CN107635586A - Ksp抑制剂与无糖基化抗‑tweakr抗体的抗体‑药物缀合物(adc) - Google Patents

Ksp抑制剂与无糖基化抗‑tweakr抗体的抗体‑药物缀合物(adc) Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供在以相对低的浓度给药后显示出细胞凋亡作用并因此可用于癌症治疗的物质。为了实现该目的，本发明提供了无糖基化或无糖基抗‑TWEAKR抗体与式(I)的KSP抑制剂的缀合物，其中一个或多个式(I)的化合物经由连接体L连接至抗体上。无糖基化抗体是在Fc区的CH2结构域中保守的N‑结合位点处不具有多糖的抗体。所述抗体优选是人、人源化或嵌合的单克隆抗体。更优选地，所述抗体是抗‑TWEAKR抗体，其特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的位置47中的氨基酸D(D47)上，特别是抗‑TWEAKR抗体TPP‑2658。

Description

KSP抑制剂与无糖基化抗-TWEAKR抗体的抗体-药物缀合物 (ADC)
背景技术
本发明涉及纺锤体驱动蛋白抑制剂的结合体药物缀合物(ADC)、这些ADC的活性代谢物、制备这些ADC的方法、这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途，以及这些ADC用于制备用于治疗和/或预防疾病的药物的用途，所述疾病特别是过度增殖性和/或血管生成性疾病，例如癌症疾病。这类治疗可以作为单一疗法或与其他药物或进一步治疗措施组合进行。
癌症是最多样化组织的不受控细胞生长的后果。在许多情况下，新的细胞渗透到现有组织中(侵袭性生长)，或者它们转移到远端器官中。癌症发生在各种不同的器官中，并且通常具有组织特异性病程。因此，术语“癌症”作为通用术语描述了不同器官、组织和细胞类型的大量确定疾病。
一些早期肿瘤可通过手术和放射治疗措施除去。转移的肿瘤通常只能通过化疗缓和地治疗。此处的目标是实现改善生活质量和延长寿命的最佳组合。
结合体蛋白(binder protein)与一个或多个活性化合物分子的缀合物是已知的，特别是为抗体药物缀合物(ADC)(其中针对肿瘤相关抗原的内化抗体经连接体共价连接至细胞毒性剂上)的形式。在将ADC引入肿瘤细胞中且随后该缀合物解离之后，所述细胞毒性剂本身或由其形成的细胞毒性代谢物在肿瘤细胞内被释放，并且可在其中直接地和选择性地展现其作用。以这种方式，与传统化疗相比，对正常组织的损伤保持在明显较窄的范围内[参见，例如，J.M.Lambert，Curr.Opin.Pharmacol.5，543-549(2005)；A.M.Wu和P.D.Senter，Nat.Biotechnol.23，1137-1146(2005)；P.D.Senter，Curr.Opin.Chem.Biol.13，235-244(2009)；L.Ducry和B.Stump，Bioconjugate Chem.21，5-13(2010)]。因此，WO2012/171020描述了其中多个毒簇分子经聚合物连接体连接至抗体上的ADC。作为可能的毒簇，WO2012/171020尤其提到了以下物质：SB 743921、SB 715992(Ispinesib)、MK-0371、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。
最后提到的物质是纺锤体驱动蛋白抑制剂。纺锤体驱动蛋白(KSP，也称为Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11)是双极有丝分裂纺锤体发挥作用所必要的驱动蛋白样马达蛋白(motorprotein)。KSP的抑制导致有丝分裂阻滞，并且在相对较长的时间内导致细胞凋亡(Tao等人，Cancer Cell 2005年7月8日(1)，39-59)。在发现第一种可渗透细胞的KSP抑制剂(Monastrol)之后，KSP抑制剂本身已成为一类新型化疗药物(Mayer等人，Science 286：971-974，1999)，并且是许多专利申请的主题(例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；及WO03/049527)。但是，由于KSP仅在有丝分裂期的相对短的时间内展现其作用，因此KSP抑制剂在此期间必须以足够高的浓度存在。WO2014/151030公开了包含某些KSP抑制剂的ADC。
发明内容
针对该背景技术，本发明的一个目的是提供在以相对低的浓度给药后展现细胞凋亡作用并因此有益于癌症治疗的物质。
为了实现该目的，本发明提供了无糖基化或无糖基抗-TWEAKR抗体与以下式(I)的化合物的缀合物，其中一个或多个式(I)的化合物经连接体L连接至抗体上。无糖基化抗体为这样的抗体：其在Fc区的CH2结构域中保守的N-结合位点处不具有任何多糖。所述抗体优选为人、人源化或嵌合单克隆抗体。特别优选特异性结合到TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位中的氨基酸D(D47)上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
式(I)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
R1代表H、–L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4′代表可被以下基团单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO-烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH，代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″(其中x代表0或1且n代表1至10的数，且R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，其中在裂解后，存在伯胺基团(相当于R4＝H)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或者R2与R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-#1、-MOD或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或可被下述基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0- 3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、(任选氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多达2个选自N、O和S的杂原子的4元至7元杂环，其中这些基团各自可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中取代基R1、R3或R4之一代表或(在R8的情况下)含有-L-#1，
L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物连接的键，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，所述烃基具有1至10个碳原子且可被一个或多个下述基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团-MOD优选具有至少一个基团-COOH。
本发明的缀合物可具有化学不稳定的连接体、酶不稳定连接体或稳定连接体。特别优选稳定连接体和可被组织蛋白酶裂解的连接体。
本发明还提供用于制备本发明的缀合物的方法以及用于该制备的前体和中间体。
本发明的缀合物的制备通常包括以下步骤：
制备任选带有保护基团并具有能够与抗体缀合的反应性基团的连接体前体；
将连接体前体与式(I)(其中在这些式中还不存在与连接体连接的键)的KSP抑制剂的任选地带有保护基团的衍生物缀合，以得到任选地带有保护基团的反应性KSP抑制剂/连接体缀合物；
脱去KSP抑制剂/连接体缀合物中存在的任何保护基团；以及
将抗体与KSP抑制剂/连接体缀合物缀合，得到本发明的抗体/KSP抑制剂缀合物。
也可在构建任选地受保护的KSP抑制剂/连接体前体缀合物之后进行反应性基团的连接。
取决于连接体，琥珀酰亚胺-连接的ADC可在缀合后根据方案26转化为具有有利的稳定性特征的开链琥珀酰胺。
如上所述，连接体前体与低分子量KSP抑制剂缀合可为通过在式(I)中R1、R3或R4处的氢被连接体取代。在缀合前的合成步骤中，存在的任何官能团也可以受保护的形式存在。在缀合步骤前，将这些保护基团通过肽化学的已知方法脱去。所述缀合可在化学上通过各种途径进行，如在实施例中方案20至31中的示例性方法中所示。特别地，可以任选地将用于与连接体缀合的低分子量KSP抑制剂改性，例如通过引入保护基团或离去基团以促进取代。
具体地，本发明提供了与抗-TWEAKR抗体缀合的新的低分子量KSP抑制剂。这些KSP抑制剂或其抗体缀合物具有以下通式(II)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
R1代表H、-L-BINDER、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2与R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-BINDER、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z,，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4′代表可被以下基团单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO-烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH，代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″(其中x代表0或1且n代表1至10的数，且R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)，其中在裂解后，存在伯胺基团(相当于R4＝H)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2与R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选地代表-L-BINDER或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH
(其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、(任选氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多达两个选自N、O和S的杂原子的4元至7元杂环(优选为氧杂环丁烷)，其中这些基团各自可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中L代表连接体且BINDER代表无糖基化抗-TWEAKR抗体，其中所述结合体可任选与多个活性化合物分子连接，
其中R1、R3和R4中的一个代表或均不代表-L-BINDER；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且可被一个或多个下述基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团-MOD优选具有至少一个基团-COOH。
附图说明
图1：不同物种的TWEAKR富含半胱氨酸的结构域(氨基酸34至68)的对比。(数字表示包括信号序列的全长构建体SEQ ID NO:169中的氨基酸位置)。
图2：A——TWEAKR(SEQ ID NO:169)的结构的示意图。该图显示出包括富含半胱氨酸的结构域(36-67)的胞外域(氨基酸28-80)(SEQ ID NO:168)、跨膜域—TM(81-101)和胞内域(102-129)。TPP-2202—融合到hIgG1的Fc结构域上的完整胞外域(28-80)。TPP-2203—融合到hIgG1的Fc结构域上的具有N-和C-末端平截(truncation)的胞外域(34-68)。二硫桥Cys36-Cys49、Cys52-Cys67和Cys55-Cys64由黑条标示。TPP-2203在N-末端比纯的富含半胱氨酸的结构域多包含两个氨基酸以及在C-末端多包含一个氨基酸，以确保正确的折叠。TPP-1984—融合到HIS6标签上的具有C-末端平截的胞外域(28-68)。所有三个构建体显示出与本发明的抗体和PDL-192(TPP-1104)的相当的结合。P4A8(TPP-1324)仅结合到全长胞外域(TPP-2202)上。
B——胞外域的氨基酸序列：已经公开了，氨基酸64对TWEAK配体结合是必要的；且氨基酸47对本发明的抗体的结合是必要的，如本文中所确定的。
发明详述
本发明提供了无糖基抗-TWEAKR抗体与一个或多个活性化合物分子的缀合物，该活性化合物分子是经连接体L连接到抗体上的纺锤体驱动蛋白抑制剂(KSP抑制剂)。
本发明的缀合物可由以下通式表示
其中BINDER代表抗-TWEAKR抗体，L代表连接体，KSP代表KSP抑制剂，且n代表1至50、优选1.2至20且特别优选2至8的数。在此，n是每个BINDER的KSP抑制剂/连接体缀合物数量的平均值。优选地，KSP-L具有如上所示的式(I)。此外，所述连接体优选与抗体的不同氨基酸连接。特别优选与结合体的不同半胱氨酸残基结合。所述无糖基化抗-TWEAKR抗体优选是人、人源化或嵌合单克隆抗体。特别优选特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位中的氨基酸D(D47)上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
下文描述可根据本发明使用的抗体、可根据本发明使用的KSP抑制剂和可根据本发明使用的连接体，它们可以组合使用而没有任何限制。特别地，在每种情况下表示为优选或特别优选的结合体可与在每种情况下表示为优选或特别优选的KSP抑制剂组合使用，任选地与在每种情况下表示为优选或特别优选的连接体组合使用。
KSP抑制剂和它们的结合体缀合物
C1-10-烷基在本发明的上下文中(即，在上述式中以及在下述式中)代表具有1至10个碳原子的直链或支链烷基。例如且优选地，可提及：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、1-甲基丙基和叔丁基。
C6-10-芳基-在本发明的上下文中代表单环或双环芳族碳环，例如苯基和萘基。
C6-10-芳烷基在本发明的上下文中代表连接C1-C4-烷基的单环芳族碳环，例如苯基。示例性C6-10-芳烷基是苄基。
C5-10-杂芳基在本发明的上下文中代表具有总共6至10个环原子的单环或双环芳族杂环，其中所述环含有一个或两个选自N、O、S、SO和SO2的环杂原子并经环碳原子或任选的环氮原子连接。可提及的实例为吡啶基、呋喃基、嘧啶基、咪唑基、噻吩基、苯硫基、异噁唑基、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、呋咱基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、哒嗪基、吡咯基、三嗪基、吲哚基、喹啉基、喹唑啉基、1,3-苯并二氧戊环基、异吲哚基、吲唑基、1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶基、苯并三唑基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、蝶啶基、萘啶基、苯并咪唑啉基、苯并噻唑啉基、苯并噁唑啉基、3,4-亚甲基二氧基苯基和苯并[6]呋喃基。
单环或双环杂环在本发明的上下文中代表具有总共5至10个环碳原子的单环或双环杂环，其中所述环含有一至三个选自N、O、S、SO和SO2的环杂原子并经环碳原子或任选的环氮原子连接。可提及的实例为哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、3,4-亚甲基二氧基苯基和四氢呋喃基。
卤素原子在本发明的上下文中代表F、Cl、Br或I。
KSP抑制剂与抗体的缀合可在化学上通过各种途径进行，如在实施例中方案20至31中的示例性方法中所示。特别地，可以任选地将用于与连接体缀合的低分子量KSP抑制剂改性，例如通过引入保护基团或离去基团以促进取代(以使在该反应中，所述离去基团而非氢原子被连接体取代)。然后，以此方法获得的KSP抑制剂-连接体分子(其中所述连接体具有用于与结合体偶联的反应性基团)可与结合体反应以得到本发明的结合体缀合物。在实验部分中，通过大量实施例以示例性方式说明该方法。
其他特别优选的化合物具有下式(I)或(Ia)：
式(I)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
R1代表H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4′代表可被以下基团单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO-烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH，代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″(其中x代表0或1且n代表1至10的数，且R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-#1、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选为C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、(任选氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多达两个选自N、O和S的杂原子的4元至7元杂环，其中这些基团各自可被-OH、CO2H或NH2取代；
其中取代基R1、R3和R4之一代表-L-#1，
L代表连接体且#1代表与抗体连接的键，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且其可被一个或多个下述基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-或-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团-MOD优选具有至少一个基团-COOH。
在式(I)的一个优选实施方案中，取代基R1或R3之一代表-L-#1。在该实施方案中，特别优选R4代表H或-SGlys-(CO)0-1-R4’，其中SGlys和R4’如上述定义。在式(I)的另一个优选实施方案中，取代基R4代表-L-#1，其中所述连接体为可在与R4连接的氮原子处裂解的连接体，以使得在裂解后存在伯氨基(相当于R4＝H)。所述可裂解的基团将在下文中详述。
式(Ia)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
R1代表H、-L-#1或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH；
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基。
R2和R4彼此独立地代表H、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4′代表可被以下基团单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO-烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH，代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″(其中x代表0或1且n代表1至10的数，且R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
或R2与R4一起代表(形成吡咯烷环)-CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；或R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z且R4代表–L-#1，且其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选地代表-L-#1或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷，且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
通过取代R1、R3或R4处的氢原子，可以将其中取代基R1、R3和R4均不代表-L-#1的式(I)或(Ia)的化合物与连接体以本领域普通技术人员已知的方式连接。这得到式(I)或(Ia)的缀合物，其中取代基R1、R3和R4之一代表-L-#1，L代表连接体且#1代表与抗体连接的键。如果式(I)或(Ia)的KSP抑制剂与结合体缀合，则因此取代基R1、R3或R4之一代表-L-#1，其中L代表连接体且#1代表与抗体连接的键。即，在缀合物的情况中，取代基R1、R3或R4之一代表-L-#1，其中-L-#1代表与抗体连接的键。所述结合体优选为人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段。在式(I)或(Ia)的一个优选的实施方案中，取代基R1或R3之一代表-L-#1。在该实施方案中，特别优选R4代表H或-SGlys-(CO)0-1-R4’，其中SGlys和R4’为如上述定义。在式(I)的另一个优选实施方案中，取代基R4代表-L-#1，其中所述连接体为可在与R4结合的氮原子处裂解的连接体，以使得在裂解后存在伯氨基(相当于R4＝H)。所述可裂解基团将在下文中详述。特别优选特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位中的氨基酸D(D47)上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
基团-L-#3也可以代替-L-#1存在于化合物中，其中L代表连接体且#3代表用于与抗体连接的反应性基团。包含-L-#3的化合物为与抗体反应的反应性化合物。#3优选为与氨基或硫醇基团反应以形成共价键，优选与蛋白质中的半胱氨酸残基反应的基团。蛋白质中的半胱氨酸残基可天然存在于蛋白质中，可通过生物化学方法引入，或优选可通过结合体的二硫化物的预还原而生成。
对于A，优选为CO(羰基)。
R1优选为-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2。
R2和R4优选为H，或R2与R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H或F。R4还优选为-L-#1，其中-L-#1是可裂解的连接体，优选可被酶细胞内裂解的连接体。
R3优选为-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代(其中烷基优选是C1-3-烷基)。
R5优选为H或F。
R6和R7彼此独立地优选为H、(任选氟化的)C1-3-烷基、(任选氟化的)C2-4-烯基、(任选氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素。
R8优选为支链的C1-5-烷基，特别是式-C(CH3)2-(CH2)0-2-Ry的基团，其中Ry代表-H、-OH、CO2H或NH2或(任选氟化的)C5-7-环烷基。特别优选的是式-C(CH3)3的基团或环己基。
R9优选为H或F。
尤其优选为式(I)或(Ia)的化合物，其中
A代表CO(羰基)；
R1代表H、-L-#1、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2或-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H或R2与R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H或F；或R4代表-L-#1且R2代表H；
R3代表-L-#1或可被卤素(特别是F)或任选氟化的C1-3-烷基单取代或多取代的苯基，或代表可任选地被以下基团取代的任选氟化的C1-10-烷基：-OY4、-SY4、-O-CO-Y4、-O-CO-NH-Y4、NH-CO-Y4、-NH-CO-NH-Y4、S(O)n-Y4(其中n代表0、1或2)、-SO2-NH-Y4、NH-Y4或N(Y4)2，其中Y4代表H、苯基(任选地被卤素(特别是F)或任选氟化的C1-3-烷基单取代或多取代)或烷基(其中烷基可被-OH、-COOH和/或-NHCO-C1-3-烷基取代，且其中烷基优选代表C1-3-烷基)；
其中特别优选地R3可被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代(其中烷基优选意指C1-3-烷基)；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选氟化的)C1-3-烷基、(任选氟化的)C2-4-烯基、(任选氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基或环己基；且
R9代表H或F。
此外，优选的是(单独或以组合的方式)
R1代表-L-#1、COOH或H，
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H，或R4代表-L-#1且R2代表H；
A代表CO，
R3代表可被以下基团取代的-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、苯基：1-3个卤素原子、1-3个氨基或1-3个烷基(其可任选地被卤化)，或代表-L-#1，
R5代表或H，
R6和R7彼此独立地代表H、C1-3-烷基或卤素；特别地，R6和R7代表F；
R8代表C1-4-烷基(优选叔丁基)或环己基；和/或
R9代表H。
另外，根据本发明优选的是
R1代表-L-#1、COOH或H，
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H，
A代表CO，
R3代表可被以下基团取代的-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、苯基：1-3个卤素原子、1-3个氨基或1-3个烷基(其可任选地被卤化)，或代表-L-#1，
R5代表H，
R6和R7彼此独立地代表H、C1-3-烷基或卤素；特别地，R6和R7代表F；
R8代表C1-4-烷基(优选叔丁基)；且
R9代表H。
其他特别优选的化合物具有下式(II)或(IIa)：
式(II)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
R1代表H、-L-BINDER、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R4代表H、-L-BINDER、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4′代表可被以下基团单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO-烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH，代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″(其中x代表0或1且n代表1至10的数，且R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-BINDER、-MOD或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选地代表-L-BINDER或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH
(其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、(任选氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多达两个选自N、O和S的杂原子的4元至7元杂环，其中这些基团各自可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团-MOD优选具有至少一个基团-COOH。
在式(II)的KSP抑制剂的结合体缀合物的情况下，R1、R3和R4中的最多一个代表(代替上文给出的条件之一)可代表-L-BINDER，其中L代表连接体且BINDER代表抗体，其中所述抗体可任选地与多个活性化合物分子连接。
式(IIa)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
R1代表-L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表H、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，或R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z且R4代表-L-#1，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4′代表可被以下基团单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO-烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH，代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″(其中x代表0或1且n代表1至10的数，且R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-BINDER或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选地代表-L-BINDER或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选地与多个活性化合物分子连接，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
此外，根据本发明优选的是以下KSP抑制剂/抗体缀合物：
式(IIb)：
其中R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，A代表CO，B代表单键、-O-CH2-或-CH2-O-且R20代表NH2、F、CF3或CH3，且n代表0、1或2。
式(IIc)：
其中A、R1、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，其中A优选代表CO且R3代表-CH2OH、-CH2OCH3、CH(CH3)OH或CH(CH3)OCH3。
式(IId)：
其中A、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义，其中A优选代表CO且R3代表-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x代表0或1且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
式(IIe)：
其中A、R2、R3、R4、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义且R1代表-L-BINDER。
式(IIi)：
其中A、R1、R2、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(II)或(IIa)中相同的含义且R4代表-L-BINDER，优选可酶促裂解的结合体，以使得在裂解后R4＝H。R1或R3特别优选代表-MOD。
式(IIj)：
其中
R3代表-L-#1；
A代表CO；且
R6、R7、R8和R9具有与式(I)中相同的含义。
式(IIk)：
其中
R1代表-L-#1；
A代表CO且R3代表-CH2OH；
R3、R6、R7、R8和R9具有与式(I)中相同的含义。
此外，优选地，在式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)和(IIk)的化合物中(单独或以组合的方式)：
Z代表Cl或Br；
R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-COOH或-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0- 3Z‘且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z’；
Y1代表H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z‘且Z‘代表-COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘且Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且Y4基团之一代表异丙基且另一个代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且Y4基团之一代表-CH3且另一个代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基；
至少一个Y4代表选自异丙基和-CH3；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-CONHCHY4COOH且Y4代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
Y4代表氨基苄基；
R2代表-(CH2)0-3Z且Z代表-SY3；
R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表H；
R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表-CO-CHY6-NH2；或
Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基。
此外，优选地，在式(I)或(II)中，R1、R2或R3代表-MOD。
特别优选地，R3代表-MOD且R1或R4代表-L-#1或-L-BINDER，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、-NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团-MOD优选具有至少一个基团-COOH；
特别优选地，基团-MOD具有(优选末端的)-COOH基团，例如在甜菜碱基团中。优选地，基团-MOD具有式-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x是0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
其他特别优选的化合物具有下式(III)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
R1代表-L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表H、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是由二肽或三肽组成的基团，R4′代表可被以下基团单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO-烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH，代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″(其中x代表0或1且n代表1至10的数，且R4″代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-BINDER或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基或-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH(其中x代表0或1且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3)，优选地代表-L-BINDER或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH，
(其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表连接体，且BINDER代表抗体，其中结合体可任选地与多个活性化合物分子连接，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
此外，优选地，在式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)、(IIk)或(III)的化合物中(单独或以组合的方式)：
Z代表Cl或Br；
R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z’；
Y1代表H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z‘且Z‘代表-COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘且Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且一个Y4代表异丙基且另一个代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-(CONHCHY4)2COOH且一个Y4代表-CH3且另一个代表-(CH2)3-NHCONH2；
Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基；
至少一个Y4代表选自异丙基和-CH3；
Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z‘，Z‘代表-CONHCHY4COOH且Y4代表任选被-NH2取代的芳基或苄基；
Y4代表氨基苄基；
R2代表-(CH2)0-3Z且Z代表-SY3；
R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表H；
R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表-CO-CHY6-NH2；或
Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基。
此外，优选式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)或(III)的化合物以及其盐、溶剂合物和盐的溶剂合物
其中
R1代表H、-L-#1或-L-BINDER、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H或-L-#1或-L-BINDER(其中-L-#1或-L-BINDER为可酶促裂解的连接体，使得R4转化为H)；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-#1或-L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选地代表可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选是C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基或(任选氟化的)C4-10-环烷基；
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1或-L-BINDER，
L代表连接体且#1代表与抗体连接的键，且BINDER代表抗体，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团-MOD优选具有至少一个基团-COOH。
此外，优选式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)或(III)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐，其中
R1代表H、-L-#1或-L-BINDER、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6-烷基，或代表任选被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H，
A代表CO、O、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-#1或-L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选地代表可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3个O-烷基、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH(其中“烷基”优选为C1-10-烷基)；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素(特别是F、Cl、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H或卤素(特别是F、Cl或Br)；
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基；
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1或-L-BINDER，
L代表连接体且#1代表与抗体连接的键且BINDER代表抗体，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中-MOD代表-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x为0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
此外，优选以下化合物，它们可任选地与酸如三氟乙酸一起存在。这些化合物可经由与位点R1、R3和R4对应的位点经连接体与抗体连接(其中氢原子被连接体取代)：
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)己酰基]氨基}乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸；
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-氟苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酸；
(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰胺；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-丝氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-L-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}甘氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸甲酯；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸；
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基]-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷-1-酸；
N-乙酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸；
N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氢呋喃-2-甲酰胺；
3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸；
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
根据本发明特别优选下列式IV的化合物，其中R1、R2、R3、R4和R5具有上述含义(如对式(I)或(II)所述)：
式IV
特别优选式IV的化合物，其中R1和R5代表H或-L-#1；R2和R4代表H或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；且R3代表CH2OH、CH(CH3)OH或-L-#1，其中取代基R1和R3之一代表-L-#1。另外，特别优选式IV的化合物，其中R1代表H或COOH；R2和R5代表H；R4代表-L-#1；且R3代表CH2OH或CH(CH3)OH，其中-L-#1是可酶促裂解的连接体，使得R4转化为H。
连接体
文献公开了用于将有机分子与结合体如抗体共价偶联(缀合)的各种选择(参见，例如K.Lang和J.W.Chin.Chem.Rev.2014，114，4764-4806，M.Rashidian等人BioconjugateChem.2013，24，1277-1294)。根据本发明优选经已作为游离巯基存在或通过二硫桥的还原生成的抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或经抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团将KSP抑制剂与抗体缀合。然而，也可经酪氨酸残基、经谷氨酰胺残基、经非天然氨基酸的残基、经游离羧基或经抗体的糖残基将KSP抑制剂与抗体连接。对于偶联，使用连接体进行。连接体可分为体内可裂解的连接体类别和体内稳定的连接体类别(参见L.Ducry和B.Stump，Bioconjugate Chem.21，5-13(2010))。体内可裂解的连接体具有体内可裂解的基团，其中又可分为体内可化学裂解的基团和体内可酶促裂解的基团。“体内可化学裂解”和“体内可酶促裂解”意指该连接体或基团在循环中是稳定的，并且仅在靶细胞处或靶细胞中通过其中不同的化学或酶环境(更低pH；升高的谷胱甘肽浓度；存在溶酶体酶如组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶，或糖苷酶(Glyosidasen)如β-葡糖醛酸酶)裂解，由此释放低分子量KSP抑制剂或其衍生物。体内可化学裂解的基团特别为二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；体内可酶促裂解的基团(特别是可被溶酶体酶裂解的那些)特别为2-8-寡肽基团、尤其是三肽或二肽基团或糖苷。在Bioconjugate Chem.2002，13，855-869和Bioorganic&MedicinalChemistry Letters 8(1998)3341-3346以及Bioconjugate Chem.1998，9，618-626中公开了肽裂解位点。这些包括，例如，缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸和苯基丙氨酸-赖氨酸(任选具有额外的酰胺基团)。
体内稳定的连接体以高稳定性为著称(在血浆中24小时后少于5％代谢物)并且没有上述体内可化学或酶促裂解的基团。
连接体-L-优选具有以下基本结构(i)至(iv)之一：
–(CO)m–SG1-L1-L2-
–(CO)m–L1-SG-L1-L2-
–(CO)m–L1-L2-
–(CO)m–L1-SG-L2
其中m为0或1；SG为体内可(化学或酶促)裂解的基团(特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；或可被组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶裂解的2-8-寡肽基团)，SG1为寡肽基团或优选为二肽基团，L1彼此独立地代表体内稳定的有机基团，且L2代表连接至结合体的偶联基团或单键。在此，优选偶联至抗体的半胱氨酸残基或赖氨酸残基上。或者，可偶联至抗体的酪氨酸残基、谷氨酰胺残基或非天然氨基酸上。非天然氨基酸可含有例如醛基或酮基(例如甲酰基甘氨酸)或叠氮基团或炔基(参见Lan&Chin,Cellular Incorporation ofUnnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins，Chem.Rev.2014，114，4764-4806)。
根据本发明特别优选基本连接体结构(iii)。通过代谢，给予本发明的具有基本连接体结构(iii)且连接体与抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基偶联的缀合物产生下式的半胱氨酸或赖氨酸衍生物：
其中L1在每种情况下与低分子量KSP抑制剂连接，例如式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIca)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(III)或(IV)的化合物。
根据本发明还优选的是基本连接体结构(ii)和(iv)，特别是当在R1位处连接时，特别是当基团L1具有下列结构之一时：
(a)-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-Y7，其中Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，且Y7代表单键或-NH-(CH2)0-4-CHNH2-CO-，使得在裂解后获得相应的结构-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-COOH或-NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-NH-(CH2)0-4-CHNH2-COOH。
(b)-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-CO-，其中x是0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，使得在裂解后获得相应的结构-CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH。
根据本发明还优选当与位置R4连接、特别是m＝0时的基本连接体结构(i)。
如果连接体与半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基连接，则L2优选衍生自与半胱氨酸的巯基反应的基团。这些包括卤乙酰、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰、芳基化化合物、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB硫醇和二硫化物-还原剂。这些基团通常以亲电子方式与巯基键反应，以形成硫桥(例如硫醚)或二硫桥。优选稳定的硫桥。L2优选为
其中
#1表示与抗体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR、CONR2(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
L2特别优选为：
其中#1表示与抗体的硫原子连接的点，#2表示与活性化合物连接的点，x代表1或2，且R22代表COOH、COOR、COR、CONR2、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3烷基)、CONH2，优选COOH。优选x＝1且R22代表COOH。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，以优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于连接体与抗体的键的总数计)的程度存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，特别优选作为式A3或A4的两种结构之一。在此，式A3或A4的结构通常一起存在，优选以60:40至40:60的比例，基于与抗体连接的键的数量计。然后剩余键作为下列结构存在
根据本发明，L1优选由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(如果G1代表NHCO或则R10优选不是NH2)。
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支链烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3元至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子或-SO-的5元至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2优选代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3元至10元(例如5元至10元)芳族或非芳族杂环(优选)，其中包括侧链的烃链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中的其他间隔基团优选为
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
在此，#1为与KSP抑制剂连接的键且#2是与偶联至抗体上的偶联基团(例如L2)连接的键。
亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基的直链或支链烃链通常包含具有所述的相应碳原子数的α,ω-二价烷基。例如并作为优选可提及以下基团：亚甲基、乙烷-1,2-二基(1,2-亚乙基)、丙烷-1,3-二基(1,3-亚丙基)、丁烷-1,4-二基(1,4-亚丁基)、戊烷-1,5-二基(1,5-亚戊基)、己烷-1,6-二基(1,6-亚己基)、庚烷-1,7-二基(1,7-亚己基)、辛烷-1,8-二基(1,8-亚辛基)、壬烷-1,9-二基(1,9-亚壬基)、癸烷-1,10-二基(1,10-亚癸基)。然而，烃链中的亚烷基还可为支链的，即上述直链亚烷基的一个或多个氢原子可任选被C1-10-烷基取代，由此形成侧链。此外，烃链可含有环状亚烷基(环烷二基)，例如1,4-环己烷二基或1,3-环戊烷二基。这些环状基团可为不饱和的。特别地，在烃基中可存在芳基(亚芳基)，例如亚苯基。反之，在环状亚烷基和亚芳基中，一个或多个氢原子还可任选被C1-10-烷基取代。以此方式，形成任选为支链的烃链。该烃链具有总共0至100个碳原子，优选1至50，特别优选2至25个碳原子。
侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
所述烃链可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5元至10元芳族或非芳族杂环(优选)。
G2中的其他间隔基团优选为
优选地，所述连接体对应于下式：
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与活性化合物连接的键且
§§代表与结合体肽或蛋白质连接的键，且
L1和L2具有上述含义。
特别优选地，L1具有式-NR11B-，其中
R11代表H或NH2；
B代表-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝0至5；且
X4代表-O-、-CONH-、-NHCO-或
根据本发明优选的连接体L具有下式：
其中
#3代表与活性化合物分子连接的键，
#4代表与结合体肽或蛋白质连接的键，
R11代表H或NH2；
B代表-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝1至5；且
X4代表-O-、-CONH-、-NHCO-或
在式(I)或(II)的缀合物中尤其优选上述连接体，其中连接体通过取代R1处的氢原子或其与R4处的可裂解的连接体SG1的组合而偶联，即R1代表-L-#1或R4代表-SG1-L-#1，其中#1代表与抗体连接的键。
根据本发明还优选以下连接体：在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，以优选大于80％，特别优选大于90％(在每种情况下基于连接体与抗体连接的键的总数计)的程度存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，特别优选为式A5或A6的两种结构之一：
其中
#1表示与抗体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONR2、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
在此，式A5或A6的结构通常一起存在，优选以60:40至40:60的比例存在，基于与抗体连接的键的数量计，然后剩余键作为下列结构存在
与半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基连接的其他连接体–L-具有下式：
其中
§代表与活性化合物分子连接的键且
§§代表与结合体肽或蛋白质连接的键，
m代表0、1、2或3；
n代表0、1或2；
p代表0至20，且
L3代表
其中
o代表0或1；
且
G3代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或SO2的3元至10元(优选5元至10元)芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在上式中，优选
m代表1；
p代表0；
n代表0；
且L3代表
其中
o代表0或1；且
G3代表-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)u CH2CH2O)v(CH2)w-，其中
s、t、v和w各自彼此独立地为0至20，且u为0或1。
上式§-(CO)m-L1-L2-§§中优选的基团L1为以下那些，其中r在每种情况下彼此独立地代表0至20、优选0至15、特别优选1至20、尤其优选2至10的数：
表C中给出L1的其他实例，其中该基团突出标示在框中。
下表A和A‘中给出了连接体部分L1的实例。此外，该表说明了L1的这些实例优选与哪种基团L2组合，以及优选的偶联点(R1或R3或R4)和m的优选值，即在L1前是否存在羰基(参见§-(CO)m-L1-L2-§§)。这些连接体优选与半胱氨酸残基偶联。如果L2是琥珀酰亚胺或由其衍生而得，则该酰亚胺还可完全或部分为如上所述的水解的开链琥珀酰胺的形式。取决于L1，这种水解成开链琥珀酰胺可为或多或少显著的或完全不存在。
表A
＊＊特别优选地，这些行中给出的连接体L1与选自以下的连接体L2连接：
和/或
其中#1表示与结合体的硫原子连接的点，#2表示与基团L1连接的点，R22优选代表COOH。在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，以优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于连接体与结合体连接的键的总数计)的程度存在与结合体的半胱氨酸残基连接的键，特别优选为式A7或A8的两种结构之一。在此，式A7或A8的结构通常一起存在，优选以60:40至40:60的比例存在，基于与结合体连接的键的数量计。然后剩余键作为以下结构存在
表A‘
＊＊：参见表A的注释＊＊。
＊＊＊：当存在该结构L2时，可同时存在下式的结构L2：
具有相应连接体的缀合物的实例具有下列结构，其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N且L1具有上述含义，L2和L3具有与L1相同的含义，AK1代表经半胱氨酸残基连接的无糖基化抗-TWEAKR抗体且n是1至10的数。特别优选地，AK1是人、人源化或嵌合单克隆抗体。特别优选特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位中的氨基酸D(D47)上的无糖基化抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
如果连接体与赖氨酸侧链或赖氨酸残基连接，则其优选具有下式：
-§-(SG)x-L4-CO-§§
其中
§代表与活性化合物分子连接的键，以及
§§代表与结合体肽或蛋白质连接的键，
x代表0或1，
SG代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽，
以及
L4代表单键或基团-(CO)y-G4-，其中y代表0或1，以及
G4代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5元至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
下表B给出了与赖氨酸残基连接的连接体的实例。此外，该表给出优选的偶联点(R1-R5)。第一栏还说明了其中使用相应连接体的实施例编号。
表B：赖氨酸连接体
-§-(SG)x-L4-CO-§§
具有相应连接体的缀合物的实例具有下列结构，其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N且L4具有上述含义，AK2代表经赖氨酸残基连接的抗体且n是1至10的数。特别优选地，AK2是人、人源化或嵌合单克隆抗体、无糖基化抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段。特别优选特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位中的氨基酸D(D47)上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
根据本发明还优选基本结构(i)、(ii)或(iv)，其中SG1或SG代表可被组织蛋白酶裂解的基团，且L1和L2具有上述含义。特别优选下列基团：
-Val-Ala-CONH-(由此在丙氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Val-Lys-CONH-(在赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Val-Cit-CONH-(在瓜氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Phe-Lys-CONH(在赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Ala-Lys-CONH-(在赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
-NH-Ala-Cit-CONH-(在瓜氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键裂解)
SG1或SG特别优选为
其中X代表H或可任选被-NHCONH2、-COOH、-OH、NH2、-NH-CNNH2或磺酸取代的C1-10-烷基。
下表C给出连接体部分–SG1-L1-或–L1-SG-L1-的实例，其中SG1和SG为可被组织蛋白酶裂解的基团。此外，表C说明-SG1-L1-和–L1-SG-L1-的这些实例优选与哪种基团L2组合，以及优选的偶联点(R1-R5)和m的优选值，即在L1前是否存在羰基(参见§-(CO)m-L1-L2-§§)。这些连接体优选与半胱氨酸残基偶联。L1基团突出标示在框中。然而，这些基团L1可被上式§-(CO)m-L1-L2-§§给出的基团L1之一替代。如果L2为琥珀酰胺或由其衍生而得，则这种酰胺还可完全或部分地为如上所述的水解的开链琥珀酰胺的形式。
表C
具有基本结构(i)的缀合物的实例具有以下结构，其中X1代表CH,X2代表C且X3代表N，L4具有与L1相同的含义，AK1代表经半胱氨酸残基连接的无糖基化抗-TWEAKR抗体且n为1至10的数。特别优选特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位中的氨基酸D(D47)的抗-TWEAKR抗体，特别是无糖基化抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
KSP抑制剂-连接体中间体和该缀合物的制备
本发明的缀合物通过首先提供低分子量KSP抑制剂与连接体来制备。以此方式获得的中间体随后与结合体(优选抗体)反应。
优选地，为了偶联至半胱氨酸残基，使以下化合物之一与含半胱氨酸的结合体如抗体(其为此目的任选地部分被还原)反应：
其中R代表-H或-COOH，
其中K代表任选地被C1-C6-烷氧基或-OH取代的直链或支链的C1-C6烷基，且
其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，SG1、L1、L2、L3和L4具有与上文所述的相同含义。
在各上述化合物中及在下述化合物中，叔丁基可被环己基替代。
该化合物可例如以其三氟乙酸盐的形式使用。对于与结合体(例如抗体)的反应，该化合物优选以相对于结合体2至12倍摩尔过量使用。
优选地，为了与赖氨酸残基偶联，使下列化合物之一与含赖氨酸的结合体(例如抗体)反应：
其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N且L4具有与L1相同的含义且L1具有与上文所述的相同含义。
对于与半胱氨酸残基偶联的中间体，该反应可如下所示：
其他中间体和其他抗体可相应地反应。
对于与赖氨酸残基偶联的中间体，该反应可如下所示：
根据本发明，得到以下缀合物：
取决于连接体，琥珀酰亚胺-连接的ADC可在缀合后转化为具有有利的稳定性特征的开链琥珀酰胺。
该反应(开环)可在pH 7.5至9下，优选在pH 8下，在25℃至37℃的温度下，例如通过搅拌进行。优选搅拌时间为8至30小时。
在上式中，X1代表CH，X2代表C且X3代表N，SG1和L1具有与上文所述相同的含义且L2、L3和L4具有与L1相同的含义；以及R和K具有与上文所述相同的含义。AK1为经半胱氨酸残基偶联的无糖基化抗-TWEAKR抗体，且AK2为经赖氨酸残基偶联的无糖基化抗-TWEAKR抗体。特别优选地，AK1和AK2代表特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位中的氨基酸D(D47)上的无糖基化抗-TWEAKR抗体，特别是无糖基化抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
无糖基化抗体
无糖基或无糖基化抗体为在Fc区的CH2结构域中保守的N-结合位点处不具有任何多糖的抗体。所述糖基化抗-TWEAKR抗体优选是人、人源化或嵌合单克隆抗体。特别优选特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位中的氨基酸D(D47)上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
文献还公开了有机分子与抗体共价偶联(缀合)的各种选择。根据本发明优选经抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或经抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团将毒簇与抗体缀合。然而，还可经游离羧基或经抗体的糖残基将毒簇与抗体结合。
抗体可与连接体经键连接。抗体可经结合体的杂原子连接。根据本发明，可用于连接的抗体的杂原子为硫(在一个实施方案中经抗体的巯基)、氧(根据本发明通过抗体的羧基或羟基)和氮(在一个实施方案中经抗体的伯胺基团或和仲胺基团或酰胺基。这些杂原子可存在于天然抗体中，或通过化学方法或分子生物学方法引入。根据本发明，相对于靶分子，抗体与毒簇的连接对抗体的结合活性仅有较小的影响。在一个优选的实施方案中，相对于靶分子，所述连接对抗体的结合活性没有影响。
根据本发明，术语“抗体”应以其最宽泛的含义理解并包括免疫球蛋白分子，例如完整或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。免疫球蛋白分子优选包含具有通常通过二硫桥连接的四个多肽链——两个重链(H链)和两个轻链(L链)——的分子。各重链包含重链可变域(缩写为VH)和重链恒定域。重链恒定域可例如包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链包含可变域(缩写为VL)和恒定域。轻链恒定域包含结构域(缩写为CL)。VH和VL域可进一步细分成高变区(也称为互补决定区(缩写为CDR))和具有低序列变异性的区域(骨架区，缩写为FR)。通常，各VH和VL区由三个CDR达FR构成。例如以下列顺序从氨基末端到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可由任何合适的物种获得，所述合适的物种例如兔、美洲驼、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，所述抗体为人源或鼠源的抗体。抗体可例如为人的、人源化的或嵌合的。
术语“单克隆”抗体为指从一群基本同质抗体中获得的抗体，即该群的各个抗体除天然存在的突变(其中可存在少数)外均是相同的。单克隆抗体以高特异性识别单个抗原结合位点。术语单克隆抗体不涉及特定制备方法。
术语“完整”抗体意指包含轻链和重链的抗原结合结构域及恒定域的抗体。恒定域可为天然存在的结构域或其具有许多修饰的氨基酸位置的变体。
术语“修饰的完整”抗体意指借助共价键(例如肽键)经它们的氨基末端或羧基末端与不源自抗体的其他多肽或蛋白质融合的完整抗体。此外，可修饰抗体以在特定位置引入反应性半胱氨酸以促进与毒簇偶联(参见Junutula等人Nat Biotechnol.2008年，26(8)：925-932)。
术语“人”抗体是指可从人中获得的抗体或为合成的人抗体。“合成的”人抗体为可部分或完全由基于分析人抗体序列的合成序列以计算机模拟获得的抗体。人抗体可例如通过从人源抗体序列库中分离的核酸编码。此类抗体的实例可见于等人，NatureBiotech.2000，18：853-856。
术语“人源化”或“嵌合”抗体描述由序列的非人部分和人部分构成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白的部分序列(受体)被非人免疫球蛋白的序列部分(供体)替代。在许多情况下，该供体是鼠免疫球蛋白。在人源化抗体的情况下，受体的CDR的氨基酸被供体的氨基酸替代。有时，骨架的氨基酸也被供体的相应氨基酸替代。一些情况下，该人源化抗体含有在抗体的优化过程中引入的既不存在于受体也不存在于供体的氨基酸。在嵌合抗体的情况下，供体免疫球蛋白的可变结构域与人抗体的恒定区融合。
本文所用的术语互补决定区(CDR)意指与抗原结合所需的可变抗体结构域的那些氨基酸。通常，各可变区具有称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR区。各CDR区可包含Kabat定义的氨基酸和/或Chotia定义的高变环(loop)的氨基酸。Kabat的定义包含例如来自可变轻链的约氨基酸位置24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)及可变重链的31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)的区域(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。Chotia的定义包含例如来自可变轻链的约氨基酸位置26-32(CDR1)、50-52(CDR2)和91-96(CDR3)及可变重链的26-32(CDR1)、53-55(CDR2)和96-101(CDR3)的区域(Chothia和Lesk；J MolBiol 196：901-917(1987))。在一些情况下，CDR可包含来自Kabat和Chotia定义的CDR区的氨基酸。
取决于重链恒定域的氨基酸序列，抗体可分成不同的类型。完整抗体有五种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中几种可分成进一步的亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类型对应的重链恒定域被称为[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε]、[gamma/γ]和[my/μ]。抗体的三维结构和亚单元结构均是已知的。
术语抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”或“抗原结合抗体片段”定义为仍包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合域的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变域)。抗体的“抗原结合域”通常包含抗体的一个或多个高变区，例如CDR、CDR2和/或CDR3区。然而，抗体的“框架”或“骨架”区在抗体与抗原的结合过程中也可起作用。框架区形成CDR的骨架。优选地，抗原结合域包含至少可变轻链的氨基酸4至103和可变重链的氨基酸5至109，更优选可变轻链的氨基酸3至107和可变重链的4至111，特别优选完全的可变轻链和重链，即VL的氨基酸1-109和VH的1至113(根据WO97/08320编号)。
本发明的“功能性片段”或“抗原结合抗体片段”非穷举地包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、双价抗体、单域抗体(DAb)、线性抗体、抗体的单链(单链Fv，缩写为scFv)；和多特异性抗体，如双和三特异性抗体，例如由抗体片段形成的，C.A.K Borrebaeck编辑(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology)，Oxford UniversityPress；R.Kontermann&S.Duebel编辑(2001)Antibody Engineering(Springer LaboratoryManual)，Springer Verlag。除“多特异性”或“多功能性”抗体以外的抗体为具有相同结合位点的那些。多特异性抗体可对抗原的不同表位是特异性的或可对多于一种抗原的表位是特异性的(参见，例如，WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人，1991，J.Immunol.147：60 69；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；或Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547 1553)。可构建F(ab')2或Fab分子，使得可减少或完全防止Ch1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用的数量。
“表位”是指能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链或其组合组成，并通常具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。
“功能性片段”或“抗原结合抗体片段”可经其氨基末端或羧基末端借助共价键(例如肽键)与非源自抗体的另一种多肽或蛋白质融合。此外，可通过在特定位置引入反应性半胱氨酸来修饰抗体和抗原结合片段，以促进与毒簇偶联(参见，Junutula等人NatBiotechnol.2008Aug；26(8)：925-32)。
多克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备。单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备(和Milstein，Nature，256，495-497，1975)。人和人源化单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备(Olsson等人，MethEnzymol.92，3-16或Cabilly等人US 4,816,567或Boss等人US 4,816,397)。
本领域普通技术人员知晓制备人抗体及其片段的各种方法，例如借助转基因小鼠(N Lonberg和D Huszar，Int Rev Immunol.1995；13(1):65-93)或噬菌体展示技术(Clackson等人，Nature.1991年8月15日，352(6336)：624-8)。本发明的抗体可由重组抗体库获得，所述重组抗体库例如由汇集自大量健康志愿者的多种多样的抗体的氨基酸序列构成。抗体也可借助已知的重组DNA技术制造。抗体的核酸序列可通过常规测序获得或可从公开访问数据库获得。
“分离的”抗体或结合体已纯化以除去细胞的其他成分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞的有害成分为例如酶、激素或细胞的其他肽或非肽成分。优选的抗体或结合体为已纯化至该抗体或结合体的大于95重量％的程度(例如通过Lowry法、UV-Vis光谱学或通过SDS毛细管凝胶电泳测定)的一种。此外，已纯化至可确定氨基末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的程度或已纯化至同质性的抗体，所述同质性通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下测定(可借助考马斯蓝染色或优选通过银着色确定检测)。然而，通常通过一个或多个纯化步骤来制备抗体。
术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(binds specifically)”是指与预定抗原/靶分子结合的抗体或结合体。抗体或结合体的特异性结合通常描述具有至少10-7M的亲和力(作为Kd值；即优选Kd值小于10-7M的那些)的抗体或结合体，其中该抗体或结合体对预定抗原/靶分子的亲和力比对不是预定抗原/靶分子或密切相关的抗原/靶分子的非特异性抗原/靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)高至少两倍。该抗体优选具有至少10-7M(作为Kd值；换言之，优选Kd值小于10-7M的那些)，优选至少10-8M，更优选10-9M至10- 11M的亲和力。可例如借助表面等离子体共振波谱法测定Kd值。
本发明的抗体-药物缀合物同样在这些范围内表现出亲和力。该亲和力优选基本不受药物缀合的影响(一般而言，该亲和力降低小于一个量级，换言之，例如最多从10-8M到10-7M)。
根据本发明使用的抗体也优选以高选择性为特征。当本发明的抗体对靶蛋白表现出的亲合力比对非依赖性的其他抗原(例如人血清白蛋白)好至少2倍、优选5倍或更优选10倍(可以例如借助表面等离子体共振波谱法测定亲和力)时，存在高选择性。
此外，所用的本发明的抗体优选为交叉反应性的。为了能够促进并更好地解释临床前研究，例如毒理学或活性研究(例如在异种移植小鼠中)，如果根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白还结合用于研究的物种中的物种靶蛋白，则是有利的。在一个实施方案中，除人靶蛋白外，根据本发明使用的抗体还对至少一个其他物种的靶蛋白呈交叉反应性。对于毒理学和活性研究，优选使用啮齿科、犬科和非人灵长科的物种。优选的啮齿物种是小鼠和大鼠。优选的非人灵长目为猕猴、猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，除人靶蛋白外，根据本发明使用的抗体还对至少一种选自小鼠、大鼠和长尾猕猴(食蟹猴)的其他物种的靶蛋白呈交叉反应性。尤其优选除人靶蛋白外至少对小鼠靶蛋白呈交叉反应性的根据本发明使用的抗体。优选对其他非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不大于50倍，特别是不大于10倍的交叉反应性抗体。
针对癌症靶分子的抗体
结合体——例如抗体或其抗原结合片段——定向的靶分子优选为癌症靶分子。术语“癌症靶分子”描述与相同组织类型的非癌细胞相比更大量存在于一种或多种癌细胞种类上的靶分子。优选地，癌症靶分子与相同组织类型的非癌细胞相比选择性存在于一种或多种癌细胞种类上，其中选择性描述与相同组织类型的非癌细胞相比至少两倍富集在癌细胞上(“选择性癌症靶分子”)。癌症靶分子的使用允许使用本发明的缀合物选择性治疗癌细胞。
在此特别优选细胞外癌症靶分子TWEAKR(SEQ ID NO:169(蛋白质)；SEQ ID NO:170(DNA))。
结合癌症靶分子的抗体可由本领域普通技术人员使用已知方法例如化学合成或重组表达制备。癌症靶分子的结合体可市售获得，或可由本领域普通技术人员使用已知方法例如化学合成或重组表达制备。在WO 2007/070538(见第22页“抗体”)中记载了用于制备抗体或抗原结合抗体片段的其他方法。本领域技术人员知晓如何处理例如可被编辑并用于发现抗体或抗原结合抗体片段的噬菌体展示库(例如Morphosys HuCAL Gold)(参见WO2007/070538，第24页及其后和第70页的AK实施例1、第72页的AK实施例2)。例如在第26页(WO 2007/070538)记载了使用来自B细胞的DNA库制备抗体的其他方法。人源化抗体的方法记载于WO2007070538的第30-32页并详细记载于Queen等人，Pros.Natl.Acad.Sci.USA 86：10029-10033，1989或WO 90/0786中。此外，通常蛋白质的以及特别是抗体的重组表达的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Berger和Kimrnel(Guide to Molecular CloningTechniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press,Inc.)；Sambrook等人，(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Cold Spring Harbor,N.Y.；1989)第1-3卷)；Current Protocols in MolecularBiology，(F.M.Ausabel等人[编辑]，Current Protocols，Green Publishing Associates，Inc./John Wiley&Sons，Inc.)；Harlow等人，(Monoclonal Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(19881，Paul[编辑])；FundamentalImmunology,(Lippincott Williams&Wilkins(1998))；和Harlow等人(Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。本领域技术人员知晓蛋白质/抗体的表达所必需的相应载体、启动子和信号肽。常见方法还记载于WO 2007/070538第41-45页中。制备IgG1抗体的方法记载于例如WO 2007/070538第74页及其后的实施例6中。能够测定抗体在与其抗原结合后的内化的方法是技术人员已知的并记载于例如WO 2007/070538第80页中。本领域技术人员能够使用WO 2007/070538中描述的方法，类似于制备具有不同靶分子特异性的抗体，所述方法已用于制备碳酸酐酶IX(Mn)抗体。
本发明的抗体是无糖基化的，即它们在Fc区的CH2结构域中保守的N-结合位点处不具有任何多糖。在下文中，除了这类无糖基化抗体(例如抗体TPP-2658)之外，还描述这样的抗体：可由该抗体通过取代Fc部分中的一个或多个氨基酸N生成相应的无糖基化抗体。一个实例是抗体TPP-2090，由该抗体通过N297处的突变获得抗体TPP-2658。
抗-TWEAKR抗体
根据本发明，使用抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段，优选一种选自下文所述的或通过合适的突变而无糖基化的那些。此外，本领域技术人员熟知与TWEAKR结合的抗体，参见例如WO2009/020933(A2)或WO2009140177(A2)。
特别地，本发明涉及具有导致TWEAKR(SEQ ID NO:169(蛋白质)；SEQ ID NO:170(DNA))的强活化的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体的缀合物，其强诱导显示TWEAKR过表达的各种癌细胞的细胞凋亡。
与先前所述的抗-TWEAKR抗体(例如PDL-192)诱发细胞凋亡和抑制增殖相关的TWEAKR激动活性是有限的并且没有达到内源性配体TWEAK的效力。激动活性的这种欠缺不是基于降低的亲和力，而是因为这些抗体结合到与内源性配体TWEAK相比亲和力在类似范围内的TWEAKR上(Michaelson JS等人，MAbs.2011年7月-8月；3(4)：362-75；Culp PA等人，Clin Cancer Res.2010年1月15日；16(2)：497-508)，且甚至具有更高结合亲和力的抗体也不一定表现出更有效的信号活性(Culp PA等人，Clin Cancer Res.2010年1月15日；16(2)：497-508)。此外，已经表明，先前所述的抗体的抗癌活性取决于Fc效应子功能，并且表明ADCC对小鼠模型中的体内效力起重要作用。
抗-TWEAKR抗体的生成
使用完整的人抗体噬菌体库(Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)，以通过使用人和小鼠-TWEAKR的二聚Fc-融合的胞外域作为固定化靶标的蛋白质筛选(Hoogenboom H.R.，Nat Biotechnol 2005；23(3)：1105-16)分离本发明的TWEAKR-特异性人单克隆抗体。识别11种不同的Fab噬菌体，并将相应的抗体再克隆到提供可溶性FAb中缺失的CH2-CH3结构域的哺乳动物IgG表达载体中。在识别优选抗体后，这些作为全长IgG表达。这些构建体如Tom等人，Methods Express中的第12章：Expression Systems，MichealR.Dyson和Yves Durocher编辑，Scion Publishing Ltd，2007(参见AK-实施例1)所述例如在哺乳动物细胞中短暂表达。该抗体通过蛋白质A色谱法纯化并使用ELISA和BIAcore分析通过它们与可溶性单体TWEAKR的结合亲和力进一步表征，如AK实施例2中所述。为了测定抗-TWEAKR抗体的细胞结合特征，通过流式细胞术测试与许多细胞系(HT29、HS68、HS578)的结合。进行NFκB报告子基因检测以评估所有所识别的11种抗体(人IgG1)的激动活性。选择具有最高的体外效力的抗体(TPP-883)用于进一步的效力和亲和力成熟(具体参见AK实施例1)。证明具有改进的激动活性的单取代变体：CDR-H3的G102T。最后，基于与最佳的单取代变体G102T相比提高的亲和力来选择7种变体。将其相应的DNA再克隆到哺乳动物IgG表达载体中并在上述NF-κB报搞子基因检测中检验功能活性。最后，将所得序列与人种系序列比较，并且修改对亲和力和效力没有显著影响的偏差。通过抗体库筛选和通过亲和力和/或效力成熟获得以下抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”和“TPP-1858”。
本发明的抗体还可通过本领域中已知的方法，如抗体噬菌体展示筛选(参见，例如，Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)；344-8)、确立的杂交瘤细胞(hybridome)技术(参见，例如，和Milstein Nature.1975年8月7日；256(5517)：495-7)，或小鼠免疫接种，尤其是hMAb小鼠(例如VelocImmune)的免疫接种获得。
抗-TWEAKR抗体的特定实施方案
本发明的一个实施方案是提供在一个或多个表达TWEAKR的细胞系中表现出半胱天冬酶3/7的强诱导的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。在一个优选实施方案中，所述一个或多个表达TWEAKR的细胞系包含于由WiDr、A253、NCI-H322、HT29和786-O组成的组中。可通过本领域中已知的常规方法(包括本文所述的方法)测量“半胱天冬酶3/7的诱导”。在一个实施方案中，使用用半胱天冬酶3/7溶液(Promega，#G8093)的活性测定和在VICTOR V(Perkin Elmer)上读取发光来测定根据本发明的“半胱天冬酶3/7的诱导”。在培养期结束时，测定半胱天冬酶3/7活性并测定相对于未处理的细胞的半胱天冬酶3/7的诱导系数。如果诱导系数大于1.2、优选大于1.5、甚至更优选大于1.8、甚至更优选大于2.1，甚至更优选大于2.5，则抗体被描述为表现出半胱天冬酶3/7的“强诱导”。本发明提供与先前描述的激动性抗体[例如PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]相比以及与300ng/ml重组人TWEAK相比导致HT29细胞中的半胱天冬酶3/7的更强诱导的抗-TWEAKR抗体。在WiDr、A253、NIC-H322和786-O细胞中也观察到诱导癌细胞中的半胱天冬酶3/7的这种强效力，其中大多数实验中所检测出的本发明的抗体与参考抗体[PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)]和与300ng/ml TWEAK相比诱导更高的偏差系数。本发明的一些抗体仅以明显低于内源性配体TWEAK的亲和力并且也低于其他已知的激动性抗体的中等亲和力(>10nM)结合到TWEAKR上。这种特性提供了进一步潜在优点，例如潜在地更深渗入肿瘤中。
在这方面，本发明的一个实施方案是提供在新型表位处特异性结合到TWEAKR上的抗体或其抗原结合抗体片段，其特征在于选择性结合到TWEAKR(SEQ ID NO:169；还参见图1)的47位处的天冬氨酸(D)(D47)上。对抗体相互作用的某些TWEAKR氨基酸识别的依赖性与对这些抗体测定的激动活性有关。天然配体TWEAK表现出TWEAKR的有效活化，并且由于TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域中的亮氨酸46而结合(Pellegrini等人，FEBS 280：1818-1829)。P4A8表现出极低的激动活性并至少与TWEAKR的富含半胱氨酸的结构域外的结构域部分地相互作用。PDL-192表现出中等激动活性并由于R56而结合到富含半胱氨酸的结构域上，但与TWEAK配体位点相对。本发明的抗体(例如TPP-2090)由于D47而结合，且TWEAK由于L46而结合。因此，TWEAK结合到相似但可辨别的结合位点上(图7)。因此，本发明的抗体——其表现出强激动活性——(由于D47)结合到与极强激动活性有关的新表位上。
TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位处的氨基酸(D47)被认为对根据本发明的抗体的结合至关重要，这意味着如果该抗体通过将该基团改变成丙氨酸而使其ELISA信号的缺失多于20％、或多于30％、或多于40％、或多于50％、或多于60％、或多于70％、或多于80％、或多于90％、或100％，则该抗体特异性结合到TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位处的D(D47)上，如AK实施例2和图6中所述。或者，如果该抗体与TPP-2203相比对TPP-2614的ELISA信号的缺失多于20％、或多于30％、或多于40％、或多于50％、或多于60％、或多于70％、或多于80％、或多于90％、或100％，则抗体特异性结合到TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位处的D(D47)上。优选地，如果该抗体与TPP-2203相比对TPP-2614的ELISA信号的缺失多于80％，则抗体特异性结合到TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位处的D(D47)上。
在本申请中，提及如下表中所示的本发明的以下优选抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”、“TPP-1858”、“TPP-2658”。
表：抗体的蛋白质序列
TPP-2090是：包含对应于SEQ ID NO:2的重链区和对应于SEQ ID NO:1的轻链区的抗体。
TPP-2658是：包含对应于SEQ ID NO:213的重链区和对应于SEQ ID NO:1的轻链区的抗体。
TPP-2149是：包含对应于SEQ ID NO:12的重链区和对应于SEQ ID NO:11的轻链区的抗体。
TPP-2093是：包含对应于SEQ ID NO:22的重链区和对应于SEQ ID NO:21的轻链区的抗体。
TPP-2148是：包含对应于SEQ ID NO:32的重链区和对应于SEQ ID NO:31的轻链区的抗体。
TPP-2084是：包含对应于SEQ ID NO:42的重链区和对应于SEQ ID NO:41的轻链区的抗体。
TPP-2077是：包含对应于SEQ ID NO:52的重链区和对应于SEQ ID NO:51的轻链区的抗体。
TPP-1538是：包含对应于SEQ ID NO:62的重链区和对应于SEQ ID NO:61的轻链区的抗体。
TPP-883是：包含对应于SEQ ID NO:72的重链区和对应于SEQ ID NO:71的轻链区的抗体。
TPP-1854是：包含对应于SEQ ID NO:82的重链区和对应于SEQ ID NO:81的轻链区的抗体。
TPP-1853是：包含对应于SEQ ID NO:92的重链区和对应于SEQ ID NO:91的轻链区的抗体。
TPP-1857是：包含对应于SEQ ID NO:102的重链区和对应于SEQ ID NO:101的轻链区的抗体。
TPP-1858是：包含对应于SEQ ID NO:112的重链区和对应于SEQ ID NO:111的轻链区的抗体。
TPP-2090是：包含对应于SEQ ID NO:10的重链可变区和对应于SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。
TPP-2658是：包含对应于SEQ ID NO:10的重链可变区和对应于SEQ ID NO:9的轻链可变区的抗体。
TPP-2149是：包含对应于SEQ ID NO:20的重链可变区和对应于SEQ ID NO:19的轻链可变区的抗体。
TPP-2093是：包含对应于SEQ ID NO:30的重链可变区和对应于SEQ ID NO:29的轻链可变区的抗体。
TPP-2148是：包含对应于SEQ ID NO:40的重链可变区和对应于SEQ ID NO:39的轻链可变区的抗体。
TPP-2084是：包含对应于SEQ ID NO:50的重链可变区和对应于SEQ ID NO:49的轻链可变区的抗体。
TPP-2077是：包含对应于SEQ ID NO:60的重链可变区和对应于SEQ ID NO:59的轻链可变区的抗体。
TPP-1538是：包含对应于SEQ ID NO:70的重链可变区和对应于SEQ ID NO:69的轻链可变区的抗体。
TPP-883是：包含对应于SEQ ID NO:80的重链可变区和对应于SEQ ID NO:79的轻链可变区的抗体。
TPP-1854是：包含对应于SEQ ID NO:90的重链可变区和对应于SEQ ID NO:89的轻链可变区的抗体。
TPP-1853是：包含对应于SEQ ID NO:100的重链可变区和对应于SEQ ID NO:99的轻链可变区的抗体。
TPP-1857是：包含对应于SEQ ID NO:110的重链可变区和对应于SEQ ID NO:109的轻链可变区的抗体。
TPP-1858是：包含对应于SEQ ID NO:120的重链可变区和对应于SEQ ID NO:119的轻链可变区的抗体。
表：抗体的DNA序列
抗-TWEAKR抗体的优选实施方案为以下：
特异性结合到TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位处的D(D47)上的无糖基化抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段。
实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体为激动性抗体。
实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段，其包含：
可变重链，其包含：
由包含式PYPMX的氨基酸序列(SEQ ID NO:171)编码的重链的CDR1，其中X为I或M；
由包含式YISPSGGXTHYADSVKG的氨基酸序列(SEQ ID NO:172)编码的重链的CDR2，其中X为S或K；和
由包含式GGDTYFDYFDY的氨基酸序列(SEQ ID NO:173)编码的重链的CDR3；
和可变轻链，其包含：
由包含式RASQSISXYLN的氨基酸序列(SEQ ID NO:174)编码的轻链的CDR1，其中X为G或S；
由包含式XASSLQS的氨基酸序列(SEQ ID NO:175)编码的轻链的CDR2，其中X为Q、A或N；和
由包含式QQSYXXPXIT的氨基酸序列(SEQ ID NO:176)编码的轻链CDR3，其中位置5处的X为T或S，位置6处的X为T或S且位置8处的X为G或F。
前述实施方案之一的抗体或其抗原结合片段，其包含：
包含如SEQ ID NO:6中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:7中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:8中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:3中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:4中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:5中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:16中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:17中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:18中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:13中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:14中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:15中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:26中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:27中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:28中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:23中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:24中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:25中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:36中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:37中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:38中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:33中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:34中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:35中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:46中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:47中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:48中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:43中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:44中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:45中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:56中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:57中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:58中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:53中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:54中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:55中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:66中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:67中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:68中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:63中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:64中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:65中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:76中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:77中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:78中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:73中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:74中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:75中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:86中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:87中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:88中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:83中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:84中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:85中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:96中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:97中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:98中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:93中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:94中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:95中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:106中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:107中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:108中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:103中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:104中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:105中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链，或
包含如SEQ ID NO:116中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:117中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:118中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，和
包含如SEQ ID NO:113中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO:114中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:115中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链。
前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合片段，其包含：
如SEQ ID NO:10中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:9中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:20中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:19中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:30中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:29中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:40中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:39中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:50中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:49中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:60中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:59中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:70中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:69中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:80中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:79中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:90中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:89中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:100中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:99中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:110中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:109中所示的轻链的可变序列，或
如SEQ ID NO:120中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:119中所示的轻链的可变序列。
前述实施方案中任一个的抗体，其为IgG抗体。
前述实施方案中任一个的抗体，其包含：
如SEQ ID NO:2中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:1中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:12中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:11中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:22中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:21中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:32中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:31中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:42中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:41中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:52中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:51中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:62中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:61中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:72中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:71中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:82中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:81中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:92中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:91中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:102中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:101中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:112中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:111中所示的轻链的序列，或
如SEQ ID NO:213中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:1中所示的轻链的序列。
前述实施方案中任一个的抗原结合片段或前述实施方案中任一个的抗体的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab’片段或F(ab’)2片段。
前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或其抗原结合片段。
前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其是人、人源化或嵌合抗体或抗原结合片段。
特别优选抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
同位素、盐、溶剂合物、同位素变体
本发明还包括本发明的化合物的所有合适的同位素变体。本发明的化合物的同位素变体在此应理解为意指这样的化合物：其中本发明的化合物中的至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于自然界中通常或主要存在的原子质量的另一种原子替换。可引入本发明的化合物中的同位素的实例为氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的那些，如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I和131I。本发明的化合物的特定同位素变体，尤其是其中已引入一种或多种放射性同位素的那些，可有益于例如检验作用机制或体内的活性成分分布；由于比较容易制备和检测，用3H或14C同位素标记的化合物尤其适于此目的。另外，同位素(例如氘)的引入可由于该化合物的更强的代谢稳定性而带来特定治疗益处，例如体内半衰期的延长或所需活性剂量的降低；因此本发明的化合物的此类改性在某些情况下也构成本发明的优选实施方案。本发明的化合物的同位素变体可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过下述方法和工作实施例中描述的方案、通过使用各个试剂和/或起始化合物的相应同位素改性来制备。
在本发明的上下中，优选的盐为本发明的化合物的生理学上可接受的盐。还包括本身不适合药物应用但可例如用于本发明的化合物的分离或纯化的盐。
本发明的化合物的生理学上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。
本发明的化合物的生理学上可接受的盐还包括常规碱的盐，例如且优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)和衍生自氨或具有1至16个碳原子的有机胺的铵盐，例如且优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2-乙二胺的铵盐。
溶剂合物在本发明的上下文中被描述为通过与溶剂分子配位而形成固态或液态的络合物的本发明的化合物的那些形式。水合物是溶剂合物的一种具体形式，其中与水配位。在本发明的上下文中优选的溶剂合物为水合物。
此外，本发明还包括本发明的化合物的前药。术语“前药”在本上下文中是指这样的化合物：其本身可为生物学活性或无活性的但在体内停留期间转化(例如代谢或水解)为本发明的化合物。
特定实施方案
下列实施方案特别优选：
实施方案A：
下式的ADC以及该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中KSP-L-代表下式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIi)、(IIj)、(IIk)或下式(IIf)的化合物，结合体(binder)为无糖基化抗-TWEAKR抗体(特别优选特异性结合到TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位处的氨基酸D(D47)上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2658)，且n代表1至10的数：
式(IIf)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H或F；
R3代表-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代(其中烷基优选为C1-3-烷基)；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选氟化的)C1-3-烷基、(任选氟化的)C2-4-烯基、(任选氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1，且
-L-代表连接体且#1代表与抗体连接的键。
该连接体优选为连接体
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与KSP连接的键且
§§代表与抗体连接的键，且
L2代表
其中
#1表示与抗体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，
且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2,
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子或-SO-的3元至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在此，#1为与KSP抑制剂连接的键且#2为与偶联至抗体的偶联基团(例如L2)连接的键。
实施方案B：
下式的ADC以及该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中KSP-L-代表下式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIi)、(IIj)、(IIk)的化合物或下式(IIg)的化合物，结合体(binder)为无糖基化抗-TWEAKR抗体，且n代表1至10的数：
式(IIg)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2和-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；
R3代表-L-#1或C1-10-烷基-，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代(其中烷基优选是C1-3-烷基)；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选氟化的)C1-3-烷基、(任选氟化的)C2-4-烯基、(任选氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中取代基R1和R3之一代表-L-#1，且
-L-代表连接体且#1代表与抗体连接的键，
其中-L-由以下表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与KSP连接的键且
§§代表与抗体连接的键，且
L2代表
其中
#1表示与抗体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，
且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2,
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子或-SO-的3元至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
#1为与KSP抑制剂连接的键且#2为与偶联至抗体的偶联基团(例如L2)连接的键。
实施方案C：
下式的ADC以及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中KSP-L-代表下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIi)、(IIj)、(IIk)或下式(IIh)的化合物，结合体(binder)为无糖基化抗-TWEAKR抗体，且n代表1至10的数：
式(IIh)：
其中
A代表CO(羰基)；
R1代表-L-#1；
R2和R4代表H，或R2和R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H；
R3代表C1-10-烷基-或-MOD，其可任选地被-OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代(其中烷基优选是C1-3-烷基)；
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或(其中如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链或支链的烃基，其具有1至10个碳原子且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团-MOD优选具有至少一个基团-COOH；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、(任选氟化的)C1-3-烷基、(任选氟化的)C2-4-烯基、(任选氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支链的C1-5-烷基基团；且
R9代表H或F，
其中-L-代表连接体且#1代表与抗体连接的键，
其中-L-由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与KSP连接的键且
§§代表与抗体连接的键，且
L2代表
其中
#1表示与抗体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，
且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2,
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3元至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中包括侧链的烃链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
#1为与KSP抑制剂连接的键且#2为与偶联至抗体的偶联基团(例如L2)连接的键。
实施方案D：
本发明还提供下列通式的结合体/活性化合物缀合物：
其中BINDER代表无糖基化抗-TWEAKR抗体，L代表连接体，WS代表活性化合物，优选KSP抑制剂，例如本发明的式(I)、(Ia)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)、(IIh)、(IIi)之一的KSP抑制剂，m代表1至2、优选1的数，且n代表1至50、优选1.2至20且特别优选2至8的数，其中L具有下列结构之一。在此，m代表每个连接体的活性化合物分子数量，且n意指每个BINDER的活性化合物/连接体缀合物数量。因此，缀合物分子中存在的所有WS的总和为m和n的乘积。
WS为在动物中、优选在人中具有局部或全身治疗作用的活性化合物。这些活性化合物通常具有低于5kDa、优选低于1.5kDa的分子量。优选的活性化合物是长春花生物碱、奥瑞斯他汀(auristatin)、微管溶素、多卡霉素、激酶抑制剂、MEK抑制剂和KSP抑制剂。
在此，L代表下式A3和A4之一
其中#1表示与结合体的硫原子连接的点，#2表示与活性化合物连接的点，x代表1或2，且R22代表COOH、COOR、COR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2、Br，优选COOH。
L1具有与上文相同的含义。优选地，-L1-#2由下式表示：
#3–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
#3表示与氮原子连接的点，
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表NHCO或则R10不代表NH2)，
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的3元至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中的其他间隔基团优选为
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，以优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于连接体与抗体连接的键的总数计)的程度存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，其为式A3或A4的两种结构之一。
含式A3或A4的连接体的缀合物可通过将抗体分别与适当的下式A3‘和A4‘的溴衍生物偶联而获得：
这些式A3‘或A4‘的溴衍生物可通过使HOOCCH2CHBrCOOR22或HOOCCHBrCH2COOR22与结合体的胺基团反应而获得，如以下方案30至32中以示例性的方式所述。
方案30：
[a):2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量TCEP，PBS缓冲液；d]PBS缓冲液，20h RT。]
方案31：
[a):2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT。]
实施方案E：
本发明还提供以下通式的结合体/活性化合物缀合物：
其中BINDER代表无糖基化抗-TWEAKR抗体，L代连接体，WS代表活性化合物、优选KSP抑制剂，例如，本发明的式(I)、(Ia)、(II)或(IIa)之一的KSP抑制剂，m代表1至2、优选1的数，且n代表1至50,、优选1.2至20且特别优选2至8的数，其中L具有以下结构之一。在此，m代表每个连接体的活性化合物分子数量且n意指每个BINDER的活性化合物/连接体缀合物数量。因此，缀合物分子中存在的所有WS的总和为m和n的乘积。
在此，L代表：
其中#1表示与抗体的硫原子连接的点，#2表示与活性化合物连接的点且R22代表COOH、COOR、COR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2、Br，优选COOH；因此与结合体的硫原子的连接可具有以下结构之一：
在每个抗体药物缀合物含有多于一个活性物质分子WS的抗体药物缀合物的情况下，式A1和/或A2的两种结构均可存在于抗体药物缀合物中。由于本发明的抗体药物缀合物可为不同抗体药物缀合物的混合物，该混合物还可包含式A1或式A2的抗体药物缀合物和式A1和A2的那些。
L5为选自-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-的基团，其中m、n、o、p和q彼此独立地具有以下值：m＝0-10；n＝0或1；o＝0-10；p＝0或1；和q＝0-10，其中m+n+o＝1-15，优选1-6。X代表5元或6元芳族或非芳族杂环或碳环，优选-C6H4-或-C6H10-。RS代表酸基团，优选-COOH或SO3H。
L6为选自-CONH-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCOO-、
的基团，其中r是1、2或3。
L7为单键或选自具有1至100个(优选1至10个)碳原子的直链或支链的烃链的基团，所述烃链来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基且可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)和/或具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2的3元至10元、优选5元至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
L5优选为基团-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m＝1-3，n＝0，o＝0-7，p＝0和q＝0或1。特别优选基团-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m＝1或2，n＝0，o＝0或1，p＝0和q＝0或1。
L6优选为选自-CONH-和-NHCO-的基团。
L7优选为单键或-[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
其中
w＝0至20；
x＝0至5；
y＝0或1；
z＝1至5；且
X4代表-O-、-CONH-、-NHCO-或
特别优选地，L7为单键或基团-[(CH2)x-NHCO-)]，其中x＝1至5。
特别优选地，-L5-L6-L7-代表-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-–NHCO-–[(CH2)x-NHCO-)]，其中m＝1或2，n＝0，o＝0或1，p＝0，且q＝0或1，且x＝1-5。
然而，这两种结构还可共同存在于本发明的缀合物中
根据本发明，这些抗体药物缀合物可由下式的化合物制备
其中L具有下式A‘
优选地，通过在pH为7.5至8.5、优选为8的pH缓冲液中，在低于37℃、优选10至25℃的温度下搅拌最多达40小时、优选1至15小时而将A‘转化为A。
实施方案I：
下式的抗体药物缀合物
其中
R2、R4和R5代表H；
R3代表-CH2OH；
R1代表-L1-L2-BINDER，其中
L1代表
其中#2代表与L2连接，且#1代表与其他连接的连接；
且L2代表以下式A5和A6的结构之一或两个：
其中
#1表示与抗体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR(其中R在每种情况下代表C1-3-烷基)、CONH2，优选COOH。
在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，以优选大于80％、特别优选大于90％(在每种情况下基于连接体与抗体连接的键的总数计)的程度存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，特别优选为式A5或A6的两种结构之一：
在此，式A5或A6的结构通常一起存在，优选以60:40至40:60的比例存在，基于与抗体连接的键的数量计。然后剩余键作为以下结构存在
该抗体优选为与TWEAKR(SEQ ID NO:169)的47位处的氨基酸D(D47)特异性结合的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
具体实施方案
提供下式之一的抗体缀合物，其中n为1至20的数且AK1和AK2为抗体。AK1为经由半胱氨酸连接的抗体，AK2为经由赖氨酸连接的抗体。
治疗用途
可使用本发明的化合物治疗的过度增殖性疾病特别包括癌症和肿瘤疾病。在本发明的上下文中，这些应理解为尤其意指下列疾病，但不限于它们：乳腺癌和乳腺肿瘤(乳腺癌包括导管和小叶形式，还为原位的(in situ))、呼吸道肿瘤(小细胞和非小细胞肺癌、支气管癌)、脑肿瘤(例如脑干肿瘤和丘脑肿瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤及神经外胚层和松果体瘤)、消化器官肿瘤(食道癌、胃癌、胆囊癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝肿瘤(尤其是肝细胞癌、胆管细胞癌和混合肝细胞胆管细胞癌)、头颈区的肿瘤(喉癌、下咽部癌、鼻咽癌、口咽癌、嘴唇癌和口腔癌，口腔黑色素瘤)、皮肤瘤(基底细胞瘤、spinaliomas、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、肥大细胞瘤)、基质和结缔组织的肿瘤(尤其是软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤(haemangiosarcomas)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤)、眼睛肿瘤(尤其是眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤)、内分泌腺和外分泌腺的肿瘤(例如甲状腺和甲状旁腺的肿瘤、胰腺和唾液腺癌、腺癌)、泌尿道肿瘤(膀胱、阴茎、肾、肾盂和输尿管的肿瘤)和生殖器官肿瘤(在女性中为子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌，在男性中为前列腺癌和睾丸癌)。这些还包括实体形式和作为循环细胞的血液、淋巴系统和脊髓的增殖性疾病，如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，例如急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓细胞性白血病和毛样细胞性白血病，以及AIDS相关的淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和中枢神经系统中的淋巴瘤。
这些在人类中已充分表征的疾病还可在其他哺乳动物中以可比较的病因学发生，并在此同样可用本发明的化合物治疗。
用本发明的化合物治疗上述癌症疾病包括实体瘤的治疗及其转移或循环形式的治疗。
在本发明的上下文中，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”以常规含义使用并且是指例如在癌症的情况下为了对抗、减轻、衰减或缓解疾病或健康异常和改善因该疾病受损的生存状况而关注、照料和看护患者。
因此，本发明还提供本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病、尤其是上述疾病的用途。
本发明还提供本发明的化合物用于制造用于治疗和/或预防疾病、尤其是上述疾病的药物的用途。
本发明还提供本发明的化合物在治疗和/或预防疾病、尤其是上述疾病的方法中的用途。
本发明还提供使用有效量的至少一种本发明的化合物治疗和/或预防疾病、尤其是上述疾病的方法。
本发明的化合物可以单独使用或如果需要，与一种或多种其他药理学活性物质组合使用，条件是这种组合不导致不期望的和不可接受的副作用。因此，本发明还提供包含至少一种本发明的化合物和一种或多种其他活性成分的药物，尤其用于治疗和/或预防上述疾病。
例如，本发明的化合物可与用于治疗癌症疾病的已知的抗过度增殖性、细胞生长抑制性或细胞毒性物质组合。合适的组合活性化合物的实例包括：
131I-chTNT、阿巴瑞克(abarelix)、阿比特龙(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、阿法替尼(afatinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、alisertib、阿利维A酸(alitretinoin)、alpharadin(氯化镭-223)、六甲蜜胺(altretamine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、AMP-514、氨柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、arglabin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、阿塞西普(atacicept)、atezolizumab、AT9283、avelumab、阿西替尼(axitinib)、阿扎胞苷(azacitidine)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝洛替康(belotecan)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博来霉素(bleomycin)、博纳吐单抗(blinatumomab)、BMS-936559、博舒替尼(bosutinib)、硼替佐米(bortezomib)、brentuximab vedotin、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡博替尼(cabozantinib)、亚叶酸钙(calcium folinate)、左亚叶酸钙、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡非佐米(carfilzomib)(蛋白酶体抑制剂)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、卡妥索单抗(catumaxomab)、塞来昔布(celecoxib)、西莫白介素(celmoleukin)、西妥昔单抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥、氯地孕酮(chlormadinone)、氮芥(chlormethine)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯膦酸(clodronic acid)、氯法拉滨(clofarabine)、copanlisib、crisantaspase、克唑替尼(crizotinib)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、CYC116、环丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D(dactinomycin)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、达拉菲尼(dabrafenib)、达鲁舍替(danusertib)、达沙替尼(dasatinib)、道诺霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)、地诺单抗(denosumab)、地洛瑞林(deslorelin)、二溴螺氯铵(dibrospidium chloride)、多西紫杉醇(docetaxel)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星+雌酮(doxorubicin+estrone)、durvalumab、依库丽单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依利醋铵(elliptinium acetate)、伊屈泼帕(eltrombopag)、内皮抑素(endostatin)、ENMD-2076、依诺他滨(enocitabine)、epacadostat、表柔比星(epirubicin)、环硫雄醇(epitiostanol)、阿法依泊汀(epoetin alfa)、倍他依泊汀(epoetin beta)、依他铂(eptaplatin)、艾日布林(eribulin)、埃罗替尼(erlotinib)、雌二醇(estradiol)、雌氮芥(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依维莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、法倔唑(fadrozole)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他米特(flutamide)、福美斯坦(formestane)、福莫司汀(fotemustine)、氟维司群(fulvestrant)、硝酸镓、加尼瑞克(ganirelix)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、吉姆单抗(gemtuzumab)、glutoxim、戈舍瑞林(goserelin)、GSK3174998、GSK3359609、组胺二盐酸盐(histamine dihydrochloride)、组氨瑞林(histrelin)、羟基脲、I-125粒子、伊班膦酸(ibandronic acid)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依鲁替尼(ibrutinib)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、咪喹莫特(imiquimod)、INCB24360、英丙舒凡(improsulfan)、干扰素-α(interferon alpha)、干扰素-β、干扰素-γ、易普利姆玛(ipilimumab)、伊立替康(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、lambrolizumab、兰瑞肽(lanreotide)、拉帕替尼(lapatinib)、来那度胺(lenalidomide)、来格司亭(lenograstim)、香菇多糖(lentinan)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、左旋咪唑(levamisole)、lirilumab、麦角乙脲(lisuride)、洛铂(lobaplatin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马索罗酚(masoprocol)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、美雄烷(mepitiostane)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、氨基乙酰丙酸甲酯(methylaminolevulinate)、甲睾酮(methyltestosterone)、米伐木肽(mifamurtide)、米替福新(miltefosine)、米铂(miriplatin)、二溴甘露醇、米托胍腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇(mitolactol)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、MLN-8054、Mps1抑制剂(公开在WO2013/087579，特别是实施例01.01；WO2014/131739，特别是实施例2中)、奈达铂(nedaplatin)、奈拉滨(nelarabine)、奈莫柔比星(nemorubicin)、尼洛替尼(nilotinib)、尼鲁米特(nilutamide)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼莫司汀(nimustine)、硝氨丙吖啶(nitracrine)、nivolumab、NMS-P715、NMS-P937、奥法木单抗(ofatumumab)、奥美拉唑(omeprazole)、奥普瑞白介素(oprelvekin)、奥戈伏单抗(oregovomab)、奥沙利铂(oxaliplatin)、p53基因疗法、紫杉醇(paclitaxel)、帕布昔利布(palbociclib)、帕利夫明(palifermin)、钯-103粒子、帕米膦酸(pamidronic acid)、帕尼单抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、培门冬酶(pegaspargase)、PEG-倍他依泊汀(epoetin beta)(甲氧基-PEG-倍他依泊汀)、聚乙二醇化非格司亭(pegfilgrastim)、聚乙二醇干扰素-α-2b(peginterferon alfa 2b)、派姆单抗(pembrolizumab)、培美曲塞(pemetrexed)、喷他佐辛(pentazocine)、喷司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、培磷酰胺(perfosfamide)、溶链菌(picibanil)、吡柔比星(pirarubicin)、pidilizumab、普乐沙福(plerixafor)、普卡霉素(plicamycin)、聚氨葡糖(poliglusam)、磷酸聚雌醇(polyestradiol phosphate)、多糖-K、帕纳替尼(ponatinib)、卟吩姆钠(porfimer sodium)、普拉曲沙(pralatrexate)、泼尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、喹高利特(quinagolide)、R763、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷莫司汀(ranimustine)、雷佐生(razoxane)、refametinib、瑞格非尼(regorafenib)、利塞膦酸(risedronic acid)、利妥昔单抗(rituximab)、罗米地辛(romidepsin)、罗米司亭(romiplostim)、roninciclib、鲁索替尼(ruxolitinib)、沙格司亭(sargramostim)、sipuleucel-T、西佐糖(sizofiran)、索布佐生(sobuzoxane)、甘氨双唑钠(sodium glycididazole)、SNS-314、索拉非尼(sorafenib)、链脲菌素(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、他拉泊芬(talaporfin)、他米巴罗汀(tamibarotene)、他莫昔芬(tamoxifen)、他索纳明(tasonermin)、替西白介素(teceleukin)、替加氟(tegafur)、替加氟+吉美拉西(gimeracil)+奥特拉西(oteracil)、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺(temozolomide)、坦罗莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮(testosterone)、替曲膦(tetrofosmin)、沙利度胺(thalidomide)、塞替哌(thiotepa)、胸腺法新(thymalfasin)、TKM-PLK1、硫鸟嘌呤(tioguanine)、托珠单抗(tocilizumab)、拓扑替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、tozasertib、曲贝替定(trabectedin)、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲妥珠单抗-美坦辛、tremelimumab、苏消安(treosulfan)、维甲酸(tretinoin)、曲洛司坦(trilostane)、曲普瑞林(triptorelin)、曲洛磷胺(trofosfamide)、色氨酸(tryptophan)、乌苯美司(ubenimex)、urelumab、戊柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、伐普肽(vapreotide)、varlilumab、威罗菲尼(vemurafenib)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春氟宁(vinflunine)、长春瑞滨(vinorelbine)、volasertib、伏立诺他(vorinostat)、伏氯唑(vorozole)、XL228、钇-90玻璃微球、净司他丁(zinostatin)、净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)、唑来膦酸(zoledronic acid)、佐柔比星(zorubicin)。
另外，本发明的化合物可例如与结合体组合，该结合体例如可与下列靶标结合：OX-40、CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3、CD40。
另外，本发明的化合物还可与放射疗法和/或外科手术组合使用。
通常，可将本发明的化合物与其他细胞抑制或细胞毒性活性剂组合来追求下列目标：
与用单一活性化合物治疗相比，改进在减慢肿瘤生长、降低其尺寸或甚至完全消除它的方面的效力；
以比单一疗法中更低的剂量使用所用的化疗药物的可能性；
与单独给药相比，具有更小副作用的更耐受治疗的可能性；
治疗更广谱的肿瘤疾病的可能性；
实现更高的治疗响应率；
与当今标准疗法相比，更长的患者生存时间。
另外，本发明的化合物还可与放射疗法和/或外科手术组合使用。
本发明还提供包含至少一种本发明化合物，通常还有一种或多种惰性、无毒、药学上适合的赋形剂的药剂，及其用于上述目的的用途。
本发明的化合物可全身和/或局部发挥作用。为此，它们可以合适的方式，例如肠胃外、可吸入或作为植入物或支架给药。
本发明的化合物可以适合这些给药途径的给药形式给药。
肠胃外给药可绕过吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内或腰内)或包括吸收(例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹腔内)。适合肠道外给药的给药形式包括溶液、混悬剂、乳剂或冻干产物形式的用于注射和输液的制剂。优选的是肠胃外给药，尤其是静脉内给药。
通常已发现，在肠胃外给药的情况下，有利的是给药量为约0.001至1mg/kg、优选约0.01至0.5mg/kg体重以实现有效结果。
然而，在某些情况下可需要偏离所述量，具体取决于体重、给药途径、个体对活性成分的响应、制剂性质和给药时间或给药间隔。因此，在某些情况下，少于上述最低量可能是足够的，而在另一些情况下，必须超过所述上限。在给予更大量的情况下，可建议将它们分成一天内的几个单个剂量。
实施例
以下实施例说明本发明。本发明不限于这些实施例。
除非另有说明，以下试验和实施例中的百分比为重量百分比；份数为重量份。液体/液体溶液的溶剂比、稀释比和浓度数据在每种情况下基于体积计。
如果在实验的说明中没有说明进行反应的温度，则可认为是室温。
合成途径：
对于工作实施例的示例，下列方案示出得到该工作实施例的示例性合成途径：
方案20：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案21：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案22：中间体的合成
[a):例如三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)例如乙酰氧基乙酰氯，NEt3，DCM，RT；c)例如LiOH，THF/水，RT；d)例如H2，Pd-C，EtOH，RT；e)例如Teoc-OSu，NEt3，二噁烷，RT；f)例如Fmoc-Cl，二异丙基乙胺，二噁烷/水2:1，RT]
方案24：中间体的合成
[a):例如溴化苄，Cs2CO3，DMF，RT；b)例如Pd(dppf)2Cl2；DMF；Na2CO3；85℃；c)例如LiAlH4，THF，0℃；MnO2，DCM，RT；d)例如Ti(iOPr)4，THF，RT；e)例如tBuLi，THF，-78℃；MeOH，NH4Cl；f)例如HCl/1,4-二噁烷]
方案25：半胱氨酸-连接的ADC的合成
方案26：经水解的琥珀酰胺合成半胱氨酸-连接的ADC
特别地，对于其中L1＝CH2或其中L1＝CH-CH3或其中L1＝苯基的ADC，该方法用于将这些ADC转化为开链连接形式。
方案27：ADC前体分子的合成
[a):三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰氯，二异丙基乙胺，DCM，RT；c)LiOH，MeOH，RT；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案28：ADC前体分子的合成
[a):HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案29：ADC前体分子的合成
[a):三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰氯，三乙胺，DCM，RT；c)LiOH，MeOH，RT；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案30：
[a):2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT。]
方案31：
[a):2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)，DCM，吡啶，RT；b)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA；c)3-4当量TCEP，PBS缓冲液；d)PBS缓冲液，20h RT。]
方案32：基于吡咯的KSP-I前体的合成
[a)例如二甲基锌，环己基MgCl，THF，-78℃；NH4Cl；b)例如HCl/1,4-二噁烷]
方案33：ADC前体分子的合成
[a):三乙酰氧基硼氢化钠，乙酸，DCM，RT；b)乙酰氧基乙酰氯，三乙胺，DCM，RT；c)L-半胱氨酸，NaHCO3，DBU，异丙醇/水，RT；d)3-硫烷基丙酸，K2CO3，RT；e)连接体，HATU，DMF，二异丙基乙胺，RT；e)氯化锌，三氟乙醇，50℃，EDTA。]
方案34：赖氨酸-连接的ADC的合成
方案35：赖氨酸-连接的ADC的合成
A.实施例
缩写和首字母缩略词：
A431NS 人肿瘤细胞系
A549 人肿瘤细胞系
ABCB1 ATP-结合盒亚族B成员1(P-gp和MDR1的同义词)
abs. 无水的
Ac 乙酰基
ACN 乙腈
aq. 含水，水性溶液
ATP 三磷酸腺苷
BCRP 乳腺癌耐药蛋白，一种外排转运蛋白
BEP 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐
Boc 叔丁氧基羰基
br. 宽峰(在NMR中)
Ex. 实施例
BxPC3 人肿瘤细胞系
CI 化学电离(在MS中)
d 双重峰(在NMR中)
d 天
TLC 薄层色谱法
DCI 直接化学电离(在MS中)
DCM 二氯甲烷
dd 双二重峰(在NMR中)
DMAP 4-N,N-二甲基氨基吡啶
DME 1,2-二甲氧基乙烷
DMEM 杜尔贝科改良的Eagle培养基(用于细胞培养的标准化营养培养基)
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
DPBS,D-PBS, 杜尔贝科磷酸盐缓冲盐溶液
PBS PBS＝DPBS＝D-PBS，pH 7.4，购自Sigma，No D8537
组成：
0.2g KCl
0.2g KH2PO4(无水)
8.0g NaCl
1.15g Na2HPO4(无水)
用H2O添加到1升
dt 双三重峰(在NMR中)
DTT DL-二硫苏糖醇
EDC N'-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐
EGFR 表皮生长因子受体
EI 电子碰撞电离(在MS中)
ELISA 酶联免疫吸附测定法
eq. 当量
ESI 电喷射离子化(在MS中)
ESI-MicroTof ESI-MicroTofq(质谱仪名称，其中Tof＝飞行
q 时间和q＝四极)
FCS 胎牛血清
Fmoc (9H-芴-9-基甲氧基)羰基
sat. 饱和的
GTP 5’-三磷酸鸟苷
h 小时
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HCT-116 人肿瘤细胞系
HEPES 4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸
HOAc 乙酸
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt 1-羟基-1H-苯并三唑水合物
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
HPLC 高压高效液相色谱法
HT29 人肿瘤细胞系
IC50 半数最大抑制浓度
i.m. 肌肉内，给药到肌肉内
i.v. 静脉内，给药到静脉内
conc. 浓的
KU-19-19 人肿瘤细胞系
LC-MS 液相色谱法-质谱法联用
LLC-PK1 Lewis肺癌猪肾细胞系
cells
L-MDR 转染LLC-PK1细胞的人MDR1
LoVo 人肿瘤细胞系
m 多重峰(在NMR中)
MDR1 多药耐药蛋白1
MeCN 乙腈
min 分钟
MS 质谱法
MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物3
NCI-H292 人肿瘤细胞系
NCI-H520 人肿瘤细胞系
NMM N-甲基吗啉
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振谱法
NMRI 小鼠品系，源自Naval Medical Research Institute(NMRI)
NSCLC 非小细胞肺癌
PBS 磷酸盐缓冲盐溶液
Pd/C 活性炭负载的钯
P-gp P-糖蛋白，一种转运蛋白
PNGaseF 用于裂解糖的酶
quant. 定量(在产率中)
quart 四重峰(在NMR中)
quint 五重峰(在NMR中)
Rf 保留指数(在DC中)
RT 室温
Rt 停留时间(在HPLC中)
s 单峰(在NMR中)
s.c. 皮下，在皮肤下给药
SCC-4 人肿瘤细胞系
SCC-9 人肿瘤细胞系
SCID小鼠 具有重度联合免疫缺陷的试验小鼠
t 三重峰(在NMR中)
TBAF 四正丁基氟化铵
TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基
tert 叔
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物
UV 紫外光谱法
v/v (溶液的)体积比
Z 苄氧基羰基
HPLC和LC-MS方法：
方法1(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ50x 1mm；流动相A：1L水+0.25ml 99％浓度的甲酸，流动相B：1l乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→1.2min 5％A→2.0min 5％A，烘箱：50℃；流速：0.40ml/min；UV检测：208-400nm。
方法(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，BEH300，2.1x 150mm，C18 1.7μm；流动相A：1L水+0.01％甲酸；流动相B：1L乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％B→1.5min 2％B→8.5min 95％B→10.0min 95％B；烘箱：50℃；流速：0.50ml/min；UV检测：220nm
方法3(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)QM；HPLC仪器：Agilent 1100Series；柱：AgilentZORBAX Extend-C18 3.0x 50mm 3.5-微米；流动相A：1L水+0.01mol碳酸铵，流动相B：1L乙腈；梯度：0.0min 98％A→0.2min 98％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；烘箱：40℃；流速：1.75ml/min；UV检测：210nm
方法4(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，HSST3，2.1x 50mm，C18 1.8μm；流动相A：1L水+0.01％甲酸；流动相B：1L乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％B→0.3min 10％B→1.7min 95％B→2.5min 95％B；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：210nm
方法5(LC-MS)：
仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μ50x 1mm；流动相A：1L水+0.25ml 99％浓度的甲酸，流动相B：1L乙腈+0.25ml 99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 95％A→6.0min 5％A→7.5min 5％A；烘箱：50℃；流速：0.35ml/min；UV检测：210-400nm。
方法6(LC-MS)：
仪器：具有Waters UPLC Acquity的Micromass Quattro Premier；柱：ThermoHypersil GOLD 1.9μ50x 1mm；流动相A：1L水+0.5ml 50％浓度的甲酸，流动相B：1L乙腈+0.5ml 50％浓度的甲酸；梯度：0.0min 97％A→0.5min 97％A→3.2min 5％A→4.0min 5％A；烘箱：50℃；流速：0.3ml/min；UV检测：210nm。
方法7(LC-MS)：
仪器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；柱：Waters Acquity UPLCHSS T3 1.8μ50x 2.1mm；流动相A：1L水+0.25ml 99％浓度的甲酸，流动相B：1L乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min 90％A→0.3min 90％A→1.7min 5％A→3.0min 5％A；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：205-305nm。
方法8(LC-MS)：
MS仪器类型：Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型：Waters Acquity I-CLASS；柱：Waters，HSST3，2.1x 50mm，C18 1.8μm；流动相A：1L水+0.01％甲酸；流动相B：1L乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 2％B→2.0min 2％B→13.0min 90％B→15.0min 90％B；烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；UV检测：210nm
方法9：用于实施例181-191的LC-MS-制备型纯化方法(方法LIND-LC-MS-Prep)
MS仪器：Waters，HPLC仪器：Waters(柱Waters X-Bridge C18，19mm x 50mm，5μm，流动相A：水+0.05％氨，流动相B：具有梯度的乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV检测：DAD；210-400nm)。
或者
MS仪器：Waters，HPLC仪器：Waters(柱Phenomenex Luna 5μ C18(2)100A，AXIATech.50x 21.2mm，流动相A：水+0.05％甲酸，流动相B：具有梯度的乙腈(ULC)；流速：40ml/min；UV检测：DAD；210-400nm)。
方法10:用于实施例181-191的LC-MS分析方法(LIND_SQD_SB_AQ)
MS仪器：Waters SQD；仪器HPLC：Waters UPLC；柱：Zorbax SB-Aq(Agilent)，50mmx 2.1mm，1.8μm；流动相A：水+0.025％甲酸，流动相B：乙腈(ULC)+0.025％甲酸；梯度：0.0min 98％A-0.9min 25％A-1.0min 5％A-1.4min 5％A-1.41min 98％A-1.5min 98％A；烘箱：40℃；流速：0.600ml/min；UV检测：DAD；210nm。
方法11(HPLC)：
仪器：HP1100系列
柱：Merck Chromolith SpeedROD RP-18e，50-4.6mm，目录号1.51450.0001，前置柱Chromolith Guard Cartridge Kit，RP-18e，5-4.6mm，目录号1.51470.0001
梯度：流速5ml/min
注射体积5μl
溶剂A：HClO4(70％浓度)于水中(4ml/l)
溶剂B：乙腈
起点20％B
0.50min 20％B
3.00min 90％B
3.50min 90％B
3.51min 20％B
4.00min 20％B
柱温度：40℃
波长：210nm
方法12(LC-MS)：
MS仪器类型：Thermo Scientific FT-MS；UHPLC+仪器类型：Thermo ScientificUltiMate 3000；柱：Waters，HSST3，2.1x 75mm，C18 1.8μm；流动相A：1L水+0.01％甲酸；流动相B：1L乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％B→2.5min 95％B→3.5min 95％B；烘箱：50℃；流速：0.90ml/min；UV检测：210nm/最佳积分路径210-300nm
方法13:(LC-MS)：
MS仪器：Waters(Micromass)Quattro Micro；Instrument Waters UPLC Acquity；柱：Waters BEH C18 1.7μ50x 2.1mm；流动相A：1L水+0.01mol甲酸铵，流动相B：1L乙腈；梯度：0.0min 95％A→0.1min 95％A→2.0min 15％A→2.5min 15％A→2.51min 10％A→3.0min 10％A；烘箱：40℃；流速：0.5ml/min；UV检测：210nm。
方法14:(LC-MS)：
MS仪器类型：ThermoFisherScientific LTQ-Orbitrap-XL；HPLC仪器类型：Agilent 1200SL；柱：Agilent，POROSHELL 120，3×150mm，SB-C18 2.7μm；流动相A：1L水+0.1％三氟乙酸；流动相B：1L乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min 2％B→0.3min 2％B→5.0min95％B→10.0min 95％B；烘箱：40℃；流速：0.75ml/min；UV检测：210nm
未在下文中明确描述其制备的所有反应物或试剂均可从通常可获得的来源购得。对于同样未在下文中描述其制备且不能商购获得或从通常不能获得的来源获得的所有其他反应物或试剂，参考记载其制备的出版文献。
原料和中间体：
中间体C2
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯
将4.22g(14.5mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶于180ml二氯甲烷中，并随后加入3.5ml吡啶和9.2g(21.7mmol)1,1,1-三乙酰氧基-1λ5,2-苯并碘氧戊环-3(1H)-酮。将混合物在RT下搅拌1h，然后用500ml二氯甲烷稀释并用10％浓度的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后依次用5％浓度的柠檬酸萃取两次和用10％浓度的碳酸氢钠溶液萃取两次。分离出有机相，经硫酸镁干燥，然后在减压下浓缩。将残余物溶于DCM中，并加入二乙醚和正戊烷的混合物。滤出沉淀物，然后浓缩滤液并从乙腈/水中冻干。得到3.7g(93％)(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，其不经进一步纯化即用于后续步骤(Rf值：0.5(DCM/甲醇95/5))。
将3.5g(9.85mmol)中间体C1溶解在160ml DCM中，并加入3.13g(14.77mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.7ml乙酸。在RT下搅拌5min后，加入3.23g(11.85mmol)(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，并将该混合物在RT下再搅拌30min。然后在减压下蒸发溶剂并将残余物溶于乙腈/水中。滤出沉淀的固体并干燥，得到5.46g(84％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.5min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝613(M+H)+。
中间体C11
R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸盐(1:1)
首先将990.0mg(2.79mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺加入15.0ml二氯甲烷中，并加入828.8mg(3.91mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和129.9mg(3.21mmol)乙酸，并将混合物在RT下搅拌5min。加入溶解在15.0ml二氯甲烷中的698.1mg(3.21mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯(中间体L58)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物在硅胶上纯化(流动相:二氯甲烷/甲醇＝100:2)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.25g(理论值的73％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝556(M+H)+。
将151.4mg(1.5mmol)三乙胺和161.6mg(1.43mmol)氯乙酰氯加入400.0mg(0.65mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将乙酸乙酯加入该反应混合物，并将有机相用水洗涤三次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(流动相:环己烷/乙酸乙酯＝3:1)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到254.4mg(理论值的57％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIneg):m/z＝676(M+HCOO-)-。
将117.4mg(0.19mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯溶于10.0ml异丙醇中，并加入928.4μl 1M NaOH和50.2mg(0.37mmol)DL-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌4.5h。将乙酸乙酯加入该反应混合物中，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到75.3mg(理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.24min；MS(ESIpos):m/z＝731(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.40(m,1H),0.75-0.91(m,11H),1.30(m,1H),1.99-2.23(m,2H),2.63-2.88(m,4H),3.18-3.61(m,5H),3.79-4.10(m,3H),4.89(d,1H),4.89(d,1H),5.16(d,1H),5.56(s,1H),6.82(m,1H),6.91(s,1H),6.97(m,1H),7.13-7.38(m,6H),7.49(s,1H),7.63(m,1H),8.26(s,3H)。
中间体C12
R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸
类似于中间体C11的合成，使用(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(中间体L57)和中间体C52作为原料进行合成。
LC-MS(方法1):Rt＝1.18min；MS(ESIpos):m/z＝775(M+H)+。
中间体C52
(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
首先将10.00g(49.01mmol)4-溴-1H-吡咯-2-羧酸甲酯加入100.0DMF中，并加入20.76g(63.72mmol)碳酸铯和9.22g(53.91mmol)溴化苄。将反应混合物在RT下搅拌过夜。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配，并将水相用乙酸乙酯萃取。合并的有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。用90.0g 4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯重复该反应。
将两种合并的反应通过制备型RP-HPLC(柱：Daiso 300x100；10μ,流速：250ml/min,MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到125.15g(理论值的87％)化合物1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.18min；MS(ESIpos):m/z＝295[M+H]+。
在氩气下，首先将4.80g(16.32mmol)1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯加入DMF中，并加入3.61g(22.85mmol)(2,5-二氟苯基)硼酸、19.20ml饱和碳酸钠溶液和1.33g(1.63mmol)[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯钯(II):二氯甲烷。将反应混合物在85℃下搅拌过夜。将反应混合物经Celite过滤，并将滤饼用乙酸乙酯洗涤。将有机相用水萃取，然后用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(流动相：环己烷/乙酸乙酯100:3)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到3.60g(理论值的67％)化合物1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。
LC-MS(方法7):Rt＝1.59min；MS(ESIpos):m/z＝328[M+H]+。
首先将3.60g(11.00mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯加入90.0ml THF中，并在0℃下加入1.04g(27.50mmol)氢化锂铝(2.4M于THF)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。在0℃下，加入饱和酒石酸钾钠溶液，并向反应混合物中加入乙酸乙酯。将有机相用饱和酒石酸钾钠溶液萃取三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂并将残余物溶于30.0ml二氯甲烷中。加入3.38g(32.99mmol)二氧化锰(IV)，并将混合物在RT下搅拌48h。再加入2.20g(21.47mmol)二氧化锰(IV)，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物经Celite过滤，并将滤饼用二氯甲烷洗涤。在减压下蒸发溶剂，残余物2.80g(1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)不经进一步纯化即用于该合成的后续步骤。
LC-MS(方法7):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝298[M+H]+。
首先将28.21g(94.88mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛以及23.00g(189.77mmol)(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入403.0ml无水THF中，并加入67.42g(237.21mmol)异丙氧化钛(IV)，并且将混合物在RT下搅拌过夜。加入500.0ml饱和NaCl溶液和1000.0ml乙酸乙酯，并将混合物在RT下搅拌1h。将混合物经硅藻土过滤，并将滤液用饱和NaCl溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物使用BiotageIsolera(硅胶，柱1500+340g SNAP，流速200ml/min，乙酸乙酯/环己烷1:10)纯化。
LC-MS(方法7):Rt＝1.63min；MS(ESIpos):m/z＝401[M+H]+。
首先在氩气下将25.00g(62.42mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入无水THF中并冷却至-78℃。然后在-78℃下加入12.00g(187.27mmol)叔丁基锂(1.7M溶液于戊烷中)，并将混合物在此温度下搅拌3小时。然后在-78℃下依次加入71.4ml甲醇和214.3ml饱和氯化铵溶液，并使反应混合物温热至RT并在RT下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺不经进一步纯化即用于该合成的后续步骤。
LC-MS(方法6):Rt＝2.97min；MS(ESIpos):m/z＝459[M+H]+。
首先将28.00g(61.05mmol)(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入186.7ml1,4-二噁烷中，然后加入45.8ml HCl于1,4-二噁烷的溶液(4.0M)。将反应混合物在RT下搅拌2h，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Kinetix 100x30；流速:60ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发乙腈，并将二氯甲烷加入到水性残余物中。将有机相用碳酸氢钠溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到16.2g(理论值的75％)标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.10min；MS(ESIpos):m/z＝338[M-NH2]+,709[2M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.87(s,9H),1.53(s,2H),3.59(s,1H),5.24(d,2H),6.56(s,1H),6.94(m,1H),7.10(d,2H),7.20(m,1H),7.26(m,2H),7.34(m,2H),7.46(m,1H)。
中间体C53
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，类似于中间体C58，将中间体C52用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯还原烷基化。然后如中间体C58所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化，随后将这两种酯基用2M于甲醇中的氢氧化锂溶液水解。将由此获得的中间体溶于乙醇中，加入碳负载的钯(10％)，并将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化1h。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙胺的存在下，使用氯甲酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基团。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝734(M-H)-。
中间体C54
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酰基]-β-丙氨酸
首先，类似于中间体C2，将中间体C52用N-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酰基]-β-丙氨酸苄酯还原烷基化。然后如中间体C58所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化。将由此获得的中间体溶于甲醇中，加入碳负载的钯(10％)，并将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化1h。随后将酯基团用2M于甲醇中的氢氧化锂溶液水解。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙基胺的存在下，使用氯甲酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基团。得到48mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝807(M+H)+。
中间体C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸
首先，类似于中间体C2，将中间体C52用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯还原烷基化。然后如中间体C27所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化，随后将这两种酯基用2M于甲醇中的氢氧化锂溶液水解。将由此获得的中间体溶于乙醇中，加入碳负载的钯(10％)，并将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化1h。
将500mg(0.886mmol)该完全脱保护的中间体溶于60ml二噁烷中，并加入253mg(0.975mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和198μl三乙胺。在RT下搅拌24h后，将反应浓缩，并且将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当级分合并、在减压下浓缩并在高真空下干燥，得到312mg(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.61min；MS(ESIpos):m/z＝658(M+H)+。
或者，通过以下途径制备中间体C58：
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶解在525ml DCM中，并加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5min后，加入溶于175ml DCM的8.99g(24.5mmol)中间体L57，并将反应在RT下再搅拌45min。然后将反应用300ml DCM稀释并用100ml碳酸氢钠溶液洗涤两次和用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。随后将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Chromatorex C18)纯化。将适当级分合并后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.6g(理论值的61％)(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614(M+H)+。
首先将2.06g(3.36mmol)该中间体加入76ml DCM中，并在2.1ml三乙胺的存在下用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化。在RT下搅拌20h后，加入0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙酯和0.94ml三乙胺，并将反应在RT下再搅拌15min。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释，并依次用300ml 5％浓度的柠檬酸萃取两次、用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次以及用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，随后经硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到2.17g(理论值的79％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
将2.17mg(2.64mmol)该中间体溶于54ml THF和27ml水中，并加入26ml 2摩尔氢氧化锂溶液。将混合物在RT下搅拌30min，随后使用1.4ml TFA将pH调节至3-4。将混合物在减压下浓缩。一旦将大部分THF蒸馏出，则将水性溶液用DCM萃取两次，随后在减压下浓缩至干燥。将残余物通过制备型HPLC(柱：Chromatorex C18)纯化。在将适当级分合并后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到1.1g(理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝656(M-H)-。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.58(m,1H),0.74-0.92(m,11H),1.40(m,1H),3.3(m,2H),3.7(m,1H),3.8-4.0(m,2H),4.15(q,2H),4.9和5.2(2d,2H),5.61(s,1H),6.94(m,2H),7.13-7.38(m,7H),7.48(s,1H),7.60(m,1H),12.35(s,1H)。
中间体C59
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，如中间体C53所述，将(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸苄基酯的仲氨基在三乙胺的存在下用(2S)-2-甲氧基丙酰氯(中间体C53的中间体)酰化。将所得的中间体溶于乙醇中，加入碳负载的钯(10％)，并将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化1h。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙胺的存在下使用氯甲酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基团。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝764(M-H)-。
中间体C60
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
类似于中间体C53进行合成。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝750(M+H)+。
中间体C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-β-丙氨酸
通过将60mg(0.091mmol)中间体C58与β-丙氨酸甲酯偶联、随后用2M氢氧化锂溶液进行酯裂解来制备标题化合物。经2步得到67mg(理论值的61％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.29min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C62
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸
类似于中间体C61，由中间体C58和D-丙氨酸甲酯制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C64
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
类似于中间体C63，由中间体C58制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝2.4min；
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝700(M+H)+。
中间体C65
(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
首先将215mg(0.59mmol)中间体L66加入25ml二氯甲烷中，并加入377mg(0.89mmol)戴斯马丁氧化剂(Dess-Martin periodinane)和144μl(1.78mmol)吡啶。将混合物在RT下搅拌30min。然后将反应用300ml二氯甲烷稀释，并将有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液、10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液各洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。得到305mg醛，其不经进一步纯化即反应。
将175mg(0.49mmol)中间体C52溶于50ml二氯甲烷中，并加入147mg(0.69mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和32.5μl乙酸。在RT下搅拌5min后，加入214mg(0.593mmol)上述醛，并将反应在RT下搅拌过夜。在此，代替预期产物，形成[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丁烷-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。由于该酰亚胺也可转化为标题化合物，因此将反应浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。在将适当的含酰亚胺的级分合并后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到195mg(58％)上述酰亚胺。
LC-MS(方法5):Rt＝3.32min；MS(ESIpos):m/z＝667(M+H)+。
将65mg(97.5μmol)该酰亚胺溶于15ml二氯甲烷中，并加入367μl(3.4mmol)乙酰氧基乙酰氯和595μl N,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌30min后，将反应在不加热下在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当级分合并，蒸发溶剂并在高真空下干燥后，得到28mg(理论值的37％)(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基乙酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min；MS(ESIpos):m/z＝767(M+H)+。
将28mg(37μmol)该中间体溶于3ml甲醇中，并加入548μl 2M氢氧化锂溶液。在RT下搅拌10min后，用三氟乙酸将反应调节至pH为4，随后浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当级分合并，蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物，得到26mg(理论值的96％)标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝743(M+H)+。
中间体C66
2-(三甲基甲硅烷基)乙基[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(甘氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸酯
首先，根据肽化学的经典方法(HATU缀合和Boc裂解)，由N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸苄基酯(1:1)。
将13mg(0.036mmol)该中间体和25mg(0.033mmol)中间体C58溶于3ml DMF中，并加入19mg(0.05mmol)HATU和17μl N,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌10min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。得到17.8mg(理论值的60％)中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝891(M+H)+。
将17mg(0.019mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，加入碳负载的钯(10％)，并将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化2h。滤出催化剂，在减压下蒸发溶剂，并在高真空下干燥残余物。得到9mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝757(M+H)+。
中间体C67
9H-芴-9-基甲基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯
首先将605.3mg(1.71mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)加入10.0ml二氯甲烷中，并加入506.7mg(2.39mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和117.9mg(1.96mmol)乙酸，并且将混合物在RT下搅拌5min。加入溶于10.0ml二氯甲烷中的580.0mg(1.96mmol)9H-芴-9-基甲基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯(中间体L70)，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(流动相：环己烷/乙酸乙酯3:1)纯化。在减压下蒸发溶剂，并在高真空下干燥残余物。得到514.7mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.10min；MS(ESIpos):m/z＝634(M+H)+。
中间体C69
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸
首先将117.0mg(0.19mmol)(2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体C70)和21.6mg(0.20mmol)3-硫烷基丙酸加入3.0ml甲醇中，加入89.5mg(0.65mmol)碳酸钾，并将混合物在50℃下搅拌4h。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并在高真空下干燥残余物。该残余物不经进一步纯化即用于该合成的后续步骤中。得到106.1mg(理论值的73％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.42min；MS(ESIneg):m/z＝700(M-H)-。
中间体C70
(2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯
首先将908.1mg(1.63mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯(参见中间体C11的合成)和545.6mg(5.39mmol)三乙胺加入10.0ml二氯甲烷中，并将混合物冷却至0℃。在此温度下，加入590.5mg(5.23mmol)氯乙酰氯，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液各洗涤三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并在高真空下干燥残余物。得到673.8mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIneg):m/z＝676(M+HCOO-)-。
中间体C71
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将536.6mg(4.43mmol)L-半胱氨酸与531.5mg(6.33mmol)碳酸氢钠一起悬浮在2.5mL水中。加入溶于25.0ml异丙醇中的400.0mg(0.63mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体C70)和1.16g(7.59mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入该反应混合物中，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤并用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并在高真空下干燥残余物。得到449.5mg(理论值的86％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.20min；MS(ESIpos):m/z＝717(M+H)+。
中间体C72
(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
首先将90mg(0.212mmol)中间体L72加入6ml二氯甲烷中，并加入86μl(1.06mmol)吡啶和135mg(0.318mmol)戴斯马丁氧化剂。将混合物在RT下搅拌30min。然后将反应用30ml二氯甲烷稀释，并将有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液洗涤两次和用5％浓度的柠檬酸溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。由此获得的醛不经进一步纯化即可反应。
将63mg(0.177mmol)中间体C52溶于15ml二氯甲烷中，并加入52.4mg(0.247mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和20.2μl乙酸。在RT下搅拌5min后，加入89.6mg(0.212mmol)上述醛，并将反应在RT下搅拌20min。将反应在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。在将适当级分合并后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到71mg(经2步为理论值的53％)(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄基酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝761(M+H)+。
将70mg(92μmol)该中间体溶于15ml二氯甲烷中，将混合物冷却至10℃，并加入54μl三乙胺和25.5μl(0.23mmol)乙酰氧基乙酰氯。在RT下搅拌1h后，加入相同量的酰基氯和三乙胺，并在RT下再搅拌1小时后再次加入。然后将反应在RT下再搅拌30min，随后在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当级分合并，蒸发溶剂并将残余物从乙腈/水中冻干后得到46.5mg(理论值的59％)酰化的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝861(M+H)+。
将46mg(53μmol)该中间体溶于5ml甲醇中，并加入2.7ml 2M氢氧化锂溶液。在RT下搅拌10min后，将反应用乙酸调节至pH为3-4，随后用15ml水稀释。将水相用乙酸乙酯萃取，将有机相经硫酸镁干燥并浓缩。将残余物从乙腈/水中冻干，在高真空下干燥残余物后，得到37mg(理论值的90％)标题化合物，其为白色固体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝729(M+H)+。
中间体C73
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-L-半胱氨酸
首先将619mg(0.86mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)加入8.8ml二氯甲烷中，并加入87mg(0.86mmol)三乙胺和224mg(0.86mmol)N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。在1h后，加入45mg(0.17mmol)N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在RT下搅拌1h。将混合物在减压下浓缩，将残余物溶于二氯甲烷中，随后将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥，在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即可进一步使用。得到602mg(71％，纯度87％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.58min；MS(ESIpos):m/z＝861(M+H)+。
中间体C74
三氟乙酸3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
将75mg(0.114mmol)中间体C58溶于12.5ml DMF中，并在65mg(0.11mmol)HATU和79μl N,N-二异丙基乙胺的存在下与78mg(0.171mmol)中间体L75偶联。在通过制备型HPLC纯化后，将中间体溶于20ml乙醇中，并在RT下在氢气标准压力下经10％活性炭负载的钯氢化1h。然后滤出催化剂，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到63mg(经2步为理论值的64％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.16min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
中间体C75
(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶于525ml DCM中，并加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5min后，加入溶于175ml DCM中的3.23g(11.85mmol)(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(由(3S)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸通过经典方法制备)，并将混合物在RT下再搅拌45min。然后将混合物用DCM稀释并用100ml饱和碳酸氢钠溶液随后用饱和氯化钠溶液萃取两次。将有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当级分合并，浓缩并将残余物在高真空下干燥，得到4.6g(理论值的61％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614.32(M+H)+。
将200mg(0.33mmol)该中间体溶于10ml DCM中，然后加入105μl三乙胺和77μl(0.717mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在RT下搅拌过夜，随后在减压下浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液随后用饱和氯化钠溶液萃取两次。将有机相经硫酸镁干燥，然后浓缩。得到213mg(75％)标题化合物，其为米黄色泡沫。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
中间体C76
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
根据肽化学的经典方法(用氯化锌脱去Teoc保护基，在HATU的存在下用N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸酰化，并用氢氧化锂在THF/水中进行酯裂解)由中间体C75制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.23min；MS(ESIpos):m/z＝818(M+H)+。
中间体C77
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸
首先将4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(8.39mg,48.1μmol)加入1.0ml DMF中，加入7.37mg(48.1μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、15.5mg((48.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲鎓氟硼酸盐和8.60μl(48.1μmol)N,N-二异丙基乙胺，并将混合物在RT下搅拌10分钟。首先将40.0mg(0.048mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)(中间体C71)加入1.0ml DMF中，加入25.4μl(141.9μmol)N,N-二异丙基乙胺，将该混合物加入所述反应中，并将反应混合物在RT下搅拌4h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。得到35.0mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.76min；MS(ESIpos):m/z＝873[M+H]+
中间体C78
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸
首先，将197mg(0.354mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯(参见中间体C11的合成)加入5.0ml二氯甲烷中，并将混合物加热至40℃。在此温度下，加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT搅拌1h。然后加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1h。然后加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用5％浓度的KHSO4溶液各萃取三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并在高真空下干燥残余物。得到74.1mg(理论值的31％)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.49min；MS(ESIpos):m/z＝670[M+H]+
首先将78.3mg(117μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯加入4.0ml THF中，并加入800μl甲醇、160μL水和230μl(230μmol)LiOH水溶液(1M)。将反应混合物在RT下搅拌3h，用乙酸淬灭，并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。得到64.8mg(理论值的85％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIneg):m/z＝654[M-H]-
中间体C79
三氟乙酸3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
首先将57.4mg(81.8μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入5.7ml DMF中，加入74.0mg(164μmol)三氟乙酸3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)(中间体L75)、43μl(250μmol)N,N-二异丙基乙胺和62.2mg(164μmol)HATU，并将混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物在RT下搅拌1h，用乙酸淬灭并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。得到52.4mg(理论值的63％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.64min；MS(ESIpos):m/z＝1022[M]+
在氩气下，首先将6.23mg(27.7μmol)乙酸钯(II)加入3.0ml二氯甲烷中，加入12μl(83μmol)三乙胺和89μl(550μmol)三乙基硅烷，并将混合物搅拌5分钟。然后加入于3.0ml二氯甲烷中的56.7mg(55.5μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸酯，并将混合物在RT下搅拌过夜。将混合物浓缩至几乎干燥，加入乙腈/水，并将混合物过滤并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。得到37.4mg(理论值的67％)标题化合物。
LC-MS(方法12):):Rt＝2.15min；MS(ESIpos):m/z＝888[M+H]+
中间体C80
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将43.4mg(95.1μmol)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(中间体L90)加入2.5ml DMF中，加入14.6mg(95.1μmol)1-羟基-1H-苯并三唑水合物、30.5mg(95.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲鎓氟硼酸盐和16.5μl(95.1μmol)N,N-二异丙基乙胺，并将混合物搅拌10min。将79.0mg(95.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)(中间体C71)溶于2.5ml DMF中，加入49.5μl(285.3μmol)N,N-二异丙基乙胺，并将该混合物加入所述反应中。将反应混合物在RT下搅拌2h并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。得到44.2mg(理论值的40％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.57min；MS(ESIpos):m/z＝1156[M+H]+
将60.2mg(52.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸悬浮在3.0ml乙醇中，加入6.0mg碳负载的钯(10％)，并将混合物在RT和标准压力下用氢气氢化1h。两次，加入6.0mg碳负载的钯(10％)，并将混合物在RT和标准压力下用氢气氢化1h。滤出催化剂，并将反应混合物在减压下除去溶剂并在高真空下干燥。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。得到29.4mg(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝3.77min；MS(ESIpos):m/z＝1021[M+H]+
中间体C81
(R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺
在氩气下并在-78℃下，将18.7ml(37.45mmol)于二乙醚中的环己基氯化镁(2M)加入到3.12ml(6.24mmol)于甲苯中的二甲基锌(2.0M)的溶液中，并将混合物在-78℃下搅拌30分钟。然后在-78℃下，加入5.0g(12.48mmol)(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺于THF的溶液，并将反应混合物在此温度下搅拌1h，随后在RT下搅拌4h。随后在-78℃下，加入ml饱和氯化铵溶液，并使反应混合物温热至RT。将混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物用Biotage Isolera(硅胶，乙酸乙酯/环己烷25:75)纯化。得到1.59g(理论值的26％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝2.76min；MS(ESIneg):m/z＝483[M-H]-
在氩气下，首先将264.0mg(0.54mmol)该中间体加入0.5ml 1,4-二噁烷中，随后加入1.36ml HCl于1,4-二噁烷溶液(4.0M)。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入二氯甲烷，并将反应混合物用1M氢氧化钠水溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并在减压下蒸发溶剂。将残余物用BiotageIsolera(硅胶，甲醇/二氯甲烷98:2)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于二氯甲烷中，用碳酸氢钠溶液洗涤并经硫酸钠干燥。在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。得到148mg(理论值的72％)标题化合物。
LC-MS(方法13):Rt＝2.07min；MS(ESIpos):m/z＝364[M-NH2]+
中间体C82
2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸酯
在氩气下，将392.2mg(1.85mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和91.29mg(1.52mmol)乙酸加入到503.0mg(1.32mmol)1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺(中间体C81)于1.4ml二氯甲烷的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入574.6(2.38mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯于二氯甲烷的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入143mg(0.66mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯后，将混合物再搅拌2h。将反应混合物用二氯甲烷稀释，并将有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。在减压下蒸发溶剂并在高真空下干燥残余物。得到488g(理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.89min；MS(ESIpos):m/z＝582(M+H)+。
中间体C83
2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸酯
将280.0mg(2.77mmol)三乙胺和397.8mg(3.52mmol)氯乙酰氯加入至含分子筛的487.9mg(0.84mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸酯(中间体C82)于8.40ml二氯甲烷的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌6h。用二氯甲烷稀释反应混合物，并用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤有机相。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残余物无需纯化即可进一步使用。这得到470mg(理论值的85％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.88min；MS(ESIpos):m/z＝680(M+Na)+。
中间体C84
S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-L-半胱氨酸
将322.1mg(2.66mmol)L-半胱氨酸与319.0mg(3.80mmol)碳酸氢钠一起悬浮在0.19ml水中。加入250.0mg(0.38mmol)溶于1.90ml异丙醇中的2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸酯(中间体C83)和693.8g(4.56mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3.5h。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤并用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸钠干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物无需进一步纯化即可进一步使用。这得到276mg(理论值的97％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.34min；MS(ESIpos):m/z＝744(M+H)+。
中间体C85
S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸
将34.8mg(0.27mmol)N,N-二异丙基乙胺加入至100mg(0.13mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-L-半胱氨酸(1:1)(中间体C84)和41.5mg(0.13mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮于4.0ml DMF的混合物中，并将反应混合物在RT下搅拌3h。无需后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到88mg(理论值的70％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.71min；MS(ESIpos):m/z＝936(M+H)+。
中间体C86
11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸
将161.65mg(1.17mmol)碳酸钾加入220.0mg(0.33mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-{[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸酯(中间体C83)和39.02mg(0.37mmol)3-硫烷基丙酸于7.45ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌4h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，并将有机相用水和用饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥，并将溶剂在减压下蒸发。残余物无需后处理即可进一步使用。这得到201mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝726(M-H)-。
中间体C87
2-(三甲基甲硅烷基)乙基{13-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基}氨基甲酸酯
将54.18mg(0.28mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体L1)、71.01mg(0.50mmol)N,N-二异丙基乙胺、104.46mg(0.27mmol)HATU和0.23ml(0.14mmol)1-羟基-7-氮杂苯并三唑(0.5M于DMF中)加入100mg(0.14mmol)11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C86)于1.37ml DMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5h。无需进一步后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到41mg(理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIpos):m/z＝907(M+H)+。
中间体C88
3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯三氟乙酸(1:1)
立体异构体的混合物
将1.71g(8.05mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.40g(6.61mmol)乙酸加入至2.04mg(5.75mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中间体C52)于51ml二氯甲烷的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌5分钟。然后加入1.32g(6.61mmol)3-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯于20ml二氯甲烷的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次，经硫酸镁干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。在减压下蒸发溶剂，并在高真空下干燥残余物。这得到1.86g(理论值的50％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝538(M+H-CF3CO2H)+。
中间体C89
3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将1.36g(13.42mmol)三乙胺和2.13g(18.87mmol)氯乙酰氯加入含分子筛的2.89g(4.19mmol，纯度为80％)3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C88)于42ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5h。将混合物在旋转蒸发仪上浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到449mg(理论值的17％)标题化合物的异构体1和442mg(理论值的17％)标题化合物的异构体2。
异构体1LC-MS(方法1):Rt＝2.74min；MS(ESIpos):m/z＝614(M+H)+。
异构体2LC-MS(方法1):Rt＝2.78min；MS(ESIpos):m/z＝614(M+H)+。
中间体C90
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将357.3mg(0.58mmol)L-半胱氨酸与488.7mg(4.07mmol)碳酸氢钠一起悬浮在2.3ml水中。加入溶于23.0ml异丙醇的357.0mg(0.58mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(异构体1)(中间体C89，异构体1)和1.06g(6.98mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤且用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物无需纯化即可进一步使用。这得到255.0mg(理论值的62％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝699(M+H)+。
中间体C91
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(异构体2)
将453.5mg(3.74mmol)L-半胱氨酸与449.2mg(5.35mmol)碳酸氢钠一起悬浮在2.1ml水中。加入溶于21.1ml异丙醇的3287.4mg(0.54mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C89，异构体2)和0.98g(6.42mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤且用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物无需纯化即可进一步使用。这得到221.0mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.12min；MS(ESIpos):m/z＝699(M+H)+。
中间体C92
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将18.49mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入至50mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C90)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮于3.3ml DMF的混合物中，并将反应混合物在RT下搅拌45分钟。无需后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到65mg(理论值的100％，纯度为71％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝892(M+H)+。
中间体C93
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1基)己酰基]-L-半胱氨酸(异构体2)
将18.49mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入至50mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C91)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮于3.0ml DMF的混合物中，并将反应混合物在RT下搅拌90分钟。无需后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到63mg(理论值的98％，纯度为73％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝892(M+H)+。
中间体C94
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1基)乙酰基]-L-半胱氨酸(异构体1)
将18.5mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺加入至50.0mg(0.07mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C90)和18.0mg(0.07mmol)-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮于3.3ml DMF的混合物中，并将反应混合物在RT下搅拌30分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用饱和NH4Cl溶液反复洗涤且用饱和NaCl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物无需进一步纯化即可使用。这得到57mg(理论值的81％，纯度为85％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝836(M+H)+。
中间体C95
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(异构体1)
将302.5mg(2.19mmol)碳酸钾加入至384.0mg(0.62mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C89，异构体1)和73.0mg(0.69mmol)3-硫烷基丙酸于14ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物无需后处理即可进一步使用。这得到358.0mg(理论值的84％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝684(M+H)+。
中间体C96
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(异构体2)
将226.0mg(1.64mmol)碳酸钾加入至287.0mg(0.45mmol)3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C89，异构体2)和54.6mg(0.51mmol)3-硫烷基丙酸于14ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物无需后处理即可进一步使用。这得到318.7mg(理论值的88％，纯度为88％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝684(M+H)+。
中间体C97
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十四烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)于2.81ml DMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入22.75mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸(中间体L1)于1.4ml DMF和5mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。
加入水，并用二氯甲烷萃取混合物。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物无需后处理即可进一步使用。这得到26mg(理论值的84％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.39min；MS(ESIpos):m/z＝863(M+H)+。
中间体C98
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)于2.81ml DMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入37.30mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸于1.4ml DMF和5mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水，并用二氯甲烷萃取混合物。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物无需进一步纯化即可使用。这得到22mg(理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.54min；MS(ESIpos):m/z＝919(M+H)+。
中间体C99
3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,19-三氧代-12,15-二氧杂-5-硫杂-2,9,18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(异构体2)
在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)HATU加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体C96)于2.81ml DMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入35.05mg(0.07mmol)N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸于1.4ml DMF和5mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水，并用二氯甲烷萃取混合物。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到25mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝4.52min；MS(ESIpos):m/z＝1007(M+H)+。
中间体C100
2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸酯
将22.2mg(0.068mmol)(2R)-N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)三氟乙酸加入至45mg(0.068mmol)(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸(中间体C58)于5.8ml DMF的溶液中。在RT下搅拌30分钟后，将39mg(0.10mmol)HATU和36mg(0.27mmol)N,N-二异丙基乙胺加入混合物中。将反应混合物在RT下搅拌1h。无需后处理，将混合物通过制备型HPLC纯化。这得到7mg(理论值的12％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z 851(M+H)+。
中间体C101
三氟乙酸/(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸甲酯(1:1)
将4.3g(12.2mmol)中间体C52溶解在525ml DCM中，并加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在RT下搅拌5分钟后，加入3.23g(11.85mmol)溶于175ml DCM的(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(由(3S)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸根据经典方法制备)，并将混合物在RT下再搅拌45min。然后将混合物用DCM稀释，并先用100ml的饱和碳酸氢钠溶液再用饱和氯化钠溶液萃取两次。将有机相经硫酸镁干燥，过滤，然后浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，浓缩并在高真空下干燥残余物，得到4.6g(理论值的61％)中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.97min；MS(ESIpos):m/z＝614.32(M+H)+。
首先，将2.06g(3.36mmol)该中间体加入76ml DCM中，并在2.1ml三乙胺存在下用0.81ml(7.17mmol)2-氯-2-氧代乙基乙酸酯酰化。在RT下搅拌20h后，再加入0.36ml 2-氯-2-氧代乙酸乙酯和0.94ml三乙胺，并将混合物在RT下再搅拌15min。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释，并依次用300ml 5％浓度的柠檬酸萃取两次、用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次以及用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后经硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到2.17g(理论值的79％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIpos):m/z＝714(M+H)+。
将321mg(0.342mmol)该中间体溶解在7ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入279.5mg(2.05mmol)氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌2h。然后加入599mg(2.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml 0.1％浓度的三氟乙酸的水溶液，并随后将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到60mg(理论值的26％)标题化合物，其仍含有一些脱乙酰化的化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min和0.95min；MS(ESIpos):m/z＝528和570(M+H)+。
中间体C102
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，类似于中间体C2，将中间体C52用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]-氨基}-4-氧代丁酸苄酯还原烷基化。然后将仲氨基用2-氯-2-氧代乙基乙酸酯酰基化，最后将两个酯基用2M氢氧化锂于甲醇的溶液水解。
LC-MS(方法1):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝646(M-H)-。
中间体C103
2-(三甲基甲硅烷基)乙基N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-谷氨酸酯
在DMF中、在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下，首先通过将151mg(0.23mmol)中间体C102与128mg(0.234mmol)中间体L98偶联来制备标题化合物。然后通过在RT下、在氢气标准压力下经由10％活性炭负载的钯氢化30分钟来脱去Z保护基，得到标题化合物。
收率：经2个步骤，为理论值的30％
LC-MS(方法1):Rt＝1.14min；MS(ESIpos):m/z＝929(M+H)+。
中间体C104
2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯
将1.87g(8.84mmol)三乙酰氧基硼氢化钠加入至含分子筛的2.24g(6.31mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺于56.0ml二氯甲烷的溶液中，并将混合物在室温下搅拌15分钟。然后加入2.20g(7.58mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3R,4S)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸酯(文献：WO2014/151030A1)，并将反应混合物在室温下搅拌3.5h。用二氯甲烷稀释混合物，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到1.39g(理论值的24％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.15min；MS(ESIpos):m/z＝600(M+H)+。
中间体C105
2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯
将295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯加入至含分子筛的692.8mg(0.88mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3R,4R)-3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯(中间体C104)于8.7ml二氯甲烷的溶液中，并将反应混合物在RT下搅拌2.5h。用二氯甲烷稀释反应混合物，并用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤有机相。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。再次，将295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯加入含分子筛的残余物于8.7ml二氯甲烷中，并将反应混合物在RT下搅拌3h。用二氯甲烷稀释反应混合物，并用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤有机相。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将有机相经硫酸钠干燥、浓缩并且无需纯化即可进一步使用。这得到691mg(理论值的74％，纯度为64％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.78min；MS(ESIpos):m/z＝676(M+H)+。
中间体C106
3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸
将316mg(2.29mmol)碳酸钾加入至691.0mg(0.65mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯(中间体C105)和76.3mg(0.72mmol)3-硫烷基丙酸于15ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入至反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并将溶剂在减压下蒸发，并将残余物在高真空下干燥。残余物无需后处理即可进一步使用。这得到502mg(理论值的67％，纯度为65％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.48min；MS(ESIneg):m/z＝744(M-H)-。
中间体C107
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸
将203.6mg(1.68mmol)L-半胱氨酸与201.7mg(2.40mmol)碳酸氢钠一起悬浮在0.95ml水中。加入170.0mg(0.24mmol)溶于9.5ml异丙醇的2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3R,4R)-3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯(中间体105)和438.5mg(2.40mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入混合物中，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物无需进一步纯化即可进一步使用。这得到152mg(理论值的83％)的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.26min；MS(ESIpos):m/z＝762(M+H)+。
中间体L1
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
由市售可得的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯通过肽化学的经典方法制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝198(M+H)+。
中间体L2
三氟乙酸/rel-(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由50mg(0.214mmol)市售可得的顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷甲酸和60mg(0.235mmol)同样市售可得的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过与EDC/HOBT偶联，随后用TFA脱保护来制备标题化合物。这得到36mg(经2个步骤，为理论值的38％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+.
中间体L3
三氟乙酸/(1S,2R)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由50mg(0.214mmol)市售可得的(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸与72mg(0.283mmol)同样市售可得的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过与EDC/HOBT偶联，随后用TFA脱保护来制备标题化合物。这得到13mg(经2个步骤，理论值的16％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.2min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L4
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环己烷甲酰胺(1:1)
由市售可得的1-[(4-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯通过肽化学的经典方法制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.26min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝280(M+H)+。
中间体L5
三氟乙酸/N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-β-丙氨酰胺(1:1)
由市售可得的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮和N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸通过肽化学的经典方法制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.22min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.22min；MS(ESIpos):m/z＝260(M+H)+。
中间体L6
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在EDC/HOBT的存在下将市售可得的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸与部分保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯(通过肽化学的经典方法制备)偶联来制备标题化合物。然后在温和条件下通过在RT下在5％浓度的三氟乙酸于DCM中搅拌而在氨基处脱保护，这得到收率为37％的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.29min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.62min；MS(ESIpos):m/z＝566(M+H)+。
中间体L7
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
根据肽化学的经典方法，由市售可得的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过依次在HATU的存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸酯偶联、用TFA脱保护、与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸酯偶联并再次用TFA脱保护来制备标题化合物。获得32mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.31min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.47min；MS(ESIpos):m/z＝516(M+H)+。
中间体L8
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
根据肽化学的经典方法，由市售可得的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过依次在HATU的存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸酯偶联并再次用TFA脱保护来制备标题化合物。获得171mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.23min；
LC-MS(方法7):Rt＝0.3min；MS(ESIpos):m/z＝417(M+H)+。
中间体L9
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙氧基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
类似于中间体L7，由市售可得的(4-氨基苯基)乙酸甲酯来制备标题化合物。获得320mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.48min；MS(ESIpos):m/z＝493(M+H)+。
中间体L10
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-rel-N6-{[(1R,2S)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)
由中间体L6通过用EDC/HOBT与顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷甲酸偶联并随后用TFA脱保护来制备标题化合物。这得到12mg(经2个步骤，理论值的52％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L11
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1S,2R)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)
由中间体L6通过用EDC/HOBT与(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸偶联并随后用TFA脱保护来制备标题化合物。这得到11mg(经2个步骤，理论值的39％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.45min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L12
三氟乙酸/1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
将381mg(2.46mmol)2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯加入至228mg(1.12mmol)溶于7ml二噁烷/水1:1的[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯中。然后加入1.2ml饱和碳酸氢钠溶液，并将反应在RT下搅拌。搅拌共5天并另外2次加入相同量的碳酸氢钠溶液后，将反应通过用三氟乙酸酸化，在旋转蒸发仪上浓缩并通过制备型HPLC纯化残余物而后处理。将适当的级分合并，在减压下除去溶剂，并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。
将残余物溶于3ml二氯甲烷中，并加入1ml的三氟乙酸。在RT下搅拌15min后，在减压下除去溶剂，并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。这得到70mg(经2个步骤，理论值的67％)作为树脂状残余物的标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.18min；MS(ESIpos):m/z＝185(M+H)+。
中间体L13
三氟乙酸/N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
类似于中间体L6，通过在EDC/HOBT存在下将(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸与N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联并随后温和脱去叔丁氧基羰基保护基来制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.42min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.43min；MS(ESIpos):m/z＝340(M+H)+。
中间体L14
三氟乙酸/1-[2-(4-氨基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
类似于中间体L2经2个步骤由哌嗪-1-基氨基甲酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸来制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝239(M+H)+。
中间体L15
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺(1:1)
将2.93g(10.58mmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯溶解在100ml二噁烷/水1:1中，并加入3.28g(21.15mmol)2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯和饱和碳酸氢钠溶液直至达到pH为6-7。将溶液在RT下搅拌30min，然后在减压下蒸发1,4-二噁烷。然后加入200ml水，并将混合物每次用300ml乙酸乙酯萃取三次。将有机萃取物合并，经硫酸镁干燥并过滤。浓缩得到褐色油状的3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸叔丁酯，其随后在高真空下干燥。
HPLC(方法11):Rt＝1.5min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝375(M+NH4)+。
将该中间体通过标准方法(用TFA脱保护、与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯偶联并再次用TFA脱保护)转化为标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝344(M+H)+。
中间体L16
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将535mg(1.73mmol)市售可得的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮和930mlN,N-二异丙基乙胺加入至266mg(1.33mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸于24ml DMF的溶液中。将反应在超声波浴中处理24h，然后在减压下浓缩至干燥。将剩余的残余物通过制备型HPLC纯化，浓缩适当级分并在高真空下干燥残余物，随后得到337mg(理论值的50％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.4min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝468(M+H)+。
中间体L17
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙胺的存在下将172mg(0.37mmol)中间体L16和125mg(0.37mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联，然后在温和条件下通过在室温下在10％浓度的三氟乙酸于DCM中搅拌2小时而将氨基脱保护，来制备标题化合物。经2个步骤，从乙腈/水中冻干，得到194mg(理论值的49％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.1min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝652(M+H)+。
中间体L18
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
由(4-氨基苯基)乙酸甲酯类似于中间体L7，相继根据肽化学的经典方法，通过在HATU的存在下连接N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸、用TFA脱保护、与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸酯偶联、用TFA脱保护、与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸酯偶联并再次用TFA脱保护来制备标题化合物。获得330mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.29min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.41min；MS(ESIpos):m/z＝465(M+H)+。
中间体L19
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-L-鸟氨酰胺(1:1)
由1,4-苯二胺相继根据肽化学的经典方法制备标题化合物。在第一步骤中，在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下，将942mg(8.72mmol)1,4-苯二胺用0.8g(2.9mmol)N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸单酰化。在第二步骤中，以类似的方式，在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下，将第二苯胺氨基用(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酰化。用TFA脱保护、与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸酯偶联并再次用TFA脱保护随之在3个进一步合成步骤中得到标题化合物，通过该途径获得148mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.21min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
LC-MS(方法4):Rt＝0.2min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
中间体L20
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
根据肽化学的经典方法，类似于中间体L8，由市售可得的1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过依次在HATU存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸酯偶联并再次用TFA脱保护来制备标题化合物。获得171mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.28min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.39min；MS(ESIpos):m/z＝445(M+H)+。
中间体L21
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-赖氨酰胺
根据肽化学的经典方法，由市售可得的0.42g(2.56mmol)(4-氨基苯基)乙酸甲酯通过依次在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与N6-(叔丁氧基羰基)-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸偶联、用哌啶脱保护、在N,N-二异丙基乙胺的存在下与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯偶联并随后经10％活性炭负载的钯氢解脱去苄氧基羰基保护基来制备标题化合物。这得到360mg(经4个步骤，理论值的32％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.5min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝493(M+H)+。
中间体L22
三氟乙酸/N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(2S)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]苯基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)
由N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯基丙氨酸相继根据肽化学的经典方法制备标题化合物。在第一步骤中，首先将2.5g(8.06mmol)该原料转化成铯盐，然后在DMF中用碘甲烷转化成甲酯。
在甲醇中经10％活性炭负载的钯氢解，然后将硝基转化成氨基。
然后，将由此生成的氨基在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下在DMF中用N5-氨基甲酰基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酸酰化。在下一步骤中，在DMF中用哌啶脱去Fmoc基团。
然后在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基-1H-苯并三唑水合物和N,N-二异丙基乙胺的存在下、在DMF中与N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸偶联，最后用三氟乙酸脱去叔丁氧基羰基。
HPLC(方法11):Rt＝1.6min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
中间体L23
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-β-丙氨酰胺(1:1)
由市售可得的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在EDCI/HOBT和N,N-二异丙基乙胺的存在下与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联并随后用三氟乙酸脱保护来制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min。
中间体L24
三氟乙酸/1-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环丙烷甲酰胺(1:1)
将114mg(0.67mmol)市售可得的1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷甲酸溶解在25mlDCM中，加入110mg(0.623mmol)市售可得的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)和395μl N,N-二异丙基乙胺，并将混合物冷却至-10℃。然后加入217mg(0.793mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐，并将混合物在RT下搅拌2h。然后将混合物用乙酸乙酯稀释并依次用10％浓度的柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液萃取，然后经硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥后得到152mg受保护的中间体。
然后将这些溶于10ml DCM中，并用1ml三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干，得到158mg(经2个步骤，理论值的71％)标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min。
LC-MS(方法3):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝224(M+H)+。
中间体L25
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将31.4mg(0.17mmol)缬氨酰基-L-丙氨酸溶解在3.0ml DMF中，并加入115.0mg(0.17mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和33.7mg(0.33mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速:50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并在高真空下干燥残余物。这得到74.1mg(理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.61min；MS(ESIpos):m/z＝763[M+H]+。
中间体L26
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600.0mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸悬浮在25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中，加入炭负载的钯(10％)并将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化5h。滤出催化剂并在减压下蒸发溶剂。所得化合物无需进一步纯化即用于下一步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.42min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180mg(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0ml DMF中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。然后加入254.6mg(0.73mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。将反应溶液直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速:50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到294.1mg(理论值的76％)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
首先将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸加入20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中，并加入27.2mg克活性炭负载的钯。将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化5h。将混合物借助Celite(R)过滤，并将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)洗涤。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。标题化合物(182mg，理论值的72％)无需进一步纯化即用于下一反应步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
中间体L27
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
首先将30mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(中间体L26)和46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺加入1.5ml DMF中，并加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应溶液在RT下搅拌过夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到55.6mg(理论值的90％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝920[M+H]+。
中间体L28
3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
首先将461.7mg(1.15mmol)3-乙基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1,3-二甲酸1-叔丁酯(根据WO2006/066896的文献方法制备该化合物)加入5.0ml无水二氯甲烷中，并将混合物冷却至-78℃。然后逐滴缓慢加入326.2mg(2.29mmol)二异丁基氢化铝溶液(1M在THF中)，并将混合物在-78℃下搅拌2h(通过薄层色谱法(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)监测)。逐滴加入1.3g(4.59mmol)溶于60ml水的酒石酸钾钠，并使反应混合物升温至RT。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将水相用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到629.0mg作为粗产品的标题化合物，其无需进一步纯化即可立即用于下一反应步骤。
中间体L29
3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
非对映体的混合物
首先将807.1mg(2.34mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(根据WO2006/100036的文献方法制备)加入8.0ml二氯甲烷中，并加入236.4mg(2.34mmol)三乙胺。在0℃下，逐滴加入267.6mg(2.34mmol)甲磺酰氯，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。再加入133.8mg(1.17mmol)甲磺酰氯和118.2mg(1.17mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。用二氯甲烷稀释混合物，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液、5％浓度的硫酸氢钾溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在Biotage Isolera(硅胶，柱50g SNAP，流速66ml/min，环己烷/乙酸乙酯)上纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到402.0mg(理论值的41％)化合物3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝424[M+H]+。
首先将400.0mg(0.94mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯加入5.0ml DMF中，并加入98.2mg(1.51mmol)叠氮化钠。将反应混合物在40℃下搅拌10h。然后再加入30.7mg(0.47mmol)叠氮化钠，并将混合物在40℃下再搅拌10h。加入乙酸乙酯，并将有机相用水反复洗涤。有机相经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到309.5mg(理论值的89％)化合物3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。该化合物无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝1.50min；MS(ESIpos):m/z＝371[M+H]+。
将250mg(0.68mmol)3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在10.0ml乙酸乙酯/乙醇(1:1)中，并加入25.0mg活性炭负载的钯(10％)。将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化8h。将反应经Celite(R)过滤，并将滤饼用乙酸乙酯充分洗涤。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到226.2mg(理论值的82％)化合物3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。该化合物无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝345[M+H]+。
将715.0mg(2.08mmol)3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在15.0ml THF中，并加入2.28ml(2.28mmol)TBAF溶液(1M在THF中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并且残余物(1.54g)无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.41min；MS(ESIpos):m/z＝231[M+H]+。
首先将1.54g(4.88mmol)3-(氨基甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯加入1,4-二噁烷中，并加入541.8mg(4.88mmol)氯化钙(无水)和488.6mg(4.88mmol)碳酸钙，并将混合物剧烈搅拌。然后加入592.8mg(5.86mmol)三乙胺和1.52g(5.86mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入644.9mg(10.7mmol)HOAc和乙酸乙酯。将有机相用水洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在硅胶(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:1)上纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到346.9mg(理论值的19％)化合物3-(羟基甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝375[M+H]+。
首先将804.0mg(2.15mmol)3-(羟基甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯加入20.0ml氯仿和20.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入59.7mg(0.22mmol)四正丁基氯化铵、429.9mg(3.22mmol)N-氯琥珀酰亚胺和33.5mg(0.22mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。将有机相分离出并在减压下除去溶剂。将残余物通过硅胶色谱法(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)纯化。这得到517.0mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.13min；MS(ESIpos):m/z＝373[M+H]+。
中间体L30
3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
立体异构体的混合物
首先将250.0mg(0.72mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟基甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(根据WO2006/100036的文献方法制备该化合物)加入12.5ml二氯甲烷/DMSO(4:1)中，并加入219.6mg(2.17mmol)三乙胺。在2℃下，一次少量地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶络合物，并将混合物在2℃下搅拌3h。再次一次少量地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶络合物，并将混合物在RT下搅拌17h。将反应混合物在二氯甲烷和水之间分配。将水相用二氯甲烷萃取三次，并且将合并的有机相用水洗涤一次并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤(薄层色谱法:石油醚/乙酸乙酯7:3)。
中间体L31
{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙二酸二叔丁酯
将57.2g(488.27mmol)氨基甲酸叔丁酯、51.2ml(683.57mmol)37％浓度的甲醛水溶液和25.9g(244.13mmol)碳酸钠加入到600ml水中。将混合物升温直至形成溶液，然后在RT下搅拌16h。将形成的悬浮液用500ml二氯甲烷萃取，并将有机相分离出，用饱和氯化钠溶液洗涤并经硫酸钠干燥。将混合物在旋转蒸发仪上浓缩，并将残余物在高真空下干燥，得到结晶固体。将残余物溶于1000ml无水THF中，并在RT下逐滴加入322ml(3.414mol)乙酸酐和138ml(1.707mol)吡啶的混合物。将反应混合物在RT下搅拌16h，然后在室温下在旋转蒸发仪上用水浴浓缩。将残余物溶于二乙醚中，并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次以及用饱和氯化钠溶液洗涤一次。将有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发仪上浓缩，并将残余物在高真空下干燥2天。将残余物溶于2000ml无水THF中，并在冰冷却下加入456ml(456.52mmol)1M叔丁醇钾于THF的溶液。将混合物在0℃下搅拌20min，然后逐滴加入100.8g(456.52mmol)溶于200ml无水THF的丙二酸二叔丁酯。将混合物在RT下搅拌48h，然后加入水。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩并溶于500ml乙酸乙酯中。将混合物用500ml水和100ml饱和氯化钠溶液洗涤，并将有机相经硫酸钠干燥。将有机相在旋转蒸发仪上浓缩，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过在硅胶上过滤纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯，梯度＝30:1→5:1)。这得到37.07g(理论值的22％)目标化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.87min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
中间体L32
[3-羟基-2-(羟基甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将37.0g(107.11mmol)(乙酰氧基甲基)丙二酸二叔丁酯溶解在1000ml无水THF中，并在冰冷却下逐滴加入535.5ml(1071.10mmol)2M硼氢化锂于THF的溶液。逐滴加入19.3ml(1071.10mmol)水并将混合物在RT下搅拌4.5h。将反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于1500ml乙酸乙酯中，加入100ml水，并将混合物在水冷却下搅拌(轻微放热)30分钟。分离出有机相，并将水相用500ml乙酸乙酯萃取两次。将有机相在旋转蒸发仪上浓缩，并将残余物在高真空下干燥。这得到20.7g(理论值的94％)目标化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝1.49min；MS(EIpos):m/z＝106[M-C5H8O2]+。
中间体L33
[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟基甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将20.00g(97.44mmol)[3-羟基-2-(羟基甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在1000ml无水二氯甲烷中，并在RT下加入6.63g(97.44mmol)咪唑和16.16g(107.18mmol)叔丁基(氯)二甲基硅烷。将反应混合物在RT下搅拌16h，并用半浓缩氯化钠溶液洗涤。将水相用乙酸乙酯萃取，并将合并的有机相经硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。这得到28.50g(理论值的92％)目标化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.02(s,6H),0.86(s,9H),1.37(s,9H),1.58-1.73(m,1H),2.91(q,2H),3.33-3.36[m,(2H,掩盖)],3.53-3.58(m,2H),6.65-6.72(m,1H)。
中间体L34
(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯
将12.65g(39.591mmol)[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟基甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在200ml二氯甲烷中，并在RT下逐滴加入19.31g(45.53mmol)溶于150ml二氯甲烷的戴斯马丁氧化剂。将混合物在室温下搅拌2h，然后加入250ml半浓缩碳酸氢钠溶液和250ml 10％浓度的硫代硫酸钠溶液，并将混合物搅拌20min。分离出有机相，并将水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用300ml水洗涤，经硫酸钠干燥，在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。这得到11.35g(理论值的90％)目标化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.02(s,6H),0.84(s,9H),1.36(s,9H),1.48-1.51(m,1H),3.08-3.32[m,(1H,掩盖)],3.50-3.58(m,2H),3.81-3.91(m,1H),6.71(t,1H),9.60(d,1H).
中间体L35
(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
根据文献中已知的方法(例如JeanBastide等人J.Med.Chem.2003,46(16),3536-3545)制备标题化合物。
中间体L36
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将100mg(0.57mmol)N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸溶于4.0ml DMF中，并加入0.08ml(0.57mmol)三乙胺。然后加入199.0mg(0.57mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和0.08ml(0.57mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌48h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，含0.1％TFA的MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到75.7mg(理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.69min；MS(ESIpos):m/z＝409[M+H]+。
中间体L37
L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将75.7mg(0.19mmol)中间体L36悬浮在25ml水/乙醇/THF中，加入7.5mg活性炭负载的钯(10％)，并将混合物在RT下在标准压力下用氢气氢化4.5h。滤出催化剂，并将反应混合物在减压下除去溶剂并在高真空下干燥。残余物无需进一步纯化即用于下一步骤。这得到64.9mg(理论值的93％)标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝275[M+H]+。
中间体L38
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
首先将38.3mg(0.14mmol)中间体L37加入3.0ml DMF中，并加入96.4mg(0.14mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和39.0μl(0.28mmol)三乙胺。将混合物在RT下搅拌过夜。然后加入16.0μl(0.28mmol)HOAc，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到58.9mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.61min；MS(ESIpos):m/z＝849[M+H]+。
中间体L39
2-(三甲基甲硅烷基)乙基(2-硫烷基乙基)氨基甲酸酯
首先将300mg(2.64mmol)2-氨基乙硫醇盐酸盐(1:1)加入3.0ml二氯甲烷中，并加入668.0mg(6.60mmol)三乙胺和719.1mg(2.77mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮。将混合物在RT下搅拌2天(通过薄层色谱法监测：二氯甲烷/甲醇＝100:1.5)。加入乙酸乙酯，并将反应混合物用水洗涤三次。将有机相用饱和NaCl溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。该化合物无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
中间体L40
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中使用炭负载的钯(10％)在RT下在标准压力下用氢气氢化。化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180.0(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0ml DMF中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到294.1mg(理论值的76％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在20ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中，加入27.2mg活性炭负载的钯，并将混合物在标准压力下和在RT下用氢气氢化。将混合物经Celite(R)过滤，并将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)充分洗涤。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到182.0mg(理论值的72％)化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
将30.0mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶解在1.5ml DMF中，并加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到55.6mg(理论值的90％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.77min；MS(ESIpos):m/z＝920[M+H]+。
中间体L41
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600mg(1.58mmol)N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0ml水/乙醇/THF(1:1:0.5)中使用炭负载的钯(10％)在RT下在标准压力下用氢气氢化。化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIpos):m/z＝247[M+H]+。
将180.0(0.73mmol)N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0mlDMF中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌3.5h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。然后在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到294.1mg(理论值的76％)化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.97min；MS(ESIpos):m/z＝480[M+H]+。
将272.2mg(0.57mmol)N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在20.0ml乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)中，加入27.2mg活性炭负载的钯，并将混合物在标准压力下和在RT下用氢气氢化。将混合物经Celite(R)过滤，并将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF(1:1:1)充分洗涤。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到182.0mg(理论值的72％)化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.53min；MS(ESIpos):m/z＝346[M+H]+。
将30.0mg(0.07mmol)L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和34.3mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解在1.5ml DMF中，并加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到40.6mg(理论值的82％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝744[M+H]+。
中间体L42
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
首先将50.0mg(0.18mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸(中间体L37)加入DMF中，并加入93.6mg(0.18mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和36.9mg(0.37mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入21.9mg(0.37mmol)HOAc，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到20.6mg(理论值的14％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.55min；MS(ESIpos):m/z＝673[M+H]+。
中间体L43
N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
首先将11.3mg(0.04mmol)L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸(中间体L37)加入DMF中，并加入50.0mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-63-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧杂六十三烷-1-基}丙酰胺和8.3mg(0.08mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入4.9mg(0.08mmol)HOAc，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到15.8mg(理论值的20％)标题化合物。
LC-MS(方法4):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1377[M+H]+。
中间体L44
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将73.3mg(0.39mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶解在7.0ml DMF中，并加入200.0mg(0.39mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和78.8mg(0.78mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到103.3mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.58min；MS(ESIpos):m/z＝587[M+H]+。
中间体L45
(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯
将2.00g(7.26mmol)N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶解在90ml二氯甲烷中，然后加入1.76ml吡啶和4.62g(10.90mmol)1,1,1-三乙酰氧基-1λ5,2-苯碘酰-3(1H)-酮(戴斯马丁氧化剂)。将反应在RT下搅拌2h，然后用200ml二氯甲烷稀释，并用10％浓度的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后依次用5％浓度的柠檬酸萃取两次以及用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相分离出，经硫酸钠干燥，然后在减压下浓缩。将100ml二乙醚和环己烷(v/v＝1:1)加入到残余物中，并将混合物稍微浓缩，以致形成白色沉淀物。将其抽吸滤出。将滤液在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥，得到1.74g(理论值的88％)浅黄色油状的目标化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝274[M+H]+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.38(s,18H),2.64-2.81(m,2H),4.31-4.36(m,1H),7.23(d,1H),9.59(s,1H)。
中间体L46
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-谷氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙胺的存在下将200mg(0.79mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)与263mg(0.87mmol)(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸/三氟乙酸(1:1)偶联，然后在温和条件下通过在室温下在10％浓度的三氟乙酸于DCM中搅拌1h而将氨基脱保护来制备标题化合物。从乙腈/水中冻干，经2个步骤得到85mg(理论值的20％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.37min；MS(ESIpos):m/z＝326[M+H]+。
中间体L47
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
通过将中间体L8与2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸酯偶联并随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝488(M+H)+。
中间体L48
三氟乙酸/(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体L2，由市售可得的(1R,2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备标题化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝1.2min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L49
三氟乙酸/N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在N,N-二异丙基乙胺于二氯甲烷的存在下将市售可得的溴乙酸酐与根据肽化学的经典方法制得的部分受保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯偶联来制备标题化合物。然后在温和条件下通过在室温下在10％浓度的三氟乙酸于DCM中搅拌而在氨基处脱保护，经2个步骤得到收率为49％的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.09min；MS(ESIpos):m/z＝593和595(M+H)+。
中间体L50
三氟乙酸/(1S,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由市售可得的(1S,3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售可得的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙胺的存在下用HATU偶联并随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.2min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L51
三氟乙酸/(1R,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由市售可得的(1R,3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售可得的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙胺的存在下用HATU偶联并随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝250(M-H)-。
中间体L52
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(1:1)
将420mg(2.62mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯溶于50ml二氯甲烷中，并加入817mg(3.15mmol)溴乙酸酐和913μl(5.24mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应在RT下搅拌1h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。
这得到577mg受保护的中间体，然后将其溶于50ml二氯甲烷中，并加入10ml三氟乙酸。在RT下搅拌1h后，将反应在减压下浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干。这得到705mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法3):Rt＝0.34min；MS(ESIpos):m/z＝181和183(M+H)+。
中间体L53
三氟乙酸/(1S,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由市售可得的(1S,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售可得的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙胺的存在下用HATU偶联并随后用TFA脱保护来制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝0.19min；
LC-MS(方法3):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝250(M-H)-。
中间体L54
三氟乙酸/(1R,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由市售可得的(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售可得的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙胺的存在下用HATU偶联并随后用TFA脱保护来制备标题化合物
LC-MS(方法3):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝252(M+H)+。
中间体L55
三氟乙酸/N6-D-丙氨酰基-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在HATU存在下将中间体L6与N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸偶联，然后在温和条件下通过在室温下在5％浓度的三氟乙酸于DCM中搅拌90分钟而在氨基处脱保护来制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.35min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.67min；MS(ESIpos):m/z＝637(M+H)+。
中间体L56
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在HATU的存在下将中间体L6与(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸偶联，然后在温和条件下通过在室温下在25％浓度的三氟乙酸于DCM中搅拌15分钟而在氨基处脱保护来制备标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.4min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.7min；MS(ESIpos):m/z＝677(M+H)+。
中间体L57
(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯
首先将500.0mg(2.72mmol)L-天冬氨酸甲酯盐酸盐和706.3mg(2.72mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基2,5-二氧代吡咯烷-1-甲酸酯加入5.0ml 1,4-二噁烷中，并加入826.8mg(8.17mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。然后在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到583.9mg(理论值的74％)化合物(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIneg):m/z＝290(M-H)-。
首先将592.9mg(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸加入10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷中，将混合物冷却至-15℃并加入205.8mg(2.04mmol)4-甲基吗啉和277.9mg(2.04mmol)氯甲酸异丁酯。15分钟后将沉淀物抽滤出，并每次用10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷洗涤两次。将滤液冷却至-10℃，并在剧烈搅拌下加入115.5mg(3.05mmol)溶于10ml水的硼氢化钠。将各相分离，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到515.9mg(理论值的91％)化合物N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝278(M+H)+。
首先将554.9mg(2.00mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯加入30.0ml二氯甲烷中，并加入1.27g(3.0mmol)戴斯马丁氧化剂和474.7mg(6.00mmol)吡啶。将混合物在RT下搅拌过夜。4h后，将反应用二氯甲烷稀释，并将有机相用10％浓度的Na2S2O3溶液、10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液各洗涤三次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。这得到565.7mg(理论值的97％)标题化合物。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.91(m,2H),2.70-2.79(m,1H),2.88(dd,1H),3.63(s,3H),4.04(m,2H),4.55(m,1H),7.54(d,1H),9.60(t,1H)。
中间体L58
2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯
将434.4mg(5.78mmol)3-氨基-1-丙醇和1.50g(5.78mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基2,5-二氧代吡咯烷-1-甲酸酯溶解在10.0ml二氯甲烷中，加入585.3mg(5.78mmol)三乙胺，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，并将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂。将残余物2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-羟丙基)氨基甲酸酯(996.4mg，理论值的79％)在高真空下干燥，并且无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
首先将807.0mg(3.68mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3-羟丙基)氨基甲酸酯加入15.0ml氯仿和15.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入102.2mg(0.37mmol)四正丁基氯化铵、736.9mg(5.52mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和57.5mg(0.37mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，并将有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物在高真空下干燥，并且无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤(890.3mg)。
中间体L59
三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
首先将300.0mg(0.91mmol)(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯加入二氯甲烷中，加入4.2g(36.54mmol)TFA，并将混合物在RT下搅拌1h(通过TLC监测:二氯甲烷/甲醇10:1)。在减压下蒸发挥发性组分，并将残余物与二氯甲烷共蒸馏四次。将残余物在高真空下干燥并且无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
LC-MS(方法1):Rt＝0.19min；MS(ESIpos):m/z＝229(M+H)+。
中间体L60
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯
将200.0mg(0.95mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸溶解在4.0ml二氯甲烷中，并加入338.0mg(2.84mmol)亚硫酰氯。将反应混合物在RT下搅拌3h，然后加入1滴DMF。将混合物再搅拌1h。在减压下蒸发溶剂，并将残余物与二氯甲烷共蒸馏三次。粗产物无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
中间体L61
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
首先，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸根据肽化学的经典方法(使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、氢解、在HATU的存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联并再次氢解)制备三肽衍生物L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将该部分受保护的肽衍生物与市售可得的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸偶联来制备标题化合物。然后在温和条件下通过在室温下在5％浓度的三氟乙酸于DCM中搅拌2.5小时而在氨基处脱保护，同时保留酯保护基。后处理并通过制备型HPLC纯化，得到438mg标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.69min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝610(M+H)+。
中间体L62
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
首先，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸根据肽化学的经典方法制备N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。然后，将148mg(0.43mmol)该中间体在195mg(0.51mmol)HATU和149μlN,N-二异丙基乙胺的存在下与200mg(0.43mmol)中间体L16偶联。将残余物浓缩并通过制备型HPLC纯化后，将该受保护的中间体溶于20mlDCM中，并通过加入2ml三氟乙酸并在RT下搅拌1h来脱去叔丁氧基羰基保护基。将残余物浓缩并从乙腈/水中冻干，得到254mg(经2个步骤，理论值的63％)。
HPLC(方法11):Rt＝1.51min；
LC-MS(方法1):Rt＝0.68min；MS(ESIpos):m/z＝696(M+H)+。
中间体L63
(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸
首先，由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸根据肽化学的经典方法(使用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、用三氟乙酸脱去Boc保护基、在HATU的存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联和在甲醇中经10％活性炭负载的钯氢解)制备三肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸。通过将该部分受保护的肽衍生物与市售可得的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联来制备标题化合物。后处理并通过制备型HPLC纯化，得到601mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝611(M+H)+。
中间体L64
(4S)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸
由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸根据肽化学的经典方法(使用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、用三氟乙酸脱去Boc保护基、在甲醇中经10％活性炭负载的钯氢化裂解苄酯以及在N,N-二异丙基乙胺的存在下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联)制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝385(M+H)+。
中间体L65
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-L-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸根据肽化学的经典方法(使用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化并用三氟乙酸脱去Boc保护基)制备标题化合物。这得到373mg(经2个步骤，理论值的79％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.72min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
中间体L66
(8S)-8-(2-羟基乙基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸甲酯
首先将1000mg(2.84mmol)(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸加入10.0ml 1,2-二甲氧基乙烷中，并加入344.4mg(3.4mmol)4-甲基吗啉和504mg(3.69mmol)氯甲酸异丁酯。在RT下搅拌10min后，将反应冷却至5℃，并在剧烈搅拌下一次少量加入161mg(4.26mmol)溶于3ml水的硼氢化钠。在1h后，再加入相同量的硼氢化钠，然后将反应缓慢温热至RT。加入170ml水，然后将反应每次用200ml乙酸乙酯萃取四次。将各相分离，并将有机相用柠檬酸洗涤一次，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到760mg(理论值的78％)化合物[(2S)-4-羟基丁烷-1,2-二基]双氨基甲酸苄基叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
将760mg(2.16mmol)溶于13ml氯化氢/二噁烷的该中间体在RT下搅拌20min。然后将反应浓缩至5ml，并加入二乙醚。将沉淀物滤出并从乙腈/水1:1中冻干。
将由此获得的产物溶解在132ml DMF中，并加入345.5mg(2.35mmol)4-甲氧基-4-氧代丁酸、970mg(2.55mmol)HATU和1025μlN,N-二异丙基乙胺。将混合物在RT下搅拌5min。在减压下除去溶剂，并将剩余的残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发乙腈。将剩余的水相用乙酸乙酯萃取两次，然后将有机相浓缩并在高真空下干燥。
将由此获得的中间体溶于甲醇中并在RT下在氢气标准压力下经10％活性炭负载的钯氢化1h。然后滤出催化剂并在减压下除去溶剂。
将247mg该脱保护的化合物溶于20ml DMF中，并加入352mg(1.36mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和592μlN,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌1h，然后浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。然后在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。经这5个步骤，得到218mg标题化合物(总收率为21％)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝363(M+H)+。
中间体L67
三氟乙酸/2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基-β-丙氨酸酯(1:1)
由50mg(0.354mmol)市售可得的1-(2-羟基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过在1.5当量EDCI和0.1当量4-N,N-二甲基氨基吡啶的存在下与134mg(0.71mmol)N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸于10ml二氯甲烷偶联并随后用三氟乙酸脱保护来制备标题化合物。
收率：56mg(经2个步骤，理论值的48％)
LC-MS(方法3):Rt＝1.15min；MS(ESIpos):m/z＝213(M+H)+。
中间体L68
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)
类似于中间体L1，根据肽化学的经典方法，由市售的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝212(M+H)+。
中间体L69
三氟乙酸/1-[(苄氧基)羰基]哌啶-4-基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸酯(1:1)
通过肽化学的经典方法，由市售可得的4-羟基哌啶-1-甲酸苄酯通过使用EDCI/DMAP与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸酯化、随后用TFA脱去Boc、然后在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与N-[(叔丁氧基)羰基]-L-缬氨酸偶联并最后再次用TFA脱去Boc来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.62min；MS(ESIpos):m/z＝492(M+H)+。
中间体L70
9H-芴-9-基甲基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯
首先将1000.0mg(3.36mmol)9H-芴-9-基甲基(3-羟丙基)氨基甲酸酯加入15.0ml氯仿和15.0ml 0.05N碳酸钾/0.05N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入93.5mg(0.34mmol)四正丁基氯化铵、673.6mg(5.04mmol)N-氯代琥珀酰亚胺和52.5mg(0.34mmol)TEMPO，并将反应混合物在RT下剧烈搅拌过夜。将反应混合物用二氯甲烷稀释，并将有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物在高真空下干燥并通过硅胶色谱法(流动相：环己烷/乙酸乙酯3:1-1:1)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到589.4mg(理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法6):Rt＝2.15min；MS(ESIpos):m/z＝296(M-H)+。
中间体L71
[4-(氯羰基)苯基]氨基甲酸叔丁酯
首先将100.0mg(0.42mmol)4-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酸加入到2.0ml二氯甲烷中，并加入64.2mg(0.51mmol)草酰氯。将反应混合物在RT下搅拌30min(通过TLC监测:二氯甲烷/甲醇)。然后再加入192.6mg(1.53mmol)草酰氯和1滴DMF，并将混合物在RT下搅拌1h。在减压下蒸发溶剂，并将残余物与二氯甲烷反复共蒸馏。残余物无需进一步纯化即用于该合成的下一步骤。
中间体L72
(9S)-9-(羟基甲基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄基酯
由市售可得的[(2S)-3-羟基丙烷-1,2-二基]双氨基甲酸苄基叔丁酯根据肽化学的经典方法通过氢解脱去Z保护基、随后在EDCI/HOBT的存在下与4-(苄氧基)-4-氧代丁酸偶联、然后用TFA脱去Boc保护基并最后在三乙胺的存在下与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝425[M+H]+。
中间体L73
N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺
将395.5mg(1.87mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸、1.21g(9.36mmol)N,N-二异丙基乙胺和854.3mg(2.25mmol)HATU加入到300mg(1.87mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯于20ml二甲基甲酰胺的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌5min。将混合物浓缩后，将残余物溶于DCM中并用水洗涤。将有机相用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，滤出并浓缩。这得到408mg(33％，纯度为53％)标题化合物，其无需进一步纯化即使用。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝354(M+H)+。
将1ml TFA加入(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯(408mg,0.365mmol)于7ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT温下搅拌0.5h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物与二氯甲烷共蒸馏两次。残余物无需进一步纯化即进一步使用。这得到384mg(94％，纯度为57％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.26min；MS(ESIpos):m/z＝254(M+H)+。
中间体L74
3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸
将107mg(0.335mmol)3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯和93mg(0.369mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酸酯溶解在5ml二甲基甲酰胺中，并加入0.074ml(0.671mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到133mg(86％，纯度为100％)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝459(M+H)+。
将0.5mlTFA加入3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯(130mg,0.284mmol)于5ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶于水中并冻干。残余物无需进一步纯化即进一步使用。这得到102mg(90％，纯度为100％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.52min；MS(ESIpos):m/z＝402(M+H)+。
中间体L75
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸根据肽化学的经典方法(使用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化并用三氟乙酸脱去Boc保护基)来制备标题化合物。这得到405mg(经2个步骤，理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
中间体L76
(2S)-2-溴-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸
首先，由(3S)-4-(苄氧基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸根据肽化学的经典方法(使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化并氢解脱去Z保护基团和苄基酯)制备适当保护的天冬氨酸衍生物。
将470mg(1.8mmol)由此获得的(2S)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸悬浮在10ml水中，并加入1.8ml1摩尔盐酸和0.5ml浓硫酸，然后加入863mg(7.25mmol)溴化钾。然后在10℃下，在30min内逐滴加入150mg(2.175mmol)亚硝酸钠于1ml水的溶液，并将混合物在10-15℃下搅拌2h。然后将混合物用50ml乙酸乙酯萃取。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并经硫酸镁干燥。蒸发溶剂并通过制备型HPLC纯化产物，得到260mg(理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIneg):m/z＝295和297(M-H)-。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ[ppm]＝0.03(s,9H),0.95(t,2H),2.94和3.2(2dd,2H),4.18(t,2H),4.57(t,1H).
中间体L77
三氟乙酸/N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-溴乙酰胺(1:1)
首先将418mg(2.05mmol)[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯与638mg(2.46mmol)溴乙酸酐反应，然后用三氟乙酸脱去Boc保护基。这得到551mg(经2个步骤，理论值的63％)标题化合物。
LC-MS(方法):Rt＝0.32min；MS(ESIpos):m/z＝227和225(M+H)+。
中间体L78
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸
由市售可得的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸通过在EDCI/HOBt和N,N-二异丙基乙胺的存在下与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联并随后用三氟乙酸脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.32min；MS(ESIpos):m/z＝227(M+H)+。
中间体L79
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸
将64.8mg(0.357mmol)β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)和100mg(0.324mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在4ml二甲基甲酰胺中，并加入65.6mg(0.649mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到84.5mg(77％，纯度为100％)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝339(M+H)+。
将1.62mlTFA加入N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯(82.8mg,0.244mmol)于8ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌2小时。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶于水中并冻干。残余物无需进一步纯化即进一步使用。这得到62.7mg(87％，纯度为95％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.75min；MS(ESIpos):m/z＝283(M+H)+。
中间体L80
3-[(15-氨基-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基)氨基]-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
由市售可得的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)根据肽化学的经典方法(释放盐并使用EDCI/DMAP与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、氢解脱去Z保护基、在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与市售可得的3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸偶联并再次氢解脱去Z保护基)来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.70min；MS(ESIpos):m/z＝552(M+H)+。
中间体L81
三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄酯(1:1)
在N,N-二异丙基乙胺于DMF的存在下将250mg(1.11mmol)2,2'-磺酰基二乙胺与92.3mg(0.37mmol)1-{[(苄氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮偶联。然后通过HPLC纯化得到70mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.64min；MS(ESIpos):m/z＝257.11(M+H)+。
中间体L82
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
将88.6mg(0.357mmol)N-Boc-2,2'-(亚乙基二氧基)二乙胺和100mg(0.324mmol)N-琥珀酰亚胺基6-(马来酰亚胺基)己酸酯溶解在4.0ml二甲基甲酰胺中，并加入0.071ml(0.650mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：75ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到127mg(理论值的81％){2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝442(M+H)+。
将2.0mlTFA加入123mg(225μmol){2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯于7.5ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌2h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶于水中并冻干。残余物无需进一步纯化即进一步使用。这得到111mg(理论值的100％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.31min；MS(ESIpos):m/z＝342(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.17(m,2H),1.47(m,4H),2.04(m,2H),2.98(m,2H),3.19(m,2H),3.39(m,4H),3,56(m,6H),7.01(s,2H),7.72(bs,3H),7.80(m,1H)。
中间体L83
三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
将200mg(0.805mmol){2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯、150mg(0.966mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和560μl(3.2mmol)N,N-二异丙基乙胺溶解在10ml二甲基甲酰胺中，并加入459mg(1.21mmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌30分钟。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于二氯甲烷中。将有机相用5％浓度的柠檬酸溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，二氯甲烷:甲醇98:2)纯化。这得到276mg(理论值的89％){2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.67min；MS(ESIpos):m/z＝386(M+H)+。
将4ml TFA加入{2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(275mg,714μmol)于15ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌30分钟。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶于水中并冻干。这得到281mg(理论值的99％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.17min；MS(ESIpos):m/z＝286(M+H)+。
中间体L84
三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯和202mg(0.654mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在4.0ml二甲基甲酰胺中，并加入0.130ml(1.2mmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入0.085ml(1.5mmol)乙酸，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到275mg(理论值的73％)[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝530(M+H)+。
将780μl(10mmol)TFA加入[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯(268mg,505μmol)于5.0ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩并将残余物溶于水中并冻干。残余物无需进一步纯化即进一步使用。这得到266mg(理论值的97％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.46min；MS(ESIpos):m/z＝430(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.17(m,2H),1.47(m,4H),2.03(m,2H),2.99(m,2H),3.18(m,2H),3.38(m,4H),3,52(m,8H),3,58(m,6H),7.01(s,2H),7.73(bs,3H),7.80(m,1H)。
中间体L85
三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯、111mg(0.713mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和410μl(2.4mmol)N,N-二异丙基乙胺溶解在6ml二甲基甲酰胺中，并加入339mg(0.892mmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌1h并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到130mg(理论值的43％)[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.71min；MS(ESIpos):m/z＝474(M+H)+。
将410μl(5.3mmol)TFA加入[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯(126mg,267μmol)于4.0ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥。这得到124mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法13):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝374(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝2.99(m,2H),3.22(m,2H),3.41(m,2H),3,53(m,8H),3,58(m,6H),4.02(s,2H),7.09(s,2H),7.73(bs,3H),8.21(m,1H)。
中间体L86
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将100mg(0.531mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸和134mg(0.531mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在3ml二甲基甲酰胺，并加入0.150ml(1.1mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌8h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到71.5mg(理论值的41％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.42min；MS(ESIpos):m/z＝326(M+H)+。
中间体L87
3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸
将250mg(1.07mmol)3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯、151mg(0.974mmol)2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸、224mg(1.46mmol)水合1-羟基-1H-苯并三唑和224mg(1.17mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解在5.0ml二甲基甲酰胺中。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入乙酸乙酯，并将混合物用5％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次，并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到267mg(理论值的64％)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.73min；MS(ESIpos):m/z＝371(M+H)+。
将1.1ml(14mmol)TFA加入3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯(263mg,710μmol)于10ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩并将残余物在高真空下干燥。这得到240mg(理论值的94％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.57min；MS(ESIpos):m/z＝315(M+H)+。
中间体L88
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
将150mg(0.797mmol)L-缬氨酰基-L-丙氨酸和246mg(0.797mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在4.0ml二甲基甲酰胺中，并加入0.220ml(1.6mmol)三乙胺。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到302mg(理论值的97％)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.02min；MS(ESIpos):m/z＝382(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝0.82(dd,6H),1.17(m,2H),1.27(d,3H),1.48(m,4H),1.94(m,1H),2.13(m,2H),3.38(t,2H),4.17(m,2H),7.00(s,2H),7.75(d,1H),8.19(d,1H)。
将130mg(0.531mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶解在6.5ml二氯甲烷中，并加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。再加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。加入二氯甲烷并将混合物用水洗涤三次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到172mg(理论值的87％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.28min；MS(ESIpos):m/z＝479(M+H)+。
中间体L89
1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-L-谷氨酸酯盐酸盐(1:1)
首先将1.00g(2.96mmol)(4S)-5-(苄氧基)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸加入13.0mlTHF中，并加入510μl(3.6mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙醇和109mg(889μmol)4-二甲基氨基吡啶。将反应混合物冷却至0℃，并加入682mg(3.56mmol)N-乙基-N'-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。将反应混合物在RT下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂并将残余物溶解在乙酸乙酯中。将有机相用0.1N HCl溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，环己烷:乙酸乙酯80:20)纯化。这得到649mg(理论值的50％)化合物1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝4.6min；MS(ESIpos):m/z＝438(M+H)+。
将649mg(1.48mmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(叔丁氧基羰基)-L-谷氨酸酯溶解在7.0ml二噁烷中，并在冰浴冷却下加入14ml(59mmol)4N HCl的二噁烷的溶液。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后在减压下浓缩，将残余物在高真空下干燥并通过Biotage Isolera(硅胶，柱25g SNAP，二氯甲烷:甲醇90:10)纯化。这得到320mg(理论值的57％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.79min；MS(ESIpos):m/z＝338(M+H)+。
中间体L90
1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
首先将118mg(566μmol)N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸加入5.0ml DMF中，加入200mg(622μmol)1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯、130mg(849μmol)水合1-羟基-1H-苯并三唑和130mg(679μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并将混合物在RT下搅拌1h。加入乙酸乙酯，并将混合物用5％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次，并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到274mg(理论值的95％)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯。
LC-MS(方法12):Rt＝1.69min；MS(ESIpos):m/z＝513(M+H)+。
将820μl(11mmol)TFA加入274mg(535μmol)1-({N-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯于5.0ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶于水中并冻干，这得到262mg(理论值的100％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.12min；MS(ESIpos):m/z＝457(M+H)+。
中间体L91
三氟乙酸/1-{[3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
由市售可得的3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸通过肽化学的经典方法(使用EDCI/DMAP与2-三甲基甲硅烷基乙醇酯化、氢解脱去Z保护基、与市售可得的N-(叔丁氧基羰基)-3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-D-丙氨酸偶联并脱去Fmoc保护基)制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.74min；MS(ESIpos):m/z＝552(M+H)+。
中间体L92
N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-α-天冬酰胺
由市售可得的N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸通过肽化学的经典方法，经由HATU在N,N-二异丙基乙胺的存在下与L-天冬酰胺酸叔丁酯偶联以及随后用三氟乙酸将羧基脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.5min；MS(ESIpos):m/z＝409(M+H)+。
中间体L93
N-乙酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-α-天冬酰胺
由市售可得的N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基-L-丙氨酸通过肽化学的经典方法，经由HATU在N,N-二异丙基乙胺的存在下与L-天冬酰胺酸叔丁酯偶联、随后通过在DCM/甲醇中经10％活性炭负载的钯氢化而脱去Z保护基、然后在DMF中在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下用乙酸酰化并最后用三氟乙酸将羧基脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.16min；MS(ESIpos):m/z＝317(M+H)+。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝1.19(2d,6H),1.82(s,3H),2.5(m,2H),4.26(m,2H),4.48(q,1H),6.9(s,1H),7.36(s,1H),8.0(m,3H),12.54(s,1H)。
中间体L94
N-{4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酰基}-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-α-天冬酰胺
首先，通过在EDCI/DMAP存在下、在DCM中将4-(苄氧基)-4-氧代丁酸与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇反应并随后氢解苄酯来制备4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝217(M-H)-。
此外，通过在DMF中、在HATU和N,N-二异丙基乙胺存在下将N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酰基-L-丙氨酸与4-硝基苄基-L-天冬酰胺酸酯氢溴化物(1:1)偶联并随后在DCM中用三氟乙酸将氨基脱保护来制备三氟乙酸/4-硝基苄基-L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-天冬酰胺酸酯(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.43min；MS(ESIpos):m/z＝410(M+H)+。
然后通过在DMF中、在HATU和N,N-二异丙基乙胺存在下将这两种中间体偶联，并随后通过在DCM/甲醇1:9中经10％活性炭负载的钯氢化为脱去对硝基苄酯来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.79min；MS(ESIpos):m/z＝475(M+H)+。
中间体L95
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
由N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和L-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)通过肽化学的经典方法制备该中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝323.16(M+H)+。
中间体L96
N-乙酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
通过肽化学的经典方法，首先将2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯与N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联，然后经10％钯/活性碳在乙醇中氢解脱去Z保护基，最后将所得二肽与1-乙酰氧基吡咯烷-2,5-二酮反应，来制备该中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝0.25min；MS(ESIpos):m/z＝317(M+H)+。
中间体L97
1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸
首先将1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸叔丁酯(100mg,201μmol)加入1.0mlDMF中，并加入(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸(46.8mg,301μmol)、水合1-羟基-1H-苯并三唑(76.9mg,502μmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(77.0mg,402μmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯。将有机相用5％浓度的柠檬酸溶液、用饱和碳酸氢钠溶液然后用饱和氯化钠溶液各洗涤两次。将有机相经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到19.1mg(理论值的13％)化合物叔丁基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝635[M+H]+
将TFA(62μl,600μmol)加入1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯(19.1mg,30.1μmol)于1.0mlDCM的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌3h。将反应混合物在减压下蒸发，并将残余物溶于水中并冻干。残余物无需进一步纯化即进一步使用。这得到10.8mg(理论值的46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.55min；MS(ESIneg):m/z＝577[M-H]-。
中间体L98
2,2-二甲基丙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N-(2-氨基乙基)-N2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-谷氨酸酯(1:1)
首先，在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸与(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯偶联。随后在DCM中用三氟乙酸脱去Boc保护基和叔丁酯。然后，先在DMF/水中在N,N-二异丙基乙胺存在下通过与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应再次保护氨基，然后在DCM中在EDCI/DMAP存在下通过与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇反应再次保护羧基。在最后步骤中，在通过大气压下在乙醇中经10％活性炭负载的钯氢解而将末端氨基脱保护。通过过滤除去催化剂，浓缩，通过制备型HPLC纯化并将残余物从乙腈/水中冻干，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝434(M+H)+。
中间体L99
三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酰基-L-赖氨酸酯(1:1)
首先，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸通过肽化学的经典方法制备N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。然后在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将该中间体与三肽结构单元N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酸(其通过标准方法制备)偶联。随后通过在甲醇中氢解而脱去Z保护基，并在HATU和N,N-二异丙基乙胺存在下将所得的中间体与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联。在最后步骤中，在温和条件下通过在RT下在10％浓度的三氟乙酸于DCM中搅拌1h而将侧链氨基脱保护。浓缩并从乙腈/水中冻干，得到标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.64min；MS(ESIpos):m/z＝625(M+H)+。
中间体L100
3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4- 噁二唑-3-基]丙酸
将461mg(6.60mmol)盐酸羟胺和1341.86mg(13.26mmol)三乙胺加入3-氰基丙酸甲酯(500mg,4.42mmol)于40ml乙醇的溶液中。将反应混合物在50℃下搅拌3h。浓缩混合物，并将残余物溶解在乙酸乙酯中，并随后用水和盐水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩。残余物无需进一步纯化即使用。这得到400mg(理论值的62％)标题化合物。
将6.91g(36.50mmol)N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸和8.22g(39.82mmol)1,3-二环己基碳二亚胺加入(4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(羟基亚氨基)丁酸甲酯(4.85g,33.19mmol)于120.0ml二噁烷的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3h。浓缩混合物，并将残余物溶解在水中并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化。这得到6.0g(理论值的57％)标题化合物。
将(4E)-4-{[N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(羟基亚氨基)丁酸甲酯(6.0g,18.91mmol)于100mlDMF的溶液在120℃下搅拌5h。加入水，并将混合物用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到4g(理论值的71％)标题化合物。
将2.96g(25.96mmol)三氟乙酸加入3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(2.0g,7.01mmol)于30ml二氯甲烷的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残余物无需进一步纯化即使用，得到1.50g(理论值的72％)标题化合物。
将1.30g(5.52mmol)1-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮和1.52g(15.04mmol)三乙胺加入3-[5-(2-氨基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(1.5g,5.01mmol)于25ml DMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌1h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到774mg(理论值的47％)标题化合物。
1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):δ[ppm]＝2.67(t,2H),2.91(t,2H),3.03(t,2H),3.46(q,2H),4.28(s,2H),7.01(s,2H),8.37(t,1H),12.28(bs,1H)。
中间体F104
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
将10mg(0.014mmol)中间体C53溶解在3.3ml DMF中，并加入8.5mg(0.027mmol)中间体L1、7.8mg(0.02mmol)HATU和12μlN,N-二异丙基乙胺。将反应在RT下搅拌15min，然后浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，冻干后得到5.6mg(理论值的38％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.32min；MS(ESIpos):m/z＝915(M+H)+。
将5.6mg(0.006mmol)该中间体溶于2ml DMF中，并加入69mg(0.61mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应在超声波浴中处理2h。然后加入35μl乙酸并将反应在高真空下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到2.4mg(理论值的48％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(EIpos):m/z＝693[M+H]+。
HPLC(方法11):Rt＝1.91min；
或者，还由中间体C58制备标题化合物。首先在13mg(0.034mmol)HATU和10μlN,N-二异丙基乙胺存在下使15mg(0.023mmol)中间体C58与11mg(0.036mmol)中间体L1反应。在RT下搅拌60min后，浓缩混合物，并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到12.3mg(理论值的63％)受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.3min；MS(EIpos):m/z＝837[M+H]+。
在第二步骤中，将该中间体溶解在3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg(0.088mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌2h。然后加入26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml 0.1％浓度的三氟乙酸水溶液。将反应通过制备型HPLC纯化。将适当级分浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干，得到8.1mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝693(M+H)+。
中间体F119
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1:1)
将29mg(0.044mmol)中间体C58溶于3.4ml DMF中，并加入36mg(0.087mmol)中间体L52、25mg(0.065mmol)HATU和19μlN,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌60min后，浓缩混合物，并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到26.4mg(理论值的73％)中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝820和822(M+H)+。
将该中间体溶解在3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入6.5mg(0.048mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌4h。加入13.9mg(0.048mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml 0.1％浓度的三氟乙酸水溶液。将反应通过制备型HPLC纯化。将适当级分浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干，得到14.4mg(理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝676和678(M+H)+。
中间体F127
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
将12mg(0.015mmol)中间体C59溶解在2.4ml DMF中，并加入14.6mg(0.046mmol)中间体L1、6mg(0.031mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5.9mg(0.039mmol)水合1-羟基-1H-苯并三唑和8μl N,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌1h后，浓缩混合物，并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到11mg(理论值的70％)中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝942(M+H)+。
将11mg(0.011mmol)该中间体溶于2ml DMF中，并加入123mg(1.1mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应在超声波浴中处理2h。然后加入63μl乙酸，并将反应在高真空下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到2mg(理论值的22％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝721[M+H]+。
HPLC(方法11):Rt＝1.95min。
中间体F153
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-羟基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
类似于中间体F104由中间体C60进行该合成。
LC-MS(方法1):Rt＝1.1min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H)+。
中间体F155
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
如对中间体F119所述，通过在8.7mg(0.023mmol)HATU和17μlN,N-二异丙基乙胺的存在下将14mg(0.019mmol)中间体C61与15mg(0.021mmol)中间体L61偶联并随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到13mg(经2个步骤，理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝1076(M+H)+。
中间体F168
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，由市售可得的(1R,2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸，根据肽化学的经典方法通过使用EDCI/DMAP与苄醇酯化并随后在DCM中用TFA脱去叔丁氧基羰基保护基来制备三氟乙酸/(1R,2S)-2-氨基环戊烷甲酸苄酯(1:1)。
将102mg(0.305mmol)该中间体溶于12ml DMF中，并在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与100mg(0.152mmol)中间体C58偶联。在通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于甲醇中，并在RT下在氢气标准压力下经10％活性炭负载的钯氢化2h。然后滤出催化剂，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到70mg(经2个步骤，理论值的59％)(1R,2S)-2-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]氨基}环戊烷甲酸。
然后如对中间体F119所述，通过在9.5mg(0.025mmol)HATU和18μl N,N-二异丙基乙胺的存在下将20mg(0.013mmol)该中间体与16.6mg(0.023mmol)中间体L61偶联，并随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到9.3mg(经2个步骤，理论值的30％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.98min；MS(ESIpos):m/z＝1116(M+H)+。
中间体F173
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
如对中间体F119所述，由15mg(0.018mmol)中间体C64通过在7.7mg(0.02mmol)HATU和16μlN,N-二异丙基乙胺存在下与12mg(0.02mmol)中间体L63偶联且随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到12mg(经2个步骤，理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(EIpos):m/z＝1048[M+H]+。
中间体F178
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}环戊烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体F168，使用中间体L52代替中间体L61来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(EIpos):m/z＝787和789[M+H]+。
中间体F180
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
如对中间体F119所述，通过在7mg(0.018mmol)HATU和6μlN,N-二异丙基乙胺的存在下，将9.6mg(0.012mmol)中间体C64与5mg(0.013mmol)中间体L64偶联并随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到3.1mg(经2个步骤，理论值的28％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(EIpos):m/z＝822[M+H]+。
中间体F192
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-L-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将60mg(0.091mmol)中间体C58溶于8ml DMF中，并在42mg(0.11mmol)HATU和64μlN,N-二异丙基乙胺的存在下与45mg(0.100mmol)中间体L65偶联。通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于10ml乙醇中并在RT下在氢气标准压力下经10％活性炭负载的钯氢化45min。然后滤出催化剂，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到24.5mg(经2个步骤，理论值的31％)3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-L-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.17min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
然后，如对中间体F119所述，通过在5.4mg(0.014mmol)HATU和8μl N,N-二异丙基乙胺的存在下，将10mg(0.012mmol)该中间体与2mg(0.013mmol)市售可得的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸中间体偶联，且随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到3.5mg(经2个步骤，理论值的33％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F193
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F192，由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)进行标题化合物的合成。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F194
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
首先由实施例M9通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联来制备标题化合物。在下一步骤中，通过在RT下在氢气标准压力下经10％活性炭负载的钯氢化1h脱去Z保护基团，然后通过与1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮反应将脱保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.19min；MS(ESIpos):m/z＝851[M+H]+。
中间体F207
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F155制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
中间体F216
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将30.2mg(0.06mmol)N,N'-双[(苄氧基)羰基]-L-胱氨酸加入2.0ml水和2.0ml异丙醇中，并加入56.7mg(0.20mmol)TCEP。将反应混合物在RT下搅拌30min。然后加入50.0mg(0.08mmol)溶于2.0ml异丙醇的{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C70)和122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后再加入122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。用乙酸乙酯稀释混合物，并将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取，并用饱和NaCl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到43.1mg(理论值的64％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝851(M+H)+。
首先将16.5mg(0.05mmol)4-甲基苯磺酸/β-丙氨酸苄酯(1:1)与14.0mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺一起加入1.5ml乙腈中。将反应混合物在RT下搅拌3min，然后加入30.8mg(0.04mmol)溶于1.5ml乙腈的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸、23.4mg(0.18mmol)N,N-二异丙基乙胺和29.9mg(0.05mmol)T3P(50％在乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。所得化合物为S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸苄酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.59min；MS(ESIpos):m/z＝1012(M+H)+。
将43.8mg(43.3μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸苄酯溶解在8.0ml乙醇中，加入4.4mg活性炭负载的钯(10％)，并在室温和标准压力下将混合物氢化过夜。将反应混合物经纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物如刚刚所述再处理两次。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.9mg(理论值的50％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝788(M+H)+。
首先将14.5mg(16.1μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)与9.1mg(17.7μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入1.0ml DMF中，并加入4.9mg(48.2μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入3.4mg(0.06mmol)乙酸。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.9mg(理论值的50％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.28min；MS(ESIpos):m/z＝1186(M+H)+。
将14.1mg(11.9μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)溶解在1.5ml三氟乙醇中，并加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌并将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌并将反应混合物在70℃下搅拌4h。加入20.8mg(0.07mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物冻干。这得到6.2mg(理论值的44％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.82min；MS(ESIpos):m/z＝1042(M+H)+。
中间体F239
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将7.5mg(0.05mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸加入1.5mlDMF中，并加入7.5mg(0.05mmol)HOBt、15.5mg(0.05mmol)TBTU和6.2mg(0.05mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入40.0mg(0.05mmol)溶于1.5mlDMF的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和18.7mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到11.2mg(理论值的25％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝854(M+H)+。
将10.9mg(12.8μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入10.4mg(76.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速:50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物冻干。这得到7.5mg(理论值的65％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝710(M+H)+。
中间体F240
三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1:1)
首先将27.5mg(0.04mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L1)一起加入1.8ml乙腈中。然后加入32.4mg(0.31mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入32.4mg(0.05mmol)T3P(50％在乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到11.9mg(理论值的35％)化合物[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.39min；MS(ESIpos):m/z＝881(M+H)+。
将11.9mg(0.01mol)[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在1.0ml三氟乙醇中，并加入5.5mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入11.8mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。这得到7.14mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.75min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F241
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(2-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
由中间体C66通过与市售可得的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联并随后用氯化锌解封闭来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(EIpos):m/z＝733和735[M+H]+。
中间体F242
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1:1)
类似于中间体F104来合成标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H)+。
中间体F243
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]丁酰胺(1:1)
类似于中间体F242和中间体F104来合成标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝737(M+H)+。
中间体F245
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)
如对中间体F119所述，通过在15mg(0.04mmol)HATU和9μlN,N-二异丙基乙胺的存在下在8ml DMF中将10mg(0.0135mmol)中间体C65与8mg(0.027mmol)中间体L1偶联，并随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到8.8mg(经2个步骤，理论值的58％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝778(M+H)+。
中间体F247
三氟乙酸/4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
将14mg(0.018mmol)中间体C66溶解在14ml DCM中，并加入19.5mg(0.092mmol)市售可得的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和10.1mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)以及一次少量地加入总共250μl吡啶，pH保持在5至6之间。然后用乙酸将pH调节至4，将反应浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。将适当级分合并，冻干并干燥，得到4mg(理论值的21％)受保护的中间体，其随后用氯化锌在氨基官能处脱保护。HPLC纯化并冻干，得到3mg(理论值的72％)无色泡沫状的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝805和807(M+H)+。
中间体F248
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1:1)
通过在HATU的存在下将10mg(0.015mmol)中间体C58与5mg(0.017mmol)中间体L12偶联并随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。得到6.5mg(经2个步骤，理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝680(M+H)+。
中间体F254
三氟乙酸/(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
类似于中间体247，通过将15mg(0.02mmol)中间体C66与21mg(0.099mmol)(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸(其如(J.Org.Chem.200,65,517-522)中所述由(2S)-2-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸盐酸盐(1:1)合成)偶联来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝805和807(M+H)+。
中间体F255
R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基})高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先将13.1mg(0.04mmol)(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸加入1.0ml of DMF中，并加入5.4mg(0.04mmol)HOBt、11.4mg(0.04mmol)TBTU和4.6mg(0.04mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入30.0mg(0.04mmol)溶于12.9mg(0.1mmol)N,N-二异丙基乙胺的R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C11)和1mlDMF。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到32mg(73％)化合物4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝1084(M+H)+。
将41.4mg(0.038mmol)4-[2-[[(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2S)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸溶解在10ml乙醇中，加入4.2mgPd/C并将混合物在标准压力下氢化。将反应混合物经纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压且不加热的条件下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x40；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到21.1mg(56％)化合物R/S-(L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.11min；MS(ESIpos):m/z＝860(M+H)+。
首先将20.4mg(20.94μmol)R/S-(L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)与11.8mg(23.04μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入1.0mlDMF中，并加入4.2mg(41.88μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入3.1mg(0.05mmol)乙酸。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到9.5mg(36％)化合物R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.66min；MS(ESIpos):m/z＝1259(M+H)+。
将9.4mg(7.47μmol)R/S-(N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸溶解在1.5ml三氟乙醇中，并加入6.1mg(44.81μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min,MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到6.9mg(75％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝1114(M+H)+。
中间体F256
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁基}-N'-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]琥珀酰胺(1:1)
如对中间体F119所述，通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将10mg(0.014mmol)中间体C65与9.6mg(0.027mmol)三氟乙酸/N-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)偶联并随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到8mg(经2个步骤，理论值的64％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝822(M+H)+。
中间体F257
R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将50.0mg(0.06mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和29mg(0.07mmol)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(中间体L74)溶解在3.0mlDMF中，并加入27.3mg(0.07mmol)HATU和23.3mg(0.18mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌2小时。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到17.4mg(26％)化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1101(M+H)+。
将17mg(0.02mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-L-半胱氨酸溶解在1.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.05mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃搅拌过夜。加入13.5mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到7.6mg(46％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝957(M+H)+。
中间体F258
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[3-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}氨基)-3-氧代丙基]丁酰胺(1:1)
通过使用HATU将中间体C58与三氟乙酸/[2-(β-丙氨酰基氨基)乙基]氨基甲酸苄酯(1:1)偶联、随后氢解、然后与1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联并最后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝747和749(M+H)+。
中间体F259
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将75mg(0.114mmol)中间体C58溶于12.5mlDMF中，并在65mg(0.11mmol)HATU和79μlN,N-二异丙基乙胺的存在下与78mg(0.171mmol)中间体L75偶联。通过制备型HPLC纯化后，将该中间体溶于20ml乙醇并在RT下在氢气标准压力下经10％活性炭负载的钯氢化1h。然后滤出催化剂，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型HPLC纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到63mg(经2个步骤，理论值的64％)3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.16min；MS(EIpos):m/z＝844[M+H]+。
然后，如上所述在HATU的存在下将40mg(0.047mmol)该中间体与N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸偶联，然后再次氢解脱保护。
然后如对中间体F119所述，通过在4μlN,N-二异丙基乙胺的存在下将10mg(0.012mmol)该中间体与7.7mg(0.032mmol)市售可得的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联并随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到1.3mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝777和779(M+H)+。
中间体F260
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F155来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
中间体F261
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙基)丁酰胺(1:1)
通过在HATU的存在下将20mg(0.03mmol)中间体C58与25.8mg(0.061mmol)中间体L77偶联并随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。这得到11.9mg(经2个步骤，理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝722和720(M+H)+。
中间体F262
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先将30mg(36μmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)与16.9mg(40μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[2-(2-{3-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙基]丙酰胺加入1.5mlDMF中，并加入10.9mg(108μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜，然后加入7.58mg(0.13mmol)乙酸。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到33.4mg(理论值的80％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1027(M+H)+。
将32.8mg(32μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸溶解在3.0ml三氟乙醇中，并加入26.1mg(192μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃搅拌2h。加入56.0mg(0.192mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。蒸发在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。这得到22.9mg(理论值的71％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝883(M+H)+。
中间体F263
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和9.8mg(0.04mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸(中间体L78)溶解在1.0mlDMF中，并加入16.4mg(0.04mmol)HATU和14.0mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌2小时。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.2mg(13％)化合物N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.31min；MS(ESIpos):m/z＝925(M+H)+。
将11.3mg(0.011mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入5.0mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入10.7mg(0.04mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.4mg(40％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H)+。
中间体F264
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将30.0mg(0.036mmol)R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)和12.2mg(0.04mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸(中间体L79)溶解在1.0mlDMF中，并加入16.4mg(0.04mmol)HATU和14.0mg(0.11mmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌2小时。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到8.9mg(24％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法6):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝981(M+H)+。
将15.3mg(0.015mmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.045mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入13.5mg(0.045mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到9.1mg(62％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.92min；MS(ESIpos):m/z＝837(M+H)+。
中间体F265
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-10,13-二氧杂-3-硫杂-7,16-二氮杂二十二烷-1-酰胺(1:1)
首先将30.0mg(42.7μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)和25.3mg(55.6μmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)(中间体L82)加入1.9ml乙腈中，并加入60μl(340μmol)N,N-二异丙基乙胺和33μl(56μmol)2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物(50％于乙酸乙酯)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水(2.0ml)，并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到26.7mg(理论值的60％)化合物[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧杂-7-硫杂-4,11,20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.40min；MS(ESIpos):m/z＝1025(M+H)+。
将25.3mg(24.7μmol)[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧杂-7-硫杂-4,11,20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入20.2mg(148μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入43.3mg(148μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到23.4mg(理论值的95％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝881(M+H)+。
中间体F266
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12-二氮杂十八烷-18-酰胺(1:1)
首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与22.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L83)一起加入1.9ml乙腈中。然后加入60μl(0.34mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol)T3P(50％在乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到20.5mg(理论值的49％)化合物[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12,19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(ESIpos):m/z＝969(M+H)+。
将19.1mg(19.7μmol)[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12,19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入16.1mg(118μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入34.6mg(118μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到13.9mg(理论值的75％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝825(M+H)+。
中间体F267
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将13.4mg(33.3μmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(中间体L74)加入1.0mlDMF中，并加入9.3μl(54.4μmol)N,N-二异丙基乙胺和12.6mg(33.3μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入25.0mg(27.7μmol)溶于4.7μl(27.7μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0mlDMF的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)(参见中间体F216的合成)。将反应混合物在RT下搅拌90分钟。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到6.90mg(理论值的19％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸。
LC-MS(方法5):Rt＝4.44min；MS(ESIpos):m/z＝1172(M+H)+。
将6.70mg(5.71μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸溶解在1.0ml三氟乙醇中，并加入4.67mg(34.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入10mg(34.3μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.4mg(理论值的67％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝1028(M+H)+。
中间体F268
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-28-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,23-二氧代-10,13,16,19-四氧杂-3-硫杂-7,22-二氮杂二十八烷-1-酰胺(1:1)
首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)与30.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)(中间体L84)一起加入2.0ml乙腈中。然后加入60μl(0.34mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol)T3P(50％在乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到27.9mg(理论值的59％)化合物[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代-14,17,20,23-四氧杂-7-硫杂-4,11,26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.41min；MS(ESIpos):m/z＝1114(M+H)+。
将25.6mg(23.0μmol)[4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代三氧代-14,17,20,23-四氧杂-7-硫杂-4,11,26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.5ml三氟乙醇中，并加入18.8mg(138μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入40.3mg(138μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到22.2mg(理论值的88％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝969(M+H)+。
中间体F269
4-{[(8R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-8-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
首先将17.0mg(0.0195mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)与4.99mg(0.0253mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体L1)一起加入1.0ml乙腈中，然后加入27μl(0.16mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入15μl(0.025mmol)T3P(50％在乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到9.5mg(理论值的46％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.47min；MS(ESIpos):m/z＝1052(M+H)+。
将8.3mg(7.89μmol)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解在1.0ml三氟乙醇中，并加入6.45mg(47.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌6h。加入6.45mg(47.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min,，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到1.10mg(理论值的14％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝852(M+H)+。
中间体F270
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)
在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体C78)加入1.0mlDMF中，并加入8.0μl(45.8μmol)N,N-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入8.54mg(27.4μmol)溶于4.0μl(22.9μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0mlDMF的三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L1)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱:Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到14.7mg(理论值的77％)化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法5):Rt＝1.33min；MS(ESIpos):m/z＝835(M+H)+。
将13.2mg(15.8μmol)[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入12.9mg(94.8μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到10.9mg(理论值的83％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝691(M+H)+。
中间体F271
4-{[(20R,26R)-25-(3-氨基丙基)-26-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-27,27-二甲基-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-20-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将19.4mg(22.2μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)加入2.0mlDMF中，并加入21.7mg(44.4μmol)三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L74)、12μl(67μmol)N,N-二异丙基乙胺和16.9mg(44.4μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到18.1mg(理论值的66％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧杂-14-硫杂-7,11,18,33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法4):Rt＝1.79min；MS(ESIpos):m/z＝1250(M+Na)+。
将18.1mg(14.7μmol)4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧杂-14-硫杂-7,11,18,33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入12.0mg(88.4μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入25.8mg(88.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸,将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到12.3mg(理论值的73％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝1028(M+H)+。
中间体F272
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N'-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]琥珀酰胺(1:1)
在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体C78)加入1.0mlDMF中，并加入8.0μl(45.8μmol)N,N-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入13.4mg(27.4μmol)溶于4.0μl(22.9μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0mlDMF的三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L85)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到15.8mg(理论值的68％)化合物[23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18,23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(ESIpos):m/z＝1011(M+H)+。
将15.1mg(14.9μmol)[23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18,23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解2.0ml三氟乙醇中，并加入12.2mg(89.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入26.2mg(89.6μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到10.3mg(理论值的70％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝867(M+H)+。
中间体F273
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18-二氮杂二十四烷-24-酰胺(1:1)
在氩气下，首先将20.0mg(28.5μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入1.0mlDMF中，并加入10.0μl(57.0μmol)N,N-二异丙基乙胺和13.0mg(34.2μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入16.7mg(34.2μmol)溶于5.0μl(28.5μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0mlDMF的三氟乙酸/N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体L85)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到18.6mg(理论值的62％)化合物[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.37min；MS(ESIpos):m/z＝1057(M+H)+。
将17.1mg(16.2μmol)[25-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入13.2mg(97.0μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入28.4mg(97.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到9.80mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝913(M+H)+。
中间体F274
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先将13.9mg(0.0167mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)与7.07mg(0.0217mmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸(中间体L86)一起加入2.0ml乙腈中。然后加入23μl(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺，并逐滴加入13μl(0.022mmol)T3P(50％在乙酸乙酯中)。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到3.70mg(理论值的19％)化合物N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.34min；MS(ESIpos):m/z＝1024(M+H)+。
将10.6mg(10.3μmol)N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入8.46mg(62.1μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入18.1mg(62.1μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到5.60mg(理论值的54％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.69min；MS(ESIpos):m/z＝880(M+H)+。
中间体F275
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
首先将39.0mg(55.6μmol)11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体C69)加入4.0mlDMF中，加入41.6mg(111μmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-L-谷氨酸酯盐酸盐(1:1)(中间体L89)、29μl(170μmol)N,N-二异丙基乙胺和42.3mg(111μmol)HATU，并将混合物在RT下搅拌1小时。将反应混合物在RT下搅拌1小时，用乙酸骤冷并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到53.1mg(理论值的93％)化合物1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-L-谷氨酸酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.71min；MS(ESIpos):m/z＝1021[M+H]+
在氩气下，首先将7.60mg(33.9μmol)乙酸钯(II)加入3.0ml二氯甲烷中，并加入14μl(100μmol)三乙胺和110μl(680μmol)三乙基硅烷。将反应混合物在RT下搅拌5min，并加入69.2mg(67.7μmol)溶于3.0ml二氯甲烷的1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-L-谷氨酸酯。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物经纸板过滤器过滤，并将滤饼用二氯甲烷洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到38.4mg(理论值的61％)化合物(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.53min；MS(ESIpos):m/z＝931(M+H)+。
首先将10.0mg(10.7μmol)(19S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸(中间体C69)加入1.0mlDMF中，加入6.73mg(21.5μmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺/2,2,2-三氟乙烷-1,1-二醇(1:1)(中间体L1)、5.6μl(32μmol)N,N-二异丙基乙胺和8.17mg(21.5μmol)HATU，并将混合物在RT下搅拌1小时。将反应混合物在RT下搅拌3小时，用乙酸骤冷并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到6.90mg(理论值的58％)化合物N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1110[M+H]+
将6.90mg(6.21μmol)N2-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-L-α-谷氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入10.1mg(74.4μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌过夜以及在RT下搅拌72h。加入54.5mg(186μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到2.4mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝866(M+H)+。
中间体F276
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，首先将9.08mg(28.9μmol)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸(中间体L87)加入1.0mlDMF中，并加入8.33μl(48.2μmol)N,N-二异丙基乙胺和11.0mg(28.9μmol)HATU。将反应混合物在RT下搅拌10min。然后加入20.0mg(27.7μmol)溶于4.67μl(24.1μmol)N,N-二异丙基乙胺和1.0mlDMF的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.70mg(理论值的19％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.47min；MS(ESIpos):m/z＝1013(M+H)+。
将13.9mg(13.7μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-L-半胱氨酸溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入5.6mg(41.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入5.6mg(41.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌30分钟。加入24.1mg(82.4μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到10.8mg(理论值的80％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.58min；MS(ESIpos):m/z＝869(M+H)+。
中间体F277
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)(中间体C80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮溶解在1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到5.80mg(理论值的65％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1008(M+H)+。
将5.80mg(5.75μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入4.70mg(34.5μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入4.70mg(34.5μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入20.2mg(69.0μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到1.70mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.90min；MS(ESIpos):m/z＝764(M+H)+。
中间体F278
N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将10.0mg(9.98μmol)三氟乙酸/3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)(中间体C80)和2.77mg(11.0μmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮溶解在1ml二甲基甲酰胺中，并加入3.3μl(30μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌过夜。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到5.50mg(理论值的54％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.51min；MS(ESIpos):m/z＝1024(M+H)+。
将5.50mg(5.36μmol)N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在1.0ml三氟乙醇中，并加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入28.2mg(96.5μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到2.70mg(理论值的56％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H)+。
中间体F279
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({(2R)-2-羧基-2-[(3-羧基丙酰基)氨基]乙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-L-丙氨酰胺
将12.2mg(14μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(83.8μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(83.8μmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.60mg(理论值的42％)化合物4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
将10.0mg(12.7μmol)4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)和7.41mg(12.7μmol)N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(中间体L88)溶解在1.5ml二甲基甲酰胺中，并加入4.4μl(25μmol)N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物在RT下搅拌2h。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到5.20mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.11min；MS(ESIpos):m/z＝1036(M+H)+。
中间体F280
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯甲酰胺(1:1)
由中间体C64通过与市售可得的1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶联并随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝755(M+H)+。
中间体F281
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，通过肽化学的经典方法来制备改性的氨基酸结构单元N-(溴乙酰基)-β-丙氨酸和3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。然后它们在HATU和吗啉的存在下偶联。然后使用在二氯甲烷中的10％浓度的三氟乙酸脱去叔丁氧基羰基保护基，得到中间体3-{[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯。
最后，通过在HATU和4-甲基吗啉的存在下将该中间体与中间体C58偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.87min；MS(ESIpos):m/z＝791and 793(M+H)+。
中间体F282
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(3-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1:1)
首先，由甘氨酸叔丁酯和溴乙酸酐通过肽化学的经典方法制备中间体三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N2-(溴乙酰基)甘氨酰胺(1:1)。
最后，通过在HATU和4-甲基吗啉的存在下将该中间体与中间体C58偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝747和749(M+H)+。
中间体F283
N-[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]-N2-(溴乙酰基)-L-α-天冬酰胺/三氟乙酸(1:1)
首先，改性的氨基酸结构单元(2S)-2-[(溴乙酰基)氨基]-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸和溴乙酸酐由(2S)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸和溴乙酸酐来制备，并且氨基酸结构单元2-(三甲基甲硅烷基)乙基-3-氨基-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸酯由市售可得的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)来制备。在HATU和吗啉的存在下将这两种结构单元偶联，并使用在二氯甲烷中的5％浓度的三氟乙酸脱去叔丁氧基羰基保护基，得到甲硅烷基乙基酯保护基并因此得到中间体三氟乙酸/N-{(2R)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-N2-(溴乙酰基)-L-α-天冬酰胺酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)。
最后，通过在HATU和4-甲基吗啉的存在下将该中间体与中间体C58偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝835和837(M+H)+。
中间体F284
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将中间体L80与市售可得的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，然后使用在二氯甲烷中的16％浓度的三氟乙酸脱去叔丁氧基羰基保护基，得到甲硅烷基乙基酯保护基。
最后，通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将该中间体与中间体C58偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝984.45(M+H)+。
中间体F285
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-[(18-溴-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，将中间体L80用市售可得的溴乙酸酐酰化，然后使用在二氯甲烷中的20％浓度的三氟乙酸脱去叔丁氧基羰基保护基，得到甲硅烷基乙基酯保护基。
最后，通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将该中间体与中间体C58偶联、随后用氯化锌脱保护来制备标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝967和969(M+H)+。
中间体F286
1-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酰基)氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将中间体L91与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，然后使用在DCM中的12.5％浓度的TFA脱去Boc保护基。在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将所得的中间体与中间体C58偶联，然后通过用氯化锌脱保护转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝984(M+H)+。
中间体F288
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-({N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丝氨酰基}氨基)-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下将35mg(39μmol)中间体C74与N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-丝氨酸(其预先由O-叔丁基-L-丝氨酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸制备)偶联。用氯化锌脱保护并通过HPLC纯化，得到14mg(理论值的38％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.43min；MS(ESIpos):m/z＝824.34(M+H)+。
中间体F289
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-N6-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，由N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)-D-赖氨酸通过肽化学的经典方法制备三氟乙酸/N6-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-D-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)。
然后在HATU和4-甲基吗啉的存在下将12.5mg(25μmol)该中间体与15mg(23μmol)中间体C58偶联。用氯化锌脱保护并通过HPLC纯化，得到14mg(理论值的53％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝779(M+H)+。
中间体F290
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-N6-(溴乙酰基)-D-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，通过肽化学的经典方法由N6-[(苄氧基)羰基]-N2-(叔丁氧基羰基)-D-赖氨酸制备三氟乙酸/N6-(溴乙酰基)-D-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯(1:1)。
然后在HATU和4-甲基吗啉的存在下将12mg(25μmol)该中间体与15mg(23μmol)中间体C58偶联。用氯化锌脱保护并通过HPLC纯化得到7mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝762and 764(M+H)+。
中间体F291
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
由实施例M9首先通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联制备标题化合物。在下一步骤中，通过在RT下在氢气标准压力下经10％活性炭负载的钯氢化1h脱去Z保护基，然后通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联将受保护的中间体转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝777(M+H)+。
中间体F293
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯甲酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将35mg(39μmol)中间体C74溶解在4mlDMF中，并在N,N-二异丙基乙胺存在下与13.5mg(43μmol)市售可得的1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮偶联。用氯化锌脱保护并通过HPLC纯化，得到12mg(理论值的34％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝799(M+H)+。
中间体F294
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
将41mg(0.05mmol)溶于12ml甲醇的中间体C76在RT下在氢气标准压力下经10mg10％活性炭负载的钯氢化1h。然后滤出催化剂，并在减压下除去溶剂。这得到32mg(理论值的92％)脱保护的中间体。
将15mg(0.022mmol)该中间体溶解在DMF中，并加入13mg(0.039mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮和7μlN,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌1h后，将反应浓缩并将残余物通过HPLC纯化。这得到9mg(理论值的45％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝895(M+H)+。
中间体F295
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-{(1S)-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-羧基丙基}-L-丙氨酰胺
将41mg(0.05mmol)溶于12ml甲醇的中间体C76在RT下在氢气标准压力下经10mg10％活性炭负载的钯氢化1h。然后滤出催化剂，并在减压下除去溶剂。这得到32mg(理论值的92％)脱保护的中间体。
将15mg(0.022mmol)该中间体溶解在4mlDMF中，并加入10mg(0.039mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮和7μlN,N-二异丙基乙胺。在RT下搅拌2h后，将反应浓缩，并将残余物通过HPLC纯化。这得到10mg(理论值的56％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.08min；MS(ESIpos):m/z＝821(M+H)+。
中间体F296
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)磺酰基]乙基}丁酰胺(1:1)
由中间体L81通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与中间体C58偶联来制备标题化合物。在下一步骤中，通过在RT下在氢气标准压力下在DCM/甲醇1:1中经10％活性炭负载的钯氢化30min来脱去Z保护基。然后通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联并最后通过用氯化锌脱保护而将脱保护的中间体转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝785(M+H)+。
中间体F297
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体1)
在氩气下，将15mg(0.11mmol)氯化锌加入36mg(0.03mmol，纯度为68％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C92)于0.74ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后加入32mg(0.11mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到6.4mg(理论值的25％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.95min；MS(ESIpos):m/z＝792(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F298
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体2)
在氩气下，将19mg(0.14mmol)氯化锌加入到45mg(0.04mmol，纯度为71％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C91)于0.94ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入42mg(0.14mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到5.7mg(理论值的18％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.96min；MS(ESIpos):m/z＝791(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F299
S-(2-{(3-氨基丙基)[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}-2-氧代乙基)-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将76.8mg(0.57mmol)氯化锌加入到88.0mg(0.09mmol)S-{11-[(R)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-半胱氨酸(中间体C84)于1.88ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入164.6mg(0.57mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到31mg(理论值的35％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.82min；MS(ESIpos):m/z＝792(M+H)+。
中间体F300
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)丁酰胺
在氩气下，将11mg(0.08mmol)氯化锌加入7mg(0.08mmol){(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-[(2-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体C100)于0.2ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入14mg(0.05mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到1.6mg(理论值的27％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝707(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F302
S-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸三氟乙酸酯(1:1)(异构体1)
在氩气下，将31.7mg(0.23mmol)氯化锌加入56.9mg(58.2mmol，纯度为85％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸(中间体C94)于1.4ml2,2,2-三氟乙醇的混合物中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入68.0mg(0.23mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到7mg(理论值的13％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝736(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F304
N-(2-{[3-({2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]氨基}乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺/三氟乙酸(1:1)(异构体2)
将13.2mg(0.10mmol)氯化锌加入22.3mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体98)于0.64ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入28.36mg(0.10mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到5mg(理论值的24％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt 3.05min；MS(ESIpos):m/z＝819(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F305
N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-N-(吡咯烷-3-基甲基)-10,13-二氧杂-3-硫杂-7,16-二氮杂二十二烷-1-酰胺/三氟乙酸(1:1)(异构体2)
13.42mg(0.10mmol)氯化锌加到24.80mg(0.02mmol)3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,19-三氧代-12,15-二氧杂-5-硫杂-2,9,18-三氮杂二十四烷-1-基]-吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体C99)于0.65ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入28.78mg(0.10mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将乙酸乙酯加入反应混合物中，并将有机相用水和饱和NaCl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到10mg(理论值的44％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝3.11min；MS(ESIpos):m/z＝907(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F306
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-β-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
如对中间体F119中所述，通过在16.7mg(0.044mmol)HATU和15μlN,N-二异丙基乙胺的存在下将24mg(0.029mmol)中间体C61与30mg(0.035mmol)中间体L99偶联并随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护来制备标题化合物。通过制备型HPLC纯化，得到19mg(经2个步骤，理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.84min；MS(ESIpos):m/z＝1091(M+H)+。
中间体F307
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-{(5R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/3-氨基-N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)(中间体C80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮溶解在1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27μmol)N-甲基吗啉。将反应混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到5.80mg(理论值的65％)化合物N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.57min；MS(ESIpos):m/z＝1008(M+H)+。
将N-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(31.9mg,31.6μmol)和L-半胱氨酸(7.66mg,63.2μmol)溶解在3.0mlDMF中，并将混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到28.1mg(理论值的76％)化合物S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法12):Rt＝2.52min；MS(ESIpos):m/z＝1049[M+H]+
将S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(13.5mg,11.6μmol)溶解在1.0mlDMF中，加入N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(6.76mg,11.6μmol)(中间体L88)和N,N-二异丙基乙胺(4.0μl,23μmol)，并将混合物在RT下搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到11.1mg(理论值的68％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法14):Rt＝7.38min；MS(ESIpos):m/z＝1412[M+H]+
将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-S-[(19R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-L-半胱氨酸(9.40mg,6.65μmol)溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(5.44mg,39.9μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(5.44mg,39.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(23.4mg,79.8μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到5.60mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝1168(M+H)+。
中间体F308
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(12R,19R)-19-氨基-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-12,19-二羧基-5,10,15-三氧代-7,17-二硫杂-4,11,14-三氮杂十九烷-1-基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
将N-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)(12.7mg,14.5μmol)和N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸(3.84mg,14.5μmol)溶解在1.5mlDMF中，并在RT下搅拌过夜。
然后加入N,N-二异丙基乙胺(2.5μl,14μmol)。将反应混合物在RT下搅拌3h，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到7.40mg(理论值的48％)化合物S-{(5R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝949[M+H]+
将S-{(5R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]-羰基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(7.50mg,7.05μmol)溶解在1.0mlDMF中，并加入N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(4.11mg,纯度为82％,7.05μmol)(中间体L88)和N,N-二异丙基乙胺(2.5μl,14μmol)。将反应混合物在RT下搅拌1h，然后直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.30mg(46％)化合物N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-10,20-二硫杂-7,13,16,23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-L-丙氨酰胺。
LC-MS(方法14):Rt＝6.47min；MS(ESIpos):m/z＝1312[M+H]+
将N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-[(8R,15R)-23-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-10,20-二硫杂-7,13,16,23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-L-丙氨酰胺(4.00mg,3.05μmol)溶解在1.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(2.49mg,18.3μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h，然后加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(5.34mg,18.3μmol)，将混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到2.50mg(理论值的64％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.00min；MS(ESIpos):m/z＝1168[M+H]+
中间体F309
4-{[(11R,17R)-16-(3-氨基丙基)-17-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-18,18-二甲基-6,6-二氧代-2,10,15-三氧代-6λ6,13-二硫杂-3,9,16-三氮杂十九烷-11-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(50.0mg,57.3μmol)(中间体C77)和三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄酯(1:1)(27.5mg,68.7μmol)(中间体L81)加入4.0mlDMF中，并加入HATU(26.1mg,68.7μmol)和N,N-二异丙基乙胺(30μl,170μmol)。将反应混合物在RT下搅拌10min，然后直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到53.9mg(81％)化合物4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26,26-二甲基-7,7-二氧代-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧杂-7λ6,14-二硫杂-4,10,17,21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.54min；MS(ESIpos):m/z＝1141[M+H]+
在氩气下，首先将乙酸钯(II)(5.12mg,22.8μmol)加入3.0mlDCM中，并加入三乙胺(9.5μl,68μmol)和三乙基硅烷(73μl,460μmol)，并将混合物搅拌5min。然后加入在2.0mlDCM中的4-{[(12R)-17-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26,26-二甲基-7,7-二氧代-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧杂-7λ6,14-二硫杂-4,10,17,21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(52.1mg,45.6μmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，并加入2.0ml水。在减压下蒸发溶剂。将乙腈加入残余物中，并且将混合物过滤并通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到43.4mg(85％)化合物三氟乙酸/4-{[(16R)-23-氨基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧代-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(1:1)。
LC-MS(方法1):Rt＝1.21min；MS(ESIpos):m/z＝1007[M+H]+
首先将三氟乙酸/4-{[(16R)-23-氨基-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧代-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(1:1)(20.0mg,17.8μmol)和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸(3.32mg,21.4μmol)加入2.0mlDMF中，并加入HATU(8.14mg,21.4μmol)和N,N-二异丙基乙胺(9.3μl,54μmol)。
将反应混合物在RT下搅拌10min。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到17.4mg(85％)化合物4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧代-6,12,17,25-四氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18,24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.46min；MS(ESIpos):m/z＝1144[M+H]+
将4-{[(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧代-6,12,17,25-四氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18,24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(15.9mg,13.9μmol)溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(11.4mg,83.4μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(11.4mg,83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(11.4mg,83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(73.2mg,250μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到10mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝1.45min；MS(ESIpos):m/z＝944[M+H]+
中间体F310
三氟乙酸/N-[(8R,14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-8-基]-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-酰胺(1:1)
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(100mg,120μmol)(中间体C70)和1-[(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(44.1mg,132μmol)加入3.0mlDMF中，并加入4-甲基吗啉(40μl,360μmol)。将反应混合物在RT下搅拌过夜，用乙酸(420μmol)骤冷并直接通过RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到69.4mg(理论值的62％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法12):Rt＝2.61min；MS(ESIneg):m/z＝933[M-H]-
首先将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-L-半胱氨酸(27.0mg,28.9μmol)加入2.0mlDMF中，并加入N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(11.4mg,57.7μmol)(中间体L1)、N,N-二异丙基乙胺(15μl,87μmol)和HATU(22.0mg,57.7μmol)。将反应混合物在RT下搅拌3h，并直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到13.7mg(理论值的43％)化合物{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-18-硫杂-15,21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS(方法12):Rt＝2.54min；MS(ESIpos):m/z＝1114[M+H]+
将{(16R)-21-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-18-硫杂-15,21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(13.7mg,12.3μmol)溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(10.1mg,73.8μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(21.6mg,73.8μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 250x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到7.30mg(理论值的47％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.01min；MS(ESIpos):m/z＝970[M+H]+
中间体F311
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸-三氟乙酸(1:1)
首先将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(10.8mg,18.7μmol)(中间体L97)加入1.0mlDMF中，加入N,N-二异丙基乙胺(5.4μl,31.2μmol)和HATU(7.10mg,18.7μmol)，并将混合物搅拌10min。然后加入溶于1.0mlDMF和N,N-二异丙基乙胺(2.7μl,15.6μmol)的S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(12.9mg,15.6μmol)(中间体C71)。将反应混合物在RT下搅拌2h，然后直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水/0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到3.5mg(18％)化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIneg):m/z＝1276[M-H]-
将S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-L-半胱氨酸(3.50mg,2.74μmol)溶解在1.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(6.25mg,16.4μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸(47μl,16μmol),将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到2.0mg(理论值的59％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.94min；MS(ESIpos):m/z＝1133(M+H)+。
中间体F312
N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-{[2-(L-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
由中间体C103通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联来制备标题化合物。在下一步骤中，通过在RT和氢气标准压力下在DCM/甲醇1:1中经10％活性炭负载的钯氢化1小时而脱去Z保护基。然后通过在HATU和N,N-二异丙基乙胺的存在下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联，并最后用氯化锌脱保护以及通过制备型HPLC纯化而将脱保护的中间体转化为标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.9min；MS(ESIpos):m/z＝992(M+H)+。
中间体F313
S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，将16.9mg(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺和50.0mg(0.13mmol)HATU加入55.0mg(0.14mmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸于2.60mlDMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入40.0mg(0.05mmol)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸(中间体C107)的溶液，并将混合物在RT下搅拌过夜。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到10mg(理论值的13％，纯度为82％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.36min；MS(ESIpos):m/z＝1145(M+H)+。
将4.3mg(0.03mmol)氯化锌加入10.9mg(7.8mmol，纯度为82％)S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸于0.85ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入9.1mg(0.03mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。这得到2.3mg(理论值的26％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt 0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F314
三氟乙酸/3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺
在氩气下，将16.89mg(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)HATU加入50.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)-乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体106)于3.14mlDMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入27.29mg(0.09mmol)N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺/三氟乙酸(1:1)(中间体L1)的溶液，并将混合物在RT下搅拌15分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到41mg(理论值的68％，纯度为66％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.55min；MS(ESIneg):m/z＝959(M-H+Na)-。
将24.7mg(0.18mmol)氯化锌加入41.1mg(0.03mmol，纯度为66％)(3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十四烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯于2.54ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入53.0mg(0.18mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。这得到10mg(理论值的36％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt 0.89min；MS(ESIpos):m/z＝781(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F315
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酰基}-L-半胱氨酸
在氩气下，将18.02mg(0.14mmol)N,N-二异丙基乙胺和31.82mg(0.09mmol)HATU加入50.0mg(0.07mmol)3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(中间体L100)于3.5mlDMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入50.0mg(0.07mmol)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺乙酸酯(1:1)(中间体C107)的溶液，并将混合物在RT下搅拌2h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物无需纯化即进一步使用。这得到49mg(理论值的21％，纯度为31％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.30min；MS(ESIpos):m/z＝1022(M+H)+。
将8.0mg(0.06mmol)氯化锌加入49.0mg(0.015mmol，纯度为31％)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酰基}-L-半胱氨酸于0.5ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入17.2mg(0.06mmol)EDTA，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。这得到3mg(理论值的21％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝877(M+H-CF3CO2H)+。
中间体F316
三氟乙酸/N-{2-[(3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3S,4R)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}-丙酰基)氨基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
在氩气下，将16.89mg(0.13mmol)N,N-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)HATU加到50.0mg(0.04mmol，纯度为65％)3-{[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3R,4R)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体106)于3.0mlDMF的溶液中。将反应混合物在RT下搅拌10分钟。然后加入37.2mg(0.09mmol，纯度为70％)N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺乙酸酯(1:1)(中间体L73)的溶液，并将混合物在RT下搅拌7分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物无需纯化即进一步使用。这得到57mg(理论值的77％，纯度为59％)标题化合物。
LC-MS(方法12):Rt＝2.60min；MS(ESIpos):m/z＝981(M+H)+。
将36.0mg(0.27mmol)氯化锌加入56.0mg(0.03mmol，纯度为59％)(3R,4R)-3-[2-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯于2.8ml2,2,2-三氟乙醇的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入78.3mg(0.27mmol)EDTA并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型HPLC纯化。这得到16mg(理论值的44％，纯度为85％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.89min；MS(ESIpos):m/z＝837(M+H-AcOH)+。
B：制备抗体药物偶联物(ADC)
B-1.生成抗-TWEAKR抗体的一般方法
例如通过筛选重组人TWEAKR SEQ ID NO:138和鼠TWEAKR SEQ ID NO:137的噬菌体展示库生成抗-TWEAKR抗体。将由此获得的抗体重新格式化为人IgG1格式并用于本文所述的示例性实施方案。此外，结合到TWEAKR上的抗体是本领域技术人员已知的，参见，例如，WO2009/020933(A2)或WO2009140177(A2)。
SEQ ID NO:138(多肽):
EQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAAAPPAPFRLLWPRSDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:137(多肽):
EQAPGTSPCSSGSSWSADLDKCMDCASCPARPHSDFCLGCAAAPPAHFRLLWPRSDKTHT
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE
PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
B-2.在哺乳动物细胞中表达抗-TWEAKR抗体的一般方法
如Tom等人，Methods Express：Expression Systems中的第12章，MichealR.Dyson和Yves Durocher编辑，Scion Publishing Ltd，2007(参见AK-实施例1)所述，在哺乳动物细胞的短期培养物中产生抗体(例如TPP-2090和TPP-2658)。
B-3.从细胞上清液中提纯抗体的一般方法
抗体(例如TPP-2090和TPP-2658)从细胞培养物上清液获得。将该细胞上清液通过细胞离心澄清化。然后将该细胞上清液通过在MabSelect Sure(GE Healthcare)色谱柱上的亲和色谱法纯化。为此，该柱在DPBS pH7.4(Sigma/Aldrich)中平衡，加入细胞上清液，并将该柱用大约10个柱体积的DPBS pH7.4+500mM氯化钠洗涤。将抗体在50mM乙酸钠pH 3.5+500mM氯化钠中洗脱，然后通过在Superdex200柱(GE Healthcare)上在DPBSpH7.4中的凝胶过滤色谱法进一步纯化。
B-4.偶联到半胱氨酸侧链上的一般方法
以下抗体用于该偶联反应：
抗-TWEAKR AK1A(TPP-2658)
抗-TWEAKR AK1B(TPP-2090)
将2至5当量溶于PBS缓冲液的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)加入浓度范围为1mg/ml至20mg/ml、优选约10mg/ml至15mg/ml范围的适当的抗体于PBS缓冲液的溶液中，并将混合物在室温下搅拌1h。为此，所用的相应抗体的溶液可以工作实施例中指定的浓度施用，或其还可任选地用PBS缓冲液稀释至约指定起始浓度的一半以达到优选的浓度范围。随后，取决于预期的载量(loading)，作为在DMSO中的溶液加入2至12当量、优选约5-10当量的待偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物。在此，DMSO的量不应超过总体积的10％。在马来酰亚胺前体的情况下，将反应在RT下搅拌60-240min，且在卤化物前体的情况下，在室温下搅拌8至24h，然后施用至PBS平衡的PD10柱(G-25,GE Healthcare)上并用PBS缓冲液洗脱。通常，除非另有说明，否则将5mg在PBS缓冲液中的所述抗体用于还原和随后的偶联。在PD10柱上的纯化，因此在每种情况下提供在3.5ml PBS缓冲液中的相应ADC溶液。然后将该样品通过超速离心浓缩并任选地用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好除去低分子量组分，在用PBS缓冲液再稀释后反复通过超滤浓缩。对于生物学试验，如果需要，将最终ADC样品的浓度任选地通过再稀释调节至0.5-15mg/ml的范围。测定在工作实施例中指定的ADC溶液的相应的蛋白质浓度。此外，使用B-7下所述的方法测定抗体载量(药物/mAb比)。
除非另有说明，实施例中所示的免疫偶联物通过这种方法制备。取决于连接体，实施例中所示的ADC也可以在更低或更高的程度上以连接到抗体上的水解的开链琥珀酰胺的形式存在。
特别地，经连接体亚结构
连接到抗体的硫醇基团上的KSP-I-ADC也可任选地经由开链琥珀酰胺连接的ADC根据方案28通过在偶联后再缓冲并在pH8下搅拌约20-24h以靶向方式来制备。
#1代表与抗体连接的硫桥，以及#2是与改性KSP抑制剂连接的点
其中连接体经水解的开链琥珀酰胺连接到抗体上的这类ADC也可任选地通过如下示例性方法以靶向方式来制备：
在氩气下，将0.344mg TCEP于100μl PBS缓冲液中的溶液加入60mg在5ml PBS缓冲液中的所述抗体(c～12mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.003mmol溶于600μlDMSO的马来酰亚胺前体化合物。再在RT下搅拌1.5h-2h后，将反应用1075μl已预先调至pH为8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施用至已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱(G-25,GEHealthcare)上，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液用PBS缓冲液pH 8稀释至总体积为14ml。将该溶液在RT下在氩气下搅拌过夜。如果需要，随后将该溶液再缓冲至pH为7.2。将ADC溶液通过超速离心浓缩，用PBS缓冲液(pH为7.2)再稀释，然后任选地再次浓缩至浓度为约10mg/ml。
在工作实施例中与抗体连接的其他潜在的水解敏感性噻烷基琥珀酰亚胺(thianylsuccinimide)桥含有以下连接体亚结构，其中#1代表与抗体连接的硫醚键以及#2代表与改性KSP抑制剂连接的点：
这些连接体亚结构代表与抗体连接的连接单元并(除连接体组成外)对肿瘤细胞中形成的代谢物的结构和特性具有显著影响。
在所示结构式中，AK1A具有下列含义：
AK1A＝抗-TWEAKR AK1A(部分还原)-S§1
AK1B＝抗-TWEAKR AK1B(部分还原)-S§
其中
§1代表与琥珀酰亚胺基团或与由其产生的任意异构的水解的开链琥珀酰胺或亚烷基连接的键，
且
S代表部分还原的抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-5.偶联到赖氨酸侧链上的一般方法
这些偶联记载于例如工作实施例194k和294k中。与抗体这种的连接可用于具有KSP抑制剂的ADC，特别是与经由CO连接至R4上的体内裂解的2-8寡肽基团SG1连接。
下列抗体用于该偶联反应：
抗-TWEAKR AK1A(TPP-2658)
抗-TWEAKR AK1B(TPP-2090)
取决于预期的载量，将2至8当量的待偶联的前体化合物作为在DMSO中的溶液加入浓度范围为1mg/ml至20mg/ml、优选约10mg/ml在PBS缓冲液中的所述抗体的溶液。在RT下搅拌30min至6h后，再加入相同量的在DMSO中的前体化合物。在此，DMSO的量不应超过总体积的10％。在RT下再搅拌30min至6h后，将反应施加至用PBS平衡的PD10柱(G-25,GE Healthcare)上并用PBS缓冲液洗脱。通常，除非另有说明，将5mg在PBS缓冲液中的所述抗体用于还原和随后的偶联。在PD10柱上纯化，因此在每种情况下提供在3.5ml PBS缓冲液中的相应ADC溶液。然后将该样品通过超速离心浓缩并任选地用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好除去低分子量组分，在用PBS缓冲液再稀释后反复通过超滤来浓缩。对于生物学试验，如果需要，将最终ADC样品的浓度任选地通过再稀释调节至0.5-15mg/ml的范围。
测定在工作实施例中指定的ADC溶液的相应的蛋白质浓度。此外，使用B-7下所述的方法测定抗体载量(药物/mAb比)。
在所示结构式中，AK2A和AK2B具有以下含义：
AK2A＝抗-TWEAKR AK1A-NH§2
AK2B＝抗-TWEAKRAK1B-NH§2
其中
§2代表与羰基连接的键
且
NH代表该抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-6a.制备封闭的琥珀酰亚胺-半胱氨酸加合物的一般方法：
在一个示例性实施方案中，将10μmol上述马来酰亚胺前体化合物溶于3-5mlDMF中，并加入2.1mg(20μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌2h至24h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。
B-6aa.制备异构的开放的琥珀酰胺-半胱氨酸加合物的一般方法：
在一个示例性实施方案中，将68μmol上述马来酰亚胺前体化合物溶于15mlDMF中，并加入36mg(136μmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌～20h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解在15mlTHF/水1:1中。加入131μl2M氢氧化锂水溶液，并将反应在RT下搅拌1h。然后将反应用1M盐酸中和，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到理论值的～50％的无色泡沫状的区域异构的受保护中间体。
在最后步骤中，将0.023mmol这些区域异构的水解产物溶解在3ml2,2,2-三氟乙醇中。加入12.5mg(0.092mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌4h。然后加入27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到为区域异构体混合物的水解的开放的硫烷基琥珀酰胺。
本发明的偶联物的进一步纯化和表征
反应后，在一些实例中，反应混合物例如通过超滤浓缩，然后通过色谱法例如使用G-25柱脱盐并纯化。例如用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行洗脱。然后将该溶液无菌过滤并冷冻。或者，可将该缀合物冻干。
B-7.抗体、毒簇载量和开放的半胱氨酸加合物比例的测定
在去糖基化和/或变性后，除分子量测定外，为了识别蛋白质，进行胰蛋白酶消化，其在变性、还原和衍生化后经由发现的胰蛋白酶肽证实蛋白质的身份。
工作实施例中所述的缀合物的所得的PBS缓冲溶液的毒簇载量按照以下进行测定：
通过各缀合物种类的分子量的质谱测定来进行赖氨酸连接的ADC的毒簇载量的测定。在此，首先将该抗体缀合物用PNGaseF去糖基化，并且将样品酸化，并在HPLC分离/脱盐后，使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)通过质谱法分析。将TIC(总离子色谱图)中的信号的所有波谱相加，并基于MaxEnt去卷积计算不同缀合物种类的分子量。然后在不同种类的信号积分后计算DAR(＝药物/抗体比)。
通过还原和变性的ADC的反相色谱法测定半胱氨酸连接的缀合物的毒簇载量。将盐酸胍(GuHCl)(28.6mg)和DL-二硫苏糖醇(DTT)溶液(500mM,3μl)加入ADC溶液(1mg/ml,50μl)中。将该混合物在55℃下培养1h并通过HPLC分析。
在Agilent 1260HPLC系统上进行HPLC分析，在220nm检测。在1ml/min的流速下用以下梯度使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合反相柱(目录号PL1912-3802)(2.1x150mm，8μm粒度，)：0min，25％B；3min，25％B；28min，50％B。流动相A由0.05％在水中的三氟乙酸(TFA)构成，流动相B由0.05％在乙腈中的三氟乙酸构成。
通过与非缀合的抗体的轻链(L0)和重链(H0)的保留时间比较，对检测出的峰进行指定。将仅在缀合的样品中检出的峰指定为具有一个毒簇的轻链(L1)和具有一个、两个和三个毒簇的重链(H1、H2、H3)。
由积分确定的峰面积计算出的含毒簇的抗体的平均载量为HC载量和LC载量之和的两倍，其中由所有LC峰的毒簇数均加权积分结果的总和除以所有LC峰的单加权积分结果的总和计算出LC载量，并且其中由所有HC峰的毒簇数均加权积分结果的总和除以所有HC峰的单加权积分结果的总和计算出HC载量。在个别情况下，由于一些峰的共洗脱，可能无法精确测定毒簇载量。
在通过HPLC无法充分分离轻链和重链的情况下，通过轻链和重链处的各缀合物种类的分子量的质谱测定进行半胱氨酸连接的缀合物的毒簇载量的测定。
将盐酸胍(GuHCl)(28.6mg)和DL-二硫苏糖醇(DTT)的溶液(500mM，3μl)加入ADC溶液(1mg/ml，50μl)中。将混合物在55℃下培养1h并在使用ESI-MicroTofQ(BrukerDaltonik)在线脱盐后通过质谱法分析。
对于DAR测定，将TIC(总离子色谱图)中的信号的所有波谱相加，并基于MaxEnt去卷积计算轻链和重链处的不同缀合物种类的分子量。由积分确定的峰面积计算出含毒簇的抗体的平均载量为HC载量和LC载量之和的两倍，其中由所有LC峰的毒簇数均加权积分结果的总和除以所有LC峰的单加权积分结果的总和计算出LC载量，并且其中由所有HC峰的毒簇数均加权积分结果的总和除以所有HC峰的单加权积分结果的总和计算出HC载量。
为了测定开放的半胱氨酸加合物的比例，测定所有单缀合的轻链和重链变体的封闭的与开放的半胱氨酸加合物(分子量Δ18道尔顿)的分子量面积比。所有变体的平均值得出开放的半胱氨酸加合物的比例。
B-8.检验ADC的抗原结合
在已缀合后，检验结合体结合到靶分子上的能力。本领域技术人员熟知可用于此目的的各种方法；例如，可使用ELISA技术或表面等离子体共振分析(BIAcoreTM测量)检查缀合物的亲和力。本领域技术人员可使用常规方法测量缀合物浓度，例如对抗体缀合物而言通过蛋白质测定法(还参见Doronina等人；Nature Biotechnol.2003；21：778-784以及Polson等人，Blood 2007；1102：616-623)测量。
代谢物实施方案
实施例M1
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将1.8mg(2μmol)中间体F104溶于1ml DMF中，并加入2.7mg(22μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌20h，然后在减压下浓缩，然后通过制备型HPLC纯化。剩余0.6mg(理论值的26％)无色泡沫状的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.80min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
实施例M2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
LC-MS(方法1):Rt＝0.80min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
首先，在N,N-二异丙基乙胺的存在下在DMF中用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮将L-半胱氨酸转化为N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将406mg(1.53mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在10ml DMF中，加入157.5mg(1.606mmol)马来酸酐，并将反应在RT下搅拌1小时。将7.5mg(0.01mmol)中间体C66加入至130μl该溶液中，并将反应在RT下搅拌5min。然后将混合物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到10mg(89％)受保护的中间体；既不能通过HPLC也不能通过LC-MS分离该区域异构体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.38min；MS(EIpos):m/z＝1120[M+H]+。
在最后一步骤中，将10mg该中间体溶解在2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg(0.088mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌30min。然后加入26mg(0.088mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到8.3mg(理论值的99％)标题化合物，其为比例为87:13的区域异构体混合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.3min和2.43min；MS(ESIpos):m/z＝832(M+H)+。
1H-NMR主要区域异构体:(500MHz,DMSO-d6):δ＝8.7(m,1H),8.5(m,2H),8.1(m,1H),7.6(m,1H),7.5(s,1H)7.4-7.15(m,6H),6.9-7.0(m,1H),6.85(s,1H),5.61(s,1H),4.9and 5.2(2d,2H),4.26and 4.06(2d,2H),3.5-3.8(m,5H),3.0-3.4(m,5H),2.75-3.0(m,3H),2.58and 2.57(dd,1H),0.77and 1,5(2m,2H),0.81(s,9H)。
或者，按照以下制备区域异构的标题化合物：
为此，首先在N,N-二异丙基乙胺的存在下在DMF中用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮将L-半胱氨酸转化为N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将55mg(0.068mmol)中间体F104和36mg(0.136mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在15ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌20h。然后浓缩混合物，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解在15ml THF/水1:1中。加入131μl 2M氢氧化锂水溶液，并将反应在RT下搅拌1h。然后将反应用1M盐酸中和，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到37mg(理论值的50％)无色泡沫状的区域异构的受保护中间体。
LC-MS(方法5):Rt＝3.33min和3.36min；MS(ESIpos):m/z＝976(M+H)+。
在最后一步骤中，将25mg(0.023mmol)该中间体溶解在3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入12.5mg(0.092mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌4h。然后加入27mg(0.092mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到18.5mg(理论值的85％)标题化合物，其为比例为21:79的区域异构体混合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.37min和3.44min；MS(ESIpos):m/z＝832(M+H)+。
按照以下进行标题化合物的单个区域异构体的靶向制备：
实施例M2-1
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
为此，首先在DMF中在N,N-二异丙基乙胺存在下用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)-吡咯烷-2,5-二酮将L-半胱氨酸甲酯转化为N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将53mg(0.251mmol)市售可得的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和70mg(0.251mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解在5ml DMF中，并加入碳酸氢钠水溶液，同时监测pH。在RT下搅拌15min后，用乙酸将pH调节至4.3，并浓缩混合物。将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到72mg(理论值的70％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]-硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法1):Rt＝0.93min；MS(ESIpos):m/z＝410(M+H)+。
在HATU的存在下，将该中间体与中间体C66偶联，并随后如上所述先用在甲醇中的氢氧化锂然后用氯化锌完全脱保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干得到2mg标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(ESIpos):m/z＝832(M+H)+。
异构体1可以类似的方制备。
实施例M3
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
以及
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
首先，在DMF中在N,N-二异丙基乙胺的存在下用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮将L-半胱氨酸转化为N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将11mg(0.013mmol)中间体F193和8mg(0.016mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在3ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌20h。然后浓缩混合物，并将残余物通过制备型HPLC纯化。
合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解在2ml THF/水1:1中。加入19μl 2M氢氧化锂水溶液，并将反应在RT下搅拌1h。然后再加入19μl2M氢氧化锂水溶液，并将反应在RT下搅拌过夜。然后将混合物用1M盐酸中和，在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型HPLC纯化。这得到4.1mg(理论值的38％)无色泡沫状的区域异构的受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min(宽)；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
在最后一步骤中，将4.1mg(0.004mmol)该中间体溶解在3ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入3mg(0.022mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌1h。然后加入6mg(0.022mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2ml0.1％浓度的三氟乙酸水溶液，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到5mg(定量)标题化合物，其为比例为20:80的区域异构体混合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min(宽)；MS(ESIpos):m/z＝876(M+H)+。
LC-MS(方法5):Rt＝2.36min和2.39min；MS(ESIpos):m/z＝876(M+H)+。
实施例M4
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙氧基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将3mg(4μmol)中间体F248溶于2ml DMF中，并加入0.9mg(8μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌18h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，将残余物从乙腈/水中冻干后，得到1.1mg(理论值的32％)白色固体状的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.78min；MS(EIpos):m/z＝801[M+H]+。
实施例M5
(3R,7S)-7-氨基-17-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧杂-4,9,15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1:1)
以及
(3R,7S)-7-氨基-18-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧杂-4,9,15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1:1)
将8mg(0.010mmol)中间体F248的受保护的中间体和5.1mg(0.02mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在3ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌18h，然后在超声浴中处理2h。然后浓缩混合物，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，然后将残余物溶解在2ml THF/水1:1中。加入15μl 2M氢氧化锂水溶液，并将反应在RT下搅拌15min。将反应用1M盐酸调节至pH～3，用20ml氯化钠溶液稀释，并用20ml乙酸乙酯萃取两次。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干。这得到8.4mg(经2个步骤，理论值的78％)无色泡沫状的区域异构的受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.44min和3.43min；MS(ESIpos):m/z＝1107(M+H)+。
在最后一步骤中，将8mg(0.007mmol)该中间体溶解在5ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入9.8mg(0.072mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌1.5h。然后加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到4mg(理论值的59％)标题化合物，其为比例为31:67的区域异构体混合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.79min和0.81min；MS(ESIpos):m/z＝819(M+H)+。
实施例M6
2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:2)以及
3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:2)
将18mg(0.021mmol)中间体F213和11.2mg(0.04mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在2ml DMF中。并将混合物在RT下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(21.2mg)溶解在3ml THF/水1:1中。加入0.04ml 2M氢氧化锂水溶液，并将反应在RT下搅拌3小时。加入0.02ml2M氢氧化锂水溶液，并将反应在RT下搅拌1小时。使用7.2mg(0.12mmol)乙酸将反应调节至pH～7。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到13mg(经2个步骤为57％)区域异构的受保护的中间体。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝1020(M+H)+。
在最后一步骤中，将13mg(0.01mmol)该中间体溶解在2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入6.2mg(0.05mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌7h。然后加入13.3mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到10.3mg(81.4％)为区域异构体混合物的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝1.03min；MS(ESIpos):m/z＝875(M+H)+。
实施例M7
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将6mg(8μmol)中间体F119溶于3ml DMF，并加入1.8mg(15μmol)L-半胱氨酸。将反应混合物在RT下搅拌6h，然后在RT下放置3天。然后将反应在减压下浓缩，并将产物通过制备型HPLC纯化。
LC-MS(方法1):Rt＝0.81min；MS(ESIpos):m/z＝717(M+H)+。
实施例M8
(3R)-6-{(11S,15R)-11-氨基-15-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-14-乙醇酰-16,16-二甲基-2,5,10-三氧代-3,6,9,14-四氮杂十七烷-1-基}-5-氧代硫代吗啉-3-甲酸/三氟乙酸(1:1)
将4mg(0.004mmol)来自实施例135的化合物溶解在4ml THF/水中，并加入48μl2摩尔氢氧化锂水溶液。将反应在RT下搅拌1h，然后浓缩并通过制备型HPLC纯化。将适当级分合并、浓缩并从乙腈/水中冻干，得到2.4mg(理论值的60％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(EIpos):m/z＝814[M+H]+。
实施例M9
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
首先将150.0mg(0.42mmol)(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体C52)加入2.0ml二氯甲烷中，并加入29.2mg(0.49mmol)HOAc和125.6mg(0.59mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在RT下搅拌5min。加入98.9mg(0.49mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次并用饱和溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇100:1)。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到188.6mg(74％)化合物2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮。
LC-MS(方法1):Rt＝1.00min；MS(ESIpos):m/z＝541[M+H]+。
首先将171.2mg(0.32mmol)2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮加入5.0ml二氯甲烷中，并加入73.6mg(0.73mmol)三乙胺。在0℃下，加入94.9mg(0.70mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在RT下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂，并将残余物使用Biotage Isolera(硅胶，柱10g SNAP，流速12ml/min，乙酸乙酯/环己烷1:3)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到159.0mg(77％)化合物乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯。
LC-MS(方法1):Rt＝1.35min；MS(ESIpos):m/z＝642[M+H]+。
首先将147.2mg(0.23mmol)乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯加入4.0ml乙醇中，并加入356.2mg(4.59mmol)甲胺(40％在水中)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物与甲苯共-蒸馏三次。将残余物在硅胶(流动相：二氯甲烷/甲醇＝10:1)上纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到67.4mg(63％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.91min；MS(ESIpos):m/z＝470[M+H]+。
实施例M10
(2R,28R)-28-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-25-(羧甲基)-4,20,24-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-26-硫杂-3,19,23-三氮杂二十九烷-1,29-二酸/三氟乙酸(1:2)以及
(1R,28R,34R)-1-氨基-33-(3-氨基丙基)-34-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35,35-二甲基-6,10,26,32-四氧代-14,17,20,23-四氧杂-3,30-二硫杂-7,11,27,33-四氮杂三十六烷-1,4,28-三羧酸/三氟乙酸(1:2)
将20mg(0.018mmol)R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体F209)和9.78mg(0.036mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在2ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(47.7mg)溶解在3ml THF/水1:1中。加入0.08ml 2M氢氧化锂水溶液，并将反应在RT下搅拌1小时。使用9.26mg(0.15mmol)乙酸将反应调节至pH～7。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到15.3mg(经2个步骤为29％)区域异构的受保护的中间体。
LC-MS(方法6):Rt＝12.26min和12.30min；MS(ESIpos):m/z＝1254(M+H)+。
在最后一步骤中，将15.3mg(0.01mmol)该中间体溶解在2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入6.1mg(0.05mmol)氯化锌，并将反应在50℃下搅拌2h。然后加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到11.9mg(79.5％)为区域异构体混合物的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.85min；MS(ESIpos):m/z＝1110(M+H)+。
实施例M11
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:2)
将15.0mg(0.018mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C71)溶解在1.0ml三氟乙醇中，并加入7.4mg(0.054mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入15.8mg(0.054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到11.1mg(77％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.83min；MS(ESIpos):m/z＝573(M+H)+。
实施例M12
4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
将12.2mg(0.014mmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-L-半胱氨酸(中间体C77)溶解在2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(0.084mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(0.084mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％TFA)。直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水，0.1％TFA)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到4.6mg(42％)标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.88min；MS(ESIpos):m/z＝673(M+H)+。
实施例M13
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体1，差向异构体1(2R)或(2S)
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
首先，在DMF中在N,N-二异丙基乙胺存在下用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮将L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(1:1)转化为N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将408mg(1.93mmol)市售可得的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和180mg(0.644mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解在8ml DMF中，并加入147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在RT下搅拌18h后，再加入136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并再将混合物在RT下搅拌12h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到151mg(理论值的57％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.74min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
将145mg该中间体通过超临界流体色谱法经手性柱(SFC；柱：DAICEL，AD-H 5u250x20mm；流速：80ml/min；方法：AD-25％ETOH-80ml；压力：100bar；波长：210nM)分离为单独的非对映异构体，得到63mg(43％)差向异构体1和58mg(40％)差向异构体2。
差向异构体1特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.94min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.57(d,1H),4.24(m,1H),4.05(t,2H),3.67(t,1H),3.65(s,3H),3.62(s,3H),3.05(dd,1H),2.70-2.88(m,2H),2.59(dd,1H),0.93(t,2H),0.02(s,9H)。
差向异构体2特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.95min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.58(d,1H),4.16-4.23(m,1H),4.05(t,2H),3.67(dd,1H),3.65(s,3H),3.64(s,3H),3.04(dd,1H),2.88(dd,1H),2.77(dd,1H),2.61(dd,1H),0.92(t,2H),0.02(s,9H)。
将32.5mg(0.079mmol)差向异构体1在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的存在下与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，在HPLC纯化后，得到43mg(理论值的57％)完全受保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸甲酯。
然后将40mg(0.035mmol)该中间体与0.9ml2-摩尔在11ml甲醇中的氢氧化锂溶液在RT下搅拌20min，使得甲酯基团裂解。通过HPLC纯化，得到12mg(理论值的31％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.74min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述，在三氟乙醇中用氯化锌将10mg(0.009mmol)该中间体完全脱保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到2.6mg(理论值的30％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M14
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体1，差向异构体2(2R或2S)
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
类似于实施例M13中的描述，使实施例M13中所述的中间体差向异构体2反应：
在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉存的在下，将32.5mg(0.079mmol)差向异构体2与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，在HPLC纯化后，得到43mg(理论值的57％)完全受保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸甲酯。
然后将40mg(0.035mmol)该中间体与0.9ml2摩尔在11ml甲醇中的氢氧化锂溶液在RT下搅拌20min，使得甲酯基团裂解。通过HPLC纯化，得到11mg(理论值的28％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.74min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述，在三氟乙醇中用氯化锌将10mg(0.009mmol)该中间体完全脱保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到4.4mg(理论值的52％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M15
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体2，差向异构体1(3R或3S)
LC-MS(方法5):Rt＝2.45min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
将742.8mg(3.3mmol)市售可得的2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸和802mg(2.87mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解在32ml DMF中，并加入655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在RT下搅拌20h后，将反应在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到521mg(理论值的43％)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法5):Rt＝3.13min；MS(ESIpos):m/z＝424(M+H)+。
将510mg该中间体通过超临界流体色谱法经手性柱(SFC；柱：DAICEL，AD-H 5u250x20mm；流速：80ml/min；方法：AD-10％ETOH-80ml；压力：100bar；波长：210nM)分离为单独的非对映异构体，得到100mg(20％)差向异构体1和141mg(28％)差向异构体2。
差向异构体1特征如下：
LC-MS(方法1):Rt＝0.99min；MS(ESIneg):m/z＝422(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.60(d,1H),4.18-4.26(m,1H),4.01-4.08(m,4H),3.63(s,3H),3.59(dd,1H),3.04(dd,1H),2.92(dd,1H),2.80(dd,1H),2.63(dd,1H),1.17(t,3H),0.92(t,2H),0.02(s,9H)。
差向异构体2特征如下：
LC-MS(方法5):Rt＝2.95min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
1H-NMR:(400MHz,DMSO-d6):δ＝7.56(d,1H),4.21-4.29(m,1H),4.01-4.1(m,4H),3.64(s,3H),3.58(dd,1H),3.08(dd,1H),2.85(dd,1H),2.78(dd,1H),2.60(dd,1H),1.17(t,3H),0.93(t,2H),0.02(s,9H)。
将33.6mg(0.079mmol)差向异构体1在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的存在下与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，在HPLC纯化后，得到51mg(63％理论值的)完全受保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸乙酯。
然后将49mg(0.042mmol)该中间体与0.5ml 2摩尔在12ml THF/水1:1中的氢氧化锂溶液在RT下搅拌30min，使得甲酯基团裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到11mg(理论值的24％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.68min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述在三氟乙醇中用氯化锌将11mg(0.01mmol)该中间体完全脱保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到3.7mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.45min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M16
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
区域异构体2，差向异构体2(3R或3S)
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(EIpos):m/z＝832[M+H]+。
类似于实施例M15中的描述，使实施例M15中所述的中间体差向异构体2反应：
在30mg(0.079mmol)HATU和13.4mg(0.132mmol)4-甲基吗啉的存在下，将33.6mg(0.079mmol)差向异构体2与50mg(0.066mmol)中间体C66偶联，在HPLC纯化后，得到51mg(理论值的63％)完全受保护的中间体4-{[(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,9,14-三氧代-5-氧杂-7,10,13-三氮杂-2-硅杂十五烷-15-基]氨基}-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸乙酯。
然后将49mg(0.042mmol)该中间体与0.5ml 2摩尔在12ml THF/水1:1中的氢氧化锂溶液在RT下搅拌30min，使得甲酯基团裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到13.4mg(理论值的28％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.66min；MS(ESIpos):m/z＝1120[M+H]+。
最后，如上所述在三氟乙醇中用氯化锌将13.4mg(0.012mmol)该中间体完全脱保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到7.5mg(理论值的66％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.44min；MS(ESIpos):m/z＝832[M+H]+。
实施例M17
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸盐酸盐(1:1)
将150mg(0.2mmol)中间体C53溶解在15ml DMF中，并2.29g(20.39mmol)DABCO。将反应在超声浴中处理30min。通过加入1.17ml乙酸，将反应调节至pH 3-4，并将混合物在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化，并将适当的级分在RT下在减压下浓缩。将残余物溶于乙腈/水(1:1)中，加入5ml 4N盐酸，然后将混合物冻干。这得到81mg(理论值的68％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.69min；MS(EIpos):m/z＝514[M+H]+。
实施例M18
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
首先，使用肽化学的经典方法制备三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-[(苄氧基)羰基]-L-谷氨酸苄酯(1:1)。然后在HATU的存在下，将该中间体与中间体C58偶联。随后，首先通过氢解脱去苄氧基羰基保护基和苄基酯，然后使用氯化锌脱去2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基。
LC-MS(方法6):Rt＝1.91min；MS(EIpos):m/z＝685[M+H]+。
实施例M19
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，使用肽化学中已知的经典保护基方法来制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸酯(1:1)。然后在HATU的存在下，将该中间体与中间体C61偶联。随后，首先使用氯化锌将2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基和2-(三甲基甲硅烷基)乙酯裂解。最后，通过氢解苄氧基羰基保护基并通过制备型HPLC纯化来获得标题化合物。
HPLC(方法11):Rt＝1.65min；
实施例M20
(1R,4R,27R,33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四氧代-13,16,19,22-四氧杂-3,29-二硫杂-7,10,26,32-四氮杂三十五烷-1,4,27-三羧酸/三氟乙酸(1:2)
首先，在DMF中在N,N-二异丙基乙胺的存在下用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮将L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(1:1)转化为N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将408mg(1.93mmol)市售可得的3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和180mg(0.644mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解在8ml DMF中，并加入147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在RT下搅拌18h，再加入136mg(0.64mmol)3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和147mg(0.97mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并再将混合物在RT下搅拌12h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到151mg(理论值的57％)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法12):Rt＝1.74min；MS(ESIneg):m/z＝408(M-H)-。
在3.66mg(8.93μmol)HATU和1.6μl(15μmol)4-甲基吗啉的存在下，将3.66mg(8.93μmol)4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸与13.0mg(7.44μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C80)偶联，在HPLC纯化后，得到3.9mg(理论值的37％)完全受保护的中间体S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11R)-8,11-双(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,13-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
然后将3.90mg(2.76μmol)该中间体与35μl2摩尔在1.0ml THF/水3:1中的氢氧化锂溶液在RT下搅拌15min，使得甲酯基团裂解。通过HPLC纯化，得到3.60mg(理论值的94％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.83min；MS(ESIpos):m/z＝1385[M+H]+。
最后，如上所述在三氟乙醇中用氯化锌将3.6mg(2.6μmol)该中间体完全脱保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到1.92mg(理论值的55％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝1094[M-H]-。
实施例M21
(2R,24S,27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-24-(羧甲基)-4,20,23-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-25-硫杂-3,19,22-三氮杂二十八烷-1,28-二酸/三氟乙酸(1:2)
将742.8mg(3.3mmol)市售可得的2-溴-4-乙氧基-4-氧代丁酸和802mg(2.87mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解在32ml DMF中，并加入655.4mg(4.31mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。在RT下搅拌20h后，将反应在减压下浓缩，并将残余物通过制备型HPLC纯化。合并适当的级分，并在减压下蒸发溶剂，得到521mg(理论值的43％)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS(方法5):Rt＝3.13min；MS(ESIpos):m/z＝424(M+H)+。
在3.92mg(10.3μmol)HATU和1.9μl(17μmol)4-甲基吗啉的存在下，将4.36mg(10.3μmol)4-乙氧基-2-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]硫烷基}-4-氧代丁酸与15.0mg(8.59μmol)S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-(甘氨酰基氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体C80)偶联，在HPLC纯化后，得到3.6mg(理论值的26％)完全受保护的中间体S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[15-({N-[(8R,11S)-11-(2-乙氧基-2-氧代乙基)-8-(甲氧基羰基)-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7-氮杂-2-硅杂十二烷-12-基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-L-半胱氨酸。
然后将6.20mg(2.82μmol)该中间体与35μl2摩尔在1.0ml THF/水1:1中的氢氧化锂溶液在RT下搅拌15min，使得酯基裂解。酸化并通过HPLC纯化，得到3.60mg(理论值的92％)二羧酸衍生物。
LC-MS(方法5):Rt＝4.71min；MS(ESIpos):m/z＝1385[M+H]+。
最后，如上所述在三氟乙醇中用氯化锌将3.60mg(1.69μmol)该中间体完全脱保护。将残余物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到0.88mg(理论值的39％)标题化合物。
LC-MS(方法5):Rt＝2.72min；MS(ESIneg):m/z＝1094[M-H]-。
实施例M22
(2R,27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-24-(羧甲基)-4,20,23-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-25-硫杂-3,19,22-三氮杂二十八烷-1,28-二酸/三氟乙酸(1:2)和(1R,27R,33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34,34-二甲基-6,9,25,31-四氧代-13,16,19,22-四氧杂-3,29-二硫杂-7,10,26,32-四氮杂三十五烷-1,4,27-三羧酸/三氟乙酸(1:2)
将16.5mg(0.015mmol)S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体F257)和8.18mg(0.031mmol)N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在2ml DMF中，并将混合物在RT下搅拌18h。将反应混合物在减压下浓缩。将残余物(28.9mg)溶解在3ml THF/水1:1中。这得到0.046ml2M氢氧化锂水溶液，并将混合物在RT下搅拌3小时。然后使用5.2μl(0.092mmol)乙酸，将混合物调节至pH～7。将反应混合物直接通过制备型RP-HPLC(柱：Reprosil 125x30；10μ，流速：50ml/min，MeCN/水；0.1％TFA)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。这得到12.1mg(经2个步骤为58％)区域异构的受保护的中间体。
LC-MS(方法12):Rt＝1.82min；MS(ESIpos):m/z＝1240(M+H)+。
在最后一步骤中，将12.1mg(0.009mmol)该中间体溶解在2ml 2,2,2-三氟乙醇中。加入7.3mg(0.054mmol)氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌2h。然后加入15.7mg(0.054mmol)乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并将产物通过制备型HPLC纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干，得到6.4mg(59％)为区域异构体混合物的标题化合物。
LC-MS(方法1):Rt＝0.86min；MS(ESIpos):m/z＝1096(M+H)+。
工作实施例
取决于连接体和偶联方法，工作实施例的结构式中所示的ADC——其经由马来酰亚胺基团偶联至抗体的半胱氨酸侧链上——主要以各自所示的开环或闭环形式存在。然而，该制备可包括一小部分各自的其他形式。
偶联反应在氩气下进行。
实施例104K
在氩气下，将0.573mg在700μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入100mg在7000μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.3mg/ml)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入4.3mg(0.0053mmol)溶于700μl DMSO的中间体F104。在RT下再搅拌90min后，将混合物流经用pH7.2的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)并用pH 7.2的PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释并再次浓缩。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：11.73mg/ml
药物/mAb比：4.3
一些ADC还可以以连接至抗体的水解的开链的琥珀酰胺的形式存在。
实施例119B
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1B(c＝12.87mg/ml；pH7.2)用于与中间体F119偶联。在TCEP还原后通过搅拌过夜进行与抗体的偶联，然后通过Sephadex纯化来进一步后处理。Sephadex纯化后，通过超速离心浓缩混合物，并用pH 7.2的PBS再稀释。
蛋白质浓度：0.91mg/ml
药物/mAb比：4.1
实施例119K
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml；pH 7.2)用于与中间体F119偶联。在TCEP还原后通过搅拌过夜进行与抗体的偶联，然后通过Sephadex纯化来进一步后处理。Sephadex纯化后，通过超速离心浓缩混合物，并用pH 7.2的PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.12mg/ml
药物/mAb比：4.5
实施例127B
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1B(c＝12.9mg/ml，pH 7.2)用于与中间体F127偶联，并在Sephadex纯化后，通过超速离心浓缩混合物，并用PBS(pH7.2)再稀释。一些ADC还可以连接至抗体的水解的开链的琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度：1.62mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例153B
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1B(c＝18.6mg/ml，pH 7.2)用于与中间体F153偶联，并在Sephadex纯化后，通过超速离心浓缩混合物，并用PBS(pH7.2)再稀释。一些ADC还可以连接至抗体的水解的开链的琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度：1.71mg/ml
药物/mAb比：2.8
实施例173K
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F173偶联，并在Sephadex纯化后，通过超速离心浓缩混合物，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.81mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例178K
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F178偶联。抗体的还原时间为30min，并在加入F178后，将混合物在RT下搅拌20h，然后在Sephadex上纯化。最后，通过超速离心浓缩混合物，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.5mg/ml
药物/mAb比：4.2
实施例180K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入0.25mg(0.27μmol)溶于50μl DMSO的中间体F180。在RT下再搅拌90min后，将混合物用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并流经用pH8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.54mg/ml
药物/mAb比：3.5
对于该ADC制备，开环的琥珀酰胺形式的比例测定为91.1％。
实施例193K
在氩气下，将0.401mg在173μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入70mg在4827μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入3.176mg(0.00373mmol)溶于500μl DMSO的中间体F193。在RT下再搅拌90min后，将混合物用2ml已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并流经用pH8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液用2ml PBS缓冲液(pH 8)稀释，并在氩气下搅拌过夜。然后使用PD10柱，将混合物再缓冲至pH7.2。随后将混合物通过超速离心浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释并再次浓缩。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：14.76mg/ml
药物/mAb比：4.0
对于该ADC制备，开环的琥珀酰胺的比例测定为91.5％。
实施例194k
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F194偶联。首先，加入5当量溶于50μl DMSO的中间体F194，并在RT下搅拌1h后，再次加入相同的量，并将反应在RT下再搅拌一小时。随后将反应在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：0.33mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例207K
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F207偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。一些ADC还可以连接至抗体的水解的开链的琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度：1.77mg/ml
药物/mAb比：2.3
实施例208K
在氩气下，将0.86mg在2ml PBS缓冲液中的TCEP溶液加入150mg在10.5ml PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.28mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入6.63mg(0.008mmol)溶于1250μl DMSO的中间体F104。在RT下再搅拌90min后，将反应用1250μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液用pH 8的PBS缓冲液稀释至总体积为22.5ml。将该溶液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后使用PD-10柱再缓冲至pH为7.2。然后将洗出液通过超速离心浓缩，用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释，并再次再浓缩。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：14.06mg/ml
药物/mAb比：3.4
对于该ADC制备，开环的琥珀酰胺的形式的比例测定为98.3％。
实施例216K
此处，将5.0mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝15.21mg/ml)用于与中间体F216偶联，并在Sephadex纯化后，将混合物通过超速离心浓缩并再稀释。一些ADC还可以连接至抗体的水解的开链的琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度：1.39mg/ml
药物/mAb比：1.9
实施例239B
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在269μl PBS中的抗-TWEAKR AK1B(c＝18.6mg/ml)中。将混合物用2081μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.19mg(0.00027mmol)溶于100μl DMSO的中间体F239。再在RT下搅拌90min后，将混合物流经已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在RT下在氩气下搅拌过夜，随后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.28mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例239k
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将混合物用2005μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.192mg(0.23μmol)溶于100μl DMSO的中间体F239。再在RT下搅拌90min后，将混合物流经已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在RT下搅拌过夜。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：0.68mg/ml
药物/mAb比：3.1
实施例240K
在氩气下，将0.29mg在500μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入50mg在4579μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10.92mg/ml)中。将反应用7421μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入1.4mg(0.0027mmol)溶于500μl DMSO的中间体F240。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料表征如下：
蛋白质浓度：10.6mg/ml
药物/mAb比：3.7
对于该ADC制备，开环的琥珀酰胺的形式的比例测定为100％。
实施例241K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将混合物在RT下搅拌30min，然后加入0.226mg(0.27μmol)溶于50μl DMSO的中间体F241。在RT下搅拌20h后，将混合物用1.9ml PBS缓冲液稀释并使用PBS缓冲液经PD10柱(G-25，GE Healthcare)洗脱。然后将混合物通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：2.01mg/ml
药物/mAb比：3.1
实施例242B
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1B(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.22mg(0.00027mmol)溶于50μl DMSO的中间体F242。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.54mg/ml
药物/mAb比：3.1
实施例243B
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μL PBS中的抗-TWEAKR AK1B(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.23mg(0.00027mmol)溶于50μl DMSO的中间体F243。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至用pH8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料表征如下：
蛋白质浓度：1.63mg/ml
药物/mAb比：3.1
实施例245K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.238mg(0.00027mmol)溶于50μl DMSO的中间体F245。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.54mg/ml
药物/mAb比：2.9
实施例247K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.264mg(0.27μmol)溶于50μl DMSO的中间体F247。在RT下搅拌20h后，将反应用1.9ml PBS缓冲液稀释，并使用PBS缓冲液经PD10柱(G-25，GE Healthcare)洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：0.9mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例248K
此处，类似于实施例104K，将5mg在450μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝11.1mg/ml)用于与中间体F248偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。以此方式制备的一些ADC还可以连接至抗体的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度：1.68mg/ml
药物/mAb比：4.8
实施例254K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.264mg(0.27μmol)溶于50μl DMSO的中间体F254。在RT下搅拌20h后，将反应用1.9ml PBS缓冲液稀释，并用PBS缓冲液在PD10柱(G-25,GE Healthcare)上洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：2.27mg/ml
药物/mAb比：2.4
实施例255K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将混合物用2005μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.287mg(0.23μmol)溶于100μl DMSO的中间体F255。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 7.2的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 7.2的PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.72mg/ml
药物/mAb比：2.7
一些ADC还可以连接至抗体的水解的开链的琥珀酰胺的形式存在。
实施例256K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.25mg(0.00027mmol)溶于50μl DMSO的中间体F256。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.33mg/ml
药物/mAb比：2.9
实施例257K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.25mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F257。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.35mg/ml
药物/mAb比：3
实施例258K
此处，将5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1a(c＝10mg/ml)用于与中间体F258偶联。抗体的还原时间为30min，并在加入F258后，将反应在RT下搅拌20h，然后在Sephadex上纯化。最后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.35mg/ml
药物/mAb比：2.4
实施例259K
此处，将5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F259偶联。抗体的还原时间为30min，并在加入F259后，将反应在RT下搅拌20h，然后在Sephadex上纯化。最后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.64mg/ml
药物/mAb比：5.0
实施例260K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.302mg(0.00027mmol)溶于50μl DMSO的中间体F260。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.58mg/ml
药物/mAb比：3.4
实施例261K
此处，将5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F261偶联。抗体的还原时间为30min，并在加入F261后，将反应在RT下搅拌4h，然后在Sephadex上纯化。最后将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.65mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例262K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.233mg(0.23μmol)溶于100μl DMSO的中间体F262。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至用pH7.2的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH7.2的PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：0.92mg/ml
药物/mAb比：1.6
一些ADC还可以连接至抗体的水解的开链的琥珀酰胺的形式存在。
实施例263K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.209mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F263。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25,GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.38mg/ml
药物/mAb比：2.4
实施例264K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μlPBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.222mg(0.23μmol)溶于100μl DMSO的中间体F264。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至用pH 7.2的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH7.2的PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.11mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例265K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μlPBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.232mg(0.23μmol)溶于100μl DMSO的中间体F265。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至用pH 7.2的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH7.2的PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.42mg/ml
药物/mAb比：2.1
实施例266K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.219mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F266。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC特征如下：
蛋白质浓度：0.93mg/ml
药物/mAb比：2.8
实施例267K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.267mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F267。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25,GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.41mg/ml
药物/mAb比：3.6
实施例268K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.253mg(0.23μmol)溶于100μl DMSO的中间体F268。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至用pH 7.2的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH7.2的PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.50mg/ml
药物/mAb比：2.4
实施例269K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.225mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F269。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.57mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例270K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.188mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F270。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.49mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例271K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.267mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F271。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.62mg/ml
药物/mAb比：3.6
实施例272K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.229mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F272。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.49mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例273K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.240mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F273。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.19mg/ml
药物/mAb比：3.4
实施例274K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在345μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝14.5mg/ml)中。将反应用2005μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.232mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F274。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.27mg/ml
药物/mAb比：3.4
实施例275K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.229mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F275。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.23mg/ml
药物/mAb比：3
实施例276K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.229mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F276。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.45mg/ml
药物/mAb比：3.4
实施例277K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在269μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2081μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.205mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F277。再在RT下搅拌20h后，将反应流经已用PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GEHealthcare)，并用PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.88mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例278K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.209mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F278。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.44mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例279K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.242mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F279。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：2.19mg/ml
药物/mAb比：2.8
实施例280K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在450μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝11.1mg/ml)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入0.23mg(0.27μmol)溶于50μl DMSO中的中间体F280。再在RT下搅拌90min后，将反应用pH8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25,GEHealthcare)，用pH8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。随后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.8mg/ml
药物/mAb比：3.0
对于该ADC制备，开环琥珀酰胺的形式的比例测定为95.8％。
实施例281K
此处，将5mg在500μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F281偶联。在0.029mg TCEP的存在下抗体的还原时间为30min。然后在加入0.22mg(0.23μmol)在50μl DMSO中的F281后，将反应在RT下搅拌20h，并随后在Sephadex上纯化。最后将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.77mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例282K
此处，将5mg在500μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F282偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。然后在加入0.22mg(0.23μmol)在50μl DMSO中的F282后，将反应在RT下搅拌20h，并随后在Sephadex上纯化。最后将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.78mg/ml
药物/mAb比：3.8
实施例283K
此处，将5mg在550μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝9.1mg/ml)用于与中间体F283偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。然后在加入0.22mg(0.23μmol)在50μl DMSO中的F283后，将反应在RT下搅拌20h，并随后在Sephadex上纯化。最后将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.83mg/ml
药物/mAb比：2.4
实施例284K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在550μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝9.1mg/ml)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入0.26mg(0.23μmol)溶于50μl DMSO的中间体F284。再在RT下搅拌90min后，将混合物用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并流经用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.13mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例285K
此处，将5mg在550μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝9.1mg/ml)用于与中间体F285偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。然后，在加入0.25mg(0.23μmol)在50μl DMSO中的F285后，将反应在RT下搅拌20h，并随后在Sephadex上纯化。最后将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.73mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例286K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP溶液加入5mg在550μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝9.1mg/ml)中，并将反应在RT下搅拌30min。然后加入0.26mg溶于50μlDMSO的(0.23μmol)中间体F286。再在RT下搅拌90min后，将反应用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，用PBS缓冲液pH 8洗脱，然后在RT下搅拌过夜。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.79mg/ml
药物/mAb比：3.3
实施例288K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在550μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝9.1mg/ml)中，并将反应在RT下搅拌30min。然后加入0.22mg(0.23μmol)溶于50μl DMSO的中间体F288。再在RT下搅拌90min后，将反应用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。然随后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.66mg/ml
药物/mAb比：3.2
实施例289K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在450μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝11.1mg/ml)中，并将反应在RT下搅拌30min。然后加入0.21mg(0.23μmol)溶于50μl DMSO的中间体F289。再在RT下搅拌90min后，将反应用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。随后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.78mg/ml
药物/mAb比：3.7
实施例290K
此处，将5mg在450μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝11.1mg/ml)用于与中间体F290偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。然后在加入0.21mg(0.23μmol)在50μl DMSO中的F290后，将反应在RT下搅拌20h，并随后在Sephadex上纯化。最后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.71mg/ml
药物/mAb比：4.8
实施例291k
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在450μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝11.1mg/ml)中，并将反应在RT下搅拌30min。然后加入0.18mg(0.23μmol)溶于50μl DMSO的中间体F291。再在RT下搅拌90min后，将反应用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。随后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.35mg/ml
药物/mAb比：2.8
实施例293K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在550μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝9.1mg/ml)中，并将反应在RT下搅拌30min。然后加入0.23mg(0.27μmol)溶于50μl DMSO的中间体F293。再在RT下搅拌90min后，将反应用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。随后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.83mg/ml
药物/mAb比：3.4
实施例294k
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)用于与中间体F294偶联。首先，加入5当量溶于50μl DMSO的中间体F294，并在RT下搅拌1h后，再次加入相同的量，并将反应在RT下再搅拌一小时。随后将反应用PBS缓冲液(pH 7.2)稀释至2.5ml，在Sephadex柱上纯化，然后通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：2.15mg/ml
药物/mAb比：6.9
实施例295k
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在550μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝9.1mg/ml)中，并将反应在RT下搅拌30min。然后加入0.19mg(0.23μmol)溶于50μl DMSO的中间体F295。再在RT下搅拌90min后，将反应用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并施加至用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。随后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.56mg/ml
药物/mAb比：3.5
实施例296k
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入0.21mg(0.23μmol)溶于50μl DMSO的中间体F296。再在RT下搅拌90min后，将混合物用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并流经用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25,GEHealthcare)，用PBS缓冲液pH 8洗脱，然后在氩气下在RT下搅拌过夜。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.72mg/ml
药物/mAb比：4.6
实施例297k(异构体1)
此处，将5mg在500μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)用于与中间体F297偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。在加入0.23mg(0.26μmol)在50μl DMSO中的F297后，将反应在RT下搅拌2h，并随后在Sephadex上纯化。最后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.56mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例298k(异构体2)
此处，将5mg在500μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)用于与中间体F298偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。在加入0.21mg(0.23μmol)在50μl DMSO中的F298后，将反应在RT下搅拌2h，并随后在Sephadex上纯化。最后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.54mg/ml
药物/mAb比：2.9
实施例299k
此处，将5mg在500μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)用于与中间体F299偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。在加入0.22mg(0.24μmol)在50μl DMSO中的F299后，将反应在RT下搅拌2h，并随后在Sephadex上纯化。最后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.38mg/ml
药物/mAb比：3.1
实施例300K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入0.22mg(0.23μmol)溶于50μl DMSO的中间体F300。再在RT下搅拌90min后，将混合物用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并流经用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25,GEHealthcare)，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.50mg/ml
药物/mAb比：3.4
实施例302k
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中，并将混合物在RT下搅拌30min。然后加入0.20mg(0.23μmol)溶于50μl DMSO的中间体F302。再在RT下搅拌90min后，将混合物用pH 8的PBS缓冲液配制成2.5ml，并流经用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，用pH 8的PBS缓冲液洗脱，然后在RT下搅拌过夜。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.64mg/ml
药物/mAb比：4
实施例304k(异构体2)
此处，将5mg在500μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)用于与中间体F304偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。在加入0.21mg(0.23μmol)在50μl DMSO中的F304后，将反应在RT下搅拌2h，并随后在Sephadex上纯化。最后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：0.95mg/ml
药物/mAb比：2.8
实施例305k(异构体2)
此处，将5mg在500μl PBS(pH 7.2)中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)用于与中间体F305偶联。在0.029mg TCEP的存在下，抗体的还原时间为30min。在加入0.21mg(0.23μmol)在50μl DMSO中的F305后，将反应在RT下搅拌2h，并随后在Sephadex上纯化。最后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。
蛋白质浓度：1.12mg/ml
药物/mAb比：2.80
实施例306K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.28mg(0.00023mmol)溶于50μl DMSO的中间体F306。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，随后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.61mg/ml
药物/mAb比：2.3
实施例307K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.299mg(0.23μmol)溶于100μl DMSO的中间体F307。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 7.2的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 7.2的PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：2.08mg/ml
药物/mAb比：2.2
实施例308K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.299mg(0.23μmol)溶于100μl DMSO的中间体F308。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 7.2的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 7.2的PBS缓冲液洗脱。然后将洗出液通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.98mg/ml
药物/mAb比：2.6
实施例309K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至为8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.247mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F309。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD10柱(G-25，GE Healthcare)，并用PBS缓冲液pH 8洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.63mg/ml
药物/mAb比：3.9
实施例310K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.299mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F310。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.35mg/ml
药物/mAb比：2.7
实施例311K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在239μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应用2111μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释，并在RT下搅拌1h。然后加入0.337mg(0.00023mmol)溶于100μl DMSO的中间体F311。再在RT下搅拌90min后，将反应施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.26mg/ml
药物/mAb比：3.6
实施例312K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝10mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.26mg(0.00023mmol)溶于50μl DMSO的中间体F312。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GE Healthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.65mg/ml
药物/mAb比：2.0
实施例313K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.260mg(0.00023mmol)溶于50μlDMSO的中间体F313。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.27mg/ml
药物/mAb比：1.6
实施例314K
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.227g(0.00023mmol)溶于50μl DMSO的中间体F314。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.19mg/ml
药物/mAb比：2.4
实施例315k
在氩气下，将0.029mg在50μl PBS缓冲液中的TCEP的溶液加入5mg在500μl PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)中。将反应在RT下搅拌30min，然后加入0.236g(0.00023mmol)溶于50μl DMSO的中间体F315。再在RT下搅拌90min后，将反应用1900μl已预先将pH调节至8的PBS缓冲液稀释。
然后将该溶液施加至已用pH 8的PBS缓冲液平衡的PD 10柱(G-25，GEHealthcare)，并用pH 8的PBS缓冲液洗脱。将洗出液在氩气下在RT下搅拌过夜，然后通过超速离心浓缩，并用PBS缓冲液(pH 7.2)再稀释。在这些条件下，一些ADC还可以闭环的形式存在。所得的ADC批料特征如下：
蛋白质浓度：1.43mg/ml
药物/mAb比：2.3
实施例316k
此处，将5mg在PBS中的抗-TWEAKR AK1A(c＝20.9mg/ml)用于与中间体F316偶联，并在Sephadex纯化后，将反应通过超速离心浓缩，并用PBS再稀释。一些ADC还可以连接至抗体的水解开链的琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度：1.68mg/ml
药物/mAb比：2.5
C：生物学效力的评估
可在下述检测中示出本发明的化合物的生物学活性：
a.C-1a针对TWEAKR的ADC的细胞毒性作用的测定
用多种细胞系进行抗-TWEAKR的ADC的细胞毒性作用的分析：
NCI-H292：人粘液表皮样肺癌细胞，ATCC-CRL-1848，标准培养基：RPMI1640(Biochrom；#FG1215，稳定化的(stab.)谷氨酰胺)+10％FCS(Biochrom；#S0415)，TWEAKR-阳性，EGFR-阳性。
BxPC3：人胰腺癌细胞，ATCC-CRL-1687，标准培养基：RPMI1640(Biochrom；#FG1215,稳定化的谷氨酰胺)+10％FCS(Biochrom；#S0415)，TWEAKR-阳性。
细胞通过如American Tissue Culture Collection(ATCC)对所述细胞系所示的标准方法进行培养。
MTT检测
根据标准方法使用C-1中所列的生长培养基培养细胞。通过用Accutase于PBS的溶液(BiochromAG#L2143)将细胞分离、造粒、再悬浮在培养基中、计数并接种到白底96孔培养板(Costar#3610)中(在100μl的总体积中，NCI H292：2500个细胞/孔，KPL-4：1200个细胞/孔，LoVo：1000个细胞/孔)进行该试验。然后将细胞在培养器中在37℃和5％二氧化碳下培养。在48小时后，更换培养基。然后将10μl培养基中浓度为10-5M至10-13M的代谢物吸移至细胞中(一式三份)，随后将试验物在培养器中在37℃和5％二氧化碳下培养。在96小时后，使用MTT检测法(ATCC，Manassas，Virginia，USA，目录号30-1010K)检测细胞增殖。为此，将MTT试剂用细胞培养4h，然后通过加入洗涤剂将细胞溶解过夜。在570nm(Infinite M1000pro，Tecan)下检测所形成的染料。利用测量数据使用DRC(剂量反应曲线)计算出生长抑制的IC50。未用试验物质处理但原本应同样处理的细胞的增殖被定义为100％数值。
CTG检测
根据标准方法使用C-1中所列的生长培养基培养细胞。通过用胰蛋白酶(0.05％)和EDTA(0.02％)于PBS的溶液(BiochromAG#L2143)将细胞分离、造粒、再悬浮在培养基中、计数并接种到白底96孔培养板(Costar#3610)中(75μl/孔，每孔为下列细胞数：NCI-H292：2500个细胞/孔，BxPC3：2500个细胞/孔)，并在培养器中在37℃和5％二氧化碳下培养来进行该试验。在24小时后，将25μl培养基中的抗体药物缀合物(浓缩四倍)加入细胞中以使得细胞上的抗体药物缀合物的最终浓度达到3x10-7M至3x10-11M(一式三份)。然后将细胞在培养器中在37℃和5％二氧化碳下培养。在平行板中，使用Cell Titer Glow(CTG)发光细胞活力检测法(Promega#G7573和#G7571)测定药物处理开始时(第0天)的细胞活力。为此，将100μl底物加入各细胞批料中，然后将该板用铝箔覆盖，在板振荡仪上以180rpm振荡2分钟，使其在实验工作台上静置8分钟，然后使用光度计(VictorX2，PerkinElmer)测量。该底物检测产生发光信号的活细胞的ATP含量，该发光信号的强度与细胞的活力直接成正比。在用抗体药物缀合物培养72h后，也使用如上所述的Cell Titer Glow发光细胞活力检测法测定这些细胞的活力。利用测得的数据，使用DRC(剂量反应曲线)分析电子表格经4参数拟合计算出与第0天相比的生长抑制的IC50。该DRC分析电子表格是Bayer Pharma AG和Bayer BusinessServices在IDBS E-WorkBook Suite平台上开发的Biobook电子表格(IDBS:ID BusinessSolutions Ltd.,Guildford,UK)。
下表1列出了来自CTG检测的抗-TWEAKR抗体的代表性工作实施例的IC50值：
表1
所报道的活性数据涉及本实验部分中所述的工作实施例，示出药物/mAb比。这些数值可能偏离不同的药物/mAb比。IC50值是几个独立实验的平均值或独立值。该TWEAKR抗体药物缀合物的作用对包含各自的连接体和毒簇的各自同型对照物是选择性的。
C-1b通过所选实施例测定纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5的抑制
人纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5(tebu-bio/Cytoskeleton Inc,No.027EG01-XL)的马达结构域在RT下在15mM PIPES，pH6.8(5mMMgCl2和10mMDTT，Sigma)中用50μg/ml紫杉醇(Sigma No.T7191-5MG)稳定的微管蛋白(牛或猪，tebu-bio/CytoskeletonInc)以10nM的浓度培养5min。将新鲜制备的混合物等分到384孔MTP中(粒化)。然后加入1.0x10-6M至1.0x10-13M浓度的待检验的抑制剂和ATP(最终浓度500μM，Sigma)。在RT下培养2h。通过检测使用孔雀绿(Biomol)形成的无机磷酸盐来检测ATPase活性。在加入该试剂后，将试验在RT下培养50min，然后在620nm的波长下检测吸收。所用的阳性对照为monastrol(Sigma,M8515-1mg)和ispinesib(AdooQ Bioscience A10486)。剂量-活性曲线的各数据是八次测定。IC50值是两个独立实验的平均值。100％对照是未用抑制剂处理的样品。
下表2总结了来自所述检测的代表性工作实施例的IC50值和相应的细胞毒性数据(MTT检测)：
表2
所报道的活性数据涉及本实验部分中所述的工作实施例。
C-2内化检测
内化是能够经由抗体药物缀合物(ADC)在表达抗原的癌细胞中特异性和有效地提供细胞毒性有效载量的关键过程。该过程经由特异性TWEAKR抗体和同型对照抗体的荧光标记来监测。首先，将荧光染料缀合到抗体的赖氨酸上。使用两倍摩尔过量的CypHer5E单NHS酯(Batch 357392，GE Healthcare)在pH8.3下进行缀合。偶联后，将反应混合物通过凝胶色谱法(Zeba Spin脱盐柱，40K，Thermo Scientific，No.87768；洗脱缓冲液：DULBECCO′SPBS，Sigma-Aldrich，No.D8537)纯化以除去过量染料并调节pH。蛋白质溶液使用VIVASPIN500柱(Sartorius stedim biotec)浓缩。通过分光光度分析(NanoDrop)以及随后的计算(D:P＝A染料ε蛋白质:(A280-0.16A染料)ε染料)来测定抗体的染料载量。
在此检查的TWEAKR抗体和同型对照物的染料载量是相当的量级。在细胞结合检测中，证实该缀合不会造成抗体亲和力的变化。
该标记的抗体用于内化检测。
在处理开始前，将细胞(2x104/孔)接种在96-MTP(厚，黑色，透明底No4308776，购自Applied Biosystems)中的100μl培养基中。在37℃/5％CO2下培养18小时后，更换培养基并以不同浓度(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)加入标记的TWEAKR抗体。对标记的同型对照物(阴性对照物)采用相同处理方案。所选的培养时间是0h、0.25h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h和24h。借助于InCellanalyser 1000(购自GE Healthcare)测量荧光。然后，经由参数颗粒计数/细胞和总颗粒强度/细胞的测量进行动力学评估。
在结合到TWEAKR后，检验TWEAKR抗体的待被内化的能力。为此，选择具有不同TWEAKR表达水平的人肿瘤细胞(NCI-H292、786-O、A498)。可在不同细胞系中观察到TWEAKR抗体的靶标介导的特异性内化，而同型对照物未显示出内化。
C-3测定细胞渗透性的体外试验
可借助使用Caco-2细胞的通量检测中的体外试验研究物质的细胞渗透性[M.D.Troutman和D.R.Thakker，Pharm.Res.20(8)，1210-1224(2003)]。为此，将细胞在24孔过滤板上培养15-16天。为了测定渗透，将各试验物质在HEPES缓冲液中在顶部(A)或基部(B)施用至细胞上并培养2小时。在0小时后和在2小时后，从顺式和反式隔室中取样。使用反相柱通过HPLC(Agilent 1200，Germany)分离样品。将HPLC系统经Turbo IonSpray Interface与三重四极质谱仪API4000(AB SCIEX Deutschland GmbH，Darmstadt，Germany)联用。基于使用Schwab等人[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46，1716-1725(2003)]公开的公式计算出的Papp值评估渗透性。当Papp(B-A)与Papp(A-B)的比率(外排率)>2或<0.5时，物质被归类为主动转运。
对细胞内释放的毒簇而言至关重要的是从B到A的渗透性[Papp(B-A)]以及Papp(B-A)与Papp(A-B)的比率(外排率)：该渗透性越低，该物质穿过Caco-2细胞的单层的主动和被动转运过程越慢。如果外排率另外没有显示任何主动转运，则该物质在细胞内释放后可在细胞中停留更久。因此，也有更多时间可供与生物化学靶标(在这种情况下：纺锤体驱动蛋白,KSP/Eg5)相互作用。
下表3列出了来自该检测的代表性工作实施例的渗透性数据：
表3a
C-4测定P-糖蛋白(P-gp)的底物性质的体外试验
许多肿瘤细胞表达用于药物的转运蛋白，这通常伴随着对细胞抑制剂的抗性发展。因此，不是此类转运蛋白的底物的物质(如P-糖蛋白(P-gp)或BCRP)可表现出改进的活性特性。
借助使用过表达P-gp的LLC-PK1细胞(L-MDR1细胞)的通量检测法测定用于P-gp(ABCB1)的物质的底物性质[A.H.Schinkel等人，J.Clin.Invest.96，1698-1705(1995)]。为此，将LLC-PK1细胞或L-MDR1细胞在96孔过滤板上培养3-4天。为了测定渗透，将各试验物质单独或在抑制剂(例如伊维菌素或维拉帕米)存在下在HEPES缓冲液中在顶部(A)或基部(B)施用至细胞上并培养2小时。在0小时后和在2小时后，从顺式和反式隔室中取样。使用反相柱通过HPLC分离样品。将HPLC系统经Turbo Ion Spray Interface与三重四极质谱仪API3000(Applied Biosystems Applera,Darmstadt,Germany)联用。基于使用Schwab等人[D.Schwab等人，J.Med.Chem.46，1716-1725(2003)]公开的公式计算出的Papp值评估渗透性。当Papp(B-A)与Papp(A-B)的外排率>2时，物质被归类为P-gp底物。
作为用于评估P-gp底物性质的其他标准，可比较L-MDR1和LLC-PK1细胞中的外排率或在存在或不存在抑制剂的情况下的外排率。如果这些值相差大于2倍，则所述物质是P-gp底物。
C-5药代动力学
C5a：体外内化后的ADC代谢物的鉴定
方法的说明：
用免疫缀合物进行内化研究以分析细胞内形成的代谢物。为此，将人肺肿瘤细胞NCI H292(3x105/孔)接种在6孔板中并培养过夜(37℃，5％CO2)。将细胞用10μg/ml(66nM)待检验的ADC处理。在37℃和5％CO2下进行内化。在各种时间点(0、4、24、48、72h)，取细胞样品用于进一步分析。首先，收集上清液(约5ml)，并在离心(2min，RT，1000rpm HeraeusVariofuge 3.0R)后，储存在-80℃。将细胞用PBS洗涤并用Accutase分离，并测定细胞数。再次洗涤后，将确定数量的细胞(2x105)用100ml裂解缓冲液(Mammalian Cell Lysis Kit(SigmaMCL1))处理，并在Protein LoBind试管(Eppendorf目录号0030108.116)中在连续振荡(Thermomixer,15min,4℃,650rpm)下培养。在培养后，将该裂解产物离心(10min,4℃,12000g,Eppendorf 5415R)并收集上清液。将所得的上清液储存在-80℃。然后按照以下分析所有样品。
在用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后通过与三重四极质谱仪(MS)联用的高压液相色谱法(HPLC)进行培养上清液或细胞裂解产物中的化合物的测量。
对于50μl培养上清液/细胞裂解产物的后处理，加入150μl沉淀试剂(通常为乙腈)并将混合物振荡10秒。沉淀试剂含有合适浓度(通常为20-100ng/ml)的内标物(ISTD)。在以16000g离心3分钟后，将上清液转移到自动采样瓶中，用500μl适用于该流动相的缓冲液配制并再次振荡。
然后使用与HPLC联用的的三重四极质谱仪API6500(购自AB SCIEX DeutschlandGmbH)测量这两种基质样品。
为了校准，将0.5-2000μg/l的浓度加入到血浆样品中。检出限(LOQ)为约2μg/l。线性范围从2延伸至1000μg/l。
为了校准肿瘤样品，将0.5-200μg/l的浓度加入到未处理的肿瘤的上清液中。检出限为4μg/l。线性范围从4延伸至200μg/l。
用于测试有效性的质量对照物(Quality controls)含有5和50μg/l。
将NCI-H292细胞各自用10μg/ml来自实施例119b的ADC培养。72h后，将细胞用PBS洗涤，裂解并深冻(-80℃)。通过上述方法后处理细胞裂解产物和细胞培养上清液，并在提取后鉴定和量化下列代谢物：
C5b：体内ADC代谢物的鉴定
在静脉给予3-30mg/kg不同的ADC后，可测量ADC和出现的任何代谢物的血浆和肿瘤浓度，并可计算药代动力学参数，如清除率(CL)、曲线下面积(AUC)和半衰期(t1/2)。
出现的任何代谢物的量化分析
在用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后通过与三重四极质谱仪(MS)联用的高压液相色谱法(HPLC)进行血浆和肿瘤中的化合物的测量。
对于50μl血浆的后处理，加入250μl沉淀试剂(通常为乙腈)，并将混合物振荡10秒。沉淀试剂含有合适浓度(通常为20-100ng/ml)的内标物(ISTD)。在以16000g离心3分钟后，将上清液转移到自动采样瓶中，用500μl适用于流动相的缓冲液配制并再次振荡。
在肿瘤的后处理过程中，将其用3倍量的提取缓冲液处理。该提取缓冲液含有50ml组织蛋白提取剂(Pierce，Rockford，IL)、完全蛋白酶抑制剂混合物(Complete-Protease-Inhibitor-Cocktail)的两个丸粒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)和最终浓度为1mM的苯基甲基磺酰氟(Sigma，St.Louis，MO)。将该样品在组织破碎仪II(Qiagen)中在最大冲程数下匀化两次持续20分钟。将50μl匀浆转移到自动采样瓶中并用150μl包括ISTD的甲醇配制。以16000g离心3分钟后，将10μl上清液用180μl适用于流动相的缓冲液配制并再次振荡。然后将该肿瘤样品准备好用于测量。
使用与HPLC联用的三重四极质谱仪API6500(购自AB SCIEX Deutschland GmbH)测量这两种基质样品。
为了校准，将0.5-2000μg/l的浓度加入到血浆样品中。检出限(LOQ)为约2μg/l。线性范围从2延伸至1000μg/l。
为了校准肿瘤样品，将0.5-200μg/l的浓度加入到未处理的肿瘤的上清液中。检出限为5μg/l。线性范围从5延伸至200μg/l。
用于测试有效性的质量对照物(Quality controls)含有5和50μg/l，另外在血浆中为500μg/l。
在将10mg/kg来自实施例119b的ADC给药至来自具有NCI-H292的异种移植模型的对照组后，在24小时后处死小鼠，取出血液并分离肿瘤。通过上述方法后处理血浆和肿瘤样品，并在提取后鉴定和量化下列代谢物：
所用抗体的量化分析
使用配体结合检测法(ELISA)测定ADC的抗体部分作为血浆样品和肿瘤裂解产物中的总IgG浓度。在此，使用夹心ELISA格式。这种ELISA已被确认和验证用于血浆和肿瘤样品中的测定。用抗人山羊的IgG Fc抗体涂覆ELISA板。用样品培养后，洗涤该板并将该板用猿猴的抗人IgG(H+L)抗体和辣根过氧化物酶(HRP)的检测缀合物培养。在进一步洗涤步骤后，将HRP底物加入OPD中并通过在490nm的吸收监测显色。使用4参数方程拟合具有已知IgG浓度的标准样品。在定量下限(LLOQ)和上限(ULOQ)内，通过内插法测定未知浓度。
C-6体内效力试验
本发明的缀合物的效力使用异种移植模型在体内测试。本领域技术人员熟悉可用于测试本发明的化合物的效力的现有技术方法(参见例如WO2005/081711；Polson等人，Cancer Res.2009Mar 15；69(6)：2358-64)。为此，例如，将表达结合体的靶分子的肿瘤细胞系植入到啮齿动物(例如小鼠)中。然后将本发明的缀合物、同型抗体对照缀合物或对照抗体或等渗盐水给药至植入动物。给药进行一次或多次。在几天的培养时间后，通过比较缀合物处理的动物和对照组来测定肿瘤尺寸。缀合物处理的动物表现出较小的肿瘤尺寸。
C-6a.小鼠中的实验肿瘤的生长抑制/消退
将表达抗体药物缀合物的抗原的人肿瘤细胞经皮接种到免疫抑制小鼠如NMRi裸鼠或SCID小鼠的侧腹中。从细胞培养物中分离1-10百万个细胞，离心并再悬浮在培养基或培养基/基质胶中。在小鼠的皮肤下注射该细胞悬浮液。
肿瘤生长数天。一旦肿瘤建立(在肿瘤尺寸为约40mm2时)，即开始治疗。如果要检验对更大肿瘤的作用，则还可以在肿瘤尺寸为50-100mm2时才开始治疗。
通过进入小鼠尾静脉的静脉内(i.v.)途径进行ADC治疗。ADC以5ml/kg的体积给药。
治疗方案取决于抗体的药代动力学。标准治疗为每四天依次进行三次。在肿瘤生长缓慢的情况下，每周一次治疗可能是合适的。为了快速评估，也可以使用单次治疗方案。然而，也可以继续该治疗，或可在稍后时间点接着进行三个治疗日的第二循环。
作为标准，每治疗组使用8个动物。除接受药物的组外，一个仅用缓冲液处理然后进行相同方案的组作为对照组。
在实验过程中，使用卡尺在两个维度(长度/宽度)上定期测量肿瘤面积。测定肿瘤面积为长度x宽度。将治疗组与对照组的平均肿瘤面积比规定为T/C面积。
如果在治疗结束后所有实验组同时终止，则可将肿瘤摘除并称重。将治疗组与对照组的平均肿瘤重量比规定为T/C重量。
C-6b.无糖基化抗-TWEGFR抗体药物缀合物在不同的肿瘤模型中的效力
将肿瘤细胞经皮下接种到雌性NMRI裸小鼠(Janvier)的侧腹中。在肿瘤尺寸～40mm2时，用抗体药物缀合物进行静脉内治疗。在治疗后，任选地进一步监测肿瘤生长。
与对照组和未缀合的抗-TWEAKR抗体相比，用抗-TWEAKR抗体药物缀合物的治疗产生显著的且长效的肿瘤生长抑制。表4示出了从开始治疗时计算的，由在实验终止的相应天数时的肿瘤重量和肿瘤面积确定的T/C值。
表4：
抗-TWEAKR抗体的工作实施例
除非本文中详细说明，否则所有实施例使用本领域技术人员已知的标准方法进行。以下实施例的分子生物学的常规方法可如标准实验教材——例如Sambrook等人，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，第2版；Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.，1989——中所述进行。
AK-实施例1：通过抗体库制备抗体
使用完整人类噬菌体展示库(Hoet RM等人，Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)通过蛋白质筛选分离本发明的TWEAKR特异性人单克隆抗体(Hoogenboom H.R.，NatBiotechnol 2005；23(3)：1105-16)，其中固定人和鼠TWEAKR的二聚Fc融合的胞外结构域作为靶标。
表AK-1：用于抗体选择的重组抗原的列表
名称 说明 SEQ ID NO
TPP-599 HUMAN-TNFRSF12Aaa28-80-hIgG1-Fc 138
TPP-601 MURIN-TNFRSF12Aaa28-80-hIgG1-Fc 137
将抗原根据制造商的说明书使用约2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS(Pierce；目录号21347)生物素化，并使用Zeba脱盐柱(Pierce；目录号89889)脱盐。将洗过的磁珠(DynaBeads)在4℃下用200nM生物素化的人抗原培养过夜，并用封闭缓冲液(含3％BSA、0.05％Tween-20的PBS)在4℃下封闭1h。将封闭的Fab噬菌体库加入封闭的TWEAKR珠(DynaBeads链霉亲和素-M280-Invitrogen 112-06D)中，并在室温下培养30min。在严格洗涤(3x在封闭缓冲液中以及9x在含0.05％Tween-20的PBS(150mM NaCl；8mM Na2HPO4；1.5mMKH2PO4；调节至pH＝7.4-7.6)中)后，将特异性结合到生物素化的TWEAKR珠(DynaBeads链霉亲和素-M280-Invitrogen112-06D)上的Fab噬菌体再悬浮在PBS中，并为了扩增，直接用于感染大肠杆菌菌株TG1。在第二选择循环中，使用两种鼠TWEAKR(200nM)以选择交叉反应性结合体，并在第三选择循环中，降低人TWEAKR的浓度(100nM)以提高对高亲和性结合体的选择压力。
识别11种不同的Fab噬菌体，并将相应的抗体克隆到提供可溶性FAb中不存在的缺失的CH2-CH3结构域的哺乳动物的IgG表达载体中。所得的IgG在哺乳动物细胞中短暂表达，如Tom等人，在Methods Express中的第12章：Micheal R.Dyson和Yves Durocher编辑的Expression Systems，Scion Publishing Ltd，2007中所述。简短地，将基于CMV启动子的表达质粒转染到HEK293-6E细胞中并在Fernbach瓶或Wave-袋中培养。在F17培养基(Invitrogen)中在37℃下进行表达5至6天。转染后24小时，加入1％Ultra-Low IgG FCS(Invitrogen)和0.5mM丙戊酸(Sigma)作为补充剂。该抗体通过蛋白质A色谱法纯化，并经ELISA和BIAcore分析通过它们与可溶性单体TWEAKR的结合亲和力进一步表征，如AK-实施例2中所述。
表AK-2：用于亲和力测量的重组抗原的列表
为了测定抗-TWEAKR抗体的细胞结合特征，通过流式细胞术检验与许多细胞系(HT29、HS68、HS578)的结合。将细胞悬浮在抗体(5μg/ml)于FACS缓冲液的稀释液中，并在冰上培养1h。然后加入第二抗体(PE山羊-抗-人IgG，Dianova#109-115-098)。在冰上培养1h后，使用FACS阵列(BD Biosciences)通过流式细胞术分析细胞。
进行NF-κB报道基因检测以评定所有11种识别的抗体(人IgG1)的激动活性。使用293fectin根据制造商的说明书用NF-κB报告基因构建体(BioCat,目录号LR-0051-PA)短暂转染HEK293细胞。将转染细胞在37℃、5％CO2下接种到在白色聚赖氨酸涂覆的384孔板(BD)中的F17培养基(无血清；Invitrogen)中。第二天，将该细胞用纯化的抗体以不同的浓度刺激6h，然后通过标准方法进行荧光素酶检测。
通过抗-TWEAKR抗体(CypHer5E单NHS酯；GEHealthcare)的荧光标记监测内化。在处理前，将HT29细胞(2x104/孔)接种在96孔MTP板(厚，黑色，透明底No.4308776，AppliedBiosystems)中的100μl培养基中。在37℃/5％CO2下培养18h后，更换培养基并以不同浓度(10、5、2.5、1、0.1μg/ml)加入标记的抗-TWEAKR抗体。所选的培养时间为0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、6和24h。使用InCell-Analyser 1000(GE Healthcare)测量荧光性。
选择具有最高体外效力的抗体(TPP-883)用于进一步的效力和亲和力成熟化。
TPP-883
SEQ ID NO.71
AQDIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPGITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.72
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDGYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-883的轻链(SEQ ID NO.71)和重链(SEQ ID NO.72)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
在第一突变收集循环中进行成熟化，然后重组最提高亲和力和效力的那些氨基酸修饰。为了收集突变NNK(N＝AGCT，K＝G或T)，使用包括NNK密码子多样化(连续氨基酸命名，对照图25)的合成寡核苷酸通过定点诱变将后续单独的氨基酸位点进行随机化：CDR-L1中的S35、S36、Y37和N39；CDR-L2中的A51、S53、S54、Q56和S57；CDR-L3中的S92、Y93、S94、S95、G97和I98；CDR-H1中的P31、Y32、P33、M34和M35；CDR-H2中的Y50、S52、P53、S54、G56、K57和H59；CDR-H3中的G99、G100、D101、G102、Y103、F104、D105和Y106。将所有独立的NNK饱和诱变库的DNA克隆到用于效力成熟化的哺乳动物IgG表达载体中或克隆到用于亲和力成熟化的噬菌粒载体中。通过噬菌体筛选进行亲和力成熟化。将洗过的磁珠(DynaBeads)在4℃下用10nM、1nM、100pM或10pM生物素化的人抗原培养过夜，并用封闭缓冲液(含3％BSA、0.05％Tween-20的PBS)在4℃下封闭1h。将封闭的Fab噬菌体库以相对于理论库复杂性10000倍、1000倍和100倍的过量加入到封闭的TWEAKR DynaBeads中，并在室温下培养30min。因此，遵循总共12种策略(4种抗原浓度x3种Fab噬菌体滴度)。在严格洗涤(3x在封闭缓冲液中和9x在含0.05％Tween-20的PBS中)后，将特异性结合到生物素化的TWEAKR DynaBeads(DynaBeads链霉亲和素-M280-Invitrogen 112-06D)上的Fab噬菌体再悬浮在PBS中并为了扩增，直接用于感染大肠杆菌菌株TG1。在选择循环2中，降低人TWEAKR-Fc的浓度(1nM、100pM、10pM和1pM)，并将相同的Fab噬菌体滴度用于所有12种策略(4.4x1011)。为了表达可溶性Fab，该噬菌粒载体用MluI消化以除去在噬菌体上Fab显示所需的基因-III膜锚定序列，并再次连接。将12个选择池中的每一个的96个变体表达为可溶性Fab，并在ELISA格式中检验。为此，抗原涂覆2.5nM生物素化的TWEAKR-Fc，并通过抗-c-Myc抗体(Abcamab62928)检测可溶性Fab的结合。检测具有改进的与TWEAKR-Fc(SeqIDNo138)的结合的7种单取代变体(连续氨基酸命名，对照图25)：CDR-L1的S36G、CDR-L2的A51Q和S57K、CDR-L3的S94T和G97F、CDR-H1的M35I和CDR-H3的G102T。为了效力成熟化，用NF-κB报道基因(BioCat，目录号LR-0051-PA)转染HEK293细胞。将转染的细胞接种到在白色聚赖氨酸涂覆的384孔板(BD)中的F17培养基(无血清；Invitrogen)中，并在哺乳动物细胞中短暂表达NNK多样化的位置抗体(人IgG1)库的独立变体。第二天，将NF-κB报道子细胞用表达的单-NNK抗体变体刺激6h，然后通过标准方法进行荧光素酶检测。检测到具有改进的激动活性的1种单取代变体：CDR-H3的G102T。还通过亲和力成熟化获得这种变体，其中其还表现出亲和力的最高增强。在通过亲和力和效力筛选收集突变后，将7种最有利的单取代(库复杂性：128种变体)重组成重组库。为此，合成寡核苷酸以在各所选位置引入所选突变或相应的野生型氨基酸。使用重叠延伸PCR的连续循环建立该库。如上所述，将最终PCR产物连接到细菌可溶性Fab表达载体中，并随机选择528种变体(所取样品的～4倍过量)用于使用可溶性Fab的平衡ELISA筛选。最后，基于与最佳单取代变体G102T相比提高的亲和力来选择7种变体。将其相应的DNA克隆到哺乳动物IgG表达载体中，并在上述NF-κB报道子细胞检测中检查功能活性。最后，将所得序列与人生殖系序列相比较，并且调节对亲和力和效力没有任何显著影响的偏差。通过抗体库筛选和通过亲和力和/或效力成熟化获得具有以下序列的抗体：
TPP-2090
SEQ ID NO.1:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.2:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMIWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGSTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-2090的轻链(SEQ ID NO.1)和重链(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-2149
SEQ ID NO.11
DIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.12
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMIWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-2149的轻链(SEQ ID NO.11)和重链(SEQ ID NO.12)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-2093
SEQ ID NO.21
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.22
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGSTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-2093的轻链(SEQ ID NO.21)和重链(SEQ ID NO.22)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-2148
SEQ ID NO.31
DIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.32EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGK THYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-2148的轻链(SEQ ID NO.31)和重链(SEQ ID NO.32)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-2084
SEQ ID NO.41
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPGITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.42
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGSTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-2084的轻链(SEQ ID NO.41)和重链(SEQ ID NO.42)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-2077
SEQ ID NO.51
DIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPGITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.52
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-2077的轻链(SEQ ID NO.51)和重链(SEQ ID NO.52)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-1538
SEQ ID NO.61
AQDIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPGITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.62
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-1538的轻链(SEQ ID NO.61)和重链(SEQ ID NO.62)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-1854
SEQ ID NO.81
AQDIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYNASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.82
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMIWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-1854的轻链(SEQ ID NO.81)和重链(SEQ ID NO.82)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-1853
SEQ ID NO.91
AQDIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPGITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.92
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-1853的轻链(SEQ ID NO.91)和重链(SEQ ID NO.92)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-1857
SEQ ID NO.101
AQDIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYNASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPGITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.102
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-1857的轻链(SEQ ID NO.101)和重链(SEQ ID NO.102)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
TPP-1858
SEQ ID NO.111
AQDIQMTQSPATLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKLYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.112
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMMWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-1858的轻链(SEQ ID NO.111)和重链(SEQ ID NO.112)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
抗体TPP-2658具有与抗体TPP-2090相同的序列，除了SEQ ID NO:2被以下SEQ IDNO:213替代：
TPP-2658
SEQ ID NO.1:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYQASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTSPFITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.213:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSPYPMIWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGSTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGDTYFDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
TPP-2658的轻链(SEQ ID NO.1)和重链(SEQ ID NO.213)的氨基酸序列；重链和轻链的CDR加下划线。
序列表
<110> 拜耳医药股份有限公司
<120> KSP抑制剂与无糖基化抗-TWEAKR抗体的抗体-药物缀合物（ADC）
<130> 173 506
<160> 241
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 2
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr
1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Pro Tyr Pro Met Ile
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 11
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 12
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe Ile Thr
1 5 10
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<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Pro Tyr Pro Met Ile
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 21
<211> 215
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gln Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
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Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
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Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
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1 5
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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Gly
<210> 28
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<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 121
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<213> 智人
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
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<213> 智人
<400> 31
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser Pro Phe
85 90 95
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100 105 110
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<213> 智人
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
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195 200 205
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Gly
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<213> 智人
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Gly
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
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20 25 30
Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
Pro Gly Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 100
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
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<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
20 25 30
Gly Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser
85 90 95
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100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
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Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
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290 295 300
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
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<212> PRT
<213> 智人
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Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Asn
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<400> 105
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Gly
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<400> 109
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<212> PRT
<213> 智人
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Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<213> 智人
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
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<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 114
Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
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1 5 10
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<213> 智人
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1 5
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<213> 智人
<400> 117
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<213> 智人
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Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<213> 智人
<400> 119
Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser
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Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
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Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Asn Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Ser
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Lys Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
115 120
<210> 121
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 121
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Asn Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
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Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
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Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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210 215
<210> 122
<211> 450
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 122
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Arg Pro Gly Val
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
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Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu
145 150 155 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
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180 185 190
Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195 200 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr
210 215 220
Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met
245 250 255
Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly
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Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val
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420 425 430
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435 440 445
Pro Gly
450
<210> 123
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 123
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
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195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 124
<211> 448
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 124
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asn Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Gly Phe Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
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115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
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165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
260 265 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
290 295 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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420 425 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
435 440 445
<210> 125
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 126
<211> 450
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly
450
<210> 127
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 128
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Gly Tyr Tyr Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 129
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 129
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Thr Tyr Ser Tyr Met Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 130
<211> 448
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 130
Glu Val Lys Leu Gly Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Pro Phe Thr Lys Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Pro Thr Tyr Ala Asp Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195 200 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
245 250 255
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
260 265 270
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
275 280 285
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
290 295 300
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
305 310 315 320
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
340 345 350
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
355 360 365
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
370 375 380
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
405 410 415
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
420 425 430
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
435 440 445
<210> 131
<211> 218
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 131
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ile Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
115 120 125
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
145 150 155 160
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
180 185 190
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
195 200 205
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 132
<211> 451
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 132
Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Pro Asp Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro
115 120 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser
130 135 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180 185 190
Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His
195 200 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro
210 215 220
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
245 250 255
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
275 280 285
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
305 310 315 320
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
355 360 365
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
370 375 380
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
405 410 415
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
420 425 430
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
435 440 445
Thr Pro Gly
450
<210> 133
<211> 282
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 133
Glu Gln Ala Pro Gly Thr Ala Pro Cys Ser His Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ser Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 134
<211> 282
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 134
Glu Gln Ala Pro Gly Asn Ala Pro Cys Ser Ser Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala His Phe
35 40 45
Arg Met Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 135
<211> 282
<212> PRT
<213> 野猪
<400> 135
Glu Arg Val Pro Gly Thr Thr Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ser Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 136
<211> 282
<212> PRT
<213> 狼
<400> 136
Glu Arg Val Pro Gly Thr Thr Pro Cys Pro Arg Gly Ser Ser Trp Ser
1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
20 25 30
His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe
35 40 45
Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
50 55 60
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
65 70 75 80
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
85 90 95
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
100 105 110
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
115 120 125
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
130 135 140
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
145 150 155 160
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
165 170 175
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
180 185 190
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
210 215 220
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
225 230 235 240
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
245 250 255
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
260 265 270
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275 280
<210> 137
<211> 282
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 137
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1 5 10 15
Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Pro Ala Arg Pro
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His Ser Asp Phe Cys Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala His Phe
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Arg Leu Leu Trp Pro Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 165
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ala Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 166
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Ala Pro Cys Ser Ala Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
35 40 45
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
50 55 60
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
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180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
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Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 167
<211> 278
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
Ala Pro Cys Ala Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys Cys
1 5 10 15
Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys Leu
20 25 30
Gly Cys Ala Ile Glu Gly Arg Met Asp Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
65 70 75 80
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
85 90 95
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
100 105 110
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
115 120 125
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
130 135 140
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
165 170 175
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
180 185 190
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
195 200 205
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
225 230 235 240
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
245 250 255
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
260 265 270
His His His His His His
275
<210> 168
<211> 53
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
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Ala Asp Leu Asp Lys Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro
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50
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<211> 129
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly
1 5 10 15
Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly
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Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys
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Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys
50 55 60
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro
65 70 75 80
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser
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Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr
100 105 110
Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile
115 120 125
Gln
<210> 170
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 170
atggctcggg gctcgctgcg ccggttgctg cggctcctcg tgctggggct ctggctggcg 60
ttgctgcgct ccgtggccgg ggagcaagcg ccaggcaccg ccccctgctc ccgcggcagc 120
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agcgacttct gcctgggctg cgctgcagca cctcctgccc ccttccggct gctttggccc 240
atccttgggg gcgctctgag cctgaccttc gtgctggggc tgctttctgg ctttttggtc 300
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cactcatcat tcattcatcc attctagagc cagtctctgc ctcccagacg cggcgggagc 480
caagctcctc caaccacaag gggggtgggg ggcggtgaat cacctctgag gcctgggccc 540
agggttcagg ggaaccttcc aaggtgtctg gttgccctgc ctctggctcc agaacagaaa 600
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tggggggtta gggacctatt tttaacacta ggggctggcc cactaggagg gctggcccta 840
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ggaggggagg gagaatttat taataaaaga atctttaact ttaaaaaaaa aaaaaaaaa 959
<210> 171
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 5..5
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 171
Pro Tyr Pro Met Xaa
1 5
<210> 172
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 172
Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Xaa Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 174
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Xaa Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 175
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 1..1
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 175
Xaa Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 176
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> 5..6
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> 8..8
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 176
Gln Gln Ser Tyr Xaa Xaa Pro Xaa Ile Thr
1 5 10
<210> 177
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 177
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggccagcca gagcatcagc ggctacctga actggtatca gcagaagccc 120
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agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacacca gccccttcat caccttcggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcggacc gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360
cccagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtgg tctgcctgct gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480
caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540
accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600
ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645
<210> 178
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 178
gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt cacattcagc ccctacccca tgatctgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg gcctggaatg ggtgtcctac atcagcccca gcggcggcag cacccactac 180
gccgatagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgcgc cagaggcggc 300
gacacctact tcgattactt cgactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 179
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 179
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc ggctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacacta gtccattcat cactttcggc 300
cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
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acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 180
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 180
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatctgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
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gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
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cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 181
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 181
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60
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gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag agctacacca gccccttcat caccttcggc 300
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cccagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtgg tctgcctgct gaacaacttc 420
tacccccgcg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480
caggaaagcg tgaccgagca ggacagcaag gactccacct acagcctgag cagcaccctg 540
accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaagt gacccaccag 600
ggcctgtcca gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgc 645
<210> 182
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 182
gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
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ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgcgc cagaggcggc 300
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aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
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tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 183
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 183
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacacta gtccattcat cactttcggc 300
cctgggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 184
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 184
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
ggaacagccg ccctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480
tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cataccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720
cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900
agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020
aaggccaagg gccagccccg cgagcctcag gtgtacacac tgccccccag ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtgaaag gcttctaccc cagcgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 185
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人
<400> 185
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgta gagccagcca gagcatcagc agctacctga actggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctatgcc gccagctctc tgcagagcgg agtgcccagc 180
agattttctg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga caatcagcag cctgcagccc 240
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cagggcacca aggtggaaat caagcggaca gtggccgctc ccagcgtgtt catcttccca 360
cctagcgacg agcagctgaa gtccggcaca gccagcgtcg tgtgcctgct gaacaacttc 420
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ggcctgtcta gccccgtgac caagagcttc aaccggggcg agtgt 645
<210> 186
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 186
gaagttcaat tgttagagtc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc ccctacccta tgatgtgggt ccgacaggcc 120
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ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actattgtgc cagaggcggc 300
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cccagcgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780
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<212> DNA
<213> 智人
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<210> 188
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 188
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 198
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tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagggggt 300
gatacttatt tcgactactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccg ctagcaccca gcagcaagag caccagcggc 420
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ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgaca gtgcccagca gcagcctggg aacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660
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gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc cagaagtgaa gtttaattgg 840
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cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347
<210> 199
<211> 651
<212> DNA
<213> 智人
<400> 199
gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca gccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60
gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attagcagct atttaaattg gtatcagcag 120
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<210> 200
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 200
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct ccttacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctctcctt ctggtggcaa gactcattat 180
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<210> 201
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 201
gatatcgtgc tgacacagtc tcccgccagc ctggccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60
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<210> 202
<211> 1350
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 202
caggtgcagc tgcagcagtc tggccctgaa gtcgtgcggc ctggcgtgtc cgtgaagatc 60
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<210> 203
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 203
gatatcgtgc tgacacagag ccccgccagc ctgaccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60
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<210> 204
<211> 1344
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 204
gaagtgaagc tggaagagtc tggcggcgga ctggtccagc ctggcggcag catgaagctg 60
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<210> 205
<211> 654
<212> DNA
<213> 智人
<400> 205
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ctggctgtat ctctggggca gagggccacc 60
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<210> 206
<211> 1350
<212> DNA
<213> 智人
<400> 206
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
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<210> 207
<211> 654
<212> DNA
<213> 智人
<400> 207
gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
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<210> 208
<211> 1347
<212> DNA
<213> 智人
<400> 208
caggtggaat tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggaag cctgagactg 60
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<210> 209
<211> 654
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 209
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<210> 210
<211> 1344
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 210
gaagtgaagc tgggagagtc tggcggcgga ctggtccagc ctggcggcag catgaagctg 60
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 211
gatatcgtgc tgacacagtc tcccgccagc ctggccgtgt ctctcggcca gagagccacc 60
atcagctgcc gggccagcaa gagcgtgtcc accagcagct acagctacat gcactggtat 120
cagcagaagc ccggccagcc ccccaagctg ctgatcaagt acaccagcaa cctggaaagc 180
ggcgtgcccg ccagattcag cggaagcggc tccggcaccg acttcatcct gaacatccac 240
cccgtggaag aagaggacgc cgccacctac tactgccagc acagcagaga gctgccctgg 300
accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgggccg atgccgcccc taccgtgtcc 360
atcttcccac ccagcagcga gcagctgacc agcggcggag ccagcgtcgt gtgcttcctg 420
aacaacttct accccaagga catcaacgtg aagtggaaga tcgacggcag cgagcggcag 480
aacggcgtgc tgaacagctg gaccgaccag gacagcaagg actccaccta cagcatgagc 540
agcaccctga ccctgaccaa ggacgagtac gagcggcaca acagctacac atgcgaggcc 600
acccacaaga ccagcaccag ccccatcgtg aagtccttca accggaacga gtgc 654
<210> 212
<211> 1353
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 212
caggtgtccc tgaaagagag cggccctggc atcctgcagc ctagccagac cctgagcctg 60
acctgcagct tcagcggctt cagcctgagc accagcggca tgggcgtgtc ctggatcaga 120
cagcccagcg gcaagggcct ggaatggctg gcccacatct actgggacga cgacaagcgg 180
tacaacccca gcctgaagtc ccggctgacc atctccaagg acaccagccg gaatcaggtg 240
ttcctgaaga tcaccagcgt ggacaccgcc gataccgcca cctactactg cgccagaaga 300
ggccccgact actacggcta ctaccccatg gactattggg gccagggcac cagcgtgacc 360
gtgtctgcca agaccaccgc ccctagcgtg taccctctgg cccctgtgtg tggcgacacc 420
accggcagct ctgtgactct gggctgcctg gtcaagggct acttccccga gcccgtgaca 480
ctgacctgga acagcggcag cctgagcagc ggcgtgcaca cctttccagc cgtgctgcag 540
agcgacctgt acaccctgag cagctccgtg accgtgacaa gcagcacctg gcccagccag 600
agcatcacct gtaacgtggc ccaccccgcc agcagcacca aggtggacaa gaagatcgag 660
cccagaggcc ccaccatcaa gccctgcccc ccttgcaagt gcccagcccc caatctgctg 720
ggcggaccca gcgtgttcat cttcccaccc aagatcaagg acgtgctgat gatcagcctg 780
agccccatcg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtccgagg acgaccccga cgtgcagatc 840
agttggttcg tgaacaacgt ggaagtgcac accgcccaga cccagaccca cagagaggac 900
tacaacagca ccctgcgggt ggtgtccgcc ctgcccatcc agcaccagga ctggatgagc 960
ggcaaagaat tcaagtgcaa agtgaacaac aaggacctgc ctgcccccat cgagcggacc 1020
atcagcaagc ccaagggcag cgtgcgggct ccccaggtgt acgtgctgcc cccacccgag 1080
gaagagatga ccaagaagca ggtcacactg acctgcatgg tcaccgactt catgcccgag 1140
gacatctacg tggaatggac caacaacggc aagaccgagc tgaactacaa gaacaccgag 1200
cctgtgctgg acagcgacgg cagctacttc atgtacagca agctgcgggt ggaaaagaaa 1260
aactgggtgg aacggaacag ctacagctgc agcgtggtgc acgagggcct gcacaaccac 1320
cacaccacca agagcttcag ccggaccccc ggc 1353
<210> 213
<211> 449
<212> PRT
<213> 智人
<400> 213
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr
20 25 30
Pro Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Thr Tyr Phe Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly

Claims (26)

1.抗体与一种或多种下式的药物分子的缀合物：
其中BINDER代表无糖基化抗-TWEAKR抗体，L代表连接体，n代表1至50、优选1.2至20且特别优选2至8的数；且
KSP代表下式(I)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
式(I)：
其中
R1代表H、-L-#1、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z‘(例如-(CH2)0-3Z‘)或-CH(CH2W)Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链的或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
R4代表H、-L-#1、-SGlys-(CO)0-1-R4’、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中SGlys代表可被溶酶体酶裂解的基团，特别是包含二肽或三肽的基团；R4’代表可被以下基团单取代或多取代的C1-10-烷基、C5-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基、C5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂芳基烷氧基、C1-10-烷氧基、C6-10-芳氧基或C6-10-芳烷氧基、C5-10-杂芳烷氧基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳氧基、C5-10-杂环烷氧基基团：-NH2、-NH-烷基、-N(烷基)2、NH-CO-烷基、N(烷基)-CO-烷基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2-N(烷基)2、-COOH、-CONH2、-CON(烷基)2或-OH，代表-H或基团-Ox-(CH2CH2O)y-R4″，(其中x代表0或1且n代表1至10的数，且R4”代表-H、-烷基(优选C1-12-烷基)、-CH2-COOH、-CH2-CH2-COOH或-CH2-CH2-NH2)；其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0- 3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4代表任选地被-NHCONH2取代的直链或支链的C1-6烷基，或代表任选地被-NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或-CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支链的C1-6-烷基；
或R2与R4一起(形成吡咯烷环)代表-CH2-CHR11-或-CHR11-CH2-，其中R11代表H、NH2、SO3H、COOH、SH、卤素(特别是F或Cl)、C1-4-烷基、C1-4-卤代烷基、C1-4-烷氧基、羟基取代的C1-4-烷基、COO(C1-4-烷基)或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-#1、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选-L-#1或可被以下基团取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基：1-3个-OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基(各自具有1-3个卤素原子)、1-3-个O-烷基基团、1-3个-SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z‘、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z‘或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH
(其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R5代表H、NH2、NO2、卤素(特别是F、C1、Br)、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z‘，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z‘，其中Z‘代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素(特别是F、Cl、Br)，
R8代表(任选氟化的)C1-10-烷基、(任选氟化的)C2-10-烯基、(任选氟化的)C2-10-炔基、(任选氟化的)C4-10-环烷基或-(CH2)0-2-(HZ2)，
其中HZ2代表具有最多达两个选自N、O和S的杂原子的4至7元杂环，其中这些基团各自可被-OH、CO2H或NH2取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中取代基R1、R3和R4之一代表-L-#1，
L代表连接体且#1代表与抗体连接的键，
其中-MOD代表-(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-、-CONH-或(其中，如果G1代表-NHCO-或则R10不代表NH2)；
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表直链和/或支链的烃基，所述烃基具有1至10个碳原子且可被一个或多个下述基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-(其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-CO-、-CRx＝N-O-(其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基)，其中包括任意侧链的烃链可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团-MOD优选具有至少一个基团-COOH。
2.权利要求1的缀合物，其中A代表CO(羰基)。
3.权利要求1或2的缀合物，其中R1代表H、-L-#1、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ“(CH2)1-3NH2或-CONZ“CH2COOH，其中Z“代表H或NH2。
4.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中R2和R4代表H或R2与R4一起(形成吡咯烷环)代表-CHR11-CH2-或-CH2-CHR11-，其中R11代表H、COOH、F、Me、CH2F、OMe、CH2OH、COO(C1-4-烷基)或OH。
5.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中R3代表-L-#1或可被卤素(特别是F)或任选氟化的C1-3-烷基单取代或多取代的苯基，或代表可任选地被下述基团取代的任选氟化的C1-10-烷基：-OY4、-SY4、-O-CO-Y4、-O-CO-NH-Y4、NH-CO-Y4、-NH-CO-NH-Y4、S(O)n-Y4(其中n代表0、1或2)、-SO2-NH-Y4、NH-Y4或N(Y4)2，其中Y4代表H、苯基(任选地被卤素(特别是F)或任选氟化的C1-3-烷基单取代或多取代)或烷基(其中所述烷基可被-OH、-COOH和/或-NHCO-C1-3-烷基取代，且其中烷基优选代表C1-3-烷基)。
6.权利要求5的缀合物，其中所述缀合物具有下式(IIj)：
其中
R3代表-L#1；
A代表CO；且
R6、R7、R8和R9具有与权利要求1中的式(I)中相同的含义。
7.权利要求1至5的一项或多项的缀合物，其中所述取代基R1代表-L#1。
8.权利要求7的缀合物，其中缀合物具有式(IIk)：
其中
R1代表-L#1；
A代表CO且R3代表-CH2OH；
R3、R6、R7、R8和R9具有与权利要求1中的式(I)中相同的含义。
9.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中R5代表H或F。
10.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中R6和R7彼此独立地代表H、(任选氟化的)C1-3-烷基、(任选氟化的)C2-4-烯基、(任选氟化的)C2-4-炔基、羟基或卤素。
11.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中R8代表支链的C1-5-烷基或环己基。
12.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中R9代表H或F。
13.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中所述抗-TWEAKR抗体特异性结合至TWEAKR(SEQ ID NO：169)的位置47中的氨基酸D(D47)上，优选抗-TWEAKR抗体TPP-2658。
14.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中连接体-L-具有以下基本结构(i)至(iv)中的一种：
1.-(CO)m-SG1-L1-L2-
(ii)-(CO)m-L1-SG-L1-L2-
(iii)-(CO)m-L1-L2-
(iv)-(CO)m-L1-SG-L2
其中m代表0或1，SG和SG1代表体内可裂解的基团，L1彼此独立地代表体内不可裂解的有机基团，以及L2代表偶联至结合体的偶联基团。
15.权利要求14的缀合物，其中体内可裂解的基团SG是2-8寡肽基团，优选二肽基团或二硫化物、腙、缩醛或缩醛胺，且SG1是2-8寡肽基团，优选二肽基团。
16.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中所述连接体连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上，并且具有下式：
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m代表0或1；
§代表与活性化合物分子连接的键且
§§代表与抗体连接的键，且
-L2-代表
其中
#1表示与抗体的硫原子连接的点，
#2表示与基团L1连接的点，
L1-(NR10)n-(G1)o-G2-，
其中R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表-NHCO-或
n代表0或1；
o代表0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支链的和/或环状亚烷基并且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代；或代表以下基团中的一个：
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
17.权利要求16的缀合物，其中L2代表下式中的一种或两种：
其中，#1表示与结合体的硫原子连接的点，#2表示与基团L1连接的点，R22代表COOH并且大于80％(基于连接体与结合体连接的键的总数计)的与结合体的硫原子连接的键存在于这两种结构中的一种。
18.权利要求16和17的一项或多项的缀合物，其中L1具有下式：
其中r代表0至8的数。
19.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中缀合物具有下式中的一种或两种：
其中
AK1A代表经由结合体的硫原子连接的无糖基化抗体；n代表1至20的数；且L1代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，所述烃链来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基并且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-SO-或-SO2-的5至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
20.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中连接体-L-连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上，且具有下式：
其中
§代表与活性化合物分子连接的键且
§§代表与抗体连接的键，
m代表0、1、2或3；
n代表0、1或2；
p代表0至20；且
L3代表
其中
o代表0或1；
且
G3代表具有1至100个碳原子的直链或支链的烃链，所述烃链来自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状亚烷基并且其可被一个或多个以下基团间隔一次或多次：-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-和具有最多达4个选自N、O和S的杂原子、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-SO-或-SO2-的5至10元芳族或非芳族杂环(优选)，其中侧链，如果存在，可被-NHCONH2、-COOH、-OH、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
21.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其中抗-TWEAKR抗体是激动性抗体。
22.前述权利要求的一项或多项的缀合物，其包含：
可变重链，其包含：
a.由包含式PYPMX的氨基酸序列(SEQ ID NO：171)编码的重链的CDR1，其中X是I或M；
b.由包含式YISPSGGXTHYADSVKG的氨基酸序列(SEQ ID NO：172)编码的重链的CDR2，其中X是S或K；和
c.由包含式GGDTYFDYFDY的氨基酸序列(SEQ ID NO：173)编码的重链的CDR3；
以及可变轻链，其包含：
d.由包含式RASQSISXYLN的氨基酸序列(SEQ ID NO：174)编码的轻链的CDR1，其中X是G或S；
e.由包含式XASSLQS的氨基酸序列(SEQ ID NO：175)编码的轻链的CDR2，其中X是Q、A或N；和
f.由包含式QQSYXXPXIT的氨基酸序列(SEQ ID NO：176)编码的轻链的CDR3，其中位置5处的X是T或S，位置6处的X为T或S且位置8处的X是G或F。
23.药物组合物，其包含权利要求1至22的一项或多项的缀合物以及惰性无毒药学上合适的助剂。
24.权利要求1至22的一项或多项的缀合物在治疗和/或预防疾病的方法中的用途。
25.权利要求1至22的一项或多项的缀合物在治疗过度增殖性和/或血管生成性疾病的方法中的用途。
26.S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2，5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]-硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]-硫烷基}-4-氧代丁酸；
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙氧基]乙基}-2，5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
(3R，7S)-7-氨基-17-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰-2，2-二甲基-8，16-二氧代-12-氧杂-4，9，15-三氮杂十九烷-19-酸；
(3R，7S)-7-氨基-18-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰-2，2-二甲基-8，16-二氧代-12-氧杂-4，9，15-三氮杂十九烷-19-酸；
2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸；
3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-({(14R)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-15，15-二甲基-2，7，12-三氧代-10-硫杂-3，6，13-三氮杂十六烷-1-基}氨基)-4-氧代丁酸；
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；
(3R)-6-{(11S，15R)-11-氨基-15-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-14-乙醇酰-16，16-二甲基-2，5，10-三氧代-3，6，9，14-四氮杂十七烷-1-基}-5-氧硫代吗啉-3-甲酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
(2R，28R)-28-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-25-(羧甲基)-4，20，24-三氧代-7，10，13，16-四氧杂-26-硫杂-3，19，23-三氮杂二十九烷-1，29-二酸；
(1R，28R，34R)-1-氨基-33-(3-氨基丙基)-34-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35，35-二甲基-6，10，26，32-四氧代-14，17，20，23-四氧杂-3，30-二硫杂-7，11，27，33-四氮杂三十六烷-1，4，28-三羧酸；
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸；
4-{[(1R)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧乙基]氨基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸；
(1R，4R，27R，33R)-1-氨基-32-(3-氨基丙基)-33-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-34，34-二甲基-6，9，25，31-四氧代-13，16，19，22-四氧杂-3，29-二硫杂-7，10，26，32-四氮杂三十五烷-1，4，27-三羧酸；
(2R，24S，27R)-27-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2，5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2，2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-硫烷基)甲基]-24-(羧甲基)-4，20，23-三氧代-7，10，13，16-四氧杂-25-硫杂-3，19，22-三氮杂二十八烷-1，28-二酸；
及这些化合物的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐。
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