ES2329851T3 - Nuevos antigenos transmembranables expresados en canceres humano y utilizacion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Utilización de un anticuerpo conjugado con una toxina o un agente terapéutico en la fabricación de un medicamento para un procedimiento terapéutico en el tratamiento del cáncer, en el que dicho anticuerpo: (i) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o (ii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido de al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o (iii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido seleccionado entre la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 y SEC ID N.º 31; o (iv) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que es al menos un 90% idéntico a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud; o (v) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que se obtiene mediante el cultivo de una célula huésped que contiene un vector de expresión que contiene un polinucleótido (a) que tiene la secuencia mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1), en la que T también puede ser U, o (b) que codifica un polipéptido cuya secuencia está codificada por el ADNc contenido en el clon 10.1 del plásmido 8P1D4 depositado como ATCC 98849 o (c) que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma; o (vi) tiñe inmunohistoquímicamente células 293T transfectadas con un plásmido de expresión que codifica y expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), pero no tiñe inmunohistoquímicamente células 293T no transfectadas.

Description

Nuevos antígenos transmembranales expresados en cánceres humano y utilizaciones de los mismos.

Campo de la invención

La invención descrita en la presente memoria se refiere a un nuevo gen y a la proteína antigénica tumoral codificada, denominados STEAP-1, y a procedimientos de diagnóstico y terapéuticos, así como a composiciones útiles en el tratamiento de diversos cánceres, incluyendo particularmente el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de vejiga, el cáncer de ovario y el cáncer pancreático.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la segunda causa principal de mortalidad humana después de la enfermedad coronaria. En todo el mundo, cada año, mueren millones de personas a causa del cáncer. Sólo en Estados Unidos, el cáncer provoca la muerte de bastante más de medio millón de personas al año, siendo diagnosticados unos 1,4 millones de nuevos casos anualmente. Mientras que las muertes por enfermedad coronaria han descendido significativamente, aquéllas provocadas por el cáncer van generalmente en aumento. Se prevé que, a comienzos del siglo que viene, el cáncer se habrá convertido en la principal causa de mortalidad.

Por todo el mundo, son varios los cánceres que destacan como los más mortíferos. En concreto, los carcinomas de pulmón, de próstata, de mama, de colon, de páncreas y de ovario representan las mayores causas de mortalidad por cáncer. Estos y casi la totalidad del resto de los carcinomas comparten su característica letal común. Con muy pocas excepciones, la metástasis a partir de un carcinoma es fatal. Además, incluso para aquellos pacientes con cáncer que sobreviven inicialmente a sus cánceres primarios, la experiencia común ha demostrado que sus vidas se ven alteradas de manera espectacular. Muchos pacientes de cáncer experimentan una gran ansiedad debida a su preocupación por sufrir una posible reaparición o un fallo del tratamiento. Muchos pacientes de cáncer experimentan debilidad física después del tratamiento.

En general, el problema fundamental en el tratamiento de los cánceres más letales es la falta de terapias sistémicas eficaces y no tóxicas. La Medicina Molecular, que todavía está en pañales, promete redefinir los modos en los que estos cánceres están siendo tratados. Sin lugar a dudas, existe un esfuerzo intensivo a nivel mundial dirigido al desarrollo de nuevos enfoques moleculares para el diagnóstico y el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, hay un gran interés por identificar los genes y las proteínas verdaderamente específicos de tumores que podrían ser usados como marcadores de diagnóstico y pronóstico y/o dianas o agentes terapéuticos. Los esfuerzos de investigación en estos campos se están intensificando, y la creciente disponibilidad de las tecnologías moleculares útiles ha acelerado la adquisición de un conocimiento significativo acerca del cáncer. No obstante, el progreso es lento y, en general, desigual.

Recientemente, ha surgido un interés particularmente fuerte por identificar antígenos específicos de tumores de la superficie celular que podrían ser útiles como dianas para diversas estrategias de tratamiento inmunoterapéutico o de moléculas pequeñas. Se ha publicado un gran número de tales antígenos de la superficie celular, y algunos, según fuentes fidedignas, han demostrado estar asociados con uno o más cánceres. Se ha prestado mucha atención al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a estos antígenos. Sin embargo, se han obtenido pocos tratamientos inmunológicos oncológicos verdaderamente eficaces.

El uso de anticuerpos monoclonales frente a antígenos específicos de tumores o sobre-expresados en el tratamiento de cánceres sólidos es instructivo. Aunque la terapia con anticuerpos ha sido bien investigada durante unos 20 años, sólo muy recientemente, se ha materializado en los correspondientes compuestos farmacéuticos. Un ejemplo es el anticuerpo monoclonal anti-HER2/neu humanizado, la Herceptina, recientemente autorizada para su uso en el tratamiento de los cánceres de mama metastásicos que sobre-expresan el receptor HER2/neu. Otro es el anticuerpo anti-CD20/linfoma de células B quimérico humano/de ratón, Rituxan, autorizado para el tratamiento del linfoma de no Hodgkin. Se están evaluando otros varios anticuerpos para el tratamiento del cáncer en pruebas clínicas o en investigación pre-clínica, incluyendo un anticuerpo monoclonal IgC2 completamente humano específico del receptor del factor de crecimiento epidérmico (Yang et al., 1999, Cancer Res. 59: 1236). Es evidente que la terapia con anticuerpos está finalmente emergiendo de una larga fase embrionaria. No obstante, todavía existe una necesidad enorme por nuevos antígenos tumorales más específicos para la aplicación de terapias con anticuerpos y otras terapias biológicas. Además, existe la correspondiente necesidad por antígenos tumorales que puedan ser útiles como marcadores para los procedimientos de diagnóstico y formación de imágenes basados en anticuerpos, que es de esperar que conducirán al desarrollo más temprano de diagnósticos y a una mayor precisión en los pronósticos.

Según lo tratado más adelante, el tratamiento del cáncer de próstata sirve como un buen ejemplo del limitado alcance en el que se ha traducido la Biología Molecular en el progreso real del campo clínico. Con limitadas excepciones, la situación es más o menos la misma para el resto de carcinomas principales mencionados anteriormente.

En todo el mundo, el cáncer de próstata es el cuarto cáncer más frecuente en hombres. En América del Norte y Europa del Norte, es, con mucho, el cáncer más común en varones, siendo la segunda causa principal de mortalidad por cáncer en hombres. Sólo en Estados Unidos, bastante más de 40.000 hombres mueren anualmente por esta enfermedad, estando sólo detrás del cáncer de pulmón. A pesar de la magnitud de estas cifras, todavía no existe un tratamiento eficaz del cáncer de próstata metastásico. La prostatectomía quirúrgica, la terapia por radiación, la terapia hormonal de ablación y la quimioterapia continúan siendo las principales modalidades de tratamiento. Desafortunadamente, en muchos casos, estos tratamientos son claramente ineficaces. Además, estos tratamientos a menudo están asociados con consecuencias significativamente no deseables.

En el ámbito del diagnóstico, el análisis del PSA en suero ha sido una herramienta muy útil. No obstante, la especificidad y la utilidad general del PSA son ampliamente consideradas como deficientes en varios aspectos. No se ha demostrado la capacidad del análisis del PSA, ni de ningún otro análisis ni marcador biológico, para identificar fiablemente la enfermedad en un estadio temprano. De manera similar, no hay un marcador disponible para predecir la aparición de la fase metastásica comúnmente fatal de la enfermedad. El diagnóstico del cáncer de próstata metastásico se realiza mediante linfadenectomía pélvica laparoscópica o quirúrgica abierta, escáner con radionúclidos de todo el cuerpo, radiografía esquelética y/o análisis de biopsias de lesiones óseas. Es evidente que mejores procedimientos de diagnóstico de formación de imágenes y otros menos invasivos ofrecen la promesa de acabar con las dificultades que estos procedimientos suponen para el paciente, así como mejorar las opciones terapéuticas. Sin embargo, hasta que haya marcadores de los tumores de próstata capaces de identificar fiablemente la enfermedad en un estadio temprano, de predecir la susceptibilidad a la metástasis y de generar imágenes precisas de los tumores, el tratamiento del cáncer de próstata continuará siendo sumamente difícil. Por consiguiente, existe una enorme necesidad por marcadores tumorales moleculares más específicos en el tratamiento del cáncer de próstata.

Existen algunos marcadores conocidos que son expresados predominantemente en la próstata, tales como el antígeno de membrana específico de la próstata (PSM), una hidrolasa con una identidad del 85% con una neuropeptidasa de rata (Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 749: Bzdega et al., 1997; J. Neurochem. 69: 2270). Sin embargo, la expresión del PSM en el intestino delgado y en el cerebro (Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54: 1807), así como su posible papel en el catabolismo de neuropéptidos en el cerebro, genera preocupación por su posible neurotoxicidad con terapias anti-PSM. Los resultados preliminares obtenidos con el uso de un anticuerpo monoclonal anti-PSM marcado con indio-111 para generar imágenes del cáncer de próstata recurrente son algo prometedores (Sodee et al., 1996, clin Nuc Med 21: 759-766). Los marcadores de cáncer de próstata más recientemente identificados incluyen PCTA-1 (Su et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 7252) y el antígeno de células madre de próstata (PSCA) (Reiter et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sd. EE.UU. 95:1735). El PCTA-1, una galectina nueva, es en buena parte secretado en el medio de expresión celular y puede ser prometedor como un marcador de diagnóstico en suero del cáncer de próstata (Su et al., 1996). El PSCA, una molécula de la superficie celular unida a GPI, fue formado a partir de ADNc de LAPC-4 y es único en tanto en cuanto es expresado fundamentalmente en células básales de tejido de próstata normal y en epitelios cancerosos (Reiter et al., 1998). También se está investigando activamente en la elaboración de vacunas para el cáncer de próstata con una variedad de antígenos, incluyendo el PSM y el PSA.

Descripción de la invención

La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere a un antígeno transmembranal en serpentina de la superficie celular. La proteína es expresada exclusiva o predominantemente en la próstata, así como en el cáncer de próstata, y por tanto, ha sido denominada "STEAP"-1 ( Six Transmembrane Epithelial Antigen of the Prostate-1).

STEAP-1 parece ser una proteína de membrana de tipo IIIa que se expresa predominantemente en células de próstata en tejidos humanos normales. Estructuralmente, la STEAP-1 es una proteína con 339 aminoácidos caracterizada por tener una topología molecular de seis dominios transmembrana y terminales N y C intracelulares, lo que sugiere que se pliega de una manera "en serpentina" en tres bucles extracelulares y dos bucles intracelulares. La expresión de la proteína STEAP-1 se mantiene a niveles elevados a través de los diversos estadios del cáncer de próstata. Además, la STEAP-1 está muy sobre-expresada en otros ciertos cánceres humanos. En concreto, se ha confirmado definitivamente la expresión en la superficie celular de STEAP-1 en una variedad de células de próstata y cancerosas de próstata, células cancerosas de vejiga y células cancerosas de colon. Estas características indican que la STEAP-1 es un antígeno tumoral de la superficie celular específico expresado a niveles elevados en los cánceres de próstata, vejiga, colon y otros cánceres.

La presente revelación proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte del gen de, ARNm de y/o secuencia que codifica la STEAP-1, preferiblemente, en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican la proteína STEAP-1 y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios al gen de o a la secuencia de ARNm de STEAP-1, o a partes de la misma, y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan con el gen STEAP-1, ARNm o con polinucleótidos que codifican la STEAP-1. También se proporcionan procedimientos para aislar los ADNc y los genes que codifican STEAP-1. También se proporcionan moléculas de ADN recombinante que contienen polinucleótidos STEAP-1, células transformadas o transducidas con tales moléculas y sistemas de vectores huésped para la expresión del producto génico STEAP-1. La revelación proporciona además la proteína-1 STEAP-1 y fragmentos polipeptídicos de la misma. La revelación proporciona además anticuerpos que se unen con la proteína STEAP-1 y con fragmentos polipeptídicos de la misma, incluyendo anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos murinos y de otros mamíferos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y completamente humanos, y anticuerpos marcados con un marcador detectable, así como anticuerpos conjugados con radionúclidos, toxinas u otras composiciones terapéuticas. La revelación proporciona además procedimientos para detectar la presencia de polinucleótidos y proteínas STEAP-1 en diversas muestras biológicas, así como procedimientos para identificar células que expresen STEAP-1. La revelación proporciona además diversas composiciones terapéuticas y estrategias para tratar el cáncer de próstata, incluyendo particularmente, la terapia con anticuerpos, vacunas y moléculas pequeñas.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: Estructura de STEAP-1. 1A: Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas del ADNc del clon 10 (8P1 B4) de STEAP-1 (SEC ID N.º 1 y 2, respectivamente). La metionina inicial se indica en negrita en la posición del residuo de aminoácido 1, y se indican seis dominios transmembrana putativos en negrita y subrayados. 1B: representación esquemática de la orientación transmembranal de STEAP-1. Los residuos de aminoácido que limitan los dominios extracelulares predichos se indican y corresponden al esquema de numeración de la Fig. 1A. 1C: La secuencia no codificante 5' rica en G/C del gen STEAP-1 está determinada por las secuencias solapantes del clon 10 y del clon 3.

Fig. 2: Expresión predominante de STEAP-1 en el tejido de próstata. El ADNc de la primera cadena se preparó a partir de 16 tejidos normales, los xenoinjertos LAPC (4AD, 4AI y 9AD) y células HeLa. La normalización se realizó mediante PCR usando cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, realizada usando cebadores derivados de ADNc (8P1D4) de STEAP-1 (Fig. 1A), muestran la expresión predominante de STEAP-1 en próstata normal y los xenoinjertos LAPC. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar STEAP-1:

8P1 04.1 5'	ACTTTGTTGATGACCAGGATTGGA 3'	(SEC ID N.º 4)
8P1 D4.2 5'	CAGAACTTCAGCACACACAGGAAC 3'	(SEC ID N.º 5)

Fig. 3: Análisis de transferencia Northern de la expresión de STEAP-1 en diversos tejidos humanos normales y xenoinjertos de cáncer de próstata, que muestran una expresión predominante de STEAP-1 en tejido de próstata. Fig. 3A: Se sondaron dos transferencias Northern de múltiples tejidos (Clontech) con un clon 10 de ADNc de STEAP de longitud completa (Fig. 1A; SEC ID N.º 1). En el lateral, se indican los patrones de peso en kilobases (kb). Cada carril contiene 2 \mug de ARNm que fue normalizado usando una sonda de \beta-actina. Fig. 3B: Se sondaron transferencias de puntos de ARN de múltiples tejidos (Clontech, Cátalogo de transferencia maestro humano n.º 7770-1) con un clon 10 de ADNc de STEAP-1 (Fig. 1A; SEC ID N.º 1), mostrando una expresión aproximadamente cinco veces mayor en el tejido de próstata en comparación con otros tejidos con una expresión detectable significativa.

Fig. 4: Secuencia de nucleótidos del clon GTH9 de STEAP-1 (SEC ID N.º 6) correspondiente a un mensaje de 4 kb sobre las transferencias Northern (Fig. 3A). La secuencia contiene un intrón de 2399 pares de bases en comparación con la secuencia del clon 10 de STEAP-1 de la Fig. 1A; las regiones codificantes son los nucleótidos 96-857 y 3257-3510 (indicados en negrita). El ATG inicial está en negrita y subrayado, el codón de terminación está en negrita y subrayado, y los límites intrón-exón están subrayados.

Fig. 5: Expresión de STEAP-1 en múltiples líneas celulares de cáncer de próstata y múltiples cánceres, y en xenoinjertos de cáncer de próstata. Se prepararon los filtros para los xenoinjertos y las líneas celulares con 10 \mug de ARN total por carril. Se analizaron las transferencias usando el clon 10 de STEAP-1 como sonda. Todas las muestras de ARN fueron normalizadas mediante tinción con bromuro de etidio y el posterior análisis con una sonda de \beta-actina. Fig. 5A: Expresión en diversas líneas celulares cancerosas y en xenoinjertos de próstata. Los carriles son los siguientes: (1) células PrEC, (2) tejido de próstata normal, (3) xenoinjerto LAPC-4 AD, (4) xenoinjerto LAPC-4 Al , (5) xenoinjerto LAPC-9 AD, (6) xenoinjerto LAPC-9 Al, (7) células LNCaP, (8) células PC-3, (9) células DU145, (10) células PANC-1, (11) células BxPC-3, (12) células HPAC, (13) células Capan-1, (14) células CACO-2, (15) células LOVO, (16) células T84, (17) células COLO-205, (18) células KCL-22(leucemia linfocítica aguda, LLA), (19) células HT1197, (20) células SCABER, (21) células UM-UC-3, (22) células TCCSUP, (23) células J82, (24) células 5637, (25) células RD-ES (Sarcoma de Ewing, SEW), (26) células CAMA-1, (27) células DU4475, (28) células MCF-7, (29) células MOA-MB-435s, (30) células NTERA-2, (31) células NCCIT, (32) células TERA-1, (33) células TERA-2, (34) células A431, (35) células HeLa, (36) células OV-1063, (37) células PA-1, (38) células SW 626, (39) células CAOV-3. Fig. 5B: La expresión de STEAP-1 en xenoinjertos LAPC desarrollados subcutáneamente (sc) en comparación con la expresión en xenoinjertos LAPC-4 y LAPC-9 desarrollados en la tibia (it) de ratones.

Fig. 6: Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína STEAP-1 en tejidos y múltiples líneas celulares. Se sondaron las transferencias Western de los lisados celulares preparados a partir de xenoinjertos de cáncer de próstata y líneas celulares con una preparación de anticuerpos anti-STEAP-1 policlonales (para más información, véase el ejemplo XX). Las muestras contienen 20 \mug de proteína y fueron normalizadas con un sondeo anti-Grb-2 de transferencias Western.

Fig. 7: Biotinilación de STEAP-1 en la superficie celular. Fig. 7A: Biotinilación de células 293T en la superficie celular transfectadas sólo con vector o con vector que contiene ADNc que codifica STEAP-1 marcada con 6His. Se inmunoprecipitaron los lisados celulares con anticuerpos específicos, se transfirieron a una membrana y se sondaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Los carriles 1-4 y 6 se corresponden con inmunoprecipitados de lisados preparados a partir de células 293T que expresan STEAP-1. Los carriles 5 y 7 son inmunoprecipitados de células transfectadas con vectores. Las inmunoprecipitaciones se realizaron usando los siguientes anticuerpos: (1) no inmune de oveja, (2) anti-antígeno T grande, (3) anti-CD71 (receptor de transferrina), (4) anti-His, (5) anti-His, (6) anti-STEAP-1, (7) anti-STEAP-1. Fig. 7B: las líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP, PC-3, DU145), de cáncer de vejiga (UM-UC-3, TCCSUP) y de cáncer de colon (LOVO, COLO) bien fueron biotiniladas (+) o no (-) antes de la lisis. Se sondaron transferencias Western de proteínas purificadas sobre gel de estreptavidina con anticuerpos anti-STEAP-1. Los marcadores del peso molecular se indican en kilodaltons (kD).

Fig. 8: Análisis inmunohistoquímico de la expresión de STEAP-1 usando anticuerpo policlonal anti-STEAP-1. Los tejidos fueron fijados en formalina al 10% e introducidos en parafina. Se tiñeron las secciones titulares usando anticuerpos policlonales anti-STEAP-1 dirigidos frente al péptido N-terminal. Las muestras incluyen: (a) células LNCaP sondadas en presencia de péptido STEAP-1 N-terminal 1, (b) LNCaP más péptido inespecífico 2, (c) tejido de próstata normal, (d) carcinoma de próstata de grado 3, (e) carcinoma de próstata de grado 4, (f) xenoinjerto LAPC-9 AD, (g) vejiga normal, (h) colon normal. Todas las imágenes están amplificadas x 400.

Fig. 9: Secuencias parciales de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de ADNc del clon GTA3 de STEAP-2 (98P4B6) (SEC ID N.º 7 y 8). La secuencia del extremo 5' de este clon contiene un ORF de 173 aminoácidos.

Fig. 10: Secuencias de nucleótidos de más miembros de la familia STEAP identificados mediante la búsqueda en la base de datos dbest con la secuencia proteica de STEAP-1. Además de STEAP-1, se indican otros tres miembros de la familia STEAP con sus números de acceso del GenBank. Uno de estos corresponde al gen 98P4B6 que fue identificado mediante SSH.

Fig. 11: Comparación estructural primaria de las proteínas de la familia STEAP. Fig. 11A: Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de STEAP-1 (clon 10 de 8P1D4) y STEAP-2 (98P4B6). Se realizó el alineamiento usando el programa de alineamiento SIM de la página web de Baylor College of Medicine Search Launcher. Los resultados muestran una identidad del 61,4% en un solapamiento de 171 aminoácidos; Puntuación: 576,0; frecuencia de huecos: 0,0%. Fig. 11B. El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de STEAP-1 con las secuencias ORF parciales de STEAP-2 y otras dos proteínas miembros de la familia putativa usando el programa PIMA (programa PIMA 1.4 en la dirección de Internet <http:\\dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331\multi-align\multi-align.html>);
los dominios transmembrana identificados por el programa SOSUI (disponible en la dirección de Internet
<http:\\www.tuat.ac.jp\\simmitaku\adv_sosui\submit.html>)están en negrita.

Fig. 12: Expresión predominante de Al139607 en placenta y próstata. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de 16 tejidos normales. La normalización se realizó mediante PCR usando cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, realizada usando cebadores para Al139607, muestra la expresión predominante de Al139607 en placenta y en próstata tras 25 ciclos de amplificación. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar Al139607:

Al139607.1	5' TTAGGACAACTTGATCACCAGCA 3'	(SEC ID N.º 13)
Al139607.2	5'TGTCCAGTCCAAACTGGGTTATTT3'	(SEC ID N.º 14)

Fig. 13: Expresión predominante de R80991 en hígado. Se preparó ADNc de la primera cadena a partir de 16 tejidos normales. La normalización se realizó mediante PCR usando cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, realizada usando cebadores para R80991, muestra la expresión predominante de R80991 en hígado tras 25 ciclos de amplificación. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar R80991:

R80991.1	5' AGGGAGTTCAGCTTCGTTCAGTC 3'	(SEC ID N.º 15)
R80991.2	5' GGTAGAACTTGTAGCGGCTCTCCT 3'	(SEC ID N.º 16)

Fig. 14: Expresión predominante de STEAP-2 (98P4B6) en tejido de próstata. El ADNc de la primera cadena se preparó a partir de 8 tejidos normales, los xenoinjertos LAPC (4AD, 4AI y 9AD) y células HeLa. La normalización se realizó mediante PCR usando cebadores para la actina y GAPDH. La PCR semi-cuantitativa, realizada usando cebadores para 98P486, muestra la expresión predominante de 98P4B6 en próstata normal y los xenoinjertos LAPC. Se usaron los siguientes cebadores para amplificar STEAP-II:

98P4B6.1	5'GACTGAGCTGGAACTGGAATTTGT 3'	(SEC ID N.º 17)
98P4B6.2	5'TTTGAGGAGACTTCATCTCACTGG 3'	(SEC ID N.º 18)

Fig. 15: Expresión inferior del gen STEAP-2/98P4B6 específico de la próstata en xenoinjertos de cáncer de próstata determinada mediante análisis de transferencia Northern. Se obtuvieron filtros de tejido normal humano (A y B) en Clontech y contienen 2 \mug de ARNm por carril. Se preparó el filtro para los xenoinjertos (C) con 10 \mug de ARN total por carril. Se analizaron las transferencias usando el clon 98P4B6 derivado de SSH como sonda. Todas las muestras de ARN fueron normalizadas mediante tinción con bromuro de etidio.

Fig. 16: Expresión de STEAP-2 en próstata y selección de líneas celulares de cáncer según lo determinado mediante análisis de transferencia Northern. Se prepararon los filtros para los xenoinjertos y las líneas celulares con 10 \mug de ARN total por carril. Se analizaron las transferencias usando un clon 98P4B6 derivado de SSH como sonda. Todas las muestras de ARN fueron normalizadas mediante tinción con bromuro de etidio.

Fig. 17: Localización cromosómica de los miembros de la familia STEAP. Las localizaciones cromosómicas de los genes STEAP descritos en la presente memoria fueron determinadas usando el grupo de híbridos de radiación GeneBridge4 (Research Genetics, Huntsville AI). El mapeado para STEAP-2 y Al139607 fue realizado usando el grupo de híbridos de radiación G3 de Stanford (Research Genetics, Huntsville AI).

Fig. 18: Representación esquemática de los límites intrón-exón del ORF del gen STEAP-1 humano. Se identificó un total de 3 intrones (I) y 4 exones (e).

Fig. 19: Análisis de transferencia Southern Zooblot del gen STEAP-1 en diversas especies. Se preparó ADN genómico de varios organismos diferentes, incluyendo humanos, de mono, de perro, de ratón, de pollo y Drosophila. Se digirieron diez microgramos de cada muestra de ADN con EcoRI, se transfirieron sobre nitrocelulosa y se sondaron con una sonda de STEAP-1. Los patrones de tamaño se indican en el lateral en kilobases (kb).

Fig. 20: Análisis de transferencia Southern de BAC de ratón con una sonda de STEAP-1. Se preparó ADN de células humanas para aislar ADN genómico y de un clon de BAC de ratón (12P11) que contiene el gen STEAP de ratón. Cada muestra de ADN fue digerida con EcoRI, transferida sobre nitrocelulosa y sondada. Se compararon ocho microgramos de ADN genómico con 250 ng de ADN de BAC de ratón.

Descripción detallada de la invención

A no ser que se defina lo contrario, todos los términos de la técnica, anotaciones y otra terminología científica usada en la presente memoria pretenden tener los significados comúnmente entendidos por aquéllos expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. En algunos casos, los términos que tienen significados comúnmente entendidos se definen en la presente memoria para aclarar y/o facilitar su consulta, y no debería entenderse necesariamente que la inclusión de tales definiciones en la presente memoria represente una diferencia sustancial frente a lo que se entiende en general en la técnica. Las técnicas y los procedimientos descritos o a los que se hace referencia en la presente memoria, en general, se comprenden bien y se emplean comúnmente mediante el uso de metodología convencional por parte de los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" II edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Según lo apropiado, los procedimientos que implican el uso de equipos y reactivos comercialmente disponibles se llevan a cabo generalmente según los protocolos y/o parámetros definidos por el fabricante, a no ser que se indique lo contrario.

Como se usan en la presente memoria, los términos "cáncer de próstata avanzado", "cáncer de próstata avanzado localmente", "enfermedad avanzada" y "enfermedad avanzada localmente" significan cánceres de próstata que se han extendido a través de la cápsula de la próstata, y pretenden incluir la enfermedad en estadio C en virtud del sistema de la Asociación Urológica Estadounidense (AUA), la enfermedad en estadio C1-C2 en virtud del sistema de Whitmore-Jewett y la enfermedad en estadio T3-T4 y N+ según el sistema TNM (tumor, nodo, metástasis). En general, la cirugía no está recomendada para los pacientes con enfermedad avanzada localmente, y estos pacientes tienen resultados favorables sustancialmente menores en comparación con los pacientes que tienen cáncer de próstata localizado clínicamente (confinado en un órgano). La enfermedad localmente avanzada se identifica clínicamente mediante pruebas palpables de induración más allá del límite lateral de la próstata, o de asimetría o induración sobre la base de la próstata. El cáncer de próstata localmente avanzado se diagnostica en la actualidad patológicamente tras una prostactectomía radical si el tumor invade o penetra en la cápsula prostática, se extiendo en el interior del margen quirúrgico o invade las vesículas seminales.

Como se usan en la presente memoria, los términos "cáncer de próstata metastásico" y "enfermedad metastásica" significan los cánceres de próstata que se han extendido hasta los nódulos linfáticos regionales o hasta puntos distantes, y pretenden incluir la enfermedad en estadio D según el sistema AUA y en estadio TxNxM+ según el sistema TNM. Como sucede en el caso del cáncer de próstata localmente avanzado, la cirugía no está generalmente indicada para pacientes con la enfermedad metastásica, siendo la terapia hormonal (ablación andrógena) la modalidad preferida de tratamiento. Los pacientes con cáncer de próstata metastásico finalmente desarrollan un estado refractario a los andrógenos a los 12 a 18 meses del inicio del tratamiento, y aproximadamente la mitad de estos pacientes mueren a los 6 meses. La zona más común para la metástasis del cáncer de próstata es el hueso. Las metástasis de hueso del cáncer de próstata son, a fin de cuentas, característicamente osteoblásticas más que osteolíticas (es decir, que resultan en la formación neta de hueso). Las metástasis óseas se encuentran más frecuentemente en la espina, seguida por el fémur, la pelvis, las costillas, el cráneo y el húmero. Otras zonas comunes para la metástasis incluyen los nódulos linfáticos, los pulmones, el hígado y el cerebro. El cáncer de próstata metastásico se diagnostica comúnmente mediante linfadenectomía pélvica laparoscópica o abierta, escáner con radionúclidos de todo el cuerpo, radiografía esquelética y/o biopsia de la lesión ósea.

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Como se usa en la presente memoria, el término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases o pares de bases de longitud, bien ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, y pretende incluir formas mono- y bicatenarias de ADN.

Como se usa en la presente memoria, el término "polipéptido" significa un polímero de al menos 10 aminoácidos. A lo largo de la memoria, se usan las denominaciones estándar de tres letras o de una sola letra para los aminoácidos.

Como se usan en la presente memoria, los términos "hibridarse", "hibridación", "se hibrida" y similares, usados en el contexto de los polinucleótido, pretenden referirse a las condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente, tales como la hibridación en formamida al 50%/6 x SSC/SDS al 0,1%/100 \mug/ml de ADNmc, en las que las temperaturas para la hibridación son superiores a 37 grados C y las temperaturas para el lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1% están por encima de 55 grados C, y lo más preferible, es que sean condiciones de hibridación rigurosas.

En el contexto de las comparaciones entre las secuencias de aminoácidos, el término "identidad" se usa para expresar el porcentaje de residuos de aminoácido en la misma posición relativa que son iguales.

También en este contexto, el término "homología" se usa para expresar el porcentaje de los residuos de aminoácido en las mismas posiciones relativas que son bien idénticos o similares, usando los criterios de los aminoácidos conservados del análisis BLAST, como se entiende generalmente en la técnica. Más adelante, se proporciona más información acerca de las sustituciones de aminoácidos que son consideradas conservadoras según tales criterios.

A lo largo de esta memoria, se entenderá que la palabra "comprenden", o las variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implican la inclusión de un elemento, un número entero o una etapa establecidos, o un grupo de elementos, de números enteros o de etapas establecido, pero sin la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.

Cualquier descripción de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que haya sido incluida en la presente memoria es únicamente a efectos de proporcionar un contexto para la presente invención. No se supondrá que alguna o la totalidad de estas cuestiones forman parte de la base de la técnica anterior o pertenecen al conocimiento general común del campo relevante para la presente invención, pues existían antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

A lo largo de los sub-apartados que figuran a continuación, se proporcionan más definiciones.

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Características moleculares y bioquímicas de STEAP-1

La invención se refiere a una nueva proteína denominada STEAP-1. Como se describe más detalladamente en los ejemplos que figuran a continuación, STEAP-1 ha sido caracterizada en una variedad de modos. Por ejemplo, se realizaron análisis de secuencias de aminoácido y que codifican nucleótidos. Se llevaron a cabo análisis de RT-PCR extensiva y de transferencia Northern de la expresión del ARNm de STEAP-1 para establecer la selección de tejidos normales y cancerosos que expresan el mensaje de STEAP-1. Se realizaron análisis de transferencia Western, inmunohistoquímicos y de citometría de flujo de la expresión de la proteína STEAP-1 para determinar los perfiles de expresión de la proteína, la localización en la superficie celular y la topología molecular gruesa de STEAP-1.

STEAP-1 es una proteína de la superficie celular de seis transmembranas de 339 aminoácidos con una homología no identificable con ninguna proteína humana conocida. La figura 1A muestra las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidos de STEAP-1 humana. En la Fig. 1B, se muestra un esquema topológico grueso de la proteína STEAP-1 integrada en la membrana celular. La expresión de STEAP-1 es predominantemente específica de la próstata en tejidos normales. Específicamente, al análisis extensivo del ARNm de STEAP-1 y la expresión de la proteína en tejidos humanos normales muestra que la proteína STEAP-1 se expresa predominantemente en la próstata y, a un grado mucho menor, en la vejiga. El ARNm de STEAP-1 también es relativamente específico de la próstata, detectándose sólo un nivel de expresión muy bajo en unos otros cuantos tejidos normales. En el cáncer, el ARNm de STEAP-1 y la proteína se expresa constantemente a niveles elevados en el cáncer de próstata y durante todos los estadios de la enfermedad. STEAP-1 también se expresa en otros cánceres. Específicamente, el ARNm de STEAP-1 se expresa a niveles muy altos en el cáncer de vejiga, de colon, pancreático y de ovario (así como en otros cánceres). Además, la expresión en la superficie celular de la proteína STEAP-1 se ha establecido en cánceres de próstata, vejiga y colon. Por lo tanto, STEAP-1 tiene todas las características distintivas de una excelente diana terapéutica para el tratamiento de ciertos cánceres, incluyendo particularmente los carcinomas de próstata, de colon y de vejiga.

STEAP-1 se mapea hasta el cromosoma 7 humano. Lo interesante es que STEAP-1 se mapea en 7p22 (7p22.3), una gran región de ganancia alélica publicada tanto para los cánceres de próstata primarios como para los recurrentes (Visakorpi et al., 1995 Cancer Res. 55: 342, Nupponen et al., 1998 American J. Pathol. 153: 141), lo que sugiere que la sobre-regulación de STEAP-1 en el cáncer podría incluir mecanismos genómicos.

Se desconoce la función de STEAP-1. Otras moléculas de la superficie celular que contienen seis dominios transmembrana incluyen canales iónicos (Dolly y Parcej, 1996 J Bioenerg Biomembr 28:231) y canales de agua o acuaporinas (Reizer et al., 1993 Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 28:235). Los estudios estructurales muestran que ambos tipos de moléculas se ensamblan en complejos tetraméricos para formar canales funcionales (Christie. 1995, Clin Exp Pharmacol Physiol 22:944, Walz et al., 1997 Nature 387:624, Cheng et al., 1997 Nature 387:627). La tinción inmunohistoquímico de STEAP-1 en la glándula de la próstata parece estar concentrada en los límites de célula-célula, detectándose una menor tinción en el lado luminal. Esto puede sugerir un papel para la STEAP-1 en las uniones estrechas, las uniones con huecos o la adhesión celular. Para analizar estas posibilidades, se pueden analizar xenopus oocytes (u otras células) que expresen STEAP usando experimentos con pinzas de voltaje o pinzas de placa para determinar si la STEAP funciona como un canal iónico. También se puede medir el volumen de las células de Oocyte para determinar si STEAP presenta propiedades de canal de agua. Si las STEAP funcionan como proteínas canal o de unión de huecos, pueden servir como excelentes dianas para la inhibición usando, por ejemplo, anticuerpos, moléculas pequeñas y polinucleótidos capaces de inhibir la expresión o la función. El patrón de expresión restringido a tejido normal y los niveles elevados de expresión en tejido canceroso sugieren que la interferencia con la función de las STEAP puede matar selectivamente células cancerosas.

Como el gen STEAP-1 se expresa predominantemente en tejido epitelial, parece posible que la proteína funcione como un canal iónico o una proteína de unión de huecos en la función de las células epiteliales. Los canales iónicos han estado implicados en la proliferación y la invasión de las células cancerosas de próstata (Lalani et al., 1997, Cancer Metastasis Rev 16:29). Las células cancerosas de próstata tanto humanas como de rata contienen sub-poblaciones de células con niveles de expresión más altos y más bajos de los canales del sodio. Los niveles más altos de expresión de los canales del sodio se correlacionan con una invasión más agresiva in vitro (Smith et al., 1998. FEBS Lett. 423:19). De manera similar, se ha demostrado que un bloqueo específico de los canales del sodio inhibe la invasión de células PC-3 in vitro (Laniado et al., 1997, Am. J. Pathol. 150:1213), mientras que la inhibición específica de los canales del potasio en células LNCaP inhibió la proliferación celular (Skryma et al., 1997, Prostate 33:112). Estos informes sugieren un papel para los canales iónicos en el cáncer de próstata y también demuestran que las moléculas pequeñas que inhiben la función de los canales iónicos pueden interferir en la proliferación del cáncer de próstata.

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Polinucleótidos STEAP

Un aspecto de la invención proporciona polinucleótidos correspondientes o complementarios a todo o parte del gen, del ARNm de y/o de la secuencia que codifica STEAP-1, preferiblemente, en forma aislada, incluyendo polinucleótidos que codifican la proteína STEAP-1 y fragmentos de la misma, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN, y moléculas relacionadas, polinucleótidos u oligonucleótidos complementarios al gen o a la secuencia de ARNm de STEAP-1, o a partes de la misma, y polinucleótidos u oligonucleótidos que se hibridan con el gen, con el ARNm de o con un polinucleótido que codifica STEAP-1 (colectivamente, "polinucleótidos STEAP-1"). Como se usan en la presente memoria, los genes y las proteínas STEAP pretenden incluir los genes y las proteínas STEAP-1, y los genes y las proteínas correspondientes a variantes estructuralmente similares de los anteriores. Tales otras proteínas y variantes de STEAP, generalmente, tendrán secuencias codificantes que serán muy homólogas a las secuencias que codifican STEAP-1.

Un polinucleótido STEAP-1 puede comprender un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos de la STEAP-1 humana según lo mostrado en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1), una secuencia complementaria a la anterior o un fragmento de polinucleótido de la anterior. Otra realización comprende un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína STEAP-1 humana según lo mostrado en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), una secuencia complementaria a la anterior o un fragmento de polinucleótido de la anterior. Otra realización comprende un polinucleótido que es capaz de hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas con el ADNc de la STEAP-1 humana mostrado en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1) o con un fragmento de polinucleótido del anterior.

Se contemplan específicamente ADN genómico, ADNc, ribozimas y moléculas antisentido, así como moléculas de ácido nucleico basadas en una estructura alternativa o que incluyen bases alternativas, bien derivadas de fuentes naturales o sintetizadas. Por ejemplo, las moléculas antisentido pueden ser ARN u otras moléculas, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (ANP) o moléculas de no ácido nucleico, tales como derivados de fosforotioato, que se unan específicamente con ADN o ARN de un modo dependiente del par de bases. El experto en la técnica puede obtener fácilmente estas clases de moléculas de ácido nucleico usando el polinucleótido STEAP-1 y las secuencias de polinucleótidos reveladas en la presente memoria.

Otras realizaciones específicas de este aspecto de la presente revelación incluyen cebadores y parejas de cebadores que permiten la amplificación específica de los polinucleótidos de la invención o de cualquier parte específica de los mismos, y sondas que se hibridan selectiva o específicamente con las moléculas de ácido nucleico de la invención o con cualquier parte de las mismas. Las sondas pueden estar marcadas con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima. Tales sondas y cebadores se pueden usar para detectar la presencia de un polinucleótido STEAP-1 en una muestra y como procedimientos para detectar una célula que exprese una proteína STEAP-1. Los ejemplos de tales sondas incluyen polinucleótidos que comprenden toda o parte de la secuencia de ADNc de la STEAP-1 humana mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1). Los ejemplos de las parejas de cebadores capaces de amplificar específicamente el ARNm de STEAP-1 también se describen en los ejemplos que figuran a continuación. Como será entendido por el experto en la técnica, se puede preparar un gran número de cebadores y sondas diferentes en base a las secuencias proporcionadas en la presente memoria y usarlos para amplificar eficazmente y/o detectar un ARNm de STEAP-1 o un ARNm que codifique STEAP-1.

Como se usa en la presente memoria, se dice que un polinucleótido está "aislado" cuando está sustancialmente separado de los polinucleótidos contaminantes que corresponden o son complementarios a genes distintos del gen de STEAP-1 o que codifican polipéptidos diferentes al producto génico STEAP-1 o a fragmentos del mismo. El experto en la técnica puede emplear fácilmente estos procedimientos de aislamiento de ácidos nucleicos para obtener un polinucleótido STEAP-1 aislado.

Los polinucleótidos STEAP-1 de la presente revelación son útiles para una variedad de objetivos, incluyendo, pero no limitándose a su uso como sondas y cebadores para la amplificación y/o la detección del gen STEAP-1, del ARNm de STEAP-1 o de fragmentos del mismo; como reactivos para el diagnóstico y/o el pronóstico del cáncer de próstata y otros cánceres; como secuencias codificantes capaces de dirigir la expresión de los polipéptidos STEAP-1; como herramientas para modular la inhibición de la expresión del gen STEAP-1 y/o la traducción del transcripto de STEAP-1; y como agentes terapéuticos.

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Procedimientos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican STEAP-1

Las secuencias de ADNc de STEAP-1 descritas en la presente memoria permiten el aislamiento de otros polinucleótidos que codifican el o los productos génicos, así como el aislamiento de polinucleótidos que codifican homólogos del producto génico STEAP, alternativamente, isoformas empalmadas, variantes alélicas y formas mutantes del producto génico STEAP. Se conocen diversos procedimientos de clonación molecular que pueden ser empleados para aislar ADNc de longitud completa que codifiquen un gen STEAP (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", II edición., Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1989; "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al., Eds., Wiley e hijos, 1995). Por ejemplo, se pueden emplear convenientemente metodologías de clonación en fagos Lambda, usando los sistemas de clonación comercialmente disponibles (por ejemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Se pueden identificar clones de fagos que contienen ADNc de genes STEAP sondando con un ADNc de STEAP marcado o con un fragmento del mismo. Por ejemplo, en una realización, se puede sintetizar el ADNc de STEAP-1 (Fig. 1A), o una parte del mismo, y usarlo como sonda para recuperar los ADNc de solapamiento y de longitud completa correspondientes a un gen STEAP. Se puede aislar un gen STEAP mediante la evaluación selectiva de bancos de ADN genómico, bancos de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), bancos de cromosomas artificiales de levadura (YAC) y similares, con sondas o cebadores de ADN de STEAP.

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Moléculas de ADN recombinante y sistemas de huésped-vector

la presente revelación también proporciona moléculas de ADN o ARN recombinante que contienen un polinucleótido STEAP-1, incluyendo, pero no limitándose a, fagos, plásmidos, fagémicos, cósmidos, YAC, BAC, así como diversos vectores virales y no virales conocidos en la técnica, y células transformadas o transfectadas con tales moléculas de ADN o ARN recombinante. Como se usa en la presente memoria, una molécula de ADN o ARN recombinante es una molécula de ADN o ARN que ha sido sometida a una manipulación molecular in vitro. Los procedimientos para generar tales moléculas son conocidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

La presente revelación proporciona además un sistema de huésped-vector que comprende una molécula de ADN recombinante que contiene un polinucleótido STEAP-1 dentro de una célula huésped procariota o eucariota adecuada. Los ejemplos de células huésped eucariotas adecuadas incluyen una célula de levadura, una célula vegetal o una célula animal, tal como una célula de mamífero o una célula de insecto (por ejemplo, una célula infectable por baculovirus, tal como una célula Sf9). Los ejemplos de células de mamífero adecuadas incluyen diversas líneas celulares de cáncer de próstata, tales como LNCaP, PC-3, DU145, LAPC-4, TsuPr1, otras líneas celulares de cáncer de próstata transfectables o transducibles, así como un número de células de mamífero usadas habitualmente para la expresión de proteínas recombinantes (por ejemplo, células COS, CHO, 293, 293T). Más concretamente, se puede usar un polinucleótido que comprende la secuencia que codifica STEAP-1 para generar una proteína STEAP-1 o fragmentos de la misma usando cualquier número de sistemas huésped-vector usados habitualmente y ampliamente conocidos en la técnica.

Hay una amplia selección de sistemas de huésped-vector adecuados para la expresión de la proteína STEAP-1 o fragmentos de la misma disponible, véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra; "Current Protocols in Molecular Biology", 1995, supra). Los vectores preferidos para la expresión en mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) y el vector retroviral pSR\alphatkneo (Muller et al., 1991, MC8 11:1785). Usando estos vectores de expresión, se puede expresar preferiblemente STEAP-1 en varias líneas celulares de cáncer de próstata y de no próstata, incluyendo, por ejemplo, 293, 283T, rat-1, 3T3, PC-3, LNCaP y TsuPr1. Los sistemas de huésped-vector de la invención son útiles para la producción de la proteína STEAP-1 o un fragmento de la misma. Tales sistemas de huésped-vector se pueden emplear para estudiar las propiedades funcionales de STEAP-1 y de las mutaciones de STEAP-1.

La proteína codificada por el gen de STEAP-1, o por fragmentos del mismo, tendrá una variedad de usos, incluyendo, pero no limitándose a, la generación de anticuerpos y en procedimientos para identificar ligandos y otros agentes y constituyentes celulares que se unan al producto génico STEAP-1. Los anticuerpos dirigidos frente a la proteína STEAP-1 o un fragmento de la misma pueden ser útiles en los análisis de diagnóstico y pronóstico, metodologías de generación de imágenes (incluyendo, particularmente, la formación de imágenes de cánceres) y procedimientos terapéuticos en el tratamiento de los cánceres humanos caracterizados por la expresión de la proteína STEAP-1, tales como el cáncer de próstata, de colon, de mama, carcinomas cervicales y de vejiga, cánceres de ovario, cánceres testiculares y cánceres pancreáticos. Se contemplan diversos análisis inmunológicos útiles para la detección de la proteína STEAP-1, incluyendo, pero no limitándose a, diversos tipos de radioinmunoanálisis, análisis de inmunoabsorción ligada a una enzima (ELISA), análisis de inmunofluorescencia ligada a una enzima (ELIFA), procedimientos inmunocitoquímicos y similares. Tales anticuerpos pueden ser marcados y usados como reactivos para la generación de imágenes inmunológicas capaces de detectar células de próstata (por ejemplo, en procedimientos de generación de imágenes radioescintigráficas). La proteína STEAP-1 también puede ser particularmente útil en la generación de vacunas contra el cáncer, tal y como se describe más adelante.

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Proteínas STEAP-1

Otro aspecto de la presente invención proporciona una variante de STEAP-1 y fragmentos polipeptídicos de la misma. Como se usa en la presente memoria, una proteína STEAP-1 se refiere a una proteína que tiene o incluye la secuencia de aminoácidos de la STEAP-1 humana según lo proporcionado en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), así como las variantes alélicas y los mutantes por sustituciones conservadoras de estas proteínas y fragmentos polipeptídicos de las mismas que tengan la actividad biológica de las STEAP.

La proteína STEAP-1 de la invención incluye aquella identificada específicamente en la presente memoria, así como las variantes alélicas, las variantes por sustituciones conservadoras y los homólogos que pueden ser aislados/generados y caracterizados sin la necesidad de una experimentación siguiendo los procedimientos señalados más adelante. Las proteínas de fusión que combinan partes de la proteína STEAP-1, o fragmentos de la misma, así como las proteínas de fusión de la proteína STEAP-1 y un polipéptido heterólogo también se incluyen. Tales proteínas STEAP-1 serán denominadas colectivamente proteínas STEAP-1, las proteínas de la invención o STEAP-1. Como se usa en la presente memoria, el término "polipéptido STEAP-1" se refiere a un fragmento de polipéptido o a una proteína STEAP-1 de al menos 10 aminoácidos, preferiblemente, de al menos 15 aminoácidos.

Una realización específica de una proteína STEAP-1 comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la STEAP-1 humana mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2).

En general, las variantes alélicas naturales de la STEAP-1 humana compartirán un grado elevado de identidad estructural y de homología (por ejemplo, un 90% o más de identidad). Comúnmente, las variantes alélicas de las proteínas STEAP-1 contendrán sustituciones de aminoácidos conservadoras dentro de la secuencia de STEAP-1 descrita en la presente memoria o contendrán una sustitución de un aminoácido de una posición correspondiente en un homólogo de STEAP-1. Una clase de variantes alélicas de STEAP-1 será la de las proteínas que comparten un grado elevado de homología con al menos una pequeña región de una determinada secuencia de aminoácidos de STEAP-1, pero contendrá además un alejamiento radical de la secuencia, tal como una sustitución no conservadora, un truncamiento, una inserción o un desplazamiento de marco. Tales alelos representan las proteínas STEAP-1 mutantes, que comúnmente no desempeñan las mismas funciones biológicas o no tienen todas las características biológicas.

Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se pueden hacer frecuentemente en una proteína sin alterar bien la configuración o la función de la proteína. Tales cambios incluyen la sustitución de cualquiera entre isoleucina (I), valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (O) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. También se pueden considerar otras sustituciones como conservadoras, en función del medio del aminoácido en particular y de su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser frecuentemente intercambiables, tal y como la alanina (A) y la valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba, puede ser frecuentemente intercambiada por leucina e isoleucina, y a veces, por valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en las ubicaciones en las que la característica significativa del residuo de aminoácido es su carga y las pK que difieren entre estos dos residuos de aminoácido no son significativas. Hay otros cambios más que se pueden considerar "conservadores" en determinados medios.

La proteína STEAP-1 puede ser realizada de muchas formas, preferiblemente, de forma aislada. Como se usa en la presente memoria, se dice que una proteína está "aislada" cuando se emplean procedimientos físicos, mecánicos o químicos para separar la proteína STEAP-1 de los constituyentes celulares que están normalmente asociados con la proteína. Cualquier experto en la técnica puede emplear fácilmente procedimientos de purificación estándar para obtener una proteína STEAP-1 aislada. Una molécula de proteína STEAP-1 purificada estará sustancialmente libre de otras proteínas o moléculas que impidan la unión de STEAP-1 con un anticuerpo u otro ligando. La naturaleza y el grado de aislamiento y purificación dependerán del uso pretendido. Las realizaciones de la proteína STEAP-1 incluyen una proteína STEAP-1 purificada y una proteína STEAP-1 soluble funcional. En una forma, tales proteínas STEAP-1 solubles funcionales o los fragmentos de las mismas conservan la capacidad para unirse con un anticuerpo u otro ligando.

La presente revelación también proporciona polipéptidos STEAP-1 que comprenden fragmentos biológicamente activos de la secuencia de aminoácidos de STEAP-1, tales como un polipéptido correspondiente a parte de las secuencias de aminoácidos de STEAP-1, según lo mostrado en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2). Tales polipéptidos presentan propiedades de una proteína STEAP-1, tales como la capacidad para provocar la generación de anticuerpos que se unan específicamente con un epítopo asociado con una proteína STEAP-1. Los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos que son únicas para la proteína STEAP-1 (en comparación con otras proteínas STEAP) se pueden usar para generar anticuerpos que reaccionarán específicamente con la proteína STEAP-1. Por ejemplo, en referencia al alineamiento de aminoácidos de las estructuras de STEAP-1 y STEAP-2 mostradas en la Fig. 11A, el experto en la técnica apreciará fácilmente que cada molécula contiene tramos de la secuencia única para su estructura. Estos tramos únicos se pueden usar para generar anticuerpos específicos frente a STEAP-1.

Los polipéptidos STEAP-1 se pueden generar usando la tecnología de síntesis de péptidos estándar o usando procedimientos de escisión química conocidos en la técnica basados en las secuencias de aminoácidos de la proteína STEAP-1 humana revelada en la presente memoria. Alternativamente, se pueden usar procedimientos recombinantes para generar moléculas de ácido nucleico que codifiquen un fragmento polipeptídico de una proteína STEAP-1. En este aspecto, las moléculas de ácido nucleico que codifican STEAP-1 descritas en la presente memoria proporcionan medios para generar fragmentos definidos de la proteína STEAP-1. Los polipéptidos STEAP-1 son particularmente útiles en la generación y la caracterización de anticuerpos de un dominio específico (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un epítopo celular o intracelular de una proteína STEAP-1), en la generación de anticuerpos específicos de un miembro de la familia de STEAP-1 que identifiquen agentes o factores celulares que se unan con STEAP-1 o con el dominio de STEAP-1, y en diversos contextos terapéuticos, incluyendo, pero no limitándose a, vacunas contra el cáncer. Es posible predecir y/o identificar polipéptidos STEAP-1 que contienen estructuras particularmente interesantes usando diversas técnicas analíticas conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los procedimientos de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schuttz o el análisis de Jameson-Woff, o en base a la inmunogenicidad. Los fragmentos que contienen tales estructuras son particularmente útiles en la generación de anticuerpos
anti-STEAP-1 específicos de una subunidad o en la identificación de factores celulares que se unen con STEAP-1.

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Anticuerpos frente a STEAP

Otro aspecto de la presente revelación proporciona anticuerpos que se unen con la proteína y los polipéptidos STEAP-1. Los anticuerpos más preferidos se unirán selectivamente con la proteína STEAP-1 y no se unirán (o se unirán débilmente) con las proteínas y polipéptidos no STEAP-1. Los anticuerpos anti-STEAP-1 que están particularmente contemplados incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales, así como fragmentos que contienen el dominio de unión antigénica y/o una o más regiones determinantes de la complementariedad de estos anticuerpos. Como se usa en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo se define como al menos una parte de la región variable de la molécula de inmunoglobulina que se une con su diana, es decir, la región de unión antigénica.

Para algunas aplicaciones, puede ser deseable generar anticuerpos que reaccionen específicamente con un epítopo en un determinado dominio estructural. Por ejemplo, los anticuerpos preferidos útiles para los objetivos de terapia contra el cáncer y generación de imágenes de diagnóstico son aquellos que reaccionan con un epítopo en una región extracelular de la proteína STEAP-1 cuando se expresa en células cancerosas. Se pueden generar tales anticuerpos usando la proteína STEAP-1 descrita en la presente memoria, o usando péptidos derivados de los dominios extracelulares predichos de la misma, como inmunógeno. A tal efecto, con referencia al esquema topológico de la proteína STEAP-1 mostrado en la Fig. 18, se pueden seleccionar las regiones de los bucles extracelulares que hay entre los dominios transmembrana indicados y usarlas para diseñar los inmunogenes apropiados para dirigir los anticuerpos específicos de un dominio extracelular.

Los anticuerpos frente a STEAP-1 de la presente revelación pueden ser particularmente útiles en las estrategias terapéuticas, en los análisis de diagnóstico y pronóstico y en las metodologías de generación de imágenes para el cáncer de próstata. La invención proporciona diversos análisis inmunológicos útiles para la detección y la cuantificación de la proteína y los polipéptidos STEAP-1 y STEAP-1 mutantes. Tales análisis comprenden generalmente uno para más anticuerpos frente a STEAP-1 capaces de reconocer y unirse con la proteína STEAP-1 o la proteína STEAP-1 mutante, según sea lo apropiado, y se pueden realizar en diversos formatos de análisis inmunológicos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a, diversos tipos de radioinmunoanálisis, análisis de inmunoabsorción unida a enzimas (ELISA), análisis de inmunofluorescencia unida a enzimas (ELIFA), y similares. Además, la invención también proporciona procedimientos inmunológicos de generación de imágenes capaces de detectar el cáncer de próstata, incluyendo, pero no limitándose a, procedimientos radioescintigráficos de generación de imágenes, en los que se usan anticuerpos frente a STEAP-1 marcados. Tales análisis pueden ser útiles clínicamente en la detección, el control y el pronóstico del cáncer de próstata, particularmente, el cáncer de próstata avanzado.

Los anticuerpos frente a STEAP-1 también se pueden usar en procedimientos para purificar proteínas y polipéptidos STEAP-1 y STEAP-1 mutantes, y para aislar homólogos de STEAP-1 y moléculas relacionadas. Por ejemplo, en una realización, el procedimiento de purificación de una proteína STEAP-1 comprende incubar un anticuerpo frente a STEAP-1, que ha sido acoplado a una matriz sólida, con un lisado u otra solución que contenga STEAP-1 en condiciones que permitan que el anticuerpo frente a STEAP-1 se una con STEAP-1; lavar la matriz sólida para eliminar las impurezas; y eluir la STEAP-1 del anticuerpo acoplado. Otros usos de los anticuerpos STEAP-1 de la invención incluyen generar anticuerpos anti-idiopáticos que imiten a la proteína STEAP-1.

También es posible usar los anticuerpos frente a STEAP-1 terapéuticamente mediante, por ejemplo, la modulación o la inhibición de la actividad biológica de una proteína STEAP-1, o la dirección y destrucción de las células cancerosas de próstata que expresen una proteína STEAP-1. La terapia del cáncer de próstata y de otros cánceres con anticuerpos se describe más específicamente en un apartado a parte que figura más adelante.

En la técnica, se conocen diversos procedimientos para la preparación de anticuerpos. Por ejemplo, es posible preparar anticuerpos mediante la inmunización de un huésped mamífero adecuado usando una proteína o un péptido STEAP-1, o un fragmento de los mismos, en forma aislada o inmunoconjugada ("Antibodies: A Laboratory Manual", CSH Press, Eds., Harlow, y Lane (1988); Harlow, Antibodies. Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Además, también se pueden usar proteínas de fusión de STEAP-1, tales como una proteína de fusión de STEAP-1 y GST. En una realización particular, se puede producir una proteína de fusión de GST que comprenda toda o la mayoría de la secuencia de aminoácidos del marco de lectura abierto de la Fig. 1A, y usarla como un inmunógeno para generar anticuerpos apropiados. También se pueden usar células que expresen o sobre-expresen STEAP-1 para las inmunizaciones. De manera similar, se puede usar cualquier célula diseñada genéticamente para expresar STEAP-1. Tales estrategias pueden dar como resultado la producción de anticuerpos monoclonales con mayores capacidades para reconocer la STEAP-1 endógena. Otro inmunógeno útil comprende la proteína STEAP-1 unida a la membrana plasmática de glóbulos rojos de oveja.

La secuencia de aminoácidos de STEAP-1 como la mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) se puede usar para seleccionar regiones específicas de la proteína STEAP-1 para generar anticuerpos. Por ejemplo, se pueden usar análisis de hidrofobicidad e hidrofilidad de la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 para identificar las regiones hidrófilas de la estructura de STEAP-1. Es posible identificar fácilmente las regiones de la proteína STEAP-1 que muestran una estructura inmunógenica, así como otras regiones y dominios, usando otros diversos procedimientos conocidos en la técnica, tales como los análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Para la generación de anticuerpos que reconozcan específicamente una proteína STEAP-1 mutante, se prefieren las secuencias de aminoácidos únicas para el mutante (en comparación con la STEAP-1 de tipo
natural).

Los procedimientos para preparar una proteína o un polipéptido para su uso como un inmunógeno y para preparar conjugados inmunógenicos de una proteína con un vehículo, tal como ASB, KLH u otras proteínas transportadoras, son conocidos en la técnica. En algunos casos, se puede usar la conjugación directa usando, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos, pueden ser eficaces reactivos de unión, tales como aquéllos suministrados por Pierce Chemical Co., Rockford, IL. La administración de un inmunógeno de STEAP-1 se realiza generalmente mediante la inyección durante un período de tiempo adecuado y el uso de un adyuvante adecuado, tal y como se entiende en la técnica en general. Durante el plan de inmunización, se pueden tomar títulos de anticuerpos para determinar la idoneidad de la formación de los anticuerpos.

Se prefieren los anticuerpos monoclonales frente a STEAP-1, y se pueden producir mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar líneas celulares inmortalizadas que secreten un anticuerpo monoclonal deseado usando el procedimiento estándar de Kohler y Milstein, o las modificaciones que producen la inmortalización de los linfocitos o las células del bazo, como se conoce en general. Las líneas celulares inmortalizadas que secretan los anticuerpos deseados son evaluadas selectivamente mediante inmunoanálisis en el que el antígeno es la proteína STEAP-1 o un fragmento de STEAP-1. Cuando se identifica el cultivo celular inmortalizado apropiado que secreta el anticuerpo deseado, se pueden expandir las células y producirse los anticuerpos bien a partir de cultivos in vitro o de fluido ascítico.

Como se menciona anteriormente, se pueden usar numerosos polipéptidos STEAP-1 como inmunogenes para generar anticuerpos monoclonales usando procedimientos tradicionales. Una realización particular comprende un anticuerpo que tiñe inmunohistoquímicamente células 293T transfectadas con un plásmido de expresión que porta la secuencia codificante de STEAP-1, células transfectadas que expresan la proteína STEAP-1, pero no tiñen inmunohistoquímicamente las células 293T no transfectadas. En el ejemplo 5 de la presente memoria, se proporciona un análisis para la caracterización de tales anticuerpos.

En otra realización, se pueden generar anticuerpos monoclonales frente a STEAP-1 usando células NIH 3T3 que expresen STEAP-1 como un inmunógeno para generar los Acm que reconozcan los epítopos de la superficie celular de STEAP-1. Se pueden evaluar selectivamente Acm reactivos mediante ELISA basado en una célula usando células PC-3 que sobre-expresen STEAP-1. En otra realización específica, 3 péptidos que representan las regiones extracelulares de la proteína STEAP-1, (específicamente, REVIHPLATSHQQYFYKlPILV, (SEC ID N.º 19) RRSYRYKLLN
WAYQQVOONKEDAWIEHDVWRMEI (SEC ID N.º 20) y WIDIKQFVWYTPPTF (SEC ID N.º 21)) son acoplados a glóbulos rojos de oveja para la inmunización. En otra realización específica, la proteína STEAP-1 recombinante generada con una etiqueta de His amino-terminal usando un sistema de expresión adecuado (por ejemplo, sistema de expresión de baculovirus pBlueBac4.5, Invitrogen) se purifica usando una columna de Níquel, y se usa como inmunógeno.

También se pueden producir los anticuerpos o sus fragmentos usando la tecnología actual mediante procedimientos recombinantes. Las regiones que se unen específicamente con las regiones deseadas de la proteína STEAP-1 también se pueden producir en el contexto de los anticuerpos quiméricos o injertados en CDR que proceden de múltiples especies. También se pueden producir anticuerpos STEAP-1 humanizados o humanos, y se prefieren para su uso en contextos terapéuticos. Se conocen diversos enfoques para producir tales anticuerpos humanizados, e incluyen procedimientos quiméricos o de injertos en CDR; los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos incluyen el despliegue en fagos y procedimientos transgénicos (para su consulta, véase Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539).

Se pueden generar anticuerpos monoclonales STEAP-1 completamente humanos usando tecnologías de clonación que empleen grandes genotecas combinatorias de Ig humanas (es decir, despliegue en fagos) (Griffiths y Hoogenboom, "Building an In vitro immune system: human antibodies from phage display libraries", en: "Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man". Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton y Barbas, "Human Antibodies from combinatorial libraries", Id., pp 65-82). También se pueden producir anticuerpos monoclonales frente a STEAP-1 completamente humanos usando ratones transgénicos diseñados genéticamente para que contengan locus de genes de inmunoglobulina humana según lo descrito en la solicitud de patente vía PCT WO98/24893, Kucherlapati y Jakobovits et al., publicada el 3 de diciembre de 1997 (véase también, Jakobovits, 1998, Exp. Opin. invest. Drugs 7(4): 607-614). Este procedimiento evita la manipulación in vitro necesaria con la tecnología de despliegue en fagos y produce eficazmente anticuerpos humanos auténticos de afinidad elevada.

Se puede establecer la reactividad de los anticuerpos frente a STEAP-1 con la proteína STEAP-1 mediante un número de procedimientos conocidos, incluyendo los análisis de transferencia Western, de inmunoprecipitación, de ELISA y de FACS, que usan, según lo apropiado, proteínas y péptidos STEAP-1, células que expresan STEAP-1 o extractos de las mismas.

Es posible marcar un anticuerpo frente a STEAP-1, o un fragmento del mismo, de la presente revelación con un marcador detectable, o conjugarlo con una segunda molécula, tal como un agente citotóxico y usarlo para dirigir la segunda molécula a una célula positiva en STEAP-1 (Vitetta, E.S. et al., 1993, Immunotoxin therapy, en DeVita, Jr., V.T. et al., eds, "Cancer: Principles and Practise of Oncology". IV ed., J.B. Lippincott Co., Filadelfia, 2624-2636). Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metales o una enzima.

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Procedimientos para la detección de STEAP-1

Otro aspecto de la presente revelación se refiere a procedimientos para detectar polinucleótidos STEAP-1 y proteínas STEAP-1, así como a procedimientos para identificar una célula que exprese STEAP-1.

Más concretamente, la presente revelación proporciona análisis para la detección de polinucleótidos STEAP-1 en una muestra biológica, tal como suero, hueso, próstata y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los polinucleótidos STEAP-1 detectables incluyen, por ejemplo, un gen STEAP-1 o fragmentos del mismo, ARNm de STEAP-1, ARNm de variantes de empalme alternativas de STEAP-1 y moléculas de ADN o ARN recombinantes que contienen un polinucleótido STEAP-1. Se conoce un número de procedimientos para amplificar y/o detectar la presencia del polinucleótido STEAP-1 en la técnica y se pueden emplear en la práctica de este aspecto de la presente revelación.

En una realización, un procedimiento para detectar un ARNm de STEAP-1 en una muestra biológica comprende producir ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc así producido usando polinucleótidos STEAP-1 como cebadores sentido y antisentido para amplificar los ADNc de STEAP-1 en los mismos; y detectar la presencia del ADNc de STEAP-1 amplificado. En otra realización, un procedimiento para detectar un gen STEAP-1 en una muestra biológica comprende primero aislar ADN genómico de la muestra; amplificar el ADN genómico aislado usando polinucleótidos STEAP-1 como cebadores sentido y antisentido para amplificar el gen STEAP-1 en los mismos; y detectar la presencia del gen STEAP-1 amplificado. Se puede diseñar cualquier número de combinaciones de sondas sentido y antisentido apropiadas a partir de la secuencia de nucleótidos proporcionada para STEAP-1 (Fig. 1A; SEC ID N.º 1).

La presente revelación también proporciona análisis para detectar la presencia de una proteína STEAP-1 en un tejido de otra muestra biológica, tal como suero, hueso, próstata y otros tejidos, orina, semen, preparaciones celulares y similares. Los procedimientos para detectar una proteína STEAP-1 también son conocidos e incluyen, por ejemplo, inmunoprecipitación, análisis inmunohistoquímico, análisis de transferencia Western, análisis de unión molecular, ELISA, ELIFA y similares.

Por ejemplo, en una realización, un procedimiento para detectar la presencia de una proteína STEAP-1 en una muestra biológica comprende primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo frente a STEAP-1, un fragmento reactivo con STEAP-1 del mismo o una proteína recombinante que contenga una región de unión antigénica de un anticuerpo frente a STEAP-1; y luego detectar la unión de la proteína STEAP-1 en la muestra con el mismo.

También se proporcionan procedimientos para identificar una célula que exprese STEAP-1. En una realización, un análisis para identificar una célula que exprese un gen STEAP-1 comprende detectar la presencia del ARNm de STEAP-1 en la célula. Los procedimientos para la detección de determinados ARNm en células son conocidos e incluyen, por ejemplo, análisis de hibridación en los que se usan sondas de ADN complementario (tales como la hibridación in situ usando ribosondas de STEAP-1 marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos análisis de amplificación de ácidos nucleicos (tales como la RT-PCR usando cebadores complementarios específicos de STEAP-1 y otros procedimientos de detección de la amplificación de otro tipo, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares). Alternativamente, un análisis para identificar una célula que exprese un gen STEAP-1 comprende detectar la presencia de la proteína STEAP-1 en la célula o secretada por la célula. Hay diversos procedimientos para la detección de proteínas que son conocidos en la técnica y que se pueden emplear para la detección de proteínas STEAP-1 y células que expresen STEAP-1.

Los análisis de expresión de STEAP-1 también pueden ser útiles como una herramienta para la identificación y la evaluación de los agentes que modulen la expresión de genes STEAP-1. La expresión de STEAP-1 es significativamente sobre-regulada en el cáncer de colon, de vejiga, pancreático, de ovario y otros tipos de cáncer. La identificación de una molécula o de un agente biológico que podría inhibir la sobre-expresión de STEAP-1 puede ser de valor terapéutico en el tratamiento del cáncer. Es posible identificar tal agente usando un filtro que cuantifique la expresión de STEAP-1 mediante RT-PCR, la hibridación de ácidos nucleicos o la unión con anticuerpos.

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Análisis para determinar el estado de la expresión de STEAP-1

La determinación del estado de los patrones de expresión de STEAP-1 en un individuo se puede usar para diagnosticar el cáncer y puede proporcionar información de pronóstico útil en la definición de las opciones terapéuticas apropiadas. De manera similar, el estado de la expresión de STEAP-1 puede proporcionar información útil para predecir la susceptibilidad a determinados estadios, la progresión y/o la agresividad tumoral de una enfermedad. La presente revelación proporciona los procedimientos y los análisis para determinar el estado de la expresión de STEAP-1 y diagnosticar cánceres que expresen STEAP-1.

En un aspecto, la presente revelación proporciona análisis útiles en la determinación de la presencia del cáncer en un individuo que comprende detectar un aumento significativo del ARNm de STEAP-1 o de la expresión de la proteína STEAP-1 en una muestra analítica de células o tejidos en comparación con los niveles de expresión en la correspondiente célula o tejido normal. En una realización, se evalúa la presencia del ARNm de STEAP-1 en muestras titulares del colon, páncreas, vejiga, ovario, cérvix, testículos o mama. La presencia de una expresión de STEAP-1 significativa en cualquiera de estos tejidos puede ser útil para indicar la aparición, la presencia y/o la gravedad de estos cánceres, pues los correspondientes tejidos normales no expresan el ARNm de STEAP-1. En una realización relacionada, se puede determinar el estado de la expresión de STEAP-1 a nivel proteico en lugar de a nivel de ácido nucleico. Por ejemplo, tal procedimiento o análisis comprendería determinar el nivel de la proteína STEAP-1 expresada por células en una muestra analítica de tejido y comparar el nivel así determinado con el nivel de STEAP expresado en la correspondiente muestra normal. En una realización, se evalúa la presencia de la proteína STEAP-1, por ejemplo, usando procedimientos inmunohistoquímicos. Los anticuerpos frente a STEAP-1 o los patrones de unión con STEAP-1 capaces de detectar la expresión de la proteína STEAP-1 se pueden usar en una variedad de formatos analíticos conocidos en la técnica a tal efecto.

La sangre periférica se puede analizar convenientemente en cuanto a la presencia de células cancerosas, incluyendo el cáncer de próstata, de colon, pancreático, de vejiga y de ovario, usando RT-PCR para detectar la expresión de STEAP-1. La presencia de ARNm de STEAP-1 amplificable mediante RT-PCR proporciona un indicio de la presencia de uno de estos tipos de cáncer. Actualmente, se están evaluando los análisis de detección por RT-PCR para las células tumorales de sangre periférica para su uso en el diagnóstico y el tratamiento de un número de tumores sólidos humanos. En el campo del cáncer de próstata, éstos incluyen análisis de RT-PCR para la detección de células que expresen PSA y PSM (Verkalk et al, 1997, Urol. Res. 25: 373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13: 1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41: 1687-1688). Los análisis de RT-PCR son conocidos en la técnica.

En otro enfoque, se puede usar un análisis sensible recientemente descrito para detectar y caracterizar células de carcinoma en sangre (Racila et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 95: 4589-4594). Este análisis combina el enriquecimiento inmunomagnético con análisis inmunohistoquímicos y de citometría de flujo de múltiples parámetros, y es muy sensible para la detección de células cancerosas en sangre, y de él se ha publicado que es capaz de detectar una célula epitelial en 1 ml de sangre periférica.

Un aspecto relacionado de la presente revelación se dirige a predecir la susceptibilidad a desarrollar cáncer en un individuo. En una realización, un procedimiento para predecir la susceptibilidad al cáncer comprende detectar ARNm de STEAP-1 o proteína STEAP-1 en una muestra de tejido, indicando su presencia la susceptibilidad al cáncer, y siendo el grado de expresión del ARNm de STEAP-1 presente proporcional al grado de susceptibilidad.

Otro aspecto relacionado más de la presente revelación se dirige a procedimientos para medir la agresividad tumoral. En una realización, un procedimiento para medir la agresividad de un tumor comprende determinar el nivel de ARNm de STEAP-1 o de proteína STEAP-1 expresado por las células en una muestra del tumor, comparar el nivel así determinado con el nivel de ARNm de STEAP-1 o de proteína STEAP-1 expresado en el correspondiente tejido normal tomado del mismo individuo o en una muestra de referencia de tejido normal, de manera que el grado de la expresión de ARNm de STEAP-1 o de proteína STEAP-1 en la muestra del tumor en comparación con la muestra normal indica el grado de agresividad.

En la presente memoria, se describen procedimientos para detectar y cuantificar la expresión de ARNm de STEAP-1 o de proteína STEAP-1, y usan la detección estándar de ácidos nucleicos y proteínas, así como tecnologías de cuantificación conocidas en la técnica. Los procedimientos estándar para la detección y la cuantificación del ARNm de STEAP-1 incluyen la hibridación in situ usando ribosondas de STEAP-1 marcadas, transferencia Northern y técnicas relacionadas en las que se usan sondas de polinucleótido STEAP-1, análisis RT-PCR en los que se usan cebadores específicos de STEAP-1 y otros procedimientos de detección de la amplificación de otro tipo, tales como, por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y similares. En una realización específica, se puede usar una RT-PCR semi-cuantitativa para detectar y cuantificar la expresión del ARNm de STEAP-1 según lo descrito en los ejemplos que figuran a continuación. Se puede usar cualquier número de cebadores capaces de amplificar STEAP-1 a tal efecto, incluyendo, pero no limitándose a, los diversos conjuntos de cebadores descritos específicamente en la presente memoria. A tal efecto, se pueden usar procedimientos estándar para la detección y la cuantificación de la proteína. En una realización específica, se pueden usar anticuerpos policlonales o monoclonales específicamente reactivos con la proteína STEAP-1 de tipo natural en un análisis inmunohistoquímico de tejido de biopsia.

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Generación de imágenes de diagnóstico de cánceres humanos

El perfil de expresión de STEAP-1 indica que los anticuerpos específicos de la misma pueden ser particularmente útiles en formas de radionúclido y otras formas de generación de imágenes de diagnóstico de ciertos cánceres. Por ejemplo, el análisis inmunohistoquímico de la proteína STEAP-1 sugiere que en tejidos normales, STEAP-1 se restringe predominantemente a la próstata y a la vejiga. La orientación transmembranal de STEAP-1 proporciona una diana fácilmente identificable por los anticuerpos específicamente reactivos con los epítopos extracelulares. Esta expresión restringida a un tejido y la localización de STEAP-1 con respecto a la superficie celular de múltiples cánceres convierte a STEAP-1 en un candidato ideal para la generación de imágenes de diagnóstico. Por consiguiente, se pueden usar técnicas de generación de imágenes in vivo para generar imágenes de cánceres humanos que expresen una proteína STEAP-1.

La proteína STEAP-1 de la superficie celular se expresa a niveles muy altos en varios cánceres humanos, particularmente, en cánceres de próstata, vejiga, colon y ovario y en el sarcoma de Ewing. Además, en tejidos normales, la expresión de la proteína STEAP-1 se restringe en buena parte a la próstata. De este modo, los anticuerpos radiomarcados específicamente reactivos con epítopos extracelulares de STEAP-1 pueden ser particularmente útiles en la generación de imágenes in vivo de tumores sólidos de los anteriores cánceres. Tales anticuerpos anti-STEAP-1 marcados pueden proporcionar sensibilidades de un nivel muy elevado para la detección de la metástasis de estos cánceres.

Preferiblemente, en los procedimientos de generación de imágenes de diagnóstico de la presente revelación, se usan anticuerpos monoclonales.

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Inmunoterapia del cáncer y vacunas contra el cáncer

La presente revelación proporciona diversos tratamientos inmunoterapéuticos para el cáncer de próstata, incluyendo terapia con anticuerpos, vacunas in vivo y procedimientos de inmunoterapia ex vivo, que utilizan polinucleótidos y polipéptidos correspondientes a STEAP-1 y a anticuerpos frente a STEAP-1. Estas aplicaciones terapéuticas se describen más detalladamente en los siguientes apartados.

Los solicitantes han ido acumulando pruebas importantes y convincentes de que STEAP-1 se expresa fuertemente de manera uniforme por la superficie de células epiteliales glandulares de la próstata y células de cáncer de próstata. Para más información, véanse los análisis inmunohistoquímicos y de transferencia Western de la expresión de la proteína STEAP-1 presentados en los ejemplos 3C (y 3D), así como los perfiles de expresión de ARNm de STEAP-1 obtenidos a partir de los datos generados mediante transferencia Northern y RT-PCR presentados en los ejemplos 1 y 3A, 3B. En concreto, los resultados del análisis inmunohistoquímico muestran que la superficie de las células epiteliales (normales o cancerosas) de la próstata humana parece estar revestida uniformemente por STEAP-1. El análisis bioquímico confirma la ubicación de STEAP-1 en la superficie celular sugerida inicialmente por sus elementos estructurales primarios de las 6 transmembranas putativas y por la tinción pericelular claramente visualizada por tinción inmunohistoquímica.

STEAP-1 se expresa uniformemente a niveles elevados por la superficie de los epitelios glandulares de la próstata, una situación ideal para las estrategias de intervención inmunoterapéutica que dirigen epítopos de STEAP extracelulares. Cabría esperar que la administración sistémica de composiciones inmunorreactivas con STEAP diera como resultado un amplio contacto de la composición con las células epiteliales de la próstata mediante la unión de los epítopos extracelulares de STEAP-1. Además, dada casi la ausencia de expresión de la proteína STEAP-1 en los tejidos humanos normales, existen razones más que suficientes para esperar una intensísima sensibilidad sin los efectos tóxicos, inespecíficos y/o sin diana provocados por la unión de la composición inmunoterapéutica con STEAP-1 sobre órganos y tejidos no diana.

Además del alto nivel de expresión de STEAP-1 en la próstata y en células de cáncer de próstata, STEAP-1 parece estar sustancialmente sobre-expresado en una variedad de otros cánceres humanos, incluyendo cáncer de vejiga, colon, pancreático y ovario. En concreto, se detecta un alto nivel de expresión del ARNm de STEAP-1 en todos los tejidos y las líneas celulares de cáncer de próstata analizados, y en la mayoría de las líneas celulares de cáncer pancreático, de colon y de vejiga analizadas. También se observa un alto nivel de expresión de STEAP-1 en algunas líneas celulares de cáncer de ovario. Se observa un nivel de expresión menor en algunas líneas celulares de cáncer de mama, testicular y cervical. También se detecta un nivel de expresión muy alto en una línea celular de sarcoma de Ewing. Los solicitantes han demostrado que la proteína STEAP-1 de la superficie celular se expresa en cánceres de vejiga y de colon, mientras que no hay proteína STEAP-1 de la superficie celular (o intracelular) detectable en el colon normal, y hay una baja expresión en vejiga normal. Los anticuerpos específicamente reactivos con los dominios extracelulares de STEAP-1 pueden ser útiles en el tratamiento de estos cánceres sistemáticamente, bien como conjugados con toxinas o agentes terapéuticos, o como anticuerpos desnudos capaces de inhibir la proliferación o la función celular.

Es posible introducir anticuerpos frente a STEAP-1 en un paciente tal que el anticuerpo se una con STEAP-1 sobre las células cancerosas y medie la destrucción de las células y del tumor y/o inhiba el crecimiento de las células o del tumor. Los mecanismos mediante los cuales tales anticuerpos ejercen un efecto terapéutico puede incluir la citolisis mediada por el complemento, citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, modulación de la función fisiológica de STEAP-1, inhibición de la unión con ligandos o de las rutas de transducción de señales, modulación de la diferenciación de las células tumorales, modificación de los perfiles de los factores de angiogénesis tumoral y/o la inducción de la apóptosis. También se pueden usar terapéuticamente anticuerpos frente a STEAP-1 conjugados con agentes terapéuticos o tóxicos para administrar el agente terapéutico o tóxico directamente en las células tumorales que portan STEAP-1.

La inmunoterapia del cáncer en la que se usan los anticuerpos anti-STEAP-1 puede seguir las enseñanzas generadas por diversos enfoques que han sido empleados con éxito con respecto a otros tipos de cáncer, incluyendo, pero no limitándose al cáncer de colon (Arlen et al., 1998, Crit Rev Immunol 18:133-138), mieloma múltiple (Ozaki et al., 1997, Blood 90: 3179-3186; Tsunenari et al., 1997, Blood 90: 2437-2444), cáncer gástrico (Kasprzyk et al., 1992. Cancer Res 52: 2771-2776), linfoma de células B (Funakoshi et al., 1996, J Immunther Emphasis Tumor Immunol 19: 93-101), leucemia (Zhong et al., 1996, Leuk Res 20: 581-589), cáncer colorrectal (Moun et al., 1994, Cancer Res 54: 6160-6166); Velders et al., 1995, Cancer Res 55: 4398-4403) y cáncer de mama (Shepard et al., 1991, J Clin Immunol 11:117-127).

Aunque la terapia con anticuerpos frente a STEAP-1 puede ser útil para todos los estadios de los anteriores cánceres, la terapia con anticuerpos puede ser particularmente apropiada en cánceres avanzados o metastásicos. Puede ser preferible combinar el procedimiento de terapia con anticuerpos de la presente memoria con un régimen quimioterapéutico o de radiaciones en pacientes que no hayan recibido un tratamiento quimioterapéutico, mientras que el tratamiento con la terapia de anticuerpos de la invención puede estar indicado para los pacientes que hayan recibido una o más quimioterapias. Además, la terapia con anticuerpos también puede permitir el uso de dosis reducidas de quimioterapia concomitante, particularmente, en pacientes que no toleren muy bien la toxicidad del agente quimioterapéutico.

Puede ser deseable la evaluación de pacientes de cáncer que no sea de próstata en cuanto a la presencia y el nivel de sobre-expresión de STEAP-1, preferiblemente, usando evaluaciones inmunohistoquímicas de tejido tumoral, generación de imágenes de STEAP-1 cuantitativa u otras técnicas capaces de indicar fiablemente la presencia y el grado de sobre-expresión de STEAP-1. Puede preferirse el análisis inmunohistoquímico de biopsias tumorales o muestras quirúrgicas a tal efecto. Los procedimientos para el análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales son conocidos en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales anti-STEAP-1 útiles en el tratamiento del cáncer de próstata y de otros cánceres incluyen aquéllos que son capaces de iniciar una potente respuesta inmune frente al tumor y aquéllos que son capaces de dirigir la citotoxicidad. A este respecto, los Acm anti-STEAP-1 pueden provocar una lisis de las células tumorales mediante mecanismos de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) o mediada por el complemento, ambos de los cuales requieren una porción Fc intacta de la molécula de inmunoglobulina para su interacción con los sitios del receptor Fc de las células efectoras o proteínas del complemento. Además, son útiles los Acm anti-STEAP-1 que ejercen un efecto biológico directo sobre el crecimiento tumoral. Los mecanismos potenciales mediante los cuales pueden actuar tales Acm directamente citotóxicos incluyen la inhibición del crecimiento celular, la modulación de la diferenciación celular, la modulación de los perfiles de los factores angiogénicos tumorales y la inducción de la apóptosis. Es posible evaluar los mecanismos mediante los cuales un determinado Acm anti-STEAP-1 ejerce un efecto anti-tumoral usando cualquier número de análisis in vitro diseñados para determinar la ADCC, ADMMC, la lisis celular mediada por el complemento, etcétera, tal y como se sabe en la técnica en general.

La actividad anti-tumoral de un determinado Acm anti-STEAP-1 o de una combinación de Acm anti-STEAP-1 puede ser evaluada in vivo usando un modelo animal adecuado. Por ejemplo, los modelos de cáncer de próstata xenogénicos, en los que se introducen explantes de cáncer de próstata humanos o tejidos de xenoinjertos pasados en animales cuyo sistema inmune está afectado, tales como ratones desnudos o SCID, son apropiados en relación con el cáncer de próstata y han sido descritos (Klein et al., 1997. Nature Medicine 3: 402-408). Por ejemplo, la solicitud de patente vía PCT WO98/16628, Sawyers et al., publicada el 23 de abril de 1998, describe diversos modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata humano capaces de repetir el desarrollo de tumores primarios, micrometástasis y la formación de la metástasis osteoblástica característica de los últimos estadios de la enfermedad. La eficacia puede ser precisa usando análisis que midan la inhibición de la formación tumoral, la regresión del tumor o la metástasis, y similares.

Cabe destacar que el uso de anticuerpos monoclonales murinos u otros no humanos, Acm quiméricos humanos/de ratón, puede inducir respuestas inmunes de moderadas a fuertes en algunos pacientes, y en los casos más graves, tal respuesta inmune puede conducir a la amplia formación de complejos inmunes que provoquen potencialmente una insuficiencia renal. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales preferidos usados en la práctica de los procedimientos terapéuticos de la invención son aquellos que bien son completamente humanos o humanizados y que se unen específicamente con el antígeno diana con una afinidad alta, pero que presentan una antigenicidad nula o baja en el paciente.

La revelación contempla la administración de Acm anti-STEAP-1 simples, así como de combinaciones o "cócteles" de diferentes Acm. Tales cócteles de Acm pueden tener ciertas ventajas en tanto en cuanto contienen Acm que hacen uso de diferentes mecanismos efectores o combinan directamente Acm citotóxicos con Acm que se atienen a la funcionalidad de los efectores inmunes. Tales Acm en combinación pueden presentar efectos terapéuticos sinérgicos. Además, la administración de Acm anti-STEAP-1 puede combinarse con otros agentes terapéuticos, incluyendo, pero no limitándose a, diversos agentes quimioterapéuticos, bloqueadores de andrógenos y moduladores inmunes (por ejemplo, IL-2, GM-CSF). Los Acm anti-STEAP-1 pueden ser administrados bien en forma "desnuda" o no conjugada, o pueden tener conjugados agentes terapéuticos.

Los anticuerpos monoclonales anti-STEAP-1 usados en la práctica del procedimiento de la presente revelación pueden ser formulados en composiciones farmacéuticas que comprendan un vehículo adecuado para el procedimiento de administración deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier material que, cuando se combine con los Acm anti-STEAP-1, conserve la función anti-tumoral del anticuerpo y no sea reactivo con los sistemas inmunes de los sujetos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de entre un número de vehículos farmacéuticos estándar, tales como soluciones estériles salinas tamponadas con fosfato, agua bacteriostática, y similares.

Las formulaciones de anticuerpo anti-STEAP-1 se pueden administrar por cualquier vía capaz de administrar los anticuerpos a la zona del tumor. Las vías potencialmente eficaces de administración incluyen, pero no se limitan a, la vía intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, intradérmica y similares. La vía de administración preferida es mediante inyección intravenosa. Una formulación preferida para la inyección intravenosa comprende los Acm anti-STEAP-1 en una solución de agua conservada bacteriostática, agua no conservada estéril y/o diluida en polivinilcloruro o bolsas de polietileno que contienen cloruro sódico estéril al 0,9% para inyección, USP. La preparación de Acm anti-STEAP-1 puede ser liofilizada y almacenada como un polvo estéril, preferiblemente, al vacío, y luego ser reconstituida en agua bacteriostática que contiene, por ejemplo, conservante de alcohol bencílico o en agua estéril antes de la inyección.

El tratamiento generalmente implicará la administración repetida de la preparación de anticuerpos anti-STEAP-1 por una vía aceptable de administración, tal como mediante inyección intravenosa (IV), comúnmente, a una dosis en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. Las dosis en el intervalo de 10-500 mg de Acm a la semana pueden ser eficaces y bien toleradas. Basándose en la experiencia clínica con el Acm Herceptina en el tratamiento del cáncer de mama metastásico, una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal del paciente IV seguida por dosis semanales de aproximadamente 2/mg/kg IV de la preparación de Acm anti-STEAP-1 puede representar un régimen posológico aceptable. Preferiblemente, la dosis de carga inicial se administra como una infusión de 90 minutos o de mayor duración. La dosis de mantenimiento periódico se puede administrar como una infusión de 30 minutos o más tiempo, siempre y cuando la dosis inicial sea bien tolerada. Sin embargo, como entenderá cualquier experto en la técnica, diversos factores influirán en el régimen posológico ideal en un determinado caso. Tales factores pueden incluir, por ejemplo, la afinidad de unión y la vida media del Acm o de los Acm usados, el grado de sobre-expresión de STEAP-1 en el paciente, el alcance del antígeno STEAP-1 emitido circulante, el nivel de concentración de anticuerpos en estado estable deseado, la frecuencia del tratamiento y la influencia de los agentes quimioterapéuticos usados en combinación con el procedimiento de tratamiento de la invención.

Óptimamente, los pacientes deberían ser evaluados en cuanto al nivel de antígeno STEAP-1 emitido circulante en suero para ayudar a la determinación del régimen posológico más eficaz y de los factores relacionados. Tales evaluaciones también se pueden usar para controlar los objetivos planteados durante la terapia, y también pueden ser útiles para medir el éxito terapéutico en combinación con la evaluación de otros parámetros (tales como los niveles de PSA en suero en una terapia contra el cáncer de próstata).

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Vacunas contra el cáncer

La presente revelación proporciona además vacunas contra el cáncer de próstata que comprenden una proteína STEAP-1 o un fragmento de la misma. El uso de un antígeno tumoral en una vacuna para generar inmunidad humoral y mediada por células para su uso en una terapia frente al cáncer es conocido en la técnica, y se ha empleado en el cáncer de próstata con el uso de inmunogenes de PSMA humanos y de PAP de roedor (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63: 231-237; Fong et al., 1997. J. Immunol: 159: 3113-3117). Es posible poner tales procedimientos fácilmente en práctica empleando una proteína STEAP-1, o un fragmento de la misma, o una molécula de ácido nucleico que codifique STEAP-1 y vectores recombinantes capaces de expresar y presentar apropiadamente el inmunógeno de STEAP-1.

Por ejemplo, se pueden usar sistemas de administración de genes víricos para administrar una molécula de ácido nucleico que codifica STEAP-1. Los diversos sistemas de administración de genes víricos que se pueden usar en la práctica de este aspecto de la presente revelación incluyen el, pero no se limitan al, virus de la viruela, de la viruela aviar, de la viruela del canario, adenovirus, gripe, poliovirus, virus adeno-asociado, lentivirus y virus Sindbus (Restifo, 1996. Curr. Opin. Immunol 8: 658-663). También se pueden emplear sistemas de administración no víricos usando ADN desnudo que codifica una proteína STEAP-1 o un fragmento de la misma introducidos en el paciente (por ejemplo, intramuscularmente) para inducir una respuesta anti-tumoral. En una realización, se puede emplear el ADNc de STEAP-1 humana de longitud completa. En otra realización, se pueden emplear moléculas de ácido nucleico de STEAP-1 que codifican epítopos de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos. Los epítopos de CTL se pueden determinar usando algoritmos específicos (por ejemplo, Epimer. Brown University) para identificar péptidos en una proteína STEAP-1 que sean capaces de unirse óptimamente con alelos de HLA especificados.

También se pueden emplear diversas estrategias ex vivo. Un enfoque implica el uso de células dendríticas para presentar un antígeno STEAP-1 al sistema inmune de un paciente. Las células dendríticas expresan el CPH de clase I y II, el coestimulador B7 e IL-12, y son por tanto células que presentan antígenos muy especializados. En el cáncer de próstata, las células dendríticas autólogas pulsadas con péptidos del antígeno específico de la membrana de la próstata (PSMA) se están usando en una prueba clínica en fase I para estimular los sistemas inmunes de pacientes de cáncer (Tjoa et al., 1996, Prostate 28: 65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29: 371-380). Las células dendríticas se pueden usar para presentar péptidos STEAP-1 en células T en el contexto de la molécula del CPH de clase I y II. En una realización, se pulsan células dendríticas autólogas con péptidos STEAP-1 capaces de unirse con moléculas del CPH. En otra realización, las células dendríticas son pulsadas con la proteína STEAP-1 completa. Otra realización más implica diseñar genéticamente la sobre-expresión del gen STEAP-1 en células dendríticas usando diversos vectores de aplicación conocidos en la técnica, tales como adenovirus (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4: 17-25), retrovirus (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56: 3763-3770), lentivirus, virus adeno-asociado, transfección de ADN (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57: 2865-2869) y tranfección de ARN derivado del tumor (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med 186:1177-1182).

También se pueden usar anticuerpos anti-STEAP-1 anti-idiotípicos en la terapia contra el cáncer como vacuna para inducir una respuesta inmune en células que expresan una proteína STEAP-1. Específicamente, la generación de anticuerpos anti-idiotípicos se conoce en la técnica y se puede adaptar fácilmente a la generación de anticuerpos anti-STEAP-1 anti-idiotípicos que imiten un epítopo en una proteína STEAP-1 (véase, por ejemplo, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J Clin Invest 96: 334-342; Herlyn et al., 1996. Cancer Immunol Immunother 43: 65-76). Es posible usar tal anticuerpo anti-idiotípico en terapia anti-idiotípica como la que se emplea actualmente con otros anticuerpos anti-idiotípicos dirigidos contra antígenos tumorales.

Se pueden emplear procedimientos de inmunización genética para generar respuestas profilácticas o humorales terapéuticas e inmunes celulares dirigidas contra células cancerosas que expresan STEAP-1. Se pueden inyectar directamente en el músculo o en la piel de un individuo constructos que comprenden ADN que codifica una proteína/un inmunógeno STEAP-1 y secuencias apropiadas reguladoras, tal que las células del músculo o de la piel incorporen el constructo y expresen la proteína/el inmunógeno STEAP-1 codificado. La expresión del inmunógeno de la proteína STEAP-1 resulta en la generación de una inmunidad profiláctica o humoral terapéutica y celular frente al cáncer de próstata. Se pueden usar varias técnicas de inmunización genética terapéuticas y profilácticas conocidas en la técnica (para su consulta, véanse la información y las referencias publicadas en la dirección de Internet www.genweb.com).

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Equipos

Para el uso en las aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas descritas o sugeridas anteriormente, la presente revelación también proporciona equipos. Tales equipos pueden comprender un vehículo que esté dividido en compartimentos para recibir en confinamiento una o más formas de envase tales como viales, tubos, y similares, cada una de los cuales comprende uno de los elementos separados para ser usado en el procedimiento. Por ejemplo, una de las formas de envase puede comprender una sonda que es o puede ser detectablemente marcada. Tal sonda puede ser un anticuerpo o un polinucleótido específico de una proteína STEAP-1 o un gen STEAP-1 o un mensaje, respectivamente. Cuando el equipo utiliza la hibridación del ácido nucleico para detectar el ácido nucleico diana, el equipo también puede tener envases que contienen nucleótido(s) para la amplificación de la secuencia diana de ácidos nucleicos y/o un envase que comprenda formas de marcaje, como proteínas de unión a la biotina, tales como avidina o estreptavidina, unidas con una molécula indicadora, tal como un marcador enzimático, fluorescente, o radionucleotídico.

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Ejemplos

Varios aspectos de la presente revelación están mejor descritos e ilustrados mediante varios ejemplos que se presentan a continuación, ninguno de los cuales pretende limitar el alcance de la invención según lo reivindicado.

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Ejemplo 1 Aislamiento de fragmento de ADNc del gen STEAP-1 Materiales y procedimientos Líneas celulares y tejidos humanos

Todas las líneas celulares de cáncer humanas usadas en este estudio fueron obtenidas de la ATCC. Todas las líneas celulares se mantuvieron en OMEM con suero de ternero fetal al 10%. Las PrEC (células epiteliales primarias de la próstata) fueron obtenidas en Clonetics y se desarrollaron en medios PrEBM complementados con factores de crecimiento (Clonetics).

Todos los xenoinjertos de cáncer de próstata humanos fueron proporcionados inicialmente por Charles Sawyers (UCLA) (Klein et al., 1997). Los xenoinjertos LAPc-4 AD y LAPC-9 AD fueron pasados según lo habitual como pequeños pedazos de tejido a SCID macho receptores. Los xenoinjertos LAPC-4 Al y LAPC-9 Al se obtuvieron según lo descrito anteriormente (Klein et al., 1997) y se pasaron a ratones SCID macho castrados y hembra. Se obtuvo del paciente una muestra de tejido de hiperplasia prostática benigna.

Los tejidos humanos para el análisis del ARN y las proteínas se obtuvieron en el Centro de Tejidos Humanos (HTRC) de UCLA (Los Angeles, CA) y en GualTek, Inc. (Santa Barbara, CA).

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Aislamiento del ARN

Se homogenizaron el tejido tumoral y las líneas celulares en un reactivo Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) usando 10 ml/g de tejido o 10 ml/10^{8} células para aislar el ARN total. Se purificó el ARN de poli(A) del ARN total usando equipos Mini y Midi de ARNm Oligotex de Qiagen. Se cuantificaron el ARNm y el ARN total mediante análisis espectrofotométrico (D.O. 260/280 nm) y se analizaron mediante electroforesis sobre gel.

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Oligonucleótidos

Se usaron los siguientes oligonucleótidos purificados mediante CLAR:

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RSACDN (cebador de síntesis de ADNc):

5'TTTTGTACAAGCTT_{30}3'

(SEC ID N.º 22)

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Adaptador 1:

1

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Adaptador 2:

2

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Cebador de PCR 1:

5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3'

(SEC ID N.º 25)

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Cebador anidado (NP)1:

5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT3'

(SEC ID N.º 26)

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Cebador anidado (NP)2:

5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT3'

(SEC ID N.º 27)

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Hibridación sustractiva por supresión

La hibridación sustractiva por supresión (SSH) se usó para identificar los ADNc correspondientes a los genes que pueden estar sobre-regulados en el cáncer de próstata dependiente de andrógenos en comparación con la hiperplasia prostática benigna.

Los ADNc bicatenarios correspondientes al xenoinjerto LAPC AD (probador) y al tejido de HPB (conductor) se sintetizaron a partir de 2 \mug de ARN poli(A)+ aislado a partir del xenoinjerto y del tejido de HPB, según lo descrito anteriormente, usando el equipo de sustracción de ADNc seleccionado por PCR de CLONTECH y 1 ng de oligonucleótido RSACDN como cebador.

Las síntesis de la primera y de la segunda cadena se llevaron a cabo según lo descrito en el protocolo del manual de usuario del equipo (n.º de protocolo de Clontech PT1117-1, n.º de catálogo K1804-1). El ADNc resultante fue digerido con Rsa I durante 3 h a 37ºC. Se extrajo el ADNc digerido con fenol/cloroformo (1:1) y etanol precipitado.

Se generó el ADNc conductor (HPB) mediante la combinación en una proporción de 4 a 1 de ADNc de HPB digerido por Rsa I con ADNc digerido procedente de hígado de ratón para garantizar la sustracción de los genes murinos del ADNc probador (LAPC-4 AD).

El ADNc probador (LAPC-4 AD) fue generado por medio de la dilución de 1 \mul de ADNc de LAPS-4 AD digerido con RsaI (400 ng) en 5 \mul de agua. Se ligó entonces el ADNc diluido (2 \mul, 160 ng) con 2 \mul de adaptador 1 y adaptador 2 (10 \muM), en reacciones de unión separadas, en un volumen total de 10 \mul a 16ºC toda la noche, utilizando 400 u de ADN ligasa de T4 (CLONTECH). La unión fue terminada con 1 \mul de EDTA 0,2M y calentamiento a 72ºC durante
5 min.

La primera hibridación se realizó mediante la adición de 1,5 \mul (600 ng) de ADNc conductor a cada uno de los dos tubos que contenían 1,5 \mul (20 ng) de adaptador 1 y Adaptador 2 unidos al ADNc probador. En un volumen final de
4 \mul, se cubrieron las muestras con aceite mineral, se desnaturalizaron en un termociclador MJ Research a 98ºC durante 1,5 minutos, y luego se dejó que se hibridaran durante 8 h a 68ºC. Se mezclaron entonces las dos hibridaciones junto con 1 \mul más de ADNc conductor desnaturalizado recién preparado y se permitió su hibridación durante toda la noche a 68ºC. Se diluyó entonces la segunda hibridación en 200 \mul de Hepes 20 mM, pH 8,3; NaCl 50 mM, EDTA 0,2 mM, se calentó a 70ºC durante 7 min y se almacenó a -20ºC.

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Amplificación por PCR, Clonación y secuenciación de los Fragmentos Génicos Generados a partir de la SSH

Para la amplificación de los fragmentos génicos que resultan de las reaccione de SSH, se realizaron dos amplificaciones por PCR. En la primera reacción de PCR, se añadió 1 \mul de la mezcla final de hibridación diluida a 1 \mul de cebador de PCR 1 (10 \muM), 0,5 \mul de mezcla de dNTP (10 \muM), 2,5 \mul de tampón de reacción x 10 (CLONTECH) y 0,5 \mul de mezcla de 50 x ADNc polimerasa Advantage (CLONTECH) en un volumen final de 25 \mul. La PCR 1 fue realizada utilizando las siguientes condiciones: 75ºC durante 5 min., 94ºC durante 25 s., luego 27 ciclos de 94ºC durante 10 s., 66ºC durante 30 s., 72ºC durante 1,5 min. Se realizaron cinco reacciones de PCR primarias por separado para cada experimento. Los productos fueron reservados y diluidos 1:10 con agua. Para la reacción de PCR secundaria, se añadió 1 \mul procedente de la reacción de PCR primaria que había sido reservada y diluida a la misma mezcla de reacción usada durante la PCR 1, a excepción de que se usaron los cebadores NP1 y NP2 (10 \muM) en lugar del cebador de PCR 1. La PCR 2 se realizó utilizando 10-12 ciclos de 94ºC durante 10 s., 68ºC durante 30 s., 72ºC durante 1,5 minutos. Los productos de PCR se analizaron utilizando electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Los productos de PCR fueron insertados en el pCR2.1 utilizando el equipo de clonación del vector T/A (Invitrogen). Las E. coli transformadas fueron sometidas a selección azul/blanco y con ampicilina. Se recogieron las colonias de color blanco y se colocaron en placas de 96 pocillos para someterlas a crecimiento en medio de cultivo líquido durante toda la noche. Para la identificación de los insertos, la amplificación por PCR se realizó en 1 ml de cultivo bacteriano usando las condiciones de la PCR1 y con NP1 y NP2 como cebadores. Los productos de PCR fueron analizados usando electroforesis en gel de agarosa al 2%.

Los clones bacterianos se almacenaron en glicerol al 20% bajo el formato de 96 pocillos. El ADN del plásmido fue preparado, secuenciado y sometido a búsquedas de homología con otros ácidos nucleicos en las bases de datos GenBank, dBest y NCI-CGAP.

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Análisis de la expresión por RT-PCR

Los ADNc de la primera cadena fueron generados a partir de 1 \mug de ARNm con oligo(dT)12-18 como cebador usando el sistema de pre-amplificación Superscript de Gibco-BRL. Se usó el protocolo de los fabricantes, y se incluyó una incubación durante 50 min a 42ºC con transcriptasa inversa seguida por un tratamiento con RNasa H a 37ºC durante 20 min. Una vez completada la reacción, se aumentó el volumen hasta 200 \mul con agua antes de la normalización. Se obtuvieron en Clontech ADNc de la primera cadena de 16 tejidos humanos normales diferentes.

La normalización de los ADNc de la primera cadena de múltiples tejidos se realizó usando los cebadores 5'atatcgcc
gcgctcgtcgtcgacaa3' y 5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' para amplificar \beta-actina. Se amplificó el ADNc de la primera cadena (5 \mul) en un volumen total de 50 \mul que contenía cebadores 0,4 \muM, 0,2 \muM de cada dNTP, 1 x tampón de PCR (Clontech, Tris-HCl 10 mM; MgCl_{2} 1,5 mM; KCl 50 mM, pH 8,3) y 1 x ADN polimerasa de Klentaq (Clontech). Se retiraron cinco \mul de la reacción PCR en los ciclos 18, 20 y 22, y se usaron para una electroforesis sobre gel de agarosa. La PCR se realizó usando un termociclador MJ Research en las siguientes condiciones: la desnaturalización inicial fue a 94ºC durante 15 s., seguida por los ciclos 18, 20 y 22 de 94ºC durante 15 s., 66ºC durante 2 min, 72ºC durante 5 s. Se llevó a cabo un alargamiento final a 72ºC durante 2 min. Tras la electroforesis sobre gel de agarosa, se compararon las intensidades de las bandas de \beta-actina de 283 pb de múltiples tejidos mediante inspección ocular. Se calcularon los factores de dilución para los ADNc de la primera cadena para dar como resultado intensidades de bandas de \beta-actina iguales en todos los tejidos tras 22 ciclos de PCR. Fueron necesarias tres series de normalización para alcanzar intensidades de banda iguales en todos los tejidos tras 22 ciclos de PCR.

Para determinar los niveles de expresión del gen 8P1D4, se analizaron 5 \mul del ADNc de la primera cadena normalizado por PCR usando 25, 30 y 35 ciclos de amplificación usando los siguientes pares de cebadores, que fueron diseñados con la ayuda de MIT (Para más información, véase www.genome.wi.mitedu):

5' ACT TTG TTG ATG ACC AGG A TT GGA 3'	(SEC ID N.º 28)
5' CAG AAC TTC AGC ACA CAC AGG AAC 3'	(SEC ID N.º 29)

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Se realizó un análisis semi-cuantitativo de la expresión mediante la comparación de los productos PCR en los números de ciclo que proporcionaron intensidades de banda ligeras.

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Resultados

Los experimentos de SSH fueron realizados según lo descrito en el apartado de Materiales y Procedimientos, más arriba, y conducen al aislamiento de numerosos clones de fragmentos génicos candidatos. Todos los clones candidatos fueron secuenciados y sometidos al análisis de homología en comparación con todas las secuencias en las principales bases de datos génicas y de EST con la finalidad de proporcionar información acerca de la identidad del correspondiente gen y ayudar a guiar la decisión de analizar un gen en particular durante la expresión diferencial. En general, los fragmentos génicos que no tenían homología con ninguna de las secuencias conocidas en cualquiera de las bases de datos consultadas, considerados, por tanto, representantes de genes novedosos, así como los fragmentos génicos que mostraron homología con marcadores de secuencias expresadas previamente secuenciadas (EST), fueron sometidos a análisis de expresión diferencial por RT-PCR y/o análisis Northern.

Uno de los clones de ADNc, denominado 8P1D4, era de una longitud de 436 pb y mostró homología con una secuencia de EST de la base de datos de genes tumorales NCI-CGAP. El ADNc de longitud completa que codifica el gen 8P1D4 fue posteriormente aislado usando este ADNc y renombrado como STEAP-1 (Ejemplo 2, más adelante). La secuencia de nucleótidos del ADNc de 8P1D4 corresponde a los residuos de nucleótido 150 a 585 de la secuencia de ADNc de STEAP-1 según lo mostrado en la Fig. 1A. Otro clon, denominado 28P3E1, de una longitud de 561 pb, mostró homología con un número de secuencia de EST de la base de datos de genes tumorales NCI-CGAP o de otras bases de datos. Parte de la secuencia de 28P3E1 (356 pb) es idéntica a un EST derivado de tejido fetal humano. Una vez obtenido y secuenciado el ADNc de longitud completa de STEAP-1, se hizo evidente que este clon también corresponde a STEAP-1 (más específicamente, a los residuos 622 hasta el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de STEAP-1 según lo mostrado en la Fig. 1A).

El análisis de expresión diferencial por RT-PCR en el que se usaron los cebadores derivados del clon de ADNc de 8P1D4 mostró que el gen 8P1D4 (STEAP-1) se expresa a niveles aproximadamente iguales en la próstata normal y en los xenoinjertos LAPC-4 y LAPC-9 (Fig. 2, grupo A). Otro análisis de expresión por RT-PCR de los ADNc de la primera cadena de 16 tejidos normales mostró los mayores niveles de expresión de 8P1D4 en la próstata. Se pudo detectar una expresión de un nivel sustancialmente inferior en otros varios tejidos normales (es decir, colon, ovario, intestino delgado, bazo y testículos) solo a los 30 ciclos de amplificación en cerebro, páncreas, colon e intestino delgado (Fig. 2, grupos B y C).

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Ejemplo 2 Aislamiento de ADNc de longitud completa codificante de STEAP-1

Se usó el fragmento del gen 8P1D4 de 436 pb (Ejemplo 1) para aislar más ADNc codificantes del gen
8P1D4/STEAP-1. En síntesis, se evaluó selectivamente un banco de ADNc de próstata humanos (Clontech) con una sonda marcada generada a partir de ADNc de 8P1D4 de 436 pb. Uno de los clones positivos, el clon 10, es de una longitud de 1195 pb y codifica una proteína de 339 aminoácidos que tiene secuencias de nucleótidos y aminoácidos codificadas que no portan una homología significativa con ninguno de los genes o proteínas humanos conocidos (homología con una proteína de lesión de riñón de rata recientemente descrita en la solicitud internacional W098/53071). La proteína codificada contiene al menos 6 motivos transmembrana predichos que implican una orientación hacia la superficie celular (véase la Fig. 1A, motivos transmembrana predichos subrayados). Estas características estructurales conducen a la denominación de "STEAP" como " Six Transmembrane Epithetial Antigens of the Prostate". La identificación posterior de otras proteínas STEAP condujo a la redenominación del producto génico 8P1D4 como "STEAP-1". Las Secuencias de ADNc y de aminoácidos codificadas de STEAP-1 se muestran en la Fig. 1A y se corresponden con las SEC ID N.º 1 y 2, respectivamente. El clon 10 del ADNc de STEAP-1 fue depositado en la colección de cultivos tipo americana ("ATCC") (Mannassas, VA) como el clon 10.1 del plásmido 8P1D4 el 26 de agosto de 1998 con el número de acceso a la ATCC: 98849. Se puede separar el clon de ADNc de STEAP-1 de la misma usando una digestión doble con EcoRI/XbaI (EcoRI en el extremo 5' y XbaI en el extremo 3').

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Ejemplo 3 Análisis de la expresión del gen y de la proteína STEAP-1

Para comenzar la caracterización de las características biológicas de STEAP-1, se realizó una amplia evaluación de la expresión del ARNm de STEAP-1 y de la proteína STEAP-1 en una variedad de muestras de tejido humano. Esta evaluación incluyó la transferencia Northern, la transferencia Western y el análisis inmunohistoquímico de la expresión de STEAP-1 en un gran número de tejidos humanos normales, xenoinjertos y líneas celulares de cáncer de próstata humanos, y otras diversas líneas celulares humanas de cáncer.

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Ejemplo 3A

Análisis de transferencia Northern de la expresión del ARNm de STEAP-1 en tejidos humanos normales

El análisis inicial de la expresión del ARNm de STEAP-1 en tejidos humanos normales fue llevado a cabo por medio del transferencia Northern de dos pruebas de tejido múltiple obtenidas de Clontech (Palo Alto, California), que comprendían un total de 16 tejidos humanos normales diferentes, usando el clon 10 de STEAP-1 como sonda. Las muestras de ARN fueron normalizadas de forma cuantitativa con una sonda \beta-actina. En la Fig. 3A, se muestran los resultados. El nivel de expresión más elevado fue detectado en la próstata normal, detectándose un nivel de expresión aproximadamente 5-10 veces menor en el colon y el hígado. Estas transferencias Northern mostraron dos transcriptos de aproximadamente 1,4 kb y 4,0 kb, el primero de los cuales corresponde al ADNc de longitud completa del clon 10 de STEAP-1, que codifica el marco de lectura abierto entero de STEAP-1. El transcripto más largo fue clonado por separado como un ADNc de 3627 pb de un banco de próstata normal, cuya secuencia contiene un intrón de 2399 pb (Fig. 4).

Se amplió este análisis inicial usando la sonda del clon 10 de STEAP-1 para analizar una matriz de transferencia de puntos de ARN de 37 tejidos humanos normales (Clontech, Palo Alto, CA; Human Master Blot^{TM}). En la Fig. 3B, se muestran los resultados, que presentan una fuerte expresión de STEAP-1 sólo en próstata. Se detectó un nivel muy bajo de expresión de ARN de STEAP-1 en tejido de hígado, pulmón, tráquea e hígado fetal, a un nivel quizás 5 veces inferior al de la próstata. No se detectó expresión en ninguno de los tejidos restantes. Basándose en estos análisis, parece que la expresión de STEAP-1 significativa es específica de la próstata en tejidos normales.

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Ejemplo 3B

Análisis por transferencia Northern de la expresión de ARNm de STEAP-1 en xenoinjertos y líneas celulares de cáncer de próstata

Para analizar la expresión de STEAP-1 en tejidos y líneas celulares humanos de cáncer, se analizaron ARN derivados de xenoinjertos de cáncer de próstata humanos y un amplio grupo de líneas celulares cancerosas y no cancerosas de próstata mediante transferencia Northern usando el clon 10 de ADNc de STEAP-1 como sonda. Todas las muestras de ARN fueron normalizadas cuantitativamente mediante tinción con bromuro de etidio y el posterior análisis con una sonda de \beta-actina marcada.

Los resultados, presentados en la Fig. 5, muestran un nivel elevado de expresión de STEAP-1 en todos los xenoinjertos LAPC y en todas las líneas celulares de cáncer de próstata. La expresión en los xenoinjertos LAPC-9 fue superior en comparación con los xenoinjertos LAPC-4, sin que se observara una diferencia significativa entre las sublíneas dependientes de andrógenos y las independientes de andrógenos (Fig. 5A). La expresión en el xenoinjerto LAPC-4 fue comparable con la expresión en la próstata normal. Se detectaron niveles inferiores de expresión en células PrEC (Clonetics), que representan el compartimiento celular basal de la próstata. Los análisis de las líneas celulares de cáncer de próstata mostraron los niveles de expresión más elevados en LNCaP, una línea celular de carcinoma de próstata dependiente de andrógenos. También se detectó una expresión significativa en las líneas celulares independientes de andrógenos PC-3 y OU145. Además se detectaron niveles elevados de expresión de STEAP en tumores de LAPC-4 y LAPC-9 que fueron desarrollados en la tibia de ratones como un modelo de la metástasis ósea del cáncer de próstata (Fig. 5B).

Significativamente, también se detectó una expresión de STEAP-1 muy fuerte en muchas de las líneas celulares humanas de cáncer no de próstata analizadas (Fig. 5A). Particularmente, se observó un nivel alto de expresión en células RD-ES, una línea celular derivada del sarcoma de Ewing (EWS). Además, se detectó un nivel muy elevado de expresión en varias líneas celulares de cáncer de colon (por ejemplo, CaCo-2, LoVo, T84 y Colo-205), líneas celulares de carcinoma de vejiga (por ejemplo, SCABER, UM-UC-3, TCCSUP y 5637), líneas celulares de cáncer de ovario (por ejemplo, OV-1063 y SW 626) Y líneas celulares de cáncer pancréatico (por ejemplo, HPAC, Capan-1, PANC-1 y BxPC-3). Estos resultados, combinados con la ausencia de una expresión fuerte en los correspondientes tejidos normales (Fig. 3), indican que STEAP-1 puede estar generalmente sobre-regulada en estos tipos (así como en otros tipos) de cánceres humanos.

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Ejemplo 3C

Análisis de transferencia Western de la expresión de la proteína STEAP-1 en cáncer de próstata y otros cánceres

Se sintetizó un péptido 15-mérico correspondiente a los residuos de aminoácido 14 a 28 de la secuencia de aminoácidos de STEAP-1 según lo mostrado en la Fig. 1A (WKMKPRRNLEEDDYL) (SEC ID N.º 30), y se usó para inmunizar ovejas para generar los anticuerpos policlonales de las ovejas frente al terminal amino de la proteína (anti-STEAP-1) como se explica a continuación. Se conjugó el péptido con KLH (hemocianina de lapa californiana). Se inmunizó inicialmente a la oveja con 400 \mug de péptido en adyuvante completo de Freund. Se volvieron a administrar al animal posteriormente cada dos semanas 200 \mug de péptido en adyuvante incompleto de Freund. Se purificó por afinidad el anticuerpo anti-STEAP del suero de oveja usando péptido STEAP unido con Affigel 10 (Bio Rad). Se almacena el anticuerpo purificado en solución salina tamponada con fosfato con azida de sodio al 0,1%.

Para probar la especificidad del anticuerpo, se clonó ADN de STEAP en un vector de expresión retroviral
(pSR\alphatkneo, Muller et al., 1991, MCB 11:1785). Se infectaron células NIH 3T3 con retrovirus que codifican STEAP-1 y se seleccionaron en G418 durante 2 semanas. Los análisis de transferencia Western de extractos proteicos de células NIH 3T3 infectadas y no infectadas mostraron la expresión de una proteína con un peso molecular aparente de 36 kD, sólo en las células infectadas (Fig. 6, carriles marcados con "3T3 STEAP" y "3T3").

Se usó el anticuerpo policlonal anti-STEAP-1 para sondar transferencias Western de lisados celulares preparados a partir de una variedad de tejidos de xenoinjertos de cáncer de próstata, líneas celulares de cáncer de próstata u otras líneas celulares de cáncer no de próstata. Se normalizaron cuantitativamente las muestras de proteínas (20 \mug cada una) sondando las transferencias con un anticuerpo anti-Grb-2.

En la Fig. 6, se muestran los resultados. La proteína STEAP-1 fue detectada en todos los xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC, en todas las líneas celulares de cáncer de próstata, en una muestra de cáncer de próstata primario y en su control de próstata normal comparado. La mayor expresión de la proteína STEAP-1 fue detectada en el xenoinjerto LAPC-9 y en las células LNCaP, coincidiendo con los análisis de transferencia Northern descritos inmediatamente antes. También se observó un alto nivel de expresión en la línea celular de carcinoma de vejiga UM-UC-3. También se detectó la expresión en otras líneas celulares de cáncer (Fig. 6).

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Ejemplo 3D

Análisis inmunohistoquímico de la expresión de la proteína STEAP-1 en muestras quirúrgicas y de biopsia de tumores de próstata

Para determinar la extensión de la expresión de la proteína STEAP-1 en materiales clínicos, se prepararon secciones tisulares a partir de una variedad de biopsias y muestras quirúrgicas de cáncer de próstata para su análisis inmunohistoquímico. Los tejidos fueron fijados en formalina al 10%, introducidos en parafina y seccionados según el protocolo estándar. Se usaron secciones cubiertas por parafina y fijadas en formalina de células LNCaP como control positivo. Se tiñeron las secciones con un anticuerpo policlonal anti-STEAP-1 dirigido frente al epítopo N-terminal de STEAP-1 (según lo descrito inmediatamente antes). Se tiñeron las secciones de LNCaP en presencia de una cantidad en exceso de inmunógeno del péptido N-terminal STEAP-1 usado para generar el anticuerpo policlonal (péptido 1) o un péptido inespecífico derivado de una región distinta de la proteína STEAP (péptido 2; YQQVQQNKEDAWIEH) (SEC ID N.º 31).

En la Fig. 8, se muestran los resultados. Las células LNCaP mostraron una tinción peri-celular uniformemente fuerte en todas las células (Fig. 8b). El péptido N-terminal STEAP en exceso (péptido 1) fue capaz de inhibir competitivamente la tinción del anticuerpo (Fig. 8a), mientras que el péptido 2 no tuvo efecto (Fig. 8b). De manera similar, se observó una tinción peri-celular uniformemente fuerte en los xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC-9 (Fig. 8f) y LAPC-4 (datos no mostrados). Estos resultados son claros y sugieren que la tinción es específica de STEAP. Además, estos resultados localizan visualmente STEAP en la membrana plasmática, lo que corrobora los hallazgos bioquímicos presentados en el ejemplo 4 que se presenta a continuación.

Los resultados obtenidos con las diversas muestras clínicas se muestran en la Fig. 8c (tejido de próstata normal), la Fig. 8d (carcinoma prostático de grado 3) y la Fig. 8e (carcinoma prostático de grado 4), y también se incluyen en los resultados resumidos mostrados en la Tabla 1. Se observó una tinción de ligera a fuerte en los epitelios glandulares de todas las muestras de cáncer de próstata analizadas, así como en todas las muestras obtenidas a partir de próstata normal o de la enfermedad benigna. La señal parece ser más fuerte en la membrana celular de las células epiteliales, especialmente, en las uniones entre células (Fig. 8c, d y e) y también se inhibe con un exceso de péptido 1 N-terminal STEAP (datos no mostrados). También se observa alguna tinción de las células basales en la próstata normal (Fig. 8c), que se hace más evidente al examinar las glándulas atróficas (datos no mostrados). STEAP-1 parece estar expresada en todos los estadios del cáncer de próstata, pues tanto los grados más bajos (Fig. 8d), como los grados más altos (Fig. 8e) y el cáncer de próstata metastásico (representado por LAPC-9; Fig. 8f) presentan una tinción fuerte.

La tinción inmunohistoquímica de un gran grupo de tejidos no prostáticos normales mostró una expresión de STEAP-1 no detectable en 24 de 27 de estos tejidos normales (Tabla 1). Sólo tres muestras de tejido mostraron cierto grado de tinción anti-STEAP-1. En concreto, la vejiga normal presentó niveles bajos de tinción de la superficie celular del epitelio de transición (Fig. 8g). El páncreas y la pituitaria mostraron niveles bajos de tinción citoplasmática (Tabla 1). No está claro si la tinción citoplasmática observada es específica o se debe a una unión inespecífica del anticuerpo, pues la trasferencia Northern mostró una expresión de STEAP-1 escasa a nula en el páncreas (Fig. 3). El colon normal, que presentó niveles de ARNm más elevados que el páncreas mediante transferencia Northern (Fig. 3), presentó una tinción no detectable con los anticuerpos anti-STEAP (Fig. 8h). Estos resultados indican que la expresión en la superficie celular de STEAP-1 en tejidos normales parece estar restringida a la próstata y a la vejiga.

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TABLA 1 Tinción inmunohistoquímica de tejidos humanos con anticuerpo policlonal anti-STEAP-1

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Ejemplo 4 Caracterización bioquímica de la proteína STEAP-1

Para caracterizar inicialmente la proteína STEAP-1, se clonó el clon 10 de ADNc (SEC ID N.º 1) en el plásmido de Myc-His pcDNA 3.1 (Invitrogen), que codifica un marcador de 6His en el terminal carboxilo, se transfectó en células 293T y se analizó por citometría de flujo usando anticuerpo monoclonal anti-His (sonda de His, Santa Cruz), así como el anticuerpo policlonal anti-STEAP-1 anteriormente descrito. La tinción de las células se realizó sobre una célula intacta, así como en células permeabilizadas. Los resultados indicaron que sólo las células permeabilizadas se tiñeron con ambos anticuerpos, lo que sugiere que ambos terminales de la proteína STEAP-1 están localizados intracelularmente. Por lo tanto, es posible que uno o más de los terminales de la proteína STEAP-1 estén asociados con orgánulos intracelulares en lugar de con la membrana plasmática.

Para determinar si la proteína STEAP-1 se expresa en la superficie celular, se marcaron células 293T transfectadas en STEAP-1 con un reactivo de biotinilación que no se introduce en las células vivas. Entonces se sometió STEAP-1 a una inmunoprecipitación desde extractos celulares usando anticuepos anti-His y anti-STEAP. Se inmunoprecipitaron el antígeno T grande de SV40, una proteína intracelular que se expresa a niveles elevados en las células 293T, y el receptor endógeno de la transferrina de la superficie celular como controles negativo y positivo, respectivamente. Tras la inmunoprecipitación, se transfirieron las proteínas a una membrana y se visualizaron con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. En la Fig. 7, se muestran los resultados de este análisis. Sólo se marcaron con biotina el receptor de la transferrina (control positivo) y STEAP-1, mientras que el antígeno T grande de SV40 (control negativo) no se marcó detectablemente (Fig. 7A). Como sólo se marcan las proteínas de la superficie celular con esta técnica, es evidente, a partir de estos resultados, que STEAP-1 es una proteína de la superficie celular. En combinación con los resultados obtenidos en el análisis de la citometría de flujo, es evidente que STEAP-1 es una proteína de la superficie celular con terminales amino y carboxilo intracelulares.

Además, los resultados anteriores junto con las predicciones sobre la estructura secundaria de STEAP-1 muestran que STEAP es una proteína de membrana de tipo IIIa con una topología molecular de seis posibles dominios transmembrana, 3 bucles extracelulares y 2 bucles intracelulares, y dos terminales intracelulares. En la Fig. 1B, se muestra una representación esquemática de la topología de la proteína STEAP-1 en relación con la membrana celular.

Además, se analizaron células de cáncer de próstata, vejiga y colon directamente para la expresión de STEAP-1 en la superficie celular mediante estudios de biotinilación. En síntesis, se purificaron por afinidad proteínas de la superficie celular biotiniladas con gel de estreptavidina y se sondaron con el anticuerpo policlonal anti-STEAP-1 descrito anteriormente. La transferencia Western de las proteínas purificadas con estreptavidina muestra claramente la biotinilación de la superficie celular de STEAP-1 endógena en todas las células analizadas de cáncer de próstata (LNCaP, PC-3, DU145), vejiga (UM-UC-3, TCCSUP) y colon (LoVo, Colo), así como en las células NIH 3T3 infectadas con un retrovirus codificante de STEAP-1, pero no en las células NIH 3T3 no expresadoras usadas como control negativo (Fig. 7B). En otro control negativo, no se detectó la proteína STEAP-1 en precipitados de estreptavidina de células que no expresaban la STEAP biotinilada (Fig. 7B).

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Ejemplo 5 Identificación y análisis estructural de STEAP-2 y otros miembros de la familia STEAP humana

STEAP-1 no tiene homología con ningún gen humano conocido. En un intento por identificar más genes que fueran homólogos con STEAP-1, se usó la secuencia de la proteína STEAP-1 como sonda electrónica para identificar los miembros de la familia en la base de datos de EST (marcadores de secuencias de expresión) de acceso público (dbest). Se realizó la consulta sobre la secuencia de la proteína STEAP-1 en la base de datos dbest usando la función "tblastn" de NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica). Este análisis reveló más homólogos putativos de STEAP-1 o miembros de la familia STEAP, como se describe más detalladamente a continuación.

Además, los experimentos de clonación de los solicitantes también identificaron un fragmento de ADNc obtenido mediante SSH relacionado con STEAP-1, el clon 98P486. Este clon fue aislado de la clonación por SSH usando ADNc de próstata normal como probador y ADNc de LAPC-4 AD como conductor. Posteriormente, se aisló una gran secuencia parcial del clon 98P4B6 de un banco de próstata normal; este clon codifica un ORF de 173 aminoácidos con homología con la estructura primaria de STEAP-1, siendo por tanto denominada STEAP-2.

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En la Fig. 9, se muestra la secuencia de nucleótidos parcial de STEAP-2 y la secuencia de aminoácidos del ORF codificada. En la fig. 11A, se muestra un alineamiento de los aminoácidos de las estructuras primarias de STEAP-1 y STEAP-2 parcial. STEAP-1 y STEAP-2 comparten una identidad del 61% por su solapamiento de 171 residuos de aminoácido (Fig. 11A). A pesar de su homología, STEAP-1 y STEAP-2 muestran patrones de expresión significativamente divergentes en tejidos y células normales y cancerosos, y también se mapean en diferentes ubicaciones sobre los brazos opuestos del cromosoma 7 humano (véanse los ejemplos 6 y 7 que se presentan a continuación).

Dos EST identificados mediante sondado electrónico con la secuencia de la proteína STEAP-1, Al139607 y R80991, codifican los ORF que portan una estrecha homología con las secuencias de STEAP y STEAP-2, y parecen por tanto representar dos STEAP más. Sus secuencias de nucleótidos se reproducen en la Fig. 10 y sus secuencias de aminoácidos de tipo STEAP del ORF codificadas se muestran en la Fig. 118. Los ORF codificados por estos EST son únicos, pero muestran relaciones estructurales muy claras tanto con STEAP-1 como con STEAP-2, particularmente, en los dominios transmembrana conservados. Por consiguiente, estos EST parecen corresponder a miembros de la familia STEAP distintos y han sido, por tanto, designados STEAP-3 (correspondiente a la STEAP Al139607) y STEAP-4 (correspondiente a R80991).

En la fig. 11B, se muestra una alineación de los aminoácidos de la secuencia de la proteína STEAP-1 completa con las secuencias de los aminoácidos de STEAP-2, STEAP-3 y STEAP-4 parciales. Este alineamiento muestra una similitud estructural entre las cuatro proteínas de la familia STEAP, particularmente, en los dominios transmembrana predichos, incluso a pesar de contar únicamente con la información de las secuencias parciales de las tres. Las proteínas STEAP-3 y STEAP-4 parecen estar más estrechamente relacionadas con STEAP-2 que con STEAP-1 o que entre sí. Específicamente, STEAP-3 presenta una identidad del 50% y una homología del 69% con STEAP-2, frente al 37% de identidad y al 63% de homología que muestra con STEAP-1. STEAP-4 presenta una identidad del 56% y una homología del 87% con STEAP-2, frente al 42% de identidad y al 65% de homología que muestra con STEAP-1. STEAP-3 y STEAP-4 son un 38% idénticas y un 57% homólogas entre sí. Estas cifras son estimaciones basadas en la información de las secuencias incompletas. Sin embargo, estas cifras sugieren la conservación de al menos alguno de los dominios transmembrana, lo que sugiere características topológicas comunes, si no características funcionales.

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Ejemplo 6 Análisis de la expresión de STEAP-2 Y otros miembros de la familia STEAP humana

Ejemplo 6A

Expresión específica de un tejido de los miembros de la familia STEAP en tejidos humanos normales

El análisis de la expresión de los miembros de la familia STEAP en tejidos normales se realizó mediante RT-PCR. Todos los miembros de la familia STEAP parecen presentar patrones de expresión restringidos a determinados tejidos. La expresión de Al139607 se detecta en placenta y en próstata tras 25 ciclos de amplificación (Fig. 12). Tras 30 ciclos, la expresión de Al139607 también se detecta en otros tejidos. La mayor expresión de R80991 se detecta en hígado normal, aunque también se detecta expresión en otros tejidos tras 30 ciclos de amplificación (Fig. 13). No se detectó la expresión de R80991 ni de Al139607 en los xenoinjertos de cáncer próstata LAPC mediante la RT-PCR.

El análisis de RT-PCR de STEAP-2 muestra la expresión en todos los xenoinjertos de cáncer de próstata LAPC y en la próstata normal (Fig. 14, grupo A). El análisis de 8 tejidos humanos normales muestra la expresión específica de la próstata tras 25 ciclos de amplificación (Fig. 14, grupo B). Se detectó un nivel de expresión inferior en otros tejidos sólo tras 30 ciclos de amplificación. La transferencia Northern para STEAP-2 muestra un patrón de 2 transcriptos (de un tamaño de aproximadamente 3 y 8 kb) sólo expresado en próstata (y a niveles significativamente inferiores en el xenoinjerto LAPC) sin que se detectara la expresión en ninguno de los otros 15 tejidos humanos normales analizados (Fig. 15, grupo C). Por lo tanto, la expresión de STEAP-2 en los tejidos humanos normales parece ser muy específica de la próstata.

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Ejemplo 6B

Expresión de STEAP-2 en diversas líneas celulares de cáncer

Los anteriores resultados de la RT-PCR sugerían que los diferentes miembros de la familia STEAP presentan patrones de expresión en diferentes tejidos. Lo interesante es que STEAP-2, que parece ser muy específica de la próstata, parece ser expresada a niveles inferiores en los xenoinjertos LAPS. En esto es contraria a STEAP-1, que se expresa a un nivel elevado en tejido de próstata tanto normal como maligno.

Para caracterizar mejor esta diferencia sugerida en el perfil de expresión del cáncer de próstata de STEAP-2 (en comparación con STEAP-1), se realizó una transferencia Northern en ARN derivado de los xenoinjertos LAPC, así como varias líneas celulares de cáncer de próstata y de otros cánceres, usando una sonda específica de STEAP-2 (clon de ADNc marcado 98P486). En la Fig. 16, se muestran los resultados, que se pueden resumir según lo siguiente. STEAP-2 se expresa a un nivel elevado en la próstata normal y en algunos de los xenoinjertos y líneas celulares de cáncer de próstata. Más concretamente, se observó una expresión muy fuerte en el xenoinjerto LAPC-9 AD y en las células LNCaP. Se observó una expresión significativamente atenuada o nula en el resto de los xenoinjertos y las líneas celulares de cáncer de próstata. También se hizo evidente un nivel de expresión muy alto en la línea celular de sarcoma de Ewing RD-ES. A diferencia de STEAP-1, que se expresa a un nivel elevado en las líneas celulares de cáncer derivadas de tumores de vejiga, colon, páncreas y ovario, STEAP-2 muestra una expresión de baja a no detectable en estas mismas líneas celulares (comparar con la Fig. 5). Lo interesante es que STEAP-2 tampoco se detectó en las células PrEC, que son representativas del compartimiento de las células basales normales de la próstata. Estos resultados sugieren que la expresión de STEAP-1 y STEAP-2 está regulada de manera diferente. Mientras que STEAP-1 puede ser un gen que generalmente esté sobre-regulado en el cáncer, STEAP-2 puede ser un gen que está más restringido a la próstata normal y al cáncer de próstata.

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Ejemplo 7 Localización cromosómica de los genes STEAP

La localización cromosómica de STEAP-1 fue determinada usando el grupo de híbridos por radiación (RH) humanos/de hámster GeneBridge 4 (Walter et al., 1994, Nat. Genetics 7:22) (Research Genetics. Huntsville Al), mientras que STEAP-2 y los homólogos de STEAP fueron mapeados usando el grupo de híbridos por radiación Stanford G3 (Stewart et al., 1997, Genome Res. 7: 422).

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Se usaron los siguientes cebadores de PCR para STEAP-1:

8P1D4.1	5' ACTTTGTTGATGACCAGGATTGGA 3'	(SEC ID N.º 28)
8P1 D4.2	5' CAGAACTTCAGCACACACAGGAAC 3'	(SEC ID N.º 29)

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El vector de mapeo de STEAP-1 resultante para los 93 ADN del grupo de híbridos por radiación (210000020110101
000100000010111010122100011100111011010100010001000101001 021000001111001010-000) y el programa de mapeo disponible en la dirección de Internet http://www-genome.wi.mil.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl localizaron el gen STEAP-1 localizó al gen STEAP-1 en el cromosoma 7p22.3, telomérico a D7S531.

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Se usaron los siguientes cebadores de PCR para 98P4B6/STEAP-2:

98P4B6.1	5'GACTGAGCTGGAACTGGAATTTGT 3'	(SEC ID N.º 17)
98P4B6.2	5'TTTGAGGAGACTTCATCTCACTGG 3'	(SEC ID N.º 18)

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El vector resultante (000001001000000000000000000000001001000000000010001000 000000000010000-1010
1010010011) y el programa de mapeo disponible en la dirección de Internet <hftp://www-shgc.stanford.edu/RH/
rhserverformnew.html> mapea el gen 98P4B6 (STEAP-2) en el cromosoma 7q21.

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Se usaron los siguientes cebadores de PCR para Al139607:

Al139607.1	5'TT AGGACAACTTGATCACCAGCA 3'	(SEC ID N.º 13)
Al139607.2	5'TGTCCAGTCCAAACTGGGTTATTT3'	(SEC ID N.º 14)

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El vector resultante (00000000100000000000000000001000100000200000001000100000001000000-100010001
010000010) y el programa de mapeo disponible en la dirección de Internet <hftp://www-shgc.stanford.edu/RH/
rhserverformnew.html> mapea Al139607 en el cromosoma 7q21.

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Se usaron los siguientes cebadores de PCR para R80991:

R80991.3	5' ACAAGAGCCACCTCTGGGTGAA 3'	(SEC ID N.º 15)
R80991.4	5' AGTTGAGCGAGTTTGCAATGGAC 3'	(SEC ID N.º 16)

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El vector resultante (000000000002000010200000000100000000000000000000100000000010000111-00000001
001000001) y el programa de mapeo disponible en la dirección de Internet <hftp://www-shgc.stanford.edu/RH/
rhserverformnew.html> mapea R80991 en el cromosoma 2q14-q21, cerca de D2S2591.

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En resumen, los resultados anteriores muestran que tres de los miembros de la familia STEAP humana putativa se ubican en el cromosoma 7, como se representa esquemáticamente en la Fig. 17. En concreto, el gen STEAP-1 se localiza en la región fatelomérica del brazo corto del cromosoma 7, en 7p22.3, mientras que STEAP-2 y Al139607 se ubican en el brazo largo del cromosoma 7, en 7q21 (Fig. 17). R80991 se mapea en el cromosoma 2q14-q21.

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Ejemplo 8 Identificación de los límites intrón-exón de STEAP-1

Se identificaron clones genómicos para STEAP-1 buscando en el GenBank clones de BAC que contenían secuencias de STEAP-1, dando como resultado la identificación de los números de acceso AC004969 (PAC DJ1121E10) y AC005053 (BAC RG041D11). Usando las secuencias derivadas de los clones de PAC y BAC para STEAP, se definieron los límites intrón-exón (Fig. 18). Se identificó un total de 4 exones y 3 intrones en la región codificante del gen STEAP. Se pueden usar los conocimientos sobre la estructura exacta exón-intrón del gen STEAP-1 para diseñar cebadores en las secuencias intrónicas que, a su vez, puedan ser usados para la amplificación genómica de los exones. Tal amplificación permite el análisis de polimorfismos configuracionales de cadenas simples (SSCP) para buscar los polimorfismos asociados con el cáncer. Se pueden secuenciar exones mutantes o polimórficos y compararlos con las STEAP de tipo natural. Tales análisis pueden ser útiles en la identificación de pacientes que sean más susceptibles a padecer un cáncer de próstata agresivo, así como otros tipos de cáncer, particularmente, cánceres de colon, de vejiga, pancreático, de ovario, cervical y testicular.

El análisis de transferencia Southern muestra que el gen STEAP-1 existe en varias especies, incluyendo el ratón (Fig. 19). Por lo tanto, se evaluó selectivamente un banco de BAC de ratón (Mouse ES 129-V versión I, Genome Systems, FRAC-4431) con ADNc humano para STEAP-1 (clon 10, ejemplo 2). Se identificó un clon positivo, 12P11, y se confirmó mediante transferencia Southern (Fig. 20). La información sobre los límites intrón-exón para las STEAP humanas se puede usar para identificar las secuencias codificantes de la STEAP-1 de ratón.

Se puede usar el clon genómico de STEAP-1 de ratón para estudiar el papel biológico de STEAP-1 durante el desarrollo y la tumorigénesis. Específicamente, se puede insertar el clon de STEAP-1 genómico de ratón en un vector de un gen noqueado (K/O) para la perturbación dirigida del gen en los ratones, usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica. Además, se puede descubrir el papel de las STEAP en los procesos metabólicos y la función de las células epiteliales. Tales ratones K/O pueden ser cruzados con otros modelos de ratones con cáncer de próstata, tales como el modelo TRAMP (Greenberg et al., 1995, PNAS 92:3439), para determinar si STEAP influye en el desarrollo y en la progresión de cánceres de próstata más o menos agresivos y metastásicos.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9824893 A [0063]

\bullet WO 9816628 A, Sawyers [0092]

\bullet WO 9853071 A [0128]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

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Claims (41)

1. Utilización de un anticuerpo conjugado con una toxina o un agente terapéutico en la fabricación de un medicamento para un procedimiento terapéutico en el tratamiento del cáncer, en el que dicho anticuerpo:

(i) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o

(ii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido de al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o

(iii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido seleccionado entre la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 y SEC ID N.º 31; o

(iv) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que es al menos un 90% idéntico a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud; o

(v) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que se obtiene mediante el cultivo de una célula huésped que contiene un vector de expresión que contiene un polinucleótido (a) que tiene la secuencia mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1), en la que T también puede ser U, o (b) que codifica un polipéptido cuya secuencia está codificada por el ADNc contenido en el clon 10.1 del plásmido 8P1D4 depositado como ATCC 98849 o (c) que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma; o

(vi) tiñe inmunohistoquímicamente células 293T transfectadas con un plásmido de expresión que codifica y expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), pero no tiñe inmunohistoquímicamente células 293T no transfectadas.

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2. Utilización de un anticuerpo en la fabricación de un agente para su uso in vivo en un análisis de diagnóstico o de pronóstico, o en una metodología de generación de imágenes en relación con el cáncer, en el que dicho anticuerpo:

(i) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o

(ii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido de al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o

(iii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido seleccionado entre la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 y SEC ID N.º 31; o

(iv) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que es al menos un 90% idéntico a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud; o

(v) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que se obtiene mediante el cultivo de una célula huésped que contiene un vector de expresión que contiene un polinucleótido (a) que tiene la secuencia mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1), en la que T también puede ser U, o (b) que codifica un polipéptido cuya secuencia está codificada por el ADNc contenido en el clon 10.1 del plásmido 8P1D4 depositado como ATCC 98849 o (c) que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma; o

(vi) tiñe inmunohistoquímicamente células 293T transfectadas con un plásmido de expresión que codifica y expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), pero no tiñe inmunohistoquímicamente células 293T no transfectadas.

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3. Utilización de un anticuerpo en un análisis de diagnóstico o de pronóstico, o en una metodología de generación de imágenes ex vivo en relación con el cáncer, en el que dicho anticuerpo:

(i) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o

(ii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido de al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o

(iii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido seleccionado entre la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 y SEC ID N.º 31; o

(iv) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que es al menos un 90% idéntico a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud;

(v) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que se obtiene mediante el cultivo de una célula huésped que contiene un vector de expresión que contiene un polinucleótido (a) que tiene la secuencia mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1), en la que T también puede ser U, o (b) que codifica un polipéptido cuya secuencia está codificada por el ADNc contenido en el clon del plásmido 10.1 8P1D4 depositado como ATCC 98849 o (c) que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma; o

(vi) tiñe inmunohistoquímicamente células 293T transfectadas con un plásmido de expresión que codifica y expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), pero no tiñe inmunohistoquímicamente células 293T no transfectadas.

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4. Utilización según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que el anticuerpo está marcado con un marcador detectable.

5. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cáncer es cáncer de próstata, de colon, de mama, cervical, de vejiga, de ovario, testicular o pancreático, o sarcoma de Ewing o cáncer metastásico en el hueso, el pulmón, el hígado, el cerebro o el nódulo linfático.

6. Utilización según la reivindicación 5, en el que el cáncer es cáncer de próstata.

7. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cáncer es cáncer metas-
tásico.

8. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas células 293T están transfectadas con un plásmido de expresión que contiene el ADNc contenido en el clon 10.1 del plásmido 8P1D4 depositado como ATCC 98849.

9. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

10. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

11. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo se une con un dominio extracelular del polipéptido de la Fig. 1A (SEC ID N.º 2).

12. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que emplea una combinación de dichos anticuerpos diferentes.

13. Análisis para detectar en una muestra biológica la presencia de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, la SEC ID N.º 20, la SEC ID N.º 21, la SEC ID N.º 30 o la SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud; cuyo procedimiento comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido recombinante que comprende el dominio de unión antigénica de un anticuerpo monoclonal que se une específicamente con dicho polipéptido, y detectar la unión de dicho polipéptido de la muestra con el mismo.

14. Análisis para detectar en una muestra biológica la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, la SEC ID N.º 20, la SEC ID N.º 21, la SEC ID N.º 30 o la SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud; cuyo procedimiento comprende:

(a) poner en contacto la muestra con una sonda de polinucleótido que se hibrida específicamente con el ADNc contenido en el plásmido 8P1D4 depositado como ATCC 98849, o el polinucleótido mostrado en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1) o los complementos de los mismos;

(b) detectar la presencia de un complejo de hibridación formado mediante la hibridación de la sonda con un polinucleótido en la muestra, indicando la presencia del complejo de hibridación la presencia de un dicho polinucleótido codificante en la muestra.

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15. Análisis para detectar la presencia de ARNm que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, la SEC ID N.º 20, la SEC ID N.º 21, la SEC ID N.º 30 o la SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud; análisis que comprende:

(a) producir ADNc a partir de la muestra mediante transcripción inversa usando al menos un cebador;

(b) amplificar el ADNc así producido usando cebadores sentido y antisentido de polinucleótido capaces de amplificar el polinucleótido mostrado en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1);

(c) detectar la presencia del ADNc amplificado.

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16. Utilización de un filtro in vitro que cuantifica la expresión de polipéptido mediante RT-PCR, la hibridación de ácidos nucleicos o la unión con anticuerpos para identificar una molécula o un agente biológico que inhiba la sobre-expresión de dicho polipéptido y pueda ser de valor terapéutico en el tratamiento del cáncer, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 o SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud.

17. Procedimiento in vitro útil en la determinación de la presencia de cáncer en un individuo, que comprende detectar un aumento en el nivel de expresión del ARNm que codifica un polipéptido o del polipéptido en una muestra celular o tisular analítica en comparación con el nivel de expresión en una célula o tejido correspondiente normal, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 o SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la presencia de dicho polipéptido se evalúa usando un procedimiento inmunohistoquímico.

19. Procedimiento según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en el que la muestra de tejido es de colon, páncreas, vejiga, ovario, cérvix, testículos o mama.

20. Procedimiento in vitro para predecir la susceptibilidad a desarrollar cáncer en un individuo, que comprende detectar un polipéptido o un ARNm que codifica el polipéptido en una muestra de tejido, en el que la presencia de dicho ARNm o polipéptido indica una susceptibilidad a padecer cáncer y el grado de expresión presente es proporcionar al grado de susceptibilidad, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 o SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud.

21. Procedimiento in vitro que comprende determinar el nivel de un polipéptido o un ARNm que codifica el polipéptido expresado por células en una muestra de un tumor, y comparar el nivel así determinado con el nivel de dicho polipéptido o ARNm que codifica dicho polipéptido expresado en el correspondiente tejido normal tomado del mismo individuo o una muestra de referencia de tejido normal, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 o SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud.

22. Equipo adecuado para su uso en un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, que comprende un vehículo compartimentalizado para recibir en confinamiento uno o más medios de envase, comprendiendo al menos uno de los medios de envase un anticuerpo específico de un polipéptido o un polinucleótido que se hibrida específicamente con un gen que codifica un dicho polipéptido, en el que dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 o SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud.

23. Anticuerpo que se une con un dominio extracelular del polipéptido de la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) o que (a) tiñe inmunohistoquímicamente células 293T transfectadas con un plásmido de expresión que codifica y expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) y (b) no tiñe inmunohistoquímicamente células 293T sin transfectar.

24. Anticuerpo según la reivindicación 23, en el que las células 293T están transfectadas con un plásmido de expresión que contiene la secuencia que codifica el ADNc en el clon 10.1 del plásmido 8P1D4 depositado como ATCC 98849.

25. Anticuerpo que se une inmunoespecíficamente con el polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma, o mostrada en la SEC ID N.º 19, la SEC ID N.º 20, la SEC ID N.º 21, la SEC ID N.º 30 o la SEC ID N.º 31, o es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud; y que es útil en los análisis de diagnóstico o pronóstico, las metodologías de generación de imágenes o los procedimientos terapéuticos en el tratamiento de cánceres humanos.

26. Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 que es monoclonal.

27. Anticuerpo según la reivindicación 26 que es un fragmento de anticuerpo.

28. Polipéptido recombinante que comprende el dominio de unión antigénica del anticuerpo de la reivindicación 26.

29. Anticuerpo según la reivindicación 26, fragmento de anticuerpo según la reivindicación 27 o polipéptido recombinante de la reivindicación 28 que está marcado con un marcador detectable.

30. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 26, fragmento de anticuerpo de la reivindicación 27 o polipéptido recombinante de la reivindicación 28 que está conjugado con una toxina.

31. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 26, fragmento de anticuerpo de la reivindicación 27 o polipéptido recombinante de la reivindicación 28 que está conjugado con un agente terapéutico.

32. Utilización del polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en la preparación de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28.

33. Utilización del polipéptido que comprende un fragmento de al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en la preparación de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28.

34. Utilización según la reivindicación 33 de un polipéptido, seleccionado entre la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 y SEC ID N.º 31.

35. Utilización de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es una variante al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) en toda su longitud en la preparación de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28.

36. Utilización de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado como ATCC 98849 en la preparación de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28.

37. Utilización de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36 fusionado con un polipéptido heterólogo en la preparación de un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un polipéptido recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28.

38. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37 en el que el polipéptido es soluble.

39. Utilización de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 38, en el que el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o el polipéptido recombinante está marcado con un marcador detectable para análisis de diagnóstico o pronóstico, o para metodologías de generación de imágenes para el cáncer.

40. Utilización de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 38, en el que el anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o el polipéptido recombinante está marcado con una toxina o un agente terapéutico para procedimientos terapéuticos en el tratamiento de los cánceres humanos.

41. Anticuerpo conjugado con una toxina o un agente terapéutico para su uso en el tratamiento del cáncer, anticuerpo que:

(i) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o

(ii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido de al menos 15 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2); o

(iii) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido seleccionado entre la SEC ID N.º 19, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 21, SEC ID N.º 30 y SEC ID N.º 31; o

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(iv) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que es al menos un 90% idéntico a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) a lo largo de toda su longitud; o

(v) se une inmunoespecíficamente con un polipéptido que se obtiene mediante el cultivo de una célula huésped que contiene un vector de expresión que contiene un polinucleótido (a) que tiene la secuencia mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 1), en la que T también puede ser U, o (b) que codifica un polipéptido cuya secuencia está codificada por el ADNc contenido en el clon 10.1 del plásmido 10.1 depositado como ATCC 98849 o (c) que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2) o al menos 15 aminoácidos contiguos de la misma; o

(vi) tiñe inmunohistoquímicamente células 293T transfectadas con un plásmido de expresión que codifica y expresa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 1A (SEC ID N.º 2), pero no tiñe inmunohistoquímicamente células 293T no transfectadas.