JP2011523414A - 抗fn14抗体、およびその使用 - Google Patents
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Abstract
受容体Fn14に結合して、Fn14を発現する癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する抗体および抗体断片を開示する。前記抗体および抗体断片を用いて、腫瘍細胞死を誘発すると共に、患者の障害を治療する方法も開示する。本発明は少なくとも部分的に、Fn14に結合して、腫瘍細胞死を誘発する抗体の同定および特性付けに基づいている。これらの抗体は、低用量で癌の動物モデルに有効であり、かつ、腫瘍の増殖を予防する作用が持続する。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2008年5月15日に出願された仮出願第61/053,650号、2009年2月3日に出願された仮出願第61/149,517号、および2009年4月27日に出願された仮出願第61/173,137号の優先権を主張するものである。これらの各先行出願の全体的内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2008年5月15日に出願された仮出願第61/053,650号、2009年2月3日に出願された仮出願第61/149,517号、および2009年4月27日に出願された仮出願第61/173,137号の優先権を主張するものである。これらの各先行出願の全体的内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
腫瘍壊死因子(TNF)関連サイトカインは、免疫調節とアポトーシス調節に関与する機能を含む一連の機能を有するタンパク質のスーパーファミリーである。TWEAK(TNF−like weak inducer of apoptosis:TNF様弱性アポトーシス誘導因子)は、このスーパーファミリーのメンバーの1つである。TWEAK受容体のFn14は、成長因子によって調節される前初期応答遺伝子であって、細胞外マトリックスへの細胞接着を減少させ、血清刺激による増殖と移動を低下させる遺伝子である(非特許文献1)。
Meighan−Mantha et al.,J.Biol.Chem.274:33166−33176(1999)
本発明は少なくとも部分的に、Fn14に結合して、腫瘍細胞死を誘発する抗体の同定および特性付けに基づいている。これらの抗体は、低用量で癌の動物モデルに有効であり、かつ、腫瘍の増殖を予防する作用が持続する。
1つの態様では、本発明は、(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1の42位にアミノ酸残基トリプトファンを含むエピトープで、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、(ii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する単離Fn14結合タンパク(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)を特色とする。「選択的に結合する」という用語は、Fn14結合タンパクの標的タンパク(例えば配列番号1のポリペプチド)が異種のタンパク質群の中に存在するときに、Fn14結合タンパク質が、その標的タンパク質に対する特異性を示す形で、標的タンパク質に結合することを指す(すなわち、「選択的」結合には、非特異的なタンパク質間相互作用は含まれない)。
本明細書で使用する場合、「配列番号1の42位にアミノ酸残基トリプトファンを含むエピトープで」結合するとは、抗体またはその抗原結合断片が、配列番号1の野生型ヒトFn14というタンパク質に選択的に結合できるが、42位にトリプトファンの代わりにアラニンを含む、配列番号1の突然変異体には有意に結合できないことを指す。例えば、42位にトリプトファンの代わりにアラニンを含む、配列番号1の突然変異体への結合は、同じアッセイ条件下で、配列番号1の野生型ヒトFn14タンパク質に対して生じる結合のレベルの50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、または10%未満のレベルで生じる場合がある。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、モノクローナル抗体P4A8、P2D3、またはP3G5の配列番号1への結合を交差ブロックし、かつ、(ii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
あるモノクローナル抗体(例えばP4A8、P3G5、またはP2D3)が先にFn14に結合することによって、その後、同一のモノクローナル抗体がFn14に結合するのを阻害するのと同じレベルで、Fn14結合タンパク質が先にFn14に結合することによって、その後、上記のモノクローナル抗体がFn14に結合するのを阻害すると、そのFn14結合タンパク質は、上記のモノクローナル抗体のFn14への結合を交差ブロックする。例えば、P4A8が先にFn14に結合することによって、その後、同一のモノクローナル抗体がFn14に結合するのを阻害するのと同じレベルで、Fn14結合タンパク質が先にFn14に結合することによって、その後、P4A8がFn14に結合するのを阻害すると、そのFn14結合タンパク質は、P4A8のFn14への結合を交差ブロックする。特定の実施形態では、Fn14結合タンパク質は、P4A8自体によって実現される交差ブロックの少なくとも約30%、50%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%のレベルまで、P4A8のヒトFn14への結合を交差ブロックする。特定の実施形態では、Fn14結合タンパク質は、P4A8のヒトFn14への結合を別の抗Fn14抗体(例えばITEM−1、ITEM−2、ITEM−3、またはITEM−4)が交差ブロックするよりも高い程度で、P4A8のヒトFn14への結合を交差ブロックする。
特定の実施形態では、P4A8は、Fn14結合タンパク質自体によって実現される交差ブロックの少なくとも約30%、50%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%のレベルで、Fn14結合タンパク質のヒトFn14への結合を交差ブロックする。
特定の実施形態では、(i)Fn14結合タンパク質は、P4A8のヒトFn14への結合を交差ブロックすると共に、(ii)P4A8は、Fn14結合タンパク質のヒトFn14への結合を交差ブロックする。
双方向の完全な交差ブロックは、2つの抗体が同じフットプリントを有すること、すなわち、同じエピトープに結合することを示している。特定の実施形態では、一方向または双方向の交差ブロックは完全ではなく、部分的、例えば、当該抗体自体によって実現される交差ブロックの少なくとも約30%、50%、70%、80%、90%、95%、98%、または99%のレベルである。一方向または双方向の部分的な交差ブロックは、2つの抗体のフットプリントが同一ではないが、重複しているか、または非常に近い場合があることを示している。
Fn14結合タンパク質の結合については、上記のように説明できるが、P4A8の代わりにP3G5またはP2D3と比較して説明することもできる。交差ブロック実験は、Fn14結合タンパク質の結合親和性に基づくFn14への結合の飽和濃度以上で存在する試験用Fn14結合タンパク質によって行ってよい。
特定の実施形態では、Fn14結合タンパク質は、本明細書に記載されている諸実験、例えば、交差ブロック実験、ならびに、様々な種のFn14および突然変異Fn14タンパク質への結合実験の1つもしくは複数の実験によって特徴付けた場合、P4A8、P3G5、またはP2D3のエピトープと同じエピトープ、または実質的に同じエピトープに結合する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、P4A8のVHドメインとVLドメインを含むモノクローナル抗体、P3G5のVHドメインとVLドメインを含むモノクローナル抗体、またはP2D3のVHドメインとVLドメインを含むモノクローナル抗体の配列番号1への結合を交差ブロックし、かつ、(ii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体、またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)抗体の定常領域に突然変異を含み(その結果、エフェクター機能が低下または欠如する)、(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する単離抗体またはその抗原結合断片も開示する。いくつかの実施形態では、この抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1の42位にアミノ酸残基トリプトファンを含むエピトープで、配列番号1のポリペプチドに結合する。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のFcまたは定常領域が免疫系のタンパク質および/または細胞に結合する機能的能力を指す。エフェクター機能を低下させた抗体、およびこのような抗体を遺伝子工学技術で作る方法は当該技術分野において周知であり(例えば、国際公開第05/18572号、国際公開第05/03175号、および米国特許第6,242,195号を参照されたい)、本明細書でさらに詳細に説明されている。典型的なエフェクター機能としては、補体タンパク質(例えば、補体タンパク質C1q)、ならびに/またはFc受容体(FcR)(例えば、FcγRI、FcγRII、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIIIa、および/もしくはFcγRIIIb)に結合する能力が挙げられる。上記分子の1つもしくは複数の分子に結合できることの機能的結果としては、オプソニン化、食作用、抗原依存性細胞障害(ADCC)、補体依存性細胞障害(CDC)、および/またはエフェクター細胞の調節が挙げられるが、これらに限定されない。エフェクター機能の低下とは、抗体(またはその断片)の可変領域の抗原結合能は維持したまま(結合親和性が低下するか、同様か、同一か、または高くなるかは問わない)、Fcがその同系統の受容体、補体タンパク質、またはエフェクター細胞に結合することによって少なくとも部分的に誘発される生化学的活性または細胞活性のうちの1つもしくは複数の活性が低下することを指す。エフェクター機能の低下、例えば、FcのFc受容体または補体タンパク質への結合は、低下の比率(例えば1.5分の1、2分の1などに低下)によって表すことができ、例えば、当該技術分野において既知の結合アッセイを用いて測定した結合活性の低下率(%)に基づいて算出してよい(例えば、国際公開第05/18572号を参照されたい)。Fc媒介性受容体の超架橋も、活性を増大させる要因であることがある。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、モノクローナル抗体P4A8、P3G5、もしくはP2D3(または、P4A8のVHドメインとVLドメインを含むモノクローナル抗体、P3G5のVHドメインとVLドメインを含むモノクローナル抗体、もしくはP2D3のVHドメインとVLドメインを含むモノクローナル抗体)と同じエピトープで、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、(ii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているFn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)が、配列番号1のポリペプチドに結合すると、このポリペプチドへのTWEAKの結合がブロックされるか、または低下する。結合は、少なくとも約10%、30%、50%、70%、80%、90%、95%、または100%低下する場合がある。TWEAKのFN14への結合は、様々な細胞ベースの系で測定することができる。例えば、Fn14をコードするベクターで細胞をトランスフェクションすることができると共に、検出可能なマーカーに結合させた可溶性TWEAKタンパク質と、これらの細胞を接触させることによって、トランスフェクションした細胞へのTWEAKの結合を測定することができる。可溶性TWEAKタンパク質を加える前に、Fn14結合タンパク質を上記の細胞に加えて、Fn14結合タンパク質が、TWEAKのFn14への結合をブロックまたは低下させるかを判断することができる。
配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、TWEAKのFn14への結合に起因する少なくとも1つの生物学的活性、例えば、IL−8の誘発、カスパーゼの切断の誘発、および/またはNFκB活性の誘発を模倣する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)(例えばアゴニスト抗体)も開示する。
本明細書では更に、配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、カニクイザルFn14、マウスFn14、およびラットFn14にも有意に(または検出可能な形で)結合する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)を開示する。
本明細書では、配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、細胞の表面上のFn14に結合した後に、細胞にインターナリゼーションされる、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、腫瘍細胞を殺す抗体またはその抗原結合断片としては、本明細書に記載されている特徴、例えば、(i)アゴニスト活性、または、TWEAKのFn14への結合に起因する生物学的作用のうちの少なくともいくつかの模倣、(ii)TWEAKのFn14への結合の有意なブロック、(iii)W42を含むヒトFn14のエピトープへの結合、(iv)ヒトFn14、カニクイザルFn14、ラットFn14、およびマウスFn14への有意な結合、ならびに、(iv)少なくともいくつかのエフェクター機能の欠損または誘発低下といった特徴のいずれかの組み合わせを有する抗体が挙げられる。例えば、1つの実施形態では、Fn14抗体は、TWEAKのFn14への結合をブロックするアゴニスト抗体である。この抗体は更に、W42を含むFn14のエピトープに結合するか、および/または、エフェクター機能が低下したFc領域を有してよい。
特定の実施形態では、配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、細胞殺滅を誘発または増大する単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)は、当該技術分野において既知の抗体、例えば、ITEM−1、ITEM−2、ITEM−3、またはITEM−4(例えば、Nakayama et al.(2003)J.Immunol.170:341、Nakayama et al.(2003)BBRC 306:819、およびHarada et al.(2002)BBRC 299:488に記載されているようなもの)ではない。
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の解離速度は、10−2〜10−6s−1、典型的には10−2〜10−5s−1、例えば、10−2〜10−3s−1、すなわち1×10−3〜5×10−3s−1などの範囲内である(実施例14も参照されたい)。1つの実施形態では、上記の抗体は、モノクローナル抗体P4A8、またはその修飾形態、例えば、そのキメラ形態もしくはヒト化形態(例えば、本明細書に記載されているヒト化形態)と類似(例えば、因数が5もしくは10以内)の親和性および/または反応速度で、ヒトFn14に結合する。抗Fn14抗体の親和性と結合反応速度は、例えば、バイオセンサー技術(BIACORE(商標))を用いて試験することができる。
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の解離速度は、10−2〜10−6s−1、典型的には10−2〜10−5s−1の範囲内である。1つの実施形態では、上記の抗体は、モノクローナル抗体P2D3、またはその修飾形態、例えば、そのキメラ形態もしくはヒト化形態(例えば、本明細書に記載されているヒト化形態)と類似(例えば、因数が5もしくは10以内)の親和性および/または反応速度で、ヒトFn14に結合する。
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の解離速度は、10−2〜10−6s−1、典型的には10−2〜10−5s−1の範囲内である。1つの実施形態では、上記の抗体は、モノクローナル抗体P3G5、またはその修飾形態、例えば、そのキメラ形態もしくはヒト化形態(例えば、本明細書に記載されているヒト化形態)と類似(例えば、因数が5もしくは10以内)の親和性および/または反応速度で、ヒトFn14に結合する。
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の結合速度は、105〜107M−1s−1、すなわち5×105〜5×106M−1s−1、例えば7×105〜3×106M−1s−1の範囲内である(実施例14を参照されたい)。特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片の結合定数は、105〜107M−1s−1、すなわち5×105〜5×106M−1s−1など、例えば7×105〜3×106M−1s−1であり、解離定数は10−2〜10−3s−1、すなわち1×10−3〜5×10−3s−1である。抗体またはその抗原結合断片の親和性定数は、10−10、10−9、もしくは10−8M、またはそれ未満、すなわち10−10M〜10−9などの範囲、例えば5×10−10〜5×10−9M、または1×10−9〜5×10−9Mであってよい(実施例14を参照されたい)。これらの反応速度パラメーターは、例えば本質的にヒトFn14の細胞外領域すなわちシステインリッチ領域(例えば、ヒトFn14の約28番目のアミノ酸から68、69、70、もしくは80番目までのアミノ酸、または、約28番目のアミノ酸から約68〜80番目までのアミノ酸)からなる可溶性ヒトFn14タンパク質のような可溶性Fn14タンパク質への抗体またはその抗原結合断片の結合の特徴を示している場合がある。
特定の実施形態では、上記の抗体またはその抗原結合断片は、ヒトFn14の残基C49、W42、K48、D51、R58、A57、H60、R56、L46、およびM50のうちの1つもしくは複数の残基と相互作用する。
特定の実施形態では、抗Fn14抗体は、P4A8、P3G5、またはP2D3が結合するエピトープと実質的に同じエピトープに結合する。2つの抗体が実質的に同じエピトープに結合するか否かは、競合アッセイによって判定することができる。このようなアッセイは、ビオチンのような検出可能な標識でコントロール抗体(例えばP4A8、または本明細書に記載されている他の抗体)を標識することによって行ってよい。Fn14に結合した標識の強度を測定する。重複するエピトープに結合することによって、標識した抗体が非標識抗体(試験抗体)と競合する場合、その強度は、ネガティブコントロールの非標識抗体による結合と相対的に低下することになる。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、上記のVHドメインは、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である。いくつかの実施形態では、上記のVHドメインは、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である。いくつかの実施形態では、上記のVHドメインは、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列と同一である。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVLドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、上記のVLドメインは、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である。いくつかの実施形態では、上記のVLドメインは、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である。いくつかの実施形態では、上記のVLドメインは、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列と同一である。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVHドメインを含み、(iii)配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVLドメインを含み、かつ(iv)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、(i)上記のVHドメインは、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であり、かつ(ii)上記のVLドメインは、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である。いくつかの実施形態では、(i)上記のVHドメインは、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であり、かつ(ii)上記のVLドメインは、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である。いくつかの実施形態では、(i)上記のVHドメインは、配列番号2、配列番号3、または配列番号4のアミノ酸配列と同一であり、かつ(ii)上記のVLドメインは、配列番号5、配列番号6、または配列番号7のアミノ酸配列と同一である。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、上記のVHドメインは、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である。いくつかの実施形態では、上記のVHドメインは、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である。いくつかの実施形態では、上記のVHドメインは、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と同一である。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVLドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、上記のVLドメインは、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である。いくつかの実施形態では、上記のVLドメインは、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である。いくつかの実施形態では、上記のVLドメインは、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と同一である。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVHドメインを含み、(iii)配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVLドメインを含み、かつ(iv)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、(i)上記のVHドメインは、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であり、かつ(ii)上記のVLドメインは、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である。いくつかの実施形態では、(i)上記のVHドメインは、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であり、かつ(ii)上記のVLドメインは、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である。いくつかの実施形態では、(i)上記のVHドメインは、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と同一であり、かつ(ii)上記のVLドメインは、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号37または配列番号39を含み、上記軽鎖は配列番号41、配列番号43、または配列番号45を含む。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号37を含み、上記軽鎖は配列番号43を含む。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)(a)配列番号2もしくは配列番号3の相補性決定領域(CDR)−H1と少なくとも90%同一である第1の重鎖CDR、配列番号2もしく配列番号3のCDR−H2と少なくとも90%同一である第2の重鎖CDR、および配列番号2もしく配列番号3のCDR−H3と少なくとも90%同一である第3の重鎖CDR、または(b)配列番号4のCDR−H1と少なくとも90%同一である第1の重鎖CDR、配列番号4のCDR−H2と少なくとも90%同一である第2の重鎖CDR、および配列番号4のCDR−H3と少なくとも90%同一である第3の重鎖CDRを含むVHドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、上記第1の重鎖CDRは、配列番号2または配列番号3のCDR−H1と同一であり、上記第2の重鎖CDRは、配列番号2または配列番号3のCDR−H2と同一であり、上記第3の重鎖CDRは、配列番号2または配列番号3のCDR−H3と同一である。いくつかの実施形態では、上記第1の重鎖CDRは、配列番号4のCDR−H1と同一であり、上記第2の重鎖CDRは、配列番号4のCDR−H2と同一であり、上記第3の重鎖CDRは、配列番号4のCDR−H3と同一である。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)(a)配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L1と少なくとも90%同一である第1の軽鎖CDR、配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L2と少なくとも90%同一である第2の軽鎖CDR、および配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L3と少なくとも90%同一である第3の軽鎖CDR、または(b)配列番号7のCDR−L1と少なくとも90%同一である第1の軽鎖CDR、配列番号7のCDR−L2と少なくとも90%同一である第2の軽鎖CDR、および配列番号7のCDR−L3と少なくとも90%同一である第3の軽鎖CDRを含むVLドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、上記第1の軽鎖CDRは、配列番号5または配列番号6のCDR−L1と同一であり、上記第2の軽鎖CDRは、配列番号5または配列番号6のCDR−L2と同一であり、上記第3の軽鎖CDRは、配列番号5または配列番号6のCDR−L3と同一である。いくつかの実施形態では、上記第1の軽鎖CDRは、配列番号7のCDR−L1と同一であり、上記第2の軽鎖CDRは、配列番号7のCDR−L2と同一であり、上記第3の軽鎖CDRは、配列番号7のCDR−L3と同一である。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)(a)配列番号2もしくは配列番号3のCDR−H1と少なくとも90%同一である第1の重鎖CDR、配列番号2もしく配列番号3のCDR−H2と少なくとも90%同一である第2の重鎖CDR、および配列番号2もしく配列番号3のCDR−H3と少なくとも90%同一である第3の重鎖CDR、または(b)配列番号4のCDR−H1と少なくとも90%同一である第1の重鎖CDR、配列番号4のCDR−H2と少なくとも90%同一である第2の重鎖CDR、および配列番号4のCDR−H3と少なくとも90%同一である第3の重鎖CDRを含むVHドメインを含み、(iii)(a)配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L1と少なくとも90%同一である第1の軽鎖CDR、配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L2と少なくとも90%同一である第2の軽鎖CDR、および配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L3と少なくとも90%同一である第3の軽鎖CDR、または(b)配列番号7のCDR−L1と少なくとも90%同一である第1の軽鎖CDR、配列番号7のCDR−L2と少なくとも90%同一である第2の軽鎖CDR、および配列番号7のCDR−L3と少なくとも90%同一である第3の軽鎖CDRを含むVLドメインを含み、かつ(iv)インビボまたはインビトロで癌細胞(例えば結腸癌細胞WiDr)の細胞殺滅を誘発または増大する、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。いくつかの実施形態では、(i)上記第1の重鎖CDRは、配列番号2のCDR−H1と同一であり、上記第2の重鎖CDRは、配列番号2のCDR−H2と同一であり、上記第3の重鎖CDRは、配列番号2のCDR−H3と同一であり、(ii)上記第1の軽鎖CDRは、配列番号5のCDR−L1と同一であり、上記第2の軽鎖CDRは、配列番号5のCDR−L2と同一であり、上記第3の軽鎖CDRは、配列番号5のCDR−L3と同一である。いくつかの実施形態では、(i)上記第1の重鎖CDRは、配列番号3のCDR−H1と同一であり、上記第2の重鎖CDRは、配列番号3のCDR−H2と同一であり、上記第3の重鎖CDRは、配列番号3のCDR−H3と同一であり、(ii)上記第1の軽鎖CDRは、配列番号6のCDR−L1と同一であり、上記第2の軽鎖CDRは、配列番号6のCDR−L2と同一であり、上記第3の軽鎖CDRは、配列番号6のCDR−L3と同一である。いくつかの実施形態では、(i)上記第1の重鎖CDRは、配列番号4のCDR−H1と同一であり、上記第2の重鎖CDRは、配列番号4のCDR−H2と同一であり、上記第3の重鎖CDRは、配列番号4のCDR−H3と同一であり、(ii)上記第1の軽鎖CDRは、配列番号7のCDR−L1と同一であり、上記第2の軽鎖CDRは、配列番号7のCDR−L2と同一であり、上記第3の軽鎖CDRは、配列番号7のCDR−L3と同一である。いくつかの実施形態では、VHドメインは、配列番号8の1〜121番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、VLドメインは、配列番号9の1〜111番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、VHドメインは、配列番号8の1〜121番目のアミノ酸を含み、上記VLドメインは、配列番号9の1〜111番目のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号8を含み、上記軽鎖は配列番号9を含む。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号16を含む。いくつかの実施形態では、上記重鎖は配列番号16を含み、上記軽鎖は配列番号9を含む。
本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系列フレームワーク領域とトータルで少なくとも90%同一である(または少なくとも95、98、もしくは99%同一である)フレームワーク領域を任意に含むことができる。「トータルで」という用語は、配列比較の際に、個々のフレームワーク領域ではなく、すべてのフレームワークを総合して考慮することを意味する。例えば、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片は、配列番号11または配列番号12のVHドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも90%同一である(または少なくとも95、98、もしくは99%同一である)VHドメインフレームワーク領域を含むことができる。別の例では、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片は、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のVLドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも90%同一である(または少なくとも95、98、もしくは99%同一である)VLドメインフレームワーク領域を含むことができる。場合によっては、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片は、(i)配列番号11または配列番号12のVHドメインのフレームワーク領域とトータルで少なくとも90%同一であるVHドメインフレームワーク領域、および(ii)配列番号13、配列番号14、または配列番号15のVLドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも90%同一であるVLドメインフレームワーク領域を含むことができる。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11を含むVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号13を含むVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11のCDRと同一であるCDRを含むVHドメイン、または、その各CDRが、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号11の対応するCDRと異なるVHドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号11のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号13のCDRと同一であるCDRを含むVLドメイン、または、その各CDRが、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号13の対応するCDRと異なるVLドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号13のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11を含むVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号14を含むVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11のCDRと同一であるCDRを含むVHドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号11のCDRと異なるCDRを含むVHドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号11のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号14のCDRと同一であるCDRを含むVLドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号14のCDRと異なるCDRを含むVLドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号14のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11を含むVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号15を含むVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11のCDRと同一であるCDRを含むVHドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号11のCDRと異なるCDRを含むVHドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号11のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号15のCDRと同一であるCDRを含むVLドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号15のCDRと異なるCDRを含むVLドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号15のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号12を含むVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号13を含むVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号12のCDRと同一であるCDRを含むVHドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号12のCDRと異なるCDRを含むVHドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号12のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号13のCDRと同一であるCDRを含むVLドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号13のCDRと異なるCDRを含むVLドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号13のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号12を含むVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号14を含むVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号12のCDRと同一であるCDRを含むVHドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号12のCDRと異なるCDRを含むVHドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号12のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号14のCDRと同一であるCDRを含むVLドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号14のCDRと異なるCDRを含むVLドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号14のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVLドメインを含む単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号12を含むVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号15を含むVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
(i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号12のCDRと同一であるCDRを含むVHドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号12のCDRと異なるCDRを含むVHドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号12のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)配列番号15のCDRと同一であるCDRを含むVLドメイン、または、多くても1個、2個、3個、もしくは4個の改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)という形で、配列番号15のCDRと異なるCDRを含むVLドメインであって、そのフレームワーク領域が、配列番号15のフレームワーク領域とトータルで少なくとも90、95、97、98、または99%同一であるVLドメインを含む、単離Fn14結合タンパク質(例えば単離抗体またはその抗原結合断片)も開示する。
1つの実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、P4A8の3つ又は6つすべてのCDRまたは近似のCDR、例えば、同一であるか、または少なくとも1個(ただし、多くても2個、3個、もしくは4個)のアミノ酸が改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)されたCDR、あるいは、本明細書に記載されている他のCDRを含む。
1つの実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、P3G5の3つ又は6つすべてのCDRまたは近似のCDR、例えば、同一であるか、または少なくとも1個(ただし、多くても2個、3個、もしくは4個)のアミノ酸が改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)されたCDR、あるいは、本明細書に記載されている他のCDRを含む。
1つの実施形態では、該抗体またはその抗原結合断片は、P2D3の3つ又は6つすべてのCDRまたは近似のCDR、例えば、同一であるか、または少なくとも1個(ただし、多くても2個、3個、もしくは4個)のアミノ酸が改変(例えば、置換、欠失、もしくは挿入)されたCDR、あるいは、本明細書に記載されている他のCDRを含む。
Fn14タンパク質と相互作用する抗Fn14抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸は、突然変異していないのが好ましい(または、突然変異している場合、保存アミノ酸残基によって置換されているのが好ましい)。抗体P4A8の変異体、または、P4A8由来の抗体もしくは抗原結合断片(例えば、配列番号11および配列番号13を含む抗体または抗原結合断片)の変異体の1つの実施形態では、CDR L1の残基S32には変化がない。別の実施形態では、CDR L1の残基Y34は変わらない。別の実施形態では、CDR L1の残基Y36は変わらない。別の実施形態では、CDR L2の残基Y54は変わらない。別の実施形態では、CDR L3の残基R96は変わらない。別の実施形態では、CDR H1の残基D31は変わらない。別の実施形態では、CDR H1の残基Y32は変わらない。別の実施形態では、CDR H2の残基S52は変わらない。別の実施形態では、CDR H2の残基Y54は変わらない。別の実施形態では、CDR H2の残基N55は変わらない。別の実施形態では、CDR H2の残基Y57は変わらない。別の実施形態では、CDR H3の残基Y101は変わらない。別の実施形態では、CDR H3の残基Y105は変わらない。別の実施形態では、CDR H3の残基Y106は変わらない。
1つの実施形態では、該抗体または抗原結合断片は、本明細書に記載されているとおりであるが、ただし、CDRの少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、もしくは6個、または、可変鎖の1本もしくは2本は、既知の抗体、例えば、ITEM−I、ITEM−2、ITEM−3、またはITEM−4由来ではないものとする。
1つの実施形態では、該抗体または抗原結合断片は、他のTNFおよびTNFRファミリーメンバーと交差反応しない。
本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片は、例えば、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、一価抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、多特異性抗体(例えば双特異性抗体)、多価抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、Fsc断片、またはFv断片であり得る。
本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片は「多特異性」、例えば双特異性、三特異性、または四特異性以上であってよく、多特異性とは、1種もしくは複数種の抗原(例えばタンパク質)上に存在する2種類以上のエピトープを同時に認識して、これらに結合することを意味する。したがって、ある結合分子が「単一特異性」であるか「多特異性」、例えば「双特異性」であるかは、その結合分子が反応するエピトープの種類の数を指す。多特異性抗体は、Fn14タンパク質の種々のエピトープに対して特異的であっても、Fn14に加えて、異種のポリペプチドまたは固体支持物質のような異種のエピトープに対して特異的であってもよい。
本明細書で使用する場合、「価」という用語(「多価抗体」の中で用いられるようなもの)は、結合分子に存在する潜在的結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を指す。各結合ドメインは、1つのエピトープに特異的に結合する。結合分子が2つ以上の結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、同じエピトープに特異的に結合しても(2つの結合ドメインを有する抗体の場合、「二価単一特異性」という)、異なるエピトープに結合してもよい(2つの結合ドメインを有する抗体の場合、「二価双特異性」という)。抗体は、各特異性において双特異性かつ二価であってもよい(「双特異性四価抗体」という)。別の実施形態では、四価ミニボディまたはドメイン欠失抗体を作製することができる。
双特異性二価抗体、およびそれらを作製する方法は例えば、米国特許第5,731,168号、同第5,807,706号、同第5,821、333号、ならびに、米国特許出願公開第2003/020734号、および同第2002/0155537号に記載されており、これらの開示内容はいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。双特異性四価抗体、およびそれらを作製する方法は例えば、国際公開第02/096948号、および国際公開第00/44788号に記載されており、これらの開示内容は双方とも、参照により本明細書に組み込まれる。一般的には、国際公開第93/17715号、国際公開第92/08802号、国際公開第91/00360号、国際公開第92/05793号、国際公開第2007/109254号、Tutt et al.,J.Immunol.147:60−69(1991)、米国特許第4,474,893号、同第4,714,681号、同第4,925、648号、同第5,573,920号、同第5,601,819号、Kostelny et al.,J.Immunol.148:1547−1553(1992)を参照されたい。これらの参考文献はいずれも、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、抗Fn14抗体、例えばその抗体の1本または2本の重鎖を1つもしくは複数のscFvに結合させて、双特異性抗体を形成する。別の実施形態では、抗Fn14抗体は、双特異性分子を形成する目的である抗体に結合されているscFvの形態をしている。抗体−scFv構築体は、例えば国際公開第2007/109254号に記載されている。
上記の抗体の重鎖および軽鎖は、実質的に完全長であり得る。このタンパク質は、少なくとも1本、任意で2本の完全な重鎖と、少なくとも1本、任意で2本の完全な軽鎖を含むことも、抗原結合断片を含むこともできる。更に別の実施形態では、上記の抗体は、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、およびIgEから選択した重鎖定常領域を有する。典型的には、この重鎖定常領域は、ヒト定常領域またはヒト定常領域の修飾形態である。別の実施形態では、上記の抗体は、例えばκまたはλから選択した軽鎖の定常領域、特定的にはκ(例えばヒトκ)の定常領域を有する。
特定の実施形態では、抗体またその抗原結合断片の結合によって、細胞の表面上の受容体Fn14が架橋またはクラスター化される。例えば、抗体またはその抗原結合断片は、例えばプロテインAに結合することによってマルチマーを形成しても、多価であってもよい。
エフェクター機能を高める目的で、例えば、本発明の抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ADCC)および/もしくは補体依存性細胞障害性(CDC)を高めるか、または、標的受容体/Fn14の架橋を促進させるように、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片を修飾することができる。これは、本抗体のFc領域に1つもしくは複数のアミノ酸置換基を導入することによって実現させてよい。この代わりに、またはこれに加えて、システイン残基(単一または複数)をFc領域に導入し、それによって、この領域で鎖間ジスルフィド結合が形成されるようにしてもよい。このように生成されたホモ二量体抗体では、インターナリゼーション能が向上しているか、および/または、補体媒介性細胞殺滅性と抗体依存性細胞障害性(ADCC)が向上している場合がある。抗腫瘍活性が向上したホモ二量体抗体は、Wolff et al.Cancer Research 53:2560−2565(1993)に記載されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製してもよい。あるいは、2つのFc領域を有するように抗体を遺伝子工学技術で作製することができ、それによって、上記の抗体は、補体溶解能とADCC能が向上している場合がある。Stevenson et al.Anti−Cancer Drug Design 3:219−230(1989)を参照されたい。加えて、抗体を脱フコシル化して、該修飾された抗体のADCCが、脱フコシル化していない形態の抗体よりも高くなるようにできる。例えば、国際公開第2006089232号を参照されたい。
本発明では、本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、例えばDNAも提供する。本発明では、上記の核酸と少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、98%、もしくは99%同一であるか、または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上記の核酸とハイブリダイゼーションする核酸も包含する。
また、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片を産生する単離細胞も開示する。本発明では、本明細書に記載されているタンパク質をコードする核酸を含む細胞、例えば単離細胞も提供する。この細胞は例えば、哺乳類のB細胞と骨髄腫細胞を融合させることによって得られる融合細胞であり得る。
本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も開示する。
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞死を誘発する方法であって、Fn14を発現する腫瘍細胞と、腫瘍細胞死を誘発するのに有効な量の、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片とを接触させることを含む方法を特色とする。
腫瘍細胞の増殖を予防または減少させる方法であって、腫瘍を有する哺乳類に、腫瘍細胞の増殖を予防または減少させるのに有効な量の、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む方法も開示する。
癌を治療する方法であって、癌を有する哺乳類に、本明細書に記載されている抗体または抗原結合断片を治療有効量含む医薬組成物を投与することを含む方法も開示する。この癌は例えば、結腸癌または乳癌であり得る。
本明細書に記載されている方法に従って治療する哺乳類は例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、またはサルであり得る。
本明細書では、「抗体または抗原結合断片」と言及した場合には、この語句は、「タンパク質」と置き換えてもよいと理解すべきである。つまり、抗体およびその抗原結合断片の説明は、それらの抗体またはその抗原結合断片を含むタンパク質のようなタンパク質にも適用される。
別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野の者が一般的に理解するような意味と同じ意味を有する。本発明の実施および試験では、本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を用いることができ、その代表的な方法および材料については下に説明されている。本明細書で言及されている公報、特許出願、特許、およびその他の参照文献はいずれも、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合には、定義を含め、本出願が優先される。本明細書の材料、方法、および実施例は、例示するためのものに過ぎず、限定することは意図していない。
本発明の他の特徴および利点は、下記の発明を実施するための形態と特許請求の範囲から明らかになる。
P4A8、P2D3、P3G5、およびP3D8は、ヒトFn14に特異的に結合すると共に、Fn14活性を作動させるか、または、細胞表面上のFn14にTWEAKが結合することに起因する活性の少なくともいくつかを模倣する典型的な抗体である。P2D3およびP3D8は、同じアミノ酸配列を有することが分かっている。本明細書に記載されている抗Fn14抗体は、例えば、カスパーゼ依存性アポトーシスのようなアポトーシス、および/または、内因性TNF−α媒介性細胞死によって細胞殺滅を誘発すると共に、Fn14が発現している癌などの疾患を治療または予防する目的で用いることができる。
Fn14
Fn14は、FGF誘導性受容体である。正常組織の細胞上に低レベルで発現する場合が多く、損傷もしくは疾患の際に、または、癌(例えば腫瘍)細胞上でアップレギュレートする場合がある。理論に束縛されなければ、Fn14のリガンド(例えばTWEAK)によってFn14が刺激されると、腫瘍細胞死を誘発することができると共に、抗Fn14抗体も、腫瘍細胞を殺傷するのに有効であると考えられている。また、Fn14はヒト腫瘍内で過剰発現するとも考えられている。抗Fn14抗体は、腫瘍細胞死を引き起こすことができるので、治療上、癌を治療するのに有益である場合がある。
Fn14は、FGF誘導性受容体である。正常組織の細胞上に低レベルで発現する場合が多く、損傷もしくは疾患の際に、または、癌(例えば腫瘍)細胞上でアップレギュレートする場合がある。理論に束縛されなければ、Fn14のリガンド(例えばTWEAK)によってFn14が刺激されると、腫瘍細胞死を誘発することができると共に、抗Fn14抗体も、腫瘍細胞を殺傷するのに有効であると考えられている。また、Fn14はヒト腫瘍内で過剰発現するとも考えられている。抗Fn14抗体は、腫瘍細胞死を引き起こすことができるので、治療上、癌を治療するのに有益である場合がある。
ヒトFn14の配列は以下の通りである。
MARGSLRRLLRLLVLGLWLALLRSVAGEQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAAAPPAPFRLLWPILGGALSLTFVLGLLSGFLVWRRCRRREKFTTPIEETGGEGCPAVALIQ(配列番号1)
更なるFn14のタンパク質配列としては、マウスFn14(例えばNCBI受託番号AAF07882またはNP_038777またはQ9CR75またはAAH25860)、ヒトFn14(例えばNCBI受託番号NP_057723またはBAA94792またはQ9NP84またはAAH02178またはAAF69108)、ラットFn14(例えばNCBI受託番号NP_851600またはAAH60537)、およびアフリカツメガエルFn14(例えばNCPI受託番号AAR21225またはNP_001083640)が挙げられる。これらのFn14タンパク質を、例えば免疫原として用いて、抗Fn14抗体を調製することができる。続いて、本明細書に記載されているように、これらの抗Fn14抗体をスクリーニングして、アゴニスト抗体を同定することができる。
更なるFn14のタンパク質配列としては、マウスFn14(例えばNCBI受託番号AAF07882またはNP_038777またはQ9CR75またはAAH25860)、ヒトFn14(例えばNCBI受託番号NP_057723またはBAA94792またはQ9NP84またはAAH02178またはAAF69108)、ラットFn14(例えばNCBI受託番号NP_851600またはAAH60537)、およびアフリカツメガエルFn14(例えばNCPI受託番号AAR21225またはNP_001083640)が挙げられる。これらのFn14タンパク質を、例えば免疫原として用いて、抗Fn14抗体を調製することができる。続いて、本明細書に記載されているように、これらの抗Fn14抗体をスクリーニングして、アゴニスト抗体を同定することができる。
抗Fn14抗体
本開示は、P4A8、P2D3、P3G5、およびP3D8のような抗Fn14アゴニスト抗体の具体例の配列を含む。上記のような特定的な抗体は例えば、当該アミノ酸配列をコードする合成遺伝子を調製して発現させることによって、または、ヒト生殖系列遺伝子を突然変異させて、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子をもたらすことによって、作製することができる。さらに、上記の抗体および他の抗Fn14抗体(例えばアゴニスト抗体)は、例えば下記の諸方法のうちの1つもしくは複数の方法を用いて製造することができる。
本開示は、P4A8、P2D3、P3G5、およびP3D8のような抗Fn14アゴニスト抗体の具体例の配列を含む。上記のような特定的な抗体は例えば、当該アミノ酸配列をコードする合成遺伝子を調製して発現させることによって、または、ヒト生殖系列遺伝子を突然変異させて、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子をもたらすことによって、作製することができる。さらに、上記の抗体および他の抗Fn14抗体(例えばアゴニスト抗体)は、例えば下記の諸方法のうちの1つもしくは複数の方法を用いて製造することができる。
抗体、特にヒト抗体を得るには、多数の方法を利用することができる。1つの例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージまたはリボゾームディスプレイライブラリーのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイは、例えば、米国特許第5,223,409号、Smith(1985)Science 228:1315−1317、国際公開第92/18619号、国際公開第91/17271号、国際公開第92/20791号、国際公開第92/15679号、国際公開第93/01288号、国際公開第92/01047号、国際公開第92/09690号、および国際公開第90/02809号に記載されている。Fab’をファージ上に提示させることは、例えば、米国特許第5,658,727号、同第5,667,988号、および同第5,885,793号に記載されている。
ディスプレイライブラリーの利用に加えて、別の方法を用いて、Fn14結合抗体を得ることができる。例えば、Fn14タンパク質またはそのペプチドを、非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えばマウス、ハムスター、またはラットなどにおいて抗原として用いることができる。加えて、細胞表面のFn14タンパク質と有効に結合する抗体を産生させる手段として、Fn14をコードするcDNAでトランスフェクションした細胞を非ヒト動物に注射することができる。
1つの実施態様では、上記の非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトIg遺伝子座の大きな断片によって、マウス抗体の産生ができないマウス株を遺伝子工学技術で作ることができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を作製および選択してよい。例えば、XENOMOUSE(商標)、Green et al.(1994)Nature Genetics 7:13−21、米国特許出願公開第2003−0070185号、国際公開第96/34096号、および国際公開第96/33735号を参照されたい。
別の実施形態では、モノクローナル抗体を上記の非ヒト動物から得てから修飾、例えば、ヒト化または脱免疫する。Winterは、本明細書に記載されているヒト化抗体を調製する目的で用いてよい例示的なCDR移植法を説明している(米国特許第5,225,539号)。特定のヒト抗体のCDRの全部または一部を、非ヒト抗体の少なくとも一部と置換してよい。Fn14に結合する有用なヒト化抗体を得るには、結合のために欠かせないCDR、またはそのようなCDRの結合決定基を置換するだけでよい場合もある。
ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与していないFv可変領域の配列をヒトFv可変領域由来の対応する配列と置換することによって生成することができる。ヒト化抗体を生成するための一般的な方法は、Morrison,S.L.(1985)Science 229:1202−1207、Oi et al.(1986)BioTechniques 4:214、ならびに、米国特許第5,585,089号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,693,762号、米国特許第5,859,205号、および米国特許第6,407,213号によって提供されている。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも1つに由来する免疫グロブリンFv可変領域の全部または一部をコードする核酸配列を単離、操作、および発現させることを含む。このような核酸の供給源は当業者には周知であり、例えば、上述のように、所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子、または合成構築体から得てよい。続いて、ヒト化抗体をコードする組み換えDNAを適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
ヒト生殖細胞系列配列は、例えば、Tomlinson,I.A.et al.(1992)J.Mol.Biol.227:776−798、Cook,G.P.et al.(1995)Immunol.Today 16:237−242、Chothia,D.et al.(1992)J.Mol.Bio.227:799−817、およびTomlinson et al.(1995)EMBO J 14:4628−4638に開示されている。V BASEディレクトリーは、ヒト免疫グロブリンの可変ドメイン配列の包括的ディレクトリーを提供している(英国ケンブリッジ、MRCプロテイン・エンジニアリング・センター(MRC Centre for Protein Engineering)のTomlinson,I.A.らがコンパイル)。これらの配列は、例えば、フレームワーク領域およびCDR用のヒト配列の供給源として用いることができる。共通ヒトフレームワーク領域も、例えば米国特許第6,300,064号に記載されているように用いることができる。
また、非ヒトFn14結合抗体も、国際公開第98/52976号および国際公開第00/34317号に開示されている方法によって、ヒトT細胞エピトープを特異的に欠失させること、すなわち「脱免疫」することによって修飾してよい。簡潔に言うと、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の、MHCクラスIIに結合するペプチドを解析することができ、これらのペプチドは、(国際公開第98/52976号および国際公開第00/34317号に定義されているような)潜在的T細胞エピトープを表す。潜在的T細胞エピトープの検出には、「ペプチドスレッディング」というコンピューターモデリング法を利用することができ、加えて、国際公開第98/52976号および国際公開第00/34317号に記載されているように、ヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースで、VHおよびVLの配列に存在するモチーフについて検索することもできる。これらのモチーフは、MHCクラスII DRの18種類の主要なアロタイプのいずれかに結合し、その結果、潜在的T細胞エピトープを構成する。検出された潜在的T細胞エピトープは、可変領域内の少数のアミノ酸残基を置換することによって、または好ましくは、1つのアミノ酸を置換することによって削除することができる。可能な限り、保存的置換を行う。ヒト生殖細胞系列抗体の配列中のある位置に共通のアミノ酸を用いてよい場合が多いが、これに限らない。脱免疫変化を同定した後、突然変異誘発またはその他の合成法(例えば、デノボ合成、カセット置換など)によって、VHとVLをコードする核酸を構築することができる。突然変異を誘発させた可変領域は任意で、ヒト定常領域、例えば、ヒトIgG1またはκ定常領域に融合させることができる。
場合によっては、潜在的T細胞エピトープは、抗体機能にとって重要であることが知られているか、または予測される残基を含むことになる。例えば、潜在的T細胞エピトープは通常、CDRの方に偏っている。加えて、潜在的T細胞エピトープは、抗体の構造および結合にとって重要なフレームワーク残基内に生じることがある。これらの潜在的エピトープを削除するための変更には、場合によっては、さらなる精査、例えば、変更した鎖と変更のない鎖を作製して試験することによる精査が必要になる。可能な場合、CDRと重複する潜在的T細胞エピトープは、CDR以外での置換によって削除することができる。場合によっては、CDR内での改変が唯一の選択肢であり、したがって、この置換を行った場合と行わなかった場合の変異体を試験することができる。別のケースでは、潜在的T細胞エピトープを除去するために必要な置換は、抗体の結合にとって非常に重要であり得るフレームワーク内の残基位置での置換である。これらのケースでは、この置換を行った場合と行わなかった場合の変異体を試験する。したがって、場合によっては、いくつかの異なる脱免疫化重鎖可変領域および軽鎖可変領域を設計し、重鎖と軽鎖の様々な組合せを試験して、最適な脱免疫化抗体を同定する。続いて、種々の変異体の結合親和性について、脱免疫化の程度、特に、可変領域に残存する潜在的T細胞エピトープの数と併せて検討することによって、最終的な脱免疫化抗体の選択を行うことができる。脱免疫化を用いて、どんな抗体、例えば、非ヒト配列を含む抗体、例えば、合成抗体、マウス抗体、その他の非ヒトモノクローナル抗体、またはディスプレイライブラリーから単離した抗体、も修飾することができる。
また、抗体をヒト化する別の方法を用いることもできる。例えば、別の方法では、抗体の三次元構造、結合決定基と三次元的に近接しているフレームワーク位置、および免疫原性ペプチド配列を説明することができる。例えば、国際公開第90/07861号、米国特許第5,693,762号、同第5,693,761号、同第5,585,089号、同第5,530,101号、および同第6,407,213号、Tempest et al.(1991)Biotechnology 9:266−271を参照されたい。さらに別の方法は、「ヒューマニアリング(humaneering)」というものであり、例えば、米国特許出願公開第2005−008625号に記載されている。
本発明の抗体は、ヒトFc領域、例えば、野生型Fc領域、または、1つもしくは複数の改変を含むFc領域を含むことができる。1つの実施形態では、定常領域を改変、例えば、突然変異させて、抗体の特性を修正する(例えば、Fc受容体への結合性、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、または補体機能のうち一つもしくは複数を増大または低下させる)。例えば、ヒトIgG1の定常領域を1つもしくは複数の残基、例えば、234番目および237番目の残基のうちの1つもしくは複数の残基で突然変異させることができる。抗体は、重鎖のCH2領域に、エフェクター機能、例えば、Fc受容体への結合および補体活性化の機能を低下または改変させる突然変異を有してよい。例えば、抗体は、米国特許第5,624,821号および同第5,648,260号に記載されているような突然変異を有してよい。また、抗体は、当該技術分野(例えばAngal et al.(1993)Mol.Immunol.30:105−08)において開示されているような、IgG4のヒンジ領域における突然変異のように、免疫グロブリンの2本の重鎖間のジスルフィド結合を安定化させる突然変異を有してもよい。米国特許出願公開第2005−0037000号も参照されたい。
親和性の成熟
1つの実施形態では、例えば突然変異誘発によって抗Fn14抗体を修飾して、さまざまな修飾抗体をもたらす。続いて、これらの修飾抗体を評価して、機能特性が改変された抗体(例えば、結合性が向上した抗体、安定性が向上した抗体、抗原性が低下した抗体、またはインビボでの安定性が向上した抗体)を1種もしくは複数種同定する。1つの実施態様では、ディスプレイライブラリー技術を用いて、該さまざまな修飾抗体を選別つまりスクリーニングする。続いて、例えば、さらに高いストリンジェンシーまたはさらに競合的な結合および洗浄条件を用いることによって、第2のライブラリーから、さらに親和性の高い抗体を同定する。他のスクリーニング技法も用いることができる。
1つの実施形態では、例えば突然変異誘発によって抗Fn14抗体を修飾して、さまざまな修飾抗体をもたらす。続いて、これらの修飾抗体を評価して、機能特性が改変された抗体(例えば、結合性が向上した抗体、安定性が向上した抗体、抗原性が低下した抗体、またはインビボでの安定性が向上した抗体)を1種もしくは複数種同定する。1つの実施態様では、ディスプレイライブラリー技術を用いて、該さまざまな修飾抗体を選別つまりスクリーニングする。続いて、例えば、さらに高いストリンジェンシーまたはさらに競合的な結合および洗浄条件を用いることによって、第2のライブラリーから、さらに親和性の高い抗体を同定する。他のスクリーニング技法も用いることができる。
いくつかの実施態様では、該突然変異誘発は、結合界面にあることが知られているか、またはその可能性が高い領域を標的にする。例えば、同定された結合タンパク質が抗体である場合には、突然変異誘発は、本明細書に記載されているように、重鎖または軽鎖のCDR領域を対象にすることができる。さらに、突然変異誘発は、CDRに近いかまたは隣接するフレームワーク領域、例えば、特定的にはCDR接合部から10、5、または3アミノ酸以内にあるフレームワーク領域を対象にすることができる。抗体の場合には、突然変異誘発は、例えば段階的な改善を行う目的で、CDRの1個または数個に限定することもできる。
1つの実施形態では、突然変異誘発を用いて、抗体を1つもしくは複数の生殖細胞系列配列にさらに近づける。1つの例示的な生殖細胞系列化法は、単離抗体の配列と類似する(例えば、特定のデータベースにおいて最も類似する)1つもしくは複数の生殖細胞系列配列を同定することを含むことができる。続いて、単離抗体で突然変異(アミノ酸レベルの突然変異)を漸増的な形、組み合わせた形、またはこの双方の形で起こすことができる。例えば、考え得る生殖細胞系列突然変異の一部または全部をコードする配列を含む核酸ライブラリーを作製する。続いて、該突然変異抗体を評価して、例えば、単離抗体と比べた場合に1つもしくは複数の追加の生殖細胞系列残基を有し、かつ、有用なままである(例えば機能活性を有する)抗体を同定する。1つの実施形態では、可能なかぎり多くの生殖細胞系列残基を単離抗体に導入する。
1つの実施形態では、突然変異誘発を用いて、CDR領域に生殖細胞系列残基を1つもしくは複数置換または挿入する。例えば、生殖細胞系列のCDR残基は、修飾される可変領域と類似する(例えば最も類似する)生殖細胞系列配列に由来し得る。突然変異誘発後、抗体の活性(例えば、結合活性またはその他の機能活性)を評価して、生殖細胞系列残基が許容されるかを判定ことができる。同様の突然変異誘発をフレームワーク領域内で行うことができる。
生殖細胞系列配列の選択は、様々な方法で行うことができる。例えば、生殖細胞系列配列が、選択性または類似性に関する所定の基準、例えば、非ヒトドナー抗体と特定の比率、例えば少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または99.5%同一であるという基準、に適合すれば、その生殖細胞系列配列を選択することができる。この選択は、少なくとも2個、3個、5個、または10個の生殖細胞系列配列を用いて行うことができる。CDR1およびCDR2の場合には、類似の生殖細胞系列配列の同定は、生殖細胞系列配列を1つ選択することを含むことができる。CDR3の場合には、類似の生殖細胞系列配列の同定は、生殖細胞系列配列を1つ選択することを含むことができるが、アミノ末端部分およびカルボキシル末端部分に別々に寄与する2つの生殖細胞系列配列を用いることも含んでもよい。別の実施態様では、2個以上または3個以上の生殖細胞系列配列を用いて、例えば、コンセンサス配列を形成する。
2つの配列間の「配列同一率」の算出は、以下のように行う。最適な比較を行う目的で、当該配列をアラインメントする(例えば、最適なアラインメントのために、第1および第2のアミノ酸または核酸配列の1つまたは両方に、ギャップを挿入することができると共に、比較する目的上、非相同配列を無視することができる)。Blossum62というスコアリング行列を有するGCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いて、ギャップペナルティーを12、ギャップ伸長ペナルティーを4、フレームシフトギャップペナルティーを5として、最適なアラインメントを最高スコアとして判定する。続いて、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列中のある位置が、第2の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、当該分子は、その位置において同一である。2つの配列間の同一率(%)は、当該配列によって共有されている同一の位置の数の関数である。
別の実施形態では、該抗体を修飾して、改変されたグリコシル化パターン(すなわち、元のまたは天然のグリコシル化パターンから改変されたパターン)を有するようにしてよい。この文脈で用いる場合、「改変」とは、欠損した炭化水素部分を1つもしくは複数有し、および/または、元の抗体に付加されたグリコシル化部位を1つもしくは複数有することを意味する。本明細書に開示されている抗体にグリコシル化部位を付加することは、アミノ酸配列を改変して、グリコシル化部位のコンセンサス配列を含めることによって行ってよく、このような技法は、当該技術分野において周知である。抗体上の炭化水素部分の数を増やす別の手段は、グリコシドを抗体のアミノ酸残基に化学的または酵素的にカップリングすることによるものである。これらの方法は、例えば、国際公開第87/05330号、およびAplin and Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.22:259−306に記載されている。当該技術分野において説明されているように(Hakimuddin et al.(1987)Arch.Biochem.Biophys.259:52、Edge et al.(1981)Anal.Biochem.118:131、およびThotakura et al.(1987)Meth.Enzymol.138:350)、抗体上に存在するどんな炭化水素部分の除去も、化学的または酵素的に行ってよい。サルベージ受容体結合エピトープを提供することによって半減期をインビボで延長する修飾については、例えば米国特許第5,869,046号を参照されたい。
1つの実施形態では、抗体は、P4A8、P2D3、P3G5、またはP3D8のCDR配列とわずかしか異ならないCDR配列を有する。わずかな差異としては、CDR、例えばChotiaまたはKabatのCDRの配列中の典型的には5〜7番目のアミノ酸のいずれかのうちの1個または2個が置換されているようなわずかなアミノ酸変化が挙げられる。典型的には、アミノ酸は、類似の電荷、疎水性、または立体化学的特徴を有する関連アミノ酸によって置換する。このような置換は、当業者の技量の範囲内である。CDRとは異なり、構造フレームワーク領域(FR)に対するより大きな変更は、抗体の結合特性に悪影響を及ぼすことなく行うことができる。FRに対する変更としては、非ヒト由来のフレームワークをヒト化すること、または、抗原との接触もしくは結合部位の安定化にとって重要なフレームワーク残基を遺伝子工学技術で作製すること、例えば、定常領域のクラスもしくはサブクラスを変更すること、Fc受容体への結合などのエフェクター機能を改変させる場合のある特定のアミノ酸残基を変更すること(Lund et al.(1991)J Immun.147:2657−62、Morgan et al.(1995)Immunology 86:319−24)、または、定常領域の由来元である種を変更することが含まれるが、これらに限定されない。
当該抗Fn14抗体は、完全長抗体の形態、または、抗体の断片の形態、例えば、Fab、F(ab’)2、Fd、dAb、およびscFv断片であり得る。抗体の断片は、可変領域、例えばVHまたはVLのような抗原結合断片であり得る。
さらなる形態としては、単一の可変ドメイン、例えばラクダまたはラクダ化ドメインを含むタンパク質が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第2005−0079574号、およびDavies et al.(1996)Protein Eng.9(6):531−7を参照されたい。
本発明では、抗Fn14と、その酸性変異体の1種もしくは複数種との混合物を含む組成物であって、例えば、その酸性変異体の量が、約80%、70%、60%、60%、50%、40%、30%、30%、20%、10%、5%、または1%未満である組成物を提供する。また、少なくとも1つの脱アミド部位を含む抗Fn14を含む組成物であって、例えば、その抗Fn14の少なくとも約90%が脱アミド化されないように(すなわち、抗体の10%未満が脱アミド化されるように)、その組成物のpHが約5.0〜約6.5である組成物も提供する。特定の実施形態では、これらの抗体の約5%未満、3%未満、2%未満、または1%未満が脱アミド化されている。上記のpHは、5.0〜6.0、例えば5.5または6.0であってよい。特定の実施形態では、該組成物のpHは、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、または6.5である。
「酸性変異体」は、目的のポリペプチドの変異体のうち、(例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーによって判定した場合に、)目的のポリペプチドよりも酸性である変異体である。酸性変異体の例は脱アミド化変異体である。
ポリペプチド分子の「脱アミド化」変異体は、元のポリペプチドの1つもしくは複数のアスパラギン残基がアスパラギン酸に変換されたポリペプチド、すなわち、中性のアミド側鎖が、全体として酸性の特徴を有する残基に変換されたポリペプチドである。
「混合物」という用語は、本明細書において、抗Fn14抗体を含む組成物に関して使用する場合、所望の抗Fn14抗体と、その酸性変異体の1種もしくは複数種が双方とも存在することを意味する。これらの酸性変異体は、大部分が脱アミド化された抗Fn14抗体を、少量の他の酸性変異体(単一または複数)と共に含んでもよい。.
1つの実施形態では、脱アミド化部位(NG)内、または脱アミノ化部位の近くのアミノ酸を突然変異させて、抗体の脱アミド化を減少または排除する。例えば、ヒト化P4A8の重鎖(配列番号11)のCDR2は、55位(N、すなわちAsn)および56位(G、すなわちGly)に脱アミド化部位(NG)を含む。抗体の脱アミド化を減少または排除する目的で、配列番号11のCDR2を含む抗体(または本明細書に記載されているその変異体)のCDR2内に、配列番号11の54位、55位、または56位に対応する位置に、少なくとも1つのアミノ酸置換基を導入することができる。この際、54位はGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、またはTrpであり、55位はAsn、Gln、Arg、Asp、Ser、Gly、またはAlaであり、56位はGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、またはTrpである。ただし、55位がAsnである場合には、56位はGlyではない。例えば、脱アミド化部位NGでは、NまたはGのいずれか一方を別のアミノ酸に置換してよい。1つの実施形態では、55位の該アスパラギン(N55)をセリンで置換する(すなわちCDR2のN55S突然変異)。類似体の追加的な例としては、54位がGly、55位がAsn、56位がValのもの、54位がGly、55位がAsn、56位がAlaのもの、54位がGly、55位がAsp、56位がGlyのもの、54位がGly、55位がGln、56位がGlyのもの、54位がGly、55位がAla、56位がGlyのもの、54位がGly、55位がGly、56位がGlyのもの、54位が、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、およびTrpからなる群から選択され、55位がAlaであり、56位がGlyであるもの、54位が、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、およびTrpからなる群から選択され、55位がGlyであり、56位がGlyであるものが挙げられる(例えば国際公開第2003/073982号を参照されたい)。
1つの実施形態では、脱アミド化部位(NG)内、または脱アミノ化部位の近くのアミノ酸を突然変異させて、抗体の脱アミド化を減少または排除する。例えば、ヒト化P4A8の重鎖(配列番号11)のCDR2は、55位(N、すなわちAsn)および56位(G、すなわちGly)に脱アミド化部位(NG)を含む。抗体の脱アミド化を減少または排除する目的で、配列番号11のCDR2を含む抗体(または本明細書に記載されているその変異体)のCDR2内に、配列番号11の54位、55位、または56位に対応する位置に、少なくとも1つのアミノ酸置換基を導入することができる。この際、54位はGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、またはTrpであり、55位はAsn、Gln、Arg、Asp、Ser、Gly、またはAlaであり、56位はGly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、またはTrpである。ただし、55位がAsnである場合には、56位はGlyではない。例えば、脱アミド化部位NGでは、NまたはGのいずれか一方を別のアミノ酸に置換してよい。1つの実施形態では、55位の該アスパラギン(N55)をセリンで置換する(すなわちCDR2のN55S突然変異)。類似体の追加的な例としては、54位がGly、55位がAsn、56位がValのもの、54位がGly、55位がAsn、56位がAlaのもの、54位がGly、55位がAsp、56位がGlyのもの、54位がGly、55位がGln、56位がGlyのもの、54位がGly、55位がAla、56位がGlyのもの、54位がGly、55位がGly、56位がGlyのもの、54位が、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、およびTrpからなる群から選択され、55位がAlaであり、56位がGlyであるもの、54位が、Gly、Ala、Ser、Val、Thr、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、およびTrpからなる群から選択され、55位がGlyであり、56位がGlyであるものが挙げられる(例えば国際公開第2003/073982号を参照されたい)。
特定の実施形態では、脱アミド化を排除する目的で突然変異させた抗体の結合親和性(KD)、会合速度(KD on)、および/または解離速度(KD off)は、野生型抗体のものと同程度であり、例えば、その差異は、約5倍、2倍、1倍(100%)、50%、30%、20%、10%、5%、3%、2%、または1%未満である。
特定の実施形態では、抗Fn14抗体は血管新生を阻害する。あるいは、抗Fn14抗体は、血管新生を刺激しても、血管新生に対する作用を及ぼさなくてもよい。血管新生に対する作用は、インビトロアッセイまたはインビボアッセイ、例えば、HUVEC細胞に対する内皮増殖アッセイ、または、角膜ポケットアッセイ、創傷閉鎖アッセイ、および当該技術分野において既知の他のアッセイで判定することができる。
抗体断片
従来、抗体断片は、無傷の抗体のタンパク質分解によって得ていた。この代わりに、これらの抗体断片は、組み換え宿主細胞によって直接産生させることもできる。抗体断片Fab、Fv、およびScFvはいずれも、大腸菌で発現させ、大腸菌から分泌させることができるので、これらの断片を大量に容易に製造することができる。抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片は、大腸菌から直接回収することができると共に、化学的に結合させて、F(ab')2断片を形成することができる(Carter et al.,Bio/Technology 10:163−167(1992))。別のアプローチによれば、F(ab')2断片は、組み換え宿主細胞の培養液から直接単離することができる。インビボ半減期が延長しており、サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むFab及びF(ab')2断片が、米国特許第5,869,046号に記載されている。他の実施形態では、選択した抗体は、単鎖Fv断片(scFv)である。FvとscFvは、定常領域がない無傷の結合部位を含むので、インビボで使用中に非特異的結合を減少させるのに適している。scFv融合タンパク質を構築して、scFvのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか一方にエフェクタータンパク質を融合できる。該抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。このような線状抗体断片は、単一特異性であっても双特異性であってもよい。
従来、抗体断片は、無傷の抗体のタンパク質分解によって得ていた。この代わりに、これらの抗体断片は、組み換え宿主細胞によって直接産生させることもできる。抗体断片Fab、Fv、およびScFvはいずれも、大腸菌で発現させ、大腸菌から分泌させることができるので、これらの断片を大量に容易に製造することができる。抗体断片は、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Fab'-SH断片は、大腸菌から直接回収することができると共に、化学的に結合させて、F(ab')2断片を形成することができる(Carter et al.,Bio/Technology 10:163−167(1992))。別のアプローチによれば、F(ab')2断片は、組み換え宿主細胞の培養液から直接単離することができる。インビボ半減期が延長しており、サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むFab及びF(ab')2断片が、米国特許第5,869,046号に記載されている。他の実施形態では、選択した抗体は、単鎖Fv断片(scFv)である。FvとscFvは、定常領域がない無傷の結合部位を含むので、インビボで使用中に非特異的結合を減少させるのに適している。scFv融合タンパク質を構築して、scFvのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか一方にエフェクタータンパク質を融合できる。該抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「線状抗体」であってもよい。このような線状抗体断片は、単一特異性であっても双特異性であってもよい。
双特異性抗体
双特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な双特異性抗体は、Fn14タンパク質の2つの異なるエピトープに結合することができる。他の双特異性抗体は、Fn14の結合部位と他のタンパク質の結合部位を兼ね備えることができる。あるいは、細胞防御機構をFn14発現細胞に集中および限局化させるように、抗Fn14アームを、T細胞受容体分子(例えばCD3)のような白血球上のトリガー分子、または、Fc−γ−RI(CD64)、Fc−γ−RII(CD32)、およびFc−γ−RIII(CD16)のようなIgGのFc受容体(Fc−γ−R)に結合するアームと組み合わせてもよい。双特異性抗体を用いて、Fn14を発現する細胞に細胞毒性剤を限局化することもできる。これらの抗体は、Fn14結合アームと、細胞毒性剤(例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート、または放射性同位体ハプテン)に結合するアームを有する。双特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片(例えばF(ab')2双特異性抗体)として調製することができる。
双特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な双特異性抗体は、Fn14タンパク質の2つの異なるエピトープに結合することができる。他の双特異性抗体は、Fn14の結合部位と他のタンパク質の結合部位を兼ね備えることができる。あるいは、細胞防御機構をFn14発現細胞に集中および限局化させるように、抗Fn14アームを、T細胞受容体分子(例えばCD3)のような白血球上のトリガー分子、または、Fc−γ−RI(CD64)、Fc−γ−RII(CD32)、およびFc−γ−RIII(CD16)のようなIgGのFc受容体(Fc−γ−R)に結合するアームと組み合わせてもよい。双特異性抗体を用いて、Fn14を発現する細胞に細胞毒性剤を限局化することもできる。これらの抗体は、Fn14結合アームと、細胞毒性剤(例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート、または放射性同位体ハプテン)に結合するアームを有する。双特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片(例えばF(ab')2双特異性抗体)として調製することができる。
完全長双特異性抗体の従来の作製法は、重鎖と軽鎖が異なる特異性を有する2対の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を共発現させることに基づいている(Millstein et al.,Nature 305:537−539(1983))。異なるアプローチでは、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。免疫グロブリン重鎖融合体と、所望の場合には、免疫グロブリン軽鎖とをコードするDNAを別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主細胞に同時トランスフェクションする。これによって、3つのポリペプチド断片の割合を調節する際の柔軟性が大きくなる。しかしながら、少なくとも2本のポリペプチド鎖が等しい比率で発現することによって、高い収率が得られるときには、2本または3本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクターに挿入することもできる。
米国特許第5,731,168号に記載されている別のアプローチによれば、1対の抗体分子間の界面を遺伝子工学技術で作製して、組み換え細胞培養液から回収されるヘテロダイマーの割合を最大化することができる。好ましい界面は、CH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1の抗体分子の界面から得られる1つもしくは複数の小さいアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)と置換する。大きなアミノ酸側鎖を、より小さい側鎖(例えばアラニンまたはトレオニン)に置換することによって、大きな側鎖と同じまたは同等の大きさの代償性「空隙」を第2の抗体分子の界面上に作製する。これによって、ホモダイマーのような不要な他の最終産物と比べて、ヘテロダイマーの収量を増大させる機構が得られる。
双特異性抗体としては、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体も挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲート抗体には、アビジンに結合させることができるものもあれば、ビオチンに結合させることができるものもある。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の利便的な架橋法を用いて作製してよい。
「ダイアボディー」技術は、双特異性抗体断片を作製するための代替的な機構を提供する。該双特異性抗体断片は、短すぎて同一鎖上ではVHドメインとVLドメインとの対形成ができないリンカーによってVLに連結されているVHを含む。したがって、1つの断片のVHドメインとVLドメインは、別のフラグメントの相補的VLドメインとVHドメインとの対形成を強いられ、それによって、2つの抗原部位が形成される。
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速くインターナリゼーション(および/または異化)することができる。本明細書に記載されている抗体は、3つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(例えば四価抗体)であることができ、その抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸を組み換え発現させることによって、容易に製造することができる。この多価抗体は、二量化ドメインと3つ以上の抗原結合部位を含むことができる。例示的な二量化ドメインは、Fc領域もしくはヒンジ領域を含む(または、Fc領域もしくはヒンジ領域からなる)。多価抗体は、3〜約8(例えば4)個の抗原結合部位を含む(または、3〜約8(例えば4)個の抗原結合部位からなる)ことができる。当該多価抗体は任意で、少なくとも1本のポリペプチド鎖(例えば少なくとも2本のポリペプチド鎖)を含み、このポリペプチド鎖は、2つ以上の可変ドメインを含む。例えば、このポリペプチド鎖は、VD1−(X1)n−VD2−(X2)n−Fcを含んでよく、このVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、Fcは、Fc領域のポリペプチド鎖であり、X1とX2は、アミノ酸またはペプチドスペーサーを表しており、nは0または1である。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速くインターナリゼーション(および/または異化)することができる。本明細書に記載されている抗体は、3つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体(例えば四価抗体)であることができ、その抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸を組み換え発現させることによって、容易に製造することができる。この多価抗体は、二量化ドメインと3つ以上の抗原結合部位を含むことができる。例示的な二量化ドメインは、Fc領域もしくはヒンジ領域を含む(または、Fc領域もしくはヒンジ領域からなる)。多価抗体は、3〜約8(例えば4)個の抗原結合部位を含む(または、3〜約8(例えば4)個の抗原結合部位からなる)ことができる。当該多価抗体は任意で、少なくとも1本のポリペプチド鎖(例えば少なくとも2本のポリペプチド鎖)を含み、このポリペプチド鎖は、2つ以上の可変ドメインを含む。例えば、このポリペプチド鎖は、VD1−(X1)n−VD2−(X2)n−Fcを含んでよく、このVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、Fcは、Fc領域のポリペプチド鎖であり、X1とX2は、アミノ酸またはペプチドスペーサーを表しており、nは0または1である。
抗体の産生
いくつかの抗体、例えばFab抗体は、細菌細胞、例えば大腸菌細胞内で産生させることができる。抗体は、真核生物細胞内でも産生させることができる。1つの実施形態では、これらの抗体(例えばscFv抗体)は、ピキア(例えば、Power et al.(2001)J Immunol Methods.251:123−35を参照されたい)、ハンゼヌラ、またはサッカロミセスのような酵母細胞内で発現させる。
いくつかの抗体、例えばFab抗体は、細菌細胞、例えば大腸菌細胞内で産生させることができる。抗体は、真核生物細胞内でも産生させることができる。1つの実施形態では、これらの抗体(例えばscFv抗体)は、ピキア(例えば、Power et al.(2001)J Immunol Methods.251:123−35を参照されたい)、ハンゼヌラ、またはサッカロミセスのような酵母細胞内で発現させる。
1つの好ましい実施形態では、抗体は、哺乳類細胞内で産生させる。抗体を発現させるための例示的な哺乳類細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)(Urlaub and Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220に記載されているdhfr− CHO細胞を、例えば、Kaufman and Sharp(1982)Mol.Biol.159:601−621に記載されているような選択可能なマーカーDHFRと共に用いるものを含む)、リンパ球細胞株、例えば骨髄腫細胞NS0、SP2細胞、COS細胞、および、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳類に由来する細胞が挙げられる。例えば、この細胞は、哺乳類上皮細胞である。
組み換え発現ベクターは、様々な免疫グロブリン領域をコードする核酸配列に加えて、宿主細胞内での該ベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)、および選択可能なマーカー遺伝子のような追加的な配列を含んでよい。該選択可能なマーカー遺伝子は、該ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする(例えば、米国特許第4,399,216号、同第4,634,665号、および同第5,179,017号を参照されたい)。例えば、典型的には、該選択可能なマーカー遺伝子は、該ベクターが導入された宿主細胞に、G418、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与する。
抗体発現用の例示的な系では、リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション法によって、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターをdhfr−CHO細胞に導入する。該組み換え発現ベクター内では、抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子をそれぞれ、エンハンサー/プロモーター調節要素(例えば、CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節要素、またはSV40エンハンサー/AdMLPプロモーター調節要素のように、SV40、CMV、アデノウイルスなどに由来するもの)に機能的に連結して、これらの遺伝子の高レベルの転写を促す。また、該組み換え体発現ベクターはDHFR遺伝子も含み、これによって、メトトレキセートによる選別/増幅法を用いて、該ベクターでトランスフェクションしたCHO細胞の選別が可能になる。選別した形質転換宿主細胞を培養して、該抗体の重鎖および軽鎖を発現可能にし、培養培地から該抗体を回収する。標準的な分子生物学的技法を用いて、該組み換え発現ベクターを調製し、該宿主細胞をトランスフェクションし、形質転換体を選別し、その宿主細胞を培養し、培養培地から該抗体を回収する。例えば、いくつかの抗体は、プロテインAまたはプロテインG結合マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって単離することができる。
Fcドメインを含む抗体の場合には、抗体産生系によって、Fc領域がグリコシル化されている抗体が合成されるのが好ましい。例えば、IgG分子のFcドメインは、CH2ドメイン中のアスパラギン297でグリコシル化する。このアスパラギンは、二分岐型オリゴ糖で修飾するための部位である。このグリコシル化は、Fcγ受容体と補体C1qによって媒介されるエフェクター機能に必要であることが証明されている(Burton and Woof(1992)Adv.Immunol.51:1−84、Jefferis et al.(1998)Immunol.Rev.163:59−76)。1つの実施形態では、該Fcドメインは、アスパラギン297に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳類発現系で産生させる。抗体のFcドメインまたは他の領域は、他の真核生物翻訳後修飾体を含むこともできる。
また、抗体は、トランスジェニック動物によって産生させることもできる。例えば、米国特許第5,849,992号には、トランスジェニック動物の乳腺内で抗体を発現させる方法が記載されている。乳特異的プロモーターと、目的の抗体および分泌のためのシグナル配列をコードする核酸とを含むトランスジーンを構築する。このようなトランスジェニック哺乳類の雌が産生した乳汁は、分泌した乳汁の中に、目的の抗体を含む。この抗体は、該乳汁から精製するか、または、いくつかの用途では直接使用する。また、動物は、本明細書に記載されている核酸の1つもしくは複数の核酸を含むように準備する。
特性付け
抗体の結合特性は、いずれかの標準的な方法、例えば、BIACORE(商標)解析、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、X線結晶構造解析、配列解析、および走査型突然変異誘発といった方法のうちの1つによって測定できる。抗体は、Fn14の1つもしくは複数の活性を促す(例えば、Fn14のシグナル伝達を促す)ことを示す統計的に有意な作用を有することが好ましい。
抗体の結合特性は、いずれかの標準的な方法、例えば、BIACORE(商標)解析、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、X線結晶構造解析、配列解析、および走査型突然変異誘発といった方法のうちの1つによって測定できる。抗体は、Fn14の1つもしくは複数の活性を促す(例えば、Fn14のシグナル伝達を促す)ことを示す統計的に有意な作用を有することが好ましい。
表面プラズモン共鳴法(SPR)
目的のタンパク質と標的(例えばFn14)との結合相互作用は、SRPを用いて解析することができる。SPRまたはBiomolecular Interaction Analysis(BIA)は、いずれの相互作用体も標識しなくても、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。該BIAチップの結合表面において質量変化が起きる(結合が起きたことの指標となる)と、表面付近で光の屈折率に変化が生じる(表面プラズモン共鳴(SPR)の光学現象)。屈折率が変化すると、検出可能な信号が発生し、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定する。SPRを用いる方法は、例えば、米国特許第5,641,640号、Raether(1988)Surface Plasmons Springer Verlag、Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338−2345、Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699−705、およびバイアコア・インターナショナル社(スウェーデン、ウプサラ)の提供するオンライン資料に記載されている。SPRで得た情報を用いて、生体分子の標的への結合に関して、平衡解離定数(Kd)、ならびに、KonおよびKoffを含む速度パラメーターを正確かつ定量的に測定することができる。
目的のタンパク質と標的(例えばFn14)との結合相互作用は、SRPを用いて解析することができる。SPRまたはBiomolecular Interaction Analysis(BIA)は、いずれの相互作用体も標識しなくても、リアルタイムで生体特異的相互作用を検出する。該BIAチップの結合表面において質量変化が起きる(結合が起きたことの指標となる)と、表面付近で光の屈折率に変化が生じる(表面プラズモン共鳴(SPR)の光学現象)。屈折率が変化すると、検出可能な信号が発生し、これを生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定する。SPRを用いる方法は、例えば、米国特許第5,641,640号、Raether(1988)Surface Plasmons Springer Verlag、Sjolander and Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63:2338−2345、Szabo et al.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5:699−705、およびバイアコア・インターナショナル社(スウェーデン、ウプサラ)の提供するオンライン資料に記載されている。SPRで得た情報を用いて、生体分子の標的への結合に関して、平衡解離定数(Kd)、ならびに、KonおよびKoffを含む速度パラメーターを正確かつ定量的に測定することができる。
また、バイアコアのクロマトグラフィー技法(Pharmacia BIAtechnology Handbook,“EpitopeMapping”,Section 6.3.2,(May 1994)を参照。Johne et al.(1993)J.Immunol.Methods,160:191−198も参照されたい)を用いて、Fn14(例えばヒトFn14)への結合をめぐって相互に競合し合う様々な抗体の能力を評価することによって、エピトープを直接マッピングすることもできる。例えばウエスタンブロットおよび免疫沈降アッセイで抗体を評価するための更なる総合的な手引きは、Antibodies:A Laboratory Manual,ed.by Harlow and Lane,Cold Spring Harbor press(1988))で見出すことができる。
アゴニスト抗体
Fn14に結合する抗体を同定したら、それらの抗体がFn14のアゴニストであるかを判定する目的で、抗体をアッセイすることができる。抗Fn14抗体が、Fn14のシグナル伝達の下流作用を増大または活性化する(例えば、天然のリガンド(例えばTWEAK)によるFn14への結合部よりも下流のイベントを増大または活性化する)か、または、天然のリガンド(例えばTWEAK)のFn14への結合によって生じる作用を模倣する能力について、抗Fn14抗体を評価することができる。同タイプの作用が生じる限りは、上記の模倣は、天然リガンドの作用と同程度であることも、天然リガンド作用と多少の程度の差があることもできる。
Fn14に結合する抗体を同定したら、それらの抗体がFn14のアゴニストであるかを判定する目的で、抗体をアッセイすることができる。抗Fn14抗体が、Fn14のシグナル伝達の下流作用を増大または活性化する(例えば、天然のリガンド(例えばTWEAK)によるFn14への結合部よりも下流のイベントを増大または活性化する)か、または、天然のリガンド(例えばTWEAK)のFn14への結合によって生じる作用を模倣する能力について、抗Fn14抗体を評価することができる。同タイプの作用が生じる限りは、上記の模倣は、天然リガンドの作用と同程度であることも、天然リガンド作用と多少の程度の差があることもできる。
例えば、Fn14発現細胞(例えば、結腸癌細胞WiDrのような癌細胞)の細胞殺滅を誘発または増大する能力について、抗体を評価することができる。別の実施形態では、Fn14発現細胞(例えばA375細胞)でのIL−8の分泌を誘発または増大する能力、NF−κB p52および/または細胞周期阻害因子p21 Wafl/Ciplの発現またはタンパク質レベルを誘発または増加させる能力について、抗体を評価する。
本明細書に記載されているように癌を治療する目的で、マウスまたはヒト化P4A8の活性と同程度の活性を有する抗体、例えば、同じ量で、マウスまたはヒト化P4A8が生む作用の少なくとも約50%、75%、80%、90%、95%、97%、98%、または99%の作用を生む抗体を用いてよい。例えば、癌を治療する目的で、P4A8によって産生されるIL−8の量の少なくとも約50%の量のIL−8の産生を誘発する抗Fn14抗体、P4A8の少なくとも50%の有効性で細胞殺滅を誘発する抗体、および、P4A8によって産生される量の少なくとも約50%の量でのNK−κB p52またはp21の発現を誘発する抗体をそれぞれ用いることができる。当然ながら、P4A8または本明細書に記載されているほかの抗体の活性よりも強力な活性を有する抗体も、本発明に包含される。
寄託
モノクローナル抗体1.P4A8.3C7(P4A8)、モノクローナル抗体1.P3G5.1E4(P3G5)、およびモノクローナル抗体1.P2D3.3D5(P2D3)を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、2009年4月7日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託されたものであり、それらの受託番号は、PTA−9947(P4A8)、PTA−9949(P3G5)、およびPTA−9948(P2D3)である。寄託物の状態が原因で、寄託機関が、本明細書に基づいて発行される特許の存続期間の満了前に、請求に応じてサンプルを提供できない場合には、出願人は、その寄託物を差し替える義務を認める。また、出願人は、当該寄託物が一般に公開されることになる当該特許の発行について、ATCCに通知する責任も認める。当該特許の発行前に、米国特許法施行規則第1.14条、および米国特許法第112条の条項に基づき、特許庁長官に当該寄託物が入手可能となる。
モノクローナル抗体1.P4A8.3C7(P4A8)、モノクローナル抗体1.P3G5.1E4(P3G5)、およびモノクローナル抗体1.P2D3.3D5(P2D3)を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、2009年4月7日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託されたものであり、それらの受託番号は、PTA−9947(P4A8)、PTA−9949(P3G5)、およびPTA−9948(P2D3)である。寄託物の状態が原因で、寄託機関が、本明細書に基づいて発行される特許の存続期間の満了前に、請求に応じてサンプルを提供できない場合には、出願人は、その寄託物を差し替える義務を認める。また、出願人は、当該寄託物が一般に公開されることになる当該特許の発行について、ATCCに通知する責任も認める。当該特許の発行前に、米国特許法施行規則第1.14条、および米国特許法第112条の条項に基づき、特許庁長官に当該寄託物が入手可能となる。
エフェクター機能を低下させた抗体
抗体および抗体−抗原複合体と、免疫系の細胞との相互作用は、様々な応答(本明細書ではエフェクター機能という)を引き起こす。IgG抗体は、細胞表面のFcγ受容体ファミリーのメンバーおよび補体系のC1qに結合することによって、免疫系のエフェクター経路を活性化する。クラスター化した抗体によるエフェクタータンパク質のライゲーションによって、炎症性サイトカインの放出、抗原産生の調節、エンドサイトーシス、および細胞殺滅を含む様々な応答が生じる。いくつかの臨床用途では、これらの応答は、モノクローナル抗体の効能に不可欠である。他の用途では、これらの応答は、炎症および抗原担持細胞の排除などの望ましくない副作用を引き起こす。したがって、本発明はさらに、エフェクター機能を改変させた、例えば低下させたFn14結合タンパク質(抗体を含む)に関する。
抗体および抗体−抗原複合体と、免疫系の細胞との相互作用は、様々な応答(本明細書ではエフェクター機能という)を引き起こす。IgG抗体は、細胞表面のFcγ受容体ファミリーのメンバーおよび補体系のC1qに結合することによって、免疫系のエフェクター経路を活性化する。クラスター化した抗体によるエフェクタータンパク質のライゲーションによって、炎症性サイトカインの放出、抗原産生の調節、エンドサイトーシス、および細胞殺滅を含む様々な応答が生じる。いくつかの臨床用途では、これらの応答は、モノクローナル抗体の効能に不可欠である。他の用途では、これらの応答は、炎症および抗原担持細胞の排除などの望ましくない副作用を引き起こす。したがって、本発明はさらに、エフェクター機能を改変させた、例えば低下させたFn14結合タンパク質(抗体を含む)に関する。
本発明の抗Fn14抗体のエフェクター機能は、多くの既知のアッセイのうちの1つを用いて確定してよい。該抗Fn14抗体のエフェクター機能は、第2の抗Fn14抗体よりも低下している場合がある。いくつかの実施形態では、この第2の抗Fn14抗体は、Fn14に特異的に結合する任意の抗体であってもよい。別の実施形態では、該第2のFn14特異的抗体は、P4A8のような本発明の抗体のどの抗体であってもよい。別の実施形態では、目的の抗Fn14抗体を修飾して、エフェクター機能を低下させた場合には、該第2の抗Fn14抗体は、目的の抗Fn14抗体の未修飾型または親型であってよい。
例示的なエフェクター機能としては、Fc受容体への結合、食作用、アポトーシス、炎症誘発性応答、細胞表面受容体(例えばB細胞受容体BCR)のダウンレギュレーションなどが挙げられる。他のエフェクター機能としては、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ACDD)(これによって、抗体が、細胞障害性T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、またはマクロファージ上のFc受容体に結合して、細胞死をもたらす)、および補体依存性細胞毒性(CDC)(補体カスケードの活性化によって誘導される細胞死)が挙げられる(Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203−234(1997)、Ward and Ghetie,Therapeutic Immunol.2:77−94(1995)、およびRavetech and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457−492(1991)で概説されている)。このようなエフェクター機能には一般に、Fc領域が結合ドメイン(例えば抗体可変ドメイン)と組み合わされていることが必要であり、このエフェクター機能は、当技術分野において既知である標準的なアッセイを用いて評価することができる(例えば、国際公開第05/018572号、国際公開第05/003175号、および米国特許第6,242,195号を参照されたい)。
エフェクター機能は、Fcドメインが欠損した抗体断片、例えばFab、Fab’2、または単鎖Fvを用いることによって回避することができる。代替策は、FcγRIに結合するが、C1qならびにFCγRIIおよびFcγRIIIには十分には結合しないIgG4サブタイプ抗体を用いることであった。IgG2サブタイプも、Fc受容体への結合性が低いが、FcγRIIaのアロタイプH131と、C1qへの有意な結合性を保持している。したがって、すべてのFc受容体およびC1qへの結合を排除するには、Fc配列のさらなる変更が必要である。
ADCCを含むいくつかの抗体エフェクター機能は、抗体のFc領域に結合するFc受容体(FcR)によって媒介される。抗体の特定のFcRに対する親和性、およびその結果、その抗体によって媒介されるエフェクター活性は、抗体のFc領域および/または定常領域のアミノ酸配列および/または翻訳後修飾体を改変することによって調節できる。
FcRは、免疫グロブリンのアイソタイプに対する特異性によって定義される。すなわち、IgG抗体のFc受容体はFcγR、IgEのFc受容体はFcεR、IgAのFc受容体はFcαRなどという。FcγRでは、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)という3つのサブクラスが同定されている。FcγRIIとFcγRIIIにはいずれも、FcγRIIA(CD32)およびFcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)およびFcγRIIIB(CD16b)という2つのタイプがある。FcγRの各サブクラスは、2つまたは3つの遺伝子によってコードされると共に、選択的RNAスプライシングによって、多数の転写産物が生じるため、FcγRアイソフォームに広範な多様性が存在する。例えば、FcγRII(CD32)には、IIa、IIb1、IIb3、およびIIcというアイソフォームが含まれる。
ヒト抗体とマウス抗体上にあるFcγR結合部位は、233〜239番目の残基(KabatらのEUインデックス番号、Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)、Woof et al.Molec.Immunol.23:319−330(1986)、Duncan et al.Nature 332:563(1988)、Canfield Morrison,J Exp.Med.173:1483−1491(1991)、Chappel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA 88:9036−9040(1991))からなるいわゆる「ヒンジ領域下流」にすでにマッピングされている。233〜239番目の残基のうち、結合に関与すると考えられるものとしては、P238およびS239が挙げられる。FcγRへの結合に関与すると考えられるものとして既に挙げられている他の領域は、ヒトFcγRIに対するG316〜K338(ヒトIgG)(配列比較のみによるものであり、置換変異体の評価は行われていない)(Woof et al.Molec Immunol.23:319−330)(1986))、ヒトFcγRIIIに対するK274〜R301(ヒトIgG1)(ペプチドベース)(Sarmay et al.Molec.Immunol.21:43−51(1984))、およびヒトFcγRIIIに対するY407〜R416(ヒトIgG)(ペプチドベース)(Gergely et al.Biochem.Soc.Trans.12:739−743(1984)、およびShields et al.J Biol Chem 276:6591−6604(2001)、Lazar GA et al.Proc Natl Acad Sci 103:4005−4010(2006)。FcRへの結合に関与するアミノ酸残基の上記および他のストレッチまたは領域は、Ig−FcR複合体の結晶構造を調べれば、当業者には明らかであろう(例えば、Sondermann et al.2000 Nature 406(6793):267−33、およびSondermann et al.2002 Biochem Soc Trans.30(4):481−6を参照されたい)。したがって、本発明の抗Fn14抗体は、上記の残基のちの1つもしくは複数の残基を修飾させたものを含む。
mAbのエフェクター機能を低下させるための他の既知のアプローチとしては、エフェクター結合相互作用に関与する、mAb表面上のアミノ酸を突然変異させること(Lund,J., et al.(1991)J Immunol.147(8):2657−62、Shields,R.L.et al.(2001)J Biol.Chem.276(9):6591−604、および、異なるサブタイプ配列セグメントの組み合わせ(例えば、IgG2とIgG4の組み合わせ)を用いて、いずれかのサブタイプ単独の場合よりも、Fcγ受容体への結合を大きく低下させること(Armour et al.,Eur.J.Immunol.(1999)29:2613−1624、Mol.Immunol.40(2003)585−593)が挙げられる。例えば、エフェクター機能を低下させる手段として、N結合型グリコシル化部位を除去することができる。
当技術分野では、一部またはすべてのFc受容体サブタイプに対する親和性(したがって、エフェクター機能)が改変および/または低下された多数のFc変異体が知られている。例えば、米国特許出願公開第2007/0224188号、米国特許出願公開第2007/0148171号、米国特許出願公開第2007/0048300号、米国特許出願公開第2007/0041966号、米国特許出願公開第2007/0009523号、米国特許出願公開第2007/0036799号、米国特許出願公開第2006/0275283号、米国特許出願公開第2006/0235208号、米国特許出願公開第2006/0193856号、米国特許出願公開第2006/0160996号、米国特許出願公開第2006/0134105号、米国特許出願公開第2006/0024298号、米国特許出願公開第2005/0244403号、米国特許出願公開第2005/0233382号、米国特許出願公開第2005/0215768号、米国特許出願公開第2005/0118174号、米国特許出願公開第2005/0054832号、米国特許出願公開第2004/0228856号、米国特許出願公開第2004/132101号、米国特許出願公開第2003/158389号を参照されたい。また、米国特許第7,183,387号、同第6,737,056号、同第6,538,124号、同第6,528,624号、同第6,194,551号、同第5,624,821号、同第5,648,260号も参照されたい。
CDCでは、抗体−抗原複合体は補体に結合し、その結果、補体カスケードが活性化され、細胞膜傷害複合体が生成される。古典補体経路の活性化は、同系列の抗原に結合している抗体(適切なサブクラスのもの)に、補体系の第1の成分(C1q)が結合することによって開始される。したがって、補体カスケードの活性化は、免疫グロブリンのC1qタンパク質に対する結合親和性によって部分的に調節される。該補体カスケードを活性化するには、抗原性標的に結合されたIgG1、IgG2、またはIgG3のうち少なくとも2つの分子、またはIgMの1つのみの分子にC1qが結合することが必要である(Ward and Ghetie,Therapeutic Immunology 2:77−94(1995)p.80)。補体の活性化を評価するには、例えばGazzano−Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)に記載されているようなCDCアッセイを行ってよい。
IgG分子の様々な残基がC1qへの結合に関与していることが提唱されており、この残基としては、CH2ドメイン上の残基Glu318、Lys320、およびLys322、同じβストランドに極めて近いターン上に位置する331番目のアミノ酸残基、ヒンジ領域下流に位置する残基Lys235およびGly237、ならびに、CH2ドメインのN末端領域に位置する231〜238番目の残基が挙げられる(例えば、Xu et al.,J Immunol.150:152A(Abstract)(1993)、国際公開第94/29351号、Tao et al, J Exp Med.,178:661−667(1993)、Brekke et al.,Eur.J.Immunol,24:2542−47(1994)、Burton et al;Nature,288:338−344(1980)、Duncan and Winter,Nature 332:738−40(1988)、Idusogie et al J Immunol 164:4178−4184(2000、米国特許第5,648,260号、および米国特許第5,624,821号を参照されたい)。IgG1における例として、ヒトIgG1のCH2ドメインのCOOH末端領域中の2つの突然変異、すなわちK322AおよびP329Aは、CDC経路を活性化せず、C1qの結合を100分の1未満に低下させることが示されている(米国特許第6,242,195号)。
したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明で提供するFn14抗体のCDC活性を低下させる目的で、上記の残基の1つもしくは複数の残基を修飾、置換、または除去しても、1つもしくは複数のアミノ酸残基を挿入してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、免疫応答をさらに活性化させる可能性を低下または排除する目的で、当該抗体のエフェクター機能を低下または排除することが望ましい場合がある。また、エフェクター機能を低下させた抗体は、抗体を投与された患者における血栓塞栓イベントのリスクを低下させる場合がある。
特定の実施形態では、本発明は、1つもしくは複数のFcR受容体に対する結合性が低下しているが、補体に結合する能力(例えば、天然の抗Fn14抗体、非変異体の抗Fn14抗体、または親抗Fn14抗体と同程度の能力、または、いくつかの実施形態では、これらよりも低い能力)を保持している抗Fn14抗体を提供する。したがって、本発明の抗Fn14抗体は、補体に結合して、これを活性化することができると同時に、FcR、例えばFcγRIIa(例えば、血小板上に発現するFcγRIIa)への結合性が低下している。FcγRIIa(例えば、血小板上に発現するFcγRIIa)への結合性が低下しているか、または無いが、C1qに結合して、少なくともある程度まで、補体カスケードを活性化できるこのような抗体は、血栓塞栓イベントのリスクを低下させると同時に、望ましいエフェクター機能を保持している可能性がある。代替的な実施形態では、本発明の抗Fn14抗体は、1つもしくは複数のFcRへの結合性が低下しているが、他の1つもしくは複数のFcRに対する結合能は保持している。例えば、米国特許出願公開第2007−0009523号、同第2006−0194290号、同第2005−0233382号、同第2004−0228856号、および同第2004−0191244号を参照されたい。これらの特許出願には、FcRI、FcRII、および/またはFcRIIIへの結合性が低下した抗体を生じさせる様々なアミノ酸修飾、ならびに、1つのFcRへの結合性を向上させるが、別のFcRへの結合性は低下させるアミノ酸置換が記載されている。
したがって、抗Fn14抗体の定常領域に関連するエフェクター機能は、その定常領域、特にFc領域の特性を改変することによって調節することができる。特定の実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Fn14抗体は、エフェクター機能を有する第2の抗体であって、エフェクター機能を媒介する天然の定常領域またはFc領域を含む非変異体抗体、天然抗体、または親抗体であってよい第2の抗体と比較する。特定的な実施形態では、エフェクター機能の調節としては、活性が無効にされるか、または完全に存在しない状態が挙げられる。
天然配列のFcまたは定常領域は、天然に存在するFcまたは定常鎖領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。相対的なエフェクター機能を評価する目的で用いるコントロール分子は、試験抗体または変異抗体が含むFc領域と同じタイプ/サブタイプのFc領域を含むのが好ましい。変異体であるかまたは改変されたFcまたは定常領域は、少なくとも1つのアミノ酸修飾(例えば、翻訳後修飾、アミノ酸の置換、挿入、または欠失など)が原因で、天然配列の重鎖領域の配列とは異なるアミノ酸配列を含む。したがって、該変異定常領域は、例えばグリコシル化パターンの改変を含む翻訳後修飾の改変をもたらす1つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含んでよい。親抗体または親Fc領域は、例えば、エフェクター機能を改変した、例えば低下させた定常領域(すなわちFc)を構築する目的で用いられる正常なエフェクター機能を有する変異体である。
エフェクター機能を改変した(例えば、低下させたか、または排除した)抗体は、変異定常領域、Fc領域、または重鎖領域を有する抗体を遺伝子工学技術で作るか、または産生させることによって生成してよい。組み換えDNA技術、ならびに/または、細胞の培養および発現条件を用いて、機能および/または活性が改変された抗体を産生させてよい。例えば、組み換えDNA技術を用いて、エフェクター機能を含む抗体機能に影響を及ぼす領域(例えば、Fc領域または定常領域など)に、1つもしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を遺伝子工学技術で行ってよい。あるいは、例えばグリコシル化パターン(下記を参照されたい)のような翻訳後修飾の変更は、抗体を産生する宿主細胞ならびに細胞の培養条件および発現条件を操作することによって実現できる。
アミノ酸置換のようなアミノ酸の改変によって、抗原結合親和性に影響を及ぼすことなく、本発明の抗Fn14抗体のエフェクター機能を改変することができる。例えば、上記のアミノ酸置換(例えば、Glu318、Kys320、Lys332、Lys235、Gly237、K332、およびP329)を用いて、エフェクター機能を低下させた抗体を生成できる。
別の実施形態では、アミノ酸置換は、重鎖定常領域の234番目、235番目、236番目、237番目、297番目、318番目、320番目、および322番目のアミノ酸残基のうちの1つもしくは複数のアミノ酸残基に対して行ってよい(米国特許第5,624,821号、および米国特許第5,648,260号を参照されたい)。このような置換によって、エフェクター機能を改変する一方で、抗原結合活性は保持することができる。234番目、235番目、236番目、および237番目のアミノ酸のうちの1つもしくは複数のアミノ酸での改変によって、非修飾抗体または非変異抗体と比べて、FcγRI受容体に対するFc領域の結合親和性を低下させることができる。234番目、236番目、および/または237番目のアミノ酸残基は、例えばアラニンで置換してよく、235番目のアミノ酸残基は、例えばグルタミンで置換してよい。別の実施形態では、抗Fn14 IgG1抗体は、234位のLeuをAlaで置換した基、235位のLeuをGluで置換した基、および237位のGlyをAlaで置換した基を含んでよい。
これに加えて、またはこの代わりに、318番目、320番目、および322番目のFcアミノ酸残基を改変してもよい。これらのアミノ酸残基は、マウスIgGおよびヒトIgGにおいて高度に保存されているが、これらのアミノ酸残基は、補体の結合を媒介する。これらのアミノ酸残基を改変すると、C1q結合性が低下するが、抗原結合性、プロテインA結合性、または、Fcがマウスマクロファージに結合する能力は改変されないことが示されている。
別の実施形態では、本発明の抗Fn14抗体は、エフェクター機能を低下または排除する置換基を含む免疫グロブリンIgG4である。本発明の抗Fn14抗体のIgG4 Fc部分は、233番目の残基においてグルタミン酸をプロリンで置換した基、234番目の残基においてフェニルアラニンをアラニンまたはバリンで置換した基、および235番目の残基においてロイシンをアラニンまたはグルタミン酸で置換した基(上記のEUインデックス番号、Kabat,E.A.et al.(1991))のうちの1つもしくは複数の置換した基を含んでよい。さらに、297番目の残基(EUインデックス番号)においてAsnをAlaで置換することによって、IgG4 Fc領域のN結合型グリコシル化部位を除去すると、エフェクター機能がさらに低下すると共に、存在し得るすべての残りのエフェクター活性が排除される場合がある。エフェクター機能を低下させた別の例示的なIgG4突然変異体は、重鎖定常領域中に突然変異S228PおよびL235E(突然変異PE)を含む、IgG4サブタイプの変異体である。この突然変異の結果、エフェクター機能が低下する。米国特許第5,624,824号、および米国特許第5,648,260号を参照されたい。IgG4の態様において、エフェクター機能を低下させる別の例示的な突然変異は、本明細書に記載されているように、S22BP/T229Aである。
定常領域における他の例示的なアミノ酸配列の変化としては、Bluestoneらによって説明されている突然変異Ala−Alaが挙げられるが、これに限定されない(国際公開第94/28027号、および国際公開第98/47531号を参照されたい。また、Xu et al.2000 Cell Immunol 200;16−28も参照されたい)。したがって、特定の実施形態では、突然変異Ala−Alaを含め、定常領域内に突然変異を有する抗Fn14抗体を用いて、エフェクター機能を低下または無効化してよい。これらの実施形態によれば、抗Fn14抗体の定常領域は、234位におけるアラニンへの突然変異、または235位におけるアラニンへの突然変異を含む。これに加えて、抗Fn14抗体の定常領域は、二重突然変異、すなわち、234位におけるアラニンへの突然変異と、235位におけるアラニンへの第2の突然変異を含んでもよい。
1つの実施形態では、抗Fn14抗体は、IgG4のフレームワークであって、突然変異Ala−Alaが、234位におけるフェニルアラニンからアラニンへの突然変異、および/または235位におけるロイシンからアラニンへの突然変異を表すことになるフレームワークを含む。別の実施形態では、該抗Fn14抗体は、IgG1のフレームワークであって、突然変異Ala−Alaが、234位におけるロイシンからアラニンへの突然変異、および/または235位におけるロイシンからアラニンへの突然変異を表すことになるフレームワークを含む。この代わりに、またはこれに加えて、抗Fn14抗体は、CH2ドメイン中の点突然変異K322Aを含む他の突然変異を有してもよい(Hezarech et al.2001 J Virol.75:12161−8)。
他の例示的なアミノ酸置換基は、国際公開第94/29351号(この特許は参照により、その全体が本明細書に組み込まれる)に記載されており、この特許には、抗体がFcRIに結合する能力を改変することによって、抗体がC1qに結合する能力を低下させ、その結果、抗体が補体を固定する能力を低下させる突然変異をCH2ドメインのN末端領域中に有する抗体が列挙されている。IgG2のCH2の上方領域の突然変異(この突然変異によって、FcRの結合がより低下する)について記載しているCole et al.(J.Immunol.(1997)159:3613−3621)も参照されたい。
アミノ酸置換基を含む上記の抗体変異体のいずれかを生成する方法は、当技術分野において周知である。これらの方法としては、部位特異的(オリゴヌクレオチド媒介性)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、カセット突然変異誘発によって抗体または抗体の少なくとも定常領域をコードする調製DNA分子を調製することが挙げられるが、これらに限定されない。
部位特異的変異誘発は、当技術分野において周知である(例えば、Carter et al.Nucleic Acids Res.13:4431−4443(1985)、およびKunkel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488(1987)を参照されたい)。
また、PCR突然変異誘発は、出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作製するのにも適している。Higuchi,in PCR Protocols,pp.177−183(Academic Press,1990)、およびVallette et al.,Nuc.Acids Res.17:723−733(1989)を参照されたい。配列変異体を調製する別の方法であるカセット突然変異誘発は、Wells et al.,Gene 34:315−323(1985)によって説明されている技法に基づいている。
本発明の別の実施形態は、エフェクター機能を低下させた抗Fn14抗体であって、抗体のFc領域またはその一部が、エフェクター誘発活性が自然に低下したFc領域(またはその一部)と置換されている抗Fn14抗体に関する。例えば、ヒトIgG4の定常領域は、補体活性化能が低いかまたは無い。さらに、種々のIgG分子は、FcRに対する結合親和性が異なり、この原因は少なくとも部分的には、IgGのヒンジ領域の長さと柔軟性が異なる(IgG3>IgG1>IgG4>IgG2の順に減少する)ことにある場合がある。例えば、IgG4は、RcγRIIaに対する結合性が低いか、または結合性がない。キメラ分子およびキメラ定常領域の例については、例えば、Gillies et al.(Cancer Res.1999,59:2159−2166)、およびMueller et al.(Mol.Immunol.1997,34:441−452)を参照されたい。
また、本発明は、Fc領域がまったくないエフェクター機能を低下させた抗Fn14抗体にも関する。このような抗体は、本発明の抗体誘導体および抗原結合断片と称してよい。このような誘導体および断片は、非抗体タンパク質配列または非タンパク質構造体、特に、動物、例えばヒトの患者に投与したときに、送達および/またはバイオアベイラビリティを促進するように設計された構造体に融合できる(下記を参照されたい)。
上述のように、ヒンジ領域内の変更も、エフェクター機能に影響を及ぼす。例えば、ヒンジ領域の欠失によって、Fc受容体に対する親和性が低下する場合があると共に、補体活性化能が低下する場合がある(Klein et al.1981 PNAS USA 78:524−528)。したがって、本開示は、ヒンジ領域に改変部を有する抗体にも関する。
特定的な実施形態では、補体依存性細胞毒性(CDC)を阻害する目的で、本発明の抗体を修飾してよい。CDC活性の調節は、抗体のFc領域に1つもしくは複数のアミノ酸の置換、挿入、または欠失を導入することによって行ってよい(例えば、米国特許第6,194,551号、および米国特許第6,242,195号を参照されたい)。この代わりに、またはこれに加えて、システイン残基をFc領域に導入し、それによって、Fc領域に鎖間ジスルフィド結合を形成できる。このようにして生成したホモ二量体抗体は、インターナリゼーション能が向上もしくは低下しているか、および/または、補体媒介性細胞殺滅能が向上もしくは低下している可能性がある。Caron et al.,J Exp Med.176:1191−1195(1992)、Shopes,B.J.Immunol.148:2918−2922(1992)、国際公開第99/51642号、Duncan&Winter Nature 322:734−40(1998)、米国特許第5,648,260号、米国特許第5,624,821号、および国際公開第94/29351号を参照されたい。
さらに、エフェクター機能は、抗体の結合親和性に応じて変わる場合のあることが分かる。例えば、親和性の高い抗体は、相対的に親和性の低い抗体と比べて、補体系を活性化する効率が高い場合がある(Marzocchi−Machado et al.1999 Immunol Invest 28:89−101)。したがって、(例えば、1つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失などの方法によって抗体の可変領域を変更することによって)抗体を改変して、その抗体の抗原に対する結合親和性が低下するようにしてもよい。結合親和性の低い抗体は、例えば、ADCCおよび/またはCDCが低下しているなど、エフェクター機能が低下している場合がある。
エフェクター機能が低下した本発明の抗Fn14抗体としては、抗Fn14親抗体または抗Fn14非変異抗体よりも、1つもしくは複数のFc受容体(FcR)に対する結合親和性が低下した抗体が挙げられる。したがって、FcRに対する結合親和性が低下した抗Fn14抗体としては、抗Fn14親抗体または抗Fn14非変異抗体と比べて、1つもしくは複数のFc受容体に対する結合親和性が1.5分の1、2分の1、2.5分の1、3分の1、4分の1、もしくは5分の1、またはそれ以下に低下した抗Fn14抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Fn14抗体は、親抗体または非変異抗体の約10分の1の親和性で、FcRに結合する。別の実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Fn14抗体は、親抗体または非変異抗体の約15分の1の親和性、または約20分の1の親和性で、FcRに結合する。該FcR受容体は、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII、ならびにそれらのアイソフォーム、かつ、FcεR、FcμRR、FcδR、および/またはFcαRのうちの1つもしくは複数の受容体であってよい。特定的な実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Fn14抗体は、FcγRIIaに対する結合親和性が1.5分の1、2分の1、2.5分の1、3分の1、4分の1、もしくは5分の1、またはそれ以下に低下している。
したがって、特定の実施形態では、本発明の抗Fn14抗体は、第2の抗Fn14抗体よりも、補体タンパク質への結合性が低い。特定の実施形態では、本発明の抗Fn14抗体は、結合性が第2の抗Fn抗体の約1.5分の1以下、約2分の1以下、約3分の1以下、約4分の1以下、約5分の1以下、約6分の1以下、約7分の1以下、約8分の1以下、約9分の1以下、約10分の1以下、または約15分の1以下である。
本発明の特定の実施形態は、配列番号2のCDR−H1、配列番号2のCDR−H2、および配列番号2のCDR−H3から選択された1つもしくは複数の重鎖CDR配列を含む抗Fn14抗体であって、天然または親のFc領域よりも低いエフェクター機能をもたらす変異Fc領域をさらに含む抗体に関する。さらなる実施形態では、該抗Fn14抗体は、上記のCDRのうちの少なくとも2つを含み、別の実施形態では、該抗体は、3つのすべての重鎖CDR配列を含む。
本発明の別の実施形態は、配列番号5のCDR−L1、配列番号5のCDR−L2、および配列番号5のCDR−L3から選択された1つもしくは複数の軽鎖CDR配列を含む抗Fn14抗体であって、天然または親のFc領域よりも低いエフェクター機能をもたらす変異Fc領域をさらに含む抗体に関する。さらなる実施形態では、該抗Fn14抗体は、上記の軽鎖CDRのうち少なくとも2つを含み、別の実施形態では、該抗体は、3つのすべての軽鎖CDR配列を含む。
本発明のさらなる実施形態では、エフェクター機能を低下させた抗Fn14抗体は、配列番号5の3つのすべての軽鎖CDR配列を含むと共に、配列番号2の3つのすべての重鎖CDR配列を含む。
別の実施形態では、本発明は、VL配列が配列番号9の1〜111番目のアミノ酸である抗Fn抗体であって、天然または親のFc領域よりも低いエフェクター機能をもたらす変異Fc領域をさらに含む抗体に関する。
別の実施形態では、本発明は、VH配列が配列番号8の1〜121番目のアミノ酸である抗Fn抗体であって、天然または親のFc領域よりも低いエフェクター機能をもたらす変異Fc領域をさらに含む抗体に関する。
グリコシル化を改変した抗Fn14抗体
グリカンを除去すると、すべての種のFc受容体ファミリーのすべてのメンバーへの結合性を大きく低下させる構造変化が生じる。抗Fn14抗体を含むグリコシル化抗体では、Fc二量体のCH2ドメイン中のN結合型保存部位に結合しているグリカン(オリゴ糖)は、CH2ドメインの間に包み込まれており、糖残基は、対向するCH2ドメイン上の特定のアミノ酸残基と接触している。それぞれ異なるグリコシル化パターンは、抗体のそれぞれ異なる生物学的特性と関連付けられている(Jefferis and Lund,1997,Chem.Immunol.,65:111−128、Wright and Morrison,1997,Trends Biotechnol,15:26−32)。ある種の特定のグリコフォームは、潜在的に有益な生物学的特性をもたらす。グリカンの喪失によって、ドメイン間の間隔が変わると共に、相互に対する可動性が増大し、グリカンの喪失は、Fc受容体ファミリーのすべてのメンバーの結合に対する阻害作用を及ぼすと予想される。例えば、様々なグリコシル化抗体を用いたインビトロ試験によって、CH2のグリカンを除去するとFc構造が変化し、その結果、Fc受容体と補体タンパク質C1Qへの抗体の結合性が大きく低下することが実証されている。エフェクター機能を低下させる別の既知のアプローチは、FcのCH2ドメインの297位(EUインデックス番号)のN結合型グリカンの産生を阻害するか、またはこのグリカンを除去することである(Nose et al,1983 PNAS 80:6632、Leatherbarrow et al.,1985 Mol.Immunol.22:407、Tao et al.,1989 J.Immunol.143:2595、Lund et al.,1990 Mol.Immunol.27:1145、Dorai et al.,1991 Hybridoma 10:211、Hand et al.,1992 Cancer Immunol.Immunother.35:165、Leader et al.,1991 Immunology 72:481、Pound et al.,1993 Mol.Immunol.30:233、Boyd et al.,1995 Mol.Immunol.32:1311)。また、様々なグリコフォームが、薬物動態、薬力学、受容体相互作用、および組織特異的ターゲッティングを含め、治療物質の特性に大きな影響を及ぼすことができることも知られている(Graddis et al.,2002,Curr Pharm Biotechnol.3:285−297)。特に、抗体では、オリゴ糖の構造は、抗体のエフェクター機能(例えば、CDCを誘発する補体複合体C1への結合、およびADCC経路の調節を担うFcγR受容体への結合)に加えて、プロテアーゼ耐性、FcRn受容体によって媒介される抗体の血中半減期、食作用、および抗体フィードバックに関連する特性に影響を及ぼすことができる(Nose and Wigzell,1983、Leatherbarrow and Dwek,1983、Leatherbarrow et al.,1985、Walker et al., 1989、Carter et al.,1992,PNAS,89:4285−4289)。
グリカンを除去すると、すべての種のFc受容体ファミリーのすべてのメンバーへの結合性を大きく低下させる構造変化が生じる。抗Fn14抗体を含むグリコシル化抗体では、Fc二量体のCH2ドメイン中のN結合型保存部位に結合しているグリカン(オリゴ糖)は、CH2ドメインの間に包み込まれており、糖残基は、対向するCH2ドメイン上の特定のアミノ酸残基と接触している。それぞれ異なるグリコシル化パターンは、抗体のそれぞれ異なる生物学的特性と関連付けられている(Jefferis and Lund,1997,Chem.Immunol.,65:111−128、Wright and Morrison,1997,Trends Biotechnol,15:26−32)。ある種の特定のグリコフォームは、潜在的に有益な生物学的特性をもたらす。グリカンの喪失によって、ドメイン間の間隔が変わると共に、相互に対する可動性が増大し、グリカンの喪失は、Fc受容体ファミリーのすべてのメンバーの結合に対する阻害作用を及ぼすと予想される。例えば、様々なグリコシル化抗体を用いたインビトロ試験によって、CH2のグリカンを除去するとFc構造が変化し、その結果、Fc受容体と補体タンパク質C1Qへの抗体の結合性が大きく低下することが実証されている。エフェクター機能を低下させる別の既知のアプローチは、FcのCH2ドメインの297位(EUインデックス番号)のN結合型グリカンの産生を阻害するか、またはこのグリカンを除去することである(Nose et al,1983 PNAS 80:6632、Leatherbarrow et al.,1985 Mol.Immunol.22:407、Tao et al.,1989 J.Immunol.143:2595、Lund et al.,1990 Mol.Immunol.27:1145、Dorai et al.,1991 Hybridoma 10:211、Hand et al.,1992 Cancer Immunol.Immunother.35:165、Leader et al.,1991 Immunology 72:481、Pound et al.,1993 Mol.Immunol.30:233、Boyd et al.,1995 Mol.Immunol.32:1311)。また、様々なグリコフォームが、薬物動態、薬力学、受容体相互作用、および組織特異的ターゲッティングを含め、治療物質の特性に大きな影響を及ぼすことができることも知られている(Graddis et al.,2002,Curr Pharm Biotechnol.3:285−297)。特に、抗体では、オリゴ糖の構造は、抗体のエフェクター機能(例えば、CDCを誘発する補体複合体C1への結合、およびADCC経路の調節を担うFcγR受容体への結合)に加えて、プロテアーゼ耐性、FcRn受容体によって媒介される抗体の血中半減期、食作用、および抗体フィードバックに関連する特性に影響を及ぼすことができる(Nose and Wigzell,1983、Leatherbarrow and Dwek,1983、Leatherbarrow et al.,1985、Walker et al., 1989、Carter et al.,1992,PNAS,89:4285−4289)。
したがって、抗体のエフェクター機能を調節する別の手段としては、抗体の定常領域のグリコシル化を改変することが挙げられる。グリコシル化の改変としては、例えば、グリコシル化残基の数の減少または増加、グリコシル化残基のパターンまたは位置の変更、および、糖構造の変更が挙げられる。ヒトIgG上に存在するオリゴ糖は、エフェクター機能の程度に影響を及ぼす(Raju,T.S.BioProcess International April 2003.44−53)。すなわち、ヒトIgGのオリゴ糖の微小不均一性は、CDCおよびADCCのような生物学的機能、様々なFc受容体への結合性、ならびに、C1qタンパク質への結合性に影響を及ぼすことができる(Wright A.&Morrison SL.TIBTECH 1997,15 26−32、Shields et al.J Biol Chem.2001 276(9):6591−604、Shields et al.J Biol Chem.2002;277(30):26733−40、Shinkawa et al.J Biol Chem.2003 278(5):3466−73、Umana et al.Nat Biotechnol.1999 Feb;17(2):176−80)。例えば、IgGがC1qに結合して、補体カスケードを活性化する能力は、2つのCH2ドメインの間に位置する炭水化物部分(通常はAsn237で固定されている)の有無または修飾に左右される場合がある(Ward and Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77−94(1995))。
Fc含有ポリペプチド、例えばIgG抗体のような抗体のグリコシル化部位は、標準的な技法によって同定できる。グリコシル化部位の同定は、実験によるものであることも、配列解析またはモデリングデータに基づくこともできる。コンセンサスモチーフ、すなわち、様々なグリコシルトランスフェラーゼによって認識されるアミノ酸配列が説明されている。例えば、N結合型グリコシル化モチーフのコンセンサスモチーフは、NXTまたはNXS(Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る)である場合が多い。潜在的なグリコシル化モチーフの位置を特定するためのいくつかのアルゴリズムも説明されている。したがって、抗体またはFc含有断片内の潜在的なグリコシル化部位を同定するには、例えば、センター・フォー・バイオロジカル・シークエンス・アナラシスの提供するウェブサイト(N結合型グリコシル化部位を予測するためのサービスNetNGlycと、O結合型グリコシル化部位を予測するためのサービスNetOGlycを参照されたい)のような利用可能な公開データベースを用いることによって、抗体の配列を調べる。
インビボ研究によって、アグリコシル化抗体のエフェクター機能の低下が確認された。例えば、アグリコシル化抗CD8抗体は、マウスにおいてCD8担持細胞を枯渇させることができず(Issacs,1992 J.Immunol.148:3062)、アグリコシル化抗CD3抗体は、マウスまたはヒトにおいてサイトカイン放出症候群を誘発しない(上記のBoyd,1995、Friend,1999 Ttansplantation 68:1632)。
重要なことに、CH2ドメインのグリカンの除去は、エフェクター機能に対して有意な作用を及ぼすと思われるが、抗体の他の機能的特性と物理的特性は変わらないままである。具体的には、グリカンを除去しても、血中半減期と抗原への結合性に対する作用は全くかほとんどなかったことが示されている(上記のNose,1983、上記のTao,1989、上記のDorai,1991、上記のHand,1992、Hobbs,1992 Mol.Immunol.29:949)。
アグリコシル化アプローチのインビボでの検証が存在するが、アグリコシル化mAbによる残存エフェクター機能が報告されている(例えば、Pound,J.D.et al.(1993)Mol.Immunol.30(3):233−41、Dorai,H.et al.(1991)Hybridoma 10(2):211−7を参照されたい)。Armour et al.には、FcγRIIaおよびFcγRIIbタンパク質への残存結合性が示されている(Eur.J.Immunol.(1999)29:2613−1624、Mol.Immunol.40(2003)585−593)。したがって、エフェクター機能、特に補体活性化能のさらなる低下は、場合によっては確実に活性を完全に無効化すようにするために重要な場合がある。このような理由で、IgG2およびIgG4、ならびにG1/G4ハイブリッドのアグリコシル化形態が、本発明の方法と、エフェクター機能を低下させた本発明の抗体組成物で有用であると想定される。
任意でFc部分の他の有益な特質を維持したまま、本発明の抗Fn14抗体を修飾または改変して、(第2のFn14特異的抗体と比べて、)エフェクター機能を低下させてよい。
したがって、特定の実施形態では、本発明は、エフェクター機能を低下させたアグリコシル化抗Fn14抗体であって、該抗体のFc部分のCH2ドメインのN結合型保存部位が修飾されていることを特徴とする抗体に関する。Fc二量体のCH2ドメインのN結合型保存部位の修飾によって、アグリコシル化抗Fn14抗体を得ることができる。このような修飾の例としては、該Fc二量体のCH2ドメインのN結合型保存部位の突然変異、CH2ドメインのN結合型部位に結合しているグリカンの除去、およびグリコシル化の妨止が挙げられる。例えば、重鎖CH2ドメインの標準的なN結合型Asn部位をGln残基に変更することによって、アグリコシル化抗Fn14抗体を作製できる(例えば国際公開第05/03175号、および米国特許出願公開第2006−0193856号を参照されたい)。
本発明の1つの実施形態では、上記の修飾は、重鎖グリコシル化部位で突然変異させて、その部位でのグリコシル化を妨止するものを含む。したがって、本発明の1つの実施形態では、該アグリコシル化抗Fn14抗体は、重鎖グリコシル化部位の突然変異、すなわちN298Q(KabatのEUインデックス番号を用いるとN297)を突然変異させることによって調製して、適切な宿主細胞内で発現させる。例えば、この突然変異は、アマシャム・ファルマシア・バイオテク(登録商標)(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)社製の独特の部位突然変異誘発キットのためのメーカー推奨のプロトコルに従うことによって実施できる。
この突然変異抗体は、宿主細胞(例えばNSO細胞またはCHO細胞)内で安定的に発現させてから、精製することができる。一例として、精製は、プロテインAクロマトグラフィーとゲルろ過クロマトグラフィーを用いて行うことができる。追加的な発現および精製法を用いてよいことは当業者には明らかである。
本発明の別の実施形態では、アグリコシル化抗Fn14抗体は、エフェクター機能が低下しており、この抗体または抗体誘導体のFc部分のCH2ドメインのN結合型保存部位での修飾は、CH2ドメインのグリカンの除去、すなわち脱グリコシル化を含む。これらのアグリコシル化抗Fn14抗体は、従来の方法によって生成してから、酵素的に脱グリコシル化してもよい。抗体を酵素的に脱グリコシル化する方法は、当業者には周知である(Williams,1973、Winkelhake&Nicolson,1976 J.Biol Chem.251:1704−80)。
本発明の別の実施形態では、脱グリコシル化は、ツニカマイシンのようなグリコシル化阻害剤を含む培地中で抗体を産生する宿主細胞を増殖させることによって実現できる(Nose&Wigzell,1983)。すなわち、上記の修飾は、前記抗体のFc部分のCH2ドメインのN結合型保存部位におけるグリコシル化を低下または防止することである。
本発明の別の実施形態では、組み換えXポリペプチド(またはこのようなポリペプチドを含む細胞もしくは細胞膜)を抗原として用いて、抗Fn14抗体または抗体誘導体を生成してから、その後にこれらを脱グリコシル化してよい。
代替的な実施形態では、本発明のアグリコシル化抗Fn14抗体、またはグリコシル化を低下させた抗Fn14抗体は、Taylor et al.(国際公開第05/18572号および米国特許出願公開第2007−0048300号)に記載されている方法によって製造できる。例えば、1つの実施形態では、抗Fn14アグリコシル化抗体は、第1のアミノ酸残基を改変することによって(例えば、置換、挿入、欠失によって、または、化学修飾によって)製造でき、この場合、改変した第1のアミノ酸残基は、立体障害もしくは帯電のいずれかまたは両方によって、第2の残基のグリコシル化を阻害する。特定の実施形態では、該第1のアミノ酸残基は、アミノ酸置換基によって修飾する。さらなる実施形態では、このアミノ酸置換基は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Asn、Gln、Trp、Pro、Ser、Thr、Tyr、Cys、Met、Asp、Glu、Lys、Arg、およびHisからなる群から選択する。別の実施形態では、該アミノ酸置換基は、非従来型のアミノ酸残基である。該第2のアミノ酸残基は、グリコシル化モチーフ、例えば、アミノ酸配列NXTまたはNXSを含むN結合型グリコシル化モチーフの近くまたは内部にあってよい。1つの実施形態では、Kabatのインデックス番号によれば、該第1のアミノ酸残基は299番目のアミノ酸であり、該第2のアミノ酸残基は297番目のアミノ酸である。例えば、該第1のアミノ酸置換基は、Kabatのインデックス番号によれば、T299A、T299N、T299G、T299Y、T299C、T299H、T299E、T299D、T299K、T299R、T299G、T299I、T299L、T299M、T299F、T299P、T299W、およびT299Vであってよい。特定的な実施形態では、このアミノ酸置換基はT299Cである。
また、本発明の抗体がブロック部分を含むように、本発明の抗体を修飾することによって、エフェクター機能を低下できる。例示的なブロック部分としては、例えば、グリコシダーゼがポリペプチドをグリコシル化する能力をブロックすることによってグリコシル化を低下させるのに十分な立体体積および/または電荷を有する部分が挙げられる。これに加えて、またはこの代わりに、上記のブロック部分は、例えば、Fc領域が受容体または補体タンパク質に結合する能力を阻害することによって、エフェクター機能を低下できる。いくつかの実施形態では、本発明は、変異Fc領域を含むFn14結合タンパク質、例えば抗Fn14抗体であって、その変異Fc領域が、第1のアミノ酸残基とN−グリコシル化部位を含み、この第1のアミノ酸残基を側鎖成分によって修飾して、未修飾の第1のアミノ酸残基よりも増加した立体体積または増大した静電荷をもたらし、それによって、N−グリコシル化部位のグリコシル化レベルを低下させるか、またはその他の形でN−グリコシル化部位のグリコシル化を改変する抗体に関する。これらの実施形態のうちの特定の実施形態では、変異Fc領域が、コントロールの非変異Fc領域よりも低いエフェクター機能をもたらす。さらなる実施形態では、立体体積が増加した側鎖は、Phe、Trp、His、Glu、Gln、Arg、Lys、Met、およびTyrからなる群から選択されたアミノ酸残基の側鎖である。さらに別の実施形態では、静電荷が増大した側鎖成分は、Asp、Glu、Lys、Arg、およびHisからなる群から選択されたアミノ酸残基の側鎖である。
したがって、1つの実施形態では、D、E、K、またはRのような帯電側鎖成分でT299を置換することによって、グリコシル化とFcの結合性を調節することができる。この結果得られる抗体は、望ましくない静電相互作用のせいで、グリコシル化が低下すると共に、Fc受容体に対するFcの結合親和性が低下することになる。
別の実施形態では、アグリコシル化されていると共に、システイン付加体を形成することもできるT299C変異抗体は、対照物であるそのアグリコシル化抗体よりもエフェクター機能(例えばFcγRI結合性)が低い場合がある(例えば国際公開第05/18572号を参照されたい)。したがって、グリコシル化モチーフに近接する第1のアミノ酸を改変することによって、第2のアミノ酸残基での抗体のグリコシル化を阻害することができ、該第1のアミノ酸がシステイン残基である場合、該抗体は、エフェクター機能がさらに低下する場合がある。これに加えて、サブタイプIgG4の抗体のグリコシル化の阻害は、他のサブタイプにおけるアグリコシル化の作用よりも、FcγRI結合性に対して大きな影響を及ぼす場合がある。
追加的な実施形態では、本発明は、グリコシル化を改変した抗Fn14抗体であって、1つもしくは複数のFcR受容体に対する結合性が低下していると共に、任意で、1つもしくは複数のFc受容体および/または補体に対する結合性が向上しているかまたは正常である抗体、例えば、グリコシル化を改変した抗体であって、少なくとも、1つもしくは複数のFc受容体および/または補体に対する結合親和性が、天然のコントロール抗Fn14抗体)と同じまたは同程度である抗体に関する。例えば、グリカン構造体として主にMan5GlcNac2N−グリカンが存在する抗Fn14抗体(例えば、Man5GlcNac2N−グリカン構造体が、Ig組成物の次の主なグリカン構造体よりも少なくとも約5モルパーセント多いレベルで存在する抗体)は、Man5GlcNac2N−グリカン構造体が主なものではない抗Fn14抗体集団よりも、エフェクター機能が改変されている場合がある。主に上記のグリカン構造体を有する抗体は、FcγRIIaおよびFcγRIIbに対する結合性が低下しており、FcγRIIIaおよびFcγRIIIbに対する結合性が向上しており、複合体C1のサブユニットC1qに対する結合性が向上している(米国特許出願公開第2006−0257399号)。上記のグリカン構造体は、主なグリカン構造体である場合にはADCCを増大させ、CDCを増大させ、血中半減期を延長し、B細胞の抗体産生を増加させ、かつマクロファージによる食作用を低下させる。
一般に、糖タンパク質上のグリコシル化構造体は、発現宿主と培養条件によって異なることになる(Raju,TS.BioProcess International April 2003.44−53)。このような相違は、エフェクター機能と薬物動態の両方に変化をもたらすことができる(Israel et al.Immunology.1996;89(4):573−578、Newkirk et al.P.Clin.Exp.1996;106(2):259−64)。例えば、ガラクトシル化は、細胞培養条件によって変化する場合があり、その特定のガラクトースパターンに応じて、いくつかの免疫グロブリン組成物は免疫原性になる場合がある(Patel et al.,1992.Biochem J.285:839−845)。非ヒト哺乳類細胞によって産生された糖タンパク質のオリゴ糖構造体は、ヒト糖タンパク質のオリゴ糖構造体とさらに近似している傾向がある。さらに、タンパク質発現宿主系は、主なIgグリコフォームを発現するように、遺伝子工学技術で作製するかまたは選択するかしても、あるいは、主なグリカン構造体を有する糖タンパク質を自然に産生できる。主なグリコフォームを有する糖タンパク質を産生する遺伝子工学的なタンパク質発現宿主系の例としては、遺伝子ノックアウト/突然変異系(Shields et al.,2002,JBC,277:26733−26740)、遺伝子操作(Umana et al.,1999,Nature Biotech.,17:176−180)、またはこれら両方を組み合わせたものが挙げられる。あるいは、特定の細胞は、主なグリコフォームを自然に発現する(例えば、ニワトリ、ヒト、および雌ウシ)(Raju et al.,2000,Glycobiology,10:477−486)。したがって、当業者は、多くの発現宿主系のうちの少なくとも1つを選択することによって、グリコシル化(例えば、主に1つの特定のグリカン構造体)が改変された抗Fn14抗体または抗体組成物を発現させることができる。本発明の抗Fn14抗体を産生させる目的で用いてよいタンパク質発現宿主系としては、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、細菌細胞などが挙げられる。例えば、米国特許出願公開第2007−0065909号、同第2007−0020725号、および同第2005−0170464号には、細菌細胞内でアグリコシル化免疫グロブリン分子を産生させることが記載されている。さらなる例として、WrightとMorrisonは、グリコシル化が欠損したCHO細胞株内で抗体を産生させ(1994 J Exp Med 180:1087−1096)、この細胞株で産生された抗体が、補体媒介性細胞溶解を行えないことを示した。糖タンパク質を産生させるための、当技術分野で見出される発現宿主系の他の例としては、Rajuの国際公開第99/22764号およびPrestaの国際公開第03/35835号のCHO細胞、Trebak et al.,1999,J.Immunol.Methods,230:59−70のハイブリドーマ細胞、Hsu et al.,1997,JBC,272:9062−970の昆虫細胞、ならびに、Gerngrossらの国際公開第04/74499号の植物細胞が挙げられる。所与の細胞または抽出物が、所与のモチーフのグリコシル化をもたらす限りでは、例えばゲル電気泳動および/または質量分析を用いて、モチーフがグリコシル化されたかを判定ための技術のうち、当該技術分野において認識されている技術を利用することができる。
抗体のグリコシル化部位を改変する追加的な方法は、例えば米国特許第6,350,861号、米国特許第5,714,350号、国際公開第05/18572号、および国際公開第05/03175号に記載されており、これらの方法を用いて、グリコシル化を改変、低下、または消失させた本発明の抗Fn14抗体を産生させることができる。
エフェクター機能を低下させたアグリコシル化抗Fn14抗体は、修飾部を含むか、または機能的部分を含むようにコンジュゲートされてよい抗体であってよい。このような機能的部分としては、ブロック部分(例えばPEG部分、システイン付加体など)、検出可能部分(例えば、蛍光性部分、放射性同位体部分、放射線不透過性部分など。診断的部分を含む)、治療的部分(例えば、細胞毒性剤、抗炎症剤、免疫調節剤、抗感染剤、抗癌剤、抗神経修飾剤、放射性核種など)、および/または、結合部分すなわちベイト(例えば、予め抗体をある腫瘍に向けてから、第2の分子(相補的結合部分すなわちプレイと、上記のような検出可能部分または治療的部分からなる)に結合させる)が挙げられる。
Fn14関連障害
抗Fn14抗体(本明細書に記載されている抗体など)を用いて、Fn14関連障害のような様々な障害を治療することができる。例えば、抗Fn14抗体を用いて、患者の癌、例えば固形腫瘍の癌を治療することができる。抗Fn抗体で治療することができる癌の例としては、結腸癌と乳癌が挙げられる。治療することができる癌のさらに他の例としては、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、二次骨癌、腸癌(結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌)、脳腫瘍、二次脳腫瘍、乳癌、二次乳癌、頸癌、小児癌、内分泌癌、眼癌、胆嚢癌、胃腸癌(例えば胃癌)、咽喉癌(食道癌)、頭頸部癌、カポージ肉腫、腎癌、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝癌、二次肝癌、肺癌(例えばNSCLC)、二次肺癌、二次リンパ節癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮種、骨髄腫、神経内分泌癌、卵巣癌、食道癌、膵癌(膵臓癌)、陰茎癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、脊髄癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、原発不明癌、膣癌、外陰癌、および子宮癌(子宮内膜癌)が挙げられる。
抗Fn14抗体(本明細書に記載されている抗体など)を用いて、Fn14関連障害のような様々な障害を治療することができる。例えば、抗Fn14抗体を用いて、患者の癌、例えば固形腫瘍の癌を治療することができる。抗Fn抗体で治療することができる癌の例としては、結腸癌と乳癌が挙げられる。治療することができる癌のさらに他の例としては、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、二次骨癌、腸癌(結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌)、脳腫瘍、二次脳腫瘍、乳癌、二次乳癌、頸癌、小児癌、内分泌癌、眼癌、胆嚢癌、胃腸癌(例えば胃癌)、咽喉癌(食道癌)、頭頸部癌、カポージ肉腫、腎癌、喉頭癌、白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝癌、二次肝癌、肺癌(例えばNSCLC)、二次肺癌、二次リンパ節癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮種、骨髄腫、神経内分泌癌、卵巣癌、食道癌、膵癌(膵臓癌)、陰茎癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、脊髄癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、原発不明癌、膣癌、外陰癌、および子宮癌(子宮内膜癌)が挙げられる。
治療することができる腫瘍としては、Fn14を発現している腫瘍、例えば、正常な成熟細胞でのFn14発現レベルよりも高いレベルでFn14を発現している腫瘍が挙げられる。
「治療する」という用語は、統計的に有意な程度まで、または当業者にとって検出可能な程度まで、障害と関連する状態、症状、またはパラメーターを改善させるか、または、障害の進行もしくは再燃(障害に起因する二次損傷を含む)を予防するのに有効な量、方式、および/または形態で、本明細書に記載されている組成物を投与することを指す。
いくつかの実施形態では、固形腫瘍を有する患者を、本明細書に記載されている抗Fn抗体で治療すると、その固形腫瘍の寸法が少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%縮小する。
上記の障害の1つを患う危険性があるか、上記の障害の1つと診断されているか、または、上記の障害の1つを有する患者に、総合的な治療効果をもたらす量および期間で、抗Fn14抗体を投与することができる。該抗Fn14抗体は、単独で投与することも(単剤療法)、他の薬剤と組み合わせて投与することも(併用療法)できる。併用療法の場合、投与の量と期間は、例えば相加的または相乗的治療効果をもたらす量と期間であり得る。さらに、抗Fn抗体の投与(第2の薬剤の有無にはかかわらない)は、第1の治療、例えば一時治療としても、すでに施した治療(すなわち、抗Fn抗体による治療以外の治療)に対する応答が不十分な患者に対する第2の治療としても用いることができる。いくつかの実施形態では、抗Fn抗体を別の化学療法剤と併用することができる。いくつかの実施形態では、該併用療法には、2種以上の抗Fn14抗体を用いること、例えば、本明細書に記載されている抗Fn抗体のうちの少なくとも1種を別の抗Fn抗体を併用すること、例えば、本明細書に記載されている抗Fn抗体のうちの2種以上を用いることが含まれる。
特定の実施形態では、抗Fn14抗体を投与される患者は、腫瘍細胞上でFn14が発現している。例えば、正常な成熟細胞でのFn14発現レベルよりも高いレベルでFn14が発現している。特定の実施形態では、抗Fn14抗体を投与される患者は、腫瘍細胞の表面上のFn14発現レベルが検出可能な患者である。腫瘍細胞上のFn14のレベルは、例えば本明細書に記載されている抗体を用いる免疫組織化学またはFACSによって測定できる。
併用療法の特定の実施形態では、望ましくない潜在的毒性作用を最小限に抑えるなどの目的で、抗Fn14抗体療法と組み合わせる療法つまり治療は、正常細胞上でのFn14の発現を有意には誘発しないものである。第2の療法つまり治療が、正常細胞上のFn14のレベルを誘発させる併用療法の特定の実施形態では、第1の療法、すなわち併用する療法を実施した後、Fn14レベルの上昇が本質的に正常に戻った時点で、抗Fn14抗体を投与する。
特定の実施形態では、本明細書に記載されているFn14抗体、例えばFn14アゴニスト抗体で治療する患者は、Fn14アゴニスト抗体によって悪化するか、または悪化する場合のある疾患を有する患者ではない。例えば、特定の実施形態では、Fn14抗体、例えばアゴニスト抗体で治療する患者は、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発硬化、脳卒中、線維症、神経修飾疾患、アルツハイマー病、ALS、全身性エリテマトーデス、または、米国特許第7,169,387号、国際公開第03/086311号、国際公開第2006/088890号、または国際公開第2006/089095号に定められている疾患を有する患者ではない。特定の実施形態では、抗Fn14抗体を投与される患者は、炎症性疾患または自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、腸疾患、狼瘡、クローン病、多発硬化、糖尿病、乾癬、急性移植片対宿主病(GVHD)、膵炎、遅延型過敏症(DTH)を有するか、または患う可能性のある患者ではない。
特定の実施形態では、抗Fn14抗体を投与される患者は、抗炎症治療を受けたか、受けているか、または受ける予定である。例えば、患者は、抗Fn14抗体による治療と同時か、この治療の前、または後に、抗炎症剤で治療してもよい。例示的な抗炎症剤としては、メトトレキセート、TNF−α遮断薬、Tweak遮断薬、疾患修飾抗リウマチ薬(DMARD)、サリチル酸(アスピリン)のような非ステロイド性抗炎症薬、金化合物、ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、ステロイド類、および免疫抑制薬が挙げられる。
特定の実施形態では、方法は、患者の腫瘍細胞上で発現しているFn14のレベルを割り出し、続いて、そのレベルが、正常細胞、例えば、癌細胞と同じタイプまたは系統の正常細胞上でのレベルよりも高い場合には、該患者を抗Fn14抗体で治療し、上記のレベルが正常細胞、例えば、癌細胞と同じタイプまたは系統の正常細胞上でのレベルよりも低いか、または、Fn14のレベルが検出不可能であった場合には、該患者を抗Fn14抗体で治療しないことを含む。
特定の実施形態では、方法は、患者の腫瘍細胞上でFn14が(最低閾値レベルで)発現しているか判定し、続いて、Fn14の発現が(最低閾値レベルで)検出された場合には、該患者を抗Fn14抗体で治療し、Fn14の発現が(最低閾値レベルで)検出されなかった場合には、該患者を抗Fn14抗体で治療しないことを含む。
いくつかの実施形態では、Fn14抗体は、Fn14の発現が検出されない疾患を治療するのにも有用である場合がある。
癌
抗Fn14抗体を用いて、癌、例えば結腸癌または乳癌であると診断されたか、癌を羅患する危険がある患者を治療することができる。この癌は、原発癌、二次癌、または転移癌であり得る。
抗Fn14抗体を用いて、癌、例えば結腸癌または乳癌であると診断されたか、癌を羅患する危険がある患者を治療することができる。この癌は、原発癌、二次癌、または転移癌であり得る。
療法:抗Fn14抗体(本明細書に記載されている抗体など)を単独で、または別の癌療法(標準的な癌療法など)と併用して、癌を治療するか、または、癌発症のリスクを軽減することができる。本明細書に記載されている併用治療に加えて、抗Fn14抗体は、ゲムシタビン(例えば膵癌治療用)、タキソールもしくはトラスツズマブ(例えば乳癌治療用)、イリノテカン、ベバシズマブ、5−フルオロウラシル、もしくはセツキシマブ(例えば結腸癌治療用)、または、トラスツズマブ(例えば胃癌治療用)と併用することができる。
他の癌治療としては、外科的手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、およびモノクローナル抗体療法が挙げられる。Fn14抗体は、これらの治療法のいずれの治療法とも併用することができる。療法の選択は、腫瘍の位置と悪性度分類、および、疾患の病期、ならびに、患者の全身状態に左右される。
体の他の部位を損傷することなく、癌を完全に除去することが治療の目標である。この目標は、外科的手術によって達成できる場合もあるが、癌が微小転移によって隣接組織に浸潤するか、または遠位部位に拡散する傾向によって、外科的手術の効果は限定的である場合が多い。化学療法の効果は、体内の他の組織に対する毒性によって限定される場合が多い。放射線も、正常組織を損傷させることがある。
外科的手術:理論上は、癌は、外科的手術によって完全に除去すれば治癒させることができるが、これは常に可能なわけではない。外科的手術の前に、癌が体内の他の部位に転移していると、通常、完全な外科的切除は不可能である。癌の進行の1つのモデルでは、腫瘍は局所的に増殖してからリンパ節に拡散し、続いて、体の他の部位に拡散する。このモデルを受けて、小型の癌では、手術のような局所限定治療が主流となった。小型の局所腫瘍でさえも転移能があるという認識が大きくなりつつある。
癌の外科的処置の例としては、乳癌での乳房切除、および前立腺癌での前立腺切除が挙げられる。外科的手術の目標は、腫瘍のみの除去、または、器官全体の除去のいずれか一方であり得る。単一の癌細胞は肉眼では見ることができないが、新たな腫瘍に再増殖することができる。
外科的手術は、原発腫瘍の除去に加えて、病期分類を行うのに、例えば、疾患の程度と、領域リンパ節に転移しているか否かとを判定するのに不可欠である場合が多い。病期分類は、予後とアジュバント療法の必要性の主要な決定因子である。
外科的手術は、脊髄圧迫または腸閉塞のような症状を制御するために、待機治療に不可欠である場合もある。
抗Fn14抗体は、外科的手術の前、最中、および/または後に、外科的手術と併用することができる。例えば、抗Fn14抗体は、外科的手術の部位、例えば、腫瘍の切除が行われる区域内および/またはその区域周辺の組織上に局所投与することも、外科的手術を受けた患者が回復期を過ぎた後の療法として投与することもできる。
放射線療法:放射線療法(放射線治療、X線療法、または放射線照射ともいう)は、癌細胞を殺すと共に、腫瘍を縮小させる目的で電離放射線を用いるものである。放射線療法は、外照射療法(EBRT)によって外部から実施することも、近接照射療法によって内部から実施することもできる。放射線療法の作用は、治療が施される領域に限局かつ限定される。放射線療法は、治療が施される区域(「標的組織」)内の細胞を損傷または破壊する。放射線療法の目標は、可能な限り多くの癌細胞を損傷することであると同時に、近隣の正常組織への被害を限定することである。したがって、放射線療法は、何回にも分けて実施して、治療を行っていない間に正常組織が回復できるようにする。
放射線療法を用いて、脳癌、乳癌、頸癌、喉頭癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、子宮癌、または軟部組織肉腫を含むほぼすべてのタイプの固形腫瘍を治療することができる。白血病とリンパ腫を治療する目的でも、放射照射を用いる。各部位に対する放射線量は、各癌型の放射線感受性と、放射線照射によって損傷する場合のある隣接する組織および器官の有無を含む多くの因子によって決まる。
抗Fn14抗体は、例えば放射線治療の前、最中、および/または後に、放射線療法と併用することができる。例えば、抗Fn14抗体は、放射線照射済み/照射中/照射予定の部位に局所投与することができる。
化学療法:化学療法は、癌細胞を破壊することができる薬剤で癌を治療するものである。「化学療法」とは通常、標的療法とは対照的に、急速に分裂する細胞全般に影響を及ぼす細胞毒性薬を指す。化学療法薬は、様々な可能な方法で、細胞分裂、例えば、DNAの複製、または新たに形成された染色体の分離を妨害する。大半の化学療法形態は、急速に分裂する細胞のすべてを標的とし、癌細胞に対して特異的であるわけではないが、正常細胞は通常、DNAの損傷を修復できるが、多くの癌細胞は修復できないことから、ある程度の特異性が得られる場合もある。
癌療法で用いる化学療法剤の例としては、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ(Crisantaspase)、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、5フルオロウラシル(5FU)、ゲムシタビン、Gliadelインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソーマルドキソルビシン、リポソーマルダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが挙げられる。
いくつかの薬剤は、単独よりも併用の方が有効であるので、2種以上の薬剤を同時に投与する場合が多い。併用化学療法として、2種以上の化学療法剤を用いる場合が多い。抗Fn14抗体は、化学療法(例えば1種もしくは複数種の化学療法剤)と併せて、例えば化学療法剤(1種もしくは複数種)の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
標的療法:標的療法は、調節不全のタンパク質または癌細胞の他の同定分子に対して特異的な薬剤を用いることからなる。小分子標的療法薬は一般に、癌細胞中の突然変異したか、過剰発現したか、またはその他の形である重要なタンパク質上の酵素ドメインの阻害剤である。顕著な例は、チロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブとゲフィチニブである。モノクローナル抗体療法は、治療剤が、癌細胞の表面上のタンパク質に特異的に結合する抗体である別の方策である。例としては、抗Fn14抗体、典型的に乳癌に用いられる抗HER2/neu抗体のトラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))、および、典型的に様々なB細胞悪性疾患に用いられる抗CD20抗体のリツキシマブが挙げられる。
標的療法は、細胞表面受容体または腫瘍周辺の羅患細胞外マトリックスに結合することができる「誘導装置」として、少量のペプチドも必要とする場合がある。このペプチド(例えばRGD)に結合している放射性核種は、癌細胞の近くで崩壊すると、最終的には癌細胞を殺滅する。
抗Fn14抗体は、別の標的療法、例えば、本明細書に記載されている標的療法と併せて、その標的療法の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
光線力学療法:光線力学療法(PDT)は、3つの要素からなる癌治療法であり、光線感作物質、組織の酸素、および光(レーザーを用いる場合が多い)を必要とする。PDTは、例えば、基底細胞癌(BCC)または肺癌の治療法として用いることができる。また、PDTは、大きな腫瘍を外科的に除去した後に、残りの悪性組織を除去するのに有用である場合もある。
抗Fn14抗体は、光線力学療法と併せて、例えば光線力学療法の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
免疫療法:癌免疫療法とは、患者自身の免疫系が腫瘍と闘うように促すように設計された多様な一連の治療策を指す。腫瘍に対する免疫応答を生じさせる最新の方法としては、表在性膀胱癌に対するBCG膀胱内注入療法、および、免疫応答を誘発するインターフェロン(例えばインターフェロン−γ)と他のサイトカインを例えば腎細胞癌と黒色腫の患者に用いることが挙げられる。
同種造血幹細胞移植は、免疫療法の1つの形態とみなすことができる。それは、ドナーの免疫細胞が、移植片対腫瘍作用で腫瘍を攻撃することになる場合が多いからである。
抗Fn14抗体は、本明細書に記載されている免疫療法と併せて、例えばその他の免疫療法の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
ホルモン療法:いくつかの癌の増殖は、特定のホルモンを供給またはブロックすることによって阻害することができる。ホルモン感受性腫瘍の一般的な例としては、特定のタイプの乳癌および前立腺癌が挙げられる。エストロゲンまたはテストステロンの除去またはブロックは、重要な追加治療である場合が多い。特定の実施形態では、プロゲストゲンのようなホルモンアゴニストの投与は、治療上有益であることがある。
抗Fn14抗体は、本明細書に記載されているホルモン療法と併せて、例えばそのホルモン療法の使用前、使用中、または使用後に用いることができる。
結腸癌 結腸癌は、大腸(結腸)または直腸(結腸の末端部)で発症する癌である。このような癌は、「結腸直腸癌」と呼ばれる場合もある。最も一般的なタイプは結腸癌腫である。リンパ腫、カルチノイド腫瘍、黒色腫、および肉腫のような他のタイプの結腸癌はまである。
原因:アメリカ癌学会(American Cancer Society)によれば、結腸直腸癌は、米国における癌関連死の代表的原因の1つである。結腸癌の原因は1つではない。ほぼすべての結腸癌は、初めは良性ポリープとして現れ、このポリープがゆっくりと癌へと進化する。患者が、結腸直腸ポリープを有する場合、結腸癌を患うリスクが高くなり、体内のいずれかの癌、結腸癌になった家族、潰瘍性大腸炎、クローン病、乳癌の病歴、および/または特定の遺伝的症候群も、結腸癌発症のリスクを増大させる。
症状:結腸癌の多くの症例では、症状は見られない。しかし、下痢、便秘、または用便習慣のその他の変化、血便、原因不明の貧血、下腹部の腹痛および圧痛、腸閉塞、原因不明の体重減少、ならびに細便といった症状は、結腸癌を示している場合がある。結腸癌は、適切なスクリーニングによって、症状の発現前に検出することができ、症状の発現前であれは、ほぼ治癒可能である。
検査および試験:理学的検査で問題が明らかになるのはまれであるが、腹部腫瘤を感じる場合がある。直腸検査によって、直腸癌患者に、結腸癌ではない腫瘤が見つかる場合がある。結腸直腸癌を診断するための画像検査としては、結腸鏡検査とS状結腸鏡検査が挙げられる。便潜血反応(FOBT)によって、少量の血便が検出される場合があり、これは、結腸癌を示唆していることもある。しかし、この試験は、結腸癌患者では陰性である場合が多い。このため、FOBTは典型的には、結腸鏡検査またはS状結腸鏡検査と共に実施する。全血球算定によって、鉄のレベルが低い貧血の徴候が明らかになる場合がある。
患者が結腸直腸癌を有する場合には、追加の試験、病期分類を行って、当該癌が拡散しているかを調べることになる。病期0期は、腸管の最内層にあるごく初期の癌であり、I期では、癌は結腸の内層にあり、II期では、癌は結腸の筋壁に拡散しており、III期では、癌はリンパ節まで拡散しており、IV期では、癌は他の器官まで拡散している。
治療法:治療法は部分的には、癌の病期によって決まる。一般に、治療法としては、癌細胞を殺滅するための化学療法薬、癌細胞を除去するための外科的手術、および/または、癌組織を破壊するための放射線療法を挙げることができる。さらに、本明細書に記載されている抗Fn14抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法と併用して、結腸癌を治療することができる。病期0期の結腸癌は、多くの場合、結腸鏡検査中に、癌細胞を除去することによって治療してよい。さらに、本明細書に記載されている抗Fn14抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法(例えば外科的手術または化学療法)と併用して、病期0期の結腸癌を治療することができる。病期I期、II期、およびIII期の癌では、癌性である結腸部分を除去するためには、さらに大規模な外科的手術が必要となる。また、本明細書に記載されている抗Fn14抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法(例えば外科的手術、化学療法、または放射線療法)と併用して、病期I期、II期、またはIII期の結腸癌を治療することができる。病期III期の結腸癌を有する患者はほぼ全員、外科的手術後、約6〜8カ月間、化学療法を受けるべきである。病期III期の結腸癌を治療するのに用いる化学療法剤の例は、5−フルオロウラシルである。また、病期IVの結腸癌を有する患者を治療する目的で、化学療法も用いる。イリノテカン、オキサリプラチン、および5−フルオロウラシルが、最もよく使われる三大薬剤である。カペシタビンも用いられる。さらに、本明細書に記載されている抗Fn14抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法(例えば外科的手術、化学療法、または放射線療法)と併用して、病期IV期の結腸癌を治療することができる。肝臓に拡散した病期IV期の疾患を有する患者には、肝臓を特異的に標的とする様々な治療法を用いることができる。この治療法としては、癌の切除、剥離、または寒冷療法を挙げることができる。化学療法剤または放射線照射は、肝臓に直接送達できる場合がある。さらに、本明細書に記載されている抗Fn14抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法(例えば外科的手術、化学療法、または放射線療法)と併用して、肝臓または体内の他の場所に転移した結腸癌を治療することができる。結腸癌患者に放射線療法を用いることもあるが、通常は、病期III期の直腸癌患者では、放射線療法は化学療法と併せて用いる。同様に、本明細書に記載されている抗Fn14抗体は、例えば放射線療法と併用して、病期IV期の結腸癌を治療することができる。
予後:患者の体の状態は、癌の病期を含む多くの事象に左右される。一般に、早期の時点で治療すると、90%を超える患者が、診断から少なくとも5年間生存する。しかし、早期発見される結腸直腸癌は約39%に過ぎない。癌が拡散してしまうと、5年生存率は大幅に低下する。患者の結腸癌が5年以内に再発しなければ、治癒したとみなされる。病期I、II、およびIII期の癌は、治癒可能とみなされている。大半のケースで、病期IVの癌は治癒不能である。
考えられる合併症:合併症としては、転移、結腸内での癌腫の再発、二次原発結腸直腸癌の発生が挙げられる。
予防:結腸癌は大抵、結腸鏡検査によって、治癒可能性が最も高い再早期に発見することができる。50歳以上の男女はほぼ全員、結腸鏡検査を受けるべきである。食生活とライフスタイルの改変が重要である。低脂肪・高繊維の食事は、結腸癌のリスクを低下させる場合があると示唆している証拠がいくつかある。抗Fn14抗体を用いて、例えば結腸癌を患うリスクがあると同定された患者の結腸癌発症のリスクを低下させるか、または結腸癌を予防することができる。
乳癌 乳癌は、乳房の組織で発症する癌である。乳癌の主要な2つのタイプは、腺管癌と小葉癌である。まれに、乳房の他の領域で乳癌が発症する場合もある。乳癌の多くは、エストロゲン感受性である(エストロゲン受容体陽性癌、すなわちER陽性癌)。HER2陽性である乳癌もある。
原因:リスクファクターとしては下記のものが挙げられる。
年齢と性別−−乳癌を患うリスクは年齢とともに向上する。進行乳癌の症例の大半は、50歳超の女性で見つかる。女性が乳癌を発症する可能性は、男性の約100倍である。
乳癌の家族歴−−乳癌、子宮癌、卵巣癌、または結腸癌を患った近親者がいるほど、乳癌のリスクが高い。乳癌の女性の約20〜30%に、乳癌の家族歴がある。
遺伝的特質−−最も一般的な遺伝子異常は、BRCA1およびBRCA2遺伝子に見られる。これらの遺伝子の1つに突然異変がある女性では、存命中に乳癌になる可能性は最大で約80%である。ATM遺伝子、CHEK−2遺伝子、および癌抑制遺伝子p53で見られる遺伝子異常を含む他の遺伝子異常も乳癌と関連付けられているが、これらはまれである。
月経周期−−初潮が早かった(12歳未満)か、または、閉経が遅かった(55歳超)女性では、乳癌のリスクが増大する。
アルコールの摂取−−1日にグラス1〜2杯を超えるアルコールを摂取すると、乳癌のリスクが増大する場合がある。
出産−−出産していないか、30歳以降にしか出産をしていない女性では、乳癌のリスクが増大する。2回以上妊娠するか、または若年齢で妊娠すると、乳癌のリスクが低下する。
DES−−流産を予防する目的でジエチルスチルベストロール(DES)を服薬した女性では、40歳以降に乳癌のリスクが増大する場合がある。
ホルモン補充療法(HRT)−−ホルモン補充療法を数年以上受けたことのある女性ほど、乳癌のリスクが高い。
肥満症−−肥満症は乳癌と関連付けられているが、この関連付けには異論がある。
放射線照射−−小児または青少年時に、胸部の癌を治療する目的で放射線療法を受けると、乳癌を発症するリスクが増大する。
症状:早期乳癌では通常、症状は現れない。癌が増殖したときの症状として、乳房または腋窩の硬くて、縁が不均一で、通常は痛みのないしこり、乳房または乳頭の大きさ、形、または感触の変化、例えば、発赤、陥凹形成、またはしわ、乳頭からの流体(血性で、透明〜黄色または緑色で、膿のように見える場合がある)が挙げられる。男性では、乳癌の症状としては、乳房のしこり、乳房の痛み、および圧痛が挙げられる。
進行乳癌の症状として、骨痛、乳房の痛みまたは不快感、皮膚潰瘍、片腕(癌のある乳房に隣接する腕)の腫脹、および体重減少が挙げられる。
検査および試験:医師は、症状とリスクファクターについて質問すると共に、理学的検査を実施することになる。この検査には、乳房、腋窩、ならびに、頚部および胸部のいずれもが含まれる。追加の検査として、マンモグラフィ、胸部MRI、胸部超音波、胸部生検、針吸引、または、さらに精密な検査のために乳房のしこりの全部もしくは一部を除去する目的で乳房のしこりを除去するものが挙げられる。患者が乳癌である場合には、今後の治療を決める手引きとなるように追加の試験を行って、癌が拡散しているか(例えば病期分類)を調べる。
乳癌の病期は、0期からIV期までに及ぶ。一般に、乳癌は、上皮内(非浸潤性)乳癌、または浸潤性乳癌である場合がある。病期数が大きいほど、癌の進行度が高い。
治療:治療は、該癌の種類と病期、該癌が特定のホルモンに対して感受性があるか、該癌がHER2/neuという遺伝子を過剰産生(過剰発現)するか否かを含む多くの因子に基づく。一般に、癌の治療法としては、化学療法、放射線療法、癌組織を除去するための外科的手術、すなわち、乳房のしこりを除去するランペクトミー、乳房の全部または一部と癌の可能性がある近隣の構造物を除去する乳房切除術が挙げられる。さらに、本明細書に記載されている抗Fn14抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法と併用して、乳癌を治療することができる。別の治療法としては、ホルモン療法と標的療法が挙げられる。ホルモン療法の例は、タモキシフェンという薬剤である。この薬剤は、エストロゲンの作用をブロックする。このエストロゲンは、乳癌細胞の生存と増殖を助けることができるものである。エストロゲン感受性乳癌の大半の女性において、この薬剤が有効である。エキセメスタン(Aromasin)のようなアロマターゼ阻害剤というさらに新しい分類の医薬は、乳癌である閉経後の女性において、タモキシフェンと同等か、またはこれを上回る効果があることが示されている。標的治療では、癌に至る場合のある、細胞の特定の変化を識別する特殊な抗癌剤を用いる。このような薬剤の1つはトラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))である。病期IVのHER2陽性乳癌の女性には、HERCEPTIN(登録商標)と化学療法を併せると、化学療法単独よりも効果があることが示されている。研究によって、早期のHER2陽性乳癌の女性でも、この医薬と化学療法を併せると、癌再発のリスクが50%低下することも示されている。本明細書に記載されている抗Fn14抗体をHERCEPTIN(登録商標)(単独または化学療法との併用)と併用して、治療を行うことができる。
癌の治療は、局所治療であっても、全身治療であってもよい。放射線照射と外科的手術は、局所治療の形態である。化学療法は、全身治療の1つのタイプである。
大半の女性には、複数の治療法を組み合わせた治療が行なわれる。病期I、II、またはIII期の乳癌の女性では、主な目標は、癌を治療すると共に、癌の再発を予防することである。病期IVの癌の女性では、目標は、症状を改善すると共に、生存期間が延長するように助けることである。大半のケースでは、病期IVの乳癌は治癒することができない。本明細書に記載されている抗Fn14抗体を単独で、または本明細書に記載されている別の治療法と併用して、病期0、I、II、III、またはIV期の乳癌を治療することができる。
病期0期−−ランペトミーと放射線照射または乳房切除が標準的な治療法である。
病期IおよびII期−−ランペトミーと放射線照射または乳房切除と共に、ある種のリンパ節の除去が標準的な治療法である。また、ホルモン療法、化学療法、および生物学的療法が術後に推奨される場合もある。
病期III期−−治療には、外科的手術の後、場合によって、化学療法、ホルモン療法、および生物学的療法を行うことが含まれる。
病期IV期−−治療には、外科的手術、放射線照射、化学療法、ホルモン療法、またはこのような治療の組み合わせが含まれる場合がある。
適切な治療を受けている乳癌患者の5年生存率は下記のとおりである。
病期0期:100%
病期I期:100%
病期IIA期:92%
病期IIB期:81%
病期IIIA期:67%
病期IIIB期:54%
病期IV期:20%
考えられる合併症:乳癌は、体の他の部分に拡散することができる。場合によっては、腫瘍全体を除去し、近隣のリンパ節に癌がないことが明らかになった後でさえも、癌は再発する。癌治療の副作用または合併症が起こり得る。例えば、放射線療法によって、一過性の乳房腫脹、ならびに、領域周辺の疼痛および痛みが起こる場合がある。
病期I期:100%
病期IIA期:92%
病期IIB期:81%
病期IIIA期:67%
病期IIIB期:54%
病期IV期:20%
考えられる合併症:乳癌は、体の他の部分に拡散することができる。場合によっては、腫瘍全体を除去し、近隣のリンパ節に癌がないことが明らかになった後でさえも、癌は再発する。癌治療の副作用または合併症が起こり得る。例えば、放射線療法によって、一過性の乳房腫脹、ならびに、領域周辺の疼痛および痛みが起こる場合がある。
予防:一般に、健康的な食生活といくつかのライフスタイルの変更によって、癌になる総体的な可能性が低下する場合がある。
乳癌は、早期発見した方が治療が容易で、かつ治癒可能である場合が多い。早期発見法には、乳房の自己検査(BSE)、医療専門家による乳房の臨床検査、および/またはスクリーニングマンモグラフィが含まれる。
医薬組成物
抗Fn抗体(本明細書に記載されている抗体のようなもの)は、患者に投与するための、例えば、本明細書に記載されている障害を治療するための医薬組成物として調合することができる。典型的には、医薬組成物は、製薬学的に許容可能な担体を含有する。本明細書で使用する場合、「製薬学的に許容可能な担体」としては、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが挙げられる。医薬組成物としては、製薬学的に許容可能な塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩(例えばBerge,S.M.,et al.(1997)J.Pharm.Sci.66:1−19を参照されたい)を挙げることができる。
抗Fn抗体(本明細書に記載されている抗体のようなもの)は、患者に投与するための、例えば、本明細書に記載されている障害を治療するための医薬組成物として調合することができる。典型的には、医薬組成物は、製薬学的に許容可能な担体を含有する。本明細書で使用する場合、「製薬学的に許容可能な担体」としては、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが挙げられる。医薬組成物としては、製薬学的に許容可能な塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩(例えばBerge,S.M.,et al.(1997)J.Pharm.Sci.66:1−19を参照されたい)を挙げることができる。
製薬学的な調合は、十分に確率された技術であり、例えばGennaro(ed.),Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)、Ansel et al.,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,7th Ed.,Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)、およびKibbe(ed.),Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association,3rd ed.(2000)(ISBN:091733096X)でさらに説明されている。
医薬組成物は様々な形態であってよい。この形態としては例えば、液体、半固体、および固体の剤形、例えば、液体溶液(例えば注射可能溶液および不融性溶液)、分散液剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、および座剤が挙げられる。好ましい形態は、意図した投与方法と治療用途によって決まる場合がある。典型的には、本明細書に記載されている薬剤用の組成物は、注射可能溶液または不融性溶液の形態である。
1つの実施形態では、抗Fn14抗体は、塩化ナトリウム、第二リン酸ナトリウム七水和物、第一リン酸ナトリウム、および安定剤といった賦形剤材料と共に調合する。抗Fn14抗体は例えば、好適な濃度で緩衝液中に供給することができると共に、2〜8℃で保管することができる。
このような組成物は、非経口投与(例えば静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内注射)することができる。「非経口投与」および「非経口投与する」という語句は、本明細書で使用する場合、通常注射によって行われる腸内投与および局所投与以外の投与方法を意味し、非経口投与としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外、および胸骨内への注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。
医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液剤、リポソーム、または高濃度での安定的な保管に適したその他の秩序構造体として調合することができる。本明細書に記載されている薬剤を所要量で適切な溶媒中に、必要に応じて、上に列挙されている構成要素の1つまたは構成要素の組み合わせと共に組み込んでから、ろ過滅菌することによって、滅菌注射用溶液を調製することができる。一般に、分散液剤は、塩基性分散媒と、上に列挙されているものから選択した所要の他の構成要素とを含有する滅菌ビヒクル中に、本明細書に記載されている薬剤を組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液の調製用の滅菌散剤の場合には、好ましい調製法は、本明細書に記載されている薬剤と、任意の追加的な所望の成分の予めろ過滅菌した溶液に由来する任意の追加的な所望の成分との粉末を生じさせる真空乾燥と凍結乾燥である。例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散液剤の場合には、所要の粒径を維持することによって、および、界面活性剤を用いることによって、溶液の適切な流動率を維持することができる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
特定の実施形態では、該抗Fn14抗体は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤のように、急速な放出から当該化合物を保護することになる担体と共に調製してよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような生分解性・生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤を調製するための多くの方法は、特許を得ているか、または一般に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York(1978)を参照されたい。
抗Fn14抗体は、例えば、抗Fn14抗体の安定化、および/または、循環、例えば血液、血清、もしくは他の組織における滞留性を例えば少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、または50倍向上させる部分によって修飾することができる。
例えば、該抗Fn14抗体は、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドのような実質的に非抗原性のポリマーと結合(例えば共役)させることができる。好適なポリマーは、実質的に重量によって変わることになる。平均分子量が約200〜約35,000ダルトン(または約1,000〜約15,000、および2,000〜約12,500ダルトン)であるポリマーを用いることができる。
例えば、該抗Fn14抗体は、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンなどに共役させることができる。このようなポリマーの例としては、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールのようなポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、これらのコポリマー、およびこれらのブロックコポリマー(ただし、ブロックコポリマーの水溶性が維持されることを条件とする)が挙げられる。追加的な有用なポリマーとしては、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマーのようなポリオキシアルキレン、ポリメタクリル酸、カルボマー、ならびに、分岐または非分岐多糖類が挙げられる。
いくつかの実施態様では、該抗Fn14抗体は、標識または他の薬剤、例えば、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤のような別の治療薬剤に結合させるか、または別の形でこれらと会合させることもできるが、多くの実施形態では、この構造は不要である。細胞毒性剤および化学療法剤の例としては、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、ビンブラスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メイタンシノイド(例えば、メイタンシノールまたはDM1メイタンシノイド、メイタンシンのスルフヒドリル含有誘導体)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、タキサン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。
該抗Fn14抗体を第2の薬剤(例えば化学療法剤)と併用する場合、これら2つの薬剤は、別々に調合することも、一緒に調合することもできる。これらの薬剤は、相乗的に有効な量で調合または使用することができる。これらの薬剤の一方または両方を、単剤療法で用いる量よりも少ない量で用いることもできる。例えば、それぞれの医薬組成物を、例えば投与直前に混合して一緒に投与することも、例えば同じ回数または異なる回数で別々に投与することもできる。
また、他のFn14結合剤またはFn14アゴニスト剤を用いることもできる。この薬剤は、患者に投与することができるあらゆるタイプの化合物(例えば、有機もしくは無機小分子、核酸、タンパク質、またはペプチド模倣体)であってよい。1つの実施形態では、この薬剤は、生物剤、例えば分子量が5〜300kDaであるタンパク質である。例えば、Fn14アゴニスト剤は、Fn14結合部の下流のイベントを活性化する場合がある。Fn14に結合するアゴニスト抗体以外の例示的なFn14アゴニスト剤としては、TWEAKと、TWEAKの可溶性形態が挙げられる(例えば米国特許第7,109,298号を参照されたい)。このような薬剤は、本明細書に記載されている1種もしくは複数種の抗体との併用療法の一環として投与することができる。また、本明細書に記載されている他の治療剤も、例えば標準的な方法または本明細書に記載されている方法によって、医薬組成物として提供することができる。
投与
該抗Fn14抗体は、様々な方法によって、患者、例えば抗Fn14抗体の投与が必要な患者、例えばヒトの患者に投与することができる。多くの用途では、投与経路は、静脈内注射または注入(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内(IP)または筋肉内注射のうちの1つである。関節内送達も用いることができる。他の非経口投与法も用いることができる。このような方法の例としては、動脈内注射、髄腔内注射、包内注射、眼窩内注射、心臓内注射、皮内注射、経気管注射、表皮下注射、関節内注射、被膜下注射、クモ膜下注射、脊椎内注射、硬膜外注射、および胸骨内注射が挙げられる。場合によっては、投与は、癌の部位に直接、例えば、腫瘍の中および/または腫瘍に隣接する部位に行ってよい。場合によっては、経口投与することもできる。
該抗Fn14抗体は、様々な方法によって、患者、例えば抗Fn14抗体の投与が必要な患者、例えばヒトの患者に投与することができる。多くの用途では、投与経路は、静脈内注射または注入(IV)、皮下注射(SC)、腹腔内(IP)または筋肉内注射のうちの1つである。関節内送達も用いることができる。他の非経口投与法も用いることができる。このような方法の例としては、動脈内注射、髄腔内注射、包内注射、眼窩内注射、心臓内注射、皮内注射、経気管注射、表皮下注射、関節内注射、被膜下注射、クモ膜下注射、脊椎内注射、硬膜外注射、および胸骨内注射が挙げられる。場合によっては、投与は、癌の部位に直接、例えば、腫瘍の中および/または腫瘍に隣接する部位に行ってよい。場合によっては、経口投与することもできる。
該抗体の投与の経路および/または方法は、例えば断層画像を用いて、例えば腫瘍を視覚化することによって、例えば患者をモニタリングすることによって、個々の症例に合わせることもできる。
該抗体は、固定用量で、または、mg/kgという単位の用量で投与することができる。該用量は、該抗Fn14抗体に対する抗体の産生を低下または回避させるように選択することもできる。投与レジメンは、所望の応答、例えば、治療応答、または治療効果の組み合わせが得られるように調整する。一般に、該抗Fn14抗体(および任意で第2の薬剤)の用量は、バイオアベイラブルな量で薬剤を患者に供給する目的で用いることができる。例えば、0.1〜100mg/kg、0.5〜100mg/kg、1mg/kg〜100mg/kg、0.5〜20mg/kg、0.1〜10mg/kg、または1〜10mg/kgの範囲の用量を投与することができる。他の用量を用いることもできる。
組成物は、抗体を約10〜100mg/ml、または約50〜100mg/ml、または約100〜150mg/ml、または約100〜200mg/ml含有してよい。
特定の実施形態では、組成物中の該抗Fn14抗体は、大半が単量体形態であり、例えば、少なくとも90%、92%、94%、96%、98%、98.5%、または99%が単量体形態である。特定の抗Fn14抗体組成物は、例えばA280nmのUVによって検出した場合において、凝集物を約5、4、3、2、1、0.5、0.3、または0.1%未満含有してよい。特定の抗Fn14抗体組成物は、例えばA280nmのUVによって検出した場合において、断片を約5、4、3、2、1、0.5、0.3、0.2、または0.1%未満含有する。
投与単位形態または「固定用量」とは、本明細書で使用する場合、物理的に分離した単位であって、治療を受ける患者用の単位投与として適した単位を指し、各単位は、所要の製剤用担体と連動として、かつ任意で別の薬剤と連動して、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。単回または複数回投与を行ってよい。この代わりに、またはこれに加えて、持続注入によって該抗体を投与してもよい。
例えば、少なくとも2用量、3用量、5用量、10用量、またはそれ以上の用量の投与に対応するのに十分である期間(治療過程)にわたって定期的な間隔で、例えば、約1〜12週間、好ましくは2〜8週間、より好ましくは約3〜7週間、さらに好ましくは約4、5、または6週間にわたって、1日に1もしくは2回、または1週間に約1〜4回、好ましくは1週間に1回、2週間に1回(2週間ごと)、3週間に1回、月に1回、抗Fn14抗体の1回分の用量を投与することができる。患者を有効に治療するために必要な用量とタイミングに影響を及ぼす可能性のある因子としては、例えば、疾患または障害の重症度、調合、送達経路、過去の治療、患者の全般的健康状態および/または年齢、ならびに、存在する他の疾患が挙げられる。さらに、治療的に有効な量の化合物で患者を治療することとしては、単回治療を挙げることができ、好ましくは、一連の治療を挙げることができる。また、動物モデルを用いて、有用な用量、例えば初回用量またはレジメンを決定することもできる。
対象者に、本明細書に記載されている癌または他の障害を発症する危険性がある場合、その癌または障害が完全に発症する前に、例えば予防的な措置として、本発明の抗体を投与することができる。このような予防的な措置の持続期間は、該抗体の単回投与であり得るし、あるいは、この処置を継続してもよい(例えば複数回投与)。例えば、上記の障害を患う危険性があるか、または疾患の素因を有する対象者を、数日間、数週間、数カ月、または数年間にわたって本発明の抗体で治療して、その障害が発症または激症化しないようにしてもよい。
医薬組成物は、本明細書に記載されている薬剤を「治療有効量」含有してよい。このような有効量は、投与される薬剤の作用、または、2種以上の薬剤を用いる場合には、それらの薬剤の併用作用に基づいて決定することができる。また、薬剤の治療有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに、個体内で所望の応答、例えば、少なくとも1つの障害パラメーターの改善、または、障害の少なくとも1つの症状の改善を当該化合物が引き出す能力といった因子によって変わる場合がある。また、治療有効量は、その組成物のあらゆる有毒作用または有害作用よりも治療上有益な作用が上回る量でもある。
治療用の装置およびキット
該抗Fn14抗体を含有する医薬組成物は、医療装置を用いて投与することができる。この装置は、可搬性、室温での保管性、ならびに、緊急時に、例えば、訓練を受けていない患者、または現場の救助隊員が、医療設備および他の医療機器から離れていても使用できるような使いやすさなどの特徴を有する設計にすることができる。この装置は、例えば、抗Fn14抗体を含有する製剤を収容するための1つもしくは複数のハウジングを備えることができると共に、1単位用量以上の該抗体を送達するように設計することができる。さらに、この装置は、第2の薬剤、例えば化学療法剤を、該抗Fn14抗体も含有する単一の医薬組成物として、または2つの別々の医薬組成物として投与するように設計することもできる。
該抗Fn14抗体を含有する医薬組成物は、医療装置を用いて投与することができる。この装置は、可搬性、室温での保管性、ならびに、緊急時に、例えば、訓練を受けていない患者、または現場の救助隊員が、医療設備および他の医療機器から離れていても使用できるような使いやすさなどの特徴を有する設計にすることができる。この装置は、例えば、抗Fn14抗体を含有する製剤を収容するための1つもしくは複数のハウジングを備えることができると共に、1単位用量以上の該抗体を送達するように設計することができる。さらに、この装置は、第2の薬剤、例えば化学療法剤を、該抗Fn14抗体も含有する単一の医薬組成物として、または2つの別々の医薬組成物として投与するように設計することもできる。
上記の医薬組成物は注射器によって投与してもよい。また、上記の医薬組成物は、米国特許第5,399,163号、同第5,383,851号、同第5,312,335号、同第5,064,413号、同第4,941,880号、同第4,790,824号、または同第4,596,556号に開示されている装置のような無針皮下注射装置を用いて投与することもできる。周知のインプラントおよびモジュールの例としては、制御された速度で医薬を分注するための植え込み型微量注入ポンプを開示している米国特許第4,487,603号、皮膚を通じて医薬を投与するための医療装置を開示している米国特許第4,486,194号、正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示している米国特許第4,447,233号、薬剤を持続的に送達するための植え込み型可変流量注入装置を開示している米国特許第4,447,224号、複数のチャンバー区画を有する浸透圧性薬剤用送達システムを開示している米国特許第4,439,196号、および、浸透圧性薬剤用送達システムを開示している米国特許第4,475,196号が挙げられる。他の多くの装置、インプラント、送達システム、およびモジュールも知られている。
抗Fn14抗体は、キットで提供することができる。1つの実施形態では、このキットは、(a)抗Fn14抗体を含有する組成物が入った容器と、任意で(b)情報資料を含む。この情報資料は、記述的資料、教材、マーケティング資料、または、本明細書に記載されている方法および/もしくは治療的有用性を得るための薬剤の使用法に関するその他の資料であり得る。
1つの実施形態では、上記のキットは、本明細書に記載されている障害を治療するための第2の薬剤、例えば化学療法剤も含む。例えば、該キットは、該抗Fn14抗体を含有する組成物が入った第1の容器と、該第2の薬剤が入った第2の容器を含む。
該キットの情報資料の形態は限定されない。1つの実施形態では、該情報資料は、当該化合物の製造、当該化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチ、または製造地情報などに関する情報を含むことができる。1つの実施形態では、該情報資料は、本明細書に記載されている癌または他の障害を患ったか、または患う危険性がある患者を治療する目的で、例えば好適な用量、剤形、または投与方法(例えば、本明細書に記載されている用量、剤形、または投与方法)で該抗Fn14抗体を投与する方法に関する。この情報は、印刷物、コンピューター可読資料、録画、もしくは録音、または、例えばインターネット上の価値のある資料へのリンクもしくはアドレスを提供する情報を含む様々な形式で提供することができる。
該キット内の組成物は、本発明の抗体に加えて、溶媒もしくは緩衝剤、安定剤、または保存剤のような他の成分を含有することができる。該抗体は、任意の形態、例えば液体形態、乾燥形態、または凍結乾燥形態、好ましくは実質的に純粋および/または無菌の形態で提供することができる。薬剤を液体溶液で提供する場合、この液体溶液は水溶液であるのが好ましい。薬剤を乾燥形態として提供する場合、再構成は一般に、好適な溶媒を加えることによって行う。この溶媒、例えば滅菌水または緩衝液は、任意で該キットに入れることができる。
該キットは、薬剤を含有する1種もしくは複数種の組成物用の1つもしくは複数の容器を含むことができる。いくつかの実施形態では、該キットは、組成物と情報資料用の別々の容器、仕切り、または区画を含む。例えば、組成物は、瓶、バイアル、またはシリンジに入れることができ、情報資料は、プラスチック製のスリーブまたは小袋の中に入れることができる。別の実施形態では、該キットの別々の要素を1つの分割されていない容器に入れる。例えば、ラベルの形で情報資料が貼付されている瓶、バイアル、またはシリンジに組成物を入れる。いくつかの実施形態では、該キットは、複数の(例えば一群の)個別の容器を含み、この各容器には、1つもしくは複数の単位投与形態(例えば、本明細書に記載されている投与形態)の薬剤が入っている。これらの容器には、単位用量を組み合わせたもの、例えば、該抗Fn14抗体と該第2の薬剤を例えば所望の比率で含む1単位分を入れることができる。例えば、該キットは、例えば、それぞれ1回分単位用量を組み合わせたものが入ったシリンジ、アンプル、ホイル製の袋、ブリスターパック、または医療用装置を複数含む。該キットの容器は、気密性、防水性(例えば湿度の変化または蒸発に対して不透過性)、および/または遮光性であり得る。
該キットは、組成物の投与に適した装置、例えば、注射器またはその他好適な送達装置を任意に含む。この装置は、一方または両方の薬剤を予め充填した状態で提供することができ、あるいは、空の状態にすることもできるが、充填に適したものである。
Fn14発現細胞への標的化
本明細書に記載されている抗Fn14抗体を用いて、Fn14発現細胞、または、Fn14と関連する組織もしくはその他の構造物にペイロードを向けることができる。例えば、外来遺伝子(例えば遺伝子治療用)を送達することができるウイルスもしくはウイルス様粒子、またはリポソーム、例えば、治療剤もしくは外来遺伝子を封入するリポソームに該抗体を結合させることができる。抗体を用いてウイルスを標的にする例示的な方法は、Roux et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA(1989)86:9079−8083に記載されている。例えばCurr Gene Ther.(2005)5:63−70、およびHum Gene Ther.(2004)15:1034−1044も参照されたい。
本明細書に記載されている抗Fn14抗体を用いて、Fn14発現細胞、または、Fn14と関連する組織もしくはその他の構造物にペイロードを向けることができる。例えば、外来遺伝子(例えば遺伝子治療用)を送達することができるウイルスもしくはウイルス様粒子、またはリポソーム、例えば、治療剤もしくは外来遺伝子を封入するリポソームに該抗体を結合させることができる。抗体を用いてウイルスを標的にする例示的な方法は、Roux et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA(1989)86:9079−8083に記載されている。例えばCurr Gene Ther.(2005)5:63−70、およびHum Gene Ther.(2004)15:1034−1044も参照されたい。
また、本発明の抗Fn14抗体は、化学療法剤のような治療剤を含むリポソームに結合させてもよい。抗体のリポソームへの結合は、標的化送達のためにトキシンまたは化学療法剤を抗体に結合させる目的で広く用いられているヘテロ二官能性架橋剤のような任意の既知の架橋剤によって行ってよい。例えば、リポソームへの共役は、炭水化物指向性架橋試薬である4−(4−マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド(MPBH)を用いて行うことができる(Duzgunes et al.(1992)J.Cell.Biochem.Abst.Suppl.16E 77)。また、抗体含有リポソームも、周知の方法によって調製することができる(例えば、独国特許第3,218,121号、Epstein et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688−92、Hwang et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030−34、米国特許4,485,045号、および同第4,544,545号を参照されたい)。
診断利用
抗Fn14抗体は、Fn14の存在をインビトロ(例えば、組織、生検材料のような生体サンプル)またはインビボ(例えば患者の生体内撮像)で検出するための診断法で用いることができる。例えば、ヒト抗Fn14抗体または事実上のヒト抗Fn14抗体を患者に投与して、その患者の体内のFn14を検出することができる。例えば、例えばMRI検出用標識または放射性標識で該抗体を標識することができる。検出可能な標識を検出するための手段を用いて、患者を評価することができる。例えば、患者を走査して、患者の体内の該抗体の局在を評価することができる。例えば、患者は、例えばNMRまたはその他の断層撮影手段を用いて撮像する。
抗Fn14抗体は、Fn14の存在をインビトロ(例えば、組織、生検材料のような生体サンプル)またはインビボ(例えば患者の生体内撮像)で検出するための診断法で用いることができる。例えば、ヒト抗Fn14抗体または事実上のヒト抗Fn14抗体を患者に投与して、その患者の体内のFn14を検出することができる。例えば、例えばMRI検出用標識または放射性標識で該抗体を標識することができる。検出可能な標識を検出するための手段を用いて、患者を評価することができる。例えば、患者を走査して、患者の体内の該抗体の局在を評価することができる。例えば、患者は、例えばNMRまたはその他の断層撮影手段を用いて撮像する。
画像診断に有用な標識の例としては、131I、111In、123I、99mTc、32P、33P、125I、3H、14C、および188Rhのような放射性標識、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子断層撮影法(「PET」)の走査装置によって検出可能な陽電子放出同位体、ルシフェリンのような化学発光物質、ならびに、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼのような酵素マーカーが挙げられる。また、短距離検出用プローブによって検出可能な同位体のような短距離放射線発光体も採用することができる。既知の技法を用いて、このような試薬で該タンパク質リガンドを標識することができる。例えば、抗体の放射性標識に関する技法については、Wensel and Meares(1983)Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy,Elsevier,New Yorkを参照されたい。また、Colocher et al.(1986)Meth.Enzymol.121:802−816も参照されたい。
患者は、例えばガンマカメラまたはエミッショントモグラフィーを用いる放射性核種走査のような既知の技法を用いて、インビボで「撮像」することができる。例えば、A.R.Bradwell et al.,“Developments in Antibody Imaging”,Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy,R.W.Baldwin et al.,(eds.),pp.65−85(Academic Press 1985)を参照されたい。あるいは、放射性標識が陽電子(例えば11C、18F、15O、および13N)を放出する場合には、ブルックヘブン国立研究所にあるPet VIと命名された撮影装置のような陽電子放射型横断断層撮影走査装置を用いることもできる。
MRI造影剤 磁気共鳴画像法(MRI)は、NMRを用いて生体の内部の特徴を可視化するものであり、予後、診断、治療、および外科的手術に有用である。MRIは、放射性トレーサー化合物なしに用いることができ、明らかに有益である。いくつかのMRI技法は、欧州特許第0 502 814A号に概説されている。一般に、様々な環境における水プロトンの緩和時間定数T1およびT2に関する差異を利用して、画像を生成する。しかし、これらの差異は、鮮明で高解像度な画像をもたらすには不十分である場合がある。
これらの緩和時間定数の差異は、造影剤によって大きくすることができる。このような造影剤の例としては、いくつかの磁性剤、常磁性剤(主にT1を変化させる)、および、強磁性剤または超常磁性剤(主にT2応答を変化させる)が挙げられる。キレート剤(例えば、キレート剤EDTA、DTPA、およびNTA)を用いて、いくつかの常磁性物質(例えば、Fe3+、Mn2+、Gd3+)を付着(および毒性を低下)させることができる。他の薬剤は、粒子(例えば、直径10μm〜約10nm未満)の形態であり得る。粒子は、常磁性、坑常磁性、または超常磁性の特性を有することができる。粒子としては、例えば、マグネタイト(Fe3O4)、γ−Fe2O3、フェライト、およびその他の遷移元素の磁性鉱物化合物を挙げることができる。磁性粒子として、1種もしくは複数種の磁性結晶(非磁性物質の有無にかかわらない)が挙げられる。非磁性物質としては、合成または天然ポリマー(セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプンなど)を挙げることができる。
また、(i)天然に豊富に存在するフッ素原子の実質的にすべてが、19F同位体であるため、実質的にすべてのフッ素含有化合物がNMR活性であり、(ii)トリフルオロ酢酸無水物のような化学的に活性な多くのポリフッ化化合物が比較的低価格で市販されており、かつ(iii)ヘモグロビンに代わるものとして、酸素を運搬するのに用いられるペルフルオロ化ポリエーテルなど、多くのフッ化化合物が、ヒトで用いるためのものとして医学的に許容可能であることが明らかになっているので、NMR活性19F原子、または複数のこのような原子を含む指示基で、該抗Fn14抗体を標識することもできる。インキュベートションのためにそのような時間を置いた後、Pykett(1982)Scientific American,246:78−88によって説明されているような装置の1つを用いて、全身MRIを行って、Fn14の分布を特定および撮像する。
別の態様では、本開示は、インビトロでサンプル(例えば、血清、血漿、組織、生検材料のような生体サンプル)におけるFn14の存在を検出する方法を提供する。本発明を用いて、障害、例えば癌を診断することができる。この方法としては、(i)該サンプルまたはコントロールサンプルを該抗Fn14抗体と接触させて、(ii)例えば、該抗Fn14とFn14との複合体の形成を検出することによるか、または、該抗Fn14抗体またはFn14の存在を検出することによって、Fn14の存在について、該サンプルを評価することが挙げられる。例えば、この抗体は、例えば支持体上に固定化することができ、その支持体上に抗原が保持されていることを検出するか、および/または、抗原上に支持体が保持されていることを検出する。コントロールサンプルを含めることもできる。該コントロールサンプルと比べて、該サンプル内での複合体の形成の統計的に有意な変化は、該サンプル内にFn14が存在する兆候でる場合がある。一般に、蛍光偏光、顕微鏡検査、ELISA、遠心分離、クロマトグラフィー、および細胞選別(例えば蛍光活性化細胞選別)を含む用途で、抗Fn14抗体を用いることができる。
以下は、本発明の実施例である。これらの例は、いかなる場合も、本発明の範囲を限定するものとはみなさない。
実施例1:抗Fn14抗体
ヒト表面Fn14を発現するCHO細胞を投与することによって、Fn14欠損マウス内で抗Fn14抗体P4A8、P3G5、P2D3、およびP3D8を産生させ、Fn14−myc−Hisというタンパク質で免疫増強した。初期の免疫戦略として必要と思われたこの免疫戦略はうまくいかなかった。上記の抗体は、インビトロでヒトFn14タンパク質およびカニクイザルFn14タンパク質の両方に結合する。ヒトFn14タンパク質(上)とカニクイザルFn14タンパク質(下)とのアラインメントは下記のとおりである。
ヒト表面Fn14を発現するCHO細胞を投与することによって、Fn14欠損マウス内で抗Fn14抗体P4A8、P3G5、P2D3、およびP3D8を産生させ、Fn14−myc−Hisというタンパク質で免疫増強した。初期の免疫戦略として必要と思われたこの免疫戦略はうまくいかなかった。上記の抗体は、インビトロでヒトFn14タンパク質およびカニクイザルFn14タンパク質の両方に結合する。ヒトFn14タンパク質(上)とカニクイザルFn14タンパク質(下)とのアラインメントは下記のとおりである。
実施例2:抗Fn14抗体は、インビトロで腫瘍細胞を殺滅する
抗Fn14抗体(P2D3、P4A8、P3G5、またはP3D8)、ポジティブコントロールのアゴニスト(Fc−TWEAK)、またはネガティブコントロール(MOPC21)(それぞれ、IFN−γと組み合わせた)によって、それらの濃度を増しながら結腸癌細胞Widrを処置した。生存率の低下(MTTアッセイによるスコアリング)によって、細胞死を測定した。抗体P2D3、P4A8、P3G5、およびP3D8、ならびに、Fc−TWEAKは、腫瘍細胞を殺滅することができた(図1)。WiDrのMTTアッセイにおけるP4A8のEC50は約30ng/mlである。MTTアッセイにおいて、ヒト化P4A8IgG1(hP4A8IgG1、後述)でも同様の結果が得られた。加えて、多量体型のhP4A8IgG1(hP4A8IgG1をプロテインAに結合させることによって生成)で処置したところ、作用が向上した(図15)。
抗Fn14抗体(P2D3、P4A8、P3G5、またはP3D8)、ポジティブコントロールのアゴニスト(Fc−TWEAK)、またはネガティブコントロール(MOPC21)(それぞれ、IFN−γと組み合わせた)によって、それらの濃度を増しながら結腸癌細胞Widrを処置した。生存率の低下(MTTアッセイによるスコアリング)によって、細胞死を測定した。抗体P2D3、P4A8、P3G5、およびP3D8、ならびに、Fc−TWEAKは、腫瘍細胞を殺滅することができた(図1)。WiDrのMTTアッセイにおけるP4A8のEC50は約30ng/mlである。MTTアッセイにおいて、ヒト化P4A8IgG1(hP4A8IgG1、後述)でも同様の結果が得られた。加えて、多量体型のhP4A8IgG1(hP4A8IgG1をプロテインAに結合させることによって生成)で処置したところ、作用が向上した(図15)。
P4A8抗体がインビトロで結腸癌細胞WiDrのアポトーシスを誘発する能力をTUNELアッセイによって測定した。WiDr細胞をP4A8抗体またはポジティブコントロール(Fc−TWEAK)(それぞれ、IFN−γと組み合わせた)で処置するか、または、未処置のままにするかした。P4A8抗体とFc−TWEAKはいずれも、腫瘍細胞を殺滅することができた(図2Aおよび2B)。
抗Fn14抗体がインビトロで乳癌細胞MDA−MB231を殺滅する能力について、抗Fn14抗体を試験した。抗体P2D3、P4A8、P3G5、もしくはP3D8、またはポジティブコントロールのアゴニスト(Fc−TWEAK)(それぞれ、IFN−γと組み合わせた)によって、それらの濃度を増しながら上記の癌細胞を処置した。生存率の低下(MTTアッセイによるスコアリング)によって、細胞死を測定した。MDA−MB231細胞はインビトロにおいて、該抗Fn14抗体に対する耐性があった(図3)。
試験したすべての細胞内に、P4A8が速やかにインターナリゼーションされた。内部顆粒の体裁は、小型かつ多数(WiDr)なものから、大型かつ少数(MDA−MB231)のものまで様々であった。加えて、P4A8による細胞の処置によって、Fn14自体が誘発または安定化された。この現象は、Fn14 mRNAの増加に起因するものではなかった。
実施例3:インターロイキン−8の分泌の誘発
抗体P2D3、P4A8、P3G5、およびP3D8を試験して、それらがインビトロでインターロイキン8(IL−8)の分泌を誘発する能力を評価した。ネガティブコントロールのMOPC21、ポジティブコントロールのhFcTWEAK、または、抗体P2D3、P4A8、P3G5、もしくはP3D8によって、それらの濃度を増しながらA375細胞を処置した。各濃度において、培地中に分泌されたIL−8のレベルを測定した。上記の各抗体はIL−8の分泌を誘導した。したがって、上記の各抗体は、Fn14アゴニストとしての機能を果たすことができる(図4)。
抗体P2D3、P4A8、P3G5、およびP3D8を試験して、それらがインビトロでインターロイキン8(IL−8)の分泌を誘発する能力を評価した。ネガティブコントロールのMOPC21、ポジティブコントロールのhFcTWEAK、または、抗体P2D3、P4A8、P3G5、もしくはP3D8によって、それらの濃度を増しながらA375細胞を処置した。各濃度において、培地中に分泌されたIL−8のレベルを測定した。上記の各抗体はIL−8の分泌を誘導した。したがって、上記の各抗体は、Fn14アゴニストとしての機能を果たすことができる(図4)。
実施例4:インビボでの腫瘍の治療
該抗Fn14抗体がインビボで癌を治療する能力を試験する目的で、結腸癌細胞WiDr異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Fn14抗体(P2D3、P4A8、P3G5、もしくはP3D8)、ネガティブコントロール(PBS、MOPC21、もしくはP1.17)、またはポジティブコントロール(Fc−TWEAK)で処置した。用いた用量、投与経路、および投与頻度は図5に示されている。腫瘍の体積(mm3、上のパネル)、または腫瘍の重量(グラム、下のパネル)によって、腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Fn14抗体は、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった(図5)。
該抗Fn14抗体がインビボで癌を治療する能力を試験する目的で、結腸癌細胞WiDr異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Fn14抗体(P2D3、P4A8、P3G5、もしくはP3D8)、ネガティブコントロール(PBS、MOPC21、もしくはP1.17)、またはポジティブコントロール(Fc−TWEAK)で処置した。用いた用量、投与経路、および投与頻度は図5に示されている。腫瘍の体積(mm3、上のパネル)、または腫瘍の重量(グラム、下のパネル)によって、腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Fn14抗体は、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった(図5)。
上記の抗Fn14抗体とコントロールの毒性についても試験した。どの処置でも、繰り返し投与した後でさえも、明らかな毒性は観察されなかった(マウスの体重によって測定)(図6)。
実施例5:大きな腫瘍の治療
該抗Fn14抗体がインビトロで癌を治療する能力を大きな腫瘍で試験した。結腸癌細胞Widr異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Fn14抗体(P4A8、100μg)またはネガティブコントロール(PBSもしくはMOPC21)で処置した。抗体は週に1回投与し、試験期間を通じて継続したか、16日目に投与を開始して早期(37日目)に終了したか、または、遅れて(37日目に)投与を開始して試験が終わるまで実施した。腫瘍の体積(mm3)によって腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Fn14抗体は、処置の開始が遅くてもまたは処置を早く終了しても、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった(図7)。
該抗Fn14抗体がインビトロで癌を治療する能力を大きな腫瘍で試験した。結腸癌細胞Widr異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Fn14抗体(P4A8、100μg)またはネガティブコントロール(PBSもしくはMOPC21)で処置した。抗体は週に1回投与し、試験期間を通じて継続したか、16日目に投与を開始して早期(37日目)に終了したか、または、遅れて(37日目に)投与を開始して試験が終わるまで実施した。腫瘍の体積(mm3)によって腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Fn14抗体は、処置の開始が遅くてもまたは処置を早く終了しても、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった(図7)。
実施例6:用量応答
WiDr細胞異種移植片の用量応答を調べた。様々な用量の抗Fn14抗体P4A8とネガティブコントロールPBSを試験した(ある期間(日数)にわたる腫瘍の体積(mm3))。抗体の用量が増えるのに伴って、効能が向上した(図8)。
WiDr細胞異種移植片の用量応答を調べた。様々な用量の抗Fn14抗体P4A8とネガティブコントロールPBSを試験した(ある期間(日数)にわたる腫瘍の体積(mm3))。抗体の用量が増えるのに伴って、効能が向上した(図8)。
また、試験試料のコントロールに対する比率(%T/C)として、用量応答も解析した。図9に示されているように、抗体の用量が増えるのに伴って、効能が向上した。様々な量の抗体とコントロールの毒性についても試験した。どの処置でも、繰り返し投与した後でさえも、明らかな毒性は観察されなかった(体重の変化率(%)によって測定)(図10)。
実施例7:インビボでの乳癌細胞の治療
該抗Fn14抗体がインビボで癌を治療する能力を試験する目的で、乳癌細胞MDA−MB231異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Fn14抗体(P2D3もしくはP4A8)、またはネガティブコントロール(PBSまたはMOPC21)で処置した。用いた用量、投与経路、および投与頻度は図11に示されている。腫瘍の体積(mm3)によって腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Fn14抗体は、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった(図11)。
該抗Fn14抗体がインビボで癌を治療する能力を試験する目的で、乳癌細胞MDA−MB231異種移植片をマウスに移植した。腫瘍の移植後、これらのマウスを抗Fn14抗体(P2D3もしくはP4A8)、またはネガティブコントロール(PBSまたはMOPC21)で処置した。用いた用量、投与経路、および投与頻度は図11に示されている。腫瘍の体積(mm3)によって腫瘍の増殖を測定した。これらの抗Fn14抗体は、インビボで腫瘍を治療するのに有効であった(図11)。
実施例8:抗体の交差反応性
抗Fn14抗体P4A8およびP2D3は、多数の種に由来するFn14に対し交差反応性がある。図12に示されているように、上記の抗体の双方とも、フローサイトメトリー(平均蛍光値(MFI))によって判定したところ、ヒト、カニクイザル、およびマウスのFn14と反応する。EC50値も図12に示されている。P4A8は、ラットFn14とも交差反応性がある。アカゲザルFn14をクローニングして、ヒトFn14と同一であることを決定した。したがって、上記の抗体のアカゲザルFn14に対する結合特性は、ヒトFn14に対する結合特性と同じである。
抗Fn14抗体P4A8およびP2D3は、多数の種に由来するFn14に対し交差反応性がある。図12に示されているように、上記の抗体の双方とも、フローサイトメトリー(平均蛍光値(MFI))によって判定したところ、ヒト、カニクイザル、およびマウスのFn14と反応する。EC50値も図12に示されている。P4A8は、ラットFn14とも交差反応性がある。アカゲザルFn14をクローニングして、ヒトFn14と同一であることを決定した。したがって、上記の抗体のアカゲザルFn14に対する結合特性は、ヒトFn14に対する結合特性と同じである。
ヒトFn14(NM_016639)、カニクイザルFn14(実施例1を参照)、マウスFn14(NM_013749)、ラットFn14(NM_181086)、およびアフリカツメガエルFn14(NM_001090171)をコードする完全長Fn14 cDNAを遺伝子工学技術で作製して、関係のない5’UTRと3’UTRを除去すると共に、同一の最適化コザック配列を付加してから、それらのDNAをpNE001(完全に配列が確認されているベクターpUC系EBV発現ベクターであって、インビトロジェンの発現ベクターpCEP4に由来するベクター)にサブクローニングした。この発現ベクター内では、プロモーターCMV−IEとSV40ポリアデニル化シグナルによって異種遺伝子の発現が制御されるが、EBNA遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子が欠損している。Fn14発現ベクター(ヒト:pEAG2121、カニクイザル:pEAG2120、マウス:pEAG2126、ラット:pEAG2275、およびアフリカツメガエル:pEAG2237)と、EGFPレポーターを含むEBV発現ベクターとを1:1のモル比で、293E細胞に同時トランスフェクションした。トランスフェクションから2日目に、細胞を、(希釈滴定によって)目的のモノクローナル抗体で染色し、緑色のEGFP陽性生細胞にゲーティングを行った状態でFACSにかけた。このタイプのアッセイは、Fn14の細胞表面密度に左右されるので、所与のトランスフェクションに関する見かけEC50値を反映する。したがって、この直接結合アッセイでは、真のKd値は得られない。
下に示されているのは、ヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスの完全長Fn14の推定タンパク質配列のアラインメントである。
図16は、一連の抗huFn14 mAB P2D3、P3D8、P3G5、およびP4A8のヒト表面Fn14およびカニクイザル表面Fn14に対する直接結合性のFACSアッセイを示しており、いずれの抗体も、同程度のEC50値で結合する。図17は、一連の抗huFn14 mAB P2D3、P3D8、P3G5、およびP4A8のマウス表面Fn14に対する直接結合性のFACSアッセイ示しており、いずれの抗体も、霊長類Fn14への結合に関する値と同程度の見かけEC50値で結合する。ヒト化P4A8(H1/L1)(huP4A8)(後述されている)は、真のマウスP4A8 mAbと同程度の親和性で、ヒトFn14に結合する。図18Aは、異なる重鎖エフェクター機能を有するhuP4A8変異体のヒトFn14上への直接結合性に関するFACSデータを示しており、図18Bは、上記のhuP4A8変異体のラットFn14上への直接結合性に関するFACSデータを示している。huP4A8のヒトFn14およびラットFn14への結合においては、見かけEC50が同程度であったことが観察された。
図19Aは、P4A8が、ヒト、カニクイザル、およびマウスの表面Fn14には十分に結合するが、アフリカツメガエルFn14への結合は検出できなかったことを示している。図19Bと図19Cは、融合タンパク質Fc−huTWEAKとmuFc−muTWEAKの双方が、ヒト、カニクイザル、マウス、およびアフリカツメガエルの表面Fn14に十分に結合することを示しており、P4A8がアフリカツメガエルFn14に結合しないのは、アフリカツメガエルFn14の表面提示の欠損が原因ではないことを示唆している。下に示されているのは、ヒトFn14(上)とアフリカツメガエルFn14(下)とのギャップ付きアラインメントであり、類似部分は48.3%であり、同一部分は40.8%に過ぎない。
また、P4A8が他のTNFファミリー受容体に結合しないこと、および、この点において、Fn14に対して選択的であることも示されている。
実施例9:P4A8のエピトープのFn14残基W42へのマッピング(P4A8の突然変異W42Aに対する感受性)
野生型ヒトFn14、カニクイザルFn14、ラットFn14、マウスFn14、および突然変異W42Aを有するヒトFn14をコードする核酸で293E細胞をトランスフェクションした。P4A8のこれらの細胞への結合をFACSによって判定した。その結果は図13に示されている。そのヒストグラムに示されているように、P4A8は、突然変異W42Aを有するヒトFn14タンパク質に、野生型ヒトFn14タンパク質よりも有意に低く結合する。同様に、抗体P3G5も、突然変異W42Aを有するヒトFn14タンパク質に、野生型よりも有意に低く結合する(図示なし)。
野生型ヒトFn14、カニクイザルFn14、ラットFn14、マウスFn14、および突然変異W42Aを有するヒトFn14をコードする核酸で293E細胞をトランスフェクションした。P4A8のこれらの細胞への結合をFACSによって判定した。その結果は図13に示されている。そのヒストグラムに示されているように、P4A8は、突然変異W42Aを有するヒトFn14タンパク質に、野生型ヒトFn14タンパク質よりも有意に低く結合する。同様に、抗体P3G5も、突然変異W42Aを有するヒトFn14タンパク質に、野生型よりも有意に低く結合する(図示なし)。
図20は、Fn14細胞外ドメインのギャップ付きアラインメントである(ヒトFn14はE28〜P80の残基)。突然変異W42Aは、ストラタジーンのQuickChange IIというキットをメーカー推奨のプトロコルに従って用いて、部位特異的突然変異誘発によって、完全長のヒトFn14、カニクイザルFn14、およびマウスFn14 cDNA用のEBV発現ベクターで構築した。導入された制限酵素認識部位の変化についてスクリーニングすることによって、突然変異プラスミドを同定した。W42A突然変異発現ベクター(ヒトFn14 W42AのベクターはpEAG2251、マウスW42AのベクターはpEAG2250、カニクイザルW42AのベクターはpEAG2249という)におけるDNA塩基配列決定法によって、得られたプラスミド内のFn14 cDNA配列を確認した。野生型huFn14と、ヒトFn14、カニクイザル14、およびマウス14の突然変異W42Aを293E細胞内で一過性に過剰発現させ、上記のように、Fc−TEWAKまたはP4A8 mAbの結合をFACSアッセイでアッセイした。図21Aには、Fc−TWEAKがすべてのW42A突然変異体に結合することが示されており、図21Bには、試験したすべての種において、W42Aへの突然変異によって、P4A8の結合が無効になることが示されている。我々は、さらなるエピトープマッピング試験を行うために、huFn14発現プラスミドpEAG212に部位特異的突然変異誘発を行って、他の点突然変異を生じさせた。図22には、残基W42を大きい疎水性残基W42F(pYL373)またはW42Y(pYL374)に突然変異させると、P4A8の結合が正常に戻ることが示されている。
鋳型のpEAG2121(huFn14のEBV発現ベクター)上での部位特異的突然変異誘発によって、アフリカツメガエルの残基を数多くの位置でヒトの配列に置換することによって、一連のFn14点突然変異体を作製した(pYL391 T33Q、pYL392 S40R、pYL393 L65Q、pYL396 M50A、pYL397 R56K、pYL398 R56P(上記のアフリカツメガエルの変化よりも劇的な置換)、およびpYL399 H60K)。直接結合に関するFACSアッセイによって、上記の一連の突然変異体のすべてがFc−TWEAKに結合することが示された(図23A)。アゴニストの抗Fn14 mAb(P4A8、P3G5、P2D3、およびP3D8)、ならびに、Nakayama et al.(2003,J.Immunol.170:341)によって説明されているアゴニストmAbのITEM−1、ITEM−2、ITEM−3、およびITEM−4を、ヒトFn14、カニクイザルFn14、ラットFn14、マウスFn14、ならびに、一連のすべてのhuFn14突然変異体(W42A、T33Q、S40R、L65Q、M50A、R56K、R56P、およびM50A)への直接結合に関するFACSアッセイで試験した。P4A8の一連の突然変異体への結合は、図23Bに示されており、P3G5の結果は図23Cに、P2D3の結果は図23Dに、ITEM−1の結果は図23Eに、ITEM−4の結果は図23Fに、ITEM−2の結果は図23Gに、ITEM−3の結果は図23Hに示されている。これらの結果によって、P3G5とP4A8は、Fn14のW42A置換体に対する感受性があるが、P2D3(およびP3D8)と、抗Fn14mAbである4つのITEMは、W42Aという変化に対する感受性がないことが示唆されている。試験したすべての抗体は、ヒトFn14、カニクイザルFn14、ラットFn14、およびマウスFn14に結合する。
実施例10:免疫組織化学
パラフィン組織切片中のFn14を検出するための免疫組織化学(IHC)試薬としての用途に関して、抗Fn14抗体P4A8を試験した。パラフィン切片は、正常膵組織と膵臓腫瘍組織のものを入手した。P4A8は、パラフィン切片中のFn14を染色することができた。その結果によって、Fn14が、正常組織よりも膵臓腫瘍で過剰発現することが証明された。
パラフィン組織切片中のFn14を検出するための免疫組織化学(IHC)試薬としての用途に関して、抗Fn14抗体P4A8を試験した。パラフィン切片は、正常膵組織と膵臓腫瘍組織のものを入手した。P4A8は、パラフィン切片中のFn14を染色することができた。その結果によって、Fn14が、正常組織よりも膵臓腫瘍で過剰発現することが証明された。
また、P4A8を用いて、正常組織中のFn14のレベルも測定した。ヒト組織アレイ(凍結およびパラフィン)をP4A8で染色した。その結果によって、大半は、上皮細胞、内皮および筋肉、ならびに細胞質分布が軽度に染色されるが、場合によっては、わずかまたは中程度に染色されることが示された(膜は強調表示されなかった)。
実施例11:抗Fn14抗体の配列
抗体P4A8のVHドメインのアミノ酸配列は、
抗体P4A8のVHドメインのアミノ酸配列は、
抗体P3G5のVHドメインのアミノ酸配列は、
抗体P2D3のVHドメインのアミノ酸配列は、
抗体P4A8のVLドメインのアミノ酸配列は、
抗体P3G5のVLドメインのアミノ酸配列は、
抗体P2D3のVLドメインのアミノ酸配列は、
上記の各可変ドメイン配列では、CDR(CDR−H1/CDR−H2/CDR−H3、およびCDR−L1/CDR−L2/CDR−L3)に下線が引かれている。
P3D8は、P2D3のVHドメインとVLドメインと同一であるVHドメインとVLドメインを有する。
抗Fn14抗体のマウス重鎖サブグループII(A)の可変ドメインのアラインメントは下記のとおりである。
抗Fn14抗体のマウス重鎖P3G5(IIA)とP2D3(IB)のアラインメントは下記のとおりである。
抗Fn14抗体のマウスκサブグループIIIの軽鎖可変ドメインのアラインメントは下記のとおりである。
実施例12:キメラ抗体
マウスP4A8の重鎖と軽鎖の可変領域をコードするcDNAを用いて、マウス−ヒトキメラ(chキメラ)発現用ベクターを構築した。このchキメラでは、muP4A8の可変領域が、ヒトのIgG1とκ定常領域に結合している。キメラP4A8−huIgG1重鎖のcDNAインサートの配列(シグナル配列のイニシエーターATGからターミネーターTGAまで)を下に示す。
マウスP4A8の重鎖と軽鎖の可変領域をコードするcDNAを用いて、マウス−ヒトキメラ(chキメラ)発現用ベクターを構築した。このchキメラでは、muP4A8の可変領域が、ヒトのIgG1とκ定常領域に結合している。キメラP4A8−huIgG1重鎖のcDNAインサートの配列(シグナル配列のイニシエーターATGからターミネーターTGAまで)を下に示す。
CHO細胞内でchP4A8を安定的に発現させるための発現ベクターを構築した。mAbのchP4A8−huIgG1,κを分泌する安定CHO細胞株は、この抗体の軽鎖と重鎖をコードするベクターで同時トランスフェクションすることによって得た。希釈滴定FACSアッセイによって、表面に発現しているヒトFn14への直接結合性によって、chP4A8の結合親和性がマウスP4A8 mAbの結合親和性と同等であることが証明された。
実施例13:ヒト化抗体
2つのヒト化P4A8(huP4A8)重鎖(生殖細胞系列huVH1−18フレームワーク/コンセンサスHUMVH1 FR4/P4A8H CDR)の例を下に示す(それぞれに、アミノ酸配列とDNA配列を示してある。CDRには下線が引かれており、復帰突然変異は太字になっている)。
2つのヒト化P4A8(huP4A8)重鎖(生殖細胞系列huVH1−18フレームワーク/コンセンサスHUMVH1 FR4/P4A8H CDR)の例を下に示す(それぞれに、アミノ酸配列とDNA配列を示してある。CDRには下線が引かれており、復帰突然変異は太字になっている)。
上記のH1/L1の組み合わせを含むと共に、アグリコシル化されたS228P/T299A huIgG4重鎖を有するヒト化型のP4A8(huP4A8−aglyG4P重鎖)を構築した。IgG4重鎖S228Pに変更を施して、抗体半分を削除し、T99Aに変更を施して、CH2のN結合グリカンを削除し、それによって、エフェクター機能を低下させる。このアグリコシル化抗体では、抗体依存性細胞障害(ADCC)と補体媒介性細胞障害(CMC)の両方に関するエフェクター機能が低下している。重鎖の成熟配列(配列番号8)を下に示すが、残基S288PとT299Aは、下線が引かれていると共に、太字になっている(VHドメインは、1〜121番目の残基に相当し、IgG4定常ドメインは、122〜447番目の残基に相当する)。
実施例14:結合親和性
ELISA直接結合アッセイを用いて、Fn14に対するhP4A8.IgG1のEC50を推定した。96ウェルのELIAプレートを炭酸ナトリウム中の2μg/mlのマウスFn14−マウスFcでpH9.5、40℃にてオーバーナイトでコーティングした。プレートは、PBS中の3%BSAで1時間、室温にてブロックした。hP4A8.IgG1の濃度は、2μg/mlから11pg/mlまで滴定し、インキュベーション時間は室温にて1時間であった。結合したhP4A8.IgG1をHRP−ヤギ抗ヒトIgGによって検出した。このELISA条件下でのhP4A8.IgG1のEC50は、約6.79ng/mlである。
ELISA直接結合アッセイを用いて、Fn14に対するhP4A8.IgG1のEC50を推定した。96ウェルのELIAプレートを炭酸ナトリウム中の2μg/mlのマウスFn14−マウスFcでpH9.5、40℃にてオーバーナイトでコーティングした。プレートは、PBS中の3%BSAで1時間、室温にてブロックした。hP4A8.IgG1の濃度は、2μg/mlから11pg/mlまで滴定し、インキュベーション時間は室温にて1時間であった。結合したhP4A8.IgG1をHRP−ヤギ抗ヒトIgGによって検出した。このELISA条件下でのhP4A8.IgG1のEC50は、約6.79ng/mlである。
別の実験では、バイアコアのAmine Coupling kitをメーカーの説明書に従って用いて、様々なアイソフォームのマウスまたはヒト化P4A8をセンサーチップCM5に固定化した。簡潔に述べると、タンパク質をpH5.0のアセテート10mM中で30μg/mlまで希釈し、チップ表面(1:1のN−ヒドロキシスクシニミドと1−エチル−3(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩を10μl投入して活性化させておいたもの)の上に10μl投入した。加えて、各実験における1つのフローセルは、バックグラウンドコントロールとして誘導体化しないでおいた。続いて、1Mのエタノールアミンを50μl注ぐことによって、過剰な遊離アミン基をキャッピングした。典型的な固定化レベルは約1200RUであった。
0.3〜30nMに及ぶ一連の濃度のヒトFn14をバイアコアバッファー#1(10mMのHEPES(pH7.0)+150mMのNaCl+3.4mMのEDTA+0.005%の界面活性剤P−20+0.05%のBSA)中で調製した。これらの実験で用いた可溶性Fn14タンパク質のアミノ酸配列は、EQAPGTAPCSRGSSWSADLDKCMDCASCRARPHSDFCLGCAAAPPAPFRLLWPEQKLISEEDLHHHHHHであった。サンプルを抗体およびコントロール表面の上に、不規則な順番で、流速50μl/分にて5分間流してから、バイアコアバッファー#1中で15分解離させた。各サイクル後、チップを15mMのNaOHで再生した。
一連の各濃度において投入前応答をY軸の0に、投入開始時をX軸の0に設定することによって、生データを正規化した。さらに、活性表面での応答値から非誘導体化表面での応答値を減じてから、次いで活性表面での結合データから活性表面でのバッファーのみでの応答値を減じることによって、データを正規化した(いわゆるデータの「二重参照」)。続いて、Biaevaluationというソフトウェアで1:1の結合に関してMarquardt−Levenvergアルゴリズムを用いてデータを適合させることによって、一連の各濃度での全体的な会合速度定数と解離速度定数を決定した。これらの速度定数の比率(KD=Kd/Ka)から、親和性定数を算出した。当該結合アッセイは、95%を超える純粋な単量体の可溶性ヒトFn14で行った。
結合アッセイの前に、ヒトFn14の吸光スキャンを行った。Pace et al.(Pace,C.N.,Vajdos,F.,Fee,L.,Grimsley,G.,and Gray,T.(1995)“How to measure and predict the molar absorption cofficient of a protein.”Protein Science,4:2411−23)の方法によって、アミノ酸配列から算出した吸光係数を用いた。
吸光スキャンは結合アッセイの前に行った。当該mAbは、上記の実験では固定化された種であるので、正確な速度定数を決定するのに、質量、濃度、または分子量を正確に把握する必要はなく、このため、150kDaというおおよその分子量と、1.5というおおよその質量吸光係数を用いて、280nmにおける吸光度から抗体の濃度を推定した。
固定化したFn14(二価のFn14−Fc)に対するP4A8抗体全体の二価結合親和性(親和性およびアビディティー成分)は、約50pMである。
実施例15:カスパーゼアッセイ
カスパーゼアッセイは、切断されたカスパーゼ3および7のレベルを測定するものである。hP4A8による処置に応じて、カスパーゼ切断の誘発を測定した。カスパーゼ3および7は、アポトーシスの誘発部位のすぐ近くにある「実行」カスパーゼとみなされており、したがって、このアッセイは、hP4A8の想定MOAに関連するものである。
カスパーゼアッセイは、切断されたカスパーゼ3および7のレベルを測定するものである。hP4A8による処置に応じて、カスパーゼ切断の誘発を測定した。カスパーゼ3および7は、アポトーシスの誘発部位のすぐ近くにある「実行」カスパーゼとみなされており、したがって、このアッセイは、hP4A8の想定MOAに関連するものである。
腫瘍細胞WiDrを96ウェルプレートに播き、80U/mlのhIFNgの存在下で、ある範囲の濃度(1μg/ml、1:3の希釈比で滴定)のhP4A8に暴露した。培養液中で3日置いた後、プロメガのCaspase−Glo 3/7 Assay試薬を用いて、切断されたカスパーゼ3および7の存在を測定した。そのデータは、未処置細胞と比較した場合のフォールドチェンジとして表されている。
結果によって、hP4A8による刺激に応答して、WiDr細胞内でカスパーゼ3/7が誘発されたと共に、最も低い濃度で試験したときでさえも、多量体型のhP4A8(hP4A8−multi)に応答した際に、最大の効果が観察されたことが示されている(図26)。単量体形態のP4A8の濃度を増しながら試験すると、用量応答が観察される。エキソビボの腫瘍でも同様の結果が得られた。
実施例16:NFκB誘発アッセイ
NF−κBアッセイは、カノニカル(p50、p65)およびノンカノニカル(p52、RelB)NF−κB経路の誘発を測定するものである。TWEAK/Fn14経路がNF−κBを通じてシグナル伝達することは十分確立されているので、これは、hP4A8のアゴニスト活性を証明するための関連アッセイである。
NF−κBアッセイは、カノニカル(p50、p65)およびノンカノニカル(p52、RelB)NF−κB経路の誘発を測定するものである。TWEAK/Fn14経路がNF−κBを通じてシグナル伝達することは十分確立されているので、これは、hP4A8のアゴニスト活性を証明するための関連アッセイである。
腫瘍細胞WiDrを6ウェルのディッシュ内で増殖させ、1μg/mlのP4A8(このアッセイでは、マウス型のP4A8を用いた)、または比較するために100ng/mlのhFc−TWEAKに暴露した。処置後、様々な時点(1分〜24時間の範囲)で、培養液から核抽出物を調製した。続いて、その核抽出物に対してELSAキット(アクティブモティフのTransAM NFκB Family transcription factor Assay kit)によって解析を行って、個々のNF−κBファミリーメンバー(p50、p65、p52、RelB、c−Rel)を測定した。すべての値を非刺激細胞に対して正規化した。
その結果によって、P4A8に応答して、WiDr細胞内でNFκBファミリーメンバーのp50、p52、p65、およびRelBが誘発されたことが示されており、これは、カノニカルNF−κB経路とノンカノニカルNF−κB経路の両方が刺激されることを示唆している(図27)。エキソビボの腫瘍でも同様の結果が得られた。
実施例17:エフェクター機能
hP4A8のADCC活性をインビトロで評価した。活性は、腫瘍細胞株WiDrとMDA−MB231内で測定した。hP4A8.IgG1(すなわち、ヒトIgG1に結合したVH1およびVL1配列を有するヒト化P4A8)を、Fcの機能が弱められた型のP4A8(hP4A8−IgG1TglyおよびhP4A8.IgG4Pagly)と比較した。
hP4A8のADCC活性をインビトロで評価した。活性は、腫瘍細胞株WiDrとMDA−MB231内で測定した。hP4A8.IgG1(すなわち、ヒトIgG1に結合したVH1およびVL1配列を有するヒト化P4A8)を、Fcの機能が弱められた型のP4A8(hP4A8−IgG1TglyおよびhP4A8.IgG4Pagly)と比較した。
ドナーPBMCから単離したNK細胞を、IL−2の存在下にてオーバーナイトでインキュベートした。標的細胞のWiDrとMDA−MB−231を51Crで標識した。様々な濃度の抗体の存在下で、培養NK細胞と標識標的細胞を5:1の比率で合わせて4時間、37度にてインキュベートした(また、2:1の比率でも行った。データは示されていない)。このアッセイには、自発的放出コントロール(NK細胞なし)と最大放出コントロール(Toriton−X−10で処置した標的細胞)を含めた。このインキュベーション期間の経過後、上清中のcpmを測定した。溶解率(%)を下記のように算出した。
グリコシル化が活性に及ぼす作用も判定した。WiDr細胞内でのMTTアッセイ(上記)を用いて、グリコシル化がインビトロ活性に作用を及ぼすか試験した。hP4A8.IgG1(エフェクター機能が完全)とhP4A8.IgG4Pagly(エフェクター機能なし)をこのアッセイで比較した。研究用標準品の材料をこのアッセイで試験した。結果によって、該インビトロアッセイにおいて、hP4A8.IgG4Paglyと比べて、hP4A8.IgG1の活性が、軽度ではあるが、再現性のある程度に向上したことが示されている。
WiDrおよびMDA−MB231双方の異種移植片アッセイにおいて、hP4A8.IgG1のFcのエフェクター機能も、インビボでP4A8活性に寄与することが示された。P4A8 hIgG1を6.4mg/kgでいずれかの動物モデルに投与した方が、P4A8hIgG4Paglyを同じ用量で投与した場合よりも有効である(図29)。
実施例18:ヒト化P4A8.IgG1のインビボでの短期効能と長期効能
0.9〜25.6mg/kgの範囲の用量で単剤として、1週間に1度(qw)のスケジュールで6週間、腹腔内(i.p.)投与したFn14抗体P4A8.hIgG1の効能をヒト結腸腫瘍WiDr担持無胸腺ヌードマウス内で評価した。マウスは、腫瘍接種から12日目(平均腫瘍体積は約200mm3であった)からQWのスケジュール(矢印で示されている)で、12.8mg/kgのIDEC151(ネガティブコントロール)と、12.8、6.4、3.2、1.8、および0.9mg/kgのP4A8.hIgG1でIP処置した。データは、処置グループあたり10匹のマウスの平均値±標準誤差である。*すべての投与グループにおいて、20〜60日目までのネガティブコントロールIDEC151との比較におけるp値は0.001未満である。
0.9〜25.6mg/kgの範囲の用量で単剤として、1週間に1度(qw)のスケジュールで6週間、腹腔内(i.p.)投与したFn14抗体P4A8.hIgG1の効能をヒト結腸腫瘍WiDr担持無胸腺ヌードマウス内で評価した。マウスは、腫瘍接種から12日目(平均腫瘍体積は約200mm3であった)からQWのスケジュール(矢印で示されている)で、12.8mg/kgのIDEC151(ネガティブコントロール)と、12.8、6.4、3.2、1.8、および0.9mg/kgのP4A8.hIgG1でIP処置した。データは、処置グループあたり10匹のマウスの平均値±標準誤差である。*すべての投与グループにおいて、20〜60日目までのネガティブコントロールIDEC151との比較におけるp値は0.001未満である。
P4A8hIgG1は、アイソタイプが一致するネガティブコントロール抗体と比べて、0.9〜25.6mg/kgの範囲の用量で、統計的に有意な(p<0.001)効能を示した(図30、図31、および図32)。0.9mg/kg、1.8mg/kg、3.2mg/kg、および6.4mg/kgの用量のグループ全体にわたって、用量依存的な効能が観察された。6.4mg/kgを超える用量では、6.4mg/kg、12.8mg/kg、および25.6mg/kgの用量のグループ全体にわたって、用量依存性は観察されなかった(図30および図31)。試験した用量範囲全体にわたって、P4A8hIgG1の効能が最小の用量は、このモデルにおいて単剤として投与した場合、qw×6のスケジュールでは、0.9mg/kgであると思われる(図30および図31)。同じ投与スケジュールにおいて、効能が最大の用量は6.4mg/kgである。図32に示されているように、抗体P4A8.hIgG1は、投与終了から50日以上にわたって、有効性を維持した。0.9〜25.6mg/kgの範囲のすべての用量(n=10匹のマウス/処置グループ)は、体重減少が見られなかったことによって示されているように、qw×6のスケジュールで良好な耐性を示した。
1週間に1度の投与スケジュールに加えて、P4A8hIgG1の投与は、2週間に1度、または3週間に1度投与した場合も、ヒト結腸腫瘍WiDr担持無胸腺ヌードマウスで有効であることが明らかになった(図37)。この実験での処置は、該腫瘍が比較的大きくなったとき(約500mm3)に開始し、腫瘍の静止が観察された。該抗体の半減期が、抗体の通常の範囲から低い範囲内であっても(担腫瘍マウスにおいて2.5日未満)、驚くべきことに、該抗体は、頻繁には投与しなくてもインビボで有効である。
6.4〜25.6mg/kgの範囲の用量で単剤として、1週間に1度(qw)のスケジュールで6週間、腹腔内(i.p.)投与したFn14抗体P4A8.hIgG1の効能を乳癌腫瘍MDA−MB−231担持SCIDマウスで評価した。ヒト乳腫瘍MDA−MB−231担持マウスは、腫瘍接種から16日目(平均腫瘍体積は約200mm3であった)からQWのスケジュール(矢印で示されている)で、25.6mg/kgのIDEC151(ネガティブコントロール)と、25.6、12.8、および6.4mg/kgのP4A8.hIgG1でIP処置した。データは、処置グループあたり9匹のマウスの平均値±標準誤差である。*すべての投与グループにおいて、23〜63日目までのネガティブコントロールIDEC151との比較におけるp値は0.001未満である。
P4A8.hIgG1は、アイソタイプが一致するネガティブコントロール抗体と比べて、6.4〜25.6mg/kgの範囲の用量で、統計的に有意な(p<0.001)効能を示した(図33)。試験グループの平均腫瘍寸法を平均ネガティブコントロールに対する比率(%)として比較したものが図34に示されており、点線は、米国国立癌研究所による活性の基準(42%)を示している。
単剤として投与した場合のP4A8.hIgG1の効能が最小の用量は、このモデルではまだ決定していない。6.4mg/kg、12.8mg/kg、および25.6mg/kgの容量グループ全体にわたって、用量依存性は観察されなかった。これらの用量は、有意な体重減少が見られなかったことによって示されているように、良好な耐性を示した。
意外なことに、P4A8.hIgG1のヒト乳腫瘍MDA−MB−231アッセイでの効能は、親抗体P4A8よりも大きかった。これらの2つの抗体のヒト結腸腫瘍WiDrアッセイでの効能は同程度であった。
実施例19:P4A8.hIgG1を多量体化すると、活性が向上する
P4A8.hIgG1をプロテインAによって多量体化したところ、MTTアッセイにおいて、WiDr細胞の死滅と、WiDr細胞内のカスパーゼの活性化が増大した(図15および図26)。
P4A8.hIgG1をプロテインAによって多量体化したところ、MTTアッセイにおいて、WiDr細胞の死滅と、WiDr細胞内のカスパーゼの活性化が増大した(図15および図26)。
実施例20:ヒト化P4A8 IgG1の胃癌での効能
ヒト化P4A8 IgG1抗体は、胃癌Hs746T異種移植片モデルにおいて、様々な試験用量で、抗腫瘍作用を呈することが示された(図35および図36A)。加えて、胃癌細胞N87異種移植片モデルにおいて、ヒト化P4A8 IgG1で、3.2mg/kg、6.4mg/kg、および12.8mg/kgにて週に1度処置したことによって、単剤での効能(腫瘍寸法が70〜80%縮小)が証明された(図36B)。
ヒト化P4A8 IgG1抗体は、胃癌Hs746T異種移植片モデルにおいて、様々な試験用量で、抗腫瘍作用を呈することが示された(図35および図36A)。加えて、胃癌細胞N87異種移植片モデルにおいて、ヒト化P4A8 IgG1で、3.2mg/kg、6.4mg/kg、および12.8mg/kgにて週に1度処置したことによって、単剤での効能(腫瘍寸法が70〜80%縮小)が証明された(図36B)。
したがって、P4A8は、インビボアニマルモデルで腫瘍細胞を有効に殺滅すると共に、持続的な作用を及ぼす。
実施例21:P4A8とFn14との相互作用の界面におけるアミノ酸残基
マウスP4A8のFabとヒトFn14の細胞外ドメインとの複合体を蒸気拡散法によって結晶化し、20℃の温度で置いた。10〜14日で、30%のPEG8000、100mMの酢酸ナトリウム(pH5)、0.2Mの硫酸リチウムを含有する結晶化溶液中に、回折品質の平板状結晶が生じた。結晶(0.2×0.2×0.01mm3)をそのままの状態で回収し、液体窒素で急速冷凍した。ナショナル・シンクロトロン・ライト・ソース(ニューヨーク州アプトン)にて、ビームラインX25で分解能3.5Åまでの回折データを取得した。HKL2000というプログラム(米国バージニア州シャーロッツビルのHKLリサーチ)によるデータ処理によって、上記の結晶がP21の空間群に属しており、おおよその格子定数がa=61.1Å、b=103.3Å、c=76.1Å、β=97.2°であることが明らかになり、非対称単位あたり2つのP4A8 Fab−Fn14複合体と一致した。ヒト化P4A8のホモロジーモデルとインハウスのFn14NMR構造を用いるMOLERP(Vagin&Teplyakov,J Appl Crystallogr 1997;30:1022−1025)による分子置換によって、P4A8 FabとFn14分子を置換したところ、46%というR因子を得た。電子密度マップで、Fn14の高システインドメインの50〜67番目の残基のみを明らかにすることができた。この密度マップから欠けているのは、Fn14細胞外ドメインのH3 CDRとN末端残基であった。該界面のさらに完全なモデルは、huFnH細胞外ドメインの最新のNMR構造(He&Dang,Protein Science 2009;18:650−656)をP4A8 Fab/Fn14結晶構に重ね合わせることによって作成した。この後に、ROSETTA(Das&Baker,Annu.Rev.Biochem.,2008;77:363−82)というソフトウェアによるH3 CDRのモデリングと、複合体全体の条件付き最適化による精密化を行った。表2には、P4A8とFn14との界面でのアミノ酸相互作用が明らかにされている。
マウスP4A8のFabとヒトFn14の細胞外ドメインとの複合体を蒸気拡散法によって結晶化し、20℃の温度で置いた。10〜14日で、30%のPEG8000、100mMの酢酸ナトリウム(pH5)、0.2Mの硫酸リチウムを含有する結晶化溶液中に、回折品質の平板状結晶が生じた。結晶(0.2×0.2×0.01mm3)をそのままの状態で回収し、液体窒素で急速冷凍した。ナショナル・シンクロトロン・ライト・ソース(ニューヨーク州アプトン)にて、ビームラインX25で分解能3.5Åまでの回折データを取得した。HKL2000というプログラム(米国バージニア州シャーロッツビルのHKLリサーチ)によるデータ処理によって、上記の結晶がP21の空間群に属しており、おおよその格子定数がa=61.1Å、b=103.3Å、c=76.1Å、β=97.2°であることが明らかになり、非対称単位あたり2つのP4A8 Fab−Fn14複合体と一致した。ヒト化P4A8のホモロジーモデルとインハウスのFn14NMR構造を用いるMOLERP(Vagin&Teplyakov,J Appl Crystallogr 1997;30:1022−1025)による分子置換によって、P4A8 FabとFn14分子を置換したところ、46%というR因子を得た。電子密度マップで、Fn14の高システインドメインの50〜67番目の残基のみを明らかにすることができた。この密度マップから欠けているのは、Fn14細胞外ドメインのH3 CDRとN末端残基であった。該界面のさらに完全なモデルは、huFnH細胞外ドメインの最新のNMR構造(He&Dang,Protein Science 2009;18:650−656)をP4A8 Fab/Fn14結晶構に重ね合わせることによって作成した。この後に、ROSETTA(Das&Baker,Annu.Rev.Biochem.,2008;77:363−82)というソフトウェアによるH3 CDRのモデリングと、複合体全体の条件付き最適化による精密化を行った。表2には、P4A8とFn14との界面でのアミノ酸相互作用が明らかにされている。
10μg/mlで開始してから、1:2で段階希釈して、ある用量曲線のP4A8と細胞を混合することによって、細胞株のFACS解析をFACSバッファー(PBS1%、BSA0.1%、Na Azide)で行った。コントロールmAbとして、IDCE151を同じ方式で調製してから、各抗体を当該細胞と30分間、4℃にてインキュベートした。FACSバッファーで2回洗浄してから、当該細胞をPE標識抗hu IgG Fc特異的抗体(ペンシルベニア州ウェストグローブのジャクソンラブス(Jackson Labs))と30分間、4℃にてインキュベートした。2回洗浄してから、当該細胞を2%のパラホルムアルデヒドで固定し、Caliber Facscan(カリフォルニア州サンノゼのベクトン・ディッキンソン)で捕捉した。Flow Jo(オレゴン州アシュランドのツリー・スター社)というソフトウェアを用いてデータを解析し、MFI(平均蛍光強度)を決定した。P4A81.25μg/mlの濃度におけるMFIに従って、下記の基準によって、細胞株(表3参照)の発現レベルをスコアリングした。
マイナス MFIが10未満
低 MFIが10〜29
中 MFIが30〜59
高 MFIが60以上
3連で、9μg/mlから始めて1:3で段階希釈したFc−Tweak、hP4A8 IgG1、hP4A8 IgG1多量体、またはコントロールmAbのIDEC151と共に、80U/mlのヒトINFgを含有する培地に該細胞を播くことによって、MTTアッセイの準備をした。これらの細胞を3〜4日間インキュベートし、One Solution Cell Titer MTT Assay(ウィスコンシン州マディソンのプロメガ)を用いて増殖させた。個々のサンプルの各々において、生存率(%)=(処置したウェルのOD/未処置のウェルの平均OD)×100という式を用いて、生存率(%)を決定した。各処置条件において平均値を算出してから、阻害剤の濃度に対して、生存率(%)をプロットした。
低 MFIが10〜29
中 MFIが30〜59
高 MFIが60以上
3連で、9μg/mlから始めて1:3で段階希釈したFc−Tweak、hP4A8 IgG1、hP4A8 IgG1多量体、またはコントロールmAbのIDEC151と共に、80U/mlのヒトINFgを含有する培地に該細胞を播くことによって、MTTアッセイの準備をした。これらの細胞を3〜4日間インキュベートし、One Solution Cell Titer MTT Assay(ウィスコンシン州マディソンのプロメガ)を用いて増殖させた。個々のサンプルの各々において、生存率(%)=(処置したウェルのOD/未処置のウェルの平均OD)×100という式を用いて、生存率(%)を決定した。各処置条件において平均値を算出してから、阻害剤の濃度に対して、生存率(%)をプロットした。
下記の基準を用いて、9μg/mlにおける増殖を阻害できる能力によって、MTTアッセイの結果(表3参照)をスコアリングした。
活性なし −(マイナス)
生存率が80%超 +/−
生存率が約80% +
生存率が約60% ++
生存率が約40% +++
生存率が20%未満 ++++
生存率が80%超 +/−
生存率が約80% +
生存率が約60% ++
生存率が約40% +++
生存率が20%未満 ++++
抗体の交差ブロックを以下のように評価した。可溶性ヒトFn14を表面上に固定化した。続いて、この表面を未標識の第1の抗体と接触させた。次いで、ビオチン化した第2の抗体を加え、第2の抗体の上記表面への結合を測定した。第2の抗体の結合が妨げられることによって、第1の抗体が、第2の抗体のFn14への結合を交差ブロックしたことが示された。1パネルの抗体が、所定の抗Fn14抗体の結合を交差ブロックできる能力は、図38A(P2D3がビオチン化した第2の抗体であった)、図38B(P3G5がビオチン化した第2の抗体であった)、図38C(P4A8がビオチン化した第2の抗体であった)、図38D(ITEM−4ビオチン化した第2の抗体であった)、および図38E(ITEM−3ビオチン化した第2の抗体であった)に示されている。これらの実験では、P1B12とP1C12を非関連コントロール抗体として用いた。*は、未標識の第1の抗体を用いなかったケースを示している。
以下は、これらの交差ブロック実験で用いたプロトコルの概要である。
1. コーニングのCostar3590を用いて、オーバーナイトで4℃にて、0.1Mの炭酸塩(pH9.5)中の0.1μg/mlのhFn14−hFcでプレートをコーティングする。
2. PBS(200μl/ウェル)中の3%のBSAで、1時間、室温にてブロックする。
3. 洗浄バッファー(PBS中の0.1%のTween−20)で3回洗浄する。
4. 抗Fn14抗体を10μg/mlで、ウェルあたり100μlにて、96ウェルプレートを横断するように(1〜12に)水平に加え、1時間インキュベートする。
5. 洗浄せずに、ビオチン化した抗Fn14抗体を0.2μg/mlで、ウェルあたり100μlにて、96ウェルプレートを横断するように(A〜Hに)水平に加え、1時間インキュベートする。
6. 洗浄バッファー(PBS中の0.1%のTween−20)で3回洗浄する。
7. HRP−SAを1:2000で加え、ウェルあたり100μl入れて、室温にて1時間、インキュベートする。
8. 1:1の比率の試薬Aと試薬Bを混合することによって、TMB Substrate Solutionを調製する(TMB Substrate Reagent Set、BDバイオサイエンス555214)。ウェルあたり100μlを加える。
9. 色が現れたら、405nmにおける値を読み取る。
10. 100μlの2N H2SO4で反応を停止し、450nmにおける値を読み取る。
6. 洗浄バッファー(PBS中の0.1%のTween−20)で3回洗浄する。
7. HRP−SAを1:2000で加え、ウェルあたり100μl入れて、室温にて1時間、インキュベートする。
8. 1:1の比率の試薬Aと試薬Bを混合することによって、TMB Substrate Solutionを調製する(TMB Substrate Reagent Set、BDバイオサイエンス555214)。ウェルあたり100μlを加える。
9. 色が現れたら、405nmにおける値を読み取る。
10. 100μlの2N H2SO4で反応を停止し、450nmにおける値を読み取る。
その他の実施形態
本発明の詳細な説明と関連させて、本発明について説明してきたが、上記の説明は、例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されている。その他の態様、利点、および修正形態は、下記の請求項の範囲内である。
本発明の詳細な説明と関連させて、本発明について説明してきたが、上記の説明は、例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図していない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されている。その他の態様、利点、および修正形態は、下記の請求項の範囲内である。
Claims (55)
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1の42位にアミノ酸残基トリプトファンを含むエピトープで、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、(ii)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、モノクローナル抗体P4A8またはP3G5の配列番号1への結合を交差ブロックし、かつ、(ii)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、モノクローナル抗体P4A8、P3G5、またはP2D3のエピトープと同じエピトープで、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合すると共に、(ii)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が配列番号1のポリペプチドに結合することによって、TWEAKの前記ポリペプチドへの結合をブロックする、請求項1〜3のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合断片。
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVHドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VHドメインが、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である、請求項5に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VHドメインが、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である、請求項6に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VHドメインが、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と同一である、請求項5に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVLドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VLドメインが、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である、請求項9に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VLドメインが、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である、請求項9に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VLドメインが、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と同一である、請求項9に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVHドメインを含み、(iii)配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるVLドメインを含み、かつ(iv)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- (i)前記VHドメインが、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも90%同一であり、かつ(ii)前記VLドメインが、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である、請求項13に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)前記VHドメインが、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも95%同一であり、かつ(ii)前記VLドメインが、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも95%同一である、請求項13に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)前記VHドメインが、配列番号11または配列番号12のアミノ酸配列と同一であり、かつ(ii)前記VLドメインが、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のアミノ酸配列と同一である、請求項13に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 重鎖が配列番号37または配列番号39を含み、軽鎖が配列番号41、配列番号43、または配列番号45を含む、請求項13に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 重鎖が配列番号37を含み、軽鎖が配列番号43を含む、請求項13に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)(a)配列番号2もしくは配列番号3の相補性決定領域(CDR)−H1と少なくとも90%同一である第1の重鎖CDR、配列番号2もしく配列番号3のCDR−H2と少なくとも90%同一である第2の重鎖CDR、および配列番号2もしく配列番号3のCDR−H3と少なくとも90%同一である第3の重鎖CDR、または(b)配列番号4のCDR−H1と少なくとも90%同一である第1の重鎖CDR、配列番号4のCDR−H2と少なくとも90%同一である第2の重鎖CDR、および配列番号4のCDR−H3と少なくとも90%同一である第3の重鎖CDRを含むVHドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- 前記第1の重鎖CDRが、配列番号2または配列番号3のCDR−H1と同一であり、前記第2の重鎖CDRが、配列番号2または配列番号3のCDR−H2と同一であり、前記第3の重鎖CDRが、配列番号2または配列番号3のCDR−H3と同一である、請求項19に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記第1の重鎖CDRが、配列番号4のCDR−H1と同一であり、前記第2の重鎖CDRが、配列番号4のCDR−H2と同一であり、前記第3の重鎖CDRが、配列番号4のCDR−H3と同一である、請求項19に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)(a)配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L1と少なくとも90%同一である第1の軽鎖CDR、配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L2と少なくとも90%同一である第2の軽鎖CDR、および配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L3と少なくとも90%同一である第3の軽鎖CDR、または(b)配列番号7のCDR−L1と少なくとも90%同一である第1の軽鎖CDR、配列番号7のCDR−L2と少なくとも90%同一である第2の軽鎖CDR、および配列番号7のCDR−L3と少なくとも90%同一である第3の軽鎖CDRを含むVLドメインを含み、かつ(iii)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- 前記第1の軽鎖CDRが、配列番号5または配列番号6のCDR−L1と同一であり、前記第2の軽鎖CDRが、配列番号5または配列番号6のCDR−L2と同一であり、前記第3の軽鎖CDRが、配列番号5または配列番号6のCDR−L3と同一である、請求項22に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記第1の軽鎖CDRが、配列番号7のCDR−L1と同一であり、前記第2の軽鎖CDRが、配列番号7のCDR−L2と同一であり、前記第3の軽鎖CDRが、配列番号7のCDR−L3と同一である、請求項22に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)配列番号1のポリペプチドが細胞の表面上に発現しているときに、配列番号1のポリペプチドに選択的に結合し、(ii)(a)配列番号2もしくは配列番号3のCDR−H1と少なくとも90%同一である第1の重鎖CDR、配列番号2もしく配列番号3のCDR−H2と少なくとも90%同一である第2の重鎖CDR、および配列番号2もしく配列番号3のCDR−H3と少なくとも90%同一である第3の重鎖CDR、または(b)配列番号4のCDR−H1と少なくとも90%同一である第1の重鎖CDR、配列番号4のCDR−H2と少なくとも90%同一である第2の重鎖CDR、および配列番号4のCDR−H3と少なくとも90%同一である第3の重鎖CDRを含むVHドメインを含み、(iii)(a)配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L1と少なくとも90%同一である第1の軽鎖CDR、配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L2と少なくとも90%同一である第2の軽鎖CDR、および配列番号5もしくは配列番号6のCDR−L3と少なくとも90%同一である第3の軽鎖CDR、または(b)配列番号7のCDR−L1と少なくとも90%同一である第1の軽鎖CDR、配列番号7のCDR−L2と少なくとも90%同一である第2の軽鎖CDR、および配列番号7のCDR−L3と少なくとも90%同一である第3の軽鎖CDRを含むVLドメインを含み、かつ(iv)インビボまたはインビトロで癌細胞の細胞殺滅を誘発または増大する、単離抗体またはその抗原結合断片。
- (i)前記第1の重鎖CDRが、配列番号2のCDR−H1と同一であり、前記第2の重鎖CDRが、配列番号2のCDR−H2と同一であり、前記第3の重鎖CDRが、配列番号2のCDR−H3と同一であり、(ii)前記第1の軽鎖CDRが、配列番号5のCDR−L1と同一であり、前記第2の軽鎖CDRが、配列番号5のCDR−L2と同一であり、前記第3の軽鎖CDRが、配列番号5のCDR−L3と同一である、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)前記第1の重鎖CDRが、配列番号3のCDR−H1と同一であり、前記第2の重鎖CDRが、配列番号3のCDR−H2と同一であり、前記第3の重鎖CDRが、配列番号3のCDR−H3と同一であり、(ii)前記第1の軽鎖CDRが、配列番号6のCDR−L1と同一であり、前記第2の軽鎖CDRが、配列番号6のCDR−L2と同一であり、前記第3の軽鎖CDRが、配列番号6のCDR−L3と同一である、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- (i)前記第1の重鎖CDRが、配列番号4のCDR−H1と同一であり、前記第2の重鎖CDRが、配列番号4のCDR−H2と同一であり、前記第3の重鎖CDRが、配列番号4のCDR−H3と同一であり、(ii)前記第1の軽鎖CDRが、配列番号7のCDR−L1と同一であり、前記第2の軽鎖CDRが、配列番号7のCDR−L2と同一であり、前記第3の軽鎖CDRが、配列番号7のCDR−L3と同一である、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト生殖細胞系列フレームワーク領域とトータルで少なくとも90%同一であるフレームワーク領域を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号11または配列番号12のVHドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも90%同一であるVHドメインフレームワーク領域を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号13、配列番号14、または配列番号15のVLドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも90%同一であるVLドメインフレームワーク領域を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、(i)配列番号11または配列番号12のVHドメインのフレームワーク領域とトータルで少なくとも90%同一であるVHドメインフレームワーク領域、および(ii)配列番号13、配列番号14、または配列番号15のVLドメインのフレーム領域とトータルで少なくとも90%同一であるVLドメインフレームワーク領域を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VHドメインが、配列番号8の1〜121番目のアミノ酸を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VLドメインが、配列番号9の1〜111番目のアミノ酸を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記VHドメインが、配列番号8の1〜121番目のアミノ酸を含み、前記VLドメインが、配列番号9の1〜111番目のアミノ酸を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 重鎖が配列番号8を含み、軽鎖が配列番号9を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 重鎖が配列番号16を含み、軽鎖が配列番号9を含む、請求項25に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が、結腸癌細胞WiDrの細胞殺滅を誘発または増大する、請求項1〜37のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体がヒト化抗体である、請求項1〜38のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体が完全ヒト抗体である、請求項1〜38のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜38のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体が一本鎖抗体である、請求項1〜38のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片がポリクローナル抗体、キメラ抗体、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、Fsc断片、またはFc断片である、請求項1〜38のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が多特異性抗体である、請求項1〜38のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記多特異性抗体が双特異性抗体である、請求項44に記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体またはその抗原結合断片が多価抗体である、請求項1〜38のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 前記抗体が、IgG1重鎖定常領域を有する、請求項1〜38のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
- 請求項1〜47のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を産生する単離細胞。
- 哺乳類B細胞と骨髄腫細胞とを融合することによって得られる融合細胞である、請求項48に記載の細胞。
- 請求項1〜47のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
- 腫瘍細胞死を誘発する方法であって、Fn14を発現する腫瘍細胞と、腫瘍細胞死を誘発するのに有効な量の、請求項1〜47のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片とを接触させることを含む方法。
- 腫瘍細胞の増殖を予防または減少させる方法であって、腫瘍を有する哺乳類に、腫瘍細胞の増殖を予防または減少させるのに有効な量の、請求項1〜47のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む方法。
- 癌を治療する方法であって、癌を有する哺乳類に、請求項1〜47のいずれかに記載の抗体または抗原結合断片を治療有効量含む医薬組成物を投与することを含む方法
- 前記癌が結腸癌または乳癌である、請求項53に記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである、請求項52〜54のいずれかに記載の方法。
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