DE69735294T2 - Spezifische monoklonale antikörper für die extrazelluläre domäne von protasta-spezifischem membranantigen - Google Patents

Spezifische monoklonale antikörper für die extrazelluläre domäne von protasta-spezifischem membranantigen Download PDF

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Description

  • 1. GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die an die extrazelluläre Domäne des Prostata-spezifischen Membran-Antigens (PSMA) binden, Hybridomzelllinien, welche die Antikörper bilden, und Methoden zur Verwendung derartiger Antikörper zur Diagnose und Behandlung von Krebs. Insbesondere betrifft sie einen monoklonalen Antikörper, der gegen ein synthetisches Peptid erzeugt wird, das im Wesentlichen homolog zu einem Teilstück der carboxyterminalen Region von PSMA ist, wobei der Antikörper mit PSMA reagiert, das auf einer Tumorzelloberfläche und in Seren von Patienten mit Prostatakarzinom exprimiert wird. Zusätzlich betrifft sie zwei monoklonale Antikörper, die gegen ein Prostatakarzinom-Membranpräparat erzeugt wurden, wobei die Antikörper auch mit PSMA reagieren, das auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine neue Proteinvariante (PSM') von PSMA, die durch die Antikörper nachgewiesen wird.
  • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Prostatakarzinom ist die zweithäufigste Ursache für Krebstod unter Männern. Tatsächlich ist das Prostatakarzinom der häufigste nicht die Haut betreffende Krebs, der bei amerikanischen Männern diagnostiziert wird. Die Zahl der Männer, bei denen ein Prostatakarzinom diagnostiziert wird, nimmt als Ergebnis der zunehmenden Population älterer Männer sowie eines größeren Bewusstseins der Krankheit, das zu ihrer früheren Diagnose führt (Parker et al., 1997, CA Cancer J. for Clin. 47: 5–28), stetig zu. Es wurde vorhergesagt, dass im Jahre 1997 bei über 334.500 Männern ein Prostatakarzinom diagnostiziert würde, und dass sich ungefähr 41.800 Todesfälle aus der Krankheit ergeben würden. Das Lebenszeitrisiko für Männer, ein Prostatakarzinom zu entwickeln, ist etwa 1 zu 5 für Weiße und 1 zu 6 für Afroamerikaner. Gruppen mit hohem Risiko werden durch solche mit einer für Prostatakarzinom positiven Familiengeschichte oder Afroamerikaner vertreten. Über die Lebenszeit sterben mehr als 213 der Männer, bei denen ein Prostatakarzinom diagnostiziert wird, an der Krankheit (Wingo et al., 1996, CA Cancer J. for Clin. 46: 113–25). Darüber hinaus erfordern viele Patienten, die dem Prostatakarzinom nicht erliegen, kontinuierliche Behandlung, um Symptome wie Schmerzen, Blutung und Harnsperre zu lindern. Daher stellt das Prostatakarzinom auch eine Hauptursache für Leiden und erhöhte Kosten der medizinischen Versorgung dar (Catalona, 1994, New Eng. J. Med. 331: 996–1004).
  • PSMA ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 120 kD, das in Prostatageweben exprimiert wird, und wurde ursprünglich durch Reaktivität mit einem monoklonalen Antikörper identifiziert, der als 7E11-C5 bezeichnet wird (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7: 927–935; U.S. Patent Nr. 6.162.504). PSMA wurde in gereinigter Form erhalten (Wright et al., 1990, Antibody Immunoconjugates and Radio Pharmaceuticals 3: Abstract 193) und als ein Transmembranprotein des Typs II mit Sequenzidentität mit dem Transferrin-Rezeptor charakterisiert (Israeli et al. 1994, Cancer Res. 54: 1807–1811) und mit NAALADase-Aktivität (Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 749–753). Noch wichtiger ist, dass PSMA in erhöhten Mengen im Prostatakarzinom exprimiert wird und dass erhöhte PSMA-Spiegel auch in den Seren dieser Patienten nachweisbar sind (Horoszewicz et al., 1987, vorstehend; Rochon et al., 1994, Prostate 25: 219–223; Murphy et al., 1995, Prostate 26: 164–168 und Murphy et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1473–1479). Eine für PSMA codierende cDNA ist kloniert worden (Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227–230), und sie bildet zwei alternativ gespleisste mRNA-Spezies: eine 2.653 Nukleotide enthaltende mRNA-Spezies, die für PSMA codiert, und eine zweite, 2.387 Nukleotide enthaltende mRNA-Spezies, die als PSM' bezeichnet wird (Su et al., 1995, Cancer Res. 55: 1441–1443). WO96/08570 offenbart ein Fusionsprotein, das ein Teilstück der Aminosäuresequenz umfasst, die für die extrazelluläre Domäne von PSMA codiert. Es beschreibt ferner Methoden zum Konstruieren eines Expressionsvektors, Translation, Reinigung und Spaltung eines PSMA-Immun-Fusionsproteins und Verwendung von gereinigter extrazellulärer Domäne von PSMA, um Mäuse zu immunisieren. Die Isolierung von für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifischen Antikörpern wird jedoch nicht beschrieben.
  • WO94/09820 beschreibt eine cDNA für PSMA (als PSM' bezeichnet) und Vektoren zur Expression von PSM'. Es beschreibt ferner eine Methode zum Auswählen von hydrophilen Aminosäurepeptiden zur Verwendung als Immunogene, um für PSMA spezifische Antikörper zu bilden. Es werden jedoch keine für PSMA spezifischen Antikörper offenbart.
  • Leek et al., 1995, Br. J. Cancer 72, 583–588, beschreiben die Charakterisierung des Gens, das für PSMA codiert, genauer gesagt, dass genomische PSMA-Klone auf zwei Loci auf dem menschlichen Chromosom 11 kartieren.
  • Vor der vorliegenden Erfindung war nicht bekannt, ob PSM' für ein Proteinprodukt codiert oder nur als untranslatierte mRNA-Spezies existierte, weit ein PSM'-Proteinprodukt niemals nachgewiesen worden war. WO06/26272 beschreibt zum Beispiel eine isolierte Säuger-DNA- und -mRNA-Sequenz, von der vorhergesagt wird, dass sie für ein alternativ gespleisstes PSM'-Antigen codiert. Dieses Dokument offenbart jedoch an keinem Punkt spezifisch ein translatiertes PSM'-Proteinprodukt von der definierten mRNA-Sequenz.
  • Ein neuester Bericht von Carter et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 749– 753) zeigt einen hohen Grad an Identität zwischen 1428 Basen, die ein Teilstück der cDNA von PSMA darstellen, und der cDNA-Sequenz des Proteins N-acetylierte α-verknüpfte saure Dipeptidase (NAALADase). NAALADase weist enzymatische Aktivität gegenüber dem Neuropeptid N-Acetylaspartylglutamat auf, um Glutamat und N-Acetylaspartat zu ergeben. Dieser Bericht demonstriert eine NAALADase-Aktivität, die dem PSMA-Protein eigen ist, aber das katalytische Teilstück von PSMA wurde nicht identifiziert. NAALADase-Aktivität wurde in LNCaP-Zellen festgestellt, die PSMA exprimierten, aber nicht in PC3-Zellen, die PSMA nicht exprimieren. Eine Transfektion der cDNA für PSMA in PC3-Zellen stellte NAALADase-Aktivität und die Anwesenheit von PSMA in diesen Zellen her.
  • Der Unterschied zwischen der cDNA von PSMA und PSM' ist der Verlust der transmembranen und intrazellulären codierenden Regionen, welche die Nukleotide # 1–171 oder Aminosäuren # 1–57 enthalten. PSMA wird als ein Membranprotein des Typs II beschrieben und es ist bekannt, dass sich die funktionelle katalytische Domäne von Membranproteinen des Typs II in der C-terminalen extrazellulären Region des Moleküls befindet (DeVries et al., 1995, J. Biol. Chem., 270: 8712–8722).
  • PSM'-mRNA wird in größeren Mengen in normalen Prostatageweben im Vergleich zu Prostatageweben von Patienten mit benigner Hyperplasie oder Prostatakarzinom gefunden (Su et al., 1995, vorstehend). Im Gegensatz dazu wird PSMA-mRNA in größeren Mengen in Patienten mit Prostatakarzinom im Vergleich zu Patienten ohne Prostatakarzinom gefunden (Su et al., 1995, vorstehend). Dieser beobachtete Unterschied ist mit den zuvor beschriebenen Serumspiegeln von PSMA vereinbar (Horoszewicz et al., 1987, vorstehend; Rochon et al., 1994, vorstehend; Murphy et al., 1995, vorstehend und Murphy et al., 1995, vorstehend). In diesem Zusammenhang ist ein erhöhter Spiegel von PSMA in Seren von Patienten mit Prostatakarzinom mit Krankheitsprogression im Gegensatz zur Remission korreliert worden und kann als prognostischer Marker verwendet werden (Murphy et al., 1995, vorstehend).
  • Das durch den monoklonalen Antikörper 7E11-C5 erkannte Epitop ist auf die ersten 6 Aminosäuren der intrazellulären N-terminalen Region von PSMA kartiert worden (Troyer et al., 1995, Urol. Oncol. 1: 29–37) (1). Durch Elektronenimmunzytochemie unter Verwendung von 7E11-C5 wurde dessen Epitop auf das Zytoplasma und genauer gesagt auf die innere Lamelle der Plasmamembran lokalisiert (Troyer et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35: 283, Abstract 1688). Darüber hinaus färbt der monoklonale Antikörper 7E11-C5 in in-vitro-Tests nur fixierte und permeabilisierte Zellen (Horoszewicz et al., 1987, vorstehend), was in Übereinstimmung mit der Kartierung des Epitops von 7E11-C5 auf den N-Terminus oder die intrazelluläre Domäne von PSMA ist. Während 7E11-C5 zum Nachweisen des Prostatakarzinoms in vivo nützlich ist, das dessen Epitop vermutlich durch Nekrose und/oder Apoptose freilegt, würde ein für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifischer monoklonaler Antikörper einen effizienteren Nachweis von PSMA auf der Oberfläche der Krebszelle ermöglichen. Zusätzlich erkennt der monoklonale Antikörper 7E11-C5 PSM' nicht, da PSM', beruhend auf der Sequenz seines mRNA-Transkriptes, die intrazelluläre Domäne von PSMA fehlt.
  • Das Zitieren oder Identifizieren einer Referenz in diesem Abschnitt oder in einem anderen Abschnitt dieser Anmeldung soll nicht als Zugeständnis ausgelegt werden, dass eine derartige Referenz als Stand der Technik für die vorliegende Erfindung erhältlich ist.
  • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifische monoklonale Antikörper, Hybridomzelllinien, welche die Antikörper bilden, und Methoden zur Verwendung der Antikörper zur Diagnose und Behandlung des Prostatakarzinoms, sowie eine variante, als PSM' bekannte Proteinform von PSMA, die durch derartige Antikörper erkannt wird.
  • Die Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung von drei monoklonalen Antikörpern, welche die extrazelluläre Domäne von PSMA erkennen, durch die Anmelder. Ein Antikörper wurde durch Immunisieren von Mäusen mit einem C-terminalen Peptid von PSMA mit der Aminosäuresequenz ESKVDPSK (SEQ. ID NO: 1) erzeugt. Der Antikörper reagiert mit den Proteinen PSMA und PSM' in Lysaten von Tumorzellen und in Seren von Patienten mit Prostatakarzinom. Zusätzlich färbt er intakte lebende Tumorzellen, was seine Spezifität für die extrazelluläre Domäne der Proteine PSMA oder PSM' bestätigt. Der Antikörper weist PSM' auch in menschlichen Samenflüssigkeiten nach und das PSM' darin weist NAALADase-Aktivität auf. Zwei zusätzliche monoklonale Antikörper wurden gegen ein Prostatakarzinom-Membranpräparat erzeugt. Diese Antikörper reagieren auch mit der extrazellulären Domäne von PSMA und PSM', einschließlich von nativem PSMA, das durch Immunaffinitätsreinigung isoliert wird, und von rekombinantem PSMA, das durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt wird. Die Antikörper sind in Kombination mit einem Antikörper, der gegen die intrazelluläre Domäne von PSMA gerichtet ist, in einem zwei-Stellen Capture-Assay nützlich, um die Anwesenheit von PSMA in einer Testprobe nachzuweisen. Darüber hinaus können alle drei hierin offenbarten Antikörper in einem zwei-Stellen Capture-Assay verwendet werden, um die Anwesenheit von PSM' in einer Testprobe nachzuweisen.
  • Eine große Vielfalt von Verwendungen wird durch die vorliegende Erfindung umfasst, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Entwicklung und Verwendung eines Immunoassays zum Nachweis oder zur Stadienbestimmung des Prostatakarzinoms bei einem Patienten, Abbildung des primären und/oder metastatischen Prostatakazinoms in vivo, therapeutische Verwendungen der Antikörper, einschließlich Verwendungen von Antikörpern, die an ein zytotoxisches oder chemotherapeutisches Mittel gekoppelt sind; und Konstruktion und Verwendung von Antikörperfragmenten, chimären Antikörpern, humanisierten Antikörpern oder bifunktionellen Antikörpern.
  • 4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1. Abgeleitete Aminosäuresequenzen der Antigene PSMA und PSM' (SEQ ID NO: 2) (Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54: 1807–1811). PSM'-mRNA enthält das 5'-Ende von PSMA nicht, das für die ersten 57 Aminosäuren codieren würde (erste Zeile der Aminosäuresequenz) und beginnt daher vermutlich bei Aminosäure 58. Vor der vorliegenden Erfindung war PSM' jedoch niemals in Proteinform identifiziert worden. Die unterstrichene Region ist die mutmaßliche Transmembrandomäne und die fette Region (Aminosäure # 716–723) ist ein Peptid, das für die Entwicklung eines monoklonalen Antikörpers ausgewählt wurde.
  • 2. Demonstration des monoklonalen Antikörpers 3F5.4G6 (ein Subklon, der von dem primären Hybridom 3F5 abgeleitet ist) und dessen Reaktivität mit einem PSMA entsprechenden, im LNCaP-Lysat vorliegenden Protein mit einem Molekulargewicht von 120 kD. Der Western-Blot wurde mit dem sekundären Antikörper HRP-anti-IgG entwickelt. Spur 1 = LNCaP-Lysat, sondiert mit 7E11-C5; Spur 2 = LNCaP-Lysat, sondiert mit 3F5.4G6.
  • 3. Demonstration durch Western-Blot von PSMA in Seren von Patienten mit Prostatakarzinom (Stadium D2) unter Verwendung der monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 (Spuren 3 und 4) und 7E11-C5 (Spuren 1 und 2) als Kontrolle.
  • 4. Western-Blot-Assay von LNCaP-Lysaten unter Verwendung der monoklonalen Antikörper 7E11-C5 (Spur 1) und 3F5.4G6 (Spur 2) und mit dem sekundären Antikörper RP-anti-IgM entwickelt. Sowohl 7E11-C5 als auch 3F5.4G6 erkannten ein Protein mit einem Molekulargewicht von 120 kD.
  • Zusätzlich erkannte 3F5.4G6 auch ein Protein mit einem Molekulargewicht von 105–110 kD, das der vorhergesagten Proteinform von PSM' entspricht. Es sollte angemerkt werden, dass 7E11-C5 PSM' nicht erkannte, weil das Epitop des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 in PSM' nicht gefunden wurde. Der Antikörper 3F5.4G6 erkennt das C-terminale Teilstück des Proteins (Aminosäure # 716–723), das der extrazellulären Domäne von PSMA und PSM' entspricht.
  • 5. Demonstration, dass die monoklonalen Antikörper 7E11-C5 und 3F5.4G6 ein identisches Protein erkannten, aber dass 3F5.4G6 ein zusätzliches Protein erkannte, das PSM' entspricht. LNCaP-Lysat wurde anfänglich mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5 immunpräzipitiert und das immunpräzipitierte Material auf SDS-Gelen aufgetrennt und in einem Western-Blot-Assay entweder mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5 (Spuren 1– 4) oder mit 3F5.4G6 (Spuren 5–8) sondiert. Spuren 1 und 5 waren rohes LNCaP-Lysat; Spuren 2 und 6 waren vorgeklärtes LNCaP-Lysat; Spuren 3 und 7 waren Material, das mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5 immunpräzipitierte; und Spuren 4 und 8 waren Proteine, die im zuvor immunpräzipitierten LNCaP-Lysat übrig geblieben waren. Der Antikörper 7E11-C5 immunpräzipitierte ein Protein von 120 kD (Spur 3), das auch durch 3F5.4G6 erkannt wurde (Spur 7). Nach der Immunpräzipitation mit 7E11-C5 wurde jedoch ein zweites Protein durch 3F5.4G6 erkannt (Spur 8), das durch 7E11-C5 nicht präzipitiert wurde (Spur 4) und das PSM' entsprach. Daher erkennt 7E11-C5 PSM' nicht.
  • 6. Demonstration, dass die monoklonalen Antikörper 7E11-C5 und 3F5.4G6 ein identisches 120 kD großes Protein erkannten. PSMA wurde aus einem LNCaP-Lysat durch den monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 immunpräzipitiert, die Proteine im Immunpräzipitat wurden auf einem SDS-Gel getrennt, auf Immobilon P übertragen und in einem Western-Blot mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5 sondiert. Spur 1 = LNCaP-Lysat, Kontrolle und mit 7E11-C5 sondiert; Spur 2 = Immunpräzipitation mit 3F5.4G6.
  • 7A & B Demonstration der Erkennung lebender LNCaP-Zellen durch den monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 durch FACS-Analyse, wodurch die Antikörperbindung an die extrazelluläre Domäne von PSMA veranschaulicht wird. 7A repräsentiert eine Kontrolle ohne primären Antikörper und 7B repräsentiert LNCaP-Zellen, die vor der FACS-Analyse mit 100 μg/ml 3F5.4G6 inkubiert wurden. Der Shift nach rechts zeigt die Bindung des Antikörpers an lebende LNCaP-Zellen an.
  • 8. Demonstration der Reaktivität des monoklonalen Antikörpers 3F5.4G6 mit PSM', das aus Samenflüssigkeit isoliert und gereinigt wurde. Spur 1 ist LNCaP-Lysat und Spur 2 ist gereinigtes PSM' aus Samenflüssigkeit. Die Proteine wurde auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf Immobilon P Papier übertragen und mit dem monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 durch Western-Blot-Verfahren sondiert. Das aus der Samenflüssigkeit gereinigte und in Spur 2 dargestellte Protein hat ein Molekulargewicht von 90kD und ist wahrscheinlich ein nicht glykosyliertes oder teilweise glykosyliertes Produkt von PSM' mit einem Molekulargewicht von 105–110 kD.
  • 9. Demonstration der Reaktivität der monoklonalen Antikörper 3D7-1.1 und 4E10-1.14 mit nativem PSMA und drei PSMA-Fragmenten. Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit nativem PSMA oder einem der drei in Bakterien exprimierten Polypeptidfragmente von PSMA beschichtet und man ließ sie in einem ELISA mit Hybridomüberständen reagieren. Während alle drei getesteten Antikörper vergleichbare Bindung an natives PSMA zeigten, reagierten 3D7-1.1 und 4E10-1.14 stark mit einem Frament, das einem Epitop in der extrazellulären Domäne von PSMA entspricht.
  • 10. Western-Blot-Analyse von PSMA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 3D7-1.1. Spur 1 = LNCaP-Lysat; Spur 2 = PC-3-Lysat; Spur 3 = immunaffinitätsgereinigtes PSMA.
  • 11. Western-Blot-Analyse von PSMA voller Länge, das in Baculovirus exprimiert wurde. Rekombinantes PSMA wurde auf einem SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, elektrisch übertragen und mit verschiedenen Antikörperpräparaten sondiert.
    Spur 1 = leer;
    Spur 2 = Kontrollmedium (20% FCS in RPMI 1640);
    Spur 3 = monoklonaler Antikörper 3D7-1.1;
    Spur 4 = monoklonaler Antikörpe 3D7-1.2;
    Spur 5 = monoklonaler Antikörper 3D7-1.3;
    Spur 6 = monoklonaler Antikörper 3D7-1.7;
    Spur 7 = monoklonaler Antikörper 3D7-2.7;
    Spur 8 = (ursprünglicher) monoklonaler Antikörper 4E10;
    Spur 9 = monoklonaler Antikörper 4E10-1.3;
    Spur 10 = monoklonaler Antikörper 4E10-1.14;
    Spur 11 = leer;
    Spur 12 = leer;
    Spur 13 = monoklonaler Antikörper 7E11-C5.
  • 12A–D Demonstration der Erkennung von lebenden LNCaP-Zellen durch die monoklonalen Antikörper 3D7-1.1 und 4E10-1.14 durch FACS-Analyse, wodurch die Antikörperbindung an die extrazelluläre Domäne von PSMA veranschaulicht wird. 12A stellt LNCaP-Zellen, die mit 4E10-1.14 inkubiert wurden, dar. 12B stellt PC-3-Zellen, die mit 4E10-1.14 inkubier wurden, dar. 12C stellt LNCaP-Zellen, die mit 3D7-1.1 inkubiert wurden, dar. 12D stellt PC-3-Zellen, die mit 3D7-1.1 inkubiert wurden, dar. Die unterschiedlichen Muster im Shift nach rechts in den 12A und 12C legt nahe, dass die beiden Antikörper unterschiedliche Epitope von PSMA erkennen können.
  • 13. Nachweis von PSMA durch einen zwei-Stellen Capture-ELISA unter Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern gegen unterschiedliche Epitope von PSMA. Seriell verdünntes, immunaffinitätsgereinigtes PSMA wurde zu Platten mit 96 Vertiefungen, die mit 7E11-C5 beschichtet waren, gegeben und durch Inkubieren mit den Überständen von 3D7-1.1 oder 4E10-1.14 nachgewiesen. Die Absorption bei 405 nm wurde in einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. –•– = 3D7-1.1; –∎– = 4E10-1.14.
  • 14. Nachweis von PSMA in einer Vielfalt biologischer Proben durch einen zwei-Stellen Capture-ELISA unter Verwendung der monoklonalen Antikörper 3D7-1.1 und 4E10-1.14.
  • 15. Nachweis von immunaffinitätsgereinigtem PSMA, das in normalem menschlichen Serum seriell verdünnt wurde, durch einen zwei-Stellen Capture-ELISA unter Verwendung der monoklonalen Antikörper 3D7-1.1 und 4E10-1.14.
  • 16. Nachweis von PSMA durch einen anderen zwei-Stellen Capture-ELISA. Seriell verdünntes, immunaffinitätsgereinigtes PSMA wurde zu Platten mit 96 Vertiefungen, die mit 3D7-1.1 beschichtet waren, gegeben und durch Inkubieren mit biotinyliertem 7E11-C5 (40 μg/ml), gefolgt von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Streptavidin nachgewiesen. Die Absorption bei 405 nm wurde in einem Mikorplatten-Lesegerät gemessen. 7E11-C5 wurde unter Verwendung des E-Z Verknüpfungs-Biotinylierungskits (Pierce) gemäß den Anleitungen des Herstellers biotinyliert.
  • 17. Western-Blot-Analyse eines LNCaP-Zelllysats und verschiedener Fraktionen eines halb gereinigten PSMA-Fragments (das den Aminosäuren 134 bis 750 des PSMA voller Länge entspricht und als ein 1,9 kb großes Insert in einem Baculovirus-Expressionssystem exprimiert wird), sondiert mit Gewebekulturüberstand des Hybridoms 4E10-1.14. Die Identifizierung des Proteinprodukts von dem 1,9 kb großen Konstrukt (Aminosäuren 134–750 von PSMA) wird durch den Pfeil angemerkt.
  • Spur 1 = Marker; Spur 2 = rohes LNCaP-Zelllysat; Spur 3 = Virales Pellet, d. h. 100.000 × g – Pellet lysierter SF9-Zellen, die mit einem Baculovirus, das ein 1,9 kb großes PSMA-Fragment exprimiert, infiziert sind; Spur 4 = 100.000 × g Überstandsfraktion aus lysierten SF9-Zellen, die mit einem Baculovirus, das ein 1,9 kb großes PSMA-Fragment exprimiert, infiziert wurden; Spur 5 = Durchfluss der in Spur 4 gezeigten Fraktion nach Passage durch eine Ni-NTA-Matrix; Spur 6 = Elution der Ni-NTA-Matrix mit 0,5 M NaCl; Spur 7 = Elution der Ni-NTA-Matrix mit 1 M Imidazol, pH 7,6; Spur 8 = Durchfluss der in Spur 4 gezeigten Fraktion nach Passage durch eine Ni-NTA-Matrix; Spur 9 = Elution der Ni-NTA-Matrix mit 0,5 M NaCl; und Spur 10 = Elution der Ni-NTA-Matrix mit 1 M Imidazol, pH 7,6. Es ist auch die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers 4E10-1.14 mit nativem PSMA voller Länge, das in LNCaP-Zellen exprimiert wird, in Spur 2 anzumerken.
  • 18. Western-Blot von Rohlysaten von SF9-Zellen, die mit einem Baculovirus infiziert wurden, das entweder ein Irrelevantes Insert oder ein 1,9 kb großes Insert enthält, das für ein Teilstück von PSMA (Aminosäuren 134–750 des PSMA voller Länge) codiert, sondiert mit dem Antikörper 7E11-C5. Spuren 1, 2 = Molekulargewichtsmarker; Spur 3 = SF9-Zelllysat, das mit einem irrelevanten Virus infiziert wurde; Spur 4 = SF9-Zelllysat; und Spur 5 = SF9-Lysat, das mit einem Virus infiziert wurde, das ein 1,9 kb großes PSMA-Insert enthält. Es ist anzumerken, dass keine für 7E11-C5 positiven Banden mit irgendwelchen Proteinprodukten, die in SF9-Zellen oder den mit einem der Viren infizierten Zellen vorliegen, beobachtet wurden.
  • 19. Western-Blot von PSMA und PSM', die aus LNCaP-Zellen, menschlicher Samenflüssigkeit und menschlichem Serum erhalten wurden, sondiert mit dem monoklonalen Antikörper 3D7-1.1. Spur 1 = LNCaP-Zelllysat; Spur 2 = mit 7E11-C5 immunaffinitätsgereinigtes PSMA aus LNCaP-Zellen; Spur 3 = menschliche Samenflüssigkeit; und Spur 4 = menschliches männliches Serum. Die Positionen von PSMA und PSM' sind angegeben.
  • 5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifische monoklonale Antikörper, Methoden zur Verwendung derartiger Antikörper und eine verkürzte Proteinvariante, PSM', die durch derartige Antikörper identifiziert wird. Obwohl die spezifischen Verfahren und Methoden, die hierin beschrieben werden, beispielhaft erläutert werden, indem ein C-terminales Peptid oder ein Membranpräparat eines PSMA exprimierenden Tumors verwendet wird, um Mäuse zu immunisieren, sind sie für die Durchführung der Erfindung lediglich veranschaulichend. Analoge Verfahren und Techniken sind auf eine Vielzahl von Wirtstieren, die gegen PSMA in Form von Protein, Peptiden, Zelloberflächenantigen und rohen Membranpräparaten immunisiert werden, ebenso anwendbar.
  • 5.1 HYBRIDOMZELLLINIEN UND ANTIKÖRPERBILDUNG
  • In einer spezifischen Ausführungsform, die im nachstehenden Abschnitt 6 als Beispiel angegeben wird, wurde ein synthetisches Peptid, das von der C-terminalen Region von PSMA abgeleitet ist, als Immunogen verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Antikörper, der als 3F5.4G6 bezeichnet wird, an die extrazelluläre Domäne von PSMA bindet, die auf der Zelloberfläche lebender Prostatakarzinomzellen und in den Seren von Patienten mit Prostatakarzinom freigelegt wird. Zusätzlich demonstriert ein zweites Arbeitsbeispiel in Abschnitt 7, nachstehend, die Herstellung von zwei monoklonalen Antikörpern, die gegen die extrazelluläre Domäne von PSMA gerichtet sind nach einer Immunisierung von Tieren mit einem einem PSMA exprimierenden Tumormembranpräparat. In diesem Zusammenhang können Krebszellen wie LNCaP, die PSMA exprimieren, Wirtszellen, die mit einer für PSMA codierenden Sequenz transfiziert sind, gereinigtes PSMA, PSM' oder Peptide der extrazellulären Domäne von PSMA als Immunogen verwendet werden, um eine Immunreaktion in Wirtstieren zur Erzeugung monoklonaler Antikörper, die spezifisch für die extrazelluläre Domäne von PSMA sind, hervorzurufen.
  • Somatische Zellen mit dem Potenzial zur Bildung von Antikörpern und besonders B-Lymphozyten sind zur Fusion mit einer B-Zell-Myelom-Linie geeignet. Jene Antikörperbildenden Zellen, die sich im teilenden Plasmablast-Stadium befinden, fusionieren bevorzugt. Somatische Zellen können aus den Lymphknoten, Milzen und aus periphe rem Blut von antigen-stimulierten Tieren erhalten werden, und die lymphatischen Zellen der Wahl hängen zu einem großen Ausmaß von ihrer empririschen Brauchbarkeit in dem jeweiligen Fusionssysstem ab. Einmal stimulierte oder hyperimmunisierte Tiere können als Quelle von Antikörper-bildenden Lymphozyten verwendet werden. Maus-Lymphozyten ergeben einen höheren Prozentsatz stabiler Fusionen mit den nachstehend beschriebenen Maus-Myelom-Linien. Von diesen wird die BALB/c-Maus bevorzugt. Andere Maus-Stämme, Kaninchen, Hamster, Schafe und Frosch können auch als Wirte zum Herstellen von Antikörper-bildenden Zellen verwendet werden. Wie durch Goding besprochen (in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. Ausg., S. 60–61, Orlando, Fla, Academic Press, 1986), kann die Verwendung von Ratten-Lymphozyten einige Vorteile bereitstellen.
  • Alternativ dazu sind menschliche somatische Zellen, die fähig sind, Antikörper zu bilden, genauer gesagt B-Lymphozyten, zur Fusion mit Myelom-Zelllinien geeignet. Während B-Lymphozyten aus biopsierten Milzen, Mandeln oder Lymphknoten eines Individuums verwendet werden können, werden die leichter zugänglichen B-Lymphozyten des peripheren Blutes bevorzugt. Die Lymphozyten können aus Patienten abgeleitet werden, bei denen Prostatakarzinome diagnostiziert wurden. Zusätzlich können menschliche B-Zellen durch das Epstein-Barr-Virus direkt immortalisiert werden (Cole et al., 1995, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96).
  • Myelom-Zelllinien, die zur Verwendung bei Hybridom-bildenden Fusionsverfahren geeignet sind, bilden vorzugsweise keine Antikörper, haben eine hohe Fusionseffizienz und Enzymdefizienzen, die sie unfähig machen, in bestimmten selektiven Medien zu wachsen, die das Wachstum der erwünschten Hybridome unterstützen. Beispiele für derartige Myelom-Zelllinien, die zur Herstellung von Hybriden fusionierter Zellen der Erfindung verwendet werden können, schließen P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4.1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 Bu 1, die alle aus Mäusen abgeleitet sind, R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210, die aus Ratten abgeleitet sind, und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON HMy2, UC729-6, die alle aus Menschen abgeleitet sind, ein (Goding in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. Ausg., S. 65–66, Orlando, Fla, Academic Press, 1986; Campbell, in Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 13, Burden und Von Knippenberg, Hrsg., S. 75–83, Amsterdam, Elseview, 1984).
  • Methoden zum Erzeugen von Hybriden aus Antikörper-bildenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen normalerweise das Mischen somatischer Zellen mit Myelomzellen in einem Verhältnis von 2 : 1 (obwohl das Verhältnis von etwa 20 : 1 bis etwa 1 : 1 variieren kann), in Anwesenheit eines Mittels oder von Mitteln (chemisch oder elektrisch), die die Fusion von Zellmembranen fördern. Es wird oft bevorzugt, dass die gleiche Tierart als Quelle der somatischen Zellen und Myelomzellen, die in dem Fusionsverfahren verwendet werden, dienen soll. Fusionsmethoden sind von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497; 1976, Eur. J. Immunol. 6: 511–519), und von Gefter et al. (1977, Somatic Cell Genet. 3: 231–236) beschrieben worden. Die von diesen Forschern verwendeten, die Fusion fördernden Mittel waren Sendai Virus bzw. Polyethylenglycol (PEG). Die von Goding (1986, in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. Ausg., S. 71–74, Orlando, Fla, Academic Press) besprochenen Fusionsmethoden, einschließlich der vorstehenden, sowie auch elektrisch induzierte Fusion, sind auch geeignet, um monoklonale Antikörper der Erfindung zu erzeugen. Fusionsverfahren stellen normalerweise lebende Hybride mit sehr niedriger Häufigkeit her, etwa 1 × 10–6 bis 1 × 10–8 somatische Zellen. Wegen der niedrigen Häufigkeit, mit der lebene Hybride erhalten werden, ist es wesentlich, ein Mittel zu haben, um fusionierte Zellhybride aus den verbleibenden unfusionierten Zellen, besonders den unfusionierten Myelomzellen auszuwählen. Ein Mittel zum Nachweisen der erwünschten Antikörper-bildenden Hybridome unter den anderen sich ergebenden fusionierten Zellhybriden ist auch notwendig.
  • im Allgemeinen werden die fusionierten Zellen in selektiven Medien gezüchtet, zum Beispiel HAT-Medium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält. HAT-Medium gestattet die Proliferation von Hybridzellen und verhindert das Wachstum von unfusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unbegrenzt weiter teilen würden. Aminopterin blockiert die de-novo-Synthese von Purin und Pyrimidin durch Hemmen der Bildung von Tetrahydrofolat. Die Zugabe von Thymidin umgeht die Blockierung in der Pyrimidin-Synthese, während Hypoxanthin in die Medien eingeschlossen wird, damit inhibierte Zellen Purine unter Verwendung des Nukleotid-Salvage-Pathways synthetisieren. Die eingesetzten Myelomzellen sind Mutanten, denen die Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT) fehlt und die daher den Salvage-Pathway nicht benutzen können. Im überlebenden Hybrid stellt der B-Lymphozyt die genetische Information zur Bildung dieses Enzyms zur Verfügung. Da B-Lymphozyten selbst eine begrenzte Lebensdauer in Kultur haben (ungefähr zwei Wochen), sind die einzigen Zellen, die in HAT-Medien proliferieren können, aus Myelom- und Milzzellen gebildete Hybride.
  • Um das Durchmustern der Antikörper, die durch die Hybride sezerniert werden, zu erleichtern und um einzelne Hybride daran zu hindern, andere zu überwachsen, wird das Gemisch aus fusionierten Myelomzellen und B-Lymphozyten in HAT-Medium verdünnt und in mehreren Vertiefungen von Mikrotiterplatten gezüchtet. In zwei bis drei Wochen, wenn Hybridklone im Mikroskop sichtbar werden, wird die überstehende Flüssigkeit der einzelnen Vertiefungen, die Hybridklone enthalten, auf einen spezifischen Antikörper analysiert. Der Assay muss empfindlich, einfach und schnell sein. Assay-Techniken schließen Radioimmunoassays, Enzymimmunoassays, Zytotoxizitätsassays, Plaque-Tests, Immunbindungs-Tüpfeltests und dergleichen ein.
  • Sobald die erwünschten fusionierten Zellhybride ausgewählt und in einzelne Antikörper-bildende Zelllinien geklont worden sind, kann jede Zelllinie auf eine von zwei Standardweisen propagiert werden. Eine Probe des Hybridoms kann einem histokompatiblen Tier der Art injiziert werden, die verwendet wurde, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion bereitzustellen. Das injizierte Tier entwickelt Tumore, die den spezifischen monoklonalen Antikörper sezernieren, der durch das fusionierte Zellhybrid gebildet wird. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie zum Beispiel Serum oder Aszites-Flüssigkeit, können angezapft werden, um monoklonale Antikörper in hoher Konzentration bereitzustellen. Alternativ dazu können die einzelnen Zelllinien in vitro in Laborkulturgefäßen propagiert werden; das Kulturmedium, das auch hohe Konzentrationen eines einzelnen spezifischen monoklonalen Antikörpers enthält, kann durch Dekantierung, Filtration oder Zentrifugation geerntet werden.
  • Monoklonale Antikörper oder gereinigte Fragmente der monoklonalen Antikörper mit mindestens einem Teilstück einer Antigen-bindenden Region, einschließlich von zum Beispiel Fv, F(ab')2, Fab-Fragmenten (Harlow und Lane, 1988, Antibody, Cold Spring Harbor), Einzelketten-Antikörpern (U.S. Patent 4.946.778), chimären oder humanisierten Antikörpern (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851; Newuberger et al., 1984, Nature 81: 6851) und komplementätsbestimmenden Regionen (CDR), können durch ein herkömmliches Verfahren hergestellt werden. Eine Reinigung der Antikörper oder Fragmente kann durch eine Vielzahl Fachleuten bekannter Methoden, einschließlich Präzipitation durch Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, gefolgt von Dialyse gegen Kochsalzlösung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitäts- oder Immunaffinitätschromatographie sowie Gelfiltration, Zonenelektrophorese usw. (siehe Goding in, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. Ausg., S. 104–126, Orlando, Fla, Academic Press) erreicht werden.
  • 5.2 CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER UND VON PSM'
  • Unter Verwendung der Techniken, die im Allgemeinen in Abschnitt 5.1 vorstehend beschrieben werden und in den Abschnitten 6 und 7 nachstehend veranschaulicht werden, wurden drei Hybridomzelllinien wegen ihrer Bildung von für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifischen monoklonalen Antikörpern ausgewählt. Die vorliegende Erfindung umfasst die Antikörper 35F.4G6, 3D7-1.1 und 4E10-1.14 sowie andere monoklonale Antikörper, die spezifisch an die extrazelluläre Domäne von PSMA und PSM' binden, besonders einschließlich aller Antikörper, welche die Bindung von einem oder mehreren der zuvor erwähnten drei Antikörper gegen PSMA, wie in einem Enzym-Immunoassay, einem Radioimmunoassay oder jedem anderen kompetitiven Bindungs-Immunoassay bewertet, kompetitiv inhibieren.
  • Der Antikörper 3F5.4G6 ist ein Antikörper des IgM-Isotyps, der spezifisch an PSMA bindet, das in Prostatakarzinomzell-Lysaten und auf der Zelloberfläche von Prostatakarzinomzellen, sowie in Seren, die von Patienten mit Prostatakarzinom erhalten werden, exprimiert wird. Zusätzlich bindet 3F5.4G6 auch spezifisch an PSM'. Das 3F5.4G6-reaktive Epitop von PSMA ist extrazellulär, C-terminal und unterschiedlich von dem, das durch 7E11-C5 erkannt wird (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7: 927– 936), das sich Membran-assoziiert im Cytoplasma der Zeile befindet. Die Antikörper 3D7-1.1 und 4E10-1.14 sind auch IGM-Antikörper und binden an PSMA, das in Prostatakarzinomzell-Lysaten und auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Diese Antikörper können verwendet werden, um sowohl primäres Prostatakarzinom als auch metastatische Tumore, wie zum Beispiel Knochenmetastasen des Prostatakarzinoms, nachzuweisen.
  • Während der Entwicklung einer Antikörperreaktion sezernieren Antikörer-bildende Zellen zuerst den IgM-Isotyp, der letztendlich zu IgG wechselt. Derartige Klassenwechsel-Ereignisse finden durch DNA-Rearrangement von Genen der konstanten Region statt, so dass die gleiche Antigenspezifität beibehalten wird. Die unterschiedlichen Antikörper-Isotypen besitzen unterschiedliche Effektor-Funktionen. Zum Beispiel können IgM und alle IgG-Unterklassen außer IgG4 nach der Bindung eines Antigens Komplement fixieren. Im Gegensatz dazu bindet IgE in einer allergischen Reaktion an Mastzellen, um die Freisetzung von Histamin auszulösen.
  • Hybridomzelllinien bilden während einer Langzelt-Kultur auch Klassenwechsel-Varianten. Insbesondere sind monoklonale Antikörper, die von IgM zu IgG oder IgG, zu IgG2a wechseln, wegen ihrer höheren Affinität für Protein A, was ihre Reinigung erleichtert, ausgewählt worden. Jede Klassenwechsel-Variante kann wegen einer besonders erwünschten Effektor-Funktion ausgewählt werden (Spira et al., 1985, In Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine, Hrsg. Springer, S. 77–88, Plenum Press, NY; Harlow und Lane, 1988, Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory). Im Falle der als Beispiel dienenden Antikörper ist es wünschenswert, da sie vom IgM-Isotyp sind, auch IgG-Varianten auszuwählen, die die gleiche Antigen-Spezifität besitzen, die für bestimmte Zwecke in vitro oder in vivo nützlicher sein können. Die vorliegende Erfindung umfasst IgG-Varianten der monoklonalen Antikörper der Erfindung, einschließlich 3F5.4G6, 3D7-1.1 und 4E10-1.14.
  • Die nachstehenden Abschnitte 6 und 7 zeigen, dass die beispielhaft erläuterten Antikörper ein Protein mit einem Molekulargewicht von 120 kD erkennen. Insbesondere erkennt 3F5.4G6 auch ein Protein mit einem Molekulargewicht von 105–110 kD in Prostatatumorzell-Lysaten. Während das Protein mit 120 kD auch durch den Antikörper 7E11-C5 erkannt wird, wird das Protein mit niedrigerem Molekulargewicht nur durch die Antikörper 3F5.4G6, 3D7-1.1 und 4E10-1.14 nachgewiesen. Deshalb stellt das Protein mit 105–110 kD das Produkt einer mRNA dar, die als PSM' bekannt ist. Vor der vorliegenden Erfindung wurde jedoch nie über ein PSM'-Protein berichtet, und man dachte, dass es sich um eine untranslatierte mRNA handelt. Da angenommen wird, dass der Aminosäuresequenz von PSM' die zytoplasmatische und Transmembran-Regionen von PSMA fehlen, wie aus dessen RNA-Sequenz abgeleitet wird, ist damit vereinbar, dass 7E11-C5 wegen seiner Spezifität für ein intrazelluläres Epitop nicht mit diesem Produkt reagieren würde. Im Gegensatz dazu erkennen die für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifischen Antikörper 3F5.4G6, 3D7-1.1 und 4E10-1.14 auch PSM'.
  • 5.3 CODIERENDE SEQUENZEN PSMA-SPEZIFISCHER MONOKLONALER ANTIKÖRPER
  • In einer anderen Ausführungsform können die beispielhaft erläuterten Hybridomzelllinien verwendet werden, um Zusammensetzungen zu bilden, die eine Antigenbindende Stelle oder Antikörper-Varianten umfassen, welche die variablen oder hypervariablen Regionen der Maus mit der menschlichen konstanten Region oder den konstanten und variablen Framework-Regionen kombinieren, d. h. chimäre oder humanisierte Antikörper sowie humanisierte Antikörper, die nur die Antigen-bindenden CDRs aus dem ursprünglichen Antikörper in Verbindung mit menschlichen Framework-Regionen beibehalten (siehe Waldmann, 1991, Science 252: 1657–1662, besonders 1658–59 und die darin zitierten Referenzen). Von derartigen chimären oder humanisierten Antikörpern, welche die Bindungsspezifität des Maus-Antikörpers beibehalten, wird erwartet, dass sie eine reduzierte Immunogenität aufweisen, wenn sie in vivo für diagnostische, prophylaktische oder therapeutische erfindungsgemäße Anwendungen verabreicht werden.
  • In noch anderen Ausführungsformen umfasst die Erfindung die Verwendung von Hybridomzelllinien als Quelle von DNA oder mRNA, die für die rearrangierten, aktivierten Immunglobulingene codiert, die durch bekannte rekombinante DNA-Techniken isoliert und kloniert werden können und zur Bildung Antigen-bindender Fragmente, die für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifisch sind, in andere Zellen übertragen werden können. Durch Isolieren rearrangierter DNA oder Herstellen von cDNA aus der Messenger-RNA der Hybridomzelllinie der Erfindung kann eine Sequenz erhalten werden, die von Introns frei ist.
  • Um zu veranschaulichen, und nicht zur Einschränkung, kann eine Immunexpressions-Bank wie folgt hergestellt und auf Antikörper-bindende Fragmente für PSMA und PSM' durchmustert werden siehe, Huse et al., 1989, Sci. 246: 1275–1281; Mullinax et al., 1990, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 8045–8099). Gesamt-RNA kann (z. B. unter Verwendung im Handel erhältlicher Kits) gereinigt und unter Verwendung eines oligo (dT) Primers für die leichte (L) Kette und eines spezifischen Primers für die schwere (H) Kette unter Verwendung von reverser Transkriptase in cDNA umgewandelt werden. Eine Amplifikation der Immunglobulin-H- und L-Ketten-Sequenzen durch Polymerasekettenreaktion (PCR) kann getrennt mit Sätzen von Primerpaaren durchgeführt werden. Stromaufwärts lokalisierte Primer können so gestaltet werden, dass sie an teilweise konservierte Sequenzen in den Leader- und/oder Framework-Regionen von VH oder VL hybridisieren und stromabwärts lokalisierte Primer können so gestaltet werden, dass sie an Sequenzen der konstanten Domäne hybridisieren. Derartige Primer würden die L-Kette in voller Länge beibehalten und H-Ketten bereitstellen, die dem Fd von IgG entsprechen und die H-L-Disulfid-Bindungen konservieren. Die PCR-amplifizierten L- und H-DNA-Fragmente werden dann verdaut und getrennt in H- und L-Ketten-Vektoren ligiert. Derartige Vektoren enthalten eine pelB-Leader-Sequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und Stopp-Codons. Geeignete λ-Phagen-Vektoren zur Expression in E. coli können aus im Handel erhältlichen Vektoren (ImmunoZAP L, ImmunoZAP N; Stratacyte, La Jolla, CA) hergestellt werden. Die ligierte rekombinante Phagen-DNA wird mit einem in-vitro-Verpackungsextrakt in einen Bakteriophagen eingegliedert und verwendet, um E. coli zu infizieren. Die so geschaffene Immunexpressionsbank wird unter Verwendung von PSMA, PSM' oder einem spezifischen Peptid davon auf Antigenbindende Fragmente durchgemustert. Positive Klone können, wie von Mullinax et al. (vorstehend) beschrieben, durchgemustert und identifiziert werden.
  • 5.4 VERWENDUNGEN VON FÜR DIE EXTRAZELLULÄRE DOMÄNE VON PSMA SPEZIFISCHEN ANTIKÖRPERN UND ANTIKÖRPER-ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Obwohl die spezifischen, hierin beschriebenen Verfahren und Methoden unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung beispielhaft erläutert werden, sind sie für die Durchführung der Erfindung lediglich veranschaulichend. Gereinigte Fragmente der monoklonalen Antikörper mit mindestens einem Teilstück der Antigenbindenden Region, einschließlich von Fv, F(ab')2, Fab-Fragmenten, Einzelketten-Antikörpern, chimären oder humanisierten Antikörpern oder CDRs können in den nachstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren und Methoden verwendet werden.
  • 5.4.1 IMMUNHISTOLOGISCHE UND IMMUNZYTOLOGISCHE ANWENDUNGEN
  • Monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Prostatakarzinomzellen in histologischen und zytologischen Proben nachzuweisen und insbesondere, um maligne Tumoren von normalen Geweben und nicht malignen Tumoren zu unterscheiden. Gewebeproben können durch die Antikörper gefärbt und deren Bindung kann durch einen zweiten Antikörper, der an einen Marker, wie zum Beispiel Peroxidase, Fluoreszein, alkalische Phosphatase und dergleichen, konjugiert ist, nachgewiesen werden.
  • Zusätzlich können Immunfluoreszenztechniken die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung verwenden, um menschliches Gewebe, Zell- und Körperflüssigkeitsproben zu untersuchen. In einem typischen Protokoll werden Objektträger, die Kryostat-Schnitte von gefrorenen, unfixierten Gewebebiopsieproben oder zytologische Abstriche enthalten, luftgetrocknet, mit Formalin oder Aceton fixiert und mit dem monoklonalen Antikörper-Präparat in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Die Objektträger werden dann gespült und mit einem Antikörperpräparat, das gegen den monoklonalen Antikörper gerichtet ist, normalerweise irgendein Anti-Maus-Immunglobulin, falls die verwendeten monoklonalen Antikörper von der Fusion einer Maus-Milz-Lymphozyte und einer Maus-Myelom-Zelllinie abgeleitet sind, weiter inkubiert. An dieses Anti-Maus-Immunglobulin wird eine Verbindung, zum Beispiel Rhodamin oder Fluoreszeinisothiocyanat, angehängt, die bei einer bestimmten Wellenlänge fluoresziert. Das Färbemuster und die Intensitäten in der Probe werden dann durch Fluoreszenz-Lichtmikroskopie bestimmt und wahlweise photographisch aufgezeichnet.
  • Als noch eine weitere Alternative kann eine Computer-verbesserte Fluoreszenz-Bildanalyse oder Durchflusszytometrie verwendet werden, um Gewebeproben oder abgeschälte Zellen, d. h. Präparate einzelner Zellen aus Absauge-Biopsien von Prostatatumoren, unter Verwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung zu untersuchen. Die monoklonalen Antikörper der Erfindung sind besonders nützlich bei der Quantifizierung lebender Tumorzellen, d. h. von Präparaten einzelner Zellen aus Absauge-Biopsien von Prostatatumoren, durch ein Computer-verbessertes Fluoreszenz-Bildanalysegerät oder mit einem Durchflusszytometer. Die Verwendung der Antikörper 3F5.4G6, 3D7-1.1 und 4E10-1.14 in derartigen Assays ist wertvoll, um benigne von malignen Prostatatumoren zu unterscheiden, da PSMA, an das die monoklonalen Antikörper binden, durch maligne Tumoren in erhöhten Mengen exprimiert wird. Der Prozentsatz der PSMA-positiven Zellpopulation kann, allein oder in Verbindung mit einer Bestimmung der DNA-Ploidie dieser Zellen, zusätzlich sehr nützliche prognostische Information bereitstellen, indem ein früher Indikator der Krankheitsprogression bereitgestellt wird.
  • In noch einer anderen alternativen Ausführungsform können die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen bekannten Prostata-Antikörpern verwendet werden, um zusätzliche Information bezüglich des malignen Phänotyps eines Prostatakarzinoms bereitzustellen.
  • 5.4.2 IMMUNSEROLOGISCHE ANWENDUNGEN
  • Die Verwendung der monoklonalen Antikörper der Erfindung kann auf das Durchmustern von menschlichen biologischen Flüssigkeiten auf die Anwesenheit der spezifischen antigenen Determinanten, die erkannt werden, ausgeweitet werden. Dadurch gestattet eine in vitro immunserologische Auswertung biologischer Flüssigkeiten, die von Patienten entnommen werden, eine nicht invasive Diagnose von Krebserkrankungen. Zur Veranschaulichung können menschliche Körperflüssigkeiten, wie zum Beispiel Prostataflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vollblut, Serum oder Urin, von einem Patienten entnommen werden und auf das spezifische Epitop, entweder als freigesetztes Antigen oder membrangebunden auf Zellen in der Probenflüssigkeit, unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die spezifisch für die extrazelluläre Domäne von PSMA und PSM' sind, in Standard-Radioimmunoassay oder enzymverbundenen Immunoassays, kompetitiven enzymverbundenen Bindungs-Immunoassays, einem Tüpfel-Blot oder Western-Blot oder anderen auf dem Fachgebiet bekannten Assays analysiert werden.
  • Zusätzlich kann ein empfindlicherer diagnostischer Assay für das PSMA- oder PSM'-Protein durch die Verwendung monoklonaler Antikörper entwickelt werden, die gegen nicht überlappende Epitope auf PSMA und PSM' gerichtet sind. Antikörper, die für entgegengesetzte Enden von PSMA spezifisch sind, wie zum Beispiel 7E11-C5 und 3F5.4G6, 3D7-1.1 oder 4E10-1.14 sind zur Verwendung in einem derartigen Assay besonders geeignet. In dieser Hinsicht kann ein Antikörper an ein Substrat verankert werden, um PSMA oder PSM' in einer biologischen Flüssigkeit einzufangen, während der andere Antikörper verwendet wird, um das Antikörper-gebundene Antigen nachzuweisen. Da die Expression von PSMA und PSM' im Prostatakarzinom bzw. in normalen Prostatageweben erhöht ist, können Antikörper, die zwischen diesen beiden Formen unterscheiden, auch verwendet werden, um eine genauere Weise bereitzustellen, um eine Regression des Tumors gegenüber einer Progression nach einer Behandlung zu überwachen. Da 3F5.4G6, 3D71.1 und 4E10-1.14 beide Formen erkennen, aber 7E11-C5 nur an PSMA bindet, können diese Antikörper in Verbindung verwendet werden, um die genauen Spiegel jeder Form in einem Patienten zu bestimmen, wodurch ihre Mengen mit der Tumorbelastung korreliert werden. Zum Beispiel kann 7E11-C5 als ein verankerter Antikörper in einem zwei-Stellen Capture-Assay verwendet werden, und jeder der anderen drei Antikörper kann als Nachweis-Antikörper verwendet werden, um PSMA zu quantifizieren. Andererseits kann jede Kombination von zwei der drei Antikörper, die für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifisch sind, in einem ähnlichen zwei-Stellen Capture-Assay verwendet werden, um spezifisch die Gesamtkonzentrationen von PSM' plus PSMA zu messen. Eine einfache Subtraktion von PSMA von Gesamt-PSMA und PSM' quantifiziert PSM' spezifisch.
  • Zusätzlich zum Nachweis der extrazellulären Domäne von PSMA und PSM' durch einen monoklonalen Antikörper in Geweben und Körperflüssigkeiten, können Messungen der Enzymaktivität von NAALADase benutzt werden, um die extrazelluläre Domäne von PSMA und/oder PSM' in Geweben und/oder Körperflüssigkeiten zu quantifizieren.
  • Zum Beispiel können Gewebespiegel bestimmt werden, indem Gewebe mit einem Detergenz solubilisiert werden, das unlösliche Material durch Zentrifugation pelletiert wird und die NAALADase-Aktivität im verbleibenden Überstand gemessen wird. Auf ähnliche Weise kann die NAALADase-Aktivität in Körperflüssigkeiten auch gemessen werden, indem das zelluläre Material zuerst durch Zentrifugation pelletiert wird und ein typischer Enzymassay für die NAALADase-Aktivität mit dem Überstand durchgeführt wird.
  • Protokolle zum NAALADase-Assay, die Spezifitäten der Antikörperbindung ausnutzen, können auch angewendet werden. Zum Beispiel könnten feste Oberflächen, die mit einem der Antikörper 7E11-C5, 3F5.4G6, 3D7-1.1 oder 4E10-1.14 beschichtet sind, verwendet werden, um das PSMA- oder PSM'-Protein zum Nachweis unter Verwendung eines Enzymassays für NAALADase einzufangen. Dies kann daher verwendet werden, um PSMA-Protein voller Länge und PSM' in einer Probe differentiell nachzuweisen und zu quantifizieren, vorausgesetzt, dass ein Antikörper, der für die extrazelluläre Domäne spezifisch ist, sowohl an PSMA als auch PSM' bindet, während 7E11-C5 nur an PSMA binden würde.
  • Zweckmäßigere Enzymassays für NAALADase, welche die Reaktionseigenschaften der Glutamatdehydrogenase ausnutzen, können auch angewendet werden (Frieden, 1959, J. Biol. Chem., 234: 2891). In diesem Assay handelt es sich bei dem Reaktionsprodukt des Enzyms NAALADase um Glutaminsäure. Diese wird aus der Enzym-katalysierten Spaltung von N-Acetylaspartylglutamat abgeleitet, um N-Acetylasparaginsäure und Glutaminsäure zu ergeben. Glutaminsäure ergibt in einem NAD(P)+-erfordernden Schritt 2-Oxoglutarat plus NAD(P)H in einer Reaktion, die durch Glutamatdehydrogenase katalysiert wird. Das Fortschreiten der Reaktion kann leicht und zweckmäßig durch die Änderung der Absorption bei 340 nm auf Grund der Umwandlung von NAD(P)+ zu NAD(P)H gemessen werden. Daher können Verbesserungen des Assays der NAALADase-Aktivität, die auf ein Festphasenformat mit immobilisierten Capture-Antikörpern anwenendbar sind, erreicht werden. Auf diese Weise können, beruhend auf der Absorptionsänderung bei 340 nm vor und nach Zugabe von NAD+ oder NADP+, mehrfache Assays gleichzeitig in einem Mikroplattenlesegerät ausgeführt werden. Es würde nicht auf Festphasenassays beschränkt sein, da Assays in Lösung, z. B. von Serum, mit dieser Art von NAALADase-Assay auch möglich wären.
  • Kits, welche die monoklonalen Antikörper der Erfindung oder Framente davon enthalten, können zur in-vitro-Diagnose, Prognose und/oder zum Monitoring des Prostatakarzinoms durch die vorstehend beschriebenen immunhistologischen, immunzytologischen und immunserologischen Methoden hergestellt werden. Die Komponenten des Kits können entweder in wässrigem Medium oder in lyophilisierter Form verpackt werden. Wenn die monoklonalen Antikörper (oder deren Fragmente) in den Kits in Form von Konjugaten verwendet werden, wobei eine Markereinheit angehängt wird, wie zum Beispiel ein Enzym oder ein radioaktives Metallion, können die Komponenten derartiger Konjugate entweder in vollständig konjugierter Form, in Form von Zwischenstufen oder als getrennte Einheiten, die vom Verwender des Kits konjugiert werden sollen, zur Verfügung gestellt werden.
  • Ein Kit kann einen Träger umfassen, der aufgeteilt ist, um darin eng beieinander einen oder mehrere Behälter oder Reihen von Behältern wie zum Beispiel Reagenzgläser, Fläschchen, Kolben, Flaschen, Spritzen oder dergleichen aufzunehmen. Ein erster derartiger Behälter oder eine erste derartige Reihe von Behältern kann den monoklonalen Antikörper (oder ein Fragment davon) oder PSMA oder PSM' enthalten. Ein zweiter derartiger Behälter oder eine zweite derartige Reihe von Behältern kann einen Marker oder eine Zwischenstufe eines Verknüpfungsmarkers enthalten, der fähig ist, an den primären Antikörper (oder ein Fragment davon), PSMA oder PSM' zu binden.
  • 5.4.3 DIAGNOSTISCHE. PROPHYLAKTISCHE UND THERAPEUTISCHE IN-VIVO-VERWENDUNGEN
  • Die monoklonalen Antikörper oder deren Framente dieser Erfindung sind besonders nützlich zum Targeting von Prostatakarzinomzellen in vivo. Sie können zur Tumorlokalisierung, zum Nachweis und Monitoring, sowie zur Therapie primärer Prostatakarzinome und Metastasen verwendet werden. Für diese in-vivo-Anwendungen ist vorzuziehen, dass gereinigte monoklonale Antikörper oder gereinigte Fragmente der monoklonalen Antikörper mit mindestens einem Teilstück einer Antigen-bindenden Region, einschließlich von zum Beispiel Fv, F(ab')2, Fab-Fragmenten (Harlow und Lane, 1988, Antibody, Cold Spring Harbor), Einzelketten-Antikörpern (U.S. Patent 4.946.778), chimären oder humanisierten Antikörpern (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851; Newuberger et al., 1984, Nature 81: 6851), komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) und dergleichen, verwendet werden. Eine Reinigung der Antikörper oder Fragmente kann durch eine Vielzahl Fachleuten bekannter Methoden einschließlich Präzipitation durch Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat gefolgt von Dialyse gegen Kochsalzlösung, Ionenaustauschchromatographie, Affinitäts- oder Immunaffinitätschromatographie, sowie Gelfiltration, Zonenelektrophorese usw. (siehe Goding in, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. Ausg., S. 104–126, Orlando, Fla, Academic Press) erreicht werden.
  • Zur Verwendung beim Nachweis und/oder Monitoring des Prostatakarzinoms in vivo können die gereinigten monoklonalen Antikörper entweder direkt oder durch einen Linker an einer Verbindung kovalent angehängt werden, die als Reporterguppe dient, um die Abbildung spezifischer Gewebe oder Organe nach Verabreichung und Lokalisierung der Konjugate oder Komplexe zu gestatten. Eine Vielfalt unterschiedlicher Substanzarten kann als Reportergruppe dienen, einschließlich von zum Beispiel radiopaquen Farbstoffen, radioaktiven Metallen, und Nichtmetall-Isotopen, fluorogenen Verbindungen, fluoreszenten Verbindungen, Isotopen, die Positronen ausstrahlen, nicht paramagnetischen Metallen usw.
  • Zur Verwendung bei der in-vivo-Therapie des Prostatakarzinoms können die gereinigten monoklonalen Antikörper allein oder kovalent, entweder direkt oder durch einen Linker, an einer Verbindung angehängt, die maligne Zellen oder Gewebe nach Verabreichung und Lokalisierung der Konjugate tötet und/oder deren Proliferation inhibiert, verwendet werden. Wenn der Antikörper allein verwendet wird, kann er die Tumorzerstörung durch Komplementfixierung oder Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität vermitteln. Alternativ dazu kann der Antikörper in Kombination mit einem chemotherapeutischen Arzneimittel verabreicht werden, um synergistische therapeu tische Wirkungen zu ergeben (Baslya und Mendelsohn, 1994, Breast Cancer Res. and Treatment 29: 127–138). Eine Vielfalt unterschiedlicher Substanzarten kann für therapeutische Verwendungen direkt an den Antikörper konjugiert werden, einschließlich radioaktiver Metalle und Nichtmetall-Isotope, chemotherapeutischer Arzneimittel, Toxine usw. (Vitetta und Uhr, 1985, Annu. Rev. Immunol. 3: 197).
  • Gemäß einer alternativen Ausführungsform können die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung zur in-vivo-Therapie des Prostatakarzinoms modifiziert werden, um in Form eines bifunktionellen oder bispezifischen Antikörpers vorzuliegen, d. h. eines Antikörpers mit einer Antigen-bindenden Region, die für die extrazelluläre Domäne des Prostata-spezifischen Membran-Antigens spezifisch ist, und einer Antigenbindenden Region, die für eine Effektorzelle spezifisch ist, die tumorizide oder Tumorinhibitorische Aktivität aufweist. Die beiden Antigen-bindenden Regionen des bispezifischen Antikörpers sind entweder chemisch verknüpft oder können durch eine Zelle exprimiert werden, die genetisch verändert wurde, um den bispezifischen Antikörper zu bilden (siehe im Allgemeinen, Fanger et al., 1995, Drug News & Perspec. 8 (3): 133–137). Geeignete Effektorzellen mit tumorizider Aktivität schließen zytotoxische T-Zellen (in erster Linie CD8+-Zellen), natürliche Killerzellen usw. ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine wirksame Menge eines bispezifischen erfindungsgemäßen Antikörpers wird einem Patienten mit Prostatakarzinom verabreicht und der bispezifische Antikörper tötet und/oder inhibiert die Proliferation der malignen Zellen nach Lokalisierung an Stellen primärer oder metastatischer Tumoren, die PSMA tragen.
  • Methoden zur Herstellung von Antikörperkonjugaten der Antikörper (oder von deren Fragmenten) der Erfindung, die zum Nachweis, Monitoring und/oder zur Therapie nützlich sind, werden in den U.S. Patenten Nr. 4.671.958, 4.741.900 und 4.867.973 beschrieben.
  • Kits zur Verwendung mit derartigen in-vivo-Methoden der Tumorlokalisation und Therapie, die monoklonale Antikörper (oder deren Fragmente) enthalten, die an eine der vorstehenden Substanzarten konjugiert sind, können hergestellt werden. Die Komponenten der Kits können entweder in wässrigem Medium oder in lyophilisierter Form verpackt werden. Wenn die monoklonalen Antikörper (oder deren Fragmente) in den Kits in Form von Konjugaten verwendet werden, wobei ein Marker oder eine therapeutische Einheit angehängt ist, wie zum Beispiel ein radioaktives Metallion oder eine therapeutische Arzneimitteleinheit, können die Komponenten derartiger Konjugate entweder in vollständig konjugierter Form, in Form von Zwischenstufen oder als getrennte Einheiten, die durch den Verwender des Kits konjugiert werden sollen, zur Verfügung gestellt werden.
  • 6. BEISPIEL: HERSTELLUNG EINES MONOKLONALEN ANTIKÖRPERS GEGEN EIN PSMA-PEPTID
  • 6.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • 6.1.1 HERSTELLUNG VON IMMUNISIERENDEM PEPTID
  • PSMA-Peptid # 716–723 (NH2-ESKVDPSK-) wurde unter Verwendung der EDC-Methode von Pierce (Rockford, IL) an Hämocyanin aus der Schlüssellochschnecke ("keyhole limpet hemocyanin", KLH) als Träger gekoppelt. Der Peptid-KLH-Komplex wurde in unvollständigem Freund'schen Adjuvans (Sigma, St. Louis, MO), das 1 mg/ml Muramyldipeptid (MDP, Pierce, Rockford, IL) enthielt, in einer Endkonzentration von 250 μg/ml emulgiert. Das emulgierte Antigen-Präparat wurde bei 4°C gelagert.
  • 6.1.2 IMMUNISIERUNG
  • Weibliche BALB/c-Mäuse wurden alle vierzehn Tage über einen Zeitraum von sechs Wochen subkutan mit 0,1 ml des emuligerten Peptid-Träger-Komplexes immunisiert. Man ließ die Mäuse bluten und ihre Seren wurden in einem Peptid-spezifischen Radioimmunoassay (RIA) auf die Anwesenheit von Antipeptid-Antikörpern getestet. Mäuse, die einen positiven Test auf Antipeptid-Antikörper mit einem Titer von 1 : 1.000 oder mehr ergaben, wurden als Donatoren in einem Fusionsprotokoll verwendet. Drei Tage vor der Fusion wurden die Mäuse intraperitoneal mit 50 μg des in Kochsalzlösung gelösten Peptid-KLH-Komplexes immunisiert.
  • 6.1.3 ZELLFUSION
  • Drei Tage nach der letzten Nachverstärkung mit dem gleichen Peptid-KLH-Komplex wurde die Milz einer BALB/c-Maus keimfrei entnommen und eine Einzelzellsuspension wurde hergestellt. Die roten Blutkörperchen wurden durch osmotischen Schock lysiert und die verbleibenden Lymphozyten wurden in RPMI-1640 Medium suspendiert. Die Milzzellen wurden mit P3X63Ag8U.1 (X63) Myelomzellen (CRL 1597 von der ATCC, Rockville, MD) in einem Verhältnis von 10 : 1 (100 × 106 Milzzellen : 10 × 106 X63 Myelomzellen) gemischt. Eine Fusion der Milzzellen mit X63-Zellen wurde mit der Methode von Galfre und Milstein (1981, Methods in Enzymology, Bd.73, Immunochemical Techniques, Teil B) durchgeführt. Hybridomzellen wurden durch den Einschluss von Aminopterin in das Zellkulturmedium (RPMI-1640-20% fötales Kälberserum) ausgewählt.
  • 6.1.4 DURCHMUSTERN VON PRIMÄREN HYBRIDOMEN
  • Fünfzig Mikroliter (μl) Zellkulturüberstand wurden von einzelnen Hybridomkulturen entfernt und in einem Peptid-spezifischen RIA auf die Anwesenheit Peptid-spezifischer Antikörper getestet. Kurz gesagt wurden die Überstände zu Vertiefungen einer Pro-Bind-Platte (Falcon) mit 96 Vertiefungen gegeben, die zuvor mit Peptid, das an Rinderserumalbumin (BSA) gekoppelt war, mit 50 μg/ml beschichtet worden war. Nach einer Inkubation bei 4°C über Nacht wurden die Platten viermal mit PBS–0,1% BSA gespült. Fünfzig Mikroliter einer 1 : 500 Verdünnung von Kaninchen-anti-Maus-IgM und -IgG (ICN) wurden zu jeder Vertiefung gegeben und die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden viermal wie vorstehend gespült und 50 μl 125I-Protein A wurde zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und 4-mal wie vorstehend gespült. Mit den Platten wurde ein Autoradiographie-Film (Kodak, X-OMAT) über Nacht belichtet und entwickelt. Positive Vertiefungen wurden ausgewählt und die Zellen wurden in Zellkulturmedium für weiteres Testen expandiert.
  • 6.1.5 DURCHMUSTERN MIT WESTERN-BLOT
  • Überstände der positiven und expandierten Vertiefungen wurden in einem Western-Blot-Assay auf Anti-PSMA-Antikörper getestet. Lysate der Tumorzelllinie LNCaP (CRL 1740 von der ATCC, Rockville, MD), einem Prostatatumor, der PSMA exprimiert, wurden auf einem SDS-Polyacrylamidgel 90 Minuten lang bei 175 Volt laufen gelassen. Die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine wurde auf eine Immobilon-PTM-Membran elektrisch übertragen und die Membran wurde durch eine Inkubation mit 5% BLOTTO in Tris-gepufferter Kochsalzlösung über Nacht blockiert. Die Membran wurde in ein Multi-Screen-Gerät von Bio-Rad (Bio-Rad) platziert und ungefähr 650 μl Hybridomüberstand wurden in einzelne Spuren pipettiert. Die Membran wurde 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und der Blot wurde 5-mal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung – 0,5% Tween-20 (TBS-T) gespült. Der gespülte Blot wurde mit einer 1 : 5.000 Verdünnung von Peroxidase-markiertem Ziegen-anti-Maus-IgG (Kirkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubier. Der Blot wurde 5-mal wie vorstehend gespült und 1 Minute lang mit 2 ml des chemilumineszenten Substrats LumiGLOTM (KPL, Gaithersburg, MD) inkubiert. Mit dem Blot wurde ein Autoradiographiefilm belichtet und entwickelt. Positive Hybridomvertiefungen (Anti-PSMA-Reaktivität) wurden identifiziert und zur weiteren Entwicklung ausgewählt.
  • 6.1.6 KLONEN DURCH BEGRENZENDE VERDÜNNUNG
  • Die durch ihre Reaktivität gegen PSMA im vorstehend beschriebenen Western-Blot identifizierten Vertiefungen mit positiven primären Hybridomen wurden durch begrenzende Verdünnung geklont. Die Zellen wurden auf 1 Zelle/ml in vollständigem Zellkulturmedium, das syngene Thymozyten als eine Nährzellpopulation enthielt, eingestellt. Die Zellsuspension wurde in 200 μl - Aliquots in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen verteilt. Nach 7–10 Tagen Kultur waren Zellkolonien sichtbar. Vertiefungen, die einzelne Kolonien enthielten, wurden ausgewählt und die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen expandiert (1,5-ml-Kulturen). Überstände der klonalen Zellen wurden geerntet und in dem vorstehend beschriebenen Western-Blot-Assay auf Anti-PSMA-Antikörper getestet. Positive Klone wurden expandiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren.
  • 6.1.7 ERZEUGUNG VON ASZITES-FLÜSSIGKEIT UND ANTIKÖRPERREINIGUNG
  • BALB/c-Mäuse wurden 7–10 Tage vor der Injektion von 10 × 106 Hybridomzellen intraperitoneal mit 0,4 ml Pristan stimuliert. Die Aszites-Flüssigkeit, die einen monoklonalen Antikörper enthielt, wurde in regelmäßigen Zeitabständen entnommen und bei 4°C gelagert. Der monoklonale Antikörper wurde unter Verwendung des Reinigungskits ImmunoPureTM von Pierce (Rockford, IL) aus Aszites-Flüssigkeit gereinigt.
  • 6.1.8 IMMUNPRÄZIPITATION VON PSMA
  • Ungefähr 10 × 106 LNCaP-Tumorzellen wurden mit 1 ml NP-40 Lysepuffer (150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris) 30 Minuten lang bei 4°C inkubiert. Das Lysat wurde bei 12.000 Upm zentrifugiert und der sich ergebende Überstand wurde durch 30 Minuten langes Inkubieren mit 50 μl normalem Maus-Serum, gefolgt von der Zugabe von 60 μl einer 20%igen Suspension von Anti-Maus-IgM Agarosekügelchen vorgeklärt. Nach einstündiger Inkubation bei 4°C wurde das Präparat zentrifugiert, um die Kügelchen zu entfernen und den sich ergebenden Überstand ließ man mit dem monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 reagieren. Variierende Mengen des monoklonalen Antikörpers 3F5.4G6 (2,5, 5 und 10 μl) wurden zu drei Replika-Lysaten gegeben und 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert. Einhundert Mikroliter einer 10%igen Suspension von Anti-Maus-IgM Agarosekügelchen (Sigma) wurden zugegeben und die Lysate wurden eine zusätzliche Stunde lang bei 4°C inkubiert. Die Lysate wurden bei 12.000 Upm zentrifugiert und die Agarosekügelchen wurden dreimal mit NP-40 Lysepuffer gespült. Dreißig Mikroliter Probenpuffer für Elektrophorese wurden zu den Kügelchen gegeben und sie wurden zehn Minuten lang auf 95°C erhitzt. Die Kügelchen wurden kurz bei 12.000 Upm zentrifugiert und der Probenpuffer wurde auf ein SDS-Polyacrylamidgel geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Proben, wie vorstehend beschrieben, elektrisch übertragen und ein Western-Blot wurde unter Verwendung des PSMA-spezifischen monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 als Reporter-Antikörper durchgeführt.
  • 6.1.9 DURCHFLUSSZYTOMETRIE-ANALYSE
  • Die Zellen wurden zuerst mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült. Versenlösung (0,2 g EDTA.4Na/l) (2 ml für einen 75-cm3-Kolben) wurde zugegeben. Das meiste der Versen-Lösung wurde vor der 5 Minuten langen Inkubation bei Raumtemperatur durch Absaugen entfernt. PBS wurde zugegeben und die Zellen wurden durch Pipettieren abgelöst. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült und gezählt. Fünfhunderttausend bis eine Million Zellen wurden 30 Minuten lang mit 50 μl primärem Antikörper auf Eis inkubiert, gefolgt von zwei Spülungen mit PBS. Die Zellen wurden anschließend 30 Minuten lang mit 50 μl FITC-markiertem sekundärem Antikörper (Ziegen-anti-Maus-IgG für 7E11-C5 oder Ziegen-anti-Maus-IgM für 4G6) auf Eis inkubiert. Überschüssiger sekundärer Antikörper wurde mit PBS von den Zellen abgespült. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert. Zellbruchstücke wurden von den Zellpopulationen ausgeschlossen, die beruhend auf ihren Vorwärtsstreulicht- und Seitwärtsstreulichtprofilen analysiert wurden.
  • 6.1.10 SERUMASSAYS DURCH WESTERN-BLOT
  • Serumproben wurden in Lysepuffer (1% Triton X-100, 50 mM HEPES, 10% Glycerin, 15 mM MgCl2, 1 mM AEBSF, 1 mM EGTA) 1 : 7 verdünnt. LNCaP-Lysat wurde 1 : 35 in Lysepuffer verdünnt. Die verdünnten Proben wurden dann in einem Verhältnis von 2 : 3 mit Probenpuffer (SDS-reduzierendem Puffer) kombiniert. Proben (20 μl) ließ man auf 8,5% SDS-PAGE laufen (Endkonzentration des Proteins 93 mg pro Probe, wie unter Verwendung des Bio-Rad Proteinassays bestimmt wurde), und die getrennten Proteine wurden eine Stunde lang bei 90 Volt auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membranen wurden dann in 5% Milch-TBS über Nacht blockiert. Am nächsten Tag wurden die Membranen mit 3 μg/ml Antikörper 7E11-C5 in TBS-T eine Stunde lang sondiert, 5-mal fünf Minuten lang in TBS-T gespült und mit 167 ng/ml sekundärem, mit Meerrettichperoxidase markiertem Schaf-anti-Maus-Antikörper in TBS-T 30 Minuten lang sondiert. Die Membranen wurden wieder 5-mal jeweils fünf Minuten lang in TBS-T gespült und die Membranen unter Verwendung des Chemiluminescent Substrate Kits (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) entwickelt (Rochon et al., 1994, The Prostate 25, 219–223).
  • Blots wurden durch Belichten von Röntgenfilm sichtbar gemacht, was eine Proteinbande von ungefähr 120 kD aufdeckte. Das Blotbild wurde mit einem Microtek Scanmaker IIHR-Scanner gescannt und Bandenintensitäten wurden durch "eine Analyse, die auf einem Macintosh Quadra 605 Computer unter Verwendung des NIH-Bildanalyse-Programms der Public Domain (geschrieben von Wayne Rasband an den U. S. National Institutes of Health und aus dem Internet durch anonyme ftp von zippy.nimh. nih.gov oder auf Diskette von NTIS, 5285 Port Royal Rd., Springfield, VA 22161, Teilenummer PB93-504868, erhältlich) durchgeführt wird " gemessen. Alle Patientenproben wurden gegen eine Probe eines gesunden normalen Spenders und eine Probe eines Patienten mit Prostatakarzinom mit hohem PSMA vom gleichen Western-Blot wie die Standardkontrollen bewertet.
  • 6.1.11 NACHWEIS DER ENZYMATISCHEN AKTIVITÄT VON PSM'
  • Einhundert ml menschlicher Samen wurden von bezahlten Spendern unter den WHO-Richtlinien für das Testen von Fruchtbarkeit gesammelt. Das zelluläre Material wurde durch 30 Minuten lange Zentrifugation bei 10.000 Upm pelletiert und der Überstand vorsichtig entfernt und über Nacht gegen zwei Wechsel von 20 mM Tris-Puffer, pH 7,6 dialysiert. Das Dialysat wurde wieder bei 10.000 Upm zentrifugiert und auf eine DEAE-Sephacrylsäule geladen, die zuvor mit 20 mM Tris-Puffer, pH 7,6, gespült worden war. Die beladene Säule wurde dann wieder mit 500 ml des gleichen Puffers gespült und die Proteine wurden durch Anwenden eines Puffergradienten von 20 mM bis 200 mM Tris bei pH 7,6 aufgetrennt. 5-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Anwesenheit von PSMA in jeder Fraktion wurde durch Western-Tüpfel-Blot unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 bestimmt. Fraktionen, die 7E11-C5-reaktive Proteinbanden enthielten, wurden vereinigt und unter Verwendung von 70% Ammoniumsulfat präzipitiert. Die präzipitierten Proteine wurden durch 30 Minuten fange Zentrifugation bei 10.000 Upm pelletiert und dann in 1 Liter 200 mM Tris-Puffer, pH 7,6, resuspendiert. Die solubilisierten Proteine wurden dann über Nacht gegen zwei Wechsel von 20 mM Tris-Puffer, pH 7,6, dialysiert. Das dialysierte Material wurde dann auf eine vorgespülte Sephacrylsäule geladen und die Proteine wurden eluiert, 3-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Ein Western-Tüpfel-Blot wurde unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 3F5.4G6 mit dem eluierten Protein durchgeführt. Die Fraktionen 88–96 waren positiv und jede dieser Fraktionen wurde durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese auf Reinheit getestet.
  • 6.2 ERGEBNISSE
  • Um monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne von PSMA zu erzeugen, wurden einige Regionen des Proteins, beruhend auf der Methode von Hopp und Woods (1983, Mol. Immunol. 20: 483–489), hinsichtlich ihrer relativen Hydrophilie analysiert.
  • Die nachstehende Tabelle 1 veranschaulicht die relative Hydrophilie einiger untersuchter Peptide. Insbesondere wurde eine Peptid mit der Sequenz ESKVDPSK (Glu-Ser-Lys-Val-Asp-Pro-Ser-Lys) (SEQ ID NO: 1) synthetisiert, das den Aminosäureresten Nummer 716–723 in der C-terminalen Region von PSMA entspricht. Zusätzlich könnten andere Teilstücke der extrazellulären Domäne, wie in Tabelle 1 gezeigt, oder die gesamte extrazelluläre Domäne selbst verwendet werden, um Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne zu bilden. Im Gegensatz dazu induzierten zwei Aminosäurepeptide, die den Resten # 44–58 und den Resten # 196–213 entsprechen, Antipeptid-Antikörperreaktionen, die nicht an natives PSMA banden.
  • Tabelle 1. Relative Hydrophilie der PSMA-Peptide
    Figure 00280001
  • Vor der Immunisierung wurde das Peptid ESKVDPSK (SEQ ID: NO 1) zuerst an KLH als Träger konjugiert. Dann wurden Mäuse immunisiert und mit dem gleichen konjugierten Material in wöchentlichen Zeitabständen nachverstärkt. Milzen von Tieren mit einem nachweisbaren Antipeptid-Serumtiter wurden isoliert und mit Myelomzellen fusioniert.
  • Anfängliche Durchmusterungen wurden durch Bindungsassays unter Verwendung von Peptid-gebundenem BSA als Antigen durchgeführt. Fünfzig μl Zellkulturüberstand wurden aus einzelnen Hybridomkulturen entfernt und in einem Peptid spezifischen Radioimmunoassay auf die Anwesenheit von Peptid-spezifischen Antikörpern getestet. Kurz gesagt wurden die Überstände zu Vertiefungen einer Pro-Bind-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, die zuvor mit Peptid, das an Rinderserumalbumin (BSA) gekoppelt war, beschichtet worden war. Nach einer Inkubation bei 4°C über Nacht wurden die Platten mit PBS gespült. Fünfzig μl einer 1 : 500 Verdünnung von Kaninchenanti-Maus-IgM und -IgG wurden zu jeder Vertiefung gegeben und die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann 4 × gespült und 50 μl 125I-Protein A wurde zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und 4 × wie vorstehend gespült. Mit den Platten wurde ein Autoradiographiefilm über Nacht belichtet und entwickelt. Positive Vertiefungen wurden ausgewählt und die Zellen wurden zum weiteren Testen in Zellkulturmedium expandiert. Unter den positiven Vertiefungen, die identifiziert wurden, wurde ein Hybridom, das als 3F5 bezeichnet wurde, weiter in einem Western-Blot-Assay getestet und es wurde gezeigt, dass der von ihm sezernierte Antikörper mit PSMA, das in LNCaP-Lysaten enthalten ist, reagierte. LNCaP-Zellen wurden, wie von Horoszewicz et al. (1983, Cancer Res. 43: 1809–1818) beschrieben, gezüchtet, und die Lysate wurden, wie von Rochon et al. (1994, Prostate 25: 219–223) beschrieben, hergestellt. Die Zellen des Hybridoms 3F5 wurden durch begrenzende Verdünnung geklont, zu höheren Zahlen expandiert und erneut in einem Western-Blot-Assay getestet. Ein Subklon des Antikörpers, der als 3F5.4G6 bezeichnet wurde, reagierte mit einem Protein mit einem Molekulargewicht von 120 kD in den LNCaP-Lysaten (2). Dieser Antikörper wurde als IgM isotypisiert. ISOStrip, das von Boehringer Mannheim zum Isotypisieren monoklonaler Antikörper der Maus erhalten wurde, wurde zum Bestimmen des Isotyps von 3F5.4G6 verwendet. Der monoklonale Antikörper wurde 1 : 100 in PBS verdünnt und die verdünnte Probe (150 μl) zu einem Entwicklungsröhrchen gegeben, das mit dem Kit zur Verfügung gestellt wird, und 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann kurz heftig bewegt. Der isotypstreifen wurden dann in das Gläschen eingeführt und 5 Minuten lang entwickelt. Eine blaue Bande erschien entweder im Lambda- oder im Kappa-Abschnitt des Streifens sowie in einem der Klassen- oder Unterklassen-Abschnitte. Der monoklonale Antikörper 3F5.4G6 wurde als IgM-Isotyp identifiziert.
  • Der monoklonale Antikörper 3F5.4G6 wurde ferner unter Verwendung der monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 als Kontrolle gegen Seren getestet, die von Patienten mit fortschreitendem Prostatakarzinom in Stadium D2 entnommen wurden (3). Beide Antikörper identifizierten eine Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 120 kD (3). Ein zusätzlicher Western-Blot-Assay von LNCaP-Zellen unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 3F5.4G6 wurde unter Verwendung eines für IgM spezifischen sekundären Antikörpers durchgeführt (4). Während der monoklonale Antikörper 7E11-C5 eine einzelne Bande von etwa 120 kD, d. h. PSMA, erkannte, erkannte 3F5.4G6 eine Bande mit ähnlichem Molekulargewicht sowie eine Bande von etwa 105–110 kD. Diese Bande entspricht der vorhergesagten Proteinform von PSM' und demonstriert den Nutzen eines Antikörpers, der die extrazelluläre Domäne von sowohl PSMA als auch PSM' spezifisch erkennt.
  • Die Reaktivität von 7E11-C5 mit einem Protein von 120 kD in den Seren von Patienten mit Prostatakarzinom war antikörperspezifisch und nicht auf die unspezifische Reaktivität des sekundären Antikörpers mit Serumproteinen im Allgemeinen zurückzuführen. In einem Western-Blot-Assay ließ man Immobilon-P-Papier, das getrennte Proteine enthielt, die von Serumproben abgeleitet worden waren, entweder mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5 plus sekundärem Antikörper, gekoppelt an HRP, oder nur mit sekundärem Antikörper, gekoppelt an HRP, reagieren. Der Film wurde 1 min lang belichtet oder 45 min lang überbelichtet, um die Nichtreaktivität des sekundären Antikörpers mit einem Protein von 120 kD in Seren zu demonstrieren. Der gleiche sekundäre Antikörper wurde auch mit 3F5.4G6 verwendet, um das gleiche Antigen nachzuweisen. Deshalb war der monoklonale Antikörper 3F5.4G6 für PSMA und PSM' spezifisch.
  • 5 bestätigt, dass das durch 7E11-C5 identifizierte Protein auch durch den monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 erkannt wurde. Zusätzlich erkannte der monoklonale Antikörper 3F5.4G6 auch ein Protein von 105–110 kD, das durch den monoklonalen Antikörper 7E11-C5 nicht nachgewiesen wurde. Dieses schneller wandernde Protein entsprach PSM'. Als das Lysat zuerst mit 7E11-C5 präzipitiert wurde, und die verbleibenden Proteine mit 7E11-C5 sondiert wurden, wies der Antikörper kein Protein nach (Spur 4). Im Gegensatz dazu wies 3F5.4G6, als die mit 7E11-C5 vorbehandelten Lysate mit ihm sondiert wurden, ein Protein von etwa 110 kD nach. 6 zeigt, dass das 120 kD große Protein, d. h. PSMA, das durch 3F5.4G6 immunpräzipitiert wurde, auch von 7E11-C5 erkannt wird.
  • 7A und B demonstriert durch FACS-Analyse, dass der monoklonale Antikörper 3F5.4G6 lebende LNCaP-Zellen erkannte, was bestätigt, dass 3F5.4G6 die extrazelluläre Domäne von PSMA erkannte. Ein derartiger Antikörper, der die extrazelluläre Domäne von PSMA erkennt, ist als ein diagnostisches und/oder therapeutisches Hilfsmittel bei Prostatakarzinom besonders nützlich.
  • Man ließ menschliche Samenflüssigkeit mit einem PSMA-spezifischen Antikörper reagieren und analysierte sie auf enzymatische Aktivität. 8 veranschaulicht, dass das Protein, das in Spur 2 durch den monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 erkannt wird, ein ungefähres Molekulargewicht von 90 kD aufweist. Während gezeigt wurde, das PSM' in LNCaP-Lysaten ein Molekulargewicht von 105–110 kD hat, handelte es sich bei dem Protein mit 90 kD in Samenflüssigkeiten wahrscheinlich um ein nicht glykosyliertes oder teilweise glykosyliertes Produkt von PSM'. Da PSM' einige Glykosylierungsstellen enthält, war dieses niedrigere Molekulargewicht das Ergebnis von Aktivitäten durch Glykosidasen in der Samenflüssigkeit. Dass PSMA in diesem gereinigten Präparat nicht vorlag, wird durch die Tatsache veranschaulicht, dass 3F5.4G6 ein in einem Lysat von LNCaP-Zellen vorliegendes Protein mit einem Molekulargewicht von 120 kD (Spur 1), bei dem es sich um PSMA handelt, erkannte, aber ein Protein mit diesem Molekulargewicht in Spur 2 nicht erkannte. Zusätzlich erkannte der Antikörper 7E11-C5 die Bande von 90 kD in Samenflüssigkeiten nicht.
  • Dieses gereinigte Präparat von PSM', das durch den monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 erkannt wird, wurde dann auf NAALADase-Aktivität analysiert. Der Hochgeschwindigkeitsüberstand, der aus einem LNCaP-Lysat hergestellt wurde, wurde als postivite Kontrolle verwendet. Das Protein, das positiv mit dem monoklonalen Antikörper 3F5.4G6 reagierte, was damit vereinbar ist, dass es sich um PSM' handelt, enthielt eine ihm eigene NAALADase-Aktivität von 16,9 nmol/min/mg Protein unter Verwendung des in Robinson et al. (1987, J. Biol. Chem. 262: 14498–14506) beschriebenen Assays.
  • 7. BEISPIEL: HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTIKÖRPER GEGEN EIN PSMA-ENTHALTENDES TUMORZELL-MEMBRANPRÄPARAT
  • 7.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • 7.1.1 IMMUNISIERUNG
  • LNCaP-Membranen wurden aus zwei 150-mm-Platten hergestellt, indem die Zellen in einer Versen-Lösung abgelöst wurden, gefolgt von einer Zentrifugation, um die Zellen zu pelletieren. Destilliertes Wasser wurde zu dem Zellpellet gegeben und die Zeilen wurden unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators homogenisiert. Die homogenisierte Suspension wurde bei 30.000 × g zentrifugiert und die pelletierte Membranfraktion wurde zur Immunisierung verwendet.
  • Adulte weibliche BALB/c-Mäuse wurden 4-mal (Abstände von 2–3 Wochen) intraperitoneal mit einem Membranpräparat aus LNCaP-Prostatakarzinomzellen, das in vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert war, immunisiert. Fünf Tage vor der Zellfusion wurden die Mäuse mit 50 μg immunaffinitätsgereinigtem PSMA in PBS nachverstärkt. Die Zellfusion wurde wie im vorstehenden Abschnitt 6.1.3 beschrieben durchgeführt.
  • 7.1.2 DURCHMUSTERN PRIMÄRER HYBRIDOME
  • Ein Festphasen-Assay, der auf einem enzymverbundenen Immunadsorptionsassay (ELISA) beruht, wurde zum Nachweis PSMA-spezifischer Antikörper eingesetzt. Immunaffinitätsgereinigtes PSMA, in Baculovirus exprimiertes PSMA voller Länger oder bakteriell exprimierte PSMA-Fragmente wurden auf Maxi-Sorp (Nunc Immuno) Platten mit 96 Vertiefungen durch eine Inkubation bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden mit PBS – 0,2% Tween-20 gespült und die verbleibenden Stellen wurden mit einer 5%igen Lösung von BSA eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Fünfzig Mikroliter Überstand von den Hybridomkulturen wurden zu den PSMA-beschichteten Vertiefungen gegeben und die Platten wurden zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wie vorstehend gespült und 50 μl einer 1 : 600 Verdünnung von Kaninchen-anti-Maus-IgG und Kaninchen-anti-Maus-IgM wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten wie vorstehend gespült und 50 μl einer 1 : 400 Verdünnung von HRP-konjugiertem Protein A wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten wie vorstehend gespült und 100 μl ABTS (150 mg 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) in 500 ml 0,1 M Zitronensäure, pH 4,35)/H2O2 (10 μl 30% H2O2 pro 10 ml ABTS-Lösung) Chromogen/Substratlösung wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden in einem Mikroplattenlesegerät abgelesen und die OD405 wurde gemessen. Die Hybridomzellen, die Überstände mit OD-Werten 0,05 über dem Hintergrund bildeten, wurden durch begrenzende Verdünnung geklont und zusätzlicher Analyse unterworfen.
  • Zum Festphasen-Einfangen von PSMA wurde der zuvor erwähnte Assay folgendermaßen modifiziert: Fünfzig Mikroliter einer 40 μg/ml Lösung des monoklonalen Anti-PSMA-Antikörpers 7E11-C5 in Bindungspuffer mit 0,1 M NaHCO2, pH 8,2, wurde zu Vertiefungen einer Maxi-Sorp-Platte gegeben und man ließ ihn bei 4°C über Nacht anhaften. Die Platten wurden wie vorstehend gespült und blockiert. Fünfzig Mikroliter seriell verdünntes immunaffinitätsgereinigtes PSMA wurden zu den mit 7E11-C5 beschichteten Vertiefungen gegeben und die Platten wurden zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach ausgiebigem Spülen wurden 50 μl unverdünnter Kulturüberstand entweder von dem Hybridomklon 3D7-1.1 oder 4E10-1.14 zu den Vertiefungen gegeben und die Platten wurden 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Spülen wie vorstehend wurden die Vertiefungen mit 50 μl einer 1 1000 Verdünnung von Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgM sondiert und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach ausgiebigem Spülen wurden 100 μl ABTS/H2O2 zu jeder Vertiefung gegeben und die Platten wurden in einem Mikroplatten-Lesegerät, wie vorstehend beschrieben, abgelesen.
  • 7.1.3 IMMUNAFFINITÄTSREINIGUNG VON PSMA
  • Sechzehn Milliliter gepackte LNCaP-Zellen wurden in 5 Volumina 25 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, durch zwei Stöße mit einem Potter-Elvehjem-Homogenisator homogenisiert, gefolgt von Rühren bei 4°C über Nacht. Der Extrakt wurde 1 Stunde lang bei 100.000 × g zentrifugiert und das Pellet wurde wie vorher erneut extrahiert. Die kombinierten Überstände wurden über Nacht in der Kälte mit 7E11-C5-Immunobeads (Pierce) (3–5 ml Bettvolumen des Harzes) gemischt. Die Kügelchen wurden zentrifugiert, ausgiebig mit Homogenisierungspuffer gespült und in eine Säule gegossen. Die Kügelchen wurden wieder mit zusätzlichem Homogenisierungspuffer, der 1% NP-40 enthielt, erneut gespült, gefolgt von einer zusätzlichen Spülung mit 1% Triton X-100R enthaltendem Puffer. Die gespülten Kügelchen wurden mit 100 mM Glycinpuffer, pH 2,5, 150 mM NaCl, 1% Triton x-100R, in 2-ml-Fraktionen eluiert. Die Proteinelution wurde bei OD280 überwacht.
  • Fraktionen, die Protein enthielten, wurden durch SDS-PAGE-Gele unter Verwendung von Silberfärbung und Western-Blotting analysiert. In typischen Präparaten war die 120-kD-Proteinbande, die einer 7E11-CSReaktivität in einem Western-Blot entsprach, zu 60–80% rein. Eine ungefähre Ausbeute aus 16 ml gepackten Zellen war 1 Milligramm PSMA-Protein. Das Detergenz im PSMA-Präparat wurde entfernt, indem die Lösung über eine Extractigel-Säule (Pierce) geschickt wurde.
  • 7.1.4 DURCHFLUSSMOMETRIE-ANALYSE
  • Die Fähigkeit monoklonaler Antikörper, externe oder extrazelluläre Epitope von PSMA zu erkennen, wurde mit Durchflusszytometrie bewertet. LNCaP-Zellen (die PSMA exprimierten) und PC-3-Zellen (die PSMA nicht exprimierten) wurden aus Gewebekulturkolben frisch geerntet und eine Einzelzellsuspension wurde hergestellt. Ungefähr eine Million Zellen wurden in einem ml unverdünntem Gewebekulturüberstand von entweder dem Hybridomklon 3D7-1.1 oder 4E10-1.14 resuspendiert und zwei Stunden lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS – 0,1% BSA, 0,01% Na-Azid, gespült, in 100 μl einer 1 : 100 Verdünnung von FITC-konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-IgM resuspendiert und zusätzliche 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden zweimal wie vorstehend gespült, in 500 μl Spülpuffer resuspendiert und mit FACSCalibur (Becton-Dickinson) mit der CellQuest Acquise-Software auf Fluoreszenzfärbung analysiert.
  • 7.1.5 WESTERN-BLOT-ANALYSE
  • Gewebekulturüberstände der Hybridomklone 3D7-1.1 und 4E10-1.14 wurden in einem Western-Blot-Assay auf PSMA-Reaktivität getestet. Die Western-Blot-Analyse wurde nach dem Protokoll von Pelletier und Boynton (1994, J. Cell. Physiol. 158: 427–434) durchgeführt. Kurz gesagt wurden Lysate von LNCaP- und PC-3-Zellen, immunaffinitätsgereinigtes PSMA oder in Baculovirus exprimiertes PSMA voller Länge auf einem 8,5%igen SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt, und die getrennten Proteine wurden eine Stunde lang bei 90 Volt auf eine PVDF-Membran elektrisch übertragen. Die Membranen wurden in 5% BLOTTO über Nacht blockiert und 90 Minuten lang mit 20 ml unverdünntem Gewebekulturüberstand des geeigneten Klons inkubiert. Der Überstand wurde entfernt, die Blots wurden fünfmal mit TBS – 0,5% Tween-20 (TBS-T) gespült und mit einer 1 : 5000 Verdünnung von Peroxidase-konjugiertem sekundärem Ziegen-anti-Maus-IgM-Antikörper (Jackson) eine Stunde lang bei Raumtemperatur sondiert. Die Membran wurde fünfmal mit TBS-T gespült, unter Verwendung des Chemiluminescent Substrate Kits (KPL) entwickelt und durch Belichten von Röntgenfilm (Kodak) sichtbar gemacht.
  • 7.1.6 HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEM PSMA DURCH EIN BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM
  • Ein Insert, das die codierende Sequenz von PSMA in voller Länge enthielt (Israeli et al., 1993, Cancer Res. 53: 227–230) wurde aus einer menschlichen Lambda pDR2 Genbank (Clonetech) unter Verwendung von Sonden, die für die Gensequenz spezifisch sind, kloniert. Das Insert wurde aus diesem Vektor durch Verdauung mit Sma I und Ssp I ausgeschnitten und gemäß den Anweisungen der Herstellers in den Transfervektor pAcHLT-C (Pharmingen) kloniert. Kotransfektion des Transfervektors mit viraler linearisierter BacPAK6-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers (Clonetech), ergab ein Virus, das für das PSMA-Protein voller Länge codiert, welches einen Polyhistidin-Schwanz am N-Terminus des Proteins enthält, der für die Isolierung des Proteins durch Binden an eine Ni-NTA-Säule verwendet werden soll. PSMA-Protein wurde durch Isolieren von Plaque-gereinigten rekombinanten Baculovirus-Partikeln, Amplifizieren und Infizieren von Sf9-Zellen mit einer Infektions-Multiplizität von etwa 1 : 2 in Anwesenheit von SFM-II-Medium (Gibco-BRI), das mit 5% FBS (Hyclone) ergänzt wurde, hergestellt. Nach einer 48-stündigen Inkubation wurden infizierte Zellen geerntet und in 1% CHAPS lysiert und durch Ni-NTA-Agarose (Quiagen) mit Imidazol-Elution gemäß den Anweisun gen des Herstellers gewonnen. Das Endprodukt wurde 3-mal gegen 1 Liter PBS dialysiert.
  • 7.2 ERGEBNISSE
  • Monoklonale Antikörper wurden gegen Prostatakarzinommembranen, die PSMA enthielten, erzeugt. Zwei Hybridomklone, 3D7-1.1 und 4E10-1.14, wurden durch einen Festphasen-Immunoassay unter Verwendung von immunaffinitätsgereinigtem nativem PSMA aus LNCaP-Zellen und bakteriell exprimierten Fragmenten von PSMA, die den Aminosäureregionen 1–175, 134–437 und 438–750 entsprachen, ausgewählt. Überstände der Hybridomklone 3D7-1.1 und 4E10-1.14 demonstrierten vergleichbare Bindung an natives PSMA, verglichen mit dem Antikörper 7E11-C5 (9). Unspezifische Hintergrundbindung an BSA war bei allen drei Antikörperpräparaten im Wesentlichen vergleichbar.
  • Als die Epitop-Bindungsspezifität getestet wurde, band der monoklonale Antikörper 7E11-C5 an das Aminosäurefragment 1–175, das der N-terminalen, intrazellulären Domäne von PSMA entspricht. Obwohl 3D7-1.1 und 4E10-1.14 geringe Bindung an dieses Fragment aufzeigten, demonstrierten diese beiden monoklonalen Antikörper die stärkste Bindung an das Aminosäurefragment 134–437 von PSMA, das Teil der extrazellulären Domäne von PSMA ist (9). Da dieses Fragment ein Teil von PSM' ist, reagieren diese Antikörper auch mit PSM'.
  • Der Überstand des Hybridomklons 3D7-1.1 wurde ferner in einem Western-Blot-Assay gegen Lysate aus LNCaP- und PC-3-Zellen und immunaffinitätsgereinigtes PSMA getestet. 10 zeigt, dass 3D7-1.1 mit einer 120-kD-Bande reagiert, die in LNCaP-Zellen (Spur 1) aber nicht in PC-3-Zellen (Spur 2) vorliegt. Sowohl Spur 1 als auch 2 zeigen eine Reaktivität auf, die am wahrscheinlichsten auf unspezifische Bindung des sekundären Antikörperreagens zurückzuführen war. Spur 3, die immunaffinitätsgereinigtes PSMA enthält, zeigt eine Hauptbande bei 120 kD, wenn sie mit dem monoklonalen Antikörper 3D7-1.1 sondiert wird. Ähnliche Western-Blot-Daten wurden auch mit dem Überstand des Klons 4E10-1.14 erhalten, obwohl der unspezifische Hintergrund des Blots viel größer war als mit 3D7-1.1. Daher reagieren sowohl 3D7-1.1 als auch 4E10-1.14 mit einer 120 kD-Bande, die in LNCaP-Zellen vorliegt, und mit immunaffinitätsgereinigtem PSMA.
  • PSMA voller Länge, das in Baculovirus exprimiert wurde, wurde auf einem SDS-PAGE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran elektrisch übertragen. Der Blot wurde in ein Mini-Protean II Multi-Screen-Gerät (Bio-Rad) eingeführt, mit einer Vielzahl von Antikörperpräparaten sondiert und als Western-Blot entwickelt. Figur 11 zeigt, dass die monoklonalen Antikörper 3D7-1.1 und 4E10-1.14 mit einer Proteinbande reagierten, die der gleichen Bande entsprach, die durch den monoklonalen Antikörper 7E11-C5 gebunden wurde.
  • LNCaP-Zellen und PC-3-Zellen wurden mit Überständen der Hybridomklone 3D7-1.1 und 4E10-1.14 gefärbt und mit Durchflusszytometrie analysiert. Die beiden Antikörper färbten lebende, nicht fixierte LNCaP-Zellen, färbten aber PC-3-Zellen nicht (12A–D). Diese Ergebnisse bestätigten, dass diese beiden Antikörper mit Epitopen in der extrazellulären Domäne des PSMA-Moleküls reagierten. Darüber hinaus legt der deutliche Shift bei der LNCaP-Färbung, der mit dem monoklonalen Antikörper 4E10-1.14 beobachtet wird, verglichen mit der Schulter, die mit 3D7-1.1 gesehen wird, nahe, dass diese beiden Antikörper unterschiedliche Epitope in dieser bestimmten Region des PSMA-Moleküls erkennen.
  • Ein zwei-Stellen Capture-ELISA für PSMA wurde unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 als ein Einfang-Reagens für PSMA und der monoklonalen Antikörper 3D7-1.1 und 4E10-1.14 als Reporter- oder Nachweis- Antikörper entwickelt. Da diese Antikörper unterschiedliche Epitope auf dem PSMA-Molekül erkennen (7E11-C5 reaktiv mit den 6 N-terminalen Aminosäuren; 3D7-1.1 und 4E10-1.14 mit einer Sequenz in der Aminosäureregion 134–475 reaktiv) paaren sie im zwei-Stellen Capture-Assay effektiv. Unter Verwendung von seriell verdünntem, immunaffinitätsgereinigtem PSMA als Testantigen waren Überstände von sowohl 3D7-1.1 als auch 4E10-1.14 in der Lage, PSMA nach Einfangen auf Platten mit 96 Vertiefungen, die mit 7E11-C5 beschichtet waren, nachzuweisen (13). Zusätzlich wurde gereinigtes PSMA aus LNCaP-Zellen und Samenflüssigkeit getestet sowie ein rohes Präparat von in Baculovirus exprimiertem PSMA voller Länge (14). Signifikante OD405-Werte wurden für das PSMA-Kontrollantigen, Samenflüssigkeit und das Baculovirus-PSMA-Präparat beobachtet. Als gereinigtes PSMA in normales weibliches menschliches Serum verdünnt wurde und die Proben unter Verwendung des zwei-Stellen Capture-Assays analysiert wurden, wiesen die gleichen Antikörper auch PSMA nach (15). Also wies der zwei-Stellen Capture-Assay, der mit monoklonalen Antikörper entwickelt wurde, die gegen unterschiedliche Teilstücke von PSAA gerichtet sind, PSMA aus einer Vielfalt von Quellen in Antigenspezifischer Weise nach.
  • Ein alternativer zwei-Stellen Capture-ELISA für PSMA wurde unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 3D7-1.1 als einem Einfang-Reagens für PSMA und dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5 als Reporter- oder Nachweis-Antikörper entwickelt. Seriell verdünntes, immunaffinitätsgereinigtes PSMA wurde als Testantigen verwendet, auf Platten, die mit 3D7-1.1 beschichtet waren, eingefangen und unter Verwendung des biotinylierten monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 nachgewiesen. Die Ergebnisse werden in 16 gezeigt.
  • 16 demonstriert, dass monoklonale Antikörper, wie zum Beispiel 3D7-1.1 oder 4E10-1.14, die spezifisch an die extrazelluläre Domäne von PSMA binden, in einem zwei-Stellen Capture-ELISA für PSMA nützlich sind.
  • Die Brauchbarkeit von 3D7-1.1 zum Einfangen von PSMA zeigt an, dass ein anderer alternativer Immunoassay, der ausschließlich auf der extrazellulären Domäne des PSMA-Proteins beruht, nützlich sein wird. Ein derartiger Assay, der zwei Antikörper, die für die extrazelluläre Domäne spezifisch sind, zum Einfangen und Nachweis benutzen würde, wäre wegen der Position des Epitops in dem Protein in der Lage, PSM' nachzuweisen. Daher würde jeder Assay, der 7E11-C5 entweder zum Einfangen oder zum Nachweis benutzen würde, PSM' spezifisch ausschließen. Ein Beispiel für einen PSM'-spezifischen Assay würde Einfangen von PSMA und PSM' durch einen Antikörper, wie zum Beispiel 3D7-1.1 oder jeden monoklonalen Antikörper, der spezifisch für die extrazelluläre Domäne von PSMA wäre, in parallelen Tests einschließen. Der anschließende Nachweis unter Verwendung von sowohl 4E10-1.14 für gesamtes PSMA und PSM' als auch 7E11-C5 nur für PSMA würde die Menge von PSM' durch einfache Subtraktion ergeben. Aus diesen Daten wird ein Verhältnis von PSM' zu PSMA abgeleitet, das aus Sicht der Referenz von Su et al., Cancer Res., 55: 1441–1443 (1995), diagnostische Relevanz haben wird.
  • Su zeigt, dass das Transkript, das für PSMA codiert, vorzugsweise in Patienten mit Prostatakarzinom (verglichen mit normalen Männern) nachgewiesen wird, obwohl Su keine Demonstration vorlegt, dass das PSMA-Transkript in diesen Patienten tatsächlich zu Protein translatiert wird. Zusätzlich zeigt Su, dass das für PSM' codierende Transkript vorzugsweise in normalen Männern (verglichen mit Patienten mit Prostatakarzinom) nachgewiesen wird, obwohl Su niemals ein PSM'-Protein nachwies. Die Erfinder demonstrieren in dieser Anmeldung, dass das PSMA-Protein in Körpergeweben und/oder -flüssigkeiten von Patienten mit Prostatakarzinom (verglichen mit normalen Männern) erhöht ist und dass das PSM'-Protein in Körpergeweben und/oder -flüssigkeiten von normalen Männern (verglichen mit Patienten mit Prostatakarzinom) erhöht ist. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung das Verhältnis von PSM' zu PSMA diagnostischen und/oder prognostischen Nutzen für die klinische Bewertung von Patienten mit Prostatakarzinom haben.
  • Ein Fragment von PSMA, das den Aminosäuren 34 bis 750 des PSMA voller Länge entspricht, wurde als ein 1,9-kb-Insert in einem Baculovirus-Expressionssystem exprimiert. Das in Baculovirus exprimierte PSMA-Fragment ist PSM' (das den Resten 58– 750 des PSMA voller Länge entspricht) sehr ähnlich, außer dass 76 zusätzliche Aminosäuren der extrazellulären Domäne von PSMA am N-Terminus des Fragments fehlen. Western-Blot-Analysen verschiedener halb gereinigter, in Baculovirus exprimierter PSMA-Fragmente und LNCaP-Zelllysate wurden mit dem monoklonalen Antikörper 4E10-1.14 als Sonde entwickelt. Die Ergebnisse werden in 17 gezeigt.
  • Eine Western-Blot-Analyse roher Lysate von SF9-Zellen, die mit Baculovirus infiziert waren, das entweder ein irrelevantes Insert oder das 1,9-kb-Insert enthielt, das für das PSMA-Fragment codiert, d. h. die Aminosäuren 134–750 des PSMA voller Länge, wurde mit dem monoklonalen Antikörper 7E11-C5 als Sonde entwickelt. Die Ergebnisse werden in 18 gezeigt.
  • 17 zeigt an, dass Antikörper, wie zum Beispiel 4E10-1.14, die für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifisch sind, auch in der Lage sind, an ein in Baculovirus exprimiertes Proteinprodukt zu binden, das PSM' sehr ähnlich ist. Im Gegensatz dazu zeigt 18 an, dass dies keine Eigenschaft des monoklonalen Antikörpers 7E11-C5 auf Grund seiner Epitop-Spezifität ist (siehe die negative Reaktivität von 7E11-C5 mit dem in Baculovirus exprimierten PSMA-Fragment in 18). Das in Baculovirus exprimierte PSM-Proteinfragment ist mit PSM' identisch (das den Resten 58–750 des PSMA voller Länge entspricht), außer dass ihm 76 zusätzliche Aminosäuren vom N-Terminus her fehlen, die sich alle in der extrazellulären Domäne befinden. Weil die Epitopspezifitäten sowohl von 3D7-1.1 als auch 4E10-1.14 in eine Region der extrazellulären Domäne kartieren, die sowohl in PSM' als auch dem PSMA-Fragment mit den Aminosäuren 134–750 enthalten ist (siehe 9), hätten die beiden Antikörper die ihnen eigene Eigenschaft, an natives PSM' zu binden, eine Eigenschaft, die von 7E11-C5 nicht geteilt wird.
  • Der monoklonale Antikörper 3D7-1.1 wurde als Sonde in einem Western-Blot mit PSMA, das aus LNCaP-Zellen abgeleitet war, sowie menschlichem Serum und Samenflüssigkeit, von der bekannt ist, dass sie auch PSMA enthält, verwendet. Die Ergebnisse werden in 19 gezeigt.
  • Eine PSMA entsprechende Bande, die bei etwa 120 kD wandert, liegt in allen Fraktionen vor. Zusätzlich wurde eine zweite, schneller wandernde Bande mit einem Molekulargewicht von 90 bis 100 kD im Serum und der Samenflüssigkeit beobachtet, wie durch den Antikörper 3D71.1 aufgedeckt wird. Diese schneller wandernde Bande wird in Western-Blots mit Serum unter Verwendung des Antikörpers 7E11-C5 (siehe Holmes et al., The Prostate, Erg. 7: 25–29 (1996)) nicht beobachtet. Diese schneller wandernde, mit 3D7-1.1 reaktive Proteinbande ist höchstwahrscheinlich in biologischen Flüssigkeiten vorliegendes PSM'.
  • 8. HINTERLEGUNG DER ZELLLINIEN
  • Die folgenden Hybridomzelllinien wurden am 12. März 1996 und am 11. März 1997 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt und ihnen wurden die folgenden Zugriffsnummern zugewiesen:
    Hybridom ATCC-Zugriffsnummer
    3F5.4G6 HB12060
    3D7-1.1 HB12309
    4E10-1.14 HB12310
  • Die vorliegende Erfindung soll durch die beispielhaft erläuterten Ausführungsformen, die als Veranschaulichungen einzelner Aspekte der Erfindung beabsichtigt sind, nicht im Umfang beschränkt werden. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu denen, die hierin gezeigt und beschrieben wurden, Fachleuten aus der vorangegangenen Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen offensichtlich sein.
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001

Claims (36)

  1. Monoklonaler Antikörper mit einer Antigen-bindenden Region, die für die extrazelluläre Domäne des Prostata-spezifischen Membran-Antigens (PSMA) spezifisch ist und worin der Antikörper an die PSMA exprimierende Oberfläche von Lebendzellen bindet.
  2. Antikörper nach Anspruch 1, worin die extrazelluläre Domäne von PSMA die Aminosäuresequenz von Rest Nr. 44 bis 750, wie in 1 (SEQ ID NO:2) erläutert, umfasst.
  3. Antikörper nach Anspruch 2, der an die Aminosäuresequenz ESKVDPSK (SEQ ID NO:1) bindet.
  4. Antikörper nach Anspruch 3, dessen Antigen-bindende Region die immunspezifische Bindung des durch das Hybridom 3F5.4G6 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12060 gebildeten monoklonalen Antikörpers kompetitiv inhibiert.
  5. Antikörper nach Anspruch 1, dessen Antigen-bindende Region die immunspezifische Bindung des durch das Hybridom 3D7-1.1 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12309 oder durch das Hybridom 4E10-1.14 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12310 gebildeten monoklonalen Antikörpers an sein Target-Epitop kompetitiv inhibiert.
  6. Hybridom-Zelllinie, die die ATCC-Zugriffsnummern HB 12060, HB 12309 oder HB 12310 aufweist.
  7. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit einer Antigen-bindenden Region, die für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifisch ist und worin der monoklonale Antikörper zum Nachweis der Anwesenheit von PSMA in einer biologischen Probe in vitro an die PSMA exprimierende Oberfläche von Lebendzellen bindet.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, worin die Antigen-bindende Region des Antikörpers die immunspezifische Bindung des durch das Hybridom 3F5.4G6 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12060, das Hybridom 3D7-1.1 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12309 oder das Hybridom 4E10-1.14 mit der ATCC-Zugriffsnummer 12310 gebildeten monoklonalen Antikörpers an sein Target-Epitop kompetitiv inhibiert.
  9. Verwendung nach Anspruch 7, worin die Probe eine Biopsie-Probe oder eine Körperflüssigkeit darstellt.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, worin die Körperflüssigkeit Vollblut, Serum, Samenflüssigkeit, Urin oder Zellen im Urin darstellt.
  11. Verwendung nach Anspruch 7, worin der Nachweis von Antikörper-gebundenem PSMA durch einen für PSMA spezifischen zweiten Antikörper erfolgt.
  12. Verwendung nach Anspruch 7, worin der Nachweis von Antigen-gebundenem PSMA mittels der NAALAUase-Aktivität erfolgt.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, worin die NAALADase-Aktivität durch eine Erhöhung von NAD(P)H nachgewiesen wird.
  14. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit einer Antigen-bindenden Region, die für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifisch ist und der an die PSMA exprimierende Oberfläche von Lebendzellen zum Nachweis der Anwesenheit von durch Krebszellen in vitro exprimiertem PSMA bindet.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, worin die Antigen-bindende Region des Antikörpers die immunspezifische Bindung des durch das Hybridom 3F5.4G6 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12060, das Hybridom 3D7-1.1 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12309 oder das Hybridom 4E10-1.4 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12310 gebildeten Antikörpers an sein Target-Epitom kompetitiv inhibiert.
  16. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit einer Antigen-bindenden Region, die für die extrazelluläre Domäne von PSMA spezifisch ist und der zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Tumors, umfassend PSMA exprimierende Prostatakarzinomzellen, an die PSMA exprimierende Oberfläche von Lebendzellen bindet.
  17. Verwendung nach einem der Ansprüche 14–16, worin der Antikörper an ein Radioisotop konjugiert ist.
  18. Isolierte Nukleotidsequenz, codierend für eine Antigen-bindende Stelle eines monoklonalen Antikörpers, der die immunspezifische Bindung des durch das Hybridom 3F5.4G6 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12060, das Hybridom 3D7-1.1 mit der Zugriffsnummer HB 12309 oder das Hybridom 4E10-1.14 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12310 gebildeten Antikörpers an sein Target-Epitop kompetitiv inhibiert.
  19. Isolierte Nukleotidsequenz, codierend für eine Antigen-bindende Stelle eines monoklonalen Antikörpers, der durch das Hybridom mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12060, das Hybridom mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12309 oder das Hybridom mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12310 gebildet wird.
  20. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit einer Antigen-bindenden Region, die für die extrazelluläre Domäne von PSMA zum Nachweis der Anwesenheit von PSM'-Protein in einer biologischen Probe in vitro spezifisch ist.
  21. Verwendung nach Anspruch 20, worin die Antigen-bindende Region des Antikörpers die immunspezifische Bindung des durch das Hybridom 3F5.4G6 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12060, das Hybridom 3D7-1.1 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12309 oder das Hybridom 4E10-1.14 mit der ATTC-Zugriffsnummer HB 12310 gebildeten monoklonalen Antikörpers an sein Target-Epitop kompetitiv inhibiert.
  22. Verwendung nach Anspruch 20, worin die Probe eine Biopsie-Probe, Körperflüssigkeit, Urin oder Zellen im Urin darstellt.
  23. Verwendung nach Anspruch 22, worin die Körperflüssigkeit Vollblut, Serum oder Samenflüssigkeit darstellt.
  24. Verwendung nach Anspruch 20, worin der Nachweis von Antikörper-gebundenem PSM' durch einen für PSM' spezifischen zweiten Antikörper erfolgt.
  25. Verwendung nach Anspruch 20, worin der Nachweis von Antikörper-gebundenem PSM' durch die NAALADase-Aktivität erfolgt.
  26. Verwendung nach Anspruch 25, worin die NAALADase-Aktivität durch eine Erhöhung von NAD(P)H nachgewiesen wird.
  27. Verwendung eines monoklonalen Antikörpers mit einer Antigen-bindenden Region, die für die extrazelluläre Domäne des Prostata-spezifischen Membran Antigens spezifisch ist und die zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Prostatakarzinoms an die PSMA exprimierende Oberfläche von Lebendzellen bindet.
  28. Verwendung nach Anspruch 27, worin die Antigen-bindende Region des Antikörpers die immunspezifische Bindung des durch das Hybridom 3F5.4G6 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12060, das Hybridom 3D71.1 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12309 oder das Hybridom 4E10-1.14 mit der ATCC-Zugriffsnummer HB 12310 gebildeten monoklonalen Antikörpers an sein Target-Epitop kompetitiv inhibiert.
  29. Verwendung nach Anspruch 27, worin der Antikörper an ein Arzneimittel, ein Toxin oder ein Radioisotop konjugiert ist.
  30. Verwendung nach Anspruch 27, worin der monoklonale Antikörper einen bispezifischen Antikörper darstellt, der weiter eine für eine Effektorzelle mit tumorizider oder Tumor-inhibitorischer Aktivität spezifische Antigen-bindende Region umfasst.
  31. Kit zur Diagnose, Prognose oder zum Monitoring des Prostatakarzinoms, umfassend den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder ein Bindungsfragment davon.
  32. Kit zur Diagnose, Prognose oder zum Monitoring des Prostatakarzinoms, umfassend den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 oder ein Bindungsfragment davon.
  33. Kit zur Diagnose, Prognose oder zum Monitoring des Prostatakarzinoms, umfassend den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 3 oder ein Bindungsfragment davon.
  34. Kit zur Diagnose, Prognose oder zum Monitoring des Prostatakarzinoms, umfassend den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 4 oder 5 oder ein Bindungsfragment davon.
  35. Kit nach Anspruch 31, 32, 33 oder 34, worin der Antikörper oder ein Fragment davon in wässrigem Medium oder in lyophilisierter Form verpackt ist.
  36. Kit nach Anspruch 31, 32, 33 oder 34, das weiter einen für PSMA spezifischen zweiten Antikörper oder Glutamatdehydrogenase umfasst.
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