JP2019502698A - Hla−drに特異的に結合する抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、該抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
Description
(配列表)
本願は、EFS−Webを介して提出された配列表を含み、その内容全体が参照により本明細書に援用される。2016年12月15日に作成されたASCIIテキストファイルは、JBI5078WOPCT_ST25.txtという名称であり、サイズは254キロバイトである。
本願は、EFS−Webを介して提出された配列表を含み、その内容全体が参照により本明細書に援用される。2016年12月15日に作成されたASCIIテキストファイルは、JBI5078WOPCT_ST25.txtという名称であり、サイズは254キロバイトである。
(発明の分野)
本発明は、HLA−DRに特異的に結合する抗体及び抗原結合断片、抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
本発明は、HLA−DRに特異的に結合する抗体及び抗原結合断片、抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチド、並びに前述のものを作製及び使用する方法に関する。
主要組織適合抗原複合体(MHC)のクラスII分子は、抗原由来ペプチドをCD4+T細胞に提示するために用いられる。ヒトは、それぞれ細胞内のペプチドに結合し、かかるペプチドを提示のため細胞表面に輸送する、アルファ/ベータ(α/β)鎖ヘテロ二量体からなる3種のMHCクラスII分子:HLA−DP、HLA−DQ、及びHLA−DRを有する。MHCクラスII分子は、B細胞、マクロファージ、及び樹状細胞を含む抗原提示細胞(APC)の表面上で発現する。
HLA−DRA1によってコードされているHLA−DRα鎖は、高度に保存されている。HLA−DRB1又はそのパラログであるHLA−DRB3、HLA−DRB4、又はHLA−DRB5のうちの1つによってコードされているHLA−DRβ鎖は、超多型性である。すべての個体由来の抗原提示細胞は、HLA−DRA1によってコードされているアルファ鎖及びHLA−DRB1によってコードされているベータ鎖を発現するが、更に、1本又は2本のHLA−DRB3、HLA−DRB4、及びHLA−DRB5によってコードされている鎖と対合するアルファ鎖を発現し得る。したがって、個体は、遺伝した母方及び父方の対立遺伝子に応じて2〜4つのHLA−DRアイソフォームを発現し得る。
特にHLA−DRB1は、多くのヒト自己免疫疾患と関連している。HLA−DRB1遺伝子における変異は、HLA−DRによって提示される特異的ペプチドに影響を与える場合があり、これにより、抗原特異的CD4+T細胞がどのHLA−DR/ペプチド複合体を認識し、応答するかに影響が生じ得る。HLA−DRB1と自己免疫疾患との遺伝的関連は、疾患の発症及び/又は進行においてヘルパーT細胞にペプチドが提示されていることを意味する。T細胞が、活性化により自己ペプチドを外来分子として最初に認識することが、自己免疫疾患の早期段階であるものと考えられる。病原性CD4+T細胞は、組織の損傷を直接引き起こし得るだけでなく、自己抗体の産生につながるB細胞の活性化をトリガーすることもある。
HLA−DRB1における多型は、関節リウマチ(RA)、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、及び1型糖尿病を含む疾患に関連していることが見出されている(Gough and Simmonds,Curr Genomics 2007;8(7):453〜465及びShiina et al.,J Human Genetics 2009;54:15〜19によって概説されている)。ベータ鎖のペプチド結合ポケット側のアミノ酸70〜74は、「共有エピトープ」と呼ばれており、正に帯電している残基(QKRAA、QRRAA、又はRRRAA)を含む。共有エピトープは、HLA−DRB1対立遺伝子であるHLA−DRB1*01:01、*01:02、*04:01、*04:04、*04:05、*04:08、及び*10:01に存在し、これらは、アミノ酸アルギニンがシトルリンに改変されているシトルリン化ペプチドを優先的に提供すると考えられる。RA患者の約3分の2は、「共有エピトープ」HLA−DR分子による提示後にシトルリン化ペプチドが認識される結果として生じると仮定されている、血清中に存在しACPA(抗シトルリン化タンパク質抗体)と呼称される自己抗体を有する。
HLA−DRは、様々な血液悪性腫瘍及び固形腫瘍でも発現し、これら適応症における抗体に基づく療法について研究が続けられているものの(Schweighofer et al.,Cancer Immunol Immunotherap 61(12)2367〜73,2012;Stein et al.,2006,Blood 108:2736〜44;Altamonte et al.,Oncogene 2003 22:6564〜6569)、このアプローチには安全上の懸念が存在する。
したがって、自己免疫疾患及びHLA−DR陽性腫瘍などのHLA−DR介在性疾患を治療するための治療法が必要とされている。
本発明は、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片であって、HLA−DRに対する結合に関して、
配列番号58の重鎖可変ドメイン(VH)及び配列番号61の軽鎖可変ドメイン(VL)、
配列番号56のVH及び配列番号60のVL、
配列番号57のVH及び配列番号61のVL、
配列番号137のVH及び配列番号61のVL、
配列番号138のVH及び配列番号61のVL、
配列番号139のVH及び配列番号61のVL、
配列番号140のVH及び配列番号142のVL、又は
配列番号141のVH及び配列番号61のVLを含む抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
配列番号58の重鎖可変ドメイン(VH)及び配列番号61の軽鎖可変ドメイン(VL)、
配列番号56のVH及び配列番号60のVL、
配列番号57のVH及び配列番号61のVL、
配列番号137のVH及び配列番号61のVL、
配列番号138のVH及び配列番号61のVL、
配列番号139のVH及び配列番号61のVL、
配列番号140のVH及び配列番号142のVL、又は
配列番号141のVH及び配列番号61のVLを含む抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片であって、
それぞれ配列番号73、74、及び75の重鎖相補性決定領域1、2、及び3(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)、並びにそれぞれ配列番号76、77、及び78の軽鎖相補性決定領域1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)、
それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号123、126、129、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号123、126、130、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号123、126、131、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号124、127、132、134、135、及び136のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、又は
それぞれ配列番号125、128、133、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号73、74、及び75の重鎖相補性決定領域1、2、及び3(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)、並びにそれぞれ配列番号76、77、及び78の軽鎖相補性決定領域1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)、
それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号123、126、129、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号123、126、130、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号123、126、131、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
それぞれ配列番号124、127、132、134、135、及び136のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、又は
それぞれ配列番号125、128、133、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片であって、本明細書に記載される特定のVH、VL、HC、及びLCアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、以下
それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
配列番号56のVH及び配列番号60のVL、並びに/又は
配列番号84若しくは96のHC及び配列番号88のLCを含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
配列番号56のVH及び配列番号60のVL、並びに/又は
配列番号84若しくは96のHC及び配列番号88のLCを含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、以下
それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
配列番号57のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
配列番号85若しくは97のHC及び配列番号89のLCを含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
配列番号57のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
配列番号85若しくは97のHC及び配列番号89のLCを含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、以下
それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
配列番号58のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
配列番号86若しくは98のHC及び配列番号89のLCを含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
配列番号58のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
配列番号86若しくは98のHC及び配列番号89のLCを含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、以下
それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
配列番号59のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
配列番号87若しくは99のHC及び配列番号89のLCを含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
配列番号59のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
配列番号87若しくは99のHC及び配列番号89のLCを含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明の抗体は、異種分子にコンジュゲートしている、本発明のHLA−DRに特異的に結合する、抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明は、配列番号56、57、58、59、60、61、84、85、86、87、96、97、98、99、137、138、139、140、141、142、149、150、151、152、154、154のVH、VL、VH及びVL、HC、LC、若しくはHC及びLCをコードしている、又は配列番号79、80、81、82、83、90、91、92、93、94、95、100、101、102、103、121、143、144、145、146、147、148、155、156、157、158、159、若しくは160のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
また、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。
また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、該抗体が発現する条件で本発明の宿主細胞を培養することと、該宿主細胞によって産生された抗体を回収することとを含む方法を提供する。
また、本発明は、HLA−DR介在性疾患を治療又は予防する方法であって、HLA−DR介在性疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明の抗体又はその抗原結合断片を、かかる治療又は予防を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
また、本発明の方法は、自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、本発明の抗体又はその抗原結合断片を、かかる抑制を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
また、本発明は、HLA−DR発現腫瘍を治療する方法であって、HLA−DR発現腫瘍を治療するのに十分な時間、細胞毒性剤にコンジュゲートしている本発明の抗体又はその抗原結合断片を、かかる治療を必要としている対象に治療的に有効な量で投与することを含む、方法を提供する。
また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
また、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合断片を含むキットを提供する。
また、本発明の抗体は、治療において使用するための本発明の抗体を提供する。
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含む(ただしそれらに限定されない)すべての刊行物は、参照によりそれらの全体が記載されているのと同様に、本明細書に援用される。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の試験を実施するために使用できるが、例示となる材料及び方法を本明細書に記載する。本発明を説明及び特許請求する上で以下の用語が用いられる。
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞(a cell)」という言及には、2つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
「特異的結合」、「特異的に結合する」、「特異的に結合」、又は「結合する」とは、抗体が抗原又は該抗原内部のエピトープに、他の抗原に対するよりも高い親和性で結合することを指す。典型的には、抗体は、約1×10−7M以下、例えば、約5×10−8M以下、約1×10−8M以下、約1×10−9M以下、約1×10−10M以下、約1×10−11M以下、又は約1×10−12M以下の平衡解離定数(KD)で抗原又は該抗原内部のエピトープに結合し、典型的には、該KDは、非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)に対する結合に関してのKDの少なくとも1/100以下である。解離定数は標準的手法を用いて測定することができる。しかし、抗原又は抗原内部のエピトープに特異的に結合する抗体は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Macaca fascicularis(カニクイザル、cyno)、Pan troglodytes(チンパンジー、chimp)、又はCallithrix jacchus(コモンマーモセット、marmoset)などの他の種由来の同じ抗原(ホモログ)に対して交差反応性を有する場合がある。単一特異性抗体は、1つの抗原又は1つのエピトープに特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は、2つの異なる抗原又は2つの異なるエピトープに特異的に結合する。「HLA−DRに特異的に結合する抗体」又は「抗HLA−DR抗体」とは、少なくとも、それぞれ配列番号13及び14に示すアミノ酸配列を有するHLA−DRA1*01:02α鎖及びHLA−DRB1*04:01β鎖で構成されるHLA−DR4に特異的に結合する抗体を指す。様々なHLA−DRタンパク質は、HLA−DRα及びHLA−DRβ鎖をコードしている遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされているので、HLA−DRに特異的に結合する抗体は、他のHLA−DRタンパク質、例えば、HLA−DR1、HLA−DR3、HLA−DR10、及びHLA−DR15にも特異的に結合し得る。
「抗体」は、広義の意味を有し、マウス、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗原結合断片、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体、四量体又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、及び必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された形態を含む免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互に接続されている2本の重鎖(HC)及び2本の軽鎖(LC)、並びにこれらの多量体(例えば、IgM)から構成される。各重鎖は、重鎖可変ドメイン(VH)及び重鎖定常ドメインで構成され、該重鎖定常ドメインは、サブドメインCH1、ヒンジ、CH2及びCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常ドメイン(CL)で構成される。VH及びVLは、フレームワーク領域(FR)に散在している相補性決定領域(CDR)と称される超可変性の領域に更に区分され得る。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4で配置された、3つのCDR及び4つのFRセグメントで構成される。
「相補性決定領域(CDR)」は、抗体における「抗原結合部位」である。CDRは、様々な用語を用いて定義され得る:(i)VH内に3つ(HCDR1、HCDR2、HCDR3)及びVL内に3つ(LCDR1、LCDR2、LCDR3)存在する相補性決定領域(CDR)は配列多様性に基づく(Wu and Kabat,(1970)J Exp Med 132:211−50;Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。(ii)VH内に3つ(H1、H2、H3)及びVL内に3つ(L1、L2、L3)存在する「超可変性領域」、「HVR」、又は「HV」は、Chothia及びLeskによって定義されているとおり、構造が超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す(Chothia and Lesk,(1987)Mol Biol 196:901〜17)。International ImMunoGeneTics(IMGT)データベース(http://www_imgt_org)は、抗原結合部位についての標準化付番及び定義を提供する。CDR、HV、及びIMGTの表記間の対応関係については、Lefranc et al.,(2003)Dev Comparat Immunol 27:55〜77に記載されている。本明細書で使用されている「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」、及び「LCDR3」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のKabat、Chothia、又はIMGTにより記載されている方法のいずれかにより定義されるCDRを含む。
免疫グロブリンは、重鎖定常領域アミノ酸配列に応じて、5つの主要なクラス、IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMに割り当てることができる。IgA及びIgGは、アイソタイプIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4に更に細分類される。どのような脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、2つの明確に異なるタイプ、すなわち、カッパ(κ)及びラムダ(λ)のうちの一方に割り当てることができる。
「抗原結合断片」は、元の完全長抗体の抗原結合特性を保持している免疫グロブリン分子の部分を指す。代表的な抗原結合断片は、重鎖相補性決定領域(HCDR)1、2及び/又は3、軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、2及び/又は3、VH、VL、VH及びVL、Fab、F(ab’)2、Fd、及びFv断片、並びに1つのVHドメイン又は1つのVLドメインのいずれかからなるドメイン抗体(dAb)である。VH及びVLドメインは、合成リンカーを介して互いに連結されて、VH/VLドメインが、分子内で、又はVH及びVLドメインが別々の鎖によって発現される場合には分子間で対形成して、一本鎖Fv(scFv)などの一価の抗原結合部位又はダイアボディを形成する様々な種類の一本鎖抗体の設計を形成することができる。例えば、国際公開第1998/44001号、同第1988/01649号、同第1994/13804号、同第1992/01047号に記載されている。
「モノクローナル抗体」は、抗体重鎖からC末端リジンを除去するなどの可能な周知の変更を除き、各重鎖及び各軽鎖において単一のアミノ酸組成を有する抗体集団を指す。モノクローナル抗体は、2つの異なる抗原エピトープに結合する二重特異性のモノクローナル抗体を除き、典型的には1つの抗原エピトープに結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団中に不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二価抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。
「単離された」とは、組み換え細胞などの分子が産生されるシステムに関係する他の成分から実質的に分離及び/又は精製されている、分子の均質な集団(例えば、合成ポリヌクレオチド又は抗体などのタンパク質)に加えて、少なくとも1つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「HLA−DRに特異的に結合する単離抗体」とは、他の細胞物質及び/又は化学物質を実質的に含まない抗体を指し、より高純度、例えば、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の純度に単離された抗体を包含する。
「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒト由来の免疫グロブリン配列に由来する抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク内に置換を含む可能性があることから、該フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の配列の正確なコピーでなくてもよい。
「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト由来の配列に由来する重鎖及び軽鎖可変ドメインを有する抗体を指す。抗体が定常ドメイン又は定常ドメインの一部を含む場合、定常ドメインもヒト由来の配列に由来する。
ヒト抗体は、抗体の可変ドメインがヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合、ヒト由来の配列に「由来する」重鎖又は軽鎖可変ドメインを含む。このような代表的な系は、ファージ又は哺乳類細胞に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及び本明細書に記載されているヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウス又はラットなどの非ヒトトランスジェニック動物である。「ヒト抗体」は、例えば天然に存在する体細胞突然変異、あるいはフレームワーク若しくは抗原結合部位、又はこれらの両方への意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子と比較したときにアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一である。一部の場合では、「ヒト抗体」は、例えばKnappik et al.,(2000)J Mol Biol 296:57〜86に記載されている、ヒトフレームワーク配列分析から得られたコンセンサスフレームワーク配列、又は例えばShi et al.,(2010)J Mol Biol 397:385〜96及び国際公開第2009/085462号に記載されている、ファージにディスプレイされたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた合成HCDR3を含み得る。
ヒト免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、ファージディスプレイ組み込み合成CDR及び/又は合成フレームワークなどの系を用いて作製することもでき、インビトロ突然変異誘発に供して抗体特性を改善した結果、インビボにおけるヒト抗体生殖系列レパートリーでは発現されない抗体を得ることもできる。
抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。
「組み換え体」とは、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体及びその他のタンパク質を指す。「組み換え抗体」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック若しくはトランスクロモソーマルである動物(例えばマウス)又はそれから調製されたハイブリドーマ(以下で更に説明する)から単離された抗体、該抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のDNA配列にスプライスすることを伴う任意の他の手段により調製、発現、作製、又は単離された抗体、あるいは二重特異的抗体などのFabアーム交換を用いてインビトロで生成される抗体などの、組み換え手段により調製、発現、作製、又は単離されるすべての抗体を含む。
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは典型的には、化学的に活性な(極性、非極性又は疎水性など)部分の表面集団、例えばアミノ酸又は多糖側鎖などの部分の表面集団からなり、特定の三次元構造特性並びに特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、立体配座上の空間単位を形成する連続的な及び/又は不連続なアミノ酸によって構成され得る。不連続なエピトープでは、抗原の直鎖配列の異なる部分にあるアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みにより三次元空間でごく近接するようになる。
「パラトープ」は、抗原に特異的に結合する抗体の部分を指す。パラトープは元々一つながりのものであってもよく、又は一つながりの連続するアミノ酸ではなく抗体のアミノ酸のうち隣接していないもの同士が空間的に関係することによって形成される非連続なものであってもよい。「軽鎖パラトープ」及び「重鎖パラトープ」又は「軽鎖パラトープのアミノ酸残基」及び「重鎖パラトープのアミノ酸残基」はそれぞれ、抗原と接触する抗体の軽鎖残基及び重鎖残基を指し、あるいは概して「抗体パラトープ残基」は、抗原と接触するこれらの抗体アミノ酸を指す。
「二重特異性」は、2つの異なる抗原、又は同じ抗原中の2つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体を指す。二重特異性抗体は、他の関連する抗原に対して交差反応性を有し得るか、又は2つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合することができる。
「多重特異性」とは、少なくとも2種の異なる抗原と特異的に結合する抗体、又は同じ抗原内の少なくとも2箇所の異なるエピトープと結合する抗体を指す。多重特異性抗体は、例えば、2種、3種、4種、若しくは5種の異なる抗原、又は同じ抗原内の異なるエピトープに結合し得る。
「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の等価な共有結合化学によって共有結合したヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。cDNAは、合成ポリヌクレオチドの典型例である。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されポリペプチドを形成している少なくとも2つのアミノ酸残基を含んでなる分子を指す。
「ペプチド」とは、30アミノ酸長以下の短いポリペプチドを指す。
「変異体」は、1つ以上の改変、例えば、1つ以上の置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドとは異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは、典型的には、ベクターを複製することができる生物学的要素を利用して生物系(例えば、細胞、ウイルス、動物、植物)及び再構成された生物系におけるこれらポリヌクレオチドの複製又は維持を促進する機能を有する、複製起点、ポリアデニル化シグナル、又は選択マーカーなどの要素を含有する。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のDNA若しくはRNA分子、又はこれらのハイブリッドであり得る。
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利用できるベクターを指す。
「約」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、すなわち測定システムの制限事項にある程度依存する。特定のアッセイ、結果、又は実施形態の文脈において実施例又は明細書のその他の箇所に別途明示的に記載のない限り、「約」は、当該技術分野の実施に従う1つの標準偏差又は5%までの範囲のいずれか大きい方の範囲内であることを意味する。
「サンプル」とは、対象から単離された類似の流体、細胞、又は組織に加えて、対象の体内に存在する流体、細胞、又は組織の収集物を指す。代表的なサンプルは、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、喀痰などの体液、分泌組織及び器官の粘膜からの分泌液、膣分泌液、腹水、胸膜腔、心膜腔、腹膜腔、腹腔、及び他の体腔の流体、気管支洗浄液によって回収された流体、滑液、対象又は生物源、例えば、細胞及び器官の培養培地(細胞又は器官の培養上清を含む)、洗浄液などと接触した液体溶液、組織生検、穿刺吸引、外科的に切除された組織、器官の培養物又は細胞の培養物である。
「〜と組み合わせて」は、2つ以上の治療薬を、混合物の状態で一緒に、単剤として同時に又、は単剤として任意の順序で逐次、対象に投与することを意味する。
「アンタゴニスト」とは、細胞タンパク質に結合したとき、該タンパク質の天然のリガンドによって誘導される少なくとも1つの反応又は活性を抑制する分子を指す。分子は、該少なくとも1つの反応若しくは活性が、アンタゴニストの非存在下(例えば、陰性対照)で抑制される少なくとも1つの反応若しくは活性よりも少なくとも約30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくは100%多く抑制されるとき、又はアンタゴニストの非存在下における抑制と比較して抑制が統計的に有意であるとき、アンタゴニストである。代表的なアンタゴニストは、T細胞の活性化、例えば、CD4+T細胞の増殖を阻害する、HLA−DRに特異的に結合する抗体である。
「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物などのすべての脊椎動物を含む。「患者」及び「対象」は、本明細書では互換的に使用される。
「ヒト白血球抗原HLA−DR」又は「HLA−DR」とは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII細胞表面受容体を指す。HLA−DRは、各サブユニットが膜を1回貫通するα及びβ鎖のヘテロ二量体である。HLA−DRα鎖は、HLA−DRA1によってコードされており、HLA−DRβ鎖は、HLA−DRB1、又はそのパラログであるHLA−DRB3、HLA−DRB4、若しくはHLA−DRB5のうちの1つによってコードされている。HLA−DRB1は、周知であるとおり、超多型性である。様々なHLA−DRα及びHLA−DRβ鎖の命名法、cDNA、及びアミノ酸配列は、周知である。例えば、international ImMunoGeneTics information system(登録商標)(IMGT(登録商標))データベースは、HLA−DRA1及びHLA−DRBによってコードされているタンパク質のアミノ酸配列、並びにそのアミノ酸アラインメントを提供する。HLAの命名法は、HLA遺伝子及びタンパク質の配列、並びにHttp:_/_hla_alleles_orgに見出すことができ、Robinson et al.,Nucleic Acids Research(2015)43:D423−431及びMarch et al.,Tissue Antigens(2010)75:291〜455に引用されているHLA対立遺伝子番号についての統計値を提供する。
「HLA−DR4」又は「DR4」とは、血清学的グループ4に含まれる特定のHLA抗原を指す。HLA−DR4α鎖は、HLA−DRA1*01によってコードされており、HLA−DR4β鎖は、HLA−DRB1*04によってコードされている。HLA−DRB1*04は、多型性であり、当該技術分野において周知であるHLA−DRB1*04:01、HLA−DRB1*04:02、HLA−DRB1*04:03、HLA−DRB1*04:04、HLA−DRB1*04:05などを含む様々な変異体をコードしている。
「HLA−DR1」又は「DR1」とは、血清学的グループ1に含まれる特定のHLA抗原を指す。HLA−DR1α鎖は、HLA−DRA1*01によってコードされており、HLA−DR1β鎖は、HLA−DRB1*01遺伝子によってコードされている。HLA−DRB1*01は、多型性であり、当該技術分野において周知であるHLA−DRB1*01:01、HLA−DRB1*01:02、HLA−DRB1*01:03、HLA−DRB1*01:04、HLA−DRB1*01:05などを含む様々な変異体をコードしている。
「HLA−DR3」又は「DR3」とは、血清学的グループ3に含まれる特定のHLA抗原を指す。HLA−DR3α鎖は、HLA−DRA1*01によってコードされており、HLA−DR3β鎖は、HLA−DRB1*03遺伝子によってコードされている。HLA−DRB1*03は、多型性であり、当該技術分野において周知であるHLA−DRB1*03:01、HLA−DRB1*03:02、HLA−DRB1*03:03、HLA−DRB1*03:04、HLA−DRB1*03:05などを含む様々な変異体をコードしている。
「HLA−DR10」又は「DR10」とは、血清学的グループ10に含まれる特定のHLA抗原を指す。HLA−DR10α鎖は、HLA−DRA1*01によってコードされており、HLA−DR10β鎖は、HLA−DRB1*10遺伝子によってコードされている。HLA−DRB1*10は、多型性であり、当該技術分野において周知であるHLA−DRB1*10:01、HLA−DRB1*10:02、HLA−DRB1*10:03、HLA−DRB1*10:04、HLA−DRB1*10:05などを含む様々な変異体をコードしている。
「HLA−DR15」又は「DR15」とは、血清学的グループ15に含まれる特定のHLA抗原を指す。HLA−DR15α鎖は、HLA−DRA1*01によってコードされており、HLA−DR15β鎖は、HLA−DRB1*15遺伝子によってコードされている。HLA−DRB1*15は、多型性であり、当該技術分野において周知であるHLA−DRB1*15:01、HLA−DRB1*15:02、HLA−DRB1*15:03、HLA−DRB1*15:04、HLA−DRB1*15:05などを含む様々なHLA−DRB1タンパク質をコードしている(ecodes)。
「共有エピトープ」とは、そのβ鎖の第3の超可変領域における特定のHLA−DRB1対立遺伝子によって共有されている共通の構造モチーフを指す。この共通のモチーフは、ペプチド結合ポケット(残基70〜74)の側に5つのアミノ酸が延出しており、QKRAA(配列番号66)、QRRAA(配列番号67)、又はRRRAA(配列番号68)のアミノ酸配列を有する。共有エピトープは、HLA−DRB1対立遺伝子であるHLA−DRB1*01:01、*01:02、*04:01、*04:04、*04:05、*04:08、及び*10:01に存在する。
本明細書で使用するとき、「アポトーシス」とは、細胞内で生じ得るプログラム細胞死(PCD)のプロセスを指す。
「B細胞の死」とは、急性の組織損傷から生じ、炎症応答、アポトーシスによる細胞死を引き起こす、又は任意の他の手段による細胞死の形態である、偶発的なB細胞死(壊死)を指す。
「複合体における/複合体として」又は「複合体化された」とは、HLA−DRα鎖、HLA−DRβ鎖、及びHLA−DR分子における周知のペプチド結合溝に存在する1つのペプチドに関する複合体を指す。インビボにおいて、ペプチド/HLA−DR相互作用は、非共有結合性である。インビトロにおいて、ペプチドは、例えば、β鎖のN末端に共有結合し得る。したがって、「複合体における/複合体として」は、HLA−DRと非共有結合的に及び共有結合的に結合しているペプチドとの複合体のいずれをも包含する。
「T細胞活性化」とは、T細胞、例えば、CD4+T細胞の1つ以上の細胞応答、例えば、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞毒性エフェクター分子の放出、細胞毒性活性、及び活性化マーカーの発現を指す。
「HLA−DRB1関連自己免疫疾患」とは、特定のHLA−DRB1対立遺伝子又はハプロタイプとの遺伝的関連が既に同定されているか又は同定されるであろう自己免疫疾患を指す。
「HLA−DR介在性疾患」とは、HLA−DRのT細胞受容体(TCR)への結合によって少なくとも部分的に介在される疾患を指す。
本明細書全体を通して、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の付番は、特に明示的に指定しない限り、Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991)に記載のとおりEUインデックスに従っている。
表1に示す従来の1文字及び3文字アミノ酸コードが本明細書で使用される。
組成物
本発明は、CD4+T細胞の活性化を阻害するHLA−DRに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、所望により、枯渇せず、HLA−DPにもHLA−DQにも結合を示さず、したがって、感染中に免疫応答を生じさせるために必要な、HLA−DP又はHLA−DQにおける他のペプチドの提示に対しては効果を有しないものの、自己免疫疾患に関連する自己ペプチドの提示にのみ干渉することによって、改善された安全性プロファイルを提供し得る。本発明は、本発明の抗体をコードしているポリペプチド及びポリヌクレオチド、又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにこれらを作製及び使用する方法を提供する。
本発明は、CD4+T細胞の活性化を阻害するHLA−DRに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、所望により、枯渇せず、HLA−DPにもHLA−DQにも結合を示さず、したがって、感染中に免疫応答を生じさせるために必要な、HLA−DP又はHLA−DQにおける他のペプチドの提示に対しては効果を有しないものの、自己免疫疾患に関連する自己ペプチドの提示にのみ干渉することによって、改善された安全性プロファイルを提供し得る。本発明は、本発明の抗体をコードしているポリペプチド及びポリヌクレオチド、又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにこれらを作製及び使用する方法を提供する。
本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、HLA−DRに対する結合に関して、
a)配列番号58の重鎖可変領域(VH)及び配列番号61の軽鎖可変領域(VL)、
b)配列番号56のVH及び配列番号60のVL、
c)配列番号57のVH及び配列番号61のVL、
d)配列番号137のVH及び配列番号61のVL、
e)配列番号138のVH及び配列番号61のVL、
f)配列番号139のVH及び配列番号61のVL、
g)配列番号140のVH及び配列番号142のVL、又は
h)配列番号141のVH及び配列番号61のVLを含む抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
a)配列番号58の重鎖可変領域(VH)及び配列番号61の軽鎖可変領域(VL)、
b)配列番号56のVH及び配列番号60のVL、
c)配列番号57のVH及び配列番号61のVL、
d)配列番号137のVH及び配列番号61のVL、
e)配列番号138のVH及び配列番号61のVL、
f)配列番号139のVH及び配列番号61のVL、
g)配列番号140のVH及び配列番号142のVL、又は
h)配列番号141のVH及び配列番号61のVLを含む抗体と競合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
それぞれ配列番号58及び61(mAb DR4B127)又は56及び60(mAb DR4B117)のVH及びVLを含む抗体は、固有の機序によってCD4+T細胞の活性化を阻害すると同定された。DR4B127及びDR4B117は、HLA−DRの同種T細胞受容体(TCR)との相互作用に干渉するのではなく、CD4結合部位においてHLA−DRに結合した。特定の理論によって束縛されるものではないが、DR4B127及びDR4B117は、HLA−DR分子における高次構造の変化及び/又は空間的な変化を誘導可能であることから、HLA−DR及び同種T細胞受容体間又はHLA−DR及びT細胞共受容体CD4間の相互作用を防ぐ。したがって、DR4B127及びDR4B117は、T細胞のシグナル伝達を急性的に混乱させ得るが、HLA−DR拘束性T細胞の長期にわたる抑制も誘導し得る。抗体の存在に起因して記憶T細胞とHLA−DRとが長期にわたって接触しないことから、T細胞プールからの喪失が引き起こされた。HLA−DRに結合し、CD4の結合に干渉する抗体は、CD4を結合させずに非生産的なHLA−DR/TCR会合を継続させることができ、同時刺激を抑制し、その結果、アネルギーが生じる。したがって、非TCR部位においてHLA−DRをブロッキングすることによってT細胞の活性化を防ぐ抗体(例えば、DR4B127及びDR4B117、並びにHLA−DRへの結合に関してDR4B127及びDR4B117と交差競合する抗体)は、自己免疫疾患の治療だけでなく、予防にも有益であり得る。HLA−DRへの結合に関して交差競合する代表的な抗体は、抗体DR4B30、DR4B117、DR4B127、DR4B78、DR4B38、DR4B70、DR4B22、及びDR4B33である。本明細書で示されたとおり、対照抗体DR4B4、DR4B5、及びDR4B6は、HLA−DRのTCRへの結合をブロックした。
HLA−DRへの結合に関しての、特定のVH及びVL配列を含む本発明の抗体又はその抗原結合断片との競合は、周知の方法を用いてインビトロでアッセイすることができる。例えば、非標識抗体の存在下でのMSD Sulfoタグ(商標)NHS−エステル標識抗体の可溶性組み換えHLA−DRへの結合は、ELISAによって評価することもでき、又はBiacore分析法若しくはフローサイトメトリーを用いて本発明の抗体との競合を示すこともできる。代表的なアッセイでは、10μg/mLの可溶性HLA−DR分子DR4G89又はDR4G99(本明細書に記載)5μLをMeso Scale Discovery(MSD)HighBindプレート(Gaithersburg,MD)に2時間吸収させ、次いで、0.1M HEPES 150μLで3回洗浄する。プレートを4℃で一晩5% BSA緩衝液でブロッキングする。翌日、プレートを0.1M HEPES緩衝液、pH7.4で3回洗浄し、続いて、ルテニウム(Ru)で標識し1mM試験HLA−DR mAbと共に30分間室温で予めインキュベートしておいた参照HLA−DR mAbの混合物を添加する。穏やかに振盪しながら室温で2時間インキュベートした後、プレートを0.1M HEPES緩衝液(pH7.4)で3回洗浄する。MSD Read Buffer Tを蒸留水で希釈し(4倍)、各ウェルに分注し、次いで、SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)で分析する。試験抗体が参照抗体のHLA−DRへの結合を80%以上、例えば、85%以上、90%以上、又は95%以上阻害するとき、試験抗体は、HLA−DRへの結合に関して参照抗体と競合する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、HLA−DRのアンタゴニストである。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、T細胞の活性化を阻害する。
T細胞の活性化は、T細胞の増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞毒性エフェクター分子の放出、細胞毒性活性、又は活性化マーカーの発現であり得る。T細胞は、CD4+T細胞であり得る。T細胞の活性化を阻害する代表的な抗体は、本明細書に記載される抗体DR4B30、DR4B117、DR4B127、DR4B78、DR4B38、DR4B70、DR4B22、DR4B98、及びDR4B33である。
T細胞の活性化は、樹状細胞又は他の抗原提示細胞をCD4+T細胞と共培養する混合リンパ球反応(MLR)を用いて決定することができ、該細胞の増殖は、3H−チミジンの取り込みによって及び本明細書に記載される方法を用いることによって決定される。抗体は、アイソタイプ対照と比較して、T細胞の活性の少なくとも1つの特徴(例えば、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞毒性エフェクター分子の放出、細胞毒性活性、又は活性化マーカーの発現)を30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、若しくは100%阻害するとき、又はアイソタイプ対照の存在下における阻害と比較して、統計的に有意に阻害するとき、「T細胞の活性化を阻害する」。「アイソタイプ対照」は、周知である。あるいは、CD4+T細胞の活性化は、増加したインターフェロン−γ(IFN−γ)又はTNF−αの分泌をMLRアッセイにおいて測定することによってアッセイすることもできる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ヒトCD4+T細胞及びヒトHLA−DR4を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞の共培養下において、1μg/mLの抗体濃度でCD4+T細胞の増殖を少なくとも30%阻害する。
ヒトHLA−DR4を発現する代表的なトランスジェニック動物は、マウス系統4149、Taconic Biosciencesである。これらのマウスは、マウスI−E(H2−E)の膜近位ドメインを遺伝子操作したヒトHLA−DRA1*01及びHLA−DRB1*04:01を発現する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、HLA−DRの同種T細胞受容体(TCR)への結合を阻害しない。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号14のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR4の、同種TCRへの結合を阻害しない。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、HLA−DRのCD4への結合を阻害する。
「結合を阻害する」とは、アイソタイプ対照と比較したときの、該抗体の存在下でのHLA−DRのCD4又は同種TCRへの結合における測定可能な減少を指す。阻害は、アイソタイプ対照と比較したときの、結合の例えば30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は100%の減少、又はアイソタイプ対照の存在下での阻害と比較して、統計的に有意な阻害であり得る。したがって、該抗体は、アイソタイプ対照と比較して、阻害が29%未満であるか又は統計的に有意ではないとき、HLA−DRの同種TCRへの結合を阻害しない。
HLA−DRのTCRへの結合の阻害は、標準的なELISA実験を用いて実施され得る。代表的なアッセイでは、5μg/mLのHLA−DR抗原DR4G134(本明細書に記載)50μLをMDSプレートにコーティングし、該プレートを室温で10分間振盪し、4℃で一晩インキュベートする。該プレートをアッセイ緩衝液(1×DPBS、1% BSA、0.05% tween 20)でブロッキングし、10−2〜102mg/mLの濃度範囲の混合物又は試験抗体、5μg/mLの組み換えTCR(DRG79、本明細書に記載)、10μg/mL抗ヒスチジン抗体、及び2μg/mL SulfoTag−SAをウェルに添加する。該プレートを1時間インキュベートし、洗浄し、150μLのMSDリード緩衝液を添加した後、MSDで読み取った。
いくつかの実施形態では、該抗体又はその抗原結合断片は、
a)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号14のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR4に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)ポリソルベート20(PS−20)、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
b)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号15のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR1に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)PS−20、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
c)B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、
d)B細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでB細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
e)HLA−DRのCD4に対する結合を阻害する。
a)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号14のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR4に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)ポリソルベート20(PS−20)、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
b)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号15のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR1に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)PS−20、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
c)B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、
d)B細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでB細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
e)HLA−DRのCD4に対する結合を阻害する。
B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有しない代表的な抗体は、本明細書に記載の抗体DR4B117、DR4B30、DR4B127、DR4B98、及びDR4B33である、の特性のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つを有する。これらの抗体は、対照抗体DR4B4、DR4B5、及びDR4B6などのB細胞の死を誘導する抗体と比較したとき、改善された安全性プロファイルを有し得る。
B細胞のアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いて、サンプル、例えば、ヒト末梢血単核球(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞としてアポトーシスB細胞を同定して、測定することができる。本発明の抗体は、アイソタイプ対照で処理されたサンプルと比較して、試験抗体で処理されたサンプル中のB細胞のアポトーシスが統計的に有意に増加したとき、「B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有しない」。「Live/dead」とは、BioLegend製のeF660など、細胞死の機序にかかわらず、生細胞と死細胞とを識別する蛍光染料を指す。
B細胞の死を誘導する能力を有しない代表的な抗体は、本明細書に記載の抗体DR4B117、DR4B30、DR4B127、及びDR4B98、及びDR4B33である。これらの抗体は、対照抗体DR4B4、DR4B5、及びDR4B6などのB細胞の死を誘導する抗体と比較して、改善された安全性プロファイルを有し得る。
B細胞の死は、フローサイトメトリーを用いて、サンプル、例えば、ヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞として死B細胞を同定して、測定することができる。本発明の抗体は、アイソタイプ対照で処理されたサンプルと比較して、試験抗体で処理されたサンプル中のB細胞の死が統計的に有意に増加したとき、「B細胞の死を誘導する能力を有しない」。
HLA−DRのCD4への結合の阻害は、公知のプロトコール及び本明細書に記載のHLA−DR抗原を用いて、ELISAを用いて測定することができる。
いくつかの実施形態では、HLA−DRは、HLA−DR4、HLA−DR1、HLA−DR3、HLA−DR10、又はHLA−DR15である。
いくつかの実施形態では、HLA−DR4は、配列番号13のHLA−DRA*01:02及び配列番号14のHLA−DRB1*04:01を含む。
いくつかの実施形態では、HLA−DR1は、配列番号13のHLA−DRA1*01:02及び配列番号15のHLA−DRB1*01:01を含む。
いくつかの実施形態では、HLA−DR4は、配列番号13のHLA−DRA1*01:02及び配列番号106のHLA−DRB1*04:02を含む。
いくつかの実施形態では、HLA−DR3は、配列番号13のHLA−DRA1*01:02及び配列番号105のHLA−DRB1*03:01を含む。
いくつかの実施形態では、HLA−DR10は、配列番号13のHLA−DRA1*01:02及び配列番号107のHLA−DRB1*10:01を含む。
いくつかの実施形態では、HLA−DR15は、配列番号13のHLA−DRA1*01:02及び配列番号108のHLA−DRB1*15:01を含む。
様々なHLA−DRα及びβ鎖の命名法及びアミノ酸配列は、周知である。本発明の抗体は、HLA−DRB1が超多型性であることを考慮すると、複数のHLA−DR分子に特異的に結合し得る。
また、本発明は、HLA−DR4に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、約5×10−8M以下未満の平衡解離定数(KD)でHLA−DR4に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
抗体又はその抗原結合断片のHLA−DR4又は他のHLA−DR分子に対する親和性は、任意の好適な方法を用いて実験により決定することができる。このような方法では、ProteOn XPR36、Biacore 3000、若しくはKinExA装置、ELISA、又は当業者に公知の競合的結合アッセイを利用することができる。特定の抗体/HLA−DRの相互作用の親和性の測定値は、異なる条件下(例えば、浸透圧、pH)で測定した場合には異なり得る。したがって、親和性及び他の結合パラメータ(例えば、KD、Kon、Koff)の測定は、典型的には、標準的な条件及び本明細書に記載される緩衝液などの標準化緩衝液を用いて行われる。例えばBiacore 3000又はProteOnを用いた親和性測定での内部誤差(標準偏差SDとして測定される)は、典型的には、典型的な検出限界内で測定した場合、5〜33%の範囲内であり得る。したがって、KDに関して用語「約」は、アッセイにおける一般的な標準偏差を反映する。例えば、KDが1×10−9Mの場合の典型的なSDは、±0.33×10−9M以下である。
本明細書に記載される実験で用いられるHLA−DR分子は、可溶性Fc−融合タンパク質として発現され得る。HLA−DRに提示されるペプチドは、HLA−DRβ鎖のN末端に共有結合して、発現を促進し得る。ヘキサヒスチジン(配列番号3)又はStrepIIタグ(配列番号6)などのタグは、α及び/若しくはβ鎖又はFcに共有結合して、発現したタンパク質の精製を容易にし得る。提示されたペプチド、α及び/又はβ鎖、Fc部分、及び/又は様々なタグの間にリンカーを挿入してもよい。好適なリンカーは、グリシン/セリンリンカー(配列番号1又は4)、タバコエッチ病ウイルスNiaプロテアーゼ切断部位(配列番号2)、又はヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位(配列番号5)であり得る。HLA−DRに提示され得る好適なペプチドは、赤血球凝集素ペプチドHA_304−318(配列番号7)、II型コラーゲンペプチドCII_1236−1249若しくはCII_257−273(それぞれ配列番号8及び配列番号9)、ビメンチンペプチド(配列番号71)、アグリカンペプチド(配列番号72)、CLIPペプチド(配列番号104)、又はII型コラーゲンペプチドCII_259−273(配列番号122)であり得る。発現し得る代表的なHLA−DR分子は、:
α鎖:細胞外ドメイン又は特定のα鎖、配列番号1のリンカー、配列番号2のリンカー、配列番号1のリンカー、Fcドメイン、配列番号3のタグ
β鎖:配列番号7のペプチド、配列番号4のリンカー、配列番号5のリンカー、特定のβ鎖の細胞外ドメイン、配列番号4のリンカー、配列番号2のリンカー、配列番号4のリンカー、Fcドメイン、配列番号6のタグの構成を有し得る。α及びβ鎖は共発現し、得られるヘテロ二量体は、標準的な方法を用いて、例えば、His6及びStrepIIタグを用いて精製され得る。HLA−DP及びHLA−DQ分子は、同様に発現し得る。
α鎖:細胞外ドメイン又は特定のα鎖、配列番号1のリンカー、配列番号2のリンカー、配列番号1のリンカー、Fcドメイン、配列番号3のタグ
β鎖:配列番号7のペプチド、配列番号4のリンカー、配列番号5のリンカー、特定のβ鎖の細胞外ドメイン、配列番号4のリンカー、配列番号2のリンカー、配列番号4のリンカー、Fcドメイン、配列番号6のタグの構成を有し得る。α及びβ鎖は共発現し、得られるヘテロ二量体は、標準的な方法を用いて、例えば、His6及びStrepIIタグを用いて精製され得る。HLA−DP及びHLA−DQ分子は、同様に発現し得る。
また、本発明は、アミノ酸配列QKRAA(配列番号66)、QRRAA(配列番号67)、又はRRRAA(配列番号68)からなる共有エピトープを含有するHLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
HLA−DR対立遺伝子であるHLA−DRB1*01:01、*01:02、*04:01、*0404、*04:05、*04:08、及び*10:01における共有エピトープは、HLA−DRβ鎖における残基位置70〜74における5アミノ酸残基のモチーフQKRAA(配列番号66)、QRRAA(配列番号67)又はRRRAA(配列番号68)である。
共有エピトープを有するHLA−DR対立遺伝子は、RAなどの自己免疫疾患と関連しており、高親和性でT細胞によって非自己として認識されるシトルリン化ペプチドを提示することが示されている。例えば、RAでは、シトルリン化タンパク質(ACPA)を認識する自己抗体は、疾患の発症前(最長で疾患の14年前)に血清中に存在しており、RAと診断される2年前には顕著な増加を示す(Rantapaa−Dahlqvist et al.,Arthritis Rheum 2003;48(10):2741〜9;Nielen et al.,Arthritis Rheum 2004;50(2):380〜6;Van de Stadt et al.,Arthritis Rheum 2011;63(11):3226〜33)。HLA−DRB1は、健常ACPA+個体からRAのACPA+個体に進行するリスクに関連することが判明している(Hensvold et al.,Ann Rheum Dis 2015;74(2):375〜80)。したがって、RAの発症前のACPAの検出は、HLA−DRに特異的に結合する抗体による処理でT細胞の活性化を抑止し、血清の自己抗体レベルが更に上昇するのを防ぎ、RAの診断につながる炎症の増加を弱めることができる機会を提示する。共有エピトープを含有するHLA−DR分子と同種T細胞受容体との相互作用をブロッキングすることによって、又はHLA−DR分子における高次構造(及び/又は空間変化)を誘導してHLA−DRと同種T細胞受容体との相互作用を防ぐことによって、T細胞の活性化を阻害する抗体は、自己免疫疾患の治療だけでなく、予防においても有益であり得る。
共有エピトープを含有するHLA−DRに結合する代表的な抗体は、本明細書に記載される抗体DR4B117、DR4B30、DR4B127、DR4B98、DR4B78、DR4B38、DR4B70、DR4B22、及びDR4B33である。
いくつかの実施形態では、HLA−DRは、ペプチドとの複合体として存在する。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号7、8、又は9、71、72、104、又は122のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号7、8、又は9、71、72、104、又は122のアミノ酸配列からなる。
また、本発明は、それぞれ配列番号73、74、及び75の重鎖相補性決定領域1、2、及び3(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
配列番号73、74、及び75は、それぞれ、HLA−DRに特異的に結合するその抗原結合断片の抗体のHDR1、HCDR2、及びHCDR3属のアミノ酸配列を表す。属内の抗体は、T細胞の活性化を阻害し、かつB細胞の死を誘導する能力は有しない。代表的なこのような抗体は、本明細書に記載の抗体DR4B127及びDR4B98である。
図1は、HCDR1のアミノ酸配列及びHCDR1属の配列のアラインメントを示す。
図2は、HCDR2のアミノ酸配列及びHCDR2属の配列のアラインメントを示す。
図3は、HCDR3のアミノ酸配列及びHCDR3属の配列のアラインメントを示す。
配列番号73
SX1X2IX3;(式中、
X1は、Y又はDであり、
X2は、S、W、又はYであり、
X3は、H又はGである)。
SX1X2IX3;(式中、
X1は、Y又はDであり、
X2は、S、W、又はYであり、
X3は、H又はGである)。
配列番号74
GIX1PIX2GX3AX4YAQKFQG;(式中、
X1は、R又はAであり、
X2は、S又はYであり、
X3は、N又はTであり、又は
X4は、E又はYである)。
GIX1PIX2GX3AX4YAQKFQG;(式中、
X1は、R又はAであり、
X2は、S又はYであり、
X3は、N又はTであり、又は
X4は、E又はYである)。
配列番号75
DASX1X2RX3YGFDY;(式中、
X1は、Y又はWであり、
X2は、Y又はAであるか、又は
X3は、N又はAである)。
DASX1X2RX3YGFDY;(式中、
X1は、Y又はWであり、
X2は、Y又はAであるか、又は
X3は、N又はAである)。
また、本発明は、それぞれ配列番号76、77、及び78の軽鎖相補性決定領域1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
配列番号76、77、及び78は、それぞれ、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3属のアミノ酸配列を表す。属内の抗体は、T細胞の活性化を阻害し、B細胞のアポトーシス及び/又は死を誘導する能力を有しない。代表的なこのような抗体は、本明細書に記載の抗体DR4B117、DR4B30、DR4B127、及びDR4B98である。
図4は、LCDR1のアミノ酸配列及びLCDR1属の配列のアラインメントを示す。
図5は、LCDR2のアミノ酸配列及びLCDR2属の配列のアラインメントを示す。
図6は、LCDR3のアミノ酸配列及びLCDR3属の配列のアラインメントを示す。
配列番号76
RASQSVSSX1YLA;(式中、
X1は、S又は欠失している)。
RASQSVSSX1YLA;(式中、
X1は、S又は欠失している)。
配列番号77
X1ASX2RAT;(式中、
X1は、G又はDであり,
X2は、S又はNである)。
X1ASX2RAT;(式中、
X1は、G又はDであり,
X2は、S又はNである)。
配列番号78
QQX1X2X3X4PLT;(式中、
X1は、Y又はRであり、
X2は、G又はSであり、
X3は、S又はNであり、
X4は、S又はWである)。
QQX1X2X3X4PLT;(式中、
X1は、Y又はRであり、
X2は、G又はSであり、
X3は、S又はNであり、
X4は、S又はWである)。
また、本発明は、それぞれ配列番号73、74、及び75の重鎖相補性決定領域1、2、及び3(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)、並びにそれぞれ配列番号76、77、及び78の軽鎖相補性決定領域1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号56、57、58、59、137、138、139、140、又は141の重鎖可変領域(VH)に含有されているHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供し、該HCDR1、該HCDR2、及び該HCDR3は、Kabat、IMGT、又はChothiaによって定義される。
また、本発明は、配列番号60、61、又は142の軽鎖可変領域(VL)に含有されているLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供し、該LCDR1、該LCDR2、及び該LCDR3は、Kabat、IMGT、又はChothiaによって定義される。
また、本発明は、配列番号39、40、41、123、124、又は125のHCDR1を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号42、43、44、45、126、127、又は128のHCDR2を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号46、47、48、49、129、139、131、132、又は133のHCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号50、51、又は134のLCDR1を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号52、53、又は135のLCDR2を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号54、55、又は136のLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、
それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54、
それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55、
それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55、
それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55、
それぞれ配列番号123、126、129、51、53、及び55、
それぞれ配列番号123、126、130、51、53、及び55、
それぞれ配列番号123、126、131、51、53、及び55、
それぞれ配列番号124、127、132、134、135、及び136、又は
それぞれ配列番号125、128、133、51、53、及び55、のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54、
それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55、
それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55、
それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55、
それぞれ配列番号123、126、129、51、53、及び55、
それぞれ配列番号123、126、130、51、53、及び55、
それぞれ配列番号123、126、131、51、53、及び55、
それぞれ配列番号124、127、132、134、135、及び136、又は
それぞれ配列番号125、128、133、51、53、及び55、のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、
それぞれ配列番号56及び60、
それぞれ配列番号57及び61、
それぞれ配列番号58及び61、
それぞれ配列番号59及び61、
それぞれ配列番号137及び61、
それぞれ配列番号138及び61、
それぞれ配列番号139及び61、
それぞれ配列番号140及び142、又は
それぞれ配列番号141及び61、のVH及びVLを含む。
それぞれ配列番号56及び60、
それぞれ配列番号57及び61、
それぞれ配列番号58及び61、
それぞれ配列番号59及び61、
それぞれ配列番号137及び61、
それぞれ配列番号138及び61、
それぞれ配列番号139及び61、
それぞれ配列番号140及び142、又は
それぞれ配列番号141及び61、のVH及びVLを含む。
いくつかの実施形態では、VH及びVLは、
それぞれ配列番号79及び80、
それぞれ配列番号81及び82、
それぞれ配列番号83及び82、
それぞれ配列番号121及び82、
それぞれ配列番号143及び82、
それぞれ配列番号144及び82、
それぞれ配列番号145及び82、
それぞれ配列番号146及び148、又は
それぞれ配列番号147及び82のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている。
それぞれ配列番号79及び80、
それぞれ配列番号81及び82、
それぞれ配列番号83及び82、
それぞれ配列番号121及び82、
それぞれ配列番号143及び82、
それぞれ配列番号144及び82、
それぞれ配列番号145及び82、
それぞれ配列番号146及び148、又は
それぞれ配列番号147及び82のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている。
いくつかの実施形態では、抗体は、
それぞれ配列番号84及び88、
それぞれ配列番号85及び89、
それぞれ配列番号86及び89、
それぞれ配列番号87及び89、
それぞれ配列番号96及び88、
それぞれ配列番号97及び89、
それぞれ配列番号98及び89、
それぞれ配列番号99及び89、
それぞれ配列番号149及び89、
それぞれ配列番号150及び89、
それぞれ配列番号151及び89、
それぞれ配列番号152及び154、又は
それぞれ配列番号153及び89、のHC及びLCを含む。
それぞれ配列番号84及び88、
それぞれ配列番号85及び89、
それぞれ配列番号86及び89、
それぞれ配列番号87及び89、
それぞれ配列番号96及び88、
それぞれ配列番号97及び89、
それぞれ配列番号98及び89、
それぞれ配列番号99及び89、
それぞれ配列番号149及び89、
それぞれ配列番号150及び89、
それぞれ配列番号151及び89、
それぞれ配列番号152及び154、又は
それぞれ配列番号153及び89、のHC及びLCを含む。
また、本発明は、それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体重鎖フレームワークは、IGHV1−69(配列番号62)に由来し、抗体軽鎖フレームワークは、IGKV3−20(配列番号64)に由来する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸残基E3、F108、D110、及びR140において配列番号13のHLA−DRA1*01:02に、アミノ酸残基V143及びQ149において配列番号14のHLA−DRB1*04:01に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸残基K2、E3、V6、E88、V89、T90、F108、D110、K111、R140、L144、R146、及びK176において配列番号13のHLA−DRA1*01:02に、アミノ酸残基L114、K139、V142、V143、S144、T145、L147、I148、Q149、及びE162において配列番号14のHLA−DRB1*04:01に結合する。
これらアミノ酸残基でHLA−DRに結合する抗体又はその抗原結合断片は、CD4結合部位においてHLA−DRに結合し、HLA−DRの同種TCRへの結合をブロックしない。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号56の重鎖可変ドメイン(VH)及び配列番号60の軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
いくつかの実施形態では、抗体VHは、配列番号79のポリヌクレオチドによってコードされており、VLは、配列番号80のポリヌクレオチドによってコードされている。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG3アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG4アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のFcγR又はFcRnへの結合を調節する、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、又はFcγRIIIbへの結合を減少させる、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG2と比較したとき、V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331S置換を含むIgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG1と比較したとき、L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331S置換を含むIgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG1と比較したとき、L234A及びL235A置換を含むIgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG4と比較したとき、S228P、F234A、及びL235A置換を含むIgG4アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号84のHC及び配列番号88のLCを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号96のHC及び配列番号88のLCを含む。
また、本発明は、
a)
i)それぞれ配列番号40、43、及び47、
ii)それぞれ配列番号41、44、及び48、又は
iii)それぞれ配列番号41、45、及び49のHCDR1、HCDR2、HCDR3、並びに
b)それぞれ配列番号51、53、及び55のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
a)
i)それぞれ配列番号40、43、及び47、
ii)それぞれ配列番号41、44、及び48、又は
iii)それぞれ配列番号41、45、及び49のHCDR1、HCDR2、HCDR3、並びに
b)それぞれ配列番号51、53、及び55のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体重鎖フレームワークは、IGHV5−51(配列番号63)に由来し、抗体軽鎖フレームワークは、IGKV3−11(配列番号65)に由来する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号57の重鎖可変ドメイン(VH)及び配列番号61の軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
いくつかの実施形態では、VHは、配列番号81のポリヌクレオチドによってコードされており、VLは、配列番号82のポリヌクレオチドによってコードされている。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG3アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG4アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のFcγR又はFcRnへの結合を調節する、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa又はFcγRIIIbへの結合を減少させる、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG2と比較したとき、V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331S置換を含むIgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG1と比較したとき、L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331S置換を含むIgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG1と比較したとき、L234A及びL235A置換を含むIgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG4と比較したとき、S228P、F234A、及びL235A置換を含むIgG4アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号85のHC及び配列番号89のLCを含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号97のHC及び配列番号89のLCを含む。
また、本発明は、それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体重鎖フレームワークは、IGHV1−69(配列番号62)に由来し、抗体軽鎖フレームワークは、IGKV3−11(配列番号65)に由来する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸残基K2において配列番号13のHLA−DRA1*01:02に、アミノ酸残基D41、S126、R130、V142、及びQ149において配列番号14のHLA−DRB1*04:01に結合する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸残基I1、K2、E3、D27、R140、E141、D142、及びH143において配列番号13のHLA−DRA1*01:02に、アミノ酸残基H16、F17、R23、R25、R29、R39、D41、D43、V44、V50、G125、S126、E128、V129、R130、V142、G146、L147、Q149、及びV159において配列番号14のHLA−DRB1*04:01に結合する。
これらアミノ酸残基でHLA−DRに結合する抗体又はその抗原結合断片は、CD4結合部位においてHLA−DRに結合し、HLA−DRの同種TCRへの結合をブロックしない。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号58の重鎖可変ドメイン(VH)及び配列番号61の軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
いくつかの実施形態では、VHは、配列番号83のポリヌクレオチドによってコードされており、VLは、配列番号82のポリヌクレオチドによってコードされている。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG3アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG4アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のFcγR又はFcRnへの結合を調節する、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa又はFcγRIIIbへの結合を減少させる、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG2と比較したとき、V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331S置換を含むIgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG1と比較したとき、L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331S置換を含むIgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG1と比較したとき、L234A及びL235A置換を含むIgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG4と比較したとき、S228P、F234A、及びL235A置換を含むIgG4アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号86の重鎖(HC)及び配列番号89の軽鎖(LC)を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号98の重鎖(HC)及び配列番号89の軽鎖(LC)を含む。
また、本発明は、それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体重鎖フレームワークは、IGHV1−69(配列番号62)に由来し、抗体軽鎖フレームワークは、IGKV3−11(配列番号65)に由来する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号59の重鎖可変ドメイン(VH)及び配列番号61の軽鎖可変ドメイン(VL)を含む。
いくつかの実施形態では、VHは、配列番号121のポリヌクレオチドによってコードされており、VLは、配列番号82のポリヌクレオチドによってコードされている。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG3アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、IgG4アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のFcγR又はFcRnへの結合を調節する、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、該抗体のFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa又はFcγRIIIbへの結合を減少させる、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG2と比較したとき、V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331S置換を含むIgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG1と比較したとき、L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331S置換を含むIgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG1と比較したとき、L234A及びL235A置換を含むIgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、野生型IgG4と比較したとき、S228P、F234A、及びL235A置換を含むIgG4アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号87の重鎖(HC)及び配列番号89の軽鎖(LC)を含む。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号99の重鎖(HC)及び配列番号89の軽鎖(LC)を含む。
表2は、選択HLA−DR抗体のKabat CDRアミノ酸配列の配列番号を示す。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、IGHV1−69(配列番号62)、IGHV5−51(配列番号63)、又はIGHV3_3−23(配列番号161)に由来する重鎖フレームワークを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体が、IGKV3−20(配列番号64)、IGKV3−11(配列番号65)、又はIGKV1−39(配列番号162)に由来する軽鎖フレームワークを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、IGHV1−69(配列番号62)に由来し、軽鎖フレームワークがIGKV3−20(配列番号64)に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、IGHV5−51(配列番号63)に由来し、軽鎖フレームワークがIGKV3−11(配列番号65)に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、IGHV1−69(配列番号62)に由来し、軽鎖フレームワークがIGKV3−11(配列番号65)に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、IGHV3−23(配列番号161)に由来し、軽鎖フレームワークがIGKV3−11(配列番号65)に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖フレームワークが、IGHV5−51(配列番号63)に由来し、軽鎖フレームワークがIGKV1−39(配列番号162)に由来する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
特定のフレームワーク又は生殖系列配列「に由来する」重鎖又は軽鎖可変領域を含む本発明の抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から、例えば、本明細書で論じられるトランスジェニックマウス又はファージディスプレイライブラリなどから得られる抗体を指す。特定のフレームワーク又は生殖系列配列「に由来する」抗体は、例えば自然に生じる体細胞突然変異又は意図的な置換のために、由来とする配列と比較したときにアミノ酸の違いを含み得る。特定のVH及びVLフレームワーク配列を有し、HLA−DRに特異的に結合する、代表的な抗体を表17に示す。
また、本発明は、配列番号56、57、58、59、137、138、139、140、又は141のVHを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号60、61、又は142のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号56のVH及び配列番号60のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号57のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号58のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号59のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体を提供する。
また、本発明は、配列番号57、58、又は59のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
HLA−DRに特異的に結合する代表的な抗体又はその抗原結合断片のVH及びVLアミノ酸配列を表14、表15、及び表16に示す。
実施例で説明する実施形態は、一方が重鎖に由来し、一方が軽鎖に由来する可変ドメインの対を含むが、当業者であれば、代替的な実施形態が単一の重鎖又は軽鎖可変ドメインを含み得ることを認識するであろう。単一の可変ドメインを用いて、例えばHLA−DRに結合することができる2ドメイン特異的抗原結合断片を形成することができる可変ドメインについてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、国際公開第1992/01047号に開示されている階層的二重コンビナトリアルアプローチ(hierarchical dual combinatorial approach)を用いたファージディスプレイスクリーニング法によって行うことができる。このアプローチでは、VH鎖又はVL鎖のいずれかのクローンを含む個別のコロニーを用いて、他方の鎖(VL又はVH)をコードしているクローンの完全なライブラリに感染させ、得られた二本鎖特異的抗原結合ドメインを公知の方法及び本明細書に記載されるものを用いてファージディスプレイ技術に従って選択する。したがって、個別のVH及びVLポリペプチド鎖は、国際特許公開第1992/01047号に開示されている方法を用いて、HLA−DRに特異的に結合する更なる抗体を同定するのに有用である。
相同抗体
表14、表15、及び表16に示すVH又はVLアミノ酸配列を含む本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の変異体は、本発明の範囲内である。例えば、変異体は、親抗体と比較したとき、相同抗体が機能特性を保持しているか又は改善された機能特性を有しているという条件で、VH及び/又はVLに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本発明のVH又はVLアミノ酸配列に対して、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%であり得る。
表14、表15、及び表16に示すVH又はVLアミノ酸配列を含む本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の変異体は、本発明の範囲内である。例えば、変異体は、親抗体と比較したとき、相同抗体が機能特性を保持しているか又は改善された機能特性を有しているという条件で、VH及び/又はVLに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、配列同一性は、本発明のVH又はVLアミノ酸配列に対して、約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%であり得る。
HLA−DRに特異的に結合する相同抗体又はその抗原結合断片は、アンタゴニストであり、
a)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号14のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR4に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)ポリソルベート20(PS−20)、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
b)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号15のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR1に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)PS−20、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
c)B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、
d)B細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでB細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
e)HLA−DRのCD4に対する結合を阻害する。
a)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号14のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR4に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)ポリソルベート20(PS−20)、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
b)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号15のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR1に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)PS−20、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
c)B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、
d)B細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでB細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
e)HLA−DRのCD4に対する結合を阻害する。
また、本発明は、配列番号56のVH及び配列番号60のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意追加的に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する、の特性のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つを有する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、配列番号57のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、配列番号58のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、配列番号59のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、配列番号137のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、配列番号138のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、配列番号139のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、配列番号140のVH及び配列番号142のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、配列番号141のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、該VH、該VL、又は該VH及び該VLの両方が、任意に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸置換を含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に置換は全く存在しない。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号56、57、58、59、137、138、139、140、141のVHと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列を有するVHを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に上記配列番号の配列の変異は全く存在しない。
また、本発明は、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号60、61、又は142のVLと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一のアミノ酸配列を有するVLを含む抗体又はその抗原結合断片を提供する。所望により、CDR内に上記配列番号の配列の変異は全く存在しない。
HLA−DRに特異的に結合する選択抗体のVHドメインのアミノ酸配列のアラインメントを図7に示し、選択抗体のVLドメインのアミノ酸配列のアラインメントを図8に示す。VH及びVL鎖は、各行の先頭の配列番号によって特定される。抗体間で異なる残基位置が、VH及び/又はVLにおいて置換可能な部位である。例えば、置換は、配列番号56、57、58、又は59のVHにおける残基位置1、16、18、20、24、27、28、30、40、43、67、71、74、76、81、82、83、87、88、89において行われ得る。行われ得る代表的な置換は、保存的アミノ酸置換、又はHLA−DRに特異的に結合する各抗体における対応する残基位置に存在するアミノ酸残基による置換であり得る。例えば、配列番号58のVHでは、アミノ酸残基位置1、16、18、20、24、27、28、30、40、43、67、71、74、76、81、82、83、87、88、89は、配列番号56、57又は59のVHに存在する対応する残基で、又は本明細書に記載される保存的改変が生じるアミノ酸で置換され得る。例えば、配列番号61のVLでは、アミノ酸残基位置9、61、78は、配列番号60のVLに存在する対応する残基で、又は本明細書に記載される保存的改変が生じるアミノ酸で置換され得る。
2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一の位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一の位置の数/位置の総数×100)。
2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているE.Meyers及びW.Millerのアルゴリズム(Comput.Appl.Biosci 4:11〜17(1988))を使用して、PAM120重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を使用して決定することができる。更に、2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、GCGソフトウェアパッケージ(http://_www_gcg_comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunschのアルゴリズム(J.Mol.Biol.48:444〜453(1970))を使用して、Blossum 62マトリクス又はPAM250マトリクス、ギャップ重み付け(gap weight)16、14、12、10、8、6、又は4、長さ重み付け(length weight)1、2、3、4、5、又は6を使用して決定することもできる。
保存的改変を有する抗体
また、本発明は、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列を含むVHと、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列を含むVLとを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、CDR配列のうちの1つ以上が、本明細書に記載の抗体(例えば、表12若しくは表14に示す抗体)に基づく指定のアミノ酸配列又はその保存的改変を含み、該抗体が、HLA−DRに特異的に結合する親抗体の所望の機能特性を保持している抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3配列を含むVHと、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3配列を含むVLとを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、CDR配列のうちの1つ以上が、本明細書に記載の抗体(例えば、表12若しくは表14に示す抗体)に基づく指定のアミノ酸配列又はその保存的改変を含み、該抗体が、HLA−DRに特異的に結合する親抗体の所望の機能特性を保持している抗体又はその抗原結合断片を提供する。
保存的改変を有する、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、アンタゴニストであり、
a)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号14のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR4に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)ポリソルベート20(PS−20)、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
b)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と、配列番号15のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR1に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)PS−20、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
c)B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、
d)B細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでB細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
e)HLA−DRのCD4に対する結合を阻害する、の特性のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つを有する。
a)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号14のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR4に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)ポリソルベート20(PS−20)、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
b)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と、配列番号15のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR1に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)PS−20、及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
c)B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、
d)B細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでB細胞の死は、フローサイトメトリーを用いてヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
e)HLA−DRのCD4に対する結合を阻害する、の特性のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つを有する。
また、本発明は、それぞれ配列番号39、42、及び46のHCDR1、HCDR2、HCDR3、並びにそれぞれ配列番号50、52、及び54のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号123、126、129、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号123、126、130、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号123、126、131、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号124、127、132、134、135、及び136のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、それぞれ配列番号125、128、133、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号56のVH及び配列番号60のVL、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号57のVH及び配列番号61のVL、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号58のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片、及びこれらの保存的改変を提供する。
また、本発明は、配列番号59のVH及び配列番号61のVL、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号137のVH及び配列番号61のVL、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号138のVH及び配列番号61のVL、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号139のVH及び配列番号61のVL、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号140のVH及び配列番号142のVL、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、配列番号141のVH及び配列番号61のVL、並びにこれらの保存的改変を含む、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
「保存的改変」とは、アミノ酸改変を含有する抗体の結合特性に著しく影響を与えることも変化させることもないアミノ酸改変を指す。保存的改変は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、明確に定義されており、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン)、芳香族側鎖(例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン)、脂肪族側鎖(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン)、アミド(例えば、アスパラギン、グルタミン)、β分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、及び含硫黄側鎖(システイン、メチオニン)を有するアミノ酸を含む。更に、アラニンスキャニング突然変異誘発について既に記載されているように(MacLennan et al.,(1988)Acta Physiol Scand Suppl 643:55〜67;Sasaki et al.,(1988)Adv Biophys 35:1〜24)、ポリペプチド中の任意のネイティブ残基をアラニンで置換してもよい。本発明の抗体に対するアミノ酸置換は、例えばPCR変異導入法(米国特許第4,683,195号)などの周知の方法によって行うことができる。あるいは、変異体のライブラリは、例えば、ランダムコドン(NNK)又は非ランダムコドン(例えば11個のアミノ酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)をコードするDVKコドン)を用いて生成することもできる。結果として生じる抗体変異体は、それらの特性に関して、本明細書に記載のアッセイを用いて試験することができる。
遺伝子操作及び改変された抗体
本発明の抗体又はその抗原結合断片を更に遺伝子操作して、親抗体と比較して類似の特性又は変化した特性を有する改変抗体を作製することができる。本発明の抗体では、VH、VL、VH及びVL、定常領域、重鎖フレームワーク、軽鎖フレームワーク、又は6つのCDRのうちのいずれか若しくはすべてが遺伝子操作されていてもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片を更に遺伝子操作して、親抗体と比較して類似の特性又は変化した特性を有する改変抗体を作製することができる。本発明の抗体では、VH、VL、VH及びVL、定常領域、重鎖フレームワーク、軽鎖フレームワーク、又は6つのCDRのうちのいずれか若しくはすべてが遺伝子操作されていてもよい。
本発明の抗体は、CDRグラフト化により遺伝子操作されてもよい。本発明の抗体の1つ以上のCDR配列を、異なるフレームワーク配列にグラフト化してもよい。CDRグラフト化は、公知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して行うことができる。
使用され得るフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開DNAデータベース又は刊行されている参照文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子に関する生殖系列DNA及びコードタンパク質配列は、IMGT(登録商標)、international ImMunoGeneTics information system(登録商標)http://_www−imgt_orgに見出すことができる。本発明の抗体の既存のフレームワーク配列を置き換えるために用いることができるフレームワーク配列は、VH若しくはVLの全長、又はFR1、FR2、FR3、及びFR4の長さにわたって親可変ドメインに対して最も高い同一性パーセント(%)を示すものであってよい。更に、好適なフレームワークは、更に、VH及びVLのCDR1及びCDR2の長さ、又は同一のLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、及びHCDR2の標準構造に基づいて選択され得る。好適なフレームワークは、公知の方法、例えば、米国特許第8,748,356号に記載のヒトフレームワーク適応又は米国特許第7,709,226号に記載の超ヒト化を用いて選択され得る。
親抗体及び遺伝子操作を受けた抗体のフレームワーク配列を、更に、例えば米国特許第6,180,370号に記載のとおり、復帰突然変異によって更に改変して、生成される抗体の抗原への結合を回復及び/又は改善させることができる。親抗体又は遺伝子操作を受けた抗体のフレームワーク配列を、更に、フレームワーク領域内の(あるいは1つ以上のCDR領域内の)1つ以上の残基を変異させることによって改変して、T細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低減することもできる。このアプローチは「脱免疫」とも呼ばれ、米国特許出願公開第20070014796号に更に詳述されている。
本発明の抗体のCDR残基を変異させて、HLA−DRに対する抗体の親和性を改善することができる。
本発明の抗体のCDR残基を変異させて、翻訳後修飾のリスクを最小化することができる。脱アミノ化(NS)、酸触媒加水分解(DP)、異性化(DS)、又は酸化(W)についての推定モチーフのアミノ酸残基を天然のアミノ酸のいずれかで置換して、該モチーフの突然変異を誘発することができ、得られた抗体を、本明細書に記載の方法を用いて、その機能及び安定性について試験することができる。
安定性、選択性、交差反応性、親和性、免疫原性、又は他の望ましい生物学的若しくは生物物理学的特性を改善するために改変され得る本発明の抗体は、本発明の範囲内である。抗体の安定性は、分子内力及び分子間力の中でも特に、(1)固有の安定性に影響を及ぼす個々のドメインのコアパッキング、(2)HCとLCとの対合に影響するタンパク質/タンパク質界面相互作用、(3)極性残基及び帯電残基の埋没、(4)極性残基及び帯電残基の水素(H)結合ネットワーク、並びに(5)表面電荷及び極性残基の分布、を含む、多くの要因によって影響を受ける(Worn et al.,(2001)J Mol Biol 305:989〜1010)。構造を不安定化させる可能性のある残基は、抗体の結晶構造に基づいて、又は場合によっては分子モデリングによって同定することができ、また、抗体の安定性に対する該残基の効果は、同定された残基において変異を保有する変異体を作製及び評価することによって試験することができる。抗体の安定性を高める方法の1つには、示差走査熱量測定法(DSC)によって測定したときの熱転移中点温度(Tm)を高くするというものがある。一般に、タンパク質のTmは、その安定性と相関しており、溶液中でのアンフォールディング及び変性のし易さ、並びにそのタンパク質がアンフォールディングする傾向に応じた分解プロセスとは逆相関する(Remmele et al.,(2000)Biopharm 13:36〜46)。多数の研究で、DSCによって熱安定性として測定された配合物(formulations)の物理的安定性のランク付けと他の方法によって測定された物理的安定性との間に相関が見出されている(Gupta et al.,(2003)AAPS PharmSci 5E8;Zhang et al.,(2004)J Pharm Sci 93:3076〜89;Maa et al.,(1996)Int J Pharm 140:155〜68;Bedu−Addo et al.,(2004)Pharm Res 21:1353〜61;Remmele et al.,(1997)Pharm Res 15:200〜8)。配合物の研究により、FabのTmは、対応するmAbの長期物理的安定性と密接な関係があることが示唆されている。
C末端リジン(CTL)は、注入された抗体から、血流中の内因性循環カルボキシペプチダーゼによって除去され得る(Cai et al.,(2011)Biotechnol Bioeng 108:404〜412)。製造中、米国特許出願公開第20140273092号に記載のとおり、細胞外Zn2+、EDTA、又はEDTA−Fe3+の濃度を制御することによって、CTLの除去を最高レベル未満に制御することができる。抗体のCTL含量は、公知の方法を用いて測定することができる。
いくつかの実施形態では、HLA−DRに特異的に結合する抗体は、約10%〜約90%、約20%〜約80%、約40%〜約70%、約55%〜約70%、又は約60%のC末端リジン含量を有する。
本発明の抗体に対してFc置換を行って、抗体エフェクター機能及び/又は薬物動態特性を調節することができる。従来の免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用の結果、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞障害、マスト細胞の脱顆粒、及び食作用から免疫調整性シグナル、例えば、リンパ球の増殖及び抗体の分泌の制御に及ぶ広範な応答が生じる。これら相互作用のすべてが、抗体又は免疫複合体のFcドメインの、細胞上の特殊な細胞表面受容体への結合を通して開始される。抗体及び免疫複合体によって誘発される細胞応答の多様性は、Fc受容体:FcγRI(CD64)の異種性から生じ、FcγRIIa(CD32A)及びFcγRIII(CD16)は、Fcγ受容体を活性化し(すなわち、免疫系の増強)、一方、FcγRIIb(CD32B)は、阻害性Fcγ受容体である(すなわち、免疫系の減弱)。FcRn受容体への結合は、抗体の半減期を調節する。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、Fc領域に少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、Fc領域に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個の置換を含む。
抗体の半減期を調節するために置換され得るFc位置は、例えば、Dall’Acqua et al.,(2006)J Biol Chem 281:23514〜240、Zalevsky et al.,(2010)Nat Biotechnol 28:157〜159、Hinton et al.,(2004)J Biol Chem 279(8):6213〜6216、Hinton et al.,(2006)J Immunol 176:346〜356、Shields et al.(2001)J Biol Chem 276:6591〜6607、Petkova et al.,(2006).Int Immunol 18:1759〜1769、Datta−Mannan et al.,(2007)Drug Metab Dispos,35:86〜94,2007、Vaccaro et al.,(2005)Nat Biotechnol 23:1283〜1288、Yeung et al.,(2010)Cancer Res,70:3269〜3277、及びKim et al.,(1999)Eur J Immunol 29:2819に記載されているものであり、250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434、及び435位を含む。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な置換は、置換T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A、及びH435Rである。抗体の半減期を延長するために行うことができる代表的な単独又は組み合わせの置換は、置換M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、及びT307A/E380A/N434Aである。抗体の半減期を短縮するために行うことができる代表的な単独又は組み合わせの置換は、置換H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及びH435Rである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、アミノ酸位置250、252、253、254、256、257、307、376、380、428、434、又は435において、抗体Fcに少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、T250Q、M252Y、I253A、S254T、T256E、P257I、T307A、D376V、E380A、M428L、H433K、N434S、N434A、N434H、N434F、H435A、及びH435Rからなる群から選択される、抗体Fcにおける少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、T307A/E380A/N434A、H435A、P257I/N434H、D376V/N434H、M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F、T308P/N434A、及びH435Rからなる群から選択される、抗体Fcにおける少なくとも1つの置換を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、抗体の活性化Fcγ受容体(FcγR)への結合を減少させる及び/又はC1q結合、補体依存性細胞傷害(CDC)、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)、若しくは貪食作用(ADCP)などのFcエフェクター機能を低下させる、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む。
抗体の活性化FcγRへの結合を減少させ、続いて、エフェクター機能を低下させるために置換され得るFc位置は、例えば、Shields et al.,(2001)J Biol Chem 276:6591〜6604、国際公開第2011/066501号、米国特許第6,737,056号及び同第5,624,821号、Xu et al.,(2000)Cell Immunol,200:16〜26、Alegre et al.,(1994)Transplantation 57:1537〜1543、Bolt et al.,(1993)Eur J Immunol 23:403〜411、Cole et al.,(1999)Transplantation,68:563〜571、Rother et al.,(2007)Nat Biotechnol 25:1256〜1264、Ghevaert et al.,(2008)J Clin Invest 118:2929〜2938、An et al.,(2009)mAbs,1:572〜579)に記載されているものであり、214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331、及び365位を含む。単独で又は組み合わせて行うことができる代表的な置換は、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4における置換K214T、E233P、L234V、L234A、G236の欠失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S、及びP331Sである。ADCCの少ない抗体が得られる代表的な組み合わせ置換は、IgG1における置換L234A/L235A、IgG2におけるV234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、IgG4におけるF234A/L235A、IgG4におけるS228P/F234A/L235A、すべてのIgアイソタイプにおけるN297A、IgG2におけるV234A/G237A、IgG1におけるK214T/E233P/L234V/L235A/G236−欠失/A327G/P331A/D365E/L358M、IgG2におけるH268Q/V309L/A330S/P331S、IgG1におけるS267E/L328F、IgG1におけるL234F/L235E/D265A、IgG1におけるL234A/L235A/G237A/P238S/H268A/A330S/P331S、IgG4におけるS228P/F234A/L235A/G237A/P238S、及びIgG4におけるS228P/F234A/L235A/G236−欠失/G237A/P238Sである。IgG2由来の残基117〜260及びIgG4由来の残基261〜447を有するFcなどのハイブリッドIgG2/4 Fcドメインを使用してもよい。
IgG4の安定性を高めるために、周知のS228P置換をIgG4抗体に行うことができる。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、少なくとも1つの残基位置214、233、234、235、236、237、238、265、267、268、270、295、297、309、327、328、329、330、331、又は365に置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、K214T、E233P、L234V、L234A、G236の欠失、V234A、F234A、L235A、G237A、P238A、P238S、D265A、S267E、H268A、H268Q、Q268A、N297A、A327Q、P329A、D270A、Q295A、V309L、A327S、L328F、A330S、及びP331Sからなる群から選択される少なくとも1つの置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、少なくとも1つの残基位置228、234、235、237、238、268、330、又は331に置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、S228P置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、V234A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、F234A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、G237A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、P238S置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、H268A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、Q268A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、A330S置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、P331S置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331S置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331S置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、F234A、L235A、G237A、P238S、及びQ268A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、L234A、L235A、又はL234A及びL235A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、F234A、L235A、又はF234A及びL235A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、S228P、F234A、及びL235A置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、S228P置換を含み、残基の付番はEUインデックスに従う。
相同抗体、保存的改変を有する抗体、及び遺伝子操作及び改変されている抗体の生成方法
親抗体と比較してアミノ酸配列が変化している本発明の抗体は、標準的なクローニング及び発現技術を用いて生成され得る。例えば、部位特異的変異導入又はPCRを介在させることによる変異導入を実施して変異を導入することができ、抗体結合又は他の所望の特性に対する影響を、周知の方法及び本明細書において実施例に記載されている方法を用いて評価することができる。
親抗体と比較してアミノ酸配列が変化している本発明の抗体は、標準的なクローニング及び発現技術を用いて生成され得る。例えば、部位特異的変異導入又はPCRを介在させることによる変異導入を実施して変異を導入することができ、抗体結合又は他の所望の特性に対する影響を、周知の方法及び本明細書において実施例に記載されている方法を用いて評価することができる。
抗体のアイソタイプ及びアロタイプ
本発明の抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4アイソタイプであり得る。
本発明の抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4アイソタイプであり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、IgG1アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、IgG2アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、IgG3アイソタイプである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、IgG4アイソタイプである。
治療用抗体の免疫原性は、注入反応のリスク増大及び治療応答の期間短縮に関連している(Baert et al.,(2003)N Engl J Med 348:602〜08)。宿主において治療用抗体が免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプによって部分的に決定され得る(Stickler et al.,(2011)Genes and Immunity 12:213〜21)。抗体のアロタイプは、抗体の定常領域配列における特定の位置のアミノ酸配列の変異に関連する。表3は、選択IgG1、IgG2、及びIgG4アロタイプを示す。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、G2m(n)アロタイプである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、G2m(n−)アロタイプである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、G2m(n)/(n−)アロタイプである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、nG4m(a)アロタイプである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、G1m(17)アロタイプである。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体は、G1m(17,1)アロタイプである。
抗イディオタイプ抗体
また、本発明は、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
また、本発明は、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
また、本発明は、配列番号56のVH及び配列番号60のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
また、本発明は、配列番号57のVH及び配列番号61のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
また、本発明は、配列番号58のVH及び配列番号61のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
また、本発明は、配列番号59のVH及び配列番号61のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体を提供する。
また、本発明は、配列番号137のVH及び配列番号61のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
また、本発明は、配列番号138のVH及び配列番号61のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
また、本発明は、配列番号139のVH及び配列番号61のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
また、本発明は、配列番号140のVH及び配列番号142のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
また、本発明は、配列番号141のVH及び配列番号61のVLを含む抗体に特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。
抗イディオタイプ(Id)抗体は、抗体の抗原決定基(例えば、パラトープ又はCDR)を認識する抗体である。Id抗体は、抗原をブロッキングするものであっても、しないものであってもよい。抗原をブロッキングするIdを使用して、サンプル中の遊離抗体(例えば、本明細書に記載される本発明の抗HLA−DR抗体)を検出することができる。ブロッキングしないIdを使用して、サンプル中の全抗体(遊離しているもの、抗原に一部結合しているもの、又は抗原に完全に結合しているもの)を検出することができる。Id抗体は、抗Idが調製されている抗体で動物を免疫することによって調製することができる。
また、更に別の動物で免疫応答を誘導する免疫原として抗Id抗体を使用して、いわゆる抗−抗Id抗体を生成することもできる。抗−抗Idは、抗Idを誘導した元のmAbとエピトープが同一であり得る。したがって、mAbのイディオタイプ決定基に対する抗体を使用することによって、同一の特異性の抗体を発現する他のクローンを同定することが可能である。抗Id抗体は様々であってよく(これにより抗Id抗体変異体が産生される)、及び/又はHLA−DR抗体に特異的に結合する抗体に関して本明細書の他の箇所に記載されているものなどの任意の好適な技術によって誘導体化してもよい。
本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体のコンジュゲート
また、本発明は、異種分子にコンジュゲートしている、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明は、異種分子にコンジュゲートしている、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態では、異種分子は、検出可能な標識又は細胞毒性剤である。
また、本発明は、検出可能な標識にコンジュゲートしている、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
また、本発明の抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートしている、HLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
HLA−DRに結合する抗体又はその抗原結合断片は、HLA−DR発現細胞に治療薬を導くために用いることができる。HLA−DRを過剰発現する腫瘍細胞は、HLA−DR抗体の取り込み時に、細胞を殺傷する細胞毒性剤をコンジュゲートされている、HLA−DRに特異的に結合する抗体の標的となり得る。あるいは、HLA−DRを発現している悪性細胞は、取り込まれることにより細胞機能を改変することを意図する治療薬(例えば、転写因子阻害剤)とカップリングされているHLA−DR抗体の標的となり得る。血液癌細胞及び組織癌細胞は、HLA−DRを発現することが報告されている(Cabrera et al.,Scand J Immunol 1995;41:398〜406;Altomonte et al.,Oncogene 2003;22:6564〜6569)ので、これら細胞を標的とする抗体の使用は、治療効果を提供し得る。
本発明の抗体は、細胞によって取り込まれるが、所望により、B細胞のアポトーシス及び/又は死を誘導しない。これらの抗体は、細胞毒性剤にコンジュゲートし得、血液悪性腫瘍などのHLA−DR陽性腫瘍を治療するために用いられ得る。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は細胞毒性剤でもある。
検出可能な標識にコンジュゲートしており本発明のHLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、様々なサンプルにおけるHLA−DRの発現を評価するために用いられ得る。
検出可能な標識は、本発明のHLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートしたときに、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段を介して後者を検出可能なものとする組成物を含む。
代表的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素(例えば、一般的にELISAにおいて使用される)、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンシレート(scintillates)、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインA、プロテインG、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ni2+、Flagタグ、mycタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体/受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。
検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。他の場合、検出可能な標識は、外部場によって刺激された結果として、シグナルを発する。
代表的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、アルファ放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。代表的な放射性同位体としては、3H、11C、13C、15N、18F、19F、55Co、57Co、60Co、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、72As、75Br、86Y、89Zr、90Sr、94mTc、99mTc、115In、1231、1241、125I、1311、211At、212Bi、213Bi、223Ra、226Ra、225Ac、及び227Acが挙げられる。
代表的な金属原子は、20超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。
いくつかの実施形態では、金属原子は、20超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、53(すなわち、ヨウ素)〜83(すなわち、ビスマス)の原子番号を有する金属であり得る。
いくつかの実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。
金属原子は、+1、+2、又は+3の酸化状態の形態の金属イオン、例えば、Ba2+、Bi3+、Cs+、Ca2+、Cr2+、Cr3+、Cr6+、Co2+、Co3+、Cu+、Cu2+、Cu3+、Ga3+、Gd3+、Au+、Au3+、Fe2+、Fe3+、F3+、Pb2+、Mn2+、Mn3+、Mn4+、Mn7+、Hg2+、Ni2+、Ni3+、Ag+、Sr2+、Sn2+、Sn4+、及びZn2+であり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。
好適な色素としては、例えば、5(6)−カルボキシフルオレセイン、IRDye 680RDマレイミド、又はIRDye 800CW、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。
好適な蛍光色素分子は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フルオレセインチオセミカルバジド、ローダミン、テキサスレッド、CyDye(例えば、Cy3、Cy5、Cy5.5)、Alexa Fluor(例えば、Alexa488、Alexa555、Alexa594;Alexa647)、近赤外線(NIR)(700〜900nm)蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。
検出可能な標識にコンジュゲートしている本発明のHLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、腫瘍の分布、HLA−DR発現細胞の存在の診断を評価するために造影剤として用いられ得る。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、細胞毒性剤にコンジュゲートしている。
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、化学療法剤、薬物、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物由来の酵素活性を有する毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち、放射性複合体)である。
細胞毒性剤にコンジュゲートしている本発明のHLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、例えば、AML、ALL、又はMM細胞、及びその細胞内蓄積部への細胞毒性剤の標的化送達に使用することができ、これらコンジュゲートしていない細胞毒性剤の全身投与は、正常細胞に許容されないレベルの毒性をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞毒性剤は、チューブリン結合、DNA結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってその細胞毒性又は細胞増殖抑制作用を引き起こし得る。
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォルディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、モモルディカ・カランティア(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンなどの酵素活性を有する毒素である。
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、212Bi、131I、131In、90Y、及び186Reなどの放射性核種である。
いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ドラスタチン又はドラスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。代表的な分子は、米国特許第5,635,483号及び同第5,780,588号に開示されている。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTPの加水分解、並びに核及び細胞分裂に干渉し(Woyke et al(2001)Antimicrob Agents and Chemother.45(12):3580〜3584))、抗癌及び抗真菌活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のN(アミノ)末端若しくはC(カルボキシル)末端を介して(国際公開第02/088172号)、又はFN3ドメインに組み込まれた任意のシステインを介して、本発明のFN3ドメインに結合することができる。
本発明の本発明のHLA−DRに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片は、公知の方法を用いて検出可能な標識にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、キレート剤と複合体を形成している。
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされている。
検出可能な標識又は細胞毒性剤は、公知の方法を用いて、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に直接又は間接的に結合し得る。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー(N−スクシミジル(succimidyl)−ベンゾアートの誘導体;ドデカボラート)、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10,四酢酸(DOTA)の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)の誘導体、S−2−(4−イソチオシアナトベンジル)−1,4,7−トリアザシクロノナン−1,4,7−三酢酸(NOTA)の誘導体、及び1,4,8,11−テトラアザシクロドデカン−1,4,8,11−四酢酸(TETA)の誘導体、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオール)プロピオナート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、ジメチルアジピミダートHCl)、活性エステル(例えば、ジスクシンイミジルスベラート)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス−ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えば、トルエン2,6−ジイソシアナート)、及びビス−活性フッ素化合物(例えば、1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン)、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。
いくつかの実施形態では、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、腎クリアランスによって血液から除去される。
本発明の抗体の作製
HLA−DRに特異的に結合する本発明の抗体又はその抗原結合断片は、様々な技術を用いて作製され得る。例えば、Kohler and Milstein,Nature 256:495,1975のハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット、又はサルを、本明細書に記載のとおりFc融合タンパク質として発現しペプチドと複合体を形成しているヒト又はカニクイザルのHLA−DR抗原で免疫し、続いて、標準的な方法を使用して、免疫した動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59〜103(Academic Press,1986))。1個の不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原に対する親和性などの所望の特性を有する抗体の産生についてスクリーニングしてよい。
HLA−DRに特異的に結合する本発明の抗体又はその抗原結合断片は、様々な技術を用いて作製され得る。例えば、Kohler and Milstein,Nature 256:495,1975のハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を作製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス又は他の宿主動物、例えばハムスター、ラット、又はサルを、本明細書に記載のとおりFc融合タンパク質として発現しペプチドと複合体を形成しているヒト又はカニクイザルのHLA−DR抗原で免疫し、続いて、標準的な方法を使用して、免疫した動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59〜103(Academic Press,1986))。1個の不死化したハイブリドーマ細胞から生じたコロニーを、結合特異性、交差反応性又はその欠如、及び抗原に対する親和性などの所望の特性を有する抗体の産生についてスクリーニングしてよい。
ヒト受容体フレームワークの選別を含む代表的なヒト化技術としては、CDRグラフト化(米国特許第5,225,539号)、SDRグラフト化(米国特許第6,818,749号)、リサーフェシング(Padlan,(1991)Mol Immunol 28:489〜499)、特異性決定残基のリサーフェシング(米国特許出願公開第2010/0261620号)、ヒトフレームワーク適応(米国特許第8,748,356)、又は超ヒト化(米国特許第7,709,226号)が挙げられる。これらの方法では、CDRの長さの類似性若しくは標準構造の同一性、又はこれらの組み合わせに基づいて、親フレームワークに対する全体的な相同性に基づいて選択され得るヒトフレームワークに親抗体のCDRを移植する。
ヒト化抗体は、国際公開第1090/007861号及び同第1992/22653号に記載されているものなどの技術によって、結合親和性を保存するように変化させたフレームワーク支持残基を組み込むことによって(復帰突然変異)、又は任意のCDRに変異を導入して、例えば抗体の親和性を改善することによって、所望の抗原に対するその選択性又は親和性を改善するように更に最適化させてもよい。
トランスジェニック動物、例えば、ゲノム中にヒト免疫グロブリン(Ig)遺伝子座を有するマウス又はラットは、HLA−DRタンパク質に対するヒト抗体を作製するために使用することができ、例えば、米国特許第6,150,584号、国際公開第99/45962号、国際公開第2002/066630号、国際公開第2002/43478号、国際公開第2002/043478号、及び国際公開第1990/04036号、Lonberg et al(1994)Nature 368:856〜9;Green et al(1994)Nature Genet.7:13〜21;Green & Jakobovits(1998)Exp.Med.188:483〜95;Lonberg and Huszar(1995)Int Rev Immunol 13:65〜93;Bruggemann et al.,(1991)Eur J Immunol 21:1323〜1326;Fishwild et al.,(1996)Nat Biotechnol 14:845〜851;Mendez et al.,(1997)Nat Genet 15:146〜156;Green(1999)J Immunol Methods 231:11〜23;Yang et al.,(1999)Cancer Res 59:1236〜1243;Bruggemann and Taussig(1997)Curr Opin Biotechnol 8:455〜458に記載されている。このような動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させてもよく、相同又は非相同組み換えを用いて、導入染色体(transchromosome)を用いて、又はミニ遺伝子を用いて、少なくとも1つの完全な又は部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座を該動物のゲノムに挿入してもよい。Regeneron(http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology,Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、Trianni(http://_www.trianni_com)、及びAblexis(http://_www_ablexis_com)などの企業は、上記の技術を用いて、選択抗原に対するヒト抗体の提供に従事し得る。
ヒト抗体は、ファージがヒト免疫グロブリン又はその一部(例えば、Fab、一本鎖抗体(scFv)、又は非対合若しくは対合抗体可変領域)を発現するように遺伝子操作を受けたファージディスプレイライブラリから選択され得る(Knappik et al.,(2000)J Mol Biol 296:57〜86;Krebs et al.,(2001)J Immunol Meth 254:67〜84;Vaughan et al.,(1996)Nature Biotechnology 14:309〜314;Sheets et al.,(1998)PITAS(USA)95:6157〜6162;Hoogenboom and Winter(1991)J Mol Biol 227:381;Marks et al.,(1991)J Mol Biol 222:581)。本発明の抗体は、例えば、Shi et al.,(2010)J Mol Biol 397:385〜96及び国際公開第09/085462号)に記載されているバクテリオファージpIXコートタンパク質との融合タンパク質として抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を発現するファージディスプレイライブラリから単離され得る。ライブラリを、ヒト及び/又はカニクイザルHLA−DRに結合するファージについてスクリーニングし、得られた陽性クローンを更に特性評価し、クローン溶解物からFabを単離し、完全長IgGとして発現させることができる。ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,580,717号、同第5,969,108号、同第6,172,197号、同第5,885,793号、同第6,521,404号、同第6,544,731号、同第6,555,313号、同第6,582,915号、及び同第6,593,081号に記載されている。
HLA−DRへの結合に関して参照抗体と競合する抗体は、ファージディスプレイライブラリを用いてヒトHLA−DRに特異的に結合する抗体を単離し、HLA−DRへの結合に関して参照抗体と競合する能力について、生成された抗体をスクリーニングすることによって生成され得る。
免疫原性抗原の調製及びモノクローナル抗体の生成は、組み換えタンパク質生成などの任意の好適な技術を用いて実施することができる。免疫原性抗原は、精製タンパク質、あるいは細胞全体又は細胞若しくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与されてもよく、抗原は、該抗原又はその一部をコードしている核酸から動物の体内で新規に(de novo)形成されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、二重特異性抗体である。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、多重特異性抗体である。
本発明のHLA−DRに特異的に結合する単一特異性抗体は、遺伝子操作して二重特異性抗体にすることもでき、これも本発明の範囲内に包含される。本発明の抗体のVL及び/又はVH領域は、公開されている方法を用いて遺伝子操作して、TandAb(登録商標)設計などの構造として一本鎖二重特異性抗体に(国際公開第1999/57150号、米国公開第2011/0206672号)、又は米国特許第5,869,620号、国際公開第1995/15388号、同第1997/14719号、若しくは同第2011/036460号に開示されているものなどの構造として二重特異性scFvにすることもできる。
本発明の抗体のVL及び/又はVH領域を遺伝子操作して二重特異性の完全長の抗体にすることもでき、この場合、各抗体のアームは、別個の抗原又はエピトープに結合する。このような二重特異性抗体は、米国特許第7,695,936号、国際公開第2004/111233号、米国特許出願公開第2010/0015133号、米国特許出願公開第2007/0287170号、国際公開第2008/119353号、米国特許出願公開第2009/0182127号、米国特許出願公開第2010/0286374号、米国特許出願公開第2011/0123532号、国際公開第2011/131746号、国際公開第2011/143545号、又は米国特許出願公開第2012/0149876号に記載されているものなどの技術を用いて、2本の抗体重鎖間のCH3相互作用を調節して二重特異性抗体を形成することによって作製することもできる。
例えば、二重特異性抗体は、国際公開第2011/131746号に記載の方法に従って、2つの単一特異性ホモ二量体抗体のCH3領域中に非対称な変異を導入し、還元条件下において2つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成してジスルフィド結合を異性化させることによって、無細胞環境でインビトロにおいて作製することができる。この方法では、ヘテロ二量体の安定性を促進する特定の置換をCH3ドメインに有するように、2つの単一特異性二価抗体を遺伝子操作する。これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合の異性化を受けるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、それにより、Fabアーム交換により二重特異性抗体が作製される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る代表的な還元剤は、2−メルカプトエチルアミン(2−MEA)、ジチオスレイトール(DTT)、ジチオエリスリトール(DTE)、グルタチオン、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、L−システイン、及びβ−メルカプトエタノールであり、好ましくは、2−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも20℃の温度で、少なくとも25mMの2−MEAの存在下又は少なくとも0.5mMのジチオトレイトールの存在下で、pH5〜8、例えば、pH7.0又はpH7.4で、少なくとも90分間のインキュベートを用いることができる。
二重特異性抗体の第1の重鎖及び第2の重鎖に使用され得る代表的なCH3突然変異は、K409R及びF405Lである。
本発明の抗体のVL及び/又はVH領域が組み込まれ得る更なる多重特異性構造は、例えば、二重可変ドメイン免疫グロブリン(DVD)(国際公開第2009/134776号)、あるいはロイシンジッパー又はコラーゲン二量体化ドメインなどの異なる特異性を有する2本の抗体アームに接続するために様々な二量体化ドメインを含む構造(国際公開第2012/022811号、米国特許第5,932,448号、米国特許第6,833,441号)である。DVDは、VH1−リンカー−VH2−CH構造を有する重鎖と、VL1−リンカー−VL2−CL構造を有する軽鎖とを含む完全長抗体であり、リンカーは任意のものである。
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
また、本発明は、特定のVH及びVL配列を有する、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体のVHが第1のポリヌクレオチドによってコードされ、該抗体のVLが第2のポリヌクレオチドによってコードされている抗体又はその抗原結合断片を提供する。ポリヌクレオチドは、相補的デオキシ核酸(cDNA)であってよく、好適な宿主において発現するためにコドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、周知の技術である。
また、本発明は、特定のVH及びVL配列を有する、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、該抗体のVHが第1のポリヌクレオチドによってコードされ、該抗体のVLが第2のポリヌクレオチドによってコードされている抗体又はその抗原結合断片を提供する。ポリヌクレオチドは、相補的デオキシ核酸(cDNA)であってよく、好適な宿主において発現するためにコドン最適化されていてもよい。コドン最適化は、周知の技術である。
また、本発明は、本発明の抗体のVH、本発明の抗体のVL、本発明の抗体の重鎖、又は本発明の抗体の軽鎖をコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号56、57、58、59、137、138、139、140、又は141のVLをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号60、61、又は142のVLをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号56、57、58、59、137、138、139、140、又は141のVHと配列番号60、61、又は142のVLとをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号84、85、86、87、96、97、98、99、149、150、151、152、又は153の重鎖をコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号88、89、又は154の軽鎖をコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号84、85、86、87、96、97、98、99、149、150、151、152、又は153の重鎖と配列番号88、89、又は154の軽鎖とをコードしている単離ポリヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、配列番号79、80、81、82、83、90、91、92、93、94、95、100、101、102、103、121、143、144、145、146、147、148、155、156、157、158、159又は160のポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の抗体のVH及び/若しくはVL又はこれらの抗原結合断片、あるいは本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードしているポリヌクレオチド配列は、意図される宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現を可能にする、プロモーター又はエンハンサーなどの1つ以上の制御エレメントに操作可能に連結され得る。ポリヌクレオチドは、cDNAであってもよい。
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。このようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現用ベクター、トランスポゾンベースのベクター、又は任意の手段によって所与の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明の合成ポリヌクレオチドを導入するのに好適な任意の他のベクターであってよい。例えば、所望により定常領域に連結されている本発明の抗体の軽鎖及び/又は重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入する。軽鎖及び/又は重鎖は、同じ又は異なる発現ベクターにクローニングされ得る。免疫グロブリン鎖をコードしているDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする発現ベクター中のコントロール配列に操作可能に連結することができる。このようなコントロール配列としては、シグナル配列、プロモーター(例えば、天然に付随する又は異種のプロモーター)、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列が挙げられ、抗体を発現するように選択された宿主細胞と適合するように選択される。ベクターを適切な宿主に組み込んだら、組み込まれたポリヌクレオチドによってコードされているタンパク質を高レベルで発現させるのに好適な条件下で宿主を維持する。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号79のポリヌクレオチド及び配列番号80のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号81のポリヌクレオチド及び配列番号82のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号83のポリヌクレオチド及び配列番号82のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号121のポリヌクレオチド及び配列番号82のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号143のポリヌクレオチド及び配列番号82のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号144のポリヌクレオチド及び配列番号82のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号145のポリヌクレオチド及び配列番号82のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号146のポリヌクレオチド及び配列番号148のポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号147のポリヌクレオチド及び配列番号82のポリヌクレオチドを含む。
好適な発現ベクターは、典型的には、エピソームとして、又は宿主染色体DNAの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。通常、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にするため、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、又はネオマイシン耐性などの選択マーカーを含む。
好適なプロモーター及びエンハンサーエレメントは、当該技術分野において既知である。真核細胞での発現に関して、代表的なプロモーターとしては、軽鎖及び/又は重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーター及びエンハンサーエレメント;サイトメガロウイルス前初期プロモーター;単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター;初期及び後期SV40プロモーター;レトロウイルス由来の末端反復配列に存在するプロモーター;マウスメタロチオネイン−Iプロモーター;並びに様々な既知の組織特異的プロモーターが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者の技量の範囲内である。
使用され得る代表的なベクターは、細菌:pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene,La Jolla,Calif.,USA);pTrc99A、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、及びpRIT5(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、真核生物:pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG及びpSVL(Pharmacia)、pEE6.4(Lonza)並びにpEE12.4(Lonza)である。
また、本発明は、本発明の1つ以上のベクターを含む宿主細胞を提供する。「宿主細胞」は、ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞という用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代、また特定の対象細胞から生成された安定な細胞株も指すことを意図すると理解される。変異又は環境による影響のいずれかにより、後続世代においてある特定の改変が生じる可能性があるため、そのような後代は親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内には依然として含まれる。そのような宿主細胞は、真核細胞、原核細胞、植物細胞、又は古細菌細胞であってよい。原核宿主細胞の例は、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)などの桿菌、並びにサルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、及び様々なシュードモナス属(Pseudomonas)の種などの他の腸内細菌科のものである。酵母などの他の微生物も発現に有用である。好適な酵母宿主細胞の例は、サッカロミセス属(Saccharomyces)(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(S. cerevisiae))及びピキア属(Pichia)である。代表的な真核宿主細胞は、哺乳動物、昆虫、鳥類、又は他の動物由来のものであり得る。哺乳動物真核宿主細胞としては、ハイブリドーマ又は骨髄腫細胞株などの不死化細胞株、例えば、SP2/0(American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VA、CRL−1581)、NS0(European Collection of Cell Cultures(ECACC),Salisbury,Wiltshire,UK、ECACC No.85110503)、FO(ATCC CRL−1646)、及びAg653(ATCC CRL−1580)マウス細胞株などが挙げられる。代表的なヒト骨髄腫細胞株は、U266(ATTC CRL−TIB−196)である。他の有用な細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に由来するもの、例えば、CHOK1SV(Lonza Biologics,Walkersville,MD)、Potelligent(登録商標)CHOK2SV(Lonza)、CHO−K1(ATCC CRL−61)、又はDG44が挙げられる。
また、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、該抗体が発現する条件で本発明の宿主細胞を培養することと、該宿主細胞によって産生された抗体を回収することとを含む方法を提供する。抗体を作製し、それを精製する方法は、当該技術分野において周知である。合成されたら(化学的に又は組み換えによって)、抗体全体、その二量体、個々の軽鎖及び/若しくは重鎖、又はVH及び/若しくはVLなどの他の抗体断片を、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)精製、ゲル電気泳動などの標準的な手順(概して、Scopes,Protein Purification(Springer−Verlag,N.Y.,(1982)を参照)に従って精製することができる。対象抗体は、実質的に純粋、例えば、少なくとも純度約80%〜85%、少なくとも純度約85%〜90%、少なくとも純度約90%〜95%、又は少なくとも約98%〜99%、又はそれ以上の純度であり得、例えば、対象抗体以外の細胞残屑、巨大分子などの夾雑物を含まない。
また、本発明は、
該抗体のVHをコードしている第1のポリヌクレオチド及び該抗体のVLをコードしている第2のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことと、
宿主細胞を該発現ベクターで形質転換することと、
該VL及び該VHが発現し、抗体を形成する条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養することと、
該宿主細胞又は該培養培地から抗体を回収することと、を含む、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を作製する方法を提供する。
該抗体のVHをコードしている第1のポリヌクレオチド及び該抗体のVLをコードしている第2のポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことと、
宿主細胞を該発現ベクターで形質転換することと、
該VL及び該VHが発現し、抗体を形成する条件下で、培養培地中で該宿主細胞を培養することと、
該宿主細胞又は該培養培地から抗体を回収することと、を含む、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を作製する方法を提供する。
本発明の特定のVH又はVL配列をコードしているポリヌクレオチドを、標準的な分子生物学的方法を用いてベクターに組み込むことができる。宿主細胞の形質転換、培養、抗体発現、及び精製は、周知の方法を用いて行われる。
医薬組成物/投与
本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。治療用途では、本発明の抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」とは、本発明の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、0.4%生理食塩水及び0.3%グリシンを用いてもよい。これらの溶液は滅菌されており、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌法(例えば、濾過)によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、pH調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本発明の抗体又はその抗原結合断片の濃度は、約0.5重量%未満から、通常は少なくとも約1重量%まで、最大で15又は20重量%まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤(他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む)は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691〜1092に記載されており、特にpp.958〜989を参照されたい。
本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。治療用途では、本発明の抗体は、医薬的に許容される担体中に活性成分として有効量の抗体を含有する医薬組成物として調製することができる。「担体」とは、本発明の抗体と一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。このようなビヒクルは、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの液体であってよい。例えば、0.4%生理食塩水及び0.3%グリシンを用いてもよい。これらの溶液は滅菌されており、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌法(例えば、濾過)によって滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容される補助物質、例えば、pH調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などを含有し得る。このような医薬製剤中の本発明の抗体又はその抗原結合断片の濃度は、約0.5重量%未満から、通常は少なくとも約1重量%まで、最大で15又は20重量%まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。好適なビヒクル及び製剤(他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む)は、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Troy,D.B.ed.,Lipincott Williams and Wilkins,Philadelphia,PA 2006,Part 5,Pharmaceutical Manufacturing pp 691〜1092に記載されており、特にpp.958〜989を参照されたい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片の治療的使用における投与方法は、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル、粒子として、注射器、埋め込み式装置、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当該技術分野において周知の、当業者が理解する他の手段に入れられた製剤を用いた、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、若しくは皮下、肺内、経粘膜(経口、鼻腔内、膣内、直腸)投与などの、抗体を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、例えば、静脈内(i.v.)注入又はボーラス注射により非経口的に、筋肉内又は皮下又は腹腔内になど任意の好適な経路によって対象に投与することができる。i.v.注入は、例えば、15、30、60、90、120、180、若しくは240分間にわたって、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12時間にわたって行ってよい。
対象に投与される用量は、治療されている疾患を軽減する、少なくとも部分的に停止させる、又は予防するのに十分(「治療的に有効な量」)なものであり、時に、0.005mg〜約100mg/kg、例えば、約0.05mg〜約30mg/kg若しくは約5mg〜約25mg/kg、又は約4mg/kg、約8mg/kg、約16mg/kg若しくは約24mg/kg、又は例えば約1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10mg/kgであり得るが、更に多量、例えば、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90若しくは100mg/kgであってもよい。
例えば、50、100、200、500、若しくは1000mgの固定単位用量を与えてもよく、又は患者の表面積に基づいて、例えば、500、400、300、250、200、若しくは100mg/m2の用量を与えてもよい。通常、1〜8用量(例えば、1、2、3、4、5、6、7、又は8)が患者を治療するために投与されるが、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれよりも多い用量を与えてもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片の投与は、1日、2日、3日、4日、5日、6日、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、5週間、6週間、7週間、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月又はそれ以上後に反復してもよい。治療コースの反復も可能であり、長期にわたる投与も同様に可能である。反復投与は、同一用量であってもよく、又は異なる用量であってもよい。例えば、本明細書に記載される本発明の抗体又はその抗原結合断片は、静脈内注入により、8週間にわたって1週間間隔で8mg/kg又は16mg/kgで投与し、続いて、更に16週間にわたって2週間ごとに8mg/kg又は16mg/kgで投与し、続いて、4週間ごとに8mg/kg又は16mg/kgで投与することができる。
例えば、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、1日当たり約0.1〜100mg/kg、例えば、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90又は100mg/kgの量の1日投薬量として、治療開始後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40日目のうちの少なくとも1日に、あるいは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20週目のうちの少なくとも1週に、又はこれらの任意の組み合わせで、24、12、8、6、4、又は2時間ごとの単一用量又は分割用量を使用して、又はこれらの任意の組み合わせで提供され得る。
また、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、自己免疫疾患の発現のリスクを低減する及び/又は症状の発症を遅延させるために、予防的に投与してもよい。
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、保管のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体で再構成し得る。この技術は、従来のタンパク質調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。
方法及び使用
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、インビトロ及びインビボで、診断上、並びに治療及び予防上の有用性を有する。例えば、本発明の抗体は、自己免疫疾患などのHLA−DR介在性疾患又はHLA−DR発現腫瘍などの様々な障害を処置、予防及び/又は診断するために、培養中の細胞にインビトロ若しくはエクスビボで、又は対象に投与することができる。
本発明の抗体又はその抗原結合断片は、インビトロ及びインビボで、診断上、並びに治療及び予防上の有用性を有する。例えば、本発明の抗体は、自己免疫疾患などのHLA−DR介在性疾患又はHLA−DR発現腫瘍などの様々な障害を処置、予防及び/又は診断するために、培養中の細胞にインビトロ若しくはエクスビボで、又は対象に投与することができる。
また、本発明は、HLA−DR介在性疾患を治療又は予防する方法であって、HLA−DR介在性疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、かかる治療又は予防を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
また、本発明は、HLA−DR介在性疾患を予防する方法であって、HLA−DR介在性疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の、HLA−DRに特異的に結合する本発明の抗体又はその抗原結合断片を、かかる予防を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、HLA−DR介在性疾患は、自己免疫疾患である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節炎である。
いくつかの実施形態では、関節炎は、若年性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、ライター症候群、強直性脊椎炎、又は痛風性関節炎である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、全身型若年性特発性関節炎である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、グレーブス病である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、橋本甲状腺炎である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、重症筋無力症である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、ループスである。
いくつかの実施形態では、ループスは、全身性エリテマトーデス(SLE)又は皮膚エリテマトーデス(CLE)である。
いくつかの実施形態では、対象は、ループス腎炎を有する。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、1型糖尿病である。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患である。
いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病である。
いくつかの実施形態では、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎である。
また、本発明は、HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む方法を提供する。
また、本発明は、HLA−DRB1関連自己免疫疾患を予防する方法であって、該自己免疫疾患を予防するのに十分な時間、治療的に有効な量の、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、かかる予防を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、ループス、又は1型糖尿病である。
また、本発明は、自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を、かかる抑制を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
また、本発明は、HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号56のVH及び配列番号60のVLを含む。
また、本発明は、HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号57のVH及び配列番号61のVLを含む。
また、本発明は、HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号58のVH及び配列番号61のVLを含む。
また、本発明は、HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療する方法であって、該HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号59のVH及び配列番号61のVLを含む。
また、本発明は、HLA−DR発現腫瘍を治療する方法であって、HLA−DR発現腫瘍を治療するのに十分な時間、細胞毒性剤にコンジュゲートしている本発明の抗体又はその抗原結合断片を、治療的に有効な量、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、HLA発現腫瘍は、血液悪性腫瘍である。
いくつかの実施形態では、血液悪性腫瘍は、B細胞非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、B細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、T細胞リンパ腫、T細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄性白血病、又は急性単芽球性白血病(AMoL)である。
いくつかの実施形態では、HLA発現腫瘍は、神経膠腫である。
いくつかの実施形態では、HLA発現腫瘍は、卵巣癌である。
いくつかの実施形態では、HLA発現腫瘍は、結腸直腸癌である。
いくつかの実施形態では、HLA発現腫瘍は、骨肉腫である。
いくつかの実施形態では、HLA発現腫瘍は、子宮頸癌である。
いくつかの実施形態では、HLA発現腫瘍は、胃癌である。
いくつかの実施形態では、対象は、結腸、喉頭、骨格筋、乳房、又は肺に腫瘍を有する。
HLA−DRの発現は、これらの癌において同定されている(例えば、Diao et al.,Int J Clin Exp Pathol 2015;8(5):5483〜90;Rangel et al.,Cancer Biol ther 2004;3(10):1021〜7;Cabrera et al.,Scand J Immunol 1995;41:398〜406;Matsushita et al.,Cancer Sci 2005;97(1):57〜63;Trieb et al.,Pathol res Practices 1998;194:679〜684を参照)。
HLA介在性疾患、自己免疫疾患、及び/又は癌の治療において有効な本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の「治療的に有効な量」は、標準的な研究技術によって決定され得る。例えば、インビトロアッセイを使用して、最適用量範囲を特定する手立てとすることもできる。所望により、関節炎若しくは関節リウマチなどの自己免疫疾患又は癌の治療において有効であり得る本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の投与量は、HLA−DRに特異的に結合する抗体を当該技術分野において公知の関連する動物モデルに投与することによって決定され得る。具体的な有効量の選択は、幾つかの要因を考慮して当業者によって(例えば、臨床試験を通して)決定され得る。このような要因としては、治療又は予防しようとする疾患、疾患症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者に公知のその他の要因が挙げられる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路及び疾患の重篤度に応じて決まり、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されなければならない。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導かれる用量反応曲線から推定することができる。本明細書に記載されるモデルのいずれかを用いて、本発明の抗体をその有効性及び有効量について試験することができる。
併用療法
本発明の方法において、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、第2の治療薬と同時に、逐次、又は別々に併用投与してよい。
本発明の方法において、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、第2の治療薬と同時に、逐次、又は別々に併用投与してよい。
本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、自己免疫疾患を治療するために有用であることが知られているか、又は用いられたことがあるか若しくは現在用いられている任意の剤又は剤の組み合わせを含む、自己免疫疾患のための任意の公知の療法と組み合わせて投与してよい。このような療法及び治療薬としては、手術又は外科手技(例えば、脾摘出、リンパ節郭清、甲状腺摘除術、プラズマフェレーシス、白血球アフェレーシス(leukophoresis)、細胞、組織又は臓器の移植、消化器外科手術(intestinal procedures)、及び臓器潅流など)、放射線療法、例えば、ステロイド療法及び非ステロイド療法、ホルモン療法、サイトカイン療法、皮膚病薬による治療(例えば、アレルギー、接触性皮膚炎、及び乾癬などの皮膚の状態を治療するために使用される局所薬)、免疫抑制療法、並びに他の抗炎症性モノクローナル抗体療法などの療法が挙げられる。
第2の治療薬は、コルチコステロイド、抗マラリア薬、免疫抑制剤、細胞毒性剤、又はB細胞調節因子であり得る。
いくつかの実施形態では、第2の治療薬は、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル(MMF)、ミコフェノール酸ナトリウム、シクロスポリン、レフルノミド、タクロリムス、リツキシマブ(Rituxan(登録商標)、又はベリムマブ(Benlysta(登録商標))である。
いくつかの実施形態では、第2の治療薬は、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、サリチル酸塩、スルファサラジン、細胞毒性薬、免疫抑制薬、ミゾリビン、クロラムブシル、シクロスポリン、タクロリムス(FK506;ProGrafrM)、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス(ラパマイシン)、デオキシスパガリン、レフルノミド及びそのマロノニトリルアミドアナログ、クロベタゾール、ハロベタゾール、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、フルオシノール(fluocinole)、フルオシノニド、メサラミンを含有する医薬(5−ASA剤として公知)、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェンプロフェン(fenprofen)、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸塩、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サリチル酸塩、スリンダク、トルメチン;ホスホジエステラーゼ−4阻害剤、抗TNFα抗体インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、ゴリムマブ(SIMPONI(登録商標))、及びアダリムマブ(HUMIRA(登録商標))、サリドマイド、又はレナリドミドなどのそのアナログである。
治療効果又はRAは、米国リウマチ学会による基準、欧州リウマチ学会による診断基準、又は任意の他の基準によって定義される臨床応答によって測定されるとおりの有効性を用いて評価することができる。例えば、Felson et al.(1995)Arthritis Rheum.38:727〜35及びvan Gestel et al.(1996)Arthritis Rheum.39:34〜40を参照。
本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片、又は細胞毒性剤にコンジュゲートしておりHLA−DRに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片は、血液悪性腫瘍を治療するために用いられる療法などの任意の公知の癌療法と組み合わせて投与してよい。
診断的使用及びキット
キット
また、本発明は、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含むキットを提供する。
キット
また、本発明は、本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含むキットを提供する。
キットは、治療的使用のために、及び診断キットとして使用することができる。
キットは、サンプル中のHLA−DRの存在を検出するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、キットは、本発明の抗体又はその抗原結合断片と、該抗体を検出するための試薬とを含む。キットは、使用説明書;他の試薬、例えば、標識、治療薬、又はキレート化ないしは別の方法のカップリングに有用な剤、標識若しくは治療薬に対する抗体、又は放射線防護組成物;投与するために該抗体を調製するための装置又は他の材料;医薬的に許容される担体;及び対象に投与するための装置又は他の材料を含む、1つ以上の他の構成要素を含み得る。
いくつかの実施形態では、キットは、容器内の本発明の抗体又はその抗原結合断片と、キットの使用説明書とを含む。
いくつかの実施形態では、キットにおける抗体は標識されている。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号56のVH及び配列番号60のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号57のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号58のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号59のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号137のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号138のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号139のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号140のVH及び配列番号142のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号141のVH及び配列番号61のVLを含む、HLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む。
HLA−DRの検出方法
また、本発明は、サンプル中のHLA−DRを検出する方法であって、該サンプルを入手することと、該サンプルを本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、該サンプル中のHLA−DRに結合している抗体を検出することと、を含む、方法を提供する。
また、本発明は、サンプル中のHLA−DRを検出する方法であって、該サンプルを入手することと、該サンプルを本発明のHLA−DRに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片と接触させることと、該サンプル中のHLA−DRに結合している抗体を検出することと、を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織に結合していない細胞(すなわち、遊離細胞)、組織(例えば、外科的に切除された腫瘍組織、穿刺吸引を含む生検材料)、組織プレパラートなどから得ることができる。
HLA−DRに結合している本発明の抗体又はその抗原結合断片は、公知の方法を用いて検出され得る。代表的な方法としては、蛍光若しくは化学発光標識、又は放射線標識を使用して抗体を直接標識すること、あるいは本発明の抗体に、ビオチン、酵素、又はエピトープタグなどの容易に検出可能な部分を結合させることが挙げられる。代表的な標識及び部分は、ルテニウム、111In−DOTA、111In−ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びベータガラクトシダーゼ、ポリ−ヒスチジン(HISタグ)、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、及びAlexafluor(登録商標)染料である。
本発明の抗体は、サンプル中のHLA−DRを検出するための様々なアッセイにおいて使用することができる。代表的なアッセイは、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫沈降、平衡透析、免疫拡散、電気化学発光(ECL)イムノアッセイ、免疫組織化学的検査、蛍光活性化細胞選別(FACS)、又はELISAアッセイである。
本発明の更なる実施形態
本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の特定の更なる実施形態を以下に記載する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態のうちの1つ1つにもまた関係する。
1)HLA−DRα鎖及びHLA−DRβ鎖を含むHLA−DRに特異的に結合する単離抗体。
2)HLA−DRがHLA−DR4である、請求項1に記載の抗体。
3)該HLA−DRα鎖が、配列番号13のアミノ酸配列を含み、該HLA−DRβ鎖が、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の抗体。
4)HLA−DRがHLA−DR1である、請求項1に記載の抗体。
5)該HLA−DRα鎖が、配列番号13のアミノ酸配列を含み、該HLA−DRβ鎖が、配列番号15のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の抗体。
6)該抗体がB細胞のアポトーシスを誘導する能力を有していない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
7)アポトーシスが、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、請求項6に記載の抗体。
8)該抗体がB細胞の死を誘導する能力を有していない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
9)該B細胞の死が、フローサイトメトリーを用いてヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、請求項7に記載の抗体。
10)HLA−DRが共有エピトープを含有する、請求項1に記載の抗体。
11)該共有エピトープが、アミノ酸配列QKRAA(配列番号66)、QRRAA(配列番号67)、又はRRRAA(配列番号68)を含む、請求項10に記載の抗体。
12)該共有エピトープが、アミノ酸配列QKRAA(配列番号66)、QRRAA(配列番号67)、又はRRRAA(配列番号68)からなる、請求項10又は11に記載の抗体。
13)HLA−DRが、ペプチドとの複合体として存在する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体。
14)該ペプチドが、II型コラーゲン(配列番号69)、赤血球凝集素(配列番号70)、NY−ESO1(配列番号71)、又はインスリン(配列番号72)のペプチド断片である、請求項13に記載の抗体。
15)該ペプチドが、配列番号7、8、9、10、又は11のアミノ酸配列を含む、請求項13又は14に記載の抗体。
16)該ペプチドが、配列番号7、8、9、10、又は11のアミノ酸配列からなる、請求項13〜15のいずれか一項に記載の抗体。
17)該抗体がT細胞の活性化を阻害する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗体。
18)実施例4に記載のアッセイを用いて、ヒトCD4+T細胞及びヒトHLA−DR4を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞の共培養下において、1μg/mLの濃度でCD4+T細胞の増殖を少なくとも30%阻害する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗体。
19)それぞれ配列番号73、74、及び75の重鎖相補性決定領域1、2、及び3(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
20)それぞれ配列番号76、77、及び78の軽鎖相補性決定領域1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
21)配列番号56、57、58、又は59の重鎖可変領域(VH)に含有されているHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、該HCDR1、該HCDR2、及び該HCDR3が、Kabat、IMGT、又はChothiaによって定義される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の抗体。
22)配列番号60又は61の軽鎖可変領域(VL)に含有されているLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、該LCDR1、該LCDR2、及び該LCDR3が、Kabat、IMGT、又はChothiaによって定義される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗体。
23)配列番号39、40、又は41のHCDR1を含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体。
24)配列番号42、43、44、又は45のHCDR2を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の抗体。
25)配列番号46、47、48、又は49のHCDR3を含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の抗体。
26)配列番号50又は51のLCDR1を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の抗体。
27)配列番号52又は53のLCDR2を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の抗体。
28)配列番号54又は55のLCDR3を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗体。
29)それぞれ配列番号39、42、及び46のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号50、52、及び54のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体。
30)
a)
i)それぞれ配列番号40、43、及び47、
ii)それぞれ配列番号41、44、及び48、又は
iii)それぞれ配列番号41、45、及び49のHCDR1、HCDR2、HCDR3、並びに
b)それぞれ配列番号51、53、及び55のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体。
31)それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項30に記載の抗体。
32)それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項30に記載の抗体。
33)それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項30に記載の抗体。
34)該抗体が、IGHV1−69(配列番号62)又はIGHV5−51(配列番号63)に由来する重鎖フレームワークを含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の抗体。
35)該抗体が、IGKV3−20(配列番号64)又はIGKV3−11(配列番号65)に由来する軽鎖フレームワークを含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の抗体。
36)該重鎖フレームワークがIGHV1−69(配列番号62)に由来し、該軽鎖フレームワークがIGKV3−20(配列番号64)に由来する、請求項34又は35に記載の抗体。
37)該重鎖フレームワークがIGHV5−51(配列番号63)に由来し、該軽鎖フレームワークがIGKV3−11(配列番号65)に由来する、請求項34又は35に記載の抗体。
38)該重鎖フレームワークがIGHV1−69(配列番号62)に由来し、該軽鎖フレームワークはIGKV3−11(配列番号65)に由来する、請求項34又は35に記載の抗体。
39)配列番号56、57、58、又は59のアミノ酸配列と少なくとも84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるVHを含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の抗体。
40)配列番号60又は61のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるVLを含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の抗体。
41)配列番号56、57、58、又は59のVHを含み、該VHが、任意追加的に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又は18個のアミノ酸置換を有する、請求項1〜40のいずれか一項に記載の抗体。
42)配列番号60又は61のVLを含み、該VLが、任意追加的に、1、2、3、4、5、6、7、又は8個のアミノ酸置換を有する、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体。
43)配列番号56のVH及び配列番号60のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
44)配列番号57のVH及び配列番号61のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
45)配列番号58のVH及び配列番号61のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
46)配列番号59のVH及び配列番号61のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
47)配列番号57、58、又は59のVH及び配列番号61のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
48)ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の抗体。
49)IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4アイソタイプの抗体である、請求項1〜48のいずれか一項に記載の抗体。
50)該抗体のFCに1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の置換を含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の抗体。
51)該1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の置換の結果、活性化Fcγ受容体(FcγR)に対する該抗体の結合が減少する、請求項50に記載の抗体。
52)該活性化FcγRが、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、又はFcγRIIIbである、請求項51に記載の抗体。
53)
a)L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331S置換、
b)V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331S置換、
c)F234A、L235A、G237A、P238S、及びQ268A置換、
d)L234A、L235A、若しくはL234A、及びL235A置換、
e)F234A、L235A、若しくはF234A、及びL235A置換、又は
f)V234A置換(残基の付番は、EUインデックスに従う)を含む、請求項52に記載の抗体。
54)S228P置換(残基の付番は、EUインデックスに従う)を含む、請求項53に記載の抗体。
55)請求項1〜54のいずれか一項に記載の抗体と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
56)請求項19〜54のいずれかに記載の抗体VH、抗体VL、又は抗体VH及び抗体VLをコードしているポリヌクレオチド。
57)請求項56に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
58)請求項57に記載のベクターを含む宿主細胞。
59)請求項19〜54のいずれかに記載の抗体を作製する方法であって、該抗体が発現する条件で請求項58に記載の宿主細胞を培養することと、該宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することと、を含む方法。
60)HLA−DRB1関連自己免疫疾患を有する対象を治療する方法であって、該HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の請求項1〜54のいずれかに記載の抗体を、かかる治療を必要としている対象に投与すること、を含む方法。
61)該HLA−DRB1関連自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は1型糖尿病である、請求項60に記載の方法。
62)自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、請求項1〜54のいずれかに記載の抗体を、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む方法。
63)該自己抗原が、自己免疫疾患の患者に存在する、請求項62に記載の方法。
64)該自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は1型糖尿病である、請求項63に記載の方法。
65)請求項43〜47のいずれか一項に記載の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体。
66)請求項43〜47のいずれか一項に記載の抗体を含むキット。
67)該抗体を検出するための試薬と、使用説明書とを更に含む、請求項66に記載のキット。
本明細書の他の箇所の開示に従う、本発明の特定の更なる実施形態を以下に記載する。本明細書に開示される本発明に関連するものとして上述された本発明の実施形態の特徴は、これらの番号付けされた更なる実施形態のうちの1つ1つにもまた関係する。
1)HLA−DRα鎖及びHLA−DRβ鎖を含むHLA−DRに特異的に結合する単離抗体。
2)HLA−DRがHLA−DR4である、請求項1に記載の抗体。
3)該HLA−DRα鎖が、配列番号13のアミノ酸配列を含み、該HLA−DRβ鎖が、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の抗体。
4)HLA−DRがHLA−DR1である、請求項1に記載の抗体。
5)該HLA−DRα鎖が、配列番号13のアミノ酸配列を含み、該HLA−DRβ鎖が、配列番号15のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の抗体。
6)該抗体がB細胞のアポトーシスを誘導する能力を有していない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
7)アポトーシスが、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、請求項6に記載の抗体。
8)該抗体がB細胞の死を誘導する能力を有していない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体。
9)該B細胞の死が、フローサイトメトリーを用いてヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、請求項7に記載の抗体。
10)HLA−DRが共有エピトープを含有する、請求項1に記載の抗体。
11)該共有エピトープが、アミノ酸配列QKRAA(配列番号66)、QRRAA(配列番号67)、又はRRRAA(配列番号68)を含む、請求項10に記載の抗体。
12)該共有エピトープが、アミノ酸配列QKRAA(配列番号66)、QRRAA(配列番号67)、又はRRRAA(配列番号68)からなる、請求項10又は11に記載の抗体。
13)HLA−DRが、ペプチドとの複合体として存在する、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体。
14)該ペプチドが、II型コラーゲン(配列番号69)、赤血球凝集素(配列番号70)、NY−ESO1(配列番号71)、又はインスリン(配列番号72)のペプチド断片である、請求項13に記載の抗体。
15)該ペプチドが、配列番号7、8、9、10、又は11のアミノ酸配列を含む、請求項13又は14に記載の抗体。
16)該ペプチドが、配列番号7、8、9、10、又は11のアミノ酸配列からなる、請求項13〜15のいずれか一項に記載の抗体。
17)該抗体がT細胞の活性化を阻害する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗体。
18)実施例4に記載のアッセイを用いて、ヒトCD4+T細胞及びヒトHLA−DR4を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞の共培養下において、1μg/mLの濃度でCD4+T細胞の増殖を少なくとも30%阻害する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗体。
19)それぞれ配列番号73、74、及び75の重鎖相補性決定領域1、2、及び3(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
20)それぞれ配列番号76、77、及び78の軽鎖相補性決定領域1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体。
21)配列番号56、57、58、又は59の重鎖可変領域(VH)に含有されているHCDR1、HCDR2、及びHCDR3を含み、該HCDR1、該HCDR2、及び該HCDR3が、Kabat、IMGT、又はChothiaによって定義される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の抗体。
22)配列番号60又は61の軽鎖可変領域(VL)に含有されているLCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含み、該LCDR1、該LCDR2、及び該LCDR3が、Kabat、IMGT、又はChothiaによって定義される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗体。
23)配列番号39、40、又は41のHCDR1を含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗体。
24)配列番号42、43、44、又は45のHCDR2を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の抗体。
25)配列番号46、47、48、又は49のHCDR3を含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の抗体。
26)配列番号50又は51のLCDR1を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の抗体。
27)配列番号52又は53のLCDR2を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の抗体。
28)配列番号54又は55のLCDR3を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗体。
29)それぞれ配列番号39、42、及び46のHCDR1、HCDR2、及びHCDR3と、それぞれ配列番号50、52、及び54のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3とを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体。
30)
a)
i)それぞれ配列番号40、43、及び47、
ii)それぞれ配列番号41、44、及び48、又は
iii)それぞれ配列番号41、45、及び49のHCDR1、HCDR2、HCDR3、並びに
b)それぞれ配列番号51、53、及び55のLCDR1、LCDR2、及びLCDR3、を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の抗体。
31)それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項30に記載の抗体。
32)それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項30に記載の抗体。
33)それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3を含む、請求項30に記載の抗体。
34)該抗体が、IGHV1−69(配列番号62)又はIGHV5−51(配列番号63)に由来する重鎖フレームワークを含む、請求項1〜33のいずれか一項に記載の抗体。
35)該抗体が、IGKV3−20(配列番号64)又はIGKV3−11(配列番号65)に由来する軽鎖フレームワークを含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の抗体。
36)該重鎖フレームワークがIGHV1−69(配列番号62)に由来し、該軽鎖フレームワークがIGKV3−20(配列番号64)に由来する、請求項34又は35に記載の抗体。
37)該重鎖フレームワークがIGHV5−51(配列番号63)に由来し、該軽鎖フレームワークがIGKV3−11(配列番号65)に由来する、請求項34又は35に記載の抗体。
38)該重鎖フレームワークがIGHV1−69(配列番号62)に由来し、該軽鎖フレームワークはIGKV3−11(配列番号65)に由来する、請求項34又は35に記載の抗体。
39)配列番号56、57、58、又は59のアミノ酸配列と少なくとも84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるVHを含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の抗体。
40)配列番号60又は61のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるVLを含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の抗体。
41)配列番号56、57、58、又は59のVHを含み、該VHが、任意追加的に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17又は18個のアミノ酸置換を有する、請求項1〜40のいずれか一項に記載の抗体。
42)配列番号60又は61のVLを含み、該VLが、任意追加的に、1、2、3、4、5、6、7、又は8個のアミノ酸置換を有する、請求項1〜41のいずれか一項に記載の抗体。
43)配列番号56のVH及び配列番号60のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
44)配列番号57のVH及び配列番号61のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
45)配列番号58のVH及び配列番号61のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
46)配列番号59のVH及び配列番号61のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
47)配列番号57、58、又は59のVH及び配列番号61のVLを含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の抗体。
48)ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の抗体。
49)IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4アイソタイプの抗体である、請求項1〜48のいずれか一項に記載の抗体。
50)該抗体のFCに1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の置換を含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の抗体。
51)該1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個の置換の結果、活性化Fcγ受容体(FcγR)に対する該抗体の結合が減少する、請求項50に記載の抗体。
52)該活性化FcγRが、FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、又はFcγRIIIbである、請求項51に記載の抗体。
53)
a)L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331S置換、
b)V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331S置換、
c)F234A、L235A、G237A、P238S、及びQ268A置換、
d)L234A、L235A、若しくはL234A、及びL235A置換、
e)F234A、L235A、若しくはF234A、及びL235A置換、又は
f)V234A置換(残基の付番は、EUインデックスに従う)を含む、請求項52に記載の抗体。
54)S228P置換(残基の付番は、EUインデックスに従う)を含む、請求項53に記載の抗体。
55)請求項1〜54のいずれか一項に記載の抗体と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
56)請求項19〜54のいずれかに記載の抗体VH、抗体VL、又は抗体VH及び抗体VLをコードしているポリヌクレオチド。
57)請求項56に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
58)請求項57に記載のベクターを含む宿主細胞。
59)請求項19〜54のいずれかに記載の抗体を作製する方法であって、該抗体が発現する条件で請求項58に記載の宿主細胞を培養することと、該宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することと、を含む方法。
60)HLA−DRB1関連自己免疫疾患を有する対象を治療する方法であって、該HLA−DRB1関連自己免疫疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の請求項1〜54のいずれかに記載の抗体を、かかる治療を必要としている対象に投与すること、を含む方法。
61)該HLA−DRB1関連自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は1型糖尿病である、請求項60に記載の方法。
62)自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、請求項1〜54のいずれかに記載の抗体を、かかる治療を必要としている対象に投与することを含む方法。
63)該自己抗原が、自己免疫疾患の患者に存在する、請求項62に記載の方法。
64)該自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は1型糖尿病である、請求項63に記載の方法。
65)請求項43〜47のいずれか一項に記載の抗体に結合する抗イディオタイプ抗体。
66)請求項43〜47のいずれか一項に記載の抗体を含むキット。
67)該抗体を検出するための試薬と、使用説明書とを更に含む、請求項66に記載のキット。
以上、本発明を一般論として説明したが、本発明の各実施形態を、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例において更に開示する。
実施例1.抗原及び対照抗体の生成
切断可能なリンカーを介してHLAβ鎖のN末端に結合している、共有結合している赤血球凝集素、コラーゲン、インスリン、又はNY−ESOペプチドとのFc融合タンパク質として、HLA−DR、HLA−DQ、及びLA−DPヘテロ二量体抗原を発現させた。α及びβ鎖を、以下のとおりのフォーマットで発現させた。
α鎖:ECD−G4S−TEV−G4S−Fc−His6
β鎖:ペプチド−3xGS−HRV3C−ECD−G4S−TEV−G4S−Fc−StrepII
ECD:発現しているHLA鎖の細胞外ドメイン
G4S:GGGGS(配列番号1)
TEV:EDLYFQ(配列番号2);タバコエッチ病ウイルスのNiaプロテアーゼ切断部位
His6:HHHHHH(配列番号3)
3xGS:GSGSGS(配列番号4)
HRV3C:LEVLFQGP(配列番号5);ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位
StrepII:WSHPQFEK(配列番号6);StrepIIタグ
赤血球凝集素ペプチドHA_304〜318:ACPKYVKQNTLKLAT(配列番号7)
II型コラーゲンペプチドCII_1236〜1249:LQYMRADQAAGGLR(配列番号8)
II型コラーゲンペプチドCII_257〜273:EPGIAGFKGEQGPKGEP(配列番号9)
インスリンペプチドINS_1〜15:FVNQLCGSHLVEAL(配列番号10)
NY−ESOペプチドNY−ESO_157〜169:SLLMWITQCFLPV(配列番号11)
PLPペプチドPLP_178〜186:NTWTTCQSI(配列番号37)
切断可能なリンカーを介してHLAβ鎖のN末端に結合している、共有結合している赤血球凝集素、コラーゲン、インスリン、又はNY−ESOペプチドとのFc融合タンパク質として、HLA−DR、HLA−DQ、及びLA−DPヘテロ二量体抗原を発現させた。α及びβ鎖を、以下のとおりのフォーマットで発現させた。
α鎖:ECD−G4S−TEV−G4S−Fc−His6
β鎖:ペプチド−3xGS−HRV3C−ECD−G4S−TEV−G4S−Fc−StrepII
ECD:発現しているHLA鎖の細胞外ドメイン
G4S:GGGGS(配列番号1)
TEV:EDLYFQ(配列番号2);タバコエッチ病ウイルスのNiaプロテアーゼ切断部位
His6:HHHHHH(配列番号3)
3xGS:GSGSGS(配列番号4)
HRV3C:LEVLFQGP(配列番号5);ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位
StrepII:WSHPQFEK(配列番号6);StrepIIタグ
赤血球凝集素ペプチドHA_304〜318:ACPKYVKQNTLKLAT(配列番号7)
II型コラーゲンペプチドCII_1236〜1249:LQYMRADQAAGGLR(配列番号8)
II型コラーゲンペプチドCII_257〜273:EPGIAGFKGEQGPKGEP(配列番号9)
インスリンペプチドINS_1〜15:FVNQLCGSHLVEAL(配列番号10)
NY−ESOペプチドNY−ESO_157〜169:SLLMWITQCFLPV(配列番号11)
PLPペプチドPLP_178〜186:NTWTTCQSI(配列番号37)
Fc:改変IgG4(配列番号12)
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL
HLA−DRA1*01:02(配列番号13)
IKEEHVIIQAEFYLNPDQSGEFMFDFDGDEIFHVDMAKKETVWRLEEFGRFASFEAQGALANIAVDKANLEIMTKRSNYTPITNVPPEVTVLTNSPVELREPNVLICFIDKFTPPVVNVTWLRNGKPVTTGVSETVFLPREDHLFRKFHYLPFLPSTEDVYDCRVEHWGLDEPLLKHWEFDAPSPLPETTE
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HLA−DRB1*04:01(配列番号14)
GDTRPRFLEQVKHECHFFNGTERVRFLDRYFYHQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVYPEVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSLTSPLTVEWRARSESAQSK
GDTRPRFLEQVKHECHFFNGTERVRFLDRYFYHQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVYPEVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSLTSPLTVEWRARSESAQSK
HLA−DRB1*01:01(配列番号15)
GDTRPRFLWQLKFECHFFNGTERVRLLERCIYNQEESVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVEPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKAGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
GDTRPRFLWQLKFECHFFNGTERVRLLERCIYNQEESVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVEPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKAGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
HLA−DQA1(配列番号16)
EDIVADHVASCGVNLYQFYGPSGQYTHEFDGDEQFYVDLERKETAWRWPEFSKFGGFDPQGALRNMAVAKHNLNIMIKRYNSTAATNEVPEVTVFSKSPVTLGQPNTLICLVDNIFPPVVNITWLSNGQSVTEGVSETSFLSKSDHSFFKISYLTFLPSADEIYDCKVEHWGLDQPLLKHWEPEIPAPMSELTE
EDIVADHVASCGVNLYQFYGPSGQYTHEFDGDEQFYVDLERKETAWRWPEFSKFGGFDPQGALRNMAVAKHNLNIMIKRYNSTAATNEVPEVTVFSKSPVTLGQPNTLICLVDNIFPPVVNITWLSNGQSVTEGVSETSFLSKSDHSFFKISYLTFLPSADEIYDCKVEHWGLDQPLLKHWEPEIPAPMSELTE
HLA_DQB1*06:02(配列番号17)
RDSPEDFVFQFKGMCYFTNGTERVRLVTRYIYNREEYARFDSDVGVYRAVTPQGRPDAEYWNSQKEVLEGTRAELDTVCRHNYEVAFRGILQRRVEPTVTISPSRTEALNHHNLLVCSVTDFYPGQIKVRWFRNDQEETAGVVSTPLIRNGDWTFQILVMLEMTPQRGDVYTCHVEHPSLQSPITVEWRAQSESAQSK
RDSPEDFVFQFKGMCYFTNGTERVRLVTRYIYNREEYARFDSDVGVYRAVTPQGRPDAEYWNSQKEVLEGTRAELDTVCRHNYEVAFRGILQRRVEPTVTISPSRTEALNHHNLLVCSVTDFYPGQIKVRWFRNDQEETAGVVSTPLIRNGDWTFQILVMLEMTPQRGDVYTCHVEHPSLQSPITVEWRAQSESAQSK
HLA−DPA1(配列番号18)
AGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEFDEDEMFYVDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFPKEPVELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSAEDFYDCRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTE
AGAIKADHVSTYAAFVQTHRPTGEFMFEFDEDEMFYVDLDKKETVWHLEEFGQAFSFEAQGGLANIAILNNNLNTLIQRSNHTQATNDPPEVTVFPKEPVELGQPNTLICHIDKFFPPVLNVTWLCNGELVTEGVAESLFLPRTDYSFHKFHYLTFVPSAEDFYDCRVEHWGLDQPLLKHWEAQEPIQMPETTE
HLA−DPB1*04:01(配列番号19)
RATPENYLFQGRQECYAFNGTQRFLERYIYNREEFARFDSDVGEFRAVTELGRPAAEYWNSQKDILEEKRAVPDRMCRHNYELGGPMTLQRRVQPRVNVSPSKKGPLQHHNLLVCHVTDFYPGSIQVRWFLNGQEETAGVVSTNLIRNGDWTFQILVMLEMTPQQGDVYTCQVEHTSLDSPVTVEWKAQSDSARSK
RATPENYLFQGRQECYAFNGTQRFLERYIYNREEFARFDSDVGEFRAVTELGRPAAEYWNSQKDILEEKRAVPDRMCRHNYELGGPMTLQRRVQPRVNVSPSKKGPLQHHNLLVCHVTDFYPGSIQVRWFLNGQEETAGVVSTNLIRNGDWTFQILVMLEMTPQQGDVYTCQVEHTSLDSPVTVEWKAQSDSARSK
表4は、発現しているHLA融合タンパク質のフォーマットを示す。表5は、α及びβ鎖の両方のアミノ酸配列を示す。発現及び精製のために、HLAα及びβECD−Fc融合物をHEK293Expi細胞にコトランスフェクトし、可溶性HLA−ECD Fc融合タンパク質をプロテインA/SECを介して精製した。EZ−Link(商標)スルホ−NHS−LC−ビオチンと、標識キット(Thermo、カタログ番号21327)を用いて、すべてのHLA−DR抗原をビオチンにコンジュゲートした。HABA−アビジンアッセイ(Thermo、カタログ番号46610)及びOctetによって、ビオチニル化の成功を分析した。
IgG2シグマアイソタイプとして定常ドメインを再度遺伝子操作した後、対照抗体として抗体Lym−1、アポリズマブ(1D10)、及びL243を使用した。遺伝子操作を受けたIgG2シグマmAbを、DR4B4(Lym−1)、DR4B5(アポリズマブ)、及びDR4B6(L243)と再命名した。IgG2σは、エフェクター機能を欠失させたFc(silent Fc)であり、野生型IgG2と比較して置換V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331Sを有する。IgG2シグマは、米国特許第8,961,967号に記載されている。
Lym−1 VH(配列番号31)
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCASHYGSTLAFASWGHGTLVTVSA
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTISGFSLTSYGVHWVRQPPGKGLEWLVVIWSDGSTTYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCASHYGSTLAFASWGHGTLVTVSA
Lym−1 VL(配列番号32)
DIQMTQSPASLSASVGETVTIICRASVNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKILAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGPFTFGSGTKLEIK
DIQMTQSPASLSASVGETVTIICRASVNIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKILAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGPFTFGSGTKLEIK
アポリズマブVH(配列番号33)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWIGVKWSGGSTEYNAAFISRLTISKDTSKNQVSLKLNSLTAADTAVYYCARNDRYAMDYWGQGTLVTVSS
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWIGVKWSGGSTEYNAAFISRLTISKDTSKNQVSLKLNSLTAADTAVYYCARNDRYAMDYWGQGTLVTVSS
アポリズマブVL(配列番号34)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVSNAKTLAEGVPSRFSGSGSGKQFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGNSYPFGQGTKLEIK
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLVSNAKTLAEGVPSRFSGSGSGKQFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGNSYPFGQGTKLEIK
L243 VH(配列番号35)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGFTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTREPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTAKYFCARDITAVVPTGFDYWGQGTTLTVSS
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGFTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTREPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTAKYFCARDITAVVPTGFDYWGQGTTLTVSS
L243 Vl(配列番号36)
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYRQKQGKSPQLLVFAASNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGDYYCQHFWTTPWAFGGGTNLEIK
DIQMTQSPASLSVSVGETVTITCRASENIYSNLAWYRQKQGKSPQLLVFAASNLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDFGDYYCQHFWTTPWAFGGGTNLEIK
実施例2.HLA−DRに結合する抗体のファージディスプレイライブラリからの単離
Shi et al.,J Mol Biol 397:385〜96,2010、国際公開第2009/085462号)に記載の2セットのデノボpIXファージディスプレイライブラリから、HLA−DR結合性のFabを選択した。簡潔に言えば、V3.0及びV5.0と呼ばれる2セットのライブラリは、ヒトスカフォールドを多様化させることによって作製されたものであり、生殖系列VH遺伝子IGHV1−69*01、IGHV3−23*01及びIGHV5−51*01を、H3ループを介してヒトIGHJ−4ミニ遺伝子で組み換え(V5.0ではIGHJ−6ミニ遺伝子も用いた)、そして、ヒト生殖系列VLカッパ遺伝子O12(IGKV1−39*01)、L6(IGKV3−11*01)、A27(IGKV3−20*01)及びB3(IGKV4−1*01)をIGKJ−1ミニ遺伝子で組み換えて、完全なVH及びVLドメインを構築した。多様化のために、タンパク質及びペプチド抗原と高頻度で接触すると特定された位置に対応するH1、H2、L1、L2及びL3ループ周辺の重鎖及び軽鎖可変領域内の位置を選択した。選択した位置における配列多様性は、それぞれのIGHV又はIGLV遺伝子のIGHV又はIGLV生殖系列遺伝子ファミリーにおいてそれぞれの位置に存在する残基に制限した。H3ループにおける多様性は、V3.0ライブラリについては7〜14アミノ酸長、V5.0ライブラリについては6〜19アミノ酸長の短鎖〜中鎖の合成ループを使用して作製した。H3におけるアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計された。ライブラリを作製するために利用したスカフォールドは、そのヒトVH及びVL生殖系列遺伝子の由来に従って命名した。V3.0及びV5.0セットの両方について、HLA−DRを発現する組み換え細胞株又はFc断片に融合しており、特定のペプチドをディスプレイするHLA−DRの細胞外ドメインに対する選択実験に用いられる各ライブラリセットについて、3つの重鎖ライブラリのそれぞれを、4個の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせて12の固有のVH:VL組み合わせを作製した。
Shi et al.,J Mol Biol 397:385〜96,2010、国際公開第2009/085462号)に記載の2セットのデノボpIXファージディスプレイライブラリから、HLA−DR結合性のFabを選択した。簡潔に言えば、V3.0及びV5.0と呼ばれる2セットのライブラリは、ヒトスカフォールドを多様化させることによって作製されたものであり、生殖系列VH遺伝子IGHV1−69*01、IGHV3−23*01及びIGHV5−51*01を、H3ループを介してヒトIGHJ−4ミニ遺伝子で組み換え(V5.0ではIGHJ−6ミニ遺伝子も用いた)、そして、ヒト生殖系列VLカッパ遺伝子O12(IGKV1−39*01)、L6(IGKV3−11*01)、A27(IGKV3−20*01)及びB3(IGKV4−1*01)をIGKJ−1ミニ遺伝子で組み換えて、完全なVH及びVLドメインを構築した。多様化のために、タンパク質及びペプチド抗原と高頻度で接触すると特定された位置に対応するH1、H2、L1、L2及びL3ループ周辺の重鎖及び軽鎖可変領域内の位置を選択した。選択した位置における配列多様性は、それぞれのIGHV又はIGLV遺伝子のIGHV又はIGLV生殖系列遺伝子ファミリーにおいてそれぞれの位置に存在する残基に制限した。H3ループにおける多様性は、V3.0ライブラリについては7〜14アミノ酸長、V5.0ライブラリについては6〜19アミノ酸長の短鎖〜中鎖の合成ループを使用して作製した。H3におけるアミノ酸分布は、ヒト抗体において観察されるアミノ酸の変動を模倣するよう設計された。ライブラリを作製するために利用したスカフォールドは、そのヒトVH及びVL生殖系列遺伝子の由来に従って命名した。V3.0及びV5.0セットの両方について、HLA−DRを発現する組み換え細胞株又はFc断片に融合しており、特定のペプチドをディスプレイするHLA−DRの細胞外ドメインに対する選択実験に用いられる各ライブラリセットについて、3つの重鎖ライブラリのそれぞれを、4個の生殖系列軽鎖又は生殖系列軽鎖ライブラリと組み合わせて12の固有のVH:VL組み合わせを作製した。
「細胞に基づく」選別では、不要のエピトープ又はネイティブ細胞(親細胞株U937)に対する初期枯渇工程、それに続く標的エピトープ又はトランスフェクトされた細胞(組み換え細胞株)の選別工程、に基づくサブトラクティブストラテジを使用した。U937細胞における安定的トランスフェクションによって、HLA−DR15を発現する組み換え細胞株(Uniprot:P01911)を作製した。このサブトラクティブストラテジでは、所望のもの他の過剰な細胞表面受容体に結合しているファージの選別を回避した。精製された組み換え抗原を用いるファージ選別では、HAペプチドHA_304〜318を有するビオチン化HLA−DR4(DR4G89)又はII型コラーゲンペプチドCII_257〜273を有するHLA−DR4(DR4G92)をベイト(bait)として用いて、ファージバインダを捕捉及び固定化した。数回の選別ラウンド後、精製抗原を用いるポリクローナルファージELISAを実施して、個々のパニング実験の特異的富化(enrichment)を検出した。個々のFabクローンから発現したFabタンパク質を、いくつかの異なるビオチン化HLA−DR抗原(DR4G89、DR4G90、DR4G92、DR4G102)並びにビオチン化HLA−DP(DR4G113)及びHLA−DQ(DR4G111及びDR4G112)に対するバインダとして使用したモノクローナルFab ELISAで、HLA−DRに対するバインダの富化が立証されたこれらパニング実験から回収されたファージを更にスクリーニングした。陰性対照FabよりもHLA−DRに対する結合シグナルが5倍高く、及び陰性対照FabよりもHLA−DP又はHLA−DQに対する結合シグナルが5倍未満で高いFabクローンを、更なる分析のために選択した。選択されたFabをIgG2シグマ/κappaとしてクローニングし、MSDアッセイを用いて更に特性評価した。
実施例3.抗HLA−DR抗体は、提示されるペプチドに関係なく可溶性HLA−DR抗原に結合する
選択された生成抗体を、ベータ鎖のN末端に結合している様々なペプチドを有する可溶性HLA−DR、HLA−DQ、又はHLA−DP抗原に対する結合について特性評価した。更に、対照抗体DR4B4、DR4B5、及びDR4B6についても試験した。DR、DP、及びDQの可溶性抗原を、4℃で一晩、5μg/mLでMSD標準プレート(Meso Scale Discovery、カタログ番号L15XA−3)にコーティングした。翌日、プレートを自動プレート洗浄機(Bio Tek)でPBSTにより3回洗浄し、30分間StartingBlock(商標)(Thermo Scientific、カタログ番号37543)でブロッキングし、抗体と共に1時間インキュベートした。0.04〜5μg/mLの範囲の4つの抗体濃度を用いてDR抗原に対する結合を試験した。5μg/mLの1つの濃度を用いてDP及びDQ抗原に対する結合を試験した。3回洗浄した後、SulfoTag抗ヒト/NHP Kappa二次抗体(Meso Scale Discovery、カタログ番号D20TF−6)を添加し、1時間インキュベートした。更に3回洗浄した後、MSDリーダー(Meso Scale Discovery)でプレートを読み取り、電気化学発光(ECL)を測定した。MSDアッセイは高い再現性を有するので、各データ点のためデュープリケートで実施した。DP及びDQに対する結合に関しては5μg/mL、DR対立遺伝子に対する結合に関しては0.2μg/mLの抗体濃度における、抗体のDR、DP、又はDQ抗原に対する結合の結果(ECLシグナルとして表す)を表6に示し、デュープリケートで取った各データ点(the two replicates)の平均として報告する。DR4G89(HA_304−318ペプチドを有するHLA−DR4)に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図9に示す。DR4G93(HA_304−318ペプチドを有するHLA−DR1)に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図10に示す。DR4G90(CII_1236−1249ペプチドを有するHLA−DR4)に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図11に示す。DR4G99(CII_1236−1249ペプチドを有するHLA−DR1)に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図12に示す。
選択された生成抗体を、ベータ鎖のN末端に結合している様々なペプチドを有する可溶性HLA−DR、HLA−DQ、又はHLA−DP抗原に対する結合について特性評価した。更に、対照抗体DR4B4、DR4B5、及びDR4B6についても試験した。DR、DP、及びDQの可溶性抗原を、4℃で一晩、5μg/mLでMSD標準プレート(Meso Scale Discovery、カタログ番号L15XA−3)にコーティングした。翌日、プレートを自動プレート洗浄機(Bio Tek)でPBSTにより3回洗浄し、30分間StartingBlock(商標)(Thermo Scientific、カタログ番号37543)でブロッキングし、抗体と共に1時間インキュベートした。0.04〜5μg/mLの範囲の4つの抗体濃度を用いてDR抗原に対する結合を試験した。5μg/mLの1つの濃度を用いてDP及びDQ抗原に対する結合を試験した。3回洗浄した後、SulfoTag抗ヒト/NHP Kappa二次抗体(Meso Scale Discovery、カタログ番号D20TF−6)を添加し、1時間インキュベートした。更に3回洗浄した後、MSDリーダー(Meso Scale Discovery)でプレートを読み取り、電気化学発光(ECL)を測定した。MSDアッセイは高い再現性を有するので、各データ点のためデュープリケートで実施した。DP及びDQに対する結合に関しては5μg/mL、DR対立遺伝子に対する結合に関しては0.2μg/mLの抗体濃度における、抗体のDR、DP、又はDQ抗原に対する結合の結果(ECLシグナルとして表す)を表6に示し、デュープリケートで取った各データ点(the two replicates)の平均として報告する。DR4G89(HA_304−318ペプチドを有するHLA−DR4)に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図9に示す。DR4G93(HA_304−318ペプチドを有するHLA−DR1)に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図10に示す。DR4G90(CII_1236−1249ペプチドを有するHLA−DR4)に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図11に示す。DR4G99(CII_1236−1249ペプチドを有するHLA−DR1)に対する抗体の結合についての用量反応曲線を図12に示す。
DR4B98が、CII_1236−1249ペプチドを有するHLA−DRに対する結合の減少を示したことを除いて、HLA−DRに提示されたペプチドに関係なく、生成された抗体はHLA−DR4及びHLA−DR1に結合した。抗体がHLA−DQ及びHLA−DPに対して示した結合は最小限のものであった。
実施例4.抗HLA−DR抗体の特性評価
生成された抗体を、その抗原特異的T細胞活性化を阻害する能力、HLA−DR4トランスジェニック動物から単離された樹状細胞及び末梢血単核球(PBMC)に対する結合、並びにB細胞の生存に対する効果について試験した。
生成された抗体を、その抗原特異的T細胞活性化を阻害する能力、HLA−DR4トランスジェニック動物から単離された樹状細胞及び末梢血単核球(PBMC)に対する結合、並びにB細胞の生存に対する効果について試験した。
方法
抗原特異的T細胞の阻害:HLA−DR4トランスジェニックマウス樹状細胞の混合リンパ球反応(MLR)アッセイ(「HLA−DR4 DC MLR」)
MLRアッセイを使用して、ヒトCD4+T細胞とヒトHLA−DR4を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞との共培養下における細胞増殖の阻害を測定して、生成された抗体のT細胞の活性化を阻害する能力を評価した。
抗原特異的T細胞の阻害:HLA−DR4トランスジェニックマウス樹状細胞の混合リンパ球反応(MLR)アッセイ(「HLA−DR4 DC MLR」)
MLRアッセイを使用して、ヒトCD4+T細胞とヒトHLA−DR4を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞との共培養下における細胞増殖の阻害を測定して、生成された抗体のT細胞の活性化を阻害する能力を評価した。
樹状細胞は、Abbノックアウト/トランスジェニックHLA−DR4マウス骨髄(系統4149、Taconic Biosciences)に由来していた。これらマウスは、マウスI−E(H2−E)の膜近位ドメインが遺伝子操作されたヒトHLA−DRA及びHLA−DRB1*04:01を発現する。骨髄は、マウスから調製し、−80℃で凍結した。骨髄を解凍し、10mLの樹状細胞(DC)培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、1%最小必須培地(MEM)非必須アミノ酸(NEAA)溶液、10%熱不活化ウシ胎児血清(すべてThermo Fisher Scientificから購入)、及び50μM 2−メルカプトエタノール(Sigma−Aldrich)を含有するRPMI−1640/Glutamax)に再懸濁させた。細胞を1200rpmで10分間遠心分離し、次いで、10mLのDC培地に再懸濁させ、カウントし、再度1200rpmで8分間スピンした。20ng/mLの組み換えマウスGM−CSF(Peprotech)を添加したDC培地で細胞を0.3×106細胞/mLに希釈した。6mLの希釈した細胞を、6ウェルプレートの各ウェルに移し、次いで、プレートを37℃/5% CO2で96時間インキュベートした。3mLの培地を各ウェルから除去し、3mLの新鮮DC培地+20ng/mL GM−CSFと交換した。プレートを37℃/5%CO2で更に48時間インキュベートした。3mLの培地を各ウェルから除去し、3mLの新鮮DC培地+20ng/mL GM−CSF+2μg/mL LPS(最終濃度1μg/mL LPS)(Enzo Life Sciences)と交換した。次いで、プレートを37℃/5% CO2で18時間インキュベートした。
MLRアッセイにおいて用いられるヒトC4+T細胞を、凍結させたヒトPBMC(Hemacare)から単離した。細胞を解凍し、50mLのコニカルに移し、40mLの完全培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10%加熱不活化ウシ胎児血清(すべてThermo Fisher Scientificから購入)、及び50μM 2−メルカプトエタノール(Sigma−Aldrich)を含有するRPMI−1640/Glutamax)で洗浄した。細胞を1000rpmで8分間遠心分離し、上清を吸引除去し、細胞を40mLのEasySep緩衝液(PBS+2%熱不活化ウシ胎児血清+1mM EDTA)に再懸濁させた。細胞を1200rpmで8分間遠心分離し、5×107個/mLの濃度でEasySep緩衝液に再懸濁させ、15mLのポリスチレン丸底チューブに移した。製造業者の指示書(Stemcell Technologies)に従ってEasySep Human CD4+T Cell Isolation Kitを用いてヒトCD4+T細胞を単離した。単離した細胞を、1×106個/mLの濃度で完全培地に再懸濁させた。
LPS成熟マウス骨髄由来樹状細胞をプレートから回収し、50mのコニカルチューブ内で合わせた。プレートを2mLのPBSで洗浄し、次いで、2mLのPBS+3mM EDTA(Thermo Fisher Scientific)を37℃/5% CO2で10分間各ウェルに添加して、残りの樹状細胞を回収した。細胞をプレートから回収し、50mLのコニカルに移した。細胞を40mLの完全培地で3回洗浄した(1200rpmで8分間遠心分離)。このDCを、2.5×105個/mLの濃度になるように完全培地に再懸濁させた。50μLの細胞を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加した。抗HLA−DR抗体を、10μg/mLの単一用量で添加した、又は4×最終濃度の完全培地で連続希釈し、50μLの抗体希釈物を各ウェルに添加した。対照ウェルには50μLの培地を加えた。T細胞を各ウェルに添加し(100μL/ウェルで、T細胞を1×106個/mL)、その結果、合計体積は200μL/ウェルになった。プレートを37℃/5% CO2で5日間インキュベートした。インキュベート後、1.0mCi/ウェル3H−チミジン(Perkin Elmer)を含有する完全培地25μLをすべてのウェルに添加し、37℃/5% CO2で6時間インキュベートした。細胞をUnifilter−96、GF/Cプレート(Perkin Elmer)に収集し、RTで一晩乾燥させた。50μLのMicroscint−20(Perkin Elmer)を各ウェルに添加し、TopCount instrument(Perkin Elmer)を用いてカウントした。
HLA−DR4トランスジェニックマウスに由来する樹状細胞に結合する抗体
HLA−DR4トランスジェニックマウスに由来する樹状細胞に対する抗HLA−DR抗体の結合を評価した。HLA−DR4 DCは、上記のように由来していた。DC(5×105個/ウェル)を、96ウェル丸底プレートの完全培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン+10%ウシ胎児血清を含有するRPMI−1640/Glutamax−すべてThermo Fisher Scientificから購入)にプレーティングした。細胞を、TruStain FcX(BioLegend)を含有する完全培地50μLに再懸濁させ、室温で10分間インキュベートした。抗HLA−DR mAb及びアイソタイプ対照mAbを、試験する最終濃度(最終濃度10μg/mL)の2倍になるように完全培地で希釈した。希釈したmAb50μLをウェルに添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートした。細胞を、アジド−及び血清/タンパク質フリーのPBS200μLで2回洗浄し、4℃で5分間1400rpmで遠心分離した。細胞を、1:4000希釈したFixable Viability Dye eFluor 450(eBioscience)を含有するPBS又はPBSのみ100μLに再懸濁させた。プレートを、光から保護した状態で2〜8℃にて30分間インキュベートした。細胞を150μLのFACS緩衝液で洗浄し、4℃で5分間1400rpmで遠心分離した。ハムスター抗マウスCD11c−PE−Cy7(BD Biosciences;1:20、5μL/試験)及びAF647 AffiniPure F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG、Fcγ断片特異的(Jackson Immunoresearch;1:2000希釈)を含有するFACS緩衝液50μLを各ウェルに添加し、プレートを暗条件下、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、1ウェル当たり150μLのFACS緩衝液で洗浄し、4℃で5分間1400rpmで遠心分離した。細胞は、4%パラホルムアルデヒド溶液(Affymetrix)200μLに再懸濁させた細胞であり、15分間氷上でインキュベートした。細胞を1800rpmで5分間遠心分離し、200μLのFACS緩衝液に再懸濁させた。LSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)でイベントを回収した。Flowjoソフトウェアを使用して、Live/Dead−CD11c+樹状細胞について平均蛍光強度(MFI、GeoMean)を決定した。抗HLA−DR mAbの結合レベルをアイソタイプ対照と比較した。
HLA−DR4トランスジェニックマウスに由来する樹状細胞に対する抗HLA−DR抗体の結合を評価した。HLA−DR4 DCは、上記のように由来していた。DC(5×105個/ウェル)を、96ウェル丸底プレートの完全培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン+10%ウシ胎児血清を含有するRPMI−1640/Glutamax−すべてThermo Fisher Scientificから購入)にプレーティングした。細胞を、TruStain FcX(BioLegend)を含有する完全培地50μLに再懸濁させ、室温で10分間インキュベートした。抗HLA−DR mAb及びアイソタイプ対照mAbを、試験する最終濃度(最終濃度10μg/mL)の2倍になるように完全培地で希釈した。希釈したmAb50μLをウェルに添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートした。細胞を、アジド−及び血清/タンパク質フリーのPBS200μLで2回洗浄し、4℃で5分間1400rpmで遠心分離した。細胞を、1:4000希釈したFixable Viability Dye eFluor 450(eBioscience)を含有するPBS又はPBSのみ100μLに再懸濁させた。プレートを、光から保護した状態で2〜8℃にて30分間インキュベートした。細胞を150μLのFACS緩衝液で洗浄し、4℃で5分間1400rpmで遠心分離した。ハムスター抗マウスCD11c−PE−Cy7(BD Biosciences;1:20、5μL/試験)及びAF647 AffiniPure F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG、Fcγ断片特異的(Jackson Immunoresearch;1:2000希釈)を含有するFACS緩衝液50μLを各ウェルに添加し、プレートを暗条件下、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、1ウェル当たり150μLのFACS緩衝液で洗浄し、4℃で5分間1400rpmで遠心分離した。細胞は、4%パラホルムアルデヒド溶液(Affymetrix)200μLに再懸濁させた細胞であり、15分間氷上でインキュベートした。細胞を1800rpmで5分間遠心分離し、200μLのFACS緩衝液に再懸濁させた。LSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)でイベントを回収した。Flowjoソフトウェアを使用して、Live/Dead−CD11c+樹状細胞について平均蛍光強度(MFI、GeoMean)を決定した。抗HLA−DR mAbの結合レベルをアイソタイプ対照と比較した。
ヒトB細胞生存アッセイ
Clinical Protocol:NOCOMPOUNDNAP1001「Generation of reagents from human whole blood for the development and control of laboratory assays and procedures」を使用して、Johnson & Johnsonの従業員のドナーから血液を回収した。血液を、ヘパリンナトリウムを含有するBD Vacutainerに回収した。血液をPBSで1:1〜1:3希釈した。15mLのFicoll−Paque(GE Healthcare)を50mLのコニカルに添加し、30mLの希釈血液を、傾けたチューブの側面にゆっくりとピペットで落とすことによってFicoll上に慎重に層状に重ねた。コニカルを、RTでブレーキなしに4N(400g)で30分間遠心分離した。PBMC層を50mLのコニカルチューブに回収し、次いで、これにPBSを充填し、1200rpmで10分間遠心分離した。細胞をPBSで更なる時間洗浄した。細胞を、完全培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、1% NEAA、1% HEPES、及び10%熱不活化ウシ胎児血清を含有するRPMI−1640/Glutamax、すべてThermo Fisher Scientificから購入)に再懸濁させ、カウントした。細胞を、800,000個/ウェルの濃度で96ウェル丸底プレートにプレーティングした。抗HLA−DR抗体を、0.2μg/mL及び2μg/mLの濃度でウェルに添加した。プレートを37℃/5% CO2で20時間インキュベートした。次いで、細胞を、RTで15分間、100μg/mLヒトIgG(Sigma−Aldrich)を含むFACS緩衝液(PBS中2%熱不活化ウシ胎児血清、ThermoFisher Scientific)100μLに再懸濁させた。細胞を遠心分離によってペレット化させ、氷上で20分間50μL抗体カクテルに再懸濁させた。抗体カクテルは、以下:Brilliant染色緩衝液(BD Biosciences)、抗CD3−PE Cy7クローンOKT3(BioLegend)、抗CD20−APC Cy7クローン2H7(BioLegend)、抗CD16−BV605クローン3G8(BioLegend)、及び抗CD14−BV785クローンM5E2(BioLegend)を含有していた。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、100μLのLive/Dead stain−eF660(L/D)(eBioscience;PBS1mL当たり1μL)に再懸濁させ、氷上で20分間インキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、次いで、アネキシンV結合緩衝液(BioLegend)で1回洗浄した。細胞を、RTで20分間、100μLのアネキシンV結合緩衝液+5μLのアネキシンV−パシフィックブルー(BioLegend)に再懸濁させた。細胞をアネキシンV結合緩衝液で1回洗浄し、氷上で10分間、100μLのCytoFix(BD Biosciences)に再懸濁させた。細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し、次いで、200μLのFACS緩衝液に再懸濁させた。LSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)でイベントを回収した。Ultracompビーズ(eBisocience)を使用して、単色補償(single-color compensations)を設定する。Flowjoソフトウェアを使用してLive/Dead(L/D)及びアネキシンV+/−B細胞の頻度を決定し、GraphPad Prism 6でグラフ化した。死B細胞の頻度を、eF660+及びアネキシンV+でもあるCD3−CD20+細胞の百分率として計算した。アポトーシスB細胞の頻度を、eF660−及びアネキシンV+でもあるCD3−CD20+細胞の百分率として計算した。t検定を用いて統計的有意性を判定した。
Clinical Protocol:NOCOMPOUNDNAP1001「Generation of reagents from human whole blood for the development and control of laboratory assays and procedures」を使用して、Johnson & Johnsonの従業員のドナーから血液を回収した。血液を、ヘパリンナトリウムを含有するBD Vacutainerに回収した。血液をPBSで1:1〜1:3希釈した。15mLのFicoll−Paque(GE Healthcare)を50mLのコニカルに添加し、30mLの希釈血液を、傾けたチューブの側面にゆっくりとピペットで落とすことによってFicoll上に慎重に層状に重ねた。コニカルを、RTでブレーキなしに4N(400g)で30分間遠心分離した。PBMC層を50mLのコニカルチューブに回収し、次いで、これにPBSを充填し、1200rpmで10分間遠心分離した。細胞をPBSで更なる時間洗浄した。細胞を、完全培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、1% NEAA、1% HEPES、及び10%熱不活化ウシ胎児血清を含有するRPMI−1640/Glutamax、すべてThermo Fisher Scientificから購入)に再懸濁させ、カウントした。細胞を、800,000個/ウェルの濃度で96ウェル丸底プレートにプレーティングした。抗HLA−DR抗体を、0.2μg/mL及び2μg/mLの濃度でウェルに添加した。プレートを37℃/5% CO2で20時間インキュベートした。次いで、細胞を、RTで15分間、100μg/mLヒトIgG(Sigma−Aldrich)を含むFACS緩衝液(PBS中2%熱不活化ウシ胎児血清、ThermoFisher Scientific)100μLに再懸濁させた。細胞を遠心分離によってペレット化させ、氷上で20分間50μL抗体カクテルに再懸濁させた。抗体カクテルは、以下:Brilliant染色緩衝液(BD Biosciences)、抗CD3−PE Cy7クローンOKT3(BioLegend)、抗CD20−APC Cy7クローン2H7(BioLegend)、抗CD16−BV605クローン3G8(BioLegend)、及び抗CD14−BV785クローンM5E2(BioLegend)を含有していた。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、100μLのLive/Dead stain−eF660(L/D)(eBioscience;PBS1mL当たり1μL)に再懸濁させ、氷上で20分間インキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、次いで、アネキシンV結合緩衝液(BioLegend)で1回洗浄した。細胞を、RTで20分間、100μLのアネキシンV結合緩衝液+5μLのアネキシンV−パシフィックブルー(BioLegend)に再懸濁させた。細胞をアネキシンV結合緩衝液で1回洗浄し、氷上で10分間、100μLのCytoFix(BD Biosciences)に再懸濁させた。細胞をFACS緩衝液で1回洗浄し、次いで、200μLのFACS緩衝液に再懸濁させた。LSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)でイベントを回収した。Ultracompビーズ(eBisocience)を使用して、単色補償(single-color compensations)を設定する。Flowjoソフトウェアを使用してLive/Dead(L/D)及びアネキシンV+/−B細胞の頻度を決定し、GraphPad Prism 6でグラフ化した。死B細胞の頻度を、eF660+及びアネキシンV+でもあるCD3−CD20+細胞の百分率として計算した。アポトーシスB細胞の頻度を、eF660−及びアネキシンV+でもあるCD3−CD20+細胞の百分率として計算した。t検定を用いて統計的有意性を判定した。
ヒトPBMCに結合する抗体
ヒトPBMCに対する抗HLA−DR抗体の結合を評価した。ヒトPBMCを、上記のとおり単離した。各ドナー由来のPBMCを、500,000個/ウェルで96ウェル丸底プレートにプレーティングした。細胞を、RTで15分間、100μg/mLヒトIgG(Sigma−Aldrich)を含むFACS緩衝液(PBS中2%熱不活化ウシ胎児血清)100μLに再懸濁させた。25μLのBrilliant染色緩衝液(BD Biosciences)中1μgの抗HLA−DR mAbをウェルに添加し、次いで、25μLの抗体カクテルをウェルに添加した。抗体カクテルは、Brilliant染色緩衝液(BD Biosciences)及び2μL/試験で以下:抗CD3−PE Cy7クローンOKT3(BioLegend)、抗CD20−APC Cy7クローン2H7(BioLegend)、抗CD16−BV605クローン3G8(BioLegend)、及び抗CD14−BV785クローンM5E2(BioLegend)、のそれぞれを含有していた。細胞を氷上で20分間インキュベートし、次いで、FACS緩衝液で2回洗浄した。次いで、細胞を、氷上で20分間、Fcγ断片特異的なものであり、AF488で標識されたAffinipure F(ab)’2断片ヤギ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch)の1:200希釈物50μLに再懸濁させた。細胞をPBSで2回洗浄し、氷上で30分間100μLのLive/Dead stain(eBioscience;PBS1mL当たり0.5μL)に再懸濁させた。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、氷上で10分間、100μLのCytofix(BD)に再懸濁させ、FACS緩衝液で1回洗浄し、次いで、200μLのFACS緩衝液に再懸濁させた。LSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)でイベントを回収した。ドナー1由来の細胞を使用して、単色補償を設定した。Flowjoソフトウェアを使用して平均蛍光強度(MFI、GeoMean)を決定し、GraphPad Prism 6でグラフ化した。抗HLA−DR mAbの結合レベルをアイソタイプ対照と比較した。
ヒトPBMCに対する抗HLA−DR抗体の結合を評価した。ヒトPBMCを、上記のとおり単離した。各ドナー由来のPBMCを、500,000個/ウェルで96ウェル丸底プレートにプレーティングした。細胞を、RTで15分間、100μg/mLヒトIgG(Sigma−Aldrich)を含むFACS緩衝液(PBS中2%熱不活化ウシ胎児血清)100μLに再懸濁させた。25μLのBrilliant染色緩衝液(BD Biosciences)中1μgの抗HLA−DR mAbをウェルに添加し、次いで、25μLの抗体カクテルをウェルに添加した。抗体カクテルは、Brilliant染色緩衝液(BD Biosciences)及び2μL/試験で以下:抗CD3−PE Cy7クローンOKT3(BioLegend)、抗CD20−APC Cy7クローン2H7(BioLegend)、抗CD16−BV605クローン3G8(BioLegend)、及び抗CD14−BV785クローンM5E2(BioLegend)、のそれぞれを含有していた。細胞を氷上で20分間インキュベートし、次いで、FACS緩衝液で2回洗浄した。次いで、細胞を、氷上で20分間、Fcγ断片特異的なものであり、AF488で標識されたAffinipure F(ab)’2断片ヤギ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch)の1:200希釈物50μLに再懸濁させた。細胞をPBSで2回洗浄し、氷上で30分間100μLのLive/Dead stain(eBioscience;PBS1mL当たり0.5μL)に再懸濁させた。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、氷上で10分間、100μLのCytofix(BD)に再懸濁させ、FACS緩衝液で1回洗浄し、次いで、200μLのFACS緩衝液に再懸濁させた。LSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)でイベントを回収した。ドナー1由来の細胞を使用して、単色補償を設定した。Flowjoソフトウェアを使用して平均蛍光強度(MFI、GeoMean)を決定し、GraphPad Prism 6でグラフ化した。抗HLA−DR mAbの結合レベルをアイソタイプ対照と比較した。
結果
試験した抗体はすべて、10μg/mLの単一用量濃度で、MLRアッセイにおいてT細胞の活性化を阻害した。抗体は、MLRアッセイにおいて、0.11〜5.36μg/mLの範囲のIC50値で細胞の増殖を阻害した。対照抗体DR4B6は、用量依存的にMLRを阻害したが、対照抗体DR4B4及びDR4B5は、試験した最高濃度10μg/mLで100%阻害に達しなかったので、これらの抗体についてIC50値を計算することはできなかった。
試験した抗体はすべて、10μg/mLの単一用量濃度で、MLRアッセイにおいてT細胞の活性化を阻害した。抗体は、MLRアッセイにおいて、0.11〜5.36μg/mLの範囲のIC50値で細胞の増殖を阻害した。対照抗体DR4B6は、用量依存的にMLRを阻害したが、対照抗体DR4B4及びDR4B5は、試験した最高濃度10μg/mLで100%阻害に達しなかったので、これらの抗体についてIC50値を計算することはできなかった。
試験した抗体はすべて、ヒトPBMCに結合し、また、ヒトHLA−DR4トランスジェニック動物由来のDCにも結合した。1つの対照抗体DR4B5は、HLA−DR4トランスジェニックDCに対して低い結合を示した。
生成された抗体は、B細胞の死又はアポトーシスを誘導することができないという点で試験抗体とは異なっていた。図13は、生成された抗HLA−DR抗体は、アイソタイプ対照と比べて3人の別々のドナーにおいて死B細胞の頻度に対して効果を有しなかったが、対照抗体DR4B6は、死B細胞の頻度の統計的に有意な増加を示したことを示す。同様に、図14は、生成された抗HLA−DR抗体は、3人の別々のドナーに由来するB細胞においてアポトーシスを誘導しなかったが、対照抗体DR4B6は誘導したことを示す。
表7は、選択された抗HLA−DR抗体の特徴を示す。
DR4B4(Lym−1)及びDR4B5(アポリズマブ)は、B細胞のアポトーシス及び死を誘導することが示されている(Zhang et al.,Cancer Biother Radiopharm 22:342〜56,2007;Mone et al.,Blood 103:1846〜54,2004)。
実施例5.抗HLA−DR抗体の構造的特徴
標準的な技術を用いて、抗体のcDNA配列及びアミノ酸翻訳物を得た。ポリペプチド配列の決定後、可変領域又は完全長抗体をコードしているいくつかの抗体cDNAを、発現をスケールアップするための標準的な方法を用いてコドンを最適化した。
標準的な技術を用いて、抗体のcDNA配列及びアミノ酸翻訳物を得た。ポリペプチド配列の決定後、可変領域又は完全長抗体をコードしているいくつかの抗体cDNAを、発現をスケールアップするための標準的な方法を用いてコドンを最適化した。
表8は、選択抗HLA−DR抗体のHCDR1のアミノ酸配列を示す。
表9は、選択抗HLA−DR抗体のHCDR2のアミノ酸配列を示す。
表10は、選択抗HLA−DR抗体のHCDR3のアミノ酸配列を示す。
表11は、選択抗HLA−DR抗体のLCDR1のアミノ酸配列を示す。
表12は、選択抗HLA−DR抗体のLCDR2のアミノ酸配列を示す。
表13は、選択抗HLA−DR抗体のLCDR3のアミノ酸配列を示す。
表14は、選択抗HLA−DR抗体のVH、VL、HC、及びLC対についてのタンパク質配列番号を示す。
表15は、選択抗HLA−DR抗体のVH、VL、HC、及びLCをコードしているポリヌクレオチド配列番号を示す。
表16は、選択抗HLA−DR抗体のVH、VL、HC、及びLCのアミノ酸配列、並びにこれらをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
表17は、選択抗HLA−DR抗体のフレームワークを示す。
IGHV1−69配列番号62
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS SYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGTANYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
IGHV5−51配列番号63
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR
IGKV3−20(A27)配列番号64
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP
IGKV3−11(L6)配列番号65
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
IGHV3_3−23配列番号161
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWGQGTLVTVSS
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWGQGTLVTVSS
IGKV1−39配列番号162
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
実施例6.HLA−DRに対する抗HLA−DR抗体の親和性
抗HLA−DR抗体と、II型コラーゲン又は赤血球凝集素ペプチドのいずれかを含有するHLA−DR1複合体及びHLA−DR4複合体との相互作用について、25℃でProteOn XPR36システムを用いて表面プラズモン共鳴(SPR)によって試験した。アミンカップリング化学についての製造業者の取扱説明書を使用して、抗HLA−DR抗体をGLCセンサチップの表面に直接カップリングさせることによって、バイオセンサ表面を調製した。カップリング緩衝液、10mM酢酸ナトリウム、pH5.0で希釈した15μg/mLのmAbで、約130〜500RU(反応単位)のmAbを固定化した。ランニング緩衝液(DPBS+0.01% P20+100μg/mL BSA)中にて25℃で速度実験を実施した。速度実験を実施するために、アナライト(HLA−DR1及びHLA−DR4複合体)を、3.7nM〜300nM(3倍連続希釈)の範囲の濃度で、カップリングした抗HLA−DR mAbセンサ上に水平配向で注入した。50μL/分で6分間、会合相をモニタリングし、続いて、30分間緩衝液を流した(解離相)。100μL/分で100mMリン酸(H3PO4)を18秒間ずつ2回流してチップ表面を再生した。回収したデータをProteOn Managerソフトウェアを用いて処理した。まず、インタースポットを用いてバックグラウンドについてデータを補正した。次いで、分析物注入用の緩衝液注入を使用して、データのダブルリファレンスサブトラクション(double reference subtraction)を行った。ラングミュア型の1:1結合モデルを用い、データの速度論的分析を実施した。各mAbの結果を、Ka(結合速度(On−rate))、Kd(解離速度(Off−rate))、及びKD(平衡解離定数)の形式で報告した。
抗HLA−DR抗体と、II型コラーゲン又は赤血球凝集素ペプチドのいずれかを含有するHLA−DR1複合体及びHLA−DR4複合体との相互作用について、25℃でProteOn XPR36システムを用いて表面プラズモン共鳴(SPR)によって試験した。アミンカップリング化学についての製造業者の取扱説明書を使用して、抗HLA−DR抗体をGLCセンサチップの表面に直接カップリングさせることによって、バイオセンサ表面を調製した。カップリング緩衝液、10mM酢酸ナトリウム、pH5.0で希釈した15μg/mLのmAbで、約130〜500RU(反応単位)のmAbを固定化した。ランニング緩衝液(DPBS+0.01% P20+100μg/mL BSA)中にて25℃で速度実験を実施した。速度実験を実施するために、アナライト(HLA−DR1及びHLA−DR4複合体)を、3.7nM〜300nM(3倍連続希釈)の範囲の濃度で、カップリングした抗HLA−DR mAbセンサ上に水平配向で注入した。50μL/分で6分間、会合相をモニタリングし、続いて、30分間緩衝液を流した(解離相)。100μL/分で100mMリン酸(H3PO4)を18秒間ずつ2回流してチップ表面を再生した。回収したデータをProteOn Managerソフトウェアを用いて処理した。まず、インタースポットを用いてバックグラウンドについてデータを補正した。次いで、分析物注入用の緩衝液注入を使用して、データのダブルリファレンスサブトラクション(double reference subtraction)を行った。ラングミュア型の1:1結合モデルを用い、データの速度論的分析を実施した。各mAbの結果を、Ka(結合速度(On−rate))、Kd(解離速度(Off−rate))、及びKD(平衡解離定数)の形式で報告した。
表18は、HLA−DR4/赤血球凝集素ペプチド複合体(DR4G89)に対する結合に関してDR4B117及びDR4B127の親和性パラメータを示す。表19は、HLA−DR4/コラーゲンペプチド複合体(DR4G90)に対する結合に関してDR4B117及びDR4B127の親和性パラメータを示す。表20は、HLA−DR1/赤血球凝集素ペプチド複合体(DR4G93)に対する結合に関してDR4B117及びDR4B127の親和性パラメータを示す。表21は、HLA−DR1/コラーゲンペプチド複合体(DR4G99)に対する結合に関してDR4B117及びDR4B127の親和性パラメータを示す。
実施例7.抗体機能に対するアイソタイプの効果
IgG2シグマ/κ抗体DR4B117、DR4B30、DR4B127、DR4B98、及びDR4B6の可変領域を野性型IgG1としてクローニングして、可能性のある機能差を評価した。
IgG2シグマ/κ抗体DR4B117、DR4B30、DR4B127、DR4B98、及びDR4B6の可変領域を野性型IgG1としてクローニングして、可能性のある機能差を評価した。
IgG1/κ抗体を、DR4B391(野性型IgG1におけるDR4B117 VH/VL)、DR4B396(野性型IgG1におけるDR4B30 VH/VL)、DR4B392(野性型IgG1におけるDR4B127 VH/VL)、DR4B401(IgG1におけるDR4B98 VH/VL)、及びDR4B397(IgG1におけるDR4B6 VH/VL)と命名した。抗体の重鎖配列を表22に示す。軽鎖配列は親抗体と同一であった。
実施例4に記載のアッセイに加えて、HLA−DR4によって提示されるII型コラーゲンペプチド(アミノ酸259〜273;GIAGFKGEQGPKGEP、配列番号122)を特異的に認識するT細胞ハイブリドーマを用いて、抗原特異的T細胞を阻害する能力について抗体を試験した(HLA−DR4/II型コラーゲンペプチド拘束性T細胞ハイブリドーマアッセイ(「HLA−DR4/ColII−Tcell」アッセイ))。
4名の個々のPBMCドナーにわたるHLA−DR4 DC MLRアッセイの結果を表23に要約する。HLA−DR4トランスジェニックマウス由来の樹状細胞へのmAbの結合((「HLA−DR4 DC結合」アッセイ)又はヒトPBMCへのmAbの結合を評価した結果、ヒトB細胞の生存に対するmAbの効果、及びHLA−DR4/CIIペプチド拘束性T細胞ハイブリドーマの阻害を表24に示す。
エフェクター機能を欠失させたIgG2シグマから野性型IgG1へのアイソタイプの切り換えは、抗体機能に対して効果を有していた。例えば、DR4B117の野性型IgG1へのアイソタイプの切り換えの結果、mAbの阻害活性が改善されたが、DR4B127の野性型IgG1へのアイソタイプの切り換えの結果、mAbの阻害活性が低下した。PBCMへの結合又はB細胞の生存においてアイソタイプによる影響は存在しなかった。
DR4B30及びDR4B127は、10μg/mL及び1μg/mLの抗体濃度で、HLA−DR4/CIIペプチド拘束性T細胞ハイブリドーマによるIL−2生成を阻害した。DR4B117は、このアッセイにおいて阻害性ではなく、抗体は、試験したすべての用量においてIL−2の生成を増強した。対照抗体DR4B6は、10μg/mL及び1μg/mLの抗体濃度では阻害性であったが、0.1μg/mL未満の濃度ではIL−2の生成を増強した(表23)。
(HLA−DR4/II型コラーゲンペプチド拘束性T細胞ハイブリドーマアッセイ(「HLA−DR4/ColII−T細胞」アッセイ))。
Boleth B細胞株(HLA−DRB1*04:01についてホモ接合型)は、国際組織適合性ワーキンググループから入手した。Boleth細胞を洗浄し、1.25×105個/mLで完全培地(DMEM/Glutamax+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+10%ウシ胎児血清+50μM 2−メルカプトエタノール)に再懸濁させ、50μLの細胞を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加した。抗HLA−DR抗体を、10μg/mLの濃度で始めて、4×最終濃度、50μL/ウェルで添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートした。
Boleth B細胞株(HLA−DRB1*04:01についてホモ接合型)は、国際組織適合性ワーキンググループから入手した。Boleth細胞を洗浄し、1.25×105個/mLで完全培地(DMEM/Glutamax+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+10%ウシ胎児血清+50μM 2−メルカプトエタノール)に再懸濁させ、50μLの細胞を96ウェル丸底プレートの各ウェルに添加した。抗HLA−DR抗体を、10μg/mLの濃度で始めて、4×最終濃度、50μL/ウェルで添加した。プレートを37℃で1時間インキュベートした。
T細胞ハイブリドーマラインDR4.CII.36.8は、University of Tennessee Health Science CenterのEdward Rosloniec博士から入手した。これら細胞を完全培地で洗浄し、2×106個/mLの濃度で完全培地に再懸濁させ、Boleth細胞を含有するプレートに添加した(50μL/ウェル)。CIIペプチド(GIAGFKGEQGPKGEP、配列番号121)を完全培地で8μM(最終濃度2μMの4倍)に希釈し、50μL/ウェルでプレートに添加した。すべてのウェルの合計体積を、完全培地を用いて200μLにした。プレートを37℃で18〜21時間インキュベートした。製造業者の指示書に従ってmIL−2 AlphaLISAキット(Perkin Elmer)を用いて、分析のために上清を回収した。
実施例8.抗HLA−DR抗体は、様々なペプチドと複合体を形成している一連のHLA−DR抗原(a spectrum of HLA-DA antigens)のスペクトルに対する結合を保持する
選択抗体を、ベータ鎖のN末端に共有結合した様々なペプチドを有する複合体における可溶性HLA−DR、HLA−DQ、及びHLA−DP抗原に対する結合について更に特性評価した。実施例3に記載のプロトコールを用いて結合をアッセイした。ヘテロ二量体抗原を実施例1に記載のとおり発現させた。表25は、更に発現させたHLA融合タンパク質のフォーマットを示し、表26は、α鎖及びβ鎖のアミノ酸配列を示す。すべての更なるHLAタンパク質は、配列番号20の共通α鎖を有していた。CLIP、LCAP、又はPLPペプチドと複合体を形成している、被験DP抗原及び被験DQ抗原に結合した抗体は存在しなかった。DR4B117及びDR4B127は、共有エピトープを含有していない、DRB1*04:02、DRB1*15:01、及びDRB1*03:01を含む、すべての被験HLA抗原に対し結合を示した。対照抗体DR4B4及びDR4B5は、DR4B117及びDR4B127と比較したとき、DRB1*04:01、DRB1*01:01、及びDRB1*10:01に対して全体的な結合の減少を示し、DRB1*15:01及びDRB1*04:02には結合しなかった。DR4B6は、試験したHLAペプチド複合体すべてに対して結合を示した。表27、表28、表29、及び表30は、HLA分子に対する抗体の結合の結果を示す。
選択抗体を、ベータ鎖のN末端に共有結合した様々なペプチドを有する複合体における可溶性HLA−DR、HLA−DQ、及びHLA−DP抗原に対する結合について更に特性評価した。実施例3に記載のプロトコールを用いて結合をアッセイした。ヘテロ二量体抗原を実施例1に記載のとおり発現させた。表25は、更に発現させたHLA融合タンパク質のフォーマットを示し、表26は、α鎖及びβ鎖のアミノ酸配列を示す。すべての更なるHLAタンパク質は、配列番号20の共通α鎖を有していた。CLIP、LCAP、又はPLPペプチドと複合体を形成している、被験DP抗原及び被験DQ抗原に結合した抗体は存在しなかった。DR4B117及びDR4B127は、共有エピトープを含有していない、DRB1*04:02、DRB1*15:01、及びDRB1*03:01を含む、すべての被験HLA抗原に対し結合を示した。対照抗体DR4B4及びDR4B5は、DR4B117及びDR4B127と比較したとき、DRB1*04:01、DRB1*01:01、及びDRB1*10:01に対して全体的な結合の減少を示し、DRB1*15:01及びDRB1*04:02には結合しなかった。DR4B6は、試験したHLAペプチド複合体すべてに対して結合を示した。表27、表28、表29、及び表30は、HLA分子に対する抗体の結合の結果を示す。
配列番号71 ビメンチンL70A突然変異体66〜78ペプチド(VitL70A)SAVRARSSVPGVR
配列番号72 アグリカンペプチドN1(アグリカン)EVVLLVATEGRVRVNSAYQDK
配列番号104;CLIP KMRMATPLLMQALPM
配列番号72 アグリカンペプチドN1(アグリカン)EVVLLVATEGRVRVNSAYQDK
配列番号104;CLIP KMRMATPLLMQALPM
配列番号105 HLA−DRB1*03:01_P01912
GDTRPRFLEYSTSECHFFNGTERVRYLDRYFHNQEENVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLEQKRGRVDNYCRHNYGVVESFTVQRRVHPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIHNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
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配列番号106 HLA−DRB1*04:02_HLA00687 ECD
GDTRPRFLEQVKHECHFFNGTERVRFLDRYFYHQEEYVRFDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEDERAAVDTYCRHNYGVVESFTVQRRVYPEVTVYPAKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSLTSPLTVEWRARSESAQSK
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配列番号107 HLA−DRB1*10:01_Q30167_ECD 30−227
GDTRPRFLEEVKFECHFFNGTERVRLLERRVHNQEEYARYDSDVGEYRAVTELGRPDAEYWNSQKDLLERRRAAVDTYCRHNYGVGESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVNGFYPGSIEVRWFRNGQEEKTGVVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPQSGEVYTCQVEHPSVMSPLTVEWRARSESAQSK
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配列番号108 HLA−DRB1*15:01_P01911_ECD 30−277
GDTRPRFLWQPKRECHFFNGTERVRFLDRYFYNQEESVRFDSDVGEFRAVTELGRPDAEYWNSQKDILEQARAAVDTYCRHNYGVVESFTVQRRVQPKVTVYPSKTQPLQHHNLLVCSVSGFYPGSIEVRWFLNGQEEKAGMVSTGLIQNGDWTFQTLVMLETVPRSGEVYTCQVEHPSVTSPLTVEWRARSESAQSK
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実施例9.DR4B117 Fabと複合体を形成しているHLA−DR4 ECDの結晶構造
構造研究のために用いたHLA−DR4コンストラクトは、DR4G86であった。一過的にトランスフェクトされたHEK 293S−GnTi細胞でタンパク質を発現させた。清澄化し、濃縮した上清を、2本のタンデムな5mL HiTrap(商標)Mabselect Sureカラム(GE Healthcareカタログ番号11−0034−95)にロードし、0.1M酢酸ナトリウム、pH3.5で溶出し、DPBS、pH7.2で透析した。mAb DR4B117のFab断片を、200mLのExpi293F(商標)細胞において一過的に発現させた。清澄化した上清を、5mL HisTrap(商標)HPカラム(GE Healthcareカタログ番号17−5248−02)にロードし、漸増するイミダゾール濃度の段階勾配を用いて溶出した。タンパク質を、HiLoad Superdex(商標)200カラム(GE Healthcareカタログ番号28−9893−36)を用い20mM Tris、50mM NaCl、pH7.4で実行したサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって更に精製した。
構造研究のために用いたHLA−DR4コンストラクトは、DR4G86であった。一過的にトランスフェクトされたHEK 293S−GnTi細胞でタンパク質を発現させた。清澄化し、濃縮した上清を、2本のタンデムな5mL HiTrap(商標)Mabselect Sureカラム(GE Healthcareカタログ番号11−0034−95)にロードし、0.1M酢酸ナトリウム、pH3.5で溶出し、DPBS、pH7.2で透析した。mAb DR4B117のFab断片を、200mLのExpi293F(商標)細胞において一過的に発現させた。清澄化した上清を、5mL HisTrap(商標)HPカラム(GE Healthcareカタログ番号17−5248−02)にロードし、漸増するイミダゾール濃度の段階勾配を用いて溶出した。タンパク質を、HiLoad Superdex(商標)200カラム(GE Healthcareカタログ番号28−9893−36)を用い20mM Tris、50mM NaCl、pH7.4で実行したサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって更に精製した。
抗体−抗原複合体を作製するために、24mgのDPBS中DR4G86、pH7.2と、11mgの20mM Tris及び50mM NaCl中DR4B117、pH7.4と、を1:1のモル比で静かに混合し、室温で1日間インキュベートした。次いで、混合物を、全タンパク質3μg当たり酵素1単位を用い、TEV緩衝液(ThermoFisherカタログ番号12575−023)中TEVプロテアーゼによって処理し、30℃で一晩インキュベートした。Fcから複合体を分離するために、DPBS、pH7.2中で予め平衡化しておいた1mL Protein Aカラム(GE Healthcareカタログ番号11−0034−93)に切断した材料をロードした。主にDR4:Fab複合体を含有するフロースルーを1mLの画分に回収し、プールし、20mM Tris、50mM NaCl、pH7.4中SECカラム(Superdex(商標)200、GE Healthcare、カタログ番号17−1071−01)にロードして、残留Fab及びTEVプロテアーゼなどの他の夾雑物を除去した。DR4B117:Fab複合体を含有するSECプールを1mg/mLに濃縮した。サンプルをSDS PAGE、A280、SE HPLC、及びSEC MALSによって分析した。SEC MALS分析は、複合体の分子量が配列から計算されたものと一致していることを示した。
結晶化のために、DR4:Fab複合体を、Amicon Ultra 10kDa MWCOデバイスを使用して、20mM Tris pH7.4、50mM NaCl中14mg/mLまで濃縮した。Mosquito robot(TTP Labtech)及びMRC 2ウェル結晶化プレート(Swissci)を用いて、20℃のシッティングドロップフォーマットにおいて気相拡散法によって、複合体の結晶化を実施した。PEGスクリーン(Qiagen、カタログ番号130904)、Crystal Screen HT(Hampton Research、カタログ番号HR2−130)、及びインハウススクリーン(Obmolova et al.(2014)Acta Crystallogr.F70:1107〜1115)を用いて結晶化条件のスクリーニングを行った。18% PEG 3350、1.0M LiCl、0.1M MES緩衝液、pH6.5から、最適化後に、回折品質の結晶が得られた。20%グリセロールを添加した母液に結晶を回収し、液体窒素で急速冷凍させた。Argonne National LaboratoryのAdvanced Photon Source(Beamline 17−ID)においてX線回折データを回収し、XDS(Kabsch,(2010)Acta Crystallogr.D66:125〜132)を用いて処理して分解能を1.75Åにした。X線データの詳細を表31に与える。
プログラムPhaser(Read,(2001)Acta Crystallogr.D57:1373〜1382)を用いて分子置換によってDR4:Fabの構造を決定した。Fabについてはタンパク質データバンク3na9、DR4ついては4mczから得られた結晶構造をサーチモデルとして用いた。構造をPhenix(Adams et al.,(2004)J.Synchrotron Radiat.11:53〜55)を用いて精密化し、COOT(Emsley and Cowtan,(2004)Acta Crystallogr.D60:2126〜2132)を用いてモデルフィッティングを行った。精密化統計値を表31に示す。Pymol(www.schrodinger.com)を用いてすべてのグラフィックを作成した。CCP4 suite(Collaborative Computational Project,Number 4(1994)Acta Crystallogr.D53:240〜255)を用いてすべての他の計算を行った。
複合体の構造を図15Aに示す。構造から、DR4B117の結合エピトープがDR4のα及びβサブユニットの両方に由来する残基で構成されていることが明らかになった。エピトープは、CLIPペプチド及びTCR結合表面に対して遠位であった。したがって、DR4B117は、TCRがDR4に結合するのを直接はブロックしなかった。抗体−抗原界面は、溶媒のアクセス可能な表面のうちの2500Å2を被覆し、そのうち1300Å2は抗体上であり、1200Å2はDR4上であった(700Å2はα上、500Å2はβ上)。DR4B117の6つのCDRすべてが抗原に対する接触を提供した。4−Åカットオフを用いて同定されたエピトープ及びパラトープ残基を表32に与える。接触の数に基づき、エピトープにおける最も重要な残基は、鎖α中E3、F108、D110、R140(配列番号13に従って残基を付番)、並びに鎖β中V143及びQ149(配列番号14に従って残基を付番)であった。
実施例10.DR4B127 Fabとの複合体におけるHLA−DR4 ECDの結晶構造
タンパク質発現、複合体の調製、結晶化、X線のデータ収集、及び構造決定を、以下を除いて実施例9に記載のとおり実施した。27mgのDPBS中DR4W176、pH7.2と、13mgの20mM Tris及び50mM NaCl中Fab DR4B127、pH7.4と、を1:1のモル比で混合することによって、複合体を形成した。18% PEG 3350、0.1M酢酸ナトリウム、pH4.5、0.2Mギ酸ナトリウムから複合体の結晶を得た。2.75Åの解像度で構造を決定した。X線データ及び精密化統計値を表33に与える。
タンパク質発現、複合体の調製、結晶化、X線のデータ収集、及び構造決定を、以下を除いて実施例9に記載のとおり実施した。27mgのDPBS中DR4W176、pH7.2と、13mgの20mM Tris及び50mM NaCl中Fab DR4B127、pH7.4と、を1:1のモル比で混合することによって、複合体を形成した。18% PEG 3350、0.1M酢酸ナトリウム、pH4.5、0.2Mギ酸ナトリウムから複合体の結晶を得た。2.75Åの解像度で構造を決定した。X線データ及び精密化統計値を表33に与える。
複合体の構造を図15Bに示す。構造から、DR4B127の結合エピトープがDR4のαサブユニット及びβサブユニットの両方に由来する残基で構成されていることが明らかになった。エピトープは、CLIPペプチド及びTCR結合表面に対して遠位であった。したがって、DR4B127は、TCRがDR4に結合するのを直接はブロックしなかった。抗体−抗原界面は、溶媒のアクセス可能な表面のうちの3200Å2を被覆し、そのうち1500Å2は抗体上であり、1700Å2はDR4上であった。6つのCDRのうちの4つ(CDR−H1、CDR−H3、CDR−L1、及びCDR−L2)だけが、抗原に対する接触を提供した。4−Åカットオフを用いて同定されたエピトープ及びパラトープ残基を表34に与える。接触の数に基づき、エピトープにおける最も重要な残基は、鎖α中K2(配列番号13に従って残基を付番)、並びに鎖β中D41、S126、R130、V142、及びQ149(配列番号14に従って残基を付番)であった。
TCR(PDB entry 1j8h;Hennecke and Wiley,(2002)J.Exp.Med.195:571〜581)(図15C)、Fab DR4B117(図15A)、及びFab DR4B127(図15B)と複合体を形成しているDR4の結晶構造の比較は、両抗体がTCRエピトープから遠位の部位においてDR4に結合するので、TCR結合に直接は干渉しなかったことを示した。DR4B117及びDR4B127は、細胞表面に近接するDR4に結合し、恐らく、DR4のECDをmAbから離れる方向に傾斜させて、DR4分子と膜との間の嵩高いFc部分に空間を与え、その結果、TCRはDR4に結合できなくなった。両抗体DR4B117及びDR4B127のFab断片は、TCR結合を阻害しなかった。DR4B117及びDR4B127は、CR4のHLA−DRへの結合をブロックする。
実施例11.エピトープのビニング
MDS又はIBISを用いて、抗原としてのDRG89(II型コラーゲン_1236ペプチドとの複合体におけるHLA−DR1*04:01)又はDR4G99(赤血球凝集素ペプチドとの複合体におけるHLA−DR1:01)を利用して31個のHLA−DR抗体の初期マトリクス交差競合実験において3つの競合群を同定した。DR4B4及びDR4B5はあまりDR4G89に結合しなかったので、アッセイで用いることができなかった。
MDS又はIBISを用いて、抗原としてのDRG89(II型コラーゲン_1236ペプチドとの複合体におけるHLA−DR1*04:01)又はDR4G99(赤血球凝集素ペプチドとの複合体におけるHLA−DR1:01)を利用して31個のHLA−DR抗体の初期マトリクス交差競合実験において3つの競合群を同定した。DR4B4及びDR4B5はあまりDR4G89に結合しなかったので、アッセイで用いることができなかった。
DRG89に対する交差競合について以下の競合群を同定した:
グループ1:DR4B30、DR4B98、DR4B117、DR4B127、DR4B78、DR4B38、DR4B70、DR4B22、及びDR4B33。グループ2:DR4B6。
グループ1:DR4B30、DR4B98、DR4B117、DR4B127、DR4B78、DR4B38、DR4B70、DR4B22、及びDR4B33。グループ2:DR4B6。
DRG99に対する交差競合について以下の競合群を同定した:
グループ1:DR4B30、DR4B117、DR4B127、DR4B78、DR4B38、DR4B70、DR4B22、及びDR4B33。グループ2:DR4B6。グループ3:DR4B98。DR4B98は、DR4G99に対する結合が最低であったことから、グループ1にはマッピングしなかった。
グループ1:DR4B30、DR4B117、DR4B127、DR4B78、DR4B38、DR4B70、DR4B22、及びDR4B33。グループ2:DR4B6。グループ3:DR4B98。DR4B98は、DR4G99に対する結合が最低であったことから、グループ1にはマッピングしなかった。
サンプル及び試薬:
抗原:
DR4G89 1.264mg/mL
DR4G99 0.99mg/mL
IBISシステム用のランニング緩衝液:PBST、脱気。
抗原:
DR4G89 1.264mg/mL
DR4G99 0.99mg/mL
IBISシステム用のランニング緩衝液:PBST、脱気。
MSD ELISAによる交差競合:
Meso Scale Discovery(MSD)HighBindプレート(Gaithersburg,MD)に、10μg/mLのDR4G89又はDR4G99 5μLを、2時間吸収させ、次いで、0.1M HEPES 150μLで3回洗浄した。プレートを4℃で一晩5%BSA緩衝液でブロッキングした。翌日、プレートを0.1M HEPES緩衝液、pH7.4で3回洗浄し、続いて、1mMの他の抗DR4 mAbと共に30分間室温で予めインキュベートしておいた、ルテニウム(Ru)で標識された抗DR4 mAbの混合物を添加した。穏やかに振盪しながら室温で2時間インキュベートした後、プレートを0.1M HEPES緩衝液(pH7.4)で3回洗浄した。MSD Read Buffer Tを蒸留水で希釈し(4倍)、各ウェルに分注し、次いで、SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)で分析した。
Meso Scale Discovery(MSD)HighBindプレート(Gaithersburg,MD)に、10μg/mLのDR4G89又はDR4G99 5μLを、2時間吸収させ、次いで、0.1M HEPES 150μLで3回洗浄した。プレートを4℃で一晩5%BSA緩衝液でブロッキングした。翌日、プレートを0.1M HEPES緩衝液、pH7.4で3回洗浄し、続いて、1mMの他の抗DR4 mAbと共に30分間室温で予めインキュベートしておいた、ルテニウム(Ru)で標識された抗DR4 mAbの混合物を添加した。穏やかに振盪しながら室温で2時間インキュベートした後、プレートを0.1M HEPES緩衝液(pH7.4)で3回洗浄した。MSD Read Buffer Tを蒸留水で希釈し(4倍)、各ウェルに分注し、次いで、SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)で分析した。
IBISによるエピトープビニング(Instrument for Biomolecular Interaction Sensing MultipleX 96,IBIS−MX96,Wasatch Microfluidics Inc.):
プロトコールは、文献(Abdiche,Y.N.et al.(2014),PLoS One 9,fe92451)に従ったが、下記のとおりいくつかの改変を行った:
プロトコールは、文献(Abdiche,Y.N.et al.(2014),PLoS One 9,fe92451)に従ったが、下記のとおりいくつかの改変を行った:
チップの調製
CFM2(Wasatch Microfluidics)を用いて96個のmAbのマイクロアレイを作製した。96ウェルマイクロプレートから48個の70μLプラグのサンプルを流体マニホールドに引き出し、これによって、SPR基材(G−COOHでコーティングされたプリズム、Ssens bv,NL製)の表面上の48個のマイクロフローセルの4×12アレイに溶液を集中させ、該溶液を60μL/分で前後に循環させる。MESカップリング緩衝液pH4.5中30μg/mLの各mAb100μLを用いて96ウェルマイクロプレートを調製し、CFMのベイ2にロードした。新たに混合した活性化試薬(合計5mLのMESカップリング緩衝液pH4.5中0.4M ECD 150μL及び0.1Mスルホ−NHS 150μL)の第2のプレートをベイ1にロードした。次いで、CFMをシステム緩衝液(PBS+0.01% T20)でプライミングした。抗DR4 mAbのプレートのセットは、トリプリケートで配列された42個のmAbを含有していた。ドッキングさせた時点で、活性化試薬を7分間表面全体に循環させ、直後に、このセットのmAbを15分間循環させた。
CFM2(Wasatch Microfluidics)を用いて96個のmAbのマイクロアレイを作製した。96ウェルマイクロプレートから48個の70μLプラグのサンプルを流体マニホールドに引き出し、これによって、SPR基材(G−COOHでコーティングされたプリズム、Ssens bv,NL製)の表面上の48個のマイクロフローセルの4×12アレイに溶液を集中させ、該溶液を60μL/分で前後に循環させる。MESカップリング緩衝液pH4.5中30μg/mLの各mAb100μLを用いて96ウェルマイクロプレートを調製し、CFMのベイ2にロードした。新たに混合した活性化試薬(合計5mLのMESカップリング緩衝液pH4.5中0.4M ECD 150μL及び0.1Mスルホ−NHS 150μL)の第2のプレートをベイ1にロードした。次いで、CFMをシステム緩衝液(PBS+0.01% T20)でプライミングした。抗DR4 mAbのプレートのセットは、トリプリケートで配列された42個のmAbを含有していた。ドッキングさせた時点で、活性化試薬を7分間表面全体に循環させ、直後に、このセットのmAbを15分間循環させた。
次いで、プリントされたチップを、シングルフローセルと、分析物当たり80mLの注入物を前後に循環させるアレイに対処するようになっているオートサンプラーとを使用する、IBIS SPRリーダー(MX96,IBIS Technologies bv)にロードした。ロードしたら、1Mエタノールアミンをチップを通して15分間かけて注入し、過剰の反応性エステルをクエンチした。次いで、システム緩衝液でチップを洗浄し、チップ画像を用いて反応スポット(すなわち、96リガンドアレイ)及び介在する参照スポット(反応スポット当たり2つのローカル参照スポット)を規定した。古典的ビニングでは、両抗原(DR4G89又はDR4G99のいずれか)及びmAb分析物を平行にフローセルに輸送し、再生を継続する前に互いの直後に注入する共注入を使用した。実験では、抗原を3分間注入し、続いて、更に3分間20μg/mL mAbを注入し、次いで、表面を再生した。すべてのSPRi実験を、96×96アナライト・オン・リガンドフォーマットで実施した。
マイクロアレイデータ解析
データをSPRintソフトウェアv.6.15.2.1で処理し(対象の結合工程前に較正、局所的に参照、及びY軸はゼロに合わせる)、ヒートマップを作成し、ソートし、ノードプロッティングするためにWasatch Microfluidicsビニングソフトウェアで解析した。階層クラスタリングを使用して、ヒートマップにおいて群様の挙動を示すmAbを一緒にした。ヒートマップ及びノードプロットは、エピトープビン及びビン間の関係を可視化する代替方法である。
データをSPRintソフトウェアv.6.15.2.1で処理し(対象の結合工程前に較正、局所的に参照、及びY軸はゼロに合わせる)、ヒートマップを作成し、ソートし、ノードプロッティングするためにWasatch Microfluidicsビニングソフトウェアで解析した。階層クラスタリングを使用して、ヒートマップにおいて群様の挙動を示すmAbを一緒にした。ヒートマップ及びノードプロットは、エピトープビン及びビン間の関係を可視化する代替方法である。
実施例12.HLA−DR抗体は、HLA−DRの同種TCR ECDとの相互作用をブロックしない。
結晶構造試験によって、DR4B117及びDR1B127はHLA−DRの同種TCRとの相互作用をブロックしなかったことが確認された。MDSを用いて、いくつかの更なる抗体を、組み換えTCRをブロックする効果について試験した。
結晶構造試験によって、DR4B117及びDR1B127はHLA−DRの同種TCRとの相互作用をブロックしなかったことが確認された。MDSを用いて、いくつかの更なる抗体を、組み換えTCRをブロックする効果について試験した。
抗体DR4B117、DR4B127、DR4B30、DR4B70、DR4B22、DR4B33、DR4B38、及びDR4B78は、HLA−DRの同種TCRとの相互作用を阻害しなかったが、DR4B98は、該相互作用を部分的に阻害した。DR4B4、DR4B5、及びDR4B6は、HLA−DR/TCR相互作用を阻害した。
図16Aは、DR4B117、DR4B127、DR4B4、DR4B5、及びDR4B6についてHLA−DR/TCR相互作用の阻害の用量応答曲線を示す。
図16Bは、DR4B22、DR4B30、及びDR4B33についてHLA−DR/TCR相互作用の阻害の用量応答曲線を示す。
材料
・MSDプレート(Meso Scale Discovery #L15XA−3)
・ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Gibco、#14190−136)
・ウシアルブミン画分V(Millipore、カタログ番号820451)
・Tween 20(Sigma、カタログ番号P1379)
・HisTag Ab−ビオチン(Genscript,#A00613)
・Sulfo−Tagストレプトアビジン(Meso Scale Discovery、#R32AD−50)
・MSD Read Buffer T(MSD、カタログ番号R92TC−1)
・HLA−DR抗原:DR4G134(ヘキサヒスチジンタグを有しないDRG89);以下のフォーマットの、赤血球凝集素ペプチドHA_304−318(HA)を有するヒトHLA−DRA1*01:02/DRB1*04:01 ECDアルファ鎖:ECD_G4S+TEV+G4S+MMB+6xHisTag;ベータ鎖:HA+3XGS+HRV3C+ECD+G4S+TEV+G4S+MMB+StrepII
・DR4G79:TCR受容体ECD;以下のフォーマットの、ヒトHA 1.7 TCR ECD:アルファ鎖ECD+TEV+MMB+HisTag;ベータ鎖ECD+TEV+huIgG4MMB+Flag+StrepII(DR4G79 HC:配列番号69;LC配列番号70
・MSDプレート(Meso Scale Discovery #L15XA−3)
・ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Gibco、#14190−136)
・ウシアルブミン画分V(Millipore、カタログ番号820451)
・Tween 20(Sigma、カタログ番号P1379)
・HisTag Ab−ビオチン(Genscript,#A00613)
・Sulfo−Tagストレプトアビジン(Meso Scale Discovery、#R32AD−50)
・MSD Read Buffer T(MSD、カタログ番号R92TC−1)
・HLA−DR抗原:DR4G134(ヘキサヒスチジンタグを有しないDRG89);以下のフォーマットの、赤血球凝集素ペプチドHA_304−318(HA)を有するヒトHLA−DRA1*01:02/DRB1*04:01 ECDアルファ鎖:ECD_G4S+TEV+G4S+MMB+6xHisTag;ベータ鎖:HA+3XGS+HRV3C+ECD+G4S+TEV+G4S+MMB+StrepII
・DR4G79:TCR受容体ECD;以下のフォーマットの、ヒトHA 1.7 TCR ECD:アルファ鎖ECD+TEV+MMB+HisTag;ベータ鎖ECD+TEV+huIgG4MMB+Flag+StrepII(DR4G79 HC:配列番号69;LC配列番号70
>DR4G79 HC配列番号69
QSVTQLGSHVSVSEGALVLLRCNYSSSVPPYLFWYVQYPNQGLQLLLKYTSAATLVKGINGFEAEFKKSETSFHLTKPSAHMSDAAEYFCAVSESPFGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKGGGGSEDLYFQSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSHHHHHH
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>DR4G79 LC配列番号70
GSVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSSTGLPYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYSLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTGGGGSEDLYFQSGGGGSCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGGGSDYKDDDDKWSHPQFEK
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プロトコール
アッセイ緩衝液:1XDPBS+1% BSA+0.05% tween 20
1.MSDプレートを50μLのDR4G134抗原(5μg/mL)でコーティングし、RTで10分間振盪する。4℃で一晩インキュベートする。
2.プレートを空にし、穏やかに振盪しながら150μLのアッセイ緩衝液で1時間ブロッキングし、その間に、DRG79、DR4 mAb、抗His Ab、Sulfo Tag−SA(最終濃度はそれぞれ5μg/mL、10μg/mL、及び2μg/mL)をプレミックスする。
3.プレートを空にし、プレミックスを添加し、1時間インキュベートする。
4.300μLのPBSTで3回洗浄する。
5.MSDプレート用MSDリード緩衝液150μLを添加する。
6.MSDで読み取る。
アッセイ緩衝液:1XDPBS+1% BSA+0.05% tween 20
1.MSDプレートを50μLのDR4G134抗原(5μg/mL)でコーティングし、RTで10分間振盪する。4℃で一晩インキュベートする。
2.プレートを空にし、穏やかに振盪しながら150μLのアッセイ緩衝液で1時間ブロッキングし、その間に、DRG79、DR4 mAb、抗His Ab、Sulfo Tag−SA(最終濃度はそれぞれ5μg/mL、10μg/mL、及び2μg/mL)をプレミックスする。
3.プレートを空にし、プレミックスを添加し、1時間インキュベートする。
4.300μLのPBSTで3回洗浄する。
5.MSDプレート用MSDリード緩衝液150μLを添加する。
6.MSDで読み取る。
実施例13.DR4B70、DR4B22、DR4B33、DR4B38、及びDR4B78の機能的特徴
DR4B70、DR4B22、DR4B33、DR4B38、及びDR4B78を、上記アッセイを用いて特性評価した。すべての抗体は、HLA−DR4又はHLA−DR1に結合し、DQ又はDPに結合した抗体は存在しなかった。表35は、様々なHLAに対する抗体の結合結果を示す。
DR4B70、DR4B22、DR4B33、DR4B38、及びDR4B78を、上記アッセイを用いて特性評価した。すべての抗体は、HLA−DR4又はHLA−DR1に結合し、DQ又はDPに結合した抗体は存在しなかった。表35は、様々なHLAに対する抗体の結合結果を示す。
表36は、機能アッセイにおける抗体の特徴を示す。すべての抗体は、アンタゴニストDR4B78、DR4B38、DR4B70、及びDR4B22であり、B細胞のアポトーシス及び/又は死を誘導した。DR4B30は誘導しなかった。
Claims (57)
- HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片であって、HLA−DRに対する結合に関して、
i)配列番号58の重鎖可変ドメイン(VH)及び配列番号61の軽鎖可変ドメイン(VL)、
j)配列番号56のVH及び配列番号60のVL、
k)配列番号57のVH及び配列番号61のVL、
l)配列番号137のVH及び配列番号61のVL、
m)配列番号138のVH及び配列番号61のVL、
n)配列番号139のVH及び配列番号61のVL、
o)配列番号140のVH及び配列番号142のVL、又は
p)配列番号141のVH及び配列番号61のVL
を含む抗体と競合する、前記抗体又はその抗原結合断片。 - HLA−DRのアンタゴニストである、請求項1に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断が、ヒトCD4+T細胞及びヒトHLA−DR4を発現しているトランスジェニック動物から単離された樹状細胞の共培養下において、1μg/mLの抗体濃度でCD4+T細胞の増殖を少なくとも30%阻害する、請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が、HLA−DRの同種T細胞受容体との相互作用をブロックしない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記HLA−DRが、配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している配列番号13のHLA−DRα鎖及び配列番号14のHLA−DR β鎖を含むHLA−DR4である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が、
a)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号14のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR4に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)ポリソルベート20(PS−20)及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
b)配列番号7の赤血球凝集素ペプチドと複合体を形成している、配列番号13のHLA−DRα鎖と配列番号15のHLA−DRβ鎖とを含むHLA−DR1に、平衡解離定数(KD)5×10−8M以下で結合し、ここでKDは、DPBS、0.01%(w/v)PS−20及び100μg/mL BSAを含有する緩衝液中、25℃で、ProteOn XPR36システムを用いて測定される、
c)B細胞のアポトーシスを誘導する能力を有さず、ここでアポトーシスは、フローサイトメトリーを用いてヒト末梢血細胞(PBMC)のサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead−B細胞の頻度を測定することによって求められる、
d)B細胞の死を誘導する能力を有さず、ここでB細胞の死は、フローサイトメトリーを用いて前記ヒトPBMCのサンプル中のCD3−CD20+アネキシンV+live/dead+B細胞の頻度を測定することによって求められる、又は
e)HLA−DRのCD4に対する結合を阻害する
との特性のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つを有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - HLA−DRが、HLA−DR4、HLA−DR1、HLA−DR3、HLA−DR10、又はHLA−DR15である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- HLA−DRα鎖及びHLA−DRβが、
a)それぞれ配列番号13及び14、
b)それぞれ配列番号13及び15、
c)それぞれ配列番号13及び106、
d)それぞれ配列番号13及び105、
e)それぞれ配列番号13及び107、又は
f)それぞれ配列番号13及び108
のアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、約5×10−8M未満の平衡解離定数(KD)でHLA−DR4に結合する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- HLA−DRが、アミノ酸配列QKRAA(配列番号66)、QRRAA(配列番号67)、又はRRRAA(配列番号68)からなる共有エピトープを含有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- HLA−DRが、ペプチドとの複合体中として存在する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記ペプチドが、配列番号7、8、9、71、72、104、又は122のアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記ペプチドが、配列番号7、8、9、71、72、104、又は122のアミノ酸配列からなる、請求項12に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体が、アミノ酸残基E3、F108、D110、及びR140において配列番号13のHLA−DRA1*01:02に、アミノ酸残基V143及びQ149において配列番号14のHLA−DRB1*04:01に結合する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体が、アミノ酸残基K2、E3、V6、E88、V89、T90、F108、D110、K111、R140、L144、R146、及びK176において配列番号13のHLA−DRA1*01:02に、アミノ酸残基L114、K139、V142、V143、S144、T145、L147、I148、Q149、及びE162において配列番号14のHLA−DRB1*04:01に結合する、請求項14に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体が、アミノ酸残基K2において配列番号13のHLA−DRA1*01:02に、アミノ酸残基D41、S126、R130、V142、及びQ149において配列番号14のHLA−DRB1*04:01に結合する、請求項1〜13のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体が、アミノ酸残基I1、K2、E3、D27、R140、E141、D142、及びH143において配列番号13のHLA−DRA1*01:02に、アミノ酸残基H16、F17、R23、R25、R29、R39、D41、D43、V44、V50、G125、S126、E128、V129、R130、V142、G146、L147、Q149、及びV159において配列番号14のHLA−DRB1*04:01に結合する、請求項16に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- a)それぞれ配列番号73、74、及び75の重鎖相補性決定領域1、2、及び3(HCDR1、HCDR2、及びHCDR3)配列、並びにそれぞれ配列番号76、77、及び78の軽鎖相補性決定領域1、2、及び3(LCDR1、LCDR2、及びLCDR3)、
b)それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
c)それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
d)それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
e)それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
f)それぞれ配列番号123、126、129、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
g)それぞれ配列番号123、126、130、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
h)それぞれ配列番号123、126、131、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
i)それぞれ配列番号124、127、132、134、135、及び136のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、又は
j)それぞれ配列番号125、128、133、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3
を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体が、IGHV1−69(配列番号62)、IGHV5−51(配列番号63)、又はIGHV3_3−23(配列番号161)に由来する重鎖フレームワークを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体が、IGKV3−20(配列番号64)、IGKV3−11(配列番号65)、又はIGKV1−39(配列番号162)に由来する軽鎖フレームワークを含む、請求項19に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記重鎖フレームワーク及び前記軽鎖フレームワークが、
a)それぞれIGHV1−69(配列番号62)及びIGKV3−20(配列番号64)、
b)それぞれIGHV5−51(配列番号63)及びIGKV3−11(配列番号65)、
c)それぞれIGHV1−69(配列番号62)及びIGKV3−11(配列番号65)、
d)それぞれIGHV3_3−23(配列番号161)及びIGKV3−11(配列番号65)、又は
e)それぞれIGHV5−51(配列番号63)及びIGKV1−39(配列番号162)
に由来する、請求項20に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号56、57、58、59、137、138、139、140、又は141のアミノ酸配列と少なくとも84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるVHを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号60、61、又は142のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるVLを含む、請求項22に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号56、57、58、59、137、138、139、140又は141のVH及び配列番号60又は61又は142のVLを含み、前記VH及び前記VLが、任意追加的に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又は18個のアミノ酸置換を有する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- a)それぞれ配列番号56及び60、
b)それぞれ配列番号57及び61、
c)それぞれ配列番号58及び61、
d)それぞれ配列番号59及び61、
e)それぞれ配列番号137及び61、
f)それぞれ配列番号138及び61、
g)それぞれ配列番号139及び61、
h)それぞれ配列番号140及び142、又は
i)それぞれ配列番号141及び61
のVH及びVLを含む、請求項24に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記VH及び前記VLが、
a)それぞれ配列番号79及び80、
b)それぞれ配列番号81及び82、
c)それぞれ配列番号83及び82、
d)それぞれ配列番号121及び82、
e)それぞれ配列番号143及び82、
f)それぞれ配列番号144及び82、
g)それぞれ配列番号145及び82、
h)それぞれ配列番号146及び148、又は
i)それぞれ配列番号147及び82
を含むポリヌクレオチドによってコードされている、請求項25に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体が、
a)IgG1アイソタイプである、
b)IgG2アイソタイプである、
c)IgG3アイソタイプである、
d)IgG4アイソタイプである、
e)前記抗体のFcγR又はFcRnへの結合を調節する、Fc領域における少なくとも1つの置換を含む、
f)野生型IgG2と比較したとき、V234A、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、及びP331S置換を含むIgG2アイソタイプである、
g)野生型IgG1と比較したとき、L234A、L235A、G237A、P238S、H268A、A330S、及びP331S置換を含むIgG1アイソタイプである、
h)野生型IgG1と比較したとき、L234A及びL235A置換を含むIgG1アイソタイプである、又は
i)野生型IgG4と比較したとき、S228P、F234A、及びL235A置換を含むIgG4アイソタイプである、
請求項1〜26のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。 - a)それぞれ配列番号84及び88、
b)それぞれ配列番号85及び89、
c)それぞれ配列番号86及び89、
d)それぞれ配列番号87及び89、
e)それぞれ配列番号96及び88、
f)それぞれ配列番号97及び89、
g)それぞれ配列番号98及び89、
h)それぞれ配列番号99及び89、
i)それぞれ配列番号149及び89、
j)それぞれ配列番号150及び89、
k)それぞれ配列番号151及び89、
l)それぞれ配列番号152及び154、又は
m)それぞれ配列番号153及び89
の重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を含む、請求項27に記載の抗体。 - 前記HC及び前記LCが、
a)それぞれ配列番号90及び94、
b)それぞれ配列番号91及び95、
c)それぞれ配列番号92及び95、
d)それぞれ配列番号93及び95、
e)それぞれ配列番号100及び94、
f)それぞれ配列番号101及び95、
g)それぞれ配列番号102及び95、
h)それぞれ配列番号103及び95、
i)それぞれ配列番号155及び95、
j)それぞれ配列番号156及び95、
k)それぞれ配列番号157及び95、
l)それぞれ配列番号158及び160、又は
m)それぞれ配列番号159及び95
のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項28に記載の抗体。 - a)それぞれ配列番号39、42、46、50、52、及び54のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
b)配列番号56のVH及び配列番号60のVL、並びに/又は
c)配列番号84若しくは96のHC及び配列番号88のLC
を含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。 - a)それぞれ配列番号40、43、47、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
b)配列番号57のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
c)配列番号85若しくは97のHC及び配列番号89のLC
を含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。 - a)それぞれ配列番号41、44、48、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
b)配列番号58のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
c)配列番号86若しくは98のHC及び配列番号89のLC
を含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。 - a)それぞれ配列番号41、45、49、51、53、及び55のHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3、
b)配列番号59のVH及び配列番号61のVL、並びに/又は
c)配列番号87若しくは99のHC及び配列番号89のLC
を含む、HLA−DRに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片。 - 前記抗体が、異種分子にコンジュゲートしている、請求項1〜33のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記異種分子が、検出可能な標識又は細胞毒性剤である、請求項34に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 前記抗体が、多重特異的又は二重特異的抗体である、請求項1〜35のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- a)配列番号56、57、58、59、60、61、84、85、86、87、96、97、98、99、137、138、139、140、141、142、149、150、151、152、153、若しくは154のVH、VL、VH及びVL、HC、LC、若しくはHC及びLCをコードしている、又は
b)配列番号79、80、81、82、83、90、91、92、93、94、95、100、101、102、103、121、143、144、145、146、147、148、155、156、157、158、159、若しくは160のポリヌクレオチド配列を含む、
ポリヌクレオチド。 - 請求項38に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項39に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項25に記載の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、前記抗体が発現する条件で請求項40に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収することとを含む、前記方法。
- HLA−DR介在性疾患を治療又は予防する方法であって、前記HLA−DR介在性疾患を治療するのに十分な時間、治療的に有効な量の請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項37に記載の医薬組成物を、前記治療を必要としている対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記HLA−DR介在性疾患が、自己免疫疾患である、請求項42に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、HLA−DRB1関連自己免疫疾患、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は1型糖尿病である、請求項43に記載の方法。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が、第2の治療薬と組み合わせて投与される、請求項42〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の治療薬が、コルチコステロイド又は免疫抑制剤である、請求項45に記載の方法。
- 自己抗原に対する免疫応答を抑制する方法であって、前記自己抗原に対する免疫応答を抑制するのに十分な時間、請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項37に記載の医薬組成物を、前記抑制を必要としている対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記自己抗原が、自己免疫疾患の患者に存在する、請求項47に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身型若年性特発性関節炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、又は1型糖尿病である、請求項48に記載の方法。
- HLA−DR発現腫瘍を治療する方法であって、HLA−DR発現腫瘍を治療するのに十分な時間、細胞毒性剤にコンジュゲートしている請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項37に記載の医薬組成物を治療的に有効な量、前記治療を必要としている対象に投与することを含む、前記方法。
- HLA−DR発現腫瘍が、血液悪性腫瘍である、請求項50に記載の方法。
- 前記血液悪性腫瘍が、B細胞非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、B細胞急性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄性白血病、T細胞リンパ腫、T細胞非ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄性白血病、又は急性単芽球性白血病(AMoL)である、請求項51の方法。
- 前記HLA−DR発現腫瘍が、神経膠腫、卵巣癌、結腸直腸癌、骨肉腫、子宮頸癌、胃癌、又は結腸、喉頭、骨格筋、乳房、若しくは肺における腫瘍である、請求項52に記載の方法。
- 請求項25に記載の抗体又はその抗原結合断片に結合する抗イディオタイプ抗体。
- 請求項25に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むキット。
- 治療において使用するための、請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗体又は請求項37に記載の医薬組成物。
- HLA−DR介在性疾患、自己免疫疾患、又は癌の治療において使用するための、請求項1〜36のいずれか一項に記載の抗体又は請求項37に記載の医薬組成物。
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