(即在-NH2基团中)的氢原子可以被式 R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-的豆荚蛋白酶可裂解基团替代，
其中
R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、 C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(＝O)- 烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)v-R22基团
其中x为0或1，
其中v代表1至20的数字，
并且
R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、 -CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸。
37.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中所述接头-L-连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基，并具有下式：
Figure BDA0003554407600002191
其中
§代表与药物分子连接的键以及
§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，
m代表0、1、2或3；
n代表0、1或2；
p代表0至20；并且
L3代表基团
Figure BDA0003554407600002192
其中
o为0或1；
并且
G3代表具有1至100个碳原子的由芳基和/或直链和/或支链和/或环状的烷基组成的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-S(＝O)-、S(＝O)2、-NH-、-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-、 -C(＝O)NH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、--NMe-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-C(＝O)-NHNH-、-S(＝O)- 和–S(＝O)2-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、 -OH、-砜、亚砜或磺酸取代。
38.实施方式37的缀合物，其中所述接头-L-连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基，并具有下式：
Figure BDA0003554407600002193
其中
§代表与药物分子连接的键以及
§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，
m为1；
p为0；
n为0；并且
L3代表基团
Figure BDA0003554407600002201
其中
o为0或1；并且
G3代表-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)u CH2CH2O)v(CH2)w-，
其中
s、t、v和w中的每一个均彼此独立地为0至20并且
u为0或1。
39.前述实施方式中任一项所述的缀合物，其中R2或R3表示–L-#1。
40.实施方式39的缀合物，其中所述缀合物具有下式之一：
Figure BDA0003554407600002211
其中
X1、X2和X3具有与实施方式4中相同的含义，
AK1代表通过结合体的硫原子连接的结合肽或蛋白质；
n代表1至20的数字，并且
L1为具有1至100个碳原子的由亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基组成的直链或支链烃链，其可被一个或多个以下基团间断一次或多次：–O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、 -NMe-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-C(＝O)-NHNH-以及具有至多4个选自 N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-S(＝O)-或-S(＝O)2-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、 -NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
L2和L3为具有1至100个碳原子的由亚芳基和/或直链和/或支链和/ 或环状的亚烷基组成的直链或支链烃链，其可被一个或多个以下基团间断一次或多次：–O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-NMe-、-NHNH-、 -S(＝O)2-NHNH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NHNH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-S(＝O)-或 -S(＝O)2-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、 -OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，并且其中所述缀合物满足下列式之一，其中
SG1代表可裂解基团，优选2-8寡肽，更优选二肽，
AK1代表通过半胱氨酸连接的抗体。
41.实施方式1至32中一项或多项的缀合物，其中所述接头-L-连接至赖氨酸侧链，且具有下式：
-§-(SG)x-L4-CO-§§
其中
§代表与药物分子连接的键以及
§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，
x代表0或1，
SG代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽，
并且
L4代表单键或基团–(C＝O)y-G4-，其中
y代表0或1，并且
G4为具有1至100个碳原子的由芳基和/或直链和/或支链和/或环状的烷基组成的直链或支链烃链，其可被一个或多个以下基团间断一次或多次：–O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、 -NMe-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-C(＝O)-NHNH-以及具有至多4个选自 N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、或-S(＝O)-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、 -NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
42.实施方式41的结合肽或蛋白质的缀合物，其中所述缀合物具有下式之一：
Figure BDA0003554407600002231
其中
X1、X2和X3具有与实施方式1中相同的含义，
AK2代表赖氨酸键合的抗体；
n为1至20的数字；
L4为具有1至100个碳原子的由芳基和/或直链和/或支链和/或环状的烷基组成的任选的直链或支链烃链，其可被一个或多个以下基团间断一次或多次：–O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-Nme-、-NHNH-、 -S(＝O)2-NHNH-、-NH-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-C(＝O)-NHNH-以及具有至多 4个选自N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-S(＝O)-或 -S(＝O)2-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、 -OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
并且其中所述缀合物满足下式之一，其中n为1至20的数字，并且式 IIa的位置R4中(即在-NH2基团中)的氢原子可以被式 R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-的豆荚蛋白酶可裂解基团替代，
其中R21代表C1-10-烷基、C510-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、 NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2-NH2、 -S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-N(烷基)2或–OH、或-H，或–Ox-(CH2CH2O)v-R22基团
其中x为0或1，
其中v代表1至20的数字，
并且
R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、
-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸，并且
SG1代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽。
43.实施方式23至42中一项或多项的缀合物，其中所述抗TWEAKR 的抗体是激动性抗体。
44.实施方式23至43中一项或多项的缀合物，其中所述抗TWEAKR 的抗体或其抗原结合片段包含：
可变重链，其包含：
a.由包含式PYPMX(SEQ ID NO:171)的氨基酸序列编码的重链的 CDR1，其中X为I或M；
b.由包含式YISPSGGXTHYADSVKG(SEQ ID NO:172)的氨基酸序列编码的重链的CDR2，其中X为S或K；以及
c.由包含式GGDTYFDYFDY(SEQ ID NO:173)的氨基酸序列编码的重链的CDR3；
以及可变轻链，其包含：
d.由包含式RASQSISXYLN(SEQ ID NO:174)的氨基酸序列编码的轻链的CDR1，其中X为G或S；
e.由包含式XASSLQS(SEQ ID NO:175)的氨基酸序列编码的轻链的CDR2，其中X为Q、A或N；以及
f.由包含式QQSYXXPXIT(SEQ ID NO:176)的氨基酸序列编码的轻链的CDR3，其中第5位处的X为T或S，第6位处的X为T或S并且第8位处的X为G或F。
45.实施方式23至44中一项或多项的缀合物，其中所述抗TWEAKR 的抗体或其抗原结合片段包含：
a.如SEQ ID NO:10所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:9 所示的轻链的可变序列，或
b.如SEQ ID NO:20所示的重链可变序列，以及如SEQ ID NO:19所示的轻链可变序列，或
c.如SEQ ID NO:30所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:29 所示的轻链的可变序列，或
d.如SEQ ID NO:40所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:39 所示的轻链的可变序列，或
e.如SEQ ID NO:50所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:49 所示的轻链的可变序列，或
f.如SEQ ID NO:60所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:59 所示的轻链的可变序列，或
g.如SEQ ID NO:70所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:69 所示的轻链的可变序列，或
h.如SEQ ID NO:80所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:79 所示的轻链的可变序列，或
i.如SEQ ID NO:90所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:89 所示的轻链的可变序列，或
j.如SEQ ID NO:100所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:99 所示的轻链的可变序列，或
k.如SEQ ID NO:110所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:109 所示的轻链的可变序列，或
l.如SEQ ID NO:120所示的重链的可变序列，以及如SEQ ID NO:119 所示的轻链的可变序列。
46.实施方式18至45中一项或多项的缀合物，其中所述抗体是IgG 抗体。
47.实施方式20至46中一项或多项的缀合物，其中所述抗TWEAKR 的抗体包含：
a.如SEQ ID NO:2所示的重链序列，和如SEQ ID NO:1所示的轻链序列，或
b.如SEQ ID NO:12所示的重链序列，和如SEQ ID NO:11所示的轻链序列，或
c.如SEQ ID NO:22所示的重链序列，和如SEQ ID NO:21所示的轻链序列，或
d.如SEQ ID NO:32所示的重链序列，和如SEQ ID NO:31所示的轻链序列，或
e.如SEQ ID NO:42所示的重链序列，和如SEQ ID NO:41所示的轻链序列，或
f.如SEQ ID NO:52所示的重链序列，和如SEQ ID NO:51所示的轻链序列，或
g.如SEQ ID NO:62所示的重链序列，和如SEQ ID NO:61所示的轻链序列，或
h.如SEQ ID NO:72所示的重链序列，和如SEQ ID NO:71所示的轻链序列，或
i.如SEQ ID NO:82所示的重链序列，和如SEQ ID NO:81所示的轻链序列，或
j.如SEQ ID NO:92所示的重链序列，和如SEQ ID NO:91所示的轻链序列，或
k.如SEQ ID NO:102所示的重链序列，和如SEQ ID NO:101所示的轻链序列，或
l.如SEQ ID NO:112所示的重链序列，和如SEQ ID NO:111所示的轻链序列。
48.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其中所述缀合物具有1至 10个、优选2至8个药物分子或前药分子/结合肽或蛋白质。
49.前述实施方式中一项或多项的抗体-前药缀合物，其中所述抗体- 前药缀合物满足下式之一：
Figure BDA0003554407600002271
Figure BDA0003554407600002281
Figure BDA0003554407600002291
Figure BDA0003554407600002301
Figure BDA0003554407600002311
Figure BDA0003554407600002321
Figure BDA0003554407600002331
Figure BDA0003554407600002341
Figure BDA0003554407600002351
Figure BDA0003554407600002361
Figure BDA0003554407600002371
Figure BDA0003554407600002381
Figure BDA0003554407600002391
Figure BDA0003554407600002401
Figure BDA0003554407600002411
Figure BDA0003554407600002421
Figure BDA0003554407600002431
Figure BDA0003554407600002441
Figure BDA0003554407600002451
Figure BDA0003554407600002461
Figure BDA0003554407600002471
Figure BDA0003554407600002481
Figure BDA0003554407600002491
Figure BDA0003554407600002501
Figure BDA0003554407600002511
Figure BDA0003554407600002521
Figure BDA0003554407600002531
Figure BDA0003554407600002541
Figure BDA0003554407600002551
Figure BDA0003554407600002561
Figure BDA0003554407600002571
其中n为1至20的数字，
AK1代表半胱氨酸键合的抗体，
AK2代表赖氨酸键合的抗体，并且式IIa的位置R4中(即在-NH2基团中)的氢原子可以被式R21-(C＝O)-(P3)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)- 或组织蛋白酶可裂解基团替代，
其中
R21代表C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、C1-10-烷氧基、C6-10- 芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10- 芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代： -NH2、-SO3H、-COOH、-SH或–OH，
P2为单键或选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、 Glu、Lys、Arg和His；
P3为单键或选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、 Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、 Glu、Lys、Arg和His。
50.实施方式1至48中一项或多项的抗体-前药缀合物，其中所述抗体-前药缀合物满足下式之一：
Figure BDA0003554407600002581
Figure BDA0003554407600002591
Figure BDA0003554407600002601
Figure BDA0003554407600002611
Figure BDA0003554407600002621
Figure BDA0003554407600002631
Figure BDA0003554407600002641
Figure BDA0003554407600002651
Figure BDA0003554407600002661
Figure BDA0003554407600002671
Figure BDA0003554407600002681
Figure BDA0003554407600002691
Figure BDA0003554407600002701
Figure BDA0003554407600002711
Figure BDA0003554407600002721
Figure BDA0003554407600002731
Figure BDA0003554407600002741
Figure BDA0003554407600002751
Figure BDA0003554407600002761
Figure BDA0003554407600002771
Figure BDA0003554407600002781
Figure BDA0003554407600002791
Figure BDA0003554407600002801
Figure BDA0003554407600002811
其中
n为1至20的数字，
AK1为半胱氨酸键合的抗体；并且
AK2为赖氨酸键合的抗体；
AK3为谷氨酰胺键合的抗体。
51.实施方式1至50中一项或多项的抗体-前药缀合物，其中：
n为1至20的数字，
AK1代表半胱氨酸键合的抗体，并且
AK2代表赖氨酸键合的抗体，
如果所述抗体-前药缀合物具有基团
Figure BDA0003554407600002812
与抗体键合，则其也可以至少部分以与所述抗体连接的水解开链琥珀酰胺的形式来代替该基团而存在。
52.药物组合物，其包含前述实施方式中一项或多项的缀合物与惰性无毒的药学上合适的辅助剂的组合。
53.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其用于治疗和/或预防疾病的方法。
54.前述实施方式中一项或多项的缀合物，其用于治疗过度增殖性和/ 或血管生成性疾病的方法。
55.具有下式(III)的纺锤体驱动蛋白抑制剂前药，以及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体：
Figure BDA0003554407600002821
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表-H、–MOD或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2、
-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、NH2、SO3H、-COOH、
-NH-C(＝O)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或
-(C(＝O)-NH-CHY4)1-3COOH，
其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6- 烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表-H、-MOD、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被–NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6- 烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，
其中Y5代表-H或-C(＝O)-CHY6-NH2，
其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)- 或式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、 -NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2NH2、 -S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-N(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)v-R22基团
其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、
-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、 Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2-NH-或-C(＝N-NH2)-；
R3代表-MOD，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、 C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(每一个均具有1-3个卤原子)、 1-3个-O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3 个-O-C(＝O)-NH-烷基、1-3个-NH-C(＝O)-烷基、1-3个-NH-C(＝O)-NH- 烷基、1-3个-S(＝O)n-烷基、1-3个-S(＝O)2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、 1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中n代表0、1或2，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘
其中Y3代表-H、-(CH2)0-3-CH(NH-C(＝O)-CH3)Z‘、
-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH，
R5代表-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是-F、-Cl、-Br)、-CN、-CF3、 -OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
R6和R7彼此独立地代表-H、氰基、C1-10-烷基、氟代-C1-10-烷基、 C2-10-烯基、氟代-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟代-C2-10-炔基、羟基、-NO2、 NH2、-COOH或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表C1-10-烷基、氟代-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟代-C2-10-烯基、 C2-10-炔基、氟代-C2-10-炔基、C4-10-环烷基、氟代-C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，
其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7 元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–OH、-CO2H或-NH2取代；
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，
其中
R10代表-H或C1-C3-烷基；
G1代表–NH-C(＝O)-、-C(＝O)NH-或
Figure BDA0003554407600002851
(其中如果G1代表–NH-C(＝O)-或
Figure BDA0003554407600002852
则R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；以及
G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被以下基团相同或不同地间断一次或多于一次：-O-、-S-、 -S(＝O)-、S(＝O)2、-NRy-、-NRyC(＝O)-、C(＝O)NRy-、-NRyNRy-、 -S(＝O)2-NRyNRy-、-C(＝O)-NRyNRy-C(＝O)-、-CRx＝N-O-
其中Rx代表-H、C1-C3-烷基或苯基，
其中Ry代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10- 炔基，其每一个均可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、 -NH2、NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)，其中包括任何侧链的烃链可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、 -NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中–MOD基团优选具有至少一个–COOH基团。
实施例
下面的实施例举例说明本发明。本发明不限于这些实施例。
除非另有说明，下面的试验和实施例中的百分比是重量百分比；份数是重量份数。液体/液体溶液的溶剂比例、稀释比例和浓度数据在每种情况下均是基于体积。
合成路线：
作为工作实施例的示例，以下方案示出了成为工作实施例的示例性合成路线：在这些方案中，式IIa的位置R4中的氢原子(即在-NH2基团中)可以被式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2CONH2)-CO-的基团或式R21-(CO)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团取代，其中P2是选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、 Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3是选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、 Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中R21代表C1-10-烷基，C6-10-芳基或C6-10-芳烷基，C5-10-杂烷基， C1-10-烷基-O-C6-10-芳基，C5-10-杂环烷基，C1-10-烷氧基，C6-10-芳氧基或 C6-10-芳烷氧基，C5-10-杂烷氧基，C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基，C5-10-杂环烷氧基，其可被-NH2、-SO3H、-COOH、-SH或–OH单取代或多取代。
方案1：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600002861
方案2：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600002862
方案3：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600002871
方案4：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600002872
方案5：赖氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600002873
a)三光气，THF，在氩气下
方案6：赖氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600002881
方案7：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002891
[a)：EDCI、HOBT、二异丙基乙胺，RT；b)乙醇、哌啶、甲胺、水， RT；c)HATU、二异丙基乙胺，RT；d)TFA、DCM，RT]
方案8：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002901
[a)：例如EDCI、HOBT、二异丙基乙胺、DMF，RT；b)例如DCM/TFA 20:1，RT；c)例如HATU、二异丙基乙胺、DMF，RT；d)例如TFA、 DCM，RT]
方案9：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002911
[a)：例如2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐、二异丙基乙胺、DCM， RT；b)例如2MLiOH溶液、THF、水，RT，区域异构体(regiosisomer) 的HPLC分离；c)例如EDCI、HOBT、二异丙基乙胺、DMF，RT；d) 例如TFA、DCM，RT]
方案10：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002921
[a)：例如H2、Pd-C、EtOH，RT；b)例如对硝基苄基溴、K2CO3、 DMF；c)例如乙醇、40％浓度的甲胺水溶液，50℃；d)例如连二亚硫酸二钠、THF、水，50℃；e)例如HATU、二异丙基乙胺、DMF，RT；f) 例如哌啶、40％浓度的甲胺水溶液、乙醇，50℃；g)例如二异丙基乙胺、 DMF，RT；h)例如哌啶、DMF，RT；i)TFA、DCM，RT]
方案11：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002931
[a)：例如Et3N、DMF，RT；b)例如H2、Pd-C、EtOH/乙酸乙酯/THF (1:1:1)，RT；c)例如4-甲基吗啉、DMF，RT；d)例如HATU、HOAt、二异丙基乙胺、DMF，RT；e)例如TFA，RT]
方案12：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002941
[a)：例如NaBH(OAc)3、HOAc、二氯甲烷，RT；b)例如氯乙酰氯、 NEt3、DCM，RT；c)例如Cs2CO3、DMF，50℃；d)例如1-(2-氨基乙基)-1H- 吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)、T3P(R)、二异丙基乙胺、MeCN，RT；e) 例如TFA，RT]
方案13：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002951
[a)：例如甲磺酰氯、NEt3、二氯甲烷，0℃；b)例如NaN3、DMF， 40℃；c)例如H2、Pd-C、EtOH/乙酸乙酯(1:1)，RT；d)例如TBAF、 THF，RT；e)例如1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5- 二酮、NEt3、CaCO3、1,4-二噁烷，RT；f)例如N-氯代琥珀酰亚胺、TEMPO、四正丁基氯化铵、氯仿、0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)；g)例如NaBH(OAc)3、HOAc、二氯甲烷，RT；h)例如氯乙酰氯、NEt3、 DCM，RT；i)例如TBAF、THF、水，RT；j)例如4-甲基吗啉、DMF， RT；k)例如TFA，RT；
方案14：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002961
[a)：例如甲醛、Na2CO3、水，RT；b)例如Ac2O、吡啶、THF，RT； c)例如丙二酸二叔丁酯、KOtBu、THF，RT；d)例如LiBH4、THF，RT； e)例如TBDMSCl、咪唑、DCM，RT；f)例如Dess-Martin过碘烷、DCM；g)例如三乙酰氧基硼氢化钠、AcOH、DCM，RT；h)例如nBu4NF、THF， RT；i)例如SOCl2、THF，RT；j)例如AcSK、nBu4NI、DMF，90℃； k)例如NaOH、MeOH、THF，RT；l)例如TCEP、二噁烷，RT；m)例如差向异构体的分离；n)例如6N盐酸、THF，RT o)例如Mal-dPEG(3)-Mal、 PBS缓冲液、ACN，RT]
方案15：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002971
[a)：例如Mal-dPEG(3)-Mal、PBS缓冲液、ACN，RT]
方案16：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002981
[a)：例如BF3OEt2、THF，0℃；b)：例如亚硝酸异戊酯，-10℃， 0.5h；c)：例如2-氯-3-氧代丁酸甲酯、吡啶、水，-5℃；d)：例如NEt3、甲苯，RT；e)：例如Et3SiH、TFA，RT；f)：例如LiBH4、THF，60℃； g)：例如Dess-Martin过碘烷、DCM，RT；h)：例如(R)-(+)-甲基-2-丙基亚磺酰胺、异丙氧钛(IV)、THF，RT；i)：例如叔丁基锂、戊烷、THF， -78℃；j)：例如在二噁烷中的HCl、THF、MeOH，RT；k)：例如3-(1,3- 二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛、NaB(OAc)3H、AcOH、DCM， RT；l)：例如乙酸2-氯-2-氧代乙酯、NEt3、DCM，RT；m)：例如甲胺、水、ETOH，50℃]
方案17：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600002991
[a)：例如N-(叔丁氧羰基)-5-氧代-L-正缬氨酸叔丁酯、NaB(OAc)3H、 AcOH、DCM，RT；b)：例如乙酸2-氯-2-氧代乙酯、NEt3、DCM，RT； c)：例如甲胺、水、EtOH，60℃；d)：例如THF、DCM，50℃；e)：例如Boc2O、NEt3、DCM，RT；f)：例如三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)、HATU、二异丙基乙胺、DMF，RT；f)：例如TFA、 DCM，RT；
方案18：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600002992
方案19：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600003001
方案20：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600003002
方案21：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600003003
方案22：中间体的合成
Figure BDA0003554407600003011
[a)：例如三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM，RT；b)例如乙酰氧基乙酰氯、NEt3、DCM，RT；c)例如LiOH、THF/水，RT；d)例如H2、 Pd-C、EtOH，RT；e)例如Teoc-OSu、NEt3、二噁烷，RT；f)：例如Fmoc-Cl、二异丙基乙胺、二噁烷/水2:1，RT]
方案23：中间体的合成
Figure BDA0003554407600003021
[a)：例如三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM，RT；b)例如乙酰氧基乙酰氯、NEt3、DCM，RT；c)例如LiOH、甲醇，RT；d)例如TFA、 DCM，RT；e)例如Boc2O、二异丙基乙胺、DCM，RT]
方案24：中间体的合成
Figure BDA0003554407600003031
[a)：例如苄基溴、Cs2CO3、DMF，RT；b)例如Pd(dppf)2Cl2、DMF、 Na2CO3，85℃；c)例如LiAlH4、THF，0℃；MnO2、DCM，RT；d)例如Ti(iOPr)4、THF，RT；e)例如tBuLi、THF，-78℃；MeOH、NH4Cl； f)例如HCl/1,4-二噁烷]
方案25：半胱氨酸连接的ADC的合成
Figure BDA0003554407600003032
方案26：通过水解的琥珀酰胺合成半胱氨酸连接的ADC
这种方法特别用于其中L1＝CH2的ADC，以将这些ADC转化成开链连接形式。
Figure BDA0003554407600003041
方案27：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600003042
[a)：三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰氯、二异丙基乙胺、DCM，RT；c)LiOH、MeOH，RT；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)HATU、DMF、二异丙基乙胺，RT； e)氯化锌、三氟乙醇，50℃，EDTA]。
方案28：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600003051
[a)：HATU、DMF、二异丙基乙胺，RT；b)氯化锌、三氟乙醇，50 ℃，EDTA]。
方案29：ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600003052
[a)：三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰氯、三乙胺、DCM，RT；c)LiOH、MeOH，RT；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H- 吡咯-2,5-二酮(1:1)HATU、DMF、二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌、三氟乙醇，50℃，EDTA]。
方案30：用于合成中间体和ADC前体的一般方法
Figure BDA0003554407600003061
[a)：HATU、DMF、N,N-二异丙基乙胺，RT或EDCI、HOBT、N,N- 二异丙基乙胺、DMF，RTb)H2、10％Pd-C、MeOH，RT；c)R21-COOH、 EDCI、HOBT、N,N-二异丙基乙胺、DMF，RT或R21-COOH、HATU、 N,N-二异丙基乙胺、DMF，RT或R21-COOSu、N,N-二异丙基乙胺、DMF， RT]
方案31：具有豆荚蛋白酶可裂解接头的ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600003071
[a)：HATU、DMF、N,N-二异丙基乙胺，RT或EDCI、HOBT、N,N- 二异丙基乙胺、DMF，RTb)H2、10％Pd-C、MeOH，RT；c)1,1'-[(1,5- 二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮、N,N-二异丙基乙胺、 DMF，RT]
方案32：具有豆荚蛋白酶可裂解接头的ADC前体分子的合成
Figure BDA0003554407600003081
[a)：HATU、DMF、N,N-二异丙基乙胺，RT或EDCI、HOBT、N,N- 二异丙基乙胺、DMF，RTb)H2、10％Pd-C、MeOH，RT；c)1,1'-[(1,5- 二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮、N,N-二异丙基乙胺、 DMF，RT]
此外，根据方案32、33和34的其他中间体可以转化成豆荚蛋白酶可裂解的ADC和APDC前体。
作为方案32-34中所示的苄氧基羰基的替代物，可以使用在肽化学中确立的其他保护基，并通过同样已知的相应方法连接它们。保护基策略的选择根据本领域技术人员已知的、关于与分子中存在的其它结构元件的相容性的要求进行。如果它们仍然存在，则分子中的其它保护团可以在最后一步中被移除。
合成也可以任选地按照它们的顺序重排。
方案33：具有豆荚蛋白酶可裂解首基(head group)的半胱氨酸键合的ADC的合成
Figure BDA0003554407600003091
[a)：HATU、DMF、N,N-二异丙基乙胺，RT；b)2-5个当量的TCEP、 PBS pH7.2，在RT下搅拌30min；c)在RT和氩气下搅拌90min，然后通过PD 10柱(
Figure BDA0003554407600003092
G-25，GEHealthcare)重新缓冲至pH 8，并在氩气和RT下搅拌过夜，随后通过超速离心进行浓缩并用PBS(pH 7.2) 设定所需浓度]
方案34：具有豆荚蛋白酶可裂解接头的赖氨酸键合的ADC的合成
Figure BDA0003554407600003101
[a)：HATU、DMF、N,N-二异丙基乙胺，RT；b)H2、10％Pd-C、甲醇1.5h，RT；c)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5- 二酮、N,N-二异丙基乙胺、DMF，在RT下搅拌过夜；d)在PBS中的AK2，加入5个当量的溶于DMSO中的活性酯，在RT和氩气下搅拌60 min，再加入5个当量的溶于DMSO中的活性酯，在RT和氩气下搅拌 60min，然后通过用PBS缓冲液(pH 7.2)(
Figure BDA0003554407600003102
G-25,GE Healthcare)平衡的PD 10柱纯化，随后通过超速离心进行浓缩并用PBS 缓冲液(pH7.2)设定所需浓度]
方案35：具有豆荚蛋白酶可裂解首基(head group)的ADC前体的合成
Figure BDA0003554407600003111
[a)：NaBH(OAc)3、HOAc、二氯甲烷，RT；b)氯乙酰氯、NEt3、 DCM，RT；c)L-半胱氨酸、NaHCO3、DBU、异丙醇/水，50℃；d)HATU、 DMF、二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌、三氟乙醇，50℃；f)d)HATU、 DMF、二异丙基乙胺，RT]
方案36：通过转谷氨酰胺酶偶联进行的ADC合成
Figure BDA0003554407600003112
[a：在DPBS pH 7.4中的5mg AK3(c～10mg/ml)，6个当量的毒性基团-接头前体(例如中间体Q31-Q34)，加入50μl 12.5μl(1.25U) 重组细菌转谷氨酰胺酶的水溶液(100U/ml)和37.5μl DPBS pH 7.4，在37℃下孵育24h]
A.实施例
缩写和首字母缩略词：
A431NS 人肿瘤细胞系
A549 人肿瘤细胞系
ABCB1 ATP-结合盒亚家族B成员1(P-gp和MDR1
的同义词)
abs. 无水的(absolute)
Ac 乙酰基
ACN 乙腈
aq. 含水的、水溶液
ATP 三磷酸腺苷
BCRP 乳腺癌耐药蛋白、外排转运蛋白
BEP 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐
Boc 叔丁氧基羰基
br. 宽(在NMR中)
Ex. 实施例
BxPC3 人肿瘤细胞系
ca. 近于、大约
CI 化学电离(在MS中)
D 双峰(在NMR中)
D 天
TLC 薄层色谱
DCI 直接化学电离(在MS中)
DCM 二氯甲烷
Dd 二个双重峰(在NMR中)
DMAP 4-N,N-二甲氨基吡啶
DME 1,2-二甲氧基乙烷
DMEM Dulbecco改良Eagle培养基(用于细胞培养
的标准化营养培养基)
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DPBS,D-PBS,PBS Dulbecco磷酸盐缓冲盐溶液
PBS＝DPBS＝D-PBS,pH 7.4,来自Sigma,编
号D8537
组成:
0.2g KCl
0.2g KH2PO4(无水)
8.0g NaCl
1.15g Na2HPO4(无水)
用H2O补足至1l
Dt 两个三重峰(在NMR中)
DTT DL-二硫苏糖醇
d.Th. 理论值(在化学产量中)
EDC N'-(3-二甲氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐
EGFR 表皮生长因子受体
EI 电子碰撞电离(在MS中)
ELISA 酶联免疫吸附测定
eq. 当量
ESI 电喷射离子化(在MS中)
ESI-MicroTofq ESI-MicroTofq(Tof＝飞行时间且q＝四级的质
谱仪的名称)
FCS 胎牛血清
Fmoc (9H-芴-9-基甲氧基)羰基
sat. 饱和的
GTP 鸟苷-5'-三磷酸
h 小时
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基
脲鎓六氟磷酸盐
HCT-116 人肿瘤细胞系
HEPES 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸
HOAc 乙酸
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt 1-羟基-1H-苯并三唑水合物
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
HPLC 高压、高效液相色谱
HT29 人肿瘤细胞系
IC50 半最大抑制浓度
i.m. 肌内、给药至肌肉内
i.v. 静脉内、给药至静脉内
conc. 浓缩的
KPL-4 人肿瘤细胞系
KU-19-19 人肿瘤细胞系
LC-MS 液相色谱-偶联的质谱
LLC-PK1 cells Lewis肺癌猪肾细胞系
L-MDR 人MDR1转染的LLC-PK1细胞
LoVo 人肿瘤细胞系
m 多重峰(在NMR中)
Me 甲基
MDR1 多药耐药蛋白1
MeCN 乙腈
min 分钟
MS 质谱法
MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑
鎓溴化物
NCI-H292 人肿瘤细胞系
NCI-H520 人肿瘤细胞系
NMM N-甲基吗啉
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振光谱法
NMRI 源自海军医学研究所(NMRI)的小鼠品系
Nude mice 实验动物
NSCLC 非小细胞肺癌
PBS 磷酸盐缓冲盐溶液
Pd/C 活性炭上的钯
P-gp P-糖蛋白、转运蛋白
PNGaseF 用于裂解糖的酶
quant. 定量(在产量中)
quart 四重峰(在NMR中)
quint 五重峰(在NMR中)
Rf 保留指数(在TLC中)
RT 室温
Rt 保留时间(在HPLC中)
s 单峰(在NMR中)
s.c. 皮下地、给药于皮肤下
SCC-4 人肿瘤细胞系
SCC-9 人肿瘤细胞系
SCID mice 具有重症联合免疫缺陷的测试小鼠
SK-HEP-1 人肿瘤细胞系
t 三重峰(在NMR中)
TBAF 四正丁基氟化铵
TCEP 三(2-羧乙基)膦
TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基
tert 叔
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
Figure BDA0003554407600003151
2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三次磷酸盐
(trioxatriphosphinane)2,4,6-三氧化物
UV 紫外分光法
v/v 体积比(溶液的)
Z 苄基羰基
786-O 人肿瘤细胞系
氨基酸缩写
Ala＝丙氨酸
Arg＝精氨酸
Asn＝天冬酰胺
Asp＝天冬氨酸
Cys＝半胱氨酸
Glu＝谷氨酸
Gln＝谷氨酰胺
Gly＝甘氨酸
His＝组氨酸
Ile＝异亮氨酸
Leu＝亮氨酸
Lys＝赖氨酸
Met＝甲硫氨酸
Nva＝正缬氨酸
Phe＝苯丙氨酸
Pro＝脯氨酸
Ser＝丝氨酸
Thr＝苏氨酸
Trp＝色氨酸
Tyr＝酪氨酸
Val＝缬氨酸
HPLC和LC-MS方法：
方法1(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ50x 1mm；流动相A：1l水+0.25ml 99％浓度的甲酸；流动相B：1l乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→1.2min 5％A→2.0min 5％A；烤箱：50℃；流速：0.40ml/min；UV检测：208-400 nm。
方法2(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，BEH300，2.1x 150mm，C18 1.7μm；流动相A： 1l水+0.01％甲酸；流动相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％B→1.5min 2％B→8.5min 95％B→10.0min 95％B；烤箱：50℃；流速：0.50ml/min；UV检测：220nm
方法3(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)QM；HPLC仪器：Agilent 1100系列；柱：AgilentZORBAX Extend-C18 3.0x 50mm 3.5微米；流动相A： 1l水+0.01mol碳酸铵，流动相B：1l乙腈；梯度：0.0min 98％A→0.2 min 98％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；烤箱：40℃；流速：1.75ml/min； UV检测：210nm
方法4(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，HSST3，2.1x 50mm，C18 1.8μm；流动相A： 1l水+0.01％甲酸；流动相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％B→0.3min 10％B→1.7min 95％B→2.5min 95％B；烤箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：210nm
方法5(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ50x 1mm；流动相A：1l水+0.25ml 99％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 95％A→6.0min 5％A→7.5min 5％A；烤箱：50℃；流速：0.35ml/min；紫外检测：210-400 nm。
方法6(LC-MS)：
仪器：具有Waters UPLC Acquity的Micromass Quattro Premier；色谱柱：ThermoHypersil GOLD 1.9μ50x 1mm；流动相A：1l水+0.5ml 50％浓度的甲酸；流动相B：1l乙腈+0.5ml 50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 97％A→0.5min 97％A→3.2min 5％A→4.0min 5％A烘箱：50 ℃；流速：0.3ml/min；UV检测：210nm。
方法7(LC-MS)：
仪器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；柱：Waters Acquity UPLCHSS T3 1.8μ50x 2.1mm；流动相A：1l水+0.25ml 99％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→0.3min 90％A→1.7min 5％A→3.0min 5％A烘箱：50℃；流速： 1.20ml/min；UV检测：205-305nm。
方法8(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，HSST3，2.1x 50mm，C18 1.8μm；流动相A： 1l水+0.01％甲酸；流动相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％B→2.0min 2％B→13.0min 90％B→15.0min 90％B；烤箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：210nm
方法9：用于实施例181-191的LC-MS-预纯化方法(方法 LIND-LC-MS-预)
MS仪器：Waters；HPLC仪器：Waters(柱Waters X-Bridge C18， 19mm x 50mm，5μm，流动相A：水+0.05％氨，流动相B：具有梯度的乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV检测：DAD；210-400nm)。
或
MS仪器：Waters；HPLC仪器：Waters(柱Phenomenex Luna 5μ C18(2)100A，AXIATech.50x 21.2mm，流动相A：水+0.05％甲酸，流动相B：具有梯度的乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV检测：DAD； 210-400nm)。
方法10：用于实施例181-191的LC-MS分析方法 (LIND_SQD_SB_AQ)
MS仪器：Waters SQD；HPLC仪器：Waters UPLC；柱：Zorbax SB-Aq (Agilent)，50mmx 2.1mm，1.8μm；流动相A：水+0.025％甲酸，流动相B：乙腈(ULC)+0.025％甲酸；梯度：0.0min 98％A-0.9min 25％A-1.0min 5％A-1.4min 5％A-1.41min 98％A-1.5min 98％A；烤箱： 40℃；流速：0.600ml/min；UV检测：DAD；210nm。
方法11(HPLC)：
仪器：HP1100系列
柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e，50-4.6mm，目录号 1.51450.0001，预柱Chromolith Guard Cartridge Kit，RP-18e， 5-4.6mm，目录号1.51470.0001
梯度：流速5ml/min
进样体积5μl
溶剂A：HClO4(70％浓度)的水溶液(4ml/l)
溶剂B：乙腈
开始20％B
0.50min 20％B
3.00min 90％B
3.50min 90％B
3.51min 20％B
4.00min 20％B
柱温度：40℃
波长：210nm
方法12(LC-MS)：
MS仪器类型：Thermo Scientific FT-MS；仪器类型UHPLC+：Thermo ScientificUltiMate 3000；柱：Waters，HSST3，2.1x 75mm，C18 1.8μm；流动相A：1l水+0.01％甲酸；流动相B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度： 0.0min 10％B→2.5min 95％B→3.5min 95％B；烤箱：50℃；流速：0.90 ml/min；UV检测：210nm/最佳积分路径210-300nm
方法13：(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)Quattro Micro；仪器Waters UPLC Acquity；柱：Waters BEH C18 1.7μ50x 2.1mm；流动相A：1l水+0.01 mol甲酸铵，流动相B：1l乙腈；梯度：0.0min 95％A→0.1min 95％A→2.0 min 15％A→2.5min 15％A→2.51min 10％A→3.0min 10％A；烤箱：40 ℃；流速：0.5ml/min；UV检测：210nm。
其制备未在下文中明确描述的所有反应物或试剂都是从通常可获得的来源商购的。对于其制备同样未在下文中描述且不能商购或者从通常不可获得的来源获得的所有其他反应物或试剂，可参考其中记载了它们的制备的公开文献。
方法14：(LC-MS)(MCW-LTQ-POROSHELL-TFA98-10 min)
MS仪器类型：ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL；HPLC仪器类型：Agilent 1200SL；柱：Agilent，POROSHELL 120，3x 150mm， SB-C18 2.7μm；洗脱液A：1l水+0.1％三氟乙酸；流动相B：1l乙腈+ 0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min 2％B→0.3min 2％B→5.0min 95％B→10.0 min 95％B；烤箱：40℃；流速：0.75ml/min；UV检测：210nm
起始化合物和中间体：
中间体C1
三氟乙酸-(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)
Figure BDA0003554407600003201
标题化合物如WO 2006/002326中所述制备。
中间体C2
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003211
将4.22g(14.5mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶于 180ml二氯甲烷中，然后加入3.5ml吡啶和9.2g(21.7mmol)1,1,1- 三乙酰氧基-1λ5,2-苯并二噁茂-3(1H)-酮。将反应在RT下搅拌1h，然后用500ml二氯甲烷稀释，用10％浓度硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后用5％浓度柠檬酸连续萃取两次并用10％浓度碳酸氢钠溶液萃取两次。分离有机相，用硫酸镁干燥，然后减压干燥。将残余物溶于乙醚中，并加入HCl(乙醚溶液)。滤出沉淀，然后将滤液浓缩并从乙腈/水中冻干。得到3.7g(93％)(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，其不经进一步纯化可用于下一步骤。(Rf：0.5(DCM/甲醇95/5)。
将3.5g(9.85mmol)中间体C1溶于160ml DCM中，加入3.13g (14.77mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.7ml乙酸，在RT下搅拌5min 后，加入3.23g(11.85mmol)(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，并将反应在RT下再搅拌30min。然后将溶剂减压蒸发，将残余物溶于乙腈/水中，滤出沉淀的固体并干燥，得到5.46g(84％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.5min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝613(M+H)+。
中间体C3
(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸
Figure BDA0003554407600003221
将5.46g(8.24mmol)中间体C2溶于160ml DCM中，加入4.8ml 三乙胺和2.2ml(20.6mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在RT下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取三次。有机相用硫酸钠干燥，然后浓缩。残余物通过在Biotage/Isolera(SNAP 340g)上进行的柱色谱法使用流动相环己烷/乙酸乙酯2:1进行纯化。得到4.57g(75％)酰化的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝713(M+H)+。
将1g(1.36mmol)该中间体溶于20ml DCM中，加入20ml TFA。在RT下搅拌5h后，浓缩混合物，并将残余物用正戊烷研磨两次。在每种情况下，将正戊烷倾析出，并将剩余的固体在高真空下干燥。得到 1.1g(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸/三氟乙酸(1:1)。LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝557(M+H)+。
将0.91g(1.57mmol)该中间体溶于70ml DCM中，加入3.43g (15.7mmol)二碳酸二叔丁酯和4.1ml的N,N-二异丙基乙胺。在RT 下搅拌30min后，将反应用DCM稀释并用5％浓度的柠檬酸萃取。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。将残余物用正戊烷研磨两次，在每种情况下均将正戊烷倾析出。
HPLC(方法11):Rt＝2.55min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.3min；MS(ESIpos):m/z＝657(M+H)+。
中间体C4
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600003231
将5.46g(8.24mmol)中间体C2溶于160ml DCM中，加入4.8ml 三乙胺和2.2ml(20.6mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在RT下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取三次。有机相用硫酸钠干燥，然后浓缩。残余物通过在Biotage/Isolera(SNAP 340g)上进行的柱色谱法使用流动相环己烷/乙酸乙酯2:1进行纯化。得到4.57g(75％)酰化的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝713(M+H)+。
将1.5g(2.035mmol)该中间体溶于50ml乙醇中，加入5.8ml 40％浓度的甲胺水溶液。将反应在50℃下搅拌4h，然后浓缩。将残余物溶于DCM中并用水洗涤两次。有机相用硫酸镁干燥，然后浓缩。将残余物在高真空下干燥。得到1.235mg该中间体，其不经进一步纯化即进一步反应。
将1.235mg(1.5mmol)该中间体溶于15ml DCM中，并加入15ml TFA。在RT下搅拌4h后，浓缩混合物。残余物经制备型HPLC纯化。适当的级分被浓缩，残余物从乙腈中冻干。得到1.04g(定量)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝515(M+H)+。
中间体C5
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸
Figure BDA0003554407600003241
将0.9g(1.24mmol)中间体C4溶于60ml DCM中，加入2.7g(12.5 mmol)二碳酸二叔丁酯和3.3ml N,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌45min 后，浓缩反应物，将残余物溶于乙醚中，加入正戊烷直至混合物开始变混浊。将反应冷却至0℃，然后倾析。再次，将正戊烷加入到残余物中并倾析混合物。将残留的固体从乙腈/水1:1中冻干，得到0.95g(定量) 的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.5min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.27min；MS(ESIpos):m/z＝615(M+H)+。
中间体C6
三氟乙酸/{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-肼基-1-氧代丁烷-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)
Figure BDA0003554407600003242
将150mg(0.16mmol)中间体C3溶于21ml DMF中，然后加入37.2 mg(0.19mmol)N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、37mg(0.243mmol)1-羟基苯并三唑、85μl N,N-二异丙基乙胺以及最后的45mg(0.18mmol)可商购的9H-芴-9-基肼基羧酸甲酯。将混合物在RT下搅拌过夜，然后减压浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。适当的级分被浓缩，残余物从乙腈/水中冻干。得到60mg(理论的41％)受保护的中间体。
HPLC(方法11):Rt＝2.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.47min；MS(ESIpos):m/z＝893(M+H)+。
将60mg(0.067mmol)该中间体溶于19ml乙醇中，加入681μl哌啶和386μl 40％浓度的甲胺水溶液。将反应在50℃下搅拌18h，然后浓缩。将残余物溶于乙腈/水2:1中并用TFA调节至pH 2。然后将混合物再次浓缩并将残余物通过制备型HPLC进行纯化。适当的级分被浓缩，残余物从乙腈/水中冻干。得到25mg(理论值的51％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.27min；MS(ESIpos):m/z＝629(M+H)+。
中间体C7
1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}肼基)乙酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600003251
将0.2g(0.305mmol)中间体C3溶于80ml DCM中，加入0.125g (0.46mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)、94mg(0.61mmol) 可商购的乙基肼基乙酯盐酸盐和159μl N,N-二异丙基乙胺，然后将混合物在RT下搅拌1h。然后将乙酸乙酯和水加入到反应混合物中，分离各相。有机相用饱和氯化钠溶液萃取，然后用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物减压干燥，不经纯化而进一步反应。为此目的，将其溶于20ml 四氢呋喃中，加入10ml水和3.2ml2N氢氧化锂溶液。将反应在RT下搅拌1h，然后使用TFA将pH调节至7。然后将反应物浓缩，并将残余物经制备型HPLC纯化。以这种方式，将标题化合物从其较早洗脱的区域异构体中分离出来。合并相应级分、冻干并干燥得到19.7g(2步的理论值的8％)的标题化合物，其为无色泡沫。
HPLC(方法11):Rt＝2.4min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.22min；MS(ESIpos):m/z＝687(M+H)+。
在受保护的中间体阶段通过NMR光谱法分离区域异构体之后，区域异构体的结构指定在单独的实验中进行。标题化合物的受保护的 (1-{(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧羰基)氨基]丁酰基}肼基)乙酸乙酯中间体具有以下1H NMR光谱：
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝7.8(m,2H),7.4-7.2(m,6H), 7.08(m,1H),6.73(d,1H),5.6(s,1H),5.25and 4,89(2d,2H),4.89and
4.77(2d,2H),4.62(t,1H),4.32and 3.78(2d,2H),4.1(t,2H),3.62-3.47 (m),2.13(s,3H),1.41and 0.72(2m,2H),1.3(s,9H),1.18(t,3H),0.92(s, 9H).
中间体C8
N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸
Figure BDA0003554407600003261
将293mg(0.41mmol)中间体C3溶于25ml DMF中，然后加入 144mg(0.75mmol)N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、128mg(0.83mmol)1-羟基苯并三唑、218μl N,N-二异丙基乙胺和最后的70mg(0.5mmol)可商购的3-甲氧基-3-氧代丙烷-1-氯化铵。将反应在RT下搅拌4h，然后减压浓缩。残余物经制备型HPLC 纯化。将适当的级分浓缩并将残余物在高真空下干燥。这得到177mg (理论值的53％)的受保护的中间体。
HPLC(方法11):Rt＝2.6min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝742(M+H)+。
将177mg(0.22mmol)该中间体溶于20ml甲醇中，并加入2.8ml 2N氢氧化锂溶液。将反应在RT下搅拌18h。然后浓缩混合物，将残余物溶于水中，并使用5％浓度的柠檬酸将溶液调节至pH 5。然后将混合物用DCM萃取两次，有机相用硫酸镁干燥并浓缩。残余物最终从乙腈/ 水中冻干，得到133mg(理论值的81％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.3min；
LC-MS(方法3):Rt＝7.4min；MS(ESIpos):m/z＝686(M+H)+。
中间体C9
(6S)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-4,7-二氧代-3,11,14,17-四氧杂-5,8-二氮杂二十烷-20-酸
Figure BDA0003554407600003271
在第一步中，在存在44mg(0.228mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐、35mg(0.228mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和60μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将70mg(0.114mmol)中间体 C5与32mg(0.114mmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁基酯在15ml DMF溶液中偶联。将反应在RT下搅拌过夜，产物通过制备型HPLC纯化。得到33mg(理论值的33％)的受保护的中间体。将其与1.1ml三氟乙酸在11ml二氯甲烷中搅拌1h，在后处理后，得到26mg(98％)的完全脱保护的化合物。
最后，将中间体溶于2ml DCM中，叔丁氧羰基保护基是通过两次加入(在每种情况下)10mg二碳酸二叔丁酯和79μl N,N-二异丙基乙胺，同时在RT下搅拌3天来引入。通过制备型HPLC纯化产物，得到 16.4mg(理论值的66％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.3min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.22min；MS(ESIpos):m/z＝818(M+H)+。
中间体C10
{3-[{(1R)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003281
标题化合物是由中间体C1经6个步骤制备：在第一步中，将1g (2.77mmol)中间体C1和0.864g(5mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯在100ml甲醇中合并，加入400ml乙酸和1.288g(13.9mmol)硼烷-吡啶复合体。将反应在RT下搅拌3天。然后将混合物减压浓缩并将残余物通过在硅胶上进行的快速色谱法(流动相：二氯甲烷/乙酸乙酯 9:1→二氯甲烷/甲醇95:5)纯化。浓缩适当的级分并在高真空下干燥，得到1.255g(理论值的80％)N-烷基化的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.0min；MS(ESIpos):m/z＝513(M+H)+。
将1.255g(2.2mmol)该中间体溶于50ml DCM中，然后加入1.2 ml三乙胺和0.52ml(4.85mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在RT下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取三次。将有机相用硫酸钠干燥，然后浓缩。残余物是通过制备型HPLC纯化，得到593mg(理论值的41％)酰化的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.4min；MS(ESIpos):m/z＝613(M+H)+。
将993mg(0.91mmol)该中间体溶于100ml乙醇中，加入60mg 10％的活性炭上的钯后，在RT和标准氢气压力下氢化3min。然后滤去催化剂，减压移除溶剂。得到494mg(理论值的91％)脱苄基化的咪唑衍生物，其为几乎无色的油状物。LC-MS(方法1):Rt＝1.17min；MS(ESIpos):m/z＝523(M+H)+。
将150mg(0.25mmol)该中间体初始加入到15ml DMF中，并加入69.2mg(0.5mmol)碳酸钾。在RT下搅拌15min后，加入60mg (0.28mmol)对硝基苄基溴，并将混合物搅拌过夜。然后减压移除溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液萃取。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，在旋转蒸发器上浓缩并通过制备型HPLC纯化。将适当的级分在旋转蒸发器上浓缩并将残余物从1,4-二噁烷中冻干。得到 169mg(定量)的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝658(M+H)+。
将165mg(0.251mmol)该中间体溶于30ml乙醇中，加入0.35ml 40％浓度的甲胺水溶液。将反应在50℃下搅拌5h，然后再次加入相同量的甲胺溶液。搅拌10h后，减压浓缩反应物。将馏出物用乙醚再蒸馏两次，然后将残余物从乙腈/水中冻干。得到148mg(理论值的89％) 该中间体。
LC-MS(方法6):Rt＝2.97min；MS(ESIpos):m/z＝616(M+H)+。
将98mg(0.15mmol)前体溶于15ml THF中，然后在RT下加入 569mg(3.27mmol)连二亚硫酸二钠在6ml水中的溶液。在50℃下搅拌8h后，再次加入等量的溶于1ml水中的连二亚硫酸盐。在50℃下再搅拌16h后，将反应冷却至RT，并用乙酸乙酯萃取。将有机相浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。从1,4-二噁烷中冻干残余物，得到 44.5mg(理论值的47％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝586(M+H)+。
中间体C11
R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-高半胱氨酸/三氟乙酸酯(1:1)
Figure BDA0003554407600003301
首先将990.0mg(2.79mmol)的(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺加入15.0ml二氯甲烷中，加入 828.8mg(3.91mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和129.9mg(3.21mmol) 乙酸，并将混合物在RT下搅拌5min。加入698.1mg(3.21mmol)溶于15.0ml二氯甲烷中的(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体L58)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，并且将有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤 (在每种情况下)两次。将有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇100:2)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到1.25g(理论值的73％)的化合物 [3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝556(M+H)+。
向400.0mg(0.65mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯中加入151.4mg(1.5mmol)三乙胺和161.6mg(1.43mmol)氯乙酰氯。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，并且将有机相用水洗涤三次，用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱分离(流动相：环己烷/ 乙酸乙酯＝3:1)。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到254.4mg (理论值的57％)的化合物{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIneg):m/z＝676 (M+HCOO-)-。
将117.4mg(0.19mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶于10.0ml异丙醇中，加入928.4μl 1M NaOH和50.2mg (0.37mmol)DL-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌4.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，并且将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)纯化残余物。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到 75.3mg(理论值的48％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝731(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.40(m,1H), 0.75-0.91(m,11H),1.30(m,1H),1.99-2.23(m,2H),2.63-2.88(m,4H), 3.18-3.61(m,5H),3.79-4.10(m,3H),4.89(d,1H),4.89(d,1H),5.16(d, 1H),5.56(s,1H),6.82(m,1H),6.91(s,1H),6.97(m,1H),7.13-7.38(m, 6H),7.49(s,1H),7.63(m,1H),8.26(s,3H).
中间体C12
R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸
Figure BDA0003554407600003321
以与中间体C11的合成类似的方式进行合成，使用(2S)-4-氧代 -2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(中间体L57)和中间体C52作为起始物质。
LC-MS(方法1):Rt＝1.18min；MS(ESIpos):m/z＝775(M+H)+。
中间体C13
9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)]-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸
Figure BDA0003554407600003322
将90.0mg(0.15mmol)中间体C16和43.6(0.23mmol)6-(乙酰基硫烷基)己酸溶于9.0ml甲醇中，加入一滴水和73.9mg(0.54mmol) 碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌4h，然后用乙酸乙酯稀释。有机相用水/饱和的NaCl溶液和饱和的NaCl溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶上色谱分离(流动相：二氯甲烷/ 甲醇＝100:2)。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到理论值的 83％的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝701(M+H)+。
中间体C14
R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]高半胱氨酸
Figure BDA0003554407600003331
首先将100.0mg(0.17mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体C16)加入4.0ml异丙醇中，并加入276.5mg(0.85mmol) 1M NaOH溶液和45.9mg(0.34mmol)D/L-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌1h。反应混合物用乙酸乙酯稀释。有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水)纯化残余物。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。
得到92.6mg(理论值的66％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝688(M+H)+。
中间体C15
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003341
将750.0mg(2.11mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C1) 溶于15.0ml二氯甲烷中，加入626.0mg(2.95mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和139μl(2.43mmol)HOAc，并将混合物在RT下搅拌5min。然后加入420.3mg(2.43mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(根据文献方法J.Med.Chem.2003,46,3536的合成)，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入乙酸乙酯，反应混合物用饱和碳酸钠溶液萃取两次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶上色谱分离(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝4:1)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到881.0mg(理论值的82％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝513[M+H]+。
中间体C16
{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003351
首先将373.4mg(0.73mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体 C15)加入到5.0ml二氯甲烷中，并加入169.5mg(1.68mmol)三乙胺和181.0mg(1.60mmol)氯乙酰氯。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯，并将混合物用水反复萃取。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶上色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:0.5)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到336.0mg(理论值的75％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝589[M+H]+。
中间体C17
9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸
Figure BDA0003554407600003361
首先将50.0mg(0.09mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体C16)加入2.0ml DMF中，并加入69.1mg(0.21mmol) 碳酸铯和28.8mg(0.10mmol)1-硫烷基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸。将混合物在50℃下搅拌过夜。加入水并将反应混合物直接通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到25.1mg(理论值的35％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.42min；MS(ESIpos):m/z＝835[M+H]+。
中间体C18
[22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十五烷-25-基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003371
首先将21.0mg(0.03mmol)9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸(中间体C17)和5.8mg(0.0.3 mmol)1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到1.0ml乙腈中，加入26.1mg(0.20mmol)N,N-二异丙基乙胺和20.9mg(0.03 mmol)T3P(50％乙酸乙酯溶液)。将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到19.7mg(理论值的79％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.42min；MS(ESIpos):m/z＝835[M+H]+。
中间体C19
(13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7,13-二氮杂-2-硅杂十六烷 -16-基)氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003381
首先将58.5mg(0.10mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体C16)加入到2.0mlDMF中，并加入44.0mg(0.20mmol) (2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体L39)和64.7 mg(0.20mmol)碳酸铯。将混合物在50℃下搅拌4h。用46.6mg(0.079 mmol)中间体C16重复该反应。将两种反应混合物合并，并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到98.0mg (理论值的71％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.62min；MS(ESIpos):m/z＝774[M+H]+。
中间体C20
三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003391
首先将98.0mg(0.13mmol)(13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10- 硫杂-7,13-二氮杂-2-硅杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体C19) 加入2.0ml DMF/叔丁醇(9:1)中，并加入96.2mg(0.63mmol)CsF。将混合物在90℃下搅拌16h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA) 纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物冻干。得到57.1mg(理论值的61％) 的标题化合物。该化合物还包含相应的亚砜。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝630[M+H]+。
中间体C21
[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧代 -7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基] 氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003401
首先将57.1mg(0.08mmol)三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基] 乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(中间体C20)加入到3.0ml DMF中，加入53.0mg(0.08mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24- 八氧杂-二十七烷-1-基}丙酰胺和15.5mg(0.15mmol)加入三乙胺。将混合物在RT下搅拌16h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物冻干。得到49.7mg(理论值的49％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1204[M+H]+。
中间体C22
[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-35-氧代-3,31,37-三氧代 -7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35λ4-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41- 基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003411
标题化合物在中间体C21的合成中作为副产物形成。得到15.5mg (理论值的15％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.25min；MS(ESIpos):m/z＝1220[M+H]+。
中间体C23
3-氨基-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
立体异构体的混合物
Figure BDA0003554407600003412
首先将411.2mg(1.15mmol)3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体C28)和339.7mg(0.96 mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C1)加入到6.0ml二氯甲烷中，并加入68.9mg(1.15mmol)HOAc，将混合物在RT下搅拌1h。加入405.2mg(1.91mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在RT下搅拌2h。减压蒸发溶剂，并且向残余物中加入乙酸乙酯和水。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，柱50g SNAP，流速40ml/min，石油醚/乙酸乙酯)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到541.5mg(理论值的81％)化合物 3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24和1.29min；MS(ESIpos):m/z＝698 [M+H]+。
将541.5mg(0.78mmol)3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基] 羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于13.0ml二氯甲烷中，并加入180.6 mg(1.78mmol)三乙胺。将反应溶液冷却至0℃，加入233.1mg(1.71 mmol)乙酰氧基乙酰氯，将混合物在RT下搅拌16h。再加入180.6mg (1.78mmol)三乙胺和233.1mg(1.71mmol)乙酰氧基乙酰氯，将混合物在RT下再搅拌80h。减压蒸发溶剂，并且将残余物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，柱50g SNAP，流速40ml/min，石油醚/乙酸乙酯)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到529.2mg(理论值的86％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53和1.56min；MS(ESIpos):m/z＝798 [M+H]+。
首先将529.2mg(0.66mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入10.0ml DMF/叔丁醇(9:1)中，并加入503.7mg(3.32mmol)CsF。将反应混合物在90℃下搅拌16h。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物使用Biotage Isolera (硅胶，柱50g SNAP，流速25ml/min，二氯甲烷/甲醇)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到172.4mg(理论值的40％) 化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑 -2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.05和1.35min；MS(ESIpos):m/z＝654 [M+H]+。
首先将172.4mg(0.26mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入4.5ml甲醇/水(2:1)中，加入80.2mg(0.58 mmol)碳酸钾，将混合物在RT下搅拌16h。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到116.0mg (理论值的72％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min和1.03min；MS(ESIpos):m/z＝612 [M+H]+。
中间体C24
三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯 (1:1)
Figure BDA0003554407600003441
将26.8mg N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C1)溶于3.0ml二氯甲烷中，加入5.2mg(0.09mmol)HOAc和22.4mg(0.11mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在RT下搅拌5min。加入62.4mg(0.09 mmol)3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体L29)，并将混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到57.6mg(理论值的91％)化合物三氟乙酸/3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.25和1.27min；MS(ESIpos):m/z＝712 [M+H]+。
首先将77.0mg(0.11mmol)3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入1.5ml二氯甲烷中，并加入21.9mg(0.22mmol)三乙胺。然后在0℃下，加入29.5mg(0.22 mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物溶于乙酸乙酯中。将有机相用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂。用77.0mg(0.11mmol)3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯重复所述反应。将合并的残余物在硅胶上纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝2:1)。得到171.1mg (理论值的85％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.56和1.57min；MS(ESIpos):m/z＝812 [M+H]+。
首先将30.0mg(0.04mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入0.5ml TBAF溶液(1M的THF溶液)中。将混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到25.0mg(理论值的92％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝626[M+H]+。
中间体C25
4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-羧酸
Figure BDA0003554407600003461
首先将171.4mg(0.48mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C1)加入4.0ml二氯甲烷中，加入248.5mg(0.72mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体 L30)和34.8mg(0.58mmol)HOAc。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入204.4mg(0.97mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在RT下搅拌60h。减压移除溶剂，并且将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，流速25ml/min，石油醚/乙酸乙酯)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到267.0mg(理论值的77％)化合物 3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝683[M+H]+。
将267.0mg(0.39mmol)3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基] 氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于5.0ml二氯甲烷中，加入91.0mg (0.90mmol)三乙胺，并将混合物冷却至0℃。加入117.4mg(0.86mmol) 乙酰氧基乙酰氯，将混合物在RT下搅拌16h。再加入593.4mg(5.87 mmol)三乙胺和427.0mg(3.13mmol)乙酰氧基乙酰氯，将混合物在 RT下再搅拌10h。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到216.3mg(理论值的71％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.70和1.72min；MS(ESIpos):m/z＝783 [M+H]+。
首先将216.3mg(0.28mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入4.0ml THF中，加入16.6mg(0.28mmol)HOAc和361.1mg(1.38mmol) TBAF溶液(1M的THF溶液)。将反应溶液在RT下搅拌4h。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到94.0mg(理论值的51％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝669[M+H]+。
首先将52.0mg(0.08mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-(羟甲基) 吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入4.0ml PBS缓冲液/乙腈(9:1)和1.2mg(0.01 mmol)TEMPO。然后同时加入14.1mg(0.16mmol)亚氯酸钠在1.0ml 水中的溶液和115.8μl(0.16mmol)10％浓度的次氯酸钠溶液。将反应混合物在RT下搅拌16h。将反应混合物倒入10％浓度的亚硫酸钠溶液中，加入乙酸乙酯。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和 NaCl溶液洗涤一次，并且用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝683[M+H]+。
首先将103.0mg(0.15mmol)4-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-(二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-羧酸加入到4.5ml甲醇/水(2:1)中，加入45.9mg (0.33mmol)碳酸钾，并将混合物在RT下搅拌3h。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次，并且用硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，标题化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(ESIpos):m/z＝641[M+H]+。
中间体C26
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003481
首先将590mg(1.69mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和155μl(2.70 mmol，162mg)乙酸加入30ml二氯甲烷中，并且将混合物在RT下搅拌 30min。然后滴加溶于40ml二氯甲烷中的600mg(1.687 mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1- 胺(通过用1N氢氧化钠水溶液萃取三氟乙酸/(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)获得)和750mg(2.362 mmol)(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯。将混合物在RT下搅拌2h。然后加入乙酸乙酯，混合物用饱和碳酸钠溶液洗涤，浓缩有机相。通过制备型HPLC(流动相：ACN/水，梯度)分离残余物。得到510mg(理论值的46％)目标化合物，其为非对映异构体混合物。
异构体1：
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min(51％)；MS(EIpos):m/z＝657 [M+H]+。
异构体2：
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min(49％)；MS(EIpos):m/z＝657 [M+H]+。
中间体C27
乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)(2,2-二甲基丙基){3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯
Figure BDA0003554407600003491
首先将510mg(0,776mmol)(3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基] 氧基}甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯加入30ml二氯甲烷中，加入181mg (249μl，1.786mmol)三乙胺和219mg(1.553mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯。将反应混合物在RT下搅拌2h，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。通过制备型HPLC(流动相：ACN/水，梯度)分离残余物。得到290mg(理论值的49％)目标化合物，其为差向异构体混合物。
异构体1：
LC-MS(METHOD 1):Rt＝1.70min；MS(EIpos):m/z＝757 [M+H]+。
异构体2：
LC-MS(方法1):Rt＝1.72min；MS(EIpos):m/z＝757[M+H]+。
中间体C28
乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-(羟甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯
Figure BDA0003554407600003501
将285mg(0.376mmol)乙酸(2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯溶于5ml THF 中。加入452μl(0.452mmol)1M四正丁基氟化铵的THF溶液，将反应混合物在RT下搅拌3h。通过制备型HPLC(流动相：ACN/水，梯度)分离反应混合物并冻干。得到214mg(理论值的81％，根据LC/MS 的纯度＝92％)目标化合物，其为差向异构体的混合物。
异构体1：
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(EIpos):m/z＝643[M+H]+。
异构体2：
LC-MS(METHOD 1):Rt＝1.40min；MS(EIpos):m/z＝643 [M+H]+。
中间体C29
乙酸2-([3-(乙酰基硫烷基)-2-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙酯
Figure BDA0003554407600003511
首先将210mg(0.301mmol)乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-(羟甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯加入8ml无水THF中，在RT下滴加溶于8ml 无水THF中的178mg(1.503mmol，109μl)亚硫酰氯，将混合物在 RT下搅拌40min。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于16ml无水DMF中，加入172mg(1.503mmol)硫代乙酸钾和133mg(0.361mmol)四正丁基碘化铵，将混合物在90℃下搅拌2h。冷却后，加入水，并且将混合物用乙酸乙酯萃取。有机相用旋转蒸发器浓缩，并且将残余物通过制备型HPLC(流动相：ACN/ 水，梯度)纯化并冻干。得到155mg(理论值的69％，根据LC/MS的纯度＝94％)的目标化合物，其为差向异构体混合物。
异构体1：
LC-MS(METHOD 1):Rt＝1.50min；MS(EIpos):m/z＝701 [M+H]+。
异构体2：
LC-MS(METHOD 1):Rt＝1.51min；MS(EIpos):m/z＝701 [M+H]+。
中间体C30
[二硫烷二基双(2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}丙烷-3,1-二基)]二氨基甲酸二叔丁酯
Figure BDA0003554407600003521
首先将1.220g(1.010mmol，根据LC/MS的纯度＝58％)乙酸 2-([3-(乙酰基硫烷基)-2-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙酯加入30ml THF和30ml甲醇中，加入10ml 1N氢氧化钠水溶液，混合物在RT下搅拌2h。加入水，并且将反应混合物用二氯甲烷萃取。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。通过制备型HPLC(流动相： ACN/水，梯度)分离残余物。得到390mg(理论值的54％，根据LC/MS 的纯度＝86％)目标化合物，其为非对映异构体混合物。
异构体：
LC-MS(METHOD 1):Rt＝1.81min；MS(EIpos):m/z＝1232 [M+H]+。
中间体C31
3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003531
将390mg(0.272mmol，根据LC/MS的纯度＝86％)[二硫烷二基双(2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}丙烷-3,1-二基)]二氨基甲酸二叔丁酯溶于20 ml 1,4-二噁烷和10ml PBS缓冲液中，加入234mg(0.817mmol)3,3',3”- 膦三基三丙酸盐酸盐(1:1)。将混合物在RT下搅拌16h。然后将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并用二氯甲烷研磨，将滤液浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于8ml异丙醇中并通过手性色谱法(柱：250x 30mm 填充有Daicel Chiralpak AZ-H，流动相：异己烷/异丙醇＝90:10)纯化。产生了两个目标化合物的级分。级分1含有181.2mg(理论值的50％) 异构体1，级分2得到90.2mg(理论值的25％)异构体2。
异构体1：
手性HPLC(柱：250x 4.6mm，填充有Diacel Chiralpak AZ-H，流动相：异己烷/乙醇90:10)：Rt＝6.98min.
LC-MS(METHOD 1):Rt＝1.47min；MS(EIpos):m/z＝617 [M+H]+。
异构体2：
手性HPLC(柱：250x 4.6mm，填充有Diacel Chiralpak AZ-H，流动相：异己烷/乙醇90:10)：Rt＝9.39min.
LC-MS(METHOD 1):Rt＝1.47min；MS(EIpos):m/z＝617 [M+H]+。
中间体C32
N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体1)
Figure BDA0003554407600003541
将123mg(199.42μmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯(异构体1)溶于2ml THF中并在RT下与10ml半浓缩的盐酸一起搅拌1h。将反应溶液在氩气下脱气，然后冻干。得到108mg (理论值的98％)目标化合物。
异构体1
LC-MS(METHOD 1):Rt＝0.95min；MS(EIpos):m/z＝517 [M+H]+。
中间体C33
N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体2)
Figure BDA0003554407600003551
将123mg(199.42μmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯(异构体2)溶于2ml THF中，并在RT下与10ml半浓缩的盐酸一起搅拌1h。将反应溶液在氩气下脱气，然后冻干。得到58mg (理论值的63％，根据LC/MS的纯度＝91％)目标化合物。
异构体2
LC-MS(METHOD 1):Rt＝0.97min；MS(EIpos):m/z＝517 [M+H]+。
中间体C34
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003552
首先将3.790g(10.02mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(通过用1N氢氧化钠水溶液萃取三氟乙酸/(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)获得)、3.186g(15.04mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和690μl (12.03mmol，722mg)加入100ml二氯甲烷中。将混合物在RT下搅拌5min。
然后加入4.687g(27.06mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯，并且将混合物在RT下搅拌16h。反应混合物用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。通过在硅胶上进行的色谱法(流动相：二氯甲烷/乙酸乙酯，梯度＝4:1→1:1) 纯化残余物。得到2.57g(理论值的48％，根据LC/MS的纯度＝96％) 目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.00min；MS(EIpos):m/z＝513[M+H]+。
中间体C35
{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003561
首先将200mg(0.38mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯加入9ml 无水二氯甲烷中，在RT下加入120μl(0.86mmol，87mg)三乙胺。在 RT下，滴加溶于1ml无水二氯甲烷中的83mg(0.45mmol)4-硝基苯甲酰氯，并将混合物在RT下搅拌1h。加入水，将混合物在旋转蒸发器上浓缩。通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度)分离残余物并干燥。得到181mg(理论值的73％)的目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.47min；MS(EIpos):m/z＝662[M+H]+。
中间体C36
{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003571
首先将170mg(0.26mmol){3-[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯加入10ml乙酸中。加入143mg(2.57mmol)铁粉，将混合物在50 ℃下搅拌16h。冷却后，加入水，混合物用乙酸乙酯萃取。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。将残余物在HV下干燥。得到154mg (理论值的77％，根据LC/MS的纯度＝82％)目标化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.73min；MS(EIpos):m/z＝632[M+H]+。
中间体C37
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基} 氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600003572
将38.6mg(0.05mmol，LC/MS纯度＝82％){3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯溶于无水DMF中，加入24.8mg(0.06mmol) HATU和13.0mg(0.10mmol)N,N-二异丙基乙胺。将混合物在RT下搅拌5min，加入63mg(0.06mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸，并将混合物在RT下搅拌3h。加入7.5mg(0.06mmol) 3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt)，并将混合物搅拌16h。加入19.1mg(0.05mmol)HATU，并且将混合物在50℃下搅拌2h。冷却后，反应混合物直接通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度)纯化。得到6.5mg(理论值的9％，根据LC/MS的纯度＝83％) 的标题化合物。
LC-MS(方法2):Rt＝7.89min；MS(EIpos):m/z＝1200.6[M+H]+。
中间体C38
2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮
Figure BDA0003554407600003581
首先将300.0mg(0.84mmol)2-[3-({(1R)-1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮 (中间体C1)加入4.0ml二氯甲烷中，加入58.3mg(0.97mmol)HOAc 和250.4mg(1.18mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在RT下搅拌5min。加入197.2mg(0.97mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次，用饱和NaCl溶液洗涤一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，残余物在硅胶上(流动相：乙酸乙酯 /环己烷1:5)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到333.3mg(70％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.05min；MS(ESIpos):m/z＝543[M+H]+。
中间体C39
乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯
Figure BDA0003554407600003591
首先将332.3mg(0.61mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮 (中间体C38)加入到8.0ml二氯甲烷中，加入142.5mg(1.35mmol) 三乙胺。在0℃下，加入184.0mg(1.35mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，用饱和NaCl溶液洗涤一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶上(流动相：乙酸乙酯/环己烷1:3)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到367.1 mg(63％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.42min；MS(ESIpos):m/z＝643[M+H]+。
中间体C40
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
Figure BDA0003554407600003601
首先将583.1mg(0.91mmol)乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯(中间体C39)加入15.0ml乙醇中，并加入1.41g(18.15mmol)甲胺(40％水溶液)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物与甲苯共蒸馏三次。残余物用硅胶色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:5)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到324.9mg(73％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝471[M+H]+。
中间体C41
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600003602
首先将50.0mg(0.11mol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C40) 和30.4mg(0.11mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-(叔丁氧基羰基)-L- 丙氨酸酯加入2.0ml DMF中，加入32.2mg(0.32mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入19.1mg(0.32mmol)HOAc，反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50 ml/min，MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到38.0mg(56％)化合物[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.26min；MS(ESIpos):m/z＝642[M+H]+。
首先将33.6mg(0.05mmol)[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基)-1- 氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯加入3.0ml二氯甲烷中。加入119.4mg (1.05mmol)TFA，将反应混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到32.8mg(96％)化合物三氟乙酸 /N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝542[M+H]+。
首先将29.5mg(0.05mmol)三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)和14.1mg(0.05mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸酯加入到1.0ml DMF中，并加入18.2mg(0.18 mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜，并通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水) 直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到23.1mg (69％)化合物N-(叔丁氧羰基)-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIpos):m/z＝741[M+H]+。
将19.4mg(0.03mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺溶于1.5ml二氯甲烷中，加入59.7 mg(0.52mmol)TFA。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入119.4mg (1.04mmol)TFA，并将混合物再次在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到19.2mg(97％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝641[M+H]+。
中间体C42
四氟硼酸2,5-二氟苯重氮盐
Figure BDA0003554407600003621
首先加入3.00g(21.16mmol，2.68ml)三氟化硼-二乙醚复合体，在0℃下缓慢滴加溶于27ml无水THF中的1.37g(10.58mmol)2,5- 二氟苯胺。在-10℃下，滴加溶于3ml无水THF中的1.61g(13.75mmol， 1.85ml)亚硝酸异戊酯溶液，并在相同温度下继续搅拌30min。加入15ml乙醚，滤出沉淀的重氮盐，用少量乙醚洗涤并在高真空下干燥。得到2.27g目标化合物(理论值的94％)。
LC-MS(方法6):Rt＝0.24min；MS(ESIpos):m/z＝141[M]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝8.11-8.17(m,1H), 8.36-8.43(m,1H),8.69-8.73(m,1H).
中间体C43
氯[2-(2,5-二氟苯基)亚肼基]乙酸甲酯
Figure BDA0003554407600003622
在氩气氛下，首先将3.63g(24.13mmol)2-氯-3-氧代丁酸甲酯加入100ml水中，并在-5℃下加入48.90g(618.19mmol，50.00ml)吡啶，将混合物在此温度下搅拌10min。t-5℃，然后加入5.00g(21.94 mmol)四氟硼酸2,5-二氟苯重氮盐，导致形成橙色悬液。混合物在此温度下搅拌30min，反应用水稀释并用二氯甲烷萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。得到5.52g目标化合物(理论值的97％，根据LC/MS的纯度＝96％)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝249[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝3.85(s,3H),6.88-6.94(m, 1H),7.16-7.21(m,1H),7.31-7.37(m,1H),10.00(s,1H).
中间体C44
4-苯甲酰基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-羧酸甲酯
Figure BDA0003554407600003631
将3.50g(13.52mmol)氯[2-(2,5-二氟苯基)亚肼基]乙酸甲酯(根据LC/MS的纯度96％)溶于9ml无水甲苯中，加入2.61g(14.87mmol) (2E)-3-(二甲基氨基)-1-苯基丙-2-烯-1-酮和3.01g(29.73mmol)，4.14ml) 三乙胺，将混合物在室温下搅拌16h。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物通过制备型HPLC(流动相：ACN/含有0.1％甲酸的水，梯度)分离。得到1.79g(理论值的39％)目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝343[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝3.86(s,3H),7.44-7.50(m, 1H),7.55-7.72(m,4H),7.81-7.87(m,3H),8.80(d,1H).
中间体C45
[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇
Figure BDA0003554407600003641
首先将3.18g(8.92mmol)4-苯甲酰基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3- 羧酸甲酯(根据LC/MS的纯度＝96％)加入到50ml三氟乙酸中，滴加 8.74g(75.13mmol，12ml)三乙基硅烷，并将混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将得到的残余物溶于120ml无水THF中，并在0℃下滴加2.89g(33.63mmol，33.63ml) 硼烷-四氢呋喃复合体。将混合物搅拌过夜。由于转化率低，加入另外 12.33ml(12.33mmol)的1M硼氢化锂的THF溶液。将混合物在室温下搅拌1h，在60℃下搅拌30min，在80℃下搅拌2h。在0℃下，用 60ml饱和碳酸氢钠溶液小心猝灭反应。用100ml乙酸乙酯萃取混合物 (在每种情况下)两次，合并的有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发仪上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥。得到2.67g(理论值的76％，纯度＝96％)目标化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝2.79min；MS(ESIpos):m/z＝329[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝3.91(s,2H),4.45(d,2H), 6.51(s,1H),7.18-7.23(m,2H),7.27-7.32(m,4H),7.46-7.53(m,1H), 7.60-7.65(m,1H),7.95(d,1H).
中间体C46
4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲醛
Figure BDA0003554407600003651
将2.66g(8.50mmol)[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇 (纯度96％)溶于150ml二氯甲烷中，4.33g(10.20mmol)Dess-Martin 过碘烷一次加入少量。将混合物在室温下搅拌2h，然后加入100ml半浓缩的碳酸氢钠溶液和100ml 10％浓度的硫代硫酸钠溶液，将混合物搅拌20min。分离出有机相，用硫酸钠干燥并在高真空下浓缩。得到2.35g(理论值的88％，纯度＝95％)目标化合物。
LC-MS(方法7):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝299[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝4.12(s,2H),7.17-7.21(m, 1H),7.27-7.31(m,4H),7.37-7.42(m,1H),7.57-7.62(m,1H),7.75-7.78(m, 1H),8.22(d,1H),10.06(s,1H).
中间体C47
(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
Figure BDA0003554407600003652
将2.35g(7.56mmol)4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲醛溶于25ml无水THF中，加入1.10g(9.08mmol)(R)-(+)-2-甲基-2-丙磺酰胺和4.73g(16.64mmol)异丙氧基钛(IV)。将反应混合物在室温下搅拌16h，加入20ml饱和氯化钠溶液和30ml乙酸乙酯。然后加入约 3g硅藻土，并将混合物在回流下煮沸1h。过滤混合物，从滤液中分离有机相。水相用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。所述残余物不经进一步纯化即可进一步使用。
在氩气氛下，将残余物溶于60ml无水THF并冷却至-78℃，滴加 14.5ml(23.24mmol)叔丁基锂的戊烷溶液(c＝1.6mol/l)。反应在-78 ℃下搅拌3h，然后用5ml甲醇和15ml饱和氯化铵溶液猝灭。在搅拌下，使反应混合物升温至室温(约30min)。用乙酸乙酯萃取混合物，有机相用饱和氯化钠溶液萃取，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。所述残余物不经进一步纯化即可进一步使用。
将残余物溶于30ml THF和6ml甲醇中，加入6ml(24.00mmol) 4N氯化氢的二噁烷溶液，并将混合物在室温下搅拌1h。然后加入15ml 饱和碳酸钠溶液，并将混合物用乙酸乙酯萃取。分离出有机相，用旋转蒸发器浓缩并在高真空下干燥。通过制备型HPLC(流动相：ACN/水，梯度)分离残余物。得到两个目标化合物的级分。第一级分产生1.31g 的产物(理论值的72％，LC/MS纯度＝97％)和第二级分0.37g的产物 (理论值的17％，LC/MS纯度＝83％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝356[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.91(s,9H),1.71(s,2H), 3.59(s,1H),3.87(s,2H),7.17-7.32(m,6H),7.45-7.51(m,1H),7.61-7.65 (m,1H),7.84(s br,1H).
中间体C48
(2S)-4-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003671
将1.28g(3.35mmol，LC/MS纯度93％)(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶于100ml无水二氯甲烷中，在室温下加入261mg(4.35mmol，250μl)乙酸和1.14g(4.34mmol) 三乙酰氧基硼氢化钠，接着在搅拌5min后，加入1.19g(4.35mmol) (2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯。将混合物在室温下搅拌15min，在旋转蒸发器上浓缩，溶于乙腈和水中，通过制备型HPLC (流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度)纯化。得到1.64g(理论值的80％) 目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.10min；MS(ESIpos):m/z＝613[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.01(s,9H),1.32(s,9H), 1.35(s,9H),1.80-1.89(m,1H),2.01-2.11(m,1H),2.54-2.71(m,2H), 3.75-3.81(m,1H),3.90(s,2H),4.18(d,1H),7.13(d,1H),7.20-7.24(m, 1H),7.28-7.34(m,5H),7.52-7.58(m,1H),7.76-7.80(m,1H),8.10(s br, 1H),8.23(s br,1H).
中间体C49
(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙酰氧基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸
Figure BDA0003554407600003681
将225mg(0.37mmol)(2S)-4-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯溶于10ml无水二氯甲烷，加入156mg(1.54mmol)三乙胺。在0℃下，加入125mg(0.92mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将混合物在RT下搅拌 16h。再加入251mg(1.84mmol)乙酰氧基乙酰氯和186mg(1.84mmol) 三乙胺，将混合物在RT下搅拌3h。加入少量二氯甲烷，并且将混合物用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于10ml乙醇中，加入0.91ml(12.67mmol)40％浓度的甲胺水溶液，将混合物在50℃下搅拌3h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩，将残余物溶于二氯甲烷中，并将有机相用水洗涤两次。有机相用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于2ml二氯甲烷中，加入2ml(25.96 mmol)三氟乙酸，并且将混合物在50℃下搅拌4h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物在高真空下干燥。将残余物溶于10ml无水二氯甲烷中，加入298mg(2.95mmol)三乙胺和429mg(1.97mmol)二碳酸二叔丁酯，并将混合物在RT下搅拌1h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物通过制备型HPLC(流动相：ACN/水，梯度)纯化。得到62mg(理论值的27％)目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝615[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.91(s,9H),1.32(s,9H), 2.64-2.72(m,4H),3.50-3.58(m,1H),3.72(dd,2H),4.07-4.22(m,2H), 4.47-4.54(m,1H),5.75(s,1H),6.84-6.89(m,1H),7.15-7.30(m,6H), 7.47-7.53(m,1H),7.70-7.75(m,1H),8.09-8.13(m,1H),11.66(s br,1H).
中间体C50
[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基] 氨基}-1-氧代丁烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003691
将60mg(0.1mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸溶于10ml无水DMF中，加入74mg(0.20mmol)HATU。将74mg (0.29mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)分别溶于2ml无水DMF中，加入38mg(0.29mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将混合物滴加到反应混合物中。将反应在RT下搅拌3天。混合物直接通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度)纯化。得到9.3 mg(理论值的13％)目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝737[M+H]+。
中间体C51
N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸
Figure BDA0003554407600003701
首先，以与中间体C2类似的方式，将中间体C47用N-{(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酰基}-β-丙氨酸苄基酯还原性烷基化。然后如对于中间体C27所述的，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化，然后用2M氢氧化锂的甲醇溶液水解两个酯基。得到23mg的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝686(M+H)+。
中间体C52
(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
Figure BDA0003554407600003702
首先将10.00g(49.01mmol)4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯加入100.0ml DMF中，加入20.76g(63.72mmol)碳酸铯和9.22g(53.91mmol)苄基溴。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配，水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。用90.0g 4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯重复该反应。
将两个合并的反应物通过制备型RP-HPLC(柱：Daiso 300x 100； 10μ，流速：250ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到125.15g(理论值的87％)化合物1-苄基-4- 溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.18min；MS(ESIpos):m/z＝295[M+H]+。
在氩气下，首先将4.80g(16.32mmol)1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯加入DMF中，加入3.61g(22.85mmol)(2,5-二氟苯基)硼酸、 19.20ml饱和碳酸钠水溶液和1.33g(1.63mmol)[1,1'-双(二苯基膦基) 二茂铁]-二氯化钯(II):二氯甲烷。将反应混合物在85℃下搅拌过夜。反应混合物通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤。有机相用水萃取，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱分离(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝100:3)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到3.60g(理论值的67％)化合物1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-羧酸甲酯。
LC-MS(方法7):Rt＝1.59min；MS(ESIpos):m/z＝328[M+H]+。
首先将3.60g(11.00mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 羧酸甲酯加入90.0ml THF中，并在0℃下加入1.04g(27.50mmol)氢化铝锂(2.4M的THF溶液)。将反应混合物在0℃下搅拌30min。在 0℃下，加入饱和酒石酸钾钠溶液，并向反应混合物中加入乙酸乙酯。有机相用饱和酒石酸钾钠溶液萃取三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次，用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物溶于30.0ml二氯甲烷中。加入3.38g(32.99mmol)氧化锰(IV)，将混合物在RT下搅拌 48h。再加入2.20g(21.47mmol)氧化锰(IV)，并将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物通过硅藻土过滤，并且将滤饼用二氯甲烷洗涤。减压蒸发溶剂，并将残余物2.80g(1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法7):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝298[M+H]+。
首先将28.21g(94.88mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 甲醛与23.00g(189.77mmol)(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入到403.0 ml无水THF中，加入67.42g(237.21mmol)异丙氧钛(IV)，将混合物在RT下搅拌过夜。加入500.0ml饱和NaCl溶液和1000.0ml乙酸乙酯，并将混合物在RT下搅拌1h。通过硅藻土过滤混合物，滤液用饱和NaCl溶液洗涤两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，残余物用Biotage Isolera(硅胶，柱1500+340g SNAP，流速200ml/min，乙酸乙酯/环己烷1:10)纯化。
LC-MS(方法7):Rt＝1.63min；MS(ESIpos):m/z＝401[M+H]+。
首先将25.00g(62.42mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺在氩气下加入无水 THF中并冷却至-78℃。然后在-78℃下加入12.00g(187.27mmol)叔丁基锂(1.7M的戊烷溶液)，并将混合物在此温度下搅拌3h。在-78 ℃下，然后依次加入71.4ml甲醇和214.3ml饱和氯化铵溶液，并将反应混合物升温至RT，并在RT下搅拌1h。混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物(R)-N-{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法6):Rt＝2.97min；MS(ESIpos):m/z＝459[M+H]+。
首先将28.00g(61.05mmol)(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入186.7 ml 1,4-二噁烷中，然后加入45.8ml HCl的1,4-二噁烷溶液(4.0M)。将反应混合物在RT下搅拌2h，并且减压蒸发溶剂。通过制备性 RP-HPLC(柱：Kinetix 100x 30；流速：60ml/min，MeCN/水)纯化残余物。减压蒸发乙腈并向含水残余物中加入二氯甲烷。有机相用碳酸氢钠溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥，得到16.2g(理论值的75％)的标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.10min；MS(ESIpos):m/z＝338[M-NH2]+, 709[2M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.87(s,9H),1.53(s,2H), 3.59(s,1H),5.24(d,2H),6.56(s,1H),6.94(m,1H),7.10(d,2H),7.20(m, 1H),7.26(m,2H),7.34(m,2H),7.46(m,1H).
中间体C53
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
Figure BDA0003554407600003731
首先，以与中间体C2类似的方式，将中间体C52用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄基酯来还原性烷基化。然后如对于中间体C27所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化，然后用2M氢氧化锂的甲醇溶液水解两个酯基。将以这种方式获得的中间体溶于乙醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化1h。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸9H-芴-9- 基甲基酯在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下引入Fmoc保护基。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝734(M-H)-。
中间体C54
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酰基]-β-丙氨酸
Figure BDA0003554407600003741
首先，以与中间体C2类似的方式，将中间体C52用N-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酰基]-β-丙氨酸苄基酯还原性烷基化。然后如对于中间体C27所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。将以这种方式获得的中间体溶于甲醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在 RT下用标准压力下的氢气氢化1h。然后用2M氢氧化锂的甲醇溶液水解酯基。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸 9H-芴-9-基甲基酯在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下引入Fmoc保护基。得到48mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝807(M+H)+。
中间体C55
2-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮
Figure BDA0003554407600003742
将340mg(0.96mmol)(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3- 基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶于7ml无水DCM中，在RT下加入69mg(1.15 mmol，60μl)乙酸和284mg(1.34mmol)三乙酰氧基硼氢化钠。搅拌混合物15min，然后加入233mg(1.15mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H- 异吲哚-2-基)丙醛。将混合物在RT下搅拌4.5h。再加入233mg(1.15mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛、69mg(1.15mmol， 60μl)乙酸和284mg(1.34mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在RT下搅拌7h。加入乙酸乙酯，反应混合物用饱和碳酸钠溶液洗涤。将有机相浓缩并将残余物通过制备型HPLC[1.)流动相：ACN/水+ 0.1％TFA，梯度；2.)流动相：ACN/水+1％TFA+1.0％NEt3)]纯化两次。得到108mg(理论值的21％)目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝543[M+H]+。
中间体C56
乙酸2-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯
Figure BDA0003554407600003751
首先将102mg(0.19mmol)2-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮加入2ml无水DCM中，并在RT下加入44mg(0.43mmol)三乙胺。在0℃下，加入31mg(0.23mmol)溶于1ml纯DCM中的乙酸2-氯-2- 氧代乙酯。将混合物在RT下搅拌40min。再加入溶于0.5ml纯DCM 中的26mg乙酸2-氯-2-氧代乙酯和19mg(0.19mmol)三乙胺，将混合物在RT下搅拌60min。
加入水，在旋转蒸发仪上浓缩混合物，并且将残余物通过制备型 HPLC(流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度)纯化。得到106mg(理论值的88％)目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝643[M+H]+。
中间体C57
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2- 基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)
Figure BDA0003554407600003761
根据标准方法，通过在存在HATU的情况下将中间体C49与(2-氨基乙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯偶联，随后用哌啶移除Fmoc保护基，制备标题化合物。得到14mg标题化合物(经2步的理论值的40％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝657(M+H)+。
中间体C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸
Figure BDA0003554407600003771
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，并加入3.63 g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5min 后，加入溶于175ml DCM中的8.99g(24.5mmol)中间体L57，将反应物在RT下再搅拌45min。然后将反应物用300ml DCM稀释并用100 ml碳酸氢钠溶液洗涤两次，用饱和NaCl溶液洗一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。然后将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：ChromatorexC18)纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到4.6g(理论值的61％) (2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614(M+H)+。
首先将2.06g(3.36mmol)该中间体加入76ml DCM中并在存在 2.1ml三乙胺的情况下用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。在RT下搅拌20h后，加入0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙酯和0.94 ml三乙胺，将反应在RT下再搅拌15min。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释并连续用300ml 5％浓度的柠檬酸萃取两次，用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，再用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到2.17g(理论值的79％) 受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
将2.17mg(2.64mmol)该中间体溶于54ml THF和27ml水中，加入26ml 2摩尔氢氧化锂溶液。将混合物在RT下搅拌30min，然后使用1.4ml TFA将pH调节至3和4之间。将混合物减压浓缩。一旦大部分THF被蒸馏出去，将水溶液用DCM萃取两次，然后减压浓缩至干燥。残余物通过制备型HPLC(柱：Chromatorex C18)纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物从乙腈/水中冻干。得到1.1g (理论值的63％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝656(M-H)-。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.58(m,1H), 0.74-0.92(m,11H),1.40(m,1H),3.3(m,2H),3.7(m,1H),3.8-4.0(m,2H), 4.15(q,2H),4.9and 5.2(2d,2H),5.61(s,1H),6.94(m,2H),7.13-7.38(m, 7H),7.48(s,1H),7.60(m,1H),12.35(s,1H).
中间体C59
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基} 丁酸
Figure BDA0003554407600003781
首先，如对于中间体C53所述的，将(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基} 丁酸苄基酯的仲氨基在存在三乙胺的情况下用(2S)-2-甲氧基丙酰氯(中间体C53的中间体)酰化。将获得的中间体溶于乙醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化1h。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸9H-芴-9-基甲基酯在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下引入Fmoc保护基。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝764(M-H)-。
中间体C60
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基} 丁酸
Figure BDA0003554407600003791
该合成以与中间体C53类似的方式进行。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝750(M+H)+。
中间体C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基) 丁酰基]-β-丙氨酸
Figure BDA0003554407600003801
通过将60mg(0.091mmol)中间体C58与β-丙氨酸甲酯偶联，然后用2M氢氧化锂溶液进行酯裂解来制备标题化合物。经2步，得到67 mg(理论值的61％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.29min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C62
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基) 丁酰基]-D-丙氨酸
Figure BDA0003554407600003802
以与中间体C61类似的方式，由中间体C58和D-丙氨酸甲酯制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C63
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2- 基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)
Figure BDA0003554407600003811
该中间体的合成开始于在第一步，在存在28.7mg(0.15mmol)1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、22.9mg(0.15mmol)1-羟基 -1H-苯并三唑水合物和39μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将50mg (0.075mmol)中间体C3与26.2mg(0.082mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯盐酸盐(1:1)偶联。在RT下搅拌18h后，浓缩混合物，并且将残余物通过制备型HPLC纯化。得到45mg(理论值的 65％)该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.51min；MS(ESIpos):m/z＝921(M+H)+。
将45mg(0.049mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，加入176μl 40％浓度的甲胺水溶液。反应在50℃下搅拌，6h后和9h后加入相同量的甲胺溶液。在50℃下再搅拌14h后，再加入700μl甲胺溶液，再搅拌 20h后，最后浓缩混合物。将残余物溶于DCM中并用水洗涤。浓缩有机相并将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并在高真空下干燥残余物得到32mg(理论值的99％){(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2-基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝657(M+H)+。
中间体C64
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2- 基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
Figure BDA0003554407600003821
标题化合物是以与中间体C63类似的方式由中间体C58制备。
HPLC(方法11):Rt＝2.4min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝700(M+H)+。
中间体C65
(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10- 二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
Figure BDA0003554407600003831
首先将215mg(0.59mmol)中间体L66加入到25ml二氯甲烷中，加入377mg(0.89mmol)Dess-Martin过碘烷和144μl(1.78mmol)吡啶。将混合物在RT下搅拌30min。然后用300ml二氯甲烷稀释反应物，有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液，10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤(在每种情况下)两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。得到305mg醛，其不经进一步纯化即进行反应。
将175mg(0.49mmol)中间体C52溶于50ml二氯甲烷中，加入 147mg(0.69mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和32.5μl乙酸。在RT下搅拌5min后，加入214mg(0.593mmol)上述醛，并将反应在RT下搅拌过夜。此处，代替预期产物，形成[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}氨基)-1-(2,5-二氧代吡咯烷-1- 基)丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。由于该酰亚胺也可以转化成标题化合物，所以浓缩反应物并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并合适的含酰亚胺的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到195mg(58％)上述酰亚胺。
LC-MS(方法5):Rt＝3.32min；MS(ESIpos):m/z＝667(M+H)+。
将65mg(97.5μmol)该酰亚胺溶于15ml二氯甲烷中，加入367μl (3.4mmol)乙酰氧基乙酰氯和595μl N,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌30min之后，将反应物在不加热的情况下减压浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂并在高真空下干燥后得到28mg(理论值的37％)(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝767(M+H)+。
将28mg(37μmol)该中间体溶于3ml甲醇中，加入548μl 2M氢氧化锂溶液。在RT下搅拌10min后，用三氟乙酸将反应物调节至pH 4，然后浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥，得到26mg(96％的理论值)的标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝743(M+H)+。
中间体C66
[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(甘氨酰氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基] 氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600003841
首先，根据肽化学的经典方法(HATU偶联和Boc移除)由N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯制备三氟乙酸 /{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸苄基酯(1:1)。
将13mg(0.036mmol)该中间体和25mg(0.033mmol)中间体C58溶于3ml DMF中，加入19mg(0.05mmol)HATU和17μl N,N- 二异丙基乙胺。在RT下搅拌10min后，浓缩混合物，并且将残余物通过制备型HPLC纯化。得到17.8mg(理论值的60％)中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝891(M+H)+。
将17mg(0.019mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，加入钯碳 (10％)，将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化2h。滤除催化剂，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到9mg(理论值的 62％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝757(M+H)+。
中间体C67
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯
Figure BDA0003554407600003851
首先将605.3mg(1.71mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)加入10.0ml二氯甲烷中，加入506.7mg(2.39mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和117.9mg(1.96mmol) 乙酸，将混合物在RT下搅拌5min。加入溶于10.0ml二氯甲烷中的580.0 mg(1.96mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯(中间体L70)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱分离(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到514.7mg(理论值的46％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.10min；MS(ESIpos):m/z＝634(M+H)+。
中间体C68
[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600003861
合成是以与化合物中间体C67的合成类似的方式进行。
1000.0mg(2.81mmol)(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3- 基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体C47)
835.0mg(3.94mmol)三乙酰氧基硼氢化钠
194.0mg(3.24mmol)乙酸
560.0mg(3.24mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
得到695.8mg(理论值的48％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.02min；MS(ESIpos):m/z＝513(M+H)+。
中间体C69
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷 -17-酸
Figure BDA0003554407600003871
首先将117.0mg(0.19mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸 2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C70)和21.6mg(0.20mmol)3-硫烷基丙酸加入到3.0ml甲醇中，加入89.5mg(0.65mmol)碳酸钾，将混合物在50℃下搅拌4h。用乙酸乙酯稀释反应混合物，有机相用水和饱和的NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。得到106.1mg(理论值的73％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.42min；MS(ESIneg):m/z＝700(M-H)-。
中间体C70
{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600003872
首先将908.1mg(1.63mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参见中间体C11的合成)和545.6mg(5.39mmol)三乙胺加入10.0ml二氯甲烷中，并将混合物冷却至0℃。在此温度下，加入 590.5mg(5.23mmol)氯乙酰氯，并将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤(在每种情况下)三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到673.8mg(理论值的65％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIneg):m/z＝676 (M+HCOO-)-。
中间体C71
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600003881
将536.6mg(4.43mmol)L-半胱氨酸与531.5mg(6.33mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.5ml水中。加入溶于25.0ml异丙醇中的400mg (0.63mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C70)和 1.16g(7.59mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤有机相，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到449.5mg(理论值的86％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.20min；MS(ESIpos):m/z＝717(M+H)+。
中间体C72
(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
Figure BDA0003554407600003891
首先将90mg(0.212mmol)中间体L72加入到6ml二氯甲烷中，加入86μl(1.06mmol)吡啶和135mg(0.318mmol)Dess-Martin过碘烷。将混合物在RT下搅拌30min。然后用30ml二氯甲烷稀释反应物，有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液洗涤两次，用5％浓度的柠檬酸溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。以该方式获得的醛不经进一步纯化即反应。
将63mg(0.177mmol)中间体C52溶于15ml二氯甲烷中，加入 52.4mg(0.247mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和20.2μl乙酸。在RT下搅拌5min后，加入89.6mg(0.212mmol)上述醛，并将反应在RT下搅拌20min。将反应物减压浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物从乙腈/水中冻干。得到 71mg(经过两步的理论值的53％)(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝761(M+H)+。
将70mg(92μmol)该中间体溶于15ml二氯甲烷中，将混合物冷却至10℃，加入54μl三乙胺和25.5μl(0.23mmol)乙酰氧基乙酰氯。在RT下搅拌1h后，加入相同量的酰基氯和三乙胺，在RT下再搅拌1 h后再次加入。然后将反应在RT下再搅拌30min，然后减压浓缩，并且将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂并将残余物从乙腈/水中冷干，得到46.5mg(理论值的59％)酰化的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝861(M+H)+。
将46mg(53μmol)该中间体溶于5ml甲醇中，加入2.7ml 2M氢氧化锂溶液。在RT下搅拌10min后，用乙酸将反应物调节至pH 3-4，然后用15ml水稀释。水相用乙酸乙酯萃取，有机相用硫酸镁干燥并浓缩。将残余物从乙腈/水中冻干，在高真空下干燥残余物之后，得到37mg (理论量的90％)的标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C73
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-L-半胱氨酸
Figure BDA0003554407600003911
首先将619mg(0.86mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)加入到8.8ml二氯甲烷中，加入87mg(0.86mmol)三乙胺和224mg(0.86mmol)N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5- 二酮。1h后，加入45mg(0.17mmol)N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在RT下搅拌1h。将混合物减压浓缩，将残余物溶于二氯甲烷中，然后将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。有机相用硫酸镁干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到602mg(71％，纯度87％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.58min；MS(ESIpos):m/z＝861(M+H)+。
中间体C74
三氟乙酸3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(11)
Figure BDA0003554407600003921
将75mg(0.114mmol)中间体C58溶于12.5ml DMF中，并在存在65mg(0.11mmol)HATU和79μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与78 mg(0.171mmol)中间体L75偶联。通过制备型HPLC纯化后，将中间体溶于20ml乙醇中，并在RT、氢气标准压力下用10％活性炭上的钯氢化1h。然后过滤催化剂，减压移除溶剂，产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水11中冻干，得到63mg(经2步的理论值的64％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.16min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
中间体C75
(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基} 氨基)丁酸甲酯
Figure BDA0003554407600003931
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，加入3.63g (17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5min 后，加入溶于175ml DCM中的3.23g(11.85mmol)(2S)-4-氧代 -2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(由(3S)-3-氨基-4- 甲氧基-4-氧代丁酸通过经典方法制备)，并将混合物在RT下再搅拌45min。然后将混合物用DCM稀释并用100ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在高真空下浓缩并干燥残余物，得到4.6g(理论值的61％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614.32 (M+H)+。
将200mg(0.33mmol)该中间体溶于10ml DCM中，然后加入105 μl三乙胺和77μl(0.717mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在RT下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，然后浓缩。得到213mg(75％)的标题化合物，其为米色泡沫。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
中间体C76
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600003941
标题化合物是由中间体C75根据肽化学的经典方法(用氯化锌移除 Teoc保护基、在存在HATU的情况下用N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L- 丙氨酸酰化并用氢氧化锂的THF/水溶液进行酯裂解)制备。
LC-MS(方法1):Rt＝1.23min；MS(ESIpos):m/z＝818(M+H)+。
中间体C77
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸
Figure BDA0003554407600003942
首先将4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(8.39mg，48.1μmol)加入1.0ml DMF中，加入7.37mg(48.1μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、15.5mg (48.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基鎓氟硼酸盐和8.60 μl(48.1μmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物在RT下搅拌10min。首先将40.0mg(0.048mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(11)(中间体C71)加入1.0ml DMF中，加入25.4μl(141.9mmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物加入到反应中，并将反应混合物在RT下搅拌4h。反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到 35.0mg(理论值的83％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.76min；MS(ESIpos):m/z＝873[M+H]+
中间体C78
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸
Figure BDA0003554407600003951
首先将197mg(0.354mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参见中间体C11的合成)加入5.0ml二氯甲烷中，并将混合物加热至40℃。在此温度下，加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl (1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1h。然后加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1h。然后加入240μl(3.0mmol)吡啶和 220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1h。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用5％KHSO4溶液萃取(在每种情况下)3次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂。残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到74.1mg(理论值的31％)11-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝670[M+H]+
首先将78.3mg(117μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯加入到4.0ml THF中，加入800μl甲醇、160 μl水和230μl(230μmol)LiOH水溶液(1M)。将反应混合物在RT 下搅拌3h，用乙酸猝灭并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250 x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到64.8mg(理论值的85％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIneg):m/z＝654[M-H]-
中间体C79
三氟乙酸3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂 -7,11-二氮杂-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯 (1:1)
Figure BDA0003554407600003961
首先将57.4mg(81.8μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14- 硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入到5.7ml DMF 中，加入74.0mg(164μmol)三氟乙酸3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)(中间体L75)、43μl(250μmol)N,N-二异丙基乙胺和62.2mg(164μmol)HATU，将混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物在RT下搅拌1h，用乙酸淬灭并通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 125x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，乙基胺残余物在高真空下干燥。得到52.4mg(理论值的63％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17三氧代-5-氧杂 -14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D- 丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.64min；MS(ESIpos):m/z＝1022[M]+
在氩气下，首先将6.23mg(27.7μmol)乙酸钯(II)加入3.0ml二氯甲烷中，加入12μl(83μmol)三乙胺和89μl(550μmol)三乙基硅烷，并将混合物搅拌5min。然后加入在3.0ml二氯甲烷中的56.7mg(55.5 μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯，将混合物在RT下搅拌过夜。将混合物浓缩至几乎干燥，加入乙腈/ 水，过滤混合物并通过制备RP-HPLC(柱：Reprosil 125x 30；μ，流速： 50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到37.4mg(理论值的67％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):):Rt＝2.15min；MS(ESIpos):m/z＝888[M+H]+
中间体C80
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-[15-(甘氨酰氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600003981
在氩气下，首先将43.4mg(95.1μmol)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(中间体L90)加入2.5ml DMF 中，加入14.6mg(95.1μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、30.5mg(95.1 μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基鎓氟硼酸盐和16.5μl (95.1μmol)N,N-二异丙基乙胺，并将混合物搅拌10min。将79.0mg (95.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷 -13-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)(中间体C71)溶于2.5ml DMF中，加入49.5μl(285.3μmol)N,N-二异丙基乙胺，并将混合物加入到反应中。将反应混合物在RT下搅拌2h，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到44.2mg(理论值的40％) 化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷 -1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.57min；MS(ESIpos):m/z＝1156[M+H]+
将60.2mg(52.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸悬浮于3.0ml乙醇中，加入6.0mg在活性炭上的钯(10％)，并将混合物在RT和标准压力下用氢气氢化1h。再一次，加入6.0mg活性炭上的钯(10％)，并将混合物在RT和标准压力下用氢气氢化1h。滤出催化剂，在减压下移除反应混合物中的溶剂，并在高真空下干燥。残余物通过制备RP-HPLC(柱： Reprosil 125x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到29.4mg(理论值的50％)的标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝3.77min；MS(ESIpos):m/z＝1021[M+H]+
中间体C81
(R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺
Figure BDA0003554407600003991
在氩气和-78℃下，将18.7ml(37.45mmol)环己基氯化镁的乙醚溶液(2M)加入3.12ml(6.24mmol)二甲基锌的甲苯溶液(2.0M) 中，并将混合物在-78℃下搅拌30min。然后在-78℃下加入5.0g(12.48 mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2- 甲基丙烷-2-亚磺酰胺的THF溶液，并将反应混合物在此温度下搅拌1h，然后在RT下搅拌4h。然后在-78℃下，加入ml的饱和氯化铵溶液，并使反应混合物升温至RT。混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物使用Biotage Isolera(硅胶，乙酸乙酯/环己烷25:75)纯化，得到1.59g(理论值的26％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝2.76min；MS(ESIneg):m/z＝483[M-H]-
在氩气下，首先将264.0mg(0.54mmol)该中间体加入0.5ml 1,4- 二噁烷中，然后加入1.36ml HCl的1,4-二噁烷溶液(4.0M)。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入二氯甲烷，反应混合物用1M氢氧化钠水溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。残余物使用Biotage Isolera(硅胶，甲醇/二氯甲烷98:2)纯化。减压蒸发溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中，用碳酸氢钠溶液洗涤并用硫酸钠干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到148mg(理论值的72％)的标题化合物。
LC-MS(方法13):Rt＝2.07min；MS(ESIpos):m/z＝364[M-NH2]+
中间体C82
(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基} 丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004001
在氩气下，将392.2mg(1.85mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和91.29 mg(1.52mmol)乙酸加入到503.0mg(1.32mmol)1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺(中间体C81)在1.4ml二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入574.6 (2.38mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯的二氯甲烷溶液，将混合物在RT下搅拌过夜。加入143mg(0.66mmol)(3- 氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯后，将混合物再搅拌2h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次，用硫酸钠干燥并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到488g(理论值的63％) 的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.89min；MS(ESIpos):m/z＝582(M+H)+。
中间体C83
(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004011
将280.0mg(2.77mmol)三乙胺和397.8mg(3.52mmol)氯乙酰氯加入到487.9mg(0.84mmol)(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯 (中间体C82)以及
Figure BDA0003554407600004012
分子筛在8.40ml二氯甲烷的溶液中，将反应混合物在RT下搅拌6h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。残余物未经纯化即进一步使用。得到470mg(理论值的85％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.88min；MS(ESIpos):m/z＝680(M+Na)+。
中间体C84
S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基}-L-半胱氨酸
Figure BDA0003554407600004021
将322.1mg(2.66mmol)L-半胱氨酸与319.0mg(3.80mmol)碳酸氢钠一起悬浮于0.19ml水中。将250.0mg(0.38mmol)(3-{[(R)-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C83)溶于1.90ml异丙醇中，加入693.8g(4.56mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥，并减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到276mg(理论值的97％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.34min；MS(ESIpos):m/z＝744(M+H)+。
中间体C85
S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸
Figure BDA0003554407600004031
将34.8mg(0.27mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到100mg(0.13 mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基}-L-半胱氨酸(1:1)(中间体C84)和41.5mg(0.13mmol)1-{6-[(2,5- 二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在4.0ml DMF 中的混合物中，将反应混合物在RT下搅拌3h。不进行后处理，通过制备型HPLC纯化混合物。得到88mg(理论值的70％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.71min；MS(ESIpos):m/z＝936(M+H)+。
中间体C86
11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2- 二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸
Figure BDA0003554407600004041
将161.65mg(1.17mmol)碳酸钾加入到220.0mg(0.33mmol) (3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C83)和39.02 mg(0.37mmol)3-硫烷基丙酸在7.45ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌4h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和饱和用NaCl溶液反复洗涤。有机相用硫酸钠干燥，并减压蒸发溶剂。残余物未经后处理即进一步使用。得到201mg(理论值的 83％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝726(M-H)-。
中间体C87
(13-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基](环己基)甲基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂3,6,13- 三氮杂十六烷-16-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004051
将54.18mg(0.28mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰胺(中间体L1)、71.01mg(0.50mmol)N,N-二异丙基乙胺、104.46mg(0.27mmol)HATU和0.23ml(0.14mmol)1-羟基-7- 氮杂苯并三唑0.5M的DMF溶液加入到100mg(0.14mmol)11-[(R)-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C86)在 1.37ml DMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5h。不经进一步后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。得到41mg(理论的33％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIpos):m/z＝907(M+H)+。
中间体C88
3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基} 氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯三氟乙酸(1:1)
立体异构体的混合物
Figure BDA0003554407600004061
将1.71g(8.05mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.40g(6.61mmol) 乙酸加入到2.04mg(5.75mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中间体C52)在51ml二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌5min。然后加入1.32g(6.61 mmol)3-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯在20ml二氯甲烷中的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)两次，用硫酸镁干燥并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到1.86g(理论值的50％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝538 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体C89
3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004071
将1.36g(13.42mmol)三乙胺和2.13g(18.87mmol)氯乙酰氯加入到2.89g(4.19mmol，80％纯度)的3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯 (中间体C88)以及
Figure BDA0003554407600004072
分子筛在42ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到449mg(理论值的17％)的标题化合物的异构体1和442mg(理论值的17％)的标题化合物的异构体2。
异构体1LC-MS(方法1):Rt＝2.74min；MS(ESIpos):m/z＝614 (M+H)+。
异构体2LC-MS(方法1):Rt＝2.78min；MS(ESIpos):m/z＝614 (M+H)+。
中间体C90
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(异构体1)
Figure BDA0003554407600004081
将357.3mg(0.58mmol)L-半胱氨酸与488.7mg(4.07mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.3ml水中。加入溶于23.0ml异丙醇中的357.0mg (0.58mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体1)(中间体C89，异构体1)和1.06g(6.98mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物未经纯化即进一步使用。得到255.0mg(理论值的62％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝699(M+H)+。
中间体C91
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(异构体2)
Figure BDA0003554407600004091
将453.5mg(3.74mmol)L-半胱氨酸与449.2mg(5.35mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.1ml水中。加入溶于21.1ml异丙醇中的3287.4mg (0.54mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体C89，异构体2)和0.98g(6.42mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物未经纯化即进一步使用。得到221.0mg(理论值的59％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.12min；MS(ESIpos):m/z＝699(M+H)+。
中间体C92
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(异构体1)
Figure BDA0003554407600004101
将18.49mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到50mg(0.07 mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C90)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.3ml DMF中的混合物中，将反应混合物在RT下搅拌45min。不进行后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。得到65mg(理论值的100％，71％纯度)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝892(M+H)+。
中间体C93
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(异构体2)
Figure BDA0003554407600004111
将18.49mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到50mg(0.07 mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C91)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.0ml DMF中的混合物中，将反应混合物在RT下搅拌90min。不进行后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。得到63mg(理论值的98％，纯度73％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝892(M+H)+。
中间体C94
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[(2,5- 二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸(异构体1)
Figure BDA0003554407600004121
将18.5mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到50.0mg(0.07 mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C90)和18.0mg(0.07mmol)-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1- 基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮在3.3ml DMF中的混合物中，将反应混合物在RT下搅拌30min。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和NH4Cl溶液和饱和用NaCl溶液反复洗涤有机相。有机相用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即使用。得到57mg (理论值的81％，纯度85％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝836(M+H)+。
中间体C95
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基} 丙酸(异构体1)
Figure BDA0003554407600004131
将302.5mg(2.19mmol)碳酸钾加入到384.0mg(0.62mmol) 3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体C89，异构体1) 和73.0mg(0.69mmol)3-硫烷基丙酸在14ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到358.0mg(理论值的84％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝684(M+H)+。
中间体C96
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基} 丙酸(异构体2)
Figure BDA0003554407600004141
将226.0mg(1.64mmol)碳酸钾加入到287.0mg(0.45mmol) 3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体C89，异构体2) 和54.6mg(0.51mmol)3-硫烷基丙酸在14ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到318.7mg(理论值的88％，纯度88％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝684(M+H)+。
中间体C97
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂 -2,9,12-三氮杂十四烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)
Figure BDA0003554407600004151
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg (0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基) 吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)在2.81 ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入22.75mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸(中间体L1)在1.4ml DMF中的溶液和5 mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物在RT下搅拌过夜。将混合物与水混合并用二氯甲烷萃取。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物未经后处理即进一步使用。得到26mg(理论值的84％) 的标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.39min；MS(ESIpos):m/z＝863(M+H)+。
中间体C98
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂 -2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)
Figure BDA0003554407600004161
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg (0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基) 吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)在2.81 ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入37.30mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 己酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸在1.4ml DMF中的溶液和5mg(0.04mmol) N,N-二异丙基乙胺，将混合物在RT下搅拌过夜。加入水，并用二氯甲烷萃取混合物。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即使用。得到22mg(理论值的63％)的标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.54min；MS(ESIpos):m/z＝919(M+H)+。
中间体C99
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,19三氧代-12,15-二氧杂 -5-硫杂-2,9,18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)
Figure BDA0003554407600004171
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg (0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基) 吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)在2.81 ml DMF中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入35.05mg(0.07mmol)N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸(中间体L82)在1.4ml DMF中的溶液和5mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺，将混合物在 RT下搅拌过夜。加入水，用二氯甲烷萃取混合物。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物经制备型 HPLC纯化。得到25mg(理论值的60％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝4.52min；MS(ESIpos):m/z＝1007(M+H)+。
中间体C100
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004181
将22.2mg(0.068mmol)(2R)-N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)三氟乙酸加入到45mg(0.068mmol) (2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸 (中间体C58)在5.8ml DMF中的溶液中。在RT下搅拌30min后，将39mg(0.10mmol)HATU和36mg(0.27mmol)N,N-二异丙基乙胺加入到混合物中。将反应混合物在RT下搅拌1h。未经后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。得到7mg(理论值的12％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z 851(M+H)+。
中间体C101
三氟乙酸/(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸甲酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004191
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，加入3.63g (17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5min 后，加入溶于175ml DCM中的3.23g(11.85mmol)(2S)-4-氧代 -2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(通过经典方法由 (3S)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸制备)，并将混合物在RT下再搅拌45 min。然后将混合物用DCM稀释，用100ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次并然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在高真空下浓缩并干燥残余物，得到4.6g(理论值的61％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614.32 (M+H)+。
首先将2.06g(3.36mmol)该中间体加入到76ml DCM中并在存在2.1ml三乙胺的情况下用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。在RT下搅拌20h后，加入0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙酯和0.94 ml三乙胺，将反应在RT下再搅拌15min。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释并依次用300ml 5％柠檬酸萃取两次、用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到2.17g(理论值的79％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
将321mg(0.342mmol)该中间体溶于7ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入279.5mg(2.05mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入599mg(2.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml 0.1％浓度的三氟乙酸水溶液，然后将混合物减压浓缩。残余物经制备型HPLC 纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到60mg(理论值的26％)的标题化合物，其仍含有一部分脱乙酰的化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min和0.95min；MS(ESIpos):m/z＝528 和570(M+H)+。
中间体C102
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸
Figure BDA0003554407600004201
首先，以与中间体C2类似的方式，用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄基酯将中间体C52还原性烷基化。然后将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化，然后用2M氢氧化锂的甲醇溶液水解两个酯基。
LC-MS(方法1):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝646(M-H)-.
中间体C103
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-谷氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004211
首先通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下使151mg (0.23mmol)中间体C102与128g(0.234mmol)中间体L98在DMF 中偶联来制备标题化合物。随后，通过在10％在活性炭上的钯上，在 RT、标准氢气压力下氢化30min来移除Z保护基，得到标题化合物。
产率：经过2个阶段的理论值的30％
LC-MS(方法1):Rt＝1.14min；MS(ESIpos):m/z＝929(M+H)+。
中间体C104
(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}氨基)甲基]-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004212
向2.24g(6.31mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙-1-胺以及
Figure BDA0003554407600004222
分子筛在56.0ml二氯甲烷中的溶液中加入1.87g(8.84mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，将混合物在室温下搅拌 15min。随后，加入2.20g(7.58mmol)(3R,4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1- 羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参考WO 2014/151030A1)，并将反应混合物在室温下搅拌3.5h。混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。残余物经制备型HPLC 纯化。得到1.39g(理论值的24％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.15min；MS(ESIpos):m/z＝600(M+H)+。
中间体C105
(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004221
向692.8mg(0.88mmol)(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯以及
Figure BDA0003554407600004223
分子筛在8.7ml二氯甲烷中的溶液中加入 295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯，将反应混合物在RT下搅拌2.5h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。将残余物与
Figure BDA0003554407600004232
分子筛一起再次溶于8.7ml二氯甲烷中，加入295.0 mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯，将反应混合物在RT下搅拌3h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。有机相用硫酸钠干燥、浓缩并不经纯化即进一步使用。得到691mg(理论值的 74％，纯度64％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.78min；MS(ESIpos):m/z＝676(M+H)+。
中间体C106
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基] 甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸
Figure BDA0003554407600004231
向691.0mg(0.65mmol)(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C105)和76.3mg(0.72 mmol)3-硫烷基丙酸在15ml甲醇和几滴水中的混合物中加入316mg (2.29mmol)碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到502mg(理论值的67％，纯度65％) 的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIneg):m/z＝744(M-H)-.
中间体C107
S-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基] 甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸
Figure BDA0003554407600004241
将203.6mg(1.68mmol)L-半胱氨酸与201.7mg(2.40mmol)碳酸氢钠一起悬浮于0.95ml水中。向其中加入溶于9.5ml异丙醇中的170.0mg(0.24mmol)(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸 2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体105)和438.5g(2.40mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤有机相，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到152mg(理论值的83％) 的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.26min；MS(ESIpos):m/z＝762(M+H)+。
中间体C108
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004251
标题化合物是通过在存在EDCI、HOBT和N,N-二异丙基乙胺的情况下将103mg(0.16mmol)中间体C102与110mg(0.175mmol)N6-β- 丙氨酰基-N2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯在DMF中偶联来制备。随后，通过在10％在活性炭上的钯上，在二氯甲烷/甲醇1:1中，在RT、标准氢气压力下氢化1h来移除Z 保护基，得到标题化合物，产量为113mg(经过2阶段的理论值的75％)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.17min；MS(ESIpos):m/z＝957(M+H)+。
此处使用的中间体是通过肽化学的常规方法通过以下步骤来制备：在存在HATU的情况下偶联可商购的N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸和 N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯，Z保护基的氢解脱离，由1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮引入三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(Teoc)保护基以及最后通过在7.5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌45min温和脱离Boc保护基。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝462(M+H)+。
中间体C109
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二叔丁基酯
Figure BDA0003554407600004261
首先，二肽衍生物β-丙氨酰基-L-谷氨酸二叔丁基酯是通过肽化学的常规方法通过以下步骤来制备：在存在HATU的情况下偶联可商购的 N-[(苄氧基)羰基]-β-丙氨酸和L-谷氨酸二叔丁基酯盐酸盐(1:1)，随后氢解脱离Z保护基。然后通过将该中间体与中间体C102在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联来制备标题化合物，随后通过在10％在活性炭上的钯上，在甲醇中，在RT、标准氢气压力下氢化45min来脱离Z保护基。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝826[M+H]+。
中间体C110
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二苄基酯
Figure BDA0003554407600004271
标题化合物是通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联L-谷氨酸二苄基酯(其已经通过在乙酸乙酯和5％碳酸氢钠溶液之间分配来预先从其对甲苯磺酸盐中释放)与中间体C61，随后用氯化锌的三氟乙醇溶液脱离Teoc保护基来制备。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝894[M+H]+。
中间体C111
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-D-谷氨酸二叔丁基酯
Figure BDA0003554407600004272
以与中间体C109类似的方式合成标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.06min；MS(ESIpos):m/z＝826[M+H]+。
中间体C112
N2-乙酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺
Figure BDA0003554407600004281
标题化合物是通过以下步骤来制备：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下中间体C102和中间体L108在DMF中的HATU偶联，以及随后通过在DCM/甲醇1:1中、在10％在活性炭上的钯上、在标准压力下的氢化脱离Z保护基。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝826(M+H)+。
中间体C113
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(苄氧基)羰基] 氨基}-D-丙氨酸苄基酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004282
首先，三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸苄基酯(1:1)是通过以下方式由可商购的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D- 丙氨酸制备，即通过在存在EDC/DMAP的情况下用苯甲醇进行酯化，接着用三氟乙酸消去Boc保护基。然后将该氨基酸单元在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下在DMF中与中间体C58偶联。在最后一步中，通过在50℃下在三氟乙醇中与6个当量的氯化锌搅拌2h并通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.05min；MS(ESIpos):m/z＝824[M+H]+。
中间体C114
三氟乙酸/4-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)丁酸叔丁酯 (1:1)
Figure BDA0003554407600004291
首先，将中间体C102与4-氨基丁酸叔丁酯盐酸盐(1:1)在存在 HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联。随后，通过在10％在活性炭上的钯上，在DCM/甲醇1:1中，在RT、标准氢气压力下氢化1h，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.0min；MS(ESIpos):m/z＝655[M+H]+。
中间体C115
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004301
首先，以与中间体C2类似的方式，将中间体C52用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄基酯来还原性烷基化。随后，按照中间体 C27中所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。
将190mg(0.244mmol)该中间体溶于7.5ml乙醇中，加入0.35ml 40％甲胺水溶液。将混合物在50℃下搅拌3h，然后再次加入相同量的甲胺。在50℃下再搅拌5h后，浓缩混合物，残余物通过制备型HPLC 纯化。得到78mg(理论值的48％)该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(EIpos):m/z＝661[M+H]+。
将78mg(0.118mmol)该中间体溶于8ml乙醇中，加入15mg 10％在活性炭上的钯后，在RT、标准氢气压力下氢化3h。然后过滤出催化剂，减压移除溶剂，并且将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水中冻干后，得到33mg(理论值的44％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝527(M+H)+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.1(m,1H),8.0(m,3H),7.9(m, 1H),7.65(m,1H),7.5(s,1H),7.15-7.35(m,5H)7.0(m,1H),6.85(m,1H), 5.6(s,1H),4.9and 5.2(2d,2H),4.02and 4.22(2d,2H),3.2-3.5(m,6H), 0.7and 1.46(2m,2H),0.8(s,9H).
中间体C116
三氟乙酸/N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004311
将三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)(81.0mg，100μmol) (中间体F104)和N2-(叔丁氧基羰基)-L-天冬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1- 基酯(43.0mg，131μmol)溶于5.0ml DMF中。将反应混合物与N,N- 二异丙基乙胺(61μl，350μmol)在RT下搅拌1h，然后直接通过制备型RP-HPLC(柱：Chromatorex 125x 30；10μ，流速：75ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物冻干。得到84mg (理论值的88％)化合物[(2S)-4-氨基)-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁烷-2-基}氨基)-1,4-二氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝907[M+H]+
[(2S)-4-氨基-1-({(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基)-1,4-二氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯(83.0mg，91.5μmol)溶于5.0ml三氟乙醇中。向反应混合物中加入氯化锌(74.8mg，549μmol)，将反应混合物在50℃下再搅拌15min。向混合物中加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(160 mg，549μmol)，所述混合物用5.0ml乙腈/水稀释，加入TFA(20μl)，搅拌混合物10min。通过注射器式过滤器过滤混合物并通过制备型 RP-HPLC(柱：Chromatorex 125x 30；10μ，流速：75ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到50mg(理论值的58％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝807[M+H]+
中间体L1
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004321
标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝198(M+H)+。
中间体L2
三氟乙酸/rel-(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004322
标题化合物是通过用EDC/HOBT偶联并随后用TFA脱保护来由50 mg(0.214mmol)可商购的顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷羧酸和60mg(0.235mmol)同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)制备。得到36mg(经2步的理论值的38％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L3
三氟乙酸/(1S,2R)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004331
标题化合物是通过用EDC/HOBT偶联并随后用TFA脱保护来由50 mg(0.214mmol)可商购的(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和72mg(0.283mmol)同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)制备。得到13mg(经2步的理论值的16％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.2min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L4
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环己烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004332
标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的1-(4-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备。
HPLC(方法11):Rt＝0.26min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝280(M+H)+。
中间体L5
三氟乙酸/N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-β-丙氨酰胺 (1:1)
Figure BDA0003554407600004341
标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮和N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸制备。
HPLC(方法11):Rt＝0.22min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.22min；MS(ESIpos):m/z＝260(M+H)+。
中间体L6
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004342
标题化合物是通过最初在存在EDC/HOBT的情况下偶联可商购的 6-(2,5-二氧代-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸与部分保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯来制备，其通过肽化学的经典方法制备。随后在温和条件下通过在5％浓度的三氟乙酸的DCM 溶液中在RT下搅拌，在氨基上进行脱保护，得到标题化合物，产率37％。
HPLC(方法11):Rt＝1.29min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.62min；MS(ESIpos):m/z＝566(M+H)+。
中间体L7
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004351
标题化合物是通过以下方式根据肽化学的经典方法由可商购的 1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过依次在存在HATU的情况下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，用 TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用TFA再次脱保护。得到32mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.31min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.47min；MS(ESIpos):m/z＝516(M+H)+。
中间体L8
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004352
标题化合物是通过以下方式根据肽化学的经典方法由可商购的 1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮顺序来制备，即通过依次在存在HATU 的情况下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联，用TFA 脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用TFA再次脱保护。得到171mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.23min；
LC-MS(方法7):Rt＝0.3min；MS(ESIpos):m/z＝417(M+H)+。
中间体L9
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基 -2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004361
标题化合物是以与中间体L7类似的方式，由可商购的乙酸(4-氨基苯基)甲酯制备。得到320mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.48min；MS(ESIpos):m/z＝493(M+H)+。
中间体L10
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-rel-N6-{[(1R,2S)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)
Figure BDA0003554407600004362
标题化合物是通过以下方式由中间体L6制备，即通过用EDC/HOBT与顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷羧酸偶联，随后用 TFA脱保护。得到12mg(经2步的理论值的52％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L11
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1S,2R)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)
Figure BDA0003554407600004371
标题化合物是通过以下方式由中间体L6来制备，即通过用 EDC/HOBT与(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸偶联，随后用 TFA脱保护。得到11mg(经2步的理论值的39％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L12
三氟乙酸/1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
Figure BDA0003554407600004381
将381mg(2.46mmol)2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯加入到228mg(1.12mmol)溶于7ml二噁烷/水1:1中的[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯中。然后加入1.2ml饱和碳酸氢钠溶液，并且将反应在RT下搅拌。在总共5天的搅拌和进一步添加相同量的碳酸氢钠溶液2次之后，将反应通过用三氟乙酸酸化、在旋转蒸发器上浓缩并通过制备型HPLC纯化残余物来进行后处理。合并适当的级分，减压移除溶剂，并且将残余物从乙腈/水1:1中冻干。
将残余物溶于3ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸。在RT下搅拌15min后，减压移除溶剂并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。得到70mg (经2步的理论值的67％)的标题化合物，其为树脂状残余物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.18min；MS(ESIpos):m/z＝185(M+H)+。
中间体L13
三氟乙酸/N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004382
标题化合物是通过在存在EDC/HOBT的情况下偶联(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸与N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)，随后以与中间体L6类似的方式温和地移除叔丁氧基羰基保护基来制备。
HPLC(方法11):Rt＝0.42min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.43min；MS(ESIpos):m/z＝340(M+H)+。
中间体L14
三氟乙酸/1-[2-(4-氨基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮 (1:1)
Figure BDA0003554407600004391
以与中间体L2类似的方式，经2步从哌嗪-1-基氨基甲酸叔丁酯和 (2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝239(M+H)+。
中间体L15
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004392
将2.93g(10.58mmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯溶于100ml二噁烷/水1:1中，加入3.28g(21.15mmol)2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-羧酸甲酯和饱和碳酸氢钠溶液直到达到6-7的 pH值。将溶液在RT下搅拌30min，然后减压蒸发1,4-二噁烷。然后加入200ml水，并将混合物用300ml乙酸乙酯萃取(在每种情况下)三次。合并有机萃取物，用硫酸镁干燥并过滤。浓缩得到棕色油状的 3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基) 丙酸叔丁酯，然后将其在高真空下干燥。
HPLC(方法11):Rt＝1.5min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝375(M+NH4)+。
通过标准方法(用TFA脱保护，与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯偶联并用TFA再次脱保护)该中间体转化为标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝344(M+H)+。
中间体L16
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5- 氨基甲酰基-L-鸟氨酸
Figure BDA0003554407600004401
将535mg(1.73mmol)可商购的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮和930ml N,N-二异丙基乙胺加入到 266mg(1.33mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸在24ml DMF 中的溶液中。反应在超声波浴中处理24h，然后减压浓缩至干燥。剩余的残余物是通过制备型HPCL纯化，在浓缩适当的级分并在高真空下干燥残余物之后，得到337mg(理论值的50％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.4min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝468(M+H)+。
中间体L17
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004402
标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在EDC/HOBT和N,N- 二异丙基乙胺的情况下偶联172mg(0.37mmol)中间体L16和125mg (0.37mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)，然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸DCM溶液中在RT下搅拌 2h使氨基脱保护。从乙腈/水中的冻干，经2步得到194mg(理论值的 49％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.1min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝652(M+H)+。
中间体L18
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基 -2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004411
标题化合物是根据肽化学的经典方法，以与中间体L7类似的方式，通过以下方式由(4-氨基苯基)乙酸甲酯来制备，即通过在存在HATU 的情况下连接N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，用 TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用TFA再次脱保护。得到330mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.29min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.41min；MS(ESIpos):m/z＝465(M+H)+。
中间体L19
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004412
标题化合物是依次根据肽化学的经典方法，由1,4-苯二胺制备。在第一步中，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将942mg(8.72 mmol)1,4-苯二胺用0.8g(2.9mmol)N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸来单酰化。在第二步中，以类似的方式，在存在HATU和 N,N-二异丙基乙胺的情况下，将仲苯胺基氨基用(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酸来酰化。用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L- 丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，并用TFA再次脱保护，然后在另外3个合成步骤中得到标题化合物，通过该路线得到148mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.21min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
LC-MS(方法4):Rt＝0.2min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
中间体L20
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004421
标题化合物是以与中间体L8类似的方式，根据肽化学的经典方法，通过以下步骤由可商购的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过依次在存在HATU的情况下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基 -L-鸟氨酸偶联，用TFA脱保护，与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，并用TFA再次脱保护。得到171mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.28min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.39min；MS(ESIpos):m/z＝445(M+H)+。
中间体L21
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-赖氨酰胺
Figure BDA0003554407600004431
标题化合物是根据肽化学的经典方法，通过以下方式由可商购的 0.42g(2.56mmol)(4-氨基苯基)乙酸甲酯制备，即通过依次在存在 HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与N6-(叔丁氧基羰基)-N2-[(9H- 芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸偶联，用哌啶脱保护，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1- 基酯偶联，随后在10％在活性炭上的钯上氢解移除苄氧基羰基保护基。
HPLC(方法11):Rt＝1.5min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝493(M+H)+。
中间体L22
三氟乙酸/N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(2S)-2- 氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]苯基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004432
标题化合物是依次根据肽化学的经典方法由N-(叔丁氧基羰基)-4- 硝基-L-苯丙氨酸制备。在第一步中，首先将2.5g(8.06mmol)该起始原料转化为铯盐，然后用碘甲烷的DMF溶液转化为甲酯。
在甲醇中经在10％在活性炭上的钯上氢解，然后将硝基转化为氨基。
然后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将以该方式生成的氨基用N5-氨基甲酰基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酸的 DMF溶液来酰化。在下一步中，用哌啶的DMF溶液移除Fmoc基团。
然后在存在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基 -1H-苯并三唑水合物和N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中用 N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸进行偶联，最后用三氟乙酸移除叔丁氧基羰基。
HPLC(方法11):Rt＝1.6min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
中间体L23
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-β-丙氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004441
标题化合物是通过以下方式由可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即在存在EDCI/HOBT和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联，然后用三氟乙酸脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min.
中间体L24
三氟乙酸/1-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环丙烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004442
将114mg(0.67mmol)可商购的1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷羧酸溶于25ml DCM中，加入110mg(0.623mmol)可商购的三氟乙酸/ 1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)和395μl N,N-二异丙基乙胺，将混合物冷却至-10℃。然后加入217mg(0.793mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐，将混合物在RT下搅拌2h。然后将混合物用乙酸乙酯稀释并连续用10％浓度的柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液萃取，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到152mg受保护的中间体。
然后将它们溶于10ml DCM中并用1ml三氟乙酸脱保护。从乙腈/ 水中冻干，得到158mg(经2步的理论值的71％)的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min.
LC-MS(方法3):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝224(M+H)+。
中间体L25
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
Figure BDA0003554407600004451
将31.4mg(0.17mmol)缬氨酰基-L-丙氨酸溶于3.0ml DMF中，加入115.0mg(0.17mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24- 八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和33.7mg(0.33mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到74.1mg(理论值的58％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.61min；MS(ESIpos):m/z＝763[M+H]+。
中间体L26
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
Figure BDA0003554407600004461
将600.0mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L- 赖氨酸悬浮于25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中，加入在活性炭上的靶 (10％)，并将混合物在RT下用标准压力下的氢气氢化5h。滤出催化剂，并且减压蒸发溶剂。所得化合物不经进一步纯化即用于下一步。
LC-MS(方法1):Rt＝0.42min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180mg(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于5.0ml DMF中，加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。然后加入254.6mg(0.73 mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg (0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。反应溶液通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
首先将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸加入20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中，加入27.2mg在活性炭上的钯。在RT和标准压力下将混合物用氢气氢化 5h。借助Celite(R)过滤混合物，并且将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1) 洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。标题化合物(182mg，理论值的72％)未经进一步纯化即用于下一反应步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
中间体L27
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
Figure BDA0003554407600004471
首先将30mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(中间体L26)和46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代 -3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺加入1.5ml DMF中，加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应溶液在RT下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到55.6mg(理论值的90％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝920[M+H]+。
中间体L28
3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004472
首先将461.7mg(1.15mmol)3-乙基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯(该化合物是根据WO 2006/066896的文献方法制备)加入5.0ml无水二氯甲烷中，并将混合物冷却至-78℃。然后缓慢滴加326.2mg(2.29mmol)二异丁基氢化铝溶液(1M，在THF中)，并将混合物在-78℃下搅拌2h(通过薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)监测)。逐滴加入溶于60ml水中的1.3g (4.59mmol)酒石酸钾钠溶液，使反应混合物升温至RT。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并且将水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次，并且用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到629.0mg作为粗产物的标题化合物，将其不经进一步纯化即立即用于下一反应步骤中。
中间体L29
3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷 -1-羧酸叔丁酯
非对映异构体的混合物
Figure BDA0003554407600004481
首先将807.1mg(2.34mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基} 甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(根据WO 2006/100036的文献方法制备)加入8.0ml二氯甲烷中，加入236.4mg(2.34mmol)三乙胺。在0℃下，滴加267.6mg(2.34mmol)甲磺酰氯，并将反应混合物在 RT下搅拌过夜。再加入133.8mg(1.17mmol)甲磺酰氯和118.2mg(1.17 mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用饱和的碳酸氢钠溶液、5％浓度的硫酸氢钾溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在Biotage Isolera(硅胶，柱50g SNAP，流速66ml/min，环己烷/乙酸乙酯)上纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到402.0mg(理论值的41％)化合物3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝424[M+H]+。
首先将400.0mg(0.94mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基} 甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入5.0ml DMF中，加入98.2mg(1.51mmol)叠氮化钠。将反应混合物在40℃下搅拌10h。然后再加入30.7mg(0.47mmol)叠氮化钠，并将该混合物在40℃下再搅拌10h。加入乙酸乙酯，并且将有机相用水反复洗涤。用硫酸镁干燥有机相后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到309.5mg(理论值的89％)化合物3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝1.50min；MS(ESIpos):m/z＝371[M+H]+。
将250mg(0.68mmol)3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于10.0ml乙酸乙酯/乙醇(1:1) 中，加入25.0mg在活性炭上的靶(10％)。在RT和标准压力下，将混合物用氢气氢化8h。通过Celite(R)过滤反应物，并将滤饼用乙酸乙酯充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到226.2mg (理论值的82％)化合物3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基] 氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝345[M+H]+。
715.0mg(2.08mmol)3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基] 氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于15.0ml THF中，并且加入2.28ml (2.28mmol)TBAF溶液(1M，在THF中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，残余物(1.54g)不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.41min；MS(ESIpos):m/z＝231[M+H]+。
首先将1.54g(4.88mmol)3-(氨基甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入1,4-二噁烷中，加入541.8mg(4.88mmol)氯化钙(无水) 和488.6mg(4.88mmol)碳酸钙，并且剧烈搅拌混合物。然后加入592.8 mg(5.86mmol)三乙胺和1.52g(5.86mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮，并且将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入644.9mg(10.7mmol)HOAc和乙酸乙酯。有机相用水洗涤两次，用饱和NaCl溶液洗涤一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:1)上纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到346.9mg(理论值的19％) 化合物3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝375[M+H]+。
首先将804.0mg(2.15mmol)3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入20.0ml氯仿和20.0 ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入59.7mg(0.22 mmol)氯化四正丁基铵，然后加入429.9mg(3.22mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和33.5mg(0.22mmol)TEMPO，并且将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。将有机相分离出来并减压移除溶剂。残余物通过硅胶(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)色谱分离。得到517.0mg(理论值的46％) 的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝373[M+H]+。
中间体L30
3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯
立体异构体的混合物
Figure BDA0003554407600004501
首先将250.0mg(0.72mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基} 甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(该化合物根据WO 2006/100036 的文献方法制备)加入12.5ml二氯甲烷/DMSO(4:1)中，并加入219.6 mg(2.17mmol)三乙胺。在2℃下，每次一点地加入345.5mg(2.17mmol) 三氧化硫-吡啶复合体，并将混合物在2℃下搅拌3h。再每次一点地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶复合体，并将混合物在RT下搅拌17h。将反应混合物在二氯甲烷和水之间分配。将水相用二氯甲烷萃取三次，将合并的有机相用水洗涤一次并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤(薄层色谱法：石油醚/乙酸乙酯7:3)。
中间体L31
{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙二酸二叔丁酯
Figure BDA0003554407600004511
将57.2g(488.27mmol)氨基甲酸叔丁酯、51.2ml(683.57mmol) 37％浓度的甲醛水溶液和25.9g(244.13mmol)碳酸钠加入到600ml 水中。加热混合物直至形成溶液，然后在RT下搅拌16h。用500ml 二氯甲烷萃取所形成的悬液，分离出有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤并用硫酸钠干燥。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物在高真空下干燥，得到结晶固体。将残余物溶于1000ml无水THF中，并在RT下逐滴加入322ml(3.414mol)乙酸酐和138ml(1.707mol)吡啶的混合物。将反应混合物在RT下搅拌16h，然后在旋转蒸发器上浓缩(在室温下水浴)。将残余物溶于乙醚中，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次，并用饱和氯化钠溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥2天。将残余物溶于2000ml无水THF中，并在冰冷却下加入456ml(456.52mmol)1M叔丁醇钾的THF溶液。将混合物在0℃下搅拌20min，然后滴加溶于200ml无水THF中的100.8 g(456.52mmol)丙二酸二叔丁酯。将混合物在RT下搅拌48h，然后加入水。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并溶于500ml乙酸乙酯中。混合物用500ml水和100ml饱和氯化钠溶液洗涤，并且将有机相用硫酸钠干燥。有机相在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥。通过硅胶过滤(流动相：环己烷/乙酸乙酯，梯度＝30:1→5:1)纯化残余物。得到37.07g(理论值的22％)目标化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.87min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
中间体L32
[3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004521
将37.0g(107.11mmol)(乙酰氧基甲基)丙二酸二叔丁酯溶于1000 ml无水THF中，在冰冷却下滴加535.5ml(1071.10mmol)2M硼氢化锂的THF溶液。逐滴加入19.3ml(1071.10mmol)水，并将混合物在 RT下搅拌4.5h。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于1500ml乙酸乙酯中，加入100ml水，并将混合物在水冷(稍微放热的)下搅拌30min。分离出有机相，并且将水相用500ml 乙酸乙酯萃取两次。有机相在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥。得到20.7g(理论值的94％)目标化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝1.49min；MS(EIpos):m/z＝106[M-C5H8O2]+。
中间体L33
[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004531
将20.00g(97.44mmol)(3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶于1000ml无水二氯甲烷中，然后在RT下加入6.63g(97.44mmol) 咪唑和16.16g(107.18mmol)叔丁基(氯)二甲基硅烷。将反应混合物在 RT下搅拌16h，并用半浓缩的氯化钠溶液洗涤。水相用乙酸乙酯萃取，并且将合并的有机相用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。得到28.50g(理论值的92％)目标化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.02(s,6H),0.86(s,9H), 1.37(s,9H),1.58-1.73(m,1H),2.91(q,2H),3.33-3.36[m,(2H,hidden)], 3.53-3.58(m,2H),6.65-6.72(m,1H).
中间体L34
(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004532
将12.65g(39.591mmol)[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶于200ml二氯甲烷中，并在RT下逐滴加入19.31g(45.53mmol)溶于150ml二氯甲烷中的Dess-Martin过碘烷。将混合物在RT下搅拌2h，然后加入250ml半浓缩的碳酸氢钠溶液和250ml 10％浓度的硫代硫酸钠溶液，将混合物搅拌20min。分离出有机相，水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用300ml水洗涤，用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。得到11.35g(理论值的90％)目标化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.02(s,6H),0.84(s,9H), 1.36(s,9H),1.48-1.51(m,1H),3.08-3.32[m,(1H,hidden)],3.50-3.58(m, 2H),3.81-3.91(m,1H),6.71(t,1H),9.60(d,1H).
中间体L35
(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004541
标题化合物是根据文献(例如Jean Bastide et al.J.Med.Chem.2003, 46(16),3536-3545)中已知的方法制备。
中间体L36
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
Figure BDA0003554407600004542
将100mg(0.57mmol)N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸溶于4.0ml DMF 中，加入0.08ml(0.57mmol)三乙胺。然后加入199.0mg(0.57mmol) 2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和0.08ml(0.57 mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌48h。通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/含0.1％TFA的水) 直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到75.7mg(理论值的33％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.69min；MS(ESIpos):m/z＝409[M+H]+。
中间体L37
L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
Figure BDA0003554407600004551
将75.7mg(0.19mmol)中间体L36悬浮于25ml水/乙醇/THF中，加入7.5mg在活性炭上的钯(10％)，将混合物在RT下用在标准压力下的氢气氢化4.5h。滤出催化剂，减压移除反应混合物中的溶剂并在高真空下干燥。将残余物不经进一步纯化即用于下一步。得到64.9mg(理论值的93％)的标题化合物。得到64.9mg(理论值的93％)的标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝275[M+H]+。
中间体L38
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
Figure BDA0003554407600004552
首先将38.3mg(0.14mmol)中间体L37加入3.0ml DMF中，并加入96.4mg(0.14mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24- 八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和39.0μl(0.28mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌过夜。然后加入16.0μl(0.28mmol)HOAc，将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到58.9mg(理论值的45％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.61min；MS(ESIpos):m/z＝849[M+H]+。
中间体L39
(2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004561
首先将300mg(2.64mmol)2-氨基乙硫醇盐酸盐(1:1)加入3.0ml 二氯甲烷中，加入668.0mg(6.60mmol)三乙胺和719.1mg(2.77mmol) 1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮。将混合物在RT下搅拌2天(通过薄层色谱监测：二氯甲烷/甲醇＝100:1.5)。加入乙酸乙酯，并将反应混合物用水洗涤三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤两次并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
中间体L40
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
Figure BDA0003554407600004562
将600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L- 赖氨酸在25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中用在活性炭上的靶(10％)，在RT和标准压力下用氢气氢化。化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180.0(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于5.0ml DMF 中，并加入74.0mg(0.73mmol)加入三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol) N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73 mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA) 直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基 -N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于20ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中，加入 27.2mg在活性炭上的钯，将混合物在标准压力和RT下用氢气氢化。混合物通过Celite(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到182.0mg(理论值的72％)化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
将30.0mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24- 八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶于1.5mlDMF中，加入6.8mg(0.07 mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到 55.6mg(理论值的90％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝920[M+H]+。
中间体L41
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
Figure BDA0003554407600004581
将600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L- 赖氨酸在25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中用在活性炭上的钯(10％) 在RT和标准压力下用氢气氢化。化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180.0(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于5.0ml DMF 中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol) N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73 mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA) 直接纯化反应混合物。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶于20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中,加入 27.2mg在活性炭上的钯，将混合物在标准压力和RT下用氢气氢化。将混合物经Celite(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到182.0mg(理论值的72％)化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
将30.0mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和34.3mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶于1.5ml DMF中，加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到40.6mg(理论值的82％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝744[M+H]+。
中间体L42
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
Figure BDA0003554407600004591
首先将50.0mg(0.18mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸 (中间体L37)加入到DMF中，加入93.6mg(0.18mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和36.9mg(0.37mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入21.9mg(0.37mmol)HOAc，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到20.6mg(理论值的14％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.55min；MS(ESIpos):m/z＝673[M+H]+。
中间体L43
N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64- 氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
Figure BDA0003554407600004601
首先将11.3mg(0.04mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸 (中间体L37)加入DMF中，并加入50.0mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-63-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧杂六十三烷-1-基}丙酰胺和8.3mg(0.08mmol)三乙胺。将反应混合物在 RT下搅拌过夜。加入4.9mg(0.08mmol)HOAc，并通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到15.8 mg(理论值的20％)的标题化合物。
LC-MS(方法4):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1377[M+H]+。
中间体L44
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
Figure BDA0003554407600004611
将73.3mg(0.39mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶于7.0ml DMF中，加入200.0mg(0.39mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和78.8mg(0.78mmol)三乙胺。将反应混合物在RT 下搅拌过夜。反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到103.3mg(理论值的45％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝587[M+H]+。
中间体L45
(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004612
将2.00g(7.26mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶于 90ml二氯甲烷中，然后加入1.76ml吡啶和4.62g(10.90mmol)1,1,1- 三乙酰氧基-1λ5,2-苯碘酰基-3(1H)-酮(Dess-Martin过碘烷)。将反应物在RT下搅拌2h，然后用200ml二氯甲烷稀释，用10％浓度的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后连续用5％浓度的柠檬酸萃取两次，用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。分离出有机相，用硫酸钠干燥，然后减压浓缩。将100ml乙醚和环己烷(v/v＝1:1)加入到残余物中，结果形成白色沉淀。抽吸过滤。将滤液在旋转蒸发器上浓缩，并在高真空下干燥，得到 1.74g(理论值的88％)目标化合物，其为浅黄色油状物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝274[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.38(s,18H),2.64-2.81(m, 2H),4.31-4.36(m,1H),7.23(d,1H),9.59(s,1H).
中间体L46
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-谷氨酸叔丁酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004621
标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在EDC/HOBT和N,N- 二异丙基乙胺的情况下，将200mg(0.79mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)与263mg(0.87mmol)(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸/三氟乙酸(1:1)偶联，然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌1h将氨基脱保护。从乙腈/水中冻干，经2步得到85mg(理论值的20％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.37min；MS(ESIpos):m/z＝326[M+H]+。
中间体L47
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004631
标题化合物是通过将中间体L8与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5- 二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，随后用TFA脱保护来制备。
LC-MS(方法3):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝488(M+H)+。
中间体L48
三氟乙酸/(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004632
以与中间体L2类似的方式，由可商购的(1R,2S)-2-[(叔丁氧基羰基) 氨基]环戊烷羧酸制备标题化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝1.22min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L49
三氟乙酸/N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁基酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004641
标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在二氯甲烷中偶联可商购的溴乙酸酐，然后是部分受保护的肽 L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯(按照肽化学的经典方法制备)。然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌在氨基上进行脱保护，经2步得到标题化合物，产率为49％。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝593和595 (M+H)+。
中间体L50
三氟乙酸/(1S,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004642
标题化合物是通过以下方式由可商购的(1S,3R)-3-[(叔丁氧基羰基) 氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯 -2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下用 HATU偶联，并随后用TFA脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L51
三氟乙酸/(1R,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004651
标题化合物是通过以下方式由可商购的(1R,3R)-3-[(叔丁氧基羰基) 氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯 -2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下用 HATU偶联，并随后用TFA脱保护。
LC-MS(方法3):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝250(M-H)-.
中间体L52
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004652
将420mg(2.62mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯溶于50ml二氯甲烷中，加入817mg(3.15mmol)溴乙酸酐和913μl(5.24mmol) N,N-二异丙基乙胺。将反应在RT下搅拌1h，然后减压浓缩。残余物经制备型HPLC纯化。
得到577mg受保护的中间体，然后将其溶入50ml二氯甲烷中，并加入10ml三氟乙酸。在RT下搅拌1h后，将反应减压浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干。得到705mg(理论值的65％)的标题化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝0.34min；MS(ESIpos):m/z＝181和183 (M+H)+。
中间体L53
三氟乙酸/(1S,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004661
标题化合物是通过以下方式由可商购的(1S,3S)-3-[(叔丁氧基羰基) 氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯 -2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下用 HATU偶联，并随后用TFA脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝250(M-H)-.
中间体L54
三氟乙酸/(1R,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004662
标题化合物是通过以下方式由可商购的(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基) 氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯 -2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下用 HATU偶联，随后用TFA脱保护。
LC-MS(方法3):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L55
三氟乙酸/N6-D-丙氨酰基-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004671
标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在HATU的情况下将中间体L6与N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸偶联，随后在温和条件下通过在 5％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌90min在氨基上进行脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝1.35min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.67min；MS(ESIpos):m/z＝637(M+H)+。
中间体L56
三氟乙酸/叔丁基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004672
标题化合物通过以下步骤制备：首先在存在HATU的情况下将中间体L6与(1R,3S)-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸偶联，然后在温和条件下通过在25％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌15min来在氨基上进行脱保护。
HPLC(方法11):Rt＝1.4min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.7min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L57
(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯
Figure BDA0003554407600004681
首先将500.0mg(2.72mmol)L-天冬氨酸甲酯盐酸盐和706.3mg (2.72mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯加入5.0 ml 1,4-二噁烷中，并加入826.8mg(8.17mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250 x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到583.9mg(理论值的74％)化合物(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基] 羰基}氨基)丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIneg):m/z＝290(M-H)-.
首先将592.9mg(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸加入10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷中，将混合物冷却至-15℃，加入205.8mg(2.04mmol)4-甲基吗啉和277.9mg(2.04mmol) 氯甲酸异丁酯。15min后通过抽滤滤出沉淀物，用10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷(在每种情况下)进行两次。将滤液冷却至-10℃，剧烈搅拌下加入溶于10ml水中的115.5mg(3.05mmol)硼氢化钠。分离各相，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤(在每种情况下)一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到515.9mg(理论值的91％)化合物N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基] 羰基}-L-高丝氨酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝278(M+H)+。
将554.9mg(2.00mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L- 高丝氨酸甲酯加入30.0ml二氯甲烷中，并加入1.27g(3.0mmol) Dess-Martin过碘烷和474.7mg(6.00mmol)吡啶。将混合物在RT下搅拌过夜。4h后，反应用二氯甲烷稀释，并且将有机相用10％浓度的 Na2S2O3溶液、10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤(在每种情况下)三次。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。得到565.7 mg(理论值的97％)的标题化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.91(m,2H), 2.70-2.79(m,1H),2.88(dd,1H),3.63(s,3H),4.04(m,2H),4.55(m,1H), 7.54(d,1H),9.60(t,1H).
中间体L58
(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004691
将434.4mg(5.78mmol)3-氨基-1-丙醇和1.50g(5.78mmol)2,5- 二氧代吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶于10.0ml二氯甲烷中，加入585.3mg(5.78mmol)三乙胺，并且将混合物在RT下搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂。残余物(3-羟基丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(996.4mg，理论值的79％)在高真空下干燥，不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
首先将807.0mg(3.68mmol)(3-羟基丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯加入15.0ml氯仿和15.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入102.2mg(0.37mmol)四正丁基氯化铵、736.9 mg(5.52mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和57.5mg(0.37mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。将残余物在高真空下干燥，并且不经进一步纯化即用于下一合成步骤(890.3mg)。
中间体L59
三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮 (1:1)
Figure BDA0003554407600004701
首先将300.0mg(0.91mmol)(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯加入二氯甲烷中，加入4.2 g(36.54mmol)TFA并将混合物在RT下搅拌1h(通过TLC监测：二氯甲烷/甲醇10:1)。减压蒸发挥发性组分，并且将残余物与二氯甲烷一起共蒸馏四次。将残余物在高真空下干燥，并且不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.19min；MS(ESIpos):m/z＝229(M+H)+。
中间体L60
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯
Figure BDA0003554407600004702
将200.0mg(0.95mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸溶于4.0ml二氯甲烷中，加入338.0mg(2.84mmol)亚硫酰氯。将反应混合物在RT下搅拌3h，然后加入1滴DMF。将混合物再搅拌1h。减压蒸发溶剂，并且将残余物与二氯甲烷共蒸馏三次。粗产物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
中间体L61
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004711
首先，肽衍生物L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯是根据肽化学的经典方法由N2-[(苄氧基) 羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸制备(用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，氢解，在存在HATU的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联并再一次氢解)。标题化合物是通过将该部分保护的肽衍生物与可商购的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 已酸在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联来制备。然后在温和条件下通过在5％浓度的三氟乙酸的DCM溶液中在RT下搅拌2.5 h，在保留酯保护基的情况下，在氨基上进行脱保护。后处理并通过制备型HPLC纯化，得到438mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.69min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝610(M+H)+。
中间体L62
三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸酯 (1:1)
Figure BDA0003554407600004721
首先，N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯是根据肽化学的经典方法由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸制备。然后在存在195mg(0.51mmol)HATU和149μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将148mg(0.43mmol)该中间体与200mg(0.43mmol) 中间体L16偶联。在浓缩并通过制备型HPLC纯化残余物后，将受保护的中间体溶于20ml DCM中，通过加入2ml三氟乙酸并在RT下搅拌1 h移除叔丁氧基羰基保护基。将残余物浓缩并从乙腈/水中冻干，得到254 mg(经2步的理论值的63％)。
HPLC(方法11):Rt＝1.51min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.68min；MS(ESIpos):m/z＝696(M+H)+。
中间体L63
(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸
Figure BDA0003554407600004722
首先，肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰基]氨基} 丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸是根据肽化学的经典方法由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸制备 (用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，用三氟乙酸移除 Boc保护基，在存在HATU的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L- 丙氨酸偶联，并在甲醇中在10％在活性炭上的钯上氢解)。标题化合物是通过将该部分保护的肽衍生物与可商购的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1- 基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联来制备。后处理并通过制备型HPLC纯化，得到601mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝611(M+H)+。
中间体L64
(4S)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-5-氧代 -5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸
Figure BDA0003554407600004731
标题化合物是根据肽化学的经典方法由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸制备(用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，用三氟乙酸移除Boc保护基，在甲醇中在10％在活性炭上的钯上氢解裂解苄基酯，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与1-{2-[(2,5- 二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝385(M+H)+。
中间体L65
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-L-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004741
标题化合物是根据肽化学的经典方法由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸制备(用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，并用三氟乙酸移除Boc保护基)。得到373mg(经2 步的理论值的79％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.72min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
中间体L66
(8S)-8-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-甲酯
Figure BDA0003554407600004742
首先将1000mg(2.84mmol)(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸加入10ml 1,2-二甲氧基乙烷中，加入344.4mg(3.4 mmol)的4-甲基吗啉和504mg(3.69mmol)氯甲酸异丁酯。在RT下搅拌10min后，将反应物冷却至5℃，在剧烈搅拌下每次一点地加入溶于3ml水中的161mg(4.26mmol)硼氢化钠。1h后，再次加入等量的硼氢化钠，然后将反应物缓慢升温至RT。加入170ml水，然后将反应物用200ml乙酸乙酯萃取(在每种情况下)四次。分离各相，有机相用柠檬酸洗涤一次，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到760mg(理论值的78％)化合物[(2S)-4-羟基丁烷-1,2-二基]二氨基甲酸苄基叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
将760mg(2.16mmol)溶于13ml氯化氢/二噁烷中的该中间体在 RT下搅拌20min。然后将反应浓缩至5ml，并且加入乙醚。滤出沉淀物并从乙腈/水1:1中冻干。
将以该方式获得的产物溶于132ml DMF中，加入345.5mg(2.35 mmol)4-甲氧基-4-氧代丁酸，加入970mg(2.55mmol)HATU和1025 μl N,N-二异丙基乙胺。将混合物在RT下搅拌5min。减压移除溶剂，并且将剩余的残余物通过制备型HPLC纯化。将适当的级分合并，并且减压蒸发乙腈。剩余的水相用乙酸乙酯萃取两次，然后浓缩有机相并在高真空下干燥。
将以该方式获得的中间体溶于甲醇中，并在10％在活性炭上的钯上在RT和氢气标准压力下氢化1h。然后滤出催化剂，并且减压移除溶剂。
将247mg该脱保护的化合物溶于20ml DMF中，并加入352mg (1.36mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和592μl N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌1h，然后浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。经过这5个反应步骤得到218mg标题化合物，总产率为21％。
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝363(M+H)+。
中间体L67
三氟乙酸/2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基-β-丙氨酸酯 (1:1)
Figure BDA0003554407600004751
标题化合物是通过以下方式由50mg(0.354mmol)可商购的1-(2- 羟基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过在存在1.5个当量的EDCI 和0.1个当量的4-N,N-二甲基氨基吡啶的情况下，与在10ml二氯甲烷中的134mg(0.71mmol)N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联，然后用三氟乙酸脱保护。
产量：56mg(经过2个阶段的理论值的48％)
LC-MS(方法3):Rt＝1.15min；MS(ESIpos):m/z＝213(M+H)+。
中间体L68
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004761
以与中间体L1类似的方式，根据肽化学的经典方法由可商购的(2,5- 二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝212(M+H)+。
中间体L69
三氟乙酸/1-[(苄氧基)羰基]哌啶-4-基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基 -L-鸟氨酸酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004762
标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的4-羟基哌啶-1-羧酸苄酯制备，即通过使用EDCI/DMAP与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸来酯化，随后用TFA移除Boc，然后在存在HATU和 N,N-二异丙基乙胺的情况下与N-[(叔丁氧基)羰基]-L-缬氨酸偶联，最后再次用TFA移除Boc。
LC-MS(方法1):Rt＝0.62min；MS(ESIpos):m/z＝492(M+H)+。
中间体L70
9H-芴-9-基甲基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯
Figure BDA0003554407600004771
首先将1000.0mg(3.36mmol)(3-羟基丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲基酯加入15.0ml氯仿和15.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液 (1:1)中。然后加入93.5mg(0.34mmol)四正丁基氯化铵、673.6mg (5.04mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和52.5mg(0.34mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和的NaCl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。将残余物在高真空下干燥并在硅胶上纯化(流动相：环己烷/ 乙酸乙酯3:1-1:1)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到589.4mg(理论值的58％)的标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.15min；MS(ESIpos):m/z＝296(M-H)+。
中间体L71
[4-(氯羰基)苯基]氨基甲酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004772
首先将100.0mg(0.42mmol)4-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酸加入 2.0ml二氯甲烷中，加入64.2mg(0.51mmol)草酰二氯(oxalyl dichloride)。将反应混合物在RT下搅拌30min(通过TLC监测：二氯甲烷/甲醇)。然后再加入192.6mg(1.53mmol)草酰二氯和1滴DMF，并将混合物在RT下搅拌1h。减压蒸发溶剂，并且将残余物与二氯甲烷反复共蒸馏。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。
中间体L72
(9S)-9-(羟甲基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄基酯
Figure BDA0003554407600004781
标题化合物是根据肽化学的经典方法，通过以下方式由可商购的 [(2S)-3-羟基丙-1,2-二基]二氨基甲酸苄基叔丁酯制备，即通过氢解移除Z 保护基，随后在存在EDCI/HOBT的情况下与4-(苄氧基)-4-氧代丁酸偶联，然后用TFA移除Boc保护基，最后通过在存在三乙胺的情况下与 1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝425[M+H]+。
中间体L73
N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺
Figure BDA0003554407600004782
将395.5mg(1.87mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸、1.21g(9.36mmol)N,N-二异丙基乙胺和854.3mg(2.25mmol) mmol)HATU加入到300mg(1.87mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯在20ml二甲基甲酰胺中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5min。浓缩混合物后，将残余物溶解在DCM中并用水洗涤。有机相用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。得到408mg(33％，纯度53％)的标题化合物，其不经进一步纯化即使用。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝354(M+H)+。
将1ml TFA加入到(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯(408mg，0.365mmol)在7ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌0.5h。将反应混合物减压浓缩并将残余物与二氯甲烷一起共蒸馏两次。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到384mg(94％，纯度57％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.26min；MS(ESIpos):m/z＝254(M+H)+。
中间体L74
3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]丙酸
Figure BDA0003554407600004791
将107mg(0.335mmol)3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基] 乙氧基]丙酸叔丁酯和93mg(0.369mmol)2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酸 (2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯溶于5ml二甲基甲酰胺中，加入0.074ml (0.671mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048 ml(0.838mmol)乙酸，通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125×30； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到133mg(86％，纯度 100％)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝459(M+H)+。
将0.5ml TFA加入到3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基] 氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯(130mg，0.284mmol) 在5ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到102mg(90％，纯度100％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.52min；MS(ESIpos):m/z＝402(M+H)+。
中间体L75
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004801
标题化合物是根据肽化学的经典方法，由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸制备(用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，并用三氟乙酸移除Boc保护基)。得到405mg(经 2步的理论值的58％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
中间体L76
(2S)-2-溴-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸
Figure BDA0003554407600004802
首先，由(3S)-4-(苄氧基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸根据肽化学的经典方法制备适当受保护的天冬氨酸衍生物(用EDCI/DMAP与 2-(三甲基甲硅烷基)乙醇来酯化，并氢解移除Z保护基和苄基酯)。
将以该方式得到的470mg(1.8mmol)(2S)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸悬浮于10ml水中，加入1.8ml 1摩尔浓度的盐酸和0.5ml浓硫酸，然后加入863mg(7.25mmol)溴化钾。然后在10℃下，经30min逐滴加入150mg(2.175mmol)亚硝酸钠在1ml 水中的溶液，并将混合物在10-15℃下搅拌2h。然后用50ml乙酸乙酯萃取混合物。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并用硫酸镁干燥。蒸发溶剂并通过制备型HPLC纯化产物，得到260mg(理论值的48％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIneg):m/z＝295和297 (M-H)-.
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.95(t,2H),2.94 and 3.2(2dd,2H),4.18(t,2H),4.57(t,1H).
中间体L77
三氟乙酸/N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-溴乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004811
首先将418mg(2.05mmol)[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯与638mg(2.46mmol)溴乙酸酐反应，然后用三氟乙酸移除Boc保护基。得到551mg(理论值的63％)的标题化合物。
LC-MS(方法):Rt＝0.32min；MS(ESIpos):m/z＝227和225 (M+H)+。
中间体L78
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸
Figure BDA0003554407600004812
标题化合物是通过以下方式由可商购的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸制备，即通过在存在EDCI/HOBt和N,N-二异丙基乙胺的情况下与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联，随后用三氟乙酸脱保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.32min；MS(ESIpos):m/z＝227(M+H)+。
中间体L79
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸
Figure BDA0003554407600004813
将64.8mg(0.357mmol)β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)和100mg (0.324mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}1H-吡咯-2,5-二酮溶于4ml二甲基甲酰胺中，加入65.6mg(0.649mmol)N- 甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol) 乙酸，反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到84.5mg(77％，纯度100％)N-[6-(2,5- 二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
将1.62ml TFA加入到N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯(82.8mg，0.244mmol)在8ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌2h。将反应混合物减压浓缩，将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到62.7mg (87％，纯度95％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝283(M+H)+。
中间体L80
3-[(15-氨基-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基)氨基]-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
Figure BDA0003554407600004821
标题化合物是根据肽化学的经典方法由可商购的3-{[(苄氧基)羰基] 氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)制备(从盐中释放，并用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇来酯化，氢解移除Z保护基，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与可商购的 3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸偶联，再次氢解移除Z保护基)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.70min；MS(ESIpos):m/z＝552(M+H)+。
中间体L81
三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄基酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004831
在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，将250mg(1.11mmol)2,2'- 磺酰基二乙胺与92.3mg(0.37mmol)1-{[(苄氧基)羰基]氧基}吡咯烷 -2,5-二酮在DMF中偶联。随后通过HPLC纯化，得到70mg(理论值的47％)的标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.64min；MS(ESIpos):m/z＝257.11 (M+H)+。
中间体L82
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004832
将88.6mg(0.357mmol)N-Boc-2,2'-(亚乙二氧基)二乙胺和100mg (0.324mmol)6-马来酰亚胺基己酸N-琥珀酰亚胺酯溶于4.0ml二甲基甲酰胺中，加入0.071ml(0.650mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在 RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：75ml/min，MeCN/ 水/0.1％TFA)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到127mg(理论值的81％){2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝442(M+H)+。
将2.0ml TFA加入123mg(225μmol){2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯在7.5ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌2h。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到111mg(理论值的100％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.31min；MS(ESIpos):m/z＝342(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.17(m,2H),1.47(m,4H), 2.04(m,2H),2.98(m,2H),3.19(m,2H),3.39(m,4H),3,56(m,6H),7.01 (s,2H),7.72(bs,3H),7.80(m,1H).
中间体L83
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004841
将200mg(0.805mmol){2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯、150mg(0.966mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙酸和560μl(3.2mmol)N,N-二异丙基乙胺溶于10ml二甲基甲酰胺中，加入459mg(1.21mmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌30min。减压蒸发溶剂，并且将残余物溶于二氯甲烷。有机相用5％柠檬酸溶液洗涤两次，用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。使用Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，二氯甲烷:甲醇98:2)纯化残余物。得到276mg(理论值的89％){2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基} 乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.67min；MS(ESIpos):m/z＝386(M+H)+。
将4ml TFA加入到{2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(275mg，714μmol) 在15ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌30min。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。得到281mg(理论值的99％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝286(M+H)+。
中间体L84
三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004851
将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯和202mg(0.654mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基) 氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶于4.0ml二甲基甲酰胺中，加入 0.130ml(1.2mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.085ml(1.5mmol)乙酸，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到275mg(理论值的73％)[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12- 四氧杂-15-氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝530(M+H)+。
将780μl(10mmol)TFA加入到[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯 (268mg，505μmol)在5.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在 RT下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到266mg(理论值的97％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.46min；MS(ESIpos):m/z＝430(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.17(m,2H),1.47(m,4H), 2.03(m,2H),2.99(m,2H),3.18(m,2H),3.38(m,4H),3,52(m,8H),3,58 (m,6H),7.01(s,2H),7.73(bs,3H),7.80(m,1H).
中间体L85
三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600004861
将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁基酯、111mg(0.713mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和410μl(2.4mmol)N,N-二异丙基乙胺溶解于6ml二甲基甲酰胺中，并加入339mg(0.892mmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌1h并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到130mg(理论值的43％)[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁基酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.71min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
向[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂 -15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁基酯(126mg，267μmol)在4.0ml二氯甲烷中的溶液中加入410μl(5.3mmol)TFA。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到124mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法13):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝374(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝2.99(m,2H),3.22(m,2H), 3.41(m,2H),3,53(m,8H),3,58(m,6H),4.02(s,2H),7.09(s,2H),7.73(bs, 3H),8.21(m,1H)。
中间体L86
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
Figure BDA0003554407600004862
将100mg(0.531mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸和134mg(0.531mmol) 1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解于 3ml二甲基甲酰胺中，并加入0.150ml(1.1mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌8h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到71.5mg(理论值的41％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.42min；MS(ESIpos):m/z＝326(M+H)+。
中间体L87
3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸
Figure BDA0003554407600004871
将250mg(1.07mmol)3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯、151mg(0.974mmol)2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸、224mg(1.46 mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和224mg(1.17mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于5.0ml二甲基甲酰胺中。将反应混合物在室温下搅拌1h。加入乙酸乙酯，将混合物用浓度为5％的柠檬酸溶液萃取两次，并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x 40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％ TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到267mg (理论值的64％)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝371(M+H)+。
向3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基) 乙氧基]丙酸叔丁酯(263mg，710μmol)在10ml二氯甲烷中的溶液中加入1.1ml(14mmol)TFA。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到240mg(理论值的 94％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.57min；MS(ESIpos):m/z＝315(M+H)+。
中间体L88
2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯
Figure BDA0003554407600004881
将150mg(0.797mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸和246mg(0.797mmol) 1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解于 4.0ml二甲基甲酰胺中，并加入0.220ml(1.6mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250 x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到302mg(理论值的97％)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.02min；MS(ESIpos):m/z＝382(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.82(dd,6H),1.17(m,2H), 1.27(d,3H),1.48(m,4H),1.94(m,1H),2.13(m,2H),3.38(t,2H),4.17(m, 2H),7.00(s,2H),7.75(d,1H),8.19(d,1H)。
将130mg(0.531mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶解于6.5ml二氯甲烷中，并加入58.8mg(0.511 mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。再加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2,5- 二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。加入二氯甲烷，并将混合物用水洗涤三次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到172mg(理论值的 87％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.28min；MS(ESIpos):m/z＝479(M+H)+。
中间体L89
1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-L-谷氨酸酯盐酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600004891
首先将1.00g(2.96mmol)(4S)-5-(苄氧基)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5- 氧代戊酸加入到13.0ml THF中，并加入510μl(3.6mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙醇和109mg(889μmol)4-二甲基氨基吡啶。将反应混合物冷却至 0℃，并加入682mg(3.56mmol)N-乙基-N'-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶解于乙酸乙酯中。将有机相用0.1N的HCl溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，环己烷:乙酸乙酯80:20)纯化。得到649mg (理论值的50％)化合物1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝4.6min；MS(ESIpos):m/z＝438(M+H)+。
将649mg(1.48mmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸酯溶解于7.0ml二噁烷中，并在冰浴冷却下加入14ml (59mmol)4N的HCl(溶于二噁烷中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥并通过 Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，二氯甲烷:甲醇90:10)纯化。得到320mg(理论值的57％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.79min；MS(ESIpos):m/z＝338(M+H)+。
中间体L90
1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
Figure BDA0003554407600004901
首先将118mg(566μmol)N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸加入到5.0ml DMF 中，加入200mg(622μmol)1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯、 130mg(849μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和130mg(679μmol)1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并将混合物在室温下搅拌1h。加入乙酸乙酯，并将混合物用浓度为5％的柠檬酸溶液萃取两次并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到274mg(理论值的95％)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷 -15-酸叔丁酯。
LC-MS(方法12):Rt＝1.69min；MS(ESIpos):m/z＝513(M+H)+。
将820μl(11mmol)TFA加入到274mg(535μmol)1-({N-[(苄氧基) 羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯在5.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。得到262mg(理论值的100％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.12min；MS(ESIpos):m/z＝457(M+H)+。
中间体L91
三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基1-{[3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004902
标题化合物是通过肽化学的经典方法由市售的3-氧代-1-苯基 -2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸制备(使用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，氢解除去Z保护基团，与市售的N-(叔丁氧基羰基)-3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸偶联，并除去Fmoc保护基团)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝552(M+H)+。
中间体L92
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600004911
标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，对市售的N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与L-天冬氨酸叔丁酯进行HATU偶联，随后用三氟乙酸对羧基去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.5min；MS(ESIpos):m/z＝409(M+H)+。
中间体L93
N-乙酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600004912
标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，对市售的N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与L-天冬氨酸叔丁酯进行HATU偶联，随后通过在DCM/甲醇中经活性碳上的钯(10％) 氢化而对Z保护基团去保护，随后在DMF中在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下用乙酸来乙酰化，最后用三氟乙酸对羧基去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.16min；MS(ESIpos):m/z＝317(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.19(2d,6H),1.82(s,3H), 2.5(m,2H),4.26(m,2H),4.48(q,1H),6.9(s,1H),7.36(s,1H),8.0(m,3H), 12.54(s,1H)。
中间体L94
N-{4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酰基}-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600004921
首先，通过在存在EDCI/DMAP的情况下，使4-(苄氧基)-4-氧代丁酸与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇在DCM中反应，随后氢解裂解苄基酯来制备 4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝217(M-H)-。
此外，通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中偶联N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与4-硝基苄基L-天冬氨酸酯氢溴酸盐(1:1)，然后在DCM中用三氟乙酸对氨基去保护来制备三氟乙酸 /4-硝基苄基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬氨酸酯(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.43min；MS(ESIpos):m/z＝410(M+H)+。
然后通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下在DMF中偶联这两个中间体，然后通过在DCM-甲醇1:9中经活性碳上的钯(10％)氢化而对对硝基苄基酯去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.79min；MS(ESIpos):m/z＝475(M+H)+。
中间体L95
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
Figure BDA0003554407600004922
该中间体是通过肽化学的常规方法由N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和L- 丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)开始制备。
LC-MS(方法12):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝323.16(M+H)+。
中间体L96
N-乙酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
Figure BDA0003554407600004931
该中间体是通过肽化学的常规方法制备：由偶联2,5-二氧代吡咯烷-1- 基-N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸与N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸开始，随后在乙醇中经10％钯/活性碳氢解裂解Z保护基团，最后使所得到的二肽与1-乙酰氧基吡咯烷-2,5-二酮反应。
LC-MS(方法1):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝317(M+H)+。
中间体L97
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸
Figure BDA0003554407600004932
首先将1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸叔丁酯(100 mg，201μmol)加入到1.0ml DMF中，并加入(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酸(46.8mg，301μmol)、1-羟基-1H-苯并三唑水合物(76.9 mg，502μmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(77.0mg， 402μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯。将有机相用5％柠檬酸溶液洗涤两次，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次并用饱和氯化钠溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到19.1mg(理论值的13％)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2- 氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝635[M+H]+
向1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯(19.1mg，30.1μmol)在1.0ml DCM 中的溶液中加入TFA(62μl，600μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到10.8mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.55min；MS(ESIneg):m/z＝577[M-H]-。
中间体L98
2,2-二甲基丙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(2-氨基乙基)-N2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-谷氨酸酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004941
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，偶联(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸与(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯。随后，通过溶于DCM中的三氟乙酸，分离Boc保护基团和叔丁基酯。然后，首先通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF/水中与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应而再保护氨基，然后通过在存在EDCI/DMAP的情况下，在DCM中与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇反应而再保护羧基。在最后一步中，通过在标准压力下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)的氢解而对末端氨基去保护。通过过滤除去催化剂，浓缩，通过制备型HPLC纯化并将残余物从乙腈/水中冻干后，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝434(M+H)+。
中间体L99
三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酰基-L-赖氨酸酯(1:1)
Figure BDA0003554407600004951
首先，根据肽化学的经典方法由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸制备2-(三甲基甲硅烷基)乙基N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸酯。然后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与通过标准方法制备的三肽单元N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酸偶联。然后通过在甲醇中氢解来除去Z保护基团，并在存在HATU和 N,N-二异丙基乙胺的情况下，将获得的中间体与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酸偶联。在最后一步中，通过在室温下在10％的三氟乙酸的 DMF溶液中搅拌1h而在温和条件下对侧链氨基去保护。浓缩并从乙腈/ 水中冻干后，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.64min；MS(ESIpos):m/z＝625(M+H)+。
中间体L100
3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4- 噁二唑-3-基]丙酸
Figure BDA0003554407600004952
向3-氰基丙酸甲酯(4g，35.4mmol)在120ml乙醇中的溶液中加入 3.69g(53mmol)羟胺盐酸盐和15ml(110mmol)三乙胺。将反应混合物在50℃下搅拌3h。浓缩混合物，将残余物溶于乙酸乙酯中，然后用水和盐水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩。残余物不经进一步纯化即使用。得到5g(理论值的97％)(4Z)-4-氨基-4-(肟基)丁酸甲酯。
向(4Z)-4-氨基-4-(肟基)丁酸甲酯(4.85g，33.19mmol)在120.0ml二噁烷中的溶液中加入6.91g(36.50mmol)N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸和 8.22g(39.82mmol)1,3-二环己基碳二亚胺。将反应混合物在室温下搅拌 3h。浓缩混合物，将残余物溶于水中并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化。得到6.0g(理论值的57％) (4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯。
将(4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯(6.0 g，18.9mmol)在100ml DMF中的溶液在120℃下搅拌5h。将混合物与水混合并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到4g(理论值的71％)3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸甲酯。
向(4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯 (4.00g，13.4mmol)在60ml THF中的溶液中加入LiOH(1.60g，66.8 mmol)在10ml水中的溶液。将反应混合物在60℃下搅拌过夜。将混合物与水混合并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残余物不经进一步纯化即使用。得到3.60g(理论值的87％)3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基) 氨基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸。
向3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(2.0g，7.01mmol)在30ml二氯甲烷中的溶液中加入2.0ml(26mmol)三氟乙酸。将反应混合物在室温下搅拌1h。将混合物与水混合并用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残余物不经进一步纯化即使用。得到1.50g (理论值的72％)3-[5-(2-氨基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸/三氟乙酸(1:1)。
向3-[5-(2-氨基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(1.5g，5.01mmol)在25 ml DMF中的溶液中加入1.30g(5.52mmol)1-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1- 基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮和1.52g(15.04mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌1h。将混合物与水混合并用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到774mg(理论值的47％)标题化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝2.67(t,2H),2.91(t,2H),3.03 (t,2H),3.46(q,2H),4.28(s,2H),7.01(s,2H),8.37(t,1H),12.28(bs,1H)。
中间体L101
L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬氨酸叔丁酯
Figure BDA0003554407600004971
标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，HATU偶联市售的N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与 L-天冬氨酸叔丁酯盐酸盐，随后在甲醇中经10％钯/活性碳氢解分离Z保护基团。
LC-MS(方法7):Rt＝0.23min；MS(ESIneg):m/z＝329(M-H)-。
中间体L102
N-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38- 基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600004972
首先将215mg 2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38- 酸(365μmol)和133mg中间体L101(402μmol)加入到1.4ml DMF中，加入146mg HATU(384μmol)和160μl N,N-二异丙基乙胺(910μmol)，并将混合物在室温下搅拌3h。加入水(1.5ml)和ACN(0.5ml)。将反应溶液通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度＝1:9→3:2) 纯化，随后在2ml DCM中用2ml TFA分离丁氧基羰基保护基团(在室温下搅拌3h)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.56min；MS(ESIneg):m/z＝844.5(M+H)+。
中间体L103
N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺三氟乙酸盐 (1:1)
Figure BDA0003554407600004981
标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下由偶联4-吡啶乙酸与市售的L-丙氨酰基-L-丙氨酸叔丁酯开始，随后用三氟乙酸去保护，与L-天冬氨酸叔丁酯偶联，随后用三氟乙酸对羧基去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.15min；MS(ESIpos):m/z＝394(M+H)+。
中间体L104
N-异烟酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺三氟乙酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600004982
标题化合物是以与中间体L103类似的方式由偶联异烟酸与市售的L- 丙氨酰基-L-丙氨酸叔丁酯开始制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝380(M+H)+。
中间体L105
N-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰基}-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬氨酸叔丁酯三氟乙酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600004991
标题化合物是以与中间体L103类似的方式由偶联[2-(2-甲氧基乙氧基) 乙氧基]乙酸与市售的L-丙氨酰基-L-丙氨酸叔丁酯开始制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝380(M+H)+。
中间体L106
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600004992
标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，偶联市售的N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与 4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-L-天冬氨酸1-叔丁酯。该氨基酸单元是通过以下方法由(3S)-4-叔丁氧基-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸制备：在存在 EDCI和DMAP的情况下，与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化，随后通过在 DCM中的5％的三氟乙酸溶液温和地除去叔丁氧基羰基保护基团。随后，将745mg(1.317mmol)完全保护的中间体溶解于43.5ml DCM中，并通过加入3.5ml三氟乙酸并在室温下搅拌5小时，使叔丁基酯温和地水解。通过制备型HPLC纯化后，从所得产物混合物中分离出168mg(理论值的 25％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝510(M+H)+。
中间体L107
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600005001
标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，对市售的N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与L-天冬氨酸叔丁酯进行HATU偶联，随后通过在DCM/甲醇中经活性碳上的钯(10％) 氢化将Z保护基团去保护，接着在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在 DMF中用1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5- 二酮酰化，最后通过三氟乙酸对羧基去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.35min；MS(ESIpos):m/z＝412(M+H)+。
中间体L108
N2-乙酰基-N-(2-氨基乙基)-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺
Figure BDA0003554407600005002
标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，对市售的N2-乙酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸与(2-氨基乙基) 氨基甲酸苄酯盐酸盐(1:1)进行HATU偶联，随后通过在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化而分离Z保护基团。
LC-MS(方法1):Rt＝0.43min；MS(ESIpos):m/z＝331(M+H)+。
中间体L109
N2-乙酰基-N6-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-赖氨酸
Figure BDA0003554407600005011
该中间体是通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，市售的N2-乙酰基-L-赖氨酸与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮在DMF/水1:1中的反应而获得。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝333(M+H)+。
中间体L110
N2-乙酰基-N6-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600005012
标题化合物的合成是在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，由 N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与L-天冬氨酸叔丁酯在DMF中偶联开始，随后通过在标准压力下在甲醇中经活性碳上的钯(10％)氢化而分离Z保护基团。随后，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中将去保护的中间体与中间体L109偶联。随后通过在7.5％的三氟乙酸在DCM的溶液中搅拌1h而完全去保护。在最后一步中，通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF/水1:1中与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应来再保护自由氨基而制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.71min；MS(ESIpos):m/z＝589(M+H)+。
中间体L111
N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600005021
标题化合物是通过肽化学的经典方法合成：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，由N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酸与N-甲基-L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐 (1:1)的HATU偶联开始，随后在DCM中用三氟乙酸对羧基去保护。随后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与L-天冬氨酸叔丁酯偶联，然后在室温、标准氢气压力下在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％) 水解分离Z保护基团。最后，通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与4-吡啶乙酸偶联，随后在DCM中用三氟乙酸对羧基去保护而将所得到的中间体转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.16min；MS(ESIpos):m/z＝408(M+H)+。
中间体L112
N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600005022
标题化合物是通过肽化学的经典方法合成：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，由N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酸与N-甲基-L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐 (1:1)的HATU偶联开始，随后在DCM中用三氟乙酸对羧基去保护。随后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与L-天冬氨酸叔丁酯偶联，然后在室温、标准氢气压力下在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％) 水解分离Z保护基团。最后，通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与 1-乙酰氧基吡咯烷-2,5-二酮偶联，随后在DCM中用三氟乙酸对羧基去保护而将所得到的中间体转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.16min；MS(ESIpos):m/z＝331(M+H)+。
中间体L113
N-甲基-N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005031
标题化合物是通过肽化学的经典方法合成：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，由吡啶-4-基乙酸与N-甲基-L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)的HATU 偶联开始，随后在DCM中用三氟乙酸对羧基去保护。随后在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下与L-丙氨酸叔丁酯偶联，并在DCM中用三氟乙酸对羧基再次去保护。然后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与L-天冬氨酸叔丁酯进行偶联，最后在DCM中用三氟乙酸对羧基去保护。HPLC纯化后，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.16min；MS(ESIpos):m/z＝408(M+H)+。
中间体L114
N-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰基}-L-丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600005032
标题化合物是通过肽化学的经典方法合成：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，由N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酸与N-甲基-L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)的HATU偶联开始，随后在DCM中用三氟乙酸对羧基去保护。随后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与L-天冬氨酸叔丁酯偶联，然后在室温、标准氢气压力下在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％) 水解分离Z保护基团。最后，通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸偶联，随后在DCM中用三氟乙酸对羧基去保护而将所得到的中间体转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.36min；MS(ESIpos):m/z＝449(M+H)+。
中间体L115
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-谷氨酸二苄酯(1:1)
Figure BDA0003554407600005041
标题化合物是通过肽化学的经典方法由市售的4-甲基苯磺酸/L-谷氨酸二苄酯(1:1)开始制备：在存在HATU的情况下与N-(叔丁氧基羰基)-β- 丙氨酸偶联，最后用TFA分离Boc保护基团。
LC-LC-MS(方法1):Rt＝0.72min；MS(ESIpos):m/z＝399[M+H]+
中间体F2
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005051
将55mg(0.089mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸 (中间体C5)溶于12ml DMF中，并连续加入68mg(0.268mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)、34.3mg(0.18mmol) 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、27.4mg(0.18mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和47μl(0.27mmol)N,N-二异丙基乙胺。将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下除去溶剂并将残留的残余物通过制备型 HPLC纯化。浓缩适当的级分，从1,4-二噁烷中冻干后，得到20mg(理论值的30％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.48min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.29min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
将20mg(0.027mmol)该中间体溶于5ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸，并将混合物在室温下搅拌1h。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将残留的残余物从乙腈/水1:1中冻干。以这种方式，得到19mg(理论值的95％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.0min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(ESIpos):m/z＝637(M+H)+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.28(t,1H),7.9-8.1(m,3H),7.7-7.8 (m,2H),7.2-7.4(m,6H)7.0-7.1(m,3H),5.7(s,1H),5.0和5.3(2d,2H),4.08 和4.25(2d,2H),3.3-3.65(m,5H),3.1-3.25(m,2H),0.75和1.45(2m,2H),0.9 (s,9H)。
中间体F3
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005061
将13mg(0.021mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸 (中间体C5)溶于5ml DMF中，然后加入33mg(86μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、15μl N,N-二异丙基乙胺和 22mg(64μmol)市售的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰肼。将反应混合物在室温下搅拌1h。然后将混合物在高真空下浓缩，并将残留的残余物通过制备型HPLC纯化。得到9.5mg(理论值的53％)的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
HPLC(方法11):Rt＝2.1min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝822(M+H)+。
将9.5mg(0.011mmol)该中间体溶于3ml二氯甲烷中，加入1ml 三氟乙酸，并将混合物在室温下搅拌2h。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将残留的残余物从乙腈/水1:1中冻干。以这种方式，得到7mg(理论值的70％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.75min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝722(M+H)+。
中间体F4
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(6-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}己基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005071
首先，以与中间体F3类似的方式，在存在HATU的情况下偶联30mg (0.049mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2- 二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸(中间体C5)与三氟乙酸/9H-芴-9-基甲基-(6-氨基己基)氨基甲酸酯(1:1)。然后根据标准方法用哌啶除去Fmoc保护基团。然后在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，将该胺组分与(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰氯(其使用亚硫酰氯由游离酸制备)偶联。在最后一步中，在DCM中用三氟乙酸除去 Boc保护基团。得到1.1mg(经四个步骤，3％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.83min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝764(M+H)+。
中间体F5
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(丙酰基)氨基]-N-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005081
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是由16mg(0.026mmol)中间体C5和8.5mg(0.03mmol)中间体L12制备。得到3mg(经两个步骤，理论值的13％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.0min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝681(M+H)+。
中间体F6
三氟乙酸/N-[(16S)-16-氨基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,14-二氮杂十八烷-18-基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005082
将8mg(12.7μmol)三氟乙酸/{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-肼基-1-氧代丁-2-基} 氨基甲酸叔丁酯(1:1)(中间体C6)溶于8ml DMF中，并加入6mg(19μmol) 市售的3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸、5.8mg(15μmol)O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)和7μl(38μmol)N,N-二异丙基乙胺。将混合物在室温下搅拌15min。然后在减压下除去溶剂，将残余物溶于乙腈/水1:1 中并用三氟乙酸调节至pH 2。通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，浓缩并从乙腈/水1:1中冻干，得到5mg(理论值的41％)Boc-保护的中间体。用三氟乙酸除去Boc基团，得到4mg(经两个步骤，理论值的32％) 标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.89min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝812(M+H)+。
中间体F7
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005091
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是由25mg(0.037mmol)中间体C5和35mg(0,112mmol)中间体L1制备。得到14.4mg(经两个步骤，理论值的29％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.0min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(ESIpos):m/z＝694(M+H)+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.2(m,1H),7.9-8.1(m,3H),7.7-7.8 (m,2H),7.2-7.4(m,6H),7.0-7.12(m,3H),5.7(s,1H),4.95和5.3(2d,2H), 4.1和4.25(2d,2H),4.0(s,2H),3.3-3.65(m,5H),3.0-3.15(m,2H),0.7和1.45 (2m,2H),0.88(s,9H)。
中间体F8
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005101
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是由10mg(0.016mmol)中间体C5与13mg(0.018mmol)中间体L6制备。得到10mg(经两个步骤，理论值的49％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.97min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝1006(M+H)+。
中间体F9
三氟乙酸/N-{(3S)-3-氨基-4-[1-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)肼基]-4-氧代丁基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005102
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是由1.5mg(0.002mmol)中间体C7与0.95mg(0.004mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯 -2,5-二酮(1:1)制备。得到1.1mg(经两个步骤，理论值的52％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝709(M+H)+。
中间体F10
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005111
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是由14mg(0.022mmol)中间体C5与10mg(0.025mmol)中间体L5制备。得到4.5mg(经两个步骤，理论值的22％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.0min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝756(M+H)+。
中间体F11
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环己烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005121
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是由12mg(0.019mmol)中间体C5与10mg(0.021mmol)中间体L4制备。得到7mg(经两个步骤，理论值的38％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.04min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝776(M+H)+。
中间体F12
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005122
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是由43mg(0.071mmol)中间体C5与30mg(0.071mmol)中间体L2制备。在Boc-保护的中间体阶段，通过制备型HPLC(ChromatorexC18-10/125x30/12ml/min)分离形成的非对映异构体。分离的非对映异构体的立体化学是通过与以类似方式由市售的(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备的单个非对映异构体进行比较而指定：
级分1：1S2R非对映异构体
Figure BDA0003554407600005131
产量：13mg(22％)
HPLC(方法11):Rt＝2.52min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝848(M+H)+。
级分2：1R2S非对映异构体
Figure BDA0003554407600005132
产量：10mg(17％)
HPLC(方法11):Rt＝2.56min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝848(M+H)+。
然后用TFA对10mg(0.011mmol)1R2S非对映异构体去保护，得到 8mg(理论值的75％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.04min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝748(M+H)+。
中间体F13
三氟乙酸/(1S,2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005141
所述合成是以与中间体F13类似的方式进行，并且是通过对1S2R非对映异构体去保护而得到标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.1min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝748(M+H)+。
中间体F14
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基 -N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005151
标题化合物是通过在存在HATU的情况下偶联20mg(0.028mmol) 中间体C5与18mg(0.028mmol)中间体L7，随后用TFA去封闭(deblock) 而制备。得到15mg(经两个步骤，理论值的49％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.97min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝1012(M+H)+。
中间体F15
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005161
该中间体是通过在存在HATU的情况下偶联15mg(0.022mmol)中间体C8与14mg(0.026mmol mmol)中间体L8，随后用TFA去封闭而制备。得到7mg(经两个步骤，理论值的27％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.85min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝984(M+H)+。
中间体F16
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基 -N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005162
首先，以与中间体F3类似的方式，在存在HATU的情况下偶联20mg (0.03mmol)中间体C3与三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)(中间体L9)(产量： 15mg(理论值的44％))。
将26mg(0.023mmol)该中间体N-{(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺溶解于5ml甲醇中，加入 1ml 2M的氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下搅拌90min。然后在减压下除去溶剂，将残余物溶于乙腈/水中，并将混合物使用TFA调节至pH 2。然后将混合物再次浓缩，通过制备型HPLC纯化残余物后，得到20mg (81％)羧基化合物。
然后将该中间体溶于5ml DMF中，并在存在8.4mg(0.022mmol) HATU和16μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与6mg(0.022mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。通过制备型HPLC 纯化，得到17mg(理论值的76％)保护的中间体。将其溶于3ml DCM 中，并加入1ml TFA。在室温下搅拌45min后，浓缩混合物，并将残余物用乙醚消化。抽滤并将残余物在高真空下干燥，得到15mg(81％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(ESIpos):m/z＝1097(M+H)+。
中间体F17
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L- 赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005181
以与中间体F12类似的方式，标题化合物是由6mg(0.01mmol)中间体C5与8mg(0.01mmol)中间体L10制备。在Boc-保护的中间体阶段，通过制备型HPLC(ChromatorexC18-10/125x30/12ml/min)分离形成的非对映异构体。分离的非对映异构体的立体化学是通过与以类似方式由市售的(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备的单个非对映异构体进行比较而指定：
级分1：1S2R非对映异构体
Figure BDA0003554407600005191
产量：1mg
HPLC(方法11):Rt＝2.73min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝1274(M+H)+。
级分2：1R2S非对映异构体
Figure BDA0003554407600005201
产量：0.7mg
HPLC(方法11):Rt＝2.81min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝1274(M+H)+。
通过溶解于1ml DCM中，加入1ml TFA并在室温下搅拌1h而实现 0.7mg(0.001mmol)1R2S非对映异构体的完全去保护。在减压下浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干，得到0.68mg(理论值的94％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.1min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝1117(M+H)+。
中间体F18
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1S,2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L- 赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005211
以与中间体F17类似的方式，标题化合物是由8.9mg(0.014mmol) 中间体C5与13mg(0,014mmol)中间体L11制备。
HPLC(方法11):Rt＝2.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝1117(M+H)+。
中间体F1中间体F19
N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005212
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是通过将25mg(0.041mmol) 中间体C5与55mg(0.122mmol)中间体L13偶联，随后去保护而制备。
HPLC(方法11):Rt＝1.84min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝780(M+H)+。
中间体F20
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{4-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]哌嗪-1-基}丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005221
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是通过将10mg(0.015mmol) 中间体C5与55mg(0.122mmol)中间体L14偶联，随后去保护而制备。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝735(M+H)+。
中间体F21
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷-15-基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005222
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是通过将10mg(0.015mmol) 中间体C5与7mg(0.015mmol)中间体L15偶联，随后去保护而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝840(M+H)+。
中间体F22
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-(1-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-2-氧代乙基}肼基)-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2- 羟基乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005231
以与中间体F9类似的方式，标题化合物是通过将13.7mg(0.017mmol) 中间体C7与5.9mg(0.017mmol)中间体L1偶联，随后去保护而制备。
HPLC(方法11):Rt＝2.3min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.2min；MS(ESIpos):m/z＝866(M+H)+。
中间体F23
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005241
以与中间体F2类似的方式，标题化合物是通过在存在EDC/HOBT和 N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联10mg(0.016mmol)中间体C5与16.8mg (0.016mmol)中间体L17，随后去保护而制备。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(ESIpos):m/z＝1092(M+H)+。
中间体F24
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005242
标题化合物的制备是以与中间体F16类似的方式进行：
首先，以与中间体F3类似的方式，在存在HATU的情况下偶联30mg (0.046mmol)中间体C3与中间体L18(产量：25mg(理论值的47％))。
将27mg(0.024mmol)该中间体溶解于5ml甲醇中，加入1ml 2M 的氢氧化锂溶液，并将混合物在室温下搅拌30min，使得甲基酯和乙酰基均裂解。然后在减压下除去溶剂，将残余物溶于乙腈/水中，并将混合物使用TFA调节至pH 2。然后再次浓缩混合物，将残余物通过制备型HPLC 纯化后，得到15mg(58％)羧基化合物。
然后将该中间体溶于3ml DMF中,并在存在6.5mg(0.017mmol) HATU和12μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与4.4mg(0.017mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。通过制备型HPLC 纯化，得到12mg(理论值的72％)保护的中间体。将其溶于2ml DCM 中，加入1ml TFA。在室温下搅拌30min后，将混合物浓缩并从乙腈/水 1:1中冻干。将残余物在高真空下干燥，得到11mg(91％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝1069(M+H)+。
中间体F25
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N5-氨基甲酰基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基} 苯基)-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005251
该中间体是通过在存在6.4mg(0.017mmol)HATU和72μl N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联9.6mg(0.014mmol)中间体C8与10.8mg(0.015 mmol)中间体L19，随后用TFA去封闭而制备。得到5mg(经两个步骤，理论值的31％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.8min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝1041(M+H)+。
中间体F26
三氟乙酸/N-{(15S,19R)-15-氨基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑 -2-基]-18-乙醇酰基-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧杂-13,18-二氮杂二十一烷-1-酰基}-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005261
该中间体是通过在存在8mg(0.04mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、6mg(0.04mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和11μl (0.06mmol)N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联16.4mg(0.02mmol)中间体C9与11.2mg(0.02mmol)中间体L20，随后用TFA去封闭而制备。得到10mg(经两个步骤，理论值的37％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.0min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝1144(M+H)+。
中间体F27
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基 -N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-L-赖氨酰胺(2:1)
Figure BDA0003554407600005271
该中间体是经4步制备：
在第一步中，在存在11mg(0.057mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、8.7mg(0.057mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和 15μl(0.085mmol)N,N-二异丙基乙胺的情况下，在5ml DMF中将20mg (0.028mmol)中间体C8与16.7mg(0.031mmol)中间体L21偶联。在室温下搅拌4天后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。产量：18mg(理论值的54.5％)。
将18mg(0.016mmol)该中间体溶解于4ml甲醇中，加入194μl 2M 的氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下搅拌过夜。然后再加入116μl氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下再搅拌4h。然后在减压下除去溶剂，将残余物溶于水中，然后将反应物用浓度为5％的柠檬酸调节至pH 5。将混合物用二氯甲烷萃取两次，并将有机相经硫酸钠干燥。然后将有机相过滤并浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到10.5mg(58％)的羧基化合物。
然后将10.5mg(0.009mmol)该中间体溶于4ml DMF中，并在存在 3.5mg(0.018mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.8mg (0.018mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和6μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与3mg(0.012mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5- 二酮(1:1)偶联。搅拌过夜之后，再次加入相同量的偶联试剂，并将反应在室温下再搅拌3天。然后将混合物浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。产量：6mg(理论值的52％)。
然后将6mg(0.005mmol)该中间体在3ml DCM用1ml三氟乙酸去保护。从乙腈/水中冻干，得到6mg(理论值的83％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.84min；
LC-MS(方法4):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝1068(M+H)+。
中间体F28
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基}氨基)-L-苯丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005281
该中间体是经5步制备：
在第一步中，在存在44.3mg(0.117mmol)HATU和30μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将40mg(0.058mmol)中间体C8与46mg(0.058mmol) 中间体L22偶联。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。产量：53mg(理论值的62.5％)。
在下一步中，在3ml DMF中用0.6ml哌啶除去Fmoc基团。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。产量：42mg (理论值的82％)。
为了裂解甲基酯，将42mg(0.033mmol)该中间体溶解于2ml THF 和1ml水中，加入330μl 2M的氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下搅拌 1h。然后将反应物用TFA中和并浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。在高真空下干燥，得到32mg(78％)羧基化合物。
然后在存在18μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，在2.3ml DMF中，将 32mg(0.026mmol)该中间体与14.6mg(0.047mmol)市售的1-{6-[(2,5- 二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联。在超声波浴中处理4小时后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。产量：20.4mg(理论值的60％)。
在最后一步中，将20.4mg(0.016mmol)该中间体在DCM用三氟乙酸去保护。从乙腈/水中冻干，得到20mg(理论值的85％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法5):Rt＝2.84min；MS(ESIpos):m/z＝1197(M+H)+。
中间体F29
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)-L-苯丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005291
标题化合物的制备是以与中间体F28类似的方式进行。
HPLC(方法11):Rt＝2.0min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝1111(M+H)+。
中间体F30
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)亚磺酰基]乙基}丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005292
该中间体是经4步制备：
在第一步中，在存在25mg(0.066mmol)HATU和29μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将37.5mg(0.055mmol)中间体C3与15mg(0.066mmol) 市售的3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丙酸甲酯盐酸盐(1:1)在DMF中偶联。在室温下搅拌15min后，再次加入偶联试剂。将反应物在室温下再搅拌15min，然后浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。产量：21mg(理论值的48％)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝802(M+H)+。
为了裂解甲基酯，将21mg(0.026mmol)该中间体溶解于5ml甲醇中，加入655μl 2M的氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下搅拌过夜。在此期间，发生硫的部分氧化。将反应物浓缩，并将残余物溶于水中，然后用乙酸调节至pH 3。将混合物用50ml乙酸乙酯萃取两次，然后将有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物在高真空下干燥后得到的混合物不经进一步纯化即用于下一步，在存在11.6mg(0.031mmol)HATU和22μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与8.4mg(0.033mmol)市售的三氟乙酸/1-(2- 氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。将反应物在室温下搅拌5min，然后浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，并将溶液用浓度为5％的柠檬酸萃取，然后用水萃取。然后将有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物在高真空下干燥后得到的混合物不经进一步纯化即用于下一步。
然后将22mg该粗物质溶解于2ml DCM中并用0.5ml三氟乙酸去保护。在室温下搅拌10min后，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC 纯化。在高真空下干燥，得到2.1mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.8min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝784(M+H)+。
中间体F31
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-(3-{[2-{(1R)-1-[(3-氨基丙基)(乙醇酰基)氨基]-2,2-二甲基丙基}-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-1-基]甲基}苯基)-L-丙氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005311
该中间体是使用肽化学的经典方法由中间体C10经6步合成。
在第一步中，在存在100mg(0.266mmol)HATU和46μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将42mg(0.066mmol)中间体C10与20.7mg(0.066 mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸在5ml DMF中偶联。将反应物在室温下搅拌过夜，并将产物通过制备型HPLC纯化。得到16mg(理论值的27％)N-酰基化的化合物和9mg(理论值的12％)N-,O-双酰基化的化合物。
N-酰基化的化合物的去保护在DMF中用哌啶进行。双酰基化的化合物在乙醇中用哌啶和甲胺水溶液两者进行处理。在两种情况下，形成 (3-{[(1R)-1-{1-[3-(L-丙氨酰基氨基)苄基]-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基}-2,2-二甲基丙基](乙醇酰基)氨基}丙基)氨基甲酸叔丁酯，通过制备型 HPLC纯化，得到13mg，纯度为95％。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝657(M+H)+。
在存在7μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将13mg(0.019mmol)该中间体与9.1mg(0.021mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸酯在2mlDMF中偶联。在室温下搅拌20h后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。从1,4-二噁烷/水中冻干，得到10mg(理论值的54％)。
随后在DMF中用哌啶除去Fmoc保护基团，得到9mg(当量)部分去保护的中间体。
然后，在存在5μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将9mg(0.01mmol) 该中间体与3.2mg(0.01mmol)市售的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在2ml DMF中偶联。在室温下搅拌过夜后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水和几滴 1,4-二噁烷中冻干，得到3mg(理论值的32％)，在最后一步中将其在2ml DCM中用0.5ml三氟乙酸去保护。从乙腈/水中冻干，得到3.8mg(当量) 标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝849(M+H)+。
中间体F32
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005321
该中间体是通过在存在10.5mg(0.055mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐、8.4mg(0,055mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和 14μl(0.08mmol)N,N-二异丙基乙胺的情况下，偶联15mg(0,041mmol) 中间体C5与16.8mg(0.027mmol)中间体L23，随后用TFA去封闭而制备。得到3.4mg(经两个步骤，理论值的15％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝708(M+H)+。
中间体F33
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺 (1:1)
Figure BDA0003554407600005331
该中间体的合成开始于在第一步中，在存在28.7mg(0.15mmol)1-(3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、22.9mg(0.15mmol)1-羟基-1H- 苯并三唑水合物和39μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，偶联50mg(0.075 mmol)中间体C3与26.2mg(0.082mmol)9H-芴-9-基甲基(2-氨基乙基) 氨基甲酸酯盐酸盐(1:1)。在室温下搅拌18h后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到45mg(理论值的65％)该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.51min；MS(ESIpos):m/z＝921(M+H)+。
将45mg(0.049mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，并加入176μl 浓度为40％的甲胺在水中的溶液。将反应物在50℃下搅拌，其中在6h后和9h后加入相同量的甲胺溶液。在50℃下再搅拌14h后，再加入700μl 甲胺溶液，再搅拌20h后，最后浓缩混合物。将残余物溶于DCM中并用水洗涤。将有机相浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物在高真空下干燥，得到32mg(理论值的99％){(2S)-1-[(2- 氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝657(M+H)+。
将8.3mg(0.013mmol)的该中间体溶解于4ml二氯甲烷中，并加入 3.3mg(0.013mmol)溴代乙酸酐和2μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。将残余物溶于1ml二氯甲烷中并用0.5ml三氟乙酸去保护。浓缩并从乙腈/水中冻干，得到1.1mg(经两个步骤，理论值的9％)标题化合物。
HPHPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝677/679(M+H)+。
中间体F34
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005341
该中间体是通过在存在9.9mg(0.026mmol)HATU和19μl N,N-二异丙基乙胺的情况下偶联14mg(0.022mmol)中间体C5与12.7mg(0.024 mmol)中间体L8而制备。将反应物在室温下搅拌30min，并将产物通过制备型HPLC纯化，然后从乙腈/水中冻干。
将所得到的中间体溶于3ml二氯甲烷中并用1ml三氟乙酸去封闭。在室温下搅拌30min后，将反应物浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到8.2mg(经两个步骤，理论值的36％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝HPLC(方法11):Rt＝1.8min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝913(M+H)+。
中间体F35
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
Figure BDA0003554407600005351
在氩气和0℃下，将57.3mg(0.07mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1- 酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸(中间体L38)、9.2mg(0.07 mmol)HOAt和32mg(0.08mmol)HATU加入到4.0ml DMF中的31.8mg (0.07mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C40)中。然后加入23.5μl (0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将反应物在室温下搅拌过夜。加入 7.7μl HOAc，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到33.4mg(理论值的38％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.12min；MS(ESIpos):m/z＝651[M+2H]2+。
中间体F36
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005352
标题化合物的合成是以与中间体F35类似的方式的制备进行。
15.4mg(0.03mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C40)。
25.0mg(0.03mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L- 丙氨酸(中间体L25)。
得到10.7mg(理论值的27％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝1215[M+H]+。
中间体F37
三氟乙酸/N-(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)-31-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1- 酰胺(1:1)
非对映异构体混合物。
Figure BDA0003554407600005361
化合物3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-{[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]氨基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯是以与中间体C21的合成类似的方式而制备。
分别为8.0(0.01mmol)和13.0mg(0.02mmol)的3-氨基-4-{[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C23)。
分别为9.0mg(0.01mmol)和14.7mg(0.02mmol)的3-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代 -3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺。
产量(合并两种反应物)：
10.5mg(42％)非对映异构体1
11.6mg(46％)非对映异构体2
标题化合物是以与中间体F38的合成类似的方式制备。
10.5mg(0.01mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-{[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1- 酰基]氨基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(非对映异构体1)
60.6mg(0.54mmol)TFA。
得到7.4mg(理论值的70％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝1086[M+H]+。
中间体F38
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7,35-二氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3-硫杂-6,34-二氮杂三十七烷-1-酰胺 (1:1)
Figure BDA0003554407600005371
首先将24.8mg(0.02mmol)[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,31,37- 三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41- 基]氨基甲酸叔丁酯(中间体C21)加入到1.0ml二氯甲烷中，并加入85.8 mg(0.75mmol)TFA。将混合物在室温下搅拌16h。在减压下蒸发溶剂中，并将残余物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到23.0mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝1104[M+H]+。
中间体F39
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005381
标题化合物是以与中间体F35的合成类似的方式而制备。
56.1mg(0.10mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(中间体 L44)。
45.0mg(0.10mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C40)。
得到20.9mg(理论值的21％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.16min；MS(ESIpos):m/z＝1040[M+H]+。
中间体F40
三氟乙酸/N-[(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)甲基]-31-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005391
3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-[33-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,31- 二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-2,30-二氮杂三十三烷-1-基]吡咯烷-1- 甲酸叔丁酯是以与中间体C21的合成类似的方式而制备。
25.0mg(0.04mmol)三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1:1)(中间体C24)。
27.6mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺。
产量：20.6mg(理论值的39％)
LC-MS(方法1):Rt＝1.23min；MS(ESIpos):m/z＝1200[M+H]+。
标题化合物是以与中间体F37的合成类似的方式而制备。
26.1mg(0.02mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-[33-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)-3,31-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-2,30-二氮杂三十三烷 -1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
90.6mg(0.80mmol)TFA。
得到22.9mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91和0.92min；MS(ESIpos):m/z＝1100 [M+H]+。
中间体F41
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7,35-二氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3-硫杂-6,34-二氮杂三十七烷-1-酰胺 3-氧化物(1:1)
Figure BDA0003554407600005401
标题化合物是以与中间体F38类似的方式由15.5mg(0.01mmol)中间体C22制备。得到4.0mg(理论值的27％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.90min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
中间体F42
三氟乙酸/4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙基]吡咯烷-3-甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005411
首先将40.5mg(0.06mmol)4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-甲酸(中间体C25)和14.5mg(0.08mmol)1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯 -2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到1.0ml乙腈中，加入64.4mg(0.51mmol)N,N- 二异丙基乙胺和50.0mg(0.08mmol)T3P，并将混合物在室温下搅拌16h。再次加入相同量的1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)、N,N-二异丙基乙胺和T3P，并将混合物在室温下再搅拌4h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水) 直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.2mg (理论值的15％)化合物3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIpos):m/z＝763[M+H]+。
首先将7.2mg(0.01mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯加入到1.0ml二氯甲烷中，并加入43.0mg(0.38mmol)TFA。将反应混合物在室温下搅拌16h。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125×30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.5mg(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝663[M+H]+。
中间体F43
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基 -L-鸟氨酰胺
Figure BDA0003554407600005421
将22.4mg(0.03mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17- 氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基 -L-鸟氨酸(中间体L42)溶解于2.0ml DMF中，并加入4.5mg(0.03mmol) HOAt、15.8mg(0.04mmol)HATU和15.7mg(0.03mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2- 羟基乙酰胺(中间体C40)。加入8.6mg(0.07mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到16.7mg(理论值的 45％)标题化合物。
LC-MS(方法4):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1125[M+H]+。
中间体F44
三氟乙酸/N-[(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)甲基]-19-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005431
标题化合物是以与中间体F40的合成类似的方式而制备。
25.0mg(0.04mmol)三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1:1)(中间体C24)。
20.5mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷 -1-基}丙酰胺。
得到21.8mg(理论值的48％)化合物3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-2,18-二氮杂二十一烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.22min；MS(ESIpos):m/z＝1025[M+H]+。
21.0mg(0.02mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-2,18-二氮杂二十一烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
168.3mg(1.48mmol)TFA。
得到17.3mg(理论值的90％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92和0.94min；MS(ESIpos):m/z＝924[M+H]+。
中间体F45
三氟乙酸/N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代 -4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-赖氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005441
所述合成是以与中间体F46的合成类似的方式而进行。
22.9mg(0.05mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C40)。
36.2mg(0.05mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基-L-赖氨酸(中间体L41)。
得到19.8mg(34％)化合物N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺。
LC-MS(方法1):Rt＝1.20min；MS(ESIpos):m/z＝1196[M+H]+。
17.0mg(0.01mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺。
得到13.6mg(理论值的79％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1096[M+H]+。
中间体F46
三氟乙酸/N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-赖氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005451
在氩气和0℃下，将49.0mg(0.05mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1- 酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(中间体L40)、7.3mg(0.05 mmol)HOAt和25.3mg(0.07mmol)HATU加入到溶于2.0ml DMF中的 25.1mg(0.05mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C40)中。然后加入18.6μl(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将反应物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到29.2mg(理论值的37％)化合物N-[31-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(3-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺。
LC-MS(方法4):Rt＝1.51min；MS(ESIpos):m/z＝1372[M+H]+。
首先将25.2mg(0.02mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺加入到3.0ml二氯甲烷中，并加入83.7mg(0.73mmol)TFA。将反应溶液在室温下搅拌 48h。将溶剂在减压下蒸发并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到24.5mg(理论值的96％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝1272[M+H]+。
中间体F47
N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基 -L-鸟氨酰胺
Figure BDA0003554407600005461
将15.2mg(0.01mmol)N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65- 氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂 -64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸(中间体 L43)溶解于1.0ml DMF中，并加入1.5mg(0.01mmol)HOAt、5.2mg (0.01mmol)HATU和5.2mg(0.01mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体C40)。加入2.9mg(0.02mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.8mg(理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法4):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝1831[M+H]+。
中间体F48
三氟乙酸/N1-(3-氨基丙基)-N1-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N18-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-6,9,12,15-四氧杂-3-硫杂十八烷-1,18-二酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005471
首先将16.1mg(0.02mmol)[22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十五烷-25-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体C18)加入到1.5ml二氯甲烷中，并加入26μl(0.34mmol) TFA。将混合物在室温下搅拌过夜，然后再加入26μl(0.34mmol)TFA。将混合物再次在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于水并冻干。得到10.8 mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝857[M+H]+。
中间体F49
(25S)-25-氨基-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代 -7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005481
化合物(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯的合成是以与中间体C16的合成类似的方式而进行。
50.0mg(0.08mmol)中间体C2
20.3mg(0.18mmol)氯乙酰氯
19.0mg(0.19mmol)三乙胺
得到43.1mg(理论值的77％)化合物(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.55min；MS(ESIpos):m/z＝689[M+H]+。
化合物(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂 -12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸的合成是以与中间体C17的合成类似的方式而进行。
38.8mg(0.06mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯。
19.1mg(0.07mmol)1-硫烷基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
45.9mg(0.14mmol)碳酸铯
得到40.7mg(理论值的77％)化合物(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基 -4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.45min；MS(ESIpos):m/z＝935[M+H]+。
化合物(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2- 二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯的合成是以与中间体C18的合成类似的方式而进行。
37.4mg(0.04mmol)(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代 -3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸。
9.2mg(0.05mmol)1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)。
得到23.4mg(理论值的49％)化合物(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂 -19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.47min；MS(ESIpos):m/z＝1057[M+H]+。
标题化合物的合成是以与中间体F38的合成类似的方式而进行。
20.8mg(0.02mmol)(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯。
157.0mg(1.37mmol)TFA。
得到13.0mg(65％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝901[M+H]+。
中间体F50
三氟乙酸/1-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环丙烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005501
将15mg(0.024mmol)中间体C5溶解于6.5ml DCM中，并加入19 mg(0.049mmol)中间体L24、13μl N,N-二异丙基乙胺和10mg(0.037 mmol)2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐。将反应物在室温下搅拌3h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，得到2.4mg保护的中间体。
然后将所述中间体溶于1ml DCM中并用三氟乙酸去保护。从乙腈/水中冻干得到2.6mg(经两个步骤，理论值的11％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.4min。
LC-MS(方法1):Rt＝1.25min；MS(ESIpos):m/z＝819[M+H]+。
中间体F51
3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1- 基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14- 氮杂十七烷-1-基]丙酰胺(异构体1)
Figure BDA0003554407600005502
首先将10.0mg(18.079μmol)N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2- 羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体1)加入到100μl PBS缓冲液(Sigma D8537) 和200μl ACN中。加入17.1mg(32.543μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺，并将混合物在室温下搅拌16h。将反应溶液通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度)纯化并冻干。得到14.0mg(理论值的75％)目标化合物。
异构体1
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1039[M+H]+。
中间体F52
3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1- 基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14- 氮杂十七烷-1-基]丙酰胺(异构体2)
Figure BDA0003554407600005511
首先将6.5mg(10.694μmol，LC/MS纯度＝91％)N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体2)加入到100μl PBS缓冲液 (Sigma D8537)和200μl ACN中。加入10.1mg(19.249μmol)3-(2,5- 二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺，并将混合物在室温下搅拌16h。将反应溶液通过制备型HPLC(流动相:ACN/水+0.1％TFA，梯度)纯化并冻干。得到5.0mg(理论值的45％)目标化合物。
异构体2
LC-MS(方法5):Rt＝2.87min；MS(ESIpos):m/z＝1039[M+H]+。
中间体F53
N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(异构体1)
Figure BDA0003554407600005521
首先将10.0mg(18.079μmol)N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2- 羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体1)加入到200μl PBS缓冲液(Sigma D8537) 和400μl ACN中。加入8.1mg(32.543μmol)1,1'-丁烷-1,4-二基双(1H-吡咯-2,5-二酮)，并将混合物在室温下搅拌1h。然后加入300μlDMF，并将混合物再搅拌1.5h。将反应溶液通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+ 0.1％TFA，梯度)纯化并冻干。得到4.0mg(理论值的29％)目标化合物。
异构体1
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝765[M+H]+。
中间体F54
N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(异构体2)
Figure BDA0003554407600005531
首先将5.0mg(9.040μmol)N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2- 羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体2)加入到500μl DMF中。加入4.0mg (16.271μmol)1,1'-丁烷-1,4-二基双(1H-吡咯-2,5-二酮)，并将混合物在室温下搅拌16h。将反应溶液通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+0.1％ TFA，梯度)纯化并冻干。得到1.1mg(理论值的16％)目标化合物。
异构体2
LC-MS(方法6):Rt＝2.41min；MS(ESIpos):m/z＝765[M+H]+。
中间体F55
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基甲酰基]苯基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005532
将6.5mg(4.5μmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17- 氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺溶解于441μl二氯甲烷中，并加入44μl(573.1μmol)三氟乙酸。将反应物在室温下于旋转蒸发仪上浓缩，溶于水和ACN中并冻干。得到5.6mg(理论值的94％，根据LC/MS的纯度＝92％)目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝1100.6[M+H]+。
中间体F56
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[(2S)-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丙-2-基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005541
标题化合物是以与中间体F50类似的方式而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(EIpos):m/z＝708[M+H]+。
中间体F57
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[(2R)-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丙-2-基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005542
标题化合物是以与中间体F56类似的方式而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(EIpos):m/z＝708[M+H]+。
中间体F58
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005551
首先将16.2mg(0.02mmol)三氟乙酸/L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)(中间体C41)加入到1.0ml DMF中，并加入8.3mg (0.06mmol)N,N-二异丙基乙胺和12.6mg(0.04mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在室温下搅拌过夜并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.0mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.18min；MS(ESIpos):m/z＝852[M+H]+。
中间体F82
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-{3-[{1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005561
标题化合物的合成是以与中间体F83的合成类似的方式而进行。所使用的外消旋中间体是以与相应的R-异构体中间体类似的方式而获得。
LC-MS(方法2):Rt＝7.07min；MS(EIpos):m/z＝1236[M+Na]+。
中间体F83
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005562
首先将30.0mg(0.06mmol)N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(实施例98)和 26.1mg(0.06mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸酯加入到2.0ml DMF中，并加入19.4mg(0.19mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并加入11.5mg(0.19mmol) HOAc。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到41.9mg(理论值的79％)化合物9H-芴-9-基甲基 [(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝763[M+H]+。
将37.2mg(0.05mmol)9H-芴-9-基甲基[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸酯溶解于1.5ml DMF中，并加入124.6mg(1.46 mmol)2-氨基乙醇。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间进行分配，并将有机相用水洗涤两次，用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂并将残余物在硅胶上纯化 (流动相：二氯甲烷/甲醇10:1)。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到14.2mg(理论值的50％)化合物N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝541[M+H]+。
将14.1mg(0.03mmol)N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺和11.4(0.03 mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸酯溶解于1.5ml DMF中，并加入7.9mg(0.08mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并加入4.7mg(0.08mmol)HOAc。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到15.9mg(理论值的71％)化合物N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝862(M+H)+。
将14.9mg(0.02mmol)N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺溶解于1.5ml DMF中，并加入44.2 mg(0.52mmol)2-氨基乙醇。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间进行分配，并将有机相用水洗涤两次，用饱和 NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂并将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇10:1)。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到5.7mg(理论值的52％)化合物L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝640(M+H)+。
将5.5mg(8.6μmol)L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺和 6.5mg(6.5μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶解于1.0ml DMF中，并加入0.9mg(8.6mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并加入0.8mg(0.01mmol)HOAc。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到7.7mg(理论值的74％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.10min；MS(ESIpos):m/z＝1214(M+H)+。
中间体F84
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005581
首先，在存在11.7mg(0.03mmol)HATU和18μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将16.5mg(0.02mmol)中间体C54溶于5ml DMF中并与10.4 mg(0.041mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)反应。在室温下搅拌5min后，将混合物浓缩并将残余物溶于乙腈/水1:1中。用三氟乙酸将pH调节至2并再次浓缩反应物。将残留的残余物通过制备型HPLC纯化。得到8mg(理论值的42％)保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(EIpos):m/z＝929[M+H]+。
将7.6mg(0.008mmol)该中间体溶于3ml DMF中，并加入92mg (0.82mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理1h。然后加入31μl乙酸，并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型 HPLC纯化。得到3mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(EIpos):m/z＝707[M+H]+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.15(t,1H),7.9-8.1(m,4H),7.6(m, 1H),7.5(s,1H),7.15-7.35(m,6H),6.9-7.0(m,3H),6.85(s,1H),5.6(s,1H), 4.9和5.2(2d,2H),4.05和4.2(2d,2H),3.1-3.2(m,4H),2.15(m,2H),0.7和 1.45(2m,2H),0.8(s,9H)。
中间体F85
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005591
首先，在存在7.8mg(0.02mmol)HATU和12μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.014mmol)中间体C53溶于3.4ml DMF中并与7mg (0.027mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)反应。在室温下搅拌15min后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到6.6mg(理论值的57％)保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.4min；MS(EIpos):m/z＝858[M+H]+。
将6.6mg(0.008mmol)该中间体溶于2ml DMF中，并加入86mg (0.77mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理2h。然后加入44μl乙酸，并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型 HPLC纯化。得到3.3mg(理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(EIpos):m/z＝636[M+H]+。
中间体F86
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005601
标题化合物是通过以下方式由8mg(0.012mmol)中间体C51制备：即通过在存在5.8mg(0.015mmol)HATU和10μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与4.5mg(0.017mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1) 反应，随后用三氟乙酸去保护。得到7mg(经两个步骤，理论值的78％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(EIpos):m/z＝708[M+H]+。
中间体F87
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005602
标题化合物是以与中间体F2类似的方式由16mg(0.025mmol)中间体C49制备：通过在存在EDCI/HOBT和N,N-二异丙基乙胺的情况下与24 mg(0.076mmol)中间体L1反应，随后用三氟乙酸去保护。得到3mg标题化合物(经两个步骤，理论值的14％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(EIpos):m/z＝694[M+H]+。
中间体F88
Figure BDA0003554407600005611
所述化合物是以与中间体F8类似的方式而制备。
LC-MS(方法5):Rt＝2.97min；MS(EIpos):m/z＝1006[M+H]+。
中间体F89
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005612
标题化合物是通过以下方式由8mg(0.012mmol)中间体C51制备：通过在存在5.8mg(0.015mmol)HATU和10μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与7.4mg(0.014mmol)中间体L8反应，随后用三氟乙酸去保护。得到 10mg(经两个步骤，理论值的78％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(EIpos):m/z＝984[M+H]+。
中间体F90
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005621
标题化合物是通过以下方式由11mg(0.018mmol)中间体C49制备：通过在存在34mg(0.089mmol)HATU和19μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与13.7mg(0.018mmol)中间体L17反应，随后用三氟乙酸去保护。得到7.5mg(经两个步骤，理论值的35％)。
LC-MS(方法8):Rt＝6.78min；MS(EIpos):m/z＝1092[M+H]+。
中间体F91
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005622
将9.3mg(0.01mmol)[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯溶解于2ml二氯甲烷中，加入740mg(6.49mmol，0.50ml)三氟乙酸，并将混合物在室温下搅拌1.5h。然后将反应混合物浓缩，并将残余物溶于乙腈和水中并冻干。得到9.2mg(理论值的96％)目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(EIpos):m/z＝637[M+H]+。
中间体F103
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(3-{[(1R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代 -3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基](4-甲基苯甲酰基)氨基}丙基)-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005631
标题化合物是通过以下方式由10mg(0.019mmol)N-(3-氨基丙基)-N-[(1R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基]-4-甲基苯甲酰胺制备：通过在存在8.8mg(0.023mmol)HATU和10μl N,N- 二异丙基乙胺的情况下与11.3mg(0.019mmol)中间体L44反应。通过制备型HPLC纯化。
产量：8.5mg(理论值的35％)
LC-MS(方法5):Rt＝3.82min；MS(EIpos):m/z＝1085[M+H]+。
中间体F104
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005641
首先在存在13mg(0.034mmol)HATU和10μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，使15mg(0.023mmol)中间体C58与11mg(0.036mmol)中间体L1反应。在室温下搅拌60min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到12.3mg(理论值的63％)保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.3min；MS(EIpos):m/z＝837[M+H]+。
在第二步中，将该中间体溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg (0.088mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入26mg (0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到8.1mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝693(M+H)+。
中间体F105
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005651
标题化合物是以与中间体F32类似的方式由中间体C5和中间体L46 制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(EIpos):m/z＝766[M+H]+。
中间体F106
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005652
标题化合物是以与中间体F104类似的方式由中间体C53和中间体L47 制备。
HPLC(方法11):Rt＝1.85min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝983(M+H)+。
中间体F107
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005661
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.024mmol)中间体C49制备：通过在存在14mg(0.037mmol)HATU和21μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与22.3mg(0.049mmol)中间体L48反应，随后用三氟乙酸去保护。得到13mg(经两个步骤，理论值的60％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F108
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005671
标题化合物是以与中间体F104类似的方式由20mg(0.027mmol)中间体C53和24mg(0.054mmol)中间体L48制备。得到3mg(经两个步骤，理论值的14％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(EIpos):m/z＝747[M+H]+。
中间体F109
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺 (1:1)
Figure BDA0003554407600005672
将17mg(0.026mmol)中间体C57溶于3ml DMF中，并在存在14μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与7mg(0.027mmol)市售的1-(2-溴乙酰氧基) 吡咯烷-2,5-二酮反应。在室温下搅拌15min后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到7mg(理论值的33％)该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.29min；MS(ESIpos):m/z＝777和779(M+H)+。
将该中间体溶于1ml二氯甲烷中并用1ml三氟乙酸去保护。浓缩并从乙腈/水中冻干后，得到6mg(理论值的88％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝677/679(M+H)+。
中间体F110
N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005681
标题化合物是以与中间体F109类似的方式由16mg(0.023mmol)中间体C5和17mg(0.025mmol)中间体L49制备。得到6mg(经两个步骤，理论值的24％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.93min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝933和935(M+H)+。
中间体F111
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005691
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.022mmol)中间体C5制备：通过在存在12.5mg(0.032mmol)HATU和19μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与16mg(0.044mmol)中间体L50反应，随后用三氟乙酸去保护。得到13mg(经两个步骤，理论值的67％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F112
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005692
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.024mmol)中间体C49制备：通过在存在14mg(0.037mmol)HATU和21μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与18mg(0.049mmol)中间体L50反应，随后用三氟乙酸去保护。得到12mg(经两个步骤，理论值的51％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F113
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005701
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.019mmol)中间体C53制备：通过在存在11mg(0.029mmol)HATU和17μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与14mg(0.038mmol)中间体L50反应，随后用在2ml DMF中的133 mg DABCO去保护。通过HPLC纯化得到4mg(经两个步骤，理论值的24％)。
LC-MS(方法5):Rt＝2.77min；MS(EIpos):m/z＝747[M+H]+。
中间体F114
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005711
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.022mmol)中间体C5制备：通过在存在12.6mg(0.032mmol)HATU和19μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与16mg(0.044mmol)中间体L51反应，随后用三氟乙酸去保护。得到11mg(经两个步骤，理论值的53％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F115
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005712
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.024mmol)中间体C49制备：通过在存在13mg(0.035mmol)HATU和21μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与18mg(0.047mmol)中间体L51反应，随后用三氟乙酸去保护。得到12mg(经两个步骤，理论值的51％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F116
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005721
标题化合物是通过以下方式由11mg(0.014mmol)中间体C53制备：通过在存在8mg(0.021mmol)HATU和12μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与11mg(0.028mmol)中间体L51反应，随后用在2ml DMF中的87mg DABCO去保护。通过HPLC纯化得到3.3mg(经两个步骤，理论值的28％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(EIpos):m/z＝747[M+H]+。
中间体F117
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3- 基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005731
标题化合物是根据肽化学的经典方法由中间体C49制备。首先，在存在HATU的情况下，将C49与9H-芴-9-基甲基肼甲酸酯偶联。然后用在 DMF中的哌啶除去Fmoc保护基团，并在存在HATU的情况下将得到的酰肼与6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸偶联。在最后一步中，用在二氯甲烷中的TFA除去Boc保护基团。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(EIpos):m/z＝722[M+H]+。
中间体F118
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005732
在第一步中，标题化合物是以与中间体F3类似的方式由15mg(0.019 mmol)中间体C53制备：通过在存在HATU的情况下与市售的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰肼偶联。然后用在DMF中的142mg DABCO除去Fmoc保护基团。通过HPLC纯化得到3mg(理论值的19％) 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.90min；MS(EIpos):m/z＝721[M+H]+。
中间体F119
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺 (1:1)
Figure BDA0003554407600005741
将29mg(0.044mmol)中间体C58溶于3.4ml DMF中，并加入36mg (0.087mmol)中间体L52、25mg(0.065mmol)HATU和19μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌60min后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到26.4mg(理论值的73％)所述中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝820和822(M+H)+。
将该中间体溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入6.5mg(0.048mmol) 氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。加入13.9mg(0.048mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到 14.4mg(理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝676和678(M+H)+。
中间体F120
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005751
标题化合物是通过以下方式由10mg(0.015mmol)中间体C5制备：通过在存在8.4mg(0.022mmol)HATU和13μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与11mg(0.03mmol)中间体L53反应，随后用三氟乙酸去保护。得到 7.5mg(经两个步骤，理论值的59％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F121
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005752
标题化合物是通过以下方式由10mg(0.016mmol)中间体C49制备：通过在存在9mg(0.024mmol)HATU和14μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与11.5mg(0.031mmol)中间体L53反应，随后用三氟乙酸去保护。得到9mg(经两个步骤，理论值的61％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F122
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005761
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.019mmol)中间体C53制备：通过在存在11mg(0.029mmol)HATU和17μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与14mg(0.038mmol)中间体L53反应，随后用在3ml DMF中的202 mg DABCO去保护。通过HPLC纯化得到4mg(经两个步骤，理论值的24％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(EIpos):m/z＝747[M+H]+。
中间体F123
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005771
标题化合物是通过以下方式由10mg(0.015mmol)中间体C5制备：通过在存在8.4mg(0.022mmol)HATU和13μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与11mg(0.030mmol)中间体L54反应，随后用三氟乙酸去保护。得到4mg(经两个步骤，理论值的31％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F124
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005772
标题化合物是通过以下方式由10mg(0.016mmol)中间体C49制备：通过在存在9mg(0.024mmol)HATU和14μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与11.5mg(0.031mmol)中间体L54反应，随后用三氟乙酸去保护。得到9mg(经两个步骤，理论值的66％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(EIpos):m/z＝748[M+H]+。
中间体F125
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005781
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.019mmol)中间体C53制备：通过在存在11mg(0.029mmol)HATU和17μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与14mg(0.038mmol)中间体L54反应，随后用在3ml DMF中的127 mg DABCO去保护。通过HPLC纯化，得到3mg(经两个步骤，理论值的17％)。
LC-MS(方法4):Rt＝1.08min；MS(EIpos):m/z＝769[M+Na]+。
中间体F126
N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4- 苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005791
标题化合物是以与中间体F110类似的方式由18mg(0.027mmol)中间体C49和21mg(0.027mmol)中间体L49制备。得到8.7mg(经两个阶段，理论值的30％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.94min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝933和935(M+H)+。
中间体F127
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005792
将12mg(0.015mmol)中间体C59溶解于2.4ml DMF中，并加入14.6 mg(0.046mmol)中间体L1、6mg(0.031mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐、5.9mg(0.039mmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物和 8μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到11mg(理论值的70％)该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝942(M+H)+。
将11mg(0.011mmol)该中间体溶于2ml DMF中，并加入123mg (1.1mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理2h。然后加入63μl乙酸并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型 HPLC纯化。得到2mg(理论值的22％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝721[M+H]+。
HPLC(方法11):Rt＝1.95min。
中间体F128
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-D-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5- 二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸 /三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005801
标题化合物是通过以下方式由3mg(0.005mmol)中间体C5制备：通过在存在2.5mg(0.007mmol)HATU和3μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与2.5mg(0.003mmol)中间体L55反应，随后用三氟乙酸去保护。得到1.4mg(经两个步骤，理论值的32％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(EIpos):m/z＝1077[M+H]+。
中间体F129
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L- 赖氨酸/三氟乙酸
Figure BDA0003554407600005811
标题化合物是以与中间体F128类似的方式通过以下方式由10mg (0.016mmol)中间体C49制备：通过在存在12mg(0.031mmol)HATU 和14μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与19mg(0.024mmol)中间体L56反应，随后用三氟乙酸去保护。得到13.5mg(经两个步骤，理论值的70％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(EIpos):m/z＝1117[M+H]+。
中间体F142
R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005812
将20.0mg(23.7μmol)R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)和13.4mg(26.04mmol) 3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解于1.0ml DMF中，并加入4.8mg(47.34μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入3.6mg(0.06mmol)乙酸并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到12.4mg(理论值的44％)化合物R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIpos):m/z＝1129(M+H)+。
将10.0mg(8.85μmol)R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代 -4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-高半胱氨酸溶解于三氟乙醇中，并加入3.1mg(22.71μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入3.9mg(0.01mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物短暂搅拌，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物用少量水冻干。得到7.6mg(理论值的78％) 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝983(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.50(m,1H),0.81(s,9H), 1.49(m,1H),1.89(m,1H),2.05(m,1H),2.29-2.43(m,4H),2.45-2.55(m,2H), 2.58-2.74(m,2H),3.10-3.20(m,2H),3.21-3.40(m,2H),3.42-3.54(m,16H), 3.55-3.65(m,4H),4.28(m,1H),4.91(dd,1H),5.18(dd,1H),5.60(s,1H), 6.95(m,1H),7.00(s,2H),7.15-7.38(m,7H),7.53(s,1H),7.68(m,1H),8.00 (m,2H)。
中间体F143
三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]己酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005831
首先将30.0mg(0.05mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯和13.5mg(0.07mmol)6-(乙酰基硫烷基)己酸加入到2.0ml 的甲醇(带有一滴水)中。加入23.0mg(0.17mmol)碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌4h。向反应混合物中加入乙酸乙酯。将有机相用饱和 NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％ TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到54.2mg (理论值的90％)化合物11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂 -2-硅杂二十烷-20-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝1106(M+H)+。
首先将54.0mg(0.07mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸和16.7mg(0.09mmol)1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到3.0ml乙腈中，并加入75.0mg(0.58mmol) N,N-二异丙基乙胺。加入60.0mg(0.09mmol)T3P(50％，在乙腈中)并将混合物在室温下搅拌过夜。用水淬灭反应并将反应混合物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到42.8mg(理论值的68％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝866(M+H)+。
将20.0mg(0.02mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入4.7mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜，然后加入10.1mg(0.04mmol)乙二胺 -N,N,N',N'-四乙酸，并将混合物搅拌10min。加入水(0.1％TFA)，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50 ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到9.2mg(理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝722(M+H)+。
中间体F144
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺 (1:1)
Figure BDA0003554407600005851
首先将50.0mg(0.1mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(中间体C15)加入到2.0ml二氯甲烷中，并加入22.7mg(0.22mmol)三乙胺和49.3mg(0.22 mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯(中间体L60) WISV1648-1-1。
将反应混合物在室温下搅拌过夜。每2h(三次)加入1个当量的中间体L60和1.2个当量的三乙胺，然后将混合物在室温下搅拌过夜。将该步骤再重复两次。在减压下除去溶剂并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到30.9mg(理论值的43％)化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.51min；MS(ESIpos):m/z＝706(M+H)+。
将24.6mg(0.04mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑 -2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基) 丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解于3.0ml二氯甲烷中，加入79.5mg(0.7mmol) TFA并将混合物在室温下搅拌6h。再加入79.5mg(0.7mmol)TFA并将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下除去溶剂并将残余物与二氯甲烷一起共蒸馏三次。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到24.2mg(理论值的97％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.02min；MS(ESIpos):m/z＝606(M+H)+。
中间体F145
三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]己酰胺
Figure BDA0003554407600005861
首先将90.0mg(0.15mmol){3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体 C16)和43.6mg(0.23mmol)6-(乙酰基硫烷基)己酸加入到9.0ml的甲醇 (带有一滴水)中，并加入73.9mg(0.54mmol)碳酸钾。将反应混合物在室温下搅拌4h，然后加入乙酸乙酯。将有机相用水/饱和NaCl溶液洗涤并用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过硅胶进行色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇100:2)。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到98.7mg(理论值的83％) 化合物9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝701(M+H)+。
首先将20.0mg(0.03mmol)9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸和6.5(0.04mmol)1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到1.5ml乙腈中，并加入23.6mg(0.04mmol)T3P和29.5mg (0.23mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入水。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到16.7mg(理论值的99％)化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.40min；MS(ESIpos):m/z＝823(M+H)+。
将14.8mg(0.02mmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑 -2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解于1.5ml 二氯甲烷中，并加入41.0mg(0.36mmol)TFA。将反应混合物在室温下搅拌过夜。
然后，再加入两次TFA，每次41.0mg(0.36mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于1,4-二噁烷和水中并冻干。得到2.9mg (理论值的19％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝723(M+H)+。
中间体F146
R/S-[2-([(3S)-3-氨基-3-羧基丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005881
将25.0mg(28.12μmol)R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸(中间体C12)和15.9mg (30.93μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解于2.0ml DMF中，并加入11.4mg(112.48μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入7.6mg(0.13mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水) 直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到23.9mg (理论值的59％)化合物R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.26min；MS(ESIpos):m/z＝1173(M+H)+。
将11.8mg(8.23μmol)R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸溶解于三氟乙醇中，并加入1.7mg(12.35μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入3.6mg(0.01mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物短暂搅拌，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.8mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法4):Rt＝1.20min；MS(ESIpos):m/z＝1029(M+H)+。
中间体F147
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10-氧代 -3,6-二氧杂-16-硫杂-9-氮杂十八烷-18-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005891
首先将15.0mg(0.03mmol)9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸(中间体C13)加入到1.5ml乙腈中，加入22.1mg(0.17 mmol)N,N-二异丙基乙胺，然后加入17.7mg(0.03mmol)T3P。将混合物在室温下搅拌5min，然后加入9.5mg(0.03mmol)三氟乙酸/1-{2-[2-(2- 氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)(中间体L59)。将反应混合物在室温下搅拌半夜，并用水淬灭。将反应混合物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到14.8mg(理论值的57％)化合物[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10,18-二氧代 -3,6-二氧杂-16-硫杂-9,19-二氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.40min；MS(ESIpos):m/z＝911(M+H)+。
将14.2mg(0.02mmol)[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10,18-二氧代-3,6-二氧杂-16-硫杂-9,19-二氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸叔丁酯溶解于 1.5ml二氯甲烷中，加入35.5mg(0.31mmol)TFA，并将混合物在室温下搅拌过夜。再加入71.0mg(0.62mmol)TFA，并将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于少量水中并冻干。得到14.0mg(理论值的97％) 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝811(M+H)+。
中间体F148
三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}亚磺酰基)-N-[2-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]己酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005911
标题化合物是在中间体F145的合成中作为副产物形成。得到8.1mg (理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.25min；MS(ESIpos):m/z＝739[M+H]+。
中间体F149
三氟乙酸/R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005912
首先将20.0mg(24.94μmol)R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2- 氧代乙基]高半胱氨酸(中间体C14)和14.1mg(27.44μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代 -3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺加入到1.0ml DMF中，并加入5.1mg (49.88μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物搅拌过夜。加入3.7mg(0.06 mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到18.2mg(理论值的67％)化合物 R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基] 高半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.23min；MS(ESIpos):m/z＝1086(M+H)+。
将17.6mg(0.02mmol)R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸溶解于1.5ml二氯甲烷中，加入37.0mg (0.32mmol)TFA，并将混合物在室温下搅拌过夜。再加入74.0mg(0.64 mmol)TFA，并将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于少量水中并冻干。得到16.0mg(理论值的90％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝986(M+H)+。
中间体F150
三氟乙酸/N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-[2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)乙基]-L-丙氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005931
在氩气和0℃下，将在1.0ml DMF中的10.0mg(0.02mmol)三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(中间体C20)用 12.1mg(0.02mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(中间体L25)、2.2mg(0.02mmol)HOAt和7.6mg(0.02mmol)HATU进行处理。然后加入5.5μl(0.03mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将反应物在室温下搅拌过夜。加入1.8μl HOAc，并将反应混合物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ,流速：50ml/min,MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.4mg(理论值的48％)化合物N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-(9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十四烷-14-基)-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法4):Rt＝1.60min；MS(ESIpos):m/z＝687.5[M+2H]2+。
首先将9.5mg(0.01mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十四烷-14-基)-L-丙氨酰胺加入到1.0ml二氯甲烷中，加入15.8mg(0.14mmol)TFA，并将混合物搅拌过夜。再加入31.6mg(0.28mmol)TFA，并将混合物搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于少量水中并冻干。得到10.2mg(理论值的98％) 标题化合物。
LC-MS(方法4):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝637.5[M+2H]2+。
中间体F151
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(3-{(2S)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]-2-苯基-2,3-二氢-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005941
首先将5.0mg(0.01mmol)(2S)-2-(3-氨基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N- 甲氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-甲酰胺加入到1.0ml乙腈中，并加入7.7mg(0.06mmol)N,N-二异丙基乙胺和9.8(0.02mmol)T3P。将混合物在室温下搅拌5min，然后加入9.1mg(0.02mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(中间体L44)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.3mg(理论值的35％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.02min；MS(ESIpos):m/z＝989[M+H]+。
中间体F152
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代 -4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基 -N-(3-{(2S)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]-2-苯基-2,3-二氢 -1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600005951
首先将5.0mg(0.01mmol)(2S)-2-(3-氨基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N- 甲氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-甲酰胺加入到1.0ml乙腈中，并加入7.7mg(0.06mmol)N,N-二异丙基乙胺和9.8(0.02mmol)T3P。将混合物在室温下搅拌5min，然后加入11.8mg(0.02mmol)N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(中间体L25)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.7mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法4):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1165[M+H]+。
中间体F153
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-羟基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600005952
所述合成是以与中间体F104类似的方式由中间体C60进行。
LC-MS(方法1):Rt＝1.1min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H)+。
中间体F154
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/ 三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005961
标题化合物是以与中间体F2类似的方式由10mg(0.015mmol)中间体C8和15mg(0.022mmol)中间体L6制备。
HPLC(方法11):Rt＝1.91min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝1077(M+H)+。
中间体F155
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/ 三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005962
标题化合物是通过以下方法制备：在存在8.7mg(0.023mmol)HATU 和17μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将14mg(0.019mmol)中间体C61 与15mg(0.021mmol)中间体L61偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到13mg (经两个步骤，理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝1076(M+H)+。
中间体F156
N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005971
首先，根据肽化学的经典方法由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸制备三肽衍生物2-(三甲基甲硅烷基)乙基L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸酯(使用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基乙醇进行酯化，氢解，在存在HATU的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L- 缬氨酰基-L-丙氨酸偶联，再进行氢解)。
将84mg(0.163mmol)该中间体溶于2.5ml DMF中，并加入58mg (0.244mmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮。在室温下搅拌10min后，将混合物浓缩，将残余物溶于乙腈/水1:1中，并将混合物用三氟乙酸调节至pH 2并用制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分后，将残余物溶于15ml 浓度为5％的三氟乙酸在DCM中的溶液并在室温下搅拌2h。然后将混合物在稍微冷却下浓缩，并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。经两个步骤，得到53mg(理论值的50％)该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝0.72min；MS(ESIpos):m/z＝537和539(M+H)+。
对于标题化合物的合成，将18mg(0.027mmol)该中间体溶于4ml DMF中，并加入16mg(0.025mmol)中间体C61以及19mg HATU和9μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌5min后，加入几滴三氟乙酸，并将反应物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并从乙腈/水1:1中冻干后，将所得中间体溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入4.8mg(0.035mmol)氯化锌后，将反应物在50℃下搅拌2.5h。然后加入10mg(0.035mmol)乙二胺-N,N,N’,N’-四乙酸，并将反应物用乙腈/水稀释并过滤。通过制备型 HPLC进行纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，经两个步骤得到3.2mg(理论值的13％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.94min；
LC-MS(方法5):Rt＝2.79min；MS(ESIpos):m/z＝932和934(M+H)+。
中间体F163
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005981
标题化合物是通过以下方法制备：在存在HATU的情况下，将37mg (0.056mmol)中间体C58与41mg(0.056mmol)中间体L61偶联，随后用氯化锌去封闭(如对于中间体F119所述的)。得到12mg(经两个步骤，理论值的19％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.49min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝1005(M+H)+。
中间体F164
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005991
标题化合物是以与中间体F155类似的方式通过以下方法制备：在存在 HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将20mg(0.030mmol)中间体C58 与27mg(0.033mmol)中间体L62偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。
HPLC(方法11):Rt＝1.92min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝1091(M+H)+。
中间体F165
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600005992
标题化合物是以与中间体F155类似的方式通过以下方法制备：在存在 HATU的情况下，将15mg(0.021mmol)中间体C61与18mg(0.023mmol) 中间体L62偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝1162(M+H)+。
中间体F166
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006001
首先，三氟乙酸/(1R,3S)-3-氨基环戊烷甲酸苄酯(1:1)是根据肽化学的经典方法由市售的(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备：通过使用EDCI/DMAP与苄醇进行酯化，随后在DCM中用TFA除去叔丁氧基羰基保护基团。
将51mg(0.076mmol)该中间体溶于6ml DMF中，并在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下与50mg(0.076mmol)中间体C58偶联。通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于甲醇中并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化2h。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从二噁烷中冻干，得到21mg(经两个步骤，理论值的34％)(1R,3S)-3-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]氨基}环戊烷甲酸。
标题化合物是以与中间体F155类似的方式通过以下方法制备：在存在 HATU的情况下，将10.5mg(0.013mmol)该中间体与11.4mg(0.014mmol) 中间体L62偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。通过制备型HPLC 纯化得到8.6mg(经两个步骤，理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝1203(M+H)+。
中间体F167
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L- 赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006011
标题化合物是以与中间体F129类似的方式由11mg(0.016mmol)中间体C5制备：通过在存在12mg(0.032mmol)HATU和14μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与20mg(0.024mmol)中间体L56反应，随后用三氟乙酸去保护。得到11mg(经两个步骤，理论值的46％)。
LC-MS(方法4):Rt＝1.13min；MS(EIpos):m/z＝1117[M+H]+。
中间体F168
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L- 赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006012
首先，三氟乙酸/(1R,2S)-2-氨基环戊烷甲酸苄酯(1:1)是根据肽化学的经典方法由市售的(1R,2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸来制备：通过使用EDCI/DMAP与苄醇进行酯化，随后在DCM中用TFA除去叔丁氧基羰基保护基团。
将102mg(0.305mmol)该中间体溶于12ml DMF中，并在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下与100mg(0.152mmol)中间体C58偶联。通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于甲醇中并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化2h。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到70mg (经两个步骤，理论值的59％)(1R,2S)-2-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]氨基}环戊烷甲酸。
然后通过以下方式制备标题化合物：在存在9.5mg(0.025mmol)HATU 和18μl N,N-二异丙基乙胺的情况下将20mg(0.013mmol)该中间体与16.6 mg(0.023mmol)中间体L61偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化，得到9.3mg(经两个步骤，理论值的30％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝1116(M+H)+。
中间体F169
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006021
标题化合物的合成是以与中间体F168类似的方式由中间体C58和L62 进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝1202(M+H)+。
中间体F170
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-D-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006031
标题化合物是以与其非对映异构体中间体F23类似的方式而制备。
HPLC(方法11):Rt＝1.9min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝1092(M+H)+。
中间体F171
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-D-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5- 二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸 /三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006032
标题化合物的合成是以与中间体F155类似的方式由中间体C62和L61 进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝1076(M+H)+。
中间体F172
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006041
标题化合物是通过以下方式由10mg(0.013mmol)中间体C63制备：通过在存在5.5mg(0.014mmol)HATU和11μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与9mg(0.014mmol)中间体L63偶联，随后通过在三氟乙酸/二氯甲烷 1:1的溶液中搅拌2.5小时来去保护。得到11mg(经两个步骤，理论值的 72％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(EIpos):m/z＝1049[M+H]+。
中间体F173
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006051
标题化合物是通过以下方式由15mg(0.018mmol)中间体C64制备：通过在存在7.7mg(0.02mmol)HATU和16μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与12mg(0.02mmol)中间体L63偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到12mg (经两个步骤，理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(EIpos):m/z＝1048[M+H]+。
中间体F174
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006052
标题化合物是以与中间体F172类似的方式由中间体C57和L63制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(EIpos):m/z＝1049[M+H]+。
中间体F175
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006061
标题化合物是通过以下方法制备：在存在6.7mg(0.018mmol)HATU 和9μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将11mg(0.013mmol)中间体C64 与3.4mg(0.016mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到8mg(经两个步骤，理论值的69％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(EIpos):m/z＝893[M+H]+。
中间体F176
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷-15-基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006062
标题化合物是通过以下方法制备：在存在3.5mg(0.009mmol)HATU 和4μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将5mg(0.006mmol)中间体C64与2mg(0.007mmol)3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基] 乙氧基}乙氧基)丙酸(其制备记载于中间体L15中)偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到2mg(经两个步骤，理论值的35％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(EIpos):m/z＝839[M+H]+。
中间体F177
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006071
标题化合物是以与中间体F168类似的方式制备，但使用中间体L1代替中间体L61。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(EIpos):m/z＝804[M+H]+.
中间体F178
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}环戊烷甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006081
标题化合物是以与中间体F177类似的方式制备，但使用中间体L52 代替中间体L1。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝787和789[M+H]+。
中间体F179
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)己基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006082
标题化合物是通过以下方法制备：在存在13mg(0.034mmol)HATU 和16μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将15mg(0.023mmol)中间体C58 与6mg(0.025mmol)1-(6-氨基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC 纯化得到8.5mg(经两个步骤，理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.22min；MS(EIpos):m/z＝692[M+H]+。
中间体F180
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-[(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006091
标题化合物是通过以下方法制备：在存在7mg(0.018mmol)HATU 和6μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将9.6mg(0.012mmol)中间体C64 与5mg(0.013mmol)中间体L64偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到3.1mg(经两个步骤，理论值的28％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(EIpos):m/z＝822[M+H]+。
中间体F192
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-L-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006092
将60mg(0.091mmol)中间体C58溶于8ml DMF中，并在存在42mg (0.11mmol)HATU和64μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与45mg(0.100 mmol)中间体L65偶联。通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于10ml 乙醇中，并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化45min。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到24.5mg(经两个步骤，理论值的31％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-L-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.17min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
然后通过以下方式制备标题化合物：通过在存在5.4mg(0.014mmol) HATU和8μlN,N-二异丙基乙胺的情况下将10mg(0.012mmol)该中间体与2mg(0.013mmol)市售的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸中间体偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化得到3.5mg(经两个步骤，理论值的33％) 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F193
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006101
标题化合物的合成是以与中间体F192类似的方式由3-{[(苄氧基)羰基] 氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F194
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600006111
标题化合物是由实施例98通过以下步骤制备：首先，在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％) 氢化1小时来除去Z保护基团，然后通过与1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基) 双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮反应将去保护的中间体转化成标题化合物(如对于中间体F58所述的)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.19min；MS(ESIpos):m/z＝851[M+H]+。
中间体F195
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-N'-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙基]琥珀酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006112
标题化合物是通过以下方法制备：在存在40mg(0.1054mmol)HATU 和61μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，在8ml DMF中，将26mg(0.035 mmol)中间体C65与18mg(0.07mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述的)。通过制备型HPLC纯化，得到16mg(经两个步骤，理论值的43％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝721(M+H)+。
1H-NMR(500MHz,DMSO-d6):δ＝7.99(t,1H),7.95(t,1H),7.6-7.75(m, 4H),7.5(s,1H)7.2-7.4(m,6H),6.8-7.0(m,4H),5.63(s,1H),4.9和5.2(2d, 2H),4.26和4.0(2d,2H),3.3-3.6(m,4H),3.15-3.25(m,3H),2.85-3.0(m,2H), 2.2-2.3(m,4H),0.64和1,49(2m,2H),0.81(s,9H)。
中间体F196
三氟乙酸/2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基-N-{(2S)-2-氨基 -4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸酯(1:1)
Figure BDA0003554407600006121
首先，将15mg(0.023mmol)中间体C58溶于4ml DMF中，并在存在13.0mg(0.034mmol)HATU和16μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与8.2 mg(0.025mmol)中间体L67反应。在室温下搅拌30min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分并蒸发溶剂后，将残余物从乙腈/水1:1中冻干。得到4.3mg(理论值的20％)保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(EIpos):m/z＝852[M+H]+。
如对于中间体F119所述，将4.3mg(4.5μmol)所述中间体溶解于1ml 三氟乙醇中并用3.65mg(27μmol)氯化锌去保护。通过制备型HPLC纯化得到1mg(经两个步骤，理论值的25％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝708(M+H)+
中间体F204
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006131
首先，在存在17mg(0.046mmol)HATU和20μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，使25mg(0.038mmol)中间体C58与16.5mg(75％纯的)(0.038 mmol)中间体L68反应。在室温下搅拌60min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到18.3mg(理论值的56％)保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(EIpos):m/z＝851[M+H]+。
在第二步中，将该中间体溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg (0.086mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入25mg (0.086mmol)乙二胺-N,N,N’,N’-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到11mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H)+。
中间体F205
三氟乙酸/1-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]哌啶-4-基N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸酯(1:1)
Figure BDA0003554407600006141
所述合成是通过以下方法进行：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将25mg(0.034mmol)中间体C61与29mg(0.041mmol)中间体L69偶联，随后在标准压力下用活性碳上的钯(10％)氢化，然后在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)乙酸偶联，最后用氯化锌除去2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基团。 HPLC纯化得到11mg(经四个步骤，理论值的26％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝1061(M+H)+。
中间体F206
三氟乙酸/1-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]哌啶-4-基 N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯 (1:1)
Figure BDA0003554407600006142
所述合成是以与中间体F205类似的方式进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝975(M+H)+。
中间体F207
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/ 三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006151
标题化合物是以与中间体F155类似的方式而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
中间体F209
R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006152
将93.9mg(0.78mmol)L-半胱氨酸悬浮于93.0mg(1.11mmol)碳酸氢钠和0.9ml水的溶液中。加入溶解于6.0ml异丙醇中的70.0mg(0.11 mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体 C70)和202.3mg(1.33mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌90min。加入水(0.1％TFA)，并将反应物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水； 0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到 53.9mg(理论值的59％)化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝717(M+H)+。
将86.0mg(0.1mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)和58.5mg(0.11mmol)3-(2,5- 二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15- 氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解于4.0ml DMF中，并加入 20.9mg(0.21mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入 15.5mg(0.26mmol)HOAc，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到68.6mg(理论值的59％)化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13- 四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝2.88min；MS(ESIpos):m/z＝1115(M+H)+。
将46.4mg(0.04mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代 -4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入17.0mg(0.13mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。再加入8.5mg(0.07mmol)二氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌过夜。加入36.5mg(0.13mmol)乙二胺-N,N,N’,N’-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到19.4mg (理论值的43％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝971(M+H)+。
中间体F210
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-D-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006171
标题化合物是以与中间体F209的合成类似的方式使用D-半胱氨酸制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝971(M+H)+。
中间体F211
三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]丙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006181
首先将30.0mg(0.05mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体C70)与5.5mg(0.05mmol)3-硫烷基丙酸一起加入到0.5ml的甲醇(带有一滴水)中。然后加入23.0mg(0.17mmol) 碳酸钾，并将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙酸乙酯，并将有机相用水洗涤一次，用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。得到30.3 mg(理论值的86％)化合物11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝702(M+H)+。
首先将30.0mg(0.04mol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸和9.8mg(0.06mmol)1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯 -2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到2.0ml乙腈中，并加入44.2mg(0.34mmol) N,N-二异丙基乙胺。加入35.4mg(0.06mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到22.0mg(理论值的63％) 化合物2-(三甲基硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝824(M+H)+。
将22.0mg(0.03mol)2-(三甲基硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入9.1mg(0.07mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入19.5mg(0.07mmol)乙二胺-N,N,N’,N’- 四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.0mg(理论值的71％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝680(M+H)+。
中间体F212
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10-氧代 -3,6-二氧杂-13-硫杂-9-氮杂十五烷-15-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006191
首先将28.8mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与18.3mg(0.05mmol)三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)(中间体 L59)一起加入到1.9ml乙腈中。然后加入42.4mg(0.33mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入33.9mg(0.05mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.7mg(理论值的26％) 化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[16-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10,15- 二氧代-3,6-二氧杂-13-硫杂-9,16-二氮杂十九烷-19-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝812(M+H)+。
将10.7mg(0.01mol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[16-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-10,15-二氧代-3,6-二氧杂-13-硫杂-9,16-二氮杂十九烷-19-基] 氨基甲酸酯溶解于0.8ml三氟乙醇中，并加入8.0mg(0.06mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入17.1mg(0.06mmol)乙二胺 -N,N,N’,N’-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝768(M+H)+。
中间体F213
三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-(2-{[(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006211
首先将27.5mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L1)一起加入到1.8ml乙腈中。然后加入32.4mg(0.31mmol)N,N- 二异丙基乙胺，并逐滴加入32.4mg(0.05mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.9mg(理论值的 35％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝881(M+H)+。
将11.9mg(0.01mol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基-[13-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入5.5mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入11.8mg(0.04mmol)乙二胺 -N,N,N’,N’-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.4mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.75min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F214
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006221
首先将111.7mg(0.30mmol)(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸加入到3.0ml DMF中，并加入46.1(0.30mmol)HOBt、 96.6mg(0.30mmol)TBTU和38.9mg(0.30mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于116.3mg(0.9mmol) N,N-二异丙基乙胺和3.0ml DMF中的250.0mg(0.30mmol) S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到257.0mg(理论值的80％)化合物(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代 -5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.55min；MS(ESIpos):m/z＝1071(M+H)+。
在氩气下，首先将24.6mg(0.11mmol)乙酸钯(II)加入到5.0ml二氯甲烷中，并加入33.2mg(0.33mmol)三乙胺和254.3mg(2.19mmol)三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5min，并加入溶解于5.0ml二氯甲烷中的234.1mg(0.22mmol)(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基] 氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过纸板过滤器(cardboard filter)过滤，并将滤饼用二氯甲烷洗涤。在不加热的情况下，在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到177.5mg(理论值的85％)化合物L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝846(M+H)+。
首先将20.0mg(20.83μmol)L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代 -5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)与 11.8mg(22.91μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5- 二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.5ml DMF中，并加入6.3mg(62.49μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入4.4mg(0.07mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到19.1mg(理论值的74％)化合物N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基 -S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝1244(M+H)+。
将17.5mg(14.06μmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17- 氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基 -S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入11.5mg(84.37μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入24.7mg(0.08mmol)乙二胺 -N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.8mg(理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝1100(M+H)+。
中间体F215
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2-羧基乙基] 硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600006241
首先将14.9mg(0.02mmol)N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(实施例229)和7.1mg(0.02 mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯加入到1.0ml DMF中，并加入5.7mg(0.06mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入4.5mg(0.08mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水) 直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13.3mg (理论值的78％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2-羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝919(M+H)+。
将11.1mg(0.01mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2- 乙酰氨基-2-羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺溶解于5.0ml乙醇中，加入1.0mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在室温、标准压力下氢化过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤，并将滤饼用乙醇/THF/水混合物洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到7.5mg(理论值的69％)化合物L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2-羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝785(M+H)+。
首先将7.3mg(8.12μmol)L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2- 羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)与4.6mg(8.93 μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1- 基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到0.5ml DMF中，并加入2.5mg(24.36μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入4.4mg(0.03mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.9mg(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝1183(M+H)+。
中间体F216
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006261
在氩气下，首先将30.2mg(0.06mmol)N,N'-双[(苄氧基)羰基]-L-胱氨酸加入到2.0ml水和2.0ml异丙醇中，并加入56.7mg(0.20mmol)TCEP。将反应混合物在室温下搅拌30min。然后加入溶解于2.0ml异丙醇中的 50.0mg(0.08mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体C70)以及122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后再加入122.2mg(0.48mmol) 1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取并用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到43.1mg(理论值的64％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝851(M+H)+。
首先将16.5mg(0.05mmol)4-甲基苯磺酸/β-丙氨酸苄酯(1:1)与14.0mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺一起加入到1.5ml乙腈中。将反应混合物在室温下搅拌3min，然后加入溶解于1.5ml乙腈中的30.8mg(0.04mmol) S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸、23.4mg(0.18mmol)N,N-二异丙基乙胺和29.9mg(0.05mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。所得化合物为 S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸苄酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.59min；MS(ESIpos):m/z＝1012(M+H)+。
将43.8mg(43.3μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸苄酯溶解于8.0 ml乙醇中，加入4.4mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在室温、标准压力下氢化过夜。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物如刚才所述再处理两次。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.9mg(理论值的50％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝788(M+H)+。
首先将14.5mg(16.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)与9.1mg(17.7 μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1- 基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.0ml DMF中，并加入4.9mg(48.2μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入3.4mg(0.06mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％ TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到 4.9mg(理论值的50％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.28min；MS(ESIpos):m/z＝1186(M+H)+。
将14.1mg(11.9μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代 -4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在70℃下搅拌4h。加入20.8mg(0.07mmol)乙二胺 -N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到6.2mg(理论值的44％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝1042(M+H)+。
中间体F217
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006281
在氩气下，首先将7.5mg(0.05mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸加入到1.5ml DMF中，并加入7.5mg(0.05mmol)HOBt、15.5 mg(0.05mmol)TBTU和6.2mg(0.05mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于1.5mlDMF中的40.0mg (0.05mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷 -13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和18.7mg(0.14mmol) N,N-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.2mg(理论值的25％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝854(M+H)+。
将10.9mg(12.8μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入10.4mg(76.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-N,N,N',N'- 四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到7.5 mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝710(M+H)+.
中间体F218
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂 -16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-γ-谷氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006301
在氩气下，首先将22.9mg(0.06mmol)(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基) 羰基]氨基}-5-氧代戊酸加入到2.0ml DMF中，并加入9.4mg(0.05mmol) HOBt、19.8mg(0.06mmol)TBTU和8.0mg(0.06mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于1.0ml DMF 中的51.2mg(0.06mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸(中间体C71)和23.9mg(0.19mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.2mg(理论值的25％)化合物(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.52min；MS(ESIpos):m/z＝1070(M+H)+。
在氩气下，首先将3.9mg(0.02mmol)乙酸钯(II)加入到1.0ml二氯甲烷中，并加入5.3mg(0.05mmol)三乙胺和254.3mg(2.19mmol)三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5min，并加入溶解于1.0ml二氯甲烷中的18.6mg(0.02mmol)(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基] 氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。在减压和不加热的情况下蒸发溶剂。将残余物溶于乙腈中，通过注射器过滤器过滤并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.0mg(理论值的66％) 化合物L-γ-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.14min；MS(ESIpos):m/z＝846(M+H)+。
首先将15.0mg(15.6μmol)L-γ-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)与8.8mg (17.2μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到 1.0ml DMF中，并加入4.7mg(46.9μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入3.3mg(0.06mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到14.2 mg(理论值的70％)化合物N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17- 氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-γ-谷氨酰基 -S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法4)Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝1244(M+H)+。
将13.8mg(11.1μmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17- 氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-γ-谷氨酰基 -S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇，并加入9.1mg(66.5μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入19.4mg(0.07mmol)乙二胺-N,N,N',N'- 四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1％ TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.9mg(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝1100(M+H)+。
中间体F235
三氟乙酸/N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代 -4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基甲酰基]苯基}-L-丙氨酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006321
将120.0mg(0.22mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯 (参见中间体C11的合成)和52.1mg(0.28mmol)4-硝基苯甲酰氯溶解于8.0ml二氯甲烷中，并加入28.4mg(0.28mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％ TFA)纯化。得到97.7mg(理论值的64％)化合物2-(三甲基甲硅烷基) 乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.54min；MS(ESIpos):m/z＝705(M+H)+。
将97.0mg(0.14mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯溶解于5.0ml乙醇中，加入9.7mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在标准压力下氢化5h。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压下蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。得到87.4mg(理论值的88％)化合物2-(三甲基甲硅烷基) 乙基{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸酯.
LC-MS(方法1):Rt＝1.47min；MS(ESIpos):m/z＝675(M+H)+。
首先将59.3mg(0.09mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸酯和25.5mg(0.11mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酸与 68.1mg(0.53mmol)N,N-二异丙基乙胺一起加入到5.0ml乙腈中。缓慢加入72.7mg(0.11mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到52.2mg(理论值的68％)化合物[(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基] 氨基}-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸苄酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝880(M+H)+。
将23.9mg(0.03mmol)[(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基} 氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]氨基}-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸苄酯溶解于3.0 ml乙酸乙酯中，加入2.4mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在标准压力下氢化2h。将反应混合物通过纸过滤器过滤，并将滤饼用乙酸乙酯洗涤。在减压下蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。得到20.1 mg(理论值的90％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-([4-(L-丙氨酰基氨基)苯甲酰基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝746(M+H)+。
首先将20.0mg(0.03mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-([4-(L-丙氨酰基氨基)苯甲酰基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯与14.9mg(0.04mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1- 基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯一起加入到2.0ml DMF中，并加入5.4mg (0.05mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L- 丙氨酰胺。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝979(M+H)+。
将17.0mg(17.4μmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺溶解于2.5ml 乙酸乙酯中，加入1.7mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在标准压力下氢化过夜。将反应混合物通过纸过滤器过滤，并将滤饼用乙酸乙酯洗涤。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.3mg(理论值的 60％)化合物L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基] 氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法1):Rt＝1.15min；MS(ESIpos):m/z＝845(M+H)+。
首先将15.3mg(0.01mmol)L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基] 羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺与7.9mg(0.02mmol) 3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到2.4ml DMF 中，并加入1.9mg(0.02mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入1.4mg(0.02mmol)乙酸。将反应混合物直接通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.7mg(理论值的 70％)化合物N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13- 四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基] 羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺。
将11.7mg(0.01mmol)N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17- 氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-γ-谷氨酰基 -S-(11-{(1R)-1-[1-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代 -4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入3.9mg(0.03mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入8.3mg(0.03mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.4mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1100(M+H)+。
中间体F236
(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}丁酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006351
标题化合物的合成是以与中间体F192类似的方式由(2R)-4-{[(苄氧基) 羰基]氨基}-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸/N-环己基环己胺(1:1)进行。
LC-MS(方法4):Rt＝1.1min；MS(ESIpos):m/z＝751(M+H)+。
中间体F238
三氟乙酸/N-{(2S)-1-氨基-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙-2-基}-N'-[2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]琥珀酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006361
将18mg(0.025mmol)中间体C72溶于6ml DMF中，并在存在11.3 mg(0.03mmol)HATU和22μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与7.5mg(0.03 mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。得到15mg(理论值的67％) 中间体。
LC-MS(方法4):Rt＝1.71min；MS(EIpos):m/z＝873[M+Na]+。
然后通过在4ml三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述)而由该中间体制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化得到8.5mg(理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+Na)+。
中间体F239
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006362
在氩气下，首先将7.5mg(0.05mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酸加入到1.5ml DMF中，并加入7.5mg(0.05mmol)HOBt、15.5 mg(0.05mmol)TBTU和6.2mg(0.05mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于1.5mlDMF中的40.0mg (0.05mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷 -13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和18.7mg(0.14mmol) N,N-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.2mg(理论值的25％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝854(M+H)+。
将10.9mg(12.8μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入10.4mg(76.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-N,N,N',N'- 四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到7.5 mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝710(M+H)+。
中间体F240
三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-(2-{[(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006381
首先将27.5mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L1)一起加入到1.8ml乙腈中。然后加入32.4mg(0.31mmol)N,N- 二异丙基乙胺，并逐滴加入32.4mg(0.05mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.9mg(理论值的 35％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝881(M+H)+。
将11.9mg(0.01mol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基-[13-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入5.5mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入11.8mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'- 四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.4mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.75min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F241
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基} 乙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006391
标题化合物是以与中间体C66类似的方式通过与市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联并随后用氯化锌去封闭而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(EIpos):m/z＝733和735[M+H]+。
中间体F242
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006401
标题化合物的合成是以与中间体F104类似的方式进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H)+。
中间体F243
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006402
标题化合物的合成是以与中间体F242类似的方式进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F244
N-{2-[(S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酰基)氨基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺
Figure BDA0003554407600006411
首先将100mg(约0.101mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-L-半胱氨酸(中间体C73)加入到88ml二甲基甲酰胺中，并加入107mg(约0.15mmol) N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(中间体 L73)、46mg(0.12mmol)HATU和88μl(0.50mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟。向混合物中加入水/二氯甲烷，然后将有机相用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到92mg(59％，纯度72％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.59min；MS(ESIpos):m/z＝1096(M+H)+。
在氩气下，将40mg(0.30mmol)氯化锌加入到91mg(约0.06mmol) 2-(三甲基甲硅烷基)乙基[(9R)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,15-三氧代-9-{[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]氨基}-7-硫杂-4,11,14-三氮杂二十烷 -1-基]氨基甲酸酯在1.45ml三氟乙醇中的溶液。将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入30mg(0.22mmol)氯化锌，并将混合物在室温下再搅拌1h。加入52mg(0.18mmol)EDTA，在室温下搅拌10分钟后，将混合物用水/乙腈稍微稀释并通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+0.1％ TFA，梯度)纯化。得到17mg(31％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.80min；MS(ESIpos):m/z＝808(M+H)+。
中间体F245
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006421
标题化合物是通过以下方法制备：在存在15mg(0.04mmol)HATU 和9μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.0135mmol)中间体C65 与8mg(0.027mmol)中间体L1在8mlDMF中偶联，随后在三氟乙醇用氯化锌去保护(如对于中间体F119所述)。通过制备型HPLC纯化得到 8.8mg(经两个步骤，理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝778(M+H)+。
中间体F247
三氟乙酸/4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
Figure BDA0003554407600006422
将14mg(0.018mmol)中间体C66溶解于14ml DCM中，加入10.1 mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)并以一次少量的方式加入总共250μl吡啶，pH保持在5和6之间。然后用乙酸将pH调节至4，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，冻干并干燥，得到4mg(理论值的21％)保护的中间体，然后将其用氯化锌在氨基官能团处去保护。HPLC纯化并冻干得到3mg(理论值的 72％)标题化合物，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝805和807(M+H)+。
中间体F248
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006431
标题化合物是通过以下方法制备：在存在HATU的情况下，将10mg (0.015mmol)中间体C58与5mg(0.017mmol)中间体L12偶联，随后用氯化锌去保护。得到6.5mg(经两个步骤，理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝680(M+H)+。
中间体F254
三氟乙酸/(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基] 氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
Figure BDA0003554407600006441
标题化合物是以与中间体247类似的方式通过以下方法制备：通过将 15mg(0.02mmol)中间体C66与21mg(0.099mmol)(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸偶联(其是如(J.Org.Chem.200,65,517-522)中所述由(2S)-2- 氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸盐酸盐(1:1)合成)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝805和807(M+H)+。
中间体F255
R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}) 高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006442
首先将13.1mg(0.04mmol)(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5- 氧代戊酸加入到1.0ml DMF中，并加入5.4mg(0.04mmol)HOBt、11.4mg (0.04mmol)TBTU和4.6mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于12.9mg(0.1mmol)N,N- 二异丙基乙胺和1ml DMF中的30.0mg(0.04mmol)R/S-(11-{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1) (中间体C11)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％ TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到 32mg(73％)化合物4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基]-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝1084(M+H)+。
将41.4mg(0.038mmol)4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2- 氧代乙基]硫烷基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸溶解于10ml乙醇中，加入4.2mg Pd/C，并将混合物在标准压力下氢化。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压和不加热的情况下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到21.1mg(56％)化合物 R/S-(L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.11min；MS(ESIpos):m/z＝860(M+H)+。
首先将20.4mg(20.94μmol)R/S-(L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)与 11.8mg(23.04μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5- 二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.0ml DMF中，并加入4.2mg(41.88μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入3.1mg(0.05mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.5mg(36％)化合物R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基 -S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.66min；MS(ESIpos):m/z＝1259(M+H)+。
将9.4mg(7.47μmol)R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基 -S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入6.1mg(44.81μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺 -N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.9mg(75％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝1114(M+H)+。
中间体F256
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-N'-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]琥珀酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006461
标题化合物是通过以下方法制备：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.014mmol)中间体C65和9.6mg(0.027mmol) 三氟乙酸/N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基) 乙酰胺(1:1)偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体F119 所述的)。通过制备型HPLC纯化得到8mg(经两个步骤，理论值的64％) 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝822(M+H)+。
中间体F257
R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006471
将50.0mg(0.06mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和29mg(0.07 mmol)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基] 乙氧基]乙氧基]丙酸(中间体L74)溶解于3.0ml DMF中，并加入27.3mg (0.07mmol)HATU和23.3mg(0.18mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到17.4mg(26％) 化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1101(M+H)+。
将17mg(0.02mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代 -4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.05mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入13.5mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.6mg (46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝957(M+H)+。
中间体F258
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-[3-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}氨基)-3-氧代丙基]丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006481
标题化合物是通过以下方法制备：使用HATU将中间体C58与三氟乙酸/[2-(β-丙氨酰基氨基)乙基]氨基甲酸苄酯(1:1)偶联，随后氢解，然后与 1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联，最后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝747和749(M+H)+。
中间体F259
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基] 氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006491
将75mg(0.114mmol)中间体C58溶于12.5ml DMF中，并在存在 65mg(0.11mmol)HATU和79μl N,N-二异丙基乙胺的情况下与78mg (0.171mmol)中间体L75偶联。通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于20ml乙醇中，并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC 纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到63mg(经两个步骤，理论值的64％) 2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.16min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
然后如上所述，在存在HATU的情况下，将40mg(0.047mmol)该中间体与N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸偶联，然后再一次氢解去保护。
然后通过以下方法制备标题化合物：在存在4μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.012mmol)该中间体与7.7mg(0.032mmol)市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。通过制备型HPLC纯化(如对于中间体F119所述的)，得到1.3mg 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝777和779(M+H)+。
中间体F260
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/ 三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006501
标题化合物是以与中间体F155类似的方式而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
中间体F261
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006502
标题化合物是通过以下方法制备：在存在HATU的情况下，将20mg (0.03mmol)中间体C58与25.8mg(0.061mmol)中间体L77偶联，随后用氯化锌去保护。得到11.9mg(经两个步骤，理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝722和720(M+H)+。
中间体F262
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006511
首先将30mg(36μmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)与16.9mg(40μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)-N-[2-(2-{3-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙基]丙酰胺一起加入到1.5ml DMF中，并加入10.9mg(108μmol)4- 甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入7.58mg(0.13mmol) 乙酸。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到33.4mg(理论值的80％)化合物 S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基) 乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1027(M+H)+。
将32.8mg(32μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基] 氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸溶解于3.0ml三氟乙醇中，并加入26.1mg(192μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2h。加入 56.0mg(0,192mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到22.9mg(理论值的71％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝883(M+H)+。
中间体F263
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-{2-[(3- 氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基} 氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006521
将30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和9.8mg(0.04 mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸(中间体 L78)溶解于1.0ml DMF中，并加入16.4mg(0.04mmol)HATU和14.0mg (0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50 ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.2mg(13％)化合物N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝925(M+H)+。
将11.3mg(0.011mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷 -13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.0mg(0.04mmol) 二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入10.7mg(0.04mmol) 乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％ TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.4mg(40％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H)+。
中间体F264
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基} 氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006531
将30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和12.2mg(0.04 mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸(中间体 L79)溶解于1.0ml DMF中，并加入16.4mg(0.04mmol)HATU和14.0mg (0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50 ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到8.9mg(24％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝981(M+H)+。
将15.3mg(0.015mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.045 mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入13.5mg(0.045 mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水 (0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.1mg(62％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝837(M+H)+。
中间体F265
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-10,13-二氧杂-3-硫杂-7,16-二氮杂二十二烷-1-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006541
首先将30.0mg(42.7μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)和25.3mg(55.6μmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)己酰胺(1:1)(中间体L82)加入到1.9ml乙腈中，并加入60μl(340 μmol)N,N-二异丙基乙胺和33μl(56μmol)2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物 (2,4,6-tripropyl-1,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinane 2,4,6-trioxide)(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到26.7mg(理论值的60％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基 [4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧杂 -7-硫杂-4,11,20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.40min；MS(ESIpos):m/z＝1025(M+H)+。
将25.3mg(24.7μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧杂-7-硫杂-4,11,20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入20.2mg(148μmol) 二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入43.3mg(148μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％ TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到23.4mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝881(M+H)+。
中间体F266
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12-二氮杂十八烷-18-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006561
首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与22.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L83)一起加入到1.9ml乙腈中。然后加入60μl (0.34mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50 ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到20.5mg(理论值的49％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧杂 -16-硫杂-3,12,19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝969(M+H)+。
将19.1mg(19.7μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[19-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12,19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入16.1mg(118μmol) 二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入34.6mg(118μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％ TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13.9mg(理论值的75％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝825(M+H)+。
中间体F267
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β- 丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006571
在氩气下，首先将13.4mg(33.3μmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(中间体L74)加入到1.0ml DMF中，并加入9.3μl(54.4μmol)N,N-二异丙基乙胺和12.6mg (33.3μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.7μl(27.7μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的25.0mg(27.7 μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)(参见中间体F216的合成)。将反应混合物在室温下搅拌90分钟。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.90mg(理论值的19％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代 -6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸。
LC-MS(方法5):Rt＝4.44min；MS(ESIpos):m/z＝1172(M+H)+。
将6.70mg(5.71μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代 -6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰基-β-丙氨酸溶解于1.0 ml三氟乙醇中，并加入4.67mg(34.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在 50℃下搅拌1h。加入10mg(34.3μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA) 直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.4 mg(理论值的67％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝1028(M+H)+。
中间体F268
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-28-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,23-二氧代-10,13,16,19-四氧杂-3-硫杂-7,22-二氮杂二十八烷-1-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006581
首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与30.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)己酰胺(1:1)(中间体L84)一起加入到2.0ml乙腈中。然后加入 60μl(0.34mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol) T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到27.9mg(理论值的59％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代 -14,17,20,23-四氧杂-7-硫杂-4,11,26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝1114(M+H)+。
将25.6mg(23.0μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代-14,17,20,23-四氧杂-7-硫杂-4,11,26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸酯溶解于2.5ml三氟乙醇中，并加入18.8mg(138 μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入40.3mg(138μmol) 乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％ TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到22.2mg(理论值的88％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝969(M+H)+。
中间体F269
4-{[(8R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10- 硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-8-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006601
首先将17.0mg(0.0195mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)与4.99mg(0.0253mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体L1)一起加入到1.0ml乙腈中。然后加入 27μl(0.16mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入15μl(0.025mmol) T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.5mg(理论值的46％)化合物 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代 -5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.47min；MS(ESIpos):m/z＝1052(M+H)+。
将8.3mg(7.89μmol)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入6.45mg(47.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌6h。加入6.45mg(47.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌 10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.10mg(理论值的 14％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝852(M+H)+。
中间体F270
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006611
在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体C78)加入到1.0ml DMF中，并加入8.0μl(45.8μmol)N,N-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.0μl(22.9μmol) N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的8.54mg(27.4μmol)三氟乙酸/N-(2- 氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L1)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到14.7mg(理论值的77％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法5):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝835(M+H)+。
将13.2mg(15.8μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.9mg(94.8μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺 -N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.9mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝691(M+H)+。
中间体F271
4-{[(20R,26R)-25-(3-氨基丙基)-26-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-27,27-二甲基-2,19,24-三氧代 -6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-20-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006621
在氩气下，首先将19.4mg(22.2μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)加入到2.0ml DMF中，并加入21.7mg(44.4μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L74)、12μl(67μmol)N,N-二异丙基乙胺和16.9mg(44.4μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速： 50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到18.1mg(理论值的66％)化合物 4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代 -5,21,24,27,30-五氧杂-14-硫杂-7,11,18,33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法4):Rt＝1.79min；MS(ESIpos):m/z＝1250(M+Na)+。
将18.1mg(14.7μmol)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧杂-14-硫杂-7,11,18,33- 四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.0mg(88.4μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入25.8mg(88.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到12.3mg (理论值的73％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝1028(M+H)+。
中间体F272
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]琥珀酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006641
在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体C78)加入到1.0ml DMF中，并加入8.0μl(45.8μmol)N,N-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.0μl(22.9μmol) N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的13.4mg(27.4μmol)三氟乙酸/N-(14- 氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L85)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.8mg(理论值的68％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基 [23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代-6,9,12,15-四氧杂 -3,18,23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(ESIpos):m/z＝1011(M+H)+。
将15.1mg(14.9μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[23-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18,23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.2mg(89.6 μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入26.2mg(89.6μmol) 乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％ TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.3mg(理论值的70％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝867(M+H)+。
中间体F273
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18-二氮杂二十四烷-24-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006651
在氩气下，首先将20.0mg(28.5μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂 -14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入到1.0ml DMF 中，并加入10.0μl(57.0μmol)N,N-二异丙基乙胺和13.0mg(34.2μmol) HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于5.0μl(28.5 μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的16.7mg(34.2μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L85)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50 ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到18.6mg(理论值的62％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝1057(M+H)+。
将17.1mg(16.2μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[25-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入13.2mg(97.0 μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入28.4mg(97.0μmol) 乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％ TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.80mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝913(M+H)+。
中间体F274
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006661
首先将13.9mg(0.0167mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)与7.07 mg(0.0217mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(中间体L86)一起加入到2.0ml乙腈中。然后加入23μl (0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入13μl(0.022mmol)T3P(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到3.70mg(理论值的19％)化合物N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1024(M+H)+。
将10.6mg(10.3μmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入8.46mg (62.1μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入18.1mg (62.1μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.60mg(理论值的54％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.69min；MS(ESIpos):m/z＝880(M+H)+。
中间体F275
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-N-(2-{[(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006681
首先将39.0mg(55.6μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11- 二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入到4.0ml DMF中，加入41.6 mg(111μmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-L-谷氨酸酯盐酸盐(1:1) (中间体L89)、29μl(170μmol)N,N-二异丙基乙胺和42.3mg(111μmol) HATU，并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物在室温下搅拌1 小时，用乙酸淬灭并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到53.1mg(理论值的93％)化合物1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14- 硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-L-谷氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.71min；MS(ESIpos):m/z＝1021[M+H]+
在氩气下，首先将7.60mg(33.9μmol)乙酸钯(II)加入到3.0ml二氯甲烷中，并加入14μl(100μmol)三乙胺和110μl(680μmol)三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5min，并加入溶解于3.0ml二氯甲烷中的69.2mg(67.7μmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11二氮杂-2-硅杂十七烷 -17-基)-L-谷氨酸酯。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用二氯甲烷洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到38.4mg(理论值的61％)化合物(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代 -19-{3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18- 三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝931(M+H)+。
首先将10.0mg(10.7μmol)(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代 -3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸(中间体C69)加入到1.0ml DMF中，加入6.73mg(21.5 μmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺/2,2,2- 三氟乙烷-1,1-二醇(1:1)(中间体L1)、5.6μl(32μmol)N,N-二异丙基乙胺和8.17mg(21.5μmol)HATU，并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物在室温下搅拌3小时，用乙酸淬灭，并通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.90mg(理论值的58％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1110[M+H]+
将6.90mg(6.21μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入10.1mg(74.4μmol)二氯化锌，将反应混合物在50℃下搅拌过夜并在室温下搅拌72h。加入54.5mg(186μmol)乙二胺-N,N,N',N'- 四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.4mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝866(M+H)+。
中间体F276
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸 (1:1)
Figure BDA0003554407600006701
在氩气下，首先将9.08mg(28.9μmol)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸(中间体L87)加入到1.0 ml DMF中，并加入8.33μl(48.2μmol)N,N-二异丙基乙胺和11.0mg(28.9 μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.67μl (24.1μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0ml DMF中的20.0mg(27.7μmol) S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.70mg(理论值的19％)化合物 S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基) 乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.47min；MS(ESIpos):m/z＝1013(M+H)+。
将13.9mg(13.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基] 氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.6mg(41.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入 5.6mg(41.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌30分钟。加入24.1mg(82.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.8mg(理论值的 80％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.58min；MS(ESIpos):m/z＝869(M+H)+。
中间体F277
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006721
将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基 -N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷 -17-基)-D-丙氨酸酯(1:1)(中间体C80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27 μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.80mg(理论值的65％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基 N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷 -17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1008(M+H)+。
将5.80mg(5.75μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入4.70mg(34.5μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入4.70mg(34.5μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入20.2mg(69.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％ TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.70mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.90min；MS(ESIpos):m/z＝764(M+H)+。
中间体F278
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-{[(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006731
将10.0mg(9.98μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基 -N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷 -17-基)-D-丙氨酸酯(1:1)(中间体C80)和2.77mg(11.0μmol)1-{2-[(2,5- 二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入3.3μl(30μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA) 直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.50mg (理论值的54％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.51min；MS(ESIpos):m/z＝1024(M+H)+。
将5.50mg(5.36μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌 1h。加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌 1h。加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌 4h。加入28.2mg(96.5μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.70mg(理论值的56％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H)+。
中间体F279
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基 -N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({(2R)-2-羧基-2-[(3-羧基丙酰基)氨基]乙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600006751
将12.2mg(14μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(83.8μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(83.8μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％ TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.60mg(理论值的42％)化合物4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
将10.0mg(12.7μmol)4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)和7.41mg(12.7μmol)2,5- 二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯(中间体L88)溶解于1.5ml二甲基甲酰胺中，并加入 4.4μl(25μmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2h。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.20mg(理论值的39％) 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.11min；MS(ESIpos):m/z＝1036(M+H)+。
中间体F280
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯甲酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006761
标题化合物是通过以下方式由中间体C64制备：通过与市售的 1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝755(M+H)+。
中间体F281
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006762
首先，通过肽化学的经典方法制备修饰的氨基酸结构单元N-(溴乙酰基)-β-丙氨酸和2-(三甲基甲硅烷基)乙基-3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸酯。然后在存在HATU和吗啉的情况下将这些偶联。然后使用浓度为10％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到中间体2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-{[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-D-丙氨酸酯。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝791和793(M+H)+。
中间体F282
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(3-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基} 丙基)丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006771
首先，通过肽化学的经典方法由甘氨酸叔丁酯和溴代乙酸酐制备中间体三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N2-(溴乙酰基)甘氨酰胺(1:1)。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝747和749(M+H)+。
中间体F283
N-[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]-N2-(溴乙酰基)-L-α-天冬酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006781
首先，由(2S)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸和溴代乙酸酐制备修饰的氨基酸结构单元(2S)-2-[(溴乙酰基)氨基]-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸和溴代乙酸酐，并由市售的3-{[(苄氧基)羰基] 氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)制备氨基酸结构单元2-(三甲基甲硅烷基)乙基-3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸酯。在存在HATU和吗啉的情况下将这两种结构单元偶联，然后使用浓度为5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团，并由此得到中间体三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基 -N-{(2R)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(溴乙酰基)-L-α-天冬氨酸酯(1:1)。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝835和837(M+H)+。
中间体F284
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006791
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将中间体L80 与市售的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，然后使用浓度为 16％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法12):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝984.45(M+H)+。
中间体F285
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-[(18-溴-17-氧代-4,7,10,13- 四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006792
首先，将中间体L80用市售的溴代乙酸酐酰化，然后使用浓度为20％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团。
最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与中间体C58偶联，随后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝967和969(M+H)+。
中间体F286
1-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酰基)氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸/ 三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006801
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将中间体L91 与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，然后使用浓度为12.5％的 TFA的DCM溶液除去Boc保护基团。在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下将所得中间体与中间体C58偶联，然后通过用氯化锌去保护而转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝984(M+H)+。
中间体F288
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-({N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丝氨酰基}氨基)-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006811
在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，偶联35mg(39μmol) 中间体C74与N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丝氨酸(其已经预先由O-叔丁基-L-丝氨酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)乙酸制备)。用氯化锌去保护并通过HPLC纯化，得到14mg(理论值的38％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.43min；MS(ESIpos):m/z＝824.34(M+H)+。
中间体F289
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-N6-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]-D-赖氨酸/三氟醋酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600006812
首先，通过肽化学的经典方法由N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)-D-赖氨酸制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N6-[(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-赖氨酸酯(1:1)。
然后，在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将12.5mg(25μmol) 该中间体与15mg(23μmol)中间体C58偶联。用氯化锌去保护并通过 HPLC纯化，得到14mg(理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝779(M+H)+。
中间体F290
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-N6-(溴乙酰基)-D-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006821
首先，通过肽化学的经典方法由N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)-D-赖氨酸制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N6-(溴乙酰基)-D-赖氨酸酯(1:1)。
然后，在存在HATU和4-甲基吗啉的情况下，将12mg(25μmol)该中间体与15mg(23μmol)中间体C58偶联。用氯化锌去保护并通过HPLC 纯化，得到7mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝762和764(M+H)+。
中间体F291
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基 -N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600006831
标题化合物是通过以下方法由实施例M9制备：首先，在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％) 氢化1小时而除去Z保护基团，然后通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联而将去保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝777(M+H)+。
中间体F293
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)苯甲酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006832
将35mg(39μmol)中间体C74溶解于4ml DMF中，并在存在N,N- 二异丙基乙胺的情况下，与13.5mg(43μmol)市售的1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶联。用氯化锌去保护并通过HPLC纯化，得到12mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝799(M+H)+。
中间体F294
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基 -N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600006841
在室温、氢标准压力下，将溶解于12ml甲醇中的41mg(0.05mmol) 中间体C76经10mg活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后，将催化剂滤出，并在减压下除去溶剂。得到32mg(理论值的92％)去保护的中间体。
将15mg(0.022mmol)该中间体溶解于DMF中，并加入13mg(0.039 mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮和7μl N,N- 二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将残余物通过HPLC 纯化。得到9mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝895(M+H)+。
中间体F295
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基 -N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
Figure BDA0003554407600006842
在室温、氢标准压力下，将溶解于12ml甲醇中的41mg(0.05mmol) 中间体C76经10mg活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后，将催化剂滤出，并在减压下除去溶剂。得到32mg(理论值的92％)去保护的中间体。
将15mg(0.022mmol)该中间体溶解于4ml DMF中，并加入10mg (0.039mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯 -2,5-二酮和7μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌2h后，将反应物浓缩，并将残余物通过HPLC纯化。得到10mg(理论值的56％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝821(M+H)+。
中间体F296
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)磺酰基]乙基}丁酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006851
标题化合物是通过以下方法由中间体L81制备：在存在HATU和N,N- 二异丙基乙胺的情况下，与中间体C58偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下，在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化30min 而除去Z保护基团。然后，通过以下方法将去保护的中间体转化成标题化合物：在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，最后用氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝785(M+H)+。
中间体F297
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体1)
Figure BDA0003554407600006861
在氩气下，将15mg(0.11mmol)氯化锌加入到36mg(0.03mmol，纯度68％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体 C92)在0.74ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后加入32mg(0.11mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到6.4mg(理论值的25％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝792 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体F298
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体2)
Figure BDA0003554407600006871
在氩气下，将19mg(0.14mmol)氯化锌加入到45mg(0.04mmol， 71％纯的)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体 C91)在0.94ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入42mg(0.14mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到5.7mg(理论值的18％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝791 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体F299
S-(2-{(3-氨基丙基)[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}-2-氧代乙基)-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006881
向88.0mg(0.09mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸 (中间体C84)在1.88ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入76.8mg(0.57 mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入164.6mg(0.57 mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到31mg(理论值的35％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.82min；MS(ESIpos):m/z＝792(M+H)+。
中间体F300
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)丙酰基]氨基}乙基)丁酰胺
Figure BDA0003554407600006891
在氩气下，向7mg(0.08mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基 {(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸酯(中间体C100)在0.2ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入11mg(0.08mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入14mg(0.05mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和饱和NaCl 溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到1.6mg(理论值的27％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝707 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体F302
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸三氟乙酸酯(1:1)(异构体1)
Figure BDA0003554407600006901
在氩气下，向56.9mg(58.2mmol，纯度85％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸(中间体C94)在1.4ml 2,2,2-三氟乙醇中的混合物中加入31.7mg(0.23mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入68.0mg(0.23mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC 纯化。得到7mg(理论值的13％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝736 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体F305
N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-N-(吡咯烷-3-基甲基)-10,13-二氧杂-3-硫杂-7,16-二氮杂二十二烷-1-酰胺/三氟乙酸(1:1)(异构体2)
Figure BDA0003554407600006911
向24.80mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,19- 三氧代-12,15-二氮杂-5-硫杂-2,9,18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C99)在0.65ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入13.42mg(0.10 mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入28.78mg(0.10 mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的44％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝3.11min；MS(ESIpos):m/z＝907 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体F306
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006921
标题化合物是通过以下方法制备：在存在16.7mg(0.044mmol)HATU 和15μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将24mg(0.029mmol)中间体C61 与30mg(0.035mmol)中间体L99偶联，随后如对于中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌去保护。通过制备型HPLC纯化，得到19mg(经两个步骤，理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝1091(M+H)+。
中间体F307
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-{(5R,14R)-13-[(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1- 基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006922
将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基 -N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷 -17-基)-D-丙氨酸酯(1:1)(中间体C80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27 μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.80mg(理论值的65％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基 N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷 -17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1008(M+H)+。
将2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14- 硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸酯 (31.9mg，31.6μmol)和L-半胱氨酸(7.66mg，63.2μmol)溶解于3.0ml DMF中，并在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱： Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到28.1mg(理论值的 76％)化合物S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23- 基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法12):Rt＝2.52min；MS(ESIpos):m/z＝1049[M+H]+
将S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基] 羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(13.5mg，11.6μmol)溶解于1.0ml DMF中，加入2,5- 二氧代吡咯烷-1-基N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯(6.76mg，11.6μmol)(中间体L88)和N,N-二异丙基乙胺(4.0μl，23μmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.1mg(理论值的68％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代 -19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂 -2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法14):Rt＝7.38min；MS(ESIpos):m/z＝1412[M+H]+
将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基] 羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸(9.40mg，6.65μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(5.44 mg，39.9μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(5.44mg， 39.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(23.4mg，79.8μmol)加入反应混合物中(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.60mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝1168(M+H)+。
中间体F308
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基 -N-[(12R,19R)-19-氨基-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-12,19-二羧基-5,10,15-三氧代-7,17-二硫杂-4,11,14-三氮杂十九烷-1-基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006951
将N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)(12.7mg，14.5μmol)和N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(3.84mg，14.5μmol)溶解于1.5ml DMF 中并在室温下搅拌过夜。
然后加入N,N-二异丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.40mg(理论值的 48％)化合物S-{(5R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸 (1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝949[M+H]+
将S-{(5R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1- 基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(7.50 mg，7.05μmol)溶解于1.0ml DMF中，并加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基 N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酯(4.11mg，纯度82％，7.05μmol)(中间体L88)和N,N-二异丙基乙胺 (2.5μl，14μmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA) 直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.30mg (46％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-10,20-二硫杂 -7,13,16,23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法14):Rt＝6.47min；MS(ESIpos):m/z＝1312[M+H]+
将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基 -N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-10,20-二硫杂 -7,13,16,23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-L-丙氨酰胺(4.00mg，3.05 μmol)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(2.49mg，18.3μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h，然后向其中加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸 (5.34mg，18.3μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.50mg(理论值的64％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.00min；MS(ESIpos):m/z＝1168[M+H]+
中间体F309
4-{[(11R,17R)-16-(3-氨基丙基)-17-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-18,18-二甲基-6,6-二氧化 (dioxido)-2,10,15-三氧代-6λ6,13-二硫杂-3,9,16-三氮杂十九烷-11-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600006971
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(50.0mg，57.3μmol)(中间体C77)和三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄酯(1:1) (27.5mg，68.7μmol)(中间体L81)加入到4.0ml DMF中，并加入HATU (26.1mg，68.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(30μl，170μmol)。将反应混合物在室温下搅拌10min，然后通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到53.9mg(81％)化合物 4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}26,26-二甲基-7,7-二氧化-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧杂-7λ6,14- 二硫杂-4,10,17,21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.54min；MS(ESIpos):m/z＝1141[M+H]+
在氩气下，首先将乙酸钯(II)(5.12mg，22.8μmol)加入到3.0ml DCM 中，加入三乙胺(9.5μl，68μmol)和三乙基硅烷(73μl，460μmol)，并将混合物搅拌5min。然后加入在2.0mlDCM中的 4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}26,26-二甲基-7,7-二氧化-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧杂-7λ6,14-二硫杂-4,10,17,21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(52.1mg，45.6μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后与2.0ml 水混合。在减压下蒸发溶剂。向残余物中加入乙腈，将混合物过滤并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到43.4mg(85％)化合物三氟乙酸/4-{[(16R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17- 三氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丙酸叔丁酯(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝1007[M+H]+
首先将三氟乙酸/4-{[(16R)-23-氨基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4- 氧代丁酸叔丁酯(1:1)(20.0mg，17.8μmol)和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸(3.32mg，21.4μmol)加入到2.0ml DMF中，并加入HATU (8.14mg，21.4μmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.3μl,54μmol)。
将反应混合物在室温下搅拌10min。将反应混合物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA) 直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到17.4mg (85％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基 -21,21-二氧化-6,12,17,25-四氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18,24-四氮杂 -2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝1144[M+H]+
将4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2- 二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17,25-四氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18,24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(15.9mg，13.9μmol)溶解于2.0ml 三氟乙醇中，并加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)。将反应混合物在 50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(73.2mg，250μmol) 加入反应混合物(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.45min；MS(ESIpos):m/z＝944[M+H]+
中间体F310
三氟乙酸/N-[(8R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基 -2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-8-基]-2,5,8,11-四氧杂十四烷 -14-酰胺(1:1)
Figure BDA0003554407600006991
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(100mg，120μmol)(中间体C70)和1-[(14- 氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(44.1mg，132 μmol)加入到3.0ml DMF中，并加入4-甲基吗啉(40μl，360μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用乙酸(420μmol)淬灭并通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA) 直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到69.4mg (理论值的62％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIneg):m/z＝933[M-H]-
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-半胱氨酸(27.0mg，28.9 μmol)加入到2.0ml DMF中，并加入N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(11.4mg，57.7μmol)(中间体L1)、N,N-二异丙基乙胺(15μl，87μmol)和HATU(22.0mg，57.7μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13.7mg(理论值的43％)化合物 2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-18-硫杂-15,21- 二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸酯。
LC-MS(方法12):Rt＝2.54min；MS(ESIpos):m/z＝1114[M+H]+
将2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-18-硫杂-15,21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸酯(13.7mg，12.3μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(10.1mg，73.8μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(21.6mg，73.8μmol) 加入反应混合物(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.30mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝970[M+H]+
中间体F311
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007011
首先将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代 -6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(10.8mg，18.7μmol) (中间体L97)加入到1.0ml DMF中，加入N,N-二异丙基乙胺(5.4μl， 31.2μmol)和HATU(7.10mg，18.7μmol)，并将混合物搅拌10min。然后加入溶解于1.0ml DMF和N,N-二异丙基乙胺(2.7μl，15.6μmol)中的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(12.9mg，15.6μmol)(中间体C71)。将反应混合物在室温下搅拌2h，然后通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到3.5mg(18％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30- 基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIneg):m/z＝1276[M-H]-
将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13- 基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸(3.50mg， 2.74μmol)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(6.25mg，16.4 μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。将乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(47μl，16μmol)加入反应混合物(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.0mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1133(M+H)+。
中间体F312
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基 -N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(L-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2- 基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007021
标题化合物是通过以下方法由中间体C103制备：在存在HATU和 N,N-二异丙基乙胺的情况下，与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去Z保护基团。然后通过以下方式将去保护的中间体转化成标题化合物：通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，最后用氯化锌去保护并通过制备型HPLC纯化。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(ESIpos):m/z＝992(M+H)+。
中间体F313
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18- 基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007031
在氩气下，向55.0mg(0.14mmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸在2.60ml DMF中的溶液中加入16.9mg(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺和50.0mg(0.13mmol) HATU。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入40.0mg(0.05 mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基} 氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C107)的溶液，并将混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的13％，纯度82％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝1145(M+H)+。
向10.9mg(7.8mmol，纯度82％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸在0.85ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入4.3mg(0.03mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入9.1mg(0.03mmol) EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到2.3mg(理论值的26％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt 0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体F314
三氟乙酸/3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺
Figure BDA0003554407600007041
在氩气下，向50.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体 106)在3.14ml DMF中的溶液中加入16.89mg(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10 分钟。随后，加入27.29mg(0.09mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5- 二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺-三氟乙酸(1:1)(中间体L1)的溶液，并将混合物在室温下搅拌15分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。得到41mg(理论值的68％，纯度66％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.55min；MS(ESIneg):m/z＝959(M-H+Na)-。
向41.1mg(0.03mmol，纯度66％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基 (3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十四烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯在2.54ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入24.7mg(0.18mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入53.0mg(0.18mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到10mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt 0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体F315
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酰基}-L-半胱氨酸
Figure BDA0003554407600007051
在氩气下，向50.0mg(0.07mmol)3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(中间体L100)在3.5 ml DMF中的溶液中加入18.02mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺和31.82 mg(0.09mmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入50.0mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1- 基)己酰胺乙酸盐(1:1)(中间体C107)的溶液，并将混合物在室温下搅拌2h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物不经纯化即进一步使用。得到49mg(理论值的21％，纯度31％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIpos):m/z＝1022(M+H)+。
向49.0mg(0.015mmol，纯度31％)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H- 吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酰基}-L-半胱氨酸在0.5 ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入8.0mg(0.06mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入17.2mg(0.06mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到3mg(理论值的21％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝877 (M+H-CF3CO2H)+。
中间体F316
三氟乙酸/N-{2-[(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)氨基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺 (1:1)
Figure BDA0003554407600007071
在氩气下，向50.0mg(0.04mmol，纯度65％)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基} 丙酸(中间体106)在3.0mlDMF中的溶液中加入16.89mg(0.13mmol) N,N-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入37.2mg(0.09mmol，纯度70％)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺乙酸盐(1:1)(中间体 L73)的溶液，并将混合物在室温下搅拌7分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物不经纯化即进一步使用。得到57mg(理论值的 77％，纯度59％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.60min；MS(ESIpos):m/z＝981(M+H)+。
向56.0mg(0.03mmol，纯度59％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基 (3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯在2.8ml 2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入36.0mg(0.27mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入78.3mg(0.27mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。得到16mg(理论值的44％，纯度85％) 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝837(M+H-AcOH)+。
用于合成APDC或ADC前体(中间体系列Q)的一般方法
上述F系列的中间体(F1-F305)可根据方案1转化成APDC前体Q。在APDC前体分子中释放豆荚蛋白酶可裂解的三肽的N-末端氨基的情况下，其可在最后一步中用各种结构的取代的酰基基团或烷基基团进行修饰以改善性能特性。
本文中描述一种示例性方法：
将0.037mmol除F194和F294之外的合适中间体F1-F305或其适当保护的前体溶于1-20ml(优选5-10ml)合适的溶剂(例如DMF、DMSO、 DCM、氯仿、甲苯、THF、甲醇或其混合物)中，并加入0.039mmol N- 末端修饰的三肽衍生物(例如中间体L92)，以及0.041mmol标准偶联试剂(例如HATU、EDCI/HOBT、BEP等)和0.11mmol标准碱(例如N,N- 二异丙基乙胺、三乙胺、4-甲基吗啉等)。在室温下搅拌5min后，将混合物用2滴三氟乙酸酸化并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。在减压下浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。
当所连接的三肽衍生物的所述N-末端修饰是保护基团时，其可随后像前体分子中仍然存在的任何保护基团一样通过已知的方法分离，例如优选地通过氢解分离Z保护基团，通过酸水解分离Boc保护基团，通过碱水解分离Fmoc保护基团或通过氟化物或用氯化锌分离Teoc基团。
最后，可将如此释放的氨基酰化或烷基化以改善性能特性，例如用胺反应性基团(如活性酯、酰氯、异氰酸酯等)，或通过在存在标准偶联试剂(例如HATU、EDCI/HOBT、BEP等)和标准碱(例如N,N二异丙基乙胺、三乙胺、4-甲基吗啉等)的情况下与羧酸衍生物偶联。如果分子中仍然存在其他保护基团，则其可在最后一步中除去。
方案1：
Figure BDA0003554407600007091
[a)：HATU，DMF，N,N-二异丙基乙胺，室温或EDCI，HOBT，N,N- 二异丙基乙胺，DMF，室温；b)H2，10％Pd-C，MeOH，室温；c)R22-COOH， EDCI，HOBT，N,N-二异丙基乙胺，DMF，室温或R22-COOH，HATU， N,N-二异丙基乙胺，DMF，室温或R22-COOSu，N,N-二异丙基乙胺，DMF，室温]
此外，其他中间体可根据方案2和3转化成豆荚蛋白酶可裂解的ADC 前体。
方案2：
Figure BDA0003554407600007101
[a)：HATU，DMF，N,N-二异丙基乙胺，室温或EDCI，HOBT，N,N- 二异丙基乙胺，DMF，室温；b)H2，10％Pd-C，MeOH，室温；c)1,1'-[(1,5- 二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮，N,N-二异丙基乙胺， DMF，室温]
方案3：
Figure BDA0003554407600007111
[a)：HATU，DMF，N,N-二异丙基乙胺，室温或EDCI，HOBT，N,N- 二异丙基乙胺，DMF，室温；b)H2，10％Pd-C，MeOH，室温；c)1,1'-[(1,5- 二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮，N,N-二异丙基乙胺， DMF，室温]
作为方案1-3中所示的苄氧基羰基基团的替代物，可以使用在肽化学中确认的其他保护基团，并可通过同样已知的相应方法连接它们。保护基团策略的选择是根据本领域技术人员已知的与分子中存在的其他结构单元的相容性有关的要求进行。如果分子中仍然存在其他保护基团，则它们可在最后一步中除去。
所述合成的顺序还可以任选地重新排列。
此外，在接头结构L1-L2的上下文中的蛋白反应性基团可以在权利要求书的范围内变化。
中间体Q1
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007121
将30mg(0.037mmol)中间体F104溶于6ml DMF中，并加入16mg (0.039mmol)中间体L92、15.5mg(0.041mmol)HATU和0.11mmol N,N- 二异丙基乙胺。在室温下搅拌5min后，将混合物用2滴三氟乙酸酸化并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到21.5mg(理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝1083(M+H)+。
中间体Q2
N-乙酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007131
将30mg(0.037mmol)中间体F104溶于6ml DMF中，并加入14mg (0.045mmol)中间体L93、15.5mg(0.041mmol)HATU和0.112mmol N,N- 二异丙基乙胺。在室温下搅拌5min后，再加入1.5mg HATU和0.01mmol N,N-二异丙基乙胺，并将混合物在室温下再搅拌10min。然后将混合物用 2滴三氟乙酸酸化并在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到12.2mg(理论值的33％) 标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝991(M+H)+。
中间体Q3
N-(3-羧基丙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007141
将15mg(0.019mmol)中间体F104溶于5ml DMF中，加入9.7mg (0.02mmol)中间体L94、8.5mg(0.022mmol)HATU和0.056mol N,N- 二异丙基乙胺，并将混合物在室温下搅拌5min。然后将混合物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到5.7mg(理论值的27％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.17min；MS(ESIpos):m/z＝1149(M+H)+。
将该中间体溶解于2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入2.6mg(0.019mmol) 氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌45min。随后，加入5.6mg(0.019mmol) 乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将混合物用3ml乙腈/水9:1稀释。然后加入 10μl三氟乙酸，并将混合物在室温下搅拌10min，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到3.1mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝1049(M+H)+。
中间体Q4
三氟乙酸/N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N1-[(11S,15R)-15-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-14-乙醇酰基-16,16-二甲基-6,6-二氧化-2,10-二氧代-6λ6-硫杂-3,9,14-三氮杂十七烷-11-基]-L-天冬酰胺(aspartamide)(1:1)
Figure BDA0003554407600007151
将5mg(0.006mmol)中间体F296溶于3ml DMF中，并加入2.8mg (0.007mmol)中间体L92，以及2.3mg(0.006mmol)HATU和0.017mmol N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌15min后，将混合物用2滴三氟乙酸酸化并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到0.93mg(理论值的13％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝1175(M+H)+。
中间体Q5
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007161
将55mg中间体C101中的混合物溶于33ml DMF中，并加入27.5mg (0.067mmol)中间体L92，以及28mg(0.073mmol)HATU和32μl N,N- 二异丙基乙胺。在室温下搅拌10min后，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。
首先将如此获得的粗产物加入到4ml THF中，并加入2ml水和0.375 ml 2M的氢氧化锂溶液。将混合物在室温下搅拌1h，然后用1N的盐酸中和并在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到10.2mg N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基 -L-丙氨酰基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-天冬酰胺(aspartamide)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝904(M+H)+。
在下一步中，通过在室温、标准氢气压力下在甲醇中经活性碳上的钯 (10％)氢化1小时而除去Z保护基团，从而得到7.5mg(理论值的87％) L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-天冬酰胺 (aspartamide)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.80min；MS(ESIpos):m/z＝770(M+H)+。
将3.75mg(0.005mmol)L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-天冬酰胺(aspartamide)溶于4ml DMF 中，并加入1.72mg(0.007mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2- 氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮和1.2μl(0.007mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后在减压下浓缩，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水) 纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.3mg(理论值的29％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝907(M+H)+。
中间体Q6
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007171
将3.75mg(0.005mmol)在F5中所述的L-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N1-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-天冬酰胺(aspartamide)中间体溶于4 ml DMF中，并加入2.2mg(0.007mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基) 双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮和1.2μl(0.007mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后在减压下浓缩，并将残余物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.9mg(理论值的 27％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.04min；MS(ESIpos):m/z＝981(M+H)+。
中间体Q7
N-乙酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-({3-[(溴乙酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丁-2-基]-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007181
将4.1mg(0.005mmol)中间体F282溶于1ml DMF中，并加入1.7mg (0.005mmol)中间体L93、2.2mg(0.006mmol)HATU和0.6μl 4-甲基吗啉。在室温下搅拌60min后，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型 HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到1.2mg (理论值的24％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝1045和1047 (M+H)+。
中间体Q8
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-羧基-1-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,19,25- 三氮杂二十八烷-28-基]-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007191
将6.80mg(6.35μmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18- 基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体F257)和2.71mg(6.63μmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺(中间体L92)溶解于1.0ml DMF中，并加入2.66mg(6.98μmol)HATU和3.3μl(19μmol)N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌45min后，将混合物用4μl三氟乙酸酸化并通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到1.20mg(理论值的14％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝1346(M+H)+。
中间体Q9
Figure BDA0003554407600007201
将5mg(0.0062mmol)中间体F104溶于2ml DMF中，并加入2.2mg (0.0068mmol)中间体L95、4.7mg(0.012mmol)HATU和5个当量N,N- 二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将反应物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到2mg(理论值的32％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.28min；MS(ESIpos):m/z＝997(M+H)+。
中间体Q10
Figure BDA0003554407600007211
将5mg(0.0062mmol)中间体F104溶于2ml DMF中，并加入2.2mg (0.0068mmol)中间体L96、5.9mg(0.016mmol)HATU和4个当量4- 甲基吗啉。在室温下搅拌2h后，将混合物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到2.5mg(理论值的41％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝991(M+H)+。
中间体Q11
N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600007221
以与中间体Q9类似的方式，将7mg(0.0087mmol)中间体F104与中间体L103偶联。得到3.5mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝1068(M+H)+。
中间体Q12
N-异烟酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600007231
以与中间体Q9类似的方式，将8mg(0.0092mmol)中间体F104与中间体L104偶联。得到6mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.71min；MS(ESIpos):m/z＝1054(M+H)+。
中间体Q13
N-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰基}-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N<sup>1</sup>-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯 -1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007232
以与中间体Q9类似的方式，将7mg(0.0087mmol)中间体F104与中间体L105偶联。得到4.6mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝1109(M+H)+。
中间体Q14
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-谷氨酰胺
Figure BDA0003554407600007241
LC-MS(方法1):Rt＝1.15min；MS(ESIpos):m/z＝1097(M+H)+。
该中间体是以与中间体Q1类似的方式而制备。
中间体Q15
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-α-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600007251
以与中间体Q1类似的方式，将10mg(0.012mmol)中间体F104与中间体L106偶联。随后，通过用氯化锌裂解三甲基甲硅烷基乙基酯来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.1min；MS(ESIpos):m/z＝1085(M+H)+。
以与中间体Q1类似的方式，以下中间体Q16-Q22是用相应的中间体前体制备：
中间体Q16
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007261
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝1111(M+H)+。
中间体Q17
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007262
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝1111(M+H)+。
中间体Q18
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007271
标题化合物是通过以下方法由化合物C111开始制备：首先在存在 HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与中间体L107偶联，随后在三氟乙醇中通过氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝1107[M+H]+。
中间体Q19
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-甘氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007281
LC-MS(方法1):Rt＝1.06min；MS(ESIpos):m/z＝1069(M+H)+。
中间体Q20
N-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38- 基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(20R)-25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-羧基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,19,25-三氮杂二十八烷 -28-基]-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007282
在0℃下，将47.2mg(0.0559mmol)中间体L102溶于0.50ml DMF 中，并加入7.2mg(0.053mmol)HOAt以及20.2mg(0.0532mmol)HATU 和74.1μl(0.425mmol)N,N-二异丙基乙胺。在0℃下搅拌5min后，加入在DMF(0.5ml)中的57.0mg(0.0532mmol)中间体F257。在0℃下搅拌2h后，加入水(1.0ml)和ACN(1.5ml)。将混合物通过制备型HPLC (流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度＝1:2→2:1)纯化两次。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到9.0mg(理论值的9.5％)标题化合物。
LC-MS(方法14):Rt＝5,43min；MS(ESIpos):m/z＝1783.8643 (M+H)+。
中间体Q21
N-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38- 基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(2S)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007301
在0℃下，将57.5mg(0.0713mmol)中间体F104溶于0.80ml DMF 中，并加入61.2mg(0.0727mmol)中间体L102以及27.6mg(0.0727mmol) HATU和74.5μl(0.428mmol)N,N-二异丙基乙胺。在0℃下搅拌30min 后，加入水(1.0ml)和ACN(1.5ml)。将混合物通过制备型HPLC(流动相：ACN/水+0.1％TFA，梯度＝45％→85％)纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到39mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法14):Rt＝5,44min；MS(ESIpos):m/z＝1519.7598 (M+H)+。
中间体Q22
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(L-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2- 基]-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007311
标题化合物是通过以下方法由化合物C103开始制备：首先在存在 HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与中间体L92偶联。在下一步中，通过在标准氢气压力、室温下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)氢化30分钟而除去Z保护基团，然后在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下使去保护的中间体与1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮在DMF中反应。在最后一步中，通过氯化锌进行去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝1078[M+H]+。
中间体Q23
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007321
标题化合物是通过以下方法由化合物M9开始制备：首先在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下与中间体L92偶联。在下一步中，通过在室温、标准氢气压力下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)氢化30分钟而除去 Z保护基团，然后如在中间体Q6中所述的通过与1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5- 二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮反应而将去保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.89min；MS(ESIpos):m/z＝938[M+H]+。
中间体Q24
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N<sup>1</sup>-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-L-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600007322
标题化合物是通过以下方法由化合物M9开始制备：首先在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下与中间体L92偶联。在下一步中，通过在室温、标准氢气压力下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)氢化30分钟而除去 Z保护基团，然后通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮反应而将去保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝863[M+H]+。
中间体Q25
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600007331
标题化合物是通过以下方法由化合物C108开始制备：首先在存在 HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与中间体L92偶联。在下一步中，通过在标准氢气压力、室温下在DCM-甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去Z保护基团，然后通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮反应，最后通过氯化锌去保护而将去保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝1106[M+H]+。
中间体Q26
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600007341
标题化合物是以与中间体Q25类似的方式制备。
LC-MS(方法12):Rt＝1.55min；MS(ESIpos):m/z＝1162[M+H]+。
中间体Q27
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007342
标题化合物是通过以下方法由化合物C109开始制备：首先在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与中间体L107偶联，随后通过氯化锌去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝1107[M+H]+。
中间体Q28
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007351
标题化合物是通过以下方法由化合物C110开始制备：首先在存在 HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与中间体L92偶联。在下一步中，通过在标准氢气压力、室温下在DCM-甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去所有的保护基团，然后通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮反应而将去保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.74min；MS(ESIneg):m/z＝1161[M-H]-。
中间体Q29
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基) 氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007361
在存在30mg HATU和34μl N,N-二异丙基乙胺的情况下，将40mg (39μmol)中间体C110在9ml DMF中与19.6mg(47mmol)中间体L92 偶联。随后，通过在标准氢气压力、室温下在甲醇中经活性碳上的钯(10％) 氢化1小时而除去所有的保护基团，然后通过在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下与1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮反应而将去保护的中间体转化成标题化合物，将其通过制备型HPLC纯化。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(ESIpos):m/z＝1181(M+H)+。
中间体Q30
N-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-N-甲基-L-丙氨酰基 -L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基] 氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007371
首先，三氟乙酸/4-硝基苄基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬氨酸酯(1:1) 是通过以下方式制备：通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与4-硝基苄基L-天冬氨酸酯氢溴酸盐(1:1)在DMF中偶联，然后在DCM中用三氟乙酸对氨基去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.43min；MS(ESIpos):m/z＝410(M+H)+。
在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下将该中间体与N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-L-丙氨酸在DMF中偶联。随后，通过在DCM-甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化而分离对硝基苄基酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.55min；MS(ESIpos):m/z＝460(M+H)+。
在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将如此获得的中间体与中间体C110在DMF中偶联。随后，通过与4个当量氯化锌在三氟乙醇中在50℃下一起搅拌1h而分离Boc保护基团。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝1235(M+H)+。
将44mg(32μmol)该中间体与25.4mg(195μmol)6-氧代己酸(其已经预先通过文献方法(J.Org.Chem.1993,58,2196)制备)在20ml甲醇中混合，并加入7.8μl乙酸和29mg(313μmol)硼烷-吡啶复合物。将混合物在室温下搅拌1h，然后在减压下浓缩，并通过制备型HPLC纯化。得到25mg(理论值的56％)(6S,13S,16S,19S,22S,25S)-16-(2-氨基-2-氧代乙基)-13-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-6-[(苄氧基)羰基]-19,22,25,26-四甲基-3,8,12,15,18,21,24-七氧代-1-苯基-2-氧杂-7,11,14,17,20,23,26-七氮杂三十二烷-32-酸。
将24.5mg(0.018mmol)该中间体溶解于6ml DMF中，加入34mg (0.27mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮、16μl N,N-二异丙基乙胺，并分次加入总量为50mg(0.13mmol)的HATU。在室温下搅拌2h后，将反应溶液用TFA调节至pH 3-4，然后浓缩并通过制备型HPLC纯化。得到23mg (87％)保护的中间体，然后将其溶于10ml乙醇中。在加入活性碳上的钯(10％)后，在标准氢气压力下除去苄基酯基团，并在滤出催化剂后，将剩余的溶液浓缩，然后将残余物从乙腈/水9:1中冻干，得到20mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝1266(M+H)+。
中间体Q31
三氟乙酸/N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N1-{(2S)-1-({2-[(N2-乙酰基-L-赖氨酰基)氨基]乙基}氨基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)(1:1)
Figure BDA0003554407600007381
标题化合物是通过以下方法制备：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，使中间体C112与中间体L103在DMF中进行HATU偶联，随后通过在50℃下在三氟乙醇中与6个当量氯化锌一起搅拌30分钟而分离Boc保护基团。
LC-MS(方法1):Rt＝0.76min；MS(ESIpos):m/z＝1101(M+H)+。
中间体Q32
N2-乙酰基-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N1-{(2S)-1-[(3-{[(5S)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007391
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将中间体C108 与中间体L92在DMF中偶联。在下一步中，通过在氢标准压力、室温下在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去Z保护基团。随后，通过以下方法将去保护的中间体转化成标题化合物：在存在HATU 和N,N-二异丙基乙胺的情况下，与中间体L109在DMF中反应，随后通过在50℃下在三氟乙醇中与12个当量氯化锌搅拌90min而去保护。
LC-MS(方法12):Rt＝1.17min；MS(ESIneg):m/z＝1137(M-H)-。
中间体Q33
N2-乙酰基-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(L-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2- 基]-L-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007401
标题化合物是通过以下方法制备：在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，将中间体C103与中间体L110在DMF中进行HATU偶联，随后通过在50℃下在三氟乙醇中与10个当量氯化锌一起搅拌6h而完全去保护。
LC-MS(方法1):Rt＝0.72min；MS(ESIpos):m/z＝1111(M+H)+。
中间体Q34
N2-乙酰基-L-赖氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基 -N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1S)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007411
标题化合物的合成是在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下从中间体 C110与中间体L110在DMF中进行HATU偶联开始。在下一步中，通过在氢标准压力、室温下在DCM/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1 小时而除去苄基酯保护基团。在最后一步中，通过在50℃下在三氟乙醇中与8个当量氯化锌一起搅拌6h而分离Teoc保护基团。
LC-MS(方法12):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝1140(M+H)+。
中间体Q35
N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基 -N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007421
以与中间体Q1类似的方式，将15mg(0.019mmol)中间体F104与 10mg(0.024mmol)中间体L111偶联。通过制备型HPLC纯化后，得到 4mg(理论值的17％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝1082(M+H)+。
中间体Q36
N-乙酰基-L-丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007431
以与中间体Q1类似的方式，将15mg(0.019mmol)中间体F104与 8mg(0.024mmol)中间体L112偶联。通过制备型HPLC纯化后，得到 5.8mg(理论值的28％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝1005(M+H)+。
中间体Q37
N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-({4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁基}氨基)-1-氧代丁-2- 基]-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007441
首先将20mg(31μmol)中间体C114与11.6mg(22.9μmol)N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺/三氟乙酸(1:1)(中间体 L104)一起加入到5.0ml DMF中。然后加入11μl N,N-二异丙基乙胺和21 mg(55μmol)HATU。将反应混合物在室温下搅拌60分钟。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。随后通过在50℃下在三氟乙醇中与6个当量的氯化锌一起搅拌 2小时而分离叔丁基酯基团。加入6个当量的EDTA后，通过制备型HPLC 进行纯化。在最后一步中，将获得的中间体溶于DMF中，加入15个当量的1-羟基吡咯烷-2,5-二酮，并通过在存在5个当量的HATU和5个当量的 N,N-二异丙基乙胺的情况下搅拌60分钟而转化为标题化合物。标题化合物是通过制备型HPLC纯化。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝1071(M+H)+。
中间体Q38
N-甲基-N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007451
以与中间体Q1类似的方式，将15mg(0.019mmol)中间体F104与 12.5mg(0.024mmol)中间体L113偶联。通过制备型HPLC纯化后，得到4mg(理论值的19％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝1082(M+H)+。
中间体Q39
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-(甲基氨基)-1-氧代丁-2-基]-L-天冬酰胺 (aspartamide)
Figure BDA0003554407600007461
标题化合物是由化合物C115开始通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下与中间体L107偶联而制备。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝920[M+H]+。
中间体Q40
N-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰基}-L-丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基] 氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)
Figure BDA0003554407600007471
以与中间体Q1类似的方式，将15mg(0.019mmol)中间体F104与 12.5mg(0.024mmol)中间体L114偶联。通过制备型HPLC纯化后，得到10.8mg(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝1123(M+H)+。
中间体Q41
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16,18-二羧基-5,10,14-三氧代-7-硫杂-4,11,15-三氮杂十八烷-1- 基]-L-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007481
在氩气下，首先将11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂 -2-硅杂十七烷-17-酸(174mg，纯度94％，234μmol)(中间体C69)和三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-谷氨酸二苄酯(1:1)(144mg，281μmol)(中间体 L115)一起加入到4.0ml DMF中。向反应混合物中加入HATU(107mg， 281μmol)和N,N-二异丙基乙胺(120μl，700μmol)，将反应混合物在室温下搅拌10分钟。将混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用水和饱和 NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到229mg(理论值的85％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14- 硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二苄酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.55min；MS(ESIpos):m/z＝1082[M+H]+
将N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二苄酯(226mg，209μmol)溶解于10ml 三氟乙醇中。将氯化锌(171mg，1.25mmol)加入反应混合物(其被在50℃下搅拌1h)。再加入两份(每份6个当量)ZnCl2，并且每次将混合物在50℃下搅拌1h。向混合物中加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(1.10g，3.75mmol)并短暂地搅拌。将反应混合物溶于乙腈中，通过注射器过滤器过滤，并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到182mg(理论值的83％)化合物三氟乙酸/N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二苄酯(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.07min；MS(ESIpos):m/z＝938[M+H]+
在氩气下，首先将三氟乙酸/N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-β-丙氨酰基-L-谷氨酸二苄酯(1:1)(55.0mg，52.3μmol)和N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺(26.0mg，62.7μmol)(中间体L92)加入到2.5ml DMF中。向反应混合物中加入HATU(23.9mg， 62.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(27μl，160μmol)，并将混合物在室温下搅拌10min。向混合物中加入1ml水(0.1％TFA)，将混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水， 0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到54.6mg(理论值的79％)化合物(2S)-2-{[(5S,8S,11S)-11-(2-氨基-2-氧代乙基)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-5,8-二甲基-3,6,9,12,18,23,27-七氧代-1-苯基-2-氧杂-20-硫杂 -4,7,10,13,17,24-六氮杂二十七烷-27-基]氨基}戊二酸二苄酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝1328[M+H]+
将(2S)-2-{[(5S,8S,11S)-11-(2-氨基-2-氧代乙基)-17-{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-5,8-二甲基 -3,6,9,12,18,23,27-七氧代-1-苯基-2-氧杂-20-硫杂-4,7,10,13,17,24-六氮杂二十七烷-27-基]氨基}戊二酸二苄酯(53.3mg，40.1μmol)溶解于3.0ml乙酸乙酯和3.0ml乙醇中，并加入活性碳上的钯(10％)(5.37mg)。将反应混合物在室温、标准压力下氢化过夜，然后通过纸过滤器过滤。将滤饼用乙酸乙酯和乙醇洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型 RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到5.6mg(理论值的11％)化合物L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5- 二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16,18-二羧基-5,10,14-三氧代-7- 硫杂-4,11,15-三氮杂十八烷-1-基]-L-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝1014[M+H]+
首先将L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N1-[(16S)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16,18-二羧基-5,10,14-三氧代-7-硫杂-4,11,15-三氮杂十八烷-1-基]-L-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1) (5.40mg，4.30μmol)和1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1.46mg，4.73μmol)加入到0.49ml DMF中。将 N,N-二异丙基乙胺(2.2μl，13μmol)加入反应混合物(其在室温下搅拌4 小时30分钟)。将0.5ml水(0.1％TFA)加入混合物(其通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA) 直接纯化)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到43.1mg 4.10mg(理论值的72％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝1207[M+H]+
中间体Q42
三氟乙酸/N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)(1:1)
Figure BDA0003554407600007511
首先将三氟乙酸/N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢 -1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺 (aspartamide)(1:1)(10.0mg，10.9μmol)(中间体C116)和N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酸(2.42mg，10.9μmol)加入到1.0ml DMF中。将HATU (4.95mg，13.0μmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.5μl，54μmol)加入反应混合物(其在室温下搅拌10分钟)。将1.0ml水(0.1％TFA)加入混合物(其通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min， MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到5.6mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.11min；MS(ESIpos):m/z＝1012[M+H]+
中间体Q43
N-[(苄氧基)羰基]-L-α-天冬酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007521
将10mg(0.011mmol)中间体C116溶于4ml DMF中，并加入3.9mg (0.012mmol)(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-叔丁氧基-4-氧代丁酸以及 6.2mg(0.016mmol)HATU和6μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌15min 后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到8.2mg(理论值的68％)保护的中间体，然后将其在50℃下在4ml三氟乙醇中用6mg(0.044mmol)氯化锌去保护。加入13mg(0.044mmol)EDTA，随后HPLC纯化后，得到3mg(理论值的35％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.05min；MS(ESIpos):m/z＝1056(M+H)+。
中间体Q44
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-α-天冬酰基-N1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1- 氧代丁-2-基}-L-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007531
将10mg(0.011mmol)中间体C116溶于4ml DMF中，并加入5.3mg (0.013mmol)(2S)-2-{[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丙酰基]氨基}-4-叔丁氧基-4-氧代丁酸以及6.2mg(0.016mmol)HATU和6μl N,N-二异丙基乙胺。在室温下搅拌15min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC 纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到8mg(理论值的57％)保护的中间体，然后将其在50℃下在2ml三氟乙醇中用5mg(0.037 mmol)氯化锌去保护。加入11mg(0.037mmol)EDTA，随后HPLC纯化后，得到3.5mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.04min；MS(ESIpos):m/z＝1127(M+H)+。
B：抗体/药物缀合物(ADC)的制备
B-1.用于产生抗体的一般方法
利用完整的人抗体噬菌体文库(Hoet RM et al.,Nat Biotechnol 2005； 23(3):344-8)，以通过使用人和小鼠TWEAKR的二聚Fc融合的胞外域作为固定化靶的蛋白质淘选(panning)(Hoogenboom H.R.,Nat Biotechnol 2005；23(3):1105-16)分离TWEAKR特异性人单克隆抗体。鉴定Fab噬菌体，并将相应的抗体重新格式化为人IgG1格式。通过在TPP-2090的重链中引入突变N297A(免疫球蛋白的Kabat编号系统)来产生非糖基化抗体 TPP-2658。将如此获得的抗体用于本文所述的工作实施例。此外，与 TWEAKR结合的抗体是本领域技术人员已知的，参见例如WO 2009/020933(A2)或WO 2009140177(A2)。
将市售的抗体西妥昔单抗(cetuximab)(商品名：Erbitux)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(商品名：Herceptin；INN 7637，CAS编号：RN： 180288-69-1)和尼妥珠单抗(nimotuzumab)(商品名：CIMAher)用于本文所述的工作实施例。
对于曲妥珠单抗-HC-N297A(对应于TPP-7510)，使用具有SEQ ID NO: 244的重链。轻链与曲妥珠单抗的轻链相同。
对于曲妥珠单抗-HC-N297Q(对应于TPP-7511)，使用具有SEQ ID NO: 245的重链。轻链与曲妥珠单抗的轻链相同。
B-2.用于在哺乳动物细胞中表达抗体的一般方法
抗体(例如TPP-2658、TPP-7510或TPP-7511)是在短暂哺乳动物细胞培养物中产生，如Tom et al.,Chapter 12in Methods Express:Expression Systems edited byMicheal R.Dyson and Yves Durocher，Scion Publishing Ltd, 2007中所述。
B-3.用于从细胞上清液中纯化抗体的一般方法
抗体(例如TPP-2658、TPP-7510或TPP-7511)是从细胞培养上清液中获得。通过对细胞进行离心而使细胞上清液澄清。然后通过在MabSelect Sure(GE Healthcare)色谱柱上进行亲和色谱法而纯化细胞上清液。为此，将所述柱在DPBS pH 7.4(Sigma/Aldrich)中平衡，施加细胞上清液，并将所述柱用约10倍柱体积的DPBS pH 7.4+500mM氯化钠洗涤。将抗体在50mM乙酸钠pH 3.5+500mM氯化钠中洗脱，然后通过在Superdex 200 柱(GEHealthcare)上在DPBS pH 7.4中进行凝胶过滤色谱法而进一步纯化。
市售的抗体是通过标准色谱法(蛋白质A色谱法、制备型凝胶过滤色谱法(SEC-尺寸排阻色谱法))从市售产品中纯化。
B-4.用于与半胱氨酸侧链偶联的一般方法
在偶联反应中使用以下抗体：
实施例a：西妥昔单抗(抗EGFR AK)
实施例e：曲妥珠单抗(抗-Her2 AK)
实施例i：尼妥珠单抗(抗-EGFR AK)
实施例k：TPP-2658(抗-TWEAKR AK)
偶联反应通常是在氩气下进行。
将溶解在PBS缓冲液中的2至5个当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP)加入到浓度范围为1mg/ml至20mg/ml(优选约10mg/ml至15 mg/ml)的适当抗体在PBS缓冲液中的溶液中，并将混合物在室温下搅拌 1h。为此目的，可以以工作实施例中所述的浓度使用所使用的各个抗体的溶液，或者也可以任选地用PBS缓冲液稀释至所述起始浓度的约一半，以达到优选的浓度范围。随后，根据预期负载量，以在DMSO中的溶液的形式加入2至12个当量(优选约5-10个当量)的待偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物。在本文中，DMSO的量应不超过总体积的 10％。在马来酰亚胺前体的情况下，将反应物在室温下搅拌60-240min，在卤化物前体的情况下，将反应物在室温下搅拌8至24h，然后将反应物施加到PBS平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007551
G-25，GE Healthcare)上并用PBS 缓冲液洗脱。一般而言，除非另有说明，否则将5mg在PBS缓冲液中的所研究的抗体用于还原和随后的偶联。因此，在每种情况下，在PD10柱上的纯化提供各个ADC在3.5ml PBS缓冲液中的溶液。然后将样品通过超速离心浓缩，并任选用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好地除去低分子量组分，用PBS缓冲液再稀释后重复超滤浓缩。对于生物学试验，如果需要，最终ADC样品的浓度任选地通过再稀释调节至0.5-15mg/ml 的范围。测定ADC溶液的各个蛋白质浓度，如工作实施例中所述。此外，使用B-7中所述的方法确定抗体负载量(药物/mAb比率)。
取决于接头，实施例中所示的ADC也可或多或少地以与抗体连接的水解的开链琥珀酰胺的形式存在。
特别地，通过以下接头结构与抗体的巯基连接的KSP-I-ADC也可以任选地通过以下方式以靶向方式制备：用经由开链琥珀酰胺连接的ADC根据方案28在偶联和搅拌后在pH8下重新缓冲约20-24h。
Figure BDA0003554407600007561
#1代表与抗体的硫桥，#2代表与修饰的KSP抑制剂的连接点
其中接头是通过水解的开链琥珀酰胺与抗体连接的此类ADC也可以任选地通过如下示例性方法以靶向方式制备：
小规模偶联：
向浓度范围为1mg/ml至20mg/ml(优选约5mg/ml至15mg/ml)的 2-5mg适当抗体在PBS缓冲液中的溶液中加入溶解于PBS缓冲液中的2 至5个当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)，并将混合物在室温下搅拌 30min至1h。为此目的，可以工作实施例中所述的浓度使用在每种情况下所使用的抗体的溶液，或者如有必要，可以用PBS缓冲液将其稀释至所述起始浓度的约一半以达到优选的浓度范围。随后，根据所需负载量，以在 DMSO中的溶液的形式加入2至12个当量(优选约5-10个当量)的待偶联的马来酰亚胺前体化合物。在本文中，DMSO的量应不超过总体积的 10％。将混合物在室温下搅拌60-240min，然后用预先已调节至pH 8的PBS 缓冲液稀释至3-7ml的体积，并在室温和氩气下搅拌过夜。然后使该溶液通过用PBS缓冲液平衡至pH 7.2的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007562
G-25，GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH7.2洗脱。随后通过超速离心浓缩并用 PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。
中规模偶联：
在氩气下，将0.344mg TCEP在100μl PBS缓冲液中的溶液加入到60 mg的所研究的抗体在5ml PBS缓冲液中的溶液(c～12mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于600μl DMSO中的0.003mmol 马来酰亚胺前体化合物。在室温下再搅拌1.5h-2h后，将反应物用1075μl 预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007563
G-25，GEHealthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗出液用PBS缓冲液pH 8稀释至总体积为14ml。将该溶液在室温和氩气下搅拌过夜。如果需要，然后将溶液重新缓冲至pH 7.2。将ADC溶液通过超速离心浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，然后任选地再次浓缩至浓度为约10mg/ml。
在工作实施例中，与抗体桥接的其他可能水解敏感的硫化环戊烷基琥珀酰亚胺(thianylsuccinimide)桥包含以下接头亚结构，其中#1代表与抗体键合的硫醚键，#2代表与修饰的KSP抑制剂的连接点：
Figure BDA0003554407600007571
这些接头亚结构代表与抗体连接的连接单元，并且(除了其他接头组成之外)对肿瘤细胞中形成的代谢物的结构和特征具有显著影响。
在所示结构式中，AK1可意指
实施例a：西妥昔单抗(部分还原的)-S§1
实施例e：曲妥珠单抗(部分还原的)-S§1
实施例i：尼妥珠单抗(部分还原的)-S§1
实施例k：抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(部分还原的)-S§1
其中
§1 代表与琥珀酰亚胺基团或与任何异构的水解的开链琥珀酰胺或由其产生的亚烷基基团连接的键
并且
S 代表部分还原的抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-5.用于与赖氨酸侧链偶联的一般方法
将以下抗体用于偶联反应：
实施例a：西妥昔单抗(抗EGFR AK)
实施例e：曲妥珠单抗(抗-Her2 AK)
实施例i：尼妥珠单抗(抗-EGFR AK)
实施例k：TPP-2658(抗-TWEAKR的抗体)
偶联反应通常是在氩气下进行。
根据预期负载量，将2至8个当量待偶联的前体化合物以在DMSO中的溶液的形式加入到所研究的抗体在PBS缓冲液中的溶液中(所述溶液的浓度范围为1mg/ml至20mg/ml，优选为约10mg/ml)。在室温下搅拌30 min至6h后，再次加入相同量的在DMSO中的前体化合物。在本文中， DMSO的量应不超过总体积的10％。在室温下再搅拌30min至6h后，将反应物施加到用PBS平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007581
G-25，GE Healthcare) 上，并用PBS缓冲液洗脱。一般而言，除非另有说明，否则将5mg在PBS 缓冲液中的所研究的抗体用于偶联。因此，在PD10柱上的纯化在每种情况下均提供各个ADC在3.5ml PBS缓冲液中的溶液。然后将样品通过超速离心浓缩，并任选地用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好地除去低分子量组分，用PBS缓冲液再稀释后重复超滤浓缩。对于生物学试验，如果需要，任选地通过再稀释将最终ADC样品的浓度调节至0.5-15mg/ml 的范围。
测定ADC溶液的各个蛋白质浓度，如工作实施例中所述。此外，使用B-7中所述的方法确定抗体负载量(药物/mAb比率)。
在所示结构式中，AK2具有以下含义
实施例a：西妥昔单抗-NH§2
实施例e：曲妥珠单抗-NH§2
实施例i：尼妥珠单抗-NH§2
实施例k：抗-TWEAKR的抗体TPP-2658-NH-§2
其中
§2 代表与羰基连接的键
并且
NH代表抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-5a.用于通过细菌转谷氨酰胺酶进行ADC合成的一般方法
在实施例系列t的偶联反应中，使用以下的抗体(以下的抗体-HC-N297Z名称意指在两个重链中氨基酸N297(Kabat编号)已被替换为氨基酸Z的抗体，TPP-XXXX-HC-Q295N-HC-N297Q名称意指具有 TPP-XXXX的抗体，其中在两个重链中氨基酸Q295(Kabat编号)已被替换为氨基酸N并且氨基酸N297(Kabat编号)已被替换为氨基酸Q。原始抗体的抗体名称可记为名称(例如曲妥珠单抗)或TPP-XXXX(具有TPP 编号XXXX的抗体))：
AK3a：抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(对应于TPP-2090-HC-N297A)
AK3b：抗-TWEAKR的抗体TPP-5442(对应于TPP-2090-HC-N297Q)
AK3c：抗-TWEAKR的抗体TPP-8225(对应于 TPP-2090-HC-Q295N-HC-N297Q)
AK3d：TPP-7510(对应于曲妥珠单抗-HC-N297A)
AK3e：TPP-7511(对应于曲妥珠单抗-HC-N297Q)
用于实现最大DAR为2的一般方法：
向5mg的相应非糖基化(aglyco)抗体变体(HC-N297A或 HC-Q295N-HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c～5-15mg/ml)中加入20μl(6个当量)合适的毒性基团接头前体的溶液(例如中间体Q31-Q34； 10mM的DMSO溶液)。在37℃下孵育5min后，加入50μl重组细菌转谷氨酰胺酶的水溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH,Darmstadt, Germany)(25U/ml)，并在37℃下继续孵育24h。然后将反应混合物用 DPBS pH 7.4稀释至总体积为2.5ml，通过凝胶过滤穿过DPBS平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007591
G-25，GE Healthcare)，并用pH 7.4的DPBS缓冲液洗脱。随后，通过Amicon Ultracel-30K Zentrifugation(Millipore)浓缩ADC 的体积，并用DPBS再次稀释至体积为2.5ml。最后，将溶于12.5μl DPBS 中的0.00625μmol b-转谷氨酰胺酶阻断剂Zedira C100加入到溶液中。测定ADC溶液的各个蛋白质浓度，如工作实施例中所述。此外，使用B-7中所述的方法确定抗体负载量(药物/mAb比率)。
用于实现最大DAR为4的一般方法：
向5mg相应非糖基化(aglyco)抗体变体(HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c～5-15mg/ml)中加入16-24个当量的合适的毒性基团接头前体的溶液(例如中间体Q31-Q34；10mM的DMSO溶液)。在37℃下孵育5min后，加入400μl(10U)重组细菌转谷氨酰胺酶的水溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH,Darmstadt,Germany)(25U/ml)，并在 37℃下继续孵育24h。然后将反应混合物用DPBS pH 7.4稀释至总体积为 2.5ml，通过凝胶过滤穿过DPBS平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007601
G-25，GE Healthcare)，并用pH 7.4的DPBS缓冲液洗脱。随后，通过Amicon Ultracel-30K Zentrifugation(Millipore)浓缩ADC的体积，并用DPBS再次稀释至体积为2.5ml。最后，将溶于200μl DPBS中的0.1μmol b-转谷氨酰胺酶阻断剂ZediraC100加入到溶液中。测定ADC溶液的各个蛋白质浓度，如工作实施例中所述。此外，使用B-7中所述的方法确定抗体负载量(药物/mAb比率)。
用于以更大的规模进行转谷氨酰胺酶介导的偶联以实现最大DAR为2 的一般方法：
向30mg特定抗体的非糖基化变体(HC-N297A、 HC-Q295N-HC-N297Q)在DPBS pH7.4中的溶液(c～5-15mg/ml)中加入6个当量的适当毒性基团接头前体的溶液(10mM的DMSO溶液)。在 37℃下孵育5min后，加入200μl(7.5U)重组细菌转谷氨酰胺酶的水溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH,Darmstadt,Germany)(25U/ml)，并在37℃下再继续孵育24h。然后将反应混合物在Superdex 200柱(GE Healthcare)上于DPBS pH 7.4中通过凝胶过滤色谱法纯化，以从ADC中分离小分子和转谷氨酰胺酶。随后，将ADC溶液通过Amicon Ultracel-30K 离心管(Millipore)浓缩至最终浓度为5-25mg/ml。然后将所述溶液无菌过滤。
测定ADC溶液的各个浓度，如工作实施例中所述。通过在B7章中所述的方法确定负载量。ADC批次的特征如工作实施例中所示。
用于以更大的规模进行转谷氨酰胺酶介导的偶联以实现最大DAR为4 的一般方法：
向30mg特定抗体的非糖基化变体(HC-N297Q)在DPBS pH 7.4中的溶液(c～5-15mg/ml)中加入16-24个当量的适当毒性基团接头前体的溶液(10mM的DMSO溶液)。在37℃下孵育5min后，加入2400μl(60 U)重组细菌转谷氨酰胺酶的水溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH, Darmstadt,Germany)(25U/ml)，并在37℃下再继续孵育24h。将反应混合物在Superdex 200柱(GE Healthcare)上于DPBS pH 7.4中通过凝胶过滤色谱法纯化，以从ADC中分离小分子和转谷氨酰胺酶。随后，将ADC 溶液通过Amicon Ultracel-30K离心管(Millipore)浓缩至最终浓度为5-25 mg/ml。然后将所述溶液无菌过滤。
测定ADC溶液的各个浓度，如工作实施例中所述。通过在B7章中所述的方法确定负载量。ADC批次的特征如工作实施例中所示。
在实施例系列t所示的结构式中，AK3在每种情况下具有以下含义：
AK3a：抗-TWEAKR的抗体(TPP-2658)(对应于TPP-2090-HC-N297A)-CO-§2
AK3b：抗-TWEAKR的抗体(TPP-5442)(对应于 TPP-2090-HC-N297Q)-CO-§2
AK3c：抗-TWEAKR的抗体(TPP-8225)(对应于 TPP-2090-HC-Q295N-HC-N297Q)-CO-§2
AK3d：TPP-7510(对应于曲妥珠单抗-HC-N297A)-CO-§2
AK3e：TPP-7511(对应于曲妥珠单抗-HC-N297Q)-CO-§2
其中
§2 意指与毒性基团接头前体的氨基连接的键，
并且
CO 代表抗体的谷氨酰胺残基的侧链羰基。
B-6a.用于制备闭链琥珀酰亚胺-半胱氨酸加合物的一般方法：
在一个示例性实施方案中，将10μmol上述马来酰亚胺前体化合物溶于3-5ml DMF中，并加入2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌2h至24h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。
B-6aa.用于制备异构的开链琥珀酰胺-半胱氨酸加合物的一般方法：
在一个示例性实施方案中，将68μmol上述马来酰亚胺前体化合物溶于15ml DMF中，并加入36mg(136μmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌约20h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解于15ml THF/水1:1中。加入131μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1h。然后用1M的盐酸中和反应物，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到理论值的约50％的区域异构的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
在最后一步中，将0.023mmol该区域异构的水解产物溶解于3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12.5mg(0.092mmol)氯化锌，并将反应物在50 ℃下搅拌4h。然后加入27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到水解的开链硫烷基琥珀酰胺，其为区域异构体混合物形式。
本发明的缀合物的进一步纯化和表征
反应后，在一些情况下，将反应混合物(例如通过超滤)浓缩，然后脱盐并通过色谱法(例如使用
Figure BDA0003554407600007621
G-25柱)纯化。(例如用磷酸盐缓冲盐水(PBS))进行洗脱。然后将所述溶液无菌过滤并冷冻。或者，可以将缀合物冻干。
B-7.确定抗体、毒性基团负载量和开链半胱氨酸加合物的比例
除了去糖基化和/或变性之后的分子量测定之外，对于蛋白质鉴定，也进行胰蛋白酶消化，其在变性、还原和衍生化后通过所发现的胰蛋白酶肽确认蛋白质的身份。
如下所述确定在工作实施例中所述的缀合物的所获得的PBS缓冲溶液的毒性基团负载量：
赖氨酸连接的ADC的毒性基团负载量的确定是通过用质谱确定单个缀合物种类的分子量而进行。在本文中，首先将抗体缀合物用PNGaseF去糖基化，将样品酸化，并在HPLC分离/脱盐后，通过质谱法使用 ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)进行分析。将在TIC(总离子色谱图) 中的信号上的所有光谱加和，并且基于MaxEnt去卷积来计算不同缀合物种类的分子量。然后在对不同种类进行信号积分后计算DAR(＝药物/抗体比率)。
半胱氨酸连接的缀合物的毒性基团负载量是通过对还原和变性的 ADC进行反相色谱法而确定。向ADC溶液(1mg/ml，50μl)中加入盐酸胍(GuHCl)(28.6mg)和DL-二硫苏糖醇(DTT)的溶液(500mM，3μl)。将混合物在55℃下孵育1小时并通过HPLC进行分析。
HPLC分析是在Agilent 1260HPLC系统上进行，在220nm处进行检测。使用PolymerLaboratories PLRP-S聚合物反相柱(目录号PL1912-3802) (2.1×150mm，粒度为8μm，
Figure BDA0003554407600007631
)，流速为1ml/min，梯度如下：0 min，25％B；3min，25％B；28min，50％B。流动相A是由0.05％的三氟乙酸(TFA)的水溶液组成，流动相B是由0.05％的三氟乙酸的乙腈溶液组成。
通过与非缀合抗体的轻链(L0)和重链(H0)的保留时间进行比较来指定检测到的峰。仅在缀合样品中检测到的峰指定为具有一个毒性基团的轻链(L1)和具有一个、两个和三个毒性基团的重链(H1、H2、H3)。
通过以HC负载量和LC负载量的二重和的方式积分而确定的峰面积来计算带有毒性基团的抗体的平均负载量，其中LC负载量是由所有LC 峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有LC峰的单独加权的积分结果之和来计算，并且其中HC负载量是由所有HC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有HC峰的单独加权的积分结果之和来计算。在个别情况下，由于某些峰的共洗脱，可能无法准确地确定毒性基团负载量。
在通过HPLC不能充分分离轻链和重链的情况下，半胱氨酸连接的缀合物的毒性基团负载量的确定是通过用质谱法确定轻链和重链上各个缀合物种类的分子量而进行。
向ADC溶液(1mg/ml，50μl)中加入盐酸胍(GuHCl)(28.6mg) 和DL-二硫苏糖醇(DTT)的溶液(500mM，3μl)。将混合物在55℃下孵育1小时，并在在线脱盐后通过质谱法使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)进行分析。
对于DAR确定，将在TIC(总离子色谱图)中的信号上的所有光谱加和，并且基于MaxEnt去卷积来计算轻链和重链上不同缀合物种类的分子量。通过以HC负载量和LC负载量的二重和的方式积分而确定的峰面积计算带有毒性基团的抗体的平均负载量，其中LC负载量是由所有LC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有LC峰的单独加权的积分结果之和来计算，并且其中HC负载量是由所有HC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有HC峰的单独加权的积分结果之和来计算。
为了确定开链半胱氨酸加合物的比例，确定了所有单一缀合的轻链和重链变体的闭链与开链半胱氨酸加合物(分子量δ18道尔顿)的分子量面积比。所有变体的均值产生开链半胱氨酸加合物的比例。
谷氨酰胺连接的缀合物的毒性基团负载量是通过对还原和变性的 ADC进行反向色谱法而确定。向ADC溶液(1mg/ml，50μl)中加入盐酸胍(GuHCl)(28.6mg)和DL-二硫苏糖醇(DTT)的溶液(500mM，3μl)。将混合物在55℃下孵育1小时并通过HPLC进行分析。
HPLC分析是在Agilent 1260HPLC系统上进行，在220nm处进行检测。使用PolymerLaboratories PLRP-S聚合物反相柱(目录号PL1912-3802) (2.1×150mm，粒度为8μm，
Figure BDA0003554407600007641
)，流速为1ml/min，梯度如下：0 min，31％B；1min，31％B；14min，38％B；16min,95％B。流动相A是由0.05％的三氟乙酸(TFA)水溶液组成，流动相B是由0.05％的三氟乙酸乙腈溶液组成。
通过与非缀合抗体的轻链(L0)和重链(H0)的保留时间进行比较来指定检测到的峰。仅在缀合样品中检测到的峰指定为具有一个毒性基团的轻链(L1)和具有一个和两个毒性基团的重链(H1、H2)。
通过以HC负载量和LC负载量的二重和的方式积分而确定的峰面积计算带有毒性基团的抗体的平均负载量，其中LC负载量是由所有LC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有LC峰的单独加权的积分结果之和来计算，并且其中HC负载量是由所有HC峰的毒性基团数均加权的积分结果之和除以所有HC峰的单独加权的积分结果之和来计算。
或者，确定谷氨酰胺连接的ADC的毒性基团负载量是通过用质谱法确定单个缀合物种类的分子量而进行。在本文中，首先将抗体缀合物用 PNGaseF去糖基化，将样品酸化，并在HPLC分离/脱盐后，通过质谱法使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)进行分析。将在TIC(总离子色谱图) 中的信号上的所有光谱加和，并且基于MaxEnt去卷积来计算不同缀合物种类的分子量。然后在对不同种类进行信号积分后计算DAR(＝药物/抗体比率)。
B-8.检查ADC的抗原结合
偶联发生后，检查结合体与靶分子结合的能力。本领域技术人员熟悉可用于此目的的多种方法；例如，可以使用ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcoreTM测量)来检查缀合物的亲和力。缀合物浓度可由本领域技术人员使用常规方法测量，例如对于抗体缀合物，通过蛋白质测量(还参见Doronina et al.；Nature Biotechnol.2003；21:778-784和Polson et al., Blood 2007；1102:616-623)。
代谢物实施方案
实施例M1
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007651
将1.8mg(2μmol)中间体F104溶于1ml DMF中，并加入2.7mg(22 μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌20h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。剩下0.6mg(理论值的26％)标题化合物，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.80min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
实施例M2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007661
LC-MS(方法1):Rt＝0.80min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
首先，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成 N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将406mg(1.53mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于10ml DMF中，加入157.5mg(1.606mmol)马来酸酐，并将反应物在室温下搅拌1小时。向130μl该溶液中加入7.5mg(0.01mmol) 中间体C66，并将反应物在室温下搅拌5min。然后将混合物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10mg(89％)保护的中间体；既不能通过HPLC 也不能通过LC-MS分离区域异构体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(EIpos):m/z＝1120[M+H]+。
在最后一步中，将10mg该中间体溶解于2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg(0.088mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌30min。然后加入26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/ 水中冻干，得到8.3mg(理论值的99％)标题化合物，其为比例为87:13 的区域异构体混合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.3min和2.43min；MS(ESIpos):m/z＝832 (M+H)+。
1H-NMR主要区域异构体:(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.7(m,1H),8.5 (m,2H),8.1(m,1H),7.6(m,1H),7.5(s,1H)7.4-7.15(m,6H),6.9-7.0(m,1H), 6.85(s,1H),5.61(s,1H),4.9和5.2(2d,2H),4.26和4.06(2d,2H),3.5-3.8(m, 5H),3.0-3.4(m,5H),2.75-3.0(m,3H),2.58和2.57(dd,1H),0.77和1,5(2m, 2H),0.81(s,9H)。
或者，区域异构的标题化合物是如下制备：
为此，首先在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将55mg(0.068mmol)中间体F104和36mg(0.136mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于15ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌20h。然后将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC 纯化。合并适当的级分，在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解于15ml THF/水1:1中。加入131μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1h。然后将反应物用1M的盐酸中和，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到37mg(理论值的50％)区域异构的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法5):Rt＝3.33min和3.36min；MS(ESIpos):m/z＝976 (M+H)+。
在最后一步中，将25mg(0.023mmol)该中间体溶解于3ml 2,2,2- 三氟乙醇中。加入12.5mg(0.092mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。然后加入27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到18.5mg(理论值的85％)标题化合物，其为比例为21:79的区域异构体混合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.37min和3.44min；MS(ESIpos):m/z＝832 (M+H)+。
实施例M3
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007681
首先，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成 N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将11mg(0.013mmol)中间体F193和8mg(0.016mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于3ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌20h。然后将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。
合并适当的级分，在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解于2ml THF/ 水1:1中。加入19μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1h。然后再加入19μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌过夜。然后将混合物用1M的盐酸中和，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到4.1mg(理论值的38％)区域异构的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min(宽峰)；MS(ESIpos):m/z＝1020 (M+H)+。
在最后一步中，将4.1mg(0.004mmol)该中间体溶解于3ml 2,2,2- 三氟乙醇中。加入3mg(0.022mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌 1h。然后加入6mg(0.022mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml浓度为 0.1％的三氟乙酸水溶液，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC 纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到5mg(定量) 标题化合物，其为比例为20:80的区域异构体混合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min(宽峰)；MS(ESIpos):m/z＝876(M+H)+。
LC-MS(方法5):Rt＝2.36min和2.39min；MS(ESIpos):m/z＝876 (M+H)+。
实施例M4
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙氧基]乙基}-2,5--二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007691
将3mg(4μmol)中间体F248溶于2ml DMF中，并加入0.9mg(8 μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌18h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，在将残余物从乙腈/ 水中冻干后，得到1.1mg(理论值的32％)标题化合物，其为白色固体形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(EIpos):m/z＝801[M+H]+。
实施例M5
(3R,7S)-7-氨基-17-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-[1-苄基 -4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰基-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧杂-4,9,15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1:1)
和
(3R,7S)-7-氨基-18-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰基-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧杂-4,9,15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007701
将8mg(0.010mmol)中间体F248的保护的中间体和5.1mg(0.02 mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于3ml DMF 中，并将混合物在室温下搅拌18h，然后在超声波浴中处理2h。然后浓缩混合物，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解于2ml THF/水1:1中。加入15μl 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌15min。然后将反应物用1M的盐酸调节至pH～3，用20ml氯化钠溶液稀释并用20ml乙酸乙酯萃取两次。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到8.4mg (经两个步骤，理论值的78％)区域异构的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min和3.43min；MS(ESIpos):m/z＝1107 (M+H)+。
在最后一步中，将8mg(0.007mmol)该中间体溶解于5ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入9.8mg(0.072mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌 1.5h。然后加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到4mg(理论值的59％)标题化合物，其为比例为31:67的区域异构体混合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.79min和0.81min；MS(ESIpos):m/z＝819 (M+H)+。
实施例M6
2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂 -3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:2)和
3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂 -3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:2)
Figure BDA0003554407600007711
将18mg(0.021mmol)中间体F213和11.2mg(0.04mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(21.2mg)溶解于3ml THF/水1:1中。加入0.04ml 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌3小时。加入0.02ml 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1小时。然后使用7.2mg(0.12mmol)乙酸将反应物调节至 pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13mg(经两个步骤，57％)区域异构的保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
在最后一步中，将13mg(0.01mmol)该中间体溶解于2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入6.2mg(0.05mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌7 h。然后加入13.3mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到10.3mg(81.4％)标题化合物，其为区域异构体混合物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝875(M+H)+。
实施例M7
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007721
将6mg(8μmol)中间体F119溶于3ml DMF中，并加入1.8mg(15 μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌6h，然后使其在室温下静置3天。然后将反应物在减压下浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝717(M+H)+。
实施例M8
(3R)-6-{(11S,15R)-11-氨基-15-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-14-乙醇酰基-16,16-二甲基-2,5,10-三氧代-3,6,9,14-四氮杂十七烷-1- 基}-5-氧代硫代吗啉-3-甲酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007731
将4mg(0.004mmol)实施例135的化合物溶解于4ml THF/水中，并加入48μl 2M的氢氧化锂水溶液。将反应物在室温下搅拌1h，然后浓缩并通过制备型HPLC纯化。将适当的级分合并，浓缩并从乙腈/水中冻干，得到2.4mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
实施例M9
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
Figure BDA0003554407600007732
首先将150.0mg(0.42mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)溶解于2.0ml二氯甲烷中，加入 29.2mg(0.49mmol)HOAc和125.6mg(0.59mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在室温下搅拌5min。加入98.9mg(0.49mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，将有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇100:1)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到188.6mg(74％)化合物2-[3-({(1R)-1-[1- 苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮。
LC-MS(方法1):Rt＝1.00min；MS(ESIpos):m/z＝541[M+H]+。
首先将171.2mg(0.32mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮加入到5.0ml二氯甲烷中，并加入73.6mg(0.73mmol)三乙胺。在0℃下，加入94.9mg(0.70mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物使用Biotage Isolera纯化(硅胶，柱10g SNAP，流速 12ml/min，乙酸乙酯/环己烷1:3)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到159.0mg(77％)化合物2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚 -2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙基乙酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(ESIpos):m/z＝642[M+H]+。
首先将147.2mg(0.23mmol)2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基] 氨基)-2-氧代乙基乙酸酯加入到4.0ml乙醇中，并加入356.2mg(4.59mmol) 甲胺(40％，在水中)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物与甲苯一起共蒸馏三次。将残余物通过硅胶进行色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇10:1)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到67.4mg(63％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝470[M+H]+。
实施例M10
(2R,28R)-28-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-25-(羧基甲基)-4,20,24-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-26-硫杂-3,19,23-三氮杂二十九烷-1,29-二酸/三氟乙酸(1:2)和
(1R,28R,34R)-1-氨基-33-(3-氨基丙基)-34-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35,35-二甲基-6,10,26,32-四氧代-14,17,20,23-四氧杂 -3,30-二硫杂-7,11,27,33-四氮杂三十六烷-1,4,28-三甲酸/三氟乙酸(1:2)
Figure BDA0003554407600007751
将20mg(0.018mmol)R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代 -2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体F209)和9.78mg(0.036mmol) N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(47.7 mg)溶解于3ml THF/水1:1中。加入0.08ml 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌1小时。然后使用9.26mg(0.15mmol)乙酸将反应物调节至pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.3mg(经两个步骤，29％)区域异构的保护的中间体。
LC-MS(方法6):Rt＝12.26min和12.30min；MS(ESIpos):m/z＝1254 (M+H)+。
在最后一步中，将15.3mg(0.01mmol)该中间体溶解于2ml 2,2,2- 三氟乙醇中。加入6.1mg(0.05mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到11.9mg(79.5％)标题化合物，其为区域异构体混合物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝1110(M+H)+。
实施例M11
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:2)
Figure BDA0003554407600007761
将15.0mg(0.018mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)溶解于1.0ml 三氟乙醇中，并加入7.4mg(0.054mmol)二氯化锌。将反应混合物在50 ℃下搅拌过夜。加入15.8mg(0,054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC (柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA) 直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.1 mg(77％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝573(M+H)+。
实施例M12
4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007771
将12.2mg(0.014mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H- 吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2- 硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体 C77)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(0.084mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(0,084mmol)乙二胺 -N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/ 水，0.1％TFA)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.6mg(42％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
实施例M13
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体1，差向异构体1(2R)或(2S)
Figure BDA0003554407600007781
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
首先，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(1:1)用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷 -2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将408mg(1.93mmol)市售的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和180mg (0.644mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于8ml DMF中，并加入147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在室温下搅拌18h后，再加入136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，将混合物在室温下再搅拌12h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型 HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到151mg(理论值的57％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.74min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
将145mg该中间体通过超临界流体色谱法经由手性柱分离成单个非对映异构体(SFC；柱DAICEL，AD-H 5u 250x20 mm；流速80ml/min；方法AD-25％ETOH-80ml；压力100bar；波长210nM)，得到63mg(43％) 差向异构体1和58mg(40％)差向异构体2。
差向异构体1的特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.94min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.57(d,1H),4.24(m,1H),4.05(t, 2H),3.67(t,1H),3.65(s,3H),3.62(s,3H),3.05(dd,1H),2.70-2.88(m,2H), 2.59(dd,1H),0.93(t,2H),0.02(s,9H)。
差向异构体2的特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.95min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.58(d,1H),4.16-4.23(m,1H), 4.05(t,2H),3.67(dd,1H),3.65(s,3H),3.64(s,3H),3.04(dd,1H),2.88(dd, 1H),2.77(dd,1H),2.61(dd,1H),0.92(t,2H),0.02(s,9H)。
在存在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的情况下，将32.5mg(0.079mmol)差向异构体1与50mg(0.066mmol) 中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到43mg(理论值的57％)完全保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸甲酯。
然后将40mg(0.035mmol)该中间体与0.9ml 2M的氢氧化锂溶液一起在11ml甲醇中在室温下搅拌20min，使两个甲酯基团均裂解。通过 HPLC纯化得到12mg(理论值的31％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.74min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述，将10mg(0.009mmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到2.6mg(理论值的30％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M14
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体1，差向异构体2(2R或2S)
Figure BDA0003554407600007801
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
以与实施例M13所述类似的方式，使实施例M13中所述的中间体差向异构体2进行反应。
在存在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的情况下，将32.5mg(0.079mmol)差向异构体2与50mg(0.066mmol) 中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到43mg(理论值的57％)完全保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸甲酯。
然后将40mg(0.035mmol)该中间体与0.9ml 2M的氢氧化锂溶液一起在11ml甲醇中在室温下搅拌20min，使得两个甲酯基团均裂解。通过 HPLC纯化，得到11mg(理论值的28％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.74min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述，将10mg(0.009mmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到4.4mg(理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M15
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体2，差向异构体1(3R或3S)
Figure BDA0003554407600007811
LC-MS(方法5):Rt＝2.45min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
将742.8mg(3.3mmol)市售的2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸和802mg (2.87mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于32ml DMF中，并加入655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在室温下搅拌20h后，将反应物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到521mg(理论值的43％)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法5):Rt＝3.13min；MS(ESIpos):m/z＝424(M+H)+。
将510mg该中间体通过超临界流体色谱法经由手性柱分离成单个非对映异构体(SFC；柱DAICEL，AD-H 5u 250x20 mm；流速80ml/min；方法AD-10％ETOH-80ml；压力100bar；波长210nM)，得到100mg(20％) 差向异构体1和141mg(28％)差向异构体2。
差向异构体1的特征如下：
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIneg):m/z＝422(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.60(d,1H),4.18-4.26(m,1H), 4.01-4.08(m,4H),3.63(s,3H),3.59(dd,1H),3.04(dd,1H),2.92(dd,1H), 2.80(dd,1H),2.63(dd,1H),1.17(t,3H),0.92(t,2H),0.02(s,9H)。
差向异构体2的特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.95min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.56(d,1H),4.21-4.29(m,1H), 4.01-4.1(m,4H),3.64(s,3H),3.58(dd,1H),3.08(dd,1H),2.85(dd,1H),2.78 (dd,1H),2.60(dd,1H),1.17(t,3H),0.93(t,2H),0.02(s,9H)。
在存在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的情况下，将33.6mg(0.079mmol)差向异构体1与50mg(0.066mmol) 中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到51mg(理论值的63％)完全保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸乙酯。
然后将49mg(0.042mmol)该中间体与0.5ml 2M的氢氧化锂溶液一起在12ml THF/水1:1中在室温下搅拌30min，使两个甲酯基团均裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到11mg(理论值的24％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.68min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述，将11mg(0.01mmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到3.7mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.45min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M16
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体2，差向异构体2(3R或3S)
Figure BDA0003554407600007831
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
以与实施例M15所述类似的方式，使实施例M15中所述的中间体差向异构体2进行反应：
在存在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的情况下，将33.6mg(0.079mmol)差向异构体2与50mg(0.066mmol) 中间体C66偶联，HPLC纯化后，得到51mg(理论值的63％)完全保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸乙酯。
然后将49mg(0.042mmol)该中间体与0.5ml 2M的氢氧化锂溶液一起在12ml THF/水1:1中在室温下搅拌30min，使两个甲酯基团均裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到13.4mg(理论值的28％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.66min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，将13.4mg(0.012mmol)该中间体如上所述在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到7.5mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M17
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酸盐酸盐(1:1)
Figure BDA0003554407600007841
将150mg(0.2mmol)中间体C53溶解于15ml DMF中，并加入2.29 g(20.39mmol)DABCO。将反应物在超声波浴中处理30min。然后通过加入1.17ml乙酸，将反应物调节至pH3-4，并将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，并将适当的级分在室温、减压下浓缩。将残余物溶于乙腈/水1:1中，加入5ml 4N的盐酸，然后将混合物冻干。得到81mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.69min；MS(EIpos):m/z＝514[M+H]+。
实施例M18
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007842
首先，使用肽化学的经典方法制备三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-[(苄氧基)羰基]-L-谷氨酸苄酯(1:1)。然后在存在HATU的情况下，将该中间体与中间体C58偶联。随后，首先通过氢解裂解除去苄氧基羰基保护基团和苄基酯，然后使用氯化锌除去2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基团。
LC-MS(方法6):Rt＝1.91min；MS(EIpos):m/z＝685[M+H]+。
实施例M19
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007851
首先，使用肽化学中已知的经典保护基团操作制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸酯(1:1)。然后在存在HATU的情况下，将该中间体与中间体C61偶联。随后，首先使用氯化锌裂解2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基团和2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯。最后，通过氢解裂解苄氧基羰基保护基团并通过制备型HPLC纯化来获得标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.65min；
实施例M20
(1R,4R,27R,33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四氧代-13,16,19,22-四氧杂-3,29- 二硫杂-7,10,26,32-四氮杂三十五烷-1,4,27-三甲酸/三氟乙酸(1:2)
Figure BDA0003554407600007861
首先，在存在N,N-二异丙基乙胺的情况下，在DMF中，将L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(1:1)用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷 -2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将408mg(1.93mmol)市售的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和180mg (0.644mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于8ml DMF中，并加入147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在室温下搅拌18h后，再加入136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将混合物在室温下再搅拌12h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到151mg(理论值的57％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.74min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
在存在3.66mg(8.93μmol)HATU和1.6μl(15μmol)4-甲基吗啉的情况下，将3.66mg(8.93μmol)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代 -2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸与 13.0mg(7.44μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C80)偶联，HPLC纯化后，得到3.9mg(理论值的37％)完全保护的中间体S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11R)-8,11-双(甲氧基羰基)-2,2- 二甲基-6,13-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]甘氨酰基} 氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
然后将3.90mg(2.76μmol)该中间体与35μl 2M的氢氧化锂溶液一起在1.0ml THF/水3:1中在室温下搅拌15min，使两个甲酯基团均裂解。通过HPLC纯化得到3.60mg(理论值的94％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.83min；MS(ESIpos):m/z＝1385[M+H]+。
最后，如上所述，将3.6mg(2.6μmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到1.92mg(理论值的55％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝1094[M-H]-。
实施例M21
(2R,24S,27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-24-(羧基甲基)-4,20,23-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-25-硫杂-3,19,22-三氮杂二十八烷-1,28-二酸/三氟乙酸(1:2)
Figure BDA0003554407600007871
将742.8mg(3.3mmol)市售的2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸和802mg (2.87mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解于32ml DMF中，并加入655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在室温下搅拌20h后，将反应物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到521mg(理论值的43％)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法5):Rt＝3.13min；MS(ESIpos):m/z＝424(M+H)+。
在存在3.92mg(10.3μmol)HATU和1.9μl(17μmol)4-甲基吗啉的情况下，将4.36mg(10.3μmol)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代 -2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸与 15.0mg(8.59μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C80)偶联，HPLC纯化后，得到3.6mg(理论值的26％)完全保护的中间体S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11S)-11-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-8-(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十二烷-12-基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
然后将6.20mg(2.82μmol)该中间体与35μl 2M的氢氧化锂溶液一起在1.0ml THF/水1:1中在室温下搅拌15min，使得两个酯基团均裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到3.60mg(理论值的92％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.71min；MS(ESIpos):m/z＝1385[M+H]+。
最后，如上所述，将3.60mg(1.69μmol)该中间体在三氟乙醇中用氯化锌完全去保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到0.88mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝1094[M-H]-。
实施例M22
(2R,27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-24-(羧基甲基)-4,20,23-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-25-硫杂-3,19,22-三氮杂二十八烷-1,28-二酸/三氟乙酸(1:2)和
(1R,27R,33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四氧代-13,16,19,22-四氧杂-3,29- 二硫杂-7,10,26,32-四氮杂三十五烷-1,4,27-三甲酸/三氟乙酸(1:2)
Figure BDA0003554407600007891
将16.5mg(0.015mmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18- 基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体F257)和8.18mg(0.031mmol) N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解于2ml DMF中，并将混合物在室温下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(28.9 mg)溶解于3ml THF/水1:1中。加入0.046ml 2M的氢氧化锂水溶液，并将反应物在室温下搅拌3小时。然后使用5.2μl(0.092mmol)乙酸将反应物调节至pH～7。将反应混合物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30； 10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到12.1mg(经两个步骤，58％)区域异构的保护的中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.82min；MS(ESIpos):m/z＝1240(M+H)+。
在最后一步中，将12.1mg(0.009mmol)该中间体溶解于2ml 2,2,2- 三氟乙醇中。加入7.3mg(0.054mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入15.7mg(0.054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到6.4mg(59％)标题化合物，其为区域异构体混合物形式。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝1096(M+H)+。
实施例M23
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-谷氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007901
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1:1)与中间体C61偶联。然后将保护的中间体溶于三氟乙醇中，并通过在存在氯化锌的情况下在50℃下搅拌过夜而完全去保护。在加入EDTA后，通过用制备型HPLC纯化而进行后处理。
LC-MS(方法12):Rt＝1.45min；MS(ESIpos):m/z＝714[M+H]+。
实施例M24
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-D-谷氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007911
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将D-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1:1)与中间体C61偶联。然后将保护的中间体溶于三氟乙醇中，并通过在存在氯化锌的情况下在50℃下搅拌而完全去保护。加入EDTA 后，通过用制备型HPLC纯化而进行后处理。
LC-MS(方法12):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝714[M+H]+。
实施例M25
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2- 基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-谷氨酸/三氟乙酸(1:1)
Figure BDA0003554407600007912
首先，在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下，将L-谷氨酸二叔丁酯盐酸盐(1:1)与中间体C61偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下在甲醇中经活性碳上的钯(10％)氢化45min而除去Z保护基团。然后将部分保护的中间体溶于三氟乙醇中，并通过在存在氯化锌的情况下在50℃下搅拌7小时而完全去保护。加入EDTA后，通过用制备型HPLC纯化而进行后处理。
LC-MS(方法12):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝643[M+H]+。
实施例M26
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体1差向异构体混合物
Figure BDA0003554407600007921
该实施例描述了实施例13和实施例14的化合物的差向异构体混合物。所述合成是以与实施例13类似的方式进行，省去了通过超临界流体色谱法分离两种差向异构体，并制备了标题化合物，其为差向异构体混合物形式。
LC-MS(方法5):Rt＝2.43min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M27
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯 -2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧基乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体2差向异构体混合物
Figure BDA0003554407600007922
该实施例描述了实施例15和实施例16的化合物的差向异构体混合物。合成以与实施例15类似的方式进行，省去了通过超临界流体色谱法分离两种差向异构体，并制备了标题化合物，其为差向异构体混合物形式。
LC-MS(方法5):Rt＝2.45min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
APDC和ADC的工作实施例
取决于接头和偶联方法，工作实施例的结构式所示的APDC和ADC (其通过马来酰亚胺基团与抗体的半胱氨酸侧链偶联)主要以在每种情况下所示的开环或闭环形式存在。然而，制品可以包含小部分相应的其他形式。
偶联反应在氩气下进行。
实施例1a
Figure BDA0003554407600007931
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05μl PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.25mg(0.00023mmol)中间体Q1。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.95ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释，并在室温、氩气下搅拌过夜。
然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 7.2平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007932
G-25,GEHealthcare)上，并用PBS缓冲液pH 7.2洗脱。
然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.46mg/ml
药物/mAb比率：2.7
实施例1e
以类似的方式，将中间体Q1与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.61mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例1i
以类似的方式，将中间体Q1与5mg尼妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.75mg/ml
药物/mAb比率：3.1
实施例1k
以类似的方式，将中间体Q1与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.26mg/ml
药物/mAb比率：3.0
实施例1k*
以类似的方式，将中间体Q1与50mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。
在氩气下，将0.29mg TCEP在0.682μl PBS缓冲液中的溶液加入到 3.07ml PBS中的50mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(c＝16.3mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于357μl DMSO中的2.53mg (0.0023mmol)中间体Q1。在室温下再搅拌90min后，将混合物用3.391 ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释至7.5ml，然后流过用PBS缓冲液pH8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007941
G-25,GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在室温、氩气下搅拌过夜。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 7.2平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007942
G-25,GE Healthcare) 上并用PBS缓冲液pH 7.2洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，用PBS 缓冲液(pH 7.2)再稀释并再次浓缩。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：9.56mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例2a
Figure BDA0003554407600007951
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.23mg(0.00023mmol)中间体Q2。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，并在室温、氩气下搅拌过夜。
然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 7.2平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007952
G-25,GEHealthcare)上，并用PBS缓冲液pH 7.2洗脱。
随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.87mg/ml
药物/mAb比率：3.2
实施例2e
以类似的方式，将中间体Q2与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.41mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例2k
以类似的方式，将中间体Q2与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.79mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例2k*
以与实施例1k*类似的方式，将2.775mg(0.0028mmol)中间体Q2 与60mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：9.97mg/ml
药物/mAb比率：3.7
实施例3k
Figure BDA0003554407600007961
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.25mg (0.00023mmol)中间体Q3。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9 ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，并在室温、氩气下搅拌过夜。
然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 7.2平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007972
G-25,GEHealthcare)上，并用PBS缓冲液pH 7.2洗脱。
随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.15mg/ml
药物/mAb比率：4.3
实施例4a
Figure BDA0003554407600007971
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.25mg(0.00023mmol)中间体Q4。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007982
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在室温、氩气下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.98mg/ml
药物/mAb比率：2.0
实施例4k
以类似的方式，将中间体Q4与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.65mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例5a
Figure BDA0003554407600007981
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.21mg(0.00023mmol) 中间体Q5。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600007991
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.91mg/ml
药物/mAb比率：2.4
实施例5e
以类似的方式，将中间体Q5与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.55mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例5k
以类似的方式，将中间体Q5与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.54mg/ml
药物/mAb比率：3.5
实施例6a
Figure BDA0003554407600008001
在本文中，将5mg在PBS中的西妥昔单抗(c＝10mg/ml)用于与中间体Q6偶联。首先，加入溶解于50μl DMSO中的5个当量(0.24mg) 中间体Q6，在室温下搅拌1h后，再加入相同量，并将反应物在室温下再搅拌1小时。随后，将反应物用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释至2.5ml，在 Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心浓缩，并用PBS(pH 7.2)再稀释。
蛋白质浓度：2.26mg/ml
药物/mAb比率：3.7
实施例6e
以类似的方式，将中间体Q6与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.97mg/ml
药物/mAb比率：5.4
实施例6k
以类似的方式，将中间体Q6与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.07mg/ml
药物/mAb比率：6.7
实施例7a
Figure BDA0003554407600008011
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05μl PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min。随后，加入溶解于50μlDMSO中的0.24mg(0.00023mmol) 中间体Q7，并将混合物在室温下搅拌过夜。然后将反应物用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释至2.5ml，在Sephadex柱上纯化，随后通过超速离心浓缩，并用PBS(pH 7.2)再稀释。
蛋白质浓度：1.91mg/ml
药物/mAb比率：1.6
实施例7k
以类似的方式，将中间体Q7与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.66mg/ml
药物/mAb比率：2.4
实施例8a
Figure BDA0003554407600008021
在氩气下，将0.029mg TCEP在50μl PBS缓冲液中的溶液加入到458 μl PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.9mg/ml)中。将反应物用1892μl预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，并在室温下搅拌1h。然后加入溶解于100μl DMSO中的0.314mg(0.00023mmol)中间体Q8。在室温下再搅拌90min后，将反应物加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱 (
Figure BDA0003554407600008022
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC也可以闭环形式存在。所得ADC 批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.15mg/ml
药物/mAb比率：2.1
实施例8e
以类似的方式，将中间体Q8与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.21mg/ml
药物/mAb比率：1.9
实施例8k
以类似的方式，将中间体Q8与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：0.65mg/ml
药物/mAb比率：2.5
实施例9k
Figure BDA0003554407600008031
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.450ml PBS中的5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(c＝11.1mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.24mg (0.00023mmol)中间体Q9。在室温下再搅拌90min后，将混合物用1.95 ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，然后流过用PBS缓冲液pH 8 平衡的PD10柱(
Figure BDA0003554407600008032
G-25,GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8 洗脱。将洗出液在室温下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：0.86mg/ml
药物/mAb比率：3.1
实施例10a
Figure BDA0003554407600008041
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg抗-TWEAKR的抗体(c＝10.9mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.23mg (0.00023mmol)中间体Q10。在室温下再搅拌90min后，将混合物用1.95 ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释，然后流过用PBS缓冲液pH 8 平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008042
G-25,GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8 洗脱。将洗出液在室温下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.92mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例10k
以类似的方式，将中间体Q10与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.65mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例11a
Figure BDA0003554407600008051
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.92mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.28mg(0.00023mmol) 中间体Q11。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.942ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008052
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8 洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。
然后将该溶液通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.99mg/ml
药物/mAb比率：2.6
实施例11e
以类似的方式，将中间体Q11与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.70mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例11k
以类似的方式，将中间体Q11与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.71mg/ml
药物/mAb比率：3.1
实施例12a
Figure BDA0003554407600008061
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.92mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.305mg(0.00023mmol) 中间体Q12。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.942ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008062
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8 洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.23mg/ml
药物/mAb比率：2.5
实施例12e
以类似的方式，将中间体Q12与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.73mg/ml
药物/mAb比率：3.1
实施例12k
以类似的方式，将中间体Q12与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.91mg/ml
药物/mAb比率：2.8
实施例13a
Figure BDA0003554407600008071
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.26mg(0.00023mmol)中间体Q13。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008081
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.98mg/ml
药物/mAb比率：2.1
实施例13e
以类似的方式，将中间体Q13与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.83mg/ml
药物/mAb比率：3.1
实施例13k
以类似的方式，将中间体Q13与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.54mg/ml
药物/mAb比率：3.2
实施例14a
Figure BDA0003554407600008091
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.92mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.29mg(0.00023mmol) 中间体Q14。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008092
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.92mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例14e
以类似的方式，将中间体Q14与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.72mg/ml
药物/mAb比率：3.4
实施例14k
以类似的方式，将中间体Q14与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.80mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例15a
Figure BDA0003554407600008101
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.92mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.25mg(0.00023mmol) 中间体Q15。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008102
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.90mg/ml
药物/mAb比率：2.8
实施例15k
以类似的方式，将中间体Q15与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.74mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例16a
Figure BDA0003554407600008111
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.26mg(0.00023mmol)中间体Q16。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008112
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.74mg/ml
药物/mAb比率：2.7
实施例16e
以类似的方式，将中间体Q16与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.61mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例16k
以类似的方式，将中间体Q16与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.75mg/ml
药物/mAb比率：3.2
实施例17a
Figure BDA0003554407600008121
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05μl PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.26mg(0.00023mmol)中间体Q17。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008132
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.93mg/ml
药物/mAb比率：2.8
实施例17e
以类似的方式，将中间体Q17与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.83mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例17k
以类似的方式，将中间体Q17与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.34mg/ml
药物/mAb比率：2.8
实施例18a
Figure BDA0003554407600008131
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.26mg(0.00023mmol)中间体Q18。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008141
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.57mg/ml
药物/mAb比率：2.4
实施例18e
以类似的方式，将中间体Q18与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.79mg/ml
药物/mAb比率：3.1
实施例18k
以类似的方式，将中间体Q18与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：0.68mg/ml
药物/mAb比率：2.8
实施例19a
Figure BDA0003554407600008151
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.25mg(0.00023mmol)中间体Q19。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.95ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释，并在室温、氩气下搅拌过夜。
然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 7.2平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008152
G-25,GEHealthcare)上，并用PBS缓冲液pH 7.2洗脱。
随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.85mg/ml
药物/mAb比率：2.3
实施例19e
以类似的方式，将中间体Q19与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.88mg/ml
药物/mAb比率：2.5
实施例19k
以类似的方式，将中间体Q19与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.80mg/ml
药物/mAb比率：1.8
实施例20k
Figure BDA0003554407600008161
在氩气下，将0.131mg TCEP在0.20ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.239ml PBS中的5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(c＝20.90mg/ml) 中。将反应物用0.461ml PBS溶解并在室温下搅拌30min，然后加入溶解于100μl DMSO中的0.833mg(0.00040mmol)中间体Q20。在室温下再搅拌120min后，将反应物用1.50ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008162
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.96mg/ml
药物/mAb比率：4.6
实施例20k*
在氩气下，将0.076mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.239ml PBS中的5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(c＝20.90mg/ml) 中。将反应物用0.20ml PBS溶解并在室温下搅拌150min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.833mg(0.00040mmol)中间体Q20。在室温下再搅拌120min后，将反应物用1.96ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008171
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.17mg/ml
药物/mAb比率：7.3
实施例21a
Figure BDA0003554407600008181
在氩气下，将0.076mg TCEP在0.20ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.427ml PBS中的5mg西妥昔单抗抗体(c＝11.7mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌150min，然后加入溶解于40μl DMSO中的0.811mg(0.000533 mmol)中间体Q21。在室温下再搅拌120min后，将反应物用1.98ml预先已调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液 pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008192
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.37mg/ml
药物/mAb比率：8.1
实施例21e
以类似的方式，将中间体Q21与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.27mg/ml
药物/mAb比率：8.0
实施例21k
以类似的方式，将中间体Q21与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.73mg/ml
药物/mAb比率：7.9
实施例22a
Figure BDA0003554407600008191
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.92mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.28mg(0.00023mmol) 中间体Q22。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008201
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.91mg/ml
药物/mAb比率：2.2
实施例22e
以类似的方式，将中间体Q22与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.59mg/ml
药物/mAb比率：1.7
实施例22k
以类似的方式，将中间体Q22与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.89mg/ml
药物/mAb比率：2.8
实施例23a
Figure BDA0003554407600008211
在本文中，将5mg在PBS中的西妥昔单抗(c＝10mg/ml)用于与中间体Q23偶联。首先，加入溶解于50μl DMSO中的5个当量(0.2mg) 中间体Q23，在室温下搅拌1h后再加入相同量，并将反应物在室温下再搅拌1小时。随后将反应物用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释至2.5ml，在 Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心浓缩并用PBS(pH 7.2)再稀释。
蛋白质浓度：1.88mg/ml
药物/mAb比率：2.6
实施例23e
以类似的方式，将中间体Q23与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.68mg/ml
药物/mAb比率：3.7
实施例23k
以类似的方式，将中间体Q23与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.23mg/ml
药物/mAb比率：3.9
实施例24a
Figure BDA0003554407600008221
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.92mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.23mg(0.00023mmol) 中间体Q24。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008222
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.80mg/ml
药物/mAb比率：2.2
实施例24e
以类似的方式，将中间体Q24与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.49mg/ml
药物/mAb比率：2.3
实施例24k
以类似的方式，将中间体Q24与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.73mg/ml
药物/mAb比率：2.2
实施例25a
Figure BDA0003554407600008231
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.21mg(0.00023mmol)中间体Q25。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008232
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.59mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例25e
以类似的方式，将中间体Q25与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.42mg/ml
药物/mAb比率：3.5
实施例25k
以类似的方式，将中间体Q25与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.44mg/ml
药物/mAb比率：3.2
实施例26a
Figure BDA0003554407600008241
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.498ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.3mg(0.00023mmol) 中间体Q26。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9mlPBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液(pH 7.2)平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008242
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液(pH 7.2)洗脱。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.0mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例26e
以类似的方式，将中间体Q26与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.66mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例26k
以类似的方式，将中间体Q26与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.83mg/ml
药物/mAb比率：3.4
实施例27a
Figure BDA0003554407600008251
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.92mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.26mg(0.00023mmol) 中间体Q27。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9ml预先已调节至 pH 8的PBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的 PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008252
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气、室温下搅拌过夜。随后通过超速离心浓缩并用PBS 缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.02mg/ml
药物/mAb比率：3.5
实施例27e
以类似的方式，将中间体Q27与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.72mg/ml
药物/mAb比率：4.2
实施例27k
以类似的方式，将中间体Q27与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.79mg/ml
药物/mAb比率：3.1
实施例28a
Figure BDA0003554407600008261
在氩气下，将0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液加入到 0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10.92mg/ml)中。将反应物在室温下搅拌30min，然后加入溶解于50μlDMSO中的0.32mg(0.00023mmol) 中间体Q28。在室温下再搅拌90min后，将反应物用1.9mlPBS缓冲液稀释。然后将该溶液加到已用PBS缓冲液(pH 7.2)平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008262
G-25,GE Healthcare)上，并用PBS缓冲液(pH 7.2)洗脱。随后进行超速离心并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.01mg/ml
药物/mAb比率：2.0
实施例28e
以类似的方式，将中间体Q28与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.86mg/ml
药物/mAb比率：3.1
实施例28k
以类似的方式，将中间体Q28与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.03mg/ml
药物/mAb比率：2.6
实施例29a
Figure BDA0003554407600008271
在本文中，将5mg在PBS中的西妥昔单抗(c＝9.1mg/ml)用于与中间体Q29偶联。首先，在氩气下，加入溶解于50μl DMSO中的5个当量 (0.21mg)中间体Q29，在室温下搅拌1h后再加入相同量，并将反应物在室温下再搅拌1小时。随后将反应物用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释至2.5 ml，在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心浓缩并用PBS(pH 7.2)再稀释。
蛋白质浓度：2.14mg/ml
药物/mAb比率：2.6
实施例29e
以类似的方式，将中间体Q29与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.05mg/ml
药物/mAb比率：3.8
实施例29k
以类似的方式，将中间体Q29与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.09mg/ml
药物/mAb比率：3.9
实施例30a
Figure BDA0003554407600008281
在本文中，将5mg在PBS中的西妥昔单抗(c＝9.1mg/ml)用于与中间体Q30偶联。首先，在氩气下，加入溶解于50μl DMSO中的5个当量 (0.22mg)中间体Q29，在室温下搅拌1h后再加入相同量，并将反应物在室温下再搅拌1小时。随后将反应物用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释至2.5 ml，在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心浓缩并用PBS(pH 7.2)再稀释。
蛋白质浓度：2.1mg/ml
药物/mAb比率：4.5
实施例30e
以类似的方式，将中间体Q30与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.96mg/ml
药物/mAb比率：5.6
实施例30k
以类似的方式，将中间体Q30与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.07mg/ml
药物/mAb比率：5.8
实施例31t
Figure BDA0003554407600008291
向5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(对应于TPP-2090-HC-N297A) 在530μl DPBS pH7.4中的溶液(c～10mg/ml)中加入20μl 10mM的中间体Q31在DMSO中的溶液。在37℃下孵育5min后，加入50μl重组细菌转谷氨酰胺酶在水中的溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH,Darmstadt, Germany)(25U/ml)，并在37℃下再继续孵育24h。然后将反应混合物用DPBS pH7.4稀释至体积为2.5ml，通过凝胶过滤流过DPBS-平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008292
G-25,GEHealthcare)并用pH 7.4的DPBS缓冲液洗脱。随后，将ADC溶液通过Amicon Ultracel-30K离心(Millipore)浓缩，并将其再次用DPBS稀释。最后，向该溶液中加入12.5μl DPBS中的0.00625 μmol b-转谷氨酰胺酶阻断剂Zedira C100。所得ADC溶液的特征如下：
蛋白质浓度：2.11mg/ml
药物/mAb比率：1.8
实施例31t-4
Figure BDA0003554407600008301
向30mg抗-TWEAKR的抗体TPP-5442(对应于TPP-2090-HC-N297Q) 在DPBS pH 7.4中的溶液(c＝10mg/ml)中加入480μl 10mmol的中间体 Q31在DMSO中的溶液。在37℃下孵育5min后，加入2400μl重组细菌转谷氨酰胺酶在水中的溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH,Darmstadt, Germany)(25U/ml)，并在37℃下孵育24h。将反应混合物通过凝胶过滤色谱法在Superdex 200柱(GE Healthcare)上在DPBS pH 7.4中纯化，以从ADC中分离小分子和转谷氨酰胺酶。随后，将ADC溶液通过Amicon Ultracel-30K离心管(Millipore)浓缩至最终浓度约为12mg/ml。然后将该溶液无菌过滤。所得ADC溶液的特征如下：
蛋白质浓度：12.0mg/ml
药物/mAb比率：3.8
实施例32t
Figure BDA0003554407600008311
向5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(对应于TPP-2090-HC-N297A) 在530μl DPBS pH7.4中的溶液(c～10mg/ml)中加入20μl 10mMol的中间体Q32在DMSO中的溶液。在37℃下孵育5min后，加入50μl重组细菌转谷氨酰胺酶的水溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH,Darmstadt, Germany)(25U/ml)，并在37℃下再继续孵育24h。然后将反应混合物用DPBS pH7.4稀释至体积为2.5ml，通过凝胶过滤流过DPBS-平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008312
G-25,GEHealthcare)并用pH 7.4的DPBS缓冲液洗脱。随后，将ADC溶液通过Amicon Ultracel-30K离心(Millipore)浓缩，并将其再次用DPBS稀释。最后，向该溶液中加入12.5μl DPBS中的0.00625 μmol b-转谷氨酰胺酶阻断剂Zedira C100。所得ADC溶液的特征如下：
蛋白质浓度：1.8mg/ml
药物/mAb比率：2.0
实施例33t
Figure BDA0003554407600008321
向5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658(对应于TPP-2090-HC-N297A) 在530μl DPBS pH7.4中的溶液(c～10mg/ml)中加入20μl 10mMol的中间体Q33在DMSO中的溶液。在37℃下孵育5min后，加入50μl重组细菌转谷氨酰胺酶在水中的溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH,Darmstadt,Germany)(25U/ml)，并在37℃下再继续孵育24h。然后将反应混合物用DPBS pH7.4稀释至体积为2.5ml，通过凝胶过滤流过DPBS- 平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008322
G-25,GEHealthcare)并用pH 7.4的DPBS 缓冲液洗脱。随后，将ADC溶液通过Amicon Ultracel-30K离心(Millipore) 浓缩，并将其再次用DPBS稀释。最后，向该溶液中加入12.5μl DPBS中的0.00625μmol b-转谷氨酰胺酶阻断剂Zedira C100。所得ADC溶液的特征如下：
蛋白质浓度：1.73mg/ml
药物/mAb比率：1.8
实施例34t-4
Figure BDA0003554407600008331
向5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-5442(对应于TPP-2090-HC-N297Q) 在DPBS pH 7.4中的溶液(c＝7.4mg/ml)中加入83μl 10mMol的中间体 Q34在DMSO中的溶液。在37℃下孵育5min后，加入400μl重组细菌转谷氨酰胺酶在水中的溶液(产品号T001，购自Zedira GmbH,Darmstadt, Germany)(25U/ml)，并在37℃下继续孵育24h。然后将反应混合物用 DPBS pH7.4稀释至总体积为2.5ml，通过凝胶过滤流过DPBS-平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008332
G-25,GEHealthcare)并用pH 7.4的DPBS缓冲液洗脱。随后，将ADC溶液通过Amicon Ultracel-30K离心(Millipore)浓缩，并将其再次用DPBS稀释至体积约为2.5ml。最后，向该溶液中加入200μl DPBS中的0.1μmol b-转谷氨酰胺酶阻断剂Zedira C100。所得ADC溶液的特征如下：
蛋白质浓度：1.76mg/ml
药物/mAb比率：3.9
实施例34te-4
Figure BDA0003554407600008341
以与实施例34t-4类似的方式，还使用和偶联了TPP-7511(对应于曲妥珠单抗-HC-N297Q)。所得ADC溶液的特征如下：
蛋白质浓度：1.56mg/ml
药物/mAb比率：3.9
实施例35a
Figure BDA0003554407600008342
在氩气下，向0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中加入0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在室温下搅拌30 min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.28mg(0.00023mmol)中间体 Q35。在室温下再搅拌90min后，将混合物用预先已调节至pH 8的PBS 缓冲液稀释至体积为2.5ml。然后使该溶液流过已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱(
Figure BDA0003554407600008351
G-25,GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在室温、氩气下搅拌过夜。
然后将该溶液通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.94mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例35e
以类似的方式，将中间体Q35与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.89mg/ml
药物/mAb比率：3.5
实施例35k
以类似的方式，将中间体Q35与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.78mg/ml
药物/mAb比率：3.5
实施例36a
Figure BDA0003554407600008361
在氩气下，向0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中加入 0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在室温下搅拌30 min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.26mg(0.00023mmol)中间体 Q36。在室温下再搅拌90min后，将混合物用预先已调节至pH 8的PBS 缓冲液稀释至体积为2.5ml。然后使该溶液流过已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱(
Figure BDA0003554407600008362
G-25,GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在室温、氩气下搅拌过夜。
然后将该溶液通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.0mg/ml
药物/mAb比率：3.2
实施例36e
以类似的方式，将中间体Q36与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.84mg/ml
药物/mAb比率：3.6
实施例36k
以类似的方式，将中间体Q36与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.75mg/ml
药物/mAb比率：3.4
实施例37a
Figure BDA0003554407600008371
在氩气下，向0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中加入 5个当量(0.2mg)的溶解于50μl DMSO中的中间体Q37的溶液，在室温下搅拌1h后再加入相同量，并将混合物在室温下再搅拌1小时。随后，将混合物用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释至2.5ml，使用Sephadex柱纯化，然后通过超速离心浓缩并用PBS(pH 7.2)再稀释。
蛋白质浓度：2.2mg/ml
药物/mAb比率：4.1
实施例37e
以类似的方式，将中间体Q37与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.64mg/ml
药物/mAb比率：4.5
实施例37k
以类似的方式，将中间体Q37与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.6mg/ml
药物/mAb比率：6.2
实施例38a
Figure BDA0003554407600008381
在氩气下，向0.458ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝11mg/ml)中加入0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在室温下搅拌 30min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.26mg(0.00023mmol)中间体Q38。在室温下再搅拌90min后，将混合物用预先已调节至pH 8的PBS 缓冲液稀释至体积为2.5ml。然后使该溶液流过已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱(
Figure BDA0003554407600008382
G-25,GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在室温、氩气下搅拌过夜。
然后将该溶液通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.94mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例38e
以类似的方式，将中间体Q38与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.82mg/ml
药物/mAb比率：3.5
实施例38k
以类似的方式，将中间体Q38与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：2.01mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例39a
Figure BDA0003554407600008391
在氩气下，向0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中加入 0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在室温下搅拌30 min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.23mg(0.00023mmol)中间体 Q39。在室温下再搅拌90min后，将混合物用1.9ml预先已调节至pH 8 的PBS缓冲液稀释。然后使该溶液流过已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10 柱(
Figure BDA0003554407600008392
G-25,GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在室温、氩气下搅拌过夜。随后通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.97mg/ml
药物/mAb比率：2.8
实施例39e
以类似的方式，将中间体Q39与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.77mg/ml
药物/mAb比率：3.3
实施例39k
以类似的方式，将中间体Q39与5mg抗-TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.74mg/ml
药物/mAb比率：3.4
实施例40a
Figure BDA0003554407600008401
在氩气下，向0.5ml PBS中的5mg西妥昔单抗(c＝10mg/ml)中加入 0.029mg TCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在室温下搅拌30 min，然后加入溶解于50μl DMSO中的0.26mg(0.00023mmol)中间体 Q40。在室温下再搅拌90min后，将混合物用预先已调节至pH 8的PBS 缓冲液稀释至体积为2.5ml。然后使该溶液流过已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱(
Figure BDA0003554407600008402
G-25,GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在室温、氩气下搅拌过夜。
然后将该溶液通过超速离心浓缩并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.95mg/ml
药物/mAb比率：2.4
实施例40e
以类似的方式，将中间体Q40与5mg曲妥珠单抗偶联。所得ADC批次的特征如下：
蛋白质浓度：1.84mg/ml
药物/mAb比率：2.9
实施例40k
以类似的方式，将中间体Q40与5mg抗TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：1.93mg/ml
药物/mAb比率：3.0
实施例41a
Figure BDA0003554407600008411
在氩气下，向0.458ml PBS(c＝10.9mg/ml)中的5mg西妥昔单抗中加入0.029mgTCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在RT 下搅拌30min，然后加入溶于50μl DMSO中的0.308mg(0.00023mmol) 中间体Q41。在RT下再搅拌90min后，用PBS缓冲液将混合物稀释至2.5ml的体积。然后使用PD10柱(
Figure BDA0003554407600008412
G-25，GE Healthcare) 纯化该溶液。然后通过超速离心浓缩该溶液并用PBS缓冲液再稀释。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：2.26mg/ml
药物/mAb比率：3.9
实施例41e
以类似的方式，将中间体Q41与5mg曲妥珠单抗偶联。得到的ADC 批次特征如下：
蛋白质浓度：2.0mg/ml
药物/mAb比率：4.3
实施例41k
以类似的方式，将中间体Q41与5mg抗TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：2.15mg/ml
药物/mAb比率：4.0
实施例42a
Figure BDA0003554407600008421
在氩气下，向0.458ml PBS(c＝10.9mg/ml)中的5mg西妥昔单抗中加入0.029mgTCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在RT 下搅拌30min，然后加入溶于50μl DMSO中的0.263mg(0.00023mmol) 中间体Q42。在RT下再搅拌90min后，用预先调节至pH 8的PBS缓冲液将混合物稀释至2.5ml的体积。然后使该溶液流过用PBS缓冲液 pH 8平衡的PD10柱(
Figure BDA0003554407600008431
G-25，GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗出液在RT、氩气下搅拌过夜。
然后通过超速离心浓缩该溶液并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：0.93mg/ml
药物/mAb比率：3.5
实施例42e
以类似的方式，将中间体Q42与5mg曲妥珠单抗偶联。得到的ADC 批次特征如下：
蛋白质浓度：0.53mg/ml
药物/mAb比率：4.2
实施例42k
以类似的方式，将中间体Q42与5mg抗TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：0.88mg/ml
药物/mAb比率：3.7
实施例43a
Figure BDA0003554407600008441
在氩气下，向0.458ml PBS(c＝10.9mg/ml)中的5mg西妥昔单抗中加入0.029mgTCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在RT 下搅拌30min，然后加入溶于50μl DMSO中的0.27mg(0.00023mmol) 中间体Q43。在RT下再搅拌90min后，用预先调节至pH 8的PBS缓冲液将混合物稀释至2.5ml的体积。然后使该溶液流过用PBS缓冲液 pH 8平衡的PD10柱(
Figure BDA0003554407600008442
G-25，GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗出液在RT、氩气下搅拌过夜。
然后通过超速离心浓缩该溶液并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：1.91mg/ml
药物/mAb比率：2.6
实施例43e
以类似的方式，将中间体Q43与5mg曲妥珠单抗偶联。得到的ADC 批次特征如下：
蛋白质浓度：1.56mg/ml
药物/mAb比率：3.6
实施例43k
以类似的方式，将中间体Q43与5mg抗TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：1.89mg/ml
药物/mAb比率：3.6
实施例44a
Figure BDA0003554407600008451
在氩气下，向0.458ml PBS(c＝10.9mg/ml)中的5mg西妥昔单抗中加入0.029mgTCEP在0.05ml PBS缓冲液中的溶液。将混合物在RT 下搅拌30min，然后加入溶于50μl DMSO中的0.29mg(0.00023mmol) 中间体Q44。在RT下再搅拌90min后，用预先调节至pH 8的PBS缓冲液将混合物稀释至2.5ml的体积。然后使该溶液流过用PBS缓冲液 pH 8平衡的PD10柱(
Figure BDA0003554407600008452
G-25，GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗出液在RT、氩气下搅拌过夜。
然后通过超速离心浓缩该溶液并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：1.82mg/ml
药物/mAb比率：2.6
实施例44e
以类似的方式，将中间体Q44与5mg曲妥珠单抗偶联。得到的ADC 批次特征如下：
蛋白质浓度：1.79mg/ml
药物/mAb比率：3.4
实施例44k
以类似的方式，将中间体Q44与5mg抗TWEAKR的抗体TPP-2658 偶联。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：1.72mg/ml
药物/mAb比率：3.7
C：生物功效的评估
本发明化合物的生物活性可以示于下述测定中：
a.C-1a ADC的细胞毒性作用的确定
ADC的细胞毒性作用的分析是使用以下各种细胞系进行：
NCI-H292：人粘液表皮样肺癌细胞，ATCC-CRL-1848，标准培养基：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，stab.谷氨酰胺)+10％FCS(Sigma；#F2442)，TWEAKR-阳性；EGFR阳性。
BxPC3：人胰腺癌细胞，ATCC-CRL-1687，标准培养基：RPMI 1640 (Biochrom；#FG1215，stab.谷氨酰胺)+10％FCS(Sigma；#F2442)， TWEAKR-阳性。
LoVo人结直肠癌细胞，ATCC编号CCL-229，用于MTT测定的培养：标准培养基：Kaighn's+L-谷氨酰胺(Invitrogen 21127)+10％热灭活的FCS(来自Gibco，编号10500-064)。用于CTG测定的培养：RPMI 1640(Biochrom；#FG1215，stab.谷氨酰胺)+10％FCS(Sigma#F2442)。 TWEAKR-阳性。
KPL4：人乳腺癌细胞系，Bayer Pharma AG(在DSMZ针对19.7.2012 进行身份检查和确认)，标准培养基：RPMI 1640(来自Gibco；# 21875-059，stab.L-谷氨酰胺)+10％热灭活的FCS(Gibco，编号10500-064)；HER-2阳性。
SK-HEP-1：人肝癌细胞系，ATCC编号HTB-52，标准培养基：具有Earle's盐+Glutamax I(Invitrogen 41090)+10％热灭活的FCS(来自 Gibco，编号10500-064)的MEM；EGFR-阳性，TWEAKR-阳性。
通过如美国组织典型保藏中心(ATCC)中针对相应细胞系所示的标准方法培养细胞。
CTG测定
按照标准方法使用C-1下列出的生长培养基培养细胞。通过以下步骤进行测试：用胰蛋白酶(0.05％)和EDTA(0.02％)的PBS溶液 (Biochrom AG#L2143)使细胞脱附、沉淀、重悬于培养基中、计数并接种到具有白底的96孔培养板(Costar#3610)中(以75μl/孔接种，每孔有下列细胞数：NCI-H292：2500细胞/孔、BxPC3 2500细胞/孔、 LoVo3000细胞/孔)，并在37℃下和5％二氧化碳的培养箱中孵育。24h 后，将抗体药物缀合物在25μl培养基(浓缩四倍)中加入到细胞中，以在细胞上得到3x 10-7M至3x 10-11M的最终抗体药物缀合物浓度(一式三份)。然后将细胞在37℃下和5％二氧化碳的培养箱中孵育。在平行平板上，使用CellTiter Glow(CTG)发光细胞活力测定(Promega #G7573和#G7571)确定药物治疗开始(第0天)时的细胞活性。为此，每个细胞批次加入100μl底物，然后用铝箔覆盖平板，在平板振荡器上以180rpm振荡2min，使其在实验台上静置8min，然后使用发光计(Victor X2，PerkinElmer)测量。底物检测了产生发光信号的活细胞的ATP含量，发光信号的强度与细胞的存活力成正比。与抗体药物缀合物一起孵育72h后，还使用如上所述的Cell Titer Glow发光细胞活力测定法确定这些细胞的存活力。从测量的数据中，使用DRC(剂量响应曲线)分析电子表格和4参数拟合，通过与第0天比较计算生长抑制的IC50。DRC分析电子表格是由BayerPharma AG和Bayer Business Services在IDBS E-WorkBook Suite平台(IDBS：IDBusiness Solutions Ltd.，Guildford，UK)上开发的biobook电子表格。
下表1a列出了IC50值：该测定的典型工作实施例：
表1a
Figure BDA0003554407600008481
Figure BDA0003554407600008491
所报道的活性数据涉及本实验部分中描述的工作实施例，使用所示的药物/mAB比率。对于不同的药物/mAB比率，这些值可能会有偏差。IC50值是几个独立实验的平均值或单个值。抗体药物缀合物的作用对于包含相应接头和毒性基团的相应亚型对照是选择性的。
作为另外的参考化合物，以与实施例1k类似的方式，将中间体 Q1的D-天冬酰胺差向异构体与抗TWEAKR的抗体TPP-2658偶联。
实施例1k的对照实施例
Figure BDA0003554407600008501
在此，以与实施例1k类似的方式，将Q1的D-天冬酰胺差向异构体与60mg抗TWEAKR的抗体TPP-2658偶联。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：11.56mg/ml
药物/mAb比率：3.6
如表1a所示，该对照ADC对3种细胞系没有显示出任何显著的细胞毒性作用。
MTT测定
按照标准方法使用C-1下列出的生长培养基培养细胞。通过以下步骤进行测试：使用Accutase的PBS溶液(来自Biochrom AG#L2143) 使细胞脱附、沉淀、重悬于培养基中、计数并接种到具有白底的96孔培养板(来自Costar#3610)中(NCI H292：2500个细胞/孔；SK-HEP-1： 1000个细胞/孔；KPL-4：1200个细胞/孔；总体积100μl)。然后将细胞在37℃下和5％二氧化碳的培养箱中孵育。48h后，更换培养基。然后将10μl培养基中浓度为10-5M至10-13M的的抗体药物缀合物移液至细胞(一式三份)，然后将测定物在37℃下和5％二氧化碳的培养箱中孵育。96h后，使用MTT测定(ATCC，Manassas，Virginia，USA，目录号30-1010K)检测细胞增殖。为此，将MTT试剂与细胞孵育4h，接着通过加入洗涤剂裂解细胞过夜。在570nm处检测到形成的染色 (Infinite M1000 pro，Tecan)。测量的数据用于使用DRC(剂量响应曲线)来计算生长抑制的IC50。没有用测试物质处理但其他以相同方式处理的细胞的增殖定义为100％数值。
下表1b和1c列出了该测定的代表性工作实施例的IC50值：
表1b
Figure BDA0003554407600008511
Figure BDA0003554407600008521
表1c
Figure BDA0003554407600008522
Figure BDA0003554407600008531
Figure BDA0003554407600008541
所报道的活性数据涉及本实验部分中描述的工作实施例，使用所示出的药物/mAB比率。对于不同的药物/mAB比率，这些值可能会有偏差。IC50值是几个独立实验的平均值或单个值。抗体药物缀合物的作用对于包含相应接头和毒性基团的相应亚型对照是选择性的。
同理，以与实施例1e类似的方式，将Q1的D-天冬酰胺差向异构体与5mg曲妥珠单抗偶联。获得的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：1.68mg/ml
药物/mAb比率：3.6
如表1c所示，该对照ADC对KPL4细胞系也没有出显示任何显著的细胞毒性作用。
C-1b通过选择的实施例测定纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5的抑制
将人纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5(tebu-bio/Cytoskeleton Inc，编号 027EG01-XL)的动力结构域(motor domain)以10nM的浓度与以50 nM/ml紫杉醇(Sigma编号T7191-5MG)稳定的微管(牛或猪， tebu-bio/Cytoskeleton Inc)在15mM PIPES(pH 6.8)(5mM MgCl2和10mM DTT，Sigma)中在RT下孵育5min。将新制备的混合物等分成 384MTP(来自Corning)。然后加入浓度为1.0x 10-6M至1.0x 10-13M 待检测的抑制剂和ATP(终浓度500μM，Sigma)。在RT下孵育2h。通过使用孔雀绿(Biomol)检测形成的无机磷酸盐来检测ATPase活性。在加入试剂后，在检测620nm波长处的吸收之前，将测定物在RT下孵育50min。使用的阳性对照是monastrol(Sigma，M8515-1 mg)和ispinesib (AdooQ Bioscience A10486)。剂量-活性曲线的个别数据是8倍的测定值。IC50值是两个独立实验的平均值。100％对照是未用抑制剂处理的样品。
下表2列出了所述测定的代表性工作实施例的IC50值，并总结了相应的细胞毒性数据(MTT测定)：
表2
Figure BDA0003554407600008551
Figure BDA0003554407600008561
所报道的活性数据涉及本实验部分所述的工作实施例。
C-1c酶促测定
a：组织蛋白酶B测定
对于每种待检测的组织蛋白酶B可裂解的前药，在微反应容器(0.5 ml，来自Eppendorf)中配制混合物。这里使用的酶是从人肝脏组织获得的。首先加入2μg组织蛋白酶B(Sigma C8571 25μg)，用50mM 磷酸钠缓冲液(pH 6.0)、2mM DTT补足至总体积200μl。然后移入 50μl待检测的底物溶液。将混合物在40℃下以300rpm恒速振荡的加热块(来自ThermoFisher Scientific)中孵育。酶促反应是动力学控制的。为此，在不同的时间取样10μl样品。将取出的样品立即与20μl冰冷的甲醇混合以停止酶促反应，然后在-20℃下冷冻。所选择的用于取样的时间为10min、2h、4h和24h后。检测RP-HPLC分析(反相HPLC，来自AgilentTechnologies，1200系列)。测定释放的毒性基团使得能够确定酶促反应的半衰期t1/2。
b：豆荚蛋白酶测定
豆荚蛋白酶测定是用重组的人酶进行。将rh豆荚蛋白酶的酶溶液 (目录#2199-CY，R&D Systems)在50mM乙酸钠缓冲液/100mM NaCl(pH 4.0)中稀释至所需浓度，并在37℃下预孵育2h。然后将rh豆荚蛋白酶在50mM MES缓冲液、250mM NaCl、pH 5.0中调节至1ng/μl的终浓度。对于待检查的每种豆荚蛋白酶可裂解的前药，在微反应器(0.5 ml，来自Eppendorf)中配制混合物。为此，用50mM MES缓冲液、250 mM NaCl，pH 5.0将底物溶液调节至所需浓度(双倍浓度)。为了进行酶促反应的动力学测量，首先加入250μl豆荚蛋白酶溶液，并通过加入250μl底物溶液(最终浓度：单一浓度)开始酶反应。在不同的时间，取样50μl样品。立即将该样品与100μl冰冷的甲醇混合以停止酶促反应，然后在-20℃下冷冻。所选择的用于取样的时间为0.5h、1h、3h 和24h后。然后通过RP-HPLC分析和LC-MS分析来分析样品。测定释放的毒性基团使得能够测定酶促反应的半衰期t1/2。
作为显示豆荚蛋白酶介导的裂解的代表性实施例，在豆荚蛋白酶测定中产生的底物是模型化合物A和B。
参考实施例：模型化合物A
N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基
-N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-(甲基氨基)-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600008571
首先，如WO 2015096982 A1中所述制备三氟乙酸/(2S)-2-氨基 -4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)。随后，该中间体用于通过以下方式制备标题化合物，即通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下在DMF中偶联中间体L103来进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝902[M+H]+。
参考实施例：模型化合物B
N-(吡啶-4-基乙酰基)-L-丙氨酰基-N-甲基-L-丙氨酰基 -N1-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-(甲基氨基)-1-氧代丁烷-2-基]-L-天冬酰胺
Figure BDA0003554407600008581
首先，如WO 2015096982 A1中所述制备三氟乙酸/(2S)-2-氨基 -4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)。随后，该中间体用于通过以下方式制备标题化合物，即通过在存在HATU和N,N-二异丙基乙胺的情况下在DMF中偶联中间体L119来进行。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝916[M+H]+。
化合物A是在上述条件下从豆荚蛋白酶裂解成目标化合物，半衰期为1.1h。
Figure BDA0003554407600008591
C-2内化测定
内化是使得能够通过抗体药物缀合物(ADC)在表达抗原的癌细胞中特异而有效地提供细胞毒性有效载荷的关键过程。该过程是通过荧光标记特异性抗体和亚型对照抗体来监测。首先，将荧光染料与抗体的赖氨酸缀合。缀合是使用二倍摩尔过量的pH 8.3的CypHer5E单NHS酯 (批次357392，GE Healthcare)进行。偶联后，将反应混合物通过凝胶色谱法(Zeba Spin Desalting Columns，40K，Thermo Scientific，编号 87768；洗脱缓冲液：DULBECCO'S PBS，Sigma-Aldrich，编号D8537) 进行纯化，以移除过量的染料并调整pH。使用VIVASPIN 500柱 (Sartorius stedim biotec)浓缩蛋白质溶液。通过分光光度分析(来自 NanoDrop)和随后的计算(D/P＝A染料ε蛋白质:(A280-0.16A染料)ε染料)测定抗体的染料载量。
在此检查的抗体和亚型对照的染料载量具有相当的数量级。在细胞结合测定中，确认偶联不引起抗体亲和力的任何变化。
标记的抗体用于内化测定。在开始处理之前，将细胞(2x 104/孔) 接种在96孔MTP(脂肪、黑色、透明底部编号4308776，来自Applied Biosystems)中的100μl培养基中。在37℃/5％CO2下孵育18h后，更换培养基并加入不同浓度(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)的标记抗体。对标记的亚型对照(阴性对照)采用相同的处理方案。选择的孵育时间为 0h、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h和24h。荧光测量是使用 InCellAnalyzer 1000(来自GE Healthcare)进行。随后通过测量参数颗粒计数/细胞和总颗粒强度/细胞进行动力学评估。
在与受体结合之后，检查抗体的内化能力。为此，选择具有不同受体表达水平的细胞。观察抗体的靶标介导的特异性内化，而亚型对照没有显示出内化。
C-3用于确定细胞渗透性的体外测试
可以通过使用Caco-2细胞的流量测定(flux assay)中的体外测试来研究物质的细胞渗透性[M.D.Troutman and D.R.Thakker,Pharm.Res. 20(8),1210-1224(2003)]。为此，将细胞在24孔滤板上培养15-16天。为了测定渗透，将相应的测试物质在HEPES缓冲液中在顶部(A)或基底 (B)上施用于细胞，并孵育2h。0h后和2h后，从顺式和反式隔室中取样。通过HPLC(Agilent 1200，
Figure BDA0003554407600008601
德国)使用反相柱分离样品。 HPLC系统是通过TurboIon Spray Interface连接至Triple Quadropol质谱仪API 4000(AB SCIEX DeutschlandGmbH，Darmstadt，德国)。基于 Papp值评估渗透性，所述Papp值是使用Schwab et al.公布的公式[D. Schwab et al.,J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]计算。当Papp(B-A) 与Papp(A-B)的比率(流出率)>2或<0.5时，物质被分类为主动运输。
对于细胞内释放的毒性基团至关重要的是从B到A的渗透性[Papp (B-A)]和Papp(B-A)与Papp(A-B)的比率(流出比)：该渗透性越低，通过Caco-2细胞单分子层的物质的主动和被动运输过程越慢。如果流出比又不表示任何主动运输，则该物质在细胞内释放后可在细胞中保留更长时间。因此，也有更多的时间可用于与生化靶标(在这种情况下：纺锤体驱动蛋白，KSP/Eg5)的相互作用。
下表3列出了该测定的代表性工作实施例的渗透性数据：
表3
Figure BDA0003554407600008611
C-4确定针对P-糖蛋白(P-gp)的底物性质的体外测试
许多肿瘤细胞表达针对药物的转运蛋白，并且这经常伴随着对细胞抑制剂的抗性的发展。不是这种转运蛋白的底物的物质，例如P-糖蛋白 (P-gp)或BCRP，因此可以表现出改善的活性特征。
用于P-gp(ABCB1)的物质的底物性质是通过使用过量表达P-gp (L-MDR1细胞)的LLC-PK1细胞的流量测定来确定[A.H.Schinkel et al.,J.Clin.Invest.96,1698-1705(1995)]。为此，将LLC-PK1细胞或 L-MDR1细胞在96孔滤板上培养3-4天。为了确定渗透，单独地或在存在抑制剂(例如伊维菌素(ivermectin)或维拉帕米(verapamil))的情况下，将相应的测试物质在HEPES缓冲液中在顶部(A)或基底(B)上施用于细胞，并孵育2h。0h后和2h后，从顺式和反式隔室中取样。通过 HPLC使用反相柱分离样品。HPLC系统通过Turbo IonSpray Interface 连接至Triple Quadropol质谱仪API 3000(Applied BiosystemsApplera， Darmstadt，德国)。基于Papp值评估渗透性，所述Papp值是使用Schwab et al.公布的公式[D.Schwab et al.,J.Med.Chem.46,1716-1725(2003)]计算。当Papp(B-A)与Papp(A-B)的流出率>2时，物质被分类为P-gp 底物。
作为评价P-gp底物性质的进一步标准，可以比较L-MDR1和 LLC-PK1细胞中的流出率或在存在或不存在抑制剂的情况下的流出率。如果这些值相差超过2倍，则所研究的物质是P-gp底物。
C-5药代动力学
C5a：体外内化后ADC代谢物的鉴定
方法描述：
用免疫缀合物进行内化研究以分析在细胞内形成的代谢物。为此，将人肺肿瘤细胞NCI H292(3x 105/孔)接种在6孔板中并孵育过夜(37 ℃、5％CO2)。用10μg/ml(66nM)待检测的ADC处理细胞。内化是在37℃和5％CO2下进行。在不同的时间点(0、4、24、48、72h)，取样细胞样品作进一步分析。首先，收集上清液(约5ml)，并在离心 (2min，RT，1000rpm HeraeusVariofuge 3.0R)之后储存在-80℃下。用PBS洗涤细胞，用Accutase脱附，确定细胞数。在又一次洗涤后，用100ml裂解缓冲液(哺乳动物细胞裂解试剂盒(Sigma MCL1))处理确定数目的细胞(2x 105)并在连续摇动下(Thermomixer，15min， 4℃，650rpm)在Protein LoBind管(Eppendorf目录号0030108.116) 中孵育。孵育后，将裂解物离心(10min，4℃，12000g，Eppendorf 5415R)，收集上清液。将获得的上清液保存在-80℃下。然后如下分析所有样品。
在用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后，通过与三重四极质谱仪(MS)联用的高压液相色谱(HPLC)测量培养物上清液或细胞裂解物中的化合物。
为了后处理50μl培养物上清液/细胞裂解液，加入150μl沉淀试剂 (通常为乙腈)，将混合物摇动10秒钟。所述沉淀试剂含有适当浓度 (通常在20-100ng/ml的范围内)的内标(ISTD)。在16000g下离心 3min后，将上清液转移到自动采样器小瓶中，用500μl适于流动相的缓冲液配制并再次摇动。
然后使用HPLC偶联的三重四极质谱仪API6500(来自AB SCIEX DeutschlandGmbH)测量两个基质样品。
为了校准，将0.5-2000μg/l的浓度加入到血浆样品中。检出限(LOQ) 约为2μg/l。线性范围为2至1000μg/l。
为了校准肿瘤样品，将0.5-200μg/l的浓度加入到未经处理的肿瘤的上清液中。检出限为4μg/l。线性范围为4至200μg/l。
测试有效性的质量控制含有5和50μg/l。
C5b：体内ADC代谢物的鉴定
在静脉内给药3-30mg/kg不同ADC后，可以测量ADC和产生的任何代谢物的血浆和肿瘤浓度，并且可以计算药代动力学参数如清除率 (CL)、曲线下面积(AUC)和半衰期(t1/2)。
作为参考实施例(R10k)，使用不可裂解的接头制备具有激动性抗体TPP-2658的ADC：
参考实施例R10k
Figure BDA0003554407600008641
在氩气下，向10.5ml PBS中的150mg抗TWEAKR的抗体TPP-2658 (c＝14.28mg/ml)中加入0.86mg TCEP在2ml PBS缓冲液中的溶液。在WO 2015/189143 A1中详细描述了抗体TPP-2658及其生产。
将混合物在RT下搅拌30min，然后加入溶于1250μl DMSO中的 6.63mg(0.008mmol)中间体F104。在RT下再搅拌90min后，用1250 μl预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释混合物。
然后使该溶液流过用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱(
Figure BDA0003554407600008642
G-25，GEHealthcare)，并用pH缓冲液pH 8洗脱。用PBS缓冲液pH 8 将洗出液稀释至总体积22.5ml。该溶液在RT和氩气下搅拌过夜，然后通过PD-10柱重新缓冲至pH 7.2。随后通过超速离心浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释并再次浓缩。得到的ADC批次特征如下：
蛋白质浓度：14.06mg/ml
药物/mAb比率：3.4
产生的任何代谢物的定量分析
在用甲醇或乙腈沉淀蛋白质之后，通过高压液相色谱(HPLC)与三重四极质谱仪(MS)联用测量肿瘤和组织中的化合物。
在肿瘤或组织的后处理过程中，后者用3倍量的提取缓冲液处理。提取缓冲液含有50ml组织蛋白提取试剂(Pierce，Rockford，IL)、两种丸粒的完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics GmbH， Mannheim，Germany)和终浓度为1mM的苯甲基磺酰氟(Sigma，St.Louis，MO)。样品在Tissuelyser II(Qiagen)中以最大冲程数均质化两次，每次20min。将50μl匀浆转移到自动采样器小瓶中，并用150 μl含有ISTD的甲醇配制。在16000g下离心3min后，用180μl适于流动相的缓冲液配制10μl上清液并再次摇动。然后准备用于测量的肿瘤样品。
然后使用HPLC-偶联的三重四极质谱仪API6500(来自AB SCIEX DeutschlandGmbH)测量两个基质样品。
为了校准肿瘤和组织样品，将0.5-200μg/l的浓度加入到未处理的肿瘤或组织的上清液中。检出限为3μg/l。线性范围为3至200μg/l。
测试有效性的质量控制含有5和50μg/l，在血浆中另外含有500 μg/l。
表：在给药10mg/kg来自实施例1k*的ADC(n＝3)或10mg/kg 来自参考实施例R10k的ADC(n＝2)后24h，在小鼠肿瘤的NCI H292 异种移植物、肝脏和肾脏中的分解代谢物浓度。在两种情况下测得的代谢物为：M26。
Figure BDA0003554407600008651
在给药具有豆荚蛋白酶可裂解的前药残基的本发明的ADC实施例 1k*后，在肿瘤中测量活性分解代谢物M26的浓度，这些浓度与给药具有相同抗体但不含豆荚蛋白酶-可裂解的前药残基的ADC后测量的那些浓度相当。相比之下，在给药来自实施例1k*的ADC之后，所测量的活性代谢物的浓度(特别是在肝脏中)远低于在给药参考ADC R10k之后所测量的活性代谢物的浓度。当在活性成分中使用豆荚蛋白酶-可裂解的前药残基时，与其他器官相比，靶组织(肿瘤)中的活性成分的选择性释放要高得多。
定量所用抗体的分析
使用配体结合测定(ELISA)测定ADC的抗体部分，作为血浆样品和肿瘤裂解物中的总IgG浓度。此处使用夹心ELISA形式。该ELISA 已经被确认并验证以用于血浆和肿瘤样品中的测定。ELISA板用抗人山羊IgG Fc抗体包被。与样品一起孵育后，将平板洗涤并与猿抗人IgG(H +L)抗体和辣根过氧化物酶(HRP)的检测缀合物一起孵育。在又一次的洗涤步骤之后，将HRP底物加入到OPD中，并通过在490nm处的吸收监测显色。具有已知IgG浓度的标准样品使用4-参数方程进行拟合。在更低的(LLOQ)和更高的(ULOQ)定量限内，通过内插确定未知浓度。
C-6体内活性测试
例如使用异种移植模型测试本发明的缀合物的活性。本领域技术人员熟悉现有技术中允许测试本发明化合物的活性的方法(参见例如WO 2005/081711；Polson et al.，Cancer Res.2009Mar 15；69(6):2358-64)。为此，将表达结合体的靶分子的肿瘤细胞系接种到啮齿动物(例如小鼠) 中。然后将本发明的缀合物、亚型对照缀合物、对照抗体或等渗盐水给药至接种的动物。给药发生一次或多次。在数天的孵育时间之后，通过比较缀合物处理的动物和对照组来确定肿瘤的大小。缀合物处理的动物显示出更小的肿瘤尺寸。
C-6a.小鼠中的实验肿瘤的生长抑制/消退
将表达用于抗体-药物缀合物的抗原的人肿瘤细胞皮下接种到免疫抑制小鼠(例如NMRi裸鼠或SCID小鼠)的胁腹。将1-100万个细胞从细胞培养物中脱附、离心并重悬于培养基或培养基/基质胶中。将细胞悬液注射到小鼠的皮下。
几天内，肿瘤生长。肿瘤建立后开始治疗，肿瘤尺寸约为40mm2。为了检查对更大肿瘤的影响，可以仅在50-100mm2的肿瘤尺寸下开始治疗。
使用APDC和ADC的治疗是通过进入小鼠尾静脉的静脉内(i.v.) 途径进行。ADC以5ml/kg的体积给药。
治疗方案取决于抗体的药代动力学。使用本发明的缀合物，每周进行一次治疗，持续2周或3周作为标准。为了快速评估，可以使用具有单一治疗的方案。然而，也可以继续治疗，或者稍后可以接着三个治疗日的第二个周期。
作为标准，每个治疗组使用8只动物。除了给药活性物质的组之外，根据相同的方案，一组作为对照组仅用缓冲液处理。
在实验期间，使用测径器在两维(长度/宽度)中定期测量肿瘤面积。肿瘤面积确定为长度X宽度。治疗组的平均肿瘤面积与对照组的平均肿瘤面积比率表示为T/C面积。
当治疗结束后，所有实验组同时终止，可将肿瘤取出并称重。治疗组的平均肿瘤重量与对照组的平均肿瘤重量比率表示为T/C重量。
C-6b.本发明的APDC和ADC在各种肿瘤模型中的功效
将肿瘤细胞皮下接种到雌性NMRI裸鼠(Janvier)的胁腹中。在～40 mm2的肿瘤尺寸下，用抗体-药物缀合物进行静脉内治疗。治疗后，如果合适的话继续监测肿瘤生长。
与使用缀合的亚型对照抗体的对照组相比，使用本发明的APDC进行的治疗导致了不同的并且在某些情况下长效的肿瘤生长抑制。表8示出了所测定的从治疗开始计算的在实验结束的相应日期的肿瘤重量和肿瘤面积的T/C值。
表8：
Figure BDA0003554407600008671
Figure BDA0003554407600008681
序列表
<110> 拜耳医药股份有限公司
<120> 具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物（ADC）和抗体前药缀合物（APDC）
<130> BHC 15 1 031 A
<160> 245
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 215
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 2
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 3
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 4
Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 5
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 6
Pro Tyr Pro Met Ile
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 7
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 8
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 11
<211> 215
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 12
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 14
Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 15
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr
1 5 10
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 16
Pro Tyr Pro Met Ile
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 17
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 18
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 21
<211> 215
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 24
Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 25
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr
1 5 10
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 26
Pro Tyr Pro Met Met
1 5
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 27
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 28
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 31
<211> 215
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 32
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 32
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 33
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 34
Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 35
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr
1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 36
Pro Tyr Pro Met Met
1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 37
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 38
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 108
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 39
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 40
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
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Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
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<210> 41
<211> 215
<212> PRT
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<400> 41
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 42
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 42
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 43
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 44
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 45
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Gly Ile Thr
1 5 10
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 46
Pro Tyr Pro Met Met
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 47
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 48
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 108
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 49
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 50
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
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Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 51
<211> 215
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Gly
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 52
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 52
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
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Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 53
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 54
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 55
Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Gly Ile Thr
1 5 10
<210> 56
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 56
Pro Tyr Pro Met Met
1 5
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 57
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 58
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 108
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 59
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 61
<211> 217
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 61
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser
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115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
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195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 62
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 62
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 63
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 64
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 65
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1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 66
Pro Tyr Pro Met Met
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 67
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 68
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 69
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
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Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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65 70 75 80
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
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35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
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<210> 71
<211> 217
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 71
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1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 72
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 73
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<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
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Gly
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<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 79
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<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 80
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
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<210> 81
<211> 217
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 81
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
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Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 82
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 83
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 84
Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 85
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr
1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 86
Pro Tyr Pro Met Ile
1 5
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 87
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 88
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 110
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 89
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
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Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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<210> 90
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 90
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 91
<211> 217
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 91
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
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195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 92
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 92
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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340 345 350
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355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 93
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 93
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 94
Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 95
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Gly Ile Thr
1 5 10
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 96
Pro Tyr Pro Met Met
1 5
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 97
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1 5 10 15
Gly
<210> 98
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 98
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 110
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 99
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 100
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 100
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 101
<211> 217
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 101
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 102
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 102
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 103
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 104
Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 105
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 105
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Gly Ile Thr
1 5 10
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 106
Pro Tyr Pro Met Met
1 5
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 107
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 108
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 109
<211> 110
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 109
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 110
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 110
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 111
<211> 217
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 111
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
Pro Phe Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 112
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 112
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 113
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 113
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 114
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 114
Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 115
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr
1 5 10
<210> 116
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 116
Pro Tyr Pro Met Met
1 5
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 117
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 118
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 118
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 119
<211> 110
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 119
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
Pro Phe Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 120
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 120
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 121
<211> 218
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 121
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Asn Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 122
<211> 450
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 122
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
115 120 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val
130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr
180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val
275 280 285
His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu
290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
305 310 315 320
Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr
355 360 365
Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu
370 375 380
Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
405 410 415
Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val
420 425 430
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 123
<211> 218
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 123
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 124
<211> 448
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 124
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asn Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Gly Phe Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
260 265 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
290 295 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
355 360 365
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
370 375 380
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
405 410 415
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
420 425 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
435 440 445
<210> 125
<211> 218
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 125
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 126
<211> 450
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 127
<211> 218
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 128
<211> 449
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 128
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 129
<211> 218
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 129
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Thr Tyr Ser Tyr Met Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 130
<211> 448
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 130
Glu Val Lys Leu Gly Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
260 265 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
290 295 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
355 360 365
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
370 375 380
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
405 410 415
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
420 425 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
435 440 445
<210> 131
<211> 218
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 131
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 132
<211> 451
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 132
Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Pro Asp Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro
115 120 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser
130 135 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180 185 190
Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro
210 215 220
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
245 250 255
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
275 280 285
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
305 310 315 320
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
355 360 365
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
370 375 380
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
405 410 415
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
420 425 430
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
435 440 445
Thr Pro Gly
450
<210> 133
<211> 282
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴（Macaca fascicularis）
<400> 133
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser His Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ser Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 134
<211> 282
<212> PRT
<213> 褐鼠（Rattus norvegicus）
<400> 134
Glu Gln Ala Pro Gly Asn Ala Pro Cys Ser Ser Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala His Phe
35 40 45
Arg Met Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 135
<211> 282
<212> PRT
<213> 野猪（Sus scrofa）
<400> 135
Glu Arg Val Pro Gly Thr Thr Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ser Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 136
<211> 282
<212> PRT
<213> 灰狼（Canis lupus）
<400> 136
Glu Arg Val Pro Gly Thr Thr Pro Cys Pro Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 137
<211> 282
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 137
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ser Pro Cys Ser Ser Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala His Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 138
<211> 282
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 138
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 139
<211> 296
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 139
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp
50 55 60
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
65 70 75 80
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
85 90 95
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
100 105 110
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
115 120 125
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
130 135 140
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
145 150 155 160
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
165 170 175
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
180 185 190
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
195 200 205
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
210 215 220
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
225 230 235 240
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
245 250 255
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
260 265 270
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
275 280 285
Gly Lys His His His His His His
290 295
<210> 140
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 140
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 141
<211> 47
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 141
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala His His His His His His
35 40 45
<210> 142
<211> 282
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 142
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Gln Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 143
<211> 282
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 143
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
Lys Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 144
<211> 282
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 144
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 145
<211> 282
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 145
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Ala Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 146
<211> 282
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 146
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Ala Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 147
<211> 282
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 147
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Arg Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
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210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 148
<211> 282
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 148
Glu Gln Ala Pro Gly Gln Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 149
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 149
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Ala
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 150
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 150
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Ala Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 151
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 151
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Ala Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
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Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
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195 200 205
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 152
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 152
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ala Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
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260 265 270
His His His His His His
275
<210> 153
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 153
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1 5 10 15
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115 120 125
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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 154
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 154
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
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<210> 155
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 155
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
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<210> 156
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<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 156
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<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 157
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275
<210> 158
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 158
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
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<210> 159
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 159
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Ala Cys
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
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260 265 270
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275
<210> 160
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 160
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Ala Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
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275
<210> 161
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 161
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Ala Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
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275
<210> 162
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 162
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ala Ala Asp Leu Asp Lys Cys
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245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 163
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 163
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Ala Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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245 250 255
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260 265 270
His His His His His His
275
<210> 164
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 164
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ala Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 165
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 165
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ala Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 166
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 166
Ala Pro Cys Ser Ala Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 167
<211> 278
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 167
Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 168
<211> 53
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 168
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro
50
<210> 169
<211> 129
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 169
Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly
1 5 10 15
Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly
20 25 30
Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys
35 40 45
Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys
50 55 60
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro
65 70 75 80
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser
85 90 95
Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr
100 105 110
Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile
115 120 125
Gln
<210> 170
<211> 959
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 170
atggctcggg gctcgctgcg ccggttgctg cggctcctcg tgctggggct ctggctggcg 60
ttgctgcgct ccgtggccgg ggagcaagcg ccaggcaccg ccccctgctc ccgcggcagc 120
tcctggagcg cggacctgga caagtgcatg gactgcgcgt cttgcagggc gcgaccgcac 180
agcgacttct gcctgggctg cgctgcagca cctcctgccc ccttccggct gctttggccc 240
atccttgggg gcgctctgag cctgaccttc gtgctggggc tgctttctgg ctttttggtc 300
tggagacgat gccgcaggag agagaagttc accaccccca tagaggagac cggcggagag 360
ggctgcccag ctgtggcgct gatccagtga caatgtgccc cctgccagcc ggggctcgcc 420
cactcatcat tcattcatcc attctagagc cagtctctgc ctcccagacg cggcgggagc 480
caagctcctc caaccacaag gggggtgggg ggcggtgaat cacctctgag gcctgggccc 540
agggttcagg ggaaccttcc aaggtgtctg gttgccctgc ctctggctcc agaacagaaa 600
gggagcctca cgctggctca cacaaaacag ctgacactga ctaaggaact gcagcatttg 660
cacaggggag gggggtgccc tccttcctta ggacctgggg gccaggctga cttggggggc 720
agacttgaca ctaggcccca ctcactcaga tgtcctgaaa ttccaccacg ggggtcaccc 780
tggggggtta gggacctatt tttaacacta ggggctggcc cactaggagg gctggcccta 840
agatacagac ccccccaact ccccaaagcg gggaggagat atttattttg gggagagttt 900
ggaggggagg gagaatttat taataaaaga atctttaact ttaaaaaaaa aaaaaaaaa 959
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<220>
<221> SITE
<222> 5..5
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 171
Pro Tyr Pro Met Xaa
1 5
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 172
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Xaa Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 173
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 173
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 174
<211> 11
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 174
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Xaa Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<220>
<221> SITE
<222> 1..1
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 175
Xaa Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 176
<211> 10
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<220>
<221> SITE
<222> 5..6
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 176
Gln Gln Ser Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Ile Thr
1 5 10
<210> 177
<211> 645
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 177
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc ggctacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctaccag gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacacca gccccttcat caccttcggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcggacc gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360
cccagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtgg tctgcctgct gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480
caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540
accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600
ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645
<210> 178
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 178
gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt cacattcagc ccctacccca tgatctgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atcagcccca gcggcggcag cacccactac 180
gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgcgc cagaggcggc 300
gacacctact tcgattactt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 179
<211> 645
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 179
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc ggctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacacta gtccattcat cactttcggc 300
cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 180
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 180
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatctgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 181
<211> 645
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 181
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctaccag gccagctccc tgcagagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacacca gccccttcat caccttcggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcggacc gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360
cccagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtgg tctgcctgct gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480
caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540
accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600
ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645
<210> 182
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 182
gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt cacattcagc ccctacccca tgatgtgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atcagcccca gcggcggcag cacccactac 180
gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgcgc cagaggcggc 300
gacacctact tcgattactt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 183
<211> 645
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 183
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacacta gtccattcat cactttcggc 300
cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 184
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 184
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 185
<211> 645
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 185
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctatgcc gccagctctc tgcagagcgg agtgcccagc 180
agattttctg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacagca cccccggcat cacatttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcggaca gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360
cctagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtcg tgtgcctgct gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaatg ccctgcagtc cggcaactcc 480
caggaaagcg tcaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540
accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600
ggcctgtcta gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgt 645
<210> 186
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 186
gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc ccctacccta tgatgtgggt ccgacaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtcctac atctctccca gcggcggcag cacccactac 180
gccgattctg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcggc 300
gacacctact tcgattactt cgactactgg ggccagggca ccctggtcac cgtgtcatct 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
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cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 187
<211> 645
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 187
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
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gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctactcta gtccagggat cactttcggc 300
cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
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caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 188
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 188
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
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ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacgtatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
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ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 189
<211> 651
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 189
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120
aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 180
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ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
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accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 190
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 190
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacgtatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660
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cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
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ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 191
<211> 651
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 191
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120
aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 180
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240
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ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
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accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 192
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 192
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
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ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660
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cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 193
<211> 651
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 193
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcggct atttaaattg gtatcagcag 120
aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tataacgcat ccagtttgca aagtggggtc 180
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240
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ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
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accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 194
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 194
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatctgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
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cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
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gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
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cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 195
<211> 651
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 195
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120
aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tataacgcat ccagtttgca aagtggggtc 180
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ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
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catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 196
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 196
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 197
<211> 651
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 197
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcggct atttaaattg gtatcagcag 120
aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tataacgcat ccagtttgca aagtggggtc 180
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240
caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagct acactagtcc agggatcact 300
ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 198
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 198
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 199
<211> 651
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 199
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120
aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tataacgcat ccagtttgca aagtggggtc 180
ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240
caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagct acactagtcc attcatcact 300
ttcggccctg ggaccaaggt ggagatcaaa cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc 600
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651
<210> 200
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 200
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 201
<211> 654
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 201
gatatcgtgc tgacacagtc tcccgccagc ctggccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60
atcagctgcc gggccaacaa gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcactggtat 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgattaagt acgccagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc tctggcaccg acttcatcct gaacatccac 240
cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc acagcagaga gctgcccttc 300
accttcggca gcggcaccaa gctggaaatc aagcgggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360
atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420
aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480
aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540
agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600
acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654
<210> 202
<211> 1350
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 202
caggtgcagc tgcagcagtc tggccctgaa gtcgtgcggc ctggcgtgtc cgtgaagatc 60
agctgcaagg gcagcggcta caccttcacc gactacggca tccactgggt caagcagagc 120
cacgccaaga gcctggaatg gatcggcgtg atcagcacct acaacggcta caccaactac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccatg accgtggaca agagcagcag caccgcctac 240
atggaactgg cccggctgac cagcgaggac agcgccatct actactgcgc cagagcctac 300
tacggcaacc tgtactacgc catggactac tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgtcc 360
tctgccaaga ccaccgcccc tagcgtgtac cctctggccc ctgtgtgtgg cgacaccacc 420
ggcagctctg tgactctggg ctgcctggtc aagggctact tccccgagcc cgtgacactg 480
acctggaaca gcggcagcct gagcagcggc gtgcacacct ttccagccgt gctgcagagc 540
gacctgtaca ccctgagcag ctccgtgacc gtgacaagca gcacctggcc cagccagagc 600
atcacctgta acgtggccca ccccgccagc agcaccaagg tggacaagaa gatcgagccc 660
agaggcccca ccatcaagcc ctgcccccct tgcaagtgcc cagcccccaa tctgctgggc 720
ggacccagcg tgttcatctt cccacccaag atcaaggacg tgctgatgat cagcctgagc 780
cccatcgtga cctgcgtggt ggtggacgtg tccgaggacg accccgacgt gcagatcagt 840
tggttcgtga acaacgtgga agtgcacacc gcccagaccc agacccacag agaggactac 900
aacagcaccc tgcgggtggt gtccgccctg cccatccagc accaggactg gatgagcggc 960
aaagaattca agtgcaaagt gaacaacaag gacctgcctg cccccatcga gcggaccatc 1020
agcaagccca agggcagcgt gcgggctccc caggtgtacg tgctgccccc acccgaggaa 1080
gagatgacca agaagcaggt cacactgacc tgcatggtca ccgacttcat gcccgaggac 1140
atctacgtgg aatggaccaa caacggcaag accgagctga actacaagaa caccgagcct 1200
gtgctggaca gcgacggcag ctacttcatg tacagcaagc tgcgggtgga aaagaaaaac 1260
tgggtggaac ggaacagcta cagctgcagc gtggtgcacg agggcctgca caaccaccac 1320
accaccaaga gcttcagccg gacccccggc 1350
<210> 203
<211> 654
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 203
gatatcgtgc tgacacagag ccccgccagc ctgaccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60
atcagctgcc gggccagcca gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcagtggtat 120
cagcagcggc ctggccagcc ccccaagctg ctgattaagt acgccaccaa cctggacagc 180
ggcgtgcccg ccagattttc tggcagcggc agcggcacag acttcaccct gaacatccac 240
cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc acagctggga gatcccttac 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360
atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420
aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480
aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540
agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600
acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654
<210> 204
<211> 1344
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 204
gaagtgaagc tggaagagtc tggcggcgga ctggtccagc ctggcggcag catgaagctg 60
agctgcgtgg ccagcggctt caccttcaac aactactgga tgagctgggt ccgacagagc 120
cccgagaagg gcctggaatg gctggccgag atccggctga agtccgacaa ctacgccacc 180
cactacgccg agagcgtgaa gggcaagttc accatcagcc gggacgacag caagagccgg 240
ctgtacctgc agatgaacaa cctgcgggcc gagaacaccg gcatctacta ctgcaccggc 300
ggcttcgccg actacttcga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gtcctctgcc 360
aagaccaccg cccctagcgt gtaccctctg gcccctgtgt gtggcgacac caccggcagc 420
tctgtgactc tgggctgcct ggtcaagggc tacttccccg agcccgtgac actgacctgg 480
aacagcggca gcctgagcag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcgacctg 540
tacaccctga gcagctccgt gaccgtgaca agcagcacct ggcccagcca gagcatcacc 600
tgtaacgtgg cccaccccgc cagcagcacc aaggtggaca agaagatcga gcccagaggc 660
cccaccatca agccctgccc cccttgcaag tgcccagccc ccaatctgct gggcggaccc 720
agcgtgttca tcttcccacc caagatcaag gacgtgctga tgatcagcct gagccccatc 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtccgag gacgaccccg acgtgcagat cagttggttc 840
gtgaacaacg tggaagtgca caccgcccag acccagaccc acagagagga ctacaacagc 900
accctgcggg tggtgtccgc cctgcccatc cagcaccagg actggatgag cggcaaagaa 960
ttcaagtgca aagtgaacaa caaggacctg cctgccccca tcgagcggac catcagcaag 1020
cccaagggca gcgtgcgggc tccccaggtg tacgtgctgc ccccacccga ggaagagatg 1080
accaagaagc aggtcacact gacctgcatg gtcaccgact tcatgcccga ggacatctac 1140
gtggaatgga ccaacaacgg caagaccgag ctgaactaca agaacaccga gcctgtgctg 1200
gacagcgacg gcagctactt catgtacagc aagctgcggg tggaaaagaa aaactgggtg 1260
gaacggaaca gctacagctg cagcgtggtg cacgagggcc tgcacaacca ccacaccacc 1320
aagagcttca gccggacccc cggc 1344
<210> 205
<211> 654
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 205
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ctggctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaaat atgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttctccct caacatccat 240
cccatggagg aggacgatac cgcaatgtat ttctgtcagc acagtaggga gcttccattc 300
acgttcggcg gagggacaaa gttggaaata aaacgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 360
atcttcccac ccagcgacga gcagctgaag tccggcaccg ccagcgtcgt gtgcctgctg 420
aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 480
ggcaacagcc aggaaagcgt caccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgtcc 540
agcaccctga ccctgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 600
acccaccagg gcctgagcag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654
<210> 206
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 206
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg gttccggcta cacattcact gattatggca tgcactgggt gcggcaggcc 120
cctggacaag ggctagagtg gatgggagtt attagtactt acaatggtta tacaaactac 180
aaccagaagt ttaagggcag agtcacaatg actgtagaca aatccacgag cacagcctat 240
atggaacttc ggagcttgag atctgacgat acggccgtgt attactgtgc aagagcctac 300
tatggcaacc tttactatgc tatggactac tggggtcaag gaaccctggt caccgtctcc 360
tcagctagca ccaaaggccc gagcgtgttt ccgctggccc cgagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggaacag ccgccctggg ctgcctggtg aaagactact tccccgaacc ggtgaccgtg 480
tcctggaact ctggcgccct gaccagcgga gtgcatacct tccccgccgt gctgcagagc 540
agcggcctgt acagcctgag cagcgtggtg acagtgccca gcagcagcct gggaacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggaa 660
cccaagagct gcgacaagac ccacacctgt cccccctgcc ctgcccctga actgctgggc 720
ggacccagcg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 780
cccgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg tcccacgagg acccagaagt gaagtttaat 840
tggtacgtgg acggcgtgga agtgcataac gccaagacca agcccagaga ggaacagtac 900
aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960
aaagagtaca agtgcaaggt ctccaacaag gccctgcctg cccccatcga gaaaaccatc 1020
agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caggtgtaca cactgccccc cagccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga aaggcttcta ccccagcgat 1140
atcgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca attacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc 1350
<210> 207
<211> 654
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 207
gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcactggtat 120
cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgattaagt acgccagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgccca gccggtttag cggctctggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agtctgcagc ccgaggactt cgccacctac tactgccagc acagctggga gatcccttac 300
accttcggcg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480
ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cgctgtctaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654
<210> 208
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 208
caggtggaat tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctactgga tgagctgggt ccgacaggct 120
ccaggcaagg gcctggaatg ggtggccgag atccggctga agtccgacaa ctacgccacc 180
cactacgccg agagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacagc 240
ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccggc 300
tactacgccg acgccatgga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt cagctcagcc 360
tccaccaagg gtccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagcgggt tgagcccaaa 660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccggg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaagagatg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210> 209
<211> 654
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 209
gatatcgtgc tgacacagtc tcccgccagc ctggccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60
atcagctgca aggccagcca gagcgtgtcc accagcacct acagctacat gcagtggtat 120
cagcagcggc ctggacagag ccccaagctg ctgattaagt acgccagcaa gctggacagc 180
ggcgtgcccg ccagattttc tggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaacatccac 240
cccgtggaag aagaggacac cgccacctac tactgccagc acagctggga gctgccctac 300
accttcggcg gaggcacccg gctggaaatc aagagggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360
atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420
aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480
aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540
agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600
acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654
<210> 210
<211> 1344
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 210
gaagtgaagc tgggagagtc tggcggcgga ctggtccagc ctggcggcag catgaagctg 60
agctgcgtgg ccagcggctt cccattcacc aaatactgga tgaactgggt ccgacagagc 120
cccgagaagg gcctggaatg ggtggccgag atccggctga agtccgacaa ctacgccacc 180
cactacgccg agagcgccaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag ccggtccagc 240
gtgtacctgc agatgaacaa cctgcgggcc gaggacaccg ccatctacta ctgcagcccc 300
acctatgccg acaccatgga ctactggggc cagggcacca gcgtgacagt gtccagcgcc 360
aagaccaccg cccctagcgt gtaccctctg gcccctgtgt gtggcgacac caccggcagc 420
tctgtgactc tgggctgcct ggtcaagggc tacttccccg agcccgtgac actgacctgg 480
aacagcggca gcctgagcag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcgacctg 540
tacaccctga gcagctccgt gaccgtgaca agcagcacct ggcccagcca gagcatcacc 600
tgtaacgtgg cccaccccgc cagcagcacc aaggtggaca agaagatcga gcccagaggc 660
cccaccatca agccctgccc cccttgcaag tgcccagccc ccaatctgct gggcggaccc 720
agcgtgttca tcttcccacc caagatcaag gacgtgctga tgatcagcct gagccccatc 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtccgag gacgaccccg acgtgcagat cagttggttc 840
gtgaacaacg tggaagtgca caccgcccag acccagaccc acagagagga ctacaacagc 900
accctgcggg tggtgtccgc cctgcccatc cagcaccagg actggatgag cggcaaagaa 960
ttcaagtgca aagtgaacaa caaggacctg cctgccccca tcgagcggac catcagcaag 1020
cccaagggca gcgtgcgggc tccccaggtg tacgtgctgc ccccacccga ggaagagatg 1080
accaagaagc aggtcacact gacctgcatg gtcaccgact tcatgcccga ggacatctac 1140
gtggaatgga ccaacaacgg caagaccgag ctgaactaca agaacaccga gcctgtgctg 1200
gacagcgacg gcagctactt catgtacagc aagctgcggg tggaaaagaa aaactgggtg 1260
gaacggaaca gctacagctg cagcgtggtg cacgagggcc tgcacaacca ccacaccacc 1320
aagagcttca gccggacccc cggc 1344
<210> 211
<211> 654
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 211
gatatcgtgc tgacacagtc tcccgccagc ctggccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60
atcagctgcc gggccagcaa gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcactggtat 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatcaagt acaccagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgcccg ccagattcag cggaagcggc tccggcaccg acttcatcct gaacatccac 240
cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc acagcagaga gctgccctgg 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360
atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420
aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480
aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540
agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600
acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654
<210> 212
<211> 1353
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus Musculus）
<400> 212
caggtgtccc tgaaagagag cggccctggc atcctgcagc ctagccagac cctgagcctg 60
acctgcagct tcagcggctt cagcctgagc accagcggca tgggcgtgtc ctggatcaga 120
cagcccagcg gcaagggcct ggaatggctg gcccacatct actgggacga cgacaagcgg 180
tacaacccca gcctgaagtc ccggctgacc atctccaagg acaccagccg gaatcaggtg 240
ttcctgaaga tcaccagcgt ggacaccgcc gataccgcca cctactactg cgccagaaga 300
ggccccgact actacggcta ctaccccatg gactattggg gccagggcac cagcgtgacc 360
gtgtctgcca agaccaccgc ccctagcgtg taccctctgg cccctgtgtg tggcgacacc 420
accggcagct ctgtgactct gggctgcctg gtcaagggct acttccccga gcccgtgaca 480
ctgacctgga acagcggcag cctgagcagc ggcgtgcaca cctttccagc cgtgctgcag 540
agcgacctgt acaccctgag cagctccgtg accgtgacaa gcagcacctg gcccagccag 600
agcatcacct gtaacgtggc ccaccccgcc agcagcacca aggtggacaa gaagatcgag 660
cccagaggcc ccaccatcaa gccctgcccc ccttgcaagt gcccagcccc caatctgctg 720
ggcggaccca gcgtgttcat cttcccaccc aagatcaagg acgtgctgat gatcagcctg 780
agccccatcg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtccgagg acgaccccga cgtgcagatc 840
agttggttcg tgaacaacgt ggaagtgcac accgcccaga cccagaccca cagagaggac 900
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgcc ctgcccatcc agcaccagga ctggatgagc 960
ggcaaagaat tcaagtgcaa agtgaacaac aaggacctgc ctgcccccat cgagcggacc 1020
atcagcaagc ccaagggcag cgtgcgggct ccccaggtgt acgtgctgcc cccacccgag 1080
gaagagatga ccaagaagca ggtcacactg acctgcatgg tcaccgactt catgcccgag 1140
gacatctacg tggaatggac caacaacggc aagaccgagc tgaactacaa gaacaccgag 1200
cctgtgctgg acagcgacgg cagctacttc atgtacagca agctgcgggt ggaaaagaaa 1260
aactgggtgg aacggaacag ctacagctgc agcgtggtgc acgagggcct gcacaaccac 1320
cacaccacca agagcttcag ccggaccccc ggc 1353
<210> 213
<211> 1210
<212> PRT
<213> Homo
<400> 213
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385 390 395 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465 470 475 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
500 505 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
690 695 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705 710 715 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725 730 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
770 775 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785 790 795 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
805 810 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
820 825 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835 840 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865 870 875 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
915 920 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
930 935 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945 950 955 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
965 970 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980 985 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995 1000 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe
1010 1015 1020
Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala
1025 1030 1035 1040
Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln
1045 1050 1055
Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp
1060 1065 1070
Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro
1075 1080 1085
Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser
1090 1095 1100
Val Gln Asn Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser
1105 1110 1115 1120
Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro
1125 1130 1135
Glu Tyr Leu Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp
1140 1145 1150
Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp
1155 1160 1165
Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn
1170 1175 1180
Gly Ile Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val
1185 1190 1195 1200
Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
1205 1210
<210> 214
<211> 622
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 214
Met Ala Leu Pro Thr Ala Arg Pro Leu Leu Gly Ser Cys Gly Thr Pro
1 5 10 15
Ala Leu Gly Ser Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Leu Gly Trp Val Gln
20 25 30
Pro Ser Arg Thr Leu Ala Gly Glu Thr Gly Gln Glu Ala Ala Pro Leu
35 40 45
Asp Gly Val Leu Ala Asn Pro Pro Asn Ile Ser Ser Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Gln Leu Leu Gly Phe Pro Cys Ala Glu Val Ser Gly Leu Ser Thr Glu
65 70 75 80
Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Ala Leu Ala Gln Lys Asn Val Lys Leu
85 90 95
Ser Thr Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro Pro
100 105 110
Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn Pro
115 120 125
Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg Ile
130 135 140
Thr Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg Gln
145 150 155 160
Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser Leu
165 170 175
Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp Leu
180 185 190
Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg Leu
195 200 205
Val Ser Cys Pro Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Ala Arg
210 215 220
Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Trp
225 230 235 240
Ser Val Ser Thr Met Asp Ala Leu Arg Gly Leu Leu Pro Val Leu Gly
245 250 255
Gln Pro Ile Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Val Ala Ala Trp Arg
260 265 270
Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr Ile
275 280 285
Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser
290 295 300
Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys
305 310 315 320
Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met
325 330 335
Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu
340 345 350
Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val
355 360 365
Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile
370 375 380
Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu
385 390 395 400
Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile Asp
405 410 415
Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp Thr
420 425 430
Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu Glu
435 440 445
Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln Asp
450 455 460
Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys Ala
465 470 475 480
Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys Ile
485 490 495
Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu Ser
500 505 510
Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg Thr
515 520 525
Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu Gly
530 535 540
Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val Arg
545 550 555 560
Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly Leu
565 570 575
Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu Ser
580 585 590
Met Gln Glu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly Pro
595 600 605
Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala
610 615 620
<210> 215
<211> 459
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 215
Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Val Pro Val His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro
35 40 45
Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp
50 55 60
Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu
65 70 75 80
Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro
85 90 95
Glu Val Lys Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp
100 105 110
Leu Pro Thr Val Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Glu Pro Gln Asn Asn
115 120 125
Ala His Arg Asp Lys Glu Gly Asp Asp Gln Ser His Trp Arg Tyr Gly
130 135 140
Gly Asp Pro Pro Trp Pro Arg Val Ser Pro Ala Cys Ala Gly Arg Phe
145 150 155 160
Gln Ser Pro Val Asp Ile Arg Pro Gln Leu Ala Ala Phe Cys Pro Ala
165 170 175
Leu Arg Pro Leu Glu Leu Leu Gly Phe Gln Leu Pro Pro Leu Pro Glu
180 185 190
Leu Arg Leu Arg Asn Asn Gly His Ser Val Gln Leu Thr Leu Pro Pro
195 200 205
Gly Leu Glu Met Ala Leu Gly Pro Gly Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gln
210 215 220
Leu His Leu His Trp Gly Ala Ala Gly Arg Pro Gly Ser Glu His Thr
225 230 235 240
Val Glu Gly His Arg Phe Pro Ala Glu Ile His Val Val His Leu Ser
245 250 255
Thr Ala Phe Ala Arg Val Asp Glu Ala Leu Gly Arg Pro Gly Gly Leu
260 265 270
Ala Val Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gly Pro Glu Glu Asn Ser Ala
275 280 285
Tyr Glu Gln Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu Ile Ala Glu Glu Gly Ser
290 295 300
Glu Thr Gln Val Pro Gly Leu Asp Ile Ser Ala Leu Leu Pro Ser Asp
305 310 315 320
Phe Ser Arg Tyr Phe Gln Tyr Glu Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys
325 330 335
Ala Gln Gly Val Ile Trp Thr Val Phe Asn Gln Thr Val Met Leu Ser
340 345 350
Ala Lys Gln Leu His Thr Leu Ser Asp Thr Leu Trp Gly Pro Gly Asp
355 360 365
Ser Arg Leu Gln Leu Asn Phe Arg Ala Thr Gln Pro Leu Asn Gly Arg
370 375 380
Val Ile Glu Ala Ser Phe Pro Ala Gly Val Asp Ser Ser Pro Arg Ala
385 390 395 400
Ala Glu Pro Val Gln Leu Asn Ser Cys Leu Ala Ala Gly Asp Ile Leu
405 410 415
Ala Leu Val Phe Gly Leu Leu Phe Ala Val Thr Ser Val Ala Phe Leu
420 425 430
Val Gln Met Arg Arg Gln His Arg Arg Gly Thr Lys Gly Gly Val Ser
435 440 445
Tyr Arg Pro Ala Glu Val Ala Glu Thr Gly Ala
450 455
<210> 216
<211> 346
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 216
Met Asp Pro Ala Arg Lys Ala Gly Ala Gln Ala Met Ile Trp Thr Ala
1 5 10 15
Gly Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Gly Ala Gln Ala Leu Glu
20 25 30
Cys Tyr Ser Cys Val Gln Lys Ala Asp Asp Gly Cys Ser Pro Asn Lys
35 40 45
Met Lys Thr Val Lys Cys Ala Pro Gly Val Asp Val Cys Thr Glu Ala
50 55 60
Val Gly Ala Val Glu Thr Ile His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Arg
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Gly Leu Pro Gly Lys Asn Asp Arg Gly Leu Asp Leu
85 90 95
His Gly Leu Leu Ala Phe Ile Gln Leu Gln Gln Cys Ala Gln Asp Arg
100 105 110
Cys Asn Ala Lys Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ala Leu Asp Pro Ala Gly
115 120 125
Asn Glu Ser Ala Tyr Pro Pro Asn Gly Val Glu Cys Tyr Ser Cys Val
130 135 140
Gly Leu Ser Arg Glu Ala Cys Gln Gly Thr Ser Pro Pro Val Val Ser
145 150 155 160
Cys Tyr Asn Ala Ser Asp His Val Tyr Lys Gly Cys Phe Asp Gly Asn
165 170 175
Val Thr Leu Thr Ala Ala Asn Val Thr Val Ser Leu Pro Val Arg Gly
180 185 190
Cys Val Gln Asp Glu Phe Cys Thr Arg Asp Gly Val Thr Gly Pro Gly
195 200 205
Phe Thr Leu Ser Gly Ser Cys Cys Gln Gly Ser Arg Cys Asn Ser Asp
210 215 220
Leu Arg Asn Lys Thr Tyr Phe Ser Pro Arg Ile Pro Pro Leu Val Arg
225 230 235 240
Leu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Thr Val Ala Ser Thr Thr Ser Val Thr
245 250 255
Thr Ser Thr Ser Ala Pro Val Arg Pro Thr Ser Thr Thr Lys Pro Met
260 265 270
Pro Ala Pro Thr Ser Gln Thr Pro Arg Gln Gly Val Glu His Glu Ala
275 280 285
Ser Arg Asp Glu Glu Pro Arg Leu Thr Gly Gly Ala Ala Gly His Gln
290 295 300
Asp Arg Ser Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Ala Lys Gly Gly Pro Gln Gln
305 310 315 320
Pro His Asn Lys Gly Cys Val Ala Pro Thr Ala Gly Leu Ala Ala Leu
325 330 335
Leu Leu Ala Val Ala Ala Gly Val Leu Leu
340 345
<210> 217
<211> 61
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 217
Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Val Gln Ile Gln Thr Gly Leu Ser Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr
20 25 30
Ser Ser Pro Ser Ala Ser Ser Asn Ile Ser Gly Gly Ile Phe Leu Phe
35 40 45
Phe Val Ala Asn Ala Ile Ile His Leu Phe Cys Phe Ser
50 55 60
<210> 218
<211> 1255
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 218
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe
385 390 395 400
Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro
405 410 415
Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg
420 425 430
Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu
435 440 445
Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly
450 455 460
Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val
465 470 475 480
Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr
485 490 495
Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His
500 505 510
Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys
515 520 525
Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys
530 535 540
Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys
545 550 555 560
Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys
565 570 575
Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp
580 585 590
Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu
595 600 605
Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln
610 615 620
Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys
625 630 635 640
Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser
645 650 655
Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly
660 665 670
Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg
675 680 685
Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly
690 695 700
Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu
705 710 715 720
Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys
725 730 735
Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile
740 745 750
Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu
755 760 765
Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg
770 775 780
Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu
785 790 795 800
Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg
805 810 815
Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly
820 825 830
Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala
835 840 845
Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe
850 855 860
Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp
865 870 875 880
Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg
885 890 895
Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val
900 905 910
Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala
915 920 925
Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro
930 935 940
Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met
945 950 955 960
Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe
965 970 975
Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu
980 985 990
Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu
995 1000 1005
Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr Leu
1010 1015 1020
Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly
1025 1030 1035 1040
Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly
1045 1050 1055
Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg
1060 1065 1070
Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly
1075 1080 1085
Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His
1090 1095 1100
Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu
1105 1110 1115 1120
Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln
1125 1130 1135
Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro
1140 1145 1150
Arg Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu
1155 1160 1165
Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val
1170 1175 1180
Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln
1185 1190 1195 1200
Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala
1205 1210 1215
Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala
1220 1225 1230
Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr
1235 1240 1245
Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1250 1255
<210> 219
<211> 297
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 219
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 220
<211> 595
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 220
Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn
20 25 30
Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys
35 40 45
Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp
50 55 60
Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg
65 70 75 80
Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr
85 90 95
Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met
100 105 110
Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His
115 120 125
Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln
130 135 140
Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys
145 150 155 160
Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln
165 170 175
Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met
180 185 190
Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu
195 200 205
Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp
210 215 220
Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys
225 230 235 240
Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys
245 250 255
Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro
260 265 270
Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile
275 280 285
Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Arg Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro
290 295 300
Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys
305 310 315 320
Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn
325 330 335
Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln
340 345 350
Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr
355 360 365
Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala
370 375 380
Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly
385 390 395 400
Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile
405 410 415
Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys
420 425 430
Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg
435 440 445
Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met
450 455 460
Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu
465 470 475 480
Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser
485 490 495
Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn
500 505 510
Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly
515 520 525
Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala
530 535 540
Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr
545 550 555 560
Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met
565 570 575
Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala
580 585 590
Ser Gly Lys
595
<210> 221
<211> 847
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 221
Met His Leu Leu Gly Pro Trp Leu Leu Leu Leu Val Leu Glu Tyr Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ser Asp Ser Ser Lys Trp Val Phe Glu His Pro Glu Thr Leu
20 25 30
Tyr Ala Trp Glu Gly Ala Cys Val Trp Ile Pro Cys Thr Tyr Arg Ala
35 40 45
Leu Asp Gly Asp Leu Glu Ser Phe Ile Leu Phe His Asn Pro Glu Tyr
50 55 60
Asn Lys Asn Thr Ser Lys Phe Asp Gly Thr Arg Leu Tyr Glu Ser Thr
65 70 75 80
Lys Asp Gly Lys Val Pro Ser Glu Gln Lys Arg Val Gln Phe Leu Gly
85 90 95
Asp Lys Asn Lys Asn Cys Thr Leu Ser Ile His Pro Val His Leu Asn
100 105 110
Asp Ser Gly Gln Leu Gly Leu Arg Met Glu Ser Lys Thr Glu Lys Trp
115 120 125
Met Glu Arg Ile His Leu Asn Val Ser Glu Arg Pro Phe Pro Pro His
130 135 140
Ile Gln Leu Pro Pro Glu Ile Gln Glu Ser Gln Glu Val Thr Leu Thr
145 150 155 160
Cys Leu Leu Asn Phe Ser Cys Tyr Gly Tyr Pro Ile Gln Leu Gln Trp
165 170 175
Leu Leu Glu Gly Val Pro Met Arg Gln Ala Ala Val Thr Ser Thr Ser
180 185 190
Leu Thr Ile Lys Ser Val Phe Thr Arg Ser Glu Leu Lys Phe Ser Pro
195 200 205
Gln Trp Ser His His Gly Lys Ile Val Thr Cys Gln Leu Gln Asp Ala
210 215 220
Asp Gly Lys Phe Leu Ser Asn Asp Thr Val Gln Leu Asn Val Lys His
225 230 235 240
Thr Pro Lys Leu Glu Ile Lys Val Thr Pro Ser Asp Ala Ile Val Arg
245 250 255
Glu Gly Asp Ser Val Thr Met Thr Cys Glu Val Ser Ser Ser Asn Pro
260 265 270
Glu Tyr Thr Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Thr Ser Leu Lys Lys
275 280 285
Gln Asn Thr Phe Thr Leu Asn Leu Arg Glu Val Thr Lys Asp Gln Ser
290 295 300
Gly Lys Tyr Cys Cys Gln Val Ser Asn Asp Val Gly Pro Gly Arg Ser
305 310 315 320
Glu Glu Val Phe Leu Gln Val Gln Tyr Ala Pro Glu Pro Ser Thr Val
325 330 335
Gln Ile Leu His Ser Pro Ala Val Glu Gly Ser Gln Val Glu Phe Leu
340 345 350
Cys Met Ser Leu Ala Asn Pro Leu Pro Thr Asn Tyr Thr Trp Tyr His
355 360 365
Asn Gly Lys Glu Met Gln Gly Arg Thr Glu Glu Lys Val His Ile Pro
370 375 380
Lys Ile Leu Pro Trp His Ala Gly Thr Tyr Ser Cys Val Ala Glu Asn
385 390 395 400
Ile Leu Gly Thr Gly Gln Arg Gly Pro Gly Ala Glu Leu Asp Val Gln
405 410 415
Tyr Pro Pro Lys Lys Val Thr Thr Val Ile Gln Asn Pro Met Pro Ile
420 425 430
Arg Glu Gly Asp Thr Val Thr Leu Ser Cys Asn Tyr Asn Ser Ser Asn
435 440 445
Pro Ser Val Thr Arg Tyr Glu Trp Lys Pro His Gly Ala Trp Glu Glu
450 455 460
Pro Ser Leu Gly Val Leu Lys Ile Gln Asn Val Gly Trp Asp Asn Thr
465 470 475 480
Thr Ile Ala Cys Ala Ala Cys Asn Ser Trp Cys Ser Trp Ala Ser Pro
485 490 495
Val Ala Leu Asn Val Gln Tyr Ala Pro Arg Asp Val Arg Val Arg Lys
500 505 510
Ile Lys Pro Leu Ser Glu Ile His Ser Gly Asn Ser Val Ser Leu Gln
515 520 525
Cys Asp Phe Ser Ser Ser His Pro Lys Glu Val Gln Phe Phe Trp Glu
530 535 540
Lys Asn Gly Arg Leu Leu Gly Lys Glu Ser Gln Leu Asn Phe Asp Ser
545 550 555 560
Ile Ser Pro Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val Asn Asn Ser
565 570 575
Ile Gly Gln Thr Ala Ser Lys Ala Trp Thr Leu Glu Val Leu Tyr Ala
580 585 590
Pro Arg Arg Leu Arg Val Ser Met Ser Pro Gly Asp Gln Val Met Glu
595 600 605
Gly Lys Ser Ala Thr Leu Thr Cys Glu Ser Asp Ala Asn Pro Pro Val
610 615 620
Ser His Tyr Thr Trp Phe Asp Trp Asn Asn Gln Ser Leu Pro Tyr His
625 630 635 640
Ser Gln Lys Leu Arg Leu Glu Pro Val Lys Val Gln His Ser Gly Ala
645 650 655
Tyr Trp Cys Gln Gly Thr Asn Ser Val Gly Lys Gly Arg Ser Pro Leu
660 665 670
Ser Thr Leu Thr Val Tyr Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Gly Arg Arg Val
675 680 685
Ala Val Gly Leu Gly Ser Cys Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Ile Cys
690 695 700
Gly Leu Lys Leu Gln Arg Arg Trp Lys Arg Thr Gln Ser Gln Gln Gly
705 710 715 720
Leu Gln Glu Asn Ser Ser Gly Gln Ser Phe Phe Val Arg Asn Lys Lys
725 730 735
Val Arg Arg Ala Pro Leu Ser Glu Gly Pro His Ser Leu Gly Cys Tyr
740 745 750
Asn Pro Met Met Glu Asp Gly Ile Ser Tyr Thr Thr Leu Arg Phe Pro
755 760 765
Glu Met Asn Ile Pro Arg Thr Gly Asp Ala Glu Ser Ser Glu Met Gln
770 775 780
Arg Pro Pro Pro Asp Cys Asp Asp Thr Val Thr Tyr Ser Ala Leu His
785 790 795 800
Lys Arg Gln Val Gly Asp Tyr Glu Asn Val Ile Pro Asp Phe Pro Glu
805 810 815
Asp Glu Gly Ile His Tyr Ser Glu Leu Ile Gln Phe Gly Val Gly Glu
820 825 830
Arg Pro Gln Ala Gln Glu Asn Val Asp Tyr Val Ile Leu Lys His
835 840 845
<210> 222
<211> 364
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 222
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln
20 25 30
Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro
35 40 45
Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly
50 55 60
Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln
65 70 75 80
Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro
85 90 95
Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp
100 105 110
Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser
115 120 125
Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg
130 135 140
Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn
145 150 155 160
Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile
165 170 175
Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr
180 185 190
His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr
195 200 205
Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu
210 215 220
Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly
245 250 255
Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys
275 280 285
Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly
290 295 300
Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr
305 310 315 320
Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu
325 330 335
Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys
340 345 350
Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln
355 360
<210> 223
<211> 572
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 223
Met Glu Cys Leu Tyr Tyr Phe Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Ala Arg
1 5 10 15
Leu Pro Leu Asp Ala Ala Lys Arg Phe His Asp Val Leu Gly Asn Glu
20 25 30
Arg Pro Ser Ala Tyr Met Arg Glu His Asn Gln Leu Asn Gly Trp Ser
35 40 45
Ser Asp Glu Asn Asp Trp Asn Glu Lys Leu Tyr Pro Val Trp Lys Arg
50 55 60
Gly Asp Met Arg Trp Lys Asn Ser Trp Lys Gly Gly Arg Val Gln Ala
65 70 75 80
Val Leu Thr Ser Asp Ser Pro Ala Leu Val Gly Ser Asn Ile Thr Phe
85 90 95
Ala Val Asn Leu Ile Phe Pro Arg Cys Gln Lys Glu Asp Ala Asn Gly
100 105 110
Asn Ile Val Tyr Glu Lys Asn Cys Arg Asn Glu Ala Gly Leu Ser Ala
115 120 125
Asp Pro Tyr Val Tyr Asn Trp Thr Ala Trp Ser Glu Asp Ser Asp Gly
130 135 140
Glu Asn Gly Thr Gly Gln Ser His His Asn Val Phe Pro Asp Gly Lys
145 150 155 160
Pro Phe Pro His His Pro Gly Trp Arg Arg Trp Asn Phe Ile Tyr Val
165 170 175
Phe His Thr Leu Gly Gln Tyr Phe Gln Lys Leu Gly Arg Cys Ser Val
180 185 190
Arg Val Ser Val Asn Thr Ala Asn Val Thr Leu Gly Pro Gln Leu Met
195 200 205
Glu Val Thr Val Tyr Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr Val Pro Ile Ala
210 215 220
Gln Val Lys Asp Val Tyr Val Val Thr Asp Gln Ile Pro Val Phe Val
225 230 235 240
Thr Met Phe Gln Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu
245 250 255
Lys Asp Leu Pro Ile Met Phe Asp Val Leu Ile His Asp Pro Ser His
260 265 270
Phe Leu Asn Tyr Ser Thr Ile Asn Tyr Lys Trp Ser Phe Gly Asp Asn
275 280 285
Thr Gly Leu Phe Val Ser Thr Asn His Thr Val Asn His Thr Tyr Val
290 295 300
Leu Asn Gly Thr Phe Ser Leu Asn Leu Thr Val Lys Ala Ala Ala Pro
305 310 315 320
Gly Pro Cys Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ser Lys Pro Thr
325 330 335
Pro Ser Leu Ala Thr Thr Leu Lys Ser Tyr Asp Ser Asn Thr Pro Gly
340 345 350
Pro Ala Gly Asp Asn Pro Leu Glu Leu Ser Arg Ile Pro Asp Glu Asn
355 360 365
Cys Gln Ile Asn Arg Tyr Gly His Phe Gln Ala Thr Ile Thr Ile Val
370 375 380
Glu Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gln Met Thr Asp Val Leu Met
385 390 395 400
Pro Val Pro Trp Pro Glu Ser Ser Leu Ile Asp Phe Val Val Thr Cys
405 410 415
Gln Gly Ser Ile Pro Thr Glu Val Cys Thr Ile Ile Ser Asp Pro Thr
420 425 430
Cys Glu Ile Thr Gln Asn Thr Val Cys Ser Pro Val Asp Val Asp Glu
435 440 445
Met Cys Leu Leu Thr Val Arg Arg Thr Phe Asn Gly Ser Gly Thr Tyr
450 455 460
Cys Val Asn Leu Thr Leu Gly Asp Asp Thr Ser Leu Ala Leu Thr Ser
465 470 475 480
Thr Leu Ile Ser Val Pro Asp Arg Asp Pro Ala Ser Pro Leu Arg Met
485 490 495
Ala Asn Ser Ala Leu Ile Ser Val Gly Cys Leu Ala Ile Phe Val Thr
500 505 510
Val Ile Ser Leu Leu Val Tyr Lys Lys His Lys Glu Tyr Asn Pro Ile
515 520 525
Glu Asn Ser Pro Gly Asn Val Val Arg Ser Lys Gly Leu Ser Val Phe
530 535 540
Leu Asn Arg Ala Lys Ala Val Phe Phe Pro Gly Asn Gln Glu Lys Asp
545 550 555 560
Pro Leu Leu Lys Asn Gln Glu Phe Lys Gly Val Ser
565 570
<210> 224
<211> 848
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 224
Met Leu Gln Thr Lys Asp Leu Ile Trp Thr Leu Phe Phe Leu Gly Thr
1 5 10 15
Ala Val Ser Leu Gln Val Asp Ile Val Pro Ser Gln Gly Glu Ile Ser
20 25 30
Val Gly Glu Ser Lys Phe Phe Leu Cys Gln Val Ala Gly Asp Ala Lys
35 40 45
Asp Lys Asp Ile Ser Trp Phe Ser Pro Asn Gly Glu Lys Leu Thr Pro
50 55 60
Asn Gln Gln Arg Ile Ser Val Val Trp Asn Asp Asp Ser Ser Ser Thr
65 70 75 80
Leu Thr Ile Tyr Asn Ala Asn Ile Asp Asp Ala Gly Ile Tyr Lys Cys
85 90 95
Val Val Thr Gly Glu Asp Gly Ser Glu Ser Glu Ala Thr Val Asn Val
100 105 110
Lys Ile Phe Gln Lys Leu Met Phe Lys Asn Ala Pro Thr Pro Gln Glu
115 120 125
Phe Arg Glu Gly Glu Asp Ala Val Ile Val Cys Asp Val Val Ser Ser
130 135 140
Leu Pro Pro Thr Ile Ile Trp Lys His Lys Gly Arg Asp Val Ile Leu
145 150 155 160
Lys Lys Asp Val Arg Phe Ile Val Leu Ser Asn Asn Tyr Leu Gln Ile
165 170 175
Arg Gly Ile Lys Lys Thr Asp Glu Gly Thr Tyr Arg Cys Glu Gly Arg
180 185 190
Ile Leu Ala Arg Gly Glu Ile Asn Phe Lys Asp Ile Gln Val Ile Val
195 200 205
Asn Val Pro Pro Thr Ile Gln Ala Arg Gln Asn Ile Val Asn Ala Thr
210 215 220
Ala Asn Leu Gly Gln Ser Val Thr Leu Val Cys Asp Ala Glu Gly Phe
225 230 235 240
Pro Glu Pro Thr Met Ser Trp Thr Lys Asp Gly Glu Gln Ile Glu Gln
245 250 255
Glu Glu Asp Asp Glu Lys Tyr Ile Phe Ser Asp Asp Ser Ser Gln Leu
260 265 270
Thr Ile Lys Lys Val Asp Lys Asn Asp Glu Ala Glu Tyr Ile Cys Ile
275 280 285
Ala Glu Asn Lys Ala Gly Glu Gln Asp Ala Thr Ile His Leu Lys Val
290 295 300
Phe Ala Lys Pro Lys Ile Thr Tyr Val Glu Asn Gln Thr Ala Met Glu
305 310 315 320
Leu Glu Glu Gln Val Thr Leu Thr Cys Glu Ala Ser Gly Asp Pro Ile
325 330 335
Pro Ser Ile Thr Trp Arg Thr Ser Thr Arg Asn Ile Ser Ser Glu Glu
340 345 350
Lys Thr Leu Asp Gly His Met Val Val Arg Ser His Ala Arg Val Ser
355 360 365
Ser Leu Thr Leu Lys Ser Ile Gln Tyr Thr Asp Ala Gly Glu Tyr Ile
370 375 380
Cys Thr Ala Ser Asn Thr Ile Gly Gln Asp Ser Gln Ser Met Tyr Leu
385 390 395 400
Glu Val Gln Tyr Ala Pro Lys Leu Gln Gly Pro Val Ala Val Tyr Thr
405 410 415
Trp Glu Gly Asn Gln Val Asn Ile Thr Cys Glu Val Phe Ala Tyr Pro
420 425 430
Ser Ala Thr Ile Ser Trp Phe Arg Asp Gly Gln Leu Leu Pro Ser Ser
435 440 445
Asn Tyr Ser Asn Ile Lys Ile Tyr Asn Thr Pro Ser Ala Ser Tyr Leu
450 455 460
Glu Val Thr Pro Asp Ser Glu Asn Asp Phe Gly Asn Tyr Asn Cys Thr
465 470 475 480
Ala Val Asn Arg Ile Gly Gln Glu Ser Leu Glu Phe Ile Leu Val Gln
485 490 495
Ala Asp Thr Pro Ser Ser Pro Ser Ile Asp Gln Val Glu Pro Tyr Ser
500 505 510
Ser Thr Ala Gln Val Gln Phe Asp Glu Pro Glu Ala Thr Gly Gly Val
515 520 525
Pro Ile Leu Lys Tyr Lys Ala Glu Trp Arg Ala Val Gly Glu Glu Val
530 535 540
Trp His Ser Lys Trp Tyr Asp Ala Lys Glu Ala Ser Met Glu Gly Ile
545 550 555 560
Val Thr Ile Val Gly Leu Lys Pro Glu Thr Thr Tyr Ala Val Arg Leu
565 570 575
Ala Ala Leu Asn Gly Lys Gly Leu Gly Glu Ile Ser Ala Ala Ser Glu
580 585 590
Phe Lys Thr Gln Pro Val Gln Gly Glu Pro Ser Ala Pro Lys Leu Glu
595 600 605
Gly Gln Met Gly Glu Asp Gly Asn Ser Ile Lys Val Asn Leu Ile Lys
610 615 620
Gln Asp Asp Gly Gly Ser Pro Ile Arg His Tyr Leu Val Arg Tyr Arg
625 630 635 640
Ala Leu Ser Ser Glu Trp Lys Pro Glu Ile Arg Leu Pro Ser Gly Ser
645 650 655
Asp His Val Met Leu Lys Ser Leu Asp Trp Asn Ala Glu Tyr Glu Val
660 665 670
Tyr Val Val Ala Glu Asn Gln Gln Gly Lys Ser Lys Ala Ala His Phe
675 680 685
Val Phe Arg Thr Ser Ala Gln Pro Thr Ala Ile Pro Ala Asn Gly Ser
690 695 700
Pro Thr Ser Gly Leu Ser Thr Gly Ala Ile Val Gly Ile Leu Ile Val
705 710 715 720
Ile Phe Val Leu Leu Leu Val Val Val Asp Ile Thr Cys Tyr Phe Leu
725 730 735
Asn Lys Cys Gly Leu Phe Met Cys Ile Ala Val Asn Leu Cys Gly Lys
740 745 750
Ala Gly Pro Gly Ala Lys Gly Lys Asp Met Glu Glu Gly Lys Ala Ala
755 760 765
Phe Ser Lys Asp Glu Ser Lys Glu Pro Ile Val Glu Val Arg Thr Glu
770 775 780
Glu Glu Arg Thr Pro Asn His Asp Gly Gly Lys His Thr Glu Pro Asn
785 790 795 800
Glu Thr Thr Pro Leu Thr Glu Pro Glu Lys Gly Pro Val Glu Ala Lys
805 810 815
Pro Glu Cys Gln Glu Thr Glu Thr Lys Pro Ala Pro Ala Glu Val Lys
820 825 830
Thr Val Pro Asn Asp Ala Thr Gln Thr Lys Glu Asn Glu Ser Lys Ala
835 840 845
<210> 225
<211> 193
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 225
Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly
1 5 10 15
Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile
20 25 30
Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu
35 40 45
Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
50 55 60
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
65 70 75 80
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
85 90 95
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
100 105 110
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
115 120 125
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
180 185 190
Pro
<210> 226
<211> 232
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 226
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1 5 10 15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35 40 45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65 70 75 80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro
100 105 110
Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met
115 120 125
Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His
130 135 140
Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly
145 150 155 160
Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile
165 170 175
Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu
180 185 190
Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys
195 200 205
Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys
210 215 220
Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met
225 230
<210> 227
<211> 557
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 227
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
325 330 335
Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
340 345 350
Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
355 360 365
Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
370 375 380
Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly
385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
405 410 415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
420 425 430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
435 440 445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
450 455 460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser
465 470 475 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Ala
485 490 495
Gly Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro
500 505 510
Gln Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp
515 520 525
Ala Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala
530 535 540
Trp Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545 550 555
<210> 228
<211> 273
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 228
Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly
20 25 30
Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser
35 40 45
Thr Glu Lys Asn Ala Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser
50 55 60
Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser
65 70 75 80
Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu
85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe
100 105 110
Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly
115 120 125
Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr
130 135 140
Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser
145 150 155 160
Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly
165 170 175
Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu Ala
180 185 190
Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn
195 200 205
Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met
210 215 220
Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser
225 230 235 240
Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly
245 250 255
Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn
260 265 270
Leu
<210> 229
<211> 310
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 229
Met Arg Arg Ala Ala Leu Trp Leu Trp Leu Cys Ala Leu Ala Leu Ser
1 5 10 15
Leu Gln Pro Ala Leu Pro Gln Ile Val Ala Thr Asn Leu Pro Pro Glu
20 25 30
Asp Gln Asp Gly Ser Gly Asp Asp Ser Asp Asn Phe Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Leu Gln Asp Ile Thr Leu Ser Gln Gln Thr Pro Ser Thr
50 55 60
Trp Lys Asp Thr Gln Leu Leu Thr Ala Ile Pro Thr Ser Pro Glu Pro
65 70 75 80
Thr Gly Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ser Thr Ser Thr Leu Pro Ala Gly
85 90 95
Glu Gly Pro Lys Glu Gly Glu Ala Val Val Leu Pro Glu Val Glu Pro
100 105 110
Gly Leu Thr Ala Arg Glu Gln Glu Ala Thr Pro Arg Pro Arg Glu Thr
115 120 125
Thr Gln Leu Pro Thr Thr His Gln Ala Ser Thr Thr Thr Ala Thr Thr
130 135 140
Ala Gln Glu Pro Ala Thr Ser His Pro His Arg Asp Met Gln Pro Gly
145 150 155 160
His His Glu Thr Ser Thr Pro Ala Gly Pro Ser Gln Ala Asp Leu His
165 170 175
Thr Pro His Thr Glu Asp Gly Gly Pro Ser Ala Thr Glu Arg Ala Ala
180 185 190
Glu Asp Gly Ala Ser Ser Gln Leu Pro Ala Ala Glu Gly Ser Gly Glu
195 200 205
Gln Asp Phe Thr Phe Glu Thr Ser Gly Glu Asn Thr Ala Val Val Ala
210 215 220
Val Glu Pro Asp Arg Arg Asn Gln Ser Pro Val Asp Gln Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Ala Ser Gln Gly Leu Leu Asp Arg Lys Glu Val Leu Gly Gly Val
245 250 255
Ile Ala Gly Gly Leu Val Gly Leu Ile Phe Ala Val Cys Leu Val Gly
260 265 270
Phe Met Leu Tyr Arg Met Lys Lys Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Ser Leu
275 280 285
Glu Glu Pro Lys Gln Ala Asn Gly Gly Ala Tyr Gln Lys Pro Thr Lys
290 295 300
Gln Glu Glu Phe Tyr Ala
305 310
<210> 230
<211> 1048
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 230
Met Ala Phe Pro Pro Arg Arg Arg Leu Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu
1 5 10 15
Pro Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Leu Cys Arg Ala Phe Asn
20 25 30
Leu Asp Val Asp Ser Pro Ala Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Tyr
35 40 45
Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Val Pro Ser Ala Ser Ser Arg Met
50 55 60
Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile
65 70 75 80
Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr Arg Arg
85 90 95
Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys
100 105 110
Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val
115 120 125
Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp
130 135 140
Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu
145 150 155 160
Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Gln Asp
165 170 175
Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp
180 185 190
Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr
195 200 205
Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val Ser Lys
210 215 220
Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr
225 230 235 240
Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val
245 250 255
Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val Ser Gly
260 265 270
Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly
275 280 285
Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met Ala Ala
290 295 300
Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr
305 310 315 320
Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp
325 330 335
Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala
340 345 350
Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala
355 360 365
Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly
370 375 380
Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys
385 390 395 400
Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ala Val
405 410 415
Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met Pro Pro
420 425 430
Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys Asn Gly
435 440 445
Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Ile Leu
450 455 460
Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr
465 470 475 480
Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro Gly Thr
485 490 495
Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp
500 505 510
Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu Leu Leu
515 520 525
Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu
530 535 540
Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser Arg Gly
545 550 555 560
Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser
565 570 575
Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Arg
580 585 590
Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu
595 600 605
Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu
610 615 620
Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val
625 630 635 640
Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr
645 650 655
Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu
660 665 670
Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg
675 680 685
Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn
690 695 700
Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly
705 710 715 720
Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu
725 730 735
Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser Asn Leu
740 745 750
Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu Ala Val
755 760 765
Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe
770 775 780
Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu
785 790 795 800
Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly
805 810 815
Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro Tyr Lys
820 825 830
Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly
835 840 845
Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys
850 855 860
Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala Gly Gln
865 870 875 880
Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu Ser Glu
885 890 895
Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu Lys Ile
900 905 910
Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr
915 920 925
Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln
930 935 940
Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val Ile Glu
945 950 955 960
Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser Thr Leu
965 970 975
Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val
980 985 990
Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu
995 1000 1005
Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg Val
1010 1015 1020
Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro His Glu
1025 1030 1035 1040
Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr
1045
<210> 231
<211> 188
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 231
Met Asp Cys Arg Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val Ile Trp Ile
1 5 10 15
Met Ala Ile Ser Lys Val Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu Gly
20 25 30
His Gln Glu Phe Ala Arg Pro Ser Arg Gly Tyr Leu Ala Phe Arg Asp
35 40 45
Asp Ser Ile Trp Pro Gln Glu Glu Pro Ala Ile Arg Pro Arg Ser Ser
50 55 60
Gln Arg Val Pro Pro Met Gly Ile Gln His Ser Lys Glu Leu Asn Arg
65 70 75 80
Thr Cys Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala
85 90 95
Cys Pro Pro Ser Phe Tyr Gly Arg Asn Cys Glu His Asp Val Arg Lys
100 105 110
Glu Asn Cys Gly Ser Val Pro His Asp Thr Trp Leu Pro Lys Lys Cys
115 120 125
Ser Leu Cys Lys Cys Trp His Gly Gln Leu Arg Cys Phe Pro Gln Ala
130 135 140
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val Ala
145 150 155 160
Ser Arg Thr Pro Glu Leu Pro Pro Ser Ala Arg Thr Thr Thr Phe Met
165 170 175
Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile Gln Ser Tyr Tyr
180 185
<210> 232
<211> 750
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 232
Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg
1 5 10 15
Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe
20 25 30
Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu
35 40 45
Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu
50 55 60
Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile
65 70 75 80
Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile
85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His
100 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile
115 120 125
Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe
130 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro
145 150 155 160
Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr
165 170 175
Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met
180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val
195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly
210 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly
245 250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr
260 265 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly
275 280 285
Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys
290 295 300
Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn
325 330 335
Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val
340 345 350
Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro
355 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly
370 375 380
Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg
385 390 395 400
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile
405 410 415
Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr
420 425 430
Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala
435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val
450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu
465 470 475 480
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser
485 490 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile
500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu
515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn
530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu
545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val
565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val
580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala
595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr
610 615 620
Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser
645 650 655
Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu
660 665 670
Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
675 680 685
His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser
690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp
705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala
725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala
740 745 750
<210> 233
<211> 976
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 233
Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu
20 25 30
Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr
35 40 45
Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile
50 55 60
Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp
65 70 75 80
Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile
85 90 95
Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu
115 120 125
Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr
130 135 140
Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His
145 150 155 160
Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys
165 170 175
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu
180 185 190
Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu
195 200 205
Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala
210 215 220
Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly
225 230 235 240
Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
245 250 255
Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala
260 265 270
Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser
275 280 285
Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala
290 295 300
Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro
305 310 315 320
Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr
325 330 335
Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln
340 345 350
Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln
355 360 365
Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg
370 375 380
Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser
385 390 395 400
Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn
405 410 415
Gly Val Ser Gly Leu Val Thr Ser Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val
420 425 430
Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro Pro Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser
435 440 445
Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser
450 455 460
Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn
465 470 475 480
Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr Glu Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp
485 490 495
Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln
500 505 510
Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser Lys Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser
515 520 525
Pro Glu Gly Ser Gly Asn Leu Ala Val Ile Gly Gly Val Ala Val Gly
530 535 540
Val Val Leu Leu Leu Val Leu Ala Gly Val Gly Phe Phe Ile His Arg
545 550 555 560
Arg Arg Lys Asn Gln Arg Ala Arg Gln Ser Pro Glu Asp Val Tyr Phe
565 570 575
Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His
580 585 590
Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile
595 600 605
His Pro Ser Cys Val Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe
610 615 620
Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu
625 630 635 640
Val Pro Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln
645 650 655
Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His
660 665 670
His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met
675 680 685
Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu
690 695 700
Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu
705 710 715 720
Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val
725 730 735
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val
740 745 750
Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro
755 760 765
Glu Ala Thr Tyr Thr Thr Ser Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp Thr
770 775 780
Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tyr Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp Val
785 790 795 800
Trp Ser Phe Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg
805 810 815
Pro Tyr Trp Glu Leu Ser Asn His Glu Val Met Lys Ala Ile Asn Asp
820 825 830
Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln
835 840 845
Leu Met Met Gln Cys Trp Gln Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe
850 855 860
Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser
865 870 875 880
Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro
885 890 895
Ser Thr Ser Gly Ser Glu Gly Val Pro Phe Arg Thr Val Ser Glu Trp
900 905 910
Leu Glu Ser Ile Lys Met Gln Gln Tyr Thr Glu His Phe Met Ala Ala
915 920 925
Gly Tyr Thr Ala Ile Glu Lys Val Val Gln Met Thr Asn Asp Asp Ile
930 935 940
Lys Arg Ile Gly Val Arg Leu Pro Gly His Gln Lys Arg Ile Ala Tyr
945 950 955 960
Ser Leu Leu Gly Leu Lys Asp Gln Val Asn Thr Val Gly Ile Pro Ile
965 970 975
<210> 234
<211> 668
<212> PRT
<213> 人类（Homo Sapiens）
<400> 234
Met Gly Gly Lys Gln Arg Asp Glu Asp Asp Glu Ala Tyr Gly Lys Pro
1 5 10 15
Val Lys Tyr Asp Pro Ser Phe Arg Gly Pro Ile Lys Asn Arg Ser Cys
20 25 30
Thr Asp Val Ile Cys Cys Val Leu Phe Leu Leu Phe Ile Leu Gly Tyr
35 40 45
Ile Val Val Gly Ile Val Ala Trp Leu Tyr Gly Asp Pro Arg Gln Val
50 55 60
Leu Tyr Pro Arg Asn Ser Thr Gly Ala Tyr Cys Gly Met Gly Glu Asn
65 70 75 80
Lys Asp Lys Pro Tyr Leu Leu Tyr Phe Asn Ile Phe Ser Cys Ile Leu
85 90 95
Ser Ser Asn Ile Ile Ser Val Ala Glu Asn Gly Leu Gln Cys Pro Thr
100 105 110
Pro Gln Thr Val Ile Thr Ser Leu Gln Gln Glu Leu Cys Pro Ser Phe
115 120 125
Leu Leu Pro Ser Ala Pro Ala Leu Gly Arg Cys Phe Pro Trp Thr Asn
130 135 140
Val Thr Pro Pro Ala Leu Pro Gly Ile Thr Asn Asp Thr Thr Ile Gln
145 150 155 160
Gln Gly Ile Ser Gly Leu Ile Asp Ser Leu Asn Ala Arg Asp Ile Ser
165 170 175
Val Lys Ile Phe Glu Asp Phe Ala Gln Ser Trp Tyr Trp Ile Leu Val
180 185 190
Ala Leu Gly Val Ala Leu Val Leu Ser Leu Leu Phe Ile Leu Leu Leu
195 200 205
Arg Leu Val Ala Gly Pro Leu Val Leu Val Leu Ile Leu Gly Val Leu
210 215 220
Gly Val Leu Ala Tyr Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Glu Glu Tyr Arg Val
225 230 235 240
Leu Arg Asp Lys Gly Ala Ser Ile Ser Gln Leu Gly Phe Thr Thr Asn
245 250 255
Leu Ser Ala Tyr Gln Ser Val Gln Glu Thr Trp Leu Ala Ala Leu Ile
260 265 270
Val Leu Ala Val Leu Glu Ala Ile Leu Leu Leu Met Leu Ile Phe Leu
275 280 285
Arg Gln Arg Ile Arg Ile Ala Ile Ala Leu Leu Lys Glu Ala Ser Lys
290 295 300
Ala Val Gly Gln Met Met Ser Thr Met Phe Tyr Pro Leu Val Thr Phe
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ile Cys Ile Ala Tyr Trp Ala Met Thr Ala Leu Tyr
325 330 335
Leu Ala Thr Ser Gly Gln Pro Gln Tyr Val Leu Trp Ala Ser Asn Ile
340 345 350
Ser Ser Pro Gly Cys Glu Lys Val Pro Ile Asn Thr Ser Cys Asn Pro
355 360 365
Thr Ala His Leu Val Asn Ser Ser Cys Pro Gly Leu Met Cys Val Phe
370 375 380
Gln Gly Tyr Ser Ser Lys Gly Leu Ile Gln Arg Ser Val Phe Asn Leu
385 390 395 400
Gln Ile Tyr Gly Val Leu Gly Leu Phe Trp Thr Leu Asn Trp Val Leu
405 410 415
Ala Leu Gly Gln Cys Val Leu Ala Gly Ala Phe Ala Ser Phe Tyr Trp
420 425 430
Ala Phe His Lys Pro Gln Asp Ile Pro Thr Phe Pro Leu Ile Ser Ala
435 440 445
Phe Ile Arg Thr Leu Arg Tyr His Thr Gly Ser Leu Ala Phe Gly Ala
450 455 460
Leu Ile Leu Thr Leu Val Gln Ile Ala Arg Val Ile Leu Glu Tyr Ile
465 470 475 480
Asp His Lys Leu Arg Gly Val Gln Asn Pro Val Ala Arg Cys Ile Met
485 490 495
Cys Cys Phe Lys Cys Cys Leu Trp Cys Leu Glu Lys Phe Ile Lys Phe
500 505 510
Leu Asn Arg Asn Ala Tyr Ile Met Ile Ala Ile Tyr Gly Lys Asn Phe
515 520 525
Cys Val Ser Ala Lys Asn Ala Phe Met Leu Leu Met Arg Asn Ile Val
530 535 540
Arg Val Val Val Leu Asp Lys Val Thr Asp Leu Leu Leu Phe Phe Gly
545 550 555 560
Lys Leu Leu Val Val Gly Gly Val Gly Val Leu Ser Phe Phe Phe Phe
565 570 575
Ser Gly Arg Ile Pro Gly Leu Gly Lys Asp Phe Lys Ser Pro His Leu
580 585 590
Asn Tyr Tyr Trp Leu Pro Ile Met Thr Ser Ile Leu Gly Ala Tyr Val
595 600 605
Ile Ala Ser Gly Phe Phe Ser Val Phe Gly Met Cys Val Asp Thr Leu
610 615 620
Phe Leu Cys Phe Leu Glu Asp Leu Glu Arg Asn Asn Gly Ser Leu Asp
625 630 635 640
Arg Pro Tyr Tyr Met Ser Lys Ser Leu Leu Lys Ile Leu Gly Lys Lys
645 650 655
Asn Glu Ala Pro Pro Asp Asn Lys Lys Arg Lys Lys
660 665
<210> 235
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 235
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 236
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 236
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 237
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 237
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu
85 90 95
Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 238
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 238
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 239
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 239
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 240
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 240
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 241
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 241
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 242
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 242
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 243
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 243
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Asn Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 244
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 244
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 245
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 245
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly

Claims (10)

1.一种结合体或其衍生物与一种或多种药物分子或其一种或多种前药的具有下式的缀合物，以及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体
Figure FDA0003554407590000011
其中
BINDER代表结合体或其衍生物，优选抗体，
L代表接头，
n代表1至50的数字，优选1至20并且更优选2至8，以及
KSP代表纺锤体驱动蛋白抑制剂或其前药，其中-L-KSP具有下式(IIa)：
Figure FDA0003554407590000012
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表-H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-C(＝O)-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，
Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、NH2、SO3H、-COOH、-NH-C(＝O)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(C(＝O)-NH-CHY4)1-3COOH，
其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表–L-#1、-H、-MOD、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，
其中Y5代表-H或-CO-CHY6-NH2，
其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表–L-#1、-H、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，
其中Y5代表-H或-C(＝O)-CHY6-NH2，
其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
或
R4代表式
R21-(C(＝O))(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)NH2)-C(＝O)-或R21-(C(＝O))(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-C(＝O)-的基团或式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C5-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团
其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2。
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸；
或
R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)–CH2-CHR10-或#-CHR10-CH2-，其中R10代表-H、-NH2、-SO3H、-COOH、-SH、卤素(尤其是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)、-OH，或R21-C(＝O)-P3-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-SIG-，
其中SIG代表在C(＝O)-SIG键裂解后释放仲胺的自消性基团；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-或-C(＝N-NH2)-；
R3代表–L-#1、-MOD，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其在每种情况下均可被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(每个均具有1-3个卤原子)、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-C(＝O)-烷基、1-3个-O-C(＝O)-NH-烷基、1-3个-NH-C(＝O)-烷基、1-3个-NH-C(＝O)-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-S(＝O)2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中n代表0、1或2，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘
其中Y3代表-H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH，(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)；
R5代表-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是-F、-Cl、-Br)、-CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
R6和R7彼此独立地代表-H、氰基、C1-10-烷基、氟代-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟代-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟代-C2-10-炔基、羟基、-NO2、NH2、-COOH或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表C1-10-烷基、氟代-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟代-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟代-C2-10-炔基、C4-10-环烷基、氟代-C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，
其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–OH、-COOH、-NH2或–L-#1取代；
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
其中取代基R1、R2、R3、R4和R8中的一个代表或(在R8的情况下)含有–L-#1，
–L代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-G3，
其中R10代表-H或C1-C3-烷基；
G1代表–NH-C(＝O)-、-C(＝O)NH-或
Figure FDA0003554407590000051
(其中如果G1代表–NH-C(＝O)-或
Figure FDA0003554407590000052
R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；
以及
其中G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-O-、-S-、-S(＝O)-、S(＝O)2、-NRy-、-NRyC(＝O)-、C(＝O)NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2NRyNRy-、-C(＝O)NRyNRy-、-C(＝O)-、-CRx＝N-O-，
其中Ry代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代
其中Rx代表-H、C1-C3-烷基或苯基，
其中在烃基上包括任选地取代的C1-C10-烷基作为侧链(如果存在的话)的烃链可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
其中G3代表-H或-COOH；
其中–MOD优选地具有至少一个–COOH基团；
其中满足以下条件(i)至(iii)中的一个或多个：
(i)–L-#1包含式
-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-X)-C(＝O)-的基团，
其中X代表–NH2或–COOH，优选–NH2；
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
(ii)R4代表式
R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)NH2)-C(＝O)-或
R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2COOH)-C(＝O)-的基团或
式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2-NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-N(烷基)2或-OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团，
其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸；
(iii)R2和R4一起代表(形成吡咯烷环)–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中吡咯烷环的仲胺基的仲氢原子被R21-C(＝O)-P3-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-SIG-替代，
其中SIG代表在C(＝O)-SIG键裂解后释放仲胺的自消性基团；并且
其中R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2-NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-N(烷基)2或-OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团，
其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸。
2.权利要求1的缀合物，其中R4代表式R21-(C(＝O))(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)NH2)-C(＝O)-的基团。
3.权利要求1或2的缀合物，其中P2选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Ser、Thr和Asn。
4.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中P3选自Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Gly、Ser和Gln。
5.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中P2为Ala。
6.前述权利要求中一项或多项的缀合物，其中P3为Ala。
7.前述权利要求中一项或多项的缀合物，
其中R21代表-H、C1-5-烷基-、C5-10-芳烷基-、C1-5-烷氧基-、C6-10-芳氧基、C5-10-杂烷基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C5-10-杂烷氧基或C5-10-杂环烷氧基，其每一个均可被以下基团取代：-COOH、-C(＝O)-O烷基、-C(＝O)O-NH2、-NH2或-N(烷基)2，或–Ox-(CH2CH2O)y-R22基团，
其中x为0或1，
其中v代表1至20的数字，并且
其中R22为–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)。
8.前述权利要求中一项或多项的缀合物，
其中R4代表–L-#1并且包含式–(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-的基团，
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；并且
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸，优选N-甲基氨基酸。
9.结合体或其衍生物与一种或多种药物分子的缀合物，其中所述缀合物具有下式中的一个或两个：
Figure FDA0003554407590000081
其中
AK1或AK1A代表通过结合体的硫原子结合的结合肽或蛋白质；
n代表1至20的数字，并且
L1为具有1至100个碳原子的由亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基组成的直链或支链烃链，其可被一个或多个以下基团间断一次或多次：–O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-C(＝O)-、-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝O)-、-NMe-、-NHNH-、-S(＝O)2-NHNH-、-C(＝O)-NHNH-以及具有至多4个选自N、O和S的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-S(＝O)-或-S(＝O)2-，其中所述侧链(如果存在的话)可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
其中式IIa的位置R4中(即在-NH2基团中)的氢原子可以被式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-的豆荚蛋白酶可裂解基团替代，
其中
R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)NH2、-C(＝O)N(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)v-R22基团
其中x为0或1，
其中v代表1至20的数字，
并且
R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg和His；
其中P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸。
10.具有下式(III)的纺锤体驱动蛋白抑制剂前药，以及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体：
Figure FDA0003554407590000101
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
(优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N)；
R1代表-H、–MOD或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、NH2、SO3H、-COOH、-NH-C(＝O)-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(C(＝O)-NH-CHY4)1-3COOH，
其中W代表-H或-OH，
其中Y4代表任选地被-NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表-H、-MOD、-C(＝O)-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
其中Y4代表任选地被–NH-C(＝O)-NH2取代的直链或支链C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，
其中Y5代表-H或-C(＝O)-CHY6-NH2，
其中Y6代表直链或支链C1-6-烷基；
R4代表式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(0-2)-P2-NH-CH(CH2C(＝O)-NH2)-C(＝O)-或式R21-(C＝O)(0-1)-(P3)(1-2)-P2-的组织蛋白酶可裂解基团，
其中R21代表C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、-NH-C(＝O)-烷基、-N(烷基)-C(＝O)-烷基、-SO3H、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2-N(烷基)2、-COOH、-C(＝O)-NH2、-C(＝O)-N(烷基)2或–OH、-H，或–Ox-(CH2CH2O)v-R22基团
其中x为0或1
其中v代表1至20的数字，
其中R22代表–H、–烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
P2为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His；
P3为选自以下的氨基酸：Gly、Pro、Ala、Val、Nva、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、瓜氨酸和His或各自的N-烷基氨基酸之一，优选N-甲基氨基酸；
A代表-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)2-NH-或-C(＝N-NH2)-；
R3代表-MOD，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被以下基团取代：1-3个–OH基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个-O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-C(＝O)-NH-烷基、1-3个-NH-C(＝O)-烷基、1-3个-NH-C(＝O)-NH-烷基、1-3个-S(＝O)n-烷基、1-3个-S(＝O)2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团(其中“烷基”优选地代表C1-10-烷基)，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中n代表0、1或2，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘
其中Y3代表-H、-(CH2)0-3-CH(NH-C(＝O)-CH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH，
R5代表-H、-NH2、-NO2、卤素(特别是-F、-Cl、-Br)、-CN、-CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、-SH或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、-NHY3、-C(＝O)-NY1Y2或-C(＝O)-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表-H、-NH2或-(CH2)0-3Z‘，
其中Y3代表-H或-(CH2)0-3Z‘，
其中Z‘代表-H、-SO3H、-NH2或-COOH；
R6和R7彼此独立地代表-H、氰基、C1-10-烷基、氟代-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟代-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟代-C2-10-炔基、羟基、-NO2、NH2、-COOH或卤素(特别是-F、-Cl、-Br)，
R8代表C1-10-烷基、氟代-C1-10-烷基、C2-10-烯基、氟代-C2-10-烯基、C2-10-炔基、氟代-C2-10-炔基、C4-10-环烷基、氟代-C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，
其中HZ2代表具有至多两个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–OH、-CO2H或-NH2取代；
R9代表-H、-F、-CH3、-CF3、-CH2F或-CHF2；
–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，
其中
R10代表-H或C1-C3-烷基；
G1代表–NH-C(＝O)-、-C(＝O)NH-或
Figure FDA0003554407590000131
(其中如果G1代表–NH-C(＝O)-或
Figure FDA0003554407590000132
则R10不为-NH2)；
n为0或1；
o为0或1；以及
G2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被以下基团相同或不同地间断一次或多于一次：-O-、-S-、-S(＝O)-、S(＝O)2、-NRy-、-NRyC(＝O)-、C(＝O)NRy-、-NRyNRy-、-S(＝O)2-NRyNRy-、-C(＝O)-NRyNRy-C(＝O)-、-CRx＝N-O-
其中Rx代表-H、C1-C3-烷基或苯基，
其中Ry代表-H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，其每一个均可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)，其中包括任何侧链的烃链可被–NH-C(＝O)-NH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CN-NH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中–MOD基团优选具有至少一个–COOH基团。
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