ES2718846T3 - Antígenos de próstata consenso, molécula de ácido nucleico que los codifica y la vacuna y usos que los comprenden - Google Patents

Antígenos de próstata consenso, molécula de ácido nucleico que los codifica y la vacuna y usos que los comprenden Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
Antígenos de próstata consenso, molécula de ácido nucleico que los codifica y la vacuna y usos que los comprenden Campo de la invención
La presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de próstata consenso y fragmentos de las mismas; para mejorar las vacunas contra el cáncer de próstata, métodos mejorados para inducir respuestas inmunitarias contra las células cancerígenas de la próstata, métodos mejorados para inmunizar profilácticamente y/o terapéuticamente a individuos contra el cáncer de próstata.
Antecedentes de la invención
El cáncer de próstata es un importante objetivo para las terapias inmunológicas. El desarrollo de un enfoque terapéutico inmunológico es complejo, ya que es necesario desarrollar inmunógenos capaces de inducir fuertes respuestas inmunitarias incluyendo preferiblemente respuestas de CTL. Mincheff et al. Eur Urol 2000; 38: 208-217 describe vacunas de ADN que codifican PSMA humanos para uso contra el cáncer de próstata y su uso en vacunación.
La administración directa de secuencias de ácido nucleico para vacunar contra enfermedades de animales y humanos ha sido estudiada y mucho esfuerzo se ha centrado en medios efectivos y eficientes de suministro de ácido nucleico para producir la expresión de los antígenos deseados, la respuesta inmunogénica resultante y, en última instancia, el éxito de esta técnica.
Las vacunas de ADN tienen muchas ventajas conceptuales sobre los métodos de vacunación más tradicionales, como las vacunas basadas en virus atenuados vivos y en proteínas recombinantes. Las vacunas de ADN son seguras, estables, fáciles de producir y están bien toleradas en humanos con ensayos preclínicos que indican poca evidencia de integración de plásmidos. [Martin, T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10 (5): p. 759-68; Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: Pág. 30-9]. Además, las vacunas de ADN son muy adecuadas para la administración repetida debido a que la eficacia de la vacuna no está influenciada por títulos de anticuerpos preexistentes hacia el vector [Chattergoon, M. J. Boyer y DB Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11 (10): pág. 753-63]. Sin embargo, uno de los principales obstáculos para la adopción clínica de vacunas de ADN ha sido una disminución en la inmunogenicidad de la plataforma cuando se traslada a animales mas grandes [Liu, M.A. y J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv. Genet., 2005. 55: p. 25-40]. Los avances tecnológicos recientes en la elaboración de inmunógenos de ADN para vacunas, como la optimización de codones, la optimización del ARN y la adición de secuencias líder de inmunoglobulina han mejorado la expresión y la inmunogenicidad de vacunas de ADN [Andre, S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J. Virol, 1998. 72 (2): p. 1497-503; Deml, L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75 (22): p. 10991-1001; Laddy, DJ, et al., Immunogenicity of novel consensusbased DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25 (16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11 (6): p. 522-33].
Los recientes avances tecnológicos en sistemas de administración de plásmido han mejorado la expresión e inmunogenicidad de las vacunas de ADN que incluyen tecnologías como la electroporación. [Hirao, La , et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26 (3): Pág. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccinespecific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81 (10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, proteína expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 2007. 179 (7): p.4741-53].
Además, los estudios han sugerido que el uso de inmunógenos de consenso puede aumentar la amplitud de la respuesta inmune celular en comparación con los antígenos nativos solos [Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15 (2): Pág. 411-21; Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81 (16): p. 8507-14]. Sin embargo, se reconoce que es un obstáculo importante romper la inmunotolerancia para los antígenos del cáncer y la generación de autoinmunidad para las vacunas contra el cáncer.
Sigue siendo una necesidad las construcciones de ácido nucleico que codifican antígenos del cáncer de próstata y las composiciones útiles para inducir respuestas inmunitarias contra los antígenos del cáncer de próstata y así romper la tolerancia inmunológica. Sigue habiendo la necesidad de vacunas profilácticas y terapéuticas eficaces contra el cáncer de próstata que sean económicas y efectivas.
Resumen de las realizaciones preferidas
El objeto por el que se solicita protección es el que se define en las reivindicaciones.
Los aspectos de la presente invención incluyen una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en:
a) Id. de Sec. n°: 6, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 735 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, y
b) Id. de Sec. n°: 8, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 8 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 752 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados.
En algunas realizaciones adicionales de la invención, el ácido nucleico puede comprender además al menos uno seleccionado entre el Id. de Sec. n°: 1 o una secuencia codificante que sea 98% homóloga al Id. de Sec. n°: 1; o Id. de Sec. n°: 3, o una secuencia codificada que es 98% homóloga al Id. de Sec. n°: 3.
En otro aspecto, la invención incluye una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en:
a) Id. de Sec. n°: 6; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 735 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, y
b) Id. de Sec. n°: 8, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 8 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 752 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados.
En algunas realizaciones adicionales de la invención, la proteína puede comprender, además, el Id. de Sec. n°: 2, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 2 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 256 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 2, que comprende los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados, o el Id. de Sec. n°: 4, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 4, que comprende los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 o 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 4 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 274 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 o 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados.
En otro aspecto, la invención incluye una composición inmunológica que comprende un ácido nucleico de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los aspectos de la presente descripción incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia codificante que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que comprende:
a) Id. de Sec. n°: 2; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 2 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 256 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2; estén conservados.
b) Id. de Sec. n°: 4; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 4 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 274 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados;
c) Id. de Sec. n°: 6; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 735 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados;
d) Id. de Sec. n°: 8; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 8 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 752 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados;
e) Id. de Sec. n°: 10; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 10; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 10 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 333 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 10;
f) Id. de Sec. n°: 12; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 12; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 12 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 349 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 12;
g) Id. de Sec. n°: 14; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 14 o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 14 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 129 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14; o
h) un péptido señal unido a los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14; una proteína que tiene un péptido señal unido a una secuencia de aminoácidos que es homóloga en un 98% a los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14; o proteína que tiene un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico de los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14, el fragmento comprende al menos 110 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14 y vinculado a un péptido señal. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico se eligen entre las que codifican las proteínas a), b), c) o d).
En otro aspecto, la descripción incluye procedimientos de tratamiento de un individuo que ha sido diagnosticado con cáncer de próstata que comprende administrar una molécula de ácido nucleico descrita en este documento a un individuo.
En otro aspecto, se proporcionan proteínas seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
a) Id. de Sec. n°: 2; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 2 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 261 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados;
b) Id. de Sec. n°: 4; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 4 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 274 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados;
c) Id. de Sec. n°: 6; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 735 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados;
d) Id. de Sec. n°: 8; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 8 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 752 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados;
e) Id. de Sec. n°: 10; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 10; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 10 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 333 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 10;
f) Id. de Sec. n°: 12; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 12; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 12 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 349 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 12;
g) Id. de Sec. n°: 14; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 14; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 14 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 129 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14; o
h) un péptido señal unido a los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14; una proteína que tiene un péptido señal unido a una secuencia de aminoácidos que es homóloga en un 98% a los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14; o una proteína que tiene un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico de los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14, el fragmento comprende al menos 110 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14 y están unidos a un péptido señal. En algunas realizaciones, la proteína se selecciona del grupo que comprende las proteínas a), b), c) o d).
Algunos aspectos de la descripción incluyen métodos para tratar a un individuo que ha sido diagnosticado con cáncer de próstata que comprende administrar a dicho individuo una proteína descrita en el presente documento. Otros aspectos de la invención son composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de ácido nucleico proporcionadas aquí y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Breve descripción de las figuras.
La Figura 1 muestra los resultados de la traducción in vitro realizada para confirmar la expresión de los antígenos PSA y PSMA.
La figura 2A muestra datos de inmunogenicidad celular. La inmunogenicidad celular de los antígenos de PSA se determinó mediante interferón gamma ELISpot.
La figura 2B muestra datos de inmunogenicidad celular. La inmunogenicidad celular de los antígenos de PSA se determinó mediante interferón gamma ELISpot.
Las Figuras 3A-C muestran las respuestas de las células T CD4+ caracterizadas mediante citometría de flujo al mostrar gráficas que muestran producción de citoquinas específicas para PSA (panel izquierdo), específicas para PSMA (panel central) y específicas para vacunas total (panel derecho): % de células T CD4+ que produce IFNy (Fig. 3A); % de células T CD4+ que produce IL-2 (Fig. 3B); y % de células T CD4+ que produce TNFa (Fig. 3C).
Las Figuras 4A-C muestran las respuestas de las células T CD8+ caracterizadas mediante citometría de flujo al mostrar gráficas que muestran la producción de citoquinas específicas para PSA (panel izquierdo), específicas para PSMA (panel central) y específicas para vacunas total (panel derecho): % de células T CD8+ que produce IFNy (Fig. 4A); % de células T CD8+ que produce IL-2 (Fig. 4B); y % de células T CD8+ que produce TNFa (Fig. 4C).
Las Figuras 5A-B muestran datos de ELISA para anticuerpos específicos de PSA una semana después de la inmunización final. (Fig. 5A) Títulaciones finales de IgG para PSA (Fig. 5B) Curvas de titulación de IgG representativas.
Descripción detallada
Se proporcionan en este documento las secuencias consenso de proteínas de próstata y moléculas de ácido nucleico aisladas que las codifican, y en particular, el antígeno específico de próstata de los antígenos de próstata (PSA), el antígeno prostático específico de membrana (PSMA), el antígeno epitelial que cruza la membrana seis veces del antígeno prostático (STEAP) y el antígeno de células madre específico de próstata (PSCA).
Los antígenos de cáncer de próstata descritos en este documento son secuencias consenso derivadas de un grupo de antígenos homólogos de varias especies, incluida la especie a la que está dirigida la vacuna. Las especies seleccionadas de las que las secuencias de antígenos están alineadas para formar un consenso se elegirán en función de la proximidad de las especies en un árbol filogenético, por ejemplo, H. sapiens (humanos), M. mulatta (macacos rhesus) y M. fascicularis (mono cynomolgus). El antígeno de consenso no es idéntico al antígeno de próstata nativo, pero tendrá una identidad cercana, cuyas secuencias comparten al menos el 85%, y preferiblemente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad. Estos antígenos consenso del cáncer descritos pueden romper la tolerancia en la especie diana (o causar autoinmunidad) y generar una respuesta inmune efectiva contra el antígeno del cáncer de próstata. Aquí se proporcionan métodos para generar una vacuna de ADN basada en antígeno consenso de cáncer.
Los aspectos de la presente descripción incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia codificante que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo que comprende:
a) Id. de Sec. n°: 2; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 2 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 256 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados;
b) Id. de Sec. n°: 4; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 4 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 274 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados;
c) Id. de Sec. n°: 6; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 735 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados;
d) Id. de Sec. n°: 8; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 8 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 752 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados;
e) Id. de Sec. n°: 10; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 10; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 10 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 333 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 10;
f) Id. de Sec. n°: 12; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 12; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 12 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 349 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 12;
g) Id. de Sec. n°: 14; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 14; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 14 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 129 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14; o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 14 que comprende al menos 129 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14; o
h) un péptido señal unido a los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14; una proteína que tiene un péptido señal unido a una secuencia de aminoácidos que es homóloga en un 98% a los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14; 0 proteína que tiene un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico de los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14, el fragmento que comprende al menos 110 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14 y unido a un péptido señal. Se describen dos secuencias consenso de proteínas de PSA: secuencia consenso del antígeno PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2) y secuencia consenso del antígeno PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4). Se describen dos secuencias consenso de proteínas para PSMA: la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6) y la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8). Se describen dos secuencias consenso de proteínas para STEAP (también referidas aquí como STEAP1): la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10) y la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12). Se describe una secuencia consenso de proteína para PSCA: la secuencia consenso del antígeno de PSCA (Id. de Sec. n°: 14). Id. de Sec. n°: 14 incluye un péptido señal de IgE. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, un antígeno de consenso de PSCA puede incluir los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14 unidos a una secuencia señal diferente a la señal de la IgE en el Id. de Sec. n°: 14. En algunas realizaciones de la presente descripción de las moléculas de ácido nucleico se eligen entre las que codifican las proteínas a), b), c) o d), anteriores. En realizaciones de la invención las moléculas de ácido nucleico pueden ser aquellas que codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo que comprende: al menos uno seleccionado de los que codifican las proteínas a) o b), y al menos uno seleccionado de los que codifican las proteínas c) o d).
Las moléculas de ácido nucleico de la descripción pueden ser además moléculas que codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo que comprende: Id. de Sec. n°: 2; Id. de Sec. n°: 4; Id. de Sec. n°: 6; Id. de Sec. n°: 8; Id. de Sec. n°: 10; Id. de Sec. n°: 12; o Id. de Sec. n°: 14; y preferiblemente, Id. de Sec. n°: 2; Id. de Sec. n°: 4; Id. de Sec. n°: 6; o Id. de Sec. n°: 8. En algunas realizaciones de la invención, la molécula de ácido nucleico puede ser una que codifique una o más proteínas seleccionadas del grupo que comprende: al menos uno seleccionado entre Id. de Sec. n°: 2 o Id. de Sec. n°: 4, y al menos uno seleccionado entre Id. de Sec. n°: 6 o Id. de Sec. n°: 8.
En otro aspecto de la presente descripción, se proporcionan proteínas seleccionadas de entre el grupo que consiste en:
a) Id. de Sec. n°: 2; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 2 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 256 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados;
b) Id. de Sec. n°: 4; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 4 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 274 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4 estén conservados;
c) Id. de Sec. n°: 6; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 735 residuos de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados;
d) Id. de Sec. n°: 8; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados, o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 8 que comprende los aminoácidos correspondientes al menos a 752 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8 estén conservados;
e) Id. de Sec. n°: 10; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 10; o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 10 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 333 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 10;
f) Id. de Sec. n°: 12; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 12; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 12 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 349 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 12;
g) Id. de Sec. n°: 14; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 14; o un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 14 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 129 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14; o
h) un péptido señal unido a los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14; una proteína que tiene un péptido señal unido a una secuencia de aminoácidos que es homóloga en un 98% a los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14; 0 una proteína que tiene un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico de los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14, el fragmento comprende al menos 110 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14 y está unido a un péptido señal. En algunas realizaciones de la descripción, la proteína se selecciona del grupo que comprende: proteínas a), b), c) o d). En realizaciones de la invención, las proteínas son aquellas que codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo que comprende: al menos una seleccionadas de cualquiera de las proteínas a) o b), y al menos una seleccionada de cualquiera de las proteínas c) o d).
Las proteínas de la descripción pueden ser además proteínas seleccionadas del grupo que comprende: Id. de Sec. n°: 2; Id. de Sec. n°: 4; Id. de Sec. n°: 6; Id. de Sec. n°: 8; Id. de Sec. n°: 10; Id. de Sec. n°: 12; o Id. de Sec. n°: 14; y preferiblemente, Id. de Sec. n°: 2; Id. de Sec. n°: 4; Id. de Sec. n°: 6; o Id. de Sec. n°: 8. En algunas realizaciones de la invención, las proteínas pueden ser seleccionadas del grupo que comprende: al menos una seleccionada de Id. de Sec. n°: 2 o Id. de Sec. n°: 4, y al menos una seleccionada del Id. de Sec. n°: 6 o el Id. de Sec. n°: 8.
Las secuencias que codifican ácidos nucleicos se han generado para mejorar y optimizar la expresión. Los codones utilizados en estas moléculas de ácido nucleico se seleccionaron para generar ARN que tiene una formación de estructura secundaria reducida debido a la hibridación intramolecular. Se describen las secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia consenso del antígeno de PSA 1 (Id. de Sec. n°: 1) y la secuencia consenso del antígeno PSA 2 (Id. de Sec. n°: 3). Asimismo, se proporcionan la secuencia codificante de ácido nucleico para la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 5 o nucleótidos 1-2250 de Id. de Sec. n°: 5) y la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 7 o nucleótidos 1-2301 de Id. de Sec. n°: 7), así como también la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 9), la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 11) y la secuencia consenso del antígeno PSCA (Id. de Sec. n°: 13). También se proporcionan secuencias de ácido nucleico que son homólogas en un 98% al Id. de Sec. n°: 1 y que codifica la secuencia consenso del antígeno PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2) o una proteína homóloga hasta en un 98% al Id. de Sec. n°: 2, incluyendo preferiblemente los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 de Id. de Sec. n°: 2, y las secuencias de ácido nucleico que son homólogas en un 98% al Id. de Sec. n°: 3 y que codifican cualquiera de las secuencia consenso de antígenos de PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4) o una proteína homóloga hasta el 98% con el Id. de Sec. n°: 4, incluyendo preferiblemente los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4. Igualmente, las secuencias de ácido nucleico que son homólogas en un 98% a los nucleótidos 2250 del Id. de Sec. n°: 5 y que codifican cualquiera de las secuencias consenso de antígenos de PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6) o una proteína homologa hasta el 98% con el Id. de Sec. n°: 6, incluyendo preferiblemente los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 de Id. de Sec. n°: 6, o las secuencias de ácido nucleico que son homólogas en un 98% a los nucleótidos 2301 de Id. de Sec. n°: 7 y que codifican cualquiera de las secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8) o una proteína homóloga hasta el 98% al Id. de Sec. n°: 8, incluyendo preferiblemente los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8, así como los nucleótidos homólogos en un 98% al Id. de Sec. n° 9 y que codifican cualquiera de las secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10) o una proteína que es hasta un 98% homóloga al Id. de Sec. n°: 10, los nucleótidos homólogos en un 98% al Id. de Sec. n°: 11 y que codifican cualquiera de las secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12) o una proteína que es hasta un 98% homóloga al Id. de Sec. n°: 12, y los nucleótidos homólogos en un 98% al Id. de Sec. n°: 13 y que codifican cualquiera de las secuencia consenso del antígeno PSCA (Id. de Sec. n°: 14) o una proteína que es hasta un 98% homóloga al Id. de Sec. n°: 14. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico codifican una proteína que comprende un péptido señal de IgE (por ejemplo, el Id. de Sec. n°: 3 que codifica el Id. de Sec. n°: 4; los nucleótidos 1-2301 del Id. de Sec. n°: 7, que codifica el Id. de Sec. n°: 8; Id. de Sec. n°: 11 que codifica Id. de Sec. n°: 12, e Id. de Sec. n°: 13 que codifica Id. de Sec. n°: Las composiciones que comprenden moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias que codifican las moléculas de ácido nucleico aislado proporcionadas en el presente documento puedan ser útiles para inducir respuestas inmunitarias contra una proteína de la próstata cuando se administran en un animal. Las composiciones que contienen una o más de estas secuencias de ácido nucleico se pueden usar como vacunas o componentes de la vacuna para inmunizar profilácticamente o terapéuticamente contra el cáncer de próstata. Asimismo, las composiciones que comprenden las proteínas de consenso pueden ser útiles para inducir respuestas inmunes contra una proteína de próstata cuando se administran en un animal. Las combinaciones de composiciones que comprenden moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias codificantes de las moléculas de ácido nucleico aisladas proporcionadas en el presente documento pueden ser útiles para inducir respuestas inmunes contra una proteína de próstata y pueden usarse colectivamente como vacunas o componentes de vacunas para inmunizar profilácticamente o terapéuticamente contra el cáncer de próstata. Asimismo, las composiciones que comprenden proteínas de consenso pueden ser útiles para inducir respuestas inmunes contra una proteína de próstata cuando se administran a un animal. Las composiciones que contienen una o más de estas proteínas consenso se pueden usar como vacunas o componentes de vacunas para inmunizar profilácticamente o terapéuticamente contra el cáncer de próstata.
Las vacunas comprenden secuencias de ácido nucleico proporcionadas en este documento. En algunas realizaciones como se describe en el presente documento, se proporcionan vacunas que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos consenso de próstata seleccionados del grupo que consiste en: antígeno de consenso PSA 1, antígeno de consenso PSA 2, antígeno de consenso PSMA 1, antígeno de consenso PSMA 2, antígeno de consenso STEAP 1, antígeno de consenso STEAP 2 y antígeno de consenso PSCA. Los métodos para inducir respuestas inmunes utilizando secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más antígenos de próstata seleccionados del grupo que consiste en: antígeno de consenso PSA1, antígeno de consenso PSA2, antígeno de consenso PSMA 1, antígeno de consenso PSMA 2, antígeno de consenso STEAP 1, antígeno de consenso STEAP 2 y antígeno de consenso PSCA. Las vacunas de la invención comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican el antígeno de consenso PSMA 1 o el antígeno de consenso PSMA 2. Se proporcionan vacunas que comprenden uno o más de antígeno de consenso PSA 1, antígeno de consenso PSA 2, antígeno de consenso PSMA 1, antígeno de consenso PSMA 2, antígeno de consenso STEAP 1, antígeno de consenso STEAP 2 y antígeno de consenso PSCA. También se describen los métodos para inducir respuestas inmunitarias utilizando uno o más de antígeno de consenso PSA 1, antígeno de consenso PSA 2, antígeno de consenso PSMA 1, antígeno de consenso PSMA 2, antígeno de consenso STEAP 1, antígeno de consenso STEAP 2 y antígeno de consenso PSCA.
Se proporcionan los ácidos nucleicos de la invención para uso en métodos para proteger a un individuo contra el cáncer de próstata o para tratar a un individuo que se ha identificado que tiene cáncer de próstata. Los métodos comprenden la etapa de: administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden una o más secuencias de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento. En algunos métodos, las moléculas de ácido nucleico se suministran por electroporación del tejido seleccionado o el tejido que recibe las moléculas de ácido nucleico. La secuencia de ácido nucleico se expresa en las células del individuo y se induce una respuesta inmune contra la proteína prostática codificada por la secuencia de ácido nucleico.
1. Definiciones.
Para la enumeración de los intervalos numéricos en este documento, se contempla explícitamente que cada número presente interviene con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el rango de 6-9, los números 7 y 8 se contemplan además de 6 y 9, y para el rango 6,0-7,0, los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0 están contemplados explícitamente .
a. Adyuvante
"Adyuvante" como se usa en este documento significa cualquier molécula añadida a las vacunas de plásmido de ADN descritas en este documento para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos codificados por los plásmidos de ADN y las secuencias que codifican los ácido nucleico descritos más adelante.
b. Anticuerpo
"Anticuerpo" como se usa en este documento significa un anticuerpo de las clases IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, o fragmentos, fragmentos o derivados de los mismos, incluyendo Fab, F(ab')2, Fd, y anticuerpos de cadena única, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos bifuncionales y derivados de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo aislado de la muestra de suero de un mamífero, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo purificado por afinidad, o mezclas de los mismos que muestren suficiente especificidad de unión a un epítopo deseado o una secuencia derivada de él.
c. Secuencia codificante
"Secuencia codificante" o "ácido nucleico codificante" como se usa en este documento significa los ácidos nucleicos (molécula de ARN o ADN) que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína. La secuencia codificante puede incluir además señales de iniciación y terminación operativamente vinculadas a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células de un individuo o mamífero a quien se le administra el ácido nucleico.
d. Complemento
"Complemento" o "complementario" como se usa en este documento significa un ácido nucleico puede significar emparejamiento de bases Watson-Crick (por ejemplo, A-T/U y C-G) o el emparejamiento de bases de Hoogsteen entre nucleótidos o análogos de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico.
e. Consenso o secuencia de consenso
"Consenso" o "secuencia de consenso" como se usa en el presente documento significa una secuencia de polipéptidos basada en el análisis de una alineación de múltiples subtipos de un antígeno prostático particular. Pueden prepararse secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia polipeptídica de consenso. Las vacunas que comprenden proteínas que comprenden secuencias de consenso y/o moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas pueden usarse para inducir una inmunidad amplia contra un antígeno prostático particular . f. Electroporación
"Electroporación", "electro-permeabilización," o "mejora electro-cinética" ("EP") como se usa de manera intercambiable en el presente documento significa el uso de un pulso de campo eléctrico transmembrana para inducir vías microscópicas (poros) en una bio-membrana; su presencia permite que las biomoléculas como los plásmidos, oligonucleótidos, ARNsi, medicamentos, iones y agua pasen de un lado de la membrana celular al otro. g. Fragmento
"Fragmento" como se usa en el presente documento con respecto a las secuencias de ácido nucleico significa una secuencia de ácido nucleico o una porción de la misma como se define en las reivindicaciones, que codifica un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmune en un mamífero que reacciona de forma cruzada con un antígeno prostático de longitud completa. Los fragmentos pueden ser fragmentos de ADN seleccionados de al menos una de las diversas secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias consenso de aminoácidos y construcciones que comprenden tales secuencias. Los fragmentos de ADN pueden comprender secuencias que codifican la secuencia líder de la inmunoglobulina, tales como las secuencias de IgE o IgG. Los fragmentos de ADN pueden codificar los fragmentos de proteínas que se exponen a continuación.
"Fragmento" con respecto a las secuencias polipeptídicas significa un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmune en un mamífero que reacciona de forma cruzada con un antígeno de próstata, que incluye, por ejemplo, PSA, PSMA, STEAP y Ps Ca , como se define en las reivindicaciones.
La secuencia de PSA humano es de aproximadamente 261 aminoácidos. Los fragmentos del antígeno de consenso de PSA 1 pueden comprender al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del Id. de Sec. n°: 2, y preferiblemente un 98 % o 99%, siempre que los fragmentos incluyan uno o más de los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248. Los fragmentos del antígeno de consenso de PSA 1 pueden comprenden 255, 256, 257, 258, 259 o 260 aminoácidos del Id. de Sec. n°: 2, pero preferiblemente 256 aminoácidos o más. Los fragmentos del antígeno de consenso de PSA 2 pueden comprender al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% del Id. de Sec. n°: 4, y preferiblemente el 98 % o 99%, siempre que los fragmentos incluyan uno o más de los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275. Todos estos fragmentos de antígeno de consenso PSA 2 también pueden excluir opcionalmente los aminoácidos 1-17. En algunas realizaciones, los fragmentos del antígeno de consenso PSA 2 pueden comprender opcionalmente uno o más de los aminoácidos 1-17 y los aminoácidos del aminoácido 18 al aminoácido 278, los fragmentos del antígeno de consenso PSA 2 también pueden comprender 255, 256, 257, 258, 259 o 260 aminoácidos del Id. de Sec. n°: 4, pero preferiblemente 274 aminoácidos o más.
La secuencia de PSMA humano es de aproximadamente 749 a 750 aminoácidos. Los fragmentos del antígeno de consenso PSMA 1 pueden comprender al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% del Id. de Sec. n°: 6, y preferiblemente el 98 % o 99%, siempre que los fragmentos incluyan uno o más de los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734. Los fragmentos del antígeno de consenso PSMA 1 pueden comprender 745, 746, 747, 748 o 749 aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6, pero preferiblemente 735 aminoácidos o más. Los fragmentos del antígeno de consenso PSMA 2 pueden comprender al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% del Id. de Sec. n°: 8, y preferiblemente el 98% o 99%, siempre que los fragmentos incluyan uno o más de los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630., 641, 670, 677, 680, 750 y 751. Todos estos fragmentos del antígeno de consenso PSA 2 también pueden excluir opcionalmente los aminoácidos 1-17. En algunas realizaciones, los fragmentos del antígeno de consenso PSA 2 pueden comprender opcionalmente uno o más de los aminoácidos 1-17 y de los aminoácidos del aminoácido 18 al aminoácido 767, los fragmentos del antígeno de consenso PSMA 2 también pueden comprender 761, 762, 763, 764, 765 o 766 aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8, pero preferiblemente 752 aminoácidos o más.
La secuencia de STEAP humana es de aproximadamente 339 aminoácidos. Las secuencias consenso de STEAP pueden comprender secuencias de aminoácidos para el líder de inmunoglobulina tal como IgE o IgG. El antígeno de consenso STEAP 2 contiene una secuencia líder de 18 aminoácidos en lugar de la metionina en la posición 1. Los fragmentos del antígeno de consenso PSMA 2 pueden comprender una secuencia líder y al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% de los aminoácidos 18-356 del Id. de Sec. n°: 12, y preferiblemente el 98% o 99%. Los fragmentos del antígeno de consenso PSMA 1 pueden comprender los aminoácidos 1-350, 1-351, 1-352, 1-353, 1-354 o 1-355 del Id. de Sec. n°: 12.
La secuencia de PSCA humano es de aproximadamente 114 aminoácidos. Las secuencias consenso de STEAP pueden comprender secuencias de aminoácidos para el líder de inmunoglobulina tal como IgE o IgG. El antígeno PSCA de consenso contiene una secuencia líder de 18 aminoácidos en lugar de la metionina en la posición 1. Los fragmentos del antígeno consenso PSCA pueden comprender una secuencia líder y al menos el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% de los aminoácidos 18-131 del Id. de Sec. n°: 14, y preferiblemente el98% o 99%. Los fragmentos del antígeno de consenso PSMA 1 pueden comprender los aminoácidos 1-125, 1-126, 1-127, 1-128, 1-129 o 1-130 del Id. de Sec. n°: 14.
h. Construcción genética
Tal como se utiliza aquí, el término "construcción genética" se refiere a las moléculas de ADN o ARN que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica una proteína. La secuencia codificante incluye señales de iniciación y terminación operativamente unidas a elementos reguladores que incluyen un promotor y una señal de poliadenilación capaces de dirigir la expresión en las células del individuo a quien se administra la molécula de ácido nucleico. Como se usa en el presente documento, el término "forma expresable" se refiere a construcciones de genes que contienen los elementos reguladores necesarios unidos operativamente a una secuencia codificante que codifica una proteína de tal manera que cuando esté presente en la célula del individuo, se expresará la secuencia de codificación.
i. Homología
La homología de alineaciones de secuencias múltiples y el filograma se generaron usando ClustalW, un programa de alineación de secuencias múltiples de propósito general para ADN o proteínas.
j. Identidad
"Idéntica" o "identidad" como se usa en el presente documento en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, significa que las secuencias tienen un porcentaje específico de residuos que son iguales en una región específica. E porcentaje puede calcularse alineando de manera óptima las dos secuencias, comparando las dos secuencias sobre la región especificada, determinando el número de posiciones en las que aparece el residuo idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la región especificada, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. En los casos en que las dos secuencias tienen diferentes longitudes o la alineación produce uno o más extremos escalonados y la región de comparación especificada incluye solo una única secuencia, los residuos de una sola secuencia se incluyen en el denominador pero no en el numerador del cálculo. Al comparar ADN y ARN, la timina (T) y el uracilo (U) pueden considerarse equivalentes. La identidad se puede realizar manualmente o utilizando un algoritmo de secuencia de computadora como BLAST o BLAST 2.0.
k. Respuesta inmune
"Respuesta inmune" como se usa en este documento significa la activación de un sistema inmune del huésped, por ejemplo, el de un mamífero, en respuesta a la introducción de un antígeno tal como un antígeno de próstata consenso. La respuesta inmune puede ser en forma de una respuesta celular o humoral, o ambas.
l. Ácido nucleico
"Ácido nucleico" u "oligonucleótido" o "polinucleótido" como se usa en el presente documento significa al menos dos nucleótidos unidos covalentemente entre sí. La representación de una sola hebra también define la secuencia de la hebra complementaria. Por lo tanto, un ácido nucleico también abarca la cadena complementaria de una cadena única representada. Se pueden usar muchas variantes de un ácido nucleico para el mismo propósito que un ácido nucleico dado. Por lo tanto, un ácido nucleico también abarca ácidos nucleicos sustancialmente idénticos y sus complementarios. Una sola hebra proporciona una sonda que puede hibridar con una secuencia diana en condiciones de hibridación rigurosas . Por lo tanto, un ácido nucleico también abarca una sonda que se hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas.
Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble, o pueden contener porciones tanto de cadena doble y secuencia de una sola hebra. El ácido nucleico puede ser ADN, genómico y ADNc, ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina, hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse por métodos de síntesis química o por métodos recombinantes.
m. Unido operativamente
"Unido operativamente" como se usa en este documento significa que la expresión de un gen está bajo el control de un promotor con el que está conectado espacialmente. Un promotor puede posicionarse 5' (corriente arriba) o 3' (corriente abajo) de un gen bajo su control. La distancia entre el promotor y un gen puede ser aproximadamente igual a la distancia entre ese promotor y el gen que controla en el gen del cual deriva el promotor. Como se conoce en la técnica, la variación en esta distancia puede acomodarse sin pérdida de la función del promotor.
n. Promotor
El "promotor", como se usa en el presente documento, puede comprender una o más secuencias reguladoras de la transcripción específicas para mejorar aún más la expresión y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de la misma. Un promotor también puede comprender elementos potenciadores o represores distales, que pueden ubicarse a varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Un promotor puede derivarse de fuentes que incluyen virus, bacterias, hongos, plantas, insectos y animales. Un promotor puede regular la expresión de un componente génico de forma constitutiva o diferencial con respecto a la célula, el tejido u órgano en el que se produce la expresión o, con respecto a la etapa de desarrollo en la que la expresión ocurre, o en respuesta a estímulos externos, tales como tensiones fisiológicas, patógenos, iones metálicos o agentes inductores. Los ejemplos representativos de promotores incluyen el promotor del bacteriófago T7, el promotor del bacteriófago T3, el promotor SP6, el operador-promotor lac, el promotor tac, el promotor tardío de SV40, el promotor temprano de SV40, el promotor RSV-LTR, el promotor IE de CMV, el promotor temprano de SV40 o el promotor tardío de SV40 y el promotor IE de CMV.
o. Condiciones de hibridación rigurosas
"Condiciones de hibridación rigurosas" como se usa en este documento significa condiciones en las que una primera secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, sonda) se hibridará con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, diana), como en una mezcla compleja de ácidos nucleico. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Las condiciones rigurosas se pueden seleccionar para que sean aproximadamente 5-10 °C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a un pH de fuerza iónica definido. La Tm puede ser la temperatura (bajo fuerza iónica, pH y concentración nucleica definidas) a la cual el 50% de las sondas complementarias a la diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, el 50 % de las sondas están ocupadas en el equilibrio). Las condiciones rigurosas pueden ser aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1,0 M de iones de sodio, como por ejemplo aproximadamente 0,01-1,0 M de concentración de iones de sodio (u otra sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente 10-50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayores que aproximadamente 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes como la formamida. Para la hibridación selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos de 2 a 10 veces la hibridación de fondo. Las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares incluyen lo siguiente: 50% de formamida, 5x SSC y 1% de SDS, incubación a 42 °C, o, 5x SSC, 1% de SDS, incubación a 65 °C, con lavado en 0,2x SSC y 0,1 % SdS a 65 °C.
p. Sustancialmente complementaria
"Sustancialmente complementaria" como se usa en el presente documento significa que una primera secuencia es al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idéntica al complementario de una segunda secuencia sobre una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070 o más nucleótidos o aminoácidos, o que las dos secuencias se hibridan en condiciones de hibridación rigurosas.
q. Substancialmente idénticas
"Sustancialmente idénticas", como se usa en el presente documento significa que una primera y segunda secuencia son al menos un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% idénticas en una región de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540, 630, 720, 810, 900, 990, 1080, 1170, 1260, 1350, 1440, 1530, 1620, 1710, 1800, 1890, 1980, 2070 o más nucleótidos o aminoácidos, o con respecto a los ácidos nucleicos, si la primera secuencia es sustancialmente complementaria al complementario de la segunda secuencia.
r. Subtipo o serotipo
"Subtipo" o "serotipo": como se usa aquí, de manera intercambiable, y en referencia a los antígenos de cáncer de próstata, significa variantes genéticas de un antígeno de cáncer de próstata tal que un subtipo (o variante) es reconocido por un sistema inmune aparte de un subtipo diferente.
s. Variante
"Variante" se usa en este documento con respecto a un medio de ácido nucleico (i) una porción o fragmento de un nucleótido de referencia de la secuencia; (ii) el complementario de una secuencia de nucleótidos referenciada o una porción de la misma; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico referenciado o su complementario; o (iv) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con el ácido nucleico referenciado, su complementario, o una secuencia sustancialmente idéntica al mismo.
"Variante" con respecto a un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, supresión, o sustitución conservativa de aminoácidos, pero retienen al menos una actividad biológica. La variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína referenciada con una secuencia de aminoácidos que retiene al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora de un aminoácido, es decir, la sustitución de un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (por ejemplo, hidrofilia, grado y distribución de las regiones cargadas) se reconoce en la técnica como que típicamente implica un cambio menor. Estos cambios menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de aminoácidos, como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Se sabe en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden estar sustituidos y aún conservan la función de la proteína. En un aspecto, los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2 están sustituidos. La hidrofilicidad de los aminoácidos también se puede usar para revelar sustituciones que darían como resultado que las proteínas retengan la función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la mayor hidrofilicidad promedio local de ese péptido, una medida útil que se ha visto que se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. Patente U.S. n° 4.554.101, incorporada completamente aquí por referencia. La sustitución de aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad similares puede dar como resultado que los péptidos retengan la actividad biológica, por ejemplo la inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones pueden realizarse con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ±2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. De acuerdo con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y en particular de las cadenas laterales de esos aminoácidos, según lo revelado por la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y otras propiedades.
t Vector
"Vector" como se usa en este documento significa una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un vector, un bacteriófago, un cromosoma artificial bacteriano o un cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser un vector de ADN o de ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico autorreplicante y, preferiblemente, es un plásmido de ADN.
2. Antígenos de consenso prostáticos.
Se proporcionan en este documento antígenos de consenso capaces de provocar una respuesta inmune en un mamífero contra un antígeno de próstata. El antígeno de consenso puede comprender epítopos que los hacen particularmente efectivos como inmunógenos contra células de cáncer de próstata. El antígeno prostático de consenso puede comprender el producto de traducción de longitud completa, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos.
Siete antígenos prostáticos consenso diferentes han sido diseñados. Dos de los antígenos consenso de próstata son el antígeno de consenso PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2) y el antígeno de consenso PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4). Dos de los antígenos consenso de próstata son el antígeno de consenso PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6) y el antígeno de consenso PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8). Dos de los antígenos consenso de próstata son el antígeno de consenso STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10) y el antígeno de consenso STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12). Uno de los antígenos consenso de próstata es el antígeno de consenso PSCA (Id. de Sec. n°: 14). Las proteínas pueden comprender secuencias homólogas a los antígenos de la próstata, fragmentos de los antígenos de la próstata y proteínas con secuencias homólogas a los fragmentos de los antígenos de la próstata.
El antígeno de consenso PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2) es aproximadamente 91% homólogo a las secuencias de PSA humano, aproximadamente 95% homólogo a M. fascicuaris PSA y aproximadamente 96% homólogo a M. mulatta PSA. El antígeno de consenso PSA 1 difiere de las secuencias de PSA humano en los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2.
El antígeno de consenso PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4) es aproximadamente un 90-91% homólogo a las secuencias de PSA humano, aproximadamente un 95% homólogo al PSA de M. fascicuaris y aproximadamente un 95% homólogo al PSA de M. mulatta. El antígeno de consenso PSA 2 comprende una secuencia líder en su extremo N. El antígeno de consenso PSA 2 también difiere de las secuencias de PSA humano en los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4.
El antígeno de consenso PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6) es aproximadamente un 96% homólogo a las secuencias de PSMA humano y aproximadamente un 94% homólogo al PSMA de M. mulatta. El antígeno de consenso PSMA 1 difiere de las secuencias de PSMA humanas en los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6.
El antígeno de consenso PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8) es aproximadamente un 96% homólogo a las secuencias de PSMA humano y aproximadamente un 94% homólogo al PSMA de M. mulatta. El antígeno de consenso PSMA 2 comprende una secuencia líder en su extremo N. El antígeno de consenso PSMA 2 también difiere de las secuencias de PSA humano en los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 del Id. de Sec. n°: 8.
El antígeno de consenso STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10) es aproximadamente un 94% homólogo a algunas secuencias de STEAP humano y aproximadamente un 99% homólogo a otras secuencias de STEAP humano. El antígeno de consenso STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10) también es aproximadamente un 94% homólogo a PSMA de M. mulatta. El antígeno de consenso STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12) es aproximadamente un 88% homóloga a algunas secuencias de STEAP humano y aproximadamente 94% homóloga a otras secuencias de STEAP humano. El antígeno de consenso STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12) también es aproximadamente un 94% homólogo al STEAP de M. mulatta. El antígeno de consenso STEAP 2 comprende una secuencia líder en su extremo N.
El antígeno de consenso PSCA (Id. de Sec. n°: 14) es aproximadamente un 87% homólogo al PSCA humano. El antígeno de consenso PSCA (Id. de Sec. n°: 14) difiere del PSCA humano por la inclusión de una secuencia líder en su extremo N.
Las proteínas pueden tener secuencias homólogas en un 98% a la secuencia consenso del antígeno PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2), la secuencia consenso del antígeno PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4), la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6), la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8), la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10), la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12) o la secuencia consenso del antígeno PSCA (Id. de Sec. n°: 14) .
Las proteínas pueden tener secuencias homólogas en un 99% a la secuencia consenso del antígeno PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2), la secuencia consenso del antígeno PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4), la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6), la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8), la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10), la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12) o la secuencia consenso del antígeno PSCA (Id. de Sec. n°: 14) .
Como se señaló anteriormente, algunas formas de realización comprenden una secuencia líder en el extremo N. En algunas realizaciones, la secuencia líder es una secuencia líder de IgE que es el Id. de Sec. n°: 16. En algunas realizaciones de las secuencias de proteínas proporcionadas en este documento, el Id. de Sec. n°: 16 se elimina de las mismas. Del mismo modo, en algunas realizaciones de las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento, el Id. de Sec. n°: 15 (que codifica el Id. de Sec. n°: 16) se elimina de la misma.
Por consiguiente, algunas realizaciones relacionadas con las proteínas que comprenden un péptido señal unido a Id. de Sec. n°: 2, Id. de Sec. n°: 6 o Id. de Sec. n°: 10 en lugar de la metionina N terminal establecida en la reivindicación (la secuencia codificante del péptido señal típicamente incluye un codón de inicio que codifica una metionina N-terminal). Algunas realizaciones se refieren a una proteína que comprende un péptido señal unido al aminoácido 19-131 del Id. de Sec. n°: 14. Algunas realizaciones relacionadas con proteínas que comprenden un péptido señal unido a una proteína homóloga al 98% con el Id. de Sec. n°: 2 siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados. Algunas realizaciones relacionadas con proteínas que comprenden un péptido señal unido a una proteína homóloga en un 98% con el Id. de Sec. n°: 6 siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados. Algunas realizaciones relacionadas con proteínas que comprenden un péptido señal unido a una proteína homóloga en un 98% con el Id. de Sec. n°: 10, en cada caso en el que el péptido señal está unido en el extremo terminal N, está unido en el lugar de la metionina N terminal descrita en la reivindicación (la secuencia codificante del péptido señal incluye típicamente un codón de inicio que codifica una metionina N terminal). Algunas realizaciones se refieren a una proteína que comprende un péptido señal unido a una proteína homóloga en un 98% con el aminoácido 19-131 del Id. de Sec. n°: 14. Algunas realizaciones se refieren a una proteína que comprende un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 2 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 256 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados. Algunas realizaciones se refieren a una proteína que comprende un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 735 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 de Id. de Sec. n°: 6 estén conservados. Algunas las realizaciones se refieren a una proteína que comprende un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 10 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 333 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 10. Algunas realizaciones se relacionan con una proteína que comprende un péptido señal unido a una proteína que tiene un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico de los aminoácidos 19­ 131 del Id. de Sec. n°: 14, el fragmento comprende al menos 110 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14.
3. Secuencias genéticas, construcciones y plásmidos.
Las moléculas de ácido nucleico que codifica las secuencias consenso de aminoácidos se generaron para optimizar la estabilidad y la expresión en seres humanos. La selección de codones se determinó basándose, entre otras cosas, en un esfuerzo por minimizar las interacciones intramoleculares y la formación de estructuras secundarias, así como el uso de codones que dan como resultado una expresión mejorada. Las vacunas pueden comprender una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una o más de las versiones de consenso de las proteínas inmunogénicas seleccionadas de este grupo de secuencias generadas para optimizar la estabilidad y la expresión en humanos. Las secuencias de ácido nucleico que incorporan secuencias codificantes para el líder de IgE en el extremo 5' de la secuencia consenso de ácido nucleico codificado optimizado se generaron que codifican proteínas que tienen la secuencia líder de IgE en el extremo N de la secuencia consenso de aminoácidos. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico que codifica el líder de IgE es el Id. de Sec. n°: 15
Se proporcionan secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia consenso del antígeno PSA 1 (secuencia de la proteína Id. de Sec. n°: 2; secuencia de ácido nucleico Id. de Sec. n°: 1), la secuencia consenso del antígeno PSA 2 (secuencia de la proteína Id. de Sec. n°: 4; secuencia de ácido nucleico Id. de Sec. n°: 3), la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (secuencia de proteínas Id. de Sec. n°: 6; secuencia de ácido nucleico que tiene los nucleótidos 1-2250 del Id. de Sec. n°: 5), la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (secuencia de proteínas Id. de Sec. n°: 8; secuencia de ácido nucleico que tiene los nucleótidos 1-2301 de Id. de Sec. n°: 7), la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (secuencia de proteínas Id. de Sec. n°: 10; secuencia de ácido nucleico Id. de Sec. n°: 9), la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (secuencia de proteínas Id. de Sec. n°: 12; secuencia de ácido nucleico Id. de Sec. n°: 11) o la secuencia consenso del antígeno PSCA (secuencia de proteínas Id. de Sec. n°: 14; secuencia de ácidos nucleicos Id. de Sec. n°: 13). La secuencia de ácido nucleico Id. de Sec. n°: 5 que codifica la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 comprende, además de los nucleótidos que codifican PSMA, 9 codones adicionales (27 nucleótidos) inmediatamente antes de los codones de parada que codifican la etiqueta HA (Id. de Sec. n°: 32), no mostrado en el Id. de Sec. n°: 6. La etiqueta HA es una secuencia peptídica que corresponde a un epítopo de la gripe útil para, entre otras cosas, la detección de proteínas, la expresión utilizando anticuerpos anti-etiqueta HA disponibles comercialmente. El Id. de Sec. n°: 5 codifica el Id. de Sec. n°: 6 más una secuencia de 9 aminoácidos adicionales. El Id. de Sec. n°: 32 unido en su extremo N al extremo C del Id. de Sec. n°: 6. En algunas realizaciones, el antígeno de consenso PSMA-1 está codificado por el Id. de Sec. n°: 5 y comprende una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6 unida en su extremo C al extremo N del Id. de Sec. n°: 32. En algunas realizaciones, el antígeno de consenso PSMA-1 está codificado por los nucleótidos 1-2250 del Id. de Sec. n°: 5 y comprende una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6. La secuencia codificante que tiene los nucleótidos 1-2250 del Id. de Sec. n°: 5 tiene uno o más codones de parada en su extremo 3'. La secuencia de ácido nucleico de Id. de Sec. n°: 7 que codifica la secuencia consenso del antígeno de PSMA 2 comprende, además de los nucleótidos que codifican la señal de IgE unida a la proteína PSMA más 9 codones adicionales (27 nucleótidos) inmediatamente antes de los codones de parada que codifican la etiqueta HA (Id. de Sec. n°: 32), que no se muestran en el Id. de Sec. n°: 8. El Id. de Sec. n°: 7 codifica el Id. de Sec. n°: 8 más una secuencia de 9 aminoácidos adicionales. El Id. de Sec. n°: 32 unido en su extremo N al extremo C del Id. de Sec. n°: 8. En algunas realizaciones, el antígeno de consenso PSMA-2 está codificado por el Id. de Sec. n°: 7 y comprende una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8 unida en su extremo C al extremo N del Id. de Sec. n°: 32. En algunas realizaciones, el antígeno de consenso PSMA-2 está codificado por los nucleótidos 1­ 2301 del Id. de Sec. n°: 7 y comprende una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 8. La secuencia codificante que tiene los nucleótidos 1-2301 del Id. de Sec. n°: 7 tiene uno o más codones de parada en su extremo 3'.
Las moléculas de ácido nucleico aislado pueden codificar proteínas que tienen secuencias homólogas en un 98% a la secuencia de antígeno consenso PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2), siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados, la secuencia de antígeno consenso
PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4), siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4, estén conservados, la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id.
de Sec. n°: 6), siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 de Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id.
de Sec. n°: 8), siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 de Id. de Sec. n°: 8 estén conservados, la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10), la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12) o la secuencia consenso del antígeno de PSCA (Id. de Sec. n°: 14).
Las moléculas de ácido nucleico aislado pueden codificar proteínas que tienen secuencias homólogas en un 99% a la secuencia consenso del antígeno PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2), siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados, la secuencia consenso del antígeno
PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4), siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 y 275 del Id. de Sec. n°: 4, estén conservados, la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id.
de Sec. n°: 6), siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 de Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id.
de Sec. n°: 8), siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 de Id. de Sec. n°: 8 estén conservados, la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10), la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12) o la secuencia consenso del antígeno de PSCA (Id. de Sec. n°: 14).
Las moléculas de ácido nucleico aislado pueden codificar proteínas que tienen secuencias homólogas en un 98% a la secuencia que codifica la secuencia consenso del antígeno PSA 1 (Id. de Sec. n°: 1), la secuencia consenso del antígeno PSA 2 (Id. de Sec. n°: 3), la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 5 o preferiblemente los nucleótidos 1-2250 del Id. de Sec. n°: 5), la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 7 o preferiblemente los nucleótidos 1-2301 del Id. de Sec. n°: 7), la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 9), la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 11) o la secuencia consenso del antígeno PSCA (Id. de Sec. n°: 13).
Las moléculas de ácido nucleico aislado puede codificar proteínas que tienen secuencias homólogas en un 99% a la secuencia que codifica la secuencia consenso del antígeno PSA 1 (Id. de Sec. n°: 1), la secuencia consenso del antígeno pSa 2 (Id. de Sec. n°: 3), la secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 5 o preferiblemente los nucleótidos 1-2250 del Id. de Sec. n°: 5), la secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 7 o, preferiblemente los nucleótidos 1-2301 del Id. de Sec. n°: 7), la secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 9), la secuencia consenso del antígeno STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 11) o la secuencia consenso del antígeno PSCA (Id. de Sec. n°: 13).
Las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden una secuencia líder en el extremo N. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico pueden codificar la secuencia líder de IgE que es el Id. de Sec. n°: 16. En algunas realizaciones las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido al Id. de Sec. n°: 2, el Id. de Sec. n°: 6 o el Id. de Sec. n°: 10 en lugar de la metionina N terminal descrita en la reivindicación (la secuencia codificante del péptido señal típicamente incluye un codón de inicio que codifica una metionina N-terminal). En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido al aminoácido 19-131 del Id.
de Sec. n°: 14. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido a una proteína homóloga en un 98% con el Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido a una proteína homóloga en un 98% con el Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del
Id. de Sec. n°: 6 estén conservados. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido a una proteína homóloga en un 98% con el Id. de Sec.
n°: 10. En el caso en el que se proporciona la secuencia codificante para un péptido señal, el péptido señal está unido a la secuencia peptídica en lugar de la metionina N terminal descrita en las secuencias mostradas (la secuencia codificante del péptido señal incluye típicamente un codón de inicio que codifica una metionina N terminal). En algunas realizaciones las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido a una proteína homóloga en un 98% con el aminoácido 19-131 del Id. de Sec.
n°: 14. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 2 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 256 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 del Id. de Sec. n°: 2 estén conservados. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido a un fragmento inmunógeno del Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 735 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 del Id. de Sec. n°: 6 estén conservados. S En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido a un fragmento inmunogénico del Id. de Sec. n°: 10 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 333 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 10. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden codificar proteínas que comprenden un péptido señal unido a una proteína que tiene un péptido señal unido a un fragmento inmunógeno de los aminoácidos 19-131 del Id. de Sec. n°: 14, comprendiendo el fragmento al menos 110 residuos de aminoácidos del Id. de Sec. n°: 14.
Se proporcionan en el presente documento construcciones genéticas que pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica antígenos consenso de próstata descritos en el presente documento, incluyendo secuencias consenso de proteínas, las secuencias homólogas a la secuencia consenso de proteína, fragmentos de las secuencias consenso de proteínas y secuencias homólogas a fragmentos de la secuencia consenso de proteína. La construcción genética puede estar presente en la célula como una molécula extracromosómica funcional. La construcción genética puede ser un minicromosoma lineal que incluye centrómero, telómeros o plásmidos o cósmidos.
La construcción genética también puede ser parte de un genoma de un vector viral recombinante, incluyendo adenovirus recombinante, virus asociado a adenovirus recombinante y virus de la vacuna recombinante. La construcción genética puede ser parte del material genético en microorganismos vivos atenuados o vectores microbianos recombinantes que viven en las células.
Las construcciones genéticas pueden comprender elementos reguladores para la expresión de genes de las secuencias codificantes del ácido nucleico. Los elementos reguladores pueden ser un promotor, un potenciador, un codón de iniciación, un codón de parada o una señal de poliadenilación.
Las secuencias de ácidos nucleicos pueden hacer que una construcción genética sea un vector. El vector puede ser capaz de expresar un antígeno en la célula de un mamífero en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmune en el mamífero. El vector puede ser recombinante. El vector puede comprender ácido nucleico heterólogo que codifica el antígeno. El vector puede ser un plásmido. El vector puede ser útil para transfectar células con ácido nucleico que codifica un antígeno, que la célula huésped transformada se cultive y se mantenga en condiciones en las que tiene lugar la expresión del antígeno.
En algunas realizaciones, las secuencias codificantes para un antígeno consenso de próstata único se proporciona en un solo vector. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes para un antígeno consenso de próstata múltiple se proporcionan en un solo vector. En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden secuencias codificantes para múltiples antígenos consenso de próstata en múltiples vectores, ya sea un antígeno por vector o múltiples antígenos por vector.
En algunas realizaciones, las secuencias codificantes de dos o más antígenos consenso de próstata diferentes se pueden proporcionar en un solo vector. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes pueden tener promotores separados que controlan la expresión. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes pueden tener un único promotor que controla la expresión con una secuencia IRES que separa la secuencia codificante. La presencia de la secuencia IRES resulta en la traducción separada del producto de transcripción. En algunas realizaciones, las secuencias codificantes pueden tener un único promotor que controla la expresión con una secuencia codificante que codifica una secuencia peptídica de escisión proteolítica que separa las secuencias codificantes de los antígenos. Se produce un único producto de traducción que luego se procesa por la proteasa que reconoce el sitio de escisión de la proteasa para generar moléculas de proteína separadas. Los sitios de escisión de las proteasas utilizadas se reconocen típicamente por una proteasa presente de manera endógena en la célula donde se produce la expresión. En algunas realizaciones, se puede incluir una secuencia codificante separada para una proteasa para proporcionar la producción de la proteasa necesaria para procesar el producto de traducción de la poliproteína. En algunas realizaciones, los vectores comprenden secuencias codificantes para uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o los siete antígenos de consenso de próstata.
En todas y cada una de las instancias descritas en el presente documento, las secuencias codificantes pueden ser optimizadas para la estabilidad y los altos niveles de expresión. En algunos casos, los codones se seleccionan para reducir la formación de la estructura secundaria del ARN, como la que se forma debido a la unión intramolecular. El vector puede comprender el ácido nucleico heterólogo que codifica un antígeno y puede comprender además una iniciación codón, que puede ser aguas arriba de la secuencia codificante de antígeno, y un codón de parada, que puede ser aguas abajo de la secuencia codificante de antígeno. El codón de iniciación y terminación puede estar en marco con la secuencia codificante del antígeno. los el vector también puede comprender un promotor que está unido operativamente a la secuencia codificante de antígeno. El promotor unido operativamente a la secuencia codificante del antígeno puede ser un promotor del virus simio 40 (SV40), un promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), un promotor del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), como el terminal largo del virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV) repetidor (LTR), un promotor del virus Moloney, un promotor del virus de la leucosis aviar (ALV), un promotor del citomegalovirus (CMV) como el promotor temprano inmediato del CMV, el promotor del virus de Epstein Barr (VEB) o un virus del sarcoma de Rous (VSR) promotor. El promotor también puede ser un promotor de un gen humano tal como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana o metalotioneína humana. El promotor también puede ser un promotor específico de tejido, tal como un promotor específico de músculo o piel, natural o sintético. Los ejemplos de dichos promotores se describen en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° US20040175727, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento en su totalidad.
El vector puede comprender también una señal de poliadenilación, que puede ser aguas debajo de la secuencia codificante del antígeno de consenso de próstata. La señal de poliadenilación puede ser una señal de poliadenilación de SV40, una señal de poliadenilación de LTR, una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (bGH), una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento humano (hGH) o una señal de poliadenilación de la globina p humana . La señal de poliadenilación de SV40 puede ser una señal de poliadenilación de un vector pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
El vector también puede comprender un promotor aguas arriba de la secuencia del antígeno codificante del antígeno de consenso de próstata. El potenciador puede ser necesario para la expresión de ADN. El potenciador puede ser el potenciador de la actina humana, de la miosina humana, de la hemoglobina humana, de la creatina de músculo humano o un potenciador viral tal como uno de CMV, HA, RSV o EBV. Las mejoras en la función polinucleotídica se describen en las patentes de EE. UU. n° 5.593.972, 5.962.428 y WO94/016737.
El vector puede también comprender un origen de replicación de mamífero con el fin de mantener el vector extracromosómicamente y producir múltiples copias del vector en una célula. El vector puede ser pVAXI, pCEP4 o pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA), que puede comprender el origen de replicación del virus de Epstein Barr y la región codificante del antígeno nuclear EBNA-1, que puede producir una replicación episomal de muchas copias sin integración. La columna vertebral del vector puede ser pAV0242. El vector puede ser un vector de adenovirus defectuoso de replicación tipo 5 (Ad5).
El vector también puede comprender una secuencia reguladora, que puede ser muy adecuada para la expresión génica en una célula de mamífero o humano en el que se administra el vector. La secuencia codificante de antígeno de consenso de próstata puede comprender un codón, que puede permitir una transcripción más eficiente de la secuencia codificante en la célula huésped.
El vector puede ser pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), que se puede utilizar para la producción de proteína en Escherichia coli (E. coli). El vector también puede ser pYES2 (Invitrogen, San Diego, California), que se puede usar para la producción de proteínas en cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae. El vector también puede ser del sistema de expresión de baculovirus completo MAXBAC ™ (Invitrogen, San Diego, California), que se puede usar para la producción de proteínas en células de insectos. El vector también puede ser pcDNA I o pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, California), que se puede usar para la producción de proteínas en células de mamíferos como las células de ovario de hámster chino (CHO). El vector puede ser vectores de expresión o sistemas para producir proteínas por técnicas rutinarias y materiales de partida fácilmente disponibles, incluidos Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor (1989), que se incorpora completamente por referencia.
Las vacunas pueden comprender uno o más de los antígenos de próstata descritos en el presente documento y/o las vacunas pueden comprender una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más de los antígenos consenso de próstata seleccionados de este grupo. Las vacunas pueden comprender uno o más de los antígenos consenso de próstata que se describen en el presente documento en combinación con otras proteínas de próstata inmunogénicas con secuencias distintas de las secuencias de consenso descritas en el presente documento que incluyen secuencias nativas y/o las vacunas pueden comprender una o más secuencias de ácido nucleico que codifican una o más de los antígenos consenso de próstata seleccionados de este grupo en combinación con moléculas de ácido nucleico que codifican otros antígenos de próstata con secuencias distintas de las secuencias de consenso descritas en el presente documento.
Aunque no está limitado por la teoría científica, una vacuna que se puede usar para provocar una respuesta inmune (humoral, celular o ambas) en general contra las células de cáncer de próstata puede comprender una o más de las siguientes secuencias de ácido nucleico que codifican una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: antígeno de consenso PSA 1, antígeno de consenso PSA 2, antígeno de consenso PSMA 1, antígeno de consenso PSMA 2, antígeno de consenso STEAP 1, antígeno de consenso STEAP 2 y antígeno de consenso PSCA 1. Las secuencias codificantes también puede incluir aquellas proporcionadas en el presente documento que comprenden secuencias homólogas, fragmentos y secuencias homólogas de fragmentos.
Algunas realizaciones descritas en este documento proporcionan métodos de generación de respuestas inmunes contra células de cáncer de próstata que comprende administrar a un individuo una o más composiciones que comprenden colectivamente una o más de secuencias codificantes o combinaciones descritas en este documento. Algunas realizaciones proporcionan métodos para la vacunación profiláctica de un individuo contra el cáncer de próstata que comprenden administrar una o más composiciones que comprenden colectivamente una o más secuencias codificantes o combinaciones descritas en el presente documento. Algunas realizaciones proporcionan métodos para vacunar terapéuticamente a un individuo que tiene cáncer de próstata que comprende administrar una o más composiciones que comprenden colectivamente una o más secuencias codificantes o combinaciones descritas en el presente documento.
4. Composiciones farmacéuticas.
Se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención que comprenden desde aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 10 mg de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden entre: 1) al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nanogramos, o al menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 o 1000 microgramos, o al menos 1,5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 o 10 mg o más; y 2) hasta e incluyendo 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 nanogramos, o hasta e incluyendo 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 975, 980, 980, 985, 990, 995 o 1000 microgramos, o incluso de 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 mg. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden desde aproximadamente 5 nanogramos a aproximadamente 10 mg de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden desde aproximadamente 25 nanogramos a aproximadamente 5 mg de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 50 nanogramos a aproximadamente 1 mg de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 5 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 10 a aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 15 a aproximadamente 150 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 20 a aproximadamente 100 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 25 a aproximadamente 75 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 30 a aproximadamente 50 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 35 a aproximadamente 40 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden desde aproximadamente 10 microgramos a aproximadamente 100 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden desde aproximadamente 20 microgramos a aproximadamente 80 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden desde aproximadamente 25 microgramos a aproximadamente 60 microgramos de ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden desde aproximadamente 30 nanogramos a aproximadamente 50 microgramos del ADN. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden desde aproximadamente 35 nanogramos a aproximadamente 45 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen desde aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramos de ADN.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se formulan de acuerdo con el modo de administración a ser utilizado. En los casos en que las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, son estériles, libres de pirógenos y libres de partículas. Preferiblemente se utiliza una formulación isotónica. En general, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotónicas tales como solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. En algunas realizaciones, se añade un agente de vasoconstricción a la formulación.
Preferiblemente la composición farmacéutica es una vacuna, y más preferiblemente una vacuna de ADN.
La vacuna puede ser una vacuna de ADN. La vacuna de ADN puede comprender una pluralidad de plásmidos iguales o diferentes que comprenden secuencias codificantes de ácido nucleico para uno o más de antígenos de consenso de próstata. La vacuna de ADN puede comprender una o más secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más de los antígenos de consenso de próstata. Cuando la vacuna de ADN comprende secuencias codificantes de más de un antígeno de consenso de próstata, todas estas secuencias pueden estar presentes en un solo plásmido, o cada una de estas secuencias puede estar presente en plásmidos diferentes.
En algunas realizaciones, las vacunas pueden comprender secuencias de ácido nucleico que codifican una o más secuencias de antígenos consenso de próstata en combinación con uno o más de los antígenos de consenso de próstata.
Las vacunas de ADN se describen en las Patente U.S. n° 5.593.972, 5.739.118, 5.817.637, 5.830.876, 5.962.428, 5.981.505, 5.580.859, 5.703.055, y 5.676.594. La vacuna de ADN puede comprender además elementos o reactivos que le impiden integrarse en el cromosoma. La vacuna puede ser un ARN del antígeno prostático. La vacuna de ARN puede ser introducida en la célula.
La vacuna puede ser una vacuna recombinante que comprende la construcción genético o antígeno descrito anteriormente. La vacuna también puede comprender uno o más antígenos consenso de próstata en forma de una o más subunidades de proteínas, o una o más partículas virales atenuadas que comprenden uno o más antígenos de consenso de próstata. La vacuna atenuada puede ser vacunas vivas atenuadas, vacunas muertas y vacunas que utilizan vectores recombinantes para administrar genes foráneos que codifican uno o más antígenos de consenso de próstata, y también vacunas de subunidades y de glicoproteínas. Ejemplos de vacunas vivas atenuadas, aquellas que utilizan vectores recombinantes para administrar antígenos de próstata, vacunas de subunidades y vacunas de glicoproteínas se describen en las patentes de U.S. n°: 4.510.245; 4,797,368; 4.722.848; 4.790.987; 4.920.209; 5.017.487; 5.077.044; 5,110,587; 5.112.749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5.453.364; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5.482.713; 5,591,439; 5.643.579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6.034.298; 6.042.836; 6.156.319 y 6.589.529. La vacuna proporcionada puede utilizarse para inducir respuestas inmunes que incluyen respuestas inmunes terapéuticas o profilácticas. Pueden generarse anticuerpos y/o células T asesinas que se dirigen al antígeno de consenso prostático. Dichos anticuerpos y células se pueden aislar.
La vacuna puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente farmacéuticamente aceptable pueden ser moléculas funcionales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un agente facilitador de la transfección, que puede incluir agentes tensioactivos, tales como complejos estimulantes inmunes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freunds, análogo de LPS que incluye monofosforil lípido A, péptidos de murilo, análogos de quinona, vesículas tales como escualeno, ácido hialurónico, lípidos, liposomas, iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas, u otros agentes facilitadores de la transfección conocidos.
El agente facilitador de la transfección es un polianión, policatión, incluyendo poli-L-glutamato (LGS), o lípido. El agente facilitador de la transfección es poli-L-glutamato, y más preferiblemente, el poli-L-glutamato está presente en la vacuna a una concentración inferior a 6 mg/ml. El agente facilitador de la transfección también puede incluir agentes tensioactivos como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freunds, análogo de LPS que incluye monofosforil lípido A, péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno, y también puede utilizarse el ácido hialurónico administrado conjuntamente con la construcción genética. En algunas realizaciones, las vacunas de vector de ADN también pueden incluir un agente facilitador de la transfección tal como lípidos, liposomas, incluyendo liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, como una mezcla de ADN-liposoma (véase, por ejemplo, el documento WO9324640), iones de calcio, proteínas virales, polianiones, policationes o nanopartículas, u otros agentes facilitadores de la transfección conocidos. Preferiblemente, el agente facilitador de la transfección es un polianión, policatión, que incluye poli-L-glutamato (LGS), o lípido. La concentración del agente de transfección en la vacuna es inferior a 4 mg/ml, inferior a 2 mg/ml, inferior a 1 mg/ml, inferior a 0,750 mg/ml, inferior a 0,500 mg/ml, inferior a 0,250 mg/ml, inferior a 0,100 mg/ml, inferior a 0,050 mg/ml o inferior a 0,010 mg/ml.
El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un adyuvante. El adyuvante puede ser otros genes que se expresan en plásmidos alternativos o se administran como proteínas en combinación con el plásmido anterior en la vacuna. El adyuvante se puede seleccionar del grupo que consiste en: interferón a (IFN-a), interferón p (IFN-p), interferón y, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), quimiocina que atrae a los linfocitos T cutáneos (CTACK), quimiocina expresada en el timo epitelial (Te Ck ), quimiocina epitelial asociada a las mucosas (MEC), IL-12, IL-15, Mh C, CD80, CD86 incluyendo IL15 con la secuencia de señal eliminada y opcionalmente incluyendo el péptido señal de IgE. El adyuvante puede ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, o una combinación de los mismos.
Otros genes que pueden ser adyuvantes útiles incluyen los que codifican: MCP-1, MIP-LA, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM- 2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL- 4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inactivo, SAP K, SAP-1, Jn K, genes de respuesta a interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, ligando de RANK, Ox40, ligando de Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de los mismos.
La vacuna puede comprender además un agente facilitador de vacunas genéticas como se describe en la patente U.S. con número de serie 021.579 presentado el 1 de abril de 1994.
5. Métodos de suministro
En este documento se proporciona un método para suministrar las formulaciones farmacéuticas, preferiblemente vacunas, para proporcionar construcciones genéticas y antígeno consenso de próstata que comprenden epítopos que los hacen inmunógenos particulares efectivos contra los que se puede inducir una respuesta inmune a las células de cáncer de próstata. El método de administración de la vacuna, o la vacunación, se puede proporcionar para inducir una respuesta inmunitaria terapéutica y/o profiláctica. La vacuna se puede administrar a un individuo para modular la actividad del sistema inmunitario del mamífero y mejorar la respuesta inmunitaria.
Tras suministrar la vacuna al mamífero, y tras entrar el vector en las células del mamífero, las células transfectadas se expresan y secretan la correspondiente proteína de consenso de próstata. Estas proteínas secretadas, o antígenos sintéticos, serán reconocidos por el sistema inmune, que montará una respuesta inmune que puede incluir: anticuerpos producidos contra los antígenos y respuesta de células T específicamente contra el antígeno. En algunos ejemplos, un mamífero vacunado con las vacunas analizadas en este documento tendrá un sistema inmunitario preparado. La vacuna se puede administrar a un individuo para modular la actividad del sistema inmunitario del individuo, mejorando así la respuesta inmune.
La vacuna puede suministrarse en forma de una vacuna y los métodos de suministro de vacunas de ADN de ADN se describen en la patente U.S. n° 4.945.050 y 5.036.006, que se incorporan ambas en su totalidad por referencia. La vacuna puede suministrarse a un mamífero para provocar una respuesta inmune en un mamífero. El mamífero puede ser humano, primate no humano, vaca, cerdo, oveja, cabra, antílope, bisonte, búfalo de agua, bóvidos, venados, erizos, elefantes, llamas, alpacas, ratones, ratas o pollos, y preferiblemente humanos, vacas, cerdos o pollos.
a. Tratamientos combinados
Las composiciones farmacéuticas, preferiblemente vacunas, se pueden administrar en combinación con una o más de otras proteínas de próstata o genes. La vacuna se puede administrar en combinación con proteínas o genes que codifican adyuvantes, que pueden incluir: interferón a (IFN-a), interferón p (IFN-p), interferón y, IL-12, IL-15, IL 28, CTACK, Te Ck , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-c Sf , IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, c D40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inactivo, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta a interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAILR3, TRAIL-R4, RANK, ligando de RANK, Ox40, ligando de Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1 o TAP2, o fragmentos funcionales de los mismos.
b. Rutas de administración
La vacuna puede administrarse por diferentes vías, incluyendo oral, parenteral, sublingual, transdérmica, rectal, transmucosa, tópica, por inhalación, vía administración bucal, intrapleural, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intranasal, intratecal e intraarticular o combinaciones de las mismas. Para uso veterinario, la composición puede administrarse como una formulación adecuadamente aceptable de acuerdo con la práctica veterinaria habitual. El veterinario puede determinar fácilmente el régimen de dosificación y la vía de administración que sea más apropiada para un animal en particular. La vacuna puede administrarse mediante jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin agujas, "pistolas de bombardeo con microproyectiles" u otros métodos físicos como la electroporación ("EP"), "método hidrodinámico", o ultrasonido.
El vector de la vacuna puede ser suministrado al mamífero mediante varias tecnologías bien conocidas incluyendo la inyección de ADN (también conocida como vacunación de ADN) con y sin electroporación in vivo, mediada por liposomas, facilitado por nanopartículas, vectores recombinantes tales como adenovirus recombinante, virus asociado a adenovirus recombinante y vacuna recombinante. El antígeno prostático se puede administrar mediante inyección de ADN y junto con la electroporación in vivo.
c. Electroporación
La administración de la vacuna mediante electroporación de los plásmidos de la vacuna se puede realizar utilizando dispositivos de electroporación que pueden configurarse para administrar a un tejido deseado de un mamífero un pulso de energía eficaz para hacer que se formen poros reversibles en las membranas celulares, y en algunas realizaciones, el pulso de energía es una corriente constante similar a una entrada de corriente preestablecida por un usuario.
En algunas formas de realización donde se utiliza la electroporación, el dispositivo de electroporación puede comprender un componente de electroporación y un conjunto de electrodos o el conjunto de empuñadura. El componente de electroporación puede incluir e incorporar uno o más de los diversos elementos de los dispositivos de electroporación, que incluyen: controlador, generador de ondas de corriente, comprobador de impedancia, registrador de forma de onda, elemento de entrada, elemento de informe de estado, puerto de comunicación, componente de memoria, fuente de alimentación e interruptor de alimentación. La electroporación se puede lograr utilizando un dispositivo de electroporación in vivo, por ejemplo, el sistema CELLECTRA® EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) o el electroporador Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) para facilitar la transfección de células por el plásmido.
El componente de la electroporación puede funcionar como un elemento de los dispositivos de electroporación, y los otros elementos son elementos separados (o componentes) en comunicación con el componente de la electroporación. El componente de electroporación puede funcionar como más de un elemento de los dispositivos de electroporación, que puede estar en comunicación con otros elementos de los dispositivos de electroporación separados del componente de electroporación. Los elementos de los dispositivos de electroporación existentes como partes de un dispositivo electromecánico o mecánico pueden no estar limitados, ya que los elementos pueden funcionar como un dispositivo o como elementos separados en comunicación entre sí. El componente de electroporación puede ser capaz de administrar el pulso de energía que produce la corriente constante en el tejido deseado, e incluye un mecanismo de retroalimentación. El conjunto de electrodos puede incluir una matriz de electrodos que tiene una pluralidad de electrodos en una disposición espacial, en la que el conjunto de electrodos recibe el pulso de energía del componente de electroporación y lo entrega al tejido deseado a través de los electrodos. Al menos uno de la pluralidad de electrodos es neutral durante el suministro del pulso de energía y mide la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al componente de electroporación. El mecanismo de retroalimentación puede recibir la impedancia medida y puede ajustar el pulso de energía suministrado por el componente de electroporación para mantener la corriente constante.
Una pluralidad de electrodos puede entregar el pulso de energía en un patrón descentralizado. La pluralidad de electrodos puede suministrar el pulso de energía en el patrón descentralizado a través del control de los electrodos bajo una secuencia programada, y la secuencia programada es ingresada por un usuario al componente de electroporación. La secuencia programada puede comprender una pluralidad de impulsos entregados en secuencia, en donde cada impulso de la pluralidad de impulsos se administra mediante al menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia, y en donde un impulso subsiguiente de la pluralidad de impulsos se administra mediante uno diferente de al menos dos electrodos activos con un electrodo neutro que mide la impedancia.
El mecanismo de retroalimentación puede realizarse mediante hardware o software. El mecanismo de retroalimentación puede realizarse mediante un circuito analógico de circuito cerrado. La retroalimentación ocurre cada 50 |is, 20 |is, 10 |is o 1 |is, pero es preferiblemente una retroalimentación en tiempo real o instantánea (es decir, sustancialmente instantánea según lo determinan las técnicas disponibles para determinar el tiempo de respuesta). El electrodo neutro puede medir la impedancia en el tejido deseado y comunica la impedancia al mecanismo de realimentación, y el mecanismo de realimentación responde a la impedancia y ajusta el pulso de energía para mantener la corriente constante en un valor similar a la corriente preestablecida. El mecanismo de retroalimentación puede mantener la corriente constante de forma continua e instantánea durante el suministro del pulso de energía.
Ejemplos de dispositivos de electroporación y métodos de electroporación que pueden facilitar el suministro de las vacunas de ADN de la presente invención, incluyen los descritos en la patente U.S. n° 7.245.963 de Draghia-Akli, et al., Pub. de Patente U.S. 2005/0052630 presentado por Smith, et al. Se pueden usar otros dispositivos de electroporación y métodos de electroporación para facilitar el suministro de las vacunas de ADN. Patente U.S. n° 7.245.963 de Draghia-Akli, et al. describe los sistemas de electrodos modulares y su uso para facilitar la introducción de una biomolécula en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Los sistemas de electrodos modulares pueden comprender una pluralidad de electrodos de aguja; una aguja hipodérmica; un eléctrico conector que proporciona un enlace conductor desde un controlador de pulso de corriente constante programable a la pluralidad de electrodos de aguja; y una fuente de alimentación. Un operador puede agarrar la pluralidad de electrodos de aguja que están montados en una estructura de soporte e insertarlos firmemente en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Las biomoléculas se administran a través de la aguja hipodérmica en el tejido seleccionado. El controlador de pulso de corriente constante programable se activa y el pulso eléctrico de corriente constante se aplica a la pluralidad de electrodos de aguja. El pulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la biomolécula en la célula entre la pluralidad de electrodos.
La publicación de patente U.S. 2005/0052630 presentada por Smith, et al. describe un dispositivo de electroporación que se puede utilizar para facilitar de manera efectiva la introducción de una biomolécula en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. El dispositivo de electroporación comprende un dispositivo electro-cinético ("dispositivo EKD") cuyo funcionamiento está especificado por software o firmware. El dispositivo EKD produce una serie de patrones de pulso de corriente constante programables entre electrodos en una matriz basada en el control del usuario y la entrada de los parámetros de pulso, y permite el almacenamiento y la adquisición de datos de corriente de forma de onda. El dispositivo de electroporación también comprende un disco de electrodo reemplazable que tiene una serie de electrodos de aguja, un canal de inyección central para una aguja de inyección y un disco de guía extraíble.
Las matrices de electrodos y los métodos descritos en la patente U.S. n° 7.245.963 y la patente de U.S. n° 2005/0052630 puede adaptarse para una penetración profunda no solo en tejidos como el músculo, sino también en otros tejidos u órganos. Debido a la configuración de la matriz de electrodos, la aguja de inyección (para administrar la biomolécula de elección) también se inserta completamente en el órgano diana, y la inyección se administra perpendicular al tejido diana, en el área que está delineada previamente por los electrodos. Los electrodos descritos en la patente U.S. n° 7.245.963 y en la publicación de patente U.S. n° 2005/005263 son preferiblemente 20 mm de largo y calibre 21.
Adicionalmente, se contempla en algunas realizaciones que incorporan dispositivos de electroporación y usos de los mismos, hay dispositivos de electroporación que son los descritos en las siguientes patentes: patente U.S. n° 5.273.525 emitida el 28 de diciembre de 1993, patentes U.S. n° 6,110,161 expedida el 29 de agosto de 2000, 6.261.281 emitida el 17 de julio de 2001 y 6.958.060 emitida el 25 de octubre de 2005, y la patente U.S. n° 6,939,862 emitida el 6 de septiembre de 2005. Además, se contemplan aquí las patentes que cubren la materia proporcionada en la patente U.S. n° 6.697.669 emitida el 24 de febrero de 2004, se refieren al suministro de ADN utilizando una variedad de dispositivos, y la patente U.S. n° 7.328.064, expedida el 5 de febrero de 2008, según el método de inyección de a Dn . Otra realización de un dispositivo de electroporación para ser utilizado con los antígenos de cáncer descritos aquí es el dispositivo Elgen EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA).
d. Método de preparación de la vacuna
Aquí se incluye métodos para preparar los plásmidos de ADN que comprenden las vacunas de ADN descritas en este documento. Los plásmidos de ADN, después de la etapa de subclonación final en el plásmido de expresión de mamíferos, se pueden usar para inocular un cultivo celular en un tanque de fermentación a gran escala, utilizando métodos conocidos en la técnica.
Los plásmidos de ADN para su uso con los dispositivos de PE de la presente invención se pueden formular o fabricar usando una combinación de dispositivos y técnicas conocidas, pero preferiblemente se fabrican utilizando una técnica de fabricación de plásmido optimizada que se describe en una solicitud de licencia copendiente de EE. UU., con número de serie provisional n° 60/939.792, que se presentó el 23 de mayo de 2007. En algunos ejemplos, los plásmidos de ADN utilizados en estos estudios se pueden formular a concentraciones mayores o iguales a 10 mg/ml. Las técnicas de fabricación también incluyen o incorporan diversos dispositivos y protocolos que son comúnmente conocidos por los expertos en la técnica, incluidos los descritos en una patente con licencia, patente U.S. n° 7.238.522, que se publicó el 3 de julio de 2007.
Ejemplos
La presente invención se ilustra adicionalmente en los siguientes Ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se proporcionan solo a modo de ilustración. A partir de la discusión anterior y estos ejemplos, un experto en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención, y sin apartarse del alcance de la misma, puede realizar diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones. Por lo tanto, serán evidentes para los expertos en la técnica diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en este documento a partir de la descripción anterior. Tales modificaciones también están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, que definen el objeto para el que se busca la protección.
Ejemplo 1
Los inmunógenos de consenso para PSA y PSMA se diseñaron a partir de las secuencias de macaco y humano disponibles en la base de datos GenBank como se describió previamente en Laddy, D.J., Yan, J., Corbitt, N., Kobasa, D., Kobinger, G.P., Weiner, D.B. (2007). Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine. 25,2984-2989, y Laddy, D.J., Yan, J., Kutzler, M., Kobasa, D., Kobinger, G.P., Khan, A.S., Greenhouse, J., Sardesai, N.Y., Draghia-Akli, R., Weiner, D.B. (2008). Heterosubtypic Protection against Pathogenic Human and Avian Influenza Viruses via In Vivo Electroporation of Synthetic Consensus DNA Antigens. PLoS ONE. 3, e2517.
Las secuencias de antígenos de consenso fueron sintetizados por GeneScript (Piscataway, NJ). Se incluyó una etiqueta HA en el extremo C de la secuencia del antígeno. Las secuencias de antígenos se optimizaron para la estabilidad del ARNm y el uso de codones en humanos. Las secuencias finales se clonaron en los sitios BamHI y XhoI del vector pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Se generó un antígeno de consenso PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2). Esta secuencia, que comprende 261 aminoácidos, se comparó con cada una de las secuencias de PSA expuestas en la Tabla 1. Las secuencias de PSA utilizadas incluyen dos secuencias humanas, una secuencia de M. fascicularis y una secuencia de M. mulatta. La Tabla 1 incluye el Id. de Sec. n°: y el número de acceso para cada secuencia utilizada en la comparación con el antígeno de consenso PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2).
Tabla 1
Figure imgf000023_0001
Se generó una alineación de secuencias múltiples de secuencias de PSA de H. sapiens (Id. de Sec. n°: 17 y Id. de Sec. n°: 18), M. mulatta (Id. de Sec. n°: 20) y M. facicularis: (Id. de Sec. n° 19) con el antígeno de consenso PSA 1 (Id. de Sec. n°: 2). KLK3 (kallikreina 3) es el gen que codifica PSA y es pseudónimo de PSA. El antígeno PSA 1 es homólogo en un 91% a H. sapiens, 96% homólogo a M. mulatta y 95% homólogo a M. facicularis respecto a las secuencias de proteína de PSA de longitud completa.
Ejemplo 2
Se generó un antígeno consenso PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4). Esta secuencia, que comprende 279 aminoácidos que incluye una secuencia líder de IgE, se comparó con cada una de las secuencias de PSA expuestas en la Tabla 2. Las secuencias de PSA utilizadas incluyen dos secuencias humanas, una secuencia de M. fascicularis y una secuencia de M. mulata. La Tabla 2 incluye el Id. de Sec. n°: y el número de acceso para cada secuencia utilizada en la comparación con el antígeno de consenso PSA 2 (Id. de Sec. n°: 4).
Tabla 2
Figure imgf000023_0002
Se generó una alineación de secuencias múltiples de secuencias de PSA de H. sapiens (Id. de Sec. n°: 17 y Id. de Sec. n°: 18), M. mulatta (Id. de Sec. n°: 21) y M. facicularis: (Id. de Sec. n° 19) con el antígeno consenso PSA 1 (Id. de Sec. n°: 4). KLK3 (kallikreina 3) es el gen que codifica PSA y es pseudónimo de PSA. El antígeno PSA 1 es un 90-91% homólogo a H. sapiens y un 95% homólogo respecto a las secuencias de proteína de PSA de longitud completa, y un 95% homólogo a la secuencia de proteínas de PSA parcial d M. mulatta.
Ejemplo 3
Se generó un antígeno consenso PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6). Esta secuencia, que comprende 750 aminoácidos, se comparó con cada una de las secuencias de PSMA expuestas en la Tabla 3. Las secuencias de PSMA utilizadas incluyen dos secuencias humanas y una secuencia de M. mulatta. La Tabla 3 incluye el Id. de Sec. n°: y el número de acceso para cada secuencia utilizada en la comparación con el antígeno consenso PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6).
Tabla 3
Figure imgf000024_0001
Se generó un alineamiento de secuencia múltiple de secuencias de PSMA de H. Sapiens y M. mulatta con el antígeno PSMA 1. La secuencia consenso del antígeno PSMA 1 (Id. de Sec. n°: 6) es homóloga en un 96% a PSMA de H. sapiens (Id. de Sec. n° : 22 y Id. de Sec. n°: 23) y homóloga en un 94% a la secuencia de la proteína PSMA de longitud completa de M. mulatta (Id. de Sec. n°: 24).
Ejemplo 4
Se generó un antígeno consenso PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8). Esta secuencia, que comprende 767 aminoácidos que incluye una secuencia líder de IgE, se comparó con cada una de las secuencias de PSMA expuestas en la Tabla 4. Las secuencias de PSMA utilizadas incluyen dos secuencias humanas y una secuencia de M. mulatta. La Tabla 4 incluye el Id. de Sec. n°: y el número de acceso para cada secuencia utilizada en la comparación con el antígeno consenso PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8).
Tabla 4
Figure imgf000024_0002
Se generó un alineamiento de secuencia múltiple de H. sapiens (Id. de Sec. n°: 22 y Id. de Sec. n°: 23) y secuencias de M. mulatta PSMA (Id. de Sec. n°: 24 y Id. de Sec. n°: 25) con el antígeno PSMA 2. La secuencia consenso del antígeno PSMA 2 (Id. de Sec. n°: 8) es un 96% homóloga a las secuencias de proteínas PSMA de H. sapiens y un 94% homóloga a las secuencias de proteínas PSMA de M. mulatta.
Ejemplo 5
Se generó un antígeno consenso STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10). Esta secuencia, que comprende 339 aminoácidos, se comparó con cada una de las secuencias STEAP expuestas en la Tabla 5. Las secuencias STEAP utilizadas incluyen dos secuencias humanas de longitud completa, una secuencia de longitud completa de M. mulatta y dos secuencias humanas más cortas. La Tabla 5 incluye el Id. de Sec. n°: y el número de acceso para cada secuencia utilizada en la comparación con el consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10).
Tabla 5
Figure imgf000024_0003
Se generó una alineación de secuencias múltiples de secuencias STEAP de H. sapiens y M. mulatta con el antígeno consenso STEAP 1. La secuencia consenso del antígeno STEAP 1 (Id. de Sec. n°: 10) es homóloga en un 99% a las isoformas humanas de longitud completa ( Id. de Sec. n°: 26 y Id. de Sec. n°: 27), 94% homólogas a las isoformas de H. sapiens más cortas (Id. de Sec. n°: 29 y Id. de Sec. n°: 30), y 94% homólogas a la secuencia de proteína STEAP 1 de longitud completa de M. mulatta (Id. de Sec. n°: 28).
Ejemplo 6
Se generó un antígeno consenso STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12). Esta secuencia, que comprende 356 aminoácidos, se comparó con cada una de las secuencias de STEAP expuestas en la Tabla 6. Las secuencias de STEAP usadas incluyen dos secuencias humanas de longitud completa, una secuencia de longitud completa de M. mulatta y dos secuencias humanas más cortas. La tabla 6 incluye el Id. de Sec. n°: y el número de acceso para cada secuencia utilizada en la comparación con el antígeno consenso STEAP 2 (Id. de Sec. n°: 12).
Tabla 6
Figure imgf000025_0001
Se generó una alineación de secuencias múltiples de secuencias STEAP 1 de H. Sapiens y M. mulatta con el antígeno consenso STEAP1 2. La secuencia consenso del antígeno STEAP1 (Id. de Sec. n°: l2) es 94% homóloga a las isoformas humanas de longitud completa (Id. de Sec. n°: 26 y Id. de Sec. n°: 27), 88% homólogas a las isoformas de H. sapiens más cortas (Id. de Sec. n°: 29 y Id. de Sec. n°: 30), y 94% homólogas a las secuencias proteína STEAP1 de longitud completa de M. mulatta (Id. de Sec. n°: 28).
Ejemplo 7
Se generó un antígeno consenso PSCA (Id. de Sec. n°: 14). Esta secuencia, que comprende 131 aminoácidos incluida la secuencia líder de IgE, se comparó con la secuencia de PSCA expuesta en la Tabla 7. La secuencia de PSCA utilizada fue una secuencia humana de longitud completa. La Tabla 7 incluye el Id. de Sec. n°: y el número de acceso para la secuencia utilizada en la comparación con el antígeno de consenso PSCA (Id. de Sec. n°: 14).
Tabla 7
Figure imgf000025_0002
Se generó un alineamiento de secuencia múltiple de la secuencia de PSCA de H. Sapiens (Id. de Sec. n°: 31) con el antígeno de consenso de PSCA (Id. de Sec. n°: 14). La secuencia de consenso del antígeno de PSCA es un 87% homóloga a la de PSCA de H. sapiens de longitud completa .
Ejemplo 8
La traducción in vitro se realizó para confirmar la expresión de los antígenos de PSA y PSMA. Se utilizaron el sistema de transcripción/traducción de acoplamiento rápido TNT® y 35S-metionina (Promega). El vector pVAX solo (control negativo) o el esqueleto pVAX con los insertos de antígeno PSA o PSMA y 35S-metionina se agregaron a la mezcla de reacción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción se llevó a cabo a 30 °C durante 2 horas. Las proteínas marcadas se inmunoprecipitaron con gel de afinidad anti-HA (Sigma, St. Louis, MO) por rotación durante la noche en un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) a 4 °C. Las proteínas inmunoprecipitadas se sometieron a electroforesis en un gel SDS-PAGE que se fijó y se secó posteriormente. La expresión de las proteínas marcadas con 35S se detectó mediante autorradiografía. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Ejemplo 9
La inmunogenicidad celular de los antígenos PSA y PSMA se determinó mediante interferón gamma ELISpot.
Se adquirieron ratones hembra de 4 a 6 semanas de edad BALB/c de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Todos los animales se alojaron en una instalación de temperatura controlada y con ciclo de luz en la Universidad de Pennsylvania. El cuidado de los animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de la Salud y el Comité de Uso y Cuidado Institucional de la Universidad de Pennsylvania .
Para los estudios de inmunogenicidad celular, se administraron 10 o 20 |ig de cada antígeno al músculo tibial anterior de los ratones Balb/c mediante inyección intramuscular seguida de electroporación utilizando el dispositivo de corriente constante adaptativa CELLECTRA® (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA). Los ratones (n = 5 por grupo) recibieron 2 inmunizaciones en las semanas 0 y 2. Se administraron dos pulsos de onda cuadrada de corriente constante de 0,1 amperios a través de una matriz triangular de 3 electrodos que consta de electrodos de acero inoxidable sólido de calibre 26. Cada pulso fue de 52 milisegundos de duración con un retraso de 1 segundo entre pulsos. Los ratones recibieron un total de 2 inmunizaciones que se administraron con 2 semanas de diferencia. Los ratones fueron humanamente sacrificados 1 semana después de la segunda inmunización para el análisis de las respuestas inmunes celulares y humorales.
Se evaluaron las respuestas inmunes celulares y humorales 1 semana después de la última inmunización (semana 5). Se usó el análisis ELISpot para determinar la secreción específica de antígeno de IFNy. Se usó el anticuerpo de captura de IFNy de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN) para recubrir las placas Immobilon-P de fondo plano (Millipore, Billerica, MA) durante la noche a 4 °C. Los esplenocitos se aislaron asépticamente y se resuspendieron en medio R10 (medio 1640 del Instituto Rosewell Park Memorial con un suplemento de suero bovino fetal al 10%, antibiótico antimicótico al 1% y 2-mercaptoetanol al 0,1%). Se agregaron 2x105 esplenocitos de ratones inmunizados a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y se estimularon durante la noche a 37 °C, 5% de CO2 , en presencia de R10 (control negativo), concanavalina A (control positivo) (Sigma, St. Louis, MO) o grupos de péptidos específicos de antígeno. Al día siguiente, se añadió anticuerpo de detección de IFNy de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN) a las placas que luego se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se añadió estreptavidina-ALP (MabTech, Suecia) a las placas durante 2 horas y las manchas específicas de antígeno se visualizaron con sustrato BCIP/NPT (MabTech, Suecia). Los péptidos de PSA y PSMA fueron péptidos 15-meros que abarcaban toda la longitud del inmunógeno consenso, sin incluir la etiqueta HA o la secuencia líder, que se superponen con 11 aminoácidos, y se sintetizaron por GenScript (Piscataway, NJ). Los péptidos de PSA y PSMA se utilizaron en una concentración final de 1,0 |ig/ml para cada péptido. El IFNy ELISpot se utilizó para evaluar las respuestas celulares específicas de antígeno 1 semana después de la última inmunización. Para PSA, las respuestas de IFNy fueron similares para las dosis de vacuna de 10 |ig (772,2 /- 138,2 SFU) y 20 |ig (771,1 /- 155,2 SFU) (Figura 2A). En contraste, hubo un aumento dependiente de la dosis en las respuestas de IFNy específicas de PSMA con 20 microgramos de la vacuna (1585,0 /- 194,0 SFU) en comparación con 10 |ig de la vacuna (1047,2 /- 160,7 SFU) (Figura 2B) . Se observó un ruido de fondo mínimo para las respuestas de PSA o PSMA en ratones sin tratamiento previo.
Ejemplo 10
Producción de células T CD4+ y CD8+ inducidas por la vacuna de IFNy, IL-2 y TNFa
La inmunogenicidad celular se caracterizó además por citometría de flujo para el co-suministro de vacunas de PSA y PSMA. La producción de células T CD4+ y CD8+ específicas de antígeno de IFNy, IL-2 y TNFa se determinó para la respuesta específica de vacuna total y los componentes de PSA y PSMA de la respuesta específica de vacuna total (n = 5).
Las respuestas inmunes celulares también se determinaron mediante tinción intracelular de citoquinas y citometría de flujo utilizando el kit CytoFix/CytoPerm según las instrucciones del fabricante (BD Biosciences, San Diego, CA). Los esplenocitos recogidos de ratones inmunizados se lavaron con PBS y luego se resuspendieron en medio R10 hasta una concentración final de 107 células/ml. Las células se sembraron en placas de fondo redondo de 96 pocillos en un volumen de 100 |il y se agregaron 100 |il adicionales de medio R10 (control negativo), medio que contiene grupos de péptidos específicos de antígeno o medio que contiene acetato de miristato de fósforo (PMA, 10 ng/ml) e ionomicina (250 ng/ml; control positivo) (Sigma, St. Louis, MO) y las placas se incubaron a 37 °C, 5% CO2 , durante 6 horas. Todos los medios de estimulación contenían 1 |ig/|il de GolgiPlug y GolgiStop (BD Biosciences, San Diego, CA). Al final del período de incubación, las placas se centrifugaron y se lavaron dos veces con PBS. Las células se tiñeron luego con un colorante violeta para determinar su viabilidad (colorante de viabilidad violeta VIVO/MUERTO, Invitrogen; Carlsbad, CA) durante 30 minutos a 4 °C. Después de lavar como anteriormente con PBS, las células se tiñeron externamente durante 30 minutos con anti-CD4 PerCPCy5.5 y anti-CD8 APC a 4 °C, seguido de fijación y permeabilización. Se añadieron anti-CD3 PE-Cy5, anti-IL-2 PE, anti-IFNY AlexaFluor-700 y anti-TNFa FITC (b D Biosciences, San Diego, CA) y las células se incubaron nuevamente a 4 °C durante 30 minutos. A las células se les da un lavado final con PBS y se fijan en 1% PFA.
La administración conjunta de la vacuna de PSA y PSMA indujo una fuerte secreción de IFNy, IL-2 y TNFa en CD4+. El porcentaje de linfocitos T CD4+ productores de IFNy específico para PSA (0,21%) y específico de PSMA (0,24%) se correspondió igualmente al total de IFNy de células T CD4+ específicas de vacuna (0,44%) (Figura 3A). Las células T CD4+ específicas de PSMA que producen IL-2 (1,08%) comprendieron la mayoría del porcentaje total de células T CD4+ que producen IL-2 específica de vacuna (1,40%) (Figura 3B). El porcentaje de PSA (0,31%) y PSMA (0,29%) indujo la producción de de TNFa en células T CD4+ contribuyó igualmente a la respuesta específica de la vacuna total (0,60%) (Figura 3C). En general, las respuestas de las células T CD4+ estaban bien equilibradas entre PSA y PSMA, con la excepción de PSMA que induce a la mayoría de la producción de IL-2 de células T CD4+ específicas de la vacuna.
La vacuna indujo la producción fuerte de de IFN e IL-2 por células T CD8+ específicas de antígeno y, en menor medida, TNFa. Tanto el PSA (0,70%) como el PSMA (0,67%) indujeron la producción robusta de IFNy en células T CD8+. De hecho, las células T CD8+ específicas de la vacuna que secretan IFNy comprendían el 1,37% de la

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante que codifica una o más proteínas seleccionadas del grupo
que consiste en:
a) Id. de Sec. n°: 6, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 de Id. de Sec. N°: 6 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 735 residuos de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 de Id. de Sec. n°: 6 estén conservados; y
b) Id. de Sec. n°: 8, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 de Id. de Sec. N°: 8 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 8 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 752 residuos de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 de Id. de Sec. N°: 8 estén conservados.
2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en:
a) nucleótidos 1-2250 de Id. de Sec. n°: 5, o una secuencia codificante que es homóloga en un 98% a los nucleótidos 1-2250 de Id. de Sec. n°: 5; y
b) nucleótidos 1-2301 de Id. de Sec. n°: 7, o una secuencia codificante que es homóloga en un 98% a los nucleótidos 1-2301 de Id. de Sec. n°: 7.
3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, que comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: al menos uno seleccionado de cualquiera de los elementos a) o b), y al menos uno seleccionado de c) Id. de Sec. n°: 1, o una secuencia codificante que es homóloga en un 98% a Id. de Sec. n°: 1; o d) Id. de Sec. n°: 3, o una secuencia codificante que es homóloga en un 98% a Id. de Sec. n°: 3.
4. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, que comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo que consiste en: los nucleótidos 1-2250 de Id. de Sec. n°: 5; y los nucleótidos 1-2301 de Id. de Sec. n°: 7.
5. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en: Id. de Sec. n°: 6; e Id. de Sec. n°: 8.
6. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la molécula de ácido nucleico es un plásmido.
7. La molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la molécula de ácido nucleico es un vector de expresión y las secuencias que codifican dicha proteína adicional están unidas operativamente a elementos reguladores.
8. Una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una proteína de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para uso en el tratamiento del cáncer de próstata.
9. Una composición inmunológica que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Una proteína seleccionada del grupo que consiste en:
a) Id. de Sec. n°: 6; una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 de Id. de Sec. n°: 6 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 6 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 735 residuos de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 6, siempre que los aminoácidos 14, 15, 32, 47, 58, 79, 111, 157, 223, 320, 350, 475, 499, 569, 613, 624, 653, 660, 663, 733 y 734 de Id. de Sec. n°: 6 estén conservados; y
b) Id. de Sec. n°: 8, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 de Id. de Sec. N°: 8 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 8 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 752 residuos de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 8, siempre que los aminoácidos 21, 31, 32, 49, 64, 75, 96, 128, 174, 240, 337, 367, 492, 516, 565, 586, 630, 641, 670, 677, 680, 750 y 751 de Id. de Sec. N°: 8 estén conservados.
11. La proteína de la reivindicación 10 que comprende al menos uno seleccionado de cualquiera de los elementos a) o b), y al menos uno seleccionado de cualquiera de
c) Id. de Sec. n°: 2, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 de Id. de Sec. n°: 2 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 2 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 256 residuos de aminoácidos de Id. de Sec. n°: 2, siempre que los aminoácidos 69, 78, 80, 82, 102, 110, 137, 139, 165, 189, 203, 220, 232 y 248 de Id. de Sec. n°: 2 estén conservados, o d) Id. de Sec. n°: 4, una proteína que es homóloga en un 98% al Id. de Sec. n°: 4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 o 275 de Id. de Sec. n°: 4 estén conservados, o un fragmento inmunogénico de Id. de Sec. n°: 4 que comprende los aminoácidos que corresponden al menos a 274 residuos de aminoácidos de Id. de Sec. n°:4, siempre que los aminoácidos 21, 86, 127, 129, 154, 156, 182, 195, 206, 218, 220, 237, 249, 255, 265, 271 or 275 Id. de Sec. n°:4 estén conservados.
12. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 que comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: Id. de Sec. n°:6; e Id. de Sec. n°:8.
13. Una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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