CN106163568A - 含纺锤体驱动蛋白（ksp）的抗体药物偶联物（adc） - Google Patents

含纺锤体驱动蛋白（ksp）的抗体药物偶联物（adc） Download PDF

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Abstract

本申请涉及新型抗体药物偶联物（ADC）、这些ADC的活性代谢物、制备这些ADC的方法、这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途和这些ADC用于制备治疗和/或预防疾病，特别是过度增生和/或血管生成疾病，例如癌症的药剂的用途。此类治疗可作为单一疗法或与其它药剂或其它治疗措施联合进行。

Description

含纺锤体驱动蛋白（KSP）的抗体药物偶联物（ADC）
引言和现有技术状况
本发明涉及纺锤体驱动蛋白抑制剂的结合体活性物质偶联物（ADC）、这些ADC的活性代谢物、制备这些ADC的方法、这些ADC用于治疗和/或预防疾病的用途和这些ADC用于制备治疗和/或预防疾病，特别是过度增生和/或血管生成疾病，例如癌症的药剂的用途。此类治疗可作为单一疗法或与其它药剂或其它治疗措施联合进行。
癌症是多种多样的组织的不受控细胞生长的后果。在许多情况下，新的细胞渗透到现有组织中（浸润性生长）或它们转移到远端器官中。癌症发生在多种多样的器官中并通常具有组织特异性病程。术语癌症作为通用术语因此描述各种器官、组织和细胞类型的大量确定疾病。
肿瘤在初期可任选通过手术和放射治疗措施除去。转移的肿瘤通常只能用化疗药物姑息治疗。此处的目标是实现改善生活质量和延长寿命的最佳组合。
结合体蛋白质与一个或多个活性物质分子的偶联物是已知的，特别是以所谓的“抗体药物偶联物”（ADC）的形式，其中抗肿瘤相关抗原的内化抗体经连接单元（“连接体”）共价连接到细胞毒性剂上。在将ADC引入肿瘤细胞中和该偶联物随后离解后，在肿瘤细胞内释放细胞毒性剂本身或由其形成的细胞毒性代谢物并可在其内直接和选择性展现其作用。由此，不同于传统化疗，可将对正常组织的损伤保持在明显较窄的界限内 [参见例如J. M.Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005)；A. M. Wu和P. D. Senter, Nat. Biotechnol. 23, 1137-1146 (2005)；P. D. Senter、Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009)；L. Ducry和B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13 (2010)]。因此，WO2012/171020描述了ADC，其中多个毒簇分子经聚合连接体连接到抗体上。作为可能的毒簇，WO2012/171020尤其提到物质SB 743921、SB 715992（Ispinesib）、MK-0371、AZD8477、AZ3146和ARRY-520。
最后提到的物质是所谓的纺锤体驱动蛋白抑制剂。纺锤体驱动蛋白（KSP，也称作Eg5、HsEg5、KNSL1或KIF11）是双极有丝分裂纺锤体发挥作用所必需的驱动蛋白样马达蛋白。KSP的抑制导致有丝分裂阻滞并经较长时间导致细胞凋亡（Tao等人, Cancer Cell2005 Jul 8(1), 39-59）。在最早的细胞穿透KSP抑制剂Monastrol发现后，KSP抑制剂已确立为一类新型化疗药物（Mayer等人, Science 286: 971-974, 1999），且它们是许多专利申请的主题（例如WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；和WO03/049527）。但是，由于KSP仅在有丝分裂期间的短时期内展现其作用，KSP抑制剂在这些初期必须以足够高的浓度存在。
发明概述
在这一背景下，本发明的一个目的是提供在以相对低的浓度给药后可展现细胞凋亡作用并因此有益于癌症治疗的物质。
为实现这一目的，本发明提供结合体或其衍生物与一个或多个活性物质分子的偶联物，其中所述活性物质分子是经连接体L连接到结合体上的纺锤体驱动蛋白抑制剂（KSP抑制剂）。该结合体优选是结合体蛋白质或肽，特别优选人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。
本发明人已经发现如何可将结合体连接到KSP抑制剂上以实现上述目的的许多可能方式。
根据本发明，该纺锤体驱动蛋白抑制剂可具有下示亚结构I(sub)：
其中
#a代表与所述分子剩余部分的键；
R1a代表H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、COOH、SO3H、SH或OH，且其中Z代表-H、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基。
根据本发明，该纺锤体驱动蛋白抑制剂可通过取代R1a、R2a、R4a或R10处的氢原子经连接体连接到结合体上。
连接到这种结合体上的KSP抑制剂（或多种KSP抑制剂，因为通常多于一种KSP抑制剂连接到结合体上）优选是下式(Ia)或(IIa)的化合物：
式(Ia)，及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:
其中
R1a代表H、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、SO3H、NH2、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R3a代表–MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，
优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R8a代表C1-10-烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环；
HZ代表可被选自卤素、可任选被卤素取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环；
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH；
其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂通过取代R1a、R2a、R3a、R4a、R8a或R10处的氢原子或任选经由HZ的取代基之一，特别经由R1a、R2a、R3a、R4a或R10连接到连接体上。
式(IIa)，及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C
（其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N是优选的）；
R1代表H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2代表–L-#1、H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R4代表–L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-#1、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0- 3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-#1、H、NH2、NO2、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团的每个可被–OH、CO2H或NH2或–L-#1取代；
其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10之一或无一代表或（在R8的情况下）含有–L-#1，
L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。
本发明的偶联物可具有化学不稳定连接体、酶不稳定连接体或稳定连接体。特别优选的是稳定连接体和可被组织蛋白酶裂解的连接体。
本发明还提供制备本发明的偶联物的方法以及用于该制备的前体和中间体。
本发明的偶联物的制备通常包含括下列步骤：
(i) 制备任选带有保护基并具有能够偶联到所述结合体上的反应性基团的连接体前体；
(ii) 所述连接体前体偶联到低分子量KSP抑制剂（优选为具有亚结构I(sub)，特别优选为式(Ia)，特别为式(IIa)的KSP抑制剂，其中在这些式中还没有连向连接体的键）的任选带有保护基的衍生物上，以产生任选带有保护基的反应性KSP抑制剂/连接体偶联物；
(iii) 除去所述KSP抑制剂/连接体偶联物中任选存在的保护基，和
(iv) 所述结合体偶联到所述KSP抑制剂/连接体偶联物上，以产生根据本发明的结合体/KSP抑制剂偶联物。
也可以在构造任选受保护的KSP抑制剂/连接体前体偶联物之后进行反应性基团的连接。
根据连接体，琥珀酰亚胺连接的ADC在偶联后可根据图式26转化成具有有利的稳定性状况的开链琥珀酰胺。
如上所示，可通过亚结构I(sub)中的R1a、R2a、R4a或R10、式(Ia)中的R1a、R2a、R3a、R4a、R8a或R10或式(IIa)中的R1、R2、R3、R4、R5、R8或R10处的氢原子被连接体取代使连接体前体偶联到低分子量KSP抑制剂上。在偶联前的合成步骤中，任选存在的官能团也可能以受保护形式存在。在偶联步骤前，通过肽化学的已知方法除去这些保护基。偶联可通过如实施例中的图式7至31中示例性显示的各种途径化学进行。特别地，任选可以改性要偶联到连接体上的低分子量KSP抑制剂，例如通过引入保护基或离去基以促进取代。
本发明特别提供可任选偶联到结合体上的新型低分子量KSP抑制剂。这些KSP抑制剂或它们的结合体偶联物具有下列通式(IIIa)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C（其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N是优选的）；
R1代表H、–L-BINDER、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2代表–L-BINDER、H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R4代表–L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表–L-BINDER、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-BINDER或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-BINDER、H、NH2、NO2、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环（优选氧杂环丁烷），其中这些基团的每个可被–OH、CO2H或NH2或–L-BINDER取代；
其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10的最多一个代表-L-结合体；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。
附图描述
图1: 各种物种的TWEAKR富含半胱氨酸结构域（氨基酸34至68）的比对。（数字显示包括信号序列的全长构建体中的氨基酸位置；SEQ ID NO: 169）。
图2: A – TWEAKR（SEQ ID NO: 169）的结构的示意图。该图显示包括富含半胱氨酸结构域（36-67）的胞外域（氨基酸28-80）（SEQ ID NO: 168）、跨膜域 – TM（81-101）和胞内域（102-129）。TPP-2202 – 完整胞外域（28-80），融合到hIgG1的Fc结构域上。TPP-2203 –具有N-和C-端截断的胞外域（34-68），融合到hIgG1的Fc结构域上。二硫桥Cys36-Cys49、Cys52-Cys67和Cys55-Cys64由黑条标示。在N-末端和C-末端，TPP-2203含有分别比未修饰的富含半胱氨酸结构域多两个氨基酸和多一个氨基酸以确保适当折叠。TPP-1984 – 具有C-端截断的胞外域（28-68），融合到HIS6标签上。所有三个构建体表现出与根据本发明的抗体和PDL-192（TPP-1104）的可比拟的结合。P4A8（TPP-1324）仅结合到全长胞外域（TPP-2202）上。
B – 胞外域的氨基酸序列：已经公开，氨基酸64对TWEAK配体结合是必不可少的；且如此处确定，氨基酸47对根据本发明的抗体的结合是必不可少的。
图3: TWEAKR胞外域与抗体和参考抗体的相互作用。显示具有TWEAKR-Fc融合蛋白涂层（TPP-2202, 1 µg/ml）并具有0.08 µg/ml（空白条）和0.03 µ/ml（实心条）生物素化IgG作为可溶性结合配对物的ELISA的结果。使用链霉亲和素-HRP和Amplex Red底物进行检测。Y是"ELISA信号强度 [Rfu]"；X是"受试抗体构建体"：a是"TPP-2090"；b是"TPP-2084"；c是"PDL-192(TPP-1104)"；d是"P4A8(TPP-1324)"；e是"P3G5(TPP-2195)"；f是"136.1(TPP-2194)"；h是"ITEM1"；i是"ITEM4"；j是小鼠同型对照；k是人同型对照。检查的所有抗体在80ng/ml浓度下表现出饱和结合。
图4: TWEAKR的富含半胱氨酸结构域与根据本发明的抗体和参考抗体的相互作用。显示具有TWEAKR (34-68)-Fc融合蛋白涂层（TPP-2203, 1 µg/ml）和0.08 µg/ml（空白条）和0.3 µ/ml（实心条）生物素化IgG作为可溶性结合配对物的ELISA的结果。使用链霉亲和素-HRP和Amplex Red底物进行检测。X是"受试抗体构建体"：a是"TPP-2090"；b是"TPP-2084"；c是"PDL-192(TPP-1104)"；d是"P4A8(TPP-1324)"；e是"P3G5(TPP-2195)"；f是"136.1(TPP-2194)"；h是"ITEM1"；i是"ITEM4"；j是小鼠同型对照；k是人同型对照。检查的所有抗体在80 ng/ml浓度下表现出饱和结合。
图5: TWEAKR（28-68）与根据本发明的抗体和参考抗体的相互作用。显示具有TWEAKR (28-68)-HIS涂层（TTP-1984, 1 µg/ml）和0.08 µg/ml（空白条）和0.3 µ/ml（实心条）生物素化IgG作为可溶性结合配对物的ELISA的结果。使用链霉亲和素-HRP和AmplexRed底物进行检测。X是"受试抗体构建体"：a是"TPP-2090"；b是"TPP-2084"；c是"PDL-192(TPP-1104)"；d是"P4A8(TPP-1324)"；e是"P3G5(TPP-2195)"；f是"136.1(TPP-2194)"；h是"ITEM1"；i是"ITEM4"；j是小鼠同型对照；k是人同型对照。检查的所有抗体在80 ng/ml浓度下表现出饱和结合。
图6: A – 富含半胱氨酸结构域的丙氨酸扫描。分析TWEAKR(34-68)-Fc的突变蛋白的PDL-192(TPP-1104) (X)-和TPP-2090 (Y)-结合。在HEK293细胞（黑色菱形）中表达S37A、R38A、S40A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A和L65A突变蛋白。涂布PFL192(TPP-1104)和TPP-2090（1 µg/ml）并添加HEK293发酵液的8倍稀释上清液用于TWEAKR蛋白质结合。X是" PDL-192/TTP-1104相互作用的ELISA强度 [Rfu]", Y是"TPP-2090相互作用的ELISA强度 [Rfu]"。TPP-2090 (Y)表现出降低的对D74A-TWEAKR突变蛋白的结合（封闭框），且PDL-192(TPP-1104) (X)表现出降低的与R56A的结合（虚线框）。
B – Y是"通过野生型结合信号标准化的以%计的结合 [%]"，1是"TPP-2090"；2是"PDL-192(TPP-1104)"；3是"P4A8(TPP-1324)". (1 µg/ml)，TWEAKR变体以250 ng/ml添加，经由抗-HIS HRP检测。与野生型构建体相比，TTP-2090表现出小于5%结合。
图7: 如Pellegrini等人（FEBS 280:1818-1829）公开的TWEAKR胞外域的NMR结构。TWEAK结合依赖于L46（Pellegrini等人），TTP-2090结合依赖于D47，且PDL-192结合到R56上。PDL-192结合到TWEAK配体结合位点的对面，TPP-2090直接结合到TWEAK配体位点上。
发明详述
本发明提供结合体或其衍生物与一个或多个活性物质分子的偶联物，其中该活性物质分子是经连接体L连接到结合体上的纺锤体驱动蛋白抑制剂（KSP抑制剂）。
本发明的偶联物可由下列通式表示
其中BINDER代表结合体，优选抗体，L代表连接体，KSP代表KSP抑制剂，m代表1至2，优选1的数值，且n代表1至50，优选1.2至20，特别优选2至8的数值。在此，m是每连接体的KSP抑制剂数量且n是每BINDER的KSP抑制剂/连接体偶联物数量的平均值。该偶联物中存在的所有KSP的总和因此是m和n的乘积。KSP-L优选具有上示式(I)或(II)。该结合体优选是结合体肽或蛋白质，例如抗体。此外，该连接体优选连接到结合体肽或蛋白质或其衍生物的不同氨基酸上。特别优选结合到结合体的不同半胱氨酸残基上。
下面描述可根据本发明使用的结合体、可根据本发明使用的KSP抑制剂和可根据本发明使用的连接体，它们可以无限制地结合使用。特别地，在每种情况下被表示为优选或特别优选的结合体可以与在每种情况下被表示为优选或特别优选的KSP抑制剂组合使用，任选与在每种情况下被表示为优选或特别优选的连接体组合使用。
KSP抑制剂和它们的结合体偶联物
低分子量KSP抑制剂例如从WO2006/044825；WO2006/002236；WO2005/051922；WO2006/060737；WO03/060064；WO03/040979；和WO03/049527中获知。
通常，KSP抑制剂具有下列亚结构I(sub)：
其中
#a代表与所述分子剩余部分的键；
R1a代表H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、COOH、SO3H、SH或OH，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基。
特别常遇到下列亚结构II(sub)
其中#a、R1a、R2a、R4a具有与I(sub)中相同的含义且R12a和R13a代表H或R12a和R13a一起（形成哌啶环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、COOH、SO3H、SH或OH；
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'），且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基。
特别地，许多KSP抑制剂具有亚结构II(sub)，其中R1a、R2a、R4a、R12a和R13a代表H。
根据本发明，可以使用亚结构I(sub)或亚结构II(sub)的KSP抑制剂。根据本发明使用的KSP抑制剂还包括例如伊斯平斯（Cytokinetics/GSK）、MK-0731（Merck）、AZD4877（AstraZeneca）、ARRY-520（Array BioPharma）和ARQ 621（ArQule）。
根据本发明优选的KSP抑制剂具有下列基本结构及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
式(I):
其中
R1a代表H、-MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、SO3H、NH2、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基，
R3a代表–MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，
优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基)；
R8a代表C1-10-烷基；
HZ代表可被选自卤素、可任选被卤素取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环；
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。
根据本发明，此类纺锤体驱动蛋白抑制剂可通过取代R1a、R2a、R3a、R4a、R8a或R10处的氢原子或任选经由HZ的取代基之一，特别经由R1a、R2a、R3a、R4a或R10连接到连接体上。
式(I)的取代基优选具有下列含义，其中这些优选含义优选互相组合。
R1a优选代表H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地优选代表H、-COCHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、SO3H、NH2、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基。
R3优选代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）。
R8a优选代表C1-10-烷基。
HZ优选代表可被选自卤素、可任选被卤素取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环。
C1-10-烷基在本发明中（即在上式中以及在下式中）代表具有1至10个碳原子的直链或支化的烷基。可作为优选提到的实例是：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、1-甲基丙基和叔丁基。
C6-10-芳基-在本发明中代表单环或双环芳族碳环，例如苯基和萘基。
C6-10-芳烷基在本发明中代表C1-C4-烷基连接到其上的单环芳族碳环，例如苯基。示例性C6-10-芳烷基是苄基。
C5-10-杂芳基在本发明中代表具有总共6至10个环原子的单环或双环芳族杂环，其中该一个或多个环含有一个或两个选自N、O、S、SO和SO2的环杂原子并经环碳原子或任选环氮原子连接。可提到的实例是吡啶基、呋喃基、嘧啶基、咪唑基、噻吩基、苯硫基、异噁唑基、异噻唑基、1,2,3-噁二唑基、呋咱基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、哒嗪基、吡咯基、三嗪基、吲哚基、喹啉基、喹唑啉基、1,3-苯并二氧戊环基、异吲哚基、吲唑基、1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶基、苯并三唑基、异喹啉基、噌啉基（Sinolinyl）、酞嗪基、蝶啶基、萘啶基、苯并咪唑啉基、苯并噻唑啉基、苯并噁唑啉基、3,4-亚甲基二氧基苯基和苯并[6]呋喃基。
单环或双环杂环在本发明中代表具有总共5至10个环碳原子的单环或双环杂环，其中该一个或多个环含有一至三个选自N、O、S、SO和SO2的环杂原子并经环碳原子或任选环氮原子连接。可提到的实例是哌啶基、吡咯啉基、吗啉基、3,4-亚甲基二氧基苯基和四氢呋喃基。
卤素原子在本发明中代表F、Cl、Br或I。
通过亚结构I(sub)或亚结构II(sub)中的R1a、R2a、R4a或R10或式(I)中的HZ处的R1a、R2a、R3a、R4a、R8a或R10处的氢原子的取代，式(I)的化合物可以以普通技术人员已知的方式连接到连接体上。特别优选在R1a、R2a、R3a、R4a处或在由R2a和R4a形成的吡咯烷环处发生氢原子的取代。这种偶联可通过如实施例中的图式7至31中示例性显示的各种途径化学进行。特别地，任选可以改性要偶联到连接体上的低分子量KSP抑制剂，例如通过引入保护基或离去基以促进取代（以使在该反应中，所述离去基而非氢原子被连接体取代）。由此获得的KSP抑制剂 – 连接体分子（其中该连接体具有用于偶联到结合体上的反应性基团）可随后与结合体反应以产生根据本发明的结合体偶联物。在实验部分中，通过大量实施例以示例性方式例示这一程序。
R1a优选是H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ''(CH2)1-3 NH2和–CONZ''CH2COOH，其中Z''代表H或NH2。
R2a和R4a优选是H，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H。
R3a优选是C1-10-烷基-，其可被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代（其中烷基优选为C1-3-烷基）。
R8a优选是支化的C1-5-烷基，优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、1-甲基丙基和叔丁基。
HZ优选是可被选自卤素、可任选被卤素取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环。
HZ特别优选是取代的吡咯、吡唑、咪唑、喹唑啉或二氢喹唑啉，其在邻位（相对于含R1a等的取代基）被任选取代的苄基取代。此外，该取代的吡咯、吡唑、咪唑或喹唑啉可优选被氧代基（在二氢喹唑啉的情况下）或被1或2个卤素原子取代的苯基取代。HZ特别优选是取代的吡咯。
优选使用的KSP抑制剂是伊斯平斯。另一优选的KSP抑制剂是Arry-520。
其它特别优选的化合物具有下式(IIa)或(II)：
式(IIa)，及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH或CF，X2代表N且X3代表C；
（其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N是优选的）；
R1代表H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2代表–L-#1、H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R4代表–L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-#1、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选是C1-10-烷基）；
R5代表–L-#1、H、-MOD、NH2、NO2、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环（优选氧杂环丁烷），其中这些基团的每个可被–OH、CO2H或NH2或L-#1取代；
其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10之一或无一代表（或在R8的情况下含有）–L-#1，
L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。
式(II)，及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C
R1代表H、–L-#1或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表H、–L-#1、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、–L-#1、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
通过以普通技术人员已知的方式取代R1、R2、R3、R4、R5或R8处或由R2和R4形成的吡咯烷环(R10)处的氢原子，可以将其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10无一代表–L-#1的式(IIa)或(II)的化合物连接到连接体上。这产生式(IIa)或(II)的偶联物，其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8或R10之一代表–L-#1，L代表连接体且#1代表与结合体或其衍生物的键。如果根据式(IIa)或(II)的KSP抑制剂与结合体偶联，取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8或R10之一因此代表–L-#1，其中L代表连接体且#1代表与结合体或其衍生物的键。即在偶联物的情况中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10之一代表–L-#1，其中–L-#1连接到结合体，例如抗体上。特别优选地，取代基R1和R3之一代表–L-#1。该结合体优选是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。
基团–L-#3也可以代替–L-#1存在于该化合物中，其中L代表连接体且#3代表用于结合到结合体或其衍生物上的反应性基团。包含–L-#3的化合物是与结合体或其衍生物反应的反应性化合物。#3优选是与氨基或硫醇基团反应以形成共价键，优选与蛋白质中的半胱氨酸残基反应的基团。蛋白质中的半胱氨酸残基可以天然存在于该蛋白质中，通过生物化学方法引入，或优选通过结合体的二硫化物的预先还原而生成。
下述式(IIa)或(II)的化合物特别优选，其中取代基R1、R2、R3、R4、R5和R10之一代表–L-#1且其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C，
特别是其中X1代表N，X2代表N且X3代表C；或X1代表CH，X2代表C且X3代表N的那些。特别优选的是其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N的化合物。
对于A，优选的是CO（羰基）。
R1优选是–L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ''(CH2)1-3 NH2和–CONZ''CH2COOH，其中Z''代表H或NH2。
R2和R4优选是H、–L-#1，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H或–L-#1。
R3优选是–L-#1或C1-10-烷基-，其可任选被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代（其中烷基优选是C1-3-烷基）。
R5优选是–L-#1、H或F。
R6和R7彼此独立地优选为H、（任选氟代的）C1-3-烷基、（任选氟代的）C2-4-烯基、（任选氟代的）C2-4-炔基、羟基或卤素，
R8优选是支化的C1-5-烷基，特别是式–C(CH3)2-(CH2)0-2 –Ry的基团，其中Ry代表–H、–OH、CO2H、NH2或–L-#1。特别优选的是式–C(CH3)2-(CH2) –Ry的基团，其中Ry代表–H或–L-#1。
R9优选是H或F。
特别优选的是下述式(IIa)或(II)的化合物，其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10无一或之一代表–L-#1，且
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C
A代表CO（羰基）；
R1代表H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ''(CH2)1-3 NH2和–CONZ''CH2COOH，其中Z''代表H或NH2；
R2和R4代表H或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表-CH2-CHR10-或–CHR10-CH2-，其中R10代表H或–L-#1；
R3代表可被卤素（特别是F）或任选氟代的C1-3-烷基单取代或多取代的苯基，或代表可任选被–OY4、-SY4、-O-CO-Y4、-O-CO-NH-Y4、NH-CO-Y4、-NH-CO-NH-Y4、S(O)n-Y4（其中n代表0、1或2）、-SO2-NH-Y4、NH-Y4或N(Y4)2取代的任选氟代的C1-10-烷基，其中Y4代表H、苯基（任选被卤素（特别是F）或任选氟代的C1-3-烷基单取代或多取代）或烷基（其中该烷基可被–OH、-COOH和/或-NHCO-C1-3-烷基取代，且其中烷基优选代表C1-3-烷基）；
其中R3特别优选可被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2取代（其中烷基优选是指C1-3-烷基）
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、（任选氟代的）C1-3-烷基、（任选氟代的）C2-4-烯基、（任选氟代的）C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支化的C1-5-烷基；且
R9代表H或F。
此外，优选的是（独自或组合）
●R1代表–L-#1、COOH或H,
● R2和R4彼此独立地代表–L-#1或H或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或–CHR10-CH2-，其中R10代表H或–L-#1，
●A代表CO，
●R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、可被1-3个卤素原子、1-3个氨基或1-3个烷基（可任选卤代）取代的苯基，或代表–L-#1，
●R5代表–L-#1或H,
●R6和R7彼此独立地代表H、C1-3-烷基或卤素；R6和R7特别代表F；
●R8代表C1-4-烷基（优选叔丁基）；和/或
●R9代表H，
●其中取代基R1、R2、R3、R4、R5和R10之一代表–L-#1。
另外，根据本发明优选的是
●R1代表–L-#1、COOH或H，
●R2和R4彼此独立地代表–L-#1或H或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或–CHR10-CH2-，其中R10代表H或–L-#1，
●A代表CO，
●R3代表-(CH2)OH、-CH(CH3)OH、-CH2SCH2CH(COOH)NHCOCH3、-CH(CH3)OCH3、可被1-3个卤素原子、1-3个氨基或1-3个烷基（可任选卤代）取代的苯基，或代表–L-#1，
●R5代表–L-#1或H，
●R6和R7彼此独立地代表H、C1-3-烷基或卤素；R6和R7特别代表F；
●R8代表C1-4-烷基（优选叔丁基）；且
●R9代表H，
●其中取代基R1、R2、R3、R4、R5和R10之一代表–L-#1。
其它特别优选的化合物具有下式(IIIa)或(III)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
式(IIIa):
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C
（其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N是优选的）；
R1代表H、–L-BINDER、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH3)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、-COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-L-BINDER、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R4代表H、-L-BINDER、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表-L-BINDER、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表-L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-BINDER、H、NH2、NO2、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团的每个可被–OH、CO2H或NH2或–L-BINDER取代；
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。
在式(IIIa)的KSP抑制剂的结合体偶联物的情况下，R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10的最多一个代表（代替上文给出的条件之一）可代表-L-BINDER，其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中该结合体可任选连接到多个活性物质分子上。
式(III)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐:
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C，或X1代表CH，X2代表C且X3代表N，或X1代表NH，X2代表C且X3代表C，或X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
R1代表–L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-BINDER或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-BINDER、H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
此外，根据本发明优选的是下列KSP抑制剂和它们的结合体偶联物：
式(IIIb):
其中X1、X2、X3具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义（其中优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N），R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8和R9具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义，A代表CO，B代表单键、–O-CH2–或–CH2-O-且R20代表NH2、F、CF3或CH3，且n代表0、1或2。
式(IIIc):
其中X1、X2、X3具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义（其中优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N），A、R1、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义，A优选代表CO且R3代表–CH2OH、-CH2OCH3、CH(CH3)OH或CH(CH3)OCH3。
式(IIId):
其中X1、X2、X3具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义（其中优选X1代表CH，X2代表C且X3代表N）、A、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义，其中A优选代表CO且R3代表–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x是0或1且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
式(IIIe):
其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N，A、R3、R6、R7、R8和R9具有与式(IIIa)或(III)中相同的含义且R1代表-L–BINDER。
此外，优选的是，在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)和(IIIe)的化合物中（独自或组合）：
●Z代表Cl或Br；
●R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'；
●Y1代表H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'且Z'代表–COOH；
●Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'且Z'代表-(CONHCHY4)2COOH；
●Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'，Z'代表-(CONHCHY4)2COOH且Y4之一代表异丙基，另一个代表–(CH2)3-NHCONH2；
●Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'，Z'代表-(CONHCHY4)2COOH且Y4之一代表–CH3，另一个代表–(CH2)3-NHCONH2；
●Y4代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基；
● 至少一个Y4代表选自异丙基和–CH3；
●Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'，Z'代表-CONHCHY4COOH且Y4代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
●Y4代表氨基苄基；
●R2代表–(CH2)0-3Z且Z代表–SY3；
●R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表H；
●R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表–CO-CHY6-NH2；
●Y4代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基。
此外，优选的是，式(IIa)或(IIIa)中的R1、R2或R3代表-MOD，特别是R4代表–L-#1或–L-BINDER（特别是–L是可裂解连接体，其直接在–N-R4或–N—L-#1或–L-BINDER处裂解，以使R4或L被H替代）。
特别优选地，R3代表-MOD且R1或R4代表–L-#1或–L-BINDER，
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH；
特别优选地，基团–MOD具有（优选末端的）–COOH基团，例如在甜菜碱基团中。基团–MOD优选具有式–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x是0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
其它特别优选的化合物具有下式(IV)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
X1代表N，X2代表C且X3代表N；
R1代表–L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被-NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-BINDER、任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基或–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x是0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，优选–L-BINDER或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-BINDER、H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
条件是R1、R2和R4不同时代表H。
此外，优选的是（独自或组合），在式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)中：
●Z代表Cl或Br；
●R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'；
●Y1代表H，Y2代表-(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'且Z'代表–COOH；
●Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'且Z'代表-(CONHCHY4)2COOH；
●Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'，Z'代表-(CONHCHY4)2COOH且一个Y4代表异丙基，另一个代表–(CH2)3-NHCONH2；
●Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'，Z'代表-(CONHCHY4)2COOH且一个Y4代表–CH3，另一个代表–(CH2)3-NHCONH2；
●Y4代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基；
● 至少一个Y4代表选自异丙基和–CH3；
●Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'，Z'代表-CONHCHY4COOH且Y4代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
●Y4代表氨基苄基；
●R2代表–(CH2)0-3Z且Z代表–SY3；
●R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表H；
●R4代表-CO-CHY4-NHY5且Y5代表–CO-CHY6-NH2；
●Y4代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基。
还优选的是式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)或(IV)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH或CF，X2代表N且X3代表C；
（其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N是优选的）；
R1代表H、–L-#1或–L-BINDER、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH3)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R4代表H；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-#1或–L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选是C1-10-烷基）；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基或（任选氟代的）C4-10-环烷基；
其中取代基R1和R3之一或无一代表–L-#1、–L-#1或–L-BINDER，
L代表连接体且#1代表与结合体或其衍生物的键且BINDER代表结合体，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。
还优选的是式(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)或(IV)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐，其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH或CF，X2代表N且X3代表C；
（其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N是优选的）；
R1代表H、–L-#1或–L-BINDER、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH3)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R4代表H；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-#1或–L-BINDER、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH((CH2CH2O)1-20H)基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选是C1-10-烷基）；
R5代表H、-MOD、NH2、NO2、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H或卤素（特别是F、Cl、Br），
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基；
其中取代基R1和R3之一或无一代表–L-#1或–L-BINDER，
L代表连接体且#1代表与结合体或其衍生物的键且BINDER代表结合体，
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
其中–MOD代表–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH，其中x是0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3。
还优选的是下列化合物，它们可任选与酸，例如三氟乙酸一起存在。这些化合物可经由与R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10，特别是R1和R3的位置对应的位置经连接体连接到结合体上（其中氢原子被连接体取代）：
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2yl]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
(15S,19R)-15-氨基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-乙醇酰-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧杂-13,18-二氮杂二十一烷-1-酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-氨基-L-苯基丙氨酸；
N-{(1R)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-氨基丙基)-2-羟基乙酰胺(1:1)；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；
N-[(3S)-3-氨基-4-肼基-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)；
N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二氨基丁基]-2-羟基乙酰胺(1:1)；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；
(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺(2:1)；
(1-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)乙酸；
N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺(2:1)；
N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；
L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；
L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基]-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基]-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；
S-{1-[6-(2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)-6-氧代己基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)己酰基]氨基}乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-D-丙氨酰基)-L-赖氨酸；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸；
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲氧基乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2,4-二氟苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-氟苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；
(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丝氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}甘氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸甲酯；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸；
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基]-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷-1-酸；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺；
N-乙酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸；
N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氢呋喃-2-甲酰胺；
3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸；
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
根据本发明特别优选的是下列式V、VI或VII的化合物，其中R1、R2、R3、R4和R5具有上文提到的含义（如对例如式(IIa)或(IIIa)提到）：
特别优选的是式V、VI、VII的化合物，其中R1和R5代表H或–L-#1；R2和R4彼此独立地代表–L-#1或H或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或–CHR10-CH2-，R10代表H或–L-#1；且R3代表CH2OH、CH(CH3)OH或–L-#1，其中取代基R1、R2、R3、R4、R5和R10之一代表–L-#1。尤其优选的是式VI的相应化合物。
连接体
文献公开了用于将有机分子共价偶联（结合）到结合体，例如抗体上的各种可能性（参见例如K. Lang和J. W. Chin. Chem. Rev. 2014, 114, 4764-4806, M. Rashidian等人Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294）。根据本发明优选的是KSP抑制剂经由已作为游离硫醇存在或通过二硫桥的还原生成的抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或经由抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团偶联到抗体上。但是，也可以经由酪氨酸残基、经由谷氨酰胺残基、经由非天然氨基酸的残基、经由游离羧基或经由抗体的糖残基将KSP抑制剂连接到抗体上。对于偶联，使用所谓的连接体。连接体可分类成可体内裂解的连接体类别和体内稳定的连接体类别（参见L. Ducry和B. Stump, Bioconjugate Chem. 21, 5-13(2010)）。可体内裂解的连接体具有可体内裂解的基团，其中又可区分可体内化学裂解的基团和可体内酶促裂解的基团。“可体内化学裂解”和“可体内酶促裂解”是指该连接体或基团在血液循环中稳定并仅在靶细胞处或靶细胞中通过其中不同的化学或酶环境（较低pH；升高的谷胱甘肽浓度；溶酶体酶，如组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶，或糖苷酶（Glyosidasen），例如β-葡糖醛酸酶的存在）裂解，由此释放低分子量KSP抑制剂或其衍生物。可体内化学裂解的基团特别是二硫、腙、缩醛和缩醛胺；可体内酶促裂解的基团特别是2-8-寡肽基团，尤其是二肽基团或糖苷。在Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869和Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8 (1998) 3341-3346以及Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626中公开了肽裂解位点。这些包括，例如，缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸和苯基丙氨酸-赖氨酸（任选具有附加酰胺基团）。
体内稳定的连接体以高稳定性为特征（在血浆中24小时后少于5%代谢产物）并且没有上文提到的可化学或酶促体内裂解的基团。
连接体–L-优选具有下示基本结构(i)至(iv)之一：
(i) –(CO)m–SG1-L1-L2-
(ii) –(CO)m –L1-SG-L1-L2-
(iii) –(CO)m –L1-L2-
(iv) –(CO)m –L1-SG-L2
其中m是0或1；SG是可（化学或酶促）体内裂解的基团（ 特别是二硫、腙、缩醛和缩醛胺；或可被组织蛋白酶或血纤维蛋白溶酶裂解的2-8-寡肽基团），SG1是寡肽基团或优选二肽基团，L1彼此独立地代表体内稳定的有机基团，且L2代表连向结合体的偶联基团或单键。在此，优选偶联到结合体的半胱氨酸残基或赖氨酸残基上。或者，可以偶联到结合体的酪氨酸残基、谷氨酰胺残基或非天然氨基酸上。非天然氨基酸可含有例如醛或酮基（例如甲酰基甘氨酸）或叠氮或炔基（参见Lan & Chin, Cellular Incorporation of Unnatural AminoAcids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem.Rev. 2014, 114, 4764-4806）。
根据本发明特别优选的是连接体基本结构(iii)，特别是当结合体是抗-TWEAKR抗体或抗-EGFR抗体时。通过代谢，具有连接体基本结构(iii)且连接体偶联到结合体蛋白质或肽的半胱氨酸或赖氨酸残基上的本发明的偶联物的给药产生下式的半胱氨酸或赖氨酸衍生物：
其中L1在每种情况下连接到低分子量KSP抑制剂，例如式(I)、(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)的化合物上。
根据本发明也优选的是连接体基本结构(ii)和(iv)，特别是当在位置(iii)连接时，特别是当基团L1具有下列结构之一时：
(a) –NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-Y7，其中Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，且Y7代表单键或–NH-(CH2)0-4–CHNH2-CO-，以在裂解后获得相应的结构–NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-COOH或–NH-(CH2)0-4-(CHCH3)0-4-CHY5-CO-NH-(CH2)0-4-CHNH2-COOH。
(b) –CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-CO-，其中x是0或1，且Y5代表H或NHY6，其中Y6代表H或-COCH3，以在裂解后获得相应的结构–CH2-Sx-(CH2)0-4-CHY5-COOH。
当L1在每种情况下连接到低分子量KSP抑制剂，例如式(I)、(IIa)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、(IIIe)或(IV)的化合物上（特别是在位置R4）时，这一实施方案是优选的。该结合体优选是抗-TWEAKR抗体或抗-EGFR抗体。
如果连接体连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上，L2优选衍生自与半胱氨酸的巯基反应的基团。这些包括卤乙酰、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰、芳基化化合物、乙烯基砜、吡啶二硫、TNB硫醇和二硫-还原剂。这些基团通常以亲电子方式与巯基键反应，以形成硫桥（例如硫醚）或二硫桥。优选的是稳定的硫桥。L2优选是
其中
#1是指与结合体的硫原子的连接点，
#2是指与基团L1的连接点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR、CONR2（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH2，优选COOH。
L2特别优选是：
或
其中#1是指与结合体的硫原子的连接点，#2是指与活性物质的连接点，x代表1或2，且R22代表COOH、COOR、COR、CONHR（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH2，优选COOH。优选x=1且R22代表COOH。
在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上存在连向结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A3或A4的两种结构之一。在此，式A3或A4的结构通常一起存在，基于连向结合体的键的数量计，优选为60:40至40:60的比率。剩余键随之作为下列结构存在
。
根据本发明，L1优选由下式表示
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或；（如果G1代表NHCO或，则R10优选不是NH2），
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）和/或具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2优选代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的3至10元，例如5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中的进一步的中断基团优选是
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
在此，#1是连向KSP抑制剂的键且#2是连向与结合体的偶联基团（例如L2）的键。
来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基的直链或支化的烃链通常包含具有各自所示的碳原子数的α,ω-二价烷基。可作为优选提到的实例是：亚甲基、乙烷-1,2-二基（1,2-亚乙基）、丙烷-1,3-二基（1,3-亚丙基）、丁烷-1,4-二基（1,4-亚丁基）、戊烷-1,5-二基（1,5-亚戊基）、己烷-1,6-二基（1,6-亚己基）、庚烷-1,7-二基（1,7-亚己基）、辛烷-1,8-二基（1,8-亚辛基）、壬烷-1,9-二基（1,9-亚壬基）、癸烷-1,10-二基（1,10-亚癸基)。但是，该烃链中的亚烷基也可以是支化的的，即上文提到的直链亚烷基的一个或多个氢原子可任选被C1-10-烷基取代，由此形成侧链。该烃链还可含有环状亚烷基（环烷二基），例如1,4-环己烷二基或1,3-环戊烷二基。这些环状基团可以是不饱和的。特别地，在该烃基中可存在芳基（亚芳基），例如亚苯基。在该环状亚烷基和亚芳基中，一个或多个氢原子也可任选被C1-10-烷基取代。由此，形成任选支化的烃链。这种烃链具有总共0至100个碳原子，优选1至50，特别优选2至25个碳原子。
如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
该烃链可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次。
G2中的进一步的中断基团优选是
。
所述连接体优选符合下式：
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m是0或1；
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，且
L1和L2具有上文给出的含义。
L1特别优选具有式–NR11B-，其中
R11代表H或NH2；
B代表–[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w = 0至20；
x = 0至5；
x = 0至5；
y = 0或1；
z = 0至5；且
X4代表–O-、-CONH-、–NHCO-或。
根据本发明优选的连接体L具有下式：
其中
#3代表连向活性物质分子的键，
#4代表连向结合体肽或蛋白质的键，
R11代表H或NH2；
B代表–[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w = 0至20；
x = 0至5；
y = 0或1；
z = 1至5；且
X4代表–O-、-CONH-、–NHCO-或。
上文提到的连接体在式(I)或(II)的偶联物中尤其优选，其中该连接体通过取代R1处的氢原子或与R4处的可裂解连接体SG1一起偶联，即R1代表–L-#1或R4代表-SG1-L-#1，其中#1代表连向结合体的键。
根据本发明还优选的是下列连接体：在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上存在连向结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A5或A6的两种结构之一：
其中
#1是指与结合体的硫原子的连接点，
#2是指与基团L1的连接点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH2，优选COOH。
在此，式A5或A6的结构通常一起存在，基于连向结合体的键的数量计，优选为60:40至40:60的比率。剩余键随之作为下列结构存在
。
连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上的其它连接体–L-具有下式：
其中
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，
m是0、1、2或3；
n是0、1或2；
p是0至20；且
L3代表
；
其中
o是0或1；
且
G3代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或SO2的杂原子的3至10元（优选5至10元）芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在上式中，优选地，
m是1；
p是0；
n是0；
且L3代表
；
其中
o是0或1；且
G3代表-(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)u CH2CH2O)v(CH2)w-，其中
s、t、v和w各自彼此独立地为0至20，且u是0或1。
上式§-(CO)m-L1-L2-§§中的优选基团L1是下示那些，其中r在每种情况下彼此独立地代表0至20，优选0至15，特别优选1至20，尤其优选2至10的数值：
在表C中给出L1的进一步实例，其中这一基团突出标示在框中。
在下表A和A'中给出连接体部分L1的实例。该表还指出L1的这些实例优选与哪种基团L2组合，以及优选的偶联点（R1-R5）和m的优选值，即在L1前是否存在羰基（参见§-(CO)m-L1-L2-§§）。这些连接体优选偶联到半胱氨酸残基上。第一列还指出使用相关连接体的西妥昔单抗ADC的实施例号，但这在各行中同样适用于含其它抗体的ADC。如果L2是琥珀酰亚胺或由其衍生而得，这种酰亚胺也可以完全或部分为如上所述的水解开链琥珀酰胺的形式。根据L1，这种水解成开链琥珀酰胺可以是或多或少显著或完全不明显的。
*R2和R4形成被连接体取代的吡咯烷环。
**特别优选地，这些行中给出的连接体L1连接到选自下列的连接体L2上：
和/或
其中#1是指与结合体的硫原子的连接点，#2是指与基团L1的连接点，R22优选代表COOH。在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上存在连向结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选作为式A7或A8的两种结构之一。在此，式A7或A8的结构通常一起存在，基于连向结合体的键的数量计，优选为60:40至40:60的比率。剩余键随之作为下列结构存在
。
**: 见表A的注**
***: 当存在这一结构L2时，可同时存在下式结构L2：
。
具有相应连接体的偶联物的实例具有下列结构，其中X1、X2、X3和L1具有上文给出的含义，L2和L3具有与L1相同的含义，AK1代表经半胱氨酸残基连接的抗体，且n是1至10的数值。特别优选地，AK1是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。
如果该连接体连接到赖氨酸侧链或赖氨酸残基上，其优选具有下式：
-§-(SG)x-L4-CO-§§
其中
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，
x代表0或1，
SG代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽，
且
L4代表单键或基团–(CO)y-G4-，其中y代表0或1，且
G4代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或-SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
下表B给出连向赖氨酸残基的连接体的实例。该表还给出优选偶联点（R1-R5）。第一列还指出使用相应连接体的实施例号。
表B：赖氨酸连接体
-§-(SG)x-L4-CO-§§
。
具有相应连接体的偶联物的实例具有下列结构，其中X1、X2、X3和L4具有上文给出的含义，AK2代表经赖氨酸残基连接的抗体，且n是1至10的数值。特别优选地，AK2是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。
根据本发明还优选的是基本结构(i)、(ii)或(iv)，其中SG1或SG代表可被组织蛋白酶裂解的基团，且L1和L2具有上文给出的含义。特别优选的是下列基团：
●-Val-Ala-CONH-（由此裂解丙氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）
●-NH-Val-Lys-CONH-（裂解赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）
●-NH-Val-Cit-CONH-（裂解瓜氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）
●-NH-Phe-Lys-CONH（裂解赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）
●-NH-Ala-Lys-CONH-（裂解赖氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）
●-NH-Ala-Cit-CONH-（裂解瓜氨酸的C-末端酰胺处的酰胺键）
SG1或SG特别优选是
或
或
其中X代表H或可任选被–NHCONH2、-COOH、-OH、NH2、-NH-CNNH2或磺酸取代的C1-10-烷基。
下表C给出连接体部分–SG1-L1-或–L1-SG-L1-的实例，其中SG1和SG是可被组织蛋白酶裂解的基团。表C还指出–SG1-L1-和–L1-SG-L1-的这些实例优选与哪种基团L2组合，以及优选的偶联点（R1-R5）和m的优选值，即在L1前是否存在羰基（参见§-(CO)m-L1-L2-§§）。这些连接体优选偶联到半胱氨酸残基上。第一列还例性地对西妥昔单抗ADC给出使用相应连接体的实施例号，示。它们同样适用于含其它抗体的相应ADC。L1基团突出标示在框中。但是，这些基团L1可被对上式§-(CO)m-L1-L2-§§给出的基团L1之一替代。如果L2是琥珀酰胺或由其衍生而得，这种酰胺也可以完全或部分为如上所述的水解开链琥珀酰胺的形式。
具有基本结构(i)的偶联物的实例具有下列结构，其中X1、X2和X3具有上文给出的含义，L4具有与L1相同的含义，AK1代表经半胱氨酸残基连接的抗体，且n是1至10的数值。特别优选地，AK1是抗-TWEAKR抗体，特别是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090。
KSP抑制剂 - 连接体中间体和该偶联物的制备
本发明的偶联物通过首先提供含连接体的低分子量KSP抑制剂制备。由此获得的中间体随后与结合体（优选抗体）反应。
优选地，为了偶联到半胱氨酸残基上，使下示化合物之一与为此任选部分还原的含半胱氨酸的结合体，如抗体反应：
其中R代表-H或–COOH，
其中K代表任选被C1-C6-烷氧基或–OH取代的直链或支化的C1-C6烷基，且
其中X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3和L4具有如上所述的相同含义。
该化合物可以例如以其三氟乙酸盐的形式使用。对于与结合体，例如抗体的反应，该化合物优选相对于结合体以2至12倍摩尔过量使用。
优选地，为了偶联到赖氨酸残基上，使下示化合物之一与含赖氨酸的结合体，如抗体反应：
其中X1、X2、X3具有与式(II)中相同的含义且L4具有与L1相同的含义且L1具有与上文所述相同的含义。
为了偶联到半胱氨酸残基上的中间体，该反应可以如下所示：
可以相应地使其它中间体和其它抗体反应。
为了偶联到赖氨酸基团上的中间体，该反应可以如下所示：
根据本发明，这产生下列偶联物：
根据连接体，琥珀酰亚胺连接的ADC在偶联后可转化成具有有利的稳定性状况的开链琥珀酰胺。
这种反应（开环）可以在pH 7.5至9下，优选在pH 8下在25℃至37℃的温度下，例如通过搅拌进行。优选搅拌时间为8至30小时。
在上式中，X1、X2、X3具有与式(II)中相同的含义，SG1和L1具有如上所述的相同含义且L2、L3和L4具有与L1相同的含义；R和K具有如上所述的相同含义。AK1是经半胱氨酸残基偶联的抗体且AK2是经赖氨酸残基偶联的抗体。特别优选地，AK1和AK2是抗-TWEAKR抗体，特别是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090。
结合体
在最广义上，术语“结合体”被理解为是指结合到该结合体/活性物质偶联物指向的某些靶细胞群上存在的靶分子上的分子。术语结合体应以其最广的含义理解并且也包括例如凝集素、能够结合到某些糖链上的蛋白质和磷脂结合蛋白。此类结合体包括，例如，高分子量蛋白质（结合蛋白）、多肽或肽（结合肽）、非肽（例如适体（US5,270,163）（Keefe AD.等人,Nat. Rev. Drug Discov. 2010；9:537-550综述）或维生素）和所有其它细胞结合分子或物质。结合蛋白是例如抗体和抗体片段或拟抗体，例如亲和体（Affibodies）、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers、纳米抗体（Gebauer M.等人, Curr. Opinion in Chem.Biol. 2009；13:245-255；Nuttall S.D.等人， Curr. Opinion in Pharmacology 2008；8:608-617综述）。结合肽是例如配体/受体对的配体，例如配体/受体对VEGF/KDR的VEGF，如配体/受体对转铁蛋白/转铁蛋白受体的转铁蛋白，或细胞因子/细胞因子受体，如配体/受体对TNFα/TNFα受体的TNFα。
文献还公开了有机分子共价偶联（结合）到抗体上的各种可能性。根据本发明优选的是毒簇经由抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或经由抗体的赖氨酸残基的一个或多个NH基团偶联到抗体上。但是，也可以经由游离羧基或经由抗体的糖残基将毒簇连接到抗体上。
“靶分子”在最广义上被理解为是指存在于靶细胞群中的分子并可以是蛋白质（例如生长因子的受体）或非肽分子（例如糖或磷脂）。其优选是受体或抗原。
术语“细胞外”靶分子描述位于细胞外部的连接到细胞上的靶分子，或位于细胞外部的靶分子的一部分，即结合体可以在完整的细胞上连接到其细胞外靶分子上。细胞外靶分子可锚定在细胞膜中或是细胞膜的组成部分。本领域技术人员了解识别细胞外靶分子的方法。对于蛋白质，这可以通过（一个或多个）跨膜域的测定和蛋白质在该膜中的取向来进行。这些数据通常存放在蛋白质数据库（例如SwissProt）中。
术语“癌症靶分子”描述与相同组织类型的非癌细胞相比更大量地存在于一种或多种癌细胞种类上的靶分子。优选地，癌症靶分子与相同组织类型的非癌细胞相比选择性存在于一种或多种癌细胞种类上，其中“选择性”描述与相同组织类型的非癌细胞相比至少两倍富集在癌细胞上（“选择性癌症靶分子”)。癌症靶分子的使用允许通过本发明的偶联物选择性治疗癌细胞。
结合体可经由键连接到连接体上。结合体的连接可经由该结合体的杂原子。结合体的根据本发明可用于连接的杂原子是硫（在一个实施方案中经由结合体的巯基）、氧（根据本发明借助结合体的羧基或羟基）和氮（在一个实施方案中经由结合体的伯或仲胺基或酰胺基）。这些杂原子可存在于天然结合体中或通过化学方法或分子生物学方法引入。根据本发明，结合体与毒簇的连接对结合体与靶分子的结合活性只有轻微影响。在一个优选实施方案中，该连接对结合体与靶分子的结合活性没有影响。
根据本发明，术语“抗体”应以其最广的含义理解并包括免疫球蛋白分子，例如完全或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体（例如双特异性抗体）。免疫球蛋白分子优选包含具有通常通过二硫桥连接的四个多肽链、两个重链（H链）和两个轻链（L链）的分子。各重链包含重链可变域（缩写为VH）和重链恒定域。重链恒定域可以例如包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链包含可变域（缩写为VL）和恒定域。轻链恒定域包含结构域（缩写为CL）。VH和VL域可进一步细分成高变区，也称作互补决定区（缩写为CDR），和具有低序列变异性的区域（骨架区，缩写为FR）。通常，各VH和VL区由三个CDR和最多四个FR构成。例如以下列顺序从氨基末端到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体可获自对此任何合适的物种，例如兔、美洲驼、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，该抗体为人或鼠来源的。抗体可以例如是人的、人源化的或嵌合的。
术语“单克隆”抗体是指获自一群基本同质抗体的抗体，即该群的各个抗体除天然存在的突变（其可以为少数）外相同。单克隆抗体以高特异性识别单个抗原结合位点。术语单克隆抗体不涉及特定制备方法。
术语“完全”抗体是指包含抗原结合域和轻链和重链的恒定域的抗体。恒定域可以是天然存在的结构域或具有许多修饰的氨基酸位置的变体。
术语“修饰的完全”抗体是指借助共价键（例如肽键）经由它们的氨基末端或羧基末端与不源自抗体的另一多肽或蛋白质融合的完全抗体。此外，可以修饰抗体以在特定位置引入反应性半胱氨酸以促进偶联到毒簇上（参见Junutula等人Nat Biotechnol. 2008年8月 ；26(8):925-32）。
术语“人”抗体是指可获自人的抗体或是合成的人抗体。“合成的”人抗体是部分或更困难地完全地可基于人抗体序列的分析由合成序列计算机模拟获得的抗体。人抗体可以例如由从人源性抗体序列库中分离的核酸编码。此类抗体的实例可见于Söderlind等人,Nature Biotech. 2000, 18:853-856。
术语“人源化”或“嵌合”抗体描述由序列的非人部分和人部分构成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白的一部分序列（受体）被非人免疫球蛋白的序列部分（供体）替代。在许多情况下，该供体是鼠免疫球蛋白。在人源化抗体的情况下，受体的CDR的氨基酸被供体的氨基酸替代。有时，骨架的氨基酸也被供体的相应氨基酸替代。在一些情况下，该人源化抗体含有在抗体的优化过程中引入的既不包含于受体中又不包含于供体中的氨基酸。在嵌合抗体的情况下，供体免疫球蛋白的可变域与人抗体的恒定区融合。
本文所用的术语互补决定区（CDR）是指结合到抗原上所需的抗体可变区的氨基酸。通常，各可变区具有三个CDR区，被称作CDR1、CDR2和CDR3。各CDR区可包含根据Kabat定义的氨基酸和/或根据Chotia定义的高变环（loops）的氨基酸。根据Kabat的定义包含例如来自大致可变轻链的氨基酸位置24 – 34（CDR1）、50 – 56（CDR2）和89 – 97（CDR3）和可变重链的31 – 35（CDR1）、50 – 65（CDR2）和95 – 102（CDR3）附近的区域（Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。根据Chotia的定义包含例如来自大致可变轻链的氨基酸位置26 – 32（CDR1）、50 – 52（CDR2）和91 –96（CDR3）和可变重链的26 – 32（CDR1）、53 – 55（CDR2）和96 – 101（CDR3）的区域（Chothia和Lesk；J MolBiol 196: 901-917 (1987)）。在一些情况下，CDR可包含来自根据Kabat和Chotia定义的CDR区的氨基酸。
根据重链恒定域的氨基酸序列，可以将抗体分成不同种类。完全抗体有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可分成进一步的亚类（同型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同种类对应的重链恒定域被称作[alpha/α]、[delta/δ]、[epsilon/ε], [gamma/γ]和[my/μ]。抗体的三维结构和亚基结构都是已知的。
抗体/免疫球蛋白的术语“功能片段”或“抗原结合抗体片段”被定义为仍包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合域的抗体/免疫球蛋白的片段（例如IgG的可变域）。抗体的“抗原结合域”通常包含抗体的一个或多个高变区，例如CDR、CDR2和/或CDR3区。但是，抗体的“框架”或“骨架”区在抗体结合到抗原上的过程中也可能起到一定作用。框架区构成CDR的骨架。抗原结合域优选包含至少可变轻链的氨基酸4至103和可变重链的氨基酸5至109，更优选可变轻链的氨基酸3至107和可变重链的4至111，特别优选完整的可变轻链和重链，即VL的氨基酸1 – 109和VH的1至113（根据WO97/08320编号）。
本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”非穷举地包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双价抗体、单域抗体（DAb）、线性抗体、单链的抗体（单链Fv，缩写为scFv）；和多特异性抗体，如双和三特异性抗体，例如由抗体片段形成C. A. K Borrebaeck编辑(1995)Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford UniversityPress；R. Kontermann & S. Duebel, 编辑 (2001) Antibody Engineering (SpringerLaboratory Manual), Springer Verlag。非“多特异性”或“多功能”抗体的抗体是具有相同结合位点的那些。多特异性抗体可对抗原的不同表位是特异性的或可对多于一种抗原的表位是特异性的（参见例如WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt,等人, 1991, J. Immunol. 147:60 69；美国专利号4,474,893；4,714,681 ；4,925,648；5,573,920；5,601,819；或Kostelny等人, 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553）。可以构建F(ab')2或Fab分子以能够减少或完全防止在Ch1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用的数量。
“表位”是指能特异性结合到免疫球蛋白或T细胞受体上的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团如氨基酸或糖侧链或其组合构成，并通常具有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
“功能片段”或“抗原结合抗体片段”可经其氨基末端或羧基末端借助共价键（例如肽键）与非源自抗体的另一多肽或蛋白质融合。此外，可通过在特定位置引入反应性半胱氨酸而修饰抗体和抗原结合片段，以促进偶联到毒簇上（参见Junutula等人Nat Biotechnol.2008 Aug；26(8):925-32）。
多克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备。单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备（Köhler和Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975）。人和人源化单克隆抗体可通过本领域普通技术人员已知的方法制备（Olsson等人, MethEnzymol. 92, 3-16或Cabilly等人US 4,816,567或Boss等人US 4,816,397）。
本领域普通技术人员了解制备人抗体及其片段的各种方法，例如借助转基因小鼠（N Lonberg和D Huszar, Int Rev Immunol. 1995；13(1):65-93）或噬菌体展示技术（Clackson等人, Nature. 1991年8月15日；352(6336):624-8）。本发明的抗体可获自例如由汇集自大量健康志愿者的多种多样的抗体的氨基酸序列构成的重组抗体库。抗体也可借助已知的重组DNA技术制造。抗体的核酸序列可通过常规测序获得或可获自可公开访问的数据库。
“分离的”抗体或结合体已经纯化以除去细胞的其它成分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞的污染成分是例如酶、激素或细胞的其它肽或非肽成分。优选的抗体或结合体已纯化至该抗体或结合体的大于95重量%的程度（例如通过Lowry法、UV-Vis光谱学或通过SDS毛细管凝胶电泳测定）。此外，已纯化至可以决定氨基末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的程度或已纯化至同质性的抗体，其中同质性通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下测定（可以借助考马斯蓝染色或优选通过银着色进行检测）。但是，通常通过一个或多个纯化步骤制备抗体。
术语“特异性结合”是指抗体或结合体结合到预定抗原/靶分子上。抗体或结合体的特异性结合通常描述具有至少10-7 M的亲和力（作为Kd值；即优选为具有比10 -7 M小的Kd 值的那些）的抗体或结合体，其中该抗体或结合体对预定抗原/靶分子的亲和力比对不是预定抗原/靶分子或密切相关抗原/靶分子的非特异性抗原/靶分子（例如牛血清白蛋白或酪蛋白）高至少两倍。该抗体优选具有至少10-7 M（作为Kd值；换言之优选为具有比10-7 M小的Kd值的那些），优选至少10-8 M，更优选10-9 M至10-11 M的亲和力。可以例如借助表面等离子体共振波谱法测定Kd值。
本发明的抗体/活性物质偶联物同样表现出在这些范围内的亲和力。该亲和力优选基本不受活性物质偶联的影响（一般而言，该亲和力降低小于一个量级，换言之，例如最多从10-8 M到10-7 M）。
根据本发明使用的抗体也优选以高选择性为特征。当本发明的抗体对靶蛋白表现出的亲合力比对非依赖性的其它抗原，例如人血清白蛋白好至少2倍，优选5倍或更优选10倍（可以例如借助表面等离子体共振波谱法测定亲和力），则存在高选择性。
此外，所用的本发明的抗体优选是交叉反应性的。为了能够促进和更好地解释临床前研究，例如毒理学或效力研究（例如在异种移植小鼠中），如果根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白还结合用于研究的物种中的物种靶蛋白，则是有利的。在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除人靶蛋白外还对至少一个其它物种的靶蛋白呈交叉反应性。对于毒理学和或效力研究，优选使用啮齿科、犬科和非人灵长科的物种。优选的啮齿物种是小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物是猕猴、猩猩和长尾猕猴。
在一个实施方案中，根据本发明使用的抗体除人靶蛋白外还对选自小鼠、大鼠和长尾猕猴（食蟹猴）的至少一个其它物种的靶蛋白呈交叉反应性。尤其优选的是除人靶蛋白外至少对小鼠靶蛋白呈交叉反应性的根据本发明使用的抗体。优选的是对其它非人物种的靶蛋白的亲和力与对人靶蛋白的亲和力相差不大于50倍，特别是不大于10倍的交叉反应性抗体。
抗癌症靶分子的抗体
结合体，例如抗体或其抗原结合片段指向的靶分子优选是癌症靶分子。术语“癌症靶分子”描述与相同组织类型的非癌细胞相比更大量存在于一种或多种癌细胞种类上的靶分子。优选地，癌症靶分子与相同组织类型的非癌细胞相比选择性存在于一种或多种癌细胞种类上，其中“选择性”描述与相同组织类型的非癌细胞相比至少两倍富集在癌细胞上（“选择性癌症靶分子”）。癌症靶分子的使用允许通过本发明的偶联物选择性治疗癌细胞。
对抗原，例如癌细胞抗原特异性的抗体可以由本领域普通技术人员借助他熟悉的方法（例如重组表达）制备或可商业获得（例如获自Merck KGaA, 德国）。癌症疗法中的已知市售抗体的实例是Erbitux®（西妥昔单抗，Merck KGaA）、Avastin®（贝伐单抗，Roche）和Herceptin®（曲妥珠单抗，Genentech）。曲妥珠单抗是IgG1κ型重组人源化单克隆抗体，其在细胞基检测中以高亲和力（Kd = 5 nM）结合人表皮生长受体的胞外域。该抗体在CHO细胞中重组产生。
在一个优选实施方案中，该靶分子是选择性癌症靶分子。
在一个特别优选的实施方案中，该靶分子是蛋白质。
在一个实施方案中，该靶分子是细胞外靶分子。在一个优选实施方案中，该细胞外靶分子是蛋白质。
癌症靶分子是本领域技术人员已知的。下面列出这些的实例。
癌症靶分子的实例是：
(1) EGF受体（NCBI参考序列NP_005219.2），SEQ ID NO: 213（1210个氨基酸）:
通过下划线标记胞外域。
(2) 间皮素（SwissProt参考Q13421-3），SEQ ID NO: 214（622氨基酸）:
>sp|Q13421-3|间皮素的MSLN_HUMAN同种型2 OS=智人 GN=MSLN
其中间皮素由氨基酸296-598编码。氨基酸37-286编码巨核细胞-强化因子。间皮素经GPI锚锚定在细胞膜中并定域在细胞外。
(3) 碳酸酐酶IX (SwissProt参考Q16790), SEQ ID NO: 215（459个氨基酸）:
>sp|Q16790|CAH9_HUMAN碳酸酐酶9 OS=智人GN=CA9 PE=1 SV=2
通过下划线标记胞外域。
(4) C4.4a（NCBI参考序列NP_055215.2；同义词LYPD3）, SEQ ID NO: 216（346个氨基酸）:
>gi|93004088|ref|NP_055215.2|含ly6/PLAUR结构域的蛋白质3-前体[智人]
通过下划线标记成熟胞外域。
(5) CD52（NCBI参考序列NP_001794.2），SEQ ID NO: 217
>gi|68342030|ref|NP_001794.2| CAMPATH-1抗原前体[智人]
(6) Her2（NCBI参考序列NP_004439.2），SEQ ID NO: 218
>gi|54792096|ref|NP_004439.2|受体酪氨酸-蛋白质激酶erbB-2同种型a [智人]
(7) CD20（NCBI参考序列NP_068769.2），SEQ ID NO: 219
>gi|23110987|ref|NP_068769.2| B-淋巴细胞抗原CD20 [智人]
(8) 淋巴细胞活化抗原CD30 (SwissProt ID P28908), SEQ ID NO: 220
>gi|68348711|ref|NP_001234.2| 肿瘤坏死因子受体超家族成员8同种型1-前体 [智人]
(9) 淋巴细胞粘附分子CD22 (SwissProt ID P20273), SEQ ID NO: 221
>gi|157168355|ref|NP_001762.2| B-细胞受体CD22同种型1-前体 [智人]
(10) 髓系细胞表面抗原CD33 (SwissProt ID P20138), SEQ ID NO: 222
>gi|130979981|ref|NP_001763.3| 髓系细胞表面抗原CD33同种型1-前体 [智人]
(11) 跨膜糖蛋白NMB (SwissProt ID Q14956), SEQ ID NO: 223
>gi|52694752|ref|NP_001005340.1| 跨膜糖蛋白NMB同种型a-前体 [智人]
(12) 粘附分子CD56 (SwissProt ID P13591), SEQ ID NO: 224
>gi|94420689|ref|NP_000606.3|神经细胞粘附分子1同种型1 [智人]
(13) 表面分子CD70 (SwissProt ID P32970), SEQ ID NO: 225
>gi|4507605|ref|NP_001243.1| CD70抗原 [智人]
(14) 表面分子CD74 (SwissProt ID P04233), SEQ ID NO: 226
>gi|10835071|ref|NP_004346.1| HLA II类组织相容性抗原γ链同种型b [智人]
(15) B-淋巴细胞抗原CD19 (SwissProt ID P15391), SEQ ID NO: 227
>gi|296010921|ref|NP_001171569.1| B-淋巴细胞抗原CD19同种型1-前体 [智人]
(16) 表面蛋白粘蛋白-1 (SwissProt ID P15941), SEQ ID NO: 228
>gi|65301117|ref|NP_002447.4| 粘蛋白-1同种型1-前体 [智人]
(17) 表面蛋白CD138 (SwissProt ID P18827), SEQ ID NO: 229
>gi|29568086|ref|NP_002988.3|多配体聚糖-1-前体 [智人]
(18) 整合素αV (Genbank Accession No.: NP_002201.1), SEQ ID NO: 230
>gi|4504763|ref|NP_002201.1| 整合素α-V同种型1-前体 [智人]
(19) 畸胎瘤衍化生长因子1蛋白质TDGF1 (Genbank Accession No.: NP_003203.1),SEQ ID NO: 231
>gi|4507425|ref|NP_003203.1| 畸胎瘤衍化生长因子1同种型1-前体 [智人]
(20) 前列腺特异性膜抗原PSMA (Swiss Prot ID: Q04609), SEQ ID NO: 232
>gi|4758398|ref|NP_004467.1| 谷氨酸羧肽酶2同种型1 [智人]
(21) 酪氨酸蛋白激酶EPHA2 (Swiss Prot ID: P29317), SEQ ID NO: 233
>gi|32967311|ref|NP_004422.2| 肝配蛋白A型受体2-前体 [智人]
(22) 表面蛋白SLC44A4 (Genbank Accession No: NP_001171515), SEQ ID NO: 234
>gi|295849282|ref|NP_001171515.1|胆碱转运蛋白样蛋白质4同种型2 [智人]
(23) 表面蛋白BMPR1B (SwissProt: O00238)
(24) 转运蛋白SLC7A5 (SwissProt: Q01650)
(25) 上皮前列腺抗原STEAP1 (SwissProt: Q9UHE8)
(26) 卵巢癌抗原MUC16 (SwissProt: Q8WXI7)
(27) 转运蛋白SLC34A2 (SwissProt: O95436)
(28) 表面蛋白SEMA5b (SwissProt: Q9P283)
(29) 表面蛋白LYPD1 (SwissProt: Q8N2G4)
(30) 内皮素受体B型EDNRB (SwissProt: P24530)
(31) 环指蛋白RNF43 (SwissProt: Q68DV7)
(32) 前列腺癌相关蛋白STEAP2 (SwissProt: Q8NFT2)
(33) 阳离子通道TRPM4 (SwissProt: Q8TD43)
(34) 补体受体CD21 (SwissProt: P20023)
(35) B细胞抗原受体复合物相关蛋白CD79b (SwissProt: P40259)
(36) 细胞粘附抗原CEACAM6 (SwissProt: P40199)
(37) 二肽酶DPEP1 (SwissProt: P16444)
(38) 白介素受体IL20Rα (SwissProt: Q9UHF4)
(39) 蛋白聚糖BCAN (SwissProt: Q96GW7)
(40) 肝配蛋白受体EPHB2 (SwissProt: P29323)
(41) 前列腺干细胞相关蛋白PSCA (Genbank Accession No: NP_005663.2 )
(42) 表面蛋白LHFPL3 (SwissProt: Q86UP9)
(43) 受体蛋白TNFRSF13C (SwissProt: Q96RJ3)
(44) B细胞抗原受体复合物相关蛋白CD79a (SwissProt: P11912)
(45) 受体蛋白CXCR5 (SwissProt: P32302)
(46) 离子通道P2X5 (SwissProt: Q93086)
(47) 淋巴细胞抗原CD180 (SwissProt: Q99467)
(48) 受体蛋白FCRL1 (SwissProt: Q96LA6)
(49) 受体蛋白FCRL5 (SwissProt: Q96RD9)
(50) MHC II类分子Ia抗原HLA-DOB (Genbank Accession No: NP_002111.1)
(51) T细胞蛋白VTCN1 (SwissProt: Q7Z7D3)
(52) TWEAKR (SEQ ID NO:169 (蛋白质)；SEQ ID NO:170 (DNA).
(53) 淋巴细胞抗原CD37 (Swiss Prot: P11049)
(54) FGF受体2；FGFR2 (基因ID: 2263；基因名称: FGFR2)。 该FGFR2受体存在于不同的剪接变体（α、β、IIIb、IIIc）中。所有剪接变体都可充当靶分子；
(55) 跨膜糖蛋白B7H3 (CD276；基因ID: 80381)
(56) B细胞受体BAFFR (CD268；基因ID: 115650)
(57) 受体蛋白ROR 1 (基因ID: 4919)
(58) 表面受体IL3RA (CD123；基因ID: 3561)
(59) CXC趋化因子受体CXCR5 (CD185；基因ID 643)
(60) 受体蛋白合胞素(基因ID 30816)。
在本发明的一个优选主题中，该癌症靶分子选自癌症靶分子(1) – (60)，特别是(1)、(6)和(52)。
在本发明的另一特别优选的主题中，该结合体结合到选自癌症靶分子(1) –(60)，特别是(1)、(6)和(52)的细胞外癌症靶分子上。
在本发明的另一特别优选的主题中，该结合体特异性结合到选自癌症靶分子(1)– (60)，特别是(1)、(6)和(52)的细胞外癌症靶分子上。在一个优选实施方案中，该结合体在结合到靶细胞上的细胞外靶分子上后由于该结合而被靶细胞内化。这导致该结合体/活性物质偶联物（其可以是免疫偶联物或ADC）被靶细胞吸收。随后优选在细胞内，优选借助溶酶体加工该结合体。
在一个实施方案中，该结合体是结合蛋白。在一个优选实施方案中，该结合体是抗体、抗原结合抗体片段、多特异性抗体或拟抗体。
优选的拟抗体是亲和体、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers或纳米抗体。优选的多特异性抗体是双特异性和三特异性抗体。
在一个优选实施方案中，该结合体是抗体或抗原结合抗体片段，更优选分离的抗体或分离的抗原结合抗体片段。
优选的抗原结合抗体片段是Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双价抗体、DAb、线性抗体和scFv。特别优选的是Fab、双价抗体和scFv。
在一个特别优选的实施方案中，该结合体是抗体。特别优选的是单克隆抗体或其抗原结合抗体片段。更特别优选的是人、人源化或嵌合抗体或其抗原结合抗体片段。
结合癌症靶分子的抗体或抗原结合抗体片段可由本领域普通技术人员使用已知方法，例如化学合成或重组表达制备。癌症靶分子的结合体可以商业获得或可以由本领域普通技术人员使用已知方法，例如化学合成或重组表达制备。在WO 2007/070538（见第22页“抗体”）中描述了用于制备抗体或抗原结合抗体片段的其它方法。本领域技术人员知道所谓的噬菌体展示库（例如Morphosys HuCAL Gold）之类的方法可编制并可用于发现抗体或抗原结合抗体片段（参见WO 2007/070538，第24页及其后和第70页中的AK实施例1、第72页中的AK实施例2）。例如在第26页中（WO 2007/070538）描述了使用来自B细胞的DNA库制备抗体的其它方法。抗体的人源化方法描述在WO2007070538的第30-32页中并详细描述在Queen等人, Pros. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989或WO 90/0786中。此外，通常蛋白质，特别是抗体的重组表达方法是本领域技术人员已知的（参见例如Berger和Kimrnel(Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 第152卷,Academic Press, Inc.)；Sambrook等人 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Cold Spring Harbor, N.Y.；1989) 第1-3卷)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausabel等人 [编辑],Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc./John Wiley & Sons,Inc.)；Harlow等人 (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press (1988, Paul [编辑])；Fundamental Immunology,(Lippincott Williams & Wilkins (1998))；和Harlow等人 (Using Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998))。本领域技术人员知道蛋白质/抗体的表达所必需的相应载体、启动子和信号肽。常见方法也描述在WO 2007/070538第41-45页中。例如在WO 2007/070538第74页及其后的实施例6中描述了制备IgG1抗体的方法。能够测定抗体在结合到其抗原上后的内化的方法是技术人员已知的并例如描述在WO 2007/070538第80页中。本领域技术人员能够使用WO 2007/070538中描述的方法，其已用于与具有另外靶分子特异性的抗体的制备类似地制备碳酸酐酶IX (Mn)抗体。
抗-EGFR抗体
结合癌症靶分子EGFR的抗体的实例是西妥昔单抗（INN号7906）、帕尼单抗（INN号8499）和尼妥珠单抗（INN号8545）。西妥昔单抗（药物库登记号DB00002）是在SP2/0小鼠骨髓瘤细胞中产生并由ImClone Systems Inc/Merck KgaA/Bristol-Myers Squibb Co出售的嵌合抗-EGFR1抗体。西妥昔单抗适用于治疗具有野生型K-Ras基因的转移性、表达EGFR的结肠直肠癌。其具有10-10M的亲和力。
序列:
西妥昔单抗轻链(κ), SEQ ID NO: 235:
西妥昔单抗重链, SEQ ID NO: 236:
帕尼单抗（INN号8499）（药物库登记号DB01269）是特异性结合到人EGF受体1上并由Abgenix/Amgen出售的重组单克隆人IgG2抗体。帕尼单抗源自转基因小鼠（XenoMouse）的免疫接种。这些小鼠能够产生人免疫球蛋白（轻链和重链）。选择产生抗EGFR的抗体的特异性B细胞克隆，这一克隆系用CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）永生化。这些细胞现在用于生产100%人抗体。帕尼单抗被指示治疗对用氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康化疗耐受的表达EGFR的转移性结肠直肠癌。其具有10-11M的亲和力。
序列:
帕尼单抗轻链(κ), SEQ ID NO: 237:
帕尼单抗重链, SEQ ID NO: 238:
尼妥珠单抗（INN号8545）（EP 00586002、EP 00712863）是特异性结合到人EGF受体1上并由YM BioScienecs Inc. (Mississauga Canada)出售的人源化单克隆IgG1抗体。其在非分泌NSO细胞（哺乳动物细胞系）中产生。尼妥珠单抗被批准用于治疗头颈瘤、高度恶性的星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤（不在EU和US）和胰腺癌（Orphan drug, EMA）。其具有10-8M的亲和力。
尼妥珠单抗轻链, SEQ ID NO: 239:
尼妥珠单抗重链, SEQ ID NO: 240:
EGFR抗体的进一步实施方案如下：
●扎鲁木单抗/2F8/HuMax-EGFr，来自Genmab A/S (WO 02/100348、WO 2004/056847，INN号8605)
●Necitumumab/11F8, ImClone/IMC-11F8，来自ImClone Systems Inc. [Eli Lilly& Co] (WO 2005/090407 (EP 01735348-A1、US 2007/0264253-A1、US 7,598,350、WO2005/090407-A1)，INN号9083)
●马妥珠单抗/抗-EGFR MAb, Merck KGaA/抗-EGFR MAb, Takeda/EMD 72000/EMD-6200/EMD-72000和EMD-55900/MAb 425/单克隆抗体425，来自Merck KGaA/Takeda (WO 92/15683，INN号8103 (马妥珠单抗))
●RG-7160/GA-201/GA201/R-7160/R7160/RG7160/RO-4858696/RO-5083945/RO4858696/ RO5083945，来自Glycart Biotechnology AG (Roche Holding AG) (WO2010/112413-A1、WO 2010/115554)
●GT-MAB 5.2-GEX/CetuGEX，来自Glycotope GmbH (WO 2008/028686-A2 (EP01900750-A1、EP 01911766-A1、EP 02073842-A2、US 2010/0028947-A1)
●ISU-101，来自Isu Abxis Inc (ISU Chemical Co Ltd)/Scancell (WO 2008/004834-A1)
●ABT-806/mAb-806/ch-806/抗-EGFR单克隆抗体806，来自Ludwig Institute forCancer Research/Abbott/Life Science Pharmaceuticals (WO 02/092771、WO 2005/081854和WO 2009/023265)
●SYM-004 (由两种嵌合IgG1抗体(992和1024)构成) ，来自Symphogen A/S (WO2010/022736-A2)
●MR1-1/MR1-1KDEL，来自IVAX Corp (Teva Pharmaceutical Industries Ltd)(Duke University), (专利: WO2001/062931-A2)
●抗缺失突变体的抗体, EGFRvIII，来自Amgen/Abgenix (WO 2005/010151、US 7,628,986)
●SC-100，来自Scancell Ltd (WO 01/088138-A1)
●MDX-447/EMD 82633/BAB-447/H 447/MAb, EGFR, Medarex/Merck KgaA，来自Bristol-Myers Squibb (US)/Merck KGaA (DE)/Takeda (JP), (WO 91/05871、WO 92/15683)
●抗-EGFR-Mab，来自Xencor (WO 2005/056606)
●DXL-1218/抗-EGFR单克隆抗体(癌症), InNexus，来自InNexus BiotechnologyInc, Pharmaprojects PH048638。
在一个优选实施方案中，该抗-EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
在一个特别优选的实施方案中，该抗-EGFR抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab和马妥珠单抗。
本领域技术人员知道可用于由上述抗体的CDR区借助序列变异制备其它抗体的方法，这些其它抗体对靶分子具有类似或更好的亲和力和/或特异性。
在另一实施方案中，该抗-EGFR抗体或抗原结合抗体片段选自
包含下列抗体之一的轻链的三个CDR区和重链的三个CDR区的抗体或抗原结合抗体片段：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab、马妥珠单抗、RG-716、GT-MAB 5.2-GEX、ISU-101、ABT-806、SYM-004、MR1-1、SC-100、MDX-447和DXL-1218。
在另一实施方案中，该抗-EGFR抗体或抗原结合抗体片段选自
包含下列抗体之一的轻链的三个CDR区和重链的三个CDR区的抗体或抗原结合抗体片段：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、Necitumumab、马妥珠单抗。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-碳酸酐酶IX抗体
结合癌症靶分子碳酸酐酶IX的抗体的实例描述在WO 2007/070538-A2（例如权利要求1– 16）中。
在一个优选实施方案中，该抗-碳酸酐酶IX抗体或抗原结合抗体片段选自抗-碳酸酐酶IX抗体或抗原结合抗体片段3ee9（ WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (a)）、3ef2（WO2007/070538-A2中的权利要求4 (b)）、1e4（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (c)）、3a4（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (d)）、3ab4（WO 2007/070538-A2中的权利要求4(e)）、3ah10（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (f)）、3bb2（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (g)）、1aa1（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (h)）、5a6（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (i)）和5aa3（WO 2007/070538-A2中的权利要求4 (j)）。
抗-C4.4a抗体:
根据本发明，使用C4.4a抗体。
C4.4a抗体和抗原结合片段的实例描述在WO 2012/143499 A2中。WO 2012/143499A2的所有抗体经此引用并入本发明的说明书中，且它们可用于本发明。在WO 2012/143499A2的表1中给出这些抗体的序列，其中各行显示第1列中所列的抗体的可变轻链或可变重链的各自CDR氨基酸序列。
在一个实施方案中，该抗-C4.4a抗体或其抗原结合抗体片段在结合到表达C4.4a的细胞上后被该细胞内化。
在另一实施方案中，该抗-C4.4a抗体或抗原结合抗体片段包含WO 2012/143499A2的表1或WO 2012/143499 A2的表2中所列的抗体的至少一个、两个或三个CDR氨基酸序列。此类抗体的优选实施方案同样列在WO 2012/143499 A2中并经此引用并入本文。
抗-HER2抗体:
结合到癌症靶分子Her2上的抗体的一个实例是曲妥珠单抗（Genentech）。曲妥珠单抗是尤其用于治疗如乳腺癌的人源化抗体。
除曲妥珠单抗（INN 7637，CAS号: RN: 180288-69-1）和帕妥珠单抗（CAS号:380610-27-5）外，结合到HER2上的抗体的进一步实例是WO 2009/123894-A2、WO 200/8140603-A2或WO 2011/044368-A2中公开的抗体。抗-HER2偶联物的一个实例是曲妥珠单抗-Emtansine（INN号 9295）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD20抗体:
结合到癌症靶分子CD20上的抗体的一个实例是利妥昔单抗（Genentech）。利妥昔单抗（CAS号: 174722-31-7）是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗体。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD52抗体:
结合到癌症靶分子CD52上的抗体的一个实例是阿仑单抗（Genzyme）。阿仑单抗（CAS号:216503-57-0）是用于治疗慢性淋巴细胞白血病的人源化抗体。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-间皮素抗体:
抗-间皮素抗体的实例描述在例如WO 2009/068204中。WO 2009/068204中描述的所有抗体经此引用并入本说明书中，以使这些抗体可用于本文中公开的本发明。
根据本发明使用的抗-间皮素抗体也优选以不变结合到间皮素上为特征。不变结合的特征在于，例如，根据本发明使用的抗体结合到无法被其它胞外蛋白遮盖的间皮素的表位上。这种其它胞外蛋白是例如蛋白质卵巢癌抗原125（CA125）。优选使用的抗体的特征在于CA125不会阻断它们结合到间皮素上。
抗-CD30抗体
结合癌症靶分子CD30并可用于治疗癌症，例如霍奇金淋巴瘤的抗体的实例是Brentuximab、Iratumumab和WO 2008/092117、WO 2008/036688或WO 2006/089232中公开的抗体。抗-CD30偶联物的一个实例是Brentuximab Vedotin（INN 号 9144）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD22抗体
结合癌症靶分子CD22并可用于治疗癌症，例如淋巴瘤的抗体的实例是Inotuzumab和依帕珠单抗。抗-CD22偶联物的实例是Inotuzumab Ozagamycin（INN号 8574）或抗-CD22-MMAE和抗-CD22-MC-MMAE（CAS RN: 139504-50-0和474645-27-7）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD33抗体
结合癌症靶分子CD33并可用于治疗癌症，例如白血病的抗体的实例是吉妥珠单抗和林妥珠单抗（INN 7580）。抗-CD33偶联物的一个实例是吉妥珠单抗-Ozagamycin。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-NMB抗体
结合癌症靶分子NMB并可用于治疗癌症，例如黑素瘤或乳腺癌的抗体的一个实例是Glembatumumab（INN 9199）。抗-NMB偶联物的一个实例是Glembatumumab Vedotin（CAS RN:474645-27-7）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD56抗体
结合癌症靶分子CD56并可用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤、小细胞肺癌、MCC或卵巢癌的抗体的一个实例是Lorvotuzumab。抗-CD56偶联物的一个实例是LorvotuzumabMertansine（CAS RN: 139504-50-0）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD70抗体
结合癌症靶分子CD70并可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤或肾细胞癌的的抗体的实例公开在WO 2007/038637-A2和WO 2008/070593-A2中。抗-CD70偶联物的一个实例是SGN-75（CD70 MMAF）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD74抗体
结合癌症靶分子CD74并可用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤的抗体的一个实例是Milatuzumab。抗-CD74偶联物的一个实例是Milatuzumab-多柔比星（CAS RN: 23214-92-8）。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD19抗体
结合癌症靶分子CD19并可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤的抗体的一个实例公开在WO 2008/031056-A2中。抗-CD19偶联物其它抗体和的实例公开在WO 2008/047242-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-粘蛋白抗体
结合癌症靶分子粘蛋白-1并可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤的抗体的实例是Clivatuzumab或WO 2003/106495-A2、WO 2008/028686-A2中公开的抗体。抗-粘蛋白偶联物的实例公开在WO 2005/009369-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-CD138抗体
结合癌症靶分子CD138的抗体及其偶联物可用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤的实例公开在WO 2009/080829-A1、WO 2009/080830-A1中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-整合素-α V抗体
结合癌症靶分子整合素αV并可用于治疗癌症，例如黑素瘤、肉瘤或癌的抗体的实例是Intetumumab（CAS RN: 725735-28-4）、阿昔单抗（CAS RN: 143653-53-6）、Etaracizumab（CAS RN: 892553-42-3）或US 7,465,449、EP 719859-A1、WO 2002/012501-A1或WO2006/062779-A2中公开的抗体。抗-整合素ΑV偶联物的实例是Intetumumab-DM4和WO 2007/024536-A2中公开的其它ADC。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-TDGF1抗体
结合癌症靶分子TDGF1并可用于治疗癌症的抗体的实例是WO 02/077033-A1、US 7,318,924、WO 2003/083041-A2和WO 2002/088170-A2中公开的抗体。抗-TDGF1偶联物的实例公开在WO 2002/088170-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-PSMA抗体
结合癌症靶分子PSMA并可用于治疗癌症，例如前列腺癌的抗体的实例是WO 97/35616-A1、WO 99/47554-A1、WO 01/009192-A1和WO2003/034903中公开的抗体。抗-PSMA偶联物的实例公开在WO 2009/026274-A1和WO 2007/002222中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-EPHA2抗体
结合癌症靶分子EPHA2并可用于制备偶联物和用于治疗癌症的的抗体的实例公开在WO2004/091375-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-SLC44A4抗体
结合癌症靶分子SLC44A4并可用于制备偶联物和用于治疗癌症，例如胰腺或前列腺癌的抗体的实例公开在WO2009/033094-A2和US2009/0175796-A1中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-HLA-DOB抗体
结合到癌症靶分子HLA-DOB上的抗体的一个实例是可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤的抗体Lym-1（CAS RN: 301344-99-0）。抗-HLA-DOB偶联物的实例公开在例如WO 2005/081711-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-VTCN1抗体
结合癌症靶分子VTCN1并可用于制备偶联物和用于治疗癌症，例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌或乳腺癌的抗体的实例公开在WO 2006/074418-A2中。这些抗体及其抗原结合片段经此引用并入本文，且它们可用于本发明。
抗-FGFR2抗体
根据本发明，可使用抗-FGFR2抗体。
抗-FGFR2抗体和抗原结合片段的实例描述在WO2013076186中。WO2013076186的所有抗体经此引用并入本发明的说明书中，且它们可用于本发明。在WO2013076186的表9和表10中显示这些抗体的序列。优选的是衍生自被称作M048-D01和M047-D08的抗体的抗体、抗原结合片段和抗体变体。优选的抗-FGFR2结合到被称作FGFR2的各种剪接变体上。
在一个实施方案中，该抗-FGFR2抗体或其抗原结合抗体片段在结合到表达FGFR2的细胞上后被该细胞内化。
在另一实施方案中，该抗-FGFR2抗体或抗原结合抗体片段包含WO2013076186的表9或表10中所列的抗体的至少一个、两个或三个CDR氨基酸序列。此类抗体的优选实施方案同样列在WO2013076186中并经此引用并入本文。
抗-TWEAKR抗体
在一个优选实施方案中，当在本发明的方法中使用抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段时，这一种或多种抗体或片段选自下述那些。此外，结合到TWEAKR上的抗体是本领域技术人员已知的，参见例如WO2009/020933(A2)或WO2009140177 (A2)。
本发明特别涉及含有导致TWEAKR（SEQ ID NO:169 (蛋白质)；SEQ ID NO:170(DNA)）的强活化的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体的偶联物，以致强诱发过表达TWEAKR的各种癌细胞中的细胞凋亡。
已描述的抗-TWEAKR抗体（例如PDL-192）在诱发细胞凋亡和抑制增殖方面的TWEAKR激动活性有限并且没有达到内源性配体TWEAK的效力。激动活性的这种欠缺不是基于降低的亲和力，因为这些抗体以与内源性配体TWEAK相比在类似范围内的亲和力结合到TWEAKR上（Michaelson JS等人, MAbs. 2011年7月-8月；3(4):362-75；Culp PA等人, ClinCancer Res. 2010年1月15日；16(2):497-508），且甚至具有更高结合亲和力的抗体也不一定表现出更有效的信号活性（Culp PA等人， Clin Cancer Res. 2010年1月15日；16(2):497-508）。此外，已经表明，已描述的抗体的抗肿瘤活性取决于Fc效应子功能，并且表明ADCC对小鼠模型中的体内效力起到重要作用。
抗-TWEAKR抗体的生成
利用完整的人抗体噬菌体库（Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005；23(3):344-8），以通过使用人和小鼠TWEAKR的二聚Fc融合胞外域作为固定化靶的蛋白质筛选（Panning）分离本发明的TWEAKR特异性人单克隆抗体（Hoogenboom H.R., Nat Biotechnol 2005；23(3):1105-16）。识别11种不同的Fab噬菌体，并将相应的抗体克隆到提供可溶性FAb中缺失的CH2-CH3结构域的哺乳动物EgG表达载体上。在识别优选抗体后，这些作为全长IgG表达。这些构建体如Tom等人, Methods Express中的第12章: Expression Systems，Micheal R.Dyson和Yves Durocher编辑, Scion Publishing Ltd, 2007（参见AK-实施例1）所述例如在哺乳动物细胞中短暂表达。该抗体通过蛋白质-A色谱法纯化并进一步使用如AK-实施例2中所述的ELISA和BIAcore分析通过它们与可溶性单体TWEAKR的结合亲和力表征。为了测定抗-TWEAKR抗体的细胞结合特征，在许多细胞系（HT29、HS68、HS578）上通过流式细胞术测试结合。进行NFκB报告基因检测以检查识别的所有11种抗体（人IgG1）的激动活性。选择具有最高体外效力的抗体（TPP-883）进行进一步的效力和亲和力成熟（细节参见AK-实施例1）。检测具有改进的激动活性的单取代变体：CDR-H3的G102T。最后，基于与最佳单取代变体G102T相比提高的亲和力选择7种变体。将其相应的DNA克隆到哺乳动物IgG表达载体中并在上文提到的NF-κB报告基因检测中检查功能活性。最后，将所得序列与人生殖系序列相比较，并且修改对亲和力和效力没有显著影响的偏差。通过抗体库筛选和通过亲和力和/或效力成熟获得下列抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”和“TPP-1858”。
本发明的抗体还可通过本领域中已知的方法，如抗体噬菌体展示筛选（参见例如Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005；23(3):344-8）、已确立的杂交瘤技术（参见例如Köhler和Milstein Nature. 1975年8月7日；256(5517):495-7）或小鼠免疫接种，尤其是hMAb小鼠（例如VelocImmune mouse®）的免疫接种获得。
抗-TWEAKR抗体的特定实施方案
本发明的一个实施方案是提供在一个或多个表达TWEAKR的细胞系中表现出半胱天冬酶3/7的强诱导的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。在一个优选实施方案中，所述一个或多个表达TWEAKR的细胞系包含于由WiDr、A253、NCI-H322、HT29和786-O构成的组中。可通过本领域中已知的常规方法，包括本文所述的那些测量“半胱天冬酶3/7的诱导”。在一个实施方案中，根据本发明通过用半胱天冬酶3/7溶液（Promega, #G8093）测定活性和在VICTORV (Perkin Elmer)上读取发光来测定“半胱天冬酶3/7的诱导”。在培养时间结束时，测定半胱天冬酶3/7活性并与未处理的细胞比较测定半胱天冬酶3/7的诱导系数。当诱导系数大于1.2，优选大于1.5，再更优选大于1.8，再更优选大于2.1，再更优选大于2.5时，抗体被描述为表现出半胱天冬酶3/7的“强诱导”。提供与已描述的激动性抗体 [例如PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)、136.1(TPP-2194)]相比以及与300 ng/ml重组人TWEAK相比导致HT29细胞中的半胱天冬酶3/7的更强诱导的抗-TWEAKR抗体。在WiDr、A253, NIC-H322和786-O细胞中也观察到诱导癌细胞中的半胱天冬酶3/7的这种强效力，其中在大多数实验中，检查的本发明的抗体与参考抗体[PDL-192(TPP-1104)、P4A8(TPP-1324)]和与300 ng/ml TWEAK相比诱发更高的变化系数。本发明的一些抗体仅以明显低于内源性配体TWEAK的亲和力并且也低于其它已知的激动性抗体的中等亲和力（>10 nM）结合到TWEAKR上。这种性质提供进一步的可能优点，例如可能更深渗入肿瘤中。
在这方面，本发明的一个实施方案是提供在新型表位特异性结合到TWEAKR上的抗体或其抗原结合抗体片段，其特征在于选择性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169；也见图1）的位置47（D47）处的天冬氨酸（D）上。对用于抗体相互作用的某些TWEAKR氨基酸识别的依赖性与对这些抗体测定的激动活性相关联。天然配体TWEAK表现出TWEAKR的有效活化并依赖于TWEAKR的富含半胱氨酸结构域中的亮氨酸46结合（Pellegrini等人, FEBS 280:1818-1829）。P4A8表现出极低激动活性并至少部分与TWEAKR的富含半胱氨酸结构域外的结构域相互作用。PDL-192表现出中等激动活性并依赖于R56结合到富含半胱氨酸的结构域上，但在TWEAK配体位点对面。本发明的抗体（例如TPP-2090）依赖于D47结合，且TWEAK依赖于L46结合。因此，TWEAK结合到类似但不同的结合位点上（图7）。因此，表现出强激动活性的本发明的抗体结合到与极高激动活性相关的抗体的新表位（D47依赖性）上。
TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的氨基酸（D47）被认为对根据本发明的抗体的结合至关重要，这意味着当该抗体如AK-实施例2和图6中所述通过将其残基改变成丙氨酸而损失其ELISA信号的多于20%、或多于30%、或多于40%、或多于50%、或多于60%、或多于70%、或多于80%、或多于90%、或100%时，该抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的D（D47）上。或者，当该抗体与TPP-2203相比损失其对TPP-2614的ELISA信号的多于20%、或多于30%、或多于40%、或多于50%、或多于60%、或多于70%、或多于80%、或多于90%、或100%时，抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的D（D47）上。优选地，当该抗体与TPP-2203相比损失其对TPP-2614的ELISA信号的多于80%时，抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的D（D47）上。
在本申请中，参考如下表中所示的本发明的下列优选抗体：“TPP-2090”、“TPP-2149”、“TPP-2093”、“TPP-2148”、“TPP-2084”、“TPP-2077”、“TPP-1538”、“TPP-883”、“TPP-1854”、“TPP-1853”、“TPP-1857”、“TPP-1858”。
TPP-2090是：包含对应于SEQ ID NO: 2的重链区和对应于SEQ ID NO: 1的轻链区的抗体。
TPP-2149是：包含对应于SEQ ID NO: 12的重链区和对应于SEQ ID NO: 11的轻链区的抗体。
TPP-2093是：包含对应于SEQ ID NO: 22的重链区和对应于SEQ ID NO: 21的轻链区的抗体。
TPP-2148是：包含对应于SEQ ID NO: 32的重链区和对应于SEQ ID NO: 31的轻链区的抗体。
TPP-2084是：包含对应于SEQ ID NO: 42的重链区和对应于SEQ ID NO: 41的轻链区的抗体。
TPP-2077是：包含对应于SEQ ID NO: 52的重链区和对应于SEQ ID NO: 51的轻链区的抗体。
TPP-1538是：包含对应于SEQ ID NO: 62的重链区和对应于SEQ ID NO: 61的轻链区的抗体。
TPP-883是：包含对应于SEQ ID NO: 72的重链区和对应于SEQ ID NO: 71的轻链区的抗体。
TPP-1854是：包含对应于SEQ ID NO: 82的重链区和对应于SEQ ID NO: 81的轻链区的抗体。
TPP-1853是：包含对应于SEQ ID NO: 92的重链区和对应于SEQ ID NO: 91的轻链区的抗体。
TPP-1857是：包含对应于SEQ ID NO: 102的重链区和对应于SEQ ID NO: 101的轻链区的抗体。
TPP-1858是：包含对应于SEQ ID NO: 112的重链区和对应于SEQ ID NO: 111的轻链区的抗体。
TPP-2090是：包含对应于SEQ ID NO: 10的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 9的轻链可变区的抗体。
TPP-2149是：包含对应于SEQ ID NO: 20的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 19的轻链可变区的抗体。
TPP-2093是：包含对应于SEQ ID NO: 30的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 29的轻链可变区的抗体。
TPP-2148是：包含对应于SEQ ID NO: 40的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 39的轻链可变区的抗体。
TPP-2084是：包含对应于SEQ ID NO: 50的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 49的轻链可变区的抗体。
TPP-2077是：包含对应于SEQ ID NO: 60的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 59的轻链可变区的抗体。
TPP-1538是：包含对应于SEQ ID NO: 70的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 69的轻链可变区的抗体。
TPP-883是：包含对应于SEQ ID NO: 80的重链可变区和对应于的SEQ ID NO: 79轻链可变区的抗体。
TPP-1854是：包含对应于SEQ ID NO: 90的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 89的轻链可变区的抗体。
TPP-1853是：包含对应于SEQ ID NO: 100的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 99的轻链可变区的抗体。
TPP-1857是：包含对应于SEQ ID NO: 110的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 109的轻链可变区的抗体。
TPP-1858是：包含对应于SEQ ID NO: 120的重链可变区和对应于SEQ ID NO: 119的轻链可变区的抗体。
抗-TWEAKR抗体的优选实施方案是下列那些：
1. 特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47处的D（D47）上的抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段。
2. 根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体是激动性抗体。
3. 根据实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段，其包含：
可变重链，其包含：
(a) 由包含式PYPMX的氨基酸序列(SEQ ID NO: 171)编码的重链的CDR1，其中X是I或M；
(b) 由包含式YISPSGGXTHYADSVKG的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172)编码的重链的CDR2，其中X是S或K；和
(c) 由包含式GGDTYFDYFDY的氨基酸序列(SEQ ID NO: 173)编码的重链的CDR3；
和可变轻链，其包含：
(a) 由包含式RASQSISXYLN的氨基酸序列(SEQ ID NO: 174)编码的轻链的CDR1，其中X是G或S；
(b) 由包含式XASSLQS的氨基酸序列(SEQ ID NO: 175)编码的轻链的CDR2，其中X是Q、A或N；和
(c) 由包含式QQSYXXPXIT的氨基酸序列(SEQ ID NO: 176)编码的轻链的CDR3，其中位置5的X是T或S，位置6的X是T或S且位置8的X是G或F。
4. 根据前述实施方案任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a. 包含如SEQ ID NO: 6中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 7中所示的重链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO: 8中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 3中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 4中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO: 5中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
b. 包含如SEQ ID NO: 16中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 17中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:18中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 13中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 14中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:15中所示的轻链的可变CDR3序列可变轻链或
c. 包含如SEQ ID NO: 26中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 27中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:28中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 23中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 24中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:25中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
d. 包含如SEQ ID NO: 36中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 37中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:38中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 33中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 34中所示的轻链的可变CDR2序列和SEQ ID NO:35中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
e. 包含如SEQ ID NO: 46中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 47中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:48中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 43中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 44中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:45中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
f. 包含如SEQ ID NO: 56中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 57中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:58中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 53中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 54中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:55中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
g. 包含如SEQ ID NO: 66中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 67中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:68中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 63中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 64中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:65中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
h. 包含如SEQ ID NO: 76中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 77中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:78中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 73中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 74中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:75中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
i. 包含如SEQ ID NO: 86中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 87中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:88中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 83中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 84中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:85中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
j. 包含如SEQ ID NO: 96中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 97中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:98中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 93中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 94中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:95中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
k. 包含如SEQ ID NO: 106中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 107中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:108中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 103中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 104中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:105中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链或
l. 包含如SEQ ID NO: 116中所示的重链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 117中所示的重链的可变CDR2序列、如SEQ ID NO:118中所示的重链的可变CDR3序列的可变重链，以及
包含如SEQ ID NO: 113中所示的轻链的可变CDR1序列、如SEQ ID NO: 114中所示的轻链的可变CDR2序列和如SEQ ID NO:115中所示的轻链的可变CDR3序列的可变轻链。
5. 根据前述实施方案任一项的抗体或其抗原结合片段，其包含：
a. 如SEQ ID NO:10中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:9中所示的轻链的可变序列，或
b. 如SEQ ID NO:20中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:19中所示的轻链的可变序列，或
c. 如SEQ ID NO:30中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:29中所示的轻链的可变序列，或
d. 如SEQ ID NO:40中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:39中所示的轻链的可变序列，或
e. 如SEQ ID NO:50中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:49中所示的轻链的可变序列，或
f. 如SEQ ID NO:60中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:59中所示的轻链的可变序列，或
g. 如SEQ ID NO:70中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:69中所示的轻链的可变序列，或
h. 如SEQ ID NO:80中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:79中所示的轻链的可变序列，或
i. 如SEQ ID NO:90中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:89中所示的轻链的可变序列，或
j. 如SEQ ID NO:100中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:99中所示的轻链的可变序列，或
k. 如SEQ ID NO:110中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:109中所示的轻链的可变序列，或
l. 如SEQ ID NO:120中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:119中所示的轻链的可变序列。
6. 根据前述实施方案任一项的抗体，其是IgG抗体。
7. 根据前述实施方案任一项的抗体，其包含：
a. 如SEQ ID NO:2中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:1中所示的轻链的序列，或
b. 如SEQ ID NO:12中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:11中所示的轻链的序列，或
c. 如SEQ ID NO:22中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:21中所示的轻链的序列，或
d. 如SEQ ID NO:32中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:31中所示的轻链的序列，或
e. 如SEQ ID NO:42中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:41中所示的轻链的序列，或
f. 如SEQ ID NO:52中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:51中所示的轻链的序列，或
g. 如SEQ ID NO:62中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:61中所示的轻链的序列，或
h. 如SEQ ID NO:72中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:71中所示的轻链的序列，或
i. 如SEQ ID NO:82中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:81中所示的轻链的序列，或
j. 如SEQ ID NO:92中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:91中所示的轻链的序列，或
k. 如SEQ ID NO:102中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:101中所示的轻链的序列，或
l. 如SEQ ID NO:112中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:111中所示的轻链的序列。
8. 根据前述实施方案任一项的抗原结合片段或根据前述实施方案任一项的抗体的抗原结合片段，其是scFv、Fab、Fab ̓片段或F(ab ̓ )2片段。
9. 根据前述实施方案任一项的抗体或抗原结合片段，其是单克隆抗体或其抗原结合片段。
10. 根据前述实施方案任一项的抗体或抗原结合片段，其是人、人源化或嵌合抗体或抗原结合片段。
特别优选的是抗-TWEAKR抗体TPP-2090。
同位素、 盐、 溶剂合物、 同位素变体
本发明还包括本发明的化合物的所有合适的同位素变体。本发明的化合物的同位素变体在此被理解为是指本发明的化合物内的至少一个原子已被具有相同原子序数但原子质量不同于自然界中通常或主要存在的原子质量的另一原子替换的化合物。可并入本发明的化合物中的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，如2H（氘）、3H（氚）、13C、14C、15N、17O、18O、32P、33P、33S、34S、35S、36S、18F、36Cl、82Br、123I、124I、129I和131I。本发明的化合物的特定同位素变体，尤其是其中已并入一种或多种放射性同位素的那些，可能有益于例如检查作用机制或体内的活性物质分布；由于比较容易制备和检测，用3H或14C同位素标记的化合物尤其适用于此用途。此外，同位素，例如氘的并入可由于该化合物的更大代谢稳定性而带来特定治疗益处，例如体内半衰期的延长或所需活性剂量的降低；本发明的化合物的此类改性因此任选也构成本发明的优选实施方案。可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过下述方法和实施例中描述的程序、通过使用各自的试剂和/或起始化合物的相应同位素改性制备本发明的化合物的同位素变体。
本发明中优选的盐是本发明的化合物的生理可接受盐。还包括本身不适合药物用途但可例如用于本发明的化合物的分离或提纯的盐。
本发明的化合物的生理可接受盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。
本发明的化合物的生理可接受盐还包括常规碱的盐，例如和优选碱金属盐（例如钠和钾盐）、碱土金属盐（例如钙和镁盐）和由氨或具有1至16个碳原子的有机胺，例如和优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2-乙二胺生成的铵盐。
溶剂合物在本发明中被描述为以固态或液态通过与溶剂分子配位而形成络合物的本发明的化合物的那些形式。水合物是溶剂合物的一种特定形式，其中与水发生配位。本发明中优选的溶剂合物是水合物。
此外，本发明还包括本发明的化合物的前药。术语“前药”在此是指本身在生物学上有活性或无活性但其在体内停留期间（例如通过代谢或水解方式）转化成本发明的化合物的化合物。
特定实施方案
下列实施方案特别优选：
实施方案A:
下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中KSP-L-是下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)或下式(IIf)的化合物，该结合体是抗-TWEAKR抗体（特别优选是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，尤其是抗-TWEAK R抗体TPP-2090），且n是1至10的数值：
式(IIf):
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A代表CO（羰基）；
R1代表–L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ''(CH2)1-3 NH2和–CONZ''CH2COOH，其中Z''代表H或NH2；
R2和R4代表H或–L-#1，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表-CH2-CHR10-或–CHR10-CH2-，其中R10代表H或–L-#1；
R3代表–L-#1或C1-10-烷基-，其可任选被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2（其中烷基优选是C1-3-烷基）取代；
R5代表–L-#1、H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、（任选氟代的）C1-3-烷基、（任选氟代的）C2-4-烯基、（任选氟代的）C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表可被–L-#1取代的支化的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10之一代表–L-#1，且
–L-代表连接体且#1代表与抗体的键。
该连接体优选是连接体
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m是0或1；
§代表连向KSP的键且
§§代表连向抗体的键，且
L2代表
其中
#1是指与抗体的硫原子的连接点，
#2是指与基团L1的连接点，
且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-或；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
在此，#1是连向KSP抑制剂的键且#2是连向与结合体的偶联基团（例如L2）的键。
实施方案B:
下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中KSP-L-是下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)或下式(IIg)的化合物，该结合体是抗体且n是1至10的数值：
式(IIg):
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A代表CO（羰基）；
R1代表–L-#1、H、-COOH、-CONHNH2、-(CH2)1-3NH2、-CONZ''(CH2)1-3 NH2和–CONZ''CH2COOH，其中Z''代表H或NH2；
R2和R4代表H或–L-#1，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表-CH2-CHR10-或–CHR10-CH2-，其中R10代表H或–L-#1；
R3代表–L-#1或C1-10-烷基-，其可任选被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2（其中烷基优选是C1-3-烷基）取代；
R5代表–L-#1、H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、（任选氟代的）C1-3-烷基、（任选氟代的）C2-4-烯基、（任选氟代的）C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支化的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中取代基R1、R2、R3、R4、R5和R10之一代表–L-#1，且
–L-代表连接体且#1与连向抗体的键，
其中–L-由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m是0或1；
§代表连向KSP的键且
§§代表连向抗体的键，且
L2代表
其中
#1是指与抗体的硫原子的连接点，
#2代表与基团L1的连接点，
且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-或；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
#1是连向KSP抑制剂的键且#2是连向与抗体的偶联基团（例如L2）的键。
实施方案C:
下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中KSP-L-是具有下示亚结构I(sub)的化合物，该结合体是抗-TWEAKR抗体（特别优选特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，尤其是抗-TWEAK R抗体TPP-2090）、抗-HER2抗体或抗-EGRF抗体（优选尼妥珠单抗），且n是1至10的数值：
其中
#a代表与所述分子剩余部分的键；
R1a代表-L-#1、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0- 3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-L-#1、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表-L-#1、H、NH2、COOH、SO3H、SH或OH，且其中Z代表-H、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
其中取代基R1a、R2a、R4a或R10之一代表–L-#1，
–L-代表连接体且#1代表与抗体的键，
其中–L-由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m是0或1；
§代表连向KSP的键且
§§代表连向抗体的键，且
L2代表
其中
#1是指与抗体的硫原子的连接点，
#2代表与基团L1的连接点，
且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-或；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
#1是连向KSP抑制剂的键且#2是连向与抗体的偶联基团（例如L2）的键。
实施方案D:
下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中KSP-L-是下式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或下式(IIh)的化合物，该结合体是抗体且n是1至10的数值：
式(IIh):
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
A代表CO（羰基）；
R1代表–L-#1；
R2和R4代表H，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表-CH2-CHR10-或–CHR10-CH2-，其中R10代表H；
R3代表可任选被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2或NH2（其中烷基优选是C1-3-烷基）取代的C1-10-烷基-，或–MOD；
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH；
R5代表H或F；
R6和R7彼此独立地代表H、（任选氟代的）C1-3-烷基、（任选氟代的）C2-4-烯基、（任选氟代的）C2-4-炔基、羟基或卤素；
R8代表支化的C1-5-烷基；且
R9代表H或F，
其中–L-代表连接体且#1代表与抗体的键，
其中–L-由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m是0或1；
§代表与KSP的键且
§§代表与抗体的键，且
L2代表
其中
#1是指连向抗体的硫原子的连接点，
#2代表连向基团L1的连接点,
且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-或；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
#1是连向KSP抑制剂的键且#2是连向与抗体的偶联基团（例如L2）的键。
实施方案E:
下式的ADC和该ADC的盐、溶剂合物和溶剂合物的盐
其中KSP-L-是具有下示亚结构I(sub)的化合物，该结合体是Nimutuzumab且n是1至10的数值：
其中
#a代表与所述分子剩余部分的键；
R1a代表-L-#1、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0- 3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-L-#1、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表-L-#1, H、NH2、COOH、SO3H、SH或OH，且其中Z代表-H、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
其中取代基R1a、R2a、R4a或R10之一代表–L-#1，
–L-代表连接体且#1代表与抗体的键，
其中–L-由下式表示
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m是0或1；
§代表连向KSP的键且
§§代表连向抗体的键，且
L2代表
其中
#1是指与抗体的硫原子的连接点，
#2是指与基团L1的连接点，
且L1由下式表示
#1–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-或；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
#1是连向KSP抑制剂的键且#2是连向与抗体的偶联基团（例如L2）的键。
在这一实施方案中，KSP-L-特别优选具有下式(IIi)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
式(IIi):
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C
（其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N是优选的）；
R1代表H、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2代表H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R4代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，优选H，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-#1，
R5代表H、NH2、NO2、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0- 3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团的每个可被–OH、CO2H或NH2取代；
L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。
实施方案F:
下列通式的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C，或X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
R1代表H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
实施方案G:
本发明还提供下列通式的结合体/活性物质：
其中BINDER代表结合体（优选：抗体）或其衍生物（优选：半胱氨酸残基），优选抗体，L代表连接体，WS代表活性物质，优选KSP抑制剂，例如式(II)、(IIa)、(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)、(IIf)、(IIg)或(IIh)之一的根据本发明的KSP抑制剂，m代表1至2的数值，优选1，且n代表1至50，优选1.2至20，特别优选2至8的数值，其中L具有下列结构之一。在此，m是每连接体的活性物质分子数量且n是每BINDER的活性物质/连接体偶联物数量的平均值。偶联物分子中存在的所有WS的总和因此是m和n的乘积。
WS是在动物中，优选在人类中具有局部或全身治疗作用的活性物质。这些活性物质通常具有低于5 kDa，优选低于1.5 kDa的分子量。优选的活性物质是抗增殖物质，例如细胞毒性或细胞生长抑制物质。优选的活性物质是细胞毒性物质、血管生成抑制剂、细胞周期抑制剂、PI3激酶或m-TOR抑制剂、MAPK信号级联通路的抑制剂、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂、PARP抑制剂、Wnt/Hedgehog信号级联通路抑制剂和RNA聚合酶抑制剂。细胞毒性物质尤其是DNA结合或嵌入物质、DNA-烷基化物质、微管蛋白稳定物质或去稳定物质、铂化合物和拓扑异构酶I抑制剂。示例性的DNA结合物质是例如蒽环类，如多柔比星或柔红霉素。示例性DNA-烷基化物质是例如刺孢霉素、替莫唑胺或环磷酰胺和衍生物。示例性微管蛋白稳定物质或去稳定物质是例如紫杉烷类，如紫杉醇、多西紫杉醇、Maytansinoide和Auristatine、Tubulysine、长春花生物碱、埃博霉素及其衍生物。Maytansinoide的实例是Maytansin、美登醇、DM-1和DM-4（参见例如美国专利US5208020）。Auristatine的实例是Auristatin E、Monomethylauristatin E (MMAE)、Auristatin F、Monomethylauristatin F (MMAF)和Dolastin（尤其参见WO 09/117531、WO 2005/081711、WO 04/010957；WO02/088172或WO01/24763）。长春花生物碱的实例是长春新碱和长春碱。埃博霉素的实例是埃博霉素A、B、C、D、E或F（尤其参见WO 98/13375；WO2004/005269；WO 2008/138561；WO 2009/002993；WO 2009/055562；WO 2009/012958；WO2009/026177；WO 2009/134279；WO 2010/033733；WO2010/034724；WO 2011/017249；WO2011/057805）。铂化合物的实例是顺铂和卡铂。拓扑异构酶I抑制剂的实例是喜树碱和衍生物。血管生成抑制剂的实例是MetAP2抑制剂，例如烟曲霉醇。细胞周期抑制剂的实例是CDK抑制剂（例如BMS-387032或PD0332991）、Rho激酶抑制剂，例如GSK429286、PLK抑制剂，例如Volasertib、极光激酶抑制剂，例如AZD1152或MLN805Z。MAPK信号级联通路的抑制剂的实例尤其是MEK抑制剂（例如PD0325901）、Ras抑制剂、JNK抑制剂、B-Raf抑制剂（例如SB590885）或p38 MAPK抑制剂（例如SB202190）。HDAC抑制剂的实例是Belinostat和Givinostat。PARP抑制剂的实例是Iniparib和奥拉帕尼。RNA聚合酶抑制剂的实例是鹅膏毒素，例如α-Amantin、鹅膏素和鹅膏无毒环肽（Amanullin）。特别优选的活性物质是长春花生物碱、Auristatine、Maytansinoide、Tubulysine、Duocarmycine、激酶抑制剂、MEK抑制剂和KSP抑制剂。
在此，L代表下式A3或A4之一
其中#1是指与结合体的硫原子的连接点，#2是指与活性物质的连接点，x代表1或2，且R22代表COOH、COOR、COR（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH2、Br，优选COOH。
L1具有与上文相同的含义。-L1-#2优选由下式表示：
#3–(NR10)n-(G1)o-G2-#2
其中
#3是指与氮原子的连接点，
R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表NHCO或，则R10不代表NH2），
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）和/或具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
G2中的进一步的中断基团优选是
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上特别优选作为式A3或A4的两种结构之一存在连向结合体的半胱氨酸残基的键。
含式A3或A4的连接体的偶联物可通过将结合体偶联到下式A3'和A4'的相应溴衍生物上获得：
式A3'或A4'的这些溴衍生物可通过如下列图式30至32中示例性所示使HOOCCH2CHBrCOOR22或HOOCCHBrCH2COOR22与结合体的胺基反应获得。
图式30:
[a): 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP), DCM, 吡啶, RT；b) 氯化锌, 三氟乙醇,50℃, EDTA；c) 3-4当量TCEP, PBS缓冲液；d] PBS缓冲液, 20h RT.]
图式31:
[a): 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP), DCM, 吡啶, RT；b) 氯化锌, 三氟乙醇,50℃, EDTA；c) 3-4当量TCEP, PBS缓冲液；d) PBS缓冲液, 20h RT.]
实施方案H:
本发明还提供下列通式的结合体/活性物质：
其中BINDER代表结合体（优选：抗体）或其衍生物（优选：半胱氨酸残基），优选抗体，L代表连接体，WS代表活性物质，优选KSP抑制剂，例如式(II)、(IIa)、(III)或(IIIa)之一的根据本发明的KSP抑制剂，m代表1至2的数值，优选1，且n代表1至50，优选1.2至20，特别优选2至8的数值，其中L具有下列结构之一。在此，m是每连接体的活性物质分子数量且n是每BINDER的活性物质/连接体偶联物数量的平均值。偶联物分子中存在的所有WS的总和因此是m和n的乘积。
在此，L代表：
其中#1是指与结合体的硫原子的连接点，#2是指与活性物质的连接点，且R22代表COOH、COOR、COR（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH2、Br，优选COOH。与结合体的硫原子的键因此可具有下列结构之一：
在每活性物质/结合体偶联物含有多于一个活性物质分子 WS的活性物质/结合体偶联物的情况下，根据式A1和/或A2的两种结构都可存在于活性物质/结合体偶联物中。由于本发明的活性物质/结合体偶联物可以是不同活性物质/结合体偶联物的混合物，这种混合物也可以包含式A1或式A2的活性物质/结合体偶联物，和式A1和A2的活性物质/结合体偶联物。
L5是选自-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-的基团，其中m、n、o、p和q彼此独立地具有下列值：m=0-10；n=0或1；o=0-10；p=0或1；和q=0-10，其中m+n+o=1-15，优选1-6。X代表5或6元芳族或非芳族杂环或碳环，优选–C6H4-或-C6H10-。RS代表酸基，优选-COOH或SO3H。
L6是选自–CONH-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCOO-、或的基团，其中r是1、2或3。
L7是单键或选自具有1至100（优选1至10）个碳原子的直链或支化的烃链的基团，所述烃链来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）和/或具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的3至10元，优选5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
L5优选是基团-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m=1-3，n=0，o=0-7，p=0且q=0或1。特别优选的是基团-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-，其中m=1或2，n=0，o=0或1，p=0和q=0或1。
L6优选是选自–CONH-和-NHCO-的基团。
L7优选是单键或–[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
其中
w = 0至20；
x = 0至5；
y = 0或1；
z = 1至5；且
X4代表–O-、-CONH-、–NHCO-或。
L7特别优选是单键或基团–[(CH2)x-NHCO-]]，其中x = 1至5。
–L5-L6-L7-特别优选代表-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-NHCO-[(CH2)x-NHCO-]]，其中m=1或2，n=0，o=0或1，p=0，且q=0或1，且x=1-5。
但是，这两种结构也可以共同存在于本发明的偶联物中。
根据本发明，这些结合体/活性物质偶联物可由下式的化合物制备
其中L具有下式A'：
优选通过在具有7.5至8.5，优选8的pH的pH缓冲液中在低于37℃，优选10至25℃的温度下搅拌最多40小时，优选1至15小时而将A'转化成A。
实施方案I:
下式的抗体偶联物
其中
R2、R4和R5代表H；
R3代表–CH2OH；
R1代表–L1-L2-BINDER，其中
L1代表
其中#2代表与L2的连接点，且#1代表与另一连接的连接点；
且L2代表下式A5和A6的结构之一或两者：
其中
#1是指与结合体的硫原子的连接点，
#2是指与基团L1的连接点，且
R22代表COOH、COOR、COR、CONHR（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH2，优选COOH。
在本发明的偶联物中或在本发明的偶联物的混合物中，在优选大于80%，特别优选大于90%（在每种情况下基于连接体与结合体的键的总数计）的程度上存在连向结合体的半胱氨酸残基的键，特别优选为式A5或A6的两种结构之一。
在此，式A5或A6的结构通常一起存在，基于连向结合体的键的数量计，优选为60:40至40:60的比率。剩余键随之作为下列结构存在
该结合体优选是结合体蛋白质或肽，特别优选人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段或抗-EGFR抗体或其抗原结合片段。特别优选的是特异性结合到TWEAKR（SEQ ID NO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上的抗-TWEAKR抗体，特别是抗-TWEAKR抗体TPP-2090或抗-EGFR抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。替代该结合体，也可存在半胱氨酸残基。
治疗用途
本发明的化合物可用于治疗的过度增殖疾病特别包括癌症和肿瘤疾病。在本发明中，这些被理解为尤其是指下列疾病，但不限于它们：乳腺癌和乳腺肿瘤（乳腺癌包括导管和小叶形式，也原位（in situ））、呼吸道肿瘤（小细胞和非小细胞癌、支气管癌）、脑肿瘤（例如脑干肿瘤和下丘脑肿瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤和神经外胚层和松果体瘤）、消化器官肿瘤（食道、胃、胆囊、小肠、大肠、直肠和肛门癌）、肝肿瘤（尤其是肝细胞癌、胆管细胞癌和混合肝细胞和胆管细胞癌）、头颈区的肿瘤（喉、下咽部、鼻咽、口咽、嘴唇和口腔癌，口腔黑色素瘤）、皮肤瘤（基底细胞瘤、Spinaliome、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、梅克尔细胞皮肤癌、肥大细胞瘤）、支持结缔组织肿瘤（尤其是软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤）、眼睛肿瘤（尤其是眼内黑色素瘤和成视网膜细胞瘤）、内分泌和外分泌腺的肿瘤（例如甲状腺和甲状旁腺、胰腺和唾液腺癌、腺癌）、尿道肿瘤（膀胱、阴茎、肾、肾盂和输尿管的肿瘤）和生殖器官肿瘤（在女性中为子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌，在男性中为前列腺癌和睾丸癌）。这些还包括实体形式和作为循环细胞的血液、淋巴系统和脊髓的增殖性血液病，如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，例如急性髓细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞性白血病和AIDS相关淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤和中枢神经系统中的淋巴瘤。
这些在人类中已充分表征的疾病在其它哺乳动物中也以相当的病因学发生，并在此同样可用本发明的化合物治疗。
用本发明的化合物治疗上述癌症疾病包括实体瘤的治疗及其转移或循环形式的治疗。
在本发明中，术语“治疗”在传统意义上使用并且是指为了对抗、减轻、减弱或缓解疾病或健康异常和改善例如在癌症的情况下因该疾病受损的生存状况而照料、护理和看护患者。
本发明因此还提供本发明的化合物用于治疗和/或预防疾病，特别是上文提到的疾病的用途。
本发明还提供本发明的化合物用于制造治疗和/或预防疾病，特别是上文提到的疾病的药剂的用途。
本发明还提供本发明的化合物在治疗和/或预防疾病，特别是上文提到的疾病的方法中的用途。
本发明还提供使用有效量的至少一种本发明的化合物治疗和/或预防疾病，特别是上文提到的疾病的方法。
本发明的化合物可以独自使用或如果需要，与一种或多种其它药理活性物质组合使用，只要这种组合不会造成不合意和不可接受的副作用。本发明因此还提供含有至少一种本发明的化合物和一种或多种附加活性物质的药剂，特别是用于治疗和/或预防上述疾病。
例如，本发明的化合物可以与用于治疗癌症的已知抗过度增殖、细胞生长抑制或细胞毒性物质组合。合适的组合活性物质的实例包括：
131I-chTNT、阿巴瑞克、阿比特龙、阿柔比星、阿法替尼、阿柏西普、阿地白介素、阿仑单抗、Alisertib、阿利维A酸、Alpharadin（氯化镭-223）、六甲蜜胺、氨鲁米特、AMP-514、氨柔比星、安吖啶、阿那曲唑、Arglabin、三氧化二砷、天冬酰胺酶、AT9283、阿西替尼、阿扎胞苷、巴利昔单抗、贝洛替康、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、比生群、博来霉素、BMS-936559、博舒替尼、硼替佐米、Brentuximab vedotin、布舍瑞林、白消安、卡巴他赛、卡博替尼、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、卡培他滨、卡铂、卡非佐米（蛋白酶体抑制剂）、卡莫氟、卡莫司汀、卡妥索单抗、塞来昔布、西莫白介素、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、氯地孕酮、氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯膦酸、氯法拉滨、Copanlisib(BAY 80-6946)、Crisantaspase、克唑替尼、环磷酰胺、CYC116、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、阿法达贝泊汀、达拉菲尼、达鲁舍替、达沙替尼、道诺霉素、地西他滨、地加瑞克、地尼白介素-Diftitox、地诺单抗、地洛瑞林、二溴螺氯铵、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、多柔比星、多柔比星 + 雌酮、依库珠单抗、依决洛单抗、依利醋铵、伊屈泼帕、内皮抑素、ENMD-2076、依诺他滨、表柔比星、环硫雄醇、阿法依泊汀、倍他依泊汀、依铂、艾日布林、埃罗替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、法倔唑、非格司亭、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他米特、福美斯坦、福莫司汀、氟维司群、硝酸镓、加尼瑞克、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗、Glutoxim、戈舍瑞林、组胺二盐酸盐、组氨瑞林、羟基脲、碘I-125粒子、伊班膦酸、替伊莫单抗、依鲁替尼、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、咪喹莫特、INCB24360、英丙舒凡、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、易普利姆玛、伊立替康、伊沙匹隆、Lambrolizumab、兰瑞肽、拉帕替尼、来那度胺、来格司亭、香菇多糖、来曲唑、亮丙瑞林、左旋咪唑、麦角乙脲、洛铂、洛莫司汀、氯尼达明、马索罗酚（Masoprocol）、甲羟孕酮、甲地孕酮、美法仑、美雄烷、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲氧沙林、氨基乙酰丙酸甲酯、甲睾酮、米伐木肽、米替福新、米铂、二溴甘露醇、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、MLN-8054、Mps1抑制剂（公开在WO2013/087579，特别是实施例01.01，WO2014/131739，特别是实施例2中）、奈达铂、奈拉滨、奈莫柔比星、尼洛替尼、尼鲁米特、尼妥珠单抗、尼莫司汀、二胺硝吖啶、Nivolumab、NMS-P715、NMS-P937、奥法木单抗、奥美拉唑、奥普瑞白介素、奥沙利铂、p53基因疗法、紫杉醇、Palbociclib、Palifermin、钯-103粒子、帕米膦酸、帕尼单抗、帕唑帕尼、培门冬酶、PEG-倍他依泊汀（甲氧基-PEG-倍他依泊汀）、聚乙二醇化非格司亭、Peg-干扰素-α-2b、培美曲塞、喷他佐辛、喷司他丁、培洛霉素、培磷酰胺、溶链菌、吡柔比星、普乐沙福、普卡霉素、聚氨葡糖、磷酸聚雌醇、多糖-K、帕纳替尼、卟吩姆-钠、普拉曲沙、泼尼莫司汀、丙卡巴肼、喹高利特、R763、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷莫司汀、雷佐生、Refametinib、瑞格非尼、利塞膦酸、利妥昔单抗、罗米地辛、罗米司亭、Roninciclib、鲁索替尼、沙格司亭、Sipuleucel-T、西佐糖、索布佐生、甘氨双唑钠、SNS-314、索拉非尼、链脲菌素、舒尼替尼、他拉泊芬、他米巴罗汀、他莫昔芬、他索纳明、替西白介素、替加氟、替加氟 +吉美嘧啶 + 奥特拉西、替莫泊芬、替莫唑胺、坦罗莫司（Temsirolimus）、替尼泊苷、睾酮、替曲膦、沙利度胺、塞替哌、胸腺法新、TKM-PLK1、硫鸟嘌呤、Tocilizumab、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗、Tozasertib、曲贝替定、曲美替尼、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、苏消安、维甲酸、曲洛司坦、曲普瑞林、曲洛磷胺、色氨酸、乌苯美司、戊柔比星、凡德他尼、伐普肽、威罗菲尼、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春氟宁、长春瑞滨、Volasertib、伏立诺他、Vorozol、XL228、钇-90玻璃微球、净司他丁、净司他丁斯酯、唑来膦酸、佐柔比星。
此外，本发明的化合物可以例如与可例如结合到下列靶上的结合体组合：OX-40、CD137/4-1BB、DR3、IDO1/IDO2、LAG-3、CD40。
此外，本发明的化合物也可以与放射疗法和/或外科手术联合使用。
通常，用本发明的化合物与其它细胞生长抑制或细胞毒性活性剂的组合追求下列目标：
● 与用单一活性物质治疗相比，在减慢肿瘤生长、降低其尺寸或甚至完全消除其方面改进的效力；
● 以比单一疗法中低的剂量使用化疗药物的可能性；
● 与独立给药相比，有可能更耐受治疗，副作用较少；
● 治疗更广谱的肿瘤疾病的可能性；
● 实现更高的治疗响应率；
● 与当今标准疗法相比，更长的患者存活时间。
此外，本发明的化合物也可以与放射疗法和/或外科手术联合使用。
本发明还提供通常与一种或多种惰性、无毒、可药用辅助剂一起包含至少一种本发明化合物的药剂，及其用于上述目的的用途。
本发明的化合物可以全身和/或局部发挥作用。为此，它们可通过合适方式，例如肠道外、可能吸入或作为植入物或支架给药。
本发明的化合物可以以适合这些给药途径的给药形式给药。
肠道外给药可以绕开再吸收步骤（例如静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内或腰内）或包括再吸收（例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内）。适合肠道外给药的给药形式包括溶液、混悬剂、乳剂或冻干产物形式的注射和输液制剂。优选的是肠道外给药，尤其是静脉给药。
通常已经发现，在肠道外给药的情况下有利的是给予大约0.001至1 mg/kg，优选大约0.01至0.5 mg/kg体重的量以实现有效结果。
然而，可能必须酌情偏离所示的量，尤其取决于体重、给药途径、个体对活性物质的响应、制剂性质和给药时间或时间间隔。因此，在一些情况下，少于上述最低量可能是足够的，而在另一些情况下，必须超过所提到的上限。在给予更大量的情况下，可能最好将它们在一天内分成几个单剂。
实施例
下列实施例例示本发明。本发明不限于这些实施例。
除非另行指明，下列试验和实施例中的百分比为重量百分比；份数为重量份。液体/液体溶液的溶剂比、稀释比和浓度在每种情况下基于体积。
合成途径：
对实施例示例，下列图式显示产生实施例的示例性合成途径：
图式1: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式2: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式3: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式4: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式5: 赖氨酸连接的ADC的合成
a) 三光气、THF、在氩气下
图式6: 赖氨酸连接的ADC的合成
图式7
[a): EDCI、HOBT、二异丙基乙基胺、RT；b) 乙醇、哌啶、甲胺、水、RT；c) HATU、二异丙基乙基胺、RT；d) TFA、DCM、RT]
图式8
[a): 例如EDCI、HOBT、二异丙基乙基胺、DMF、RT；b) 例如DCM/TFA 20:1、RT；c) 例如HATU、二异丙基乙基胺、DMF、RT；d) 例如TFA、DCM、RT]
图式9
[a): 例如2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐、二异丙基乙基胺、DCM、RT；b) 例如2M LiOH溶液、THF、水、RT、区域异构体的HPLC分离；c) 例如EDCI、HOBT、二异丙基乙基胺、DMF、RT；d]例如TFA、DCM、RT]
图式10
[a): 例如H2、Pd-C、EtOH、RT；b) 例如对硝基苄基溴、K2CO3、DMF；c) 例如乙醇、40%的甲胺水溶液、50℃；d) 例如连二亚硫酸二钠、THF、水、50℃；e) 例如HATU、二异丙基乙基胺、DMF、RT；f) 例如哌啶、40%的甲胺水溶液、乙醇、50℃；g) 例如二异丙基乙基胺、DMF、RT；h)例如哌啶、DMF、RT；i) TFA、DCM、RT]
图式11
[a): 例如Et3N、DMF、RT；b) 例如H2、Pd-C、EtOH/乙酸乙酯/THF(1:1:1)、RT；c) 例如4-甲基吗啉、DMF、RT；d) 例如HATU、HOAt、二异丙基乙基胺、DMF、RT；e] 例如TFA、RT]
图式12
[a): 例如NaBH(OAc)3、HOAc、二氯甲烷、RT；b) 例如氯乙酰氯、NEt3、DCM、RT；c) 例如Cs2CO3、DMF、50℃；d) 例如1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)、T3P(R)、二异丙基乙基胺、MeCN、RT；e] 例如TFA、RT]
图式13
[a): 例如甲磺酰氯、NEt3、二氯甲烷、0℃；b) 例如NaN3、DMF、40℃；c) 例如H2、Pd-C、EtOH/乙酸乙酯(1:1)、RT；d) 例如TBAF、THF、RT；e) 例如1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮、NEt3、CaCO3、1,4-二氧杂环己烷、RT；f) 例如N-氯琥珀酰亚胺、TEMPO、四正丁基氯化铵、氯仿、0.05 N 碳酸钾/0.05 N碳酸氢钠溶液(1:1)；g) 例如NaBH(OAc)3、HOAc、二氯甲烷、RT；h) 例如氯乙酰氯、NEt3、DCM、RT；i) 例如TBAF、THF、水、RT；j) 例如4-甲基吗啉、DMF、RT；k) 例如TFA、RT]
图式14
[a): 例如甲醛、Na2CO3、水、RT；b) 例如Ac2O、吡啶、THF、RT；c) 例如丙二酸二叔丁酯、KOtBu、THF、RT；d) 例如LiBH4、THF、RT；e) 例如TBDMSCl、咪唑、DCM、RT；f] 例如戴斯马丁氧化剂、DCM；g) 例如三乙酰氧基硼氢化钠、AcOH、DCM、RT；h) 例如nBu4NF、THF、RT；i) 例如SOCl2、THF、RT；j) 例如AcSK、nBu4NI、DMF、90℃；k) 例如NaOH、MeOH、THF、RT；l) 例如TCEP、二氧杂环己烷、RT；m) 例如差向异构体的分离；n) 例如6N盐酸、THF、RT o) 例如Mal-dPEG(3)-Mal、PBS缓冲液、ACN、RT]
图式15
[a): 例如Mal-dPEG(3)-Mal、PBS缓冲液、ACN、RT]
图式16
[a): 例如BF3OEt2、THF、0℃；b): 例如亚硝酸异戊酯、-10℃、0.5 h；c]: 例如2-氯-3-氧代丁酸甲酯、吡啶、水、-5℃；d): 例如NEt3、甲苯、RT；e): 例如Et3SiH、TFA、RT；f): 例如LiBH4、THF、60℃；g): 例如戴斯马丁氧化剂、DCM、RT；h): 例如(R)-(+)-甲基-2-丙烷亚磺酰胺、异丙醇钛(IV)、THF、RT；i): 例如叔-BuLi、戊烷、THF、-78℃；j): 例如在二氧杂环己烷中的HCl、THF、MeOH、RT；k): 例如3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛、NaB(OAc)3H、AcOH、DCM、RT；l): 例如乙酸2-氯-2-氧代乙酯、NEt3、DCM、RT；m): 例如甲基胺、水、EtOH、50℃]
图式17
[a): 例如N-(叔丁氧基羰基)-5-氧代-L-正缬氨酸叔丁酯、NaB(OAc)3H、AcOH、DCM、RT；b): 例如乙酸2-氯-2-氧代乙酯、NEt3、DCM、RT；c): 例如甲胺、水、EtOH、60℃；d): 例如THF、DCM、50℃；e): 例如Boc2O、NEt3、DCM、RT；f): 例如三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)、HATU、二异丙基乙基胺、DMF、RT；f): 例如TFA、DCM、RT]
图式18: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式19: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式20: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式21: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式22
[a): 例如三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM、RT；b) 例如乙酰氧基乙酰氯、NEt3、DCM、RT；c) 例如LiOH、THF/水、RT；d) 例如H2、Pd-C、EtOH、RT；e) 例如Teoc-OSu、NEt3、二氧杂环己烷、RT；f] 例如Fmoc-Cl、二异丙基乙基胺、二氧杂环己烷/水2:1、RT]
图式23
[a): 例如三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM、RT；b) 例如乙酰氧基乙酰氯、NEt3、DCM、RT；c) 例如LiOH、甲醇、RT；d) 例如TFA、DCM、RT；e] 例如Boc2O、二异丙基乙基胺、DCM、RT]
图式24
[a): 例如苄基溴、Cs2CO3、DMF、RT；b) 例如Pd(dppf)2Cl2、DMF、Na2CO3、85℃；c) 例如LiAlH4、THF、0℃；MnO2、DCM、RT；d) 例如Ti(iOPr)4、THF、RT；e) 例如tBuLi、THF、-78℃；MeOH、NH4Cl；f] 例如HCl/1,4-二氧杂环己烷]
图式25: 半胱氨酸连接的ADC的合成
图式26: 经水解琥珀酰胺合成半胱氨酸连接的ADC
这种方法特别用于其中L1 = CH2的ADC以将这些ADC转化成开链连接形式。
图式27:
[a): 三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM、RT；b) 乙酰氧基乙酰氯、二异丙基乙基胺、DCM、RT；c) LiOH、MeOH、RT；d) 三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1) HATU、DMF、二异丙基乙基胺、RT；e] 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA.]
图式28:
[a): HATU、DMF、二异丙基乙基胺、RT；b) 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA.]
图式29:
[a): 三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、DCM、RT；b) 乙酰氧基乙酰氯、三乙胺、DCM、RT；c)LiOH、MeOH、RT；d) 三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1) HATU、DMF、二异丙基乙基胺、RT；e] 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA.]
图式30:
[a): 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)、DCM、吡啶、RT；b) 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA；c) 3-4当量的TCEP、PBS缓冲液；d) PBS缓冲液、20h RT.]
图式31:
[a): 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(BEP)、DCM、吡啶、RT；b) 氯化锌、三氟乙醇、50℃、EDTA；c) 3-4当量的TCEP、PBS缓冲液；d) PBS缓冲液、20h RT.]。
A. 实施例
缩写和首字母缩略词:
A431NS 人肿瘤细胞系
A549 人肿瘤细胞系
ABCB1 ATP-结合盒亚家族B成员1（P-gp和MDR1的同义词）
abs. 纯
Ac 乙酰基
CAN 乙腈
aq. 含水，水溶液
ATP 三磷酸腺苷
BCRP 乳腺癌耐药蛋白，外排转运蛋白
BEP 2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐
Boc 叔丁氧基羰基
br. 宽（在NMR中）
Bsp. 实施例
CI 化学电离（在MS中）
d 双重峰（在NMR中）
d 天
DC 薄层色谱法
DCI 直接化学电离（在MS中）
dd 双重双峰（在NMR中）
DMAP 4-N,N-二甲基氨基吡啶
DME 1,2-二甲氧基乙烷
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium（用于细胞培养的标准化营养培养基）
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
DPBS, D-PBS, PBS Dulbecco's磷酸盐缓冲的盐溶液
　　　　　　　　PBS = DPBS = D-PBS, pH 7.4，来自Sigma, No D8537
　　　　　　　　组成：
　　　　　　　　0.2 g KCl
　　　　　　　　0.2 g KH2PO4 (无水)
　　　　　　　　8.0 g NaCl
　　　　　　　　1.15 g Na2HPO4 (无水)
　　　　　　　　用H2O补充到1升
dt 双重三峰（在NMR中）
DTT DL-二硫苏糖醇
d. Th. 理论值的（在化学收率中）
EDC N'-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐
EGFR 表皮生长因子受体
EI 电子碰撞电离（在MS中）
ELISA 酶联免疫吸附测定法
eq. 当量
ESI 电喷雾电离（在MS中）
ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (质谱仪名称Tof = 飞行时间和q = 四极)
FCS 胎牛血清
Fmoc (9H-芴-9-基甲氧基)羰基
ges. 饱和
GTP 5'-三磷酸鸟苷
h 小时
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HCT-116 人肿瘤细胞系
HEPES 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙烷磺酸
HOAc 乙酸
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
HOBt 水合1-羟基-1H-苯并三唑
HOSu N-羟基琥珀酰亚胺
HPLC 高压高效液相色谱法
HT29 人肿瘤细胞系
IC50 半最大抑制浓度
i.m. 肌肉内，给药到肌肉内
i.v. 静脉，给药到静脉内
konz. 浓缩
LC-MS 液相色谱法-质谱法联用
LLC-PK1 cells Lewis肺癌猪肾细胞系
L-MDR 人MDR1转染LLC-PK1细胞
m 多重峰（在NMR中）
MDR1 多药耐药蛋白1
MeCN 乙腈
min 分钟
MS 质谱法
MTT 溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑鎓
NCI-H292 人肿瘤细胞系
NCI-H520 人肿瘤细胞系
NMM N-甲基吗啉
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振谱法
NMRI 小鼠品系，源自Naval Medical Research Institute (NMRI)
Nude Mäuse 裸小鼠（受试动物）
NSCLC 非小细胞肺癌
PBS 磷酸盐缓冲的盐溶液
Pd/C 活性炭载钯
P-gp P-糖蛋白，转运蛋白
PNGaseF 用于裂解糖的酶
quant. 定量（收率）
quart 四重峰（在NMR中）
quint 五重峰（在NMR中）
Rf 保留指数（在DC中）
RT 室温
Rt 停留时间（在HPLC中）
s 单重峰（在NMR中）
s.c. 皮下，在皮肤下给药
SCC-4 人肿瘤细胞系
SCC-9 人肿瘤细胞系
SCID Mäuse 具有重症联合免疫缺陷的受试小鼠
t 三重峰（在NMR中）
TBAF 四正丁基氟化铵
TEMPO (2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基
tert. 叔
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
T3P® 2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物
UV 紫外光谱法
v/v （溶液的）体积比
Z 苄氧基羰基。
如果在本公开中在反应的描述中没有给出温度，始终应该采用室温。
HPLC和LC-MS方法:
方法1 (LC-MS):
仪器: Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ 50x 1 mm；洗脱剂A: 1升水 + 0.25毫升99%的甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.25毫升99%的甲酸；梯度: 0.0 min 90% A → 1.2 min 5% A → 2.0 min 5% A 炉: 50℃；流速: 0.40ml/min；UV检测: 208 – 400 nm。
方法2 (LC-MS):
MS仪器类型: Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型: Waters Acquity I-CLASS；柱:Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 µm；洗脱剂A: 1升水 + 0.01%甲酸；洗脱剂B:1升乙腈 + 0.01%甲酸；梯度: 0.0 min 2% B → 1.5 min 2% B → 8.5 min 95% B →10.0 min 95% B；炉: 50℃；流速: 0.50 ml/min；UV检测: 220 nm。
方法3 (LC-MS):
MS仪器: Waters (Micromass) QM；HPLC仪器: Agilent 1100系列；柱: AgilentZORBAX Extend-C18 3.0 x 50 mm 3.5 micron；洗脱剂A: 1升水 + 0.01摩尔碳酸铵, 洗脱剂B: 1升乙腈；梯度: 0.0 min 98% A → 0.2min 98% A → 3.0 min 5% A→ 4.5 min5% A ；炉: 40℃；流速: 1.75 ml/min；UV检测: 210 nm。
方法4 (LC-MS):
MS仪器类型: Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型: Waters Acquity I-CLASS；柱:Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 µm；洗脱剂A: 1升水 + 0.01%甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.01%甲酸；梯度: 0.0 min 10% B → 0.3 min 10% B → 1.7 min 95% B →2.5 min 95% B；炉: 50℃；流速: 1.20 ml/min；UV检测: 210 nm。
方法5 (LC-MS):
仪器: Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ 50x 1 mm；洗脱剂A: 1升水 + 0.25毫升99%的甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.25毫升99%的甲酸；梯度: 0.0 min 95% A → 6.0 min 5% A → 7.5 min 5% A 炉: 50℃；流速: 0.35ml/min；UV检测: 210 – 400 nm。
方法6 (LC-MS):
仪器: Micromass Quattro Premier with Waters UPLC Acquity；柱: ThermoHypersil GOLD 1.9 µ 50 x 1 mm；洗脱剂A: 1升水 + 0.5毫升50%的甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.5毫升50%的甲酸；梯度: 0.0 min 97% A → 0.5 min 97% A → 3.2 min 5% A→ 4.0 min 5% A；炉: 50℃；流速: 0.3 ml/min；UV检测: 210 nm。
方法7 (LC-MS):
仪器: Agilent MS Quad 6150；HPLC: Agilent 1290；柱: Waters Acquity UPLC HSST3 1.8 µ 50 x 2.1 mm；洗脱剂A: 1升水 + 0.25毫升99%的甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 +0.25毫升99%的甲酸；梯度: 0.0 min 90% A → 0.3 min 90% A → 1.7 min 5% A → 3.0min 5% A；炉: 50℃；流速: 1.20 ml/min；UV检测: 205 – 305 nm。
方法8 (LC-MS):
MS仪器类型: Waters Synapt G2S；UPLC仪器类型: Waters Acquity I-CLASS；柱:Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm、C18 1.8 µm；洗脱剂A: 1升水 + 0.01%甲酸；洗脱剂B: 1升乙腈 + 0.01%甲酸；梯度: 0.0 min 2% B → 2.0 min 2% B → 13.0 min 90% B → 15.0min 90% B；炉: 50℃；流速: 1.20 ml/min；UV检测: 210 nm。
方法9: 用于实施例181-191的LC-MS-Prep提纯方法（方法LIND-LC-MS-Prep）
MS仪器: Waters；HPLC仪器: Waters（柱Waters X-Bridge C18, 19 mm x 50 mm, 5 µm, 洗脱剂A: 水 + 0.05%氨, 洗脱剂B: 具有梯度的乙腈（ULC）；流速: 40 ml/min；UV检测: DAD；210 – 400 nm）。
或:
MS仪器: Waters；HPLC仪器: Waters（柱Phenomenex Luna 5µ C18(2) 100A, AXIATech. 50 x 21.2 mm, 洗脱剂A: 水 + 0.05%甲酸, 洗脱剂B: 具有梯度的乙腈（ULC）；流速: 40 ml/min；UV检测: DAD；210 – 400 nm）。
方法10: 用于实施例181-191的LC-MS分析方法（LIND_SQD_SB_AQ）
MS仪器: Waters SQD；HPLC仪器: Waters UPLC；柱: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50mm x 2.1 mm, 1.8 µm；洗脱剂A: 水 + 0.025%甲酸, 洗脱剂B: 乙腈（ULC） + 0.025%甲酸；梯度: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A – 1.0 min 5%A - 1.4 min 5%A – 1.41 min98%A – 1.5 min 98%A；炉: 40℃；流速: 0.600 ml/min；UV检测: DAD；210 nm。
方法11 (HPLC):
仪器: HP1100系列
柱:Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4.6 mm、目录号1.51450.0001, 前置柱Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4.6mm, 目录号 1.51470.0001
梯度:流速5 ml/min
注射体积5 µl
溶剂A:在水中的HClO4（70%）（4 ml/l）
溶剂B: 乙腈
起点 20% B
0.50 min 20% B
3.00 min 90% B
3.50 min 90% B
3.51 min 20% B
4.00 min 20% B
柱温度: 40℃
波长: 210 nm。
下文没有明确描述其制备的所有反应物或试剂购自一般可得的来源。对于其制备同样没有描述在下文中并且不可购得或获自一般不可得的来源的所有其它反应物或试剂，参考描述了其制备的出版文献。
原材料和中间体:
中间体C1
三氟乙酸-(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)
如WO2006/002326中所述制备标题化合物。
中间体C2
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯
将4.22克（14.5毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶解在180毫升二氯甲烷中，然后加入3.5毫升吡啶和9.2克（21.7毫摩尔）1,1,1-三乙酰氧基-1λ5,2-苯碘酰-3(1H)-酮。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后用500毫升二氯甲烷稀释并用10%的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后相继用5%的柠檬酸萃取两次和用10%的碳酸氢钠溶液萃取两次。分离出有机相，经硫酸镁干燥，然后在真空下浓缩。将残留物置于DMC中，并加入二乙醚和正戊烷的混合物。滤出沉淀物，然后浓缩滤液并从乙腈/水中冻干。这产生3.7克（93%）(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，其不经进一步提纯即用于下一步骤。（Rf值:0.5 (DCM/甲醇95/5)）。
将3.5克（9.85毫摩尔）中间体C1溶解在160毫升DCM中，并加入3.13克（14.77毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和0.7毫升乙酸。在室温下搅拌5分钟后，加入3.23克（11.85毫摩尔）(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯并将该配制品在室温下搅拌另外30分钟。然后在真空下蒸发溶剂并将残留物置于乙腈/水中。滤出沉淀的固体并干燥，以产生5.46克（84%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.5 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.13 min；MS (ESIpos): m/z = 613 (M+H)+。
中间体C3
(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸
将5.46克（8.24毫摩尔）中间体C2溶解在160毫升DCM中，然后加入4.8毫升三乙胺和2.2毫升（20.6毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯。将该配制品在室温下搅拌整夜，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取。有机相经硫酸钠干燥，然后浓缩。残留物通过在Biotage/Isolera (SNAP 340g)上使用洗脱剂环己烷/乙酸乙酯2:1的柱色谱法提纯。这产生4.57克（75%）酰化中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 713 (M+H)+。
将1克（1.36毫摩尔）这种中间体溶解在20毫升DCM中，并加入20毫升TFA。在室温下搅拌5小时后浓缩，残留物用正戊烷搅拌两次。在每种情况下，滗析出正戊烷，残留固体在高真空下干燥。这产生1.1克(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸/三氟乙酸(1:1)。LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 557 (M+H)+。
将0.91克（1.57毫摩尔）这种中间体溶解在70毫升DCM中，并加入3.43克（15.7毫摩尔）二碳酸二叔丁酯和4.1毫升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌30分钟后，该配制品用DCM稀释并用5%的柠檬酸萃取。有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残留物用正戊烷搅拌两次并在每种情况下滗析出正戊烷。残留固体从乙腈/水1:1中冻干，以产生1.11克标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.55 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.3 min；MS (ESIpos): m/z = 657 (M+H)+。
中间体C4
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸/三氟乙酸(1:1)
将5.46克（8.24毫摩尔）中间体C2溶解在160毫升DCM中，并加入4.8毫升三乙胺和2.2毫升（20.6毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯。将该配制品在室温下搅拌整夜，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取。有机相经硫酸钠干燥，然后浓缩。残留物通过在Biotage/Isolera (SNAP 340g)上使用洗脱剂环己烷/乙酸乙酯2:1的柱色谱法提纯。这产生4.57克（75%）酰化中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 713 (M+H)+。
将1.5克（2.035毫摩尔）这种中间体置于50毫升乙醇中，并加入5.8毫升40%的甲胺水溶液。将该配制品在50℃下搅拌4小时，然后浓缩。将残留物置于DCM中并用水洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥，然后浓缩。该残留物在高真空下干燥。这产生1.235毫克这种中间体，其不经进一步提纯即进一步反应。
将1.235毫克（1.5毫摩尔）这种中间体溶解在15毫升DCM中，并加入15毫升TFA。在室温下搅拌4小时后浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物从乙腈中冻干。这产生1.04克（定量）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 515 (M+H)+。
中间体C5
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸
将0.9克（1.24毫摩尔）中间体C4溶解在60毫升DCM中，并加入2.7克（12.5毫摩尔）二碳酸二叔丁酯和3.3毫升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌45分钟后，浓缩该配制品并将残留物置于二乙醚中，加入正戊烷直至开始变浑浊。将该配制品冷却至0℃，然后滗析。再次将正戊烷添加到残留物中并滗析。残留固体从乙腈/水1:1中冻干，以产生0.95克（定量）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.5 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.27 min；MS (ESIpos): m/z = 615 (M+H)+。
中间体C6
三氟乙酸/{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-肼基-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)
将150毫克（0.16毫摩尔）中间体C3溶解在21毫升DMF中，然后加入37.2毫克（0.19毫摩尔）N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、37毫克（0.243毫摩尔）1-羟基苯并三唑、85微升N,N-二异丙基乙基胺和最后45毫克（0.18毫摩尔）市售肼甲酸9H-芴-9-基甲酯。将该配制品在室温下搅拌整夜，然后在真空下浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物从乙腈/水中冻干。这产生60毫克（理论值的41%）受保护的中间体。
HPLC (方法11): Rt = 2.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.47 min；MS (ESIpos): m/z = 893 (M+H)+。
将60毫克（0.067毫摩尔）这种中间体溶解在19毫升乙醇中，并加入681微升哌啶和386微升40%的甲胺水溶液。将该配制品在50℃下搅拌18小时，然后浓缩。将残留物置于乙腈/水2:1中并用TFA调节至pH 2。然后重新浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物从乙腈/水中冻干。这产生25毫克（理论值的51%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.2 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.27 min；MS (ESIpos): m/z = 629 (M+H)+。
中间体C7
1-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}肼基)乙酸/三氟乙酸(1:1)
将0.2克（0.305毫摩尔）中间体C3溶解在80毫升DCM中，加入0.125克（0.46毫摩尔）2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐（BEP）、94毫克（0.61毫摩尔）市售肼基乙酸乙酯盐酸盐和159微升N,N-二异丙基乙基胺，然后将该混合物在室温下搅拌1小时。然后将乙酸乙酯和水添加到反应混合物中，并分离相。有机相用饱和氯化钠溶液萃取，然后经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残留物在真空下干燥并且不经提纯即进一步反应。为此，将其置于20毫升四氢呋喃中，并加入10毫升水和3.2毫升2N氢氧化锂溶液。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后使用TFA调节至pH 7。然后浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。由此将标题化合物与其更早洗脱的区域异构体分离。相应馏分的合并、冻干和干燥后产生19.7克（经2步骤，理论值的8%）无色泡沫形式的标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.4 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.22 min；MS (ESIpos): m/z = 687 (M+H)+。
在分离在受保护的中间体阶段的区域异构体后，在单独实验中通过NMR谱法进行区域异构体的结构赋值。标题化合物的受保护的中间体(1-{(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基) 氨基]丁酰基}肼基)乙酸乙酯具有下列1H NMR谱：
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d = 7.8 (m, 2H), 7.4-7.2 (m, 6H), 7.08 (m,1H), 6.73 (d, 1H), 5.6 (s, 1H), 5.25和4,89 (2d, 2H), 4.89和4.77 (2d, 2H),4.62 (t, 1H), 4.32和3.78 (2d, 2H), 4.1 (t, 2H), 3.62-3.47 (m), 2.13 (s, 3H),1.41和0.72 (2m, 2H), 1.3 (s, 9H), 1.18 (t, 3H), 0.92 (s, 9H)。
中间体C8
N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸
将293毫克（0.41毫摩尔）中间体C3溶解在25毫升DMF中，然后加入144毫克（0.75毫摩尔）N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、128毫克（0.83毫摩尔）1-羟基苯并三唑、218微升N,N-二异丙基乙基胺和最后70毫克（0.5毫摩尔）市售氯化3-甲氧基-3-氧代丙-1-铵。将该配制品在室温下搅拌4小时，然后在真空下浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物在高真空下干燥。这产生177毫克（理论值的53%）受保护的中间体。
HPLC (方法11): Rt = 2.6 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.33 min；MS (ESIpos): m/z = 742 (M+H)+。
将177毫克（0.22毫摩尔）这种中间体置于20毫升甲醇中，并加入2.8毫升2N氢氧化锂溶液。将该配制品在室温下搅拌18小时。然后浓缩，将残留物置于水中并使用5%的柠檬酸将该溶液调节至pH 5。然后用DCM萃取两次，有机相经硫酸镁干燥并浓缩。残留物最后从乙腈/水中冻干，以产生133毫克（理论值的81%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.3 min；
LC-MS (方法3): Rt = 7.4 min；MS (ESIpos): m/z = 686 (M+H)+。
中间体C9
(6S)-6-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]乙基}-2,2-二甲基-4,7-二氧代-3,11,14,17-四氧杂-5,8-二氮杂二十烷-20-酸
在第一步骤中，在15毫升DMF中在44毫克（0.228毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、35毫克（0.228毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和60微升N,N-二异丙基乙基胺存在下使70毫克（0.114毫摩尔）中间体C5与32毫克（0.114毫摩尔）3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯偶联。
将该配制品在室温下搅拌整夜，该产物通过制备型HPLC提纯。分离出33毫克（理论值的33%）受保护的中间体。这与1.1毫升三氟乙酸一起在11毫升二氯甲烷中搅拌1小时，以在后处理后产生26毫克（98%）完全脱保护的化合物。
最后，将该中间体置于2毫升DCM中并通过在室温下在3天搅拌下加入在每种情况下10毫克二碳酸二叔丁酯和79微升N,N-二异丙基乙基胺两次而引入叔丁氧基羰基保护基。产物通过制备型HPLC提纯后产生16.4毫克（理论值的66%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.3 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.22 min；MS (ESIpos): m/z = 818 (M+H)+。
中间体C10
{3-[{(1R)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
由中间体C1经6个步骤制备标题化合物：在第一步骤中，将1克（2.77毫摩尔）中间体C1和0.864克（5毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯合并在100毫升甲醇中，并加入400毫升乙酸和1.288克（13.9毫摩尔）硼烷-吡啶络合物。将该配制品在室温下搅拌3天。然后在真空下浓缩，残留物通过在硅胶上的快速色谱法提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/乙酸乙酯9:1 -> 二氯甲烷/甲醇95:5）。适当馏分的浓缩和在高真空下的干燥后产生1.255克（理论值的80%）N-烷基化中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.0 min；MS (ESIpos): m/z = 513 (M+H)+。
将1.255克（2.2毫摩尔）这种中间体溶解在50毫升DCM中，然后加入1.2毫升三乙胺和0.52毫升（4.85毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯。将该配制品在室温下搅拌整夜，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙酸乙酯并用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取。有机相经硫酸钠干燥，然后浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。
这产生593毫克（理论值的41%）酰化中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.4 min；MS (ESIpos): m/z = 613 (M+H)+。
将993毫克（0.91毫摩尔）这种中间体溶解在100毫升乙醇中并在加入60毫克10%钯-活性炭后，在标准氢气压下在室温下氢化3小时。然后滤出催化剂并在真空下除去溶剂。这产生494毫克（理论值的91%）几乎无色油形式的脱苄基的咪唑衍生物。LC-MS (方法1):Rt = 1.17 min；MS (ESIpos): m/z = 523 (M+H)+。
将150毫克（0.25毫摩尔）这种中间体最初装载在15毫升DMF中，并加入69.2毫克（0.5毫摩尔）碳酸钾。在室温下搅拌15分钟后，加入60毫克（0.28毫摩尔）对硝基苄基溴并搅拌整夜。然后在真空下除去溶剂，将残留物置于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液萃取。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，在旋转蒸发器上浓缩并通过制备型HPLC提纯。在旋转蒸发器上浓缩适当馏分，残留物从1,4-二氧杂环己烷中冻干。这产生169毫克（定量）中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.39 min；MS (ESIpos): m/z = 658 (M+H)+。
将165毫克（0.251毫摩尔）这种中间体置于30毫升乙醇中，并加入0.35毫升40%的甲胺水溶液。将该配制品在50℃下搅拌5小时，然后再加入相同量的甲胺溶液。在搅拌另外10小时后，该配制品在真空下浓缩。用二乙醚再蒸馏两次，残留物然后从乙腈/水中冻干。这产生148毫克（89%）这种中间体。
LC-MS (方法6): Rt = 2.97 min；MS (ESIpos): m/z = 616 (M+H)+。
将98毫克（0.15毫摩尔）该前体溶解在15毫升THF中，然后在室温下加入569毫克（3.27毫摩尔）连二亚硫酸二钠在6毫升水中的溶液。在50℃下搅拌8小时后，再加入溶解在1毫升H2O中的相同量的连二亚硫酸盐。在50℃下搅拌另外16小时后，将该配制品冷却至RT并用乙酸乙酯萃取。浓缩有机相，残留物通过制备型HPLC提纯。残留物从1,4-二氧杂环己烷中冻干后产生44.5毫克（理论值的47%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 586 (M+H)+。
中间体C11
R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸盐(1:1)
将990.0毫克（2.79毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺最初装载在15.0毫升二氯甲烷中，加入828.8毫克（3.91毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和129.9毫克（3.21毫摩尔）乙酸，并在室温下搅拌5分钟。加入溶解在15.0毫升二氯甲烷中的698.1毫克（3.21毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体L58），并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物使用硅胶提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇100:2）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生1.25克（理论值的73%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.09 min；MS (ESIpos): m/z = 556 (M+H)+。
将151.4毫克（1.5毫摩尔）三乙胺和161.6毫克（1.43毫摩尔）氯乙酰氯添加到400.0毫克（0.65毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯中。将反应混合物在室温下搅拌整夜。将乙酸乙酯添加到反应混合物中，有机相用水洗涤三次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物使用硅胶提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯3:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生254.4毫克（理论值的57%）化合物{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.49 min；MS (ESIneg): m/z = 676 (M+HCOO-)-。
将117.4毫克（0.19毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在10.0毫升异丙醇中，并加入928.4微升1M NaOH和50.2毫克（0.37毫摩尔）DL-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌4.5小时。将乙酸乙酯添加到反应混合物中，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x40；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生75.3毫克（理论值的48%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 731 (M+H)+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.40 (m, 1H), 0.75-0.91 (m, 11H), 1.30 (m, 1H), 1.99-2.23 (m, 2H), 2.63-2.88 (m, 4H), 3.18-3.61(m, 5H), 3.79-4.10 (m, 3H), 4.89 (d, 1H), 4.89 (d, 1H), 5.16 (d, 1H), 5.56(s, 1H), 6.82 (m, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.97 (m, 1H), 7.13-7.38 (m, 6H), 7.49(s, 1H), 7.63 (m, 1H), 8.26 (s, 3H)。
中间体C12
R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸
与中间体C11的合成类似地使用(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯（中间体L57）和中间体C52作为原材料进行合成。
LC-MS (方法1): Rt = 1.18 min；MS (ESIpos): m/z = 775 (M+H)+。
中间体C13
9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸
将90.0毫克（0.15毫摩尔）中间体C16和43.6毫克（0.23毫摩尔）6-(乙酰基硫烷基)己酸溶解在9.0毫升甲醇中，并加入一滴水和73.9毫克（0.54毫摩尔）碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌4小时，然后用乙酸乙酯稀释。有机相用水/饱和NaCl溶液和饱和NaCl溶液洗涤，随后经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上色谱分离（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇= 100:2）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这以理论值的83%产生标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.44 min；MS (ESIpos): m/z = 701 (M+H)+。
中间体C14
R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]高半胱氨酸
将100.0毫克（0.17毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯（中间体C16）最初装载在4.0毫升异丙醇中，并加入276.5毫克（0.85毫摩尔）1 M NaOH溶液和45.9毫克（0.34毫摩尔）D/L-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌1小时。该反应混合物用乙酸乙酯稀释。有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤。经硫酸镁干燥，并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x40；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。
这产生92.6毫克（理论值的66%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 688 (M+H)+。
中间体C15
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将750.0毫克（2.11毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C1）溶解在15.0毫升二氯甲烷中，加入626.0毫克（2.95毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和139微升（2.43毫摩尔）HOAc，并在室温下搅拌5分钟。然后加入420.3毫克（2.43毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯（根据文献程序合成J.Med.Chem. 2003, 46, 3536），并在室温下搅拌整夜。向该反应混合物加入乙酸乙酯，用饱和碳酸钠溶液萃取两次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上色谱分离（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯 = 4:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生881.0毫克（理论值的82%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 513 [M+H]+。
中间体C16
{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
将373.4毫克（0.73毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯）中间体C15)最初装载在5.0毫升二氯甲烷中，并加入169.5毫克（1.68毫摩尔）三乙胺和181.0毫克（1.60毫摩尔）氯乙酰氯。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入乙酸乙酯并用水反复萃取。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上色谱分离（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇 = 100:0.5）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生336.0毫克（理论值的75%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.48 min；MS (ESIpos): m/z = 589 [M+H]+。
中间体C17
9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸
将50.0毫克（0.09毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯（中间体C16）最初装载在2.0毫升DMF中，并加入69.1毫克（0.21毫摩尔）碳酸铯和28.8毫克（0.10毫摩尔）1-硫烷基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸。在50℃下搅拌整夜。向反应混合物加入水且直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生25.1毫克（理论值的35%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.42 min；MS (ESIpos): m/z = 835 [M+H]+。
中间体C18
[22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十五烷-25-基]氨基甲酸叔丁酯
将21.0毫克（0.03毫摩尔）9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸（中间体C17）和5.8毫克（0.0.3毫摩尔）1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)最初装载在1.0毫升乙腈中，并加入26.1毫克（0.20毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和20.9毫克（0.03毫摩尔）T3P（50%在乙酸乙酯中）。在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生19.7毫克（理论值的79%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.42 min；MS (ESIpos): m/z = 835 [M+H]+。
中间体C19
(13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7,13-二氮杂-2-硅杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯
将58.5毫克（0.10毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯（中间体C16）最初装载在2.0毫升DMF中，并加入44.0毫克（0.20毫摩尔）(2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体L39）和64.7毫克（0.20毫摩尔）碳酸铯。在50℃下搅拌4小时。用46.6毫克（0.079毫摩尔）中间体C16重复该配制品。合并这两种反应混合物并直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生98.0毫克（理论值的71%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.62 min；MS (ESIpos): m/z = 774 [M+H]+。
中间体C20
三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将98.0毫克（0.13毫摩尔）(13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7,13-二氮杂-2-硅杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯（中间体C19）最初装载在2.0毫升DMF/叔丁醇（9:1）中，并加入96.2毫克（0.63毫摩尔）CsF。在90℃下搅拌16小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂并将残留物冻干。这产生57.1毫克（理论值的61%）标题化合物。该化合物还包含相应的亚砜。
LC-MS (方法1): Rt = 1.08 min；MS (ESIpos): m/z = 630 [M+H]+。
中间体C21
[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基]氨基甲酸叔丁酯
将57.1毫克（0.08毫摩尔）三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯（中间体C20）最初装载在3.0毫升DMF中，并加入53.0毫克（0.08毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和15.5毫克（0.15毫摩尔）三乙胺。在室温下搅拌16小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速:50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂并将残留物冻干。这产生49.7毫克（理论值的49%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 1204 [M+H]+。
中间体C22
[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-35-氧化-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35λ4-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基]氨基甲酸叔丁酯
作为中间体C21的合成中的副产物形成标题化合物。这产生15.5毫克（理论值的15%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.25 min；MS (ESIpos): m/z = 1220 [M+H]+。
中间体C23
3-氨基-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
立体异构体的混合物
将411.2毫克（1.15毫摩尔）3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（中间体L28）和339.7毫克（0.96毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C1）最初装载在6.0毫升二氯甲烷中，加入68.9毫克（1.15毫摩尔）HOAc并在室温下搅拌1小时。加入405.2毫克（1.91毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠并在室温下搅拌2小时。在真空下蒸发溶剂并将乙酸乙酯和水添加到残留物中。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱50 g SNAP, 流速40 ml/min, 石油醚/乙酸乙酯）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生541.5毫克（理论值的81%）化合物3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.24和1.29 min；MS (ESIpos): m/z = 698 [M+H]+。
将541.5毫克（0.78毫摩尔）3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在13.0毫升二氯甲烷中，并加入180.6毫克（1.78毫摩尔）三乙胺。将反应溶液冷却至0℃，加入233.1毫克（1.71毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯并在室温下搅拌16小时。加入另外180.6毫克（1.78毫摩尔）三乙胺和233.1毫克（1.71毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯，并在室温下搅拌另外80小时。在真空下蒸发溶剂并使残留物在水和乙酸乙酯之间分相。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱50 g SNAP, 流速40 ml/min, 石油醚/乙酸乙酯）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生529.2毫克（理论值的86%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.53和1.56 min；MS (ESIpos): m/z = 798 [M+H]+。
将529.2毫克（0.66毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在10.0毫升DMF/叔丁醇（9:1）中，并加入503.7毫克（3.32毫摩尔）CsF。将反应混合物在90℃下搅拌16小时。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分相。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次和经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱50 g SNAP,流速25 ml/min, 二氯甲烷/甲醇）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生172.4毫克（理论值的40%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.05和1.35 min；MS (ESIpos): m/z = 654 [M+H]+。
将172.4毫克（0.26毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-氨基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在4.5毫升甲醇/水（2:1）中，加入80.2毫克（0.58毫摩尔）碳酸钾并在室温下搅拌16小时。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分相。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生116.0毫克（理论值的72%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.01 min和1.03 min；MS (ESIpos): m/z = 612 [M+H]+。
中间体C24
三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1:1)
将26.8毫克N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C1）溶解在3.0毫升二氯甲烷中，加入5.2毫克（0.09毫摩尔）HOAc和22.4毫克（0.11毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠并在室温下搅拌5分钟。加入62.4毫克（0.09毫摩尔）3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（中间体L29）并在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1%TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生57.6毫克（理论值的91%）化合物三氟乙酸/3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.25和1.27 min；MS (ESIpos): m/z = 712 [M+H]+。
将77.0毫克（0.11毫摩尔）3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在1.5毫升二氯甲烷中，并加入21.9毫克（0.22毫摩尔）三乙胺。在0℃下，随后加入29.5毫克（0.22毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯并将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂并将残留物置于乙酸乙酯中。有机相用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂。用77.0毫克（0.11毫摩尔）基 3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯重复该配制品。合并的残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯 = 2:1）。这产生171.1毫克（理论值的85%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.56和1.57 min；MS (ESIpos): m/z = 812 [M+H]+。
将30.0毫克（0.04毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在0.5毫升TBAF溶液（1M在THF中）中。在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生25.0毫克（理论值的92%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 626 [M+H]+。
中间体C25
4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-甲酸
将171.4毫克（0.48毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C1）最初装载在4.0毫升二氯甲烷中，并加入248.5毫克（0.72毫摩尔）3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（中间体L30）和34.8毫克（0.58毫摩尔）HOAc。将反应混合物在室温下搅拌1小时。加入204.4毫克（0.97毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠并在室温下搅拌60小时。在真空下除去溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱25 g SNAP, 流速25 ml/min,石油醚/乙酸乙酯）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生267.0毫克（理论值的77%）化合物3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 683 [M+H]+。
将267.0毫克（0.39毫摩尔）3-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在5.0毫升二氯甲烷中，加入91.0毫克（0.90毫摩尔）三乙胺并冷却至0℃。加入117.4毫克（0.86毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯并在室温下搅拌16小时。加入另外593.4毫克（5.87毫摩尔）三乙胺和427.0毫克（3.13毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯，并在室温下搅拌另外10小时。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生216.3毫克（理论值的71%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.70和1.72 min；MS (ESIpos): m/z = 783 [M+H]+。
将216.3毫克（0.28毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在4.0毫升THF中，并加入16.6毫克（0.28毫摩尔）HOAc和361.1毫克（1.38毫摩尔）TBAF溶液（1M在THF中）。将反应溶液在室温下搅拌4小时。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生94.0毫克（理论值的51%）化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 669 [M+H]+。
将52.0毫克（0.08毫摩尔）3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在4.0毫升PBS缓冲液/乙腈（1:1）中，并加入1.2毫克（0.01毫摩尔）TEMPO。然后同时加入在1.0毫升水中的14.1毫克（0.16毫摩尔）亚氯酸钠和115.8微升（0.16毫摩尔）10%的次氯酸钠溶液。将反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物倒入10%的亚硫酸钠溶液中，并加入乙酸乙酯。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂且残留物不经进一步提纯即用于下一合成步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 683 [M+H]+。
将103.0毫克（0.15毫摩尔）4-{[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-甲酸最初装载在4.5毫升甲醇/水（2:1）中，加入45.9毫克（0.33毫摩尔）碳酸钾并在室温下搅拌3小时。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分相。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂且标题化合物不经进一步提纯即用于下一合成步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 1.35 min；MS (ESIpos): m/z = 641 [M+H]+。
中间体C26
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将590毫克（1.69毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和155微升（2.70毫摩尔，162毫克）乙酸最初装载在30毫升二氯甲烷中，并将该混合物在室温下搅拌30分钟。然后逐滴加入600毫克（1.687毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（由三氟乙酸/(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)通过用1N氢氧化钠水溶液萃取）和溶解在40毫升二氯甲烷中的750毫克（2.362毫摩尔）(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯。在室温下搅拌2小时。然后加入乙酸乙酯，该混合物用饱和碳酸钠溶液洗涤并浓缩有机相。残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生510毫克（理论值的46%）作为非对映体混合物的目标化合物。
异构体1:
LC-MS (方法1): Rt = 1.36 min (51%)；MS (EIpos): m/z = 657 [M+H]+。
异构体2:
LC-MS (方法1): Rt = 1.41 min (49%)；MS (EIpos): m/z = 657 [M+H]+。
中间体C27
乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯
将510毫克（0,776毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯最初装载在30毫升二氯甲烷中，并在室温下加入181毫克（249微升，1.786毫摩尔）三乙胺和219毫克（1.553毫摩尔）乙酸2-氯-2-氧代乙酯。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生290毫克（理论值的49%）作为差向异构体混合物的目标化合物。
异构体1:
LC-MS (方法1): Rt = 1.70 min；MS (EIpos): m/z = 757 [M+H]+。
异构体2:
LC-MS (方法1): Rt = 1.72 min；MS (EIpos): m/z = 757 [M+H]+。
中间体C28
乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-(羟甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯
将285毫克（0.376毫摩尔）乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯溶解在5毫升THF中。加入452微升（0.452毫摩尔）四正丁基氟化铵在THF中的1M溶液，并将反应混合物在室温下搅拌3小时。该反应混合物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）并冻干。这产生214毫克（理论值的81%，根据LC/MS的纯度 = 92%）作为差向异构体混合物的目标化合物。
异构体1:
LC-MS (方法1): Rt = 1.37 min；MS (EIpos): m/z = 643 [M+H]+。
异构体2:
LC-MS (方法1): Rt = 1.40 min；MS (EIpos): m/z = 643 [M+H]+。
中间体C29
乙酸2-([3-(乙酰基硫烷基)-2-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙酯
将210毫克（0.301毫摩尔）乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-(羟甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯最初装载在8毫升纯THF中，在室温下逐滴加入溶解在8毫升纯THF中的178毫克（1.503毫摩尔，109微升）亚硫酰氯并在室温下搅拌40分钟。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残留物置于16毫升纯DMF中，加入172毫克（1.503毫摩尔）硫代乙酸钾和133毫克（0.361毫摩尔）四正丁基碘化铵并在90℃下搅拌2小时。在冷却后，加入水并用乙酸乙酯萃取该混合物。有机相在旋转蒸发器上浓缩，残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水,梯度）并冻干。这产生155毫克（理论值的69%，根据LC/MS的纯度 = 94%)作为差向异构体混合物的目标化合物。
异构体1:
LC-MS (方法1): Rt = 1.50 min；MS (EIpos): m/z = 701 [M+H]+。
异构体2:
LC-MS (方法1): Rt = 1.51 min；MS (EIpos): m/z = 701 [M+H]+。
中间体C30
[二硫烷二基双(2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙-3,1-二基)]双氨基甲酸二-叔丁酯
将1.220克（1.010毫摩尔，根据LC/MS的纯度 = 58%）乙酸2-([3-(乙酰基硫烷基)-2-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙酯最初装载在30毫升THF和30毫升甲醇中，加入10毫升1 N氢氧化钠水溶液并在室温下搅拌2小时。向该反应混合物加入水并用二氯甲烷萃取。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生390毫克（理论值的54%，根据LC/MS的纯度 = 86%）作为非对映体混合物的目标化合物。
异构体:
LC-MS (方法1): Rt = 1.81 min；MS (EIpos): m/z = 1232 [M+H]+。
中间体C31
3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯
将390毫克（0.272毫摩尔，根据LC/MS的纯度 = 86%）[二硫烷二基双(2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙-3,1-二基)]双氨基甲酸二-叔丁酯置于20毫升1,4-二氧杂环己烷和10毫升PBS缓冲液中，并加入234毫克（0.817毫摩尔）3,3',3''-磷烷三基三丙酸盐酸盐(1:1)。在室温下搅拌16小时。然后将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并用二氯甲烷搅拌，浓缩滤液并在高真空下干燥。将残留物溶解在8毫升异丙醇中并通过手性色谱法提纯（柱: 250x30 mm，填充DaicelChiralpak AZ-H，洗脱剂: 异己烷/异丙醇 = 90:10）。这产生目标化合物的两个馏分。馏分1含有181.2毫克（理论值的50%）异构体1且馏分2产生90.2毫克（理论值的25%）异构体2。
异构体1:
Chiral HPLC (柱: 250x4.6 mm，填充Diacel Chiralpak AZ-H，洗脱剂: 异己烷/乙醇90:10): Rt = 6.98 min.
LC-MS (方法1): Rt = 1.47 min；MS (EIpos): m/z = 617 [M+H]+。
异构体2:
Chiral HPLC (柱: 250x4.6 mm，填充Diacel Chiralpak AZ-H，洗脱剂: 异己烷/乙醇90:10): Rt = 9.39 min.
LC-MS (方法1): Rt = 1.47 min；MS (EIpos): m/z = 617 [M+H]+。
中间体C32
N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1) (异构体1)
将123毫克（199.42微摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯（异构体1）溶解在2毫升THF中并与10毫升半浓缩盐酸一起在室温下搅拌1小时。该反应溶液在氩气下脱气，然后冻干。这产生108毫克（理论值的98%）目标化合物。
异构体1
LC-MS (方法1): Rt = 0.95 min；MS (EIpos): m/z = 517 [M+H]+。
中间体C33
N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1) (异构体2)
将123毫克（199.42微摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯（异构体2）溶解在2毫升THF中并与10毫升半浓缩盐酸一起在室温下搅拌1小时。该反应溶液在氩气下脱气，然后冻干。这产生58毫克（理论值的63%，根据LC/MS的纯度 = 91%）目标化合物。
异构体2
LC-MS (方法1): Rt = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 517 [M+H]+。
中间体C34
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将3.790克（10.02毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（获自三氟乙酸/(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)，通过用1N氢氧化钠水溶液萃取）、3.186克（15.04毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和690微升（12.03毫摩尔，722毫克）最初装载在100毫升二氯甲烷中。在室温下搅拌5分钟。
然后加入4.687克（27.06毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯，并在室温下搅拌16小时。该反应混合物用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。残留物通过硅胶上的色谱法提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/乙酸乙酯,梯度 = 4:1 → 1:1）。这产生2.57克（理论值的48%，根据LC/MS的纯度 = 96%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.00 min；MS (EIpos): m/z = 513 [M+H]+。
中间体C35
{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
将200毫克（0.38毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯最初装载在9毫升纯二氯甲烷中，并在室温下加入120微升（0.86毫摩尔，87毫克）三乙胺。在室温下，逐滴加入溶解在1毫升纯二氯甲烷中的83毫克（0.45毫摩尔）4-硝基苯甲酰氯，并在室温下搅拌1小时。加入水，并将该混合物在旋转蒸发器上浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）并干燥。这产生181毫克（理论值的73%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.47 min；MS (EIpos): m/z = 662 [M+H]+。
中间体C36
{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯
将170毫克（0.26毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯最初装载在10毫升乙酸中。加入143毫克（2.57毫摩尔）铁粉并在50℃下搅拌16小时。在冷却后，加入水并用乙酸乙酯萃取该混合物。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。残留物在HV下干燥。这产生154毫克（理论值的77%，根据LC/MS的纯度 = 82%）目标化合物。
LC-MS (方法5): Rt = 4.73 min；MS (EIpos): m/z = 632 [M+H]+。
中间体C37
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺
将38.6毫克（0.05毫摩尔，LC/MS纯度 = 82%）{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯溶解在纯DMF中，并加入24.8毫克（0.06毫摩尔）HATU和13.0毫克（0.10毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将该混合物在室温下搅拌5分钟，然后加入63毫克（0.06毫摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸并在室温下搅拌3小时。加入7.5毫克（0.06毫摩尔）3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇（HOAt）并搅拌16小时。加入19.1毫克（0.05毫摩尔）HATU并将该混合物在50℃下搅拌2小时。在冷却后，该反应混合物直接通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1%TFA, 梯度）。这产生6.5毫克（理论值的9%，根据LC/MS的纯度 = 83%）目标化合物。
LC-MS (方法2): Rt = 7.89 min；MS (EIpos): m/z = 1200.6 [M+H]+。
中间体C38
2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮
将300.0毫克（0.84毫摩尔）2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮（中间体C1）最初装载在4.0毫升二氯甲烷中，加入58.3毫克（0.97毫摩尔）HOAc和250.4毫克（1.18毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠并在室温下搅拌5分钟。加入197.2毫克（0.97毫摩尔）3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 乙酸乙酯/环己烷1:5）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生333.3毫克（70%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.05 min；MS (ESIpos): m/z = 543 [M+H]+。
中间体C39
乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯
将332.3毫克（0.61毫摩尔）2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮（中间体C38）最初装载在8.0毫升二氯甲烷中，并加入142.5毫克（1.35毫摩尔）三乙胺。在0℃下，加入184.0毫克（1.35毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 乙酸乙酯/环己烷1:3）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生367.1毫克（63%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.42 min；MS (ESIpos): m/z = 643 [M+H]+。
中间体C40
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
将583.1毫克（0.91毫摩尔）乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯（中间体C39）最初装载在15.0毫升乙醇中，并加入1.41克（18.15毫摩尔）甲胺（40%在水中）。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物与甲苯共蒸馏三次。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇 = 100:5）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生324.9毫克（73%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 471 [M+H]+。
中间体C41
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)
将50.0毫克（0.11摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）和30.4毫克（0.11毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯最初装载在2.0毫升DMF中，并加入32.2毫克（0.32毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入19.1毫克（0.32毫摩尔）HOAc，该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速:50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生38.0毫克（56%）化合物[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.26 min；MS (ESIpos): m/z = 642 [M+H]+。
将33.6毫克（0.05毫摩尔）[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯最初装载在3.0毫升二氯甲烷中。向反应混合物加入119.4毫克（1.05毫摩尔）TFA并在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生32.8毫克（96%）化合物三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 542 [M+H]+。
将29.5毫克（0.05毫摩尔）三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)和14.1毫克（0.05毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯最初装载在1.0毫升DMF中，并加入18.2毫克（0.18毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜并直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生23.1毫克（69%）化合物N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 1.30 min；MS (ESIpos): m/z = 741 [M+H]+。
将19.4毫克（0.03毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺溶解在1.5毫升二氯甲烷中，并加入59.7毫克（0.52毫摩尔）TFA。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入119.4毫克（1.04毫摩尔）TFA，并再在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min,MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生19.2毫克（97%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 641 [M+H]+。
中间体C42
四氟硼酸2,5-二氟苯重氮盐
最初装入3.00克（21.16毫摩尔，2.68毫升）三氟化硼-二乙醚络合物，并在0℃下缓慢地逐滴加入溶解在27毫升纯THF中的1.37克（10.58毫摩尔）2,5-二氟苯胺。在-10℃下，逐滴加入1.61克（13.75毫摩尔，1.85毫升）亚硝酸异戊酯溶解在3毫升纯THF中的溶液，并在相同温度下继续搅拌30分钟。加入15毫升二乙醚并滤出沉淀的重氮盐，用少量二乙醚洗涤并在高真空下干燥。这产生2.27克目标化合物（理论值的94%）。
LC-MS (方法6): Rt = 0.24 min；MS (ESIpos): m/z = 141 [M]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 8.11-8.17 (m, 1H), 8.36-8.43 (m,1H), 8.69-8.73 (m, 1H)。
中间体C43
氯[2-(2,5-二氟苯基)亚肼基]乙酸甲酯
在氩气气氛下，将3.63克（24.13毫摩尔）2-氯-3-氧代丁酸甲酯最初装载在100毫升水中，在-5℃下加入48.90克（618.19毫摩尔，50.00毫升）吡啶，并在此温度下搅拌10分钟。在-5℃下，然后加入5.00克（21.94毫摩尔）四氟硼酸2,5-二氟苯重氮盐，以致形成橙色悬浮液。在此温度下搅拌30分钟，该配制品用水稀释并用二氯甲烷萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。这产生5.52克目标化合物（理论值的97%，根据LC/MS的纯度 = 96%）。
LC-MS (方法1): Rt = 1.03 min；MS (ESIpos): m/z = 249 [M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.85 (s, 3H), 6.88-6.94 (m, 1H),7.16-7.21 (m, 1H), 7.31-7.37 (m, 1H), 10.00 (s, 1H)。
中间体C44
4-苯甲酰基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯
将3.50克（13.52毫摩尔）氯[2-(2,5-二氟苯基)亚肼基]乙酸甲酯（根据LC/MS的纯度96%）溶解在9毫升纯甲苯中，加入2.61克（14.87毫摩尔）(2E)-3-(二甲基氨基)-1-苯基丙-2-烯-1-酮和3.01克（29.73毫摩尔，4.14毫升）三乙胺并在室温下搅拌16小时。该反应混合物在旋转蒸发器上浓缩，残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/含0.1%甲酸的水, 梯度）。这产生1.79克（理论值的39%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 343 [M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.86 (s, 3H), 7.44-7.50 (m, 1H),7.55-7.72 (m, 4H), 7.81-7.87 (m, 3H), 8.80 (d, 1H)。
中间体C45
[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇
将3.18克（8.92毫摩尔）4-苯甲酰基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯（根据LC/MS的纯度 = 96%）最初装载在50毫升三氟乙酸中，逐滴加入8.74克（75.13毫摩尔，12毫升）三乙基硅烷并在室温下搅拌1小时。该反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将所得残留物置于120毫升纯THF中，并在0℃下逐滴加入2.89克（33.63毫摩尔，33.63毫升）硼烷-四氢呋喃络合物。搅拌整夜。由于低转化率，加入另外12.33毫升（12.33毫摩尔）在THF中的1M硼氢化锂溶液。在室温下搅拌1小时，在60℃下搅拌30分钟并在80℃下搅拌2小时。在0℃下，小心地用60毫升饱和碳酸氢钠溶液猝灭。该混合物用在每种情况下100毫升乙酸乙酯萃取两次，合并的有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥。这产生2.67克（理论值的76%，纯度 = 96%）目标化合物。
LC-MS (方法3): Rt = 2.79 min；MS (ESIpos): m/z = 329 [M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 3.91 (s, 2H), 4.45 (d, 2H), 6.51 (s,1H), 7.18-7.23 (m, 2H), 7.27-7.32 (m, 4H), 7.46-7.53 (m, 1H), 7.60-7.65 (m,1H), 7.95 (d, 1H)。
中间体C46
4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲醛
将2.66克（8.50毫摩尔）[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]甲醇（纯度96%）溶解在150毫升二氯甲烷中，并逐份加入4.33克（10.20毫摩尔）戴斯马丁氧化剂。将该混合物在室温下搅拌2小时，然后加入100毫升半浓缩碳酸氢钠溶液和100毫升10%的硫代硫酸钠溶液并搅拌20分钟。分离出有机相，经硫酸钠干燥并在高真空下浓缩。这产生2.35克（理论值的88%，纯度 = 95%）目标化合物。
LC-MS (方法7): Rt = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 299 [M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 4.12 (s, 2H), 7.17-7.21 (m, 1H),7.27-7.31 (m, 4H), 7.37-7.42 (m, 1H), 7.57-7.62 (m, 1H), 7.75-7.78 (m, 1H),8.22 (d, 1H), 10.06 (s, 1H)。
中间体C47
(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
将2.35克（7.56毫摩尔）4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-甲醛溶解在25毫升纯THF中，并加入1.10克（9.08毫摩尔）(R)-(+)-2-甲基-2-丙烷亚磺酰胺和4.73克（16.64毫摩尔）异丙醇钛(IV)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后加入20毫升饱和氯化钠溶液和30毫升乙酸乙酯。然后加入大约3克硅藻土，在回流下沸腾1小时。过滤并从滤液中分离有机相。水相用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即进一步使用。
在氩气气氛下，将残留物溶解在60毫升纯THF中并冷却至-78℃，逐滴加入14.5毫升（23.24毫摩尔）在戊烷中的叔丁基锂溶液（c = 1.6 mol/l）。在-78℃下搅拌3小时，然后用5毫升甲醇和15毫升饱和氯化铵溶液猝灭。在搅拌下，使反应混合物升温至室温（大约30分钟）。用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和氯化钠溶液萃取，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即进一步使用。
将残留物置于30毫升THF和6毫升甲醇中，加入6毫升（24.00毫摩尔）在二氧杂环己烷中的4N氯化氢溶液并在室温下搅拌1小时。然后加入15毫升饱和碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取。分离出有机相，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物通过制备型HPLC分离（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生目标化合物的两个馏分。第一馏分产生1.31克（理论值的72%，LC/MS纯度 = 97%）且第二馏分产生0.37克（理论值的17%，LC/MS纯度 = 83%）产物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 356 [M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.91 (s, 9H), 1.71 (s, 2H), 3.59 (s,1H), 3.87 (s, 2H), 7.17-7.32 (m, 6H), 7.45-7.51 (m, 1H), 7.61-7.65 (m, 1H),7.84(s br, 1H)。
中间体C48
(2S)-4-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯
将1.28克（3.35毫摩尔，LC/MS纯度 93%）(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶解在100毫升纯二氯甲烷中，并在室温下加入261毫克（4.35毫摩尔，250微升）乙酸和1.14克（4.34毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠，在搅拌5分钟后加入1.19克（4.35毫摩尔）(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯。在室温下搅拌15分钟，在旋转蒸发器上浓缩，置于乙腈和水中并通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水+ 0.1% TFA, 梯度）。这产生1.64克（理论值的80%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.10 min；MS (ESIpos): m/z = 613 [M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.01 (s, 9H), 1.32 (s, 9H), 1.35 (s,9H), 1.80-1.89 (m, 1H), 2.01-2.11 (m, 1H), 2.54-2.71 (m, 2H), 3.75-3.81 (m,1H), 3.90 (s, 2H), 4.18 (d, 1H), 7.13 (d, 1H), 7.20-7.24 (m, 1H), 7.28-7.34(m, 5H), 7.52-7.58 (m, 1H), 7.76-7.80 (m, 1H), 8.10 (s br, 1H), 8.23 (s br,1H)。
中间体C49
(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸
将225毫克（0.37毫摩尔）(2S)-4-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯溶解在10毫升纯二氯甲烷中，并加入156毫克（1.54毫摩尔）三乙胺。在0℃下，加入125毫克（0.92毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯，并在室温下搅拌16小时。加入另外251毫克（1.84毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯和186毫克（1.84毫摩尔）三乙胺，并在室温下搅拌3小时。加入少量二氯甲烷，用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残留物置于10毫升乙醇中，加入0.91毫升（12.67毫摩尔）40%的甲胺水溶液并在50℃下搅拌3小时。该混合物在旋转蒸发器上浓缩，将残留物置于二氯甲烷中，有机相用水洗涤两次。有机相经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残留物置于2毫升二氯甲烷中，加入2毫升（25.96毫摩尔）三氟乙酸并在50℃下搅拌4小时。该混合物在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥。将残留物置于10毫升纯二氯甲烷中，加入298毫克（2.95毫摩尔）三乙胺和429毫克（1.97毫摩尔）二碳酸二叔丁酯并在室温下搅拌1小时。该混合物在旋转蒸发器上浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水, 梯度）。这产生62毫克（理论值的27%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.32 min；MS (ESIpos): m/z = 615 [M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.91 (s, 9H), 1.32 (s, 9H), 2.64-2.72 (m, 4H), 3.50-3.58 (m, 1H), 3.72 (dd, 2H), 4.07-4.22 (m, 2H), 4.47-4.54(m, 1H), 5.75 (s, 1H), 6.84-6.89 (m, 1H), 7.15-7.30 (m, 6H), 7.47-7.53 (m,1H), 7.70-7.75 (m, 1H), 8.09-8.13 (m, 1H), 11.66 (s br, 1H)。
中间体C50
[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯
将60毫克（0.1毫摩尔）(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸溶解在10毫升纯DMF中，并加入74毫克（0.20毫摩尔）HATU。将74毫克（0.29毫摩尔）三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)单独溶解在2毫升纯DMF中，加入38毫克（0.29毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并逐滴添加到反应混合物中。在室温下搅拌3天。该混合物直接通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）。这产生9.3毫克（理论值的13%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 737 [M+H]+。
中间体C51
N-{(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸
首先，中间体C47类似于中间体C2用N-{(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酰基}-β-丙氨酸苄酯还原性烷基化。该仲氨基随后如对中间体C27所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化，这两种酯基团然后用在甲醇中的2M氢氧化锂溶液水解。这产生23毫克标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 686 (M+H)+。
中间体C52
(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺
将10.00克（49.01毫摩尔）4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯最初装载在100.0毫升DMF中，并加入20.76克（63.72毫摩尔）碳酸铯和9.22克（53.91毫摩尔）苄基溴。将反应混合物在室温下搅拌整夜。使反应混合物在水和乙酸乙酯之间分相，水相用乙酸乙酯萃取。合并的有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。用90.0克4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯重复该配制品。
这两个合并的配制品通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Daiso 300x100；10µ, 流速:250 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生125.15克（理论值的87%）化合物1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.18 min；MS (ESIpos): m/z = 295 [M+H]+。
在氩气下，将4.80克（16.32毫摩尔）1-苄基-4-溴-1H-吡咯-2-甲酸甲酯最初装载在DMF中，并加入3.61克（22.85毫摩尔）(2,5-二氟苯基)硼酸、19.20毫升饱和碳酸钠溶液和1.33克（1.63毫摩尔）[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯钯(II):二氯甲烷。将反应混合物在85℃下搅拌整夜。该反应混合物经C盐过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤。有机相用水萃取，然后用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯100:3）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生3.60克（理论值的67%）化合物1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯。
LC-MS (方法7): Rt = 1.59 min；MS (ESIpos): m/z = 328 [M+H]+。
将3.60克（11.00毫摩尔）1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲酸甲酯最初装载在90.0毫升THF中，并在0℃下加入1.04克（27.50毫摩尔）氢化锂铝（2.4 M在THF中）。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟。在0℃下，加入饱和酒石酸钾钠溶液并将乙酸乙酯添加到反应混合物中。有机相用饱和酒石酸钾钠溶液萃取三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂并将残留物溶解在30.0毫升二氯甲烷中。加入3.38克（32.99毫摩尔）氧化锰(IV)并在室温下搅拌48小时。加入另外2.20克（21.47毫摩尔）氧化锰(IV)并在室温下搅拌整夜。该反应混合物经C盐过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物2.80克(1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛)不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
LC-MS (方法7): Rt = 1.48 min；MS (ESIpos): m/z = 298 [M+H]+。
将28.21克（94.88毫摩尔）1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-甲醛与23.00克（189.77毫摩尔）(R)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺一起最初装载在403.0毫升纯THF中，加入67.42克（237.21毫摩尔）异丙醇钛(IV)并在室温下搅拌整夜。加入500.0毫升饱和NaCl溶液和1000.0毫升乙酸乙酯，并在室温下搅拌1小时。经硅藻土过滤，滤液用饱和NaCl溶液洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱1500+340 g SNAP, 流速200 ml/min, 乙酸乙酯/环己烷1:10）。
LC-MS (方法7): Rt = 1.63 min；MS (ESIpos): m/z = 401 [M+H]+。
将25.00克（62.42毫摩尔）(R)-N-{(E/Z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺最初在氩气下装载在纯THF中并冷却至-78℃。然后在-78℃下加入12.00克（187.27毫摩尔）叔丁基锂（在戊烷中的1.7 M溶液）并在此温度下搅拌3小时。在-78℃下，然后相继加入71.4毫升甲醇和214.3毫升饱和氯化铵溶液，并使反应混合物升温至室温并在室温下搅拌1小时。用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
LC-MS (方法6): Rt = 2.97 min；MS (ESIpos): m/z = 459 [M+H]+。
将28.00克（61.05毫摩尔）(R)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺最初装载在186.7毫升1,4-二氧杂环己烷中，然后加入45.8毫升HCl/1,4-二氧杂环己烷溶液（4.0 M）。将反应混合物在室温下搅拌2小时并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Kinetix 100x30；流速:60 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发乙腈并将二氯甲烷添加到含水残留物中。有机相用碳酸氢钠溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生16.2克（理论值的75%）标题化合物。
LC-MS (方法6): Rt = 2.10 min；MS (ESIpos): m/z = 338 [M-NH2]+, 709 [2M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s,1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1H), 6.94 (m, 1H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 1H),7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1H)。
中间体C53
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，中间体C52类似于C2用 (2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯还原性烷基化。该仲氨基随后如对中间体C27所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化，这两种酯基团然后用在甲醇中的2M氢氧化锂溶液水解。将由此获得的中间体溶解在乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化1小时。将脱保护的化合物置于二氧杂环己烷/水2:1中并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙基胺存在下使用氯碳酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基。
LC-MS (方法1): Rt = 1.37 min；MS (ESIpos): m/z = 734 (M-H)-。
中间体C54
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酰基]-β-丙氨酸
首先，中间体C52类似于中间体C2用N-[(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酰基]-β-丙氨酸苄酯还原性烷基化。该仲氨基随后如对中间体C27所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化。将由此获得的中间体溶解在乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化1小时。这两种酯基团然后用在甲醇中的2M氢氧化锂溶液水解。将脱保护的化合物置于二氧杂环己烷/水2:1中并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙基胺存在下使用氯碳酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基。这产生48毫克标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.38 min；MS (ESIpos): m/z = 807 (M+H)+。
中间体C55
2-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮
将340毫克（0.96毫摩尔）(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶解在7毫升纯DCM中，并在室温下加入69毫克（1.15毫摩尔，60微升）乙酸和284毫克（1.34毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠。搅拌15分钟，然后加入233毫克（1.15毫摩尔）3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将该混合物在室温下搅拌4.5小时。加入另外233毫克（1.15毫摩尔）3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛、69毫克（1.15毫摩尔，60微升）乙酸和284毫克（1.34毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠，并在室温下搅拌7小时。向该反应混合物加入乙酸乙酯，用饱和碳酸钠溶液洗涤。浓缩有机相，残留物通过制备型HPLC提纯两次 [1.) 洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度；2.) 洗脱剂: ACN/水 + 1%TFA+1.0% NEt3]。这产生108毫克（理论值的21%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 543 [M+H]+。
中间体C56
乙酸2-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯
将102毫克（0.19毫摩尔）2-[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮最初装载在2毫升纯DCM中，并在室温下加入44毫克（0.43毫摩尔）三乙胺。在0℃下，加入溶解在1毫升纯DCM中的31毫克（0.23毫摩尔）乙酸2-氯-2-氧代乙酯。将该混合物在室温下搅拌40分钟。将另外26毫克乙酸2-氯-2-氧代乙酯溶解在0.5毫升纯DCM中，加入19毫克（0.19毫摩尔）三乙胺，并将该混合物在室温下搅拌60分钟。
加入水，该混合物在旋转蒸发器上浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯（洗脱剂:ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）。这产生106毫克（理论值的88%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.37 min；MS (ESIpos): m/z = 643 [M+H]+。
中间体C57
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)
根据标准方法通过在HATU存在下将中间体C49与(2-氨基乙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯偶联和随后用哌啶裂解Fmoc保护基来制备标题化合物。这产生14毫克标题化合物（经2个步骤，理论值的40%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 657 (M+H)+。
中间体C58
(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸
首先，中间体C52类似于中间体C2用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯还原性烷基化。该仲氨基随后如对中间体C27所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯酰化，这两种酯基团然后用在甲醇中的2M氢氧化锂溶液水解。将由此获得的中间体溶解在乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化1小时。
将500毫克（0.886毫摩尔）这种完全脱保护的中间体置于60毫升二氧杂环己烷中，并加入253毫克（0.975毫摩尔）1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和198微升三乙胺。在室温下搅拌24小时后，浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的合并、在真空下浓缩和在高真空下的干燥后产生312毫克（理论值的50%）标题化合物。
LC-MS (方法5): Rt = 4.61 min；MS (ESIpos): m/z = 658 (M+H)-。
中间体C59
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
首先，(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸苄酯的仲氨基如对中间体C53所述在三乙胺存在下用(2S)-2-甲氧基丙酰氯（中间体C53的中间体）酰化。将所得中间体置于乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化1小时。将脱保护的化合物置于二氧杂环己烷/水2:1中并在最后步骤中在N,N-二异丙基乙基胺存在下使用氯碳酸9H-芴-9-基甲酯引入Fmoc保护基。
LC-MS (方法1): Rt = 1.39 min；MS (ESIpos): m/z = 764 (M-H)-。
中间体C60
(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸
类似于中间体C53进行合成。
LC-MS (方法1): Rt = 1.41 min；MS (ESIpos): m/z = 750 (M+H)+。
中间体C61
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-β-丙氨酸
通过将60毫克（0.091毫摩尔）中间体C58与β-丙氨酸甲酯偶联、接着用2M氢氧化锂溶液进行酯裂解，制备标题化合物。这经2个步骤产生67毫克（理论值的61%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.29 min；MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+。
中间体C62
N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-D-丙氨酸
类似于中间体C61由中间体C58和D-丙氨酸甲酯制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.32 min；MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+。
中间体C63
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)
这种中间体的合成在第一步骤中以50毫克（0.075毫摩尔）中间体C3与26.2毫克（0.082毫摩尔）(2-氨基乙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯盐酸盐(1:1)在28.7毫克（0.15毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、22.9毫克（0.15毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和39微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联开始。在室温下搅拌18小时后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生45毫克（理论值的65%）这种中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.51 min；MS (ESIpos): m/z = 921 (M+H)+。
将45毫克（0.049毫摩尔）这种中间体置于10毫升乙醇中并加入176微升40%的甲胺水溶液。在50℃下搅拌该配制品，在6小时后和在9小时后加入相同量的甲胺溶液。在50℃下进一步搅拌14小时后，加入另外700微升甲胺溶液，并在进一步搅拌24小时后，最后浓缩。将残留物置于DCM中并用水洗涤。浓缩有机相，残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物在高真空下的干燥后产生32毫克（理论值的99%）{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.95 min；MS (ESIpos): m/z = 657 (M+H)+。
中间体C64
三氟乙酸/{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
类似于中间体C63由中间体C58制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.4 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.01 min；MS (ESIpos): m/z = 700 (M+H)+。
中间体C65
(8S)-8-{2-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-(乙醇酰)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
将215毫克（0.59毫摩尔）中间体L66最初装载在25毫升二氯甲烷中并加入377毫克（0.89毫摩尔）戴斯马丁氧化剂和144微升（1.78毫摩尔）吡啶。在室温下搅拌30分钟。该配制品然后用300毫升二氯甲烷稀释，有机相用10%的Na2S2O3溶液、10%的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液各洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。这产生305毫克醛，其不经进一步提纯即反应。
将175毫克（0.49毫摩尔）中间体C52溶解在50毫升二氯甲烷中，并加入147毫克（0.69毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和32.5微升乙酸。在室温下搅拌5分钟后，加入214毫克（0.593毫摩尔）上述醛，并将该配制品在室温下搅拌整夜。在此，代替预期产物，形成[(2S)-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丁烷-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。由于这种酰亚胺也可转化成标题化合物，浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。在合并适当的含酰亚胺的馏分后，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生195毫克（58%）上文指定的酰亚胺。
LC-MS (方法5): Rt = 3.32 min；MS (ESIpos): m/z = 667 (M+H)+。
将65毫克（97.5微摩尔）这种酰亚胺置于15毫升二氯甲烷中，并加入367微升（3.4毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯和595微升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌30分钟后，在真空下在不加热下浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分并在溶剂蒸发和在高真空下干燥后产生28毫克（理论值的37%）乙酸(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.44 min；MS (ESIpos): m/z = 767 (M+H)+。
将28毫克（37微摩尔）这种中间体溶解在3毫升甲醇中，并加入548微升2M氢氧化锂溶液。在室温下搅拌10分钟后，用三氟乙酸将该配制品调节至pH 4，然后浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分，蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥后，产生26毫克（理论值的96%）白色固体形式的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.33 min；MS (ESIpos): m/z = 743 (M+H)+。
中间体C66
[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-{[2-(甘氨酰氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
首先，根据肽化学的经典方法（HATU偶联和Boc裂解）由N-[(苄氧基)羰基]甘氨酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸苄酯(1:1)。
将13毫克（0.036毫摩尔）这种中间体和25毫克（0.033毫摩尔）中间体C58置于3毫升DMF中，并加入19毫克（0.05毫摩尔）HATU和17微升N,N-二异丙基乙基胺。
在室温下搅拌10分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生17.8毫克（理论值的60%）中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.36 min；MS (ESIpos): m/z = 891 (M+H)+。
将17毫克（0.019毫摩尔）这种中间体溶解在10毫升乙醇中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化2小时。滤出催化剂，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生9毫克（理论值的62%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.03 min；MS (ESIpos): m/z = 757 (M+H)+。
中间体C67
[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
将605.3毫克（1.71毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（中间体C52）最初装载在10.0毫升二氯甲烷中，加入506.7毫克（2.39毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和117.9毫克（1.96毫摩尔）乙酸并在室温下搅拌5分钟。将580.0毫克（1.96毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯（中间体L70）溶解在10.0毫升二氯甲烷中并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯3:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生514.7毫克（理论值的46%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.10 min；MS (ESIpos): m/z = 634 (M+H)+。
中间体C68
[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
与化合物中间体C67的合成类似地进行该合成。
1000.0毫克（2.81毫摩尔）(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（中间体C47）
835.0毫克（3.94毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠
194.0毫克（3.24毫摩尔）乙酸
560.0毫克（3.24毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
这产生695.8毫克（理论值的48%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.02 min；MS (ESIpos): m/z = 513 (M+H)+。
中间体C69
11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸
将117.0毫克（0.19毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C70）和21.6毫克（0.20毫摩尔）3-硫烷基丙酸最初装载在3.0毫升甲醇中，加入89.5毫克（0.65毫摩尔）碳酸钾并在50℃下搅拌4小时。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。该残留物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。这产生106.1毫克（理论值的73%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.42 min；MS (ESIneg): m/z = 700 (M-H)-。
中间体C70
{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸(2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
将908.1毫克（1.63毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（见中间体C11的合成）和545.6毫克（5.39毫摩尔）三乙胺最初装载在10.0毫升二氯甲烷中，并冷却至0℃。在此温度下，加入590.5毫克（5.23毫摩尔）氯乙酰氯并在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液各洗涤三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ,流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生673.8毫克（理论值的65%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.53 min；MS (ESIneg): m/z = 676 (M+HCOO-)-。
中间体C71
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将536.6毫克（4.43毫摩尔）L-半胱氨酸与531.5毫克（6.33毫摩尔）碳酸氢钠一起悬浮在2.5毫升水中。加入溶解在25.0毫升异丙醇中的400.0毫克（0.63毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C70）和1.16克（7.59毫摩尔）1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌1.5小时。将乙酸乙酯添加到反应混合物中，有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤和用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱:Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生449.5毫克（理论值的86%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.20 min；MS (ESIpos): m/z = 717 (M+H)+。
中间体C72
(9S)-9-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰) 氨基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸
将90毫克（0.212毫摩尔）中间体L72最初装载在6毫升二氯甲烷中，并加入86微升（1.06毫摩尔）吡啶和135毫克（0.318毫摩尔）戴斯马丁氧化剂。在室温下搅拌30分钟。该配制品然后用30毫升二氯甲烷稀释，有机相用10%的Na2S2O3溶液洗涤两次和用5%的柠檬酸溶液洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。由此获得的醛不经进一步提纯即反应。
将63毫克（0.177毫摩尔）中间体C52溶解在15毫升二氯甲烷中，并加入52.4毫克（0.247毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和20.2微升乙酸。在室温下搅拌5分钟后，加入89.6毫克（0.212毫摩尔）上述醛，并将该配制品在室温下搅拌20分钟。该配制品在真空下浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。在合并适当的馏分后，在真空下蒸发溶剂，残留物从乙腈/水中冻干。这产生71毫克（经2个步骤，理论值的53%）(9R)-9-[({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.21 min；MS (ESIpos): m/z = 761 (M+H)+。
将70毫克（92微摩尔）这种中间体置于15毫升二氯甲烷中，冷却至10℃并加入54微升三乙胺和25.5微升（0.23毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯。在室温下搅拌1小时后，再加入相同量的酰基氯和三乙胺，并在室温下下搅拌另外1小时后再次加入。该配制品随后在室温下搅拌另外30分钟，然后在真空下浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分，在溶剂蒸发和残留物从乙腈/水中冻干后产生46.5毫克（理论值的59%）酰化中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.53 min；MS (ESIpos): m/z = 861 (M+H)+。
将46毫克（53微摩尔）这种中间体溶解在5毫升甲醇中，并加入2.7毫升2M氢氧化锂溶液。在室温下搅拌10分钟后，用乙酸将该配制品调节至pH 3-4，然后用15毫升水稀释。水相用乙酸乙酯萃取，有机相经硫酸镁干燥并浓缩。残留物从乙腈/水中冻干并在残留物在高真空下干燥后产生37毫克（理论值的90%）白色固体形式的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.32 min；MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H)+。
中间体C73
S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-L-半胱氨酸
将619毫克（0.86毫摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（中间体C71）最初装载在8.8毫升二氯甲烷中，并加入87毫克（0.86毫摩尔）三乙胺和224毫克（0.86毫摩尔）N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。在1小时后，加入45毫克（0.17毫摩尔）N-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在室温下搅拌1小时。该混合物在真空下浓缩，将残留物置于二氯甲烷中，有机相然后用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。有机相经硫酸镁干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即进一步使用。这产生602毫克（71%，纯度 87%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.58 min；MS (ESIpos): m/z = 861 (M+H)+。
中间体L1
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)
通过肽化学的经典方法由市售(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.19 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.17 min；MS (ESIpos): m/z = 198 (M+H)+。
中间体L2
三氟乙酸/rel-(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由50毫克（0.214毫摩尔）市售顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷甲酸和60毫克（0.235毫摩尔）同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过与EDC/HOBT偶联和随后用TFA脱保护制备标题化合物。这产生36毫克（经2个步骤，理论值的38%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.2 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.17 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+。
中间体L3
三氟乙酸/(1S,2R)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由50毫克（0.214毫摩尔）市售(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸与72毫克（0.283毫摩尔）同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过与EDC/HOBT偶联和随后用TFA脱保护制备标题化合物。这产生13毫克（经2个步骤，理论值的16%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.2 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.2 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+。
中间体L4
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环己烷甲酰胺(1:1)
通过肽化学的经典方法由市售1-[(4-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)甲基]-1H-吡咯-2,5-二酮和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.26 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.25 min；MS (ESIpos): m/z = 280 (M+H)+。
中间体L5
三氟乙酸/N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-β-丙氨酰胺(1:1)
通过肽化学的经典方法由市售1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮和N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.22 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.22 min；MS (ESIpos): m/z = 260 (M+H)+。
中间体L6
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过最初在EDC/HOBT存在下将市售6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸与通过肽化学的经典方法制成的部分保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯偶联，制备标题化合物。此后在温和条件下通过在室温下在DCM中的5%三氟乙酸中搅拌而在氨基处脱保护，这以37%的收率产生标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.29 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.62 min；MS (ESIpos): m/z = 566 (M+H)+。
中间体L7
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
根据肽化学的经典方法由市售1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过相继在HATU存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护而制备标题化合物。这产生32毫克标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.31 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.47 min；MS (ESIpos): m/z = 516 (M+H)+。
中间体L8
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
根据肽化学的经典方法由市售1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过相继在HATU存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护而制备标题化合物。这产生171毫克标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.23 min；
LC-MS (方法7): Rt = 0.3 min；MS (ESIpos): m/z = 417 (M+H)+。
中间体L9
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
类似于中间体L7由市售(4-氨基苯基)乙酸甲酯制备标题化合物。这产生320毫克标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.45 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.48 min；MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H)+。
中间体L10
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-rel-N6-{[(1R,2S)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)
由中间体L6通过用EDC/HOBT与顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷甲酸偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。这产生12毫克（经2个步骤，理论值的52%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.45 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.73 min；MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)+。
中间体L11
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1S,2R)-2-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)
由中间体L6通过用EDC/HOBT与(1S,2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。这产生11毫克（经2个步骤，理论值的39%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.45 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.74 min；MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)+。
中间体L12
三氟乙酸/1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
将381毫克（2.46毫摩尔）2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯添加到溶解在7毫升二氧杂环己烷/水1:1中的228毫克（1.12毫摩尔）[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯中。然后加入1.2毫升饱和碳酸氢钠溶液并在室温下搅拌该配制品。在搅拌总共5天和另外两次加入相同量的碳酸氢钠溶液后，该配制品通过用三氟乙酸酸化、在旋转蒸发器上浓缩和通过制备型HPLC提纯而后处理。合并适当的馏分，在真空下除去溶剂，且残留物从乙腈/水1:1中冻干。
将残留物置于3毫升二氯甲烷中并加入1毫升三氟乙酸。在室温下搅拌15分钟后，在真空下除去溶剂，且残留物从乙腈/水1:1中冻干。这产生70毫克（经2个步骤，理论值的67%）树脂状残留物形式的标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.2 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.18 min；MS (ESIpos): m/z = 185 (M+H)+。
中间体L13
三氟乙酸/N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过类似于中间体L6在EDC/HOBT存在下将(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸与N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联和随后温和裂解叔丁氧基羰基保护基而制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.42 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.43 min；MS (ESIpos): m/z = 340 (M+H)+。
中间体L14
三氟乙酸/1-[2-(4-氨基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
类似于中间体L2由哌嗪-1-基氨基甲酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸经2个步骤制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.2 min；
LC-MS (方法3): Rt = 0.25 min；MS (ESIpos): m/z = 239 (M+H)+。
中间体L15
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺(1:1)
将2.93克（10.58毫摩尔）3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯溶解在100毫升二氧杂环己烷/水1:1中，并加入3.28克（21.15毫摩尔）2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯和饱和碳酸氢钠溶液直至达到6-7的pH。将该溶液在室温下搅拌30分钟，然后在真空下蒸发1,4-二氧杂环己烷。然后加入200毫升水，并将该混合物用每次300毫升乙酸乙酯萃取三次。合并有机萃取物，经硫酸镁干燥并过滤。浓缩后产生棕色油形式的3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸叔丁酯，其随后在高真空下干燥。
HPLC (方法11): Rt = 1.5 min；
LC-MS (方法3): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 375 (M+NH4)+。
这种中间体通过标准方法（用TFA脱保护、与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯偶联和再次用TFA脱保护）转化成标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.2 min；
LC-MS (方法3): Rt = 0.25 min；MS (ESIpos): m/z = 344 (M+H)+。
中间体L16
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将535毫克（1.73毫摩尔）市售1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮和930毫升N,N-二异丙基乙基胺添加到266毫克（1.33毫摩尔）L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸在24毫升DMF中的溶液中。该配制品在超声浴中处理24小时，然后在真空下浓缩至干。留下的残留物通过制备型HPLC提纯并在适当馏分的浓缩和残留物在高真空下的干燥后产生337毫克（理论值的50%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.4 min；
LC-MS (方法3): Rt = 0.58 min；MS (ESIpos): m/z = 468 (M+H)+。
中间体L17
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过最初在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙基胺存在下将172毫克（0.37毫摩尔）中间体L16和125毫克（0.37毫摩尔）N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联、然后通过在室温下在DCM中的10%三氟乙酸中搅拌2小时在温和条件下将氨基脱保护，制备标题化合物。从乙腈/水中冻干后经2个步骤产生194毫克（理论值的49%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.1 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.58 min；MS (ESIpos): m/z = 652 (M+H)+。
中间体L18
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
由(4-氨基苯基)乙酸甲酯类似于中间体L7相继根据肽化学的经典方法通过在HATU存在下连接N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护而制备标题化合物，这产生330毫克标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.29 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.41 min；MS (ESIpos): m/z = 465 (M+H)+。
中间体L19
三氟乙酸/L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-L-鸟氨酰胺(1:1)
由1,4-苯二胺相继根据肽化学的经典方法制备标题化合物。在第一步骤中，942毫克（8.72毫摩尔）1,4-苯二胺在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下用0.8克（2.9毫摩尔）N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸单酰化。在第二步骤中，以类似方式，第二苯胺氨基在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下用(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸酰化。用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护随之在3个进一步合成步骤中产生标题化合物，通过这一途径获得148毫克。
LC-MS (方法1): Rt = 0.21 min；MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)+.
LC-MS (方法4): Rt = 0.2 min；MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H)+。
中间体L20
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
根据肽化学的经典方法类似于中间体L8由市售1-(4-氨基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过相继在HATU存在下与N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸偶联、用TFA脱保护、与N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和再次用TFA脱保护而制备标题化合物，这产生171毫克标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.28 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.39 min；MS (ESIpos): m/z = 445 (M+H)+。
中间体L21
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-赖氨酰胺
根据肽化学的经典方法由市售0.42克（2.56毫摩尔）(4-氨基苯基)乙酸甲酯通过相继在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下与N6-(叔丁氧基羰基)-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸偶联、用哌啶脱保护、在N,N-二异丙基乙基胺存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和随后经10%钯-活性炭进行氢解裂解苄氧基羰基保护基而制备标题化合物。这产生360毫克（经4个步骤，理论值的32%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.5 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.73 min；MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H)+。
中间体L22
三氟乙酸/N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(2S)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]苯基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)
由N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯基丙氨酸相继根据肽化学的经典方法制备标题化合物。2.5克（8.06毫摩尔）这种原材料在第一步骤中首先转化成铯盐，然后在DMF中用碘甲烷转化成甲酯。
然后在甲醇经10%钯-活性炭氢解地将硝基转化成氨基。
由此生成的氨基随后在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下在DMF中用 N5-氨基甲酰基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酸酰化。在下一步骤中，在DMF中用哌啶裂解Fmoc基团。
然后在DMF中在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、水合1-羟基-1H-苯并三唑和N,N-二异丙基乙基胺存在下与N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸进行偶联，最后用三氟乙酸裂解叔丁氧基羰基。
HPLC (方法11): Rt = 1.6 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.77 min；MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H)+。
中间体L23
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-β-丙氨酰胺(1:1)
由市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在EDCI/HOBT和N,N-二异丙基乙基胺存在下与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.19 min。
中间体L24
三氟乙酸/1-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环丙烷甲酰胺(1:1)
将114毫克（0.67毫摩尔）市售1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷甲酸溶解在25毫升DCM中，加入110毫克（0.623毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)和395微升N,N-二异丙基乙基胺并冷却至-10℃。然后加入217毫克（0.793毫摩尔）2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐，并将该配制品在室温下搅拌2小时。然后用乙酸乙酯稀释并相继用10%的柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液萃取，然后经硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下的干燥后产生152毫克受保护的中间体。
然后将这些置于10毫升DCM中并用1毫升三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干后产生158毫克（经2个步骤，理论值的71%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.19 min.
LC-MS (方法3): Rt = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 224 (M+H)+。
中间体L25
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将31.4毫克（0.17毫摩尔）缬氨酰基-L-丙氨酸溶解在3.0毫升DMF中并加入115.0毫克（0.17毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和33.7毫克（0.0.33毫摩尔）三乙胺。在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生74.1毫克（理论值的58%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.61 min；MS (ESIpos): m/z = 763 [M+H]+。
中间体L26
L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将600.0毫克（1.58毫摩尔）N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸悬浮在25.0毫升水/乙醇/THF（1:1:0.5）中，加入钯碳(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化5小时。滤出催化剂并在真空下蒸发溶剂。所得化合物不经进一步提纯即用于下一步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 0.42 min；MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]+。
将180毫克（0.73毫摩尔）N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0毫升DMF中并加入74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。然后加入254.6毫克（0.73毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌3.5小时。该反应溶液直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生294.1毫克（理论值的76%）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]+。
将272.2毫克（0.57毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸最初装载在20.0毫升乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）中并加入27.2毫克钯-活性炭。在室温下在标准压力下用氢气氢化5小时。借助Celite(R)滤出，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）后洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。标题化合物（182毫克，理论值的72%）不经进一步提纯即用于下一反应步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 0.53 min；MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]+。
中间体L27
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
将30毫克（0.07毫摩尔）L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸（中间体L26）和46.1毫克（0.07毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺最初装载在1.5毫升DMF中并加入6.8毫克（0.07毫摩尔）4-甲基吗啉。该反应溶液在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生55.6毫克（理论值的90%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.77 min；MS (ESIpos): m/z = 920 [M+H]+。
中间体L28
3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
将461.7毫克（1.15毫摩尔）3-乙基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1,3-二甲酸1-叔丁酯（根据WO 2006/066896的文献程序制备这种化合物）最初装载在5.0毫升纯二氯甲烷中并冷却至-78℃。然后逐滴缓慢加入326.2毫克（2.29毫摩尔）二异丁基氢化铝溶液（1 M在THF中）并在-78℃下搅拌2小时（通过薄层色谱法监测（石油醚/乙酸乙酯 = 3:1））。逐滴加入溶解在60毫升水中的1.3克（4.59毫摩尔）酒石酸钾钠并使反应混合物升温至室温。将乙酸乙酯添加到反应混合物中，水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生629.0毫克作为粗产物的标题化合物，其不经进一步提纯即立即用于下一反应步骤。
中间体L29
3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
非对映体的混合物
将807.1毫克（2.34毫摩尔）3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（根据WO 2006/100036的文献程序制备）最初装载在8.0毫升二氯甲烷中并加入236.4毫克（2.34毫摩尔）三乙胺。在0℃下，逐滴加入267.6毫克（2.34毫摩尔）甲磺酰氯，并将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入另外133.8毫克（1.17毫摩尔）甲磺酰氯和118.2毫克（1.17毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液、5%的硫酸氢钾溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在Biotage Isolera上提纯（硅胶，柱50 g SNAP, 流速66ml/min, 环己烷/乙酸乙酯）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生402.0毫克（理论值的41%）化合物3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.38 min；MS (ESIpos): m/z = 424 [M+H]+。
将400.0毫克（0.94毫摩尔）3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在5.0毫升DMF中并加入98.2毫克（1.51毫摩尔）叠氮化钠。将反应混合物在40℃下搅拌10小时。然后加入另外30.7毫克（0.47毫摩尔）叠氮化钠并在40℃下搅拌另外10小时。加入乙酸乙酯，该有机相用水反复洗涤。在有机相经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生309.5毫克（理论值的89%）化合物3-(叠氮甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。该化合物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 1.50 min；MS (ESIpos): m/z = 371 [M+H]+。
将250毫克（0.68毫摩尔）3-(叠氮甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在10.0毫升乙酸乙酯/乙醇(1:1)中并加入25.0毫克钯-活性炭(10%)。在室温下在标准压力下用氢气氢化8小时。该反应经Celite(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯充分洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生226.2毫克（理论值的82%）化合物3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。该化合物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 345 [M+H]+。
将715.0毫克（2.08毫摩尔）3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯溶解在15.0毫升THF中并加入2.28毫升（2.28毫摩尔）TBAF溶液（1M在THF中）。将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物（1.54克）不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 0.41 min；MS (ESIpos): m/z = 231 [M+H]+。
将1.54克（4.88毫摩尔）3-(氨基甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在1,4-二氧杂环己烷中，加入541.8毫克（4.88毫摩尔）氯化钙（无水）和488.6毫克（4.88毫摩尔）碳酸钙，并剧烈搅拌。然后加入592.8毫克（5.86毫摩尔）三乙胺和1.52克（5.86毫摩尔）1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮并将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入644.9毫克（10.7毫摩尔）HOAc和乙酸乙酯。有机相用水洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇 = 100:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生346.9毫克（理论值的19%）化合物3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.08 min；MS (ESIpos): m/z = 375 [M+H]+。
将804.0毫克（2.15毫摩尔）3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在20.0毫升氯仿和20.0毫升0.05 N碳酸钾/0.05 N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入59.7毫克（0.22毫摩尔）四正丁基氯化铵、429.9毫克（3.22毫摩尔）N-氯琥珀酰亚胺和33.5毫克（0.22毫摩尔）TEMPO并将反应混合物在室温下剧烈搅拌整夜。分离出有机相并在真空下脱除溶剂。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯 = 3:1）。这产生517.0毫克（理论值的46%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.13 min；MS (ESIpos): m/z = 373 [M+H]+。
中间体L30
3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-甲酸叔丁酯
立体异构体的混合物
将250.0毫克（0.72毫摩尔）3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（根据WO2006/100036的文献程序制备该化合物）最初装载在12.5毫升二氯甲烷/DMSO（4:1）中并加入219.6毫克（2.17毫摩尔）三乙胺。在2℃下，逐份加入345.5毫克（2.17毫摩尔）三氧化硫-吡啶络合物并在2℃下搅拌3小时。逐份加入另外345.5毫克（2.17毫摩尔）三氧化硫-吡啶络合物并在室温下搅拌17小时。使反应混合物在二氯甲烷和水之间分相。水相用二氯甲烷萃取三次，合并的有机相用水洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤（薄层色谱法: 石油醚/乙酸乙酯7:3）。
中间体L31
{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙二酸二-叔丁酯
将57.2克（488.27毫摩尔）氨基甲酸叔丁酯、51.2毫升（683.57毫摩尔）37%的甲醛水溶液和25.9克（244.13毫摩尔）碳酸钠添加到600毫升水中。使该混合物升温直至形成溶液，然后在室温下搅拌16小时。形成的悬浮液用500毫升二氯甲烷萃取并分离出有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤并经硫酸钠干燥。在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥，以产生结晶固体。将残留物置于1000毫升纯THF中，并在室温下逐滴加入322毫升（3.414摩尔）乙酸酐和138毫升（1.707摩尔）吡啶的混合物。将反应混合物在室温下搅拌16小时，然后在旋转蒸发器上借助室温下的水浴浓缩。将残留物置于二乙醚中并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次和用饱和氯化钠溶液洗涤一次。有机相经硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥2天。将残留物置于2000毫升纯THF中，并在冰冷却下加入456毫升（456.52毫摩尔）叔丁醇钾在THF中的1M溶液。在0℃下搅拌20分钟，然后逐滴加入溶解在200毫升纯THF中的100.8克（456.52毫摩尔）丙二酸二叔丁酯。在室温下搅拌48小时，然后加入水。该反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并置于500毫升乙酸乙酯中。该混合物用500毫升水和100毫升饱和氯化钠溶液洗涤，有机相经硫酸钠干燥。有机相在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥。该残留物通过经硅胶过滤提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯, 梯度 = 30:1 → 5:1）。这产生37.07克（理论值的22%）目标化合物。
LC-MS (方法6): Rt = 2.87 min；MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]+。
中间体L32
[3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将37.0克（107.11毫摩尔）(乙酰氧基甲基)丙二酸二-叔丁酯溶解在1000毫升纯THF中，并在冰冷却下逐滴加入535.5毫升（1071.10毫摩尔）硼氢化锂在THF中的2M溶液。逐滴加入19.3毫升（1071.10毫摩尔）水并在室温下搅拌4.5小时。该反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残留物置于1500毫升乙酸乙酯中，加入100毫升水，并在冰冷却下搅拌（轻微放热）30分钟。分离出有机相，水相用500毫升乙酸乙酯萃取两次。有机相在旋转蒸发器上浓缩，残留物在高真空下干燥。这产生20.7克（理论值的94%）目标化合物。
LC-MS (方法6): Rt = 1.49 min；MS (EIpos): m/z = 106 [M-C5H8O2]+。
中间体L33
[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯
将20.00克（97.44毫摩尔）[3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在1000毫升纯二氯甲烷中并在室温下加入6.63克（97.44毫摩尔）咪唑和16.16克（107.18毫摩尔）叔丁基(氯)二甲基硅烷。在室温下搅拌16小时并用半浓缩氯化钠溶液洗涤该反应混合物。水相用乙酸乙酯萃取，合并的有机相经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。这产生28.50克（理论值的92%）目标化合物。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.02 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 1.37(s, 9H), 1.58-1.73 (m, 1H), 2.91 (q, 2H), 3.33-3.36 [m, (2H, obscured)],3.53-3.58 (m, 2H), 6.65-6.72 (m, 1H)。
中间体L34
(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯
将12.65克（39.591毫摩尔）[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟基-甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在200毫升二氯甲烷中并在室温下逐滴加入溶解在150毫升二氯甲烷中的19.31克（45.53毫摩尔）戴斯马丁氧化剂。将该混合物在室温下搅拌2小时，然后加入250毫升半浓缩碳酸氢钠溶液和250毫升10%的硫代硫酸钠溶液并搅拌20分钟。分离出有机相，水相用乙酸乙酯萃取。合并的有机相用300毫升水洗涤，经硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。这产生11.35克（理论值的90%）目标化合物。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.02 (s, 6H), 0.84(s, 9H), 1.36(s, 9H), 1.48-1.51 (m, 1H), 3.08-3.32 [m, (1H, obscured)], 3.50-3.58 (m, 2H),3.81-3.91 (m, 1H), 6.71 (t, 1H), 9.60 (d, 1H)。
中间体L35
(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯
根据文献中已知的方法（例如Jean Bastide等人 J. Med. Chem. 2003, 46(16),3536-3545）制备标题化合物。
中间体L36
N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将100毫克（0.57毫摩尔）N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸置于4.0毫升DMF中并加入0.08毫升（0.57毫摩尔）三乙胺。然后加入199.0毫克（0.57毫摩尔）2,5-二氧代吡咯烷-1-基 N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸和0.08毫升（0.57毫摩尔）三乙胺。在室温下搅拌48小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水+ 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生75.7毫克（理论值的33%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.69 min；MS (ESIpos): m/z = 409 [M+H]+。
中间体L37
L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将75.7毫克（0.19毫摩尔）中间体L36悬浮在25毫升水/乙醇/THF中，加入7.5毫克钯-活性炭(10%)并在室温下在标准压力下用氢气氢化4.5小时。滤出催化剂，将反应混合物在真空下脱除溶剂并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即用于下一步骤。这产生64.9毫克（理论值的93%）标题化合物。
LC-MS (方法6): Rt = 0.25 min；MS (ESIpos): m/z = 275 [M+H]+。
中间体L38
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将38.3毫克（0.14毫摩尔）中间体L37最初装载在3.0毫升DMF中并加入96.4毫克（0.14毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和39.0微升（0.28毫摩尔）三乙胺。在室温下搅拌整夜。然后向反应混合物加入16.0微升（0.28毫摩尔）HOAc，且直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生58.9毫克（理论值的45%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.61 min；MS (ESIpos): m/z = 849 [M+H]+。
中间体L39
(2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
将300毫克（2.64毫摩尔）2-氨基乙硫醇盐酸盐(1:1)最初装载在3.0毫升二氯甲烷中并加入668.0毫克（6.60毫摩尔）三乙胺和719.1毫克（2.77毫摩尔）1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮。在室温下搅拌2天（通过薄层色谱法监测: 二氯甲烷/甲醇 = 100:1.5）。向该反应混合物加入乙酸乙酯，用水洗涤三次。有机相用饱和NaCl溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。该化合物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
中间体L40
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
600毫克（1.58毫摩尔）N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0毫升水/乙醇/THF（1:1:0.5）中使用钯碳(10%)在室温下在标准压力下用氢气氢化。该化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 0.99 min；MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]+。
将180.0克（0.73毫摩尔）N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0毫升DMF中并加入74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。加入254.6毫克（0.73毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌3.5小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生294.1毫克（理论值的76%）化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]+。
将272.2毫克（0.57毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在20毫升乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）中，加入27.2毫克钯-活性炭并在标准压力下和在室温下用氢气氢化。经Celite (R)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）充分洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生182.0毫克（理论值的72%）化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 0.53 min；MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]+。
将30.0毫克（0.07毫摩尔）L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和46.1毫克（0.07毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶解在1.5毫升DMF中并加入6.8毫克（0.07毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min,MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生55.6毫克（理论值的90%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.77 min；MS (ESIpos): m/z = 920 [M+H]+。
中间体L41
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸
600毫克（1.58毫摩尔）N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸在25.0毫升水/乙醇/THF（1:1:0.5）中使用钯碳(10%)在室温下在标准压力下用氢气氢化。该化合物N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 0.99 min；MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H]+。
将180.0克（0.73毫摩尔）N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在5.0毫升DMF中并加入74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。加入254.6毫克（0.73毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌3.5小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生294.1毫克（理论值的76%）化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H]+。
将272.2毫克（0.57毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸溶解在20.0毫升乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）中，加入27.2毫克钯-活性炭并在标准压力下和在室温下用氢气氢化。经Celite(R)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/THF（1:1:1）充分洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生182.0毫克（理论值的72%）化合物L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 0.53 min；MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H]+。
将30.0毫克（0.07毫摩尔）L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和34.3毫克（0.07毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解在1.5毫升DMF中并加入6.8毫克（0.07毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生40.6毫克（理论值的82%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.73 min；MS (ESIpos): m/z = 744 [M+H]+。
中间体L42
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将50.0毫克（0.18毫摩尔）L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸（中间体L37）最初装载在DMF中并加入93.6毫克（0.18毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和36.9毫克（0.37毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入21.9毫克（0.37毫摩尔）HOAc且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速:50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生20.6毫克（理论值的14%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.55 min；MS (ESIpos): m/z = 673 [M+H]+。
中间体L43
N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸
将11.3毫克（0.04毫摩尔）L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸（中间体L37）最初装载在DMF中并加入50.0毫克（0.04毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{63-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-63-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧杂六十三烷-1-基}丙酰胺和8.3毫克（0.08毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入4.9毫克（0.08毫摩尔）HOAc且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生15.8毫克（理论值的20%）标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 1377 [M+H]+。
中间体L44
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
将73.3毫克（0.39毫摩尔）L-缬氨酰基-L-丙氨酸溶解在7.0毫升DMF中并加入200.0毫克（0.39毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和78.8毫克（0.78毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱:Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生103.3毫克（理论值的45%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.58 min；MS (ESIpos): m/z = 587 [M+H]+。
中间体L45
(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯
将2.00克（7.26毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-高丝氨酸叔丁酯溶解在90毫升二氯甲烷中，然后加入1.76毫升吡啶和4.62克（10.90毫摩尔）1,1,1-三乙酰氧基-1λ5,2-苯碘酰-3(1H)-酮（戴斯马丁氧化剂）。将该配制品在室温下搅拌2小时，然后用200毫升二氯甲烷稀释并用10%的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后相继用5%的柠檬酸萃取两次和用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。分离出有机相，经硫酸钠干燥，然后在真空下干燥。将100毫升二乙醚和环己烷（v/v=1:1）添加到残留物中，以致形成白色沉淀物。将其抽吸滤出。在旋转蒸发器上浓缩滤液并在高真空下干燥，以产生1.74克（理论值的88%）浅黄色油形式的目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 274 [M+H]+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 1.38 (s, 18H), 2.64-2.81 (m, 2H),4.31-4.36 (m, 1H), 7.23 (d, 1H), 9.59 (s, 1H)。
中间体L46
三氟乙酸/N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-谷氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙基胺存在下将200毫克（0.79毫摩尔）三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)与263毫克（0.87毫摩尔）(4S)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸/三氟乙酸(1:1)偶联、然后通过在室温下在DCM中的10%三氟乙酸中搅拌1小时在温和条件下将氨基脱保护，制备标题化合物。从乙腈/水中冻干后经2个步骤产生85毫克（理论值的20%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.37 min；MS (ESIpos): m/z = 326 [M+H]+。
中间体L47
三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
通过将中间体L8与N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联和随后用TFA脱保护，制备标题化合物。
LC-MS (方法3): Rt = 1.36 min；MS (ESIpos): m/z = 488 (M+H)+。
中间体L48
三氟乙酸/(1R,2S)-2-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体L2由市售(1R,2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备标题化合物。
LC-MS (方法3): Rt = 1.22 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+。
中间体L49
三氟乙酸/N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在二氯甲烷中在N,N-二异丙基乙基胺存在下将市售溴乙酸酐与根据肽化学的经典方法制成的部分保护的肽L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸叔丁酯偶联，制备标题化合物。此后在温和条件下通过在室温下在DCM中的10%三氟乙酸中搅拌而在氨基处脱保护，以经2个步骤以49%收率产生标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.09 min；MS (ESIpos): m/z = 593和595 (M+H)+。
中间体L50
三氟乙酸/(1S,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由市售(1S,3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙基胺存在下用HATU偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.2 min；
LC-MS (方法3): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+。
中间体L51
三氟乙酸/(1R,3R)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由市售(1R,3R)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙基胺存在下用HATU偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。
LC-MS (方法3): Rt = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 250 (M-H)-。
中间体L52
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(1:1)
将420毫克（2.62毫摩尔）(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯置于50毫升二氯甲烷中并加入817毫克（3.15毫摩尔）溴乙酸酐和913微升（5.24毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后在真空下干燥。残留物通过制备型HPLC提纯。
这产生577毫克受保护的中间体，然后将其置于50毫升二氯甲烷中并加入10毫升三氟乙酸。在室温下搅拌1小时后，该配制品在真空下浓缩，残留物从乙腈/水中冻干。这产生705毫克（理论值的65%）标题化合物。
LC-MS (方法3): Rt = 0.34 min；MS (ESIpos): m/z = 181和183 (M+H)+。
中间体L53
三氟乙酸/(1S,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由市售(1S,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙基胺存在下用HATU偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 0.19 min；
LC-MS (方法3): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 250 (M-H)-。
中间体L54
三氟乙酸/(1R,3S)-3-氨基-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由市售(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸和同样市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)通过在N,N-二异丙基乙基胺存在下用HATU偶联和随后用TFA脱保护而制备标题化合物
LC-MS (方法3): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H)+。
中间体L55
三氟乙酸/N6-D-丙氨酰基-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在HATU存在下将中间体L6与N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸偶联，接着在温和条件下通过在室温下在DCM中的5%三氟乙酸中搅拌90分钟而在氨基处脱保护，制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.35 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.67 min；MS (ESIpos): m/z = 637 (M+H)+。
中间体L56
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-氨基环戊基]羰基}-L-赖氨酸叔丁酯(1:1)
通过首先在HATU存在下将中间体L6与(1R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸偶联，接着在温和条件下通过在室温下在DCM中的25%三氟乙酸中搅拌15分钟而在氨基处脱保护，制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.4 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.7 min；MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H)+。
中间体L57
(2S)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯
将500.0毫克（2.72毫摩尔）L-天冬氨酸甲酯盐酸盐和706.3毫克（2.72毫摩尔）2,5-二氧代吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯最初装载在5.0毫升1,4-二氧杂环己烷中并加入826.8毫克（8.17毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x40；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1%TFA）。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生583.9毫克（理论值的74%）化合物(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIneg): m/z = 290 (M-H)-。
将592.9毫克(3S)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸最初装载在10.0毫升1,2-二甲氧基乙烷中，冷却至-15℃并加入205.8毫克（2.04毫摩尔）4-甲基吗啉和277.9毫克（2.04毫摩尔）氯甲酸异丁酯。在15分钟后抽吸滤出沉淀物并用每次10.0毫升1,2-二甲氧基乙烷洗涤两次。将滤液冷却至-10℃，并在剧烈搅拌下加入溶解在10毫升水中的115.5毫克（3.05毫摩尔）硼氢化钠。分离相，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液各洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生515.9毫克（理论值的91%）化合物N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H)+。
将554.9毫克（2.00毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-高丝氨酸甲酯最初装载在30.0毫升二氯甲烷中并加入1.27克（3.0毫摩尔）戴斯马丁氧化剂和474.7毫克（6.00毫摩尔）吡啶。在室温下搅拌整夜。在4小时后，该配制品用二氯甲烷稀释，有机相用10%的Na2S2O3溶液、10%的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液各洗涤三次。有机相经硫酸镁干燥和在真空下蒸发溶剂。这产生565.7毫克（理论值的97%）标题化合物。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 (m, 1H), 2.88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54(d, 1H), 9.60 (t, 1H)。
中间体L58
(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
将434.4毫克（5.78毫摩尔）3-氨基-1-丙醇和1.50克（5.78毫摩尔）2,5-二氧代吡咯烷-1-甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在10.0毫升二氯甲烷中，加入585.3毫克（5.78毫摩尔）三乙胺并在室温下搅拌整夜。该反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂。残留物(3-羟丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（996.4毫克，理论值的79%）在高真空下干燥并且不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
将807.0毫克（3.68毫摩尔）(3-羟丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯最初装载在15.0毫升氯仿和15.0毫升0.05 N碳酸钾/0.05 N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入102.2毫克（0.37毫摩尔）四正丁基氯化铵、736.9毫克（5.52毫摩尔）N-氯琥珀酰亚胺和57.5毫克（0.37毫摩尔）TEMPO并将反应混合物在室温下剧烈搅拌整夜。该反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物在高真空下干燥并且不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤（890.3毫克）。
中间体L59
三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)
将300.0毫克（0.91毫摩尔）(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯最初装载在二氯甲烷中，加入4.2克（36.54毫摩尔）TFA并在室温下搅拌1小时（通过DC监测: 二氯甲烷/甲醇10:1）。在真空下蒸发挥发性组分，残留物与二氯甲烷共蒸馏四次。将残留物在高真空下干燥并且不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
LC-MS (方法1): Rt = 0.19 min；MS (ESIpos): m/z = 229 (M+H)+。
中间体L60
6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯
将200.0毫克（0.95毫摩尔）6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸溶解在4.0毫升二氯甲烷中并加入338.0毫克（2.84毫摩尔）亚硫酰氯。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后加入1滴DMF。搅拌另外1小时。在真空下蒸发溶剂，与二氯甲烷共蒸馏三次。粗产物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
中间体L61
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
首先，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸根据肽化学的经典方法（使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、氢解、在HATU存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联和再次氢解）制备三肽衍生物L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。通过在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下将这种部分受保护的肽衍生物与市售6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸偶联，制备标题化合物。此后在温和条件下通过在室温下在DCM中的5%三氟乙酸中搅拌2.5小时而在氨基处脱保护，保留酯保护基。后处理和通过制备型HPLC提纯后产生438毫克标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.69 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.78 min；MS (ESIpos): m/z = 610 (M+H)+。
中间体L62
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
首先，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸根据肽化学的经典方法制备N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。148毫克（0.43毫摩尔）这种中间体然后在195毫克（0.51毫摩尔）HATU和149微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与200毫克（0.43毫摩尔）中间体L16偶联。在浓缩和残留物通过制备型HPLC提纯后，将该受保护的中间体置于20毫升DCM中并通过添加2毫升三氟乙酸和在室温下搅拌1小时使叔丁氧基羰基保护基脱落。浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生254毫克（经2个步骤，理论值的63%）。
HPLC (方法11): Rt = 1.51 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.68 min；MS (ESIpos): m/z = 696 (M+H)+。
中间体L63
(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸
首先，由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸根据肽化学的经典方法制备三肽衍生物(4S)-4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-氨基-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸（使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、用三氟乙酸裂解Boc保护基、在HATU存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联和在甲醇中经10%钯-活性炭氢解）。通过这种部分受保护的肽衍生物与市售1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮的偶联制备标题化合物。后处理和通过制备型HPLC提纯后产生601毫克标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 611 (M+H)+。
中间体L64
(4S)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸
由(2S)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸根据肽化学的经典方法（使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、用三氟乙酸裂解Boc保护基、苄酯在甲醇中经10%钯-活性炭氢解裂解和在N,N-二异丙基乙基胺存在下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联）制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (ESIpos): m/z = 385 (M+H)+。
中间体L65
三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-L-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)
由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-L-丙氨酸根据肽化学的经典方法（使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化和用三氟乙酸裂解Boc保护基）制备标题化合物。这产生373毫克（经2个步骤，理论值的79%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.72 min；MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)+。
中间体L66
(8S)-8-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸甲酯
将1000毫克（2.84毫摩尔）(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸最初装载在10.0毫升1,2-二甲氧基乙烷中并加入344.4毫克（3.4毫摩尔）4-甲基吗啉和504毫克（3.69毫摩尔）氯甲酸异丁酯。在室温下搅拌10分钟后，将该配制品冷却至5℃并在剧烈搅拌下逐份加入溶解在3毫升水中的161毫克（4.26毫摩尔）硼氢化钠。在1小时后，再加入相同量的硼氢化钠，然后将该配制品缓慢升温至室温。加入170毫升水，该反应然后用每次200毫升乙酸乙酯萃取四次。分离相，有机相用柠檬酸洗涤一次，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥，在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生760毫克（理论值的78%）化合物[(2S)-4-羟基丁烷-1,2-二基]双氨基甲酸苄基叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H)+。
将溶解在13毫升氯化氢/二氧杂环己烷中的760毫克（2.16毫摩尔）这种中间体在室温下搅拌20分钟。然后将该配制品浓缩至5毫升，并加入二乙醚。滤出沉淀物并从乙腈/水1:1中冻干。
将由此获得的产物溶解在132毫升DMF中并加入345.5毫克（2.35毫摩尔）4-甲氧基-4-氧代丁酸、970毫克（2.55毫摩尔）HATU和1025微升N,N-二异丙基乙基胺。将该混合物在室温下搅拌5分钟。在真空下除去溶剂，留下的残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分并在真空下蒸发乙腈。留下的水相用乙酸乙酯萃取两次，然后浓缩有机相并在高真空下干燥。
将由此获得的中间体置于甲醇中并在室温下在氢气标准压力下经10%钯-活性炭氢化1小时。然后滤出催化剂并在真空下除去溶剂。
将247毫克这种脱保护的化合物置于20毫升DMF中并加入352毫克（1.36毫摩尔）1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和592微升N,N-二异丙基乙基胺。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。然后在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这经这5个反应步骤以21%的总收率产生218毫克标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.74 min；MS (ESIpos): m/z = 363 (M+H)+。
中间体L67
三氟乙酸/β-丙氨酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酯(1:1)
由50毫克（0.354毫摩尔）市售1-(2-羟乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮通过在10毫升二氯甲烷中在1.5当量的EDCI和0.1当量的4-N,N-二甲基氨基吡啶存在下与134毫克（0.71毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联和随后用三氟乙酸脱保护，制备标题化合物。
收率: 56毫克（经2个步骤，理论值的48%）
LC-MS (方法3): Rt = 1.15 min；MS (ESIpos): m/z = 213 (M+H)+。
中间体L68
三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)
类似于中间体L1根据肽化学的经典方法由市售(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.17 min；MS (ESIpos): m/z = 212 (M+H)+。
中间体L69
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸1-[(苄氧基)羰基]哌啶-4-基酯(1:1)
通过肽化学的经典方法由市售4-羟基哌啶-1-甲酸苄酯通过使用EDCI/DMAP用N2-(叔丁氧基羰基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸酯化、随后用TFA裂解Boc、接着在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下与N-[(叔丁氧基)羰基]-L-缬氨酸偶联和最后再次用TFA裂解Boc而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.62 min；MS (ESIpos): m/z = 492 (M+H)+。
中间体L70
(3-氧代丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯
将1000.0毫克（3.36毫摩尔）(3-羟丙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯最初装载在15.0毫升氯仿和15.0毫升0.05 N碳酸钾/0.05 N碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入93.5毫克（0.34毫摩尔）四正丁基氯化铵、673.6毫克（5.04毫摩尔）N-氯琥珀酰亚胺和52.5毫克（0.34毫摩尔）TEMPO并将反应混合物在室温下剧烈搅拌整夜。该反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物在高真空下干燥并在硅胶上提纯（洗脱剂: 环己烷/乙酸乙酯3:1-1:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生589.4毫克（理论值的58%）标题化合物。
LC-MS (方法6): Rt = 2.15 min；MS (ESIpos): m/z = 296 (M-H)+。
中间体L71
[4-(氯羰基)苯基]氨基甲酸叔丁酯
将100.0毫克（0.42毫摩尔）4-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酸最初装载在2.0毫升二氯甲烷中并加入64.2毫克（0.51毫摩尔）草酰氯。将反应混合物在室温下搅拌30分钟（通过DC监测: 二氯甲烷/甲醇）。然后加入另外192.6毫克（1.53毫摩尔）草酰氯和1滴DMF并在室温下搅拌1小时。在真空下蒸发溶剂，残留物反复与二氯甲烷共蒸馏。该残留物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。
中间体L72
(9S)-9-(羟甲基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄酯
由市售[(2S)-3-羟基丙烷-1,2-二基]双氨基甲酸苄基叔丁酯根据肽化学的经典方法通过氢解裂解Z保护基、随后在EDCI/HOBT存在下与4-(苄氧基)-4-氧代丁酸偶联、接着用TFA裂解Boc保护基和最后在三乙胺存在下与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 425 [M+H]+。
中间体L73
N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺
将395.5毫克（1.87毫摩尔）6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸、1.21克（9.36毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和854.3毫克（2.25毫摩尔）HATU添加到300毫克（1.87毫摩尔）(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯在20毫升二甲基甲酰胺中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌5分钟。在浓缩该混合物后，将残留物置于DCM中并用水洗涤。有机相用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，滤出并浓缩。这产生408毫克（33%，纯度53%）标题化合物，其不经进一步提纯即使用。
LC-MS (方法1): Rt = 0.75 min；MS (ESIpos): m/z = 354 (M+H)+。
将1毫升TFA添加到(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯（408毫克，0.365毫摩尔）在7毫升二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌0.5小时。该反应混合物在真空下浓缩，残留物与二氯甲烷共蒸馏两次。残留物不经进一步提纯即进一步使用。这产生384毫克（94%，纯度57%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.26 min；MS (ESIpos): m/z = 254 (M+H)+。
中间体F1
N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-{2-[(4S)-2,5-二氧代-1,3-噁唑烷-4-基]乙基}-2-羟基乙酰胺
在氩气下，将77毫克（0.14毫摩尔）(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸盐酸盐(1:1)（中间体C4）溶解在THF中。然后向该配制品加入2毫克活性炭和27.5毫克（0.14毫摩尔）三光气，然后在50℃下搅拌10分钟。在再加入两次每次27.5毫克三光气和在室温下搅拌30分钟后，该反应完成。
经注射器式过滤器滤出活性炭，然后在真空下除去溶剂。向该配制品加入乙腈，再次在真空下浓缩。这产生72毫克（95%）标题化合物，其不经进一步提纯即用于ADC偶联。
HPLC (方法11): Rt = 2.28 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.2 min；MS (ESIpos): m/z = 541 (M+H)+。
中间体F2
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]丁酰胺(1:1)
将55毫克（0.089毫摩尔）(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸（中间体C5）置于12毫升DMF中，相继加入68毫克（0.268毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)、34.3毫克（0.18毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、27.4毫克（0.18毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和47微升（0.27毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将该混合物在室温下搅拌整夜。在真空下除去溶剂，留下的残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当的馏分，在从1,4-二氧杂环己烷中冻干后产生20毫克（理论值的30%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.48 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.29 min；MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+。
将20毫克（0.027毫摩尔）这种中间体置于5毫升二氯甲烷中，加入1毫升三氟乙酸并在室温下搅拌1小时。该反应混合物然后在真空下浓缩，留下的残留物从乙腈/水1:1中冻干。这产生19毫克（理论值的95%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.0 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (ESIpos): m/z = 637 (M+H)+.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d = 8.28 (t, 1H), 7.9-8.1 (m, 3H), 7.7-7.8 (m,2H), 7.2-7.4 (m, 6H) 7.0-7.1 (m, 3H), 5.7 (s, 1H), 5.0和5.3 (2d, 2H), 4.08和4.25 (2d, 2H), 3.3-3.65 (m, 5H), 3.1-3.25 (m, 2H), 0.75和1.45 (2m, 2H), 0.9(s, 9H)。
中间体F3
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
将13毫克（0.021毫摩尔）(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸（中间体C5）置于5毫升DMF中，然后加入33毫克（86微摩尔）O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、15微升N,N-二异丙基乙基胺和22毫克（64微摩尔）市售6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后在高真空下浓缩，留下的残留物通过制备型HPLC提纯。这产生9.5毫克（理论值的53%）无色泡沫形式的受保护的中间体。
HPLC (方法11): Rt = 2.1 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.33 min；MS (ESIpos): m/z = 822 (M+H)+。
将9.5毫克（0.011毫摩尔）这种中间体置于3毫升二氯甲烷中，加入1毫升三氟乙酸并在室温下搅拌2小时。该反应混合物然后在真空下浓缩，留下的残留物从乙腈/水1:1中冻干。这产生7毫克（理论值的70%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.75 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 722 (M+H)+。
中间体F4
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(6-{[(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}己基)丁酰胺(1:1)
首先，30毫克（0.049毫摩尔）(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸（中间体C5）类似于中间体F3在HATU存在下与三氟乙酸/(6-氨基己基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯(1:1)偶联。然后根据标准方法用哌啶除去Fmoc保护基。这种胺组分然后在N,N-二异丙基乙基胺存在下与已由该游离酸使用亚硫酰氯制成的(2R)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰氯偶联。在最后步骤中，在DCM中用三氟乙酸除去Boc保护基。这产生1.1毫克（经4个步骤，3%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.83 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 764 (M+H)+。
中间体F5
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(丙酰基)氨基]-N-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1:1)
类似于中间体F2由16毫克（0.026毫摩尔）中间体C5和8.5毫克（0.03毫摩尔）中间体L12制备标题化合物。这产生3毫克（经2个步骤，理论值的13%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.0 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 681 (M+H)+。
中间体F6
三氟乙酸/N-[(16S)-16-氨基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,14-二氮杂十八烷-18-基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
将8毫克（12.7微摩尔）三氟乙酸/{(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-肼基-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)（中间体C6）置于8毫升DMF中并加入6毫克（19微摩尔）市售3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸、5.8毫克（15微摩尔）O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐（HATU）和7微升（38微摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将该混合物在室温下搅拌15分钟。然后在真空下除去溶剂，将残留物置于乙腈/水 1:1中并用三氟乙酸调节至pH 2。通过制备型HPLC提纯。适当馏分的合并、浓缩和从乙腈/水1:1中冻干后产生5毫克（理论值的41%）Boc保护的中间体。用三氟乙酸裂解Boc基团后提供4毫克（经2个步骤，理论值的32%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.89 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 812 (M+H)+。
中间体F7
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
类似于中间体F2由25毫克（0.037毫摩尔）中间体C5和35毫克（0.112毫摩尔）中间体L1制备标题化合物。这产生14.4毫克（经2个步骤，理论值的29%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.0 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (ESIpos): m/z = 694 (M+H)+.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d = 8.2 (m, 1H), 7.9-8.1 (m, 3H), 7.7-7.8 (m,2H), 7.2-7.4 (m, 6H), 7.0-7.12 (m, 3H), 5.7 (s, 1H), 4.95和5.3 (2d, 2H), 4.1和4.25 (2d, 2H), 4.0 (s, 2H), 3.3-3.65 (m, 5H), 3.0-3.15 (m, 2H), 0.7和1.45(2m, 2H), 0.88 (s, 9H)。
中间体F8
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F2由10毫克（0.016毫摩尔）中间体C5和13毫克（0.018毫摩尔）中间体L6制备标题化合物。这产生10毫克（经2个步骤，理论值的49%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.97 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 1006 (M+H)+。
中间体F9
三氟乙酸/N-{(3S)-3-氨基-4-[1-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)肼基]-4-氧代丁基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
类似于中间体F2由1.5毫克（0.002毫摩尔）中间体C7和0.95毫克（0.004毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)制备标题化合物。这产生1.1毫克（经2个步骤，理论值的52%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 709 (M+H)+。
中间体F10
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(3-{[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
类似于中间体F2由14毫克（0.022毫摩尔）中间体C5和10毫克（0.025毫摩尔）中间体L5制备标题化合物。这产生4.5毫克（经2个步骤，理论值的22%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.0 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 756 (M+H)+。
中间体F11
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环己烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体F2由12毫克（0.019毫摩尔）中间体C5和10毫克（0.021毫摩尔）中间体L4制备标题化合物。这产生7毫克（经2个步骤，理论值的38%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.04 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 776 (M+H)+。
中间体F12
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体F2由43毫克（0.071毫摩尔）中间体C5和30毫克（0.071毫摩尔）中间体L2制备标题化合物。在Boc保护的中间体阶段，形成的非对映体通过制备型HPLC彼此分离（Chromatorex C18-10/125x30/12ml/min）。通过与以类似方式由市售(1S, 2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制成的独立非对映体比较，可以指定分离的非对映体的立体化学：
馏分1: 1S2R非对映体
产量: 13毫克（22%）
HPLC (方法11): Rt = 2.52 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.31 min；MS (ESIpos): m/z = 848 (M+H)+。
馏分2: 1R2S非对映体
产量: 10毫克（17%）
HPLC (方法11): Rt = 2.56 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.33 min；MS (ESIpos): m/z = 848 (M+H)+。
10毫克（0.011毫摩尔）1R2S非对映体用TFA脱保护随之产生8毫克（理论值的75%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.04 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 748 (M+H)+。
中间体F13
三氟乙酸/(1S,2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体F13进行合成并通过1S2R非对映体的脱保护获得标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.1 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 748 (M+H)+。
中间体F14
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
通过20毫克（0.028毫摩尔）中间体C5和18毫克（0.028毫摩尔）中间体L7在HATU存在下的偶联和随后用TFA解封而制备标题化合物。这产生15毫克（经2个步骤，理论值的49%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.97 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 1012 (M+H)+。
中间体F15
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
通过15毫克（0.022毫摩尔）中间体C8和14毫克（0.026毫摩尔）中间体L8在HATU存在下的偶联和随后用TFA解封而制备这种中间体。这产生7毫克（经2个步骤，理论值的27%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.85 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 984 (M+H)+。
中间体F16
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
首先，20毫克（0.03毫摩尔）中间体C3类似于中间体F3在HATU存在下与三氟乙酸/β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)（中间体L9）偶联（产量：15毫克（理论值的44%））。
将26毫克（0.023毫摩尔）这种中间体N-{(2S)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺溶解在5毫升甲醇中，加入1毫升2M氢氧化锂溶液并将该配制品在室温下搅拌90分钟。然后在真空下除去溶剂，将残留物置于乙腈/水中并使用TFA将该配制品调节至pH 2。然后再浓缩，在通过制备型HPLC提纯残留物后产生20毫克（81%）羧基化合物。
然后将这种中间体置于5毫升DMF中并在8.4毫克（0.022毫摩尔）HATU和16微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与6毫克（0.022毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。通过制备型HPLC提纯后产生17毫克（理论值的76%）受保护的中间体。将这些置于3毫升DCM中并加入1毫升TFA。在室温下搅拌45分钟后浓缩，残留物用二乙醚浸渍（digeriert）。抽吸过滤和残留物在高真空下的干燥后产生15毫克（81%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (ESIpos): m/z = 1097 (M+H)+。
中间体F17
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F12由6毫克（0.01毫摩尔）中间体C5和8毫克（0.01毫摩尔）中间体L10制备标题化合物。在Boc保护的中间体阶段，形成的非对映体通过制备型HPLC彼此分离（Chromatorex C18-10/125x30/12 ml/min）。通过与以类似方式由市售(1S, 2R)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制成的独立非对映体比较，可以指定分离的非对映体的立体化学：
馏分1: 1S2R非对映体
产量: 1 mg
HPLC (方法11): Rt = 2.73 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.37 min；MS (ESIpos): m/z = 1274 (M+H)+。
馏分2: 1R2S非对映体
产量: 0.7 mg
HPLC (方法11): Rt = 2.81 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.41 min；MS (ESIpos): m/z = 1274 (M+H)+。
通过溶解在1毫升DCM中、添加1毫升TFA和在室温下搅拌1小时，实现0.7毫克（0.001毫摩尔）1R2S非对映体的完全脱保护。在真空下浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生0.68毫克（理论值的94%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.1 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 1117 (M+H)+。
中间体F18
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1S,2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F17由8.9毫克（0.014毫摩尔）中间体C5和13毫克（0.014毫摩尔）中间体L11制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.2 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.01 min；MS (ESIpos): m/z = 1117 (M+H)+。
中间体F19
N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F2通过25毫克（0.041毫摩尔）中间体C5与55毫克（0.122毫摩尔）中间体L13的偶联和随后脱保护制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.84 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 780 (M+H)+。
中间体F20
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-{4-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]哌嗪-1-基}丁酰胺(1:1)
类似于中间体F2通过10毫克（0.015毫摩尔）中间体C5与55毫克（0.122毫摩尔）中间体L14的偶联和随后脱保护制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 735 (M+H)+。
中间体F21
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷-15-基]丁酰胺(1:1)
类似于中间体F2通过10毫克（0.015毫摩尔）中间体C5与7毫克（0.015毫摩尔）中间体L15的偶联和随后脱保护制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 840 (M+H)+。
中间体F22
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-(1-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-2-氧代乙基}肼基)-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
类似于中间体F9通过13.7毫克（0.017毫摩尔）中间体C7与5.9毫克（0.017毫摩尔）中间体L1的偶联和随后脱保护制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.3 min；
LC-MS (方法1): Rt = 1.2 min；MS (ESIpos): m/z = 866 (M+H)+。
中间体F23
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F2通过10毫克（0.016毫摩尔）中间体C5与16.8毫克（0.016毫摩尔）中间体L17在EDC/HOBT和N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后脱保护制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (ESIpos): m/z = 1092 (M+H)+。
中间体F24
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
类似于中间体F16进行标题化合物的制备：
首先，30毫克（0.046毫摩尔）中间体C3类似于中间体F3在HATU存在下与中间体L18偶联（产量：25毫克（理论值的47%））。
将27毫克（0.024毫摩尔）这种中间体溶解在5毫升甲醇中，加入1毫升2M氢氧化锂溶液并将该配制品在室温下搅拌30分钟，以使甲酯和乙酰基都裂解。然后在真空下除去溶剂，将残留物置于乙腈/水中并使用TFA将该配制品调节至pH 2。然后再浓缩，在通过制备型HPLC提纯残留物后产生15毫克（58%）羧基化合物。
然后将这种中间体置于3毫升DMF中并在6.5毫克（0.017毫摩尔）HATU和12微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与4.4毫克（0.017毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。通过制备型HPLC提纯后产生12毫克（理论值的72%）受保护的中间体。将这些置于2毫升DCM中并加入1毫升TFA。在室温下搅拌30分钟后浓缩并从乙腈/水1:1中冻干。残留物在高真空下的干燥提供11毫克（91%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.83 min；MS (ESIpos): m/z = 1069 (M+H)+。
中间体F25
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-L-鸟氨酰胺(1:1)
通过9.6毫克（0.014毫摩尔）中间体C8与10.8毫克（0.015毫摩尔）中间体L19在6.4毫克（0.017毫摩尔）HATU和72微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后用TFA解封而制备这种中间体。这产生5毫克（经2个步骤，理论值的31%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.8 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 1041 (M+H)+。
中间体F26
三氟乙酸/N-{(15S,19R)-15-氨基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-乙醇酰-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧杂-13,18-二氮杂二十一烷-1-酰基}-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
通过16.4毫克（0.02毫摩尔）中间体C9与11.2毫克（0.02毫摩尔）中间体L20在8毫克（0.04毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、6毫克（0.04毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和11微升（0.06毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后用TFA解封而制备这种中间体。这产生10毫克（经2个步骤，理论值的37%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.0 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 1144 (M+H)+。
中间体F27
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-L-赖氨酰胺(2:1)
经4个步骤制备这种中间体：
在第一步骤中，20毫克（0.028毫摩尔）中间体C8与16.7毫克（0.031毫摩尔）中间体L21在5毫升DMF中在11毫克（0.057毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、8.7毫克（0.057毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和15微升（0.085毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺存在下偶联。在室温下搅拌4天后，浓缩该配制品，该产物通过制备型HPLC提纯。产量:18毫克（理论值的54.5%）。
将18毫克（0.016毫摩尔）这种中间体溶解在4毫升甲醇中，加入194微升2M氢氧化锂溶液并将该配制品在室温下搅拌整夜。然后加入另外116微升氢氧化锂溶液，并将该配制品在室温下搅拌另外4小时。然后在真空下除去溶剂，将残留物置于水中，然后用5%的柠檬酸将该配制品调节至pH 5。用二氯甲烷萃取两次，有机相经硫酸钠干燥。有机相然后过滤并浓缩，残留物在高真空下干燥。这产生10.5毫克（58%）羧基化合物。
然后将10.5毫克（0.009毫摩尔）这种中间体置于4毫升DMF中并在3.5毫克（0.018毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐、2.8毫克（0.018毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和6微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与3毫克（0.012毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。在搅拌整夜后，再加入相同量的偶联试剂并将该配制品在室温下搅拌另外3天。然后浓缩，该产物通过制备型HPLC提纯。产量：6毫克（理论值的52%）。
6毫克（0.005毫摩尔）这种中间体然后在3毫升DCM中用1毫升三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干后产生6毫克（理论值的83%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.84 min；
LC-MS (方法4): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 1068 (M+H)+。
中间体F28
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基}氨基)-L-苯基丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
经5个步骤制备这种中间体：
在第一步骤中，40毫克（0.058毫摩尔）中间体C8与46毫克（0.058毫摩尔）中间体L22在44.3毫克（0.117毫摩尔）HATU和30微升N,N-二异丙基乙基胺存在下偶联。在室温下搅拌1小时后，浓缩该配制品，该产物通过制备型HPLC提纯。产量：53毫克（理论值的62.5%）。
在下一步骤中，在3毫升DMF中用0.6毫升哌啶裂解Fmoc基团。在室温下搅拌1小时后，浓缩该配制品，该产物通过制备型HPLC提纯。产量：42毫克（理论值的82%）。
为了裂解甲酯，将42毫克（0.033毫摩尔）这种中间体溶解在2毫升THF和1毫升水中，加入330微升2M氢氧化锂溶液并将该配制品在室温下搅拌1小时。
该配制品然后用TFA中和并浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。在高真空下的干燥后产生32毫克（78%）羧基化合物。
32毫克（0.026毫摩尔）这种中间体然后在2.3毫升DMF中在18微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与14.6毫克（0.047毫摩尔）市售1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联。在超声浴中处理4小时后，浓缩该配制品，产物通过制备型HPLC提纯。产量：20.4毫克（理论值的60%）。
在最后步骤中，20.4毫克（0.016毫摩尔）这种中间体在DCM中用三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干后产生20毫克（理论值的85%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法5): Rt = 2.84 min；MS (ESIpos): m/z = 1197 (M+H)+。
中间体F29
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-({N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}氨基)-L-苯基丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F28进行标题化合物的制备。
HPLC (方法11): Rt = 2.0 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 1111 (M+H)+。
中间体F30
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-{2-[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)亚磺酰基]乙基}丁酰胺(1:1)
经4个步骤制备这种中间体：
在第一步骤中，37.5毫克（0.055毫摩尔）中间体C3与15毫克（0.066毫摩尔）市售3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丙酸甲酯盐酸盐(1:1)在DMF中在25毫克（0.066毫摩尔）HATU和29微升N,N-二异丙基乙基胺存在下偶联。在室温下搅拌15分钟后，再加入偶联试剂。将该配制品在室温下搅拌另外15分钟，然后浓缩，该产物通过制备型HPLC提纯。产量：21毫克（理论值的48%）。
LC-MS (方法1): Rt = 1.41 min；MS (ESIpos): m/z = 802 (M+H)+。
为了裂解甲酯，将21毫克（0.026毫摩尔）这种中间体溶解在5毫升甲醇中，加入655微升2M氢氧化锂溶液并将该配制品在室温下搅拌整夜。在此期间，发生硫处的部分氧化。浓缩该配制品并将残留物置于水中，然后用乙酸调节至pH 3。用50毫升乙酸乙酯萃取两次，有机相然后经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残留物在高真空下干燥后获得的混合物不经进一步提纯即用于在11.6毫克（0.031毫摩尔）HATU和22微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与8.4毫克（0.033毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联的下一步骤。将该配制品在室温下搅拌5分钟，然后浓缩。将残留物置于乙酸乙酯中，该溶液用5%的柠檬酸，然后用水萃取。有机相然后经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残留物在高真空下干燥后获得的混合物不经进一步提纯即用于下一步骤。
然后将22毫克这种粗制材料溶解在2毫升DCM中并用0.5毫升三氟乙酸脱保护。在室温下搅拌10分钟后，浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。在高真空下的干燥后产生2.1毫克标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.8 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.83 min；MS (ESIpos): m/z = 784 (M+H)+。
中间体F31
三氟乙酸/N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-(3-{[2-{(1R)-1-[(3-氨基丙基)(乙醇酰)氨基]-2,2-二甲基丙基}-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-1-基]甲基}苯基)-L-丙氨酰胺(1:1)
使用肽化学的经典方法由中间体C10经6个步骤合成这种中间体。
在第一步骤中，42毫克（0.066毫摩尔）中间体C10与20.7毫克（0.066毫摩尔）N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸 在5毫升DMF中在100毫克（0.266毫摩尔）HATU和46微升N,N-二异丙基乙基胺存在下偶联。将该配制品在室温下搅拌整夜，该产物通过制备型HPLC提纯。这产生16毫克（理论值的27%）N-酰化化合物和9毫克（理论值的12%）N-,O-双酰化化合物。
在DMF中用哌啶进行该N-酰化化合物的脱保护。该双酰化化合物在乙醇中用哌啶和用甲胺的水溶液处理。在这两种情况下，形成(3-{[(1R)-1-{1-[3-(L-丙氨酰基氨基)苄基]-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基}-2,2-二甲基丙基](乙醇酰)氨基}丙基)氨基甲酸叔丁酯并通过制备型HPLC提纯后分离出13毫克，纯度95%。
LC-MS (方法1): Rt = 0.95 min；MS (ESIpos): m/z = 657 (M+H)+。
13毫克（0.019毫摩尔）这种中间体在2毫升DMF中在7微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与9.1毫克（0.021毫摩尔）N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联。在室温下搅拌20小时后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。从1,4-二氧杂环己烷/水中冻干后产生10毫克（理论值的54%）。
随后在DMF中用哌啶裂解Fmoc保护基以产生9毫克（定量）部分脱保护的中间体。
9毫克（0.01毫摩尔）这种中间体然后在2毫升DMF中在5微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与3.2毫克（0.01毫摩尔）市售1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1H-吡咯-2,5-二酮偶联。在室温下搅拌整夜后，浓缩该配制品，该产物通过制备型HPLC提纯。从乙腈/水和几滴1,4-二氧杂环己烷中冻干后提供3毫克（理论值的32%），其在最后步骤中在2毫升DCM中用0.5毫升三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干后产生3.8毫克（定量）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 849 (M+H)+。
中间体F32
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
通过15毫克（0.041毫摩尔）中间体C5与16.8毫克（0.027毫摩尔）中间体L23在10.5毫克（0.055毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、8.4毫克（0.055毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和14微升（0.08毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后用TFA解封而制备这种中间体。这产生3.4毫克（经2个步骤，理论值的15%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 708 (M+H)+。
中间体F33
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1:1)
这种中间体的合成在第一步骤中以50毫克（0.075毫摩尔）中间体C3与26.2毫克（0.082毫摩尔）(2-氨基乙基)氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯盐酸盐(1:1)在28.7毫克（0.15毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、22.9毫克（0.15毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和39微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联开始。在室温下搅拌18小时后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生45毫克（理论值的65%）这种中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.51 min；MS (ESIpos): m/z = 921 (M+H)+。
将45毫克（0.049毫摩尔）这种中间体置于10毫升乙醇中并加入176微升40%的甲胺水溶液。在50℃下搅拌该配制品，在6小时后和在9小时后加入相同量的甲胺溶液。在50℃下进一步搅拌14小时后，加入另外700微升甲胺溶液，并在进一步搅拌20小时后，最后浓缩。将残留物置于DCM中并用水洗涤。浓缩有机相，残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物在高真空下的干燥后产生32毫克（理论值的99%）{(2S)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.95 min；MS (ESIpos): m/z = 657 (M+H)+。
将8.3毫克（0.013毫摩尔）这种中间体溶解在4毫升二氯甲烷中，并加入3.3毫克（0.013毫摩尔）溴乙酸酐和2微升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌1小时后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分，残留物从乙腈/水中冻干。置于1毫升二氯甲烷中并用0.5毫升三氟乙酸脱保护。浓缩和从乙腈/水中冻干后产生1.1毫克（经2个步骤，理论值的9%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 677/679 (M+H)+。
中间体F34
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
通过14毫克（0.022毫摩尔）中间体C5与12.7毫克（0.024毫摩尔）中间体L8在9.9毫克（0.026毫摩尔）HATU和19微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联制备这种中间体。将该配制品在室温下搅拌30分钟，产物通过制备型HPLC提纯，然后从乙腈/水中冻干。
将所得中间体置于3毫升二氯甲烷中并用1毫升三氟乙酸解封。在室温下搅拌30分钟后，浓缩该配制品，残留物从乙腈/水中冻干。这产生8.2毫克（经2个步骤，理论值的36%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.8 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 913 (M+H)+。
中间体F35
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
在氩气下和在0℃下，将57.3毫克（0.07毫摩尔）N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸（中间体L38）、9.2毫克（0.07毫摩尔）HOAt和32毫克（0.08毫摩尔）HATU添加到在4.0毫升DMF中的31.8毫克（0.07毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）中。然后加入23.5微升（0.14毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并在室温下搅拌整夜。向该反应混合物加入7.7微升HOAc，且直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生33.4毫克（理论值的38%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.12 min；MS (ESIpos): m/z = 651 [M+2H]2+。
中间体F36
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
类似于中间体F35的制备进行标题化合物的合成。
15.4毫克（0.03毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）。
25.0毫克（0.03毫摩尔）N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸（中间体L25）。
这产生10.7毫克（理论值的27%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.13 min；MS (ESIpos): m/z = 1215 [M+H]+。
中间体F37
三氟乙酸/N-(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)-31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰胺(1:1)
非对映体的混合物
化合物3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-4-{[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]氨基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯与中间体C21的合成类似地制备。
8.0毫克（0.01毫摩尔）和13.0毫克（0.02毫摩尔）的3-氨基-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（中间体C23）。
9.0毫克（0.01毫摩尔）和14.7毫克（0.02毫摩尔）的3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺。
产量（合并这两个配制品）:
10.5毫克（42 %）非对映体1
11.6毫克（46 %）非对映体2
与中间体F38的合成类似地制备标题化合物。
10.5毫克（0.01毫摩尔）3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-4-{[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]氨基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯（非对映体1）
60.6毫克（0.54毫摩尔）TFA。
这产生7.4毫克（理论值的70%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.09 min；MS (ESIpos): m/z = 1086 [M+H]+。
中间体F38
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7,35-二氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3-硫杂-6,34-二氮杂三十七烷-1-酰胺(1:1)
将24.8毫克（0.02毫摩尔）[38-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基]氨基甲酸叔丁酯（中间体C21）最初装载在1.0毫升二氯甲烷中并加入85.8毫克（0.75毫摩尔）TFA。在室温下搅拌16小时。在真空下蒸发溶剂，残留物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生23.0毫克（理论值的95%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.96 min；MS (ESIpos): m/z = 1104 [M+H]+。
中间体F39
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
与中间体F35的合成类似地制备标题化合物。
56.1毫克（0.10毫摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸（中间体L44）。
45.0毫克（0.10毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）。
这产生20.9毫克（理论值的21%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.16 min；MS (ESIpos): m/z = 1040 [M+H]+。
中间体F40
三氟乙酸/N-[(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)甲基]-31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰胺(1:1)
3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-4-[33-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,31-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-2,30-二氮杂三十三烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯与中间体C21的合成类似地制备。
25.0毫克（0.04毫摩尔）三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1:1)（中间体C24）。
27.6毫克（0.04毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺。
产量: 20.6毫克（理论值的39%）
LC-MS (方法1): Rt = 1.23 min；MS (ESIpos): m/z = 1200 [M+H]+。
与中间体F37的合成类似地制备标题化合物。
26.1毫克（0.02毫摩尔）3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-4-[33-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,31-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-2,30-二氮杂三十三烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
90.6毫克（0.80毫摩尔）TFA。
这产生22.9毫克（理论值的95%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91和0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 1100 [M+H]+。
中间体F41
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-7,35-二氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3-硫杂-6,34-二氮杂三十七烷-1-酰胺3-氧化物(1:1)
类似于中间体F38由15.5毫克（0.01毫摩尔）中间体C22制备标题化合物。这产生4.0毫克（理论值的27%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.90 min；MS (ESIpos): m/z = 1120 [M+H]+。
中间体F42
三氟乙酸/4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]吡咯烷-3-甲酰胺(1:1)
将40.5毫克（0.06毫摩尔）4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-甲酸（中间体C25）和14.5毫克（0.08毫摩尔）1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)最初装载在1.0毫升乙腈中，加入64.4毫克（0.51毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和50.0毫克（0.08毫摩尔）T3P并在室温下搅拌16小时。再加入相同量的1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)、N,N-二异丙基乙基胺和T3P并在室温下搅拌另外4小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生7.2毫克（理论值的15%）化合物3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-4-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.30 min；MS (ESIpos): m/z = 763 [M+H]+。
将7.2毫克（0.01毫摩尔）3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-4-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯最初装载在1.0毫升二氯甲烷中并加入43.0毫克（0.38毫摩尔）TFA。将反应混合物在室温下搅拌16小时。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1%TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生4.5毫克（理论值的50%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 663 [M+H]+。
中间体F43
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
将22.4毫克（0.03毫摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸（中间体L42）溶解在2.0毫升DMF中并加入4.5毫克（0.03毫摩尔）HOAt、15.8毫克（0.04毫摩尔）HATU和15.7毫克（0.03毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）。加入8.6毫克（0.07毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生16.7毫克（理论值的45%）标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 1125 [M+H]+。
中间体F44
三氟乙酸/N-[(4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)甲基]-19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰胺(1:1)
与中间体F40的合成类似地制备标题化合物。
25.0毫克（0.04毫摩尔）三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1:1)（中间体C24）。
20.5毫克（0.04毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺。
这产生21.8毫克（理论值的48%）化合物3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-4-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-2,18-二氮杂二十一烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.22 min；MS (ESIpos): m/z = 1025 [M+H]+。
21.0毫克（0.02毫摩尔）3-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}-4-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-2,18-二氮杂二十一烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。
168.3毫克（1.48毫摩尔）TFA。
这产生17.3毫克（理论值的90%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92和0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 924 [M+H]+。
中间体F45
三氟乙酸/N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-赖氨酰胺(1:1)
与中间体F46的合成类似地进行合成。
22.9毫克（0.05毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）。
36.2毫克（0.05毫摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸（中间体L41）。
这产生19.8毫克（34%）化合物N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 1.20 min；MS (ESIpos): m/z = 1196 [M+H]+。
17.0毫克（0.01毫摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺。
这产生13.6毫克（理论值的79%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 1096 [M+H]+。
中间体F46
三氟乙酸/N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-赖氨酰胺(1:1)
在氩气下和在0℃下，将49.0毫克（0.05毫摩尔）N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸（中间体L40）、7.3毫克（0.05毫摩尔）HOAt和25.3毫克（0.07毫摩尔）HATU添加到在2.0毫升DMF中的25.1毫克（0.05毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）中。然后加入18.6微升（0.11毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并在室温下继续搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速:50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生29.2毫克（理论值的37%）化合物N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺。
LC-MS (方法4): Rt = 1.51 min；MS (ESIpos): m/z = 1372 [M+H]+。
将25.2毫克（0.02毫摩尔）N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酰胺最初装载在3.0毫升二氯甲烷中并加入83.7毫克（0.73毫摩尔）TFA。将反应溶液在室温下搅拌48小时。在真空下蒸发溶剂和残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生24.5毫克（理论值的96%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.95 min；MS (ESIpos): m/z = 1272 [M+H]+。
中间体F47
N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
将15.2毫克（0.01毫摩尔）N-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸（中间体L43）溶解在1.0毫升DMF中并加入1.5毫克（0.01毫摩尔）HOAt、5.2毫克（0.01毫摩尔）HATU和5.2毫克（0.01毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）。加入2.9毫克（0.02毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生6.8毫克（理论值的33%）标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.37 min；MS (ESIpos): m/z = 1831 [M+H]+。
中间体F48
三氟乙酸/N1-(3-氨基丙基)-N1-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N18-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-6,9,12,15-四氧杂-3-硫杂十八烷-1,18-二酰胺(1:1)
将16.1毫克（0.02毫摩尔）[22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十五烷-25-基]氨基甲酸叔丁酯（中间体C18）最初装载在1.5毫升二氯甲烷中并加入26微升（0.34毫摩尔）TFA。在室温下搅拌整夜，然后加入另外26微升（0.34毫摩尔）TFA。再次在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂并将残留物置于水中并冻干。这产生10.8毫克（理论值的66%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 857 [M+H]+。
中间体F49
(25S)-25-氨基-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸/三氟乙酸(1:1)
与中间体C16的合成类似地进行化合物(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯的合成。
50.0毫克（0.08毫摩尔）中间体C2
20.3毫克（0.18毫摩尔）氯乙酰氯
19.0毫克（0.19毫摩尔）三乙胺
这产生43.1毫克（理论值的77%）化合物(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.55 min；MS (ESIpos): m/z = 689 [M+H]+。
与中间体C17的合成类似地进行化合物(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸的合成。
38.8毫克（0.06毫摩尔）(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯。
19.1毫克（0.07毫摩尔）1-硫烷基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸
45.9毫克（0.14毫摩尔）碳酸铯
这产生40.7毫克（理论值的77%）化合物(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.45 min；MS (ESIpos): m/z = 935 [M+H]+。
与中间体C18的合成类似地进行化合物(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯的合成。
37.4毫克（0.04毫摩尔）(6S)-9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸。
9.2毫克（0.05毫摩尔）1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)。
这产生23.4毫克（理论值的49%）化合物(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.47 min；MS (ESIpos): m/z = 1057 [M+H]+。
与中间体F38的合成类似地进行标题化合物的合成。
20.8毫克（0.02毫摩尔）(25S)-22-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯。
157.0毫克（1.37毫摩尔）TFA。
这产生13.0毫克（65%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 901 [M+H]+。
中间体F50
三氟乙酸/1-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环丙烷甲酰胺(1:1)
将15毫克（0.024毫摩尔）中间体C5溶解在6.5毫升DCM中并加入19毫克（0.049毫摩尔）中间体L24、13微升N,N-二异丙基乙基胺和10毫克（0.037毫摩尔）2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐。将该配制品在室温下搅拌3小时，然后在真空下干燥。残留物通过制备型HPLC提纯，产生2.4毫克受保护的中间体。
然后将这些置于1毫升DCM中并用0.1毫升三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干后产生2.6毫克（经2个步骤，理论值的11%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 2.4 min.
LC-MS (方法1): Rt = 1.25 min；MS (ESIpos): m/z = 819 [M+H]+。
中间体F51
3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺（异构体1）
将10.0毫克（18.079微摩尔）N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)（异构体1）最初装载在100微升PBS缓冲液（Sigma D8537）和200微升ACN中。加入17.1毫克（32.543微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺并在室温下搅拌16小时。该反应溶液通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）并冻干。这产生14.0毫克（理论值的75%）目标化合物。
异构体1
LC-MS (方法1): Rt = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 1039 [M+H]+。
中间体F52
3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺（异构体2）
将6.5毫克（10.694微摩尔，LC/MS纯度 = 91%）N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)（异构体2）最初装载在100微升PBS缓冲液（Sigma D8537）和200微升ACN中。加入10.1毫克（19.249微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺并在室温下搅拌16小时。该反应溶液通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1% TFA, 梯度）并冻干。这产生5.0毫克（理论值的45%）目标化合物。
异构体2
LC-MS (方法5): Rt = 2.87 min；MS (ESIpos): m/z = 1039 [M+H]+。
中间体F53
N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（异构体1）
将10.0毫克（18.079微摩尔）N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)（异构体1）最初装载在200微升PBS缓冲液（Sigma D8537）和400微升ACN中。加入8.1毫克（32.543微摩尔）1,1'-丁烷-1,4-二基双(1H-吡咯-2,5-二酮)并在室温下搅拌1小时。然后加入300微升DMF并搅拌另外1.5小时。该反应溶液通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 0.1%TFA, 梯度）并冻干。这产生4.0毫克（理论值的29%）目标化合物。
异构体1
LC-MS (方法1): Rt = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 765 [M+H]+。
中间体F54
N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（异构体2）
将5.0毫克（9.040微摩尔）N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)（异构体2）最初装载在500微升DMF中。加入4.0毫克（16.271微摩尔）1,1'-丁烷-1,4-二基双(1H-吡咯-2,5-二酮)并在室温下搅拌16小时。该反应溶液通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 +0.1% TFA, 梯度）并冻干。这产生1.1毫克（理论值的16%）目标化合物。
异构体2
LC-MS (方法6): Rt = 2.41 min；MS (ESIpos): m/z = 765 [M+H]+。
中间体F55
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基甲酰基]苯基}-L-丙氨酰胺
将6.5毫克（4.5微摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺溶解在441微升二氯甲烷中并加入44微升（573.1微摩尔）三氟乙酸。在室温下在旋转蒸发器上浓缩，置于水和ACN中并冻干。这产生5.6毫克（理论值的94%，根据LC/MS的纯度 = 92%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.01 min；MS (ESIpos): m/z = 1100.6 [M+H]+。
中间体F56
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[(2S)-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丙-2-基]丁酰胺(1:1)
类似于中间体F50制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (EIpos): m/z = 708 [M+H]+。
中间体F57
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[(2R)-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丙-2-基]丁酰胺(1:1)
类似于中间体F56制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (EIpos): m/z = 708 [M+H]+。
中间体F58
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
将16.2毫克（0.02毫摩尔）三氟乙酸/L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺(1:1)（中间体C41）最初装载在1.0毫升DMF中并加入8.3毫克（0.06毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和12.6毫克（0.04毫摩尔）1,1'-[(1,5-二氧代戊-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在室温下搅拌整夜并直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ,流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生11.0毫克（理论值的60%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.18 min；MS (ESIpos): m/z = 852 [M+H]+。
中间体F82
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
与中间体F83的合成类似地进行标题化合物的合成。所用外消旋中间体与相应R-异构体中间体类似地获得。
LC-MS (方法2): Rt = 7.07 min；MS (EIpos): m/z = 1236 [M+Na]+。
中间体F83
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
将30.0毫克（0.06毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（实施例98）和26.1毫克（0.06毫摩尔）N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯最初装载在2.0毫升DMF中并加入19.4毫克（0.19毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜并加入11.5毫克（0.19毫摩尔）HOAc。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生41.9毫克（理论值的79%）化合物[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.44 min；MS (ESIpos): m/z = 763 [M+H]+。
将37.2毫克（0.05毫摩尔）[(2S)-1-({3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯溶解在1.5毫升DMF中并加入124.6毫克（1.46毫摩尔）2-氨基乙醇。将反应混合物在室温下搅拌整夜。使反应混合物在乙酸乙酯和水之间分相，有机相用水洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇10:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生14.2毫克（理论值的50%）化合物N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 541 [M+H]+。
将14.1毫克（0.03毫摩尔）N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺和11.4（0.03毫摩尔）N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯溶解在1.5毫升DMF中并加入7.9毫克（0.08毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜，加入4.7毫克（0.08毫摩尔）HOAc。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生15.9毫克（理论值的71%）化合物N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 1.46 min；MS (ESIpos): m/z = 862 (M+H)+。
将14.9毫克（0.02毫摩尔）N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺溶解在1.5毫升DMF中并加入44.2毫克（0.52毫摩尔）2-氨基乙醇。将反应混合物在室温下搅拌整夜。使反应混合物在乙酸乙酯和水之间分相，有机相用水洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇 10:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生5.7毫克（理论值的52%）化合物L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 640 (M+H)+。
将5.5毫克（8.6微摩尔）L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺和6.5毫克（6.5微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶解在1.0毫升DMF中并加入0.9毫克（8.6毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜，并加入0.8毫克（0.01毫摩尔）HOAc。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生7.7毫克（理论值的74%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.10 min；MS (ESIpos): m/z = 1214 (M+H)+。
中间体F84
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
首先，将16.5毫克（0.02毫摩尔）中间体C54置于5毫升DMF中并在11.7毫克（0.03毫摩尔）HATU和18微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与10.4毫克（0.041毫摩尔）三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)反应。在室温下搅拌5分钟后浓缩并将残留物置于乙腈/水1:1中。用三氟乙酸将pH调节至2并再浓缩该配制品。留下的残留物通过制备型HPLC提纯。这产生8毫克（理论值的42%）受保护的中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.38 min；MS (EIpos): m/z = 929 [M+H]+。
将7.6毫克（0.008毫摩尔）这种中间体置于3毫升DMF中并加入92毫克（0.82毫摩尔）1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。该配制品在超声浴中处理1小时。然后加入31微升乙酸并在高真空下浓缩该配制品。残留物通过制备型HPLC提纯。这产生3毫克（理论值的45%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (EIpos): m/z = 707 [M+H]+.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d = 8.15 (t, 1H), 7.9-8.1 (m, 4H), 7.6 (m,1H), 7.5 (s, 1H), 7.15-7.35 (m, 6H), 6.9-7.0 (m, 3H), 6.85 (s, 1H), 5.6 (s,1H), 4.9和5.2 (2d, 2H), 4.05和4.2 (2d, 2H), 3.1-3.2 (m, 4H), 2.15 (m, 2H),0.7和1.45 (2m, 2H), 0.8 (s, 9H)。
中间体F85
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]丁酰胺(1:1)
首先，将10毫克（0.014毫摩尔）中间体C53置于3.4毫升DMF中并在7.8毫克（0.02毫摩尔）HATU和12微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与7毫克（0.027毫摩尔）三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)反应。在室温下搅拌15分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生6.6毫克（理论值的57%）受保护的中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.4 min；MS (EIpos): m/z = 858 [M+H]+。
将6.6毫克（0.008毫摩尔）这种中间体置于2毫升DMF中并加入86毫克（0.77毫摩尔）1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。该配制品在超声浴中处理2小时。然后加入44微升乙酸并在高真空下浓缩该配制品。残留物通过制备型HPLC提纯。这产生3.3毫克（理论值的53%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (EIpos): m/z = 636 [M+H]+。
中间体F86
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
由8毫克（0.012毫摩尔）中间体C51通过在5.8毫克（0.015毫摩尔）HATU和10微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与4.5毫克（0.017毫摩尔）三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生7毫克（经2个步骤，理论值的78%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.83 min；MS (EIpos): m/z = 708 [M+H]+。
中间体F87
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)
类似于中间体F2由16毫克（0.025毫摩尔）中间体C49通过在EDCI/HOBT和N,N-二异丙基乙基胺存在下与24毫克（0.076毫摩尔）中间体L1反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生3毫克标题化合物（经2个步骤，理论值的14%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (EIpos): m/z = 694 [M+H]+。
中间体F88
类似于中间体F8制备该化合物。
LC-MS (方法5): Rt = 2.97 min；MS (EIpos): m/z = 1006 [M+H]+。
中间体F89
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
由8毫克（0.012毫摩尔）中间体C51通过在5.8毫克（0.015毫摩尔）HATU和10微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与7.4毫克（0.014毫摩尔）中间体L8反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生10毫克（经2个步骤，理论值的78%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (EIpos): m/z = 984 [M+H]+。
中间体F90
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
由11毫克（0.018毫摩尔）中间体C49通过在34毫克（0.089毫摩尔）HATU和19微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与13.7毫克（0.018毫摩尔）中间体L17反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生7.5毫克（经2个步骤，理论值的35%）。
LC-MS (方法8): Rt = 6.78 min；MS (EIpos): m/z = 1092 [M+H]+。
中间体F91
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]丁酰胺(1:1)
将9.3毫克（0.01毫摩尔）[(2S)-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯溶解在2毫升二氯甲烷中，加入740毫克（6.49毫摩尔，0.50毫升）三氟乙酸，并在室温下搅拌1.5小时。然后浓缩该反应混合物，将残留物置于乙腈和水中并冻干。这产生9.2毫克（理论值的96%）目标化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (EIpos): m/z = 637 [M+H]+。
中间体F103
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(3-{[(1R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基](4-甲基苯甲酰基)氨基}丙基)-L-丙氨酰胺
由10毫克（0.019毫摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-[(1R)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基]-4-甲基苯甲酰胺通过在8.8毫克（0.023毫摩尔）HATU和10微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与11.3毫克（0.019毫摩尔）中间体L44反应而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯。
产量: 8.5毫克（理论值的35%）
LC-MS (方法5): Rt = 3.82 min；MS (EIpos): m/z = 1085 [M+H]+。
中间体F104
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
将10毫克（0.014毫摩尔）中间体C53溶解在3.3毫升DMF中并加入8.5毫克（0.027毫摩尔）中间体L1、7.8毫克（0.02毫摩尔）HATU和12微升N,N-二异丙基乙基胺。将该配制品在室温下搅拌15分钟，然后浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯，在冻干后产生5.6毫克（理论值的38%）受保护的中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.32 min；MS (ESIpos): m/z = 915 (M+H)+。
将5.6毫克（0.006毫摩尔）这种中间体置于2毫升DMF中并加入69毫克（0.61毫摩尔）1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。该配制品在超声浴中处理2小时。然后加入35微升乙酸并在高真空下浓缩该配制品。残留物通过制备型HPLC提纯。这产生2.4毫克（理论值的48%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (EIpos): m/z = 693 [M+H]+.
HPLC (方法11): Rt = 1.91 min。
或者，也由中间体C58制备标题化合物。最初在13毫克（0.034毫摩尔）HATU和10微升N,N-二异丙基乙基胺存在下使15毫克（0.023毫摩尔）中间体C58与11毫克（0.036毫摩尔）中间体L1反应。在室温下搅拌60分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生12.3毫克（理论值的63%）受保护的中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.3 min；MS (EIpos): m/z = 837 [M+H]+。
在第二步骤中，将这种中间体溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入12毫克（0.088毫摩尔）氯化锌并在50℃下搅拌2小时。然后加入26毫克（0.088毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2毫升0.1%的三氟乙酸水溶液。该配制品通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生8.1毫克（理论值的68%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 693 (M+H)+。
中间体F105
N2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F32由中间体C5和中间体L46制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (EIpos): m/z = 766 [M+H]+。
中间体F106
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-N-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(1:1)
类似于中间体F104由中间体C53和中间体L47制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.85 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (ESIpos): m/z = 983 (M+H)+。
中间体F107
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由15毫克（0.024毫摩尔）中间体C49通过在14毫克（0.037毫摩尔）HATU和21微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与22.3毫克（0.049毫摩尔）中间体L48反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生13毫克（经2个步骤，理论值的60%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F108
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体F104由20毫克（0.027毫摩尔）中间体C53和24毫克（0.054毫摩尔）中间体L48制备标题化合物。这产生3毫克（经2个步骤，理论值的14%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (EIpos): m/z = 747 [M+H]+。
中间体F109
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1:1)
将17毫克（0.026毫摩尔）中间体C57置于3毫升DMF中并在14微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与7毫克（0.027毫摩尔）市售1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应。在室温下搅拌15分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生7毫克（理论值的33%）这种中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.29 min；MS (ESIpos): m/z = 777和779 (M+H)+。
将这种中间体置于1毫升二氯甲烷中并用1毫升三氟乙酸脱保护。在浓缩和从乙腈/水中冻干后，获得6毫克（理论值的88%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (ESIpos): m/z = 677/679 (M+H)+。
中间体F110
N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F109由16毫克（0.023毫摩尔）中间体C5和17毫克（0.025毫摩尔）中间体L49制备标题化合物。这产生6毫克（经2个步骤，理论值的24%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.93 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 933和935 (M+H)+。
中间体F111
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由15毫克（0.022毫摩尔）中间体C5通过在12.5毫克（0.032毫摩尔）HATU和19微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与16毫克（0.044毫摩尔）中间体L50反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生13毫克（经2个步骤，理论值的67%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F112
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由15毫克（0.024毫摩尔）中间体C49通过在14毫克（0.037毫摩尔）HATU和21微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与18毫克（0.049毫摩尔）中间体L50反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生12毫克（经2个步骤，理论值的51%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F113
三氟乙酸/(1S,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由15毫克（0.019毫摩尔）中间体C53通过在11毫克（0.029毫摩尔）HATU和17微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与14毫克（0.038毫摩尔）中间体L50反应和随后在2毫升DMF中用133毫克DABCO脱保护而制备标题化合物。通过HPLC提纯产生4毫克（经2个步骤，理论值的24%）。
LC-MS (方法5): Rt = 2.77 min；MS (EIpos): m/z = 747 [M+H]+。
中间体F114
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由15毫克（0.022毫摩尔）中间体C5通过在12.6毫克（0.032毫摩尔）HATU和19微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与16毫克（0.044毫摩尔）中间体L51反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生11毫克（经2个步骤，理论值的53%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F115
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由15毫克（0.024毫摩尔）中间体C49通过在13毫克（0.035毫摩尔）HATU和21微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与18毫克（0.047毫摩尔）中间体L51反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生12毫克（经2个步骤，理论值的51%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F116
三氟乙酸/(1R,3R)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由11毫克（0.014毫摩尔）中间体C51通过在8毫克（0.021毫摩尔）HATU和12微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与11毫克（0.028毫摩尔）中间体L51反应和随后在2毫升DMF中用87毫克DABCO脱保护而制备标题化合物。通过HPLC提纯产生3.3毫克（经2个步骤，理论值的28%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (EIpos): m/z = 747 [M+H]+。
中间体F117
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
根据肽化学的经典方法由中间体C49制备标题化合物。首先，在HATU存在下将C49与肼甲酸9H-芴-9-基甲酯偶联。然后在DMF中用哌啶除去Fmoc保护基并将所得酰肼在HATU存在下与6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸偶联。在最后步骤中，在二氯甲烷中用TFA除去Boc保护基。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (EIpos): m/z = 722 [M+H]+。
中间体F118
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
在第一步骤中，类似于中间体F3由15毫克（0.019毫摩尔）中间体C53通过在HATU存在下与市售6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己烷酰肼偶联制备标题化合物。然后在DMF中用142毫克DABCO裂解Fmoc保护基。通过HPLC提纯产生3毫克（理论值的19%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.90 min；MS (EIpos): m/z = 721 [M+H]+。
中间体F119
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1:1)
将29毫克（0.044毫摩尔）中间体C58置于3.4毫升DMF中并加入36毫克（0.087毫摩尔）中间体L52、25毫克（0.065毫摩尔）HATU和19微升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌60分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生26.4毫克（理论值的73%）中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 820和822 (M+H)+。
将这种中间体溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入6.5毫克（0.048毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌4小时。加入13.9毫克（0.048毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2毫升0.1%的三氟乙酸水溶液。该配制品通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生14.4毫克（理论值的58%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 676和678 (M+H)+。
中间体F120
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由10毫克（0.015毫摩尔）中间体C5通过在8.4毫克（0.022毫摩尔）HATU和13微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与11毫克（0.03毫摩尔）中间体L53反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生7.5毫克（经2个步骤，理论值的59%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F121
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由10毫克（0.016毫摩尔）中间体C49通过在9毫克（0.024毫摩尔）HATU和14微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与11.5毫克（0.031毫摩尔）中间体L53反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生9毫克（经2个步骤，理论值的61%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F122
三氟乙酸/(1S,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由15毫克（0.019毫摩尔）中间体C53通过在11毫克（0.029毫摩尔）HATU和17微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与14毫克（0.038毫摩尔）中间体L53反应和随后在3毫升DMF中用202毫克DABCO脱保护而制备标题化合物。通过HPLC提纯产生4毫克（经2个步骤，理论值的24%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (EIpos): m/z = 747 [M+H]+。
中间体F123
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由10毫克（0.015毫摩尔）中间体C5通过在8.4毫克（0.022毫摩尔）HATU和13微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与11毫克（0.030毫摩尔）中间体L54反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生4毫克（经2个步骤，理论值的31%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F124
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由10毫克（0.016毫摩尔）中间体C49通过在9毫克（0.024毫摩尔）HATU和14微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与11.5毫克（0.031毫摩尔）中间体L54反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生9毫克（经2个步骤，理论值的66%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (EIpos): m/z = 748 [M+H]+。
中间体F125
三氟乙酸/(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)
由15毫克（0.019毫摩尔）中间体C53通过在11毫克（0.029毫摩尔）HATU和17微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与14毫克（0.038毫摩尔）中间体L54反应和随后在3毫升DMF中用127毫克DABCO脱保护而制备标题化合物。通过HPLC提纯产生3毫克（经2个步骤，理论值的17%）。
LC-MS (方法4): Rt = 1.08 min；MS (EIpos): m/z = 769 [M+Na]+。
中间体F126
N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F110由18毫克（0.027毫摩尔）中间体C49和21毫克（0.027毫摩尔）中间体L49制备标题化合物。这产生8.7毫克（经2个阶段，理论值的30%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.94 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (ESIpos): m/z = 933和935 (M+H)+。
中间体F127
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
将12毫克（0.015毫摩尔）中间体C59溶解在2.4毫升DMF中并加入14.6毫克（0.046毫摩尔）中间体L1、6毫克（0.031毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5.9毫克（0.039毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和8微升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌1小时后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生11毫克（理论值的70%）这种中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 942 (M+H)+。
将11毫克（0.011毫摩尔）这种中间体置于2毫升DMF中并加入123毫克（1.1毫摩尔）1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将该配制品在超声浴中处理2小时。然后加入63微升乙酸并在高真空下浓缩该配制品。残留物通过制备型HPLC提纯。这产生2毫克（理论值的22%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (EIpos): m/z = 721 [M+H]+.
HPLC (方法11): Rt = 1.95 min。
中间体F128
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-D-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
由3毫克（0.005毫摩尔）中间体C5通过在2.5毫克（0.007毫摩尔）HATU和3微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与2.5毫克（0.003毫摩尔）中间体L55反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生1.4毫克（经2个步骤，理论值的32%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (EIpos): m/z = 1077 [M+H]+。
中间体F129
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸
类似于中间体F128由10毫克（0.016毫摩尔）中间体C49通过在12毫克（0.031毫摩尔）HATU和14微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与19毫克（0.024毫摩尔）中间体L56反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生13.5毫克（经2个步骤，理论值的70%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (EIpos): m/z = 1117 [M+H]+。
中间体F142
R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将20.0毫克（23.7微摩尔）R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)和13.4毫克（26.04毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解在1.0毫升DMF中并加入4.8毫克（47.34微摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入3.6毫克（0.06毫摩尔）乙酸且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生12.4毫克（理论值的44%）化合物R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]高半胱氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.30 min；MS (ESIpos): m/z = 1129 (M+H)+。
将10.0毫克（8.85微摩尔）R/S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-高半胱氨酸溶解在三氟乙醇中并加入3.1毫克（22.71微摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。向该反应混合物加入3.9毫克（0.01毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，简短搅拌，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物用少量水冻干。这产生7.6毫克（理论值的78%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 983 (M+H)+.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 0.50 (m, 1H), 0.81 (s, 9H), 1.49 (m,1H), 1.89 (m, 1H), 2.05 (m, 1H), 2.29-2.43 (m, 4H), 2.45-2.55 (m, 2H), 2.58-2.74 (m, 2H), 3.10-3.20 (m, 2H), 3.21-3.40 (m, 2H), 3.42-3.54 (m, 16H), 3.55-3.65 (m, 4H), 4.28 (m, 1H), 4.91 (dd, 1H), 5.18 (dd, 1H), 5.60 (s, 1H), 6.95(m, 1H), 7.00 (s, 2H), 7.15-7.38 (m, 7H), 7.53 (s, 1H), 7.68 (m, 1H), 8.00(m, 2H)。
中间体F143
三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]己酰胺(1:1)
将30.0毫克（0.05毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯和13.5毫克（0.07毫摩尔）6-(乙酰基硫烷基)己酸最初一起装载在含一滴水的2.0毫升甲醇中。加入23.0毫克（0.17毫摩尔）碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌4小时。将乙酸乙酯添加到反应混合物中。有机相用饱和NaCl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生54.2毫克（理论值的90%）化合物11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 1106 (M+H)+。
将54.0毫克（0.07毫摩尔）11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸和16.7毫克（0.09毫摩尔）1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)最初装载在3.0毫升乙腈中并加入75.0毫克（0.58毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。加入60.0毫克（0.09毫摩尔）T3P（50%在乙腈中）并在室温下搅拌整夜。用水猝灭该反应且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生42.8毫克（理论值的68%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.48 min；MS (ESIpos): m/z = 866 (M+H)+。
将20.0毫克（0.02毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.0毫升三氟乙醇中并加入4.7毫克（0.04毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌整夜，然后加入10.1毫克（0.04毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，并搅拌10分钟。加入水（0.1% TFA）且反应混合物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min,MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生9.2毫克（理论值的48%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 722 (M+H)+。
中间体F144
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
将50.0毫克（0.1毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯（中间体C15）最初装载在2.0毫升二氯甲烷中并加入22.7毫克（0.22毫摩尔）三乙胺和49.3毫克（0.22毫摩尔）6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氯（中间体L60）WISV1648-1-1。
将反应混合物在室温下搅拌整夜。然后每2小时三次加入1当量中间体L60和1.2当量三乙胺，然后在室温下搅拌整夜。这一程序再重复两次。在真空下除去溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生30.9毫克（理论值的43%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.51 min；MS (ESIpos): m/z = 706 (M+H)+。
将24.6毫克（0.04毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在3.0毫升二氯甲烷中，加入79.5毫克（0.7毫摩尔）TFA并在室温下搅拌6小时。加入另外79.5毫克（0.7毫摩尔）TFA并在室温下搅拌整夜。在真空下除去溶剂且残留物与二氯甲烷共蒸馏三次。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生24.2毫克（理论值的97%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.02 min；MS (ESIpos): m/z = 606 (M+H)+。
中间体F145
三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]己酰胺
将90.0毫克（0.15毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯（中间体C16）和43.6毫克（0.23毫摩尔）6-(乙酰基硫烷基)己酸最初与一起装载在含一滴水的9.0毫升甲醇中并加入73.9毫克（0.54毫摩尔）碳酸钾。将反应混合物在室温下搅拌4小时，然后加入乙酸乙酯。有机相用水/饱和NaCl溶液和用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物在硅胶上提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇100:2）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生98.7毫克（理论值的83%）化合物9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.44 min；MS (ESIpos): m/z = 701 (M+H)+。
将20.0毫克（0.03毫摩尔）9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸和6.5 (0.04毫摩尔)1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1) 最初装载在1.5毫升乙腈中并加入23.6毫克（0.04毫摩尔）T3P和29.5毫克（0.23毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入水。该反应混合物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生16.7毫克（理论值的99%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.40 min；MS (ESIpos): m/z = 823 (M+H)+。
将14.8毫克（0.02毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在1.5毫升二氯甲烷中并加入41.0毫克（0.36毫摩尔）TFA。将反应混合物在室温下搅拌整夜。
然后，再加入两次每次41.0毫克（0.36毫摩尔）TFA并在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，将残留物置于1,4-二氧杂环己烷和水中并冻干。这产生2.9毫克（理论值的19%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 723 (M+H)+。
中间体F146
R/S-[2-([(3S)-3-氨基-3-羧基丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将25.0毫克（28.12微摩尔）R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸（中间体C12）和15.9毫克（30.93微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解在2.0毫升DMF中并加入11.4毫克（112.48微摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入7.6毫克（0.13毫摩尔）乙酸且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生23.9毫克（理论值的59%）化合物R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]高半胱氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.26 min；MS (ESIpos): m/z = 1173 (M+H)+。
将11.8毫克（8.23微摩尔）R/S-[(8S)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]高半胱氨酸溶解在三氟乙醇中并加入1.7毫克（12.35微摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。向该反应混合物加入3.6毫克（0.01毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，简短搅拌，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生5.8毫克（理论值的62%）标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.20 min；MS (ESIpos): m/z = 1029 (M+H)+。
中间体F147
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10-氧代-3,6-二氧杂-16-硫杂-9-氮杂十八烷-18-酰胺(1:1)
将15.0毫克（0.03毫摩尔）9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸（中间体C13）最初装载在1.5毫升乙腈中并加入22.1毫克（0.17毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺，然后17.7毫克（0.03毫摩尔）T3P。在室温下搅拌5分钟，然后加入9.5毫克（0.03毫摩尔）三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)（中间体L59）。将反应混合物在室温下搅拌整夜并用水猝灭。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱:Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生14.8毫克（理论值的57%）化合物[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10,18-二氧代-3,6-二氧杂-16-硫杂-9,19-二氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.40 min；MS (ESIpos): m/z = 911 (M+H)+。
将14.2毫克（0.02毫摩尔）[19-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10,18-二氧代-3,6-二氧杂-16-硫杂-9,19-二氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸叔丁酯溶解在1.5毫升二氯甲烷中，加入35.5毫克（0.31毫摩尔）TFA并在室温下搅拌整夜。加入另外71.0毫克（0.62毫摩尔）TFA并将该混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱:Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，将残留物置于少量水中并冻干。这产生14.0毫克（理论值的97%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.01 min；MS (ESIpos): m/z = 811 (M+H)+。
中间体F148
三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}亚磺酰基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]己酰胺(1:1)
作为中间体F145的合成中的副产物形成标题化合物。这产生8.1毫克（理论值的53%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.25 min；MS (ESIpos): m/z = 739 [M+H]+。
中间体F149
三氟乙酸/R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]高半胱氨酸(1:1)
将20.0毫克（24.94微摩尔）R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]高半胱氨酸（中间体C14）和14.1毫克（27.44微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺最初装载在1.0毫升DMF中并加入5.1毫克（49.88微摩尔）4-甲基吗啉。将该反应混合物搅拌整夜。加入3.7毫克（0.06毫摩尔）乙酸且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生18.2毫克（理论值的67%）化合物R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]高半胱氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.23 min；MS (ESIpos): m/z = 1086 (M+H)+。
将17.6毫克（0.02毫摩尔）R/S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]高半胱氨酸溶解在1.5毫升二氯甲烷中，加入37.0毫克（0.32毫摩尔）TFA并在室温下搅拌整夜。加入另外74.0毫克（0.64毫摩尔）TFA并在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水,0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，将残留物置于少量水中并冻干。这产生16.0毫克（理论值的90%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 986 (M+H)+。
中间体F150
三氟乙酸/N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[2-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)乙基]-L-丙氨酰胺(1:1)
在氩气下和在0℃下，10.0毫克（0.02毫摩尔）三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯（中间体C20）在1.0毫升DMF中用12.1毫克（0.02毫摩尔）N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸（中间体L25）、2.2毫克（0.02毫摩尔）HOAt和7.6毫克（0.02毫摩尔）HATU处理。然后加入5.5微升（0.03毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并在室温下搅拌整夜。向反应混合物加入1.8微升HOAc且直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生10.4毫克（理论值的48%）化合物N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十四烷-14-基)-L-丙氨酰胺。
LC-MS (方法4): Rt = 1.60 min；MS (ESIpos): m/z = 687.5 [M+2H]2+。
将9.5毫克（0.01毫摩尔）N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(9-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十四烷-14-基)-L-丙氨酰胺最初装载在1.0毫升二氯甲烷中，加入15.8毫克（0.14毫摩尔）TFA并搅拌整夜。加入另外31.6毫克（0.28毫摩尔）TFA并将该混合物搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱:Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，将残留物置于少量水中并冻干。这产生10.2毫克（理论值的98%）标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.13 min；MS (ESIpos): m/z = 637.5 [M+2H]2+。
中间体F151
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(3-{(2S)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]-2-苯基-2,3-二氢-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-L-丙氨酰胺
将5.0毫克（0.01毫摩尔）(2S)-2-(3-氨基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-甲酰胺最初装载在1.0毫升乙腈中并加入7.7毫克（0.06毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和9.8（0.02毫摩尔）T3P。将该混合物在室温下搅拌5分钟，然后加入9.1毫克（0.02毫摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸（中间体L44）。在室温下搅拌整夜。加入水且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x40；10µ,流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生4.3毫克（理论值的35%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.02 min；MS (ESIpos): m/z = 989 [M+H]+。
中间体F152
N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-(3-{(2S)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]-2-苯基-2,3-二氢-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-L-丙氨酰胺
将5.0毫克（0.01毫摩尔）(2S)-2-(3-氨基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-N-甲氧基-N-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2H)-甲酰胺最初装载在1.0毫升乙腈中并加入7.7毫克（0.06毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和9.8（0.02毫摩尔）T3P。在室温下搅拌5分钟，然后加入11.8毫克（0.02毫摩尔）N-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸（中间体L25）。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入水且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱:Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生4.7毫克（理论值的34%）标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.34 min；MS (ESIpos): m/z = 1165 [M+H]+。
中间体F153
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-2-羟基丙酰基]氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
类似于中间体F104由中间体C60进行该合成。
LC-MS (方法1): Rt = 1.1 min；MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H)+。
中间体F154
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F2由10毫克（0.015毫摩尔）中间体C8和15毫克（0.022毫摩尔）中间体L6制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.91 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 1077 (M+H)+。
中间体F155
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
通过14毫克（0.019毫摩尔）中间体C61与15毫克（0.021毫摩尔）中间体L61在8.7毫克（0.023毫摩尔）HATU和17微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生13毫克（经2个步骤，理论值的59%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (ESIpos): m/z = 1076 (M+H)+。
中间体F156
N-(溴乙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，由N2-[(苄氧基)羰基]-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸根据肽化学的经典方法（使用EDCI/DMAP用2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化、氢解、在HATU存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联和再次氢解）制备三肽衍生物L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
将84毫克（0.163毫摩尔）这种中间体置于2.5毫升DMF中并加入58毫克（0.244毫摩尔）1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮。在室温下搅拌10分钟后浓缩，将残留物置于乙腈/水1:1中并用三氟乙酸调节至pH 2并通过制备型HPLC提纯。在适当馏分的浓缩后，将残留物置于15毫升在DCM中的5%三氟乙酸溶液中并在室温下搅拌2小时。然后在轻微冷却下浓缩，残留物从乙腈/水1:1中冻干。经2个步骤获得53毫克（理论值的50%）这种中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 0.72 min；MS (ESIpos): m/z = 537和539 (M+H)+。
为了合成标题化合物，将18毫克（0.027毫摩尔）这种中间体置于4毫升DMF中并加入16毫克（0.025毫摩尔）中间体C61和19毫克HATU和9微升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌5分钟后，加入几滴三氟乙酸，该配制品通过制备型HPLC提纯。在适当馏分的浓缩和从乙腈/水1:1中冻干后，将所得中间体溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。在加入4.8毫克（0.035毫摩尔）氯化锌后，将该配制品在50℃下搅拌2.5小时。然后加入10毫克（0.035毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，该反应用乙腈/水稀释并过滤。通过制备型HPLC进行提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后经2个步骤产生3.2毫克（理论值的13%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.94 min；
LC-MS (方法5): Rt = 2.79 min；MS (ESIpos): m/z = 932和934 (M+H)+。
中间体F163
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基] 丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
通过37毫克（0.056毫摩尔）中间体C58和41毫克（0.056毫摩尔）中间体L61在HATU存在下的偶联和随后如对中间体F119所述用氯化锌解封而制备标题化合物。这产生12毫克（经2个步骤，理论值的19%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.49 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 1005 (M+H)+。
中间体F164
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F155通过20毫克（0.030毫摩尔）中间体C58与27毫克（0.033毫摩尔）中间体L62在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.92 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 1091 (M+H)+。
中间体F165
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F155通过15毫克（0.021毫摩尔）中间体C61与18毫克（0.023毫摩尔）中间体L62在HATU存在下的偶联和随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 1162 (M+H)+。
中间体F166
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，由市售(1R, 3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸根据肽化学的经典方法通过使用EDCI/DMAP用苄醇酯化和随后在DCM中用TFA裂解叔丁氧基羰基保护基而制备三氟乙酸/(1R, 3S)-3-氨基环戊烷甲酸苄酯(1:1)。
将51毫克（0.076毫摩尔）这种中间体置于6毫升DMF中并在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下与50毫克（0.076毫摩尔）中间体C58偶联。在通过制备型HPLC提纯后，将该中间体置于甲醇中并在室温下在氢气标准压力下经10%钯-活性炭氢化2小时。然后滤出催化剂，在真空下除去溶剂，该产物通过制备型HPLC提纯。从二氧杂环己烷中冻干后产生21毫克（经2个步骤，理论值的34%）(1R,3S)-3-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]氨基}环戊烷甲酸。
类似于中间体F155通过10.5毫克（0.013毫摩尔）这种中间体与11.4毫克（0.014毫摩尔）中间体L62在HATU存在下的偶联和随后在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生8.6毫克（经2个步骤，理论值的48%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 1203 (M+H)+。
中间体F167
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F129由11毫克（0.016毫摩尔）中间体C5通过在12毫克（0.032毫摩尔）HATU和14微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与20毫克（0.024毫摩尔）中间体L56反应和随后用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。这产生11毫克（经2个步骤，理论值的46%）。
LC-MS (方法4): Rt = 1.13 min；MS (EIpos): m/z = 1117 [M+H]+。
中间体F168
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，由市售(1R,2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸根据肽化学的经典方法通过使用EDCI/DMAP用苄醇酯化和随后在DCM中用 TFA裂解叔丁氧基羰基保护基而制备三氟乙酸/(1R,2S)-2-氨基环戊烷甲酸苄酯(1:1)。
将102毫克（0.305毫摩尔）这种中间体置于12毫升DMF中并在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下与100毫克（0.152毫摩尔）中间体C58偶联。在通过制备型HPLC提纯后，将该中间体置于甲醇中并在室温下在氢气标准压力下经10%钯-活性炭氢化2小时。然后滤出催化剂，在真空下除去溶剂，该产物通过制备型HPLC提纯。从乙腈/水1:1中冻干后产生70毫克（经2个步骤，理论值的59%）(1R,2S)-2-{[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]氨基}环戊烷甲酸。
然后通过20毫克（0.013毫摩尔）这种中间体与 16.6毫克（0.023毫摩尔）中间体L61在9.5毫克（0.025毫摩尔）HATU和18微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生9.3毫克（经2个步骤，理论值的30%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.98 min；MS (ESIpos): m/z = 1116 (M+H)+。
中间体F169
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{[(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F168由中间体C58和L62进行标题化合物的合成。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 1202 (M+H)+。
中间体F170
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-D-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
与其非对映体中间体F23类似地制备标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.9 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.83 min；MS (ESIpos): m/z = 1092 (M+H)+。
中间体F171
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-D-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F155由中间体C62和L61进行标题化合物的合成。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 1076 (M+H)+。
中间体F172
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
由10毫克（0.013毫摩尔）中间体C63通过在5.5毫克（0.014毫摩尔）HATU和11微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与9毫克（0.014毫摩尔）中间体L63偶联和随后通过在三氟乙酸/二氯甲烷1:1溶液中搅拌2.5小时脱保护而制备标题化合物。这产生11毫克（经2个步骤，理论值的72%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (EIpos): m/z = 1049 [M+H]+。
中间体F173
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
由15毫克（0.018毫摩尔）中间体C64通过在7.7毫克（0.02毫摩尔）HATU和16微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与12毫克（0.02毫摩尔）中间体L63偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生12毫克（经2个步骤，理论值的58%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (EIpos): m/z = 1048 [M+H]+。
中间体F174
N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F172由中间体C57和L63制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.9 min；MS (EIpos): m/z = 1049 [M+H]+。
中间体F175
三氟乙酸/N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)
通过11毫克（0.013毫摩尔）中间体C64与3.4毫克（0.016毫摩尔）6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酸在6.7毫克（0.018毫摩尔）HATU和9微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生8毫克（经2个步骤，理论值的69%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.35 min；MS (EIpos): m/z = 893 [M+H]+。
中间体F176
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷-15-基]丁酰胺(1:1)
通过5毫克（0.006毫摩尔）中间体C64与2毫克（0.007毫摩尔）3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸（其制备描述在中间体L15下）在3.5毫克（0.009毫摩尔）HATU和4微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生2毫克（经2个步骤，理论值的35%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (EIpos): m/z = 839 [M+H]+。
中间体F177
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)环戊烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体F168使用中间体L1代替中间体L61制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (EIpos): m/z = 804 [M+H]+。
中间体F178
三氟乙酸/(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-N-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}环戊烷甲酰胺(1:1)
类似于中间体F177使用中间体L52代替中间体L1制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (EIpos): m/z = 787和789 [M+H]+。
中间体F179
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己基]丁酰胺(1:1)
通过15毫克（0.023毫摩尔）中间体C58与6毫克（0.025毫摩尔）1-(6-氨基己基)-1H-吡咯-2,5-二酮在13毫克（0.034毫摩尔）HATU和16微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生8.5毫克（经2个步骤，理论值的46%）标题化合物。
LC-MS (方法6): Rt = 2.22 min；MS (EIpos): m/z = 692 [M+H]+。
中间体F180
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-N2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
通过9.6毫克（0.012毫摩尔）中间体C64与5毫克（0.013毫摩尔）中间体L64在7毫克（0.018毫摩尔）HATU和6微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生3.1毫克（经2个步骤，理论值的28%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (EIpos): m/z = 822 [M+H]+。
中间体F192
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-L-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将60毫克（0.091毫摩尔）中间体C58 置于8毫升DMF中并在42毫克（0.11毫摩尔）HATU和64微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与45毫克（0.100毫摩尔）中间体L65偶联。在通过制备型HPLC提纯后，将该中间体置于10毫升乙醇中并在室温下在氢气标准压力下经10%钯-活性炭氢化45分钟。然后滤出催化剂，在真空下除去溶剂，该产物通过制备型HPLC提纯。从乙腈/水1:1中冻干后产生24.5毫克（经2个步骤，理论值的31%）3-氨基-N-[(2S)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-L-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.17 min；MS (EIpos): m/z = 844 [M+H]+。
然后通过10毫克（0.012毫摩尔）这种中间体与2毫克（0.013毫摩尔）市售(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸中间体在5.4毫克（0.014毫摩尔）HATU和8微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生3.5毫克（经2个步骤，理论值的33%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+。
中间体F193
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-D-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F192由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-N-(叔丁氧基羰基)-D-丙氨酸/N-环己基环己胺(1:1)进行标题化合物的合成。
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+。
中间体F194
N-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
由实施例98首先通过在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下与N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酸偶联而制备标题化合物。在下一步骤中，通过在室温下在氢气标准压力下经10%钯-活性炭氢化1小时而除去Z保护基，然后如对中间体F58所述通过与1,1'-[(1,5-二氧代戊-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮反应而将该脱保护的中间体转化成标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.19 min；MS (ESIpos): m/z = 851 [M+H]+。
中间体F195
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁基}-N'-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]琥珀酰胺(1:1)
通过26毫克（0.035毫摩尔）中间体C65与18毫克（0.07毫摩尔）市售三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)在8毫升DMF中在40毫克（0.1054毫摩尔）HATU和61微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生16毫克（经2个步骤，理论值的43%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 721 (M+H)+.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d = 7.99 (t, 1H), 7.95 (t, 1H), 7.6-7.75 (m,4H), 7.5 (s, 1H) 7.2-7.4 (m, 6H), 6.8-7.0 (m, 4H), 5.63 (s, 1H), 4.9和5.2(2d, 2H), 4.26和4.0 (2d, 2H), 3.3-3.6 (m, 4H), 3.15-3.25 (m, 3H), 2.85-3.0(m, 2H), 2.2-2.3 (m, 4H), 0.64和1,49 (2m, 2H), 0.81 (s, 9H)。
中间体F196
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酯(1:1)
首先，将15毫克（0.023毫摩尔）中间体C58 置于4毫升DMF中并在13.0毫克（0.034毫摩尔）HATU和16微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与8.2毫克（0.025毫摩尔）中间体L67反应。在室温下搅拌30分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。在合并适当的馏分和溶剂蒸发后，残留物从乙腈/水1:1中冻干。这产生4.3毫克（理论值的20%）受保护的中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.35 min；MS (EIpos): m/z = 852 [M+H]+。
将4.3毫克（4.5微摩尔）该中间体溶解在1毫升三氟乙醇中并如对中间体F119所述用3.65毫克（27微摩尔）氯化锌脱保护。通过制备型HPLC提纯后产生1毫克（经2个步骤，理论值的25%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 708 (M+H)+。
中间体F204
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
首先使25毫克（0.038毫摩尔）中间体C58与16.5毫克（75%）（0.038毫摩尔）中间体L68在17毫克（0.046毫摩尔）HATU和20微升N,N-二异丙基乙基胺存在下反应。在室温下搅拌60分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生18.3毫克（理论值的56%）受保护的中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.32 min；MS (EIpos): m/z = 851 [M+H]+。
在第二步骤中，将这种中间体溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入12毫克（0.086毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌2小时。然后加入25毫克（0.086毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2毫升0.1%的三氟乙酸水溶液。该配制品通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生11毫克（理论值的62%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H)+。
中间体F205
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸1-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]哌啶-4-基酯(1:1)
通过25毫克（0.034毫摩尔）中间体C61和29毫克（0.041毫摩尔）中间体L69在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联，接着在标准压力下用钯-活性炭(10%)氢化、然后在HATU和N,N-二异丙基乙基胺存在下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸偶联和最后用氯化锌裂解2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基而进行该合成。HPLC提纯后产生11毫克（经4个步骤，理论值的26%）。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (ESIpos): m/z = 1061 (M+H)+。
中间体F206
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-L-丙氨酸1-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]哌啶-4-基酯(1:1)
类似于中间体F205进行该合成。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (ESIpos): m/z = 975 (M+H)+。
中间体F207
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F155制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 1020 (M+H)+。
中间体F209
R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将93.9毫克（0.78毫摩尔）L-半胱氨酸悬浮在93.0毫克（1.11毫摩尔）碳酸氢钠和0.9毫升水的溶液中。将70.0毫克（0.11毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C70）溶解在6.0毫升异丙醇中并加入202.3毫克（1.33毫摩尔）1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌90分钟。向该配制品加入水（0.1% TFA），通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水；0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生53.9毫克（理论值的59%）化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS (方法1): Rt = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 717 (M+H)+。
将86.0毫克（0.1毫摩尔）R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)和58.5毫克（0.11毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解在4.0毫升DMF中并加入20.9毫克（0.21毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入15.5毫克（0.26毫摩尔）HOAc且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水；0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生68.6毫克（理论值的59%）化合物R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS (方法6): Rt = 2.88 min；MS (ESIpos): m/z = 1115 (M+H)+。
将46.4毫克（0.04毫摩尔）R-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-半胱氨酸溶解在2.0毫升三氟乙醇中并加入17.0毫克（0.13毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。加入另外8.5毫克（0.07毫摩尔）二氯化锌并在50℃下搅拌整夜。向该反应混合物加入36.5毫克（0.13毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生19.4毫克（理论值的43%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 971 (M+H)+。
中间体F210
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-D-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
与中间体F209的合成类似地使用D-半胱氨酸制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 971 (M+H)+。
中间体F211
三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]丙酰胺(1:1)
将30.0毫克（0.05毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C70）最初与5.5毫克（0.05毫摩尔）3-硫烷基丙酸一起装载在含一滴水的0.5毫升甲醇中。然后加入23.0毫克（0.17毫摩尔）碳酸，并将反应混合物在50℃下搅拌4小时。加入乙酸乙酯，有机相用水洗涤一次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。该残留物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。这产生30.3毫克（理论值的86%）化合物11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.39 min；MS (ESIpos): m/z = 702 (M+H)+。
将30.0毫克（0.04摩尔）11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸和9.8毫克（0.06毫摩尔）1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)最初装载在2.0毫升乙腈中并加入44.2毫克（0.34毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。加入35.4毫克（0.06毫摩尔）T3P（50%在乙酸乙酯中）并将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入水并直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生22.0毫克（理论值的63%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.41 min；MS (ESIpos): m/z = 824 (M+H)+。
将22.0毫克（0.03摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在1.0毫升三氟乙醇中并加入9.1毫克（0.07毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌5小时。向反应混合物加入19.5毫克（0.07毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生15.0毫克（理论值的71%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 680 (M+H)+。
中间体F212
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10-氧代-3,6-二氧杂-13-硫杂-9-氮杂十五烷-15-酰胺(1:1)
将28.8毫克（0.04毫摩尔）11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸（中间体C69）最初与18.3毫克（0.05毫摩尔）三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)（中间体L59）一起装载在1.9毫升乙腈中。然后加入42.4毫克（0.33毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并逐滴加入33.9毫克（0.05毫摩尔）T3P（50%在乙酸乙酯中）。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生10.7毫克（理论值的26%）化合物[16-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10,15-二氧代-3,6-二氧杂-13-硫杂-9,16-二氮杂十九烷-19-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.44 min；MS (ESIpos): m/z = 812 (M+H)+。
将10.7毫克（0.01摩尔）[16-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-10,15-二氧代-3,6-二氧杂-13-硫杂-9,16-二氮杂十九烷-19-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在0.8毫升三氟乙醇中并加入8.0毫克（0.06毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌5小时。向反应混合物加入17.1毫克（0.06毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。
LC-MS (方法1): Rt = 1.03 min；MS (ESIpos): m/z = 768 (M+H)+。
中间体F213
三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1:1)
将27.5毫克（0.04毫摩尔）11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸（中间体C69）最初与15.9毫克（0.05毫摩尔）三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)（中间体L1）一起装载在1.8毫升乙腈中。然后加入32.4毫克（0.31毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并逐滴加入32.4毫克（0.05毫摩尔）T3P（50%在乙酸乙酯中）。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生11.9毫克（理论值的35%）化合物[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.39 min；MS (ESIpos): m/z = 881 (M+H)+。
将11.9毫克（0.01摩尔）[13-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在1.0毫升三氟乙醇中并加入5.5毫克（0.04毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。向反应混合物加入11.8毫克（0.04毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生7.4毫克（理论值的60%）标题化合物。
LC-MS (方法5): Rt = 2.75 min；MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+。
中间体F214
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将111.7毫克（0.30毫摩尔）(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸最初装载在3.0毫升DMF中并加入46.1（0.30毫摩尔）HOBt、96.6毫克（0.30毫摩尔）TBTU和38.9毫克（0.30毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。将250.0毫克（0.30毫摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（中间体C71）溶解在116.3毫克（0.9毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺中，然后加入3.0毫升DMF。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生257.0毫克（理论值的80%）化合物(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.55 min；MS (ESIpos): m/z = 1071 (M+H)+。
在氩气下，将24.6毫克（0.11毫摩尔）乙酸钯(II)最初装载在5.0毫升二氯甲烷中并加入33.2毫克（0.33毫摩尔）三乙胺和254.3毫克（2.19毫摩尔）三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入溶解在5.0毫升二氯甲烷中的234.1毫克（0.22毫摩尔）(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2S)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物经纸板过滤器过滤，滤饼用二氯甲烷后洗涤。在不加热的情况下在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生177.5毫克（理论值的85%）化合物L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS (方法1): Rt = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 846 (M+H)+。
将20.0毫克（20.83微摩尔） L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)最初与11.8毫克（22.91微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起装载在1.5毫升DMF中并加入6.3毫克（62.49微摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入4.4毫克（0.07毫摩尔）乙酸。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生19.1毫克（理论值的74%）化合物N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 1244 (M+H)+。
将17.5毫克（14.06微摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-α-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解在1.5毫升三氟乙醇中并加入11.5毫克（84.37微摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4小时。向反应混合物加入24.7毫克（0.08毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1%TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生10.8毫克（理论值的63%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 1100 (M+H)+。
中间体F215
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2-羧乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺
将14.9毫克（0.02毫摩尔）N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（实施例229）和7.1毫克（0.02毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯最初装载在1.0毫升DMF中并加入5.7毫克（0.06毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入4.5毫克（0.08毫摩尔）乙酸。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生13.3毫克（理论值的78%）化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2-羧乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 919 (M+H)+。
将11.1毫克（0.01毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2-羧乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺溶解在5.0毫升乙醇中，加入1.0毫克钯-活性炭(10%)并在室温和标准压力下氢化整夜。该反应混合物经C盐过滤，滤饼用乙醇/THF/水混合物后洗涤。在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂并将残留物冻干。这产生7.5毫克（理论值的69%）化合物L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2-羧乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (ESIpos): m/z = 785 (M+H)+。
将7.3毫克（8.12微摩尔）L-缬氨酰基-N-{3-[({[(2R)-2-乙酰氨基-2-羧乙基]硫烷基}乙酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-L-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)最初与4.6毫克（8.93微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起装载在0.5毫升DMF中并加入2.5毫克（24.36微摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入4.4毫克（0.03毫摩尔）乙酸。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水,0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生4.9毫克（理论值的50%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 1183 (M+H)+。
中间体F216
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，将30.2毫克（0.06毫摩尔）N,N'-双[(苄氧基)羰基]-L-胱氨酸最初装载在2.0毫升水和2.0毫升异丙醇中并加入56.7毫克（0.20毫摩尔）TCEP。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。然后加入溶解在2.0毫升异丙醇中的50.0毫克（0.08毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C70）和122.2毫克（0.48毫摩尔）1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌7小时。然后加入另外122.2毫克（0.48毫摩尔）1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯并将反应混合物在50℃下搅拌1小时。用乙酸乙酯稀释，有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取并用饱和NaCl溶液洗涤。有机相经硫酸镁干燥并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速:50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生43.1毫克（理论值的64%）化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.46 min；MS (ESIpos): m/z = 851 (M+H)+。
将16.5毫克（0.05毫摩尔）4-甲基苯磺酸/β-丙氨酸苄酯(1:1)最初与14.0毫克（0.11毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺一起装载在1.5毫升乙腈中。将反应混合物在室温下搅拌3分钟，然后加入溶解在1.5毫升乙腈中的30.8毫克（0.04毫摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酸、23.4毫克（0.18毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和29.9毫克（0.05毫摩尔）T3P（50%在乙酸乙酯中）。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入水且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。所得化合物是S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸苄酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.59 min；MS (ESIpos): m/z = 1012 (M+H)+。
将43.8毫克（43.3微摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(苄氧基)羰基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸苄酯溶解在8.0毫升乙醇中，加入4.4毫克钯-活性炭(10%)并在室温和标准压力下氢化整夜。该反应混合物经纸板过滤器过滤，滤饼用乙醇后洗涤。在真空下蒸发溶剂。该残留物如刚刚所述再处理两次。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生4.9毫克（理论值的50%）化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS (方法1): Rt = 1.08 min；MS (ESIpos): m/z = 788 (M+H)+。
将14.5毫克（16.1微摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)最初与9.1毫克（17.7微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起装载在1.0毫升DMF中并加入4.9毫克（48.2微摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入3.4毫克（0.06毫摩尔）乙酸。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min,MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生4.9毫克（理论值的50%）化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS (方法1): Rt = 1.28 min；MS (ESIpos): m/z = 1186 (M+H)+。
将14.1毫克（11.9微摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-半胱氨酰-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)溶解在1.5毫升三氟乙醇中并加入9.7毫克（71.3微摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3小时。加入另外9.7毫克（71.3微摩尔）二氯化锌并将反应混合物在50℃下搅拌3小时。加入另外9.7毫克（71.3微摩尔）二氯化锌并将反应混合物在70℃下搅拌4小时。向反应混合物加入20.8毫克（0.07毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂并将残留物冻干。这产生6.2毫克（理论值的44%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 1042 (M+H)+。
中间体F217
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，将7.5毫克（0.05毫摩尔）(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸最初装载在1.5毫升DMF中并加入7.5毫克（0.05毫摩尔）HOBt、15.5毫克（0.05毫摩尔）TBTU和6.2毫克（0.05毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。然后加入溶解在1.5毫升DMF中的40.0毫克（0.05毫摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（中间体C71）和18.7毫克（0.14毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺，并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生11.2毫克（理论值的25%）化合物S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.37 min；MS (ESIpos): m/z = 854 (M+H)+。
将10.9毫克（12.8微摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]-L-半胱氨酸溶解在2.0毫升三氟乙醇中并加入10.4毫克（76.6微摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4小时。向反应混合物加入22.4毫克（0.08毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂并将残留物冻干。这产生7.5毫克（理论值的65%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 710 (M+H)+。
中间体F218
N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-γ-谷氨酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
在氩气下，将22.9毫克（0.06毫摩尔）(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸最初装载在2.0毫升DMF中并加入9.4毫克（0.05毫摩尔）HOBt、19.8毫克（0.06毫摩尔）TBTU和8.0毫克（0.06毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。然后加入溶解在1.0毫升DMF中的51.2毫克（0.06毫摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸（中间体C71）和23.9毫克（0.19毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺，并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生11.2毫克（理论值的25%）化合物(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.52 min；MS (ESIpos): m/z = 1070 (M+H)+。
在氩气下，将3.9毫克（0.02毫摩尔）乙酸钯(II)最初装载在1.0毫升二氯甲烷中并加入5.3毫克（0.05毫摩尔）三乙胺和254.3毫克（2.19毫摩尔）三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并加入溶解在1.0毫升二氯甲烷中的 18.6毫克（0.02毫摩尔）(16R)-11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4S)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。在不加热的情况下在真空下蒸发溶剂。将残留物置于乙腈中，经注射器式过滤器过滤并通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生11.0毫克（理论值的66%）化合物L-γ-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。
LC-MS (方法1): Rt = 1.14 min；MS (ESIpos): m/z = 846 (M+H)+。
将15.0毫克（15.6微摩尔）L-γ-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)最初与8.8毫克（17.2微摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起装载在1.0毫升DMF中并加入4.7毫克（46.9微摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入3.3毫克（0.06毫摩尔）乙酸。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min,MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生14.2毫克（理论值的70%）化合物N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-γ-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS (方法4) Rt = 1.24 min；MS (ESIpos): m/z = 1244 (M+H)+。
将13.8毫克（11.1微摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-γ-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解在2.0毫升三氟乙醇中并加入9.1毫克（66.5微摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4小时。向反应混合物加入19.4毫克（0.07毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1%TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生6.9毫克（理论值的50%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 1100 (M+H)+。
中间体F235
三氟乙酸/N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基甲酰基]苯基}-L-丙氨酰胺(1:1)
将120.0毫克（0.22毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（参见中间体C11的合成）和52.1毫克（0.28毫摩尔）4-硝基苯甲酰氯溶解在8.0毫升二氯甲烷中并加入28.4毫克（0.28毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。这产生97.7毫克（理论值的64%）化合物{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.54 min；MS (ESIpos): m/z = 705 (M+H)+。
将97.0毫克（0.14毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在5.0毫升乙醇中，加入9.7毫克钯-活性炭(10%)并在标准压力下氢化5小时。该反应混合物经纸板过滤器过滤，滤饼用乙醇后洗涤。在真空下蒸发溶剂。残留物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。这产生87.4毫克（理论值的88%）化合物{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.47 min；MS (ESIpos): m/z = 675 (M+H)+。
将59.3毫克（0.09毫摩尔）{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯和25.5毫克（0.11毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酸最初与68.1毫克（0.53毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺一起装载在5.0毫升乙腈中。缓慢加入72.7毫克（0.11毫摩尔）T3P（50%在乙酸乙酯中）。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生52.2毫克（理论值的68%）化合物[(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]氨基}-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸苄酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.48 min；MS (ESIpos): m/z = 880 (M+H)+。
将23.9毫克（0.03毫摩尔）[(2S)-1-{[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基] 氨基}-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸苄酯溶解在3.0毫升乙酸乙酯中，加入2.4毫克钯-活性炭(10%)并在标准压力下氢化2小时。该反应混合物经纸过滤器过滤，滤饼用乙酸乙酯后洗涤。在真空下蒸发溶剂。残留物不经进一步提纯即用于该合成的下一步骤。这产生20.1毫克（理论值的90%）化合物[3-([4-(L-丙氨酰基氨基)苯甲酰基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.13 min；MS (ESIpos): m/z = 746 (M+H)+。
将20.0毫克（0.03毫摩尔）[3-([4-(L-丙氨酰基氨基)苯甲酰基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯最初与14.9毫克（0.04毫摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯一起装载在2.0毫升DMF中并加入5.4毫克（0.05毫摩尔）4-甲基吗啉。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生化合物N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 1.49 min；MS (ESIpos): m/z = 979 (M+H)+。
将17.0毫克（17.4微摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺溶解在2.5毫升乙酸乙酯中，加入1.7毫克钯-活性炭(10%)并在标准压力下氢化整夜。该反应混合物经纸过滤器过滤和，滤饼用乙酸乙酯后洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生15.3毫克（理论值的60%）化合物L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 1.15 min；MS (ESIpos): m/z = 845 (M+H)+。
将15.3毫克（0.01毫摩尔）L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺最初与7.9毫克（0.02毫摩尔）3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-N-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起装载在2.4毫升DMF中并加入1.9毫克（0.02毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入1.4毫克（0.02毫摩尔）乙酸。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生11.7毫克（理论值的70%）化合物N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺。
将11.7毫克（0.01毫摩尔）N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-γ-谷氨酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-L-丙氨酰胺溶解在2.0毫升三氟乙醇中并加入3.9毫克（0.03毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。向反应混合物加入8.3毫克（0.03毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生5.4毫克（理论值的47%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.94 min；MS (ESIpos): m/z = 1100 (M+H)+。
中间体F236
(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}丁酸/三氟乙酸(1:1)
类似于中间体F192由(2R)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸/N-环己基环己胺(1:1)进行标题化合物的合成。
LC-MS (方法4): Rt = 1.1 min；MS (ESIpos): m/z = 751 (M+H)+。
中间体F238
三氟乙酸/N-{(2S)-1-氨基-3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙-2-基}-N'-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]琥珀酰胺(1:1)
将18毫克（0.025毫摩尔）中间体C72 置于6毫升DMF中并在11.3毫克（0.03毫摩尔）HATU和22微升N,N-二异丙基乙基胺存在下与7.5毫克（0.03毫摩尔）三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。在室温下搅拌1小时后，浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分且残留物从乙腈/水1:1中冻干。这产生15毫克（理论值的67%）中间体。
LC-MS (方法4): Rt = 1.71 min；MS (EIpos): m/z = 873 [M+Na]+。
然后由这种中间体通过如对中间体F119所述在4毫升三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生8.5毫克（理论值的63%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (ESIpos): m/z = 707 (M+Na)+。
中间体F241
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(2-{[N-(溴乙酰基)甘氨酰]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)
类似地由中间体C66通过与市售1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联和随后用氯化锌解封而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (EIpos): m/z = 733和735 [M+H]+。
中间体F242
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-(3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1:1)
类似于中间体F104进行标题化合物的合成。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H)+。
中间体F243
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]丁酰胺(1:1)
类似于中间体F242进行标题化合物的合成。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H)+。
中间体F244
N-{2-[(S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酰)氨基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺
将100毫克（大约0.101毫摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-N-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-L-半胱氨酸（中间体C 73）最初装载在88毫升二甲基甲酰胺中，并加入107毫克（大约0.15毫摩尔）N-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺（中间体L73 ）、46毫克（0.12毫摩尔）HATU和88微升（0.50毫摩尔）。将反应混合物在室温下搅拌15分钟。将水/二氯甲烷添加到该混合物中，有机相然后用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残留物不经进一步提纯即进一步使用。这产生92毫克（59%，纯度 72%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.59 min；MS (ESIpos): m/z = 1096 (M+H)+。
在氩气下，将40毫克（0.30毫摩尔）氯化锌添加到91毫克（大约0.06毫摩尔）[(9R)-4-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,10,15-三氧代-9-{[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]氨基}-7-硫杂-4,11,14-三氮杂二十烷-1-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯在1.45毫升三氟乙醇中的溶液中。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。然后加入30毫克（0.22毫摩尔）氯化锌并将该混合物在室温下搅拌另外1小时。加入52毫克（0.18毫摩尔）EDTA并在室温下搅拌10分钟后，用水/乙腈轻微稀释并通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 +0.1%TFA, 梯度)。这产生17毫克（31%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.80 min；MS (ESIpos): m/z = 808 (M+H)+。
中间体F245
三氟乙酸/N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁基}-N'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)
通过10毫克（0.0135毫摩尔）中间体C65与8毫克（0.027毫摩尔）中间体L1在8毫升DMF中在15毫克（0.04毫摩尔）HATU和9微升N,N-二异丙基乙基胺存在下的偶联和随后如对中间体F119所述在三氟乙醇中用氯化锌脱保护而制备标题化合物。通过制备型HPLC提纯后产生8.8毫克（经2个步骤，理论值的58%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (ESIpos): m/z = 778 (M+H)+。
中间体F247
三氟乙酸/4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
将14毫克（0.018毫摩尔）中间体C66溶解在14毫升DCM中，并加入10.1毫克（0.037毫摩尔）2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐（BEP）和逐份的总共250微升吡啶，其中使pH保持在5和6之间。然后用乙酸将pH调节至4。浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的合并、冻干和干燥后产生4毫克（理论值的21%）受保护的中间体，其随后用氯化锌在氨基官能处脱保护。HPLC提纯和冻干后产生3毫克（理论值的72%）无色泡沫形式的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 805和807(M+H)+。
中间体F248
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1:1)
通过10毫克（0.015毫摩尔）中间体C58与5毫克（0.017毫摩尔）中间体L12在HATU存在下的偶联和随后用氯化锌脱保护而制备标题化合物。这产生6.5毫克（经2个步骤，理论值的52%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 680 (M+H)+。
中间体F254
三氟乙酸/(3S)-4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基] 氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
类似于中间体247通过15毫克（0.02毫摩尔）中间体C66与21毫克（0.099毫摩尔）如(J.Org.Chem. 200, 65, 517-522)中所述由(2S)-2-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸盐酸盐(1:1)合成的(2S)-2-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸的偶联制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 805和807 (M+H)+。
1661398说明书第二部分
B:抗体/活性物质偶联物(ADC)的制备
B-1. 生成抗-TWEAKR抗体的一般方法
例如通过重组人TWEAKR SEQ ID NO: 138和鼠TWEAKR SEQ ID NO: 137的噬菌体展示库的筛选生成抗-TWEAKR抗体。将由此获得的抗体重新格式化成为人IgG1格式并用于本文所述的实施例。此外，结合到TWEAKR上的抗体是本领域技术人员已知的，参见例如WO2009/020933(A2)或WO2009140177 (A2)。
SEQ ID NO:138 (多肽):
SEQ ID NO:137 (多肽):
B-2. 在哺乳动物细胞中表达抗-TWEAKR抗体的一般方法
如Tom等人，Methods Express: Expression Systems中的第12章， Micheal R. Dyson和Yves Durocher编辑, Scion Publishing Ltd, 2007（参见AK-实施例1）中所述在短期哺乳动物细胞培养物中制造抗体，例如TPP-2090。
B-3.从细胞上清液中提纯抗体的一般方法
抗体，例如TPP-2090获自细胞培养上清液。该细胞上清液通过细胞离心澄清化。该细胞上清液然后通过在MabSelect Sure (GE Healthcare)色谱柱上的亲和色谱法提纯。为此，该柱在DPBS pH 7.4（Sigma/Aldrich）中平衡，施加细胞上清液，该柱用大约10柱体积的DPBS pH 7.4 + 500 mM氯化钠洗涤。抗体在50 mM乙酸钠pH 3.5 + 500 mM氯化钠中洗脱，然后通过在Superdex 200柱（GE Healthcare）上在DPBS pH 7.4中的凝胶渗透色谱法进一步提纯。
市售抗体西妥昔单抗（商品名Erbitux）由商品通过标准色谱法（蛋白质A，制备型SEC）提纯。
市售抗体曲妥珠单抗（商品名Herceptin）由商品通过标准色谱法（蛋白质A，制备型SEC）提纯。
由商品（商品名CIMAher），通过标准色谱法（蛋白质A，制备型SEC）提纯抗体尼妥珠单抗。
由商品（商品名Vectibix），通过标准色谱法（蛋白质A，制备型SEC）提纯抗体帕尼单抗。
B-4.偶联到半胱氨酸侧链上的一般方法
下列抗体用于该偶联反应：
西妥昔单抗（抗EGFR AK）
抗-TWEAKR AK 1（TPP-2090）
曲妥珠单抗（抗-Her2 AK）
尼妥珠单抗（抗-EGFR AK）
帕尼单抗（抗-EGFR AK）。
将溶解在PBS缓冲液中的2至5当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）添加到在1mg/ml至20 mg/ml，优选大约10 mg/ml至15 mg/ml浓度范围内的相应抗体在PBS缓冲液中的溶液中，并在室温下搅拌1小时。为此，所用的各自抗体的溶液可以以实施例中所示的浓度使用，或其任选也可以用PBS缓冲液稀释至所示起始浓度的大约一半以达到优选浓度范围。随后，根据预期载量，作为在DMSO中的溶液加入2至12当量，优选大约5-10当量的待偶联的马来酰亚胺前体化合物或卤化物前体化合物。在此，DMSO的量不应超过总体积的10%。该配制品在马来酰亚胺前体的情况下在室温下搅拌60-240分钟，在卤化物前体的情况下在室温下搅拌8至24小时，然后施加到PBS平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液洗脱。通常，除非另行指明，在PBS缓冲液中的5毫克相应抗体用于还原和随后偶联。在PD10柱上的提纯后因此在每种情况下提供相应ADC在3.5毫升PBS缓冲液中的溶液。然后通过超离心浓缩并任选用PBS缓冲液再稀释该样品。如果需要，为了更好分离低分子量组分，在用PBS缓冲液再稀释后重复通过超滤浓缩。对于生物试验，如果需要，任选通过再稀释将最终ADC样品的浓度调节至0.5-15 mg/ml的范围。测定在实施例中所示的ADC溶液的各自蛋白质浓度。此外，使用B-7下描述的方法测定抗体载量（药物/mAb比）。
除非另行指明，通过这种方法制备实施例中所示的免疫偶联物。根据连接体，实施例中所示的ADC也可以任选在更低或更高的程度上以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
特别地，经连接体亚结构
连接到抗体的硫醇基团上的KSP-I-ADC也可任选经由经开链琥珀酰胺连接的ADC根据图式26通过在偶联后再缓冲和在pH 8下搅拌大约20小时而以定向方式制备，
#1代表与抗体的硫桥，#2是与改性KSP抑制剂的连接点
其中连接体经水解开链琥珀酰胺连接到抗体上的此类ADC也可任选通过如下的示例性程序以定向方式制备：
在氩气下，将0.344毫克TCEP在100微升PBS缓冲液中的溶液添加到在5毫升PBS缓冲液中的60毫克所涉抗体（c~12 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在600微升DMSO中的0.003毫摩尔马来酰亚胺前体化合物。在室温下搅拌另外1.5小时-2小时后，用已预先调节至pH 8的1075微升PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物用PBS缓冲液pH 8稀释至14毫升总体积。这种溶液在室温下在氩气下搅拌整夜。任选地，然后再缓冲至pH 7.2。该ADC溶液通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释，然后任选再浓缩至大约10 mg/ml的浓度。
在实施例中连向抗体的其它可能水解敏感的Thianyl琥珀酰亚胺桥含有下列连接体亚结构，其中#1代表与抗体的硫醚键且#2代表与改性KSP抑制剂的连接点：
这些连接体亚结构代表与抗体的连接单元并且（除连接体组成外）对在肿瘤细胞中形成的代谢物的结构和特性具有显著影响。
在所示结构式中，AK1A、AK1B、AK1E、AK1I、AK1H、AK1K具有下列含义：
AK1A = 西妥昔单抗（部分还原）- S§1
AK1B = 抗-TWEAKR AK-1（部分还原）- S§1
AK1E = 曲妥珠单抗（部分还原）-S§1
AK1I = 尼妥珠单抗（部分还原）- S§1
AK1H = 帕尼单抗（部分还原）- S§1
其中
§1代表与琥珀酰亚胺基团或与由其产生的异构水解开链琥珀酰胺或亚烷基的键，
且
S代表部分还原抗体的半胱氨酸残基的硫原子。
B-5.偶联到赖氨酸侧链上的一般方法
下列抗体用于该偶联反应：
西妥昔单抗（抗EGFR AK）
抗-TWEAKR AK 1（TPP-2090）
曲妥珠单抗（抗-Her2 AK）
尼妥珠单抗（抗-EGFR AK）
帕尼单抗（抗-EGFR AK）。
根据预期载量，将2至8当量的待偶联的前体化合物作为在DMSO中的溶液添加在1mg/ml至20 mg/ml，优选大约10 mg/ml浓度范围内的相应抗体在PBS缓冲液中的溶液中。在室温下搅拌30分钟至6小时后，再加入相同量的在DMSO中的前体化合物。在此，DMSO的量不应超过总体积的10%。在室温下搅拌另外30分钟至6小时后，将该配制品施加到用PBS平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液洗脱。通常，除非另行指明，在PBS缓冲液中的5毫克相应抗体用于还原和随后偶联。在PD10柱上的提纯因此在每种情况下提供相应ADC在3.5毫升PBS缓冲液中的溶液。然后通过超离心浓缩，该样品任选用PBS缓冲液再稀释。如果需要，为了更好分离低分子量组分，在用PBS缓冲液再稀释后重复通过超滤浓缩。对于生物试验，如果需要，任选通过再稀释将最终ADC样品的浓度调节至0.5-15mg/ml的范围。
测定在实施例中所示的ADC溶液的各自蛋白质浓度。此外，使用B-7下描述的方法测定抗体载量（药物/mAb比）。
在所示结构式中，AK2A、AK2B、AK2G、AK2E、AK2I、AK2H、AK2K具有下列含义：
AK2A = 西妥昔单抗（抗-EGFR AK）-NH§2
AK2B = 抗-TWEAKR AK-1- NH§2
AK2E = 曲妥珠单抗- NH§2
AK2I = 尼妥珠单抗-NH§2
AK2H = 帕尼单抗-NH§2
其中
§2代表与羰基的键
且
NH代表该抗体的赖氨酸残基的侧链氨基。
B-6a.制备封闭琥珀酰亚胺-半胱氨酸加合物的一般方法:
在一个示例性实施方案中，将10微摩尔上述马来酰亚胺前体化合物置于3-5毫升DMF中并加入2.1毫克（20微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌2小时至24小时，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
B-6aa.制备异构开放琥珀酰胺-半胱氨酸加合物的一般方法:
在一个示例性实施方案中，将68微摩尔上述马来酰亚胺前体化合物置于15毫升DMF中，并加入36毫克（136微摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌~20小时，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分和在真空下蒸发溶剂后，将残留物溶解在15毫升THF/水1:1中。加入131微升2M氢氧化锂水溶液，并将该配制品在室温下搅拌1小时。该配制品然后用1M盐酸中和，在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生理论值的~50%的无色泡沫形式的区域异构的受保护中间体。
在最后步骤中，将0.023毫摩尔这些区域异构的水解产物溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入12.5毫克（0.092毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌4小时。然后加入27毫克（0.092毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生作为区域异构体混合物的水解开放硫烷基琥珀酰胺。
B-6b.制备赖氨酸加合物的一般方法:
在一个示例性实施方案中，将10微摩尔上述活化酯前体化合物置于3-5毫升DMF中，并在30微摩尔N,N-二异丙基乙基胺存在下加入α-氨基保护的L-赖氨酸。将反应混合物在室温下搅拌2小时至24小时，然后在真空下干燥，然后通过制备型HPLC提纯。然后通过已知方法除去保护基。
本发明的偶联物的进一步提纯和表征
在反应后，在一些情况下，例如通过超滤浓缩反应混合物，然后通过色谱法，例如使用Sephadex® G-25柱脱盐和提纯。例如用磷酸盐缓冲的盐水（PBS）进行洗脱。然后将该溶液无菌过滤并冷冻。或者，可以将该偶联物冻干。
B-7.抗体、毒簇载量和开放半胱氨酸加合物含量的测定
在去糖基化和/或变性后，除分子量测定外，为了识别蛋白质，进行胰蛋白酶消化，其在变性、还原和衍生化后经由发现的胰蛋白酶肽证实蛋白质的身份。
实施例中描述的偶联物在PBS缓冲液中的所得溶液如下测定毒簇载量：
通过各偶联物类的分子量的质谱测定进行赖氨酸连接的ADC的毒簇载量的测定。在此，该抗体偶联物首先用PNGaseF去糖基化，将样品酸化并在HPLC分离/脱盐后，使用ESI-MicroTofQ (Bruker Daltonik)通过质谱法分析。将TIC（总离子色谱图）中的信号上的所有波谱相加并基于MaxEnt去卷积计算不同偶联物类的分子量。然后在不同物类的信号积分后计算DAR（= 药物/抗体比）。
通过还原和变性的ADC的反相色谱法测定半胱氨酸连接的偶联物的毒簇载量。将盐酸胍（GuHCl）（28.6毫克）和DL-二硫苏糖醇（DTT）溶液（500 mM, 3微升）添加到ADC溶液（1mg/ml, 50微升）中。将该混合物在55℃下培养1小时并通过HPLC分析。
在Agilent 1260 HPLC系统上用在220纳米的检测进行HPLC分析。在1 ml/min的流速下以下列梯度使用Polymer Laboratories PLRP-S聚合反相柱（目录号PL1912-3802）（2.1 x150 mm, 8微米粒度, 1000 Å）：0 min, 25%B；3 min, 25%B；28 min, 50%B。洗脱剂A由在水中的0.05%三氟乙酸（TFA）构成，洗脱剂B由在乙腈中的0.05%三氟乙酸构成。
通过与非偶联抗体的轻链(L0)和重链(H0)的保留时间比较，对检测出的峰赋值。将仅在偶联样品中检出的峰指定为具有一个毒簇的轻链(L1)和具有一个、两个和三个毒簇的重链(H1、H2、H3)。
作为所有峰的毒簇数加权积分结果的总和的两倍除以所有峰的单加权积分结果的总和由通过积分测定的峰面积计算含毒簇的抗体的平均载量。在个例中，由于一些峰的共洗脱，可能无法精确测定毒簇载量。
在通过HPLC无法充分分离轻链和重链的情况下，通过轻链和重链处的各偶联物类的分子量的质谱测定进行半胱氨酸连接的偶联物的毒簇载量的测定。
将盐酸胍（GuHCl）（28.6毫克）和DL-二硫苏糖醇（DTT）溶液（500 mM, 3微升）添加到ADC溶液（1 mg/ml, 50微升）中。将该混合物在55℃下培养1小时并在使用ESI-MicroTofQ(Bruker Daltonik)在线脱盐后通过质谱法分析。
对于DAR测定，将TIC（总离子色谱图）中的信号上的所有波谱相加并基于MaxEnt去卷积计算轻链和重链处的不同偶联物类的分子量。作为所有峰的毒簇数加权积分结果的总和的两倍除以所有峰的单加权积分结果的总和由通过某些分子量面积的积分计算含毒簇的抗体的平均载量。
为了测定开放半胱氨酸加合物的含量，测定所有单偶联的轻链和重链变体的封闭和开放半胱氨酸加合物（分子量Δ18道尔顿）的分子量面积比。所有变体的平均值得出开放半胱氨酸加合物的含量。
B-8.检查ADC的抗原结合
在已偶联后检查结合体结合到靶分子上的能力。本领域技术人员熟悉可用于此用途的各种方法；例如，可以使用ELISA技术或表面等离子体共振分析（BIAcore™测量）检查偶联物的亲和力。本领域技术人员可以使用常规方法测量偶联物浓度，例如对抗体偶联物而言通过蛋白质测定法（也参见Doronina等人；Nature Biotechnol. 2003；21:778-784和Polson等人, Blood 2007；1102:616-623）。
实施例ADC
实施例1A
在此，在PBS中的70毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体F1偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶（Sephadex）提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 10.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
插入语
在实施例1A中，获得其中n=2.6的下式的化合物
和某一抗体（西妥昔单抗）。但是本发明不仅提供刚好具有在这一活性物质/抗体比下的这一抗体的这种特定偶联物，还提供具有这一式的其它结合体偶联物，即其中西妥昔单抗被不同的抗体或其衍生物（如半胱氨酸）替代且n=2.6被在n=1至20，优选n=1-10范围内的任何值替代的偶联物。
这相应地适用于下列实施例。
实施例2A
在此，在PBS中的80毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体F2偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 11.0 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例2B
在此，在PBS中的50毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F2偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 11.7 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例2E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.4 mg/ml）用于与中间体F2偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.77 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例3A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体F3偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.87 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例3B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.5 mg/ml）用于与中间体F3偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.13 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例4A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体F4偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.11 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例4B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.5 mg/ml）用于与中间体F4偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.69 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例5A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体F5偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.16 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例5B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.5 mg/ml）用于与中间体F5偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.5 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例6A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体F6偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.24 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例6B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.5 mg/ml）用于与中间体F6偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.88 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例7A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F7偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.46 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例7B
在此，在PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F7偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 11.27 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例8A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.7 mg/ml）用于与中间体F8偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例8B
在此，在PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F8偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 11.54 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例8E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.4 mg/ml）用于与中间体F8偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.97 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例8H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗（c = 10 mg/ml）用于与中间体F8偶联。将用TCEP还原的时间增加至4小时并将用于ADC偶联的搅拌时间增加至20小时。该反应然后在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 1.79 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例9A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.6 mg/ml）用于与中间体F9偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.05 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例9B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体F9偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例10A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F10偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.04 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
实施例10B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体F10偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例11A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F11偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.97 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例11B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体F11偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例12A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F12偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例12B
在此，在PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F12偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 9.9 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例13A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F13偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.87 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例13B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体F13偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例14A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.2 mg/ml）用于与中间体F14偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.32 mg/ml
药物/mAb比: 3.8。
实施例14B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体F14偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.23 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例14E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.4 mg/ml）用于与中间体F14偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.21 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例15A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.2 mg/ml）用于与中间体F15偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.39 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例15B
在此，在PBS中的32毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F15偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 11.82 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例15E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.4 mg/ml）用于与中间体F15偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.57 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例16A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.2 mg/ml）用于与中间体F16偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.15 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例16B
在此，在PBS中的30毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F16偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 9.54 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例16E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.4 mg/ml）用于与中间体F16偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.26 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例17A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.6 mg/ml）用于与中间体F17偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.02 mg/ml
药物/mAb比:无数据（nd）。
实施例17B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体F17偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.64 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例18A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.6 mg/ml）用于与中间体F18偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例18B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体F18偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.74 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例19A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F19偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例19B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体F19偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.9 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例20A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F20偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.99 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例20B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F20偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.03 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例21A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F21偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.76 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例21B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F21偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例22A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.56 mg/ml）用于与中间体F22偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.99 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例22B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F22偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.77 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例22E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.4 mg/ml）用于与中间体F22偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.89 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例23A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.56 mg/ml）用于与中间体F23偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 1.32 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例23B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F23偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例24A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.56 mg/ml）用于与中间体F24偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例24B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F24偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例25A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.56 mg/ml）用于与中间体F25偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.17 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例25B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F25偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.78 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例26A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.56 mg/ml）用于与中间体F26偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 无数据。
实施例26B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F26偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.02 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例27A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F27偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例27B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F27偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例28A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.59 mg/ml）用于与中间体F28偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.13 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例28B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F28偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例29A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.59 mg/ml）用于与中间体F29偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.49 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例29B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F29偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.82 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例30A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.59 mg/ml）用于与中间体F30偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.04 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例30B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F30偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.85 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例31A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体F31偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.21 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例31B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.54 mg/ml）用于与中间体F31偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.59 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例32A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.59 mg/ml）用于与中间体F32偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例32B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10.1 mg/ml）用于与中间体F32偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.78 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例33A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=8.95 mg/ml）用于与中间体F33偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.78 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例33B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F33偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.46 mg/ml
药物/mAb比: 3.9。
实施例34A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=8.95 mg/ml）用于与中间体F34偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.21 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例34B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F34偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.4 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例35A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F35偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 14.30 mg/ml
药物/mAb比: 1.4。
实施例35B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=16.54 mg/ml）用于与中间体F35偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 0.93 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例35E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F35偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.61 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例36A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F36偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 13.86 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例36B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=16.54 mg/ml）用于与中间体F36偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.08 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例36E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F36偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例37A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.08 mg/ml）用于与中间体F37偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.52 mg/ml
药物/mAb比: 1.5。
实施例37B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=16.54 mg/ml）用于与中间体F37偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例37E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F37偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.23 mg/ml
药物/mAb比: 1.5。
实施例38A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.08 mg/ml）用于与中间体F38偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.45 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例38B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F38偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.54 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例38E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F38偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.90 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例39A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F39偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例39B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F39偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.40 mg/ml
药物/mAb比: 1.4。
实施例39E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F39偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.04 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例40A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F40偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.0 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例40B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F40偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.81 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例40E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F40偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例41A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.08 mg/ml）用于与中间体F41偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.53 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例41B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F41偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.73 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例41E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F39偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.09 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例42A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F42偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.05 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例42B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F42偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.64 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例42E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F42偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.80 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例43A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F43偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.90 mg/ml
药物/mAb比: 1.3。
实施例43B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F43偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 0.85 mg/ml
药物/mAb比: 1.3。
实施例43E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F43偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.97 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例44A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F44偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.99 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例44B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F44偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.65 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例44E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F44偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例45A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F45偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例45B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F45偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.27 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
实施例45E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F45偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例46A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F46偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.0 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例46B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F46偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 11.21 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例46E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F46偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例47A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F47偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.51 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例47B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F47偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 0.89 mg/ml
药物/mAb比: 1.7。
实施例47E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F47偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.97 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例48A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F48偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.10 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例48B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=10.10 mg/ml）用于与中间体F48偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.73 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
实施例48E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.39 mg/ml）用于与中间体F48偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例49A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F49偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.09 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例49B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F49偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例49E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F49偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.96 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例50A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.02 mg/ml）用于与中间体F50偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.89 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例50B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F50偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.82 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例51A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺（异构体1）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.16 mg/ml。
实施例51B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.5 mg/ml）用于与中间体3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺（异构体1）偶联 ，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.74 mg/ml
药物/mAb比: 1.7。
实施例51E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.2 mg/ml）用于与中间体3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺（异构体1）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.67 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例52A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺（异构体2）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.41 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例52B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.5 mg/ml）用于与中间体3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺（异构体2）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.34 mg/ml
药物/mAb比: 1.6。
实施例52E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.2 mg/ml）用于与中间体3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-N-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺（异构体2）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.16 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例53A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（异构体1）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.09 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例53B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.5 mg/ml）用于与中间体N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（异构体1）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
实施例53E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.2 mg/ml）用于与中间体N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（异构体1）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.15 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例54A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（异构体2）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.17 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例54B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=16.5 mg/ml）用于与中间体N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（异构体2）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例54E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.2 mg/ml）用于与中间体N-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（异构体2）偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.90 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
实施例55A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.1 mg/ml）用于与中间体N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基甲酰基]苯基}-L-丙氨酰胺偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 0.47 mg/ml
药物/mAb比: 无数据。
实施例55B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.2 mg/ml）用于与中间体N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基甲酰基]苯基}-L-丙氨酰胺偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.26 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
实施例56A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=15.33 mg/ml）用于与中间体F56偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.74 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例56B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F56偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例57A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=15.33 mg/ml）用于与中间体F57偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.04 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例57B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F57偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例58A
在此，在PBS中的20毫克西妥昔单抗（c=21.32 mg/ml）用于与中间体F58偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.33 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例58B
在此，在PBS中的20.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F58偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.54 mg/ml
药物/mAb比: 4.6。
实施例58E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F58偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.15 mg/ml。
实施例59
N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸三氟乙酸(1:1)
将8毫克（15微摩尔）中间体F1置于1.7毫升DCM中并加入7.3毫克（30微摩尔）N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和13微升N,N-二异丙基乙基胺。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。然后将该中间产物置于1毫升DCM中并使用1毫升TFA脱保护。浓缩该配制品，残留物从乙腈/水1:1中冻干。
LC-MS (方法1): Rt = 0.8 min；MS (ESIpos): m/z = 643 (M+H)+。
实施例60
S-{1-[6-(2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)-6-氧代己基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸
将4毫克（5微摩尔）中间体F3置于1毫升DCM中并加入1.2毫克（10微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌20小时，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 843 (M+H)+。
实施例61
S-{1-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸
将7毫克（9微摩尔）中间体F2置于1.75毫升DMF中，并加入2.3毫克（19微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌20小时，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (ESIpos): m/z = 758 (M+H)+。
实施例62
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(丙酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙氧基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸
将2.9毫克（3.6微摩尔）中间体F5置于1毫升DMF中并加入0.9毫克（7.3微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌3天，然后再加入相同量的半胱氨酸。在室温下搅拌另外24小时后，在真空下浓缩，产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (ESIpos): m/z = 802 (M+H)+。
实施例63
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸三氟乙酸(1:1)
将3毫克（3微摩尔）中间体F8置于2毫升DMF中并加入1毫克（8微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，加入500微升水并使用TFA将该混合物调节至pH 2，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 1127 (M+H)+。
实施例64
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)
将5.6毫克（7微摩尔）中间体F7置于1毫升DMF中并加入1.7毫克（14微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌20小时，然后在真空下浓缩，该产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 815 (M+H)+。
实施例65
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-(4-{[(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
将3毫克（3微摩尔）中间体F25置于2毫升DMF和200微升水中并加入1毫克（8微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌4小时，然后加入500微升水并使用TFA调节至pH 2，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.76 min；MS (ESIpos): m/z = 1162 (M+H)+。
实施例66
S-(1-{4-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]苯基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸
将3.5毫克（3.8微摩尔）中间体F10置于1毫升DMF中并加入1.4毫克（11微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌23小时，然后再加入相同量的半胱氨酸。在室温下搅拌另外24小时后，在真空下浓缩，产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 877 (M+H)+。
实施例67
S-{1-[2-({[(1R,2S)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸
将3.3毫克（4微摩尔）中间体F12置于1毫升DMF中并加入1.4毫克（11微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后加入500微升水，然后在真空下浓缩，产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 869 (M+H)+。
实施例68
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基]-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
将3毫克（3微摩尔）中间体F15置于2毫升DMF中并加入1毫克（8微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后将500微升水添加到该配制品中，并使用TFA调节至pH2。然后在真空下浓缩，产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.76 min；MS (ESIpos): m/z = 1105 (M+H)+。
实施例69
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-(2-{[2-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
将3毫克（2微摩尔）中间体F16置于2毫升DMF中并加入0.8毫克（7微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后将500微升水添加到该配制品中，并使用TFA调节至pH 2。然后在真空下浓缩，产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 1218 (M+H)+。
实施例70
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(2-{[2-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺
将3毫克（3微摩尔）中间体F24置于2毫升DMF和200微升水中并加入0.9毫克（8微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后将500微升水添加到该配制品中，并使用TFA调节至pH 2。然后在真空下浓缩，产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.77 min；MS (ESIpos): m/z = 1190 (M+H)+。
实施例71
(15S,19R)-15-氨基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-乙醇酰-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧杂-13,18-二氮杂二十一烷-1-酸/三氟乙酸(1:1)
在第一步骤中，70毫克（0.114毫摩尔）中间体C5与32毫克（0.114毫摩尔）3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯在15毫升DMF中在44毫克（0.228毫摩尔）1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、35毫克（0.228毫摩尔）水合1-羟基-1H-苯并三唑和60微升N,N-二异丙基乙基胺存在下偶联。
将该配制品在室温下搅拌整夜，该产物通过制备型HPLC提纯。这产生33毫克（理论值的33%）受保护的中间体。这与1.1毫升三氟乙酸一起在11毫升二氯甲烷中搅拌1小时，在后处理后产生26毫克（98%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 718 (M+H)+。
实施例72
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸/三氟乙酸(1:1)
由中间体C3使用肽化学的经典方法制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 842 (M+H)+。
实施例73
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于实施例72由中间体C3使用肽化学的经典方法制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 814 (M+H)+。
实施例74
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-氨基-L-苯基丙氨酸/三氟乙酸(1:2)
由中间体C8和由市售N-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-L-苯基丙氨酸使用肽化学的经典方法制备的三氟乙酸/4-氨基-L-苯基丙氨酸甲酯(1:1)合成标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 748 (M+H)+。
实施例75
三氟乙酸/N-{(1R)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-氨基丙基)-2-羟基乙酰胺(1:1)
由中间体C10通过用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 486 (M+H)+。
实施例76
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸/三氟乙酸(1:1)
由中间体C5通过用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 515 (M+H)+。
实施例77
三氟乙酸/N-[(3S)-3-氨基-4-肼基-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)
由中间体C6通过用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 529 (M+H)+。
实施例78
三氟乙酸/N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二氨基丁基]-2-羟基乙酰胺(1:1)
在第一步骤中，类似于中间体C2使中间体C1与[(2S)-4-氧代丁-1,2-二基]双氨基甲酸苄基叔丁酯反应。类似于中间体C2由市售(3S)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-[(叔丁氧基羰基) 氨基]丁酸通过还原和随后氧化制备所用的醛。
在第二步骤中，类似于中间体C3进行N-酰化，最后首先用冰醋酸中的33%氢溴酸溶液，然后用氢氧化锂完全脱保护。
LC-MS (方法1): Rt = 0.78 min；MS (ESIpos): m/z = 500 (M+H)+。
实施例79
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸
由中间体C8通过用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (ESIpos): m/z = 586 (M+H)+。
实施例80
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺(2:1)
由中间体C5使用肽化学的经典方法制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.72 min；MS (ESIpos): m/z = 557 (M+H)+。
实施例81
(1-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)乙酸/三氟乙酸(1:2)
由中间体C7通过用三氟乙酸脱保护而制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 587 (M+H)+。
实施例82A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F82偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.59 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例82B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=10.10 mg/ml）用于与中间体F82偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.59 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
实施例82E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=11.50 mg/ml）用于与中间体F82偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.15 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例83A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F83偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.77 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例83B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F83偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.29 mg/ml
药物/mAb比: 1.3。
实施例83E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F83偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例83H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗（c = 10 mg/ml）用于与中间体F83偶联。将用TCEP还原的时间增加至4小时并将用于ADC偶联的搅拌时间增加至20小时。该配制品然后在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.57 mg/ml
药物/mAb比: 0.9。
实施例84A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.02 mg/ml）用于与中间体F84偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例84B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F84偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.77 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例85A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.02 mg/ml）用于与中间体F85偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.13 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例85B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F85偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.63 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例86A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.59 mg/ml）用于与中间体F86偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.96 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例86B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F86偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.55 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例87A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=8.95 mg/ml）用于与中间体F87偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.08 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例87B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F87偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例88A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.02 mg/ml）用于与中间体F88偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.03 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例88B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F88偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.9 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例89A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.02 mg/ml）用于与中间体F89偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.2 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例89B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F89偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.03 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例90A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=13.33 mg/ml）用于与中间体F90偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 2.19 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例90B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F90偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.97 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例91A
在此，在PBS中的80毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F91偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 12.75 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例91B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F91偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 5.71 mg/ml
药物/mAb比: 4.0。
实施例92
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)
将3毫克（4微摩尔）中间体F86置于3毫升DCM/水10:1中并加入1.3毫克（11微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.77 min；MS (EIpos): m/z = 829 [M+H]+。
实施例93
N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)（异构体1）
根据中间体C32（异构体1）获得该化合物。
实施例94
中间体C33（异构体2） N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)（异构体2）
根据中间体C33（异构体2）获得该化合物。
实施例95
三氟乙酸/4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺（2:1）
由{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯通过用三氟乙酸脱保护而获得标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (EIpos): m/z = 532 [M+H]+。
实施例96
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
将101毫克（0.16毫摩尔）乙酸2-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯最初装载在2毫升纯乙醇中并加入244毫克（3.14毫摩尔，225微升）40%的甲胺水溶液。在50℃下搅拌1小时，然后加入另外244毫克（3.14毫摩尔，225微升）40%的甲胺水溶液并在总共3.5小时后直接通过制备型HPLC提纯（洗脱剂: ACN/水 + 1.0% NEt3, 梯度）。这产生52毫克（理论值的70%）目标化合物。
LC-MS (方法3): Rt = 2.56 min；MS (EIpos): m/z = 471 [M+H]+。
实施例97
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将3毫克（4微摩尔）中间体F33置于2毫升DMF和200微升水中并加入1.4毫克（12微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌1小时。该配制品然后在真空下浓缩，产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 718 (M+H)+。
实施例98
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
将150.0毫克（0.42毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺（中间体C52）最初装载在2.0毫升二氯甲烷中，加入29.2毫克（0.49毫摩尔）HOAc和125.6毫克（0.59毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠，并在室温下搅拌5分钟。加入98.9毫克（0.49毫摩尔）3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物然后用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物使用硅胶提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇100:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生188.6毫克（74%）化合物2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮。
LC-MS (方法1): Rt = 1.00 min；MS (ESIpos): m/z = 541 [M+H]+。
将171.2毫克（0.32毫摩尔）2-[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮最初装载在5.0毫升二氯甲烷中并加入73.6毫克（0.73毫摩尔）三乙胺。在0℃下，加入94.9毫克（0.70毫摩尔）乙酰氧基乙酰氯并将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂，残留物使用Biotage Isolera提纯（硅胶，柱10 g SNAP, 流速12 ml/min, 乙酸乙酯/环己烷1:3）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生159.0毫克（77%）化合物乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.35 min；MS (ESIpos): m/z = 642 [M+H]+。
将147.2毫克（0.23毫摩尔）乙酸2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯最初装载在4.0毫升乙醇中并加入356.2毫克（4.59毫摩尔）甲胺（40%在水中）。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物与甲苯共蒸馏三次。残留物使用硅胶提纯（洗脱剂: 二氯甲烷/甲醇10:1）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生67.4毫克（63%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 470 [M+H]+。
实施例99
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)
首先，中间体C52类似于C2用(2S)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄酯还原性烷基化。然后如对中间体C27中所述用乙酸2-氯-2-氧代乙酯将仲氨基酰化。
将190毫克（0.244毫摩尔）这种中间体置于7.5毫升乙醇中并加入0.35毫升40%的甲胺水溶液。将该配制品在50℃下搅拌3小时，然后再加入相同量的甲胺。在50℃下进一步搅拌5小时后，浓缩该配制品，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生78毫克（理论值的48%）这种标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.32 min；MS (EIpos): m/z = 661 [M+H]+。
将78毫克（0.118毫摩尔）这种中间体溶解在8毫升乙醇中，并在加入15毫克10%钯-活性炭后，在标准氢气压下在室温下氢化3分钟。然后滤出催化剂，在真空下除去溶剂，该产物通过制备型HPLC提纯。在从乙腈/水中冻干后，获得33毫克（理论值的44%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.88 min；MS (ESIpos): m/z = 527 (M+H)+.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): d = 8.1 (m, 1H), 8.0 (m, 3H), 7.9 (m, 1H),7.65 (m, 1H), 7.5 (s, 1H), 7.15-7.35 (m, 5H) 7.0 (m, 1H), 6.85 (m, 1H), 5.6(s, 1H), 4.9和5.2 (2d, 2H), 4.02和4.22 (2d, 2H), 3.2-3.5 (m, 6H), 0.7和1.46(2m, 2H), 0.8 (s, 9H)。
实施例100
三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)
将100.0毫克（0.21摩尔）N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺（中间体C40）和109.8毫克（0.28毫摩尔）N5-氨基甲酰基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酸最初装载在5.0毫升乙腈中并加入137.3毫克（1.06毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺和175.8毫克（0.28毫摩尔）T3P。将反应混合物在室温下搅拌整夜。使反应混合物在饱和氯化铵溶液和乙酸乙酯之间分相。有机相用水洗涤两次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。在经硫酸镁干燥后，在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生118.9毫克（66%）化合物N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 1.31 min；MS (ESIpos): m/z = 850 [M+H]+。
将97.3毫克（0.11毫摩尔）N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-N2-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-鸟氨酰胺最初装载在4.0毫升DMF中并加入194.9毫克（2.29毫摩尔）哌啶。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后用HOAc中和。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生101.4毫克标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.87 min；MS (ESIpos): m/z = 628 [M+H]+。
实施例101
三氟乙酸/L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)
将96.2毫克（0.13毫摩尔）三氟乙酸/N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)（实施例100）和40.8毫克（0.13毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯最初装载在2.0毫升DMF中并加入39.4毫克（0.39毫摩尔）4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入另外59.1毫克（0.59毫摩尔）4-甲基吗啉并在室温下搅拌整夜。使反应混合物在乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液之间分相。有机相用饱和NaCl溶液洗涤一次并经硫酸镁干燥。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ,流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生74.1毫克（69%）化合物N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺。
LC-MS (方法1): Rt = 1.27 min；MS (ESIpos): m/z = 827 [M+H]+。
将68.1毫克（0.08毫摩尔）N-(叔丁氧基羰基)-L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺溶解在4.0毫升二氯甲烷中并加入187.8毫克（1.65毫摩尔）TFA。将反应混合物在室温下搅拌整夜，加入另外187.8毫克（1.65毫摩尔）TFA，再次在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生67.2毫克（97%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.97 min；MS (ESIpos): m/z = 727 [M+H]+。
实施例102
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺
与化合物实施例98的合成类似地使用相应的S-异构体中间体进行合成。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 470 [M+H]+。
实施例103A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=15.33 mg/ml）用于与中间体F103偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 0.9 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例103B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F103偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 0.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例103E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F103偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.05 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例104A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=15.33 mg/ml）用于与中间体F104偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例104B
在此，在PBS中的35毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F104偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 10.93 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例104E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F104偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.11 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例104I
在此，在PBS中的5.0毫克尼妥珠单抗（c=13.1 mg/ml）用于与中间体F104偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.89 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例104H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗（c = 12 mg/ml）用于与中间体F104偶联。将用TCEP还原的时间增加至4小时并将用于ADC偶联的搅拌时间增加至20小时。该反应然后在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.79 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例105A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=5.9 mg/ml）用于与中间体F105偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例105B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.23 mg/ml）用于与中间体F105偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.01 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例106A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=15.33 mg/ml）用于与中间体F106偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例106B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F106偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.76 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例106E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F106偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.5 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例107A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.3 mg/ml）用于与中间体F107偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.16 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例107B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F107偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.9 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例107E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F107偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.48 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例108A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=15.3 mg/ml）用于与中间体F108偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例108B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F108偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.22 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例109A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F109偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.1 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例109B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.4 mg/ml）用于与中间体F109偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.63 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例110A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=15.33 mg/ml）用于与中间体F110偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 3.8。
实施例110B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F110偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.64 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例110E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F110偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.23 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例111A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F111偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.4 mg/ml
药物/mAb比: 3。
实施例111B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.4 mg/ml）用于与中间体F111偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.71 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例112A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F122偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.2 mg/ml
药物/mAb比: 3。
实施例112B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.4 mg/ml）用于与中间体F112偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.39 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例113A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F113偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例113B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.4 mg/ml）用于与中间体F113偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例114A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F114偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.07 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例114B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.4 mg/ml）用于与中间体F114偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.9 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例115A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F115偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.18 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例115B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.4 mg/ml）用于与中间体F115偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.0 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例116A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F116偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.03 mg/ml
药物/mAb比: 4.4。
实施例116B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.4 mg/ml）用于与中间体F116偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.96 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例117A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F117偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.02 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例117B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.4 mg/ml）用于与中间体F117偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.77 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例118A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F118偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.38 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例118B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F118偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.14 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例118E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F118偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.27 mg/ml
药物/mAb比: 3。
实施例119A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.8 mg/ml）用于与中间体F119偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.14 mg/ml
药物/mAb比: 3.9。
实施例119B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F119偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 0.91 mg/ml
药物/mAb比: 4.1。
实施例119E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F119偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.69 mg/ml
药物/mAb比: 4.4。
实施例120A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F120偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例120B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F120偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.71 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例121A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F121偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.1 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例121B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F121偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.88 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例122A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F122偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.78 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例122B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F122偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.64 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例123A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F123偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例123B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F123偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例124A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F124偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例124B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F124偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例125A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F125偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.14 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例125B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F125偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例126A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F126偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.89 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例126B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F126偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.62 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例126E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=8.23 mg/ml）用于与中间体F126偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例127A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F127偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.54 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例127B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F127偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.62 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例127E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F127偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.07 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例128A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F128偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.99 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例128B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F128偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.99 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例129A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.84 mg/ml）用于与中间体F129偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.28 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例129B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F129偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.06 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例129E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F129偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.0 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例130
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将4.2毫克（5微摩尔）中间体F32置于2毫升DCM/水10:1中并加入1.8毫克（15微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.8 min；MS (EIpos): m/z = 829 [M+H]+。
实施例131
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将5毫克（6微摩尔）中间体F87置于1毫升DMF中并加入7.5毫克（62微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌20小时，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (EIpos): m/z = 815 [M+H]+。
实施例132
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基]-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
将5毫克（5微摩尔）中间体F89置于2毫升DMF/水10:1中并加入1.7毫克（14微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙腈/水1:1中并使用TFA调节至pH 2，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分并在残留物从乙腈/水中冻干后产生3毫克白色泡沫形式的标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 0.93 min；MS (EIpos): m/z = 1105 [M+H]+。
实施例133
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将1.6毫克（2微摩尔）中间体F84置于1.5毫升DMF/水10:1中并加入0.74毫克（6微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙腈/水1:1中并使用TFA调节至pH 2，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分并在残留物从乙腈/水中冻干后产生1.9毫克（理论值的89%）白色泡沫形式的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.8 min；MS (EIpos): m/z = 828 [M+H]+。
实施例134
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
将3.8毫克（3微摩尔）中间体F90置于1.5毫升DMF/水10:1中并加入1.2毫克（9微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌15分钟，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙腈/水1:1中，再浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分并在残留物从乙腈/水中冻干后产生2.3毫克（理论值的56%）白色泡沫形式的标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.0 min；MS (EIpos): m/z = 1213 [M+H]+。
实施例135
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将1.8毫克（2微摩尔）中间体F104置于1毫升DMF中并加入2.7毫克（22微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌20小时，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。留下0.6毫克（理论值的26%）无色泡沫形式的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.80 min；MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+。
实施例136
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将3.3毫克（4微摩尔）中间体F109置于2毫升DMF/水10:1中并加入1.5毫克（13微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙腈/水1:1中，再浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分并在残留物从乙腈/水中冻干后产生1.9毫克（理论值的55%）白色泡沫形式的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.75 min；MS (EIpos): m/z = 718 [M+H]+。
实施例137
S-{1-[6-(2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)-6-氧代己基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将3.2毫克（4微摩尔）中间体F117置于2毫升DMF/水10:1中并加入1.6毫克（13微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后在真空下浓缩。将残留物置于乙腈/水1:1中，再浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。浓缩适当馏分并在残留物从乙腈/水中冻干后产生2毫克（理论值的47%）白色泡沫形式的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.76 min；MS (EIpos): m/z = 843 [M+H]+。
实施例138
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将6.0毫克（0.01毫摩尔）R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（中间体F146）最初装载在2.2毫升DMF/水（10:1）中，加入2.0毫克（0.02毫摩尔）L-半胱氨酸并在室温下搅拌10分钟。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱:Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生5.5毫克（理论值的76%）标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.07 min；MS (ESIpos): m/z = 1106 (M+H)+。
实施例139
S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:2)
与化合物实施例138的合成类似地进行该合成。
6.0毫克（0.01毫摩尔）三氟乙酸/(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]丁酰胺(1:1)。
2.6毫克（0.02毫摩尔）L-半胱氨酸。
这产生3.4毫克（理论值的43%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 757 (M+H)+。
实施例140
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸/三氟乙酸(1:2)
与化合物实施例138的合成类似地进行该合成。
6.0毫克（0.01毫摩尔）三氟乙酸/R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]高半胱氨酸(1:1)（中间体F149）。
2.0毫克（0.02毫摩尔）L-半胱氨酸。
这产生6.1毫克（理论值的84%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 1107 (M+H)+。
实施例141
S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)己酰基]氨基}乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:2)
与化合物实施例138的合成类似地进行该合成。
10.07毫克（0.01毫摩尔）三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-N-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基]己酰胺(1:1)（中间体F143）。
9.3毫克（0.08毫摩尔）L-半胱氨酸。
这产生9.2毫克（理论值的67%）标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.05 min；MS (ESIpos): m/z = 843 (M+H)+。
实施例142A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F142偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.08 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例142B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=34.42 mg/ml）用于与中间体F142偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例142E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F142偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例142I
在此，在PBS中的5.0毫克尼妥珠单抗（c=13.8 mg/ml）用于与中间体F142偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例142H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗（c = 2.1 mg/ml）用于与中间体F142偶联。用TCEP还原的时间为1小时且用于ADC偶联的搅拌时间为1.5小时。然后在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.7 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例143A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F143偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例143B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=34.42 mg/ml）用于与中间体F143偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.05 mg/ml
药物/mAb比: 1.6。
实施例143E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F143偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例144B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F144偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 1.53 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例145A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F145偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.00 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例145B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F145偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.54 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例145E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F145偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例146A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F146偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.02 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例146B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=34.42 mg/ml）用于与中间体F146偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.87 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例146E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F146偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例147A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F147偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.04 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例147B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F147偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.31 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
实施例147E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F147偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例148A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F148偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.11 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例148B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F148偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例148E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F148偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.62 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例149A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=5.90 mg/ml）用于与中间体F149偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.09 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例149B
在此，在PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-1（c=34.42 mg/ml）用于与中间体F149偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 9.61 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例149E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F149偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例150A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=15.33 mg/ml）用于与中间体F150偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例150B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F150偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.81 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例150E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F150偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例151A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=16.90 mg/ml）用于与中间体F151偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例151B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F151偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.78 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例151E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=16.90 mg/ml）用于与中间体F151偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.74 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例152A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=16.90 mg/ml）用于与中间体F152偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.80 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例152B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=12.87 mg/ml）用于与中间体F152偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.77 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例152E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=16.90 mg/ml）用于与中间体F152偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.69 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例153A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=21.32 mg/ml）用于与中间体F153偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例153B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F153偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.71 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例154A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=26.8 mg/ml）用于与中间体F154偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.34 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例154B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F154偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 3.8。
实施例155A
在此，在PBS中的50毫克西妥昔单抗（c=8.51 mg/ml）用于与中间体F155偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 14.85 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例155B
在此，在PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F155偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 11.25 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例156A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=21.3 mg/ml）用于与中间体F156偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例156B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F156偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.79 mg/ml
药物/mAb比: 3.9。
实施例156E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F156偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 4.2。
实施例157
S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将2毫克（2微摩尔）中间体F125置于2毫升DMF/水10:1中并加入0.8毫克（6微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌20小时，然后在真空下浓缩，然后通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (EIpos): m/z = 868 [M+H]+。
实施例158
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将6毫克（8微摩尔）中间体F119 置于3毫升DMF中并加入1.8毫克（15微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌6小时，然后使其在室温下静置3天。该反应然后在真空下浓缩，产物通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 717 (M+H)+。
实施例159
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-D-丙氨酰基)-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，由N-[(苄氧基)羰基]-D-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸甲酯使用肽化学的经典方法制备N6-D-丙氨酰基-N2-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸甲酯。
为了合成标题化合物，将8.4毫克（0.022毫摩尔）这种中间体置于4毫升DMF中并加入10毫克（0.015毫摩尔）中间体C5和11毫克HATU和13微升N,N-二异丙基乙基胺中。在室温下搅拌5分钟后，该配制品通过制备型HPLC提纯。在适当馏分的浓缩和在高真空下干燥后，将所得中间体溶解在4毫升甲醇中，加入83微升2M氢氧化锂溶液并将该配制品在室温下搅拌整夜。加入另外167微升氢氧化锂溶液并搅拌另外4小时。然后用水稀释并用5%的柠檬酸调节至pH = 5。在浓缩后，残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生3.5毫克（理论值的26%）Boc保护的中间体。通过在2毫升DCM中用1毫升三氟乙酸脱保护，这产生3毫克（理论值的95%）标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.76 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.75 min；MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H)+。
实施例160
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
将4毫克（3微摩尔）中间体F155置于2.5毫升DMF/水10:1中并加入1.2毫克（10微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后在真空下浓缩，置于乙腈/水1:1中后，通过制备型HPLC提纯。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (EIpos): m/z = 1197 [M+H]+。
实施例161
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)
首先，使用肽化学的经典方法制备三氟乙酸/N-(2-氨基乙基)-N2-[(苄氧基)羰基]-L-谷氨酸苄酯(1:1)。在HATU存在下，这种中间体然后与中间体C58偶联。随后，首先通过氢解裂解除去苄氧基羰基保护基和苄酯，然后使用氯化锌除去2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基。
LC-MS (方法6): Rt = 1.91 min；MS (EIpos): m/z = 685 [M+H]+。
实施例162
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)
首先，使用肽化学中已知的经典保护基操作制备三氟乙酸/N2-[(苄氧基)羰基]-L-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)。在HATU存在下，这种中间体然后与中间体C61偶联。随后，首先使用氯化锌裂解2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基和2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。最后，通过苄氧基羰基保护基的氢解裂解和通过制备型HPLC提纯获得标题化合物。
HPLC (方法11): Rt = 1.65 min；
LC-MS (方法1): Rt = 0.76 min；MS (EIpos): m/z = 713 [M+H]+。
实施例163A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.3 mg/ml）用于与中间体F163偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.02 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例163B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F163偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.76 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例163H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗（c = 10 mg/ml）用于与中间体F163偶联。用TCEP还原的时间为30分钟且用于ADC偶联的搅拌时间为2小时。在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.61 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例164A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=16.9 mg/ml）用于与中间体F164偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 2.15 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例164B
在此，在PBS中的30毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F164偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 14.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例164E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F164偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.11 mg/ml
药物/mAb比: 3.8。
实施例165A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=16.9 mg/ml）用于与中间体F165偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例165B
在此，在PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F165偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 12.02 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例165E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F165偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例166A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=21.3 mg/ml）用于与中间体F166偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.0 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例166B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F166偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.76 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例166E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F166偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.01 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例167A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=16.9 mg/ml）用于与中间体F167偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.05 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例167B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F167偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.76 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例167E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F167偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.9 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例168A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.3 mg/ml）用于与中间体F168偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例168B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F168偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.33 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例168E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F168偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.89 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例168H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗（c = 10 mg/ml）用于与中间体F168偶联。用TCEP还原的时间为4小时且用于ADC偶联的搅拌时间为20小时。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.76 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例169A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=16.9 mg/ml）用于与中间体F169偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例169B
在此，在PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F169偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 11.2 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例169E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F169偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例170A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=16.9 mg/ml）用于与中间体F170偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例170B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F170偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.72 mg/ml
药物/mAb比: 3.07。
实施例170E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F170偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例171A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.3 mg/ml）用于与中间体F171偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例171B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=12.9 mg/ml）用于与中间体F171偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.58 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例172A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.3 mg/ml）用于与中间体F172偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.96 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例172B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F172偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.85 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例172E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F172偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例173A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.3 mg/ml）用于与中间体F173偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.1 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例173B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F173偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 12.26 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例173E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F173偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.33 mg/ml
药物/mAb比: 3.9。
实施例174A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.3 mg/ml）用于与中间体F174偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.18 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例174B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F174偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.99 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例174E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F174偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.03 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例175A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=16.9 mg/ml）用于与中间体F175偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 3.8。
实施例175B
在此，在PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F175偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。
蛋白质浓度: 9.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例175E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F175偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.97 mg/ml
药物/mAb比: 4.2。
实施例176A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=21.3 mg/ml）用于与中间体F176偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例176B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F176偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例176E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F176偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.85 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例177A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=21.3 mg/ml）用于与中间体F177偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.96 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例177B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F177偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.2 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例177E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F177偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例178A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=21.3 mg/ml）用于与中间体F178偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例178B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F178偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.45 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例178E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F178偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例179A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=11.3 mg/ml）用于与中间体F179偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 2.04 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例179B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F179偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.65 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例179E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F179偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.89 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例180A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=8.51 mg/ml）用于与中间体F180偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.72 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例180B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F180偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.82 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例180E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F180偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.01 mg/ml
药物/mAb比: 4.7。
实施例181
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺
将1.01克（2.84毫摩尔）(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺最初装载在20毫升1,2-二氯乙烷中，加入0.84克（3.98毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和2.56克（42.65毫摩尔）乙酸，并在室温下搅拌5分钟。然后加入0.54克（3.13毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯在5毫升1,2-二氯乙烷中的溶液并将反应混合物搅拌整夜。然后完全蒸发，将残留物置于乙酸乙酯中并过滤，将含产物的滤液完全蒸发。
将51.26毫克该残留物溶解在0.8毫升1,2-二氯甲烷中并在深96孔多滴定板上添加到7.85毫克（0.1毫摩尔）乙酰氯中。然后加入25.8毫克（0.2毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并在室温下摇振整夜。然后使用离心干燥器完全除去溶剂，向残留物加入0.4毫升1,2-二氯乙烷和0.4毫升三氟乙酸并摇振整夜。然后使用离心干燥器完全除去溶剂，并将0.8毫升DMF添加到残留物中。然后过滤，通过制备型LC-MS（方法9）从滤液中分离目标化合物。含产物的馏分使用离心干燥器在真空下浓缩。将各产物馏分的残留物溶解在0.6毫升DMSO中。合并这些并最后在离心干燥器中脱除溶剂。这产生12.2毫克（理论值的27%；纯度100%）标题化合物。
LC-MS (方法10): Rt = 0.95 min；MS (ESIpos): m/z = 455 [M+H]+。
与实施例181类似地制备表XA中所示的示例性化合物：
。
实施例186
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙酰胺
将1.0克（2.82毫摩尔）(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺最初装载在20毫升1,2-二氯乙烷中，加入1.4克（3.95毫摩尔）三乙酰氧基硼氢化钠和2.54克（42.32毫摩尔）乙酸，并在室温下搅拌5分钟。然后加入0.54克（3.10毫摩尔）(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯在5毫升1,2-二氯乙烷中的溶液并将反应混合物搅拌整夜。然后完全蒸发，将残留物置于乙酸乙酯中并过滤，将含产物的滤液完全蒸发。
将51.16毫克该残留物溶解在0.8毫升1,2-二氯甲烷中并在深96孔多滴定板上添加到14.65毫克（0.1毫摩尔）3,3,3-三氟丙酰氯中。然后加入25.8毫克（0.2毫摩尔）N,N-二异丙基乙基胺并在室温下摇振整夜。然后使用离心干燥器完全除去溶剂，向残留物加入0.4毫升1,2-二氯乙烷和0.4毫升三氟乙酸并摇振整夜。然后使用离心干燥器完全除去溶剂，并将0.8毫升DMF添加到残留物中。然后过滤，通过制备型LC-MS（方法9）从滤液中分离目标化合物。含产物的馏分使用离心干燥器在真空下浓缩。将各产物馏分的残留物溶解在0.6毫升DMSO中。合并这些并最后在离心干燥器中脱除溶剂。这产生1.0毫克（理论值的2%；纯度82%）标题化合物。
LC-MS (方法10): Rt = 1.01 min MS (ESIpos): m/z = 522 [M+H]+。
与实施例186类似地制备表XA1中所示的示例性化合物：
。
实施例192A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=21.3 mg/ml）用于与中间体F192偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.968 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例192B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F192偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例192E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F192偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.04 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例193A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=23.1 mg/ml）用于与中间体F193偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.98 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例193B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F193偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.03 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例193E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F193偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.61 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例194A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=23.1 mg/ml）用于与中间体F194偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.67 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例194B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F194偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 0.99 mg/ml
药物/mAb比: 3.8。
实施例194E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F194偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.39 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例195A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=23.1 mg/ml）用于与中间体F195偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.79 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例195B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F195偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.53 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例195E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F195偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例196A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=23.1 mg/ml）用于与中间体F196偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.85 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例196B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F196偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.73 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例196E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F196偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例197
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸盐酸盐(1:1)
将150毫克（0.2毫摩尔）中间体C53溶解在15毫升DMF中并加入2.29克（20.39毫摩尔）DABCO。该配制品在超声浴中处理30分钟。通过添加1.17毫升乙酸，随后将该配制品调节至pH 3-4，在真空下浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯并在室温下在真空下浓缩适当的馏分。将残留物置于乙腈/水1:1中，加入5毫升4N盐酸，然后冻干。这产生81毫克（理论值的68%）标题化合物。
LC-MS (方法5): Rt = 2.69 min；MS (EIpos): m/z = 514 [M+H]+。
实施例198
三氟乙酸/(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺(1:1)
将15毫克（0.018毫摩尔）中间体C64溶解在4毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入15毫升（0.110毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌2小时。然后加入32毫克（0.110毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸并在真空下浓缩该配制品。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生9.5毫克（理论值的77%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.68 min；MS (ESIpos): m/z = 556 (M+H)+。
实施例199
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
LC-MS (方法1): Rt = 0.80 min；MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+。
首先，将L-半胱氨酸在DMF中在N,N-二异丙基乙基胺存在下用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将406毫克（1.53毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在10毫升DMF中，加入157.5毫克（1.606毫摩尔）马来酸酐并将该配制品在室温下搅拌1小时。将7.5毫克（0.01毫摩尔）中间体C66添加到130微升这种溶液中并将该配制品在室温下搅拌5分钟。然后在真空下浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生10毫克（89%）受保护的中间体；通过HPLC和通过LC-MS都不可能分离区域异构体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.38 min；MS (EIpos): m/z = 1120 [M+H]+。
在最后步骤中，将10毫克这种中间体溶解在2毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入12毫升（0.088毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌30分钟。然后加入26毫克（0.088毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生8.3毫克（理论值的99%）作为87:13的区域异构体混合物的标题化合物。
LC-MS (方法5): Rt = 2.3 min和2.43 min；MS (ESIpos): m/z = 832 (M+H)+.
1H NMR主要区域异构体: (500 MHz, DMSO-d6): d = 8.7 (m, 1H), 8.5 (m, 2H),8.1 (m, 1H), 7.6 (m, 1H), 7.5 (s, 1H) 7.4-7.15 (m, 6H), 6.9-7.0 (m, 1H), 6.85(s, 1H), 5.61 (s, 1H), 4.9和5.2 (2d, 2H), 4.26和4.06 (2d, 2H), 3.5-3.8 (m,5H), 3.0-3.4 (m, 5H), 2.75-3.0 (m, 3H), 2.58和2.57 (dd, 1H), 0.77和1,5 (2m,2H), 0.81 (s, 9H)。
或者，如下制备区域异构的标题化合物：
为此，首先将L-半胱氨酸在DMF中在 N,N-二异丙基乙基胺存在下用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将55毫克（0.068毫摩尔）中间体F104和36毫克（0.136毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在15毫升DMF中并将该配制品在室温下搅拌20小时。然后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分和在真空下蒸发溶剂后，将该残留物溶解在15毫升THF/水1:1中。加入131微升2M氢氧化锂水溶液并将该配制品在室温下搅拌1小时。该反应然后用1M盐酸中和，在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生37毫克（理论值的50%）无色泡沫形式的区域异构的受保护中间体。
LC-MS (方法5): Rt = 3.33 min和3.36 min；MS (ESIpos): m/z = 976 (M+H)+。
在最后步骤中，将25毫克（0.023毫摩尔）这种中间体溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入12.5毫升（0.092毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌4小时。然后加入27毫克（0.092毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生18.5毫克（理论值的85%）作为21:79的区域异构体混合物的标题化合物。
LC-MS (方法5): Rt = 2.37 min和3.44 min；MS (ESIpos): m/z = 832 (M+H)+。
如下进行标题化合物的独立区域异构体的定向制备。
实施例199-2
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
为此，首先将L-半胱氨酸甲酯在DMF中在N,N-二异丙基乙基胺存在下用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯。
将53毫克（0.251毫摩尔）市售3-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸和70毫克（0.251毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸甲酯溶解在5毫升DMF中，并在监测pH的同时加入碳酸氢钠水溶液。在室温下搅拌15分钟后，用乙酸调节至pH=4.3并浓缩该配制品。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的合并和溶剂的在真空下蒸发后产生72毫克（理论值的70%）4-甲氧基-3-{[(2R)-3-甲氧基-3-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基] 硫烷基}-4-氧代丁酸。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 410 (M+H)+。
这种中间体在HATU存在下与中间体C66偶联，然后如上所述首先用在甲醇中的氢氧化锂，然后用氯化锌完全脱保护。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生2毫克标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.78 min；MS (ESIpos): m/z = 832 (M+H)+。
可以以类似方式制备异构体1。
实施例200
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
将10毫克（0.014毫摩尔）中间体C61溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入11毫升（0.082毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌30分钟。然后加入24毫克（0.082毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生4.2毫克（理论值的40%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.79 min；MS (ESIpos): m/z = 585 (M+H)+。
实施例201
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丝氨酸/三氟乙酸(1:1)
将20毫克（0.03毫摩尔）中间体C58和8.5毫克（0.037毫摩尔）L-丝氨酸苄酯盐酸盐(1:1)置于5毫升DMF中并加入17毫克（0.046毫摩尔）HATU和21微升N,N-二异丙基乙基胺。在室温下搅拌10分钟后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生12.5毫克（理论值的49%）中间体。LC-MS (方法1): Rt = 1.42 min；MS (ESIpos): m/z = 835 (M+H)+。
将12.5毫克（0.015毫摩尔）这种中间体溶解在10毫升乙醇中，加入钯碳(10%)，在室温下在标准压力下用氢气氢化30分钟。滤出催化剂并在真空下蒸发溶剂，在残留物从乙腈/水中冻干后产生7.5毫克（理论值的67%）中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.28 min；MS (ESIpos): m/z = 745 (M+H)+。
将7.5毫克（0.01毫摩尔）这种中间体溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入8毫升（0.06毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌4.5小时。然后加入17.7毫克（0.06毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生4.2毫克（理论值的58%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.75 min；MS (ESIpos): m/z = 601 (M+H)+。
实施例202
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于实施例201由中间体C58和L-丙氨酸苄酯盐酸盐(1:1)制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 585 (M+H)+。
实施例203
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}甘氨酸/三氟乙酸(1:1)
类似于实施例201由中间体C58和甘氨酸苄酯盐酸盐(1:1)制备标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.82 min；MS (ESIpos): m/z = 571 (M+H)+。
实施例204A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=23.1 mg/ml）用于与中间体F204偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.88 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例204B
在此，在PBS中的50毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F204偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 12.66 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例204E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F204偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.65 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例205A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=23.1 mg/ml）用于与中间体F205偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.99 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例205B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F205偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 0.96 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例205E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F205偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例206A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=23.1 mg/ml）用于与中间体F206偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.73 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例206B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F206偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.21 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例206E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F206偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例207A
在此，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）用于与中间体F207偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.79 mg/ml
药物/mAb比: 3.4。
实施例207B
在此，在PBS中的50毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F207偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩，用PBS再稀释并再浓缩。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。对于这种ADC制备，在该合成后立即测得19%的开环琥珀酰胺形式的含量。
蛋白质浓度: 12.99 mg/ml
药物/mAb比: 4.3。
实施例207E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=13.5 mg/ml）用于与中间体F207偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.39 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例207I
在此，在PBS中的5.0毫克尼妥珠单抗（c=13.1 mg/ml）用于与中间体F207偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例207H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗（c = 13.6 mg/ml）用于与中间体F207偶联。用TCEP还原的时间为4小时且用于ADC偶联的搅拌时间为20小时。在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.0 mg/ml
药物/mAb比: 1.9。
实施例208A
在氩气下，将0.344毫克TCEP在100微升PBS缓冲液中的溶液添加到在5494微升PBS中的60毫克西妥昔单抗（c=10.92 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在600微升DMSO中的2.582毫克（0.003毫摩尔）中间体F104。在室温下搅拌另外120分钟后，用1306微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物用PBS缓冲液pH 8稀释至14毫升总体积。这种溶液在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 13.36 mg/ml
药物/mAb比: 1.8。
对于这种ADC制备，测得94%的开环琥珀酰胺形式的含量。
实施例208B
在氩气下，在3225微升PBS中的60毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用775微升PBS缓冲液稀释，然后加入0.344毫克TCEP在100微升PBS缓冲液中的溶液。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在600微升DMSO中的2.582毫克（0.003毫摩尔）中间体F104。在室温下搅拌另外120分钟后，用300微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物用PBS缓冲液pH 8稀释至14毫升总体积。这种溶液在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 14.95 mg/ml
药物/mAb比: 3.2。
实施例208I
在氩气下，将0.344毫克TCEP在100微升PBS缓冲液中的溶液添加到在4587微升PBS中的60毫克尼妥珠单抗（c=13.1 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在600微升DMSO中的2.582毫克（0.003毫摩尔）中间体F104。在室温下搅拌另外120分钟后，用2213微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该反应。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物用PBS缓冲液pH 8稀释至14毫升总体积。这种溶液在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 14.79 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
对于这种ADC制备，测得91%的开环琥珀酰胺形式的含量。
实施例208K
在氩气下，将0.23毫克TCEP在67微升PBS缓冲液中的溶液添加到在2759微升PBS中的40毫克抗-TWEAKR AK-2（c=14.5 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在400微升DMSO中的1.72毫克（0.002毫摩尔）中间体F104。在室温下搅拌另外120分钟后，用1774微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物用PBS缓冲液pH 8稀释至14毫升总体积。这种溶液在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 11.66 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例209A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=21.32 mg/ml）用于与中间体F209偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.75 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例209B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.60 mg/ml）用于与中间体F209偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.30 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例209E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F209偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.03 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例209H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗抗体（c=70.5 mg/ml）用于与中间体F209偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 1.5。
实施例209I
在此，在PBS中的5.0毫克尼妥珠单抗抗体（c=13.1 mg/ml）用于与中间体F209偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.81 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例210A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=21.32 mg/ml）用于与中间体F210偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例210B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.60 mg/ml）用于与中间体F210偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.41 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例210E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F210偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.79 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例211A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=12.33 mg/ml）用于与中间体F211偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.82 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例211B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=34.42 mg/ml）用于与中间体F211偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.52 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例211E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F211偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例212A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=11.3 mg/ml）用于与中间体F212偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例212B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F212偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 0.85 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例212E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F212偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.55 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例213A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=21.32 mg/ml）用于与中间体F213偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例213B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F213偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.4 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例213E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F213偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例214A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=15.21 mg/ml）用于与中间体F214偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.00 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例214B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F214偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.01 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例214E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F214偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例215A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=15.21 mg/ml）用于与中间体F215偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.99 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例215B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F215偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.64 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例215E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F215偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例215H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗抗体（c=70.5 mg/ml）用于与中间体F215偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 1.4。
实施例215I
在此，在PBS中的5.0毫克尼妥珠单抗（c=13.1 mg/ml）用于与中间体F215偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例216A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=15.21 mg/ml）用于与中间体F216偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.97 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例216B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F216偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.94 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例216E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F216偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.90 mg/ml
药物/mAb比: 1.7。
实施例217A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=15.21 mg/ml）用于与中间体F217偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.05 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例217B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F217偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.44 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例217E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F217偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.85 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例218A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=15.21 mg/ml）用于与中间体F218偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.05 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例218B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAKR AK-1抗体（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F218偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.95 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例218E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗抗体（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F218偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例218H
在此，在PBS中的5.0毫克帕尼单抗抗体（c = 20 mg/ml）用于与中间体F218偶联。将用TCEP还原的时间增加至4小时并将用于ADC偶联的搅拌时间增加至20小时。在葡聚糖凝胶提纯后，该反应通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.33 mg/ml
药物/mAb比: 0.8。
实施例218I
在此，在PBS中的5.0毫克尼妥珠单抗抗体（c=13.8 mg/ml）用于与中间体F218偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.48 mg/ml
药物/mAb比: 3.0。
实施例219
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺(1:1)
将70.0毫克（0.09毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯（中间体C67）最初装载在3.0毫升二氯甲烷中并加入31.3毫克（0.31毫摩尔）三乙胺和31.8毫克（0.21毫摩尔）4-甲基苯甲酰氯。将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生33.4毫克（理论值的48%）化合物{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-甲基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯。
LC-MS (方法2): Rt = 11.91 min；MS (ESIpos): m/z = 774 (M+Na)+。
33.0毫克（0.04毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-甲基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯在1.0毫升DMF中与20.0毫克（0.23毫摩尔）吗啉一起搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生9.6毫克（理论值的34%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 1.01 min；MS (ESIpos): m/z = 530 (M+H)+。
实施例220
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲酰胺(1:1)
将50.0毫克（0.07毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯（中间体C67）最初装载在2.0毫升二氯甲烷中并加入22.3毫克（0.22毫摩尔）三乙胺和27.5毫克（0.15毫摩尔）4-(甲基硫烷基)苯甲酰氯。将反应混合物在40℃下搅拌4小时，加入另外10.2毫克（0.10毫摩尔）三乙胺和27.5毫克（0.15毫摩尔）4-(甲基硫烷基)苯甲酰氯并在室温下搅拌整夜。然后加入另外14.9毫克（0.15毫摩尔）三乙胺和27.5毫克（0.15毫摩尔）4-(甲基硫烷基)苯甲酰氯，并在40℃下搅拌2小时。用乙酸乙酯稀释，有机相用水洗涤三次并用饱和NaCl溶液洗涤一次。有机相经硫酸镁干燥并在真空下浓缩。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ,流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生39.8毫克（理论值的76%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[4-(甲基硫烷基)苯甲酰基]氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.59 min；MS (ESIpos): m/z = 785 (M+H)+。
18.0毫克（0.02毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[4-(甲基硫烷基)苯甲酰基]氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯在1.0毫升DMF中与10.0毫克（0.12毫摩尔）吗啉一起搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生6.2毫克（理论值的40%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.99 min；MS (ESIpos): m/z = 562 (M+H)+。
实施例221
三氟乙酸/(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺(1:1)
将40.0毫克（0.06毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯（中间体C67）最初装载在2.0毫升二氯甲烷中并加入9.6毫克（0.10毫摩尔）三乙胺和14.3毫克（0.10毫摩尔）乙酸(2S)-1-氯-1-氧代丙-2-酯。将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生39.7毫克（理论值的84%）化合物乙酸(2S)-1-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丙基)氨基]-1-氧代丙-2-酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.51 min；MS (ESIpos): m/z = 748 (M+H)+。
37.0毫克（0.05毫摩尔）乙酸(2S)-1-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(3-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丙基)氨基]-1-氧代丙-2-酯在1.0毫升DMF中与0.1毫升吗啉和3滴水一起在50℃下搅拌10小时。加入另外0.1毫升吗啉和0.1毫升水并在50℃下搅拌10小时。在加入20.5毫克（0.15毫摩尔）碳酸钾和在室温下搅拌72小时后，加入0.1毫升1N NaOH溶液并在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1%TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生20.5毫克（理论值的69%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.89 min；MS (ESIpos): m/z = 484 (M+H)+。
实施例222
三氟乙酸/N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙酰胺(1:1)
将70.0毫克（0.11毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C 70）最初装载在3.0毫升DMF中。加入15.5毫克（0.22毫摩尔）甲烷硫醇钠并将反应混合物在50℃下搅拌2小时。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生60.0毫克（理论值的84%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(甲基硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.50 min；MS (ESIpos): m/z = 644 (M+H)+。
将40.0毫克（0.06摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(甲基硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶解在2.0毫升三氟乙醇中并加入21.2毫克（0.16毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。加入45.4毫克（0.01毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速:50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生34.6毫克（理论值的91%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 500 (M+H)+。
实施例223
三氟乙酸/(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺(1:1)
将40.0毫克（0.08毫摩尔）[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在2.0毫升二氯甲烷中并加入19.7毫克（0.20毫摩尔）三乙胺和29.4毫克（0.20毫摩尔）乙酸(2S)-1-氯-1-氧代丙-2-酯。将反应混合物搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生21.2毫克（理论值的43%）化合物乙酸(2S)-1-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.46 min；MS (ESIpos): m/z = 627 (M+H)+。
将21.2毫克（0.03毫摩尔）乙酸(2S)-1-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-酯溶解在1.0毫升二氯甲烷中，加入77.1毫克（0.68毫摩尔）三氟乙酸并在室温下搅拌2小时。再两次加入每次另外77.1毫克（0.68毫摩尔）三氟乙酸并每次在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物反复与二氯甲烷共蒸馏，然后在高真空下干燥。包含物质三氟乙酸/乙酸(2S)-1-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-1-氧代丙-2-酯(1:1)的残留物不经进一步提纯即进一步反应。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 527 (M+H)+。
将26.5毫克（0.04毫摩尔）三氟乙酸/乙酸(2S)-1-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-1-氧代丙-2-酯(1:1)溶解在THF/甲醇/水（1.0 ml/1.0 ml/0.05 ml）中并加入17.2毫克碳酸钾。将反应混合物在室温下搅拌整夜。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水；0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生17.3毫克（理论值的70%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 485 (M+H)+。
实施例224
三氟乙酸/4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸甲酯(1:1)
将60.0毫克（0.11毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（参见中间体C11的合成）溶解在1.0毫升二氯甲烷中并加入19.6毫克（0.25毫摩尔）吡啶和35.8毫克（0.24毫摩尔）4-氯-4-氧丁酸甲酯。将反应混合物在40℃下搅拌整夜。加入另外19.6毫克（0.25毫摩尔）吡啶和35.8毫克（0.24毫摩尔）4-氯-4-氧代丁酸甲酯并在40℃下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生16.1毫克（理论值的22%）化合物11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.52 min；MS (ESIpos): m/z = 670 (M+H)+。
将16.1毫克（0.02毫摩尔）11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯溶解在1.0毫升三氟乙醇中并加入16.4毫克（0.12毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌5小时。向反应混合物加入35.1毫克（0.12毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生11.1毫克（理论值的72%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 526 (M+H)+。
实施例225
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
将9.7毫克（0.02毫摩尔）三氟乙酸/4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸甲酯(1:1)（实施例224）最初装载在THF/甲醇/水（1.0 ml/0.2 ml/0.04 ml）中并加入1.3毫克（0.03毫摩尔）一水合氢氧化锂。将反应混合物在室温下搅拌整夜。加入另外1.3毫克（0.03毫摩尔）一水合氢氧化锂并在室温下搅拌整夜。加入3.6毫克（0.06毫摩尔）HOAc，该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水；0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生5.4毫克（理论值的57%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.90 min；MS (ESIpos): m/z = 512 (M+H)+。
实施例226
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基]-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷-1-酸/三氟乙酸(1:2)
将10.3毫克（毫摩尔）R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（中间体F209）最初装载在DMF/水（2.0 ml/0.2 ml）中，加入L-半胱氨酸并将该混合物在室温下搅拌10分钟。向反应混合物加入水且直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水；0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生10.3毫克（理论值的82%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.84 min；MS (ESIpos): m/z = 1092 (M+H)+。
实施例227
三氟乙酸/4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺(2:1)
将50.0毫克（0.10摩尔）[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯（中间体C68）最初装载在二氯甲烷中并加入54.9毫克（0.22毫摩尔）[4-(氯羰基)苯基]氨基甲酸叔丁酯（中间体L71）和22.7毫克（0.22毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜，加入另外54.9毫克（0.22毫摩尔）[4-(氯羰基)苯基]氨基甲酸叔丁酯（中间体L71）和22.7毫克（0.22毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil250x40；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生26.2毫克（理论值的37%）化合物[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酰基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。
LC-MS (方法1): Rt = 5.34 min；MS (ESIpos): m/z = 732 (M+H)+。
将26.2毫克（0.04毫摩尔）[3-({(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酰基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解在2.0毫升二氯甲烷中并加入204.1毫克（1.79毫摩尔）TFA。将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生3.4毫克（理论值的13%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.92 min；MS (ESIpos): m/z = 532 (M+H)+。
实施例228
N-乙酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将50.0毫克（0.08摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯（中间体C70）与66.43毫克碳酸氢钠一起悬浮在0.30毫升水中。将144.47（0.95毫摩尔）1,8-二氮杂双环(5.4.0)十一-7-烯和51.62毫克（0.32毫摩尔）N-乙酰基-L-半胱氨酸在3.0毫升异丙醇中的溶液添加到该悬浮液中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5小时。向反应混合物加入水（0.1%TFA）且直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min,MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生55.2毫克（理论值的92%）化合物N-乙酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.41 min；MS (ESIpos): m/z = 759 (M+H)+。
将53.1毫克（69.96微摩尔）N-乙酰基-S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-L-半胱氨酸溶解在5.0毫升三氟乙醇中并加入57.2毫克（419.76微摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4小时。向反应混合物加入122.67毫克（0.42毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。这产生32.5毫克（理论值的64%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.90 min；MS (ESIpos): m/z = 615 (M+H)+。
实施例229
N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将30.3毫克（41.58微摩尔）N-乙酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（实施例228）溶解在1.5毫升DMF中并加入8.4毫克（83.15微摩尔）4-甲基吗啉和14.65毫克（45.73微摩尔）N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯。将反应混合物在室温下搅拌整夜，然后加入另外8.4毫克（83.15微摩尔）4-甲基吗啉。再将反应混合物在室温下再搅拌整夜。加入10.0毫克（0.17毫摩尔）乙酸且反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生31.2毫克（理论值的92%）化合物N-乙酰基-S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸。
LC-MS (方法1): Rt = 1.22 min；MS (ESIpos): m/z = 820 (M+H)+。
将28.6毫克（0.04毫摩尔）N-乙酰基-S-[2-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({N-[(苄氧基)羰基]-L-丙氨酰基}氨基)丙基]氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸溶解在5.0毫升乙醇中并加入2.9毫克钯-活性炭(10%)。该反应混合物在标准压力和室温下氢化整夜。该配制品经C盐过滤，滤饼用乙醇的混合物后洗涤。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 250x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂并将残留物冻干。这产生17.4毫克（理论值的62%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 686 (M+H)+。
实施例230
三氟乙酸/(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氢呋喃-2-甲酰胺(1:1)
将100.0毫克（0.16毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯（中间体C67）与71.9毫克（0.71毫摩尔）三乙胺一起溶解在5.0毫升二氯甲烷中并逐滴添加到新鲜制备的(2S)-四氢呋喃-2-羰基氯的溶液中（制备：将54.7毫克（0.39毫摩尔）(2S)-四氢呋喃-2-甲酸最初装载在0.7毫升甲苯中，加入0.04毫升亚硫酰氯并在90℃下搅拌1小时。在冷却后，该粗制反应溶液进一步反应）。将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生44.3毫克（理论值的38%）化合物[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-四氢呋喃-2-基羰基]氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.52 min；MS (ESIpos): m/z = 776 (M+HCOOH-H)-。
将26.0毫克（0.04毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2S)-四氢呋喃-2-基羰基]氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯溶解在2.6毫升DMF中并加入0.26毫升吗啉。将反应混合物在室温下搅拌3小时。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1%TFA)。这产生11.7毫克（理论值的53%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 510 (M+H)+。
实施例231
3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸/三氟乙酸(1:1)
将53.9毫克（0.08毫摩尔）11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸（中间体C69）溶解在4.0毫升三氟乙醇中并加入31.4毫克（0.23毫摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌整夜。向反应混合物加入67.3毫克（0.23毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA)。这产生34.2毫克（理论值的66%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.91 min；MS (ESIpos): m/z = 558 (M+H)+。
实施例232
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸/三氟乙酸(1:2)
将40.0毫克（47.3微摩尔）S-(11-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)高半胱氨酸（中间体C11）溶解在3.0毫升三氟乙醇中并加入38.7毫克（0.28微摩尔）二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌6天。向反应混合物加入83毫克（0.28毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，搅拌10分钟，然后加入水（0.1% TFA）。直接通过制备型RP-HPLC进行提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。这产生32.4毫克（理论值的84%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 587 (M+H)+。
实施例233
三氟乙酸/4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺（2:1）
将73.0毫克（0.12毫摩尔）[3-({(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯（中间体C67）和27.8毫克（0.15毫摩尔）4-硝基苯甲酰氯溶解在2.0毫升二氯甲烷中并加入15.2毫克（0.15毫摩尔）三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌整夜。再加入相同量的4-硝基苯甲酰氯和三乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌整夜。在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。这产生39.3毫克（理论值的44%）化合物{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸9H-芴-9-基甲酯。
LC-MS (方法1): Rt = 1.54 min；MS (ESIpos): m/z = 783 (M+H)+。
将39.3毫克（0.05毫摩尔）{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸芴-9-基甲酯溶解在2.0毫升乙醇中，加入3.9毫克氢氧化钯/活性炭(20%)并在标准压力下氢化整夜。该反应混合物经纸过滤器过滤，滤饼用乙醇后洗涤。在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型RP-HPLC提纯（柱:Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50 ml/min, MeCN/水, 0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生32.9毫克（理论值的86%）标题化合物。LC-MS (方法1): Rt =0.93 min；MS (ESIpos): m/z = 531 (M+H)+。
实施例234A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.2毫克（0.00027毫摩尔）中间体F85。在室温下搅拌另外90分钟后，用1900微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.68 mg/ml
药物/mAb比: 3.8。
实施例234B
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在269微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.2毫克（0.00027毫摩尔）中间体F85。在室温下搅拌另外90分钟后，用2130微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.57 mg/ml
药物/mAb比: 3.7。
实施例234I
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克尼妥珠单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.2毫克（0.00027毫摩尔）中间体F85。在室温下搅拌另外90分钟后，用1900微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.93 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例234H
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克帕尼单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌4小时，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.2毫克（0.00027毫摩尔）中间体F85。在室温下搅拌另外120分钟后，用1900微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 2.12 mg/ml
药物/mAb比: 1.4。
实施例235A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在329微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=15.2 mg/ml）中，然后用2021微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.28毫克中间体F235。在室温下搅拌另外90分钟后，然后将该配制品施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.5 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例235B
类似于实施例235A，在269微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用PBS缓冲液pH 8稀释至2 mg/ml的浓度并与中间体F235偶联。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 0.56 mg/ml
药物/mAb比: 1.0。
实施例235E
类似于实施例235A，在370微升PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=14.5 mg/ml)用PBS缓冲液pH 8稀释至2 mg/ml的浓度并与中间体F235偶联。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.67 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例235I
类似于实施例235A，在382微升PBS中的5毫克尼妥珠单抗（c=13.08 mg/ml）用PBS缓冲液pH 8稀释至2 mg/ml的浓度并与中间体F235偶联。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.81 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例235H
类似于实施例235A，在74微升PBS中的5毫克帕尼单抗（c=67.4 mg/ml）用PBS缓冲液pH8稀释至2 mg/ml的浓度并与中间体F235偶联。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.14 mg/ml
药物/mAb比: 0.9。
实施例236A
类似于实施例234A，在500微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c= 10 mg/ml）与中间体F236偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.85 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例236B
类似于实施例234A，在500微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c= 10 mg/ml）与中间体F236偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.67 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例236E
类似于实施例234A，在500微升PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c= 10 mg/ml）与中间体F236偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.67 mg/ml
药物/mAb比: 3.9。
实施例237A
在氩气下，将0.344毫克TCEP在100微升PBS缓冲液中的溶液添加到在4000微升PBS中的60毫克西妥昔单抗（c=15 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后加入溶解在600微升DMSO中的3.04毫克（0.003毫摩尔）中间体F209。在室温下搅拌另外90分钟后，用已预先调节至pH 8的PBS缓冲液将该配制品稀释至15毫升。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。这种溶液在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 13.78 mg/ml
药物/mAb比: 4.8。
实施例237B
在氩气下，将0.287毫克TCEP在500微升PBS缓冲液中的溶液添加到在2688微升PBS中的50毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）中，用8812微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后加入溶解在500微升DMSO中的2.894毫克（0.003毫摩尔）中间体F209。在室温下搅拌另外90分钟后，然后将该配制品施加到已用PBS缓冲液pH8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。这种溶液在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。对于这一批料，在合成后直接测得开环形式的含量为23%。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 11.1 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例237I
类似于实施例237A，在4587微升PBS中的60毫克尼妥珠单抗（c= 13.08 mg/ml）与中间体F209偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 15.88 mg/ml
药物/mAb比: 4.0。
实施例238A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.22毫克（0.00027毫摩尔）中间体F238。在室温下搅拌另外90分钟后，用1900微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.89 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例238B
类似于实施例238A，在500微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c= 10 mg/ml）与中间体F238偶联。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.66 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
在这些偶联条件下，26%的ADC以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
实施例238E
类似于实施例238A，在500微升PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c= 10 mg/ml）与中间体F238偶联。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例239A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在458微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10.92 mg/ml）中。用1892微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品并在室温下搅拌1小时。然后加入溶解在100微升DMSO中的0.19毫克（0.00027毫摩尔）中间体F217。在室温下搅拌另外90分钟后，将该配制品施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.86 mg/ml
药物/mAb比: 2.8。
实施例239B
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在269微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）中。用2081微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品并在室温下搅拌1小时。然后加入溶解在100微升DMSO中的0.19毫克（0.00027毫摩尔）中间体F217。在室温下搅拌另外90分钟后，将该配制品施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.28 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例239I
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在382微升PBS中的5毫克尼妥珠单抗（c=13.1 mg/ml）中。用1968微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品并在室温下搅拌1小时。然后加入溶解在100微升DMSO中的0.19毫克（0.00027毫摩尔）中间体F217。在室温下搅拌另外90分钟后，将该配制品施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.32 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
对于这种ADC制备，测得89%的开环琥珀酰胺形式的含量。
实施例239H
在氩气下，将0.048毫克TCEP在83微升PBS缓冲液中的溶液添加到在74微升PBS中的5毫克帕尼单抗（c=67.5 mg/ml）中。用2243微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品并在室温下搅拌4小时。然后加入溶解在100微升DMSO中的0.19毫克（0.00027毫摩尔）中间体F217。将该配制品在室温下搅拌整夜。然后将该溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.33 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例240A
在氩气下，将0.29毫克TCEP在500微升PBS缓冲液中的溶液添加到在4579微升PBS中的50毫克西妥昔单抗（c=10.92 mg/ml）中。用7421微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品并在室温下搅拌1小时。然后加入溶解在500微升DMSO中的1.4毫克（0.0027毫摩尔）中间体F213。在室温下搅拌另外90分钟后，将该配制品施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 15.63 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例240B
类似于实施例239A，在500微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c= 10 mg/ml）与中间体F213偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 0.9 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例240E
类似于实施例239A，在500微升PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c= 10 mg/ml）与中间体F213偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.4 mg/ml
药物/mAb比: 2.1。
实施例241A
在氩气下，将0.172毫克TCEP在300微升PBS缓冲液中的溶液添加到在3毫升PBS中的30毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在330微升DMSO中的1.36毫克（1.6微摩尔）中间体F241。在室温下搅拌20小时后，用1.37毫升PBS缓冲液稀释该配制品并使用PBS缓冲液经PD 10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）洗脱。然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 9.98 mg/ml
药物/mAb比: 3.3。
实施例241B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10 mg/ml）用于与中间体F241偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.39 mg/ml
药物/mAb比: 3.9。
实施例241E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=10 mg/ml）用于与中间体F241偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.83 mg/ml
药物/mAb比: 4.7。
实施例241I
在此，在PBS中的5毫克尼妥珠单抗（c=10 mg/ml）用于与中间体F241偶联。在TCEP还原后，在搅拌下进行与抗体的偶联整夜，接着通过葡聚糖凝胶提纯进一步后处理。在葡聚糖凝胶提纯后，该配制品通过超离心浓缩并用PBS再稀释。
蛋白质浓度: 1.6 mg/ml
药物/mAb比: 4.0。
实施例242A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.22毫克（0.00027毫摩尔）中间体F242。在室温下搅拌另外90分钟后，用1900微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.7。
实施例242B
如实施例242A中所述，在500微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c= 10 mg/ml）与0.22毫克中间体F242偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.54 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例242E
如实施例242A中所述，在500微升PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c= 10 mg/ml）与0.22毫克中间体F242偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.76 mg/ml
药物/mAb比: 3.6。
实施例243A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.23毫克（0.00027毫摩尔）中间体F243。在室温下搅拌另外90分钟后，用1900微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.92 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例243B
如实施例243A中所述，在500微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c= 10 mg/ml）与0.23毫克中间体F243偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.63 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例243E
如实施例243A中所述，在500微升PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c= 10 mg/ml）与0.23毫克中间体F243偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例243I
如实施例243A中所述，在500微升PBS中的5毫克尼妥珠单抗（c= 10 mg/ml）与0.23毫克中间体F243偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.87 mg/ml
药物/mAb比: 3.1。
实施例244A
在此，在PBS中的5.0毫克西妥昔单抗（c=23.10 mg/ml）用于与中间体F244偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 2.12 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例244B
在此，在PBS中的5.0毫克抗-TWEAK AK-1（c=18.60 mg/ml）用于与中间体F244偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 1.65 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例244E
在此，在PBS中的5.0毫克曲妥珠单抗（c=13.50 mg/ml）用于与中间体F244偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例244I
在此，在PBS中的5.0毫克尼妥珠单抗（c=13.08 mg/ml）用于与中间体F244偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并再稀释。
蛋白质浓度: 1.91 mg/ml
药物/mAb比: 2.9。
实施例245A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.24毫克（0.00027毫摩尔）中间体F245。在室温下搅拌另外90分钟后，用1900微升已预先调节至pH 8的PBS缓冲液稀释该配制品。
然后将这种溶液施加到已用PBS缓冲液pH 8平衡的PD 10柱（Sephadex® G-25, GEHealthcare）上并用PBS缓冲液pH 8洗脱。洗脱物在室温下在氩气下搅拌整夜，然后通过超离心浓缩并用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.69 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例245B
如实施例245A中所述，在500微升PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c= 10 mg/ml）与0.24毫克中间体F245偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.51 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例245E
如实施例245A中所述，在500微升PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c= 10 mg/ml）与0.24毫克中间体F245偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 3.5。
实施例245I
如实施例245A中所述，在500微升PBS中的5毫克尼妥珠单抗（c= 10 mg/ml）与0.24毫克中间体F245偶联。在这些条件下，部分ADC也可能以闭环形式存在。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.65 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例246
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
首先，L-半胱氨酸在DMF中在N,N-二异丙基乙基胺存在下用1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮转化成N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸。
将11毫克（0.013毫摩尔）中间体F193和8毫克（0.016毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在3毫升DMF中并将该配制品在室温下搅拌20小时。然后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。
合并适当的馏分并在真空下蒸发溶剂后，将残留物溶解在2毫升THF/水1:1中。加入19微升2M氢氧化锂水溶液并将该配制品在室温下搅拌1小时。然后加入另外19微升2M氢氧化锂水溶液并将该配制品在室温下搅拌整夜。然后用1M盐酸中和，在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生4.1毫克（理论值的38%）无色泡沫形式的区域异构的受保护中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.03 min (宽)；MS (ESIpos): m/z = 1020 (M+H)+。
在最后步骤中，将4.1毫克（0.004毫摩尔）这种中间体溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入3毫升（0.022毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌1小时。然后加入6毫克（0.022毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸和2毫升0.1%的三氟乙酸水溶液，并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生5毫克（定量）作为20:80的区域异构体混合物的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.78 min (broad)；MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H)+.
LC-MS (方法5): Rt = 2.36 min和2.39 min；MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H)+。
实施例247A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.264毫克（0.27微摩尔）中间体F247。在室温下搅拌20小时后，用1.9毫升PBS缓冲液稀释该配制品并使用PBS缓冲液经PD 10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）洗脱。然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.66 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例247B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10 mg/ml）用于与中间体F247偶联，并如实施例247A中所述进行偶联和后处理。
蛋白质浓度: 1.49 mg/ml
药物/mAb比: 2.6。
实施例247E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=10 mg/ml）用于与中间体F247偶联，并如实施例247A中所述进行偶联和后处理。
蛋白质浓度: 1.67 mg/ml
药物/mAb比: 2.3。
实施例247I
在此，在PBS中的5毫克尼妥珠单抗（c=10 mg/ml）用于与中间体F247偶联，并如实施例247A中所述进行偶联和后处理。
蛋白质浓度: 1.62 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例248A
在此，类似于实施例5A，在PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10.92 mg/ml）用于与中间体F248偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 2.06 mg/ml
药物/mAb比: 3.8。
实施例248B
在此，类似于实施例5B，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=18.6 mg/ml）用于与中间体F248偶联，且该配制品在葡聚糖凝胶提纯后通过超离心浓缩并用PBS再稀释。由此制备的部分ADC也可能以连接到抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式存在。
蛋白质浓度: 1.84 mg/ml
药物/mAb比: 4.1。
实施例249
S-{1-[6-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)己基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将11毫克（14微摩尔）中间体F179置于2.2毫升DMF中并加入3.3毫克（27微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌3小时，然后在真空下浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当的馏分并在残留物从乙腈/水中冻干后产生7.3毫克（理论值的58%）无色泡沫形式的标题化合物。
LC-MS (方法4): Rt = 1.04 min；MS (EIpos): m/z = 813 [M+H]+。
实施例250
4-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
将10毫克（0.013毫摩尔）中间体F85和5.3毫克（0.02毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在3毫升DMF中并将该配制品在室温下搅拌3天。然后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分并在真空下蒸发溶剂后，将该残留物溶解在2毫升THF/水1:1中。加入9微升2M氢氧化锂水溶液并将该配制品在室温下搅拌1小时。然后用1M盐酸将该配制品调节至pH ~3，在真空下蒸发溶剂，残留物通过制备型HPLC提纯。这产生3毫克（经2个步骤，理论值的24%）无色泡沫形式的区域异构的受保护中间体。
LC-MS (方法5): Rt = 3.39 min和3.43 min；MS (ESIpos): m/z = 919 (M+H)+。
在最后步骤中，将3毫克（0.0033毫摩尔）这种中间体溶解在3毫升2,2,2-三氟乙醇.中。加入2.2毫升（0.016毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌3.5小时。然后加入4.8毫克（0.016毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生1毫克（理论值的33%）作为43:34的区域异构体混合物的标题化合物。该异构体混合物包含23%的另一异构体(RT =2.51)。
LC-MS (方法5): Rt = 2.57 min和2.62 min；MS (ESIpos): m/z = 775 (M+H)+。
实施例251
S-(1-{2-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙氧基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)
将3毫克（4微摩尔）中间体F248置于2毫升DMF中并加入0.9毫克（8微摩尔）L-半胱氨酸。将反应混合物在室温下搅拌18小时，然后在真空下浓缩。残留物通过制备型HPLC提纯。浓缩适当的馏分并在残留物从乙腈/水中冻干后产生1.1毫克（理论值的32%）白色固体形式的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.78 min；MS (EIpos): m/z = 801 [M+H]+。
实施例252
(3R,7S)-7-氨基-17-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧杂-4,9,15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1:1)
和
(3R,7S)-7-氨基-18-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-3-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-4-乙醇酰-2,2-二甲基-8,16-二氧代-12-氧杂-4,9,15-三氮杂十九烷-19-酸/三氟乙酸(1:1)
将中间体F248的8毫克（0.010毫摩尔）受保护的中间体和5.1毫克（0.02毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在3毫升DMF中并将该配制品在室温下搅拌18小时，然后在超声浴中处理2小时。然后浓缩，残留物通过制备型HPLC提纯。合并适当的馏分并在真空下蒸发溶剂后，将该残留物溶解在2毫升THF/水1:1中。加入15微升2M氢氧化锂水溶液并将该配制品在室温下搅拌15分钟。然后用1M盐酸将该配制品调节至pH ~3，用20毫升氯化钠溶液稀释并用20毫升乙酸乙酯萃取两次。有机相经硫酸镁干燥并浓缩，残留物从乙腈/水中冻干。这产生8.4毫克（经2个步骤，理论值的78%）无色泡沫形式的区域异构的受保护中间体。
LC-MS (方法1): Rt = 1.44 min和3.43 min；MS (ESIpos): m/z = 1107 (M+H)+。
在最后步骤中，将8毫克（0.007毫摩尔）这种中间体溶解在5毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入9.8毫升（0.072毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌1.5小时。然后加入乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸并在真空下蒸发溶剂。残留物通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生4毫克（理论值的59%）作为31:67的区域异构体混合物的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.79 min和0.81 min；MS (ESIpos): m/z = 819 (M+H)+。
实施例253
4-({2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}氨基)-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
和
4-({2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}氨基)-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)
类似于实施例250由中间体F84和N-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸制备异构标题化合物。
实施例254A
在氩气下，将0.029毫克TCEP在50微升PBS缓冲液中的溶液添加到在500微升PBS中的5毫克西妥昔单抗（c=10 mg/ml）中。将该配制品在室温下搅拌30分钟，然后加入溶解在50微升DMSO中的0.264毫克（0.27微摩尔）中间体F254。在室温下搅拌20小时后，用1.9毫升PBS缓冲液稀释该配制品并使用PBS缓冲液经PD 10柱（Sephadex® G-25, GE Healthcare）洗脱。然后通过超离心浓缩，用PBS缓冲液（pH 7.2）再稀释并再浓缩。所得ADC批料表征如下：
蛋白质浓度: 1.74 mg/ml
药物/mAb比: 2.2。
实施例254B
在此，在PBS中的5毫克抗-TWEAKR AK-1（c=10 mg/ml）用于与中间体F254偶联，并如实施例254A中所述进行偶联和后处理。
蛋白质浓度: 1.8 mg/ml
药物/mAb比: 2.5。
实施例254E
在此，在PBS中的5毫克曲妥珠单抗（c=10 mg/ml）用于与中间体F254偶联，并如实施例254A中所述进行偶联和后处理。
蛋白质浓度: 1.74 mg/ml
药物/mAb比: 2.4。
实施例254I
在此，在PBS中的5毫克尼妥珠单抗（c=10 mg/ml）用于与中间体F254偶联，并如实施例254A中所述进行偶联和后处理。
蛋白质浓度: 1.73 mg/ml
药物/mAb比: 2.0。
实施例255
(2R,28R)-28-氨基-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-25-(羧甲基)-4,20,24-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-26-硫杂-3,19,23-三氮杂二十九烷-1,29-二酸/三氟乙酸(1:2)和
(1R,28R,34R)-1-氨基-33-(3-氨基丙基)-34-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-35,35-二甲基-6,10,26,32-三氧代-14,17,20,23-四氧杂-3,30-二硫杂-7,11,27,33-四氮杂三十六烷-1,4,28-三甲酸/三氟乙酸(1:2)
将20毫克（0.018毫摩尔）R-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-N-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-L-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)（中间体F209）和9.78毫克（0.036毫摩尔）N-{[2-(三甲基甲硅烷基) 乙氧基]羰基}-L-半胱氨酸溶解在2毫升DMF中并将该配制品在室温下搅拌18小时。该反应混合物在真空下蒸发。将残留物（47.7毫克）溶解在3毫升THF/水1:1中。加入0.08毫升2M氢氧化锂水溶液并将该配制品在室温下搅拌1小时。然后使用9.26毫克（0.15毫摩尔）乙酸将该配制品调节至pH ~7。该反应混合物直接通过制备型RP-HPLC提纯（柱: Reprosil 125x30；10µ, 流速: 50ml/min, MeCN/水；0.1% TFA）。在真空下蒸发溶剂，残留物在高真空下干燥。这产生15.3毫克（经2个步骤，29%）区域异构的受保护中间体。
LC-MS (方法6): Rt = 12.26 min和12.30 min；MS (ESIpos): m/z = 1254 (M+H)+。
在最后步骤中，将15.3毫克（0.01毫摩尔）这种中间体溶解在2毫升2,2,2-三氟乙醇中。加入6.1毫升（0.05毫摩尔）氯化锌并将该配制品在50℃下搅拌2小时。然后加入13.1毫克（0.05毫摩尔）乙二胺-N,N,N',N'-四乙酸，该溶剂通过制备型HPLC提纯。适当馏分的浓缩和残留物从乙腈/水中冻干后产生11.9毫克（79.5%）作为区域异构体混合物的标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.85 min；MS (ESIpos): m/z = 1110 (M+H)+。
实施例256
(3R)-6-{(11S,15R)-11-氨基-15-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-14-乙醇酰-16,16-二甲基-2,5,10-三氧代-3,6,9,14-四氮杂十七烷-1-基}-5-氧代硫代吗啉-3-甲酸/三氟乙酸(1:1)
将4毫克（0.004毫摩尔）来自实施例135的化合物溶解在4毫升THF/水中并加入48微升2摩尔浓度的氢氧化锂水溶液。将该配制品在室温下搅拌1小时，然后浓缩并通过制备型HPLC提纯。适当馏分的合并、浓缩和从乙腈/水中冻干后产生2.4毫克（理论值的60%）标题化合物。
LC-MS (方法1): Rt = 0.86 min；MS (EIpos): m/z = 814 [M+H]+。
C: 生物效力的评估
可以在下述检测中显示本发明的化合物的生物作用：
m. C-1a抗TWEAKR的ADC的细胞毒性作用的测定
用各种细胞系进行抗-TWEAKR-ADC的细胞毒性作用的分析：
NCI-H292: 人粘液表皮样肺癌细胞，ATCC-CRL-1848，标准培养基: RPMI 1640(Biochrom；#FG1215, 稳定化的（stab.）谷氨酰胺) + 10% FCS (Biochrom；#S0415),TWEAKR阳性, EGFR阳性。
BxPC3: 人胰腺癌细胞，ATCC-CRL-1687，标准培养基: RPMI 1640 (Biochrom；#FG1215, 稳定化的谷氨酰胺) + 10% FCS (Biochrom；#S0415), TWEAKR阳性。
KPL4: 人乳腺癌细胞，标准培养基: RPMI 1640 + GlutaMAX I + 10% FBS, 细胞库, Bayer Pharma AG (在2012.7.19在DSMZ上核查和证实身份), Berlin, ERBB2阳性。
细胞通过如American Tissue Type Collection (ATCC)中对各自细胞系所示的标准方法培养。
MTT检测
通过用Accutase在PBS中的溶液（Biochrom AG #L2143）将细胞分离、造粒、再悬浮在培养基中、计数并播种到白底96孔培养板（Costar #3610）中（根据所用细胞，1000-2000个细胞，100 µl/孔）并在培养器中在37℃和5%二氧化碳下培养，进行该试验。在48小时后，该抗体活性物质偶联物在10微升培养基中以10-5M至10-13M的浓度添加到细胞中（一式三份）并在培养器中在37℃和5%二氧化碳下培养。在72小时后，使用MTT检测法（ATCC, Manassas,Virginia, USA, 目录号No. 30-1010K）检测增殖。在所选培养时间结束后，该MTT试剂用细胞培养4小时，接着通过添加洗涤剂将细胞裂解整夜。在570纳米下检测形成的染料。没有用试验物质处理但在其它方面相同处理的细胞的增殖被定义为100%数值。
CTG检测
细胞根据标准方法使用C-1下所列的培养基培养。通过用胰蛋白酶（0.05%）和EDTA（0.02%）在PBS中的溶液（Biochrom AG #L2143）将细胞分离、造粒、再悬浮在培养基中、计数并播种到白底96孔培养板（Costar #3610）中（75 µl/孔，每孔下列细胞数：NCI-H292: 2500个细胞/孔，BxPC3 2500个细胞/孔）并在培养器中在37℃和5%二氧化碳下培养，进行该试验。在24小时后，将抗体活性物质偶联物在25微升培养基中（浓缩四倍）添加到细胞中以提供在细胞上3 x 10-7 M至3 x 10-11 M的最终抗体活性物质偶联物浓度（一式三份）。该细胞然后在培养器中在37℃和5%二氧化碳下培养。在平行板上，使用Cell Titer Glow (CTG)发光细胞活力检测（Promega #G7573和#G7571）测定在活性物质处理开始时（第0天）的细胞活力。为此，每细胞批料加入100微升底物，然后用铝箔覆盖该板，在板振荡仪上以180 rpm振荡2分钟，使其在实验工作台上静置8分钟，然后使用光度计（Victor X2, Perkin Elmer）测量。该底物检测生成发光信号的活细胞的ATP含量，该发光信号的强度与细胞的活力成正比。在用抗体活性物质偶联物培养72小时后，然后也使用如上所述的Cell Titer Glow发光细胞活力检测法测定这些细胞的活力。由测得的数据，使用DRC (剂量响应曲线)分析电子表格和4参数拟合与第0天比较计算生长抑制的IC50。该DRC分析电子表格是Bayer PharmaAG和Bayer Business Services在IDBS E-WorkBook Suite平台上开发的Biobook电子表格（IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK）。
下表1a、1b和1c列出来自这一检测的使用抗-TWEAKR抗体的代表性实施例的IC50值：
。
所示作用数据涉及本实验部分中描述的实施例，示出药物/mAb比。在不同的药物/mAb比下，这些数值任选偏离。IC50值是几个独立实验的平均值或独立值。该TWEAKR抗体/活性物质偶联物的作用对包含各自的连接体和毒簇的各自同型对照物是选择性的。
下表2列出来自MTT检测的使用西妥昔单抗抗体的代表性实施例的IC50值：
。
所示作用数据涉及本实验部分中描述的实施例，示出药物/mAb比。在不同的药物/mAb比下，这些数值任选偏离。IC50值是几个独立实验的平均值或独立值。该西妥昔单抗抗体/活性物质偶联物的作用对包含各自的连接体和毒簇的各自同型对照物是选择性的。
下表3列出来自MTT检测的使用曲妥珠单抗抗体的代表性实施例的IC50值：
。
所示作用数据涉及本实验部分中描述的实施例，示出药物/mAb比。在不同的药物/mAb比下，这些数值任选偏离。IC50值是几个独立实验的平均值或独立值。该曲妥珠单抗抗体/活性物质偶联物的作用对包含各自的连接体和毒簇的各自同型对照物是选择性的。
C-1b 所选实施例对纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5的抑制的测定
人纺锤体驱动蛋白KSP/Eg5（来自tebu-bio/Cytoskeleton Inc, No. 027EG01-XL）的马达结构域在15 mM PIPES, pH 6.8（5 mM MgCl2和10mM DTT，来自Sigma）中以10 nM的浓度用50 µg/ml紫杉醇（来自Sigma No. T7191-5MG）稳定的微管蛋白（牛或猪，来自tebu-bio/Cytoskeleton Inc）在室温下培养5分钟。将新鲜制备的混合物等分到384孔MTP中。然后加入1.0 x 10-6 M至1.0 x 10-13 M浓度的待检查的抑制剂和ATP（最终浓度500 µM，来自Sigma）。在室温下培养2小时。通过检测使用孔雀绿（来自Biomol）形成的无机磷酸盐，检测ATPase活性。在添加该试剂后，在检测在620纳米波长下的吸收之前在室温下培养50分钟。使用Monastrol和Ispinesib（来自Adooq A10486）作为阳性对照。剂量-作用曲线的各数据是八倍测定。IC50值是3个独立实验的平均值。100%对照是未用抑制剂处理的样品。
下表4概括来自所述检测的代表性实施例的IC50值：它们以示例性方式证实所述毒簇和ADC代谢物在靶处的高效力。
所示作用数据涉及本实验部分中描述的实施例。
C-2 内化检测
内化是能经抗体药物偶联物（ADC）实现在表达抗原的癌细胞中特异性和有效地提供细胞毒性有效载荷的关键过程。经由特异性TWEAKR抗体和同型对照抗体（M014）的荧光标记监测这一过程。首先，使荧光染料偶联到抗体的赖氨酸上。使用两倍摩尔过量的CypHer 5E单NHS酯（Batch 357392, GE Healthcare）在pH 8.3下进行偶联。在该偶联后，该反应混合物在4℃下渗析（sSlide-A-Lyser Dialysis Cassettes MWCD 10kD，来自Pierce）整夜以除去过量染料和调节pH，然后浓缩蛋白质溶液（VIVASPIN 500，来自Sartorius stedimbiotec）。通过分光光度分析（来自NanoDrop）和随后的计算（D: P = A染料ε蛋白质:(A280-0.16A染料)ε染料）测定抗体的染料载荷。在此检查的TWEAKR抗体和同型对照物的染料载荷为相当量级。在细胞结合检测中，证实该偶联不会造成抗体亲和力变化。
该标记的抗体用于内化检测。在处理开始前，将细胞（2 x 104/孔）播种在96孔MTP（厚，黑色，透明底No 4308776，来自Applied Biosystems）中的100微升培养基中。在37℃/5%CO2下培养18小时后，更换培养基并以不同浓度（10、5、2.5、1、0.1 µg/ml）加入标记的抗-TWEAKR抗体。对标记的同型对照物（阴性对照物）采用相同处理程序。所选培养时间为0、0.25小时、0.5小时、1小时、1.5小时、2小时、3小时、6小时和24小时。使用InCellanalyser1000（来自GE Healthcare）进行荧光测量。此后经由参数颗粒计数/细胞和总颗粒强度/细胞的测量进行动力学评估。
在结合到TWEAKR上后，检查TWEAKR抗体的内化能力。为此，选择具有不同TWEAKR表达水平的细胞。用TWEAKR抗体可以观察靶介导的特异性内化，而同型对照物没有表现出内化。
C-3 用于测定细胞通透性的体外试验
可以借助使用Caco-2细胞的通量检测中的体外试验研究物质的细胞通透性 [M.D.Troutman和D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]。为此，细胞在24孔过滤板上培养15-16天。为了测定渗透，将各受试物质在HEPES缓冲液中在顶部(A)或基部(B)施加到细胞上并培养2小时。在0小时后和在2小时后，从顺式和反式隔室中取样。使用反相柱通过HPLC（Agilent 1200, Böblingen, 德国）分离样品。该HPLC系统经Turbo IonSpray接口耦合到三重四极质谱仪API 4000（Applied Biosystems Applera, Darmstadt,德国）上。基于使用Schwab等人[D. Schwab等人, J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]公开的公式计算出的Papp值评估通透性。当Papp (B-A)与Papp (A-B)的比率（外排率）>2或<0.5时，物质被归类为主动转运。
对细胞内释放的毒簇而言至关重要的是从B到A的通透性 [Papp (B-A)]和Papp (B-A)与Papp (A-B)的比率（外排率）：这种通透性越低，该物质穿过Caco-2细胞的单层的主动和被动转运过程越慢。如果外排率另外没有指示任何主动转运，该物质在细胞内释放后可在细胞中停留更久。因此，也有更多时间可供与生物化学靶（在这种情况下：纺锤体驱动蛋白,KSP/Eg5）相互作用。
下表5列出来自这一检测的代表性实施例的通透性数据：
。
C-4用于测定P-糖蛋白(P-gp)的底物性质的体外试验
许多肿瘤细胞表达用于活性物质的转运蛋白，这通常伴随着对细胞生长抑制剂的抗药性发展。不是此类转运蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）或BCRP的底物的物质因此可表现出改进的作用状况。
借助使用过表达P-gp的LLC-PK1细胞（L-MDR1细胞）的通量检测法测定物质用于P-gp（ABCB1）的底物性质 [A.H. Schinkel等人, J. Clin. Invest. 96, 1698-1705(1995)]。为此，LLC-PK1细胞或L MDR1细胞在96孔过滤板上培养3-4天。为了测定渗透，将各受试物质独自或在抑制剂（例如伊维菌素或维拉帕米）存在下在HEPES缓冲液中在顶部(A)或基部(B)施加到细胞上并培养2小时。在0小时后和在2小时后，从顺式和反式隔室中取样。使用反相柱通过HPLC分离样品。该HPLC系统经Turbo Ion Spray接口耦合到三重四极质谱仪API 3000（Applied Biosystems Applera, Darmstadt, 德国）上。基于使用Schwab等人[D. Schwab等人, J. Med. Chem. 46, 1716-1725 (2003)]公开的公式计算出的Papp值评估通透性。当Papp (B-A)与Papp (A-B)外排率>2时，物质被归类为P-gp底物。
作为用于评估P-gp底物性质的其它标准，可以比较L-MDR1和LLC-PK1细胞中的外排率或在存在或不存在抑制剂的情况下的外排率。如果这些值相差大于2倍，所涉物质是P-gp底物。
C-5药代动力学
C5a: 体外内化后的ADC代谢物的鉴定
该方法的描述：
用免疫偶联物进行内化研究以分析细胞内形成的代谢物。为此，将人肺肿瘤细胞NCIH292（3x105/孔）播种在6孔板中并培养整夜（37℃，5% CO2）。用10 µg/ml待查验的ADC处理。在37℃和5% CO2下进行内化。在各种时间点（0、4、24、48、72小时），提取细胞样品以供进一步分析。首先，收取上清液（大约5毫升）并在离心（2分钟，RT，1000 rpm Heraeus Variofuge3.0R）后，储存在-80℃。细胞用PBS洗涤并用Accutase分离，测定细胞数。在另一次洗涤后，向指定数量的细胞（2 x 105）加入100微升裂解缓冲液（Mammalian Cell Lysis Kit(Sigma MCL1)）并在Protein LoBind管（eppendorf 目录号 0030 108.116）中在连续振荡（温匀仪, 15 min, 4℃, 650 rpm）下培养。在培养后，将该裂解液离心（10 min, 4℃,12000 g，eppendorf 5415R）并收取上清液。将所得上清液储存在–80℃。然后如下分析所有样品。
在用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后通过高压液相色谱法（HPLC）-三重四极质谱仪（MS）联用进行培养上清液或细胞裂解液中的化合物的测量。
对于50微升培养上清液/细胞裂解液的后处理，向其中加入150微升沉淀试剂（通常乙腈）并振荡10秒。沉淀试剂含有合适浓度（通常20-100 ng/ml）的内标（ISTD）。在以16000 g离心3分钟后，将上清液转移到自动取样瓶中，用500微升适用于该洗脱剂的缓冲液补充并再振荡。
最后使用与来自AB SCIEX Deutschland GmbH的三重四极质谱仪API6500联用的HPLC测量这两种基质样品。
为了校准，将0.5–2000 µg/l的浓度添加到血浆样品中。检出限（LOQ）为大约2 µg/l。该线性范围从2延伸至1000 µg/l。
为了校准该肿瘤样品，将0.5–200 µg/l的浓度添加到未处理的肿瘤的上清液中。检出限为4 µg/l。该线性范围从4延伸至200 µg/l。
用于测试有效性的品质对照物（Qualitätskontrollen）含有5和50 µg/l。
NCI-H292细胞在每种情况下用10 µg/ml的来自实施例104b、119b、155b、165b和173b的ADC培养。在72小时后，用PBS洗涤该细胞，裂解并深冻（-80℃）。使用上述方法，后处理细胞裂解液和细胞培养上清液并在提取后鉴定和量化下列代谢物：
。
NCI-H292细胞在每种情况下用10 µg/ml的来自实施例179a、226a、85b和208b的ADC培养。在72小时后，用PBS洗涤该细胞，裂解并深冻（-80℃）。使用上述方法，后处理细胞裂解液和细胞培养上清液并在提取后鉴定和量化下列代谢物：
。
C5b: 体内ADC代谢物的鉴定
在3-30 mg/kg不同ADC的静脉给药后，可以测量ADC和可能出现的代谢物的血浆和肿瘤浓度并可以计算药代动力学参数，如清除率（CL）、曲线下面积（AUC）和半衰期（t1/2）。
用于量化可能出现的代谢物的分析
在用甲醇或乙腈沉淀蛋白质后通过高压液相色谱法（HPLC）-三重四极质谱仪（MS）联用进行血浆和肿瘤中的化合物的测量。
对于50微升血浆的后处理，向其中加入250微升沉淀试剂（通常乙腈）并振荡10秒。沉淀试剂含有合适浓度（通常20-100 ng/ml）的内标（ISTD）。在以16000 g离心3分钟后，将上清液转移到自动取样瓶中，用500微升适用于该洗脱剂的缓冲液补充并再振荡。
在肿瘤的后处理过程中，将其用3倍量的提取缓冲液处理。该提取缓冲液含有50毫升组织蛋白提取剂（Pierce, Rockford, IL）、两个Complete-Protease-Inhibitor-Cocktail丸粒（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, 德国）和1 mM最终浓度的苯基甲基磺酰氟（Sigma, St. Louis, MO）。该样品在组织研磨器II (Qiagen)中在最大往返数下匀浆两次20分钟。将50微升匀浆转移到自动取样瓶中并用包括ISTD的150微升甲醇补充。在以16000 g离心3分钟后，10微升上清液用180微升适用于该洗脱剂的缓冲液补充并再振荡。该肿瘤样品随之准备好测量。
最后使用与来自AB SCIEX Deutschland GmbH的三重四极质谱仪API6500联用的HPLC测量这两种基质样品。
为了校准，将0.5–2000 µg/l的浓度添加到血浆样品中。检出限（LOQ）为大约2 µg/l。该线性范围从2延伸至1000 µg/l。
为了校准该肿瘤样品，将0.5–200 µg/l的浓度添加到未处理的肿瘤的上清液中。检出限为5 µg/l。该线性范围从5延伸至200 µg/l。
用于测试有效性的品质对照物含有5和50 µg/l，在血浆中另外为500 µg/l。
在来自具有NCI-H292的异种移植模型的对照组中给予10 mg/kg来自实施例119b和104b的ADC后，在24小时后处死小鼠，取出血液并分离肿瘤。使用上述方法，后处理血浆和肿瘤样品并在提取后鉴定和量化下列代谢物：
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用于量化所用抗体的分析
使用配体结合检测法（ELISA）作为血浆样品和肿瘤裂解液中的总IgG浓度测定ADC的抗体含量。在此，使用夹心ELISA格式。这种ELISA已被确认和验证用于血浆和肿瘤样品中的测定。用山羊的抗人IgG Fc抗体涂覆ELISA板。在用样品培养后，洗涤该板并用猿猴的抗人IgG(H+L)抗体和辣根过氧化物酶（HRP）的检测偶联物培养。在进一步洗涤步骤后，将HRP底物添加到OPD中并通过在490纳米的吸收监测显色。使用4参数方程拟合具有已知IgG浓度的标准样品。在定量下限（LLOQ）和上限（ULOQ）内，通过插值法测定未知浓度。
C-6体内效力试验
例如使用异种移植模型测试本发明的偶联物的效力。本领域技术人员熟悉现有技术中的能够测试本发明的化合物的效力的方法（参见例如WO 2005/081711；Polson等人,Cancer Res. 2009年3月15日；69(6):2358-64）。为此，将表达该结合体的靶分子的肿瘤细胞系移植到啮齿动物（例如小鼠）中。然后将本发明的偶联物、同型抗体对照偶联物、对照抗体或等渗盐水给药于移植动物。给药进行一次或多次。在几天的培养时间后，通过比较偶联物治疗的动物和对照组，测定肿瘤尺寸。偶联物治疗的动物表现出较小的肿瘤尺寸。
C-6a. 小鼠中的实验肿瘤的生长抑制/消退
将表达抗体活性物质偶联物的抗原的人肿瘤细胞皮下接种到免疫抑制小鼠，例如NMRi裸鼠或SCID小鼠的侧腹中。从细胞培养物中分离1百万-1千万个细胞，离心并再悬浮在培养基或培养基/基质胶中。在小鼠的皮肤下注入该细胞悬浮液。
在几天内，肿瘤生长。在肿瘤建立后（大约40 mm²的肿瘤尺寸）开始治疗。为了检查对较大肿瘤的作用，可以在50-100 mm²的肿瘤尺寸后才开始治疗。
通过静脉注入小鼠尾静脉中的途径进行ADC治疗。ADC以5 ml/kg的体积给药。
治疗程序取决于抗体的药代动力学。作为标准，治疗每四天连续进行三次。为了快速评定，可以使用单次治疗程序。但是，该治疗也可以继续或可以在稍后接着第二个3治疗日循环。
作为标准，每治疗组使用8个动物。除给予活性物质的组外，一组根据相同程序作为仅使用缓冲液的对照组对待。
在实验过程中，使用卡尺在两个维度（长度/宽度）上定期测量肿瘤面积。作为长度x 宽度测定肿瘤面积。将治疗组与对照组的平均肿瘤面积比指定为T/C面积。
当在治疗结束后所有实验组同时终止时，可以除下肿瘤并称重。将治疗组与对照组的平均肿瘤重量比指定为T/C重量。
C-6b. 在重复治疗时抗-EGFR抗体活性物质偶联物在NCI-H292肿瘤模型中的效力
将1百万NCI-H292细胞皮下接种到雌性NMRI裸小鼠（Janvier）的侧腹中。在第7天35 mm²的肿瘤尺寸下，以3或10 mg/kg的剂量经静脉开始治疗（第7、11、15天）。在该治疗后，监测肿瘤生长直至第105天。
用根据实施例01a和02a的抗体活性物质偶联物的治疗导致与赋形剂和同型对照组相比肿瘤生长的显著抑制。一开始与剂量无关，大多数肿瘤消退。表6显示在第35天经肿瘤面积测得的T/C面积值。用对照偶联物（抗不相关抗原的同型抗体）治疗造成明显较弱的肿瘤生长抑制作用。用未偶联的抗体的治疗同样造成生长抑制；但是，这弱于抗体活性物质 偶联物的情况。
C-6c. 在单次治疗时抗-EGFR抗体活性物质偶联物在NCI-H292肿瘤模型中的效力
将1百万NCI-H292细胞皮下接种到雌性NMRI裸小鼠（Janvier）的侧腹中。在第9天~37mm²的肿瘤尺寸下，用3 mg/kg ADC或2.5 mg/kg毒簇A（N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺）或毒簇B（N-[(3R)-3-氨基-4-氟丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺）的剂量经静脉治疗一次。在该治疗后，监测肿瘤生长直至第25天。
用根据实施例35A和02A的抗体活性物质偶联物的治疗导致与对照组相比肿瘤生长的显著抑制。在用3 mg/kg治疗的过程中，大多数肿瘤消退。表7显示在第25天对肿瘤重量和肿瘤面积测得的T/C值。在此，抗体活性物质偶联物35A表现出比西妥昔单抗和比毒簇A或毒簇B更好的效力。
C-6d. 在单次治疗时抗-EGFR和抗-TWEAKR抗体活性物质偶联物在NCI-H292肿瘤模型中的效力
将1百万NCI-H292细胞皮下接种到雌性NMRI裸小鼠（Janvier）的侧腹中。在第7天~37mm²的肿瘤尺寸下，以3或10 mg/kg抗体活性物质偶联物的剂量经静脉进行治疗一次。在该治疗后，监测肿瘤生长直至第24天。
用抗-TWEAKR抗体活性物质偶联物02B的单次治疗导致与对照组和未偶联的抗-TWEAKR抗体相比肿瘤生长的显著和持久抑制。表8显示在第24天对肿瘤重量和肿瘤面积测得的T/C值。
C-6e. 在多次治疗时抗-TWEAKR抗体活性物质偶联物在BxPC3肿瘤模型中的效力
将2百万BxPC3细胞皮下接种到雌性NMRI裸小鼠（Janvier）的侧腹中。在第10天45 mm²的肿瘤尺寸下，以10 mg/kg的剂量经静脉开始治疗（第10、14、18天）。在该治疗后，监测肿瘤生长直至第42天。
用根据实施例07B、08B、12B、15B和46B的抗体活性物质偶联物的治疗导致与对照组相比肿瘤生长的显著抑制。表9显示在第42天对肿瘤重量和肿瘤面积测得的T/C值。用各自的对照偶联物（抗不相关抗原的同型抗体）的治疗造成明显较弱的肿瘤生长抑制作用。用未偶联的抗体的治疗同样造成在一些情况下较弱的肿瘤生长抑制。
C-6f. 在单次治疗时抗-TWEAKR抗体活性物质偶联物在NCI-H292肿瘤模型中的效力（2个独立实验）
在这两个实验中，都将1百万NCI-H292细胞皮下接种到雌性NMRI裸小鼠（Janvier）的侧腹中。在第10天（实验1）或第8天（实验2）~45 mm²肿瘤尺寸下，以3 mg/kg抗体活性物质偶联 物的剂量经静脉进行治疗一次。在该治疗后，监测肿瘤生长直至第18天（实验1）或第24天（实验2）。
在实验1中用抗-TWEAKR抗体活性物质偶联物02B、07B和08B的单次治疗导致与对照组和未偶联的抗-TWEAKR抗体相比肿瘤生长的显著抑制。表10（实验1）显示在第18天对肿瘤重量和肿瘤面积测得的T/C值。在实验2中用抗-TWEAKR抗体活性物质偶联物155B、173B、165B和085B的单次治疗同样导致与对照组和各自的同型对照物（未显示）相比肿瘤生长的显著抑制。表11（实验2）显示在第24天对肿瘤面积测得的T/C值。
C-6g. 在多次治疗时抗-TWEAKR抗体活性物质偶联物在A375肿瘤模型中的效力
将5百万A375（人黑素瘤）细胞皮下接种到雌性NMRI裸小鼠（Janvier）的侧腹中。在第10天41 mm²的肿瘤尺寸下，以10 mg/kg的剂量经静脉开始治疗（第10、14、18天）。在该治疗后，监测肿瘤生长直至第22天。
用根据实施例38B和104B的抗体活性物质偶联物的治疗导致与对照组相比肿瘤生长的显著抑制。表10显示在第22天对肿瘤重量和肿瘤面积测得的T/C值。用各自的对照偶联物（抗不相关抗原的同型抗体）的治疗造成明显较弱的肿瘤生长抑制作用。用未偶联的抗体的治疗同样造成在一些情况下较弱的肿瘤生长抑制。
C-6h. 在多次治疗时抗-TWEAKR抗体活性物质偶联物在LoVo肿瘤模型中的效力
将5百万LoVo（人结肠癌）细胞皮下接种到雌性NMRI裸小鼠（Janvier）的侧腹中。在第7天43 mm²的肿瘤尺寸下，以10 mg/kg的剂量经静脉开始治疗（第7、11、15天）。在该治疗后，监测肿瘤生长直至第45天。
用根据实施例07B、87B和104B的抗体活性物质偶联物的治疗导致与对照组相比肿瘤生长的显著抑制。表11显示在第45天对肿瘤重量和肿瘤面积测得的T/C值。用07B的对照偶联物（抗不相关抗原的同型抗体）的治疗造成明显较弱的肿瘤生长抑制作用。
D. 药物组合物的实施例
本发明的化合物可如下转化成药物制剂：
静脉溶液:
将本发明的化合物以低于饱和溶解度的浓度溶解在生理可接受的溶剂（例如等渗盐水溶液、D-PBS 或在添加了聚山梨酯80的柠檬酸盐缓冲液中含甘氨酸和氯化钠的制剂）中。对该溶液施以无菌过滤并分配到无菌和无热原的注射容器中。
静脉溶液:
可以将本发明的化合物转化成所提到的给药形式。这可以以本身已知的方式通过与惰性、无毒、可药用辅助剂（例如缓冲物质、稳定剂、增溶剂、防腐剂）“混合”或“溶解在其中”实现。可能例如含有下列：氨基酸（甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯基丙氨酸等）、糖和相关化合物（葡萄糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖、乳糖、山梨糖醇）、甘油、钠盐、钾、铵盐和钙盐（例如氯化钠、氯化钾或磷酸氢二钠和许多其它）、乙酸盐/乙酸缓冲体系、磷酸盐缓冲体系、柠檬酸和柠檬酸盐缓冲体系、氨基丁三醇（TRIS和TRIS盐）、聚山梨酯（例如聚山梨酯80和聚山梨酯20）、泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188和泊洛沙姆171）、聚乙二醇（PEG衍生物，例如3350）、Triton X-100、EDTA盐、谷胱甘肽、白蛋白（例如人）、脲、苄醇、酚、氯甲酚、间甲酚、苯扎氯铵和许多其它。
用于随后转化成静脉、皮下或肌肉溶液的冻干产物:
或者，可以将本发明的化合物转化成稳定的冻干产物（可能借助上述辅助剂）并在给药前，用合适的溶剂（例如注射级水、等渗盐水溶液）重构并给药。
抗-TWEAKR抗体的实施例
除非本文中详细描述，所有实施例使用本领域技术人员已知的标准方法进行。可以如标准实验室教材，如Sambrook等人, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989中所述进行下列实施例的分子生物学的常规方法。
AK实施例1: 使用抗体库的抗体制备
利用完整人噬菌体展示库（Hoet RM等人, Nat Biotechnol 2005；23(3):344-8）通过蛋白质筛选分离本发明的TWEAKR特异性人单克隆抗体（Hoogenboom H.R., NatBiotechnol 2005；23(3):1105-16），其中作为靶固定人和鼠TWEAKR的二聚Fc融合胞外域。
该抗原使用大约2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS（Pierce；目录号 21347）根据制造商的指示生物素化并使用Zeba脱盐柱（Pierce；目录号 89889）脱盐。洗过的磁珠（DynaBeads）在4℃下用200 nM生物素化人抗原培养整夜并用封闭缓冲液（含3% BSA,0.05% Tween-20的PBS）在4℃下封闭1小时。将封闭的Fab噬菌体库添加到封闭的TWEAKR珠（DynaBeads链霉亲和素-M280 - Invitrogen 112-06D）中并在室温下培养30分钟。在严格洗涤（3 x用封闭缓冲液和9 x用PBS（150 mM NaCl；8 mM Na2HPO4；1.5 mM KH2PO4；调节至pH = 7.4-7.6），含0.05% Tween-20）后，将特异性结合到生物素化TWEAKR珠（DynaBeads链霉亲和素- M280 - Invitrogen 112-06D）上的Fab噬菌体再悬浮在PBS中并为了扩增，直接用于感染大肠杆菌菌株TG1。在第二选择回合中，使用两种鼠TWEAKR（200 nM）以选择交叉反应性结合体，并在第三选择回合中，降低人TWEAKR的浓度（100 nM）以提高对高亲和力结合体的选择压力。
识别11种不同的Fab噬菌体并将相应的抗体克隆到提供可溶性FAb中不存在的缺失CH2-CH3结构域的哺乳动物EgG表达载体中。所得IgG如Tom等人, Methods Express中的第12章: Expression Systems，Micheal R. Dyson和Yves Durocher编辑, ScionPublishing Ltd, 2007中所述在哺乳动物细胞中短暂表达。简短地，将基于CMV启动子的表达质粒转染到HEK293-6E细胞中并在Fernbach瓶或Wave袋中培养。在F17培养基(Invitrogen)中在37℃下进行表达5至6天。在转染后24小时作为补充剂加入1% Ultra-LowIgG FCS (Invitrogen)和0.5 mM丙戊酸(Sigma)。该抗体通过蛋白质-A色谱法纯化并如AK-实施例2中所述使用ELISA和BIAcore分析通过它们与可溶性单体TWEAKR的结合亲和力进一步表征。
为了测定抗-TWEAKR抗体的细胞结合特征，通过流式细胞术检查与许多细胞系（HT29、HS68、HS578）的结合。将细胞悬浮在抗体(5 µg/ml)在FACS缓冲液中的稀释液中并在冰上培养1小时。然后加入第二抗体（PE山羊-抗人IgG, Dianova #109-115-098）。在冰上培养1小时后，使用FACS阵列（BD Biosciences）通过流式细胞术分析细胞。
进行NF-κB报告基因检测以评定识别的所有11种抗体（人IgG1）的激动活性。HEK293细胞使用293fectin根据制造商的指示用NF-κB报告基因构建体（BioCat, 目录号LR-0051-PA）短暂转染。将转染细胞在37C、5% CO2下在F17培养基（无血清；Invitrogen）中播种到白色聚赖氨酸涂覆的384孔板（BD）中。第二天，该细胞用各种浓度的纯化抗体刺激6小时，然后使用标准方法进行荧光素酶检测。
经由抗-TWEAKR抗体（CypHer 5E单NHS酯；GE Healthcare）的荧光标记监测内化。在处理前，将HT29细胞（2 x 104/孔）播种在96孔MTP板（厚，黑色，透明底No 4308776，Applied Biosystems）中的100微升培养基中。在37℃/5%CO2下培养18小时后，更换培养基并以不同浓度（10、5、2.5、1、0.1 µg/ml）加入标记的抗-TWEAKR抗体。所选培养时间为0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、6和24小时。在InCell-analyser 1000（GE Healthcare）进行荧光测量。
选择具有最高体外效力的抗体（TPP-883）进行进一步的效力和亲和力成熟化。
TPP-883的轻链（SEQ ID NO.71）和重链（SEQ ID NO.72）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
在第一突变收集回合中进行成熟化，接着重组最提高亲和力和效力的那些氨基酸修饰。为了收集突变NNK（N = AGCT，K = G或T），使用包括NNK密码子多样化（连续氨基酸命名，参见图25）的合成寡核苷酸通过定点诱变在下列独立氨基酸位置进行随机化：CDR-L1中的S35、S36、Y37和N39；CDR-L2中的A51、S53、S54、Q56和S57；CDR-L3中的S92、Y93、S94、S95、G97和I98；CDR-H1中的P31、Y32、P33、M34和M35；CDR-H2中的Y50、S52、P53、S54、G56、K57和H59；CDR-H3中的G99、G100、D101、G102、Y103、F104、D105和Y106。将所有独立NNK饱和诱变库的DNA克隆到用于效力成熟化的哺乳动物IgG表达载体中或克隆到用于亲和力成熟化的噬菌粒载体上。通过噬菌体筛选进行亲和力成熟化。洗过的磁珠（DynaBeads）在4℃下用10nM、1 nM、100 pM或10 pM生物素化人抗原培养整夜并用封闭缓冲液（含3% BSA, 0.05%Tween-20的PBS）在4℃下封闭1小时。将封闭的Fab噬菌体库以与理论库复杂性（Bibliothekkomplexität）相比10000倍、1000倍和100倍过量添加到封闭的TWEAKR-DynaBeads中并在室温下培养30分钟。这意味着总共遵循12种策略（4种抗原浓度 x 3种Fab噬菌体滴度）。在严格洗涤（3 x用封闭缓冲液和9 x用含0.05% Tween-20的PBS）后，将特异性结合到生物素化TWEAKR DynaBeads（DynaBeads链霉亲和素- M280 - Invitrogen 112-06D）上的Fab噬菌体再悬浮在PBS中并为了扩增，直接用于感染大肠杆菌菌株TG1。在选择回合2中，降低人TWEAKR-Fc的浓度（1 nM、100 pM、10 pM和1 pM）并对所有12种策略使用相同的Fab噬菌体滴度（4.4 x 1011）。为了表达可溶性Fab，该噬菌粒载体用MluI消化以除去在噬菌体上展示Fab所需的基因-III膜锚定序列，并重新连接。这12个选择池各96个变体作为可溶性Fab表达并在ELISA格式中检查。为此，抗原涂覆2.5 nM生物素化TWEAKR-Fc，并使用抗-c-Myc抗体（Abcam ab62928）验证可溶性Fab的结合。验证具有改进的与TWEAKR-Fc（Seq IDNo 138）的结合的7种单取代变体（连续氨基酸命名，参见图25）：CDR-L1的S36G、CDR-L2的A51Q和S57K、CDR-L3的S94T和G97F、CDR-H1的M35I和CDR-H3的G102T。对于效力成熟化，用NF-κB报告基因（BioCat, 目录号 LR-0051-PA）转染HEK293细胞。将转染的细胞在F17培养基（无血清；Invitrogen）中播种到白色聚赖氨酸涂覆的384孔板（BD）中，并在哺乳动物细胞中短暂表达NNK多样化的位置抗体（人IgG1）库的独立变体。第二天，NF-κB报告基因细胞用表达的独立NNK抗体变体刺激6小时，然后使用标准方法进行荧光素酶检测。检测到1种具有改进的激动活性的单取代变体：CDR-H3的G102T。也通过亲和力成熟化获得这种变体，并也表现出亲和力的最高增强。在通过亲和力和效力筛选收集突变后，将所有7种有利的单取代（库复杂性：128种变体）重组成重组库。为此，合成寡核苷酸以在各所选位置引入所选突变或相应的野生型氨基酸。使用“重叠延伸PCR”的相继回合建立该库。将最后PCR产物连接到细菌可溶性Fab表达载体中，并随机选择528种变体（所取样品的~ 4倍过量）进行如上所述的使用可溶性Fab的平衡ELISA筛选。最后，基于与最佳单取代变体G102T相比提高的亲和力选择7种变体。将这些相应的DNA本身克隆到哺乳动物IgG表达载体中并在上文提到的NF-κB报告基因细胞检测中检查功能活性。最后，将所得序列与人生殖系序列相比较，并且调节对亲和力和效力没有任何显著影响的偏差。通过抗体库筛选和通过亲和力和/或效力成熟化获得具有下列序列的抗体：
TPP-2090的轻链（SEQ ID NO.1）和重链（SEQ ID NO.2）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-2149的轻链（SEQ ID NO.11）和重链（SEQ ID NO.12）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-2093的轻链（SEQ ID NO.21）和重链（SEQ ID NO.22）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-2148的轻链（SEQ ID NO.31）和重链（SEQ ID NO.32）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-2084的轻链（SEQ ID NO.41）和重链（SEQ ID NO.42）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-2077的轻链（SEQ ID NO.51）和重链（SEQ ID NO.52）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-1538的轻链（SEQ ID NO.61）和重链（SEQ ID NO.62）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-1854的轻链（SEQ ID NO.81）和重链（SEQ ID NO.82）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-1853的轻链（SEQ ID NO.91）和重链（SEQ ID NO.92）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-1857的轻链（SEQ ID NO.101）和重链（SEQ ID NO.102）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
TPP-1858的轻链（SEQ ID NO.111）和重链（SEQ ID NO.112）的氨基酸序列；在重链和轻链的CDR下加划线。
实施例2: 抗体的生物化学特征
通过Biacore分析测定结合亲和力:
在Biacore T100仪器（GE Healthcare Biacore, Inc.）上使用表面等离子体共振分析检查抗-TWEAKR抗体的结合亲和力。使用间接捕捉试剂抗人IgG(Fc)将抗体固定在CM5传感器芯片上。如制造商所述使用"Human Antibody Capture Kit"（BR-1008-39, GEHealthcare Biacore, Inc.）的试剂。以10 µl/min注射10 µg/ml浓度的抗-TWEAKR抗体10秒。
将在HEPES-EP缓冲液（GE Healthcare Biacore, Inc.）中的各种浓度（200 nM、100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.12 nM、1.56 nM）的纯化重组人TWEAKR蛋白（TPP-2305，SEQ ID NO:168）以60 µl/min的流速注射在固定的抗-TWEAKR抗体上3分钟，解离时间为5分钟。在在线参考细胞校正后生成传感图，接着减去缓冲液样品。基于通过使用1:1一阶结合模型拟合传感图获得的缔合常数(kon)和解离常数(koff)的比率计算解离常数(KD)。
测定本发明的抗体以中等亲和力（KD 10 – 200 nM）结合TWEAKR，而一些对比抗体（例如PDL-192(TPP-1104)、136.1(TPP-2194)、18.3.3(TPP-2193)、P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)、P2D3(TPP-2196)、ITEM-1、ITEM-4）表现出高亲和力结合（0.7 – 3.7 nM）。抗体PDL-192、136.1、18.3.3、P4A8、P3G5和P2D3的可变域的序列获自专利文献WO2009/020933和WO2009/140177，加入人IgG1和鼠IgG2的恒定区的编码序列，以产生全长IgG PDL-192(TPP-1104)、136.1(TPP-2194)、18.3.3(TPP-2193)、P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)、P2D3(TPP-2196)。在这一研究中测得的亲和力范围很好地符合已发布的数据：对PDL-192、18.3.3和136.1而言，已发布5.5、0.2和0.7 nM的KD值（WO2009/020933）；对P4A8而言，2.6nM（WO2009/140177）。作为比较：天然配体TWEAK以0.8 – 2.4 nM的KD值结合TWEAKR（Immunity. 2001 Nov；15(5):837-46；Biochem J. 2006年7月15日；397(2):297-304；Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003年4月1日；23(4):594-600）。
因此，可以记录，本发明的抗体（TPP-883、TPP-1538、TPP-2077、TPP-2084、TPP-2148、TPP-2093、TPP-2149和TPP-2090）以中等亲和力（KD 10 – 200 nM）结合TWEAKR作为结果。
使用TWEAKR胞外域的N-和C-端截断变体表征TPP-2090的结合表位：
不同物种的TWEAKR的富含半胱氨酸结构域（氨基酸34-68）的比对（图1-比对）表明其在分析的所有6个物种中非常保守。PDL-192依赖于R56结合（WO2009/020933: 图2B），因此不结合到大鼠、猪和小鼠TWEAKR上。TPP-2090依赖于保守氨基酸D47结合，因此结合到所示的所有物种上。
在表征上文提到的抗体的结合表位的第一种方法中，生成TWEAKR胞外域的N-和C-端截断变体并检查其结合各种抗-TWEAKR抗体的能力。在N端删除氨基酸28至33并在C端删除氨基酸69至80，以使具有在Cys36-Cys49、Cys52-Cys67和Cys55-Cys64之间的二硫桥的富含半胱氨酸结构域保持完好（参见图2）。作为Fc融合蛋白TPP-2202和TPP-2203表达和纯化两种构建体——包括N-和C-末端的完整胞外域28-80和截断胞外域34-68。
为了分析该结合，涂覆1 µg/ml的相应二聚TWEAKR Fc构建体并使用0.3 µg/ml和0.08 µg/ml的生物素化IgG作为可溶性结合配对物。使用链霉亲和素-HRP和Amplex Red底物进行检测。IgG使用大约2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS（Pierce；目录号 21347）根据制造商的指示生物素化并使用Zeba脱盐柱（Pierce；目录号 89889）脱盐。在可溶性配体的所有使用浓度下，本发明的抗体对这两种构建体都表现出饱和结合，而抗体P4A8(TPP-1324)、P3G5(TPP-2195)和Item-4仅对全长胞外域表现出饱和结合，而与N-和C-端截断构建体的结合变差（图3 & 图4）。这表明本发明的抗体的结合表位位于氨基酸34-68之间的富含半胱氨酸结构域中。为了分析P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)结合是否需要TWEAKR胞外域的N末端或C末端，生成具有氨基酸69至80的C端缺失的单体胞外域。P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)与C端截断TWEAKR胞外域的结合同样变差，而本发明的抗体表现出饱和结合（图5）。
因此，富含半胱氨酸结构域中的TPP-2090、TPP-2084、PDL-192(TPP-1104)和136.1(TPP-2194)的结合表位和P4A8(TPP-1324)和P3G5(TPP-2195)的结合表位至少部分位于富含半胱氨酸结构域外。
TWEAKR-Fc突变蛋白对抗体亲和力的作用
为了更详细检查本发明的抗体的结合特征，研究被提出与已知激动性抗体（WO2009/140177）的作用相关的TWEAKR的某些突变蛋白。为此，作为Fc融合蛋白表达和纯化具有下列独立氨基酸置换的全长胞外域（氨基酸28-80）：T33Q；S40R；W42A；M50A；R56P；H60K；L65Q。
为了获得剂量-反应数据，将不同的TWEAKR-Fc突变蛋白以低浓度（62 ng/ml）涂覆到384孔Maxisorb ELISA板上并使用以100 nM的浓度开始的生物素化IgG的连续2倍稀释液作为可溶性结合配对物。使用链霉亲和素-HRP和Amplex Red进行检测。检查的IgG是本发明的TPP-2090和TPP-2084、WO2009/020933的PDL-192、136.1和18.3.3、WO2009/140177的P4A8和P3G5和Nakayama等人[Biochem Biophys Res Com 306: 819-825]的ITEM-1和ITEM-4。
IgG使用大约2倍摩尔过量的生物素-LC-NHS（Pierce；目录号 21347）根据制造商的指示生物素化并使用Zeba脱盐柱（Pierce；目录号 89889）脱盐。拟合该剂量-反应数据并测定IC50。为了阐述结果，生成表；“-”标记超过50 nM的IC50，“+”标记1至150 pM的IC50。
如已经发布，ITEM-4表现出变差的与H60K突变蛋白的结合 [WO2009/140177: 图23F]，PDL-192表现出变差的与R56P突变蛋白的结合 [WO2009/020933: 图22B]。不同于已发布的数据，ITEM-1表现出变差的与R56P的结合，且所有抗体表现出变差的与W42A的结合[WO2009/140177: 图23E, 图23F]。可以通过所选方法解释这些差异。
不同于ITEM-1、ITEM-4、PDL-192、136.1和18.3.3，本发明的抗体与除W42A外的所有取代无关地结合。
富含半胱氨酸结构域的丙氨酸扫描：
进行富含半胱氨酸结构域（氨基酸34-68）的丙氨酸扫描以测定本发明的抗体的结合位点。图6表明TWEAKR的全长胞外域的N-和C-端截断变体不会使本发明的抗体的结合变差。因此，结合表位位于富含半胱氨酸结构域中。将下列取代引入TWEAKR(34-68) Fc构建体中：S37A、R38A、S40A、S41A、W42A、S43A、D45A、D47A、K48A、D51A、S54A、R56A、R58A、P59A、H60A、S61A、D62A、F63A和L65A。
在HEK293细胞中表达这些TWEAKR(34-68) Fc突变蛋白。为了获得剂量-反应数据，将IgG以1 µg/ml的浓度涂覆到384孔Maxisorp ELISA板上并使用包含TWEAKR突变蛋白的上清液的连续2倍稀释液作为可溶性结合配对物。使用抗-HIS-HRP和Amplex Red进行检测。检查的IgG是本发明的TPP-2090、WO2009/020933的PDL-192和WO2009/140177的P4A8。
为了评估TWEAKR突变蛋白与结合到各种IgG上的相关性，制备在特定突变蛋白浓度下的相关印迹（Blot）。例如，图6显示TWEAKR表达肉汤的8倍稀释上清液的相关印迹，在X轴上为PDL-192(TPP-1104)，在Y轴上为TPP-2090。该印迹表明取代D47A使TPP-2090的结合变差，取代R56A使PDL-192(TPP-1104)的结合变差。这些构建体无一可以表明结合到P4A8(TPP-1324)上，这符合上文获得的结果（图6）。因此，P4A8表位至少部分位于富含半胱氨酸结构域外。
抗体相互作用对某些TWEAKR氨基酸的识别出的依赖性与对这些抗体测定的激动活性相关联。天然配体TWEAK表现出TWEAKR的有效活化并依赖于亮氨酸46结合到TWEAKR的富含半胱氨酸结构域中（Pellegrini等人, FEBS 280:1818-1829）。P4A8表现出极低激动活性并至少部分与TWEAKR的富含半胱氨酸结构域外的结构域相互作用。PDL-192表现出中等激动活性并依赖于R56结合到富含半胱氨酸结构域上，但在TWEAK配体位点对面。TPP-2090和TWEAK依赖于D47和L46而结合，且它们因此结合到类似的结合位点上（图7）。
可以断定，本发明的抗体（例如TPP-2090）依赖于D47而结合到TWEAKR上。
抗体相互作用对某些TWEAKR氨基酸的识别出的依赖性与对这些抗体测定的激动活性相关联。天然配体TWEAK表现出TWEAKR的有效活化并依赖于亮氨酸46结合到TWEAKR的富含半胱氨酸结构域上（Pellegrini等人, FEBS 280:1818-1829）。P4A8表现出极低激动活性并至少部分与TWEAKR的富含半胱氨酸结构域外的结构域相互作用。PDL-192表现出中等激动活性并依赖于R56结合到富含半胱氨酸结构域上，但在TWEAK配体位点对面。本发明的抗体（例如TPP-2090）依赖于D47而结合，且TWEAK依赖于L46而结合，但结合到类似但不同的结合位点上（图7）。因此，表现出强激动活性的本发明的抗体结合到与极高激动活性相关的抗体的新表位（D47依赖性）上。有意思的是，Michaelson等人（见第369页，左栏，MichaelsonJS等人, MAbs. 2011 Jul-Aug；3(4):362-75）给出为何所有由其检查的所有激动性抗体具有比天然配体TWEAK更弱的激动活性的解释。他们断定降低的效力可能取决于该抗体与TWEAKR的二聚结合相互作用，其中TWEAK可能进行三聚相互作用。因此令人惊讶的结果是，本发明的抗体尽管与TWEAKR二聚相互作用，但具有甚至更高的激动活性。这种令人惊讶的作用与本发明的抗体的特异性结合性质，即与TWEAKR的D47的特异性结合有关。
进一步实施方案
1. 结合体或其衍生物与一个或多个活性物质分子的偶联物，所述活性物质分子是经连接体L连接到结合体上的纺锤体驱动蛋白抑制剂。
2. 根据第1项的偶联物，其中所述结合体或其衍生物是结合体肽或蛋白质或结合体肽或蛋白质的衍生物。
3. 根据第2项的偶联物，其中各活性物质分子经连接体连接到所述结合体肽或蛋白质或其衍生物的不同氨基酸上。
4. 根据前述项目的一项或多项的偶联物，其中所述偶联物具有每结合体平均1.2至20个活性物质分子。
5. 根据第2至4项的一项或多项的偶联物，其中所述结合体肽或蛋白质代表抗体或所述结合体肽或蛋白质的衍生物或。
6. 根据前述项目的一项或多项的偶联物，其中所述结合体结合到癌症靶分子。
7. 根据第6项的偶联物，其中所述结合体结合到细胞外靶分子上。
8. 根据第7项的偶联物，其中所述结合体在结合到细胞外靶分子上后被表达所述靶分子的细胞内化并在细胞内（优选借助溶酶体）加工。
9. 根据第2至8项的一项或多项的偶联物，其中所述结合体肽或蛋白质是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段。
10. 根据第9项的偶联物，其中所述结合体肽或蛋白质是抗-HER2抗体、抗-EGFR抗体、抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段。
11. 根据第10项的偶联物，其中所述抗-TWEAKR抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ IDNO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上，优选抗-TWEAKR抗体TPP-2090。
12. 根据前述项目的一项或多项的偶联物，其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂具有下示亚结构及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
#a代表连向所述分子剩余部分的键；
R1a代表H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、-NHY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、COOH、SO3H、SH或OH，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂通过取代R1a、R2a、R4a处或由R2a和R4a形成的吡咯烷环处的氢原子连接到所述连接体上。
13. 根据前述项目的一项或多项的偶联物，其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂由通式(I)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐表示：
其中
R1a代表H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、-NHY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、SO3H、NH2、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R3a代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基-或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自可具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R8a代表C1-10-烷基；
HZ代表可被选自卤素、可任选被卤素取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基和C6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环；
其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂通过取代R1a、R2a、R3a、R4a、R8a处或由R2a和R4a形成的吡咯烷环处的氢原子连接到所述连接体上。
14. 根据前述项目的一项或多项的偶联物，其中所述活性物质分子-连接体由通式(II)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐表示：
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
R1代表H、–L-#1或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-#1或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基、C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基-或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自可具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'和Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-#1、H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或–CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中取代基R1、R2、R3、R4和R5之一代表–L-#1，
L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
15. 根据第14项的偶联物，
其中R1代表–L-#1、H、-(CH2)0-3Z，其中Z代表–H、-CO-NY1Y2、NHY3、OY3、-SY3或–CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1- 3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-#1、-CO-CHY4-NHY5或H，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-，其中R10代表H、–L-#1、NH2、COOH、SH、OH或SO3H，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO，
R3代表–(CH2)OH或–L-#1，且
R5代表–L-#1或H，
其中取代基R1、R2、R3、R4和R5之一代表–L-#1。
16. 根据第14或15项的偶联物，其中R6和R7彼此独立地代表H、C1-3-烷基或卤素。
17. 根据第14至16项的一项或多项的偶联物，其中R8代表C1-4-烷基（优选叔丁基）。
18. 根据第14至17项的一项或多项的偶联物，其中R9代表H。
19. 根据第14至18项的一项或多项的偶联物，其中R6和R7代表F。
20. 根据前述项目的一项或多项的偶联物，其中所述连接体–L-具有下示基本结构(i)至(iv)之一：
(i) -(CO)m–SG1-L1-L2-
(ii) -(CO)m –L1-SG-L1-L2-
(iii) -(CO)m –L1-L2-
(iv) –(CO)m –L1-SG-L2
其中m是0或1，SG和SG1是体内可裂解基团，L1彼此独立地代表不可体内裂解的有机基团，且L2代表与所述结合体的偶联基团。
21. 根据第20项的偶联物，其中所述体内可裂解基团SG是2-8寡肽基团，优选二肽基团或二硫、腙、缩醛或缩醛胺，且SG1是2-8寡肽基团，优选二肽基团。
22. 根据第2至21项的一项或多项的偶联物，其中所述连接体连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上并具有下式：
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m是0或1；
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，且
-L2-代表
其中
#1是指与结合体的硫原子的连接点，
#2是指与基团L1的连接点，
L1代表–(NR10)n-(G1)o-G2-，
其中R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-或；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
或代表下示基团之一：
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
23. 根据第22项的偶联物，其中所述烃链被下示基团之一中断：
其中X代表H或可任选被–NHCONH2、-COOH、-OH、NH2、-NH-CNNH2、砜、亚砜或磺酸取代的C1-10-烷基。
24. 根据第22项的偶联物，其中所述连接体具有下式：
其中
#3代表连向活性物质分子的键，
#4代表连向结合体肽或蛋白质的键，
R11代表H或NH2；
B代表–[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w = 0至20；
x = 0至5；
x = 0至5；
y = 0或1；
z = 0至5；且
X4代表–O-、-CONH-或–NHCO- 。
25. 根据第24项的偶联物，其中R1或R4代表–L-#1。
26. 根据第21至25项的一项或多项的偶联物，其中所述偶联物具有下式之一：
其中
X1、X2和X3具有与第14项中相同的含义，
AK1代表经所述结合体的硫原子连接的结合体肽或蛋白质；n代表1至20的数值；且L1代表具有1至70个碳原子的任选支化的烃基，其代表来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基的具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
且SG1是2-8寡肽，优选二肽；
L4是单键或基团–(CO)y-G4-，其中y代表0或1，且G4代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
27. 根据第1至21项的一项或多项的偶联物，其中所述连接体–L-连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上并具有下式：
其中
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，
m是0、1、2或3；
n是0、1或2；
p是0至20；且
L3代表
；
其中
o是0或1；
且
G3代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-和具有最多4个选自N、O和S、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、砜、亚砜或磺酸取代。
28. 根据第27项的偶联物，其中所述连接体–L-连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上并具有下式：
其中
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，
m是1；
p是0；
n是0；
且L3代表
；
其中
o是0或1；且
G3代表–(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)u (CH2CH2O)v(CH2)w-，其中
s、t、v和w各自彼此独立地为0至20且u是0或1。
29. 根据第27或28项的偶联物，其中R2或R3代表–L-#1。
30. 根据第29项的偶联物，其中所述偶联物具有下式之一：
其中
X1、X2和X3具有与第14项中相同的含义，
AK1代表经所述结合体的硫原子连接的结合体肽或蛋白质；n代表1至20的数值；且L2和L3代表具有1至100个碳原子的任选支化、直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-,-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
31. 根据第1至21项的一项或多项的偶联物，其中所述连接体–L-连接到赖氨酸侧链上并具有下式：
-§-(SG)x-L4-CO-§§
其中
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，
x代表0或1，
SG代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽，
且
L4代表单键或基团–(CO)y-G4-，其中y代表0或1，且
G4代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
32. 根据第31项的结合体肽或蛋白质的偶联物，其中所述偶联物具有下式之一：
其中
X1、X2和X3具有与第14项中相同的含义，
AK2代表经所述结合体的硫原子连接的结合体肽或蛋白质；n代表1至20的数值；且L4代表具有1至100个碳原子的任选直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，且
SG1代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽。
33. 根据第10至32项的一项或多项的偶联物，其中所述抗-TWEAKR抗体是激动性抗体。
34. 根据第10至33项的一项或多项的偶联物，其包含：
可变重链，其包含：
a. 由包含式PYPMX的氨基酸序列(SEQ ID NO: 171)编码的重链的CDR1，其中X是I或M；
b. 由包含式YISPSGGXTHYADSVKG的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172)编码的重链的CDR2，其中X是S或K；和
c. 由包含式GGDTYFDYFDY的氨基酸序列(SEQ ID NO: 173)编码的重链的CDR3；
和可变轻链，其包含：
d. 由包含式RASQSISXYLN的氨基酸序列(SEQ ID NO: 174)编码的轻链的CDR1，其中X是G或S；
e. 由包含式XASSLQS的氨基酸序列(SEQ ID NO: 175)编码的轻链的CDR2，其中X是Q、A或N；和
f. 由包含式QQSYXXPXIT的氨基酸序列(SEQ ID NO: 176)编码的轻链的CDR3，其中位置5的X是T或S，位置6的X是T或S且位置8的X是G或F。
35. 根据第10至34项的一项或多项的偶联物，其包含：
a. 如SEQ ID NO:10中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:9中所示的轻链的可变序列，或
b. 如SEQ ID NO:20中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:19中所示的轻链的可变序列，或
c. 如SEQ ID NO:30中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:29中所示的轻链的可变序列，或
d. 如SEQ ID NO:40中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:39中所示的轻链的可变序列，或
e. 如SEQ ID NO:50中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:49中所示的轻链的可变序列，或
f. 如SEQ ID NO:60中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:59中所示的轻链的可变序列，或
g. 如SEQ ID NO:70中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:69中所示的轻链的可变序列，或
h. 如SEQ ID NO:80中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:79中所示的轻链的可变序列，或
i. 如SEQ ID NO:90中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:89中所示的轻链的可变序列，或
j. 如SEQ ID NO:100中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:99中所示的轻链的可变序列，或
k. 如SEQ ID NO:110中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:109中所示的轻链的可变序列，或
l. 如SEQ ID NO:120中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:119中所示的轻链的可变序列。
36. 根据第10至35项的一项或多项的偶联物，其中所述抗体是IgG抗体。
37. 根据第10至36项的一项或多项的偶联物，其包含：
a. 如SEQ ID NO:2中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:1中所示的轻链的序列，或
b. 如SEQ ID NO:12中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:11中所示的轻链的序列，或
c. 如SEQ ID NO:22中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:21中所示的轻链的序列，或
d. 如SEQ ID NO:32中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:31中所示的轻链的序列，或
e. 如SEQ ID NO:42中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:41中所示的轻链的序列，或
f. 如SEQ ID NO:52中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:51中所示的轻链的序列，或
g. 如SEQ ID NO:62中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:61中所示的轻链的序列，或
h. 如SEQ ID NO:72中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:71中所示的轻链的序列，或
i. 如SEQ ID NO:82中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:81中所示的轻链的序列，或
j. 如SEQ ID NO:92中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:91中所示的轻链的序列，或
k. 如SEQ ID NO:102中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:101中所示的轻链的序列，或
l. 如SEQ ID NO:112中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:111中所示的轻链的序列。
38. 根据前述项目的一项或多项的纺锤体偶联物，其中所述偶联物具有每结合体肽或蛋白质1至10，优选2至8个活性物质分子。
39. 制备根据第26或30项的偶联物的方法，其中下式之一的化合物，优选以其三氟乙酸盐的形式，连接到任选预先部分还原的结合体肽或蛋白质的半胱氨酸残基上，其中所述化合物优选相对于所述结合体肽或蛋白质以2至12倍摩尔过量使用：
其中R代表-H或–COOH，
其中K代表任选被C1-C6-烷氧基或–OH、C1-C6-烷基取代的直链或支链，且
其中X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3和L4具有与第26或30项中相同的含义。
40. 制备根据第32项的偶联物的方法，其中下式之一的化合物，优选以其三氟乙酸盐的形式，连接到结合体肽或蛋白质的赖氨酸残基上，其中所述化合物优选相对于所述结合体肽或蛋白质以2至12倍摩尔过量使用：
其中X1、X2、X3、SG1和L4具有与第32项中相同的含义。
41. 下式之一的化合物：
其中R代表-H或–COOH，
其中K代表任选被C1-C6-烷氧基或–OH、C1-C6-烷基取代的直链或支链，且
其中X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3和L4具有与第26、30或32项中相同的含义。
42. 通式(III)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C，或X1代表CH，X2代表C且X3代表N，或X1代表NH，X2代表C且X3代表C，或X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
R1代表–L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-BINDER或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-BINDER、H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
43. 通式(IV)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
X1代表N，X2代表C且X3代表N；
R1代表–L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4彼此独立地代表任选被-NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z',和Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-BINDER或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基、C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基-或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个–S-烷基、1-3个–O-CO-烷基、1-3个–O-CO-NH-烷基、1-3个–NH-CO-烷基、1-3个–NH-CO-NH-烷基、1-3个–S(O)n-烷基、1-3个–SO2-NH-烷基、1-3个–NH-烷基、1-3个–N(烷基)2基团、1-3个–NH2基团或1-3个–(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表–H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或–CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或–(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或–(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-BINDER、H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2；
条件是R1、R2和R4不同时代表H。
44. 根据第43项的化合物，其中Z代表Cl或Br。
45. 根据第43项的化合物，其中R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'。
46. 根据第43-44项的一项或多项的化合物，其中Y1代表H，Y2代表–(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'且Z'代表–COOH。
47. 根据第43-44项的一项或多项的化合物，其中Y1代表H，Y2代表–CH2CH2Z'且Z'代表–(CONHCHY4)2COOH。
48. 根据第47项的化合物，其中Y4代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基。
49. 根据第48项的化合物，其中至少一个Y4的代表选自异丙基和–CH3。
50. 根据第43和45项的一项或多项的化合物，其中Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'，Z'代表-CONHCHY4COOH且Y4代表任选被–NH2取代的芳基或苄基。
51. 根据第50项的化合物，其中Y4代表氨基苄基。
52. 根据第43项的化合物，其中R2代表–(CH2)0-3Z且Z代表–SY3。
53. 根据第43项的化合物，其中R4代表–CO-CHY4-NHY5且Y5代表H。
54. 根据第43项的化合物，其中R4代表–CO-CHY4-NHY5且Y5代表–CO-CHY6-NH2。
55. 根据第53和54项的一项或多项的化合物，其中Y4代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基。
56. 根据第43至55项的一项或多项的化合物，其中所述化合物具有下式之一：
(15S,19R)-15-氨基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-乙醇酰-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧杂-13,18-二氮杂二十一烷-1-酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-氨基-L-苯基丙氨酸；
N-{(1R)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-氨基丙基)-2-羟基乙酰胺(1:1)；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；
N-[(3S)-3-氨基-4-肼基-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)；
N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二氨基丁基]-2-羟基乙酰胺(1:1)；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；
(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺(2:1)；
(1-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)乙酸；
N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺（2:1)；
N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；
L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；
L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)。
57. 包含根据第1至38项的一项或多项的偶联物或根据第42-56项的化合物以及惰性无毒可药用辅助剂的药物组合物。
58. 用在治疗和/或预防疾病的方法中的根据第1至38项的一项或多项的偶联物或根据第42-56项的化合物。
59. 用在治疗过度增生和/或血管生成疾病的方法中的根据第1至38项的一项或多项的偶联物或根据第42-56项的化合物。
60. 根据第1至38项的一项或多项的偶联物或根据第42-56项的化合物，其中R3a或R3代表–L-BINDER或取代的烷基、芳基或杂芳基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基或C5-10-杂烷基，其可被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2、NH2或-(CH2)0-3Z取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）。
61. 使用有效量的至少一种根据第1至38项的一项或多项的偶联物或根据第42-56项的化合物治疗和/或预防人和动物的过度增生和/或血管生成疾病的方法。

Claims (71)

1.结合体或其衍生物与一个或多个活性物质分子的偶联物，其中所述活性物质分子是经连接体L连接到结合体上的纺锤体驱动蛋白抑制剂，其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂具有下式(IIa)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH或CF，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C
（其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N是优选的）；
R1代表H、–L-#1、–MOD或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'（例如-(CH2)0-3Z'）或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO2H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2代表–L-#1、H、-MOD、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R4代表–L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-#1、-MOD或任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0- 3Z'且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-#1、H、NH2、NO2、卤素（特别是F、Cl、Br）、-CN、CF3、-OCF3、-CH2F、-CH2F、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基、NO2、NH2、COOH或卤素（特别是F、Cl、Br），
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或–(CH2)0-2-(HZ2)，其中HZ2代表具有最多2个选自N、O和S的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团的每个可被–OH、CO2H或NH2或–L-#1取代；
其中取代基R1、R2、R3、R4、R5、R8和R10之一或无一代表或（在R8的情况下）含有–L-#1，
L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，
其中–MOD代表–(NR10)n-(G1)o-G2-H，其中
R10代表H或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-、-CONH-或（其中，如果G1代表–NHCO-或，则R10不代表NH2）；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表直链和/或支化的烃基，其具有1至10个碳原子并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中基团–MOD优选具有至少一个基团-COOH。
2.根据权利要求1的偶联物，其中X1代表CH，X2代表C且X3代表N。
3.根据权利要求1或2的偶联物，其中取代基R1代表–L-#1。
4.结合体或其衍生物与一个或多个活性物质分子的偶联物，其中所述活性物质分子是经连接体L连接到结合体上的纺锤体驱动蛋白抑制剂，其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂具有下示亚结构及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
#a代表与所述分子剩余部分的键；
R1a代表H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、-NHY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、NH2、COOH、SO3H、SH或OH，
其中Z代表-H、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂通过取代R1a、R2a、R4a处或由R2a和R4a形成的吡咯烷环处的氢原子连接到所述连接体上。
5.根据权利要求4的偶联物，其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂由通式(I)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐表示：
其中
R1a代表H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-OY3、-SY3、-NHY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2a和R4a彼此独立地代表H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2a和R4a一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表H、SO3H、NH2、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
R3a代表任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，优选C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基-或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自可具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R8a代表C1-10-烷基；
HZ代表可被选自卤素、可任选被卤素取代的C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基的一个或多个取代基取代的单环或双环杂环；
其中所述纺锤体驱动蛋白抑制剂通过取代R1a、R2a、R3a、R4a、R8a处或由R2a和R4a形成的吡咯烷环处的氢原子连接到所述连接体上。
6.根据前述权利要求的一项或多项的偶联物，其中所述活性物质分子-连接体由通式(II)及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐表示：
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C；或
X1代表N，X2代表C且X3代表N；或
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；或
X1代表NH，X2代表C且X3代表C；或
X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
R1代表H、–L-#1或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-#1、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-#1或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基或杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基、C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基-或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自可具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-#1、H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、OY3、-SY3、卤素、NHY3、-CO-NY1Y2或–CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中取代基R1、R2、R3、R4和R5之一代表–L-#1，
L代表连接体且#1代表与所述结合体或其衍生物的键，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
7.根据权利要求6的偶联物，
其中R1代表–L-#1、H、-(CH2)0-3Z，其中Z代表–H、-CO-NY1Y2、NHY3、OY3、-SY3或–CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1- 3COOH，其中W代表H或OH，其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-#1、-CO-CHY4-NHY5或H，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-，其中R10代表H、–L-#1、NH2、COOH、SH、OH或SO3H，
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO，
R3代表–(CH2)OH或–L-#1，且
R5代表–L-#1或H，
其中取代基R1、R2、R3、R4和R5之一代表–L-#1。
8.根据权利要求6或7的偶联物，其中R6和R7彼此独立地代表H、C1-3-烷基或卤素。
9.根据权利要求6至8的一项或多项的偶联物，其中R8代表C1-4-烷基（优选叔丁基）。
10.根据权利要求6至9的一项或多项的偶联物，其中R9代表H。
11.根据权利要求6至10的一项或多项的偶联物，其中R6和R7代表F。
12.根据前述权利要求的一项或多项的偶联物，其中所述结合体或其衍生物是结合体肽或蛋白质或结合体肽或蛋白质的衍生物。
13.根据权利要求12的偶联物，其中各活性物质分子经连接体连接到所述结合体肽或蛋白质或其衍生物的不同氨基酸上。
14.根据前述权利要求的一项或多项的偶联物，其中所述偶联物具有每结合体平均1.2至20个活性物质分子。
15.根据权利要求12至14的一项或多项的偶联物，其中所述结合体肽或蛋白质代表抗体或所述结合体肽或蛋白质的衍生物或。
16.根据前述权利要求的一项或多项的偶联物，其中所述结合体结合到癌症靶分子上。
17.根据权利要求16的偶联物，其中所述结合体结合到细胞外靶分子上。
18.根据权利要求17的偶联物，其中所述结合体在结合到细胞外靶分子上后被表达所述靶分子的细胞内化并在细胞内（优选借助溶酶体）加工。
19.根据权利要求12至18的一项或多项的偶联物，其中所述结合体肽或蛋白质是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段。
20.根据权利要求19的偶联物，其中所述结合体肽或蛋白质是抗-HER2抗体、抗-EGFR抗体、抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段。
21.根据权利要求20的偶联物，其中所述抗-TWEAKR抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ IDNO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上，优选抗-TWEAKR抗体TPP-2090。
22.根据权利要求20的偶联物，其中所述结合体肽或蛋白质是抗-EGFR抗体且R3代表–L-#1。
23.根据前述权利要求的一项或多项的偶联物，其中所述连接体–L-具有下示基本结构(i)至(iv)之一：
-(CO)m–SG1-L1-L2-
(ii) -(CO)m –L1-SG-L1-L2-
(iii) -(CO)m –L1-L2-
(iv) –(CO)m –L1-SG-L2
其中m是0或1，SG和SG1是体内可裂解基团，L1彼此独立地代表不可体内裂解的有机基团，且L2代表与结合体的偶联基团。
24.根据权利要求23的偶联物，其中所述体内可裂解基团SG是2-8寡肽基团，优选二肽基团或二硫、腙、缩醛或缩醛胺，且SG1是2-8寡肽基团，优选二肽基团。
25.根据前述权利要求的一项或多项的偶联物，其中所述连接体连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上并具有下式：
§-(CO)m-L1-L2-§§
其中
m是0或1；
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，且
-L2-代表
或
其中
#1是指与结合体的硫原子的连接点，
#2是指与基团L1的连接点，
L1代表–(NR10)n-(G1)o-G2-，
其中R10代表H、NH2或C1-C3-烷基；
G1代表–NHCO-或；
n是0或1；
o是0或1；且
G2代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
或代表下示基团之一：
或
其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基。
26.根据权利要求25的偶联物，其中L2由下式之一或两者表示：
其中#1是指与结合体的硫原子的连接点，#2是指与基团L1的连接点，R22代表COOH且连向结合体的硫原子的键的多于80%（基于连接体与结合体的键的总数计）以这两种结构之一存在。
27.根据权利要求25或26的偶联物，其中所述烃链被下示基团之一中断：
其中X代表H或可任选被–NHCONH2、-COOH、-OH、NH2、-NH-CNNH2、砜、亚砜或磺酸取代的C1-10-烷基。
28.根据权利要求25的偶联物，其中所述连接体具有下式：
其中
#3代表连向活性物质分子的键，
#4代表连向结合体肽或蛋白质的键，
R11代表H或NH2；
B代表–[(CH2)x-(X4)y]w-(CH2)z-，
w = 0至20；
x = 0至5；
x = 0至5；
y = 0或1；
z = 0至5；且
X4代表–O-、-CONH-或–NHCO- 。
29.根据权利要求25的偶联物，其中R1或R4代表–L-#1。
30.根据权利要求25至29的一项或多项的偶联物，其中所述偶联物具有下式之一：
其中
X1、X2和X3具有与权利要求4中相同的含义，
AK1代表经所述结合体的硫原子连接的结合体肽或蛋白质；n代表1至20的数值；且L1代表具有1至70个碳原子的任选支化的烃基，其代表来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基的具有1至100个碳原子的直链或支化的并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，
且SG1是2-8寡肽，优选二肽；
L4是单键或基团–(CO)y-G4-，其中y代表0或1，且G4代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
31.结合体或其衍生物与一个或多个活性物质分子的偶联物，其中所述偶联物具有下式之一或两者：
其中
AK1A代表经所述结合体的硫原子连接的结合体肽或蛋白质；n代表1至20的数值；且L1代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-CONH-、-NHCO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
32.根据前述权利要求的一项或多项的偶联物，其中所述连接体–L-连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上并具有下式：
其中
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，
m是0、1、2或3；
n是0、1或2；
p是0至20；且
L3代表
；
其中
o是0或1；
且
G3代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-和具有最多4个选自N、O和S、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、砜、亚砜或磺酸取代。
33.根据权利要求32的偶联物，其中所述连接体–L-连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上并具有下式：
其中
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，
m是1；
p是0；
n是0；
且L3代表
；
其中
o是0或1；且
G3代表–(CH2CH2O)s(CH2)t(CONH)u (CH2CH2O)v(CH2)w-，其中
s、t、v和w各自彼此独立地为0至20且u是0或1。
34.根据权利要求32或33的偶联物，其中R2或R3代表–L-#1。
35.根据权利要求34的偶联物，其中所述偶联物具有下式之一：
其中
X1、X2和X3具有与权利要求4中相同的含义，
AK1代表经所述结合体的硫原子连接的结合体肽或蛋白质；n代表1至20的数值；且L2和L3代表具有1至100个碳原子的优选支化、直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
36.根据权利要求1至31的一项或多项的偶联物，其中所述连接体–L-连接到赖氨酸侧链上并具有下式：
-§-(SG)x-L4-CO-§§
其中
§代表连向活性物质分子的键且
§§代表连向结合体肽或蛋白质的键，
x代表0或1，
SG代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽，
且
L4代表单键或基团–(CO)y-G4-，其中y代表0或1，且
G4代表具有1至100个碳原子的直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NHCO-、-CONH-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S或-SO-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
37.根据权利要求36的结合体肽或蛋白质的偶联物，其中所述偶联物具有下式之一：
其中
X1、X2和X3具有与权利要求4中相同的含义，
AK2代表经所述结合体的硫原子连接的结合体肽或蛋白质；n代表1至20的数值；且L4代表具有1至100个碳原子的任选直链或支化的烃链，其来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NH-、-CO-、-NMe-、-NHNH-、-SO2NHNH-、-NHCO-、-CONH-、-CONHNH-和具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的5至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在侧链，其可被–NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，且
SG1代表可裂解基团，优选2-8寡肽，特别优选二肽。
38.根据权利要求20至37的一项或多项的偶联物，其中所述抗-TWEAKR抗体是激动性抗体。
39.根据权利要求20至38的一项或多项的偶联物，其包含：
可变重链，其包含：
a. 由包含式PYPMX的氨基酸序列(SEQ ID NO: 171)编码的重链的CDR1，其中X是I或M；
b. 由包含式YISPSGGXTHYADSVKG的氨基酸序列(SEQ ID NO: 172)编码的重链的CDR2，其中X是S或K；和
c. 由包含式GGDTYFDYFDY的氨基酸序列(SEQ ID NO: 173)编码的重链的CDR3；
和可变轻链，其包含：
d. 由包含式RASQSISXYLN的氨基酸序列(SEQ ID NO: 174)编码的轻链的CDR1，其中X是G或S；
e. 由包含式XASSLQS的氨基酸序列(SEQ ID NO: 175)编码的轻链的CDR2，其中X是Q、A或N；和
f. 由包含式QQSYXXPXIT的氨基酸序列(SEQ ID NO: 176)编码的轻链的CDR3，其中位置5的X是T或S，位置6的X是T或S且位置8的X是G或F。
40.根据权利要求20至39的一项或多项的偶联物，其包含：
a. 如SEQ ID NO:10中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:9中所示的轻链的可变序列，或
b. 如SEQ ID NO:20中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:19中所示的轻链的可变序列，或
c. 如SEQ ID NO:30中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:29中所示的轻链的可变序列，或
d. 如SEQ ID NO:40中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:39中所示的轻链的可变序列，或
e. 如SEQ ID NO:50中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:49中所示的轻链的可变序列，或
f. 如SEQ ID NO:60中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:59中所示的轻链的可变序列，或
g. 如SEQ ID NO:70中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:69中所示的轻链的可变序列，或
h. 如SEQ ID NO:80中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:79中所示的轻链的可变序列，或
i. 如SEQ ID NO:90中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:89中所示的轻链的可变序列，或
j. 如SEQ ID NO:100中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:99中所示的轻链的可变序列，或
k. 如SEQ ID NO:110中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:109中所示的轻链的可变序列，或
l. 如SEQ ID NO:120中所示的重链的可变序列以及如SEQ ID NO:119中所示的轻链的可变序列。
41.根据权利要求20至40的一项或多项的偶联物，其中所述抗体是IgG抗体。
42.根据权利要求20至41的一项或多项的偶联物，其包含：
a. 如SEQ ID NO:2中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:1中所示的轻链的序列，或
b. 如SEQ ID NO:12中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:11中所示的轻链的序列，或
c. 如SEQ ID NO:22中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:21中所示的轻链的序列，或
d. 如SEQ ID NO:32中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:31中所示的轻链的序列，或
e. 如SEQ ID NO:42中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:41中所示的轻链的序列，或
f. 如SEQ ID NO:52中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:51中所示的轻链的序列，或
g. 如SEQ ID NO:62中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:61中所示的轻链的序列，或
h. 如SEQ ID NO:72中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:71中所示的轻链的序列，或
i. 如SEQ ID NO:82中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:81中所示的轻链的序列，或
j. 如SEQ ID NO:92中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:91中所示的轻链的序列，或
k. 如SEQ ID NO:102中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:101中所示的轻链的序列，或
l. 如SEQ ID NO:112中所示的重链的序列以及如SEQ ID NO:111中所示的轻链的序列。
43.根据前述权利要求的一项或多项的纺锤体偶联物，其中所述偶联物具有每结合体肽或蛋白质1至10，优选2至8个活性物质分子。
44.制备根据权利要求30或34的偶联物的方法，其中下式之一的化合物，优选以其三氟乙酸盐的形式，连接到任选预先部分还原的结合体肽或蛋白质的半胱氨酸残基上，其中所述化合物优选相对于所述结合体肽或蛋白质以2至12倍摩尔过量使用：
其中R代表-H或–COOH，
其中K代表任选被C1-C6-烷氧基或–OH、C1-C6-烷基取代的直链或直链，且
其中X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3和L4具有与权利要求30或34中相同的含义。
45.制备根据权利要求44的偶联物的方法，其中下式之一的化合物，优选以其三氟乙酸盐的形式，连接到结合体肽或蛋白质的赖氨酸残基上，其中所述化合物优选相对于所述结合体肽或蛋白质以2至12倍摩尔过量使用：
其中X1、X2、X3、SG1和L4具有与权利要求36中相同的含义。
46.下式之一的化合物：
其中R代表-H或–COOH，
其中K代表任选被C1-C6-烷氧基或–OH、C1-C6-烷基取代的直链或支链，且
其中X1、X2、X3、SG1、L1、L2、L3和L4具有与权利要求26、30或32中相同的含义。
47.通式(III)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
X1代表N，X2代表N且X3代表C，或X1代表CH，X2代表C且X3代表N，或X1代表NH，X2代表C且X3代表C，或X1代表CH，X2代表N且X3代表C；
R1代表–L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-BINDER或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个-S-烷基、1-3个-O-CO-烷基、1-3个-O-CO-NH-烷基、1-3个-NH-CO-烷基、1-3个-NH-CO-NH-烷基、1-3个-S(O)n-烷基、1-3个-SO2-NH-烷基、1-3个-NH-烷基、1-3个-N(烷基)2基团、1-3个-NH2基团或1-3个-(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-BINDER、H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
48.通式(IV)的化合物及其盐、溶剂合物和溶剂合物的盐：
其中
X1代表CH，X2代表C且X3代表N；
R1代表–L-BINDER、H或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、-NHY3、-OY3、-SY3、卤素、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2、-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'或-CH(CH2W)Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、NH2、SO3H、COOH、-NH-CO-CH2-CH2-CH(NH2)COOH或-(CO-NH-CHY4)1-3COOH；其中W代表H或OH；
其中Y4彼此独立地代表任选被-NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基；
R2和R4彼此独立地代表–L-BINDER、H、-CO-CHY4-NHY5或-(CH2)0-3Z，或R2和R4一起（形成吡咯烷环）代表–CH2-CHR10-或-CHR10-CH2-，其中R10代表L-#1、H、NH2、SO3H、COOH、SH或OH，
其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中Y4彼此独立地代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6烷基，或代表任选被–NH2取代的芳基或苄基，且Y5代表H或–CO-CHY6-NH2，其中Y6代表直链或支化的C1-6-烷基；
A代表CO、SO、SO2、SO2NH或CNNH；
R3代表–L-BINDER或任选取代的烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基、C6-10-芳烷基、C5-10-杂烷基、C1-10-烷基-O-C6-10-芳基-或C5-10-杂环烷基，其可被1-3个–OH基团、1-3个卤素原子、1-3个卤代烷基（各自具有1-3个卤素原子）、1-3个O-烷基、1-3个–SH基团、1-3个–S-烷基、1-3个–O-CO-烷基、1-3个–O-CO-NH-烷基、1-3个–NH-CO-烷基、1-3个–NH-CO-NH-烷基、1-3个–S(O)n-烷基、1-3个–SO2-NH-烷基、1-3个–NH-烷基、1-3个–N(烷基)2基团、1-3个–NH2基团或1-3个–(CH2)0-3Z基团取代，其中Z代表–H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或–CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或–(CH2)0-3Z'，且Y3代表H、-(CH2)0-3-CH(NHCOCH3)Z'、-(CH2)0-3-CH(NH2)Z'或–(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）；
R5代表–L-BINDER、H、F、NH2、NO2、卤素、SH或-(CH2)0-3Z，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，
其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH；
其中L代表连接体且BINDER代表结合体或其衍生物，其中所述结合体可任选连接到多个活性物质分子上，
R6和R7彼此独立地代表H、氰基、（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C2-10-烯基、（任选氟代的）C2-10-炔基、羟基或卤素，
R8代表（任选氟代的）C1-10-烷基、（任选氟代的）C4-10-环烷基或任选取代的氧杂环丁烷；且
R9代表H、F、CH3、CF3、CH2F或CHF2。
49.根据权利要求48的化合物，其中Z代表Cl或Br。
50.根据权利要求48的化合物，其中R1代表-(CH2)0-3Z，其中Z代表-CO-NY1Y2，其中Y2代表-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'，且Y1代表H、NH2或-(CH2CH2O)0-3-(CH2)0-3Z'。
51.根据权利要求48-50的一项或多项的化合物，其中Y1代表H，Y2代表–(CH2CH2O)3-CH2CH2Z'且Z'代表–COOH。
52.根据权利要求48-50的一项或多项的化合物，其中Y1代表H，Y2代表–CH2CH2Z'且Z'代表–(CONHCHY4)2COOH。
53.根据权利要求48的化合物，其中Y4代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基。
54.根据权利要求48的化合物，其中至少一个Y4的代表选自异丙基和–CH3。
55.根据权利要求48和50的一项或多项的化合物，其中Y1代表H，Y2代表-CH2CH2Z'，Z'代表-CONHCHY4COOH且Y4代表任选被–NH2取代的芳基或苄基。
56.根据权利要求55的化合物，其中Y4代表氨基苄基。
57.根据权利要求48的化合物，其中R2代表–(CH2)0-3Z且Z代表–SY3。
58.根据权利要求48的化合物，其中R4代表–CO-CHY4-NHY5且Y5代表H。
59.根据权利要求48的化合物，其中R4代表–CO-CHY4-NHY5且Y5代表–CO-CHY6-NH2。
60.根据权利要求58和59的一项或多项的化合物，其中Y4代表任选被–NHCONH2取代的直链或支化的C1-6-烷基。
61.根据权利要求48至60的一项或多项的化合物，其中所述化合物具有下式之一：
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]-N-甲基丁酰胺(1:1)；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2yl]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
(15S,19R)-15-氨基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-18-乙醇酰-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧杂-13,18-二氮杂二十一烷-1-酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-氨基-L-苯基丙氨酸；
N-{(1R)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-(3-氨基丙基)-2-羟基乙酰胺(1:1)；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；
N-[(3S)-3-氨基-4-肼基-4-氧代丁基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)；
N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-N-[(3S)-3,4-二氨基丁基]-2-羟基乙酰胺(1:1)；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；
(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺(2:1)；
(1-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)乙酸；
N-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺(2:1)；
N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；
L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；
L-缬氨酰基-N-{3-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丙基}-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺(1:1)；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1S)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基]-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-L-丙氨酰基-N-[4-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)苯基]-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰胺；
S-(1-{2-[(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)氨基]乙基}-2,5-二氧代吡咯烷-3-基)-L-半胱氨酸；
N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N5-氨基甲酰基-L-鸟氨酰基-N6-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-赖氨酸；
S-[1-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；
S-{1-[6-(2-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}肼基)-6-氧代己基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
S-{(3R/S)-1-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九-1-酰基]-R/S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
S-[(3R/S)-1-(2-{[6-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)己酰基]氨基}乙基)-2,5-二氧代吡咯烷-3-基]-L-半胱氨酸；
S-{1-[2-({[(1R,3S)-3-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}氨基)乙基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}-L-半胱氨酸；
S-(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)-L-半胱氨酸；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-D-丙氨酰基)-L-赖氨酸；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-N2-{N-[6-(3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-L-丙氨酰基}-L-赖氨酸；
N-[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-L-谷氨酰胺；
N6-(N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-L-赖氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲氧基乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2,4-二氟苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-3,3,3-三氟丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-氟苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(三氟甲基)苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-乙氧基乙酰胺；
(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酸；
(2S)-2-氨基-N-(2-氨基乙基)-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰胺；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丝氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}-L-丙氨酸；
N-{(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}甘氨酸；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-4-(甲基硫烷基)苯甲酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-(甲基硫烷基)乙酰胺；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基丙酰胺；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸甲酯；
4-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-4-氧代丁酸；
(2R)-22-[(3R/S)-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-2,5-二氧代吡咯烷-1-基]-2-[({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)甲基]-4,20-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,19-二氮杂二十二烷-1-酸；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1H-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺；
N-乙酰基-S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-L-半胱氨酸；
N-乙酰基-S-[2-([3-(L-丙氨酰基氨基)丙基]{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-L-半胱氨酸；
(2S)-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}四氢呋喃-2-甲酰胺；
3-({2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酸；
S-{2-[(3-氨基丙基){(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}高半胱氨酸；
4-氨基-N-(3-氨基丙基)-N-{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}苯甲酰胺；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸；
4-[(2-{[(2R)-2-({(2S)-2-氨基-4-[{(1R)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1H-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-{[(2R)-2-氨基-2-羧乙基]硫烷基}-4-氧代丁酸。
62.包含根据权利要求1至43的一项或多项的偶联物或根据权利要求48-61的化合物以及惰性无毒可药用辅助剂的药物组合物。
63.用在治疗和/或预防疾病的方法中的根据权利要求1至43的一项或多项的偶联物或根据权利要求48-61的化合物。
64.用在治疗过度增生和/或血管生成疾病的方法中的根据权利要求1至43的一项或多项的偶联物或根据权利要求48-61的化合物。
65.根据权利要求1至43的一项或多项的偶联物或根据权利要求48-61的化合物，其中R3a或R3代表–L-BINDER或取代的烷基、芳基或杂芳基，优选–L-#1或C1-10-烷基、C6-10-芳基或C6-10-芳烷基或C5-10-杂烷基，其可被–OH、O-烷基、SH、S-烷基、O-CO-烷基、O-CO-NH-烷基、NH-CO-烷基、NH-CO-NH-烷基、S(O)n-烷基、SO2-NH-烷基、NH-烷基、N(烷基)2、NH2或-(CH2)0-3Z取代，其中Z代表-H、卤素、-OY3、-SY3、-NHY3、-CO-NY1Y2或-CO-OY3，其中Y1和Y2彼此独立地代表H、NH2或-(CH2)0-3Z'，且Y3代表H或-(CH2)0-3Z'，其中Z'代表H、SO3H、NH2或COOH（其中“烷基”优选代表C1-10-烷基）。
66.使用有效量的至少一种根据权利要求1至43的一项或多项的偶联物或根据权利要求48-61的化合物治疗和/或预防人和动物的过度增生和/或血管生成疾病的方法。
67.根据下式之一的抗体偶联物，其中n是1至20的数值且AK1A和AK2A代表抗体：
其中ADC如果经基团连接到抗体上，也可代替这种基团而至少部分以连接到所述抗体上的水解开链琥珀酰胺的形式。
68.下列通式的结合体-活性物质：
其中BINDER代表结合体（优选：抗体）或其衍生物（优选：半胱氨酸残基），优选抗体，L代表连接体，WS代表活性物质，优选KSP抑制剂，m代表1至2的数值，n代表1至50的数值，其中L具有下示结构之一：
其中#1是指与结合体的硫原子的连接点，#2是指与活性物质的连接点且R22代表COOH、COOR、COR（其中R在每种情况下代表C1-3-烷基）、CONH2、Br，优选COOH；
L5是选自-(CH2)m-(CHRS)n-(OCH2CH2)o-(X)p-(CH2)q-的基团，其中m、n、o、p和q彼此独立地具有下列值：m=0-10；n=0或1；o=0-10；p=0或1；和q=0-10，其中m+n+o=1-15，优选1-6，X代表5或6元芳族或非芳族杂环或碳环，优选–C6H4-或-C6H10-，RS代表酸基，优选-COOH或SO3H，
L6是选自–CONH-、-OCONH-、-NHCO-、-NHCOO-、或的基团，其中r是1、2或3，
L7是单键或选自具有1至100（优选1至10）个碳原子的直链或支化的烃链的基团，所述烃链来自亚芳基和/或直链和/或支化和/或环状亚烷基并可被基团-O-、-S-、-SO-、SO2、-NRy-、-NRyCO-、-C(NH)NRy-、CONRy-、-NRyNRy-、-SO2NRyNRy-、-CONRyNRy-（其中Ry代表H、苯基、C1-C10-烷基、C2-C10-烯基或C2-C10-炔基，它们各自可被NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代）、-CO-、-CRx=N-O-（其中Rx代表H、C1-C3-烷基或苯基）和/或具有最多4个选自N、O和S、-SO-或–SO2-的杂原子的3至10元芳族或非芳族杂环（优选）的一个或多个中断一次或多次，其中如果存在烃链包括侧链，其可被-NHCONH2、-COOH、-OH、-NH2、NH-CNNH2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。
69.根据权利要求67至68的一项或多项的偶联物，其中所述抗体是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段。
70.根据权利要求69的偶联物，其中所述抗体是抗-HER2抗体、抗-EGFR抗体、抗-TWEAKR抗体或其抗原结合片段。
71.根据权利要求70的偶联物，其中所述抗-TWEAKR抗体特异性结合到TWEAKR（SEQ IDNO:169）的位置47中的氨基酸D（D47）上，优选抗-TWEAKR抗体TPP-2090。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107635586A (zh) * 2014-12-15 2018-01-26 拜耳医药股份有限公司 Ksp抑制剂与无糖基化抗‑tweakr抗体的抗体‑药物缀合物(adc)
CN109568321A (zh) * 2019-01-14 2019-04-05 山东轩竹医药科技有限公司 RORγ调节剂
CN110072556A (zh) * 2016-12-21 2019-07-30 拜耳制药股份公司 具有ksp抑制剂的特异性抗体药物缀合物(adc)
CN110312533A (zh) * 2016-12-21 2019-10-08 拜耳公司 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药
CN110312534A (zh) * 2016-12-21 2019-10-08 拜耳制药股份公司 具有酶促可裂解基团的抗体-药物-缀合物(adc)
CN114989040A (zh) * 2022-07-07 2022-09-02 南京正荣医药化学有限公司 一种吡唑解草酯中间体的合成方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114917361A (zh) * 2015-06-22 2022-08-19 拜耳医药股份有限公司 具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物（adc）和抗体前药缀合物（apdc）
CN107921146A (zh) * 2015-06-23 2018-04-17 拜耳医药股份有限公司 纺锤体驱动蛋白(ksp)抑制剂与抗‑cd123的抗体的抗体药物缀合物(adc)
MX2017017138A (es) * 2015-06-23 2018-04-30 Bayer Pharma AG Conjugados homogeneos especificos de sitio con inhibidores de ksp.
CA2990394A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-tweakr-antibodies
US20180185510A1 (en) * 2015-06-23 2018-07-05 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (ksp) inhibitors with anti-b7h3-antibodies
US11071788B2 (en) * 2015-06-23 2021-07-27 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates of kinesin spindel protein (KSP) inhibitors with antiB7H3-antibodies
CA2949032A1 (en) 2015-11-30 2017-05-30 Pfizer Inc. Site specific her2 antibody drug conjugates
EP3368056A4 (en) * 2016-01-26 2019-06-05 Raghoottama Pandurangi COMPOSITIONS AND METHODS FOR SENSITIZING TUMORS WITH LOW CARACTERIUM THERAPY REACTION
CN105646361B (zh) * 2016-02-17 2017-12-01 吉首大学 一种2,4,5‑三芳基咪唑型化合物及其制法和用途
BR112018069483A2 (pt) 2016-03-24 2019-07-30 Bayer Pharma AG pró-fármacos de medicamentos citotóxicos contendo grupos enzimaticamente cliváveis.
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
EP3919518A1 (en) 2016-06-15 2021-12-08 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates (adcs) with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
CA3103327A1 (en) 2018-06-18 2019-12-26 Bayer Aktiengesellschaft Binder/active agent conjugates directed against cxcr5, having enzymatically cleavable linkers and improved activity profile
AU2019341066B1 (en) * 2019-08-07 2021-04-01 Mabplex International Co., Ltd. Antibody-drug conjugates and uses thereof
CN111410689B (zh) * 2020-03-16 2021-11-02 重庆理工大学 抗hpv16e7蛋白单抗69e2、杂交瘤细胞株及其制备方法和应用
CN112701304B (zh) * 2021-01-07 2021-12-14 淮北德昇科技有限公司 一种海胆状P掺杂ZrMo2O8纳米催化剂的制备方法
WO2022245759A2 (en) * 2021-05-17 2022-11-24 Biohaven Therapeutics Ltd. Agents for directed conjugation techniques and conjugated products
WO2023288226A2 (en) * 2021-07-12 2023-01-19 Nektar Therapeutics Polymer engineered forms of interferon-gamma and methods of use

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004100873A2 (en) * 2003-05-07 2004-11-25 Cytokinetics, Inc. Compounds, compositions, and methods
CN1993331A (zh) * 2004-06-18 2007-07-04 希龙公司 N－(1－(1－苄基－4－苯基－1h－咪唑－2－基 )－2 , 2－二甲基丙基)苯甲酰胺衍生物和相关化合物作为用于治疗癌症的驱动蛋白纺锤蛋白(ksp)抑制剂
CN101253167A (zh) * 2005-08-09 2008-08-27 诺华有限公司 作为ksp抑制剂的取代的咪唑化合物
CN101622247A (zh) * 2007-01-05 2010-01-06 诺瓦提斯公司 作为驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂的咪唑衍生物
US7662581B1 (en) * 2003-12-18 2010-02-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Eg5 co-crystals
CN102076717A (zh) * 2008-04-30 2011-05-25 伊缪诺金公司 交联剂和它们的用途

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4714681A (en) 1981-07-01 1987-12-22 The Board Of Reagents, The University Of Texas System Cancer Center Quadroma cells and trioma cells and methods for the production of same
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE8808645U1 (zh) 1988-07-06 1988-08-25 Hofer, Daniel, 7730 Villingen-Schwenningen, De
US4925648A (en) 1988-07-29 1990-05-15 Immunomedics, Inc. Detection and treatment of infectious and inflammatory lesions
US5601819A (en) 1988-08-11 1997-02-11 The General Hospital Corporation Bispecific antibodies for selective immune regulation and for selective immune cell binding
EP0739904A1 (en) 1989-06-29 1996-10-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
WO1991005871A1 (en) 1989-10-20 1991-05-02 Medarex, Inc. Bispecific heteroantibodies with dual effector functions
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
AU667460B2 (en) 1990-10-05 1996-03-28 Medarex, Inc. Targeted immunostimulation with bispecific reagents
DE69128253T2 (de) 1990-10-29 1998-06-18 Chiron Corp Bispezifische antikörper, verfahren zu ihrer herstellung und deren verwendungen
JP3854306B2 (ja) 1991-03-06 2006-12-06 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング ヒト化及びキメラモノクローナル抗体
US5573920A (en) 1991-04-26 1996-11-12 Surface Active Limited Antibodies, and methods for their use
ES2193143T3 (es) 1992-03-05 2003-11-01 Univ Texas Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos.
DE69327620T2 (de) 1992-08-18 2000-08-03 Immunologia Molecular Ciudad D Monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor, Zellen und Verfahren zur ihrer Herstellung und sie erhaltende Zusammensetzungen
PT719859E (pt) 1994-12-20 2003-11-28 Merck Patent Gmbh Anticorpo monoclonal anti-alfa v-integrina
EP0859841B1 (en) 1995-08-18 2002-06-19 MorphoSys AG Protein/(poly)peptide libraries
DE69735294T2 (de) 1996-03-25 2006-09-21 Medarex Inc. Spezifische monoklonale antikörper für die extrazelluläre domäne von protasta-spezifischem membranantigen
US6150508A (en) 1996-03-25 2000-11-21 Northwest Biotherapeutics, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
EP1210374B1 (en) 1999-07-29 2006-10-11 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to prostate specific membrane antigen
EP1266009B1 (en) 2000-02-25 2008-12-31 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES ANTI-EGFRvIII SCFVS WITH IMPROVED CYTOTOXICITY AND YIELD, IMMUNOTOXINS BASED THEREON, AND METHODS OF USE THEREOF
KR100480985B1 (ko) 2000-05-19 2005-04-07 이수화학 주식회사 표피 성장 인자 수용체에 대한 사람화된 항체
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
AUPR395801A0 (en) 2001-03-26 2001-04-26 Austin Research Institute, The Antibodies against cancer
WO2003083041A2 (en) 2002-03-22 2003-10-09 Biogen, Inc. Cripto-specific antibodies
RS20110024A (en) 2001-04-26 2011-08-31 Biogen Idec Ma Inc. ANTIBODIES THAT BLOCK CRIPTO AND USE IT
ES2552281T3 (es) 2001-05-11 2015-11-26 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Proteínas de unión específica y usos de las mismas
IL159225A0 (en) 2001-06-13 2004-06-01 Genmab As Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (egfr)
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US20040249127A1 (en) 2001-07-12 2004-12-09 Olga Bandman Intracellular signaling molecules
SG114505A1 (en) 2001-10-17 2005-09-28 First Cube Pte Ltd System and method for facilitating delivery and return service
DE60232994D1 (de) 2001-12-06 2009-08-27 Merck & Co Inc Inhibitoren von mitotischem kinesin
US7282567B2 (en) 2002-06-14 2007-10-16 Immunomedics, Inc. Monoclonal antibody hPAM4
WO2003100033A2 (en) 2002-03-13 2003-12-04 Biogen Idec Ma Inc. ANTI-αvβ6 ANTIBODIES
WO2005056606A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Xencor, Inc Optimized antibodies that target the epidermal growth factor receptor
JP2006524693A (ja) 2003-04-11 2006-11-02 メディミューン，インコーポレーテッド ＥｐｈＡ２および非腫瘍性過増殖性細胞障害
KR101531400B1 (ko) 2003-06-27 2015-06-26 암젠 프레몬트 인코포레이티드 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그용도
WO2005009369A2 (en) 2003-07-21 2005-02-03 Immunogen, Inc. A ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
ES2376552T3 (es) 2003-11-25 2012-03-14 Novartis Ag Compuestos de quinazolinona como agentes antic�?ncer.
US7767792B2 (en) 2004-02-20 2010-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Antibodies to EGF receptor epitope peptides
WO2006074418A2 (en) 2005-01-07 2006-07-13 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
CA2560305C (en) 2004-03-19 2016-07-05 Imclone Systems Incorporated Human anti-epidermal growth factor receptor antibody
WO2006002326A2 (en) 2004-06-22 2006-01-05 Greystone Medical Group, Inc. Methods for treatment of wounds using time release compositions
US7449486B2 (en) 2004-10-19 2008-11-11 Array Biopharma Inc. Mitotic kinesin inhibitors and methods of use thereof
US20100093767A1 (en) 2004-12-03 2010-04-15 Takeda San Diego, Inc. Mitotic Kinase Inhibitors
US8603483B2 (en) 2004-12-09 2013-12-10 Janssen Biotech, Inc. Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses
GB0428250D0 (en) 2004-12-23 2005-01-26 Novartis Ag Organic compounds
SG170006A1 (en) 2005-02-18 2011-04-29 Medarex Inc Monoclonal antibodies against cd30 lacking fucosyl residues
GB0505969D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Novartis Ag Organic compounds
NZ609752A (en) 2005-08-24 2014-08-29 Immunogen Inc Process for preparing maytansinoid antibody conjugates
ES2527961T3 (es) 2005-09-26 2015-02-02 Medarex, L.L.C. Anticuerpos monoclonales humanos para CD70
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
WO2008004834A1 (en) 2006-07-06 2008-01-10 Isu Abxis Co., Ltd Humanized monoclonal antibody highly binding to epidermal growth factor receptor, egf receptor
PL2066349T3 (pl) 2006-09-08 2012-09-28 Medimmune Llc Humanizowane przeciwciała anty-CD19 i ich zastosowanie w leczeniu nowotworów, transplantacjach i leczeniu chorób autoimmunologicznych
EP1911766A1 (en) 2006-10-13 2008-04-16 Glycotope Gmbh Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
EP2428223A3 (en) 2006-09-10 2012-05-16 Glycotope GmbH Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
EP1900750A1 (en) 2006-09-18 2008-03-19 Glycotope Gmbh Fully human high yield production system for improved antibodies
AU2007299843B2 (en) 2006-09-18 2012-03-08 Xencor, Inc Optimized antibodies that target HM1.24
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
ES2523915T5 (es) 2006-12-01 2022-05-26 Seagen Inc Agentes de unión a la diana variantes y usos de los mismos
US8652466B2 (en) 2006-12-08 2014-02-18 Macrogenics, Inc. Methods for the treatment of disease using immunoglobulins having Fc regions with altered affinities for FcγRactivating and FcγRinhibiting
WO2008092117A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 Xencor, Inc. Immunoglobulins with modifications in the fcr binding region
EP2545938A1 (en) 2007-08-03 2013-01-16 Abbott Biotherapeutics Corp. Therapeutic use of anti-tweak receptor antibodies
JP5532486B2 (ja) 2007-08-14 2014-06-25 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ｅｇｆ受容体を標的とするモノクローナル抗体１７５ならびにその誘導体および用途
WO2009026274A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 Medarex, Inc. Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions
ES2424745T3 (es) 2007-09-07 2013-10-08 Agensys, Inc. Anticuerpos y moléculas relacionadas que se unen a las proteínas 24P4C12
US8039597B2 (en) 2007-09-07 2011-10-18 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 24P4C12 proteins
SI2215121T1 (sl) 2007-11-26 2016-06-30 Bayer Intellectual Property Gmbh Protitelesa anti-mezotelin in njihova uporaba
DK2242772T3 (en) 2007-12-26 2015-01-05 Biotest Ag Immunoconjugates that targets CD138, and uses thereof
BRPI0821447A2 (pt) 2007-12-26 2015-06-16 Biotest Ag Anticorpo de alvejamento engenheirado, composição farmacêutica, hibridoma, ensaio com base em anticorpo, polipeptídeo isolado, e, método para ligação homogênea
AU2009231991B2 (en) 2008-04-02 2014-09-25 Macrogenics, Inc. HER2/neu-specific antibodies and methods of using same
JP2011523414A (ja) 2008-05-15 2011-08-11 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 抗ｆｎ１４抗体、およびその使用
AU2009287163B2 (en) 2008-08-29 2014-11-13 Les Laboratoires Servier Recombinant anti-Epidermal Growth Factor Receptor antibody compositions
US20110275685A1 (en) * 2009-01-26 2011-11-10 Michael Mutz Salt and polymorphs of a kinesin inhibitor compound
DK2486141T3 (en) 2009-10-07 2018-04-23 Macrogenics Inc FC-REGION-CONTAINING POLYPEPTIDES THAT PROVIDE IMPROVED EFFECTOR FUNCTION BASED ON CHANGES OF THE SCOPE OF FUCOSYLATION AND PROCEDURES FOR THEIR USE
CN103826661B (zh) 2011-04-21 2019-03-05 西雅图基因公司 新的结合剂-药物缀合物(adc)及其用途
US8815226B2 (en) * 2011-06-10 2014-08-26 Mersana Therapeutics, Inc. Protein-polymer-drug conjugates
BR112013031819B1 (pt) 2011-06-10 2022-05-03 Mersana Therapeutics, Inc Suporte polimérico, composição farmacêutica, composto, e, uso do suporte
EP2968591A1 (en) * 2013-03-15 2016-01-20 Novartis AG Cell proliferation inhibitors and conjugates thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004100873A2 (en) * 2003-05-07 2004-11-25 Cytokinetics, Inc. Compounds, compositions, and methods
US7662581B1 (en) * 2003-12-18 2010-02-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Eg5 co-crystals
CN1993331A (zh) * 2004-06-18 2007-07-04 希龙公司 N－(1－(1－苄基－4－苯基－1h－咪唑－2－基 )－2 , 2－二甲基丙基)苯甲酰胺衍生物和相关化合物作为用于治疗癌症的驱动蛋白纺锤蛋白(ksp)抑制剂
CN101253167A (zh) * 2005-08-09 2008-08-27 诺华有限公司 作为ksp抑制剂的取代的咪唑化合物
CN101622247A (zh) * 2007-01-05 2010-01-06 诺瓦提斯公司 作为驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂的咪唑衍生物
CN102076717A (zh) * 2008-04-30 2011-05-25 伊缪诺金公司 交联剂和它们的用途

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107635586A (zh) * 2014-12-15 2018-01-26 拜耳医药股份有限公司 Ksp抑制剂与无糖基化抗‑tweakr抗体的抗体‑药物缀合物(adc)
CN107635586B (zh) * 2014-12-15 2021-09-24 拜耳医药股份有限公司 Ksp抑制剂与无糖基化抗-tweakr抗体的抗体-药物缀合物(adc)
CN110072556A (zh) * 2016-12-21 2019-07-30 拜耳制药股份公司 具有ksp抑制剂的特异性抗体药物缀合物(adc)
CN110312533A (zh) * 2016-12-21 2019-10-08 拜耳公司 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药
CN110312534A (zh) * 2016-12-21 2019-10-08 拜耳制药股份公司 具有酶促可裂解基团的抗体-药物-缀合物(adc)
CN110312534B (zh) * 2016-12-21 2023-04-04 拜耳制药股份公司 具有酶促可裂解基团的抗体-药物-缀合物(adc)
CN110072556B (zh) * 2016-12-21 2023-05-02 拜耳制药股份公司 具有ksp抑制剂的特异性抗体药物缀合物(adc)
CN110312533B (zh) * 2016-12-21 2023-11-03 拜耳公司 具有酶促可裂解的基团的细胞毒性活性剂的前药
CN109568321A (zh) * 2019-01-14 2019-04-05 山东轩竹医药科技有限公司 RORγ调节剂
CN109568321B (zh) * 2019-01-14 2022-02-22 山东轩竹医药科技有限公司 RORγ调节剂
CN114989040A (zh) * 2022-07-07 2022-09-02 南京正荣医药化学有限公司 一种吡唑解草酯中间体的合成方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106163568B (zh) 2021-03-23
TWI650136B (zh) 2019-02-11
EP3086814A1 (de) 2016-11-02
AU2014372833A1 (en) 2016-07-07
IL246124B (en) 2019-12-31
US10022453B2 (en) 2018-07-17
DK3086814T3 (da) 2020-09-14
JP2017507905A (ja) 2017-03-23
RU2016130121A3 (zh) 2018-08-27
KR102329024B1 (ko) 2021-11-19
BR112016014830A2 (pt) 2017-09-19
ZA201603585B (en) 2019-02-27
WO2015096982A1 (de) 2015-07-02
CA2934617A1 (en) 2015-07-02
TW201536328A (zh) 2015-10-01
PE20160996A1 (es) 2016-11-09
US20160346402A1 (en) 2016-12-01
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