JP2005505271A - 癌の処置および検出において有用なｓｔｅａｐ−１と名称が与えられる核酸および対応するタンパク質 - Google Patents

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Abstract

新規遺伝子０８Ｐ１Ｄ４（ＳＴＥＡＰ−１と称される）ならびにそのコードタンパク質および改変体が記載される。ＳＴＥＡＰ−１は、正常な成体組織における組織特異的発現を示すとはいえ、これは、表Ｉに列挙される癌において異常に発現される。その結果、ＳＴＥＡＰ−１は、癌に対する診断的、予後的、予防的および／または治療的な標的を提供する。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子もしくはそのフラグメント、またはそれらのコードタンパク質、またはそれらの改変体、またはそれらのフラグメントは、体液性免疫応答または細胞性免疫応答を惹起するために使用され得；ＳＴＥＡＰ−１に反応性の抗体またはＴ細胞は、能動免疫または受動免疫において使用され得る。

Description

【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、米国仮特許出願番号６０／３１７，８４０（２００１年９月６日出願）、および米国仮特許出願番号６０／３７０，３８７（２００２年４月５日出願）の優先権を主張する。本願は、米国特許出願番号６０／０８７，５２０（１９９８年６月１日出願）、および米国特許出願番号６０／０９１，１８３（１９９８年６月３０日出願）、および米国特許出願番号０９／３２３，８７３（１９９９年６月１日出願）、および米国特許出願番号１０／０１１，０９５（２００１年１２月６日出願）、および米国特許出願番号１０／０１０，６６７（２００１年１２月６日出願）、および米国特許出願番号０９／４５５，４８６（１９９９年１２月６日出願）、および米国特許出願番号６０／２９６，６５６（２００１年６月６日出願）、および米国特許出願番号１０／１６５，０４４（２００２年６月６日出願）に関連する。
【０００２】
（連邦政府支援の研究の下でなされた本発明に対する権利の陳述）
適用なし。
【０００３】
（発明の分野）
本明細書中に記載された発明は、特定の癌において発現される０８Ｐ１Ｄ４またはＳＴＥＡＰ−１といわれる遺伝子およびそのコードタンパク質、ならびにＳＴＥＡＰ−１を発現する癌の取り扱いにおいて有用な診断方法および治療方法、および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ガンは、冠状動脈疾患（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）に次いで、ヒトの第２の死亡原因である。全世界的に、数百万の人々が、毎年癌により死亡している。米国単独では、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙによって報告されるように、癌は毎年５０万人をはるかに超える人々の死亡原因であり、毎年１２０万あまりの新たな症例が診断されている。心臓疾患での死亡は顕著に減少している一方で、癌に起因する死亡は、一般に増加の傾向にある。来世紀の初期には、癌は死亡の主要な原因になると予測されている。
【０００５】
全世界で、いくつかの癌が主要な死亡原因（ｋｉｌｌｅｒ）として顕著である。特に、肺、前立腺、乳房、結腸、膵臓、および卵巣の癌腫は、癌による死亡の主要な原因を代表する。これらおよび事実上全ての他の癌腫は、共通する致死的特徴を共有している。ごくわずかな例外はあるが、癌腫が原因の転移性疾患は、致命的である。さらに、初期の病期ではその原発性癌を生き延びた癌患者についてすら、その生活が劇的に変化したという共通の経験が示されている。多くの癌患者は、再発または処置の失敗についての可能性を知ることによって駆り立てられる、強い不安を経験している。多くの癌患者は、処置後に肉体的衰弱を経験している。さらに、多くの癌患者は、再発を経験している。
【０００６】
全世界で、前立腺癌は、男性において４番目に最も一般的な癌である。北部アメリカおよび北欧では、はるかに、最も一般的な男性の癌であり、そして男性における癌による死亡の２番目に主要な原因である。米国単独では、肺癌のみに次いで、３０，０００人をはるかに超える男性がこの疾患で毎年死亡している。これらの数字の規模にもかかわらず、転移性の前立腺癌に対する有効な処置は未だ存在しない。外科的前立腺切除、放射線療法、ホルモン除去（ｈｏｒｍｏｎｅ ａｂｌａｔｉｏｎ）療法、外科的去勢および化学療法は、主要な処置様式であり続けている。不運にも、これらの処置は、多くに対して有効でなく、かつしばしば、所望されない結果を付随する。
【０００７】
診断現場において、初期段階の局所腫瘍を正確に検出し得る前立腺腫瘍マーカーが存在しないことは、依然としてこの疾患の診断および管理における大きな限界を残している。血清の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）アッセイは非常に有用なツールであるが、しかしながら、その特異性および一般的利用性は、いくつかの重大な点が欠如していると広く考えられている。
【０００８】
前立腺癌についてのさらなる特異的マーカーを同定することにおける進歩は、マウスにおける疾患の異なる病期を再現し得る前立腺癌異種移植片の生成により改善されてきた。ＬＡＰＣ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ）異種移植片は、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおける継代を生き延び、かつアンドロゲン依存性からアンドロゲン非依存性への移行を模倣する能力を示した前立腺癌異種移植片である（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：４０２）。より近年同定された前立腺癌マーカーとしては、ＰＣＴＡ−１（Ｓｕら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７２５２）、前立腺特異膜（ＰＳＭ）抗原（Ｐｉｎｔｏら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６ Ｓｅｐ ２（９）：１４４５−５１）、ＳＴＥＡＰ（Ｈｕｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９ Ｄｅｃ ７；９６（２５）：１４５２３−８）および前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（Ｒｅｉｔｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１７３５）。
【０００９】
ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＰＣＴＡおよびＰＳＣＡのような以前に同定されたマーカーは、前立腺癌を診断し、そしてこれを処置する取り組みを促進したが、診断および治療をさらに改善するために、前立腺癌および関連する癌に対するさらなるマーカーおよび治療標的を同定する必要がある。
【００１０】
腎臓細胞癌腫（ＲＣＣ）は、成体の悪性疾患の約３％に及ぶ。一旦、腺腫が直径２〜３ｃｍに到達すると、悪性疾患の潜在性が存在する。成体において、２つの主な悪性腎臓腫瘍は、腎臓細胞腺癌および腎盂および尿管の移行性細胞癌である。腎臓細胞腺癌の発生数は、米国で２９，０００症例を超え、そして１９９８年にこの疾患で１１，６００人を超える患者が死亡したと見積もられる。転移性細胞癌は、余り頻繁ではなく米国において１年あたり約５００症例ほどの発生数である。
【００１１】
手術は、長い年月にわたり腎臓細胞腺癌のための主な治療であった。近年まで、転移性疾患は、あらゆる全身性治療に対して難治性であった。全身性治療（特に、免疫治療）における近年の発達に伴ない、転移性腎臓細胞癌は、耐久性のある応答の可能性を伴って、適切な患者に攻撃的にアプローチされ得る。それにもかかわらず、これらの患者に対する有効な治療の必要性が存在し続けている。
【００１２】
米国における癌の全ての新しい症例のうち、膀胱癌は、男性において約５％（最も一般的な新生物の５番目）および女性において３％（最も一般的な新生物の８番目）を表す。発生数は穏やかに増加し、高齢の人口の増加と一致する。１９９８年において、男性における３９，５００症例と女性における１５，０００症例を含め、推定５４，５００症例が存在した。米国における年齢調整された（ａｇｅ−ａｄｊｕｓｔｅｄ）発病率は、男性について１００，０００人当たり３２人、および女性において１００，０００人当たり８人である。３：１の歴史的な男性／女性比は、女性における喫煙パターンに関連して減少し得る。１９９８年に膀胱癌で推定１１，０００人（男性７，８００人および女性３，９００人）が死亡した。膀胱癌発病率および死亡率は、年齢に伴って大きく増加し、そして集団がより高齢化することにつれて問題も増す。
【００１３】
大部分の膀胱癌は、膀胱中で再発する。膀胱癌は、膀胱の経尿道的切除術（ＴＵＲ）と膀胱内化学療法または免疫療法との組み合わせを用いて管理される。膀胱癌の多病巣性の性質および再発性の性質は、ＴＵＲの限界を指摘する。ほとんどの筋肉侵襲性癌は、ＴＵＲ単独では治癒しない。根治的膀胱切除術および尿路変更術（ｕｒｉｎａｒｙ ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）は、癌を切除するための最も効果的な手段であるが、尿の機能および性的機能に否定できない影響を及ぼす。膀胱癌患者に有益な処置様式の重大な必要性が存在し続けている。
【００１４】
米国で２０００年では、９３，８００症例の結腸癌および３６，４００症例の直腸癌を含め、推定１３０，２００症例の結腸直腸癌が生じた。結腸直腸癌は、男性および女性における三番目に一般的な癌である。発生率は、１９９２年〜１９９６年の間に有意に減少していた（１年あたり−２．１％）。調査は、これらの減少が侵襲性の癌へのポリープの進行を予防する、スクリーニングの増加およびポリープ除去の増加に起因していることを示唆する。２０００年には、推定５６，３００人の死亡者（４７，７００人は結腸癌、８，６００人は直腸癌による）が存在し、米国の癌死亡者全体の約１１％を占めた。
【００１５】
現在、手術が、結腸直腸癌、および広がっていない癌の治療のための最も一般的な形態であり、これは頻繁に治癒的である。化学療法または化学療法に加えての放射線照射は、その癌が、腸壁に深く穿刺しているか、またはリンパ節に広がっている大部分の患者に対して手術前もしくは後に提供される。永久的な人工肛門形成（身体の排泄物の除去するための腹部開口部の形成）は、結腸癌について時折必要とされ、そして直腸癌については頻繁に要求される。結腸直腸癌についての効果的な診断様式および処置様式の必要性が存在し続けている。
【００１６】
２０００年には、肺癌および気管支癌の推定１６４，１００の新たな症例が存在し、米国の癌診断全体の１４％を占めた。肺癌および気管支癌の発生率は、１９８４年の１００，０００人中８６．５人の高さから１９９６年の７０．０人へと、男性において有意に減少している。１９９０年代、女性の間での増加率は低くになり始めた。１９９６年の女性における発生率は、１００，０００人中４２．３人である。
【００１７】
肺癌および気管支癌は、２０００年に推定１５６，９００人の死亡者を生じ、全ての癌死亡者の２８％を占めた。１９９２年〜１９９６年の間、肺癌による死亡率は、男性の間で有意に減少した（１年当たり−１．７％）一方で、女性についての死亡率は依然として有意に増加している（１年当たり０．９％）。１９８７年以来、より多くの女性が乳癌よりも肺癌で毎年死亡しており、４０年よりも長期にわたって女性における癌による死の主な原因であった。肺癌発生率および死亡率の減少は、過去３０年にわたる喫煙率の減少に起因している可能性が最も高い；しかし女性の間での喫煙パターンの減少は、男性の減少に遅れている。成体におけるタバコの使用の減少が鈍くなっているが、若者におけるタバコの使用が再度増加していることは、重大である。
【００１８】
肺癌および気管支癌のための処置選択肢は、癌の型および病期によって決定され、選択肢としては、手術、放射線療法および化学療法が挙げられる。多くの局在化された癌について、手術は、通常選り抜きの処置である。この疾患は、通常、発見されるまでに広がっているので、放射線療法および化学療法が、手術と組み合わせてしばしば必要とされる。化学療法単独または放射線療法との組み合わせた化学療法は、小細胞肺癌についての選り抜きの処置であり；このレジメンにおいて、患者の大きな％が寛解を経験し、これはいくつかの場合において長く持続する。しかし、肺癌および気管支癌に対する効果的な処置アプローチおよび診断アプローチの必要性が存在し続けている。
【００１９】
乳癌の推定１８２，８００の新しい侵襲性症例が、２０００年の間に米国の女性の間で生じると予測された。さらに、乳癌の約１，４００の新しい症例が、２０００年に男性において診断されると予測された。１９８０年代における１年当たり約４％の増加後、女性における乳癌発生率は、１９９０年代に１００，０００症例当たり約１１０．６症例に頭打ちとなった。
【００２０】
米国単独で、乳癌に起因して２０００年に推定４１，２００人の死亡者が存在した（４０，８００人が女性、４００人が男性）。乳癌は、女性における癌による死亡の２番目に主要なものである。最も最近のデータによると、死亡率は、１９９２年〜１９９６年の間に有意に減少しており、白人および黒人の両方の若い女性の間で最も大きく減少していた。これらの減少は、おそらく早期発見および処置の改善の結果であった。
【００２１】
医学的環境および患者の好みを考慮にいれると、乳癌の処置は以下を含み得る：ランペクトミー（腫瘍の局所的な切除）および脇下リンパ節の切除；乳房切除（乳房の外科的切除）および脇下リンパ節の切除；放射線療法；化学療法；またはホルモン療法。しばしば、２つ以上の方法が組み合わせて使用される。多数の研究が初期段階の疾患について示されており、ランペクトミーに加えた放射線療法後の長期生存率は、改変された根本的な乳房切除後の生存率に同様である。再構築技術における顕著な進歩は、乳房切除後の乳房再構築についていくつかの選択肢を提供する。近年、このような再構築は、乳房切除と同時に行われている。
【００２２】
適切な量の周囲の正常胸部組織を伴うインサイチュの腺管癌腫（ＤＣＩＳ）の局所切除によって、ＤＣＩＳの局所的な再発を防ぎ得る。胸部への放射線照射および／またはタモキシフェンによって、残っている胸部組織におけるＤＣＩＳの発生機会が低減され得る。ＤＣＩＳが未処理のままであると、ＤＣＩＳは発達して浸潤性乳癌になり得るので、このことは重要である。それにもかかわらず、これらの処置について、深刻な副作用または後遺症が存在する。従って、効果的な乳癌処置の必要性が存在する。
【００２３】
２０００年の米国において卵巣癌の推定２３，１００の新症例が存在した。卵巣癌は女性における全ての癌のうち４％に匹敵し、婦人科癌において第２位に位置付けられている。１９９２年〜１９９６年の間において、卵巣癌の発症率は、有意に低下した。卵巣癌の結果として、２０００年においては推定１４，０００人の死亡者が存在した。卵巣癌は、女性生殖系の他のいかなる癌よりも最も多い死亡者を生じる。
【００２４】
手術、放射線療法、および化学療法は、卵巣癌にとっての処置選択肢である。手術としては、通常、卵巣の一方かまたは両方の切除、ファローピウス管の切除（卵管卵巣摘出術）、および子宮の切除（子宮摘出術）が挙げられる。いくつかの非常に初期の腫瘍において、子供を持つことを望む若い女性において特に、関与する卵巣のみが除去される。進行した疾患において、全ての腹腔内の疾患を除去して化学療法の効力を増大させることが試みられる。卵巣癌についての効果的な処置選択肢についての重要な必要性が存在し続ける。
【００２５】
２０００年の米国において膵臓癌の推定２８，３００の新症例が存在した。過去２０年間にわたって、膵臓癌の割合は、男性においては減少している。女性における割合は、おおよそ一定のままであるが、減少し始めるかもしれない。膵臓癌は、２０００年に、米国において推定２８，２００の死者を出した。過去２０年間にわたって、男性における致死率は僅かであるが有意に減少している（１年間で約−０．９％）が、その一方で、その割合が女性においては僅かに上昇した。
【００２６】
手術、放射線療法、および化学療法は、膵臓癌にとっての処置選択肢である。これらの処置選択肢は、多くの患者において生存を長期化し得、そして／またはその症状を軽減し得るが、大部分の人に対して治癒を生み出すようではない。膵臓癌にとってのさらなる治療選択肢および診断選択肢に対しての重大な必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の要旨）
本発明は、ＳＴＥＡＰ−１と称される遺伝子に関し、この遺伝子は、表Ｉに列挙される癌において過剰発現されることが現在見出されている。正常組織におけるＳＴＥＡＰ−１遺伝子発現のノーザンブロット発現分析は、成人組織における制限された発現パターンを示す。ＳＴＥＡＰ−１のヌクレオチド配列（図２）およびアミノ酸配列（図２および図３）を提供する。正常成人組織におけるＳＴＥＡＰ−１の組織関連プロファイルは、表Ｉに列挙した組織において観察された過剰発現とあわせて、ＳＴＥＡＰ−１が少なくともいくつかの癌において異常に過剰発現されており、したがって、表Ｉで列挙された組織のような組織の癌について有用な診断標的、予防標的、予後診断標的および／または治療標的として役立つことを示す。
【００２８】
本発明は、以下を提供する：ＳＴＥＡＰ−１の遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列の全体または一部分に対応するかまたは相補的である（好ましくは単離された形態の）ポリヌクレオチド（これらとしては、以下が挙げられる：４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２５を超えて連続したアミノ酸の、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質およびＳＴＥＡＰ−１関連フラグメントをコードするポリヌクレオチド）；少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００または１００を超えて連続したアミノ酸のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、ならびにペプチド／タンパク質自体；ＳＴＥＡＰ−１の遺伝子配列もしくはｍＲＮＡ配列またはそれらの一部に対して相補的であるかまたは少なくとも９０％の相同性を有する、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、ならびにＳＴＥＡＰ−１の遺伝子、ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するための手段もまた提供される。ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子、このような分子で形質転換または形質導入された細胞、およびＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の発現のための宿主−ベクター系もまた提供される。本発明はさらに、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質およびそれらのポリペプチドフラグメントに結合する抗体を提供し、これらの抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、マウス抗体および他の哺乳動物抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、ならびに検出可能なマーカーまたは治療剤で標識された抗体が挙げられる。特定の実施形態においては、ただし、図２の核酸配列全体はコードされず、そして／または図２のアミノ酸配列全体は調製されない。特定の実施形態では、図２の核酸配列全体がコードされ、そして／または図２のアミノ酸配列全体が調製され、これらのいずれかは、それぞれのヒト単位投薬形態である。
【００２９】
本発明は、種々の生物学的サンプル中でのＳＴＥＡＰ−１のポリヌクレオチドおよびタンパク質の存在および状態を検出するための方法、ならびにＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を同定するための方法をさらに提供する。本発明の代表的な実施形態は、癌のような何らかの形態の増殖調節不全を有するかまたはそれらを有する疑いのある組織サンプルまたは血液学的サンプルにおいて、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。
【００３０】
本発明は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌（例えば、表Ｉに列挙された組織の癌）を処置するための、種々の免疫原性組成物または治療組成物およびストラテジー（ＳＴＥＡＰ−１の転写、翻訳、プロセシングまたは機能を阻害することを目的とした治療を含む）ならびに癌ワクチンをさらに提供する。１つの局面では、本発明は、ヒト被験体においてＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を処置するための、組成物およびこれを含む方法を提供し、ここで、この組成物は、ヒトの用途について適切なキャリア、ならびにＳＴＥＡＰ−１の産生または機能を阻害する１以上の薬剤のヒトの単位用量を含む。好ましくは、このキャリアは、ヒト特有のキャリアである。本発明の別の局面では、この薬剤は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質と免疫反応性の部分である。このような部分の非限定的な例としては、抗体（例えば、単鎖抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体）、（天然に存在しているかまたは合成の）それらの機能的等価物、ならびにそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。これらの抗体は、診断的部分または治療的部分に結合体化され得る。別の局面では、この薬剤は、本明細書中で定義されるような低分子である。
【００３１】
別の局面では、この薬剤は、ＳＴＥＡＰ−１に対するＣＴＬ応答を誘導するためのヒトにおけるＨＬＡクラスＩ分子に結合する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む１以上のペプチドおよび／またはＨＴＬ応答を誘発するためのヒトにおいてＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープを含む１以上のペプチドを含む。本発明のペプチドは、同一のポリペプチド分子上に存在しても、１以上の別個のポリペプチド分子上に存在してもよい。本発明のさらなる局面では、この薬剤は、上記のようなＣＴＬ応答刺激ペプチドまたはＨＴＬ応答刺激ペプチドのうちの１以上を発現する１つ以上の核酸分子を含む。本発明のさらに別の局面では、１以上の核酸分子は、上記のようにＳＴＥＡＰ−１と免疫学的に反応性の部分を発現し得る。１つ以上の核酸分子はまた、ＳＴＥＡＰ−１の産生を阻害する分子であり得るか、またはこの分子をコードし得る。このような分子の非限定的な例としては、ＳＴＥＡＰ−１の産生に必須のヌクレオチド配列に相補的な分子（例えば、ＳＴＥＡＰ−１産生にとって必須のヌクレオチド二重らせんと三重らせんを形成する核酸を有する、アンチセンス配列またはアンチセンス分子）またはＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡを溶解するのに効果的なリボザイムが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
親タンパク質（例えば、改変体１、改変体２など）に関して表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩ（集合的にＨＬＡペプチド表（ＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔａｂｌｅ）とする）に示される任意のペプチドの開始位置を決定するために、以下の３つの要因を参照することに留意すること：特定の改変体、ＨＬＡペプチド表におけるそのペプチドの長さ、および表ＬＸＩにおける検索ペプチド（Ｓｅａｒｃｈ Ｐｅｐｔｉｄｅ）。一般に、固有の検索ペプチドを使用して、特定の改変体に対する特定のＨＬＡペプチドを得る。そのそれぞれの親分子に対する各検索ペプチドの位置を、表ＬＸＩに列挙する。したがって、検索ペプチドが「Ｘ」位で始まる場合、これらの親分子におけるＨＬＡペプチドの実際の位置を得るために表Ｖ−ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩにおける各位置に対して値「Ｘ−１」を加えなければならない。例えば、特定の検索ペプチドがその親分子の１５０位で始まるとき、その親分子におけるそのアミノ酸の位置を計算するために各ＨＬＡペプチドアミノ酸の位置に１５０−１、すなわち１４９を加えなければならない。
【００３３】
本発明の１つの実施形態は、集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも２回出現するＨＬＡエピトープ、またはこのＨＬＡペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む。本発明の別の実施形態は、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいて少なくとも１回および表ＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも１回出現するＨＬＡペプチド、またはこのＨＬＡペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含む。
【００３４】
本発明の別の実施形態は、ペプチド領域を構成する抗体エピトープまたはこのペプチド領域をコードするオリゴヌクレオチドであり、これらは、以下の特徴のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つを有する：
ｉ）図５の親水性プロファイルにおいて０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のうちの特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、任意の整数の増分での、図３におけるこのタンパク質の全長までのペプチド領域；
ｉｉ）図６のヒドロパシー（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロファイルにおいて０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下の値を有するかまたは０．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のうちの特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、任意の整数の増分での、図３におけるこのタンパク質の全長までのペプチド領域；
ｉｉｉ）図７のパーセント接触可能残基プロファイルにおいて０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のうちの特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、任意の整数の増分での、図３におけるこのタンパク質の全長までのペプチド領域；
ｉｖ）図８の平均可橈性プロファイルにおいて０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のうちの特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、任意の整数の増分での、図３におけるこのタンパク質の全長までのペプチド領域；あるいは
ｖ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３のうちの特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸から、任意の整数の増分での、図３におけるこのタンパク質の全長までのペプチド領域。
【００３５】
（発明の詳細な説明）
（節の概要）
Ｉ．）定義
ＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド
ＩＩ．Ａ．）ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの用途
ＩＩ．Ａ．１．）遺伝的異常のモニタリング
ＩＩ．Ａ．２．）アンチセンスの実施形態
ＩＩ．Ａ．３．）プライマーおよびプライマー対
ＩＩ．Ａ．４．）ＳＴＥＡＰ−１コード核酸分子の単離
ＩＩ．Ａ．５．）組換え核酸分子および宿主−ベクター系
ＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質
ＩＩＩ．Ａ．）モチーフ保有タンパク質の実施形態
ＩＩＩ．Ｂ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の発現
ＩＩＩ．Ｃ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の改変
ＩＩＩ．Ｄ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の用途
ＩＶ．）ＳＴＥＡＰ−１抗体
Ｖ．）ＳＴＥＡＰ−１細胞免疫応答
ＶＩ．）ＳＴＥＡＰ−１トランスジェニック動物
ＶＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１の検出方法
ＶＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１関連遺伝子およびそれらの産物の状態をモニタリングするための方法
ＩＸ．）ＳＴＥＡＰ−１と相互作用する分子の同定
Ｘ．）治療法および組成物
Ｘ．Ａ．）抗癌ワクチン
Ｘ．Ｂ．）抗体ベースの治療のための標的としてのＳＴＥＡＰ−１
Ｘ．Ｃ．）細胞免疫応答についての標的としてのＳＴＥＡＰ−１
Ｘ．Ｃ．１．ミニ遺伝子ワクチン
Ｘ．Ｃ．２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ
Ｘ．Ｃ．３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組み合わせ
Ｘ．Ｃ．４．ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物
Ｘ．Ｄ．）養子免疫療法
Ｘ．Ｅ．）治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
ＸＩ．）ＳＴＥＡＰ−１の診断的実施形態および予後的実施形態
ＸＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１タンパク質機能の阻害
ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体を用いたＳＴＥＡＰ−１の阻害
ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質を用いたＳＴＥＡＰ−１の阻害
ＸＩＩ．Ｃ．）ＳＴＥＡＰ−１の転写または翻訳の阻害
ＸＩＩ．Ｄ．）治療的ストラテジーについての一般的考慮事項
ＸＩＩＩ．）キット／製品。
【００３６】
（Ｉ．）定義）
他に定義されていない限りは、本明細書中で使用される当該分野の全ての用語、記号、および他の科学的用語または専門用語は、本発明が関係している当業者によって一般的に理解されている意味を有すると意図される。いくつかの場合においては、一般的に理解されている意味を有する用語は、明確さおよび／または容易な参照のために本明細書中で定義され、そして本明細書中にこのような定義を含むことは、当該分野で一般的に理解されている定義に対する実質的な差異を示すとは必ずしも解釈されるべきでない。本明細書中に記載されるかまたは参照される技術および手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されている、広範囲に利用されている分子クローニング方法論）の多くは、一般的に十分に理解されており、そして当業者によって、従来の方法論を用いて一般的に使用される。適切である場合には、市販のキットおよび試薬の使用に関する手順は、注記されていないならば、製造業者によって規定されるプロトコルおよび／またはパラメーターに従って一般的に行われる。
【００３７】
用語「進行した前立腺癌」、「局所的に進行した前立腺癌」、「進行した疾患」、および「局所的に進行した疾患」は、前立腺嚢を通じて拡大した前立腺癌を意味し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＵＡ）システムのもとでのステージＣの疾患、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−ＪｅｗｅｔｔシステムのもとでのステージＣ１〜Ｃ２の疾患、およびＴＮＭ（腫瘍、節、転移）システムのもとでのステージＴ３〜Ｔ４およびＮ＋の疾患を含むことを意味する。一般的には、外科手術は、局所的に進行した疾患を有する患者については推奨されず、そしてこれらの患者は、臨床的に局在した（器官に限定された）前立腺癌を有している患者と比較して、実質的にあまり好ましくない結果を有する。局所的に進行した疾患は、前立腺の外側縁を超えるしこり、あるいは前立腺の基部の上部の非対称性またはしこりの明白な証拠によって、臨床的に同定される。局所的に進行した前立腺癌は、現在は、腫瘍が前立腺嚢に侵入または浸潤するか、外科的な縁にまで伸びるか、あるいは精嚢に侵入する場合には、根治的な前立腺切除後に病理学的に診断される。
【００３８】
「ネイティブなグリコシル化パターンを改変すること」は、本明細書中の目的では、ネイティブ配列のＳＴＥＡＰ−１において見出される１つ以上の糖質部分を欠失させること（内在するグリコシル化部位を除去することによってか、または化学的手段および／もしくは酵素的手段によってグリコシル化を除去することによってのいずれかで）、ならびに／あるいはネイティブ配列のＳＴＥＡＰ−１に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することを意図する。さらに、この用語は、存在する種々の糖質部分の性質および比率の変化に関するｓ、ネイティブタンパク質のグリコシル化の定量的変化を包含する。
【００３９】
用語「アナログ」は、構造的に類似するか、別の分子と類似する特性または相当する特性を共有する分子（例えば、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質）をいう。例えば、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアナログは、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する抗体またはＴ細胞によって特異的に結合され得る。
【００４０】
用語「抗体」は、最も広範な意味で使用される。従って、「抗体」は、天然に存在する抗体、または従来のハイブリドーマ技術によって産生されるモノクローナル抗体のような人工抗体であり得る。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体ならびにこれらの抗体の抗原結合ドメインおよび／または１つ以上の相補的決定領域を含むフラグメントを含む。
【００４１】
「抗体フラグメント」は、その標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部分（すなわち、抗原結合領域）として定義される。１つの実施形態において、これは、単一の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体およびそのクローン（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体が挙げられる）ならびにポリエピトープ特異性を有する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体組成物を特に網羅する。
【００４２】
用語「コドン最適化配列」は、約２０％未満の使用頻度を有する任意のコドンを置換することによって特定の宿主種について最適化されたヌクレオチド配列をいう。偽ポリアデニル化配列の除去、エキソン／イントロンスプライシングシグナルの除去、トランスポソン様リピートの除去および／またはコドン最適化に加えてＧＣ含量の最適化によって、所定の宿主種における発現について最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書中で「発現増強配列」といわれる。
【００４３】
用語「細胞傷害性薬剤」は、細胞の発現活性、細胞の機能を阻害するかまたは防止し、そして／あるいは細胞の破壊を引き起こす物質をいう。この用語は、放射性同位体化学療法剤および毒素（例えば、細菌起源、真菌起源、植物起源または動物起源の、低分子毒素または酵素的に活性な毒素）（フラグメントおよび／またはその改変体を含む）を含むことが意図される。細胞傷害性薬剤の例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、アウロマイシン（ａｕｒｏｍｙｃｉｎ）、マイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、イットリウム、ビスマス、リシン、リシンＡ鎖、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、ドロスタチン（ｄｏｌｏｓｔａｔｉｎ）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レトストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クリシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、およびグルココルチコイド、ならびに他の化学療法剤、ならびに放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体（Ｌｕ１７７を含む））。抗体はまた、プロドラッグをその活性形態に変換し得る抗癌プロドラッグ活性化酵素へと結合体化され得る。
【００４４】
用語「ホモログ」は、（例えば、対応する位置で同じかまたは類似である化学残基の配列を有することによって）別の分子と相同性を示す分子をいう。
【００４５】
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトのクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第８版，Ｌａｎｇｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９９４）を参照のこと）。
【００４６】
ポリヌクレオチドの状況で使用される、用語「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）」、「ハイブリダイズする（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ）」などは、従来のハイブリダイゼーション条件（好ましくは、例えば、５０％のホルムアミド／６×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ／１００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション）をいうことが意味される。ここでは、ハイブリダイゼーションの温度は３７℃を超え、そして０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中での洗浄のための温度は５５℃以上である。
【００４７】
句「単離された」または「生物学的に純粋」は、ネイティブな状態で見出されるような物質を通常伴う構成要素を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従う単離されたペプチドは、好ましくはインサイチュ環境においてペプチドに通常付随する物質を含まない。例えば、ポリヌクレオチドは、ＳＴＡＥＰ−１遺伝子以外の遺伝子に対応するかまたは相補的であるか、またはＳＴＡＥＰ−１遺伝子産物またはそのフラグメント以外のポリペプチドをコードする混入物のポリヌクレオチドから実質的に分離される場合、「単離される」と言われる。当業者は、単離されたＳＴＡＥＰ−１ポリヌクレオチドを得るために核酸単離手順を容易に利用し得る。タンパク質は、例えば、物理的方法、機械的方法または化学的方法が、タンパク質に通常付随する細胞の成分からＳＴＡＥＰ−１タンパク質を除去するするために利用される場合、「単離された」と言われる。当業者は、単離されたＳＴＡＥＰ−１タンパク質を得るために標準的な精製方法を容易に利用し得る。あるいは、単離されたタンパク質は、化学的手段によって調製され得る。
【００４８】
用語「哺乳動物」は、哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよびヒトを含む）に分類される任意の生物をいう。本発明の１つの実施形態において、哺乳動物はマウスである。本発明の別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００４９】
用語「転移性の前立腺癌」および「転移性の疾患」は、局所的なリンパ節または離れた部位に拡大した前立腺癌を意味し、そしてＡＵＡシステムのもとでのステージＤの疾患、およびＴＮＭシステムのもとでのステージＴ×Ｎ×Ｍ＋を含むように意味される。局所的に進行した前立腺癌の症例における場合には、外科手術は、一般的には、転移性の疾患を有している患者については意図されず、そしてホルモン（アンドロゲンの切除）治療が、好ましい処置様式である。転移性の前立腺癌を有している患者は、最終的には、処置の開始の１２〜１８ヶ月以内のアンドロゲン治療不応性状態を発症する。これらのアンドロゲン治療不応性の患者のほぼ半分が、その状態の発症後６ヶ月以内に死亡する。前立腺癌の転移の最も一般的な部位は骨である。前立腺癌の骨転移は、しばしば、骨溶解ではなく骨芽細胞性（すなわち、正味の骨の形成を生じる）である。骨転移は、脊椎においてもっとも頻繁に見出され、大腿骨、骨盤、肋骨郭（ｒｉｂ ｃａｇｅ）、頭蓋骨、および上腕骨が続く。他の一般的な転移の部位として、リンパ節、肺、肝臓、および脳が挙げられる。転移性の前立腺癌は、代表的には、開放性骨盤リンパ腺切除または腹腔鏡による骨盤リンパ腺切除、全身の放射性核種スキャン、骨格のレントゲン撮影、および／あるいは骨の病変の生検によって、診断される。
【００５０】
用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の集団から得られる抗体（すなわち、少量存在する、天然に存在する可能性を除いて同一である集団を含む抗体）をいう。
【００５１】
ＳＴＡＥＰ−１関連タンパク質の生物学的モチーフとしての「モチーフ」は、タンパク質の一次配列の一部を形成するアミノ酸の任意のパターン（特定の機能（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用など）、または改変（例えば、リン酸化、グリコシル化、もしくはアミノ化）、または局在（例えば、分泌配列、核局在化配列など）に関連する）、あるいは免疫原性（体液性または細胞性のいずれか）と関連する配列をいう。モチーフは、一般的に、特定の機能または特性に関連する特定の位置に隣接し得るか、または整列し得るかのいずれかである。ＨＬＡモチーフの文脈において、「モチーフ」とは、特定のＨＬＡ分子によって認識される、規定された長さのペプチドにおける残基（通常、クラスＩ ＨＬＡモチーフに対する約８〜約１３のアミノ酸、およびクラスＩＩ ＨＬＡモチーフに対する約６〜約２５のアミノ酸からのペプチド）のパターンをいう。ＨＬＡ結合についてのペプチドモチーフは、代表的に、各ヒトＨＬＡ対立遺伝子によってコードされる各タンパク質について異なり、そして一次アンカー残基および二次アンカー残基のパターンにおいて異なる。
【００５２】
「薬学的な賦形剤」とは、アジュバント、キャリア、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張剤、湿潤剤、保存剤などのような物質を含む。
【００５３】
「薬学的に受容可能な」とは、非毒性、不活性および／またはヒトまたは他の哺乳動物に生理学的に適合する組成物をいう。
【００５４】
用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１０個の塩基または塩基対の長さのヌクレオチドの多型性の形態（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、あるいはいずれかのヌクレオチドの型の改変された形態）を意味し、そして一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことを意味する。当該分野において、この用語は、必要であれば、しばしば「オリゴヌクレオチド」と相互に使用される。ポリヌクレオチドは、本明細書中で開示されたヌクレオチド配列を含み得、ここでチミジン（Ｔ）（例えば、図２に示されるような）はまたウラシル（Ｕ）であり得る。この説明は、ＤＮＡおよびＲＮＡの化学的構造間の違い、特に４つの主な塩基のうち１つがＲＮＡでは、チミジン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）であるという知見に関連する。
【００５５】
用語「ポリペプチド」は、少なくとも約４、５、６、７または８アミノ酸のポリマーを意味する。本明細書を通して、アミノ酸についての標準的な３文字表記または１文字表記が使用される。当該分野において、この用語は、しばしば「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。
【００５６】
ＨＬＡの「一次アンカー残基」は、免疫ペプチドおよびＨＬＡ分子との間に接触点を提供することが理解される、ペプチド配列に沿う特定の位置でのアミノ酸である。１〜３つ、通常２つの、規定された長さのペプチド内の一次アンカー残基は、一般的に、免疫原性ペプチドに対する「モチーフ」を規定する。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合グルーブと、結合グローブの特異的ポケットに埋め込まれるそれらの側鎖と密接に接触することが理解される。１つの実施形態において、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子についての一次アンカー残基は、本発明に従って、（アミノ末端位置から）２位、そしてカルボキシ末端位置の残基ペプチドエピトープ８位、９位、１０位、１１位または１２位に局在される。別の実施形態において、例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドの一次アンカー残基は、ペプチドの末端ではなく、互いに関連して間隔をおいて配置される。ここで、ペプチドは、一般的に少なくとも９アミノ酸長である。各モチーフおよびスーパーモチーフ（ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ）についての一次アンカー位置は、表ＩＶに示される。例えば、アナログペプチドは、表ＩＶに示される、一次アンカー位置および／または二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。このようなアナログは、特定のＨＬＡモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性および／または集団範囲（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｖｅｒａｇｅ）を調節するために使用される。
【００５７】
「放射性同位体」としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない（非限定的な例示的な用途もまた示す）：
医療用同位体の例：
同位体
用途の説明
アクチニウム−２２５
（ＡＣ−２２５）
トリウム−２２９（Ｔｈ−２２９）を参照のこと
アクチニウム−２２７
（ＡＣ−２２７）
癌（すなわち、乳癌および前立腺癌）ならびに癌放射免疫治療から生じる骨転移を処置するために使用されるα放射体である、ラジウム−２２３（Ｒａ−２２３）の親
ビスマス−２１２
（Ｂｉ−２１２）
トリウム−２２８（Ｔｈ−２２８）を参照のこと
ビスマス−２１３
（Ｂｉ−２１３）
トリウム−２２９（Ｔｈ−２２９）を参照のこと
カドミウム−１０９
（Ｃｄ−１０９）
癌検出
コバルト−６０
（Ｃｏ−６０）
癌の放射線治療、食品照射器および医療品の殺菌のための放射線源
銅−６４
（Ｃｕ−６４）
癌治療およびＳＰＥＣＴ画像診断のために使用される陽電子放射体
銅−６７
（Ｃｕ−６７）
癌放射免疫治療および診断研究（すなわち、乳癌および結腸癌ならびにリンパ腫）に使用されるβ／γ放射体
ジスプロシウム−１６６
（Ｄｙ−１６６）
癌放射免疫治療
エルビウム−１６９
（Ｅｒ−１６９）
特に、指およびつま先に関与する小関節のための、慢性関節リウマチの処置、
ユーロピウム−１５２
（Ｅｕ−１５２）
食品照射器および医療品の殺菌のための放射線源
ユーロピウム−１５４
（Ｅｕ−１５４）
食品照射器および医療品の殺菌のための放射線源
ガドリニウム−１５３
（Ｇｄ−１５３）
骨粗鬆症検出および核医療品質保証装置
金−１９８
（Ａｕ−１９８）
卵巣癌、前立腺癌および脳腫瘍の移植治療および腔内治療
ホルミニウム−１６６
（Ｈｏ−１６６）
標的骨格治療、癌放射免疫治療、骨髄切除および慢性関節リウマチの処置における多発性骨髄腫の処置
ヨウ素−１２５
（Ｉ−１２５）
骨粗鬆症検出、診断的画像処理、追跡薬、脳腫瘍処置、放射標識、腫瘍画像処理、脳内レセプターのマッピング、間質性放射治療、前立腺癌処置のための近接照射療法、糸球体濾速度（ＧＦＲ）の決定、血漿体積の決定、脚の深部静脈血栓の検出
ヨウ素−１３１
（Ｉ−１３１）
甲状腺機能評価、甲状腺疾患検出、甲状腺癌および他の非悪性甲状腺疾患（すなわち、グレーブス病、甲状腺腫および甲状腺機能亢進症）の処置、放射免疫治療を使用した白血病、リンパ腫および他の形態の癌（すなわち、乳癌）の処置
イリジウム−１９２
（Ｉｒ−１９２）
近接照射療法、脳腫瘍および脊髄腫瘍の処置、動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の処置および乳房腫瘍および前立腺腫瘍のための移植
ルテニウム−１７７
（Ｌｕ−１７７）
放射免疫治療および動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の処置
モリブデン−９９
（Ｍｏ−９９）
脳、肝臓、肺、心臓および他の器官を画像処理するために使用される、テクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ−９９ｍ）の親。現在では、Ｔｃ−９９ｍは、脳、心臓、肝臓、肺を含む種々の癌および疾患の診断的画像処理のために使用される、最も広範に使用される放射性同位体である；また、脚の深部静脈血栓の検出に使用される。
【００５８】
オスミウム−１９４
（Ｏｓ−１９４）
癌放射免疫治療
パラジウム−１０３
（Ｐｄ−１９３）
前立腺癌処置
白金−１９５ｍ
（Ｐｔ−１９５ｍ）
化学療法薬である、シスプラチンの体内分布および代謝の研究
リン−３２
（Ｐ−３２）
真性一次性白血球増加症（血球疾患）および白血病の処置、骨癌診断／処置；結腸、膵臓および肝臓癌の処置；インビトロ研究での核酸の放射標識、表在性腫瘍の診断、動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の処置ならびに腔内治療
リン−３３
（Ｐ−３３）
白血病処置、骨疾患診断／処置、放射標識および動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の処置
ラジウム−２２３
（Ｒａ−２２３）
アクチニウム−２２７（Ａｃ−２２７）参照のこと
レニウム−１８６
（Ｒｅ−１８６）
骨癌の鎮痛、慢性関節リウマチの処置およびリンパ腫および放射免疫治療を使用した骨、乳房、結腸、および肝臓癌の診断および処置
レニウム−１８８
（Ｒｅ−１８８）
放射免疫治療を使用した癌の診断および処置、骨癌の鎮痛、慢性関節リウマチの処置および前立腺癌の処置
ロジウム−１０５
（Ｒｈ−１０５）
癌放射免疫治療
サマリウム−１４５
（Ｓｍ−１４５）
眼癌の処置
サマリウム−１５３
（Ｓｍ−１５３）
癌放射免疫治療および骨癌の鎮痛
スカンジウムー４７
（Ｓｃ−４７）
癌放射免疫治療および骨癌の鎮痛
セレン−７５
（Ｓｅ−７５）
脳研究の放射性追跡子、γシンチグラフィによる副腎皮質の画像処理、ステロイド分泌腫瘍の側位、膵臓のスキャニング、機能亢進性副甲状腺の検出、内在性プールからの胆汁酸損失の速度の測定
ストロンチウム−８５
（Ｓｒ−８５）
骨癌検出および脳スキャン
ストロンチウム−８９
（Ｓｒ−８９）
骨癌の鎮痛、多発性骨髄腫処置および造骨細胞治療
テクネチウム−９９ｍ
（Ｔｃ−９９ｍ）
モリブデン−９９（Ｍｏ−９９）を参照のこと
ソリウム−２２８
（Ｔｈ−２２８）
癌放射免疫治療に使用されるα放射体である、ビスマス−２１２（Ｂｉ−２１２）の親
ソリウム−２２９
（Ｔｈ−２２９）
癌放射免疫治療に使用されるα放射体である、アクチジウム−２２５（Ａｃ−２２５）の親およびビスマス−２１３（Ｂｉ−２１３）の祖父母
ツリウム−１７０
（Ｔｍ−１７０）
血液照射器のためのγ源、移植された医療デバイスのためのエネルギー源
スズ−１１７ｍ
（Ｓｎ−１１７ｍ）
癌放射免疫治療および骨肉種鎮痛
タングステン−１８８
（Ｗ−１８８）
癌診断／処置、骨癌の鎮痛、慢性関節リウマチの処置および動脈閉塞（すなわち、動脈硬化症および再狭窄）の処置のために使用される、レニウム−１８８（Ｒｅ−１８８）の親
キセノン−１２７
（Ｘｅ−１２７）
脳障害の神経画像処理、高分解能ＳＰＥＣＴ研究、肺機能試験および脳血流研究
イッテルビウム−１７５
（Ｙｂ−１７５）
癌放射免疫治療
イットリウム−９０
（Ｙ−９０）
肝臓癌処置のためのイットリウム−８９（Ｙ−８９）を照射することによって得られたマイクロシード
イットリウム−９１
（Ｙ−９１）
癌放射免疫治療（すなわち、リンパ腫、乳房、結腸、腎臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓および手術不可能な肝臓癌）のために使用される、イッテリウム−９０（Ｙ−９０）に対するγ放射標識
「組換え」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、インビトロでの分子操作に供されたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００５９】
低分子の非限定的な例としては、ＳＴＡＥＰ−１リガンドに結合または相互作用する化合物（ホルモン、神経ペプチド、ケモカイン、臭気剤、リン脂質、および結合し、そして好ましくはＳＴＡＥＰ−１タンパク質機能を阻害するそれらの機能等価物が挙げられる）が挙げられる。このような非限定的な低分子は、好ましくは約１０ｋＤａ未満の分子量、より好ましくは約９ｋＤａ、約８ｋＤａ、約７ｋＤａ、約６ｋＤａ、約５ｋＤａまたは約４ｋＤａ以下の分子量を有する。特定の実施形態において、低分子は、ＳＴＡＥＰ−１タンパク質と物理的に会合するか、またはＳＴＡＥＰ−１に結合する；天然に存在する代謝経路において見出されない；そして／または非水溶液よりも水溶液により可溶性である。
【００６０】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能であり、そして一般的には、プローブの長さ、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算である。一般的には、より長いプローブは、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方、より短いプローブは、より低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般的には、それらの融解温度以下の環境下に相補鎖が存在する場合に、変性された核酸が再度アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間での所望される相同性の程度が高ければ高いほど、使用され得る相対的な温度は高くなる。結果として、より高い相対的な温度が、反応条件をよりストリンジェントにする傾向があり、一方、より低い温度は、あまりそうではないという結果になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９５）を参照のこと。
【００６１】
「ストリンジェントな条件」、または「高ストリンジェントな条件」は、本明細書中で定義される場合は、以下によって同定されるがこれらに限定されない：（１）洗浄のために低いイオン強度および高温（例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム、５０℃）を使用する；（２）変性剤（例えば、ホルムアミド）をハイブリダイゼーションの間に使用する（例えば、０．１％のウシの血清アルブミンを含有する５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のＦｉｃｏｌｌ／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有するｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、４２℃）；または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子のＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用し、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で４２℃で、そして５０％のホルムアミド中で５５℃で洗浄し、次いで５５℃でＥＤＴＡを含有している０．１×ＳＳＣから構成される高ストリンジェンシーの洗浄が続く。「中程度のストリンジェントな条件」は、限定されないが、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９によって記載され、そして上記に記載されているハイブリダイゼーション条件よりもストリンジェントの低い洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントの条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍＬの変性された剪断されたサケ精子のＤＮＡを含有している溶液中で３７℃での一晩のインキュベーション、続く１×ＳＳＣ中での約３７℃〜５０℃でのフィルターの洗浄である。当業者は、プローブの長さなどの因子に順応させることが必要とされる場合には、温度、イオン強度などを調節するための方法を認識する。
【００６２】
ＨＬＡの「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によってコードされるＨＬＡ分子によって特異的に共有されるペプチド結合である。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「処置すること」または「処置的な」および文法的に関連する用語は、疾患の任意の結果（例えば、延長した生存、より少ない罹患率、および／または副作用を少なくすること（代替的な治療形式の副産物；疾患の完全な撲滅が必要とされない））の任意の改善をいう。
【００６４】
「トランスジェニック動物」（例えば、マウスまたはラット）は、導入遺伝子を含む細胞を有する動物であり、この導入遺伝子は、動物に導入されたか、または出生前（例えば、胚の段階）に動物の先祖に導入された。「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組込まれるＤＮＡである。
【００６５】
本明細書中で使用する場合、ＨＬＡまたは細胞性免疫応答「ワクチン」は、本発明の１つ以上のペプチドを含むか、またはコードする組成物をいう。このようなワクチン（例えば１つ以上の別個のペプチド；ポリエピトープペプチドによって含まれる、本発明の１つ以上のペプチド；あるいはこのような別個のペプチドまたはポリペプチド（例えば、ポリエピトープペプチドをコードする小遺伝子）をコードする核酸）の多数の実施形態が存在する。「１つ以上のペプチド」は、１〜１５０またはそれ以上（例えば、本発明の少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、もしくは１５０以上）の本発明のペプチドの任意の全整数単位が挙げられ得る。ペプチドまたはポリペプチドは、必要に応じて、（例えば、脂質化、標的化配列または他の配列の付加によって）改変され得る。本発明のＨＬＡクラスＩペプチドは、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進させるために、ＨＬＡクラスＩＩペプチドと混合または連結され得る。ＨＬＡワクチンはまた、ペプチドパルス抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得る。
【００６６】
用語「改変体」とは、記載される型または基準（例えば、特に記載されるタンパク質（例えば、図２または図３に示されるＳＴＡＥＰ−１タンパク質）の対応部分に、１つ以上の異なるアミノ酸残基を有するタンパク質）からの改変を示す分子をいう。アナログは、改変タンパク質の例である。スプライシングアイソフォームおよび単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、改変体のさらなる例である。
【００６７】
本発明の「ＳＴＡＥＰ−１関連タンパク質」としては、本明細書中で具体的に同定されたタンパク質、ならびに対立遺伝子改変体、（本明細書中に概説される方法または当該分野で用意に利用可能な方法に従って実験を実施することなく、単離／生成され得、そして特徴付けられ得る）保存的置換改変体、アナログおよびホモログが挙げられる。異なるＳＴＡＥＰ−１タンパク質またはそのフラグメントの一部分に結合する融合タンパク質、ならびにＳＴＡＥＰ−１タンパク質および異種ポリペプチドの融合タンパク質もまた、含まれる。このようなＳＴＡＥＰ−１タンパク質は、本発明のタンパク質であるＳＴＡＥＰ−１関連タンパク質、またはＳＴＡＥＰ−１として集合的に称される。用語「ＳＴＡＥＰ−１関連タンパク質」とは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２５以上のアミノ酸；または少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０もしくは６６４以上のアミノ酸の、ポリペプチドフラグメントまたはＳＴＡＥＰ−１タンパク質配列をいう。
【００６８】
（ＩＩ．）ＳＴＡＥＰ−１ポリヌクレオチド）
本発明の１つの局面は、ＳＴＡＥＰ−１の遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはコード配列の全てまたは一部に対応するかまたは相補的な、好ましくは単離形態のポリヌクレオチドを提供し、これには、ＳＴＡＥＰ−１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそのフラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ＳＴＡＥＰ−１の遺伝子もしくはｍＲＮＡ配列に相補的なポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはその一部、ならびにＳＴＡＥＰ−１の遺伝子、ｍＲＮＡ、もしくはＳＴＡＥＰ−１コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド（集合的に「ＳＴＡＥＰ−１ポリヌクレオチド」）が挙げられる。この節において参照される場合、全ての例において、Ｔは、図２において、Ｕでもあり得る。
【００６９】
ＳＴＡＥＰ−１ポリヌクレオチドの実施形態としては、以下が挙げられる：図２に示される配列を有するＳＴＡＥＰ−１ポリヌクレオチド、図２に示されるようなＳＴＡＥＰ−１ヌクレオチド配列（ここで、ＴはＵである）；図２に示されるような配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド；または図２に示される配列を有するポリヌクレオチドの少なくとも１０個連続するヌクレオチド（ここで、ＴはＵである）。例えば、ＳＴＡＥＰ−１ヌクレオチドの実施形態は、限定ではなく、以下を含む：
（Ｉ）図２Ａに示されるような配列を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＩ）図２Ａに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号６６〜ヌクレオチド残基番号１０８５（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＩＩ）図２Ｂに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＶ）図２Ｃに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号９４４（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（Ｖ）図２Ｄに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（必要に応じて終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩ）図２Ｅに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩＩ）図２Ｆに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＶＩＩＩ）図２Ｇに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＩＸ）図２Ｈに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（Ｘ）図２Ｉに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩＩ）図２Ｊに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩＩＩ）図２Ｋに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩＶ）図２Ｌに示されるような配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、実質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＶ）図２Ｍに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこの配列からなるか、またはこの配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＶＩ）図２Ｎに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこのような配列からなるか、またはこのような配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＶＩＩ）図２Ｏに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこの配列からなるか、またはこの配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＶＩＩＩ）図２Ｐに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこの配列からなるか、またはこの配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＩＸ）図２Ｑに示される配列の、ヌクレオチド残基番号９６〜ヌクレオチド残基番号８７２（終止コドンを含む）を含むか、本質的にこの配列からなるか、またはこの配列からなる、ポリヌクレオチド（ここで、ＴはＵでもあり得る）；
（ＸＸ）図２Ａ〜Ｑに示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同なＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩ）図２Ａ〜Ｑに示される全長アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩに示される少なくとも１つのペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＩＩ）図５の親水性（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）プロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＶ）図６のヒドロパシー（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）性プロファイルにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶ）図７のパーセント接近可能残基プロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＶＩ）図８の平均可橈性プロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩＩ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５より大きい値を有するアミノ酸位置を含む、図３Ａのペプチドの、少なくとも５アミノ酸から、３３９までの任意の整数の増分のペプチド領域をコードする、ポリヌクレオチド；
（ＸＸＶＩＩＩ）（Ｉ）〜（ＸＩＸ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに完全に相補的なポリヌクレオチド；
（ＸＸＩＸ）（Ｉ）〜（ＸＩＸ）のいずれかによってコードされるペプチド；および
（ＸＸＸ）薬学的賦形剤と共に、そして／またはヒトの単位用量形態中での、（Ｉ）〜（ＸＩＸ）のうちのいずれかのポリヌクレオチドまたは（ＸＸＩＩＩ）〜（ＸＸＶＩＩ）のうちのペプチド。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、ある範囲は、その全単位位置の全てを具体的に開示することが理解される。
【００７１】
本明細書中に開示される発明の代表的な実施形態としては、ＳＴＥＡＰ−１のｍＲＮＡ配列の特定の部分をコードするＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド（およびこのような配列に相補的なポリヌクレオチド）が挙げられる（例えば、以下：
（ａ）ＳＴＥＡＰ−１改変体１の、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３３０、３３９またはそれ以上の連続するアミノ酸；（最大の長さは、他の改変体：改変体２、２５８アミノ酸；改変体３、２８２アミノ酸、および改変体４、２５８アミノ酸と関係がある）
のタンパク質および／またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）。
【００７２】
例えば、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態としては、以下が挙げられる：図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸１〜約アミノ酸１０をコードする、ポリヌクレオチドおよびコードされたペプチド自体、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸１０〜約アミノ酸２０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸２０〜約アミノ酸３０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸３０〜約アミノ酸４０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸４０〜約アミノ酸５０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸５０〜約アミノ酸６０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸６０〜約アミノ酸７０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸７０〜約アミノ酸８０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸８０〜約アミノ酸９０をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の約アミノ酸９０〜約アミノ酸１００をコードするポリヌクレオチド、図２または図３に前記されるカルボキシル末端のアミノ酸をコードする、約１０アミノ酸ずつ。従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の１００からカルボキシル末端アミノ酸までのアミノ酸のアミノ酸配列の（約１０アミノ酸の）部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の実施形態である。ここで、各特定のアミノ酸位置は、±５アミノ酸残基の位置を開示することが理解される。
【００７３】
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の比較的長い部分をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明の範囲内である。例えば、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質またはその「改変体」の、約アミノ酸１（または２０または３０または４０など）〜約アミノ酸２０（または３０または４０または５０など）をコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知の種々の技術によって生成され得る。これらのポリヌクレオチドフラグメントは、図２に示されるようなＳＴＥＡＰ−１配列の任意の部分を含み得る。
【００７４】
本明細書中に開示される発明のさらなる例示的実施形態としては、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列または「改変体」配列内に含まれる１以上の生物学的モチーフをコードするＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドフラグメントが挙げられ、これには、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩに示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質または「改変体」の、１以上のモチーフ保有部分配列が挙げられる。別の実施形態において、本発明の代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、既知の分子に対する相同性を示すＳＴＥＡＰ−１のタンパク質または改変体の、１以上の領域をコードする。本発明の別の実施形態において、代表的なポリヌクレオチドフラグメントは、ＳＴＥＡＰ−１のタンパク質または改変体のＮ−グリコシル化部位、ｃＡＭＰ依存性およびｃＧＭＰ依存性のプロテインキナーゼリン酸化部位、カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位またはＮ−ミリストイル化部位、ならびにアミド化部位のうち１以上をコードし得る。
【００７５】
その親タンパク質（例えば、改変体１、改変体２など）に対する、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＬＩ（集合的に、ＨＬＡペプチド表）に示される任意のペプチドの出発位置を決定するために、以下の３つの因子について言及がなされることに留意のこと：特定の改変体、ＨＬＡペプチド表中のペプチドの長さ、表ＬＶＩＩに列挙される検索ペプチド。一般に、独自の検索ペプチドが、特定の改変体についてのＨＬＡペプチドを得るために使用される。そのそれぞれの親分子に対する各検索ペプチドの位置は、表ＬＸＩに列挙される。従って、検索ペプチドが位置「Ｘ」で開始する場合、それらの親分子中のＨＬＡペプチドの実際の位置を得るために、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＩＬ中の各位置に、「Ｘ−１」の値を加算しなければならない。例えば、特定の検索ペプチドがその親分子の位置１５０にて開始する場合、親分子中のアミノ酸の位置を計算するために、１５０−１（すなわち、１４９）を、各ＨＬＡペプチドのアミノ酸位置に加算しなければならない。
（ＩＩ．Ａ．ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの用途）
（ＩＩ．Ａ．１．遺伝子異常のモニタリング）
上記項目のポリヌクレオチドは、多数の異なる特定の用途を有する。ヒトＳＴＥＡＰ−１遺伝子は、「ＳＴＥＡＰ−１の染色体マッピング」との表題の実施例において示される染色体位置にマッピングされる。例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子は、この染色体にマッピングされるので、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の異なる領域をコードするポリヌクレオチドは、この染色体位置の細胞発生異常（例えば、種々の癌に関連するとして同定された異常）を特徴付けるために使用される。特定の遺伝子において、再配列を含む種々の染色体異常が、多数の異なる癌における頻繁な細胞発生的異常として同定されている（例えば、Ｋｒａｊｉｎｏｖｉｃら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．３８２（３−４）：８１−８３（１９９８）；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ ８６（１０）：３９０５−３９１４（１９９５）およびＦｉｎｇｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８５（２３）：９１５８−９１６２（１９８８）を参照のこと）。従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、悪性の表現型に寄与し得る、ＳＴＥＡＰ−１をコードする染色体領域における細胞発生的異常を説明するために使用され得る、以前に可能であったツールよりもより正確な、新たなツールを提供する。この文脈において、これらのポリヌクレオチドは、より微妙な染色体異常およびあまり一般的でない染色体異常を同定するために、染色体スクリーニングの感受性を拡大することについての、当該分野における必要性を満たす（例えば、Ｅｖａｎｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ １７１（４）：１０５５−１０５７（１９９４）を参照のこと）。
【００７６】
さらに、ＳＴＥＡＰ−１は、膀胱癌および他の癌において高度に発現されることが示されているので、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドは、正常組織 対 癌性組織におけるＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態を評価する方法において使用される。代表的に、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の領域をコードするポリヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の特定の領域（例えば、１以上のモチーフを含む領域）における乱れ（例えば、抗原の喪失などを生じる欠失、挿入、点変異または変更）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイとしては、ＲＴ−ＰＣＲアッセイおよび一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）分析（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８（１９９９）を参照のこと）の両方が挙げられ、これらは両方とも、タンパク質内の特定の領域を試験するために、タンパク質内のこれらの領域をコードするポリヌクレオチドを利用する。
（ＩＩ．Ａ．２．アンチセンス実施形態）
本明細書中に記載される本発明の実施形態に関連する、他の具体的に企図された核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス分子、ならびに天然供給源由来であるか合成であるかにかかわらず、代替的骨格に基づく核酸分子または代替的塩基を含む核酸分子であり、そしてこれには、ＳＴＥＡＰ−１のＲＮＡ発現またはタンパク質発現を阻害し得る分子が含まれる。例えば、アンチセンス分子は、塩基対依存的な様式でＤＮＡまたはＲＮＡに特異的に結合する、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または非核酸分子（例えば、ホスホロチオエート誘導体）を含む、ＲＮＡまたは他の分子であり得る。当業者は、本明細書中に開示されるＳＴＥＡＰ−１のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列を使用して、これらのクラスの核酸分子を容易に獲得し得る。
【００７７】
アンチセンス技術は、細胞内に位置する標的ポリヌクレオチドに結合する外因性オリゴヌクレオチドの投与を伴う。用語「アンチセンス」は、このようなオリゴヌクレオチドが、その細胞内標的（例えば、ＳＴＥＡＰ−１）に相補的であるという事実をいう。例えば、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；およびＳｙｎｔｈｅｓｉｓ １：１−５（１９８８）を参照のこと。本発明のＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、誘導体（例えば、Ｓ−オリゴヌクレオチド（ホスホロチオエート誘導体またはＳ−オリゴ、Ｊａｃｋ Ｃｏｈｅｎ（前出）を参照のこと）が挙げられ、これは、増強された癌細胞増殖阻害作用を示す。Ｓ−オリゴ（ヌクレオシドホスホロチオエート）は、リン酸基の非架橋酸素原子が硫黄原子によって置換されている、オリゴヌクレオチド（Ｏ−オリゴ）の等電子アナログである。本発明のＳ−オリゴは、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（これは、硫黄転移試薬である）での対応するＯ−オリゴの処理によって調製され得る。例えば、Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９８（１９９０）；およびＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：１２５３−１２５４（１９９０）。本発明のさらなるＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、当該分野で公知のモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる（例えば、Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら、１９９６、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１６９−１７５を参照のこと）。
【００７８】
本発明のＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、代表的に、ＳＴＥＡＰ−１ゲノム配列または対応するｍＲＮＡの最初の１００個の５’側コドンまたは最後の１００個の３’側コドンに相補的であり、かつこれらと安定にハイブリダイズする、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。絶対的な相補性は必要ないが、高度な相補性が好ましい。この領域に相補的なオリゴヌクレオチドの使用によって、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションは可能になるが、プロテインキナーゼの他の調節サブユニットを指定するｍＲＮＡへの選択的なハイブリダイゼーションは可能にならない。１つの実施形態において、本発明のＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡにハイブリダイズする配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子の１５〜３０マーのフラグメントである。必要に応じて、ＳＴＥＡＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１の最初の１０個の５’側コドンまたは最後の１０個の３’側コドン中の領域に相補的な３０マーのオリゴヌクレオチドである。あるいは、このアンチセンス分子は、ＳＴＥＡＰ−１発現の阻害においてリボザイムを使用するように改変される（例えば、Ｌ．Ａ．Ｃｏｕｔｕｒｅ ＆ Ｄ．Ｔ．Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １２：５１０−５１５（１９９６）を参照のこと）。
（ＩＩ．Ａ．３．プライマーおよびプライマー対）
本発明のこれらのヌクレオチドのさらに特定の実施形態としては、プライマーおよびプライマー対（これらは、本発明のポリヌクレオチドまたはその任意の特定の部分の特異的増幅を可能にする）、ならびにプローブ（これは、本発明の核酸分子またはその任意の部分に選択的にかまたは特異的にハイブリダイズする）が挙げられる。プローブは、検出可能なマーカー（例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生体発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素）で標識され得る。このようなプローブおよびプライマーは、サンプル中のＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの存在を検出するため、およびＳＴＥＡＰ−１タンパク質を発現する細胞を検出するための手段として使用される。
【００７９】
このようなプローブの例としては、図２に示されるヒトＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが挙げられる。ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡを特異的に増幅し得るプライマー対の例はまた、実施例に記載される。当業者によって理解されるように、非常に多数の異なるプライマーおよびプローブが、本明細書中に提供される配列に基づいて調製され得、そしてＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡを増幅および／または検出するために有効に使用され得る。
【００８０】
本発明のＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドは、種々の目的のために有用であり、その用途としては、限定ではなく以下が挙げられる：ＳＴＥＡＰ−１の遺伝子、ｍＲＮＡもしくはそのフラグメントの増幅および／または検出のためのプローブおよびプライマーとして；前立腺癌および他の癌の診断および／または予後についての試薬として；ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの発現を指向し得るコード配列として；ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現および／またはＳＴＥＡＰ−１転写物の翻訳を調節または阻害するためのツールとして；そして治療剤として。
【００８１】
本発明は、天然に存在する供給源（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）由来のＳＴＥＡＰ−１核酸配列またはＳＴＥＡＰ−１関連核酸配列を同定および単離するための、本明細書中に記載されるような任意のプローブの使用、ならびに単離された核酸配列自体（これは、使用されるプローブ中に見出される配列の全てまたはほとんどを含む）を包含する。
（ＩＩ．Ａ．４．ＳＴＥＡＰ−１コード核酸分子の単離）
本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ配列は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびにＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物ホモログ、選択的スプライシングされたアイソフォーム、対立遺伝子改変体およびＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の変異形態をコードする他のポリヌクレオチドの単離、ならびにＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質のアナログをコードするポリヌクレオチドの単離を可能にする。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子をコードする全長ｍＲＮＡを単離するために使用され得る種々の分子クローニング方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９５を参照のこと）。例えば、λファージクローニング方法論は、市販のクローニングシステム（例えば、Ｌａｍｂｄａ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、簡便に使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子のｃＤＮＡを含むファージクローンは、標識されたＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡまたはそのフラグメントを用いて探索することによって、同定され得る。例えば、１つの実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ（例えば、図２）またはその一部が、合成され得、そしてＳＴＥＡＰ−１遺伝子に対する重複およびＳＴＥＡＰ−１遺伝子に対応する全長ｃＤＮＡを検索するためのプローブとして使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子自体は、ゲノムＤＮＡライブラリー、細菌人工染色体ライブラリー（ＢＡＣ）、酵母人工染色体ライブラリー（ＹＡＣ）などを、ＳＴＥＡＰ−１ ＤＮＡのプローブまたはプライマーを用いてスクリーニングすることによって、単離され得る。
（ＩＩ．Ａ．５．組換え核酸分子および宿主−ベクター系）
本発明はまた、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログ、またはホモログを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ならびに当該分野で周知の種々のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない）、およびこのような組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされた細胞を提供する。このような分子を生成する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出を参照のこと）。
【００８２】
本発明はさらに、適切な原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞中にＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、そのフラグメント、アナログ、またはホモログを含む組換えＤＮＡ分子を含む、宿主−ベクター系を提供する。適切な真核生物宿主細胞の例としては、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞のようなバキュロウイルス感染性細胞））が挙げられる。適切な哺乳動物細胞の例としては、種々の前立腺癌細胞株（例えば、ＤＵ１４５およびＴｓｕＰｒ１）、他のトランスフェクト可能または形質導入可能な前立腺癌細胞株、一次細胞（ＰｒＥＣ）、および組換えタンパク質の発現のために慣用的に使用される多くの哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞）が挙げられる。より詳細には、ＳＴＥＡＰ−１のコード配列を含むポリヌクレオチド、またはそのフラグメント、アナログ、もしくはホモログは、当該分野で慣用的に使用され、そして広範に知られている多数の宿主−ベクター系を用いて、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質またはそのフラグメントを生成するために使用され得る。
【００８３】
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質またはそのフラグメントの発現に適切な広範な範囲の宿主−ベクター系が利用可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５、前出を参照のこと）。哺乳動物での発現に好ましいベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３．１ ｍｙｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびレトロウイルスベクターｐＳＲαｔｋｎｅｏ（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９１、ＭＣＢ １１：１７８５）が挙げられるがこれらに限定されない。これらの発現ベクターを用いて、ＳＴＥＡＰ−１は、いくつかの前立腺癌細胞株および非前立腺細胞株（例えば、２９３、２９３Ｔ、ｒａｔ−１、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＴｓｕＰｒ１を含む）において発現され得る。本発明の宿主−ベクター系は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質またはそのフラグメントを生成するのに有用である。このような宿主−ベクター系は、ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−１変異体もしくはアナログの機能的特性を研究するために使用され得る。
【００８４】
組換えヒトＳＴＥＡＰ−１タンパク質またはそのアナログもしくはホモログもしくはフラグメントは、ＳＴＥＡＰ−１関連ヌクレオチドをコードする構築物でトランスフェクトされた哺乳動物細胞により生成され得る。例えば、２９３Ｔ細胞は、ＳＴＥＡＰ−１またはそのフラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする発現プラスミドでトランスフェクトされ得、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質が、２９３Ｔ細胞中で発現され、そして組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質が、標準的な精製方法（例えば、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を用いるアフィニティー精製）を用いて単離される。別の実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１コード配列は、レトロウイルスベクターｐＳＲαＭＳＶｔｋｎｅｏ中にサブクローニングされ、そしてＳＴＥＡＰ−１発現細胞株を確立するために、種々の哺乳動物細胞株（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＴｓｕＰｒ１、２９３、およびｒａｔ−１）を感染するために使用される。当該分野で周知の種々の他の発現系もまた、使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１コード配列にインフレームで連結されたリーダーペプチドをコードする発現構築物は、分泌形態の組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質の生成のために使用され得る。
【００８５】
本明細書中で議論されるように、遺伝子コードの重複性は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子配列におけるバリエーションを許容する。詳細には、特定の宿主種は、しばしば、特定のコドン優先性を有することが、当該分野で公知であり、従って、当業者は、開示された配列を、所望の宿主で優先されるよう適合し得る。例えば、優先されるアナログコドン配列は、代表的に、より高頻度のコドンと置きかえられた稀なコドン（すなわち、所望の宿主の公知の配列において約２０％未満の使用頻度を有するコドン）を有する。特定種についてのコドン優先性は、例えば、インターネット上（例えば、ＵＲＬ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／〜ｎａｋａｍｕｒａ／ｃｏｄｏｎ．ｈｔｍｌ）で利用可能なコドン使用表を用いることによって算出される。
【００８６】
さらなる配列の改変は、細胞性宿主におけるタンパク質発現を増強することが知られている。これらとしては、偽ポリアデニル化シグナルをコードする配列の除去、エキソン／イントロンスプライス部位シグナル、トランスポゾン様反復、および／または遺伝子発現に対して有害な他のこのような十分特徴付けられた配列が挙げられる。配列のＧＣ含量は、所定の細胞性宿主について平均的なレベル（その宿主細胞において発現される公知の遺伝子を参照することによって算出される）に調整される。可能な場合、配列は、予測されるヘアピン二次ｍＲＮＡ構造を回避するよう改変される。他の有用な改変としては、Ｋｏｚａｋ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、９：５０７３−５０８０（１９８９）に記載されるような、オープンリーディングフレームの開始点での翻訳開始コンセンサス配列の追加が挙げられる。当業者は、真核生物リボソームが５’近位のＡＵＧコドンで排他的に翻訳を開始することが、稀な条件下でのみ排除されるという一般規則を理解する（例えば、Ｋｏｚａｋ ＰＮＡＳ ９２（７）：２６６２−２６６６、（１９９５）およびＫｏｚａｋ ＮＡＲ １５（２０）：８１２５−８１４８（１９８７）を参照のこと）。
（ＩＩＩ．ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質）
本発明の別の局面は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を提供する。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の実施形態は、図２または図３に示されるようなヒトＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸配列の全てまたは一部を有するポリペプチドを包含する。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の実施形態は、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１のアミノ酸配列中に変更を有する改変体、ホモログ、またはアナログポリペプチドを包含する。
【００８７】
ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの実施形態としては、図２に示される配列を有するＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド、図２に示されるようなＳＴＥＡＰ−１のペプチド配列（ここで、ＴがＵである）；図２に示される配列を有するポリペプチドの少なくとも１０連続ヌクレオチド；または図２に示される配列を有するポリペプチドの少なくとも１０連続ヌクレオチド（ここで、ＴがＵである）が挙げられる。例えば、ＳＴＥＡＰ−１ペプチドの実施形態は、以下を包含する（しかし、これらに限定されない）：
（Ｉ）図２Ａ〜Ｑまたは図３Ａ〜Ｄに示されるアミノ酸配列を含むか、この配列から本質的になるか、またはこの配列からなるタンパク質；
（ＩＩ）図２Ａ〜Ｑに示される全アミノ酸配列に少なくとも９０％相同な１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質；
（ＩＩＩ）図２Ａ〜Ｑまたは図３Ａ〜Ｄに示される全アミノ酸配列に少なくとも９０％同一な１０１Ｐ３Ａ１１関連タンパク質；
（ＩＶ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩまたは表ＸＸＩＩ〜ＬＩに示される少なくとも１つのペプチドを含むタンパク質（必要に応じて、ただし、図２のタンパク質全体ではない）；
（Ｖ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示される少なくとも１つのペプチド（集合的に、このペプチドはまた、表ＸＸＩＩ〜ＬＩにも示される）を含むタンパク質（必要に応じて、ただし、図２のタンパク質全体ではない）；
（ＶＩ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＬＩに示されるペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含むタンパク質（必要に応じて、ただし、図２のタンパク質全体ではない）；
（ＶＩＩ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＬＩに示されるペプチドから選択される少なくとも２つのペプチドを含むタンパク質（必要に応じて、ただし、このタンパク質は、図２のアミノ酸配列由来の連続配列ではない）；
（ＶＩＩＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩに示されるペプチドから選択される少なくとも１つのペプチド；および表ＸＸＩＩ〜ＬＩに示される少なくとも１つのペプチドを含むタンパク質（ただし、このタンパク質は、図２のアミノ酸配列由来の連続配列ではない）；
（ＩＸ）図５の親水性プロファイルにおいて、０．５より高い値を有するアミノ酸位置を含む、それぞれ３３９、２５８、２８２または２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃまたは３Ｄのタンパク質の少なくとも５アミノ酸を含むポリペプチド；
（Ｘ）図６のヒドロパシー性プロファイルにおいて、０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む、それぞれ３３９、２５８、２８２または２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃまたは３Ｄのタンパク質の少なくとも５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩ）図７のパーセント接近可能残基プロファイルにおいて、０．５より高い値を有するアミノ酸位置を含む、それぞれ３３９、２５８、２８２または２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃまたは３Ｄのタンパク質の少なくとも５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩＩ）図８の平均可橈性のプロファイルにおける、０．５より高い値を有するアミノ酸位置を含む、それぞれ３３９、２５８、２８２または２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃまたは３Ｄのタンパク質の少なくとも５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩＩＩ）図９のβ−ターンプロファイルにおける、０．５より高い値を有するアミノ酸位置を含む、それぞれ３３９、２５８、２８２または２５８まで任意の自然数きざみで増える、図３Ａ、３Ｂ、３Ｃまたは３Ｄのタンパク質の少なくとも５アミノ酸を含むポリペプチド；
（ＸＩＶ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも２度現れるペプチド；
（ＸＶ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも３度現れるペプチド；
（ＸＶＩ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも４度現れるペプチド；
（ＸＶＩＩ）集合的に、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも５度現れるペプチド；
（ＸＶＩＩＩ）表Ｖ〜ＸＶＩＩＩにおいて少なくとも１度現れ、そして表ＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて少なくとも１度現れるペプチド；
（ＸＩＸ）以下の特徴の１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つを含むペプチド、またはこのようなペプチドをコードするオリゴヌクレオチド：
ｉ）図５の親水性プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える図３におけるそのタンパク質（全長まで）、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｉ）図６のヒドロパシー性プロファイルにおいて、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下の値を有するかまたは０．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える図３におけるそのタンパク質（全長まで）、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｉｉ）図７のパーセント接近可能残基プロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える図３におけるそのタンパク質（全長まで）、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
ｉｖ）図８の平均可橈性のプロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、任意の自然数きざみで増える図３におけるそのタンパク質（全長まで）、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；あるいは
ｖ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９以上の値を有するかまたは１．０に等しい値を有するアミノ酸位置を含む、図３におけるそのタンパク質の全長までの任意の自然数増分の、図３の特定のペプチドの少なくとも５アミノ酸の領域；
（ＸＸ）薬学的賦形剤と共に、および／またはヒト単位投薬形態での、（Ｉ）〜（ＸＩＸ）のペプチド。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、範囲は、その全ての全単位の位置を詳細に開示することが理解される。
【００８９】
本明細書中で開示される本発明の代表的な実施形態としては、例えば以下のような１０１Ｐ３Ａ１１ ｍＲＮＡ配列の特定の部分（およびこのような配列に相補的な配列）をコードする１０１Ｐ３Ａ１１ポリヌクレオチド（例えば、タンパク質および／またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド）が挙げられる：
ａ）４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３３０、３３９またはＳＴＥＡＰ−１改変体１のより隣接するアミノ酸；他の改変体に関連した最長の長さは、以下である：改変体２、２５８アミノ酸；改変体３、２８２アミノ酸；および改変体４、２５８アミノ酸。
【００９０】
一般的に、ヒトＳＴＥＡＰ−１天然に存在する対立遺伝子改変体は、高い程度の構造的同一性および相同性（例えば、９０％以上の相同性）を共有する。代表的に、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰ−１配列中に保存的アミノ酸置換を含むか、またはＳＴＥＡＰ−１のホモログにおいて対応する位置からのアミノ酸の置換を含む。ＳＴＥＡＰ−１対立遺伝子改変体の１つのクラスは、特定のＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の少なくとも小さい領域で高い程度の相同性を共有するが、その配列由来の根本的な逸脱（例えば、非保存的置換、短縮、挿入、またはフレームシフト）をさらに含むタンパク質である。タンパク質配列の比較において、用語、類似性、同一性、および相同性は、各々、遺伝子の分野で理解される通りの別個の意味を有する。さらに、オルソロジーおよびパラロジー は、ある生物における所定のタンパク質ファミリーのメンバーの、他の生物における同じファミリーのメンバーに対する関係を記載する重要な概念であり得る。
【００９１】
アミノ酸略号は、表ＩＩに提供される。保存的アミノ酸置換は、しばしば、そのタンパク質のコンホメーションまたは機能のいずれも変更することなくタンパ ク質中でなされ得る。本発明のタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の保存的置換を含み得る。このような変更としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかについて、これらの疎水性アミノ酸の他のいずれかでの置換；グルタミン酸（Ｅ）でのアスパラギン酸（Ｄ）の置換およびその逆；アスパラギン（Ｎ）でのグルタミン（Ｑ）の置換およびその逆；ならびにスレオニン（Ｔ）でのセリン（Ｓ）の置換およびその逆が挙げられる。他の置換もまた、特定のアミノ酸の環境およびそのタンパク質の三次元構造におけるその役割に依存して、保存的であるとみなされ得る。例えば、グリシン（Ｇ）およびアラニン（Ａ）は、しばしば、交換可能であり得、アラニン（Ａ）およびバリン（Ｖ）も同様であり得る。比較的疎水性のメチオニン（Ｍ）は、しばしば、ロイシンおよびイソロイシンと交換され得、そして時々、バリンと交換され得る。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）は、しばしば、そのアミノ酸残基の重要な特徴がその電荷であり、これら２つのアミノ酸残基の異なるｐＫが重要でない位置で交換可能である。さらに他の変更は、特定の環境で「保存的」であるとみなされ得る（例えば、本明細書中の表ＩＩＩ；１３〜１５頁「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第２版、Ｌｕｂｅｒｔ Ｓｔｒｙｅｒ編（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、ＰＮＡＳ １９９２ Ｖｏｌ８９ １０９１５−１０９１９；Ｌｅｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９５ Ｍａｙ １９；２７０（２０）：１１８８２−６を参照のこと）。
【００９２】
本明細書中に開示される発明の実施形態として、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の広範な種々の当該分野で受け入れられる改変体またはアナログ（例えば、アミノ酸挿入、欠失、および置換を有するポリペプチド）が挙げられる。ＳＴＥＡＰ−１改変体は、当該分野で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発、アラニンスキャンニング、およびＰＣＲ変異誘発）を用いて作製され得る。部位特異的変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１０：６４８７（１９８７））、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５））、制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ、３１７：４１５ （１９８６））、または他の公知の技術が、ＳＴＥＡＰ−１改変体ＤＮＡを生成するために、クローニングしたＤＮＡにおいて実施され得る。
【００９３】
スキャンニングアミノ酸分析はまた、特異的な生物学的活性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用）に関連する連続配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定するのに使用され得る。比較的小さく、中性のアミノ酸が、好ましいスキャンニングアミノ酸に含まれる。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンは、代表的に、この群の中で好ましいスキャンニングアミノ酸である。なぜならば、アラニンは、β炭素の後ろの側鎖を排除し、そして改変体の主鎖のコンホメーションを変更する可能性がより低いからである。アラニンはまた、代表的に、それが、最も一般的なアミノ酸であるので好ましい。さらに、アラニンは、しばしば、埋もれた位置および露出した位置の両方において見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９７６））。アラニン置換が、十分な量の改変体を生じない場合、等比体積のアミノ酸が使用され得る。
【００９４】
本明細書中で規定される場合、ＳＴＥＡＰ−１改変体、アナログ、またはホモログは、図３のアミノ酸配列を有するＳＴＥＡＰ−１タンパク質と「交差反応性」である少なくとも１つのエピトープを有するという特徴的な特性を有する。この文で使用される場合、「交差反応性」は、ＳＴＥＡＰ−１改変体に特異的に結合する抗体またはＴ細胞がまた、図３に示されるアミノ酸配列を有するＳＴＥＡＰ−１タンパク質に特異的に結合することを意味する。ポリペプチドは、出発ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に特異的に結合する抗体またはＴ細胞により認識され得るいかなるエピトープも含まない場合、図３に示すタンパク質の改変体でなくなる。当業者は、タンパク質を認識する抗体が、異なる大きさのエピトープに結合し、そして約４または５アミノ酸オーダーの一群（連続していようとしていまいと）が、最小エピトープにおけるアミノ酸の代表的な数とみなされることを理解する。例えば、Ｎａｉｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００ １６５（１２）：６９４９−６９５５；Ｈｅｂｂｅｓら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）２６（９）：８６５−７３；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５）１３５（４）：２５９８−６０８を参照のこと。
【００９５】
他のクラスのＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質改変体は、図３のアミノ酸配列またはそのフラグメントと、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％以上の類似性を共有する。別の特定のクラスのＳＴＥＡＰ−１タンパク質改変体またはアナログは、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で現在公知のＳＴＥＡＰ−１の生物学的モチーフの１つ以上を含む。従って、最初のフラグメントと比較して変更された機能的（例えば、免疫原性）特性を有するＳＴＥＡＰ−１フラグメント（核酸またはアミノ酸）のアナログは、本発明に包含される。現在当該分野の一部であるかまたは当該分野の一部となるモチーフが図２または図３の核酸配列またはアミノ酸配列に適用されることが理解される。
【００９６】
本明細書中で議論されるように、請求項に記載された発明の実施形態は、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の全長より短いアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。例えば、本発明の代表的な実施形態は、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の任意の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の連続するアミノ酸を有するペプチド／タンパク質を含む。
【００９７】
さらに、本明細書中に開示される本発明の代表的な実施形態は、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列全体を通して、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タ ンパク質のアミノ酸約１〜アミノ酸約１０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約１０〜アミノ酸約２０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約２０〜アミノ酸約３０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約３０〜アミノ酸約４０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約４０〜アミノ酸約５０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約５０〜アミノ酸約６０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約６０〜アミノ酸約７０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約７０〜アミノ酸約８０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約８０〜アミノ酸約９０からなるポリペプチド、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約９０〜アミノ酸約１００からなるポリペプチドなどを含む。さらに、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸約１（または２０または３０または４０など）〜アミノ酸約２０（または１３０または１４０または１５０など）からなるポリペプチドが、本発明の実施形態である。この段落における開始位置および停止位置は、特定の位置およびプラス５残基またはマイナス５残基の位置をいうことが理解される。
【００９８】
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質は、標準的なペプチド合成技術を用いてかまたは当該分野で周知の化学切断方法を用いて生成される。あるいは、組み換え方法が、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードする核酸分子を生成するのに使用され得る。１つの実施形態において、核酸分子は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質（またはその改変体、ホモログ、またはアナログ）の規定されたフラグメントを生成する手段を提供する。
【００９９】
（ＩＩＩ．Ａ．モチーフ保有タンパク質の実施形態）
本明細書中に開示される本発明のさらなる例示の実施形態は、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド配列中に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドを包含する。種々のモチーフが当該分野で公知であり、そしてタンパク質は、多くの公に利用可能なインターネットサイト（例えば、ＵＲＬアドレス：ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／；ｈｔｔｐ：／／ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｅｑ−ｓｅａｒｃｈ／ｓｔｒｕｃ−ｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ；ｐｓｏｒｔ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／；ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ／ｓｃａｎ．ｈｔｍｌ；ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｋｓ／ｓｃｎｐｓｉｔ．ｈｔｍｌ；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ． ｈｔｍｌ；およびＢＩＭＡＳ、ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により、このようなモチーフの存在について評価され得る。
【０１００】
全てのＳＴＥＡＰ−１改変体タンパク質のモチーフ保有部分配列は、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩにおいて示されそして同定される。
【０１０１】
表ＸＩＸは、ｐｆａｍサーチ（ＵＲＬアドレスｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／を参照のこと）に基づくいくつかの頻繁に生じるモチーフを示す。表ＸＩＸのカラムは、（１）モチーフ名の略称、（２）このモチーフファミリーの異なるメンバーの間で見出された同一性％、（３）モチーフ名または詳細、および（４）最も一般的な機能を列挙し；位置情報は、そのモチーフが位置に関連性がある場合に含まれる。
【０１０２】
先に議論された１つ以上のＳＴＥＡＰ−１モチーフを含むポリペプチドは、先に議論されたＳＴＥＡＰ−１モチーフが増殖調節不全に関連するという観察の観点で、およびＳＴＥＡＰ−１が特定の癌で過剰発現されるという理由から、悪性の表現型の特異的な特徴を解明するのに有用である（例えば、表Ｉを参照のこと）。カゼインキナーゼＩＩ、ｃＡＭＰおよびｃａｍｐ依存性プロテインキナーゼ、ならびにプロテインキナーゼＣは、例えば、悪性の表現型の発生に関連することが公知である酵素である（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．、７８（２）：１６５−１７４（１９９８）；Ｇａｉｄｄｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３６（１０）：４３３１−４３３８（１９９５）；Ｈａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４（６）：１１１９−１１２６（１９９６）；Ｐｅｔｅｒｚｉｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（４６）：６３２２−６３２９（１９９９）、およびＯ’Ｂｒｉａｎ、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．５（２）：３０５−３０９（１９９８）を参照のこと）。さらに、グリコシル化およびミリストイル化の両方は、癌および癌の進行にも関連するタンパク質修飾である（例えば、Ｄｅｎｎｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４７３（１）：２１−３４（１９９９）；Ｒａｊｕら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２３５（１）：１４５−１５４（１９９７）を参照のこと）。アミド化は、癌および癌の進行にも関連する別のタンパク質修飾である（例えば、Ｔｒｅｓｔｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．（１３）：１６９−１７５（１９９２）を参照のこと）。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明のタンパク質は、当該分野で認知された方法に従って同定された１つ以上の免疫反応性エピトープ（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩに示されるペプチド）を含む。ＣＴＬエピトープは、特定のＨＬＡ対立遺伝子に最適に結合し得るＳＴＥＡＰ−１タンパク質中のペプチドを同定するための特別なアルゴリズムを用いて決定され得る（例えば、表ＩＶ：ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＲＬ ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ；およびＢＩＭＡＳ、ＵＲＬ ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。さらに、 ＨＬＡ分子に対して十分な結合親和性を有し、そして免疫原性エピトープであることに関連するペプチドを同定するためのプロセスが当該分野で周知であり、そして過度の実験を行うことなく実施される。さらに、免疫原性エピトープであるペプチドを同定するためのプロセスが、当該分野で周知であり、そしてインビトロまたはインビボのいずれかで、過度の実験を行わずに実施される。
【０１０４】
免疫原性を調節するために、このようなエピトープのアナログを作製するための原理もまた、当該分野で公知である。例えば、当業者は、ＣＴＬまたはＨＴＬモチーフ（例えば、表ＩＶのＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフを参照のこと）を有するエピトープを用いて開始する。このエピトープは、特定の位置のうちの１つのアミノ酸を置換し、そしてそれをその位置に特定された別のアミノ酸で置き換えることにより、アナログを作製される。例えば、当業者は、任意の他の残基（例えば、表ＩＶに規定されるような優先性の残基）に有利となるように、有害な残基を置換し得るか；優先性の低い残基を、表ＩＶに規定されるような優先性の残基で置換し得るか；または天然に存在する優先性の残基を、表ＩＶに規定されるような別の優先性の残基で置換し得る。置換は、ペプチド中の主要なアンカー位置または他の位置で生じ得る；例えば、表ＩＶを参照のこと。
【０１０５】
種々の参考文献は、目的のタンパク質およびそのアナログにおけるエピトープの同定および生成に関する分野を反映している。例えば、Ｃｈｅｓｎｕｔらに対するＷＯ９７／３３６０２；Ｓｅｔｔｅ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９ ５０（３−４）：２０１−２１２；Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ １６６（２）：１３８９−１３９７；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７ ５８（１）：１２−２０；Ｋｏｎｄｏら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９７ ４５（４）：２４９−２５８；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６ １５７（８）：３４８０−９０；およびＦａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３−７５（１９９４）；Ｋａｓｔら、１９９４ １５２（８）：３９０４−１２；Ｂｏｒｒａｓ−Ｃｕｅｓｔａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ ６１（３）：２６６−２７８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、ＰＭＩＤ：７８９５１６４、ＵＩ：９５２０２５８２；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１ １４７（８）：２６６３−２６６９；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９４ １（９）：７５１−７６１、およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８ １８（２）：７９−９２を参照のこと。
【０１０６】
本発明の関連の実施形態は、表ＸＸに示される異なるモチーフ、ならびに／または表Ｖ〜ＸＶＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＸＬＶＩＩの１つ以上の推定ＣＴＬエピトープ、ならびに／または表ＸＬＶＩＩＩ〜ＬＩの１つ以上の推定ＨＴＬエピトープ、ならびに／または当該分野で公知の１つ以上のＴ細胞結合モチーフの組み合わせを含むポリペプチドを包含する。好ましい実施形態は、このポリペプチドのモチーフ内または介在配列内のいずれにも、挿入、欠失、または置換を含まない。さらに、これらのモチーフのいずれかの側に、多くのＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基のいずれかを含む実施形態が、望ましくあり得る（例えば、モチーフが位置するポリペプチド構造のより大きな部分を含むために）。代表的に、モチーフのいずれかの側のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸残基の数は、約１〜約１００アミノ酸残基の間、好ましくは、５〜約５０アミノ酸残基の間である。
【０１０７】
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質は、多くの形態、好ましくは、単離された形態で具体化される。精製されたＳＴＥＡＰ−１タンパク質分子は、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドへのＳＴＥＡＰ−１の結合を障害する、他のタンパク質または分子を、実質的に含まない。単離および精製の性質および程度は、意図される用途に依存する。ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の実施形態は、精製されたＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、および機能的な可溶性ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を含む。１つの実施形態において、機能的な可溶性ＳＴＥＡＰ−１タンパク質またはそのフラグメントは、抗体、Ｔ細胞または他のリガンドによって結合される能力を維持する。
【０１０８】
本発明はまた、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含むＳＴＥＡＰ−１タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、以下のような出発ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特性を示す：出発ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に関連するエピトープに特異的に結合する抗体の産生を誘発する能力；このような抗体によって結合される能力；ＨＴＬまたはＣＴＬの活性化を誘発する能力；ならびに／あるいは、この出発タンパク質にもまた特異的に結合するＨＴＬまたはＣＴＬによって認識される能力。
【０１０９】
特定の興味深い構造を含むＳＴＥＡＰ−１関連ポリペプチドは、当該分野で周知の種々の分析技術を使用してかまたは免疫原性に基づいて、予測および／または同定され得、これらの技術としては、例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析の方法が挙げられる。このような構造を含むフラグメントは、サブユニット特異的抗ＳＴＥＡＰ−１抗体もしくはＴ細胞の作製、またはＳＴＥＡＰ−１に結合する細胞因子の同定において、特に有用である。例えば、親水性プロファイルが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．およびＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｐ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８の方法を使用して、同定され得る。ヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）プロファイルが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２の方法を使用して、同定され得る。接近可能残基の％のプロファイルが作製され得、そして、免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２の方法を使用して、同定され得る。平均可撓性プロファイルが作製され得、そしてＢｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を使用して、免疫原性ペプチドフラグメントが同定され得る。β−ターンプロファイルが作製され得、そして免疫原性ペプチドフラグメントは、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４の方法を使用して、同定され得る。
【０１１０】
ＣＴＬエピトープは、特定化されたＨＬＡ対立遺伝子に必要に応じて結合し得るＳＴＥＡＰ−１タンパク質内のペプチドを同定するために、特定のアルゴリズムを使用して（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／のＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイト；表ＩＶ（Ａ）〜（Ｅ）の表；ＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭおよびＥｐｉｍｅｒＴＭ、 Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＲＬ（ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）；ならびに、ＢＩＭＡＳ，ＵＲＬ ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を使用することによって）決定され得る。この例示において、ヒトＭＨＣクラスＩ分子の状況において示されるＳＴＥＡＰ−１由来のペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、Ａ２４、Ｂ７およびＢ３５）が、予測された（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩ、表ＸＸＩＩ〜ＬＩを参照のこと）。詳細には、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の完全なアミノ酸配列および他の改変体の関連部分（すなわち、ＨＬＡクラスＩ予測については、点変異のいずれかの側上の９個の隣接した残基、およびＨＬＡクラスＩＩ予測については、点変異のいずれかの側上の１４個の隣接した残基）を、上記Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）ウェブサイトにおいて見出されるＨＬＡ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆ Ｓｅａｒｃｈアルゴリズムに入力し、そして、ＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／のＳＹＦＰＥＩＴＨＩサイトを加えて、使用した。
【０１１１】
ＨＬＡペプチドモチーフ検索アルゴリズムは、ＨＬＡクラスＩ分子、詳細には、ＨＬＡ−Ａ２のグルーブにおける特定のペプチド配列の結合に基づいて、Ｄｒ．Ｋｅｎ Ｐａｒｋｅｒによって発見された（例えば、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０−６（１９９１）；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１２６１−３（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：１６３−７５（１９９４）を参照のこと）。このアルゴリズムは、ＨＬＡ−Ａ２および他の多数のＨＬＡクラスＩ分子への予測される結合についての完全なタンパク質配列から、８マー、９マー、および１０マーのペプチドを配置およびランク付けすることを可能にする。多数のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、８マー、９マー、１０マーまたは１１マーである。例えば、クラスＩ ＨＬＡ−Ａ２について、エピトープは、好ましくは、２位においてロイシン（Ｌ）またはメチオニン（Ｍ）を含み、そしてＣ末端においてバリン（Ｖ）またはロイシン（Ｌ）を含む（例えば、Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３５８０−７（１９９２）を参照のこと）。ＳＴＥＡＰ−１予測結合ペプチドの選択結果は、本明細書中の表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＬＩに示される。表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよび表ＸＸＩＩ〜ＸＬＶＩＩにおいて、選択された候補物である、各ファミリーメンバーについての９マーおよび１０マーが、それらの位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアとともに示される。表ＸＬＶＩＩＩ〜ＬＩにおいて、選択された候補物である、各ファミリーメンバーについての１５マーが、それらの位置、各特定のペプチドのアミノ酸配列、および推定結合スコアとともに示される。この結合スコアは、３７℃（ｐＨ６．５）においてペプチドを含む複合体の解離の、推定半減時間に対応する。最も高い結合スコアを有するペプチドは、最良の期間にわたって、細胞表面上でＨＬＡクラスＩに最も密接して結合され、Ｔ細胞認識のための最良の免疫原性標的を示すと予測される。
【０１１２】
ＨＬＡ対立遺伝子へのペプチドの実際の結合は、抗原プロセシング欠損細胞株Ｔ２上でのＨＬＡ発現を安定性化させることによって評価され得る（例えば、Ｘｕｅら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３０：７３−８（１９９７）およびＰｅｓｈｗａら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３６：１２９−３８（１９９８）を参照のこと）。特定のペプチドの免疫原性は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の存在下におけるＣＤ＋８細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することによって、インビトロで評価され得る。
【０１１３】
ＢＩＭＡＳ部位、ＥｐｉｍｅｒＴＭ部位およびＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ部位によって予測されるか、あるいは当該分野で利用可能であるかまたは表ＩＶに示されるような分野の一部となる、ＨＬＡクラスＩモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフによって特定化される（あるいは、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ｓｉｔｅ ＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／、またはＢＩＭＡＳ，ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を使用して決定される）、全てのエピトープは、本発明に従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に「適用」されるということは、理解されるべきである。この文脈において使用される場合、「適用される」とは、例えば、可視によってか、または当該関連分野における当業者によって理解されるような、コンピューターベースのパターン認定方法によって、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質が評価されることを意味する。ＨＬＡクラスＩモチーフを保有する、８、９、１０もしくは１１のアミノ酸残基のＳＴＥＡＰ−１タンパク質の全ての部分配列、またはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有する９以上のアミノ酸残基の部分配列は、本発明の範囲内である。
【０１１４】
（ＩＩＩ．Ｂ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の発現）
以下の実施例において記載される実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１は、市販の発現ベクター（例えば、Ｃ末端６×ＨｉｓおよびＭＹＣタグ（ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨＩＳ，ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＴａｇ５，ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ ＴＮ）を用いてＳＴＥＡＰ−１をコードする、ＣＭＶ駆動発現ベクター）でトランスフェクトした細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）中で簡便に発現され得る。Ｔａｇ５ベクターは、ＩｇＧＫ分泌シグナルを提供し、このシグナルを使用して、トランスフェクト細胞中の分泌されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質の生成を容易にし得る。培養培地中の分泌されたＨＩＳタグ化ＳＴＥＡＰ−１は、例えば、標準技術を使用するニッケルカラムを使用して、精製され得る。
【０１１５】
（ＩＩＩ．Ｃ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の改変）
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の改変（例えば、共有結合的改変）は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合的改変の１つの型は、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、有機誘導体化因子（これは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の選択される側鎖残基またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応し得る）と反応させることを包含する。本発明の範囲内に含まれるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの共有結合的改変の別の型は、本発明のタンパク質のネイティブなグリコシル化パターンを変化させることを包含する。ＳＴＥＡＰ−１の共有結合改変の別の型は、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドを、種々の非タンパク様ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）のうちの１つに、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第号４，７９１，１９２号；または同第４，１７９，３３７号に記載される様式で連結させることを包含する。
【０１１６】
本発明のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質はまた、キメラ分子を形成するように改変され得、このキメラ分子は、別の異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合されたＳＴＥＡＰ−１を含む。このようなキメラ分子は、化学的にかまたは組換え的に、合成され得る。キメラ分子は、別の腫瘍関連抗原またはそのフラグメントに融合された本発明のタンパク質を有し得る。あるいは、本発明に基づくタンパク質は、ＳＴＥＡＰ−１配列のフラグメントの融合体（アミノ酸または核酸）を含み得、その結果、その長さを通して、図２または図３に示されるアミノ酸配列または核酸配列に直接的に相同しない分子が作製される。このようなキメラ分子は、ＳＴＥＡＰ−１の複数の同じ部分配列を含み得る。キメラ分子は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の、ポリヒスチジンエピトープタグとの融合体を含み得、これは、固定化されたニッケルが選択的に結合し得るエピトープに、サイトカインまたは増殖因子を提供する。エピトープタグは、一般に、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端に位置される。代替の実施形態において、キメラ分子は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含み得る。二価の形態のキメラ分子（「「免疫接着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）とも呼ばれる」）について、このような融合体は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。このＩｇ融合体は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に代わる、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの可溶性（膜貫通ドメインを欠失または不活性化した）形態の置換を含む。好ましい実施形態において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧＩ分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、またはヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の産生については、例えば、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日発行）を参照のこと。
【０１１７】
（ＩＩＩ．Ｄ．）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の用途）
本発明のタンパク質は、多くの異なる特定の用途を有する。ＳＴＥＡＰ−１が前立腺癌および他の癌において高度に発現される場合、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質は、癌組織に対して、正常なＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態を評価する方法において使用され、それによって悪性表現型が明らかになる。代表的には、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の領域由来のポリペプチドが、それらの領域（例えば、１つ以上のモチーフを含む領域）における摂動（例えば、欠失、挿入、点変異など）の存在を評価するために使用される。例示的なアッセイは、癌性組織に対して正常なこの領域の特徴を評価するか、またはエピトープに対する免疫応答を惹起させるために、抗体またはＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド配列に含まれる１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＴ細胞標的化ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を用いる。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質において１つ以上の生物学的モチーフのアミノ酸残基を含むＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を使用して、ＳＴＥＡＰ−１の領域と相互作用する因子についてスクリーニングする。
【０１１８】
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質フラグメント／部分配列は、ドメイン特異的抗体（例えば、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の細胞外エピトープまたは細胞内エピトープを認識する抗体）を作製しそして特徴付ける際に、ＳＴＥＡＰ−１またはその特定の構造ドメインに結合する薬剤または細胞因子を同定するために、そして種々の治療状況および診断状況（診断アッセイ、癌ワクチンおよびこのようなワクチンを調製する方法が挙げられるがこれらに限定されない）において、特に有用である。
【０１１９】
ＳＴＥＡＰ−１遺伝子によってコードされるタンパク質、またはそれらのアナログ、ホモログもしくはフラグメントによってコードされるタンパク質は、種々の用途を有し、これらの用途としては、抗体の作製、ならびにＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物に結合する、リガンドおよび他の薬剤および細胞構築物を同定するための方法が挙げられるがこれらに限定されない。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質またはそのフラグメントに対して惹起される抗体は、診断アッセイおよび予後アッセイ、ならびにＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現によって特徴付けられるヒト癌（例えば、表１に列挙されるような癌）の管理における画像化方法に有用である。このような抗体は、細胞内で発現され得、そしてこのような癌を有する患者を処置する方法において使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１関連核酸またはＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質はまた、ＨＴＬ応答またはＣＴＬ応答を生じさせる際に使用される。
【０１２０】
ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を検出するために有用な種々の免疫学的アッセイが、使用され、これらのアッセイとしては、種々の型の放射免疫アッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）、免疫細胞化学方法などが挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞を検出し得る免疫学的画像化試薬として（例えば、放射性核種（ｒａｄｉｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｉｃ）画像化方法において）、標識および使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質はまた、本明細書中でさらに記載されるように、癌ワクチンを作製する際に、特に有用である。
【０１２１】
（ＩＶ．）ＳＴＥＡＰ−１抗体）
本明細書中の別の局面は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に特異的に結合し、そしてペプチドまたはＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質ではないタンパク質には結合しない（または弱く結合する）。例えば、ＳＴＥＡＰ−１に結合する抗体は、それらのホモログまたはアナログのようなＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に結合し得る。
【０１２２】
本発明のＳＴＥＡＰ−１抗体は、癌（例えば、表Ｉを参照のこと）の診断アッセイおよび予後アッセイ、ならびに画像化方法論において、特に有用である。同様に、このような抗体は、ＳＴＥＡＰ−１がまた、他の癌において発現されるかまたは過剰に発現される程度まで、これらの他の癌を処置、診断および／または予後診断する際に有用である。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば、一本鎖抗体）は、ＳＴＥＡＰ−１の発現が関与する癌（例えば、進行性または転移性の前立腺癌）の処置において、治療学的に有用である。
【０１２３】
本発明はまた、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質および変異ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の検出および定量化のために有用な種々の免疫学的アッセイを提供する。このようなアッセイは、適切な場合、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を認識および結合し得る、１種以上のＳＴＥＡＰ−１抗体を含み得る。これらのアッセイは、当該分野で周知の種々の免疫学的アッセイ様式の範囲内で実施され得、これらのアッセイとしては、種々の型の放射免疫アッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２４】
本発明の免疫学的非抗体アッセイはまた、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）ならびに主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）結合アッセイも含む。
【０１２５】
さらに、ＳＴＥＡＰ−１を発現する前立腺癌および他の癌を検出し得る免疫学的画像化方法もまた、本発明によって提供され、これらとしては、標識化ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用する、放射性核種画像化方法が挙げられるがこれらに限定されない。このようなアッセイは、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌（例えば、前立腺癌）の検出、モニタリング、および予後診断において、臨床学的に有用である。
【０１２６】
ＳＴＥＡＰ−１抗体はまた、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を精製するための方法、ならびにＳＴＥＡＰ−１ホモログおよびＳＴＥＡＰ−１関連分子を単離するための方法において使用される。例えば、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を精製する方法は、以下の工程を包含する：固体マトリクスに結合しているＳＴＥＡＰ−１抗体を、溶解物またはＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を含有する他の溶液とともに、ＳＴＥＡＰ−１抗体がＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に結合することが可能な条件下でインキュベートする工程；この固体マトリクスを洗浄して、不純物を取り除く工程；ならびに、結合している抗体から、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を溶出する工程。本発明に従う、ＳＴＥＡＰ−１抗体の他の用途としては、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を模倣する抗イディオタイプ抗体を作製することが挙げられる。
【０１２７】
抗体を調製するための種々の方法が、当該分野で周知である。例えば、抗体は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、ペプチド、またはフラグメントを使用して、適切な哺乳動物宿主を免疫することによって、単離形態または免疫結合体化形態で、調製され得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ，編，Ｈａｒｌｏｗ，ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９））。さらに、ＳＴＥＡＰ−１ ＧＳＴ融合タンパク質のようなＳＴＥＡＰ−１融合タンパク質もまた、使用され得る。特定の実施形態において、図２または図３のアミノ酸配列の全てまたは大部分を含むＧＳＴ融合タンパク質が生成され、次いで、これを免疫原として使用して、適切な抗体を作製する。別の実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質が合成され、そして免疫原として使用される。
【０１２８】
さらに、当該分野で公知の裸のＤＮＡ免疫技術が使用され（精製されたＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質またはＳＴＥＡＰ−１発現細胞を用いてかまたは用いずに）、そのコードされた免疫原に対する免疫応答が生じる（総説としては、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８を参照のこと）。
【０１２９】
図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ酸配列を分析して、抗体を作製するための、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の特定の領域を選択し得る。例えば、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の疎水性分析および親水性分析を使用して、ＳＴＥＡＰ−１構造における親水性領域を同定する。免疫原構造を示すＳＴＥＡＰ−１タンパク質の領域、ならびに他の領域およびドメインは、当該分野で公知の種々の他の方法（例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析）を使用して、容易に同定され得る。親水性プロフィールは、Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．およびＷｏｏｄｓ，Ｋ．Ｒ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８の方法を使用して、作製され得る。水治療法プロフィールは、Ｋｙｔｅ，Ｊ．およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２の方法を使用して、作製され得る。アクセス可能なパーセント（％）残基プロフィールは、Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２の方法を使用して、作製され得る。平均可橈性プロファイル（ａｖｅｒａｇｅ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ）は、Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５の方法を使用して、作製され得る。βターンプロフィールは、Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．，１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４の方法を使用して、作製され得る。従って、これらのプログラムまたは方法のいずれかによって同定される各領域は、本発明の範囲内である。ＳＴＥＡＰ−１抗体を作製するための方法は、本明細書中で提供される実施例によって、さらに例示される。免疫原として使用するためのタンパク質またはポリペプチドを調製するための方法は、当該分野で周知である。キャリア（例えば、ＢＳＡ、ＫＬＨまたは他のキャリアタンパク質）とタンパク質との免疫原性結合体を調製するための方法もまた、当該分野で周知である。いくつかの状況において、例えば、カルボジイミド試薬を使用する直接的結合体化が使用され；別の例においては、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬによって供給される結合試薬が有効である。ＳＴＥＡＰ−１免疫原の投与は、当該分野で理解されるように、適切な期間にわたって、適切なアジュバントを使用して注射することによって、しばしば行われる。免疫スケジュールの間、抗体の力価を収集して、抗体形成の妥当性を決定し得る。
【０１３０】
ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手段によって生成され得る。例えば、所望なモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準的なハイブリドーマ技術、または一般に公知のように、抗体産生Ｂ細胞を不死化する改変を使用して、調製される。所望な抗体を分泌する不死化細胞株は、免疫アッセイによってスクリーニングされる（このアッセイにおいて、抗原は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質である）。適切な不死化細胞培養物が同定された場合、この細胞が拡大され得、そしてインビトロ培養物または腹水のいずれかから、抗体が生成され得る。
【０１３１】
本発明の抗体またはフラグメントはまた、組換え手段によっても生成され得る。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の所望な領域に特異的に結合する領域はまた、複数の種起源のキメラ抗体または相補性決定領域（ＣＤＲ）移植化（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体の状況下で産生され得る。ヒト化ＳＴＥＡＰ−１抗体またはヒトＳＴＥＡＰ−１抗体もまた産生され得、そして治療的状況下での使用のために好ましい。１つ以上の非ヒト抗体ＣＤＲを、対応するヒト抗体配列と置換することによる、マウス抗体および他の非ヒト抗体をヒト化するための方法は、周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６を参照のこと）。Ｃａｒｔｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５、およびＳｉｍｓら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６もまた参照のこと。
【０１３２】
完全なヒトモノクローナル抗体を産生するための方法としては、ファージディスプレイ方法およびトランスジェニック方法が挙げられる（概要については、Ｖａｕｇｈａｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５−５３９を参照のこと）。完全なヒトＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体は、大きいヒトＩｇ遺伝子コンビナトリアルライブラリー（すなわち、ファージディスプレイ）を使用するクローニング技術を使用して生成され得る（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍａｎ，Ｃｌａｒｋ，Ｍ．編）、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ、４５−６４頁（１９９３）のＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ＢｕｒｔｏｎおよびＢａｒｂａｓ、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（同書）６５−８２頁）。完全なヒトＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体はまた、１９９７年１２月３日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓら）に記載されるように、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニックマウスを使用して産生され得る（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ、１９９８、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７（４）：６０７−６１４；米国特許第６，１６２，９６３号（２０００年１２月１９日発行）；米国特許第６，１５０，５８４号（２０００年１１月１２日発行）；および米国特許第６，１１４，５９８号（２０００年９月５日発行）もまた参照のこと）。この方法は、ファージディスプレイ技術に必要とされるインビトロ操作を回避し、そして高い親和性の真正ヒト抗体を効率的に産生する。
【０１３３】
ＳＴＥＡＰ−１抗体のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質との反応性は、多数の周知方法によって確立され得、これらの方法としては、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、および適切な場合、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞またはそれらの抽出物を使用する、ＦＡＣＳ分析が挙げられる。ＳＴＥＡＰ−１抗体またはそれらのフラグメントは、検出可能なマーカーで標識され得るか、または第二の分子に結合体化され得る。適切な検出可能なマーカーとしては、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、２つ以上のＳＴＥＡＰ−１エピトープに特異的な二重特異性（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体が、当該分野で一般に公知の方法を使用して、作製される。ホモダイマー抗体もまた、当該分野で公知の架橋技術によって、作製され得る（例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０−２５６５）。
【０１３４】
（Ｖ．）ＳＴＥＡＰ−１細胞免疫応答）
Ｔ細胞が抗原を認識する機構は、解明されている。本発明の有効なペプチドエピトープワクチン組成物は、世界中の集団の非常に広範な区分において治療的免疫応答または予防的免疫応答を誘導する。細胞免疫応答を誘導する本発明の組成物の価値および効力の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説を示す。
【０１３５】
ＨＬＡ分子とペプチド抗原との複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞によって認識されるリガンドとして作用する（Ｂｕｕｓ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ４７：１０７１，１９８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：３５９，１９８５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１，１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３，１９９３）。単一のアミノ酸が置換された抗原アナログの研究および内因性結合した天然でプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、ＨＬＡ抗原分子への特異的結合に必要なモチーフに対応する重要な残基が、同定されており、表ＩＶに記載される（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３，１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：１７８，１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂを介してＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／にアクセスのこと）；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８，１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３，１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９，１９９２；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５２，１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ ７４：９２９−９３７，１９９３；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２，１９９５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９９ Ｎｏｖ；５０（３−４）：２０１−１２、総説を参照のこと）。
【０１３６】
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶学的分析は、対立遺伝子特異的様式においてペプチドリガンドにより保有される残基を収容するＨＬＡ分子のペプチド結合間隙／溝部内のポケットを明らかにし；次いで、これらの残基は、この残基が存在するペプチドのＨＬＡ結合能を決定する（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７，１９９５；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：２０３，１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８：３０５，１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：２４５，１９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５，１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６４：３３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０５３，１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６４，１９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６０：３６７，１９９２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９２７，１９９２；Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ ７０：１０３５，１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９１９，１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７，１９９１を参照のこと。）
従って、クラスＩおよびクラスＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、またはクラスＩもしくはクラスＩＩのスーパーモチーフの定義は、特定のＨＬＡ抗原への結合と関連するタンパク質内の領域の同定を可能にする。
【０１３７】
従って、ＨＬＡモチーフの同定プロセスによって、エピトープベースのワクチンの候補が、同定されている；このような候補は、エピトープとその対応するＨＬＡ分子との会合の結合親和性および／または期間を決定するために、ＨＬＡ−ペプチド結合アッセイによりさらに評価され得る。これらのワクチン候補の中から、集団適用範囲および／または免疫原性の観点で好ましい特徴を有するエピトープを選択するために、さらなる確証実験が行われ得る。
【０１３８】
種々のストラテジーが、細胞免疫原性を評価するために使用され得、これには以下が挙げられる：
１）正常な個体由来の一次Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３，１９９５；Ｃｅｌｉｓ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：２１０５，１９９４；Ｔｓａｉ，Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６，１９９７；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１，１９９８を参照のこと）。この手順は、抗原提示細胞の存在下で、インビトロで数週間の期間にわたって、正常な被験体由来の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を試験ペプチドで刺激することを包含する。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この時間の間に活性化され、そして例えば、ペプチドで感作された標的細胞を含むリンホカイン放出アッセイまたは５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
【０１３９】
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７，１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１，１９９６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３，１９９７を参照のこと）。例えば、このような方法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドが、ＨＬＡトランスジェニックマウスに皮下投与される。免疫の数週間後、脾細胞が取り出され、そして試験ペプチドの存在下で、約１週間インビトロで培養される。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチドで感作された標的細胞および内因的に生成された抗原を発現する標的細胞を含む、５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、検出される。
【０１４０】
３）効果的にワクチン接種された免疫個体および／または慢性的に病気の患者のいずれか由来のリコールＴ細胞応答の証明（例えば、Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７，１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７，１９９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１，１９９７を参照のこと）。従って、リコール応答は、疾患に起因して抗原に晒され、従って「自然に」免疫応答を生成した被験体由来のＰＢＬ、または抗原に対してワクチン接種された患者由来のＰＢＬを培養することによって、検出される。被験体由来のＰＢＬは、試験ペプチド＋抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間、インビトロで培養され、「未刺激」Ｔ細胞と比較して「メモリー」Ｔ細胞の活性化を可能にする。この培養期間の最後に、Ｔ細胞活性が、ペプチドで感作した標的を含む５１Ｃｒ放出、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン放出を含むアッセイを使用して、検出される。
【０１４１】
（ＶＩ．）ＳＴＥＡＰ−１トランスジェニック動物）
ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードする核酸はまた、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製するために使用され得、この動物は、次いで、治療に有用な試薬の開発およびスクリーニングにおいて有用である。確立された技術によって、ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡが、ＳＴＥＡＰ−１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。次いで、このクローン化されたゲノム配列は、ＳＴＥＡＰ−１をコードするＤＮＡを発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。トランスジェニック動物（特に、マウスまたはラットのような動物）を作製するための方法は、当該分野で通常になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号（１９８８年４月１２日発行）および同第４，８７０，００９号（１９８９年９月２６日発行）において記載されている。代表的には、特定の細胞が、組織特異的エンハンサーを用いるＳＴＥＡＰ−１導入遺伝子組込みのために標的化される。
【０１４２】
ＳＴＥＡＰ−１をコードする１コピーの導入遺伝子を含むトランスジェニック動物は、ＳＴＥＡＰ−１をコードするＤＮＡの発現を増加する効果を試験するために使用され得る。このような動物は、例えば、その過剰発現に関連する病理学的状態からの防御を付与すると考えられる試薬についてのテスター動物として使用され得る。本発明のこの局面によると、動物は、試薬で処置され、そしてこの導入遺伝子を有する未処置の動物と比較して減少した病理学的状態の発生率は、この病理学的状態に対する潜在的な治療的介入を示す。
【０１４３】
あるいは、ＳＴＥＡＰ−１の非ヒトホモログは、ＳＴＥＡＰ−１「ノックアウト」動物を構築するために使用され得、このＳＴＥＡＰ−１「ノックアウト」動物は、ＳＴＥＡＰ−１をコードする内在性遺伝子と、この動物の胚性細胞に導入されたＳＴＥＡＰ−１をコードする変化したゲノムＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、ＳＴＥＡＰ−１をコードする欠損遺伝子または変化した遺伝子を有する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従って、ＳＴＥＡＰ−１をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用され得る。ＳＴＥＡＰ−１をコードするゲノムＤＮＡの一部は、欠失され得るか、または別の遺伝子（例えば、組込みをモニタリングするために使用され得る選択マーカーをコードする遺伝子）で置換され得る。代表的には、数キロベースの変化していない隣接ＤＮＡ（５’末端と３’末端との両方）が、ベクター中に含まれる（例えば、相同組換えベクターの説明については、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）を参照のこと）。このベクターは、胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入され、そしてこの導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照のこと）。ついで、この選択された細胞は、動物（例えば、マウスまたはラット）の胚盤胞に注入されて、凝集キメラが形成される（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），１１３−１５２頁を参照のこと）。キメラ胚は、次いで、適切な偽妊娠雌性代理母動物に移植され得、そしてこの胚は、出産されて、「ノックアウト」動物が作製される。生殖細胞中に相同組換えされたＤＮＡを有する子孫が、標準的な技術によって同定され得、そして全ての細胞が相同組み替えされたＤＮＡを含む動物を育種させるために使用され得る。ノックアウト動物は、例えば、特定の病理学的状態に対して防御する能力について、またはＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドの非存在に起因する病理学的状態の発症について、特徴付けされ得る。
【０１４４】
（ＶＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１の検出のための方法）
本発明の別の局面は、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドおよびＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を検出するための方法、ならびにＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を同定するための方法に関する。ＳＴＥＡＰ−１の発現プロフィールは、ＳＴＥＡＰ−１を、転移した疾患についての診断マーカーにする。従って、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態は、進行した病期の疾患に対する感受性、進行速度および／または腫瘍の攻撃性を含む種々の因子を推定するために有用な情報を提供する。本明細書中で詳細に議論されるように、患者サンプル中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態が、当該分野で周知の種々のプロトコルによって分析され得、このプロトコルとしては、免疫組織化学分析、種々のノーザンブロット技術（インサイチュハイブリダイゼーションを含む）、ＲＴ−ＰＣＲ分析（例えば、レーザー捕捉微小解剖サンプルについて）、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられる。
【０１４５】
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル（例えば、血清、骨、前立腺および他の組織、尿、精液、細胞調製物など）中のＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの検出のためのアッセイを提供する。検出可能なＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドとしては、例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子またはそのフラグメント、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、選択的スプライス改変体ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、およびＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子が挙げられる。ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを増幅し、そして／またはＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドの存在を検出するための多数の方法が、当該分野で周知であり、本発明のこの局面の実施において用いられ得る。
【０１４６】
一実施形態において、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡを検出するための方法は、少なくとも１つのプライマーを使用して、逆転写によりこのサンプルからｃＤＮＡを生成する工程；センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしてＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを使用して、このようにして生成されたｃＤＮＡを増幅して、その中のＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡを増幅する工程；およびこの増幅されたＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、を包含する。必要に応じて、この増幅されたＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡの配列が、決定され得る。
【０１４７】
別の実施形態において、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子を検出する方法は、第１に、このサンプルからゲノムＤＮＡを単離する工程；センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとしてＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを使用して、この単離されたゲノムＤＮＡを増幅する工程；およびこの増幅されたＳＴＥＡＰ−１遺伝子の存在を検出する工程、を包含する。多数の適切なセンスプローブとアンチセンスプローブとの組合せが、ＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列から設計され得（例えば、図２を参照のこと）、そしてこの目的のために使用され得る。
【０１４８】
本発明はまた、組織または他の生物学的サンプル（例えば、血清、精液、骨、前立腺、尿、細胞調製物など）中のＳＴＥＡＰ−１タンパク質の存在を検出するためのアッセイを提供する。ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を検出するための方法もまた、周知であり、これには、例えば、免疫沈降、免疫組織化学分析、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡなどが挙げられる。例えば、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の存在を検出する方法は、第１に、このサンプルと、ＳＴＥＡＰ−１抗体、そのＳＴＥＡＰ−１反応性フラグメント、またはＳＴＥＡＰ−１抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質とを接触させる工程；次いで、このサンプル中のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の結合を検出する工程、を包含する。
【０１４９】
ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を同定するための方法もまた、本発明の範囲内である。一実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの存在を検出する工程を包含する。細胞中の特定のｍＲＮＡを検出するための方法は、周知であり、そして例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、標識されたＳＴＥＡＰ−１リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロットおよび関連の技術）、および種々の核酸増幅アッセイ（例えば、ＳＴＥＡＰ−１に対して特異的な相補的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ、および他の増幅型検出方法（例えば、分枝状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど））が挙げられる。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子を発現する細胞を同定するためのアッセイは、この細胞中に存在するか、またはこの細胞により分泌される、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の存在を検出する工程を包含する。タンパク質の検出のための種々の方法が、当該分野で周知であり、そしてＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の検出のために、およびＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を発現する細胞の検出のために用いられる。
【０１５０】
ＳＴＥＡＰ−１発現分析はまた、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子発現を調節する因子を同定および評価するための手段として有用である。例えば、ＳＴＥＡＰ−１発現は、前立腺癌において有意にアップレギュレートされ、そして表Ｉに列挙される組織の癌において発現される。癌細胞におけるＳＴＥＡＰ−１発現またはＳＴＥＡＰ−１過剰発現を阻害する分子または生物学的因子の同定は、治療学的価値を有する。例えば、このような因子は、ＲＴ−ＰＣＲ、核酸ハイブリダイゼーションまたは抗体結合によりＳＴＥＡＰ−１発現を定量するスクリーニングを使用することによって、同定され得る。
【０１５１】
（ＶＩＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１関連遺伝子およびその産物の状態をモニタリングするための方法）
腫瘍形成は、細胞増殖が次第に調節不全になり、細胞が正常な生理学的状態から前癌状態まで進行し、次いで癌状態まで進行する、多段階プロセスであることが知られている（例えば、Ａｌｅｒｓら、Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７７（５）：４３７−４３８（１９９７）およびＩｓａａｃｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．２３：１９−３２（１９９５）を参照のこと）。この状況において、生物学的サンプルを調節不全性の細胞増殖の証拠（例えば、癌における異常なＳＴＥＡＰ−１発現）について試験することにより、癌のような病理学的状態が、治療選択肢がより制限される段階まで進行する前、そして／または予後が悪化する前に、このような異常な生理学を早期に検出することが可能になる。このような試験において、目的の生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１の状態が、例えば、対応する正常なサンプル（例えば、病理により影響を受けていない、この個体または代替の別の個体由来のサンプル）中のＳＴＥＡＰ−１の状態と比較され得る。生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１の状態における（正常なサンプルと比較した場合の）変化は、調節不全性の細胞増殖の証拠を提供する。病理により影響を受けていない生物学的サンプルを正常なサンプルとして使用することに加えて、所定の規範値（例えば、ｍＲＮＡ発現の所定の正常なレベル）（例えば、Ｇｒｅｖｅｒら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９６ Ｄｅｃ ９；３７６（２）：３０６−１４および米国特許第５，８３７，５０１号を参照のこと）が、サンプル中のＳＴＥＡＰ−１の状態を比較するために使用され得る。
【０１５２】
この文脈において、用語「状態」は、当該分野で認められた意味に従って使用され、遺伝子およびその産物の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎまたはｓｔａｔｅ）をいう。代表的には、当業者は、多数のパラメーターを使用して、遺伝子およびその産物の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎまたはｓｔａｔｅ）を評価する。これには、発現された遺伝子産物の位置（ＳＴＥＡＰ−１発現細胞の位置を含む）、ならびに発現された遺伝子産物（例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）のレベルおよび生物学的活性が挙げられるが、これらに限定されない。代表的に、ＳＴＥＡＰ−１の状態における変化は、ＳＴＥＡＰ−１および／またはＳＴＥＡＰ−１発現細胞の位置における変化、ならびに／あるいはＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡおよび／またはＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現の増加を含む。
【０１５３】
サンプル中のＳＴＥＡＰ−１の状態は、当該分野で周知の多数の手段によって分析され得、この手段としては、免疫組織化学分析、インサイチュハイブリダイゼーション、レーザー捕捉微小解剖サンプルに対するＲＴ−ＰＣＲ分析、ウェスタンブロット分析および組織アレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子および遺伝子産物の状態を評価するための代表的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ ２（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），４（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ），１５（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）ａｎｄ １８（ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ）に見出される。従って、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１の状態は、当業者により使用される種々の方法によって評価され、これらの方法としては、ゲノムサザン分析（例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子中の変動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を試験するため）、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡのノーザン分析および／またはＰＣＲ分析（例えば、ポリヌクレオチド配列またはＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの発現レベルにおける変化を試験するため）、ならびにウェスタン分析および／または免疫組織化学分析（例えば、ポリペプチド配列における変更、サンプル内のポリペプチドの局在化における変化、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現レベルにおける変化、および／またはＳＴＥＡＰ−１タンパク質とポリペプチド結合パートナーとの会合を試験するため）が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能なＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドとしては、例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子またはそのフラグメント、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、代替的スプライス改変体、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ、およびＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡ分子または組換えＲＮＡ分子が挙げられる。
【０１５４】
ＳＴＥＡＰ−１の発現プロフィールは、局所および／または転移した疾患のための診断マーカーにし、そして生物学的サンプルの増殖または腫瘍の可能性についての情報を提供する。詳細には、ＳＴＥＡＰ−１の状態は、特定の疾患段階、病気の進行、および／または腫瘍攻撃性に対する感受性を予測するために有用な情報を提供する。本発明は、ＳＴＥＡＰ−１の状態を決定するため、および表Ｉに列挙される組織の癌のようなＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を診断するための方法およびアッセイを提供する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡは、前立腺および正常な前立腺組織に対する他の癌においてかなり高度に発現されるので、生物学的サンプルにおいてＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの転写物またはタンパク質のレベルを評価するアッセイは、ＳＴＥＡＰ−１調節不良に関連する疾患を診断するために使用され得、適切な治療法の選択を規定する際に有用な予後情報を提供し得る。
【０１５５】
ＳＴＥＡＰ−１の発現状態は、形成異常細胞、前癌細胞および癌細胞の存在、段階および位置を含む、疾患の種々の段階に対する感受性を予測すること、および／または腫瘍の進行を評価するための情報を提供する。さらに、発現プロフィールは、転移した疾患のための画像化薬剤として有用にされる。その結果、本発明の局面は、癌のように調節不良を起こした細胞増殖により特徴付けられる病理学に罹患したかまたは罹患した疑いのある個体から得られるような生物学的サンプルにおいて、ＳＴＥＡＰ−１の状態を試験するための種々の分子予後方法および診断方法に関する。
【０１５６】
上記のように、生物学的サンプルにおけるＳＴＥＡＰ−１の状態は、当該分野で周知の多数の手順により試験され得る。例えば、体内の特定の位置から得られた生物学的サンプルにおけるＳＴＥＡＰ−１の状態は、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞（例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはタンパクを発現する細胞）の存在または非存在についてこのサンプルを評価することにより試験され得る。生物学的サンプルにおけるＳＴＥＡＰ−１の状態におけるそのような変化は、しばしば調節不良細胞増殖に関連しているので、例えばＳＴＥＡＰ−１発現細胞が、そのような細胞（例えば、リンパ節）を通常含まない生物学的サンプルにおいて見出される場合、この試験は、調節不良細胞増殖の証拠を提供し得る。特に、調節不良細胞増殖の１つの指標は、起源器官（例えば、前立腺）から身体の異なる部位（例えば、リンパ節）への癌細胞の転移である。この文脈において、調節不良細胞増殖の証拠は、重要である。なぜなら、例えば、潜在性リンパ節転移は、前立腺癌を有する患者の実質的な割合で検出され得、そのような転移は、疾患の進行の既知の予測値に関係しているからである（例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ ４２（４）：３１５−３１７（２０００）；Ｓｕら、Ｓｅｍｉｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１８（１）：１７−２８（２０００）およびＦｒｅｅｍａｎら、Ｊ Ｕｒｏｌ １９９５ Ａｕｇ １５４（２ Ｐｔ １）：４７４−８））。
【０１５７】
１つの局面において、本発明は、調節不全性の細胞増殖に関連する疾患（例えば、過形成または癌）を有すると疑われる個体由来の細胞により発現されるＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態を決定し、次いでこのように決定した状態を、対応する正常なサンプル中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態と比較することによって、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物をモニタリングするための方法を提供する。正常なサンプルと比較して、試験サンプル中の異常なＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の存在は、個体の細胞内の調節不全性の細胞増殖の存在の指標を提供する。
【０１５８】
別の局面において、本発明は、個体における癌の存在を決定する際に有用なアッセイを提供し、このアッセイは、対応する正常な細胞または正常な組織における発現レベルと比較して、試験細胞サンプルまたは試験組織サンプル中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の有意な増加を検出する工程を包含する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの存在は、表Ｉに列挙される組織を包含するがそれに限定されない組織において評価され得る。これらの組織のいずれかにおける有意なＳＴＥＡＰ−１発現の存在は、癌の発症、存在および／または重篤度を示すために有用である。なぜなら、対応する正常な組織は、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡを発現しないか、これを低レベルでしか発現しないからである。
【０１５９】
関連の実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１の状態は、核酸レベルでよりもむしろタンパク質レベルで決定される。例えば、このような方法は、試験組織サンプル中の細胞により発現されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルを決定し、このように決定されたレベルを、対応する正常なサンプルにおいて発現されるＳＴＥＡＰ−１のレベルと比較する工程を包含する。一実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の存在は、例えば、免疫組織化学方法を使用して、評価される。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現を検出し得るＳＴＥＡＰ−１抗体またはＳＴＥＡＰ−１結合パートナーが、この目的のために、当該分野で周知の種々のアッセイ様式で使用される。
【０１６０】
さらなる実施形態において、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列およびＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の状態が、これらの分子の構造における変動を同定するために、評価され得る。これらの変動としては、挿入、欠失、置換などが挙げられ得る。このような評価は、有用である。なぜなら、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動は、増殖調節不全性の表現型と関連する多数のタンパク質において観察されるからである（例えば、Ｍａｒｒｏｇｉら、１９９９，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（８）：３６９−３７８を参照のこと）。例えば、ＳＴＥＡＰ−１の配列における変異は、腫瘍の存在または発癌補助作用を示し得る。従って、このようなアッセイは、ＳＴＥＡＰ−１における変異が潜在的な機能喪失または腫瘍増殖の増加を示す場合、診断的価値および予測的価値を有する。
【０１６１】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列における変動を観察するための広範な種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の核酸配列またはアミノ酸配列のサイズおよび構造は、本明細書中で考察されるノーザンプロトコル、サザンプロトコル、ウェスタンプロトコル、ＰＣＲプロトコルおよびＤＮＡ配列決定プロトコルにより観察される。さらに、ヌクレオチド配列および核酸配列における変動を観察するための他の方法（例えば、一本鎖高次構造多型分析）が、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，３８２，５１０号（１９９９年９月７日発行）および同第５，９５２，１７０号（１９９５年１月１７日発行）を参照のこと）。
【０１６２】
さらに、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子のメチル化状態が試験され得る。遺伝子の５’調節領域中のＣｐＧアイランドの異常な脱メチル化および／または過剰メチル化が、しばしば、不死化細胞および形質転換細胞において生じ、種々の遺伝子の変化した発現を生じ得る。例えば、πクラスのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（正常な前立腺において発現されるタンパク質であるが、前立腺癌の９０％より多くにおいては発現されない）のプロモーター過剰メチル化は、この遺伝子の転写を永久的に止めるようであり、前立腺癌において最も頻繁に検出されるゲノム変化である（Ｄｅ Ｍａｒｚｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５（６）：１９８５−１９９２（１９９９））。さらに、この変化は、高度な前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）の症例のうちの少なくとも７０％において存在する（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．，１９９８，７：５３１−５３６）。別の例において、ＬＡＧＥ−Ｉ腫瘍特異的遺伝子の発現（これは、正常な前立腺においては発現されないが、前立腺癌の２５〜５０％において発現される）は、リンパ芽球細胞においてデオキシ−アザシチジンにより誘導され、このことは、腫瘍発現が脱メチル化に起因することを示唆している（Ｌｅｔｈｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７６（６）：９０３−９０８（１９９８））。遺伝子のメチル化状態を試験するための種々のアッセイが、当該分野で周知である。例えば、サザンハイブリダイゼーションアプローチにおいて、メチル化されたＣｐＧ部位を含む配列を切断し得ないメチル化感受性制限酵素を使用して、ＣｐＧアイランドのメチル化状態を評価し得る。さらに、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、所定の遺伝子のＣｐＧアイランド中に存在する全てのＣｐＧ部位のメチル化状態を容易にプロファイルし得る。この手順は、亜硫酸水素ナトリウム（これはメチル化されていない全てのシトシンをウラシルに変換する）によりまずＤＮＡを改変し、続いてメチル化されていないＤＮＡに対してメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを使用して増幅することを包含する。メチル化干渉を含むプロトコルはまた、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ １２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５において見出され得る。
【０１６３】
遺伝子増幅は、ＳＴＥＡＰ−１の状態を評価するためのさらなる方法である。遺伝子増幅は、本明細書中で提供される配列に基づいて、例えば、適切に標識されたプローブを使用して、ｍＲＮＡの転写を定量するための従来のサザンブロッティングまたはノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５）、ドットブロッティング、またはインサイチュハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接測定される。あるいは、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）を認識する抗体が、使用される。次いで、この抗体は、標識され、そしてアッセイが実施され、このアッセイにおいて、この二重鎖は、表面に結合され、その結果、この表面上で二重鎖が形成されると、この二重鎖に結合した抗体の存在が、検出され得る。
【０１６４】
生検組織または末梢血が、例えば、ノーザン分析、ドットブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して、癌細胞の存在について簡便にアッセイされて、ＳＴＥＡＰ−１発現が検出され得る。ＲＴ−ＰＣＲ増幅可能なＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの存在は、癌の存在の指標を提供する。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、当該分野で周知である。末梢血中の腫瘍細胞のためのＲＴ−ＰＣＲ検出アッセイは、多数のヒト固形腫瘍の診断および管理における使用について、現在評価されている。前立腺癌の分野において、これらのアッセイには、ＰＳＡおよびＰＳＭを発現する細胞の検出のためのＲＴ−ＰＣＲアッセイが挙げられる（Ｖｅｒｋａｉｋら、１９９７，Ｕｒｏｌ．Ｒｅｓ．２５：３７３−３８４；Ｇｈｏｓｓｅｉｎら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１１９５−２０００；Ｈｅｓｔｏｎら，１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１６８７−１６８８）。
【０１６５】
本発明のさらなる局面は、発症中の癌に対して個体が有する感受性の評価である。一実施形態において、癌に対する感受性を予想するための方法は、組織サンプル中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質（その存在は、癌に対する感受性を示す）を検出する工程を包含し、ここで、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現の程度は、感受性の程度と相関する。特定の実施形態において、前立腺または他の組織中のＳＴＥＡＰ−１の存在が、試験され、ここで、このサンプル中のＳＴＥＡＰ−１の存在は、前立腺癌感受性（または前立腺腫瘍の発症もしくは存在）の指標を提供する。同様に、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列およびＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得る。サンプル中のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の１つ以上の変動の存在は、癌感受性（または腫瘍の発症もしくは存在）の指標である。
【０１６６】
本発明はまた、腫瘍の攻撃性を評価するための方法を包含する。一実施形態において、腫瘍の攻撃性を評価するための方法は、腫瘍細胞によって発現されるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルを決定する工程、このように決定したレベルを、同じ個体もしくは正常な組織参照サンプルから採取した対応する正常な組織において発現されるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルと比較する工程を包含し、ここで正常なサンプルに対する腫瘍サンプルにおけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現の程度は、攻撃性の程度を示す。特定の実施形態において、腫瘍の攻撃性は、ＳＴＥＡＰ−１が腫瘍細胞において発現される程度を決定することによって評価され、ここでより高い発現レベルは、より攻撃性の腫瘍を示す。別の実施形態は、ＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸の分子構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定するための、生物学的サンプル中のこのＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列の完全性の評価である。１つ以上の変動の存在は、より攻撃性の腫瘍を示す。
【０１６７】
本発明の別の実施形態は、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法に関する。一実施形態において、個体における悪性腫瘍の進行を経時的に観察するための方法は、腫瘍のサンプル中の細胞により発現されるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルを決定する工程、このようにして決定されたレベルを、異なる時間に同じ個体から採取した同等な組織サンプルにおいて発現されるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質のレベルと比較する工程、を包含し、ここで、経時的な腫瘍サンプルにおけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現の程度は、癌の進行についての情報を提供する。特定の実施形態において、癌の進行は、腫瘍細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を経時的に決定することにより評価され、ここで経時的に増加した発現は、癌の進行を示す。また、生物学的サンプル中のＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列およびＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列の完全性を評価して、これらの分子の構造における変動（例えば、挿入、欠失、置換など）を同定し得、ここで、１つ以上の変動の存在は、癌の進行を示す。
【０１６８】
上記の診断アプローチは、当該分野で公知の種々の予後プロトコルおよび診断プロトコルのいずれか１つと組み合わされ得る。例えば、本発明の別の実施形態は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現およびＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の発現（またはＳＴＥＡＰ−１遺伝子の変動およびＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物における変動）と、組織サンプルの状態を診断および予想するための手段としての悪性腫瘍に関連する因子との間の同時発生を観察するための方法に関する。悪性腫瘍に関連する種々の因子（例えば、悪性腫瘍に関連する遺伝子の発現（例えば、前立腺癌についてのＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＰＳＭの発現など）、ならびに肉眼で見える細胞学的知見）が、使用され得る（例えば、Ｂｏｃｋｉｎｇら、１９８４，Ａｎａｌ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｙｔｏｌ．６（２）：７４−８８；Ｅｐｓｔｅｉｎ，１９９５，Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２６（２）：２２３−９；Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９８，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．１１（６）：５４３−５１；Ｂａｉｓｄｅｎら、１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２３（８）；９１８−２４を参照のこと）。ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現およびＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の発現（または、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子およびＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物における変動）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、有用である。なぜなら、例えば、疾患と同時に生じる特定の因子のセットの存在は、組織サンプルの状態を診断および予測するために重要な情報を提供するからである。
【０１６９】
一実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現とＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の発現（または、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子およびＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物における変動）と、悪性腫瘍に関連する別の因子との間の同時発生を観察するための方法は、組織サンプル中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡおよびＳＴＥＡＰ−１タンパク質の過剰発現を検出すること、組織サンプル中のＰＳＡ ｍＲＮＡまたはＰＳＡタンパク質の過剰発現（またはＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）を検出すること、ならびにＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡもしくはＳＴＥＡＰ−１タンパク質の過剰発現と、ＰＳＡ ｍＲＮＡもしくはＰＳＡタンパク質の過剰発現（またはＰＳＣＡ発現もしくはＰＳＭ発現）との同時発生を観察することを伴う。特定の実施形態において、前立腺組織におけるＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡおよびＰＳＡ ｍＲＮＡの発現が、試験され、ここで、このサンプル中のＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ過剰発現とＰＳＡ ｍＲＮＡ過剰発現との同時発生は、前立腺癌の存在、前立腺癌感受性または前立腺腫瘍の発症もしくは状態を示す。
【０１７０】
ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質の発現を検出および定量するための方法が、本明細書中に記載されており、そして標準核酸およびタンパク質の検出技術および定量技術は、当該分野で周知である。ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの検出および定量するための標準方法としては、標識ＳＴＥＡＰ−１リボプローブを使用するインサイチュハイブリダイゼーション、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドプローブを使用するノーザンブロットおよび関連する技術、ＳＴＥＡＰ−１に対して特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析、並びに他の増幅型検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）が挙げられる。特定の実施形態において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡ発現を検出および定量する。ＳＴＥＡＰ−１を増幅し得る任意の数のプライマーを、この目的のために使用し得、このプライマーとしては、本明細書中で具体的に記載される種々のプライマーセットが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、野生型ＳＴＥＡＰ−１タンパク質と特異的に反応するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、生検組織の免疫組織化学アッセイにおいて使用し得る。
【０１７１】
（ＩＸ．ＳＴＥＡＰ−１と相互作用する分子の同定）
本明細書中に開示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質および核酸配列は、当業者が、ＳＴＥＡＰ−１と相互作用するタンパク質、低分子および他の薬剤、ならびに種々の分野で受け入れられたプロトコルのうちのいずれか１つを介して、ＳＴＥＡＰ−１によって活性化される経路を同定することを可能にする。例えば、いわゆる相互作用トラップ系（「２ハイブリッドアッセイ」とも呼ばれる）のうちの１つを利用し得る。このような系において、分子は、レポーター遺伝子の発現を指向する転写因子と相互作用し、そして再構成し、一方でこのレポーター遺伝子の発現をアッセイする。他の系は、真核生物転写活性化因子の再構築を介して、インビボでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する（例えば、１９９９年９月２１日に発行された米国特許第５，９５５，２８０号、１９９９年７月２０日に発行された同第５，９２５，５２３号、１９９８年１２月８日に発行された同第５，８４６，７２２号、および１９９９年１２月２１日に発行された同第６，００４，７４６号を参照のこと）。アルゴリズムもまた、タンパク質機能のゲノムベースの予測のために当該分野で利用可能である（例えば、Ｍａｒｃｏｔｔｅら，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：１９９９年１１月４日，８３−８６を参照のこと）。
【０１７２】
あるいは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために、ペプチドライブラリをスクリーニングし得る。このような方法において、ＳＴＥＡＰ−１に結合するペプチドは、アミノ酸のランダムな収集物または制御された収集物をコードするライブラリーをスクリーニングすることによって同定される。このライブラリーによってコードされたペプチドは、バクテリオファージコートタンパク質の融合タンパク質として発現され、次いで、このバクテリオファージ粒子は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に対してスクリーニングされる。
【０１７３】
従って、種々の広範の用途（例えば、治療剤、予後剤または診断剤）を有するペプチドは、予想されるリガンド分子またはレセプター分子の構造に関するいかなる以前の情報もなしで同定される。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列と相互作用する分子を同定するために使用され得る、代表的なペプチドライブラリおよびスクリーニング方法は、例えば、１９９８年３月３日に発行された米国特許第５，７２３，２８６号、および１９９８年３月３１日に発行された同第５，７３３，７３１号で開示される。
【０１７４】
あるいは、ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞株は、ＳＴＥＡＰ−１によって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定するために使用される。このような相互作用は、免疫沈降技術（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｂ．Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ，１９９９，２６１：６４６−５１を参照のこと）を使用して試験され得る。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用するＳＴＥＡＰ−１発現細胞株から免疫沈降され得る。あるいは、Ｈｉｓ−ｔａｇに対する抗体は、ＳＴＥＡＰ−１およびＨｉｓ−ｔａｇ（上記のベクター）の融合物を発現するように操作された細胞株中で使用され得る。この免疫沈降複合体は、ウェスタンブロッティング、タンパク質の３５Ｓ−メチオニン標識、タンパク質のマイクロシークエンシング、銀染色および２次元ゲルゲル電気泳動のような手順に沿ってタンパク質に関して試験され得る。
【０１７５】
ＳＴＥＡＰ−１と相互作用する低分子およびリガンドは、このようなスクリーニングアッセイの関連する実施形態を介して同定され得る。例えば、低分子（リン酸化および脱リン酸化を媒介するＳＴＥＡＰ−１の能力に干渉する分子を含む）により、タンパク質機能との干渉が、細胞サイクル、第２メッセンジャーシグナル伝達、または腫瘍形成の調節の指標としてのＤＮＡまたはＲＮＡとの相互作用として機能することが同定され得る。同様に、ＳＴＥＡＰ−１関連イオンチャネル、タンパク質ポンプ、または細胞連絡機能を調節する低分子を、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を有するタンパク質を処理するために、同定および使用する（例えば、Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ 第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９２）。さらに、ＳＴＥＡＰ−１機能を調節するリガンドは、ＳＴＥＡＰ−１に結合し、そしてレポーター構築物を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。代表的な方法は、例えば、１９９９年７月２７日に発行された米国特許第５，９２８，８６８号において議論されており、そして少なくとも１つのリガンドが低分子であるハイブリッドリガンドを形成するための方法を含む。例示の実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１の融合タンパク質およびＤＮＡ結合タンパク質を発現するために操作された細胞を使用して、ハイブリッドリガンド／低分子の融合タンパク質およびｃＤＮＡライブラリー転写活性化タンパク質を同時発現する。この細胞は、レポーター遺伝子（この発現は、第１融合タンパク質および第２融合タンパク質の互いに隣接して調整される）をさらに含み、この事象は、ハイブリッドリガンドが、両方のハイブリッドタンパク質の標的部位に結合する場合のみ生じる。レポーター遺伝子を発現するこれらの細胞を選択し、そして未知の低分子または未知のリガンドを同定する。この方法は、ＳＴＥＡＰ−１を活性化または阻害する、調節因子を同定する手段を提供する。
【０１７６】
本発明の実施形態は、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列と相互作用する分子についてスクリーニングする方法を含み、この方法は、分子集団とＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列とを接触させる工程、上記分子集団と上記ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列とを、相互作用を容易にする条件下で相互作用させる工程、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列と相互作用する分子の存在を決定する工程、次いで、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列と相互作用しない分子を、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸と相互作用する分子から分離する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法は、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列と相互作用する分子を精製する工程、特徴付けする工程および同定する工程をさらに包含する。この同定された分子は、ＳＴＥＡＰ−１によって実施される機能を調節するために使用され得る。好ましい実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１アミノ酸配列は、ペプチドライブラリと接触される。
【０１７７】
（Ｘ．治療方法および組成物）
限定されたセットの組織において正常に発現されるが、前立腺癌および他の癌においても発現されるタンパク質のようなＳＴＥＡＰ−１の同定により、多数の治療アプローチをこのような癌の処置に広げる。本明細書において企図されるように、ＳＴＥＡＰ−１は、腫瘍促進遺伝子を活性化すること、または腫瘍形成をブロックする遺伝子を抑制することに関与する転写因子として機能する。
【０１７８】
従って、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の活性を阻害する治療アプローチは、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を患った患者に有用である。このような治療アプローチは、一般に、２つのクラスに分類される。一つのクラスは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質とその結合パートナーまたは他のタンパク質との結合または会合を阻害するための種々の方法を含む。別のクラスは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の翻訳またはＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための種々の方法を含む。
【０１７９】
（Ｘ．Ａ．抗癌ワクチン）
本発明は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質またはＳＴＥＡＰ−１関連核酸を含む、癌ワクチンを提供する。ＳＴＥＡＰ−１の発現に関して、癌ワクチンは、非標的組織において最小の効果または効果なしで、ＳＴＥＡＰ−１発現癌を予防および／または処置する。抗癌治療として、体液性免疫応答および／または細胞媒介免疫応答を生じるワクチンにおける腫瘍抗原の使用は、当該分野で周知であり、ヒトＰＳＭＡおよびげっ歯ＰＡＰ免疫原を使用して前立腺癌において利用されている（Ｈｏｄｇｅら，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２３１−２３７；Ｆｏｎｇら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−３１１７）。
【０１８０】
このような方法は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質、またはＳＴＥＡＰ−１コード核酸分子およびＳＴＥＡＰ−１免疫原（これは、代表的に、多数の抗体またはＴ細胞エピトープを含む）を発現および提示し得る組換えベクターを利用することによって容易に実施され得る。当業者は、免疫反応性エピトープの送達のための広範な種々のワクチン系が当該分野で周知であることを理解する（例えば、Ｈｅｒｙｌｎら，Ａｎｎ Ｍｅｄ １９９９年２月，３１（１）：６６−７８；Ｍａｒｕｙａｍａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０００年６月，４９（３）：１２３−３２）。簡潔には、哺乳動物において、免疫応答（例えば、体液性免疫応答および／または細胞媒介免疫応答）を生じるこのような方法は、以下の工程を包含する：免疫反応性エピトープ（例えば、エピトープは、図３に示されるＳＴＥＡＰ−１タンパク質、またはそのアナログもしくはホモログ中に存在する）に哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、この哺乳動物に、エピトープに対して特異的な免疫応答を生じさせる（例えば、このエピトープを特異的に認識する抗体を生じさせる）工程。好ましい方法において、ＳＴＥＡＰ−１免疫原は、生物学的モチーフを含む（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩ、または図５、図６、図７、図８、および図９に示されるＳＴＥＡＰ−１由来のあるサイズ範囲のペプチドを参照のこと）。
【０１８１】
全ＳＴＥＡＰ−１タンパク質、免疫原性領域またはそれらのエピトープを、種々の手段によって合わせ、および送達し得る。このようなワクチン組成物としては、例えば、以下が挙げられる：リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１，１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）マイクロカプセル中にカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７−２９４，１９９１：Ａｌｏｎｓｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １２：２９９−３０６，１９９４；Ｊｏｎｅｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：６７５−６８１，１９９５を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれたペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３−８７５，１９９０；Ｈｕら，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３，１９９８を参照のこと）、多抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９−５４１３，１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９６：１７−３２，１９９６を参照のこと）、多価ペプチドとして処方されたペプチド、弾道送達系において使用するためのペプチド（代表的に、結晶化したペプチド）、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編，第３７９頁，１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３５，１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ３２０：５３７，１９８６；Ｋｉｎｅｙ，Ｍ．−Ｐ．ら，ＡＩＤＳ Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：７９０，１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８，１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７５：５３５，１９９０）、ウイルス起源または合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５，１９９６；Ｅｌｄｒｉｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３；Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．７：６４９，１９９５）、アジュバント（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９，１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：２９３，１９９３）、リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５，１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：１３１，１９９６）または裸のｃＤＮＡもしくは粒子吸収ｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５，１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１：９５７，１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．編，第４２３頁，１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３，１９９４およびＥｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６，１９９３）。毒素標的送達技術（レセプター媒介標的化（例えば、Ａｖａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のレセプター媒介標的化）としても公知）もまた、使用され得る。
【０１８２】
ＳＴＥＡＰ−１に関連する癌を有する患者において、本発明のワクチン組成物はまた、癌のために使用される他の処置（例えば、手術、化学療法、薬物治療、放射線治療など（ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなどのような免疫アジュバントと組み合わせた使用を含む））と合わせて使用され得る。
【０１８３】
（細胞ワクチン）
ＣＴＬエピトープは、対応するＨＬＡ対立遺伝子に結合するＳＴＥＡＰ−１タンパク質内のペプチドを同定するための特定のアルゴリズムを使用して決定され得る：（例えば表ＩＶ；ＥｐｉｍｅｒＴＭおよびＥｐｉｍａｔｒｉｘＴＭ，Ｂｒｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＵＲＬ ｂｒｏｗｎ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＴＢ−ＨＩＶ＿Ｌａｂ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ／ｅｐｉｍａｔｒｉｘ．ｈｔｍｌ）；およびＢＩＭＡＳ（ＵＲＬ ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／；ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ ＵＲＬ ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｉｍ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／））。好ましい実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１免疫原は、当該分野で周知の技術を使用して同定された１種以上のアミノ酸配列を含み、これらは、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩに示される配列、またはＨＬＡクラスＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ａ）、表ＩＶ（Ｄ）、または表ＩＶ（Ｅ））によって特定された８個、９個、１０個もしくは１１個のアミノ酸のペプチド、および／またはＨＬＡクラスＩＩモチーフ／スーパーモチーフ（例えば、表ＩＶ（Ｂ）、または表ＩＶ（Ｃ））を含む、少なくとも９個のアミノ酸のペプチドである。当該分野で理解されているように、ＨＬＡクラスＩ結合溝は、本質的に、閉鎖的に終結され、その結果、特定のサイズ領域のみのペプチドが、溝に適合し、かつ、結合され得、一般に、ＨＬＡクラスＩエピトープが、８、９、１０、または１１個のアミノ酸長である。対照的に、ＨＬＡクラスＩＩ結合溝は、本質的に、開放的に終結され、従って、約９個以上のアミノ酸のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって結合され得る。ＨＬＡクラスＩとＨＬＡクラスＩＩとの間の結合溝の差異に起因して、ＨＬＡクラスＩモチーフは、長さ特異的である。すなわち、クラスＩモチーフの２つの位置は、このペプチドのアミノからカルボキシル方向の第２アミノ酸である。クラスＩＩモチーフのアミノ酸位置は、互いに対してのみ相関し、全体のペプチドに対して相関していない。すなわち、さらなるアミノ酸は、モチーフ保有配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に付着され得る。ＨＬＡクラスＩＩエピトープは、しばしば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長、または２５アミノ酸長よりも長い。
【０１８４】
（抗体ベースのワクチン）
哺乳動物において免疫応答を発生するための広範な種々の方法は、（例えば、ハイブリドーマの発生における第１工程として）当該分野で公知である。哺乳動物における免疫応答を発生させる方法は、タンパク質（例えば、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質）上の免疫原性エピトープに哺乳動物の免疫系を曝露し、その結果、免疫応答を発生させる工程を包含する。代表的な実施形態は、十分な量の少なくとも１つのＳＴＥＡＰ−１Ｂ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはそれらのアナログを宿主と接触させ；そして少なくとも１回の周期的な間隔の後、ＳＴＥＡＰ−１Ｂ細胞もしくは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープまたはそれらのアナログを宿主と再び接触させることによって、宿主において、ＳＴＥＡＰ−１に対する免疫応答を発生させるための方法からなる。特定の実施形態は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質または人工多エピトープペプチドに対する免疫応答を発生させる方法からなり、この方法は、ＳＴＥＡＰ−１免疫原（例えば、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質またはそのペプチドフラグメント、ＳＴＥＡＰ−１融合タンパク質またはアナログなど）を、ヒトまたは別の哺乳動物に対してワクチン調製物として投与する工程を包含する。代表的に、このようなワクチン調製物は、さらに、適切なアジュバント（例えば、米国特許第６，１４６，６３５号）またはＰＡＤＲＥＴＭペプチドのような汎用ヘルパーエピトープ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ １６４（３）；１６４（３）：１６２５−１６３３；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９４ １（９）：７５１−７６１およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９９８ １８（２）：７９−９２を参照のこと）。代替方法は、ＳＴＥＡＰ−１免疫原をコードするＤＮＡ配列、ＤＮＡ配列の発現を制御する調製配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を、個々の身体の筋肉または皮膚にインビボで投与することによって、ＳＴＥＡＰ−１免疫原に対して固体におけるの免疫応答を発生させる工程を包含し、ここで、このＤＮＡ分子は、細胞によって取り込まれ、ＤＮＡ分子は、この細胞において発現され、そして免疫応答を、免疫原に対して発生する（例えば、米国特許第５，９６２，４２８号を参照のこと）。必要に応じて、遺伝子ワクチン促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）（例えば、アニオン性脂質；サポニン；レクチン；エストロゲン化合物；ヒドロキシル化低級アルキル；ジメチルスルホキシド；および尿素）がまた、投与される。さらに、ＳＴＥＡＰ−１を模倣する抗イディオタイプ抗体が、標的抗原に対する応答を発生させるために投与され得る。
【０１８５】
（核酸ワクチン）
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡは、患者に投与され得る。遺伝子免疫方法は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌細胞に対する、予防的または治療的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答を発生させるために利用され得る。ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質／免疫原をコードするＤＮＡを含む構成物および適切な調節配列は、個体の筋肉または皮膚に直接注射され得、その結果、筋肉または皮膚の細胞は、この構成物を取り込み、そしてコードされたＳＴＥＡＰ−１タンパク質／免疫原を発現する。あるいは、ワクチンは、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を含む。ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質免疫原の発現は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を保有する細胞に対する、予防的または治療的な体液性免疫および細胞性免疫の発生を生じる。当該分野で公知の、種々の予防的または治療的な遺伝子免疫技術が、使用され得る（総説については、インターネットアドレスｇｅｎｗｅｂ．ｃｏｍで公開されている情報および参考文献を参照のこと）。核酸ベース送達は、例えば、Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５（１９９０）および米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；ＷＯ ９８／０４７２０に記載されている。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「裸のＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介送達（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）を含む。
【０１８６】
治療的または予防的な免疫の目的のために、本発明のタンパク質は、ウイルスベクターまたは細菌ベクターを介して発現され得る。本発明の実施において使用され得る種々のウイルス遺伝子送達系としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、およびシンドビスウイルス（例えば、Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５８−６６３；Ｔｓａｎｇら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８７：９８２−９９０（１９９５）を参照のこと）。非ウイルス送達系もまた、抗腫瘍応答を誘導するために患者に、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質をコードする裸のＤＮＡを（例えば筋内または皮内で）導入することにより利用され得る。
【０１８７】
ワクチンウイルスは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとして使用される。宿主への導入の際に、組換えワクチンウイルスは、タンパク質免疫原性ペプチドを発現し、そしてこれによって、宿主免疫応答を惹起する。免疫プロトコルにおいて有用なワクチンベクターおよび方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ ３５１：４５６−４６０（１９９１）に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫のための有用な、広範な種々の他のベクター（例えば、アデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉベクター、無毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書の記載から当業者に明らかである。
【０１８８】
従って、遺伝子送達系は、ＳＴＥＡＰ−１関連核酸分子を送達するために使用される。一つの実施形態において、全長ヒトＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡを使用する。別の実施形態において、特定の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および／または抗体エピトープをコードするＳＴＥＡＰ−１核酸分子を使用する。
【０１８９】
（エキソビボワクチン）
種々のエキソビボストラテジーを利用して、免疫応答を発生させ得る。一つのアプローチは、患者の免疫系に対してＳＴＥＡＰ−１抗原を提示する樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用に関する。従って、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７−同時刺激、ならびにＩＬ−１２を発現する樹状細胞は、高度に特異的な抗原提示細胞である。前立腺癌において、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のペプチドを用いて適用される自己樹状細胞が、前立腺癌患者の免疫系を刺激するために、フェーズＩ臨床試験において使用される（Ｔｊｏａら，１９９６，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２８：６５−６９；Ｍｕｒｐｈｙら，１９９６，Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２９：３７１−３８０）。従って、樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の状況において、ＳＴＥＡＰ−１ペプチドをＴ細胞に提示するために使用され得る。一つの実施形態において、自己樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し得るＳＴＥＡＰ−１ペプチドでパルスされる。別の実施形態において、樹状細胞は、完全ＳＴＥＡＰ−１タンパク質でパルスされる。なお別の実施形態は、当該分野で公知の種々の実行ベクターを使用する樹状細胞中で、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の過剰発現を操作することに関する（Ａｒｔｈｕｒら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１７−２５）、レトロウイルス（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３７６３−３７７０）、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＤＮＡトランスフェクション（Ｒｉｂａｓら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２８６５−２８６９）、または腫瘍誘導ＲＮＡトランスフェクション（Ａｓｈｌｅｙら，１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１７７−１１８２）。ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞はまた、免疫調節因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するように操作され得る、そして免疫剤として使用され得る。
【０１９０】
（Ｘ．Ｂ．抗体ベースの治療のための標的としてのＳＴＥＡＰ−１）
ＳＴＥＡＰ−１は、抗体ベースの治療ストラテジーのための魅力的な標的である。多数の抗体ストラテジーは、細胞外分子と細胞内分子との両方を標的するために、当該分野で公知であり（例えば、相補体およびＡＤＣＣ媒介の殺傷および身体内での使用を参照のこと）。ＳＴＥＡＰ−１は、対応する正常な細胞に対応する種々の系統の癌細胞によって発現されるので、免疫活性組成物を非標的器官および組織に結合することによって生じる、毒性効果、非特異的効果および／または非標的効果なしで、優れた感受性を示す、ＳＴＥＡＰ−１免疫活性組成物の全身投与を調製する。ＳＴＥＡＰ−１のドメインと特異的に反応する抗体は、トキシンまたは治療剤と組み合わせてか、または細胞増殖または機能を阻害し得る裸の抗体としてのいずれかで、全身的に癌を発生するＳＴＥＡＰ−１を処置するために有用である。
【０１９１】
ＳＴＥＡＰ−１抗体は、抗体がＳＴＥＡＰ−１に結合し、そして機能（例えば、結合パートナーとの相互作用）を調節し、そして結果として腫瘍細胞の破壊を媒介し、そして／または腫瘍細胞の増殖を阻害するように、患者に導入され得る。このような抗体が治療効果を発揮する機構としては、補体媒介性細胞溶解、抗体依存性細胞性細胞傷害、ＳＴＥＡＰ−１の生理学的機能を調節すること、リガンド結合またはシグナル伝達経路を阻害すること、腫瘍細胞分化を調節すること、腫瘍脈管形成因子プロフィールを変化させること、および／またはアポトーシスを包含し得る。
【０１９２】
当業者は、抗体が、免疫原性分子（例えば、図２または図３に示されるＳＴＥＡＰ−１配列の免疫原性領域）を特異的に標的および結合するために使用され得ることを理解する。さらに、当業者は、抗体を細胞傷害性薬剤に複合物化することは慣用的であることを理解する（例えば、Ｓｌｅｖｅｒｓら，Ｂｌｏｏｄ ９３：１１ ３６７８−３６８４（１９９９年６月１日）を参照のこと）。細胞傷害性薬剤および／または治療剤は、例えば、この細胞（例えば、ＳＴＥＡＰ−１）によって発現される分子に対して特異的な抗体にそれらの試薬を複合物化させることによって、細胞に直接送達され、この細胞傷害性薬剤は、それらの細胞上において公知の生物学的効果（例えば、細胞傷害性）を発揮する。
【０１９３】
抗体細胞傷害性薬剤を使用するための多種多様の組成物および方法が細胞を殺傷するために複合物化することは、当該分野で公知である。癌の状況において、代表的な方法は、腫瘍を有する哺乳動物に生物学的に有効な量の複合物を投与する工程を包含し、この複合物は、発現されたか、結合に接近可能か、または細胞表面上に局在化された、マーカー（例えば、ＳＴＥＡＰ−１）に結合する標的薬剤（例えば、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体）に連結される、選択された細胞傷害性薬剤および／または治療剤を含む。代表的な実施形態は、細胞傷害性薬剤および／または治療剤を細胞発現ＳＴＥＡＰ−１に送達する方法であり、この方法は、ＳＴＥＡＰ−１エピトープに免疫特異的に結合する抗体に細胞傷害性薬剤を複合物化させる工程、および抗体薬剤複合体に細胞を曝露する工程を包含する。別の例示的な実施形態は、転移癌を患ったと疑われる個体を処置する方法であり、この方法は、細胞傷害性薬剤および／または治療剤に複合物化された、治療有効量の抗体を含む薬学的組成物を前記個体に非経口的に投与する工程を包含する。
【０１９４】
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用する癌免疫治療は、他の型の癌の処置に首尾良く使用される種々のアプローチに従ってなされ、この癌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結腸癌（Ａｒｌｅｎら、１９９８、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１３３〜１３８）、多発性骨髄腫（Ｏｚａｋｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：３１７９〜３１８６；Ｔｓｕｎｅｎａｒｉら、１９９７、Ｂｌｏｏｄ ９０：２４３７〜２４４４）、胃癌（Ｋａｓｐｒｚｙｋら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：２７７１〜２７７６）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｆｕｎａｋｏｓｈｉら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．Ｅｍｐｈａｓｉｓ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：９３〜１０１）、白血病（Ｚｈｏｎｇら、１９９６、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２０：５８１〜５８９）、結腸直腸癌（Ｍｏｕｎら、１９９４、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１６０〜６１６６；Ｖｅｌｄｅｒｓら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：４３９８〜４４０３）、および乳癌（Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１１７〜１２７）。いくつかの治療アプローチは、毒素および放射線同位体への裸の抗体の結合（例えば、抗ＣＤ２０抗体へのＹ９１またはＩ１３１の結合（例えば、ＺｅｖａｌｉｎＴＭ、ＩＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．、またはＢｅｘｘａｒＴＭ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含むが、一方他のアプローチは、抗体と他の治療剤（例えば、ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ（トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）とパクリタキセル（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．））との同時投与を含む。これらの抗体は、治療剤に対して複合物化され得る。前立腺癌の処置のために、例えば、ＳＴＥＡＰ−１抗体が、照射、化学療法またはホルモン切除と組み合わせて、投与され得る。また、抗体は、カリヘアミシン（例えば、ＭｙｌｏｔａｒｇＴＭ，Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＮＪ，抗腫瘍抗菌性カリヘアミシンに複合物化された組換えヒト化ＩｇＧ４κ抗体）またはマンタシノイド（例えば、タキサンベース腫瘍活性化プロドラック、ＴＡＰ、プラットホーム、ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ、また米国特許第５，４１６，０６４号を参照のこと）のような毒素に対して複合物化され得る。
【０１９５】
ＳＴＥＡＰ−１抗体療法は、癌の全てのステージに対して有用であるが、抗体療法は、進行癌または転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体療法を用いた処置は、以前に１つ以上の化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメンまたは放射線レジメンと組み合わせられる。さらに、抗体療法は、特に、非常に十分にはその化学療法薬剤の毒性を許容しない患者について、減少した投薬量の併用化学療法の使用を可能にし得る。Ｆａｎら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４６３７−４６４２，１９９３）、Ｐｒｅｗｅｔｔら（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｏｎｃｏ．９：２１７−２２４，１９９６）、およびＨａｎｃｏｃｋら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４５７５−４５８０，１９９１）は、化学療法薬剤と組み合わせた、種々の抗体の使用を記載する。
【０１９６】
ＳＴＥＡＰ−１抗体療法は、癌の全てのステージに対して有用であるが、抗体療法は、進行癌または転移癌において特に適切であり得る。本発明の抗体療法を用いた処置は、以前に１つ以上の化学療法を受けている患者に示される。あるいは、本発明の抗体療法は、化学療法処置を受けていない患者のために、化学療法レジメンまたは放射線レジメンと組み合わせられる。さらに、抗体療法は、特に、非常に十分にはその化学療法薬剤の毒性を許容しない患者について、減少した投薬量の併用化学療法の使用を可能にし得る。
【０１９７】
癌患者は、好ましくは、腫瘍組織の免疫組織化学的評価、定量的ＳＴＥＡＰ−１画像化、またはＳＴＥＡＰ−１発現の存在および程度を確かに示し得る他の技術を使用して、ＳＴＥＡＰ−１発現の存在およびレベルについて評価し得る。腫瘍生検または外科的生検の免疫組織化学分析が、この目的にとって好ましい。腫瘍組織の免疫組織化学的分析のための方法は、当該分野で周知である。
【０１９８】
前立腺癌および他の癌を処置する抗ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体としては、その腫瘍に対する強力な免疫応答を示し得る抗体、または直接細胞傷害性であり得る抗体が挙げられる。これに関して、抗ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、補体媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のいずれかの機構によって、腫瘍細胞溶解を惹起し得、これらの機構の両方が、補体タンパク質上のエフェクター細胞Ｆｃレセプター部位との相互作用のために、その免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。さらに、腫瘍増殖に対する直接の生物学的効果を発揮する抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂが、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を処置するのに有用である。直接的に細胞傷害性ｍＡｂが作用する機構としては、細胞増殖の阻害、細胞分化の調節、腫瘍脈管形成因子プロフィールの調節、およびアポトーシスの誘導が、挙げられる。特定の抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂが抗腫瘍効果を発揮する機構は、当該分野で一般的に知られているように、ＡＤＣＣ、ＡＤＭＭＣ、補体媒介性細胞溶解などの細胞死を評価する、任意の数のインビトロアッセイを使用して、評価され得る。
【０１９９】
何人かの患者において、マウスまたは他の非ヒトモノクローナル抗体の使用、あるいはヒト／マウスキメラｍＡｂの使用が、非ヒト抗体に対する中程度から強力な免疫応答を誘導し得る。これは、循環からの抗体のクリアランスおよび減少した効力をもたらす。最も深刻な場合において、このような免疫応答は、潜在的に腎不全を引き起こし得る、免疫複合体の広範な形成をもたらし得る。従って、本発明の治療法の実施にて使用される好ましいモノクローナル抗体は、高い親和性で標的ＳＴＥＡＰ−１抗原に特異的に結合するが、患者において低い抗原性を示すかまたは全く抗原性を示さない、完全にヒトであるかまたはヒト化されているかのいずれかである抗体である。
【０２００】
本発明の治療法は、単一の抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂの投与、ならびに異なるｍＡｂの組み合わせまたはカクテルの投与を企図する。このようなｍＡｂカクテルは、それらが、異なるエピトープを標的とするｍＡｂ含むか、異なるエフェクター機構を使用するか、または免疫エフェクター機能性に依存するｍＡｂと直接細胞傷害性ｍＡｂを組み合わせるのと同じ程度だけ、特定の利点を有し得る。組み合わせたこのようなｍＡｂは、相乗的治療効果を示し得る。さらに、抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂの投与は、種々の化学療法薬剤、アンドロゲン遮断薬、免疫調節因子（例えば、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ）、手術または放射線を含むがこれらに限定されない、他の治療剤と同時に投与され得る。抗ＳＴＥＡＰ−１ｍＡｂは、その「裸（ｎａｋｅｄ）」の形態または非結合形態で投与され得るし、またはそれらに結合した治療剤を有し得る。
【０２０１】
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体処方物は、腫瘍細胞に抗体を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。投与の経路としては、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路などが挙げられるが、これらに限定されない。処置は一般的に、代表的に、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、受容可能な投薬経路を介する、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体調製物の組換えし投与を含む。一般に、１週間に１０〜１０００ｍｇ ｍＡｂの範囲の用量が、効果的であり得かつ十分に許容され得る。
【０２０２】
転移性乳癌の処置においてＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ ｍＡｂを用いる臨床実験に基づいて、抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂ調製物の約４ｍｇ／ｋｇ患者体重（ＩＶ）の初回負荷用量に引き続いて、約２ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ）の毎週の用量が、受容可能な投薬レジメンを示す。好ましくは、この初回負荷用量が、９０分以上の注入として投与される。その初回用量が十分に許容された場合、周期的維持用量が、３０分以上の注入として投与される。当業者が理解するように、種々の因子が、特定の場合における理想的な用量レジメンに影響し得る。このような因子としては、例えば、使用されるＡｂまたはｍＡｂの結合親和性および半減期、患者におけるＳＴＥＡＰ−１発現の程度、循環する放出された（ｓｈｅｄ）ＳＴＥＡＰ−１抗原の程度、所望される安定状態の抗体濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法薬剤または他の因子の影響ならびに特定の患者の健康状態が、挙げられる。
【０２０３】
必要に応じて、患者は、最も有効な投与レジメンなどの決定を補助するために、所定のサンプル中のＳＴＥＡＰ−１のレベル（例えば、循環するＳＴＥＡＰ−１抗原および／またはＳＴＥＡＰ−１発現細胞のレベル）について評価されるべきである。このような評価はまた、治療を通じて目的のものをモニタリングするために使用され、そして他のパラメーター（例えば、膀胱癌治療における尿細胞学および／またはＩｍｍｕｎｏＣｙｔレベル、あるいは、類推されるところによれば、前立腺癌治療における血清ＰＳＡレベル）を評価することと組合せて治療的成功を評価するために有用である。
【０２０４】
抗イディオタイプ抗ＳＴＥＡＰ−１抗体はまた、抗癌療法において、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を発現する細胞に対する免疫応答を惹起するためのワクチンとして使用され得る。詳細には、抗イディオタイプ抗体の生成は、当該分野で周知であり；この方法論は、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質上のエピトープを模倣する抗イディオタイプ抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を生成するように容易に適合され得る（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：３３〜４０；Ｆｏｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：３３４〜３４２；Ｈｅｒｌｙｎら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４３：６５〜７６を参照のこと）。このような抗イディオタイプ抗体は、癌ワクチンストラテジーにおいて使用され得る。
【０２０５】
（Ｘ．Ｃ． 細胞免疫応答についての標的としてのＳＴＥＡＰ−１）
本明細書に記載される、免疫原的に有効量の１つ以上のＨＬＡ結合ペプチドを含むワクチンおよびこのワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。さらに、本発明に従うワクチンは、１つ以上の特許請求されるペプチドの組成物を含む。ペプチドは、ワクチンにおいて個々に存在し得る。あるいは、ペプチドは、同じペプチドの複数コピーを含むホモポリマーとして、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、増加した免疫学的反応の利点を有し、そして異なるペプチドエピトープがポリマーを構成するために使用される場合、免疫応答を標的化する病原性生物または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するというさらなる能力を有する。この組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、または例えば、組換えもしくは化学合成によって調製され得る。
【０２０６】
本発明のワクチンとともに使用され得るキャリアは、当業者に周知であり、そして例えば、サイログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。ワクチンは、生理学的に許容可能（すなわち、受容可能）な希釈剤（例えば、水、または生理食塩水、好ましくは、リン酸緩化衝生理食塩水）を含み得る。ワクチンはまた、代表的に、アジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中で開示されるように、ＣＴＬ応答は、本発明のペプチドを脂質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））に複合物化することによって、初回刺激され得る。さらに、アジュバント（例えば、合成シトシン−ホスホロチオール化グアニン含有（ＣｐＧ）オリゴヌクレオチド）は、ＣＴＬ応答を１０〜１００倍増加することが見出された（例えば、ＤａｖｉｌａおよびＣｅｌｉｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５３９〜５４７（２０００）を参照のこと）。
【０２０７】
注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸内、髄腔内、または他の適切な経路による、本発明に従うペプチド組成物での免疫に際して、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な、大量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを産生することによってワクチンに応答する。結果として、宿主は、ＳＴＥＡＰ−１抗原を発現するかまたは過剰発現する細胞の後期発生に少なくとも部分的に免疫されるか、あるいは抗原が腫瘍関連であった場合、少なくともいくつかの治療的利益を導く。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、クラスＩペプチド成分を、標的抗原に対する中和抗体および／またはヘルパーＴ細胞応答を誘導するかまたは促進する成分と組み合わせることが望ましくあり得る。このような組成物の好ましい実施形態は、本発明に従うクラスＩエピトープおよびクラスＩＩエピトープを含む。このような組成物の代替の実施形態は、交差反応性ＨＴＬエピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）分子（例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載される））とともに、本発明に従うクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む。
【０２０９】
本発明のワクチンはまた、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））を、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして含み得る。樹状細胞を動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）し、そして収集し、これによって、樹状細胞の負荷をインビトロで生じさせた後に、ワクチン組成物が、インビトロで作製され得る。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明に従うミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、またはペプチドでパルスされる。次いで、樹状細胞は、インビボで免疫応答を惹起するために患者に投与され得る。ワクチン組成物（ＤＮＡベースまたはペプチドベースのいずれか）はまた、樹状細胞動員とともにインビボで投与され得、これによって、樹状細胞の負荷がインビボで生じる。
【０２１０】
好ましくは、以下の原理が、ワクチンにおける使用のためにポリエピトープ組成物中での封入のために、あるいはワクチンに含まれるべき、そして／または核酸（例えば、ミニ遺伝子）によってコードされるべき別々のエピトープを選択するためにエピトープのアレイを選択する場合に利用される。以下の原理のそれぞれが選択を行うためにバランスをとられることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれるマルチエピトープは、エピトープが由来するネイティブ抗原において連続した配列であり得る（しかし、必要ではない）。
【０２１１】
１．）投与のとき、腫瘍クリアランスと相関して観測された免疫応答を模倣するエピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩについて、これは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来する３〜４エピトープを含む。ＨＬＡクラスＩＩについて、類似の原理が使用される；再び、３〜４エピトープは、少なくとも１つのＴＡＡから選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１４４７〜１４５０を参照のこと）。１つのＴＡＡからのエピトープは、１つ以上のさらなるＴＡＡからのエピトープと組み合わせて使用され得、頻繁に発現されるＴＡＡの種々の発現パターンを有する腫瘍を標的化するワクチンを産生する。
【０２１２】
２．）免疫原性と関連することが確証された必須の結合親和性を有するエピトープが選択される：ＨＬＡクラスＩについて、５００ｎＭ以下（しばしば、２００ｎＭ以下）のＩＣ５０；およびクラスＩＩについて、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０。
【０２１３】
３．）十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団適用範囲を与えるように選択される。例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。モンテカルロ解析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団適用範囲の幅または冗長性を評価し得る。
【０２１４】
４．）癌関連抗原由来のエピトープが選択される場合、アナログを選択することがしばしば有用である。なぜなら、患者は、ネイティブのエピトープに対して耐性を発生し得るからである。
【０２１５】
５．）「ネスティッドエピトープ（ｎｅｓｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ）」と呼ばれるエピトープが、特に関連する。ネスティッドエピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列で重なる場合、生じる。ネスティッドペプチド配列は、Ｂ細胞エピトープ、ＨＬＡクラスＩエピトープおよび／またはＨＬＡクラスＩＩエピトープを含み得る。ネスティッドエピトープを提供する場合、一般的な目的は、配列当たり最も多くの数のエピトープを提供することである。従って、１つの局面は、ペプチド中のアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシル末端エピトープのカルボキシル末端よりも長いペプチドを提供することを避けることである。マルチエピトープ配列（例えば、ネスティッドエピトープを含む配列）を提供する場合、病理学的なまたは他の有害な生物学的特性を有さないことを保証するために、配列をスクリーニングすることが一般的に重要である。
【０２１６】
６．）ポリエピトープタンパク質を作製する場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的は、目的のエピトープを含む最小のペプチドを作製することである。この原理は、ネスティッドエピトープを含むペプチドを選択する場合に使用される原理と同じでない場合、類似する。しかし、人工ポリエピトープペプチドを用いる場合、サイズ最小化の目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープ間に任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対してバランスがとられる。例えば、スペーサーアミノ酸残基は、接合エピトープ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）（免疫系によって認識され、標的抗原に存在せず、かつエピトープの人工並置によってのみ作製されるエピトープ）を避けるためにか、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによって、エピトープ提示を増強するために導入され得る。接合エピトープは、一般的に、避けられるべきである。なぜなら、レシピエントは、その非ネイティブなエピトープに対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合エピトープが特に関心が高い。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少されるかまたは抑制されるような強い（ｚｅａｌｏｕｓ）応答を導き得る。
【０２１７】
７．）同じ標的タンパク質の複数の改変体の配列が存在する場合、潜在的なペプチドエピトープはまた、それらの保存性に基づいて選択され得る。例えば、保存性についての基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体またはクラスＩＩ結合ペプチドの９マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定された割合で保存されることを規定し得る。
【０２１８】
（Ｘ．Ｃ．１． ミニ遺伝子ワクチン）
マルチエピトープの同時送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、本発明の特に有用な実施形態である。ミニ遺伝子中への封入のためのエピトープは、好ましくは、先の節に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の１つまたはマルチエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
【０２１９】
マルチエピトープミニ遺伝子の使用は、以下およびＩｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３９１５〜３９２５、１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２，１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２，１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８，１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４２６，１９９８に記載される。例えば、ＳＴＥＡＰ−１由来のスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープをコードするマルチエピトープＤＮＡプラスミド、ＳＴＥＡＰ−１由来のＰＡＤＲＥ（登録商標）ユニバーサルヘルパーＴ細胞エピトープまたは複数のＨＴＬエピトープ、（例えば、表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩを参照のこと）、および小胞体トランスロケーションシグナル配列が操作され得る。ワクチンはまた、他のＴＡＡ由来のエピトープを含み得る。
【０２２０】
マルチエピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対してＣＴＬ誘導応答の大きさを評価するためにトランスジェニックマウスで確認され得る。さらに、インビボのＤＮＡコードエピトープの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドをトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のＣＴＬ株のインビトロ応答と相関し得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、１．）ＣＴＬ応答を生成すること、および２．）誘導されたＣＴＬが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識することの両方に役立つことを示し得る。
【０２２１】
例えば、ヒト細胞における発現のために選択されたエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、エピトープのアミノ酸配列は、逆翻訳され得る。ヒトコドン使用頻度表は、各アミノ酸に対するコドン選択の指針のために使用され得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、直接隣接し得、その結果、翻訳された場合に、連続したポリペプチド配列が作製される。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、ミニ遺伝子設計に組み込まれ得る。ミニ遺伝子配列に逆翻訳され得、そして含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、抗体エピトープ、ユビキチン化シグナル配列、および／または小胞体標的化シグナル。さらに、ＣＴＬおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープに隣接する、合成（例えば、ポリ−アラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって改善され得る；エピトープを含むこれらのより大きなペプチドは、本発明の範囲内である。
【０２２２】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドを組み立てることによってＤＮＡに変換され得る。重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）は、周知技術を使用して、適切な条件下で、合成され得、リン酸化され得、精製され得、そしてアニールされ得る。オリゴヌクレオチドの末端は、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して結合され得る。次いで、この合成ミニ遺伝子（エピトープポリペプチドをコードする）は、所望の発現ベクターにクローン化され得る。
【０２２３】
当業者に周知の標準的な調節配列は、好ましくは、標的細胞における発現を確実にするためにベクターに含まれる。数個のベクターエレメントが、望ましい：ミニ遺伝子挿入のための下流クローニング部位を有するプロモーター；十分な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多くのプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）がこの目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列について、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【０２２４】
さらなるベクター改変は、ミニ遺伝子発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合において、イントロンは、効率的な遺伝子発現に必要とされ、そして１つ以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写領域に組み込まれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列を含ませることもまた、ミニ遺伝子発現を増加するために考慮され得る。
【０２２５】
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローン化される。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換され、そしてＤＮＡは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクターに含まれる全ての他のエレメントは、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンクおよび作業細胞バンクとして保存され得る。
【０２２６】
さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性を増強することが望ましい場合に、ミニ遺伝子コード配列の外側で、ベクターに含まれ得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第２タンパク質（免疫原性を増強または減少するために含まれる）の両方の産生を可能にするビシストロニック（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用され得る。同時発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、同時刺激分子、または、ＨＴＬ応答について、ｐａｎ−ＤＲ結合タンパク質（ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに結合され得、そして発現されるＣＴＬエピトープから別々に発現され得る；これは、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの方向付けを可能にする。必要とされる場合、これは、ＨＴＬエピトープにＨＬＡクラスＩＩ経路へのより効率的な進入を促進し得、それによって、ＨＴＬ誘導を改善する。ＨＴＬ誘導またはＣＴＬ誘導と対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有益であり得る。
【０２２８】
プラスミドＤＮＡの治療的な量は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉでの発酵、続く精製によって生成され得る。作業細胞バンクからのアリコートを使用して、増殖培地に播種し、そして周知技術に従ってシェーカーフラスコまたはバイオリアクターで飽和まで増殖される。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される固相アニオン交換樹脂のような標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要な場合、スーパーコイルＤＮＡは、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、開環状形態および線形形態から単離され得る。
【０２２９】
精製プラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して注射のために調製され得る。これらのうち最も簡単なものは、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥されたＤＮＡの再構成である。このアプローチ（「裸のＤＮＡ」として公知である）は、臨床試験における筋肉内（ＩＭ）投与のために現在使用される。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大化するために、精製プラスミドＤＮＡを処方するための代替方法が、望ましくあり得る。種々の方法が記載され、そして新規な技術が利用可能となり得る。カチオン性脂質、糖脂質、およびフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームもまた、処方物中で使用され得る（例えば、ＷＯ９３／２４６４０；Ｍａｎｎｉｎｏ ＆ Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ９１／０６３０９；およびＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３（１９８７）を参照のこと）。さらに、保護性の相互作用性非凝縮化合物（ＰＩＮＣ）として集合的に呼ばれるペプチドおよび化合物もまた、安定性、筋肉内分散性、あるいは特定の器官または細胞型への輸送のような変数に影響するように、精製プラスミドＤＮＡに複合化され得る。
【０２３０】
標的細胞感作は、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示についての機能性アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切な哺乳動物細胞株に導入される。使用されるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸」のＤＮＡのために使用され得るが、カチオン性脂質は、直接的なインビトロトランスフェクションを可能とする。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドは、蛍光細胞分離分析装置（ＦＡＣＳ）を使用して、トランスフェクトされた細胞の濃縮を可能にするために同時トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、クロム−５１（５１Ｃｒ）標識され、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ株に対する標的細胞として使用され；細胞溶解（５１Ｃｒ放出によって検出される）は、ミニ遺伝子コード化ＣＴＬエピトープの産生およびＨＬＡ提示の両方を示す。ＨＴＬエピトープの発現は、ＨＴＬ活性を評価するためのアッセイを使用して、類似の様式で評価され得る。
【０２３１】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能試験についての第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、ＤＮＡ産物を用いて免疫する。用量および投与経路は、処方物依存である（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてＩＭ、脂質複合化ＤＮＡについて腹腔内（ｉ．ｐ．））。免疫の２１日後、脾細胞を収集し、そして試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間、再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的技術を使用して、ペプチド負荷５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに対応するペプチドエピトープを負荷されたＨＬＡによって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ導入についてのＤＮＡワクチン機能を実証する。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、類似の方法で、トランスジェニックマウスにおいて確認される。
【０２３２】
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるように、弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与され得る。この技術を使用して、ＤＮＡのみから構成される粒子が投与される。さらなる代替の実施形態において、ＤＮＡは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
【０２３３】
ミニ遺伝子はまた、当該分野で周知の他の細菌送達系またはウイルス送達系を使用して送達され得る（例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物が、ワクシニアのようなウイルスベクターに組み込まれ得る）。
【０２３４】
（Ｘ．Ｃ．２． ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組み合わせ）
本発明のＣＴＬペプチドを含むワクチン組成物は、所望の性状（例えば、改善された血清半減期、広げられた集団適用範囲、または増強された免疫原性）を提供するために改変（例えば、アナログ化）され得る。
【０２３５】
例えば、ペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、ペプチドを、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを含む配列に連結することによって増強され得る。ＣＴＬペプチドは直接Ｔヘルパーペプチドに連結され得るが、しばしば、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体は、スペーサー分子によって連結される。スペーサーは、代表的に、比較的小さな中性の分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）（これは、生理学的条件下において、実質的に荷電されていない）から構成される。スペーサーは、代表的に、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、あるいは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペーサーが同じ残基から構成される必要はなく、従って、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、スペーサーは、通常、少なくとも１つまたは２つの残基、より通常には、３〜６個の残基、ときどき、１０以上の残基である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて、直接的またはスペーサーを介してのいずれかで、Ｔヘルパーペプチドに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。
【０２３６】
特定の実施形態において、Ｔヘルパーペプチドは、遺伝的に多様な集団の大部分に存在するＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多く、ほとんど、または全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。多くのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するこのようなアミノ酸の例は、破傷風トキソイドの８３０〜８４３位ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ（配列番号４４）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）（ＣＳ）タンパク質の３７８〜３９８位ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号４５）、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ １８ｋＤタンパク質の１１６〜１３１位ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ（配列番号４６）のような抗原由来の配列を含む。他の例としては、ＤＲ １−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを有するペプチドを含む。
【０２３７】
あるいは、天然に見出されないアミノ酸配列を使用して、緩いＨＬＡ拘束様式（ｌｏｏｓｅｌｙ ＨＬＡ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ）で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製することが可能である（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７７０７を参照のこと）。Ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープ（例えば、ＰＡＤＲＥＴＭ、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、大部分のＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子に最も優先的に結合するように設計される。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（配列番号４７）（ここで、「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニン、またはチロシンのいずれかであり、そしてａは、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）を有するｐａｎ−ＤＲ結合エピトープペプチドは、大部分のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、そしてそれらのＨＬＡ型に関わりなく、大部分の個体由来のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見出された。ｐａｎ−ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」天然アミノ酸を含み、そしてエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【０２３８】
ＨＴＬペプチドエピトープはまた、それらの生物学的特性を変更するために改変され得る。例えば、これらは、プロテアーゼに対するそれらの耐性を増加し、従って、それらの血清半減期を拡大するためにＤ−アミノ酸を含むように改変され得るか、あるいはこれらは、それらの生物学的活性を増加させるために、脂質、タンパク質、炭水化物などのような他の分子に結合され得る。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、１つ以上のパルミチン酸に複合物化され得る。
【０２３９】
（Ｘ．Ｃ．３．）ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライミング剤との組合せ
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、Ｂリンパ球またはＴリンパ球をプライミングする少なくとも１つの成分を含むことが望ましくあり得る。脂質は、ＣＴＬをインビボでプライミングし得る薬剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどのような１つ以上の連結残基を介して免疫原性ペプチドに連結され得る。次いで、脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子で直接的に投与され得るか、リポソームに組み込まれ得るか、またはアジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中で乳化され得るかのいずれかで投与され得る。好ましい実施形態において、特に有効な免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ基およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸（これは、免疫原性ペプチドのアミノ末端に連結（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して結合される）を含む。
【０２４０】
ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））は、適切なペプチドに共有結合される場合、ウイルス特異的ＣＴＬをプライミングするために使用され得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５６１，１９８９を参照のこと）。本発明のペプチドは、例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドは、標的抗原に対する免疫応答を特異的にプライミングするために個体に投与され得る。さらに、中和抗体の導入がまたＰ３ＣＳＳ結合エピトープを用いてプライミングされ得るので、２つのこのような組成物は、体液性応答および細胞媒介応答の両方をより効率的に惹起するように組み合わせられ得る。
【０２４１】
（Ｘ．Ｃ．４．）ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドでパルスされたＤＣを含むワクチン組成物
本発明に従うワクチン組成物の実施形態は、患者血液由来のＰＢＭＣ、またはそれら由来の単離されたＤＣに対する、エピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を含む。ＤＣの収集を容易にする薬物（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｍｏｎｓａｎｔｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用され得る。ＤＣをペプチドでパルスした後、そして患者に再注入する前に、未結合ペプチドを除去するためにＤＣを洗浄する。この実施形態において、ワクチンは、それらの表面に、ＨＬＡ分子を複合体化した、パルスされたペプチドエピトープを提示するペプチドパルス化ＤＣを含む。
【０２４２】
ＤＣは、ペプチドのカクテルを用いてエキソビボでパルスされ得、これらのうちのいくつかは、ＳＴＥＡＰ−１に対するＣＴＬ応答を刺激する。必要に応じて、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチド（例えば、天然または人工の緩い拘束性ＨＬＡクラスＩＩペプチド）は、ＣＴＬ応答を促進するために含められ得る。従って、本発明に従うワクチンは、ＳＴＥＡＰ−１を発現するかまたは過剰発現する癌を処置するために使用される。
【０２４３】
（Ｘ．Ｄ．）養子免疫療法
抗原性ＳＴＥＡＰ−１関連ペプチドは、エキソビボでＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答もまた惹起するために使用される。得られるＣＴＬ細胞またはＨＴＬ細胞は、他の従来の形式の治療に応答しないか、または本発明に従う治療ワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者の腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原に対するエキソビボＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、組織培養物中において、患者のまたは遺伝的に適合性のＣＴＬ前駆細胞またはＨＴＬ前駆細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）の供給源および適切な免疫原性ペプチドとともにインキュベートすることによって誘導される。適切なインキュベーション時間（代表的には、約７〜２８日）（ここで、前駆細胞が、活性化され、そして効果細胞に増殖する）後に、細胞は、患者に注入して戻され、ここで、これらは、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）か、または破壊を促進する（ＨＴＬ）。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
【０２４４】
（Ｘ．Ｅ．）治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、代表的に、ＳＴＥＡＰ−１を発現するかまたは過剰発現する癌を処置および／または予防するために使用される。治療適用において、ペプチド組成物および／または核酸組成物は、抗原に対して有効なＢ細胞応答、ＣＴＬ応答および／またはＨＴＬ応答を誘発し、そして症状および／または合併症を治癒するかあるいは少なくとも部分的に停止または遅延させるのに十分な量で患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効用量」として規定される。この使用のための有効量は、例えば、投与される特定の組成物、投与方法、処置される疾患の病期および重篤度、患者の体重および全身健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【０２４５】
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡは、一般的に、ＳＴＥＡＰ−１を発現する腫瘍をすでに有する個体に投与される。ペプチドまたはそれらをコードするＤＮＡは、個々に、または１つ以上のペプチド配列の融合物として投与され得る。患者は、適切なように、別々にまたは他の処置（例えば、外科手術）とともに、免疫原性ペプチドを用いて処置され得る。
【０２４６】
治療的使用のために、投与は、一般的に、ＳＴＥＡＰ−１関連癌の第１の診断において開始すべきである。これは、少なくとも症状が実質的に停止するまで、そしてその後の一定期間の間、用量をブーストすることによって続けられる。患者に送達されるワクチン組成物の実施形態（すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、またはＴＡＡ特異的ＣＴＬまたはパルスされた樹状細胞のような実施形態を含むが、これらに限定されない）は、疾患の病期または患者の健康状態に従って、変化し得る。例えば、ＳＴＥＡＰ−１を発現する腫瘍を有する患者において、ＳＴＥＡＰ−１特異的ＣＴＬを含むワクチンは、代替の実施形態よりも進行した疾患を有する患者において腫瘍細胞を殺す際に、より有効であり得る。
【０２４７】
細胞傷害性Ｔ細胞応答を効率的に刺激するのに十分な投与の様式によって送達されるペプチドエピトープの量を提供することが一般的に重要である；ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物はまた、本発明のこの実施形態に従って、与えられ得る。
【０２４８】
最初の治療的免疫化のための投薬量は、一般的に、下限値が約１μｇ、５μｇ、５０μｇ、５００μｇ、または１，０００μｇであり、かつ上限値が約１０，０００μｇ；２０，０００μｇ；３０，０００μｇ；または５０，０００μｇである単位用量範囲で存在する。ヒトのための投薬量値は、代表的に、７０ｋｇの患者当たり、約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。数週間〜数ヶ月にわたるブーストレジメンに従って、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のブースト投薬量のペプチドが、患者の血液から得られたＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって決定されるような患者の応答および状態に依存して投与され得る。投与は、少なくとも臨床的症状または実験室の試験によって、新生物形成が、排除されるかまたは減少することを示すまで、そしてその後、一定期間続けられるべきである。投薬量、投与の経路、および用量スケジュールは、当該分野に公知の方法論に従って調整される。
【０２４９】
特定の実施形態において、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態（すなわち、生命を脅かすかまたは潜在的に生命を脅かす状態）で使用される。このような場合、本発明の好ましい組成物では、外来性物質が最小量でありそしてペプチドが比較的非毒性の性質であることの結果として、これらの記載された投薬量と比較してかなり過剰のこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そして処置する医師によって望ましく感じられら得る。
【０２５０】
本発明のワクチン組成物はまた、純粋に予防薬剤として使用され得る。一般的に、初回の予防免疫のための投薬量は一般に、低い値が約１、５、５０、５００または１０００μｇでありかつ高い値が約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである単位投薬量範囲で存在する。ヒトのための投薬量の値は、代表的に、７０ｋｇの患者あたりで約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。これに続いて、初回のワクチン投与から約４週間後〜６ヵ月後の規定された間隔で、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のペプチドのブースト投薬量が投与される。ワクチンの免疫原性は、患者の血液サンプルから得られるＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって評価され得る。
【０２５１】
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与、経鼻投与、クモ膜下腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）投与、または局部的（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、クリームまたは局所的軟膏として）のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内、皮下的、皮内、または筋内）に投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解または懸濁された免疫原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。
【０２５２】
種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来からの周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または濾過滅菌され得る。得られた水溶液は、使用のためにその状態のままでパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得る（この凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌溶液と合わせられる）。
【０２５３】
この組成物は、必要に応じて、生理的条件に近づけるために、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、張度調整剤、湿潤剤、防腐薬など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど））を含み得る。
【０２５４】
薬学的処方物における本発明のペプチドの濃度は、広範に（すなわち、重量で、約０．１％未満から、通常は、約２％であるかもしくは少なくとも約２％から、２０％〜５０％ほど多くまで、またはそれより多くまで）変動し得、そして選択された特定の投与様式に従って、主に流体容量、粘度などにより選択される。
【０２５５】
組成物のヒト単位用量形態は、代表的に、ヒト単位用量の受容可能なキャリア（１つの実施形態では、水性キャリア）を含む薬学的組成物中に含まれ、そしてヒトへのこのような組成物の投与のために使用されることが当業者に公知（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，編者Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８５を参照のこと）の容量／量で投与される。例えば、初回免疫のためのペプチド用量は、７０ｋｇの患者について、約１〜約５０，０００μｇ、一般的には、１００〜５，０００μｇであり得る。例えば、核酸については、初回免疫は、裸の核酸の形態で発現ベクターを使用して実施され得、複数の部位に０．５〜５ｍｇの量でＩＭ（またはＳＣもしくはＩＤ）投与され得る。核酸（０．１〜１０００μｇ）もまた、遺伝子銃を使用して投与され得る。３〜４週間のインキュベーション期間後に、次いで、ブースター用量が投与される。ブースターは、５×１０７〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。
【０２５６】
抗体について、処置は一般に、静脈内注射（ＩＶ）のような受容可能な投与経路を介して、代表的には約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体調製物を反復投与することを包含する。一般的には、１週間あたり１０〜５００ｍｇ ｍＡｂの範囲の用量が有効であり、かつ十分に許容される。さらに、抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂ調製物を、ＩＶで約４ｍｇ／ｋｇ患者体重の初回負荷用量で与え、次いで毎週、ＩＶで約２ｍｇ／ｋｇの用量を与えることは、受容可能な投薬レジメンを表す。当業者に理解されるように、種々の要因が、特定の場合における理想的な用量に影響を及ぼし得る。このような要因としては、例えば、組成物の半減期、Ａｂの結合親和性、物質の免疫原性、患者におけるＳＴＥＡＰ−１の発現程度、循環しているシェッド（ｓｈｅｄ）ＳＴＥＡＰ−１抗原の程度、所望される定常状態の濃度レベル、処置の頻度、および本発明の処置方法と組み合わせて使用される化学療法剤または他の薬剤の影響、ならびに特定の患者の健康状態が挙げられる。限定されない好ましいヒト単位用量は、例えば５００μｇ〜１ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜１００ｍｇ、１００ｍｇ〜２００ｍｇ、２００ｍｇ〜３００ｍｇ、４００ｍｇ〜５００ｍｇ、５００ｍｇ〜６００ｍｇ、６００ｍｇ〜７００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ、８００ｍｇ〜９００ｍｇ、９００ｍｇ〜１ｇまたは１ｍｇ〜７００ｍｇである。ある実施形態において、用量は、２ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある（例えば、１ｍｇ／ｋｇ体重〜３ｍｇ／ｋｇ体重の週間用量で続ける）；０．５ｍｇ、１ｍｇ／ｋｇ体重、２ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、４ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、６ｍｇ／ｋｇ体重、７ｍｇ／ｋｇ体重、８ｍｇ／ｋｇ体重、９ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、週間用量によって２週間、３週間または４週間続ける）；０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、週間用量によって２週間、３週間または４週間続ける）；毎週２２５ｍｇｍ２体面積、２５０ｍｇｍ２体面積、２７５ｍｇｍ２体面積、３００ｍｇｍ２体面積、３２５ｍｇｍ２体面積、３５０ｍｇｍ２体面積、３７５ｍｇｍ２体面積、４００ｍｇｍ２体面積；毎週１ｍｇｍ２体面積〜６００ｍｇｍ２体面積；毎週２２５ｍｇｍ２体面積〜４００ｍｇｍ２体面積；これらの用量は２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１９週、１１週、１２週かそれ以上の週、週間用量で続けられ得る。
【０２５７】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチドのヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲または有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、ポリヌクレオチドの配列、ポリヌクレオチドの分子量、および投与経路を含む多数の要因に依存する。投薬量は一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で公知の種々のパラメーターに従って、医師または他の医療専門家により選択される。一般的には、約２０塩基のポリヌクレオチドについて、投薬量範囲は、例えば、約０．１、０．２５、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｍｇ／ｋｇのような独立して選択される下限から、その下限よりも大きな約６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００または１０，０００ｍｇ／ｋｇの独立して選択される上限までの中から選択され得る。例えば、用量は、以下のほぼいずれかであり得る：０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ、５００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５００〜５０００ｍｇ／ｋｇ、または５００〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ。一般的に、非経口的な投与経路は、疾患組織に対するより直接的なポリヌクレオチドの適用（増加する長さのポリヌクレオチドで行う場合）と比較して、より多い用量のポリヌクレオチドを必要とし得る。
【０２５８】
１つの実施形態では、Ｔ細胞のヒト単位投薬形態は、任意の治療的効果を与える適切な投薬量範囲または有効量を含む。当業者に理解されるように、治療的効果は、多数の要因に依存する。投薬量は一般的に、症状の重篤度、患者の病歴などのような、当該分野で公知の種々のパラメーターに従って、医師または他の医療専門家により選択される。用量は、約１０４細胞〜約１０６細胞、約１０６細胞〜約１０８細胞、約１０８細胞〜約１０１１細胞、または約１０８細胞〜約５×１０１０細胞であり得る。用量はまた、約１０６細胞／ｍ２〜約１０１０細胞／ｍ２、または約１０６細胞／ｍ２〜約１０８細胞／ｍ２であり得る。
【０２５９】
本発明のタンパク質（１つまたは複数）および／またはそのタンパク質（１つまたは複数）をコードする核酸はまた、リポソームを介して投与され得、それらはまた以下のために役立ち得る：１）リンパ系組織のような特定組織へのタンパク質（１つまたは複数）の標的化；２）疾患細胞に対する選択的な標的化；または、３）ペプチド組成物の半減期の増加。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫体（ｆｏａｍ）、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、層状層などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるペプチドは、単独でかあるいはリンパ系細胞に蔓延しているレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と組み合わせてかまたは他の治療用組成物もしくは免疫原性組成物と組み合わせて、リポソームの部分として組み込まれる。従って、本発明の所望のペプチドを充填しているかまたは施されているかのいずれかのリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向され得、次いで、このリンパ系細胞に、リポソームはペプチド組成物を送達する。本発明に従って使用するためのリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され、これは一般的に、中性リン脂質および負に荷電したリン脂質、ならびにステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は一般的に、例えば、リポソームのサイズ、酸不安定性、および血流中でのリポソームの安定性の考慮により導かれる。リポソームを調製するためには、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されているように、種々の方法が利用可能である。
【０２６０】
免疫系の細胞を標的化するために、リポソームに取り込まれるべきリガンドとしては、例えば、所望される免疫系細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、静脈内、局部的、局所的などによって、とりわけ投与様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の病期に従って変動する用量において投与され得る。
【０２６１】
固形組成物については、従来の非毒性の固形キャリアが使用され得、これには、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性の組成物は、任意の通常使用される賦形剤（例えば、先に列挙されたキャリアなど）と、一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチド）そしてより好ましくは、２５％〜７５％の濃度の活性成分とを組み込むことによって形成される。
【０２６２】
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドは好ましくは、界面活性剤および噴霧剤と共に細かく分割された形態で供給される。ペプチドの代表的なパーセンテージは、約０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは、約１％〜１０％である。当然ながら、界面活性剤は非毒性でなければならず、そして好ましくは、噴霧剤に可溶性でなければならない。このような薬剤の代表例は、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物との、約６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸（例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリック酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、およびオレイン酸）のエステルおよび部分エステルである。混合エステル（例えば、混合グリセリドまたは天然のグリセリド）が使用され得る。界面活性剤は、その組成物の約０．１重量％〜２０重量％、好ましくは、約０．２５〜５％を構成し得る。組成物の残りは通常、噴霧剤である。キャリアもまた、例えば、鼻腔内送達のためのレシチンの場合のように、所望の場合に含まれ得る。
【０２６３】
（ＸＩ．）ＳＴＥＡＰ−１の診断的実施形態および予後的実施形態
本明細書中で開示されるように、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド、ＳＴＥＡＰ−１反応性の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ＳＴＥＡＰ−１反応性のヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）および抗ポリペプチド抗体は、癌のような調節不全性の細胞増殖と関連した状態、特に、表Ｉに列挙された癌（例えば、その組織発現の特異的パターン、ならびに、例えば、「正常組織、および患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現分析」と表題を付けられた実施例に記載されているような特定の癌におけるその過剰発現の両方を参照のこと）を試験する周知の診断的アッセイ、予後的アッセイ、および治療的アッセイにおいて使用される。
【０２６４】
ＳＴＥＡＰ−１は、前立腺関連抗原であるＰＳＡに類似し得る。ＰＳＡは、前立腺癌の存在を同定およびモニターするために数年間にわたり医療従事者により使用されてきた原型マーカーである（例えば、Ｍｅｒｒｉｌｌら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（２）：５０３−５１２０（２０００）；Ｐｏｌａｓｃｉｋら，Ｊ．Ｕｒｏｌ．Ａｕｇ；１６２（２）：２９３−３０６（１９９９）およびＦｏｒｔｉｅｒら，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９１（１９）：１６３５−１６４０（１９９９）を参照のこと）。種々の他の診断マーカーもまた、同様の状況下で使用され、これらにはｐ５３およびＫ−ｒａｓが挙げられる（例えば、Ｔｕｌｃｈｉｎｓｋｙら，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １９９９ Ｊｕｌ ４（１）：９９−１０２およびＭｉｎｉｍｏｔｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ ２０００；２４（１）：１−１２を参照のこと）。従って、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドおよびＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドプローブおよび抗ＳＴＥＡＰ−１抗体）ならびにそれらの特性に関する本開示により、当業者は、例えば、癌に関連した状態を試験することに関する種々の診断アッセイにおいて使用された方法と類似した方法においてこれらの分子を利用することが可能となる。
【０２６５】
ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチド、ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド、ＳＴＥＡＰ−１と反応性のＴ細胞および抗体を利用する診断方法の代表的な実施形態は、例えば、ＰＳＡポリヌクレオチド、ＰＳＡポリペプチドならびにＰＳＡと反応性のＴ細胞および抗体を使用する十分に確立された診断アッセイ由来の方法と類似する。例えば、ＰＳＡの過剰発現または前立腺癌の転移をモニターする方法において、ＰＳＡ ｍＲＮＡの存在および／またはレベルを観察するために、まさしくＰＳＡポリヌクレオチドを、プローブ（例えば、ノーザン分析において（例えば、Ｓｈａｒｉｅｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３３（３）：５６７〜７４（１９９４）を参照のこと））およびプライマー（例えば、ＰＣＲ分析において（例えば、Ｏｋｅｇａｗａら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３（４）：１１８９〜１１９０（２０００）を参照のこと））として使用するように、本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺癌および他の癌の転移を検出するために、同じ様式で利用され得る。あるいは、まさしくＰＳＡポリペプチドを使用してＰＳＡに特異的な抗体を生成し、次いで、この抗体を、ＰＳＡタンパク質の過剰発現（例えば、Ｓｔｅｐｈａｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ５５（４）：５６０〜３（２０００）を参照のこと）または前立腺細胞の転移（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３〜７（１９９６）を参照のこと）をモニターする方法においてＰＳＡタンパク質の存在および／またはレベルを観察するために使用し得るように、本明細書中に記載されるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドは、ＳＴＥＡＰ−１の過剰発現またはこの遺伝子を発現する前立腺細胞および他の癌細胞の転移の検出する際に使用するための抗体を生成するために使用され得る。
【０２６６】
詳細には、転移は、元々の器官（例えば、肺または前立腺など）から身体の異なる領域（例えば、リンパ節）への癌細胞の移動を包含するので、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドおよび／またはＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドを発現する細胞の存在について生物学的サンプルを試験するアッセイが、転移の証拠を提供するために使用され得る。例えば、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞を通常含まない組織（リンパ節）由来の生物学的サンプルが、ＬＡＰＣ４およびＬＡＰＣ９（それぞれ、リンパ節および骨の転移から単離された異種移植片）に見られるＳＴＥＡＰ−１発現のような、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞を含むことが見出される場合、この発見は転移を示す。
【０２６７】
あるいは、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドおよび／またはＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドは、例えば、通常ＳＴＥＡＰ−１を発現しないかまたは異なるレベルでＳＴＥＡＰ−１を発現する生物学的サンプル中の細胞が、ＳＴＥＡＰ−１を発現するかまたはＳＴＥＡＰ−１の増加した発現を有することが見出された場合（例えば、表Ｉに列挙された癌および添付の図面に示される患者サンプルなどにおけるＳＴＥＡＰ−１の発現を参照のこと）に、癌の証拠を提供するために使用され得る。このようなアッセイにおいて、当業者は、（ＳＴＥＡＰ−１に加えて）第二の組織制限マーカー（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＣＡなど）の存在について生物学的サンプルを試験することによって、転移に関する補足的な証拠を生み出すことをさらに所望し得る（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）。
【０２６８】
まさしくＰＳＡポリヌクレオチドフラグメントおよびＰＳＡポリヌクレオチド改変体が、ＰＳＡをモニターする方法における使用のために当業者によって利用されるように、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドフラグメントおよびＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレチド改変体は、類似の様式で使用される。特に、ＰＳＡをモニターする方法において使用される代表的なＰＳＡポリヌクレオチドは、ＰＳＡ ｃＤＮＡ配列のフラグメントから構成されるプローブまたはプライマーである。これを例にとると、ＰＳＡポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅するために使用されるプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応において機能するように、ＰＳＡ配列全体よりも短い配列を含まなくてはならない。このようなＰＣＲ反応の状況において、当業者は一般に、目的のポリヌクレオチドの異なる部分を増幅するためにかまたは増幅反応を最適化するためにプライマーとして使用され得る、種々の異なるポリヌクレオチドフラグメントを作製する（例えば、Ｃａｅｔａｎｏ−Ａｎｏｌｌｅｓ，Ｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５（３）：４７２−４７６，４７８−４８０（１９９８）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：１２１−１５４（１９９８）を参照のこと）。このようなフラグメントの使用のさらなる例示が、「正常組織、および患者被験体標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現分析」と表題を付けられた実施例に提供され、ここで、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドフラグメントは、癌細胞におけるＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡの発現を示すためのプローブとして使用される。さらに、改変体ポリヌクレオチド配列は、代表的に、ＰＣＲ分析およびノーザン分析において、対応するｍＲＮＡについてのプライマーおよびプローブとして使用される（例えば、Ｓａｗａｉら，Ｆｅｔａｌ Ｄｉａｇｎ．Ｔｈｅｒ．１９９６ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１１（６）：４０７−１３およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｕｎｉｔ ２，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５を参照のこと）。ポリヌクレオチドフラグメントおよび改変体は、それらが、高ストリンジェンシー条件下で、標的ポリヌクレオチド配列（例えば、図２に示されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドまたはその改変体）に結合し得る状況下において有用である。
【０２６９】
さらに、抗体によって認識され得るエピトープを含むＰＳＡポリペプチドまたはそのエピトープに特異的に結合するＴ細胞が、ＰＳＡをモニターする方法において使用される。ＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドフラグメント、およびＳＴＥＡＰ−１ポリペプチドアナログまたは改変体もまた、類似の様式で使用され得る。ポリペプチドフラグメントまたはポリペプチド改変体を使用して抗体（例えば、抗ＰＳＡ抗体またはＴ細胞）を生成するこの実施は、開業医によって使用されている融合タンパク質のような広範な種々の系と共に当該分野の技術において代表的である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｕｎｉｔ １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９５を参照のこと）。この状況において、各エピトープ（単数または複数）は、抗体またはＴ細胞と反応性である構造体を提供するように機能する。代表的に、当業者は、目的のポリペプチドの異なる部分に特異的な免疫応答を生成するために使用され得る種々の異なるポリペプチドフラグメントを生成する（例えば、米国特許第５，８４０，５０１号および米国特許第５，９３９，５３３号を参照のこと）。例えば、本明細書中に考察されるＳＴＥＡＰ−１の生物学的モチーフまたは当該分野で利用可能なモチーフに基づいて当業者により容易に同定されるモチーフ保有部分配列の１つを含むポリペプチドを利用することが好適であり得る。ポリペプチドのフラグメント、改変体またはアナログは代表的に、これらが標的ポリペプチド配列（例えば、図３に示されるＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド）に特異的な抗体またはＴ細胞を生成し得るエピトープを含む限りにおいて、この状況で有用である。
【０２７０】
本明細書中に示されるように、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドおよびＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドプローブおよび抗ＳＴＥＡＰ−１抗体またはＴ細胞）は、表Ｉに列挙された癌のような癌を診断するにおいてそれらを有用なものとする特異的特性を示す。前立腺癌のような、本明細書中に記載の疾患状態の存在または発症を評価するために、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の存在を測定する診断アッセイは、ＰＳＡを用いて非常に首尾よく行われているように、予防的な測定またはさらなるモニタリングのための患者を同定するために使用される。さらに、これらの物質は、例えば、前立腺起源の転移の明確な診断がＰＳＡのみについての試験に基づいてなされ得ず（例えば、Ａｌａｎｅｎら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９２（３）：２３３−２３７（１９９６）を参照のこと）、そしてその結果、ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドおよびＳＴＥＡＰ−１ポリペプチド（ならびに、これらの分子の存在を同定するために使用されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドプローブおよび抗ＳＴＥＡＰ−１抗体）のような物質が、前立腺起源の転移を確認するために使用されることが必要である状況において、ＰＳＡに対して類似した特徴または補足的な特徴を有する分子についての当該分野での必要性を満たす。
【０２７１】
最後に、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示されるＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドは、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子がマッピングされる染色体領域（以下の「ＳＴＥＡＰ−１の染色体マッピング」と題された実施例を参照のこと）におけるオンコジーン関連染色体異常の同定におけるそれらの使用のような、多くの他の用途を有する。さらに、診断アッセイにおけるそれらの使用に加えて、本明細書中に開示されるＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質およびＳＴＥＡＰ−１関連ポリヌクレオチドは、起源未知の組織の法医学的分析におけるそれらの使用のような他の有用性を有する（例えば、Ｔａｋａｈａｍａ Ｋ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ １９９６ Ｊｕｎ ２８；８０（１−２）：６３−９を参照のこと）。
【０２７２】
さらに、本発明のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質またはＳＴＥＡＰ−１関連ポリヌクレオチドを使用して、ＳＴＥＡＰ−１の過剰発現により特徴付けられる病理学的状態を処置し得る。例えば、図２もしくは図３のアミノ酸配列もしくは核酸配列、またはいずれかのフラグメントを使用して、ＳＴＥＡＰ−１抗原に対する免疫応答を生成し得る。ＳＴＥＡＰ−１と反応する抗体または他の分子を使用して、この分子の機能を調節し得、それにより治療的利益を提供し得る。
【０２７３】
（ＸＩＩ．）ＳＴＥＡＰ−１タンパク質機能の阻害
本発明は、ＳＴＥＡＰ−１のその結合パートナーへの結合を阻害するためまたは他のタンパク質（単数または複数）とのその結合を阻害するための種々の方法および組成物、ならびに、ＳＴＥＡＰ−１の機能を阻害するための方法を含む。
【０２７４】
（ＸＩＩ．Ａ．）細胞内抗体を用いたＳＴＥＡＰ−１の阻害
１つのアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する単鎖抗体をコードする組換えベクターが、ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞へと遺伝子移入技術を介して導入される。それにより、そのコードされた単鎖抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は細胞内で発現され、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に結合し、そしてそれによりその機能を阻害する。このような細胞内単鎖抗体を操作するための方法は周知である。このような細胞内抗体（「内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」としても公知）は、その細胞内の特定の区画に特異的に標的化され、その処置の阻害活性が焦点をあわせられる箇所に対する制御を与える。この技術は、当該分野で首尾良く適用されている（概説として、ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＭａｒａｓｃｏ、１９９５、ＴＩＢＴＥＣＨ、第１３巻を参照のこと）。内部抗体は、他の豊富な細胞表面レセプターの発現を実質的に排除することが示されている（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：３１３７〜３１４１；Ｂｅｅｒｌｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９：２３９３１〜２３９３６；Ｄｅｓｈａｎｅら、１９９４、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１：３３２〜３３７を参照のこと）。
【０２７５】
単鎖抗体は、可撓性のリンカーポリペプチドにより連結された重鎖および軽鎖の可変ドメインを含み、そして単一のポリペプチドとして発現される。必要に応じて、単鎖抗体は、その軽鎖定常領域に連結された単鎖可変領域フラグメントとして発現される。周知の細胞内輸送シグナルが、内部抗体を所望の細胞内区画に対して正確に標的化するために、このような単鎖抗体をコードする組換えポリヌクレオチドベクター中に操作される。例えば、小胞体（ＥＲ）に標的化された内部抗体は、リーダーペプチドを組み込むように、そして必要に応じて、Ｃ末端ＥＲ保持シグナル（例えば、ＫＤＥＬアミノ酸モチーフ）を組み込むように、操作される。核において活性を発揮することが意図される内部抗体は、核局在化シグナルを含むように操作される。脂質部分が、形質膜の細胞質ゾル側に内部抗体をつなぐために、その内部抗体に連結される。内部抗体はまた、細胞質ゾルにおいて機能を発揮するように標的化され得る。例えば、細胞質ゾル内部抗体を使用して、細胞質ゾル内に因子を隔離し、それによりそれらの因子がその天然での細胞中の目的地に輸送されることを防ぐ。
【０２７６】
１つの実施形態では、内部抗体を使用して、核内のＳＴＥＡＰ−１を捕捉し、それにより核内でその活性を妨げる。核標的化シグナルが、所望の標的化を達成するために、このようなＳＴＥＡＰ−１内部抗体に操作される。このようなＳＴＥＡＰ−１内部抗体は、特定のＳＴＥＡＰ−１ドメインに特異的に結合するように設計される。別の実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質に特異的に結合する細胞質ゾル内部抗体を使用して、ＳＴＥＡＰ−１が核に近づくことを妨げ、それにより、ＳＴＥＡＰ−１が、核内においていかなる生物学的活性を発揮することをも妨げる（例えば、ＳＴＥＡＰ−１が他の因子と転写複合体を形成するのを妨げる）。
【０２７７】
このような内部抗体の発現を特定の細胞に特異的に指向するために、その内部抗体の転写は、適切な腫瘍特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの調節制御下に配置される。内部抗体の発現を前立腺に特異的に標的化するために、例えば、ＰＳＡプロモーターおよび／またはプロモーター／エンハンサーが、利用され得る（例えば、１９９９年７月６日付けで発行された、米国特許第５，９１９，６５２号を参照のこと）。
【０２７８】
（ＸＩＩ．Ｂ．）組換えタンパク質を用いたＳＴＥＡＰ−１の阻害
別のアプローチにおいて、組換え分子は、ＳＴＥＡＰ−１に結合し、それによりＳＴＥＡＰ−１の機能を妨げる。例えば、このような組換え分子は、ＳＴＥＡＰ−１が、その結合パートナー（単数または複数）に接近／結合すること、または他のタンパク質（１つまたは複数）と結合することを防止または阻害する。このような組換え分子は、例えば、ＳＴＥＡＰ−１特異的抗体分子の反応性部分（単数または複数）を含み得る。特定の実施形態において、ＳＴＥＡＰ−１結合パートナーのＳＴＥＡＰ−１結合ドメインは、二量体融合タンパク質へと操作され、これによってこの融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１）のＦｃ部分に連結された２つのＳＴＥＡＰ−１リガンド結合ドメインを含む。このようなＩｇＧ部分は、例えば、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインならびにヒンジ領域を含み得るが、ＣＨ１ドメインは含まない。このような二量体融合タンパク質は、ＳＴＥＡＰ−１の発現と関連する癌に罹患している患者に可溶性形態で投与され、それによりこの二量体融合タンパク質はＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合し、そしてＳＴＥＡＰ−１の結合パートナーとの相互作用をブロックする。このような二量体融合タンパク質はさらに、公知の抗体連結技術を使用して、多量体タンパク質へと組み合わされる。
【０２７９】
（ＸＩＩ．Ｃ．）ＳＴＥＡＰ−１の転写または翻訳の阻害
本発明はまた、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の転写を阻害するための種々の方法および組成物を含む。同様に、本発明はまた、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するための方法および組成物を提供する。
【０２８０】
１つのアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の転写を阻害する方法は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子をＳＴＥＡＰ−１アンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法は、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡをアンチセンスポリヌクレオチドと接触させる工程を包含する。別のアプローチにおいて、ＳＴＥＡＰ−１特異的リボザイムが、ＳＴＥＡＰ−１メッセージを切断し、それにより翻訳を阻害するために使用される。このようなアンチセンスに基づく方法およびリボザイムに基づく方法はまた、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の調節領域（例えば、ＳＴＥＡＰ−１プロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント）に関し得る。同様に、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子転写因子を阻害し得るタンパク質が、ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡの転写を阻害するために使用される。上述の方法において有用な種々のポリヌクレオチドおよび組成物が、上記で記載されている。転写および翻訳を阻害するためのアンチセンス分子およびリボザイム分子の使用は、当該分野で周知である。
【０２８１】
ＳＴＥＡＰ−１の転写活性化を妨害することによりＳＴＥＡＰ−１の転写を阻害する他の因子もまた、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を処置するために有用である。同様に、ＳＴＥＡＰ−１のプロセシングに干渉する因子は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を処置するために有用である。このような因子を利用する癌の処置方法もまた、本発明の範囲内である。
【０２８２】
（ＸＩＩ．Ｄ．）治療ストラテジーに関する一般的問題
遺伝子移入および遺伝子治療の技術が、ＳＴＥＡＰ−１を合成している腫瘍細胞に、治療用ポリヌクレオチド分子（すなわち、アンチセンス、リボザイム、内部抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）をコードするポリヌクレオチド、および他のＳＴＥＡＰ−１阻害分子）を送達するために使用され得る。多数の遺伝子治療アプローチが、当該分野で公知である。ＳＴＥＡＰ−１アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＳＴＥＡＰ−１の転写に干渉し得る因子などをコードする組換えベクターが、このような遺伝子治療アプローチを使用して標的腫瘍細胞に送達され得る。
【０２８３】
上記の治療的アプローチは、広範な種々の外科的レジメン、化学療法的レジメンまたは放射線療法レジメンのいずれか１つと組み合わされ得る。本発明の治療的アプローチは、すべての患者に対して、そして特に、化学療法剤の毒性に十分に耐性ではない患者に対して利点となる、化学療法（または他の療法）の減少した投薬量の使用および／またはより低頻度の投与の使用を可能にし得る。
【０２８４】
特定の組成物（例えば、アンチセンス、リボザイム、内部抗体）、またはこのような組成物の組合せの抗腫瘍活性は、種々のインビトロアッセイ系およびインビボアッセイ系を使用して評価され得る。治療的活性を評価するインビトロアッセイとしては、細胞増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび腫瘍促進活性を示す他のアッセイ、治療用組成物が結合パートナーへのＳＴＥＡＰ−１の結合を阻害する程度を決定し得る結合アッセイなどが挙げられる。
【０２８５】
インビボでは、ＳＴＥＡＰ−１治療用組成物の効果は、適切な動物モデルにおいて評価され得る。例えば、異種間前立腺癌モデル（ここで、ヒト前立腺癌の外植片または継代された異種移植片組織が、免疫無防備状態の動物（例えば、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス）に導入される）が使用され得る（Ｋｌｅｉｎら、１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３：４０２〜４０８）。例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１６６２８および米国特許第６，１０７，５４０号は、原発性腫瘍の発生、微小転移、および疾患の後期段階に特徴的な骨芽細胞転移の形成を反復し得る、ヒト前立腺癌の種々の異種移植片モデルを記載する。効力は、腫瘍形成の阻害、腫瘍後退または転移などを測定するアッセイを使用して予測され得る。
【０２８６】
アポトーシスの促進を評価するインビボアッセイが、治療用組成物の評価において有用である。１つの実施形態において、治療用組成物で処置された腫瘍保有マウス由来の異種移植片は、アポトーシス性病巣の存在について試験され得、そして未処置のコントロール異種移殖片保有マウスと比較され得る。アポトーシス性病巣が処置マウスの腫瘍に見出される度合いが、この組成物の治療的効力の指標を提供する。
【０２８７】
前述の方法の実施において使用される治療用組成物は、所望の送達方法に適切なキャリアを含む薬学的組成物に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療用組成物と組み合わされる場合に、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ患者の免疫系と一般に無反応性である、任意の物質が挙げられる。例としては、任意の多数の標準的な薬学的キャリア（例えば、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水溶液、静菌水など）が挙げられるがこれに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版），Ａ．Ｏｓａｌ．編、１９８０を参照のこと）。
【０２８８】
治療用処方物は、可溶化され得、そして腫瘍部位に治療用組成物を送達し得る任意の経路を介して投与され得る。潜在的に有効な投与経路としては、静脈内、非経口、腹腔内、筋内、腫瘍内、皮内、器官内、同所性（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）などが挙げられるがこれらに限定されない。静脈内注射に好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌非保存水の溶液中および／または注射用０．９％滅菌塩化ナトリウム（ＵＳＰ）を含むポリビニルクロリド製またはポリエチレン製のバッグに希釈された治療用組成物を含む。治療用タンパク質調製物は、凍結乾燥され得、そして滅菌粉末として、好ましくは減圧下で保存され得、次いで注射する前に、静菌水（例えば、ベンジルアルコール保存剤を含む）または滅菌水中で再構築され得る。
【０２８９】
前述の方法を使用する癌の処置についての投薬量および投与プロトコルは、方法および標的の癌とともに変動し、そして一般に、当該分野で理解される多数の他の要因に依存する。
【０２９０】
（ＸＩＩＩ．）キット／製品）
本明細書中で記載される診断適用および治療適用における使用について、キットもまた、本発明の範囲内である。このようなキットは、キャリア、パッケージ、またはバイアル、チューブなどのような１つ以上の容器を収容するために区画化されている容器を含み得、各容器は、本方法において使用される別々のエレメントのうちの１つを含む。例えば、容器は、検出可能に標識されているかまたは標識され得るプローブを含み得る。このようなプローブは、それぞれ図２関連タンパク質または図２の遺伝子もしくはメッセージに特異的な抗体またはポリヌクレオチドであり得る。本方法が標的核酸を検出するために核酸ハイブリダイゼーションを利用する場合、キットはまた、この標的核酸配列増幅のためのヌクレオチドを含む容器、および／またはレポーター分子（例えば、酵素標識、蛍光標識または放射性同位体標識）に結合されたレポーター手段（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン結合タンパク質）を含む容器を有し得る。キットは、図２もしくは図３のアミノ酸配列またはこれらのアナログ、あるいはこのようなアミノ酸配列をコードする核酸分子の全てまたは一部を含み得る。
【０２９１】
本発明のキットは、代表的には上記の容器、ならびに商業的立場および使用者の立場から所望される物質を含む１つ以上の他の容器を含み、この物質としては、以下が挙げられる：緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ；キャリア、パッケージ、容器、バイアルおよび／または内容物および／もしくは使用説明書を列挙するチューブラベル、ならびに使用説明書を有するパッケージ挿入物。
【０２９２】
ラベルは、組成物が特定の治療適用または非治療適用（例えば、診断適用または実験室適用）に使用されることを示すために容器上にあり得、そしてインビボ用途またはインビトロ用途（例えば、上記の用途）のいずれであるかについての指示もまた示し得る。指示および／または他の情報はまた、キットと共にまたはキット上に含まれる挿入物またはラベルに含まれ得る。
【０２９３】
用語「キット」および「製品」は、同義語として使用され得る。
【０２９４】
本発明の別の実施形態において、アミノ酸配列、低分子、核酸配列、および／または抗体のような組成物（例えば、表Ｉに示されるような組織の新形成の診断、予後、予防および／または処置に有用な物質）を含む製品が、提供される。製品は、典型的には、少なくとも１つの容器および少なくとも１つのラベルを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。これらの容器は、種々の材料（例えば、ガラスまたはプラスチック）より形成され得る。容器は、アミノ酸配列、低分子、核酸配列、および／または抗体を保持し得、１つの実施形態において、容器は、細胞のｍＲＮＡ発現プロファイルを試験する際に使用するためのポリヌクレオチドをこの目的に使用される試薬と一緒に保持する。
【０２９５】
容器は、あるいは、状態を処置、診断、予後または予防するに効果的な組成物を保持し得、そして滅菌アクセス口を有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通され得るストッパーを有する静脈内溶液のバッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の活性薬剤は、ＳＴＥＡＰ−１を特異的に結合し得かつＳＴＥＡＰ−１の機能を調節し得る抗体であり得る。
【０２９６】
ラベルは、容器上にあっても容器に取り付けられていてもよい。文字、数、またはこのラベルを形成する他の特徴がこの容器自体にかたどられるかまたはエッチングされる場合、ラベルは容器上にあり得；容器（例えば、パッケージ挿入物）をまた保持する容器（ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ）またはキャリア内に存在する場合、ラベルは容器に取り付けられ得る。ラベルは、この組成物が、状態（例えば、表Ｉに記載される組織の新形成）を診断、処置、予防または予後するために使用されることを示し得る。製品はさらに、薬学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液および／またはデキストロース溶液）を含む第２の容器を含み得る。製品はさらに、商業的立場および使用者の立場から所望される他の物質を含み得、この物質としては、以下が挙げられる：他の緩衝液、希釈液、フィルター、スターラー、針、シリンジ、ならびに／または指示を有するパッケージ挿入物および／もしくは使用説明書。
【実施例】
【０２９７】
本発明の種々の局面は、以下のいくつかの実施例によってさらに記載および例示され、これらの実施例は、いずれも、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０２９８】
（実施例１：ＳＴＥＡＰ遺伝子のｃＤＮＡフラグメントのＳＳＨ生成単離）
（材料および方法）
（ＬＡＰＣ異種移植片）
ＬＡＰＣ異種移植片を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓａｗｙｅｒｓ博士（ＵＣＬＡ）から入手し、記載（Ｋｌｅｉｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：４０２−４０８；Ｃｒａｆｔら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：５０３０−５０３６）のように生成した。アンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＰＣ−４異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−４ ＡＤおよびＡＩ）ならびにアンドロゲン依存性ＬＡＰＣ−９異種移植片およびアンドロゲン非依存性ＬＡＣＰ−９異種移植片（それぞれＬＡＰＣ−９ ＡＤおよびＡＩ）をそれぞれインタクトな雄ＳＣＩＤマウスまたは去勢した雄において増殖させ、そしてレシピエント雄に小組織塊として継代させた。ＬＡＰＣ−４ ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−４ ＡＤ腫瘍から誘導し、ＬＡＰＣ−９ ＡＩ異種移植片は、ＬＡＰＣ−９ ＡＤ腫瘍から誘導した。ＡＩ異種移植片を生成するために、ＬＡＰＣ ＡＤ腫瘍を有する雄マウスを去勢し、そして２〜３ヶ月間飼育した。ＬＡＰＣ腫瘍が再増殖した後、この腫瘍を採集し、そして去勢雄ＳＣＩＤマウスにおいてまたは雌ＳＣＩＤマウスにおいて継代させた。
【０２９９】
ＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片は、以下のように脛骨内（ｉｎｔｒａｔｉｂｉａｌｌｙ）で増殖した。皮膚下で増殖したＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片腫瘍組織を、この組織を１×Ｉｓｃｏｖｅｓ培地に浸しながら、１〜２ｍｍ３の切片に細かく切断した。次いで、切り刻んだ組織を、１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離し、この上清を、１０ｍｌの氷冷１×Ｉｓｃｏｖｅｓ培地中に再懸濁し、そして１．３Ｋｒｐｍで、４分間遠心分離した。次いで、このペレットを、１％プロナーゼＥを含む１×Ｉｓｃｏｖｅｓ中に再懸濁し、そして穏やかなゆれ攪拌（ｒｏｃｋｉｎｇ ａｇｉｔａｔｉｏｎ）をしながら、室温で２０分間インキュベートした後に氷上で２〜４分間インキュベートした。濾液を、１．３Ｋｒｐｍで４分間遠心分離し、そしてプロナーゼを、１０ｍｌのＩｓｃｏｖｅｓ中での再懸濁および再遠心分離によって、吸引されたペレットから除去した。次いで、細胞の凝集塊を、ＰｒＥＧＭ培地にプレートし、そして一晩増殖させた。次いで、この細胞を収集し、濾過し、２×ＲＰＭＩで洗浄し、そしてカウントした。約５０，０００個の細胞を、氷上で、当容量の氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合し、そして２７ゲージの針を介してＳＣＩＤマウスの近位脛骨幹端（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｉｂｉａｌ ｍｅｔａｐｈｙｓｅｓ）に、外科的に注射した。１０〜１２週間後、骨髄において増殖したＬＡＰＣ−４腫瘍を、回収した。
【０３００】
（細胞株および組織）
ヒト細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を、ＡＴＣＣから入手し、そして５％ウシ胎仔血清を有するＤＭＥＭ中で維持した。ＲＮＡ分析およびタンパク質分析についてのヒト組織を、ＵＣＬＡ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）のＨｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＨＴＲＣ）およびＱｕａｌＴｅｋ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）から得た。
【０３０１】
（ＲＮＡ単離）
腫瘍組織および細胞株を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）において１０ｍｌ／ｇ組織または１０ｍｌ／１０８細胞で用いてホモジナイズし、総ＲＮＡを単離した。ポリＡ ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ Ｏｌｉｇｏｔｅｘ ｍＲＮＡ ＭｉｎｉキットおよびＭｉｄｉキットを用いて総ＲＮＡから精製した。総ＲＮＡおよびｍＲＮＡを、分光光度計分析（Ｏ．Ｄ． ２６０／２８０ｎｍ）によって定量し、そしてゲル電気泳動によって分析した。
【０３０２】
（オリゴヌクレオチド）
以下のＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを使用した。
【０３０３】
【化１】
Figure 2005505271
（抑制サブトラクティブ（ｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ）ハイブリダイゼーション）
抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）を使用して、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）と比較して、アンドロゲン依存性前立腺癌で上方制御され得る遺伝子に対応するｃＤＮＡを同定した。
【０３０４】
ＬＡＰＣ−４ ＡＤ異種移植片に対応する二本鎖ｃＤＮＡ（テスター）およびＢＰＨ組織に対応する二本鎖ｃＤＮＡ（ドライバー）を、ＣＬＯＮＴＥＣＨのＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔおよびプライマーとして１ｎｇのオリゴヌクレオチドＲＳＡＣＤＮを使用して、上記のように、異種移植片およびＢＰＨ組織から単離した２μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡから合成した。第一鎖合成および第二鎖合成を、このキットの使用者マニュアルプロトコル（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．ＰＴ１１１７−１、Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．Ｋ１８０４−１）に記載のように実施した。この得られたｃＤＮＡを、ＲｓａＩで３７℃で３時間消化した。消化したｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、そしてエタノール沈殿した。
【０３０５】
ドライバーｃＤＮＡ（ＢＰＨ）を、４：１比で、ＲｓａＩ消化したＢＰＨ ｃＤＮＡとマウス肝臓由来の消化したｃＤＮＡとを合わせることによって生成し、マウス遺伝子が、このテスターｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−４ ＡＤ）から差し引かれることを確実にした。
【０３０６】
テスターｃＤＮＡ（ＬＡＰＣ−４ ＡＤ）を、５μｌの水中に１μｌのＲｓａＩ消化したＬＡＰＣ−４ ＡＤ ｃＤＮＡ（４００ｎｇ）を希釈することにより生成した。次いで、この希釈したｃＤＮＡ（２μｌ、１６０ｎｇ）を、４００ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて、総容量１０μｌで、１６℃で一晩、別々の連結反応液中で、２μｌのアダプター１およびアダプター２（１０μＭ）に連結した。連結を、１μｌの０．２Ｍ ＥＤＴＡで、そして７２℃で５分間加熱して終結させた。
【０３０７】
第一のハイブリダイゼーションを、１．５μｌ（６００ｎｇ）のドライバーｃＤＮＡを、１．５μｌ（２０ｎｇ）のアダプター１を連結したテスターｃＤＮＡおよびアダプター２を連結したテスターｃＤＮＡを含む２つの各チューブに添加することにより実施した。４μｌの最終容量で、サンプルに鉱油を重層し、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ サーマルサイクラー中で、９８℃で１．５分間変性し、次いで、６８℃で８時間ハイブリダイズさせた。次いで、この２つのハイブリダイゼーション物を、さらなる１μｌの新鮮な変性ドライバーｃＤＮＡと一緒に混合し、そして６８℃で一晩ハイブリダイズさせた。次いで、この第二のハイブリダイゼーション物を、２００μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中で希釈し、７０℃で７分間加熱し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０３０８】
（ＳＳＨから生成した遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅、クローニング、および配列決定）
ＳＳＨ反応から生じる遺伝子フラグメントを増幅するために、２つのＰＣＲ増幅を行った。第一のＰＣＲ反応において、１μｌの希釈した最終ハイブリダイゼーション混合物を、最終容量２５μｌ中の１μｌのＰＣＲプライマー１（１０μＭ）、０．５μｌ ｄＮＴＰミックス（１０μＭ）、２．５μｌの１０×反応緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）および０．５μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ ｃＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）に添加した。ＰＣＲ１を、以下の条件を用いて実施した：７５℃で５分、９４℃で２５秒、次いで９４℃で１０秒、６６℃で３０秒、７２℃で１．５分を２７サイクル。５つの別の第一のＰＣＲ反応を、各実験について行った。産物をプールし、そして水で１：１０に希釈した。第二のＰＣＲ反応については、このプールしそして希釈した第一のＰＣＲ反応物からの１μｌを、プライマーＮＰ１およびＮＰ２（１０μＭ）をＰＣＲプライマー１の代わりに使用したことを除き、ＰＣＲ１について用いた反応混合物と同じ反応混合物に添加した。ＰＣＲ２を、９４℃で１０秒、６８℃で３０秒、７２℃で１．５分を１０〜１２サイクル用いて実施した。これらのＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０３０９】
これらのＰＣＲ産物を、Ｔ／Ａベクタークローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１に挿入した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉを、青／白およびアンピシリン選択に供した。白色コロニーを拾い、９６ウェルプレート中に並べ、そして液体培養中で一晩増殖させた。挿入物を同定するために、ＰＣＲ増幅を、ＰＣＲ１の条件ならびにプライマーとしてＮＰ１およびＮＰ２を用いて、１ｍｌの細菌培養物に対して実施した。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。
【０３１０】
細菌クローンを、９６ウェル形式で２０％グリセロール中に貯蔵した。プラスミドＤＮＡを、調製し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ、ｄｂＥＳＴおよびＮＣＩ−ＣＧＡＰデータベースの核酸相同性検索に供した。
【０３１１】
（ＲＴ−ＰＣＲ発現分析）
第一鎖ｃＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムを用いるオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライミングによって、１μｇのｍＲＮＡから生成した。製造者プロトコルを使用し、そしてこれは、４２℃で５０分間の逆転写酵素とのインキュベーション、それに続く、３７℃で２０分間のＲＮＡｓｅ Ｈ処理を含んだ。反応を完了した後、この容量を、正規化の前に水で２００μｌに増大させた。１６の異なる正常ヒト組織からの第一鎖ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した。
【０３１２】
複数の組織からの第一鎖ｃＤＮＡの正規化を、プライマー５’ａｔａｔｃｇｃｃｇｃｇｃｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａａ３’（配列番号５６）および５’ａｇｃｃａｃａｃｇｃａｇｃｔｃａｔｔｇｔａｇａａｇｇ３’（配列番号５７）を用いてβアクチンを増幅することにより実施した。第一鎖ｃＤＮＡ（５μｌ）を、０．４μＭプライマー、０．２μＭ各ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．３）および１×Ｋｌｅｎｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む、総容量５０μｌで増幅した。１８サイクル、２０サイクルおよび２２サイクルで、５μｌのＰＣＲ反応物を取り出し、そしてアガロース電気泳動のために使用した。ＰＣＲを、以下の条件下で、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈサーマルサイクラーを用いて実施した：初期変性は９４℃で１５秒間であり、続いて９４℃で１５、６５℃で２分、７２℃で５秒を１８サイクル、２０サイクル、および２２サイクル。７２℃での最終伸長を、２分間行った。アガロースゲル電気泳動後、複数の組織からの２８３ｂｐのβアクチンバンドのバンド強度を、目視検査によって比較した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいβアクチンバンド強度を生じるように、第一鎖ｃＤＮＡの希釈倍率を算定した。２２サイクルのＰＣＲ後に全ての組織において等しいバンド強度を達成するには、３回の正規化が必要であった。
【０３１３】
８Ｐ１Ｄ４遺伝子の発現レベルを決定するために、５μｌの正規化した第一鎖ｃＤＮＡを、以下のプライマー対を用いる、２５、３０、および３５サイクルの増幅を用いるＰＣＲによって分析した：
５’ ＡＣＴ ＴＴＧ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＴＴ ＧＧＡ ３’（配列番号５８）
５’ ＣＡＧ ＡＡＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＡＣ ３’（配列番号５９）。
半定量発現分析を、軽度のバンド強度を与えるサイクル数でのＰＣＲ産物を比較することにより達成した。
【０３１４】
（結果）
いくつかのＳＳＨ実験を、上述の材料および方法に記載のように行い、そしてこれらのＳＳＨ実験は、多数の候補遺伝子フラグメントクローンの単離を導いた。全ての候補クローンを配列決定し、そして、対応する遺伝子の正体に関する情報を提供するためおよび示差的な発現について特定の遺伝子を分析するための決定を導くことを補助するために、主な公的な遺伝子データベースおよびＥＳＴデータベース中の全配列に対する相同性分析に供した。一般に、これらの検索したデータベースのいずれかにおいていかなる公知の配列とも相同性を有さず、従って新規な遺伝子を表すと考えられる遺伝子フラグメント、ならびに以前に配列決定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に対して相同性を示す遺伝子フラグメントを、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析によって示差的発現分析に供した。
【０３１５】
８Ｐ１Ｄ４と名付けた、これらのｃＤＮＡクローンの１つは、４３６ｂｐの長さであり、そしてＮＣＩ−ＣＧＡＰ腫瘍遺伝子データベースにおいてＥＳＴ配列に対する相同性を示した。その後、この８Ｐ１Ｄ４遺伝子をコードする全長ｃＤＮＡを、このｃＤＮＡを使用して単離し、ＳＴＥＡＰ−１と改名した。この８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡヌクレオチド配列は、図１Ａ〜Ｂに示されるように、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１５０〜５８５に対応する。２８Ｐ３Ｅ１と名付けた、別のクローンは、５６１ｂｐの長さであり、そしてＮＣＩ−ＣＧＡＰ腫瘍遺伝子データベースまたは他のデータベースにおいて、多くのＥＳＴ配列に対する相同性を示した。この２８Ｐ３Ｅ１配列の一部（３５６ｂｐ）は、ヒト胎児組織由来のＥＳＴと同一である。全長ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡを得てそして配列決定した後に、このクローンはまた、ＳＴＥＡＰ−１（より詳細には、図１に示されるような、ＳＴＥＡＰ−１ヌクレオチド配列の残基６２２から３’末端まで）に対応することが明らかとなった。
【０３１６】
８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡクローン由来のプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによる示差的発現分析は、８Ｐ１Ｄ４（ＳＴＥＡＰ−１）遺伝子が、正常前立腺ならびにＬＡＰＣ−４異種移植片およびＬＡＰＣ−９異種移植片において、ほぼ等しいレベルで発現されることを示した。１６の正常組織由来の第１鎖ｃＤＮＡのさらなるＲＴ−ＰＣＲ発現分析は、前立腺における最も高いレベルの８Ｐ１Ｄ４発現を示した。いくつかの他の正常組織（すなわち、結腸、卵巣、小腸、脾臓および精巣）における実質的により低レベルな発現は、脳、膵臓、結腸および小腸における３０サイクルの増幅でのみ検出可能であった。
【０３１７】
（実施例２：全長ＳＴＥＡＰ−１をコードするｃＤＮＡの単離）
４３６ｂｐの８Ｐ１Ｄ４遺伝子フラグメント（実施例１）を使用して、８Ｐ１Ｄ４／ＳＴＥＡＰ−１遺伝子をコードするさらなるｃＤＮＡを単離した。手短に言うと、正常なヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、この４３６ｂｐの８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡから作製した標識プローブを用いてスクリーニングした。陽性クローンの１つであるクローン１０は、１１９５ｂｐの長さであり、そして３３９アミノ酸のタンパク質をコードし、ヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列は、いかなる公知のヒト遺伝子に対してもタンパク質に対しても有意な相同性を保持しなかった（国際出願ＷＯ９８／５３０７１に最近記載されたラット腎臓損傷タンパク質に対する相同性）。このコードされるタンパク質は、少なくとも６つの推定膜貫通モチーフを含み、これは、細胞表面配向性を示す（図１Ａ〜Ｂ（下線を付した推定膜貫通モチーフ）を参照のこと）。これらの構造的特徴によって、「前立腺の６つの膜貫通上皮抗原（Ｓｉｘ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ）」にちなんで、ＳＴＥＡＰと命名した。
【０３１８】
引き続くさらなるＳＴＥＡＰタンパク質の同定によって、この８Ｐ１Ｄ４遺伝子産物は「ＳＴＥＡＰ−１」と改名された。このＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡの配列およびコードされるアミノ酸配列を、図２Ａ〜Ｑに示す。ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡクローン１０を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９ ＵＳＡ）に、プラスミド８Ｐ１Ｄ４クローン１０．１として、１９９８年８月２６日に寄託し、ＡＴＣＣ登録番号９８８４９を付与された。このＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡクローンは、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩの二重消化（５’末端でＥｃｏＲＩ、３’末端でＸｂａＩ）を使用して、このプラスミドから切り出され得る。
【０３１９】
（実施例３：ＳＴＥＡＰ−１の染色体マッピング）
染色体の位置決定は、疾患の病因における遺伝子と関連し得る。いくつかの染色体マッピングアプローチが利用可能であり、これれとしては、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ヒト／ハムスター放射線ハイブリッド（ＲＨ）パネル（Ｗａｌｔｅｒら、１９９４；Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：２２；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ Ａｌ）、ヒト−げっ歯類体細胞ハイブリッドパネル（例えば、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｄｅｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から入手可能なようなもの）、および配列決定されそしてマッピングされたゲノムクローンに対するＢＬＡＳＴ相同性を利用するゲノムビュアー（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。
【０３２０】
ＳＴＥＡＰ−１は、ＳＴＥＡＰ−１配列およびＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴツール（ワールドワイドウェブ（．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ／ｓｅｑ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？Ｆ＝ＨｓＢｌａｓｔ．ｈｔｍｌ＆＆ＯＲＧ＝Ｈｓに位置する）を使用して、染色体７ｑ２１にマッピングされ得る。
【０３２１】
（実施例４：ＳＴＥＡＰ−１の発現分析）
胃癌患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を、図１４に示す。ＲＮＡを、正常胃（Ｎ）および１０個の異なる胃癌患者標本（Ｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを用いるノーザンブロットを、ＳＴＥＡＰ−１配列を用いてプローブした。結果は、胃腫瘍組織における約１．６ｋｂのＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。下のパネルは、このＲＮＡサンプルの品質を示す、このブロットの臭化エチジウム染色を表す。
【０３２２】
図１５は、ＳＴＥＡＰ−１が、直腸癌患者組織において発現したことを示す。ＲＮＡを、正常直腸（Ｎ）、直腸癌患者腫瘍（Ｔ）、および直腸癌転移物（Ｍ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡを有するノーザンブロットを、ＳＴＥＡＰ−１配列を用いてプローブした。結果は、直腸癌患者組織におけるＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。下のパネルは、このＲＮＡサンプルの品質を示す、このブロットの臭化エチジウム染色を表す。
【０３２３】
ＲＴ−ＰＣＲによるＳＴＥＡＰ−１の発現は、ＳＴＥＡＰ−１が、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）において強力に発現することを示した（図１６）。第１鎖ｃＤＮＡを、ＨＵＶＥＣ細胞、ＬＡＰＣ−４ＡＤおよびＬＡＰＣ−９ＡＤの前立腺癌異種移植片、ならびにヒト脳組織から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを使用して、ＰＣＲによって、正規化を実施した。ＳＴＥＡＰ−１に対するプライマーを使用する半定量的ＰＣＲを、２７サイクルおよび３０サイクルの増幅において実施した（図１６Ａ）。コントロールとして、アクチンに対するプライマーを使用するＰＣＲを、図１６Ｂに示す。結果は、前立腺癌異種移植片組織において検出される発現に類似する、ＨＵＶＥＣ細胞においてＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。ＨＵＶＥＣ細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現は、標的化ＳＴＥＡＰ−１がまた、腫瘍の新生血管生成の内皮細胞を標的とし得ることを示す。
【０３２４】
（実施例５：８Ｐ１Ｄ４の転写産物改変体）
転写産物改変体は、選択的転写または選択的スプライシングによって生じる、同一遺伝子からの成熟ｍＲＮＡの改変体である。選択的転写産物は、同一遺伝子からの転写産物であるが、異なる点で転写を開始する。スプライシング改変体は、同一転写産物から異なってスプライシングされたｍＲＮＡ改変体である。真核生物において、複数のエキソンを有する遺伝子（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｏｎ ｇｅｎｅ）が、ゲノムＤＮＡから転写される場合、最初のＲＮＡがスプライシングされて、エキソンのみを有しかつアミノ酸配列への翻訳に使用される機能的ｍＲＮＡが産生される。従って、所定の遺伝子は、０から多くの選択的転写産物を有し得、そして各転写産物は、０から多くのスプライシング改変体を有し得る。各転写産物改変体は、独特のエキソン構成（ｍａｋｅｕｐ）を有し、そしてオリジナルの転写産物由来の異なるコード部分および／または非コード部分（５’末端または３’末端）を有し得る。転写産物改変体は、同一または同様の機能を有する同様または異なるタンパク質をコードしても、異なる機能を有するタンパク質をコードしてもよく、そして同一の時点で同一組織に発現しても、同一の時点で異なる組織に発現しても、異なる時点で同一の組織に発現しても、異なる時点で異なる組織に発現してもよい。転写産物改変体によりコードされるタンパク質は、同様または異なる細胞局在または細胞外局在（例えば、細胞内に対して分泌型）を有し得る。
【０３２５】
転写産物改変体は、当該分野において受け入れられた種々の方法によって同定される。例えば、選択的な転写産物およびスプライシング改変体は、全長クローニング実験によって、または全長転写産物およびＥＳＴ配列の使用によって、同定される。第１に、全てのヒトＥＳＴを、互いに直接的または間接的に同一性を示すクラスターにグループ化した。第２に、同一クラスター中のＥＳＴをさらに、サブクラスターにグループ化し、そしてコンセンサス配列に集合させた。オリジナルの遺伝子配列を、コンセンサス配列または他の全長配列と比較する。各コンセンサス配列は、その遺伝子についての潜在的なスプライシング改変体である（例えば、Ｋａｎ，Ｚ．ら、Ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ ａｌｉｇｎｅｄ ＥＳＴｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１年５月，１１（５）：８８９−９００を参照のこと）。全長クローンではない改変体が同定された場合でさえ、その改変体のその部分は、当該分野において公知の技術を使用する抗原生成および全長スプライシング改変体のさらなるクローニングに非常に有用である。
【０３２６】
さらに、ゲノム配列に基づいて転写産物改変体を同定するコンピュータープログラムが当該分野において利用可能である。ゲノムベースの転写産物改変体同定プログラムとしては、ＦｇｅｎｅｓＨ（Ａ．ＳａｌａｍｏｖおよびＶ．Ｓｏｌｏｖｙｅｖ，「Ａｂ ｉｎｉｔｉｏ ｇｅｎｅ ｆｉｎｄｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ」，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０００年４月；１０（４）：５１６−２２）；Ｇｒａｉｌ（ＵＲＬ ｃｏｍｐｂｉｏ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ／Ｇｒａｉｌ−ｂｉｎ／ＥｍｐｔｙＧｒａｉｌＦｏｒｍ）およびＧｅｎＳｃａｎ（ＵＲＬ ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）が挙げられる。スプライシング改変体同定プロトコルの一般的議論については、例えば、以下を参照のこと：Ｓｏｕｔｈａｎ，Ｃ．，Ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００１年６月８日；４９８（２−３）：２１４−８；ｄｅ Ｓｏｕｚａ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ＯＲＦ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００年１１月７日；９７（２３）：１２６９０−３。
【０３２７】
転写産物改変体のパラメーターをさらに確認するために、種々の技術（例えば、全長クローニング、タンパク質確認（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）、ＰＣＲベースの確認、および５’ＲＡＣＥ確認など）が当該分野において利用可能である（例えば、タンパク質確認：Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｓ．Ｏ．ら，Ａｌｂｕｍｉｎ ｂａｎｋｓ ｐｅｎｉｎｓｕｌａ：ａ ｎｅｗ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９９年８月１７日；１４３３（１−２）：３２１−６；Ｆｅｒｒａｎｔｉ Ｐら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｐｒｅ−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｃａｐｒｉｎｅ ａｌｐｈａ（ｓ１）−ｃａｓｅｉｎ，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７年１０月１日；２４９（１）：１〜７を、ＰＣＲベースの確認については：Ｗｅｌｌｍａｎｎ Ｓら，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ） ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｂｙ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２００１年４月；４７（４）：６５４−６０；Ｊｉａ，Ｈ．Ｐ．ら，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｅｎｅ．２００１年１月２４日；２６３（１−２）：２１１〜８を、ＰＣＲベースの確認および５’ＲＡＣＥ確認については：Ｂｒｉｇｌｅ，Ｋ．Ｅ．ら，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｌａｔｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔ ｓｐｌｉｃｅ ｆｏｒｍｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９７年８月７日；１３５３（２）：１９１−８を参照のこと）。
【０３２８】
ゲノム領域が癌において調節されることは、当該分野において公知である。遺伝子がマッピングされるゲノム領域が特定の癌において調節される場合、その遺伝子の選択的な転写産物またはスプライシング改変体もまた調節される。８Ｐ１Ｄ４は癌に関連する特定の発現プロファイルを有するということが、本明細書中に開示される。８Ｐ１Ｄ４の選択的な転写産物およびスプライシング改変体はまた、同一または異なる組織における癌に関与し得、従って腫瘍関連マーカー／抗原として働く。
【０３２９】
８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１と示されるもともとの転写物のエキソン組成は、表ＬＸＩに示される。全長遺伝子およびＥＳＴ配列を使用して、２つの転写改変体を同定し、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２および８Ｐ１Ｄ４ ｖ．３と名付けた。８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１と比較して、転写改変体８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２は、図１１に示すように、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１のイントロン４がスプライシングされておらず、改変体８Ｐ１Ｄ４ ｖ．３は、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１のイントロン４から１つのさらなるエキソンがスプライシングにより失われている。理論上、空間的順番でのエキソンの異なる組合わせ（例えば、エキソン２および３）の各々は、潜在的スプライシング改変体である。図１１は、転写改変体のエキソンの模式的整列を示す。
【０３３０】
表ＬＩＩＩ〜ＬＸは改変塩基による改変を示す。表ＬＩＩＩおよびＬＶＩＩは、転写改変体のヌクレオチド配列を示す。表ＬＩＶは、その転写改変体と８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１の核酸配列との整列を示す。表ＬＶＩＩＩは、その転写改変体と、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２の核酸配列との整列を示す。表ＬＶおよびＬＩＸは、同定したリーディングフレーム方向についての転写改変体のアミノ酸翻訳を並べる。表ＬＶＩは、スプライシング改変体によってコードされるアミノ酸配列と、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１によってコードされるアミノ酸配列との整列を示す。表ＬＸは、スプライシング改変体によってコードされるアミノ酸配列と、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２によってコードされるアミノ酸配列との整列を示す。
【０３３１】
（実施例６：８Ｐ１Ｄ４の単一ヌクレオチド多型）
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、特定の位置でのヌクレオチド配列中の単一塩基対改変である。ゲノムの任意の所定の点で、可能性のある４つの塩基対（Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｇ／ＣおよびＴ／Ａ）が存在する。遺伝子型は、個体のゲノム中の１つ以上の位置の特定の塩基対配列をいう。ハプロタイプは、しばしば、１つの遺伝子の観点でかまたはいくつかの密接に連鎖した遺伝子の点で、同一のＤＮＡ分子（または、高等生物における同一の染色体）上の１つより多い位置の塩基対配列をいう。ｃＤＮＡ上に生じるＳＮＰは、ｃＳＮＰと呼ばれる。これらのｃＳＮＰは、その遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸を変化させ得、よってそのタンパク質の機能を変化させ得る。いくつかのＳＮＰは、遺伝的疾患を生じる；他のＳＮＰは、表現型における定量的改変および環境因子（個体での食餌および薬物を含む）に対する反応に寄与する。よって、ＳＮＰおよび／または対立遺伝子の組合わせ（ハプロタイプと呼ばれる）は、多くの適用（遺伝的疾患の診断、薬物反応および投薬量の決定、疾患に応答性の遺伝子の同定、および個体間での遺伝的関係の分析を含む）を有する（Ｐ．Ｎｏｗｏｔｎｙ，Ｊ．Ｍ．ＫｗｏｎおよびＡ．Ｍ．Ｇｏａｔｅ，「ＳＮＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｄｉｓｓｅｃｔ ｈｕｍａｎ ｔｒａｉｔｓ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００１ Ｏｃｔ；１１（５）：６３７−６４１；Ｍ．ＰｉｒｍｏｈａｍｅｄおよびＢ．Ｋ．Ｐａｒｋ，「Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａｄｖｅｒｓｅ ｄｒｕｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２００１ Ｊｕｎ；２２（６）：２９８−３０５；Ｊ．Ｈ．Ｒｉｌｅｙ，Ｃ．Ｊ．Ａｌｌａｎ，Ｅ．ＬａｉおよびＡ．Ｒｏｓｅｓ，「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｇｅｎｅｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００ Ｆｅｂ；１（１）：３９−４７；Ｒ．Ｊｕｄｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ＳｔｅｐｈｅｎｓおよびＡ．Ｗｉｎｄｅｍｕｔｈ，「Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｐｏｗｅｒ ｏｆ ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００ Ｆｅｂ；１（１）：１５−２６）。
【０３３２】
ＳＮＰは、当該分野において受容された種々の方法（Ｐ．Ｂｅａｎ，「Ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｖｏｙａｇｅ ｏｆ ＳＮＰ ｔａｒｇｅｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」，Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．２００１ Ｏｃｔ−Ｎｏｖ；２０（９）：１８−２０；Ｋ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓ，「Ｉｎ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｖａｒｉａｔｉｏｎ」，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１９９８ Ｊｕｌ；８（７）：６９１−６９７：Ｍ．Ｍ．Ｓｈｅ，「Ｅｎａｂｌｉｎｇ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２００１ Ｆｅｂ；４７（２）：１６４−１７２）によって同定される。例えば、ＳＮＰは、ゲルベースの方法（例えば、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）および変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ））によって多型を示すＤＮＡフラグメントを配列決定することによって同定される。これらはまた、異なる個体からプールされたＤＮＡサンプルの直接配列決定によってか、または異なるＤＮＡサンプルからの配列を比較することによって、見出され得る。公的データベースおよび私的データベースにおける配列データ迅速な蓄積を用いて、コンピュータープログラム（Ｚ．Ｇｕ，Ｌ．ＨｉｌｌｉｅｒおよびＰ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，「Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｈｕｎｔｉｎｇ ｉｎ ｃｙｂｅｒｓｐａｃｅ」，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９９８；１２（４）：２２１−２２５）を使用して配列を比較することによってＳＮＰが見出され得る。ＳＮＰが確認され得、そして個々の遺伝型またはハプロタイプは、直接配列決定およびハイスループットマイクロアレイを含む種々の方法によって決定され得る（Ｐ．Ｙ．Ｋｗｏｋ，「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００１；２：２３５−２５８；Ｍ．Ｋｏｋｏｒｉｓ，Ｋ．Ｄｉｘ，Ｋ．Ｍｏｙｎｉｈａｎ，Ｊ．Ｍａｔｈｉｓ，Ｂ．Ｅｒｗｉｎ，Ｐ．Ｇｒａｓｓ，Ｂ．ＨｉｎｅｓおよびＡ．Ｄｕｅｓｔｅｒｈｏｅｆｔ，「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｍａｓｓｃｏｄｅ ｓｙｓｔｅｍ」，Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２０００ Ｄｅｃ；５（４）：３２９−３４０）。
【０３３３】
上記の方法を使用して、１４つのＳＮＰを、クローンＧＴＨ９由来の転写物（８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２と称される）において、６０２位（Ｃ／Ｇ）、３８６位（Ｃ／Ｔ）、１０８７位（Ｔ／Ｇ）、１４４７位（Ｔ／Ｃ）、１６２１位（Ａ／Ｔ）、１６２５位（Ｇ／Ｔ）、１７１６位（Ｃ／Ａ）、２３５８位（Ｃ／Ｔ）、２６４６位（Ｔ／Ｇ）、２８５９位（Ｔ／Ｇ）、２９０８位（Ａ／Ｔ）、３００６位（Ｇ／Ｃ）、３１０７位（Ｃ／Ｔ）、および３１８０位（Ａ／Ｔ）にて同定した。選択的な対立遺伝子を有する転写物またはタンパク質を、それぞれ改変体８Ｐ１Ｄ４ ｖ．４、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．５、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．６、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．７、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．８、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．９、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１０、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１１、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１２、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１３、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１４、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１５、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１６および８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１７と名付けた。図１０は、ＳＮＰ改変体の模式的整列を示す。図１２は、タンパク質改変体（ヌクレオチド改変体に対応する）の模式的整列を示す。このＳＮＰのこれらの対立遺伝子（ここで別々に示されるが）を、異なる組み合わせ（ハプロタイプ）、およびＳＮＰの配列背景を含む転写改変体のいずれか１つ（例えば、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１および８Ｐ１Ｄ４ ｖ．３）において生じ得る。例えば、最初の２つのＳＮＰは、同じ位置で８Ｐ１Ｄ４ ｖ．３上にもあったが、それぞれ５７２位および３５６位では、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１上にあった。
【０３３４】
（実施例７：原核生物系における組換え８Ｐ１Ｄ４の産生）
原核生物細胞において組換え８Ｐ１Ｄ４および８Ｐ１Ｄ４改変体を発現させるために、全長または部分長の８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡ配列および８Ｐ１Ｄ４改変体ｃＤＮＡ配列を、当該分野において公知の種々の発現ベクターのいずれか１つ中にクローニングする。８Ｐ１Ｄ４由来の全長ｃＤＮＡ、または８Ｐ１Ｄ４由来の連続する任意の８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、またはそれより多くのアミノ酸、その改変体もしくはアナログを使用する。
【０３３５】
（Ａ．インビトロでの転写構築物および翻訳構築物）
ｐＣＲＩＩ： ＲＮＡインサイチュ研究のための８Ｐ１Ｄ４のセンスおよびアンチセンスのＲＮＡプローブを作製するために、ｐＣＲＩＩ構築物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を作製する（これは、８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡの全体またはフラグメントのいずれかをコードする）。ｐＣＲＩＩベクターは、挿入物に隣接して、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション実験におけるプローブとして使用するための８Ｐ１Ｄ４ ＲＮＡの転写を誘導するＳｐ６プロモーターおよびＴ７プロモーターを有する。これらのプローブを、ＲＮＡレベルでの８Ｐ１Ｄ４の細胞発現および組織発現を分析するために用いる。８Ｐ１Ｄ４遺伝子のｃＤＮＡアミノ酸コード領域を表す、転写された８Ｐ１Ｄ４ ＲＮＡを、８Ｐ１Ｄ４タンパク質を合成するためのＴｎＴＴＭ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃｒｏｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のようなインビトロでの翻訳系において用いる。
【０３３６】
（Ｂ．細菌構築物）
ｐＧＥＸ構築物： 細菌細胞において組換え８Ｐ１Ｄ４タンパク質（これは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質に融合される）を産生するために、８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡまたは改変体の全てまたは一部を、ｐＧＥＸファミリーのＧＳＴ−融合ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中にクローニングする。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＧＳＴおよびカルボキシル末端の６個のヒスチジンのエピトープ（６Ｘ Ｈｉｓ）を有する組換え８Ｐ１Ｄ４タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＧＳＴおよび６Ｘ Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いる、誘導された細菌からの組換え融合タンパク質の精製を可能にし、そして抗ＧＳＴ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いる融合タンパク質の認識を可能にする。６Ｘ Ｈｉｓタグは、例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端のクローニングプライマーへ６つのヒスチジンコドンを付加することにより作製される。タンパク質切断部位（例えば、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１中のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭ認識部位）を用いて、８Ｐ１Ｄ４関連タンパク質からＧＳＴタグの切断を可能にし得る。アンピシリン耐性遺伝子およびｐＢＲ３２２起源は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのｐＧＥＸプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０３３７】
ｐＭＡＬ構築物： 細菌において、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合された組換え８Ｐ１Ｄ４タンパク質を産生するために、８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＭＡＬ−ｃ２ＸおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）へとクローニングすることによりＭＢＰ遺伝子に融合する。これらの構築物は、アミノ末端で融合したＭＢＰおよびカルボキシル末端の６Ｘ Ｈｉｓエピトープを有する組換え８Ｐ１Ｄ４タンパク質配列の制御された発現を可能にする。このＭＢＰおよび６Ｘ Ｈｉｓタグは、適切なアフィニティーマトリクスを用いる、誘導された細菌からの組換え融合タンパク質の精製を可能にし、そして抗ＭＢＰ抗体および抗Ｈｉｓ抗体を用いる融合タンパク質の認識を可能にする。６Ｘ Ｈｉｓエピトープタグは、３’クローニングプライマーへの６つのヒスチジンコドンの付加により作製される。Ｘａ因子認識部位は、８Ｐ１Ｄ４からのｐＭＡＬタグの切断を可能にする。ｐＭＡＬ−ｃ２ＸベクターおよびｐＭＡＬ−ｐ２Ｘベクターは、それぞれ、細胞質または周辺質において組換えタンパク質を発現するように最適化される。周辺質発現は、ジスルフィド結合を有するタンパク質の折畳みを増大させる。
【０３３８】
ｐＥＴ構築物： 細菌細胞において、８Ｐ１Ｄ４を発現させるために、８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＴファミリーのベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へとクローニングする。これらのベクターは、可溶性を増大させるタンパク質（例えば、ＮｕｓＡおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ））、および組換えタンパク質の精製および検出を補助するエピトープタグ（例えば、６Ｘ ＨｉｓおよびＳ−タグＴＭ）への融合を用いておよび用いずに、細菌における組換え８Ｐ１Ｄ４タンパク質の緊密に制御された発現を可能にする。例えば、構築物を、ｐＥＴ ＮｕｓＡ融合系４３．１を利用して作製して、その結果、８Ｐ１Ｄ４タンパク質の領域を、ＮｕｓＡへのアミノ末端融合物として発現する。
【０３３９】
（Ｃ．酵母構築物）
ｐＥＳＣ構築物： 組換えタンパク質の産生および機能的研究のために、酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて８Ｐ１Ｄ４を発現させるために、８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＳＣファミリーのベクター（これらの各々は、４つの選択マーカー、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、およびＵＲＡ３の内１つを含む）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）へとクローニングする。これらのベクターは、同じ酵母細胞中にＦｌａｇＴＭまたはＭｙｃエピトープタグのいずれかを含む、２つまでの異なる遺伝子またはクローン化された配列の同じプラスミドからの、制御された発現を可能にする。この系は、８Ｐ１Ｄ４のタンパク質−タンパク質相互作用を確認するために有用である。さらに、酵母における発現は、真核生物細胞において発現される場合に見出される翻訳後修飾に類似の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化およびリン酸化）を生じる。
【０３４０】
ｐＥＳＰ構築物： 酵母種Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅにおいて８Ｐ１Ｄ４を発現させるために、８Ｐ１Ｄ４ ｃＤＮＡタンパク質コード配列の全てまたは一部を、ｐＥＳＰファミリーのベクターにクローニングする。これらのベクターは、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかで、組換えタンパク質の精製を補助するＧＳＴへ融合される、８Ｐ１Ｄ４タンパク質配列の制御された高レベル発現を可能にする。ＦｌａｇＴＭエピトープタグは、抗ＦｌａｇＴＭ抗体を用いる組換えタンパク質の検出を可能にする。
【０３４１】
（実施例８：真核生物系における組換えＳＴＥＡＰ−１の産生）
（Ａ．哺乳動物構築物）
真核生物細胞において組換えＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡ配列の全長または部分長を、当該分野で公知の種々の発現ベクターのいずれか１つへとクローニングし得る。ＳＴＥＡＰ−１の以下の領域の１つ以上が、これらの構築物において発現される：ＳＴＥＡＰ−１ｖ．１、ＳＴＥＡＰ−１ｖ．４のアミノ酸１〜３３９、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２のアミノ酸１〜２５８、ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３のアミノ酸１〜２８２、；またはＳＴＥＡＰ−１由来の任意の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上の連続するアミノ酸、これらの改変体もしくはアナログ。特定の実施形態において、特定の位置でアミノ酸をコードするＳＴＥＡＰ−１の特定の改変体の領域が発現され、これは、その位置で見いだされる任意の他の改変体のアミノ酸とは異なる。他の実施形態において、その改変体に特有の配列内に部分的にまたは全体的に存在するＳＴＥＡＰ−１の改変体の領域が発現される。
【０３４２】
これらの構築物は、２９３Ｔ細胞のような広範な種々の哺乳動物細胞のいずれか１つへとトランスフェクトされ得る。トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞溶解産物は、本明細書中に記載されるように、抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル血清を用いてプローブされ得る。
【０３４３】
ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ構築物： 哺乳動物細胞においてＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦまたはその一部を、ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローン化する。タンパク質発現を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＳＰ１６翻訳エンハンサーから誘導する。この組換えタンパク質は、アミノ末端に融合されたＸｐｒｅｓｓＴＭおよび６つのヒスチジン（６Ｘ Ｈｉｓ）エピトープを有する。このｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘベクターはまた、ラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。
【０３４４】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ構築物： 哺乳動物細胞においてＳＴＥＡＰ−１を発現させるために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有するＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦをまたはその一部を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓ Ｖｅｒｓｉｏｎ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へとクローニングした。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導される。この組換えタンパク質は、カルボキシル末端に融合されたｍｙｃエピトープおよび６Ｘ Ｈｉｓエピトープを有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＭｙｃＨｉｓベクターはまた、ラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子を用い得る。なぜならば、ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にするからである。
【０３４５】
ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ構築物：哺乳動物細胞においてＳＴＥＡＰ−１を発現し、そして蛍光を用いる組換えタンパク質の検出を可能にするために、コンセンサスＫｏｚａｋ翻訳開始部位を有するＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦまたはその一部を、ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）へとクローン化する。タンパク質発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターから誘導される。組換えタンパク質は、非侵襲的にインビボでの検出および細胞生物学研究を容易にする、カルボキシル末端に融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する。ｐｃＤＮＡ３．１／ＣＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯベクターはまた、ラージＴ抗原を発現する細胞株におけるエピソーム複製および単純なベクターレスキューのためのＳＶ４０起源と共に、ｍＲＮＡ安定性を増大するための、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を含む。ネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドの選択および維持を可能にする。アミノ末端ＧＦＰ融合物を有するさらなる構築物は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の全体の長さにわたるｐｃＤＮＡ３．１／ＮＴ−ＧＦＰ−ＴＯＰＯにおいて作製される。
【０３４６】
ＰＡＰｔａｇ： ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦまたはその一部を、ｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｒｏｐ．Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮ）へとクローン化する。この構築物は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のカルボキシル末端のアルカリホスファターゼ融合物（これは、一方で、アミノ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合している）を作製する。アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列とアルカリホスファターゼがＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ末端に融合されている構築物もまた作製される。得られた組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、トランスフェクトされた哺乳動物細胞の培地への分泌に最適化され、そしてＳＴＥＡＰ−１タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために用いられ得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導され、そして組換えタンパク質はまた、検出および精製を容易にするカルボキシル末端で融合されたｍｙｃエピトープおよび６Ｘ Ｈｉｓエピトープを含む。ベクター中に存在するゼオシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０３４７】
ｐｔａｇ５： ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦまたはその部分を、ｐＴａｇ−５へとクローン化した。このベクターは、ｐＡＰｔａｇに類似するが、アルカリホスファターゼ融合物を含まない。この構築物は、アミノ末端ＩｇＧκシグナル配列、ならびに検出およびアフィニティー精製を容易にするカルボキシル末端のｍｙｃエピトープタグおよび６Ｘ Ｈｉｓエピトープタグを有する、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を産生した。得られた組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌のために最適化し、そして免疫原、またはＳＴＥＡＰ−１タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するためのリガンドとして用いた。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導した。ベクターに存在するゼオシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０３４８】
ＰｓｅｃＦｃ： ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦ、またはその部分をまた、ｐｓｅｃＦｃへとクローン化した。このｐｓｅｃＦｃベクターをヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ）Ｆｃ（ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域）をｐＳｅｃＴａｇ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へとクローニングすることにより、アセンブリした。この構築物は、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のカルボキシル末端のＩｇＧ１ Ｆｃ融合物（一方で、これは、Ｎ末端にＩｇＧκシグナル配列を融合する）を作製する。マウスＩｇＧ１ Ｆｃ領域を利用するＳＴＥＡＰ−１融合物もまた用いる。得られた組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、トランスフェクトした哺乳動物細胞の培地への分泌について最適化し、そして免疫原としてか、またはＳＴＥＡＰ−１タンパク質と相互作用するリガンドまたはレセプターのようなタンパク質を同定するために用い得る。タンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターから誘導される。ベクター中に存在するハイグロマイシン耐性遺伝子は、組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択を可能にする。
【０３４９】
ｐＳＲα構築物： ＳＴＥＡＰ−１を構成的に発現する哺乳動物細胞株を作製するために、ＳＴＥＡＰ−１のＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦまたはその一部を、ｐＳＲα構築物へとクローン化した。両栄養性レトロウイルスおよびエコトロピックレトロウイルスを、それぞれ、２９３Ｔ−１０Ａ１パッケージング株へのｐＳＲα構築物のトランスフェクション、またはｐＳＲαおよびヘルパープラスミド（欠失したパッケージング配列を含む）の２９３細胞への同時トランスフェクションにより作製した。このレトロウイルスを、種々の哺乳動物細胞株を感染させるために用いて、クローン化された遺伝子であるＳＴＥＡＰ−１の宿主細胞株への組み込みを生じた。タンパク質発現は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）から誘導される。ベクター中に存在するネオマイシン耐性遺伝子は、タンパク質を発現する哺乳動物細胞の選択を可能にし、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＣｏｌＥ１起源は、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択および維持を可能にする。その後、このレトロウイルスベクターを、例えば、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＴｓｕＰｒｌ細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞を用いる、種々の細胞株の感染および産生のために用いた。
【０３５０】
さらなるｐＳＲα構築物を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いる検出を可能にするために、ＳＴＥＡＰ−１配列のカルボキシル末端に、ＦＬＡＧＴＭタグのようなエピトープタグを融合して作製する。例えば、ＦＬＡＧＴＭ配列５’ｇａｔ ｔａｃ ａａｇ ｇａｔ ｇａｃ ｇａｃ ｇａｔ ａａｇ３’（配列番号６０）を、ＯＲＦの３’末端のクローニングプライマーに付加する。さらなるｐＳＲα構築物を、全長ＳＴＥＡＰ−１タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端のＧＦＰおよびｍｙｃ／６Ｘ Ｈｉｓ融合タンパク質の両方を産生させるために作製した。
【０３５１】
さらなるウイルスベクター： さらなる構築物を、ＳＴＥＡＰ−１のウイルス媒介送達および発現のために作製する。ＳＴＥＡＰ−１の高レベル発現につながる高ウイルス力価は、アデノウイルスベクターおよびヘルペスアンプリコンベクターのようなウイルス送達系において達成される。ＳＴＥＡＰ−１コード配列またはそのフラグメントは、ＰＣＲにより増幅され、そしてＡｄＥａｓｙシャトルベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へとサブクローニングされる。組換えおよびウイルスパッケージングを、アデノウイルスベクターを作製するための製造業者の指示書に従って実施する。あるいは、ＳＴＥＡＰ−１コード配列およびそのフラグメントを、ＨＳＶ−１ベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ）へとクローニングして、ヘルペスウイルスベクターを作製する。その後、このウイルスベクターを、ＰＣ３、ＮＩＨ ３Ｔ３、２９３またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株の感染のために用いる。
【０３５２】
調節された発現系： 哺乳動物細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を制御するために、ＳＴＥＡＰ−１のコード配列またはその部分を、Ｔ−Ｒｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｔｉｇｈｔｌｙ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｃｄｙｓｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような調節された哺乳動物発現系へとクローニングする。これらの系は、組換えＳＴＥＡＰ−１の時間依存効果および濃度依存効果の研究を可能にする。その後、これらのベクターは、ＰＣ３細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、２９３細胞、またはｒａｔ−１細胞のような種々の細胞株におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を制御するために用いられる。
【０３５３】
（Ｂ．バキュロウイルス発現系）
バキュロウイルス発現系において組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を産生するために、ＳＴＥＡＰ−１ ＯＲＦまたはその部分を、バキュロウイルス移入ベクターであるｐＢｌｕｅＢａｃ ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（これは、Ｎ末端にＨｉｓタグを提供する）へとクローニングする。具体的には、ｐＢｌｕｅＢａｃ−ＳＴＥＡＰ−１は、ヘルパープラスミドｐＢａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＳＦ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞へと同時トランスフェクトされて、組換えバキュロウイルスを作製する（詳細については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示マニュアルを参照のこと）。次いで、バキュロウイルスを、細胞上清から収集し、そしてプラークアッセイにより精製する。次いで、組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、精製したバキュロウイルスを用いるＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の感染により作製する。組換えＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、抗ＳＴＥＡＰ−１または抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出し得る。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、精製し、そして種々の細胞ベースのアッセイにおいて、またはＳＴＥＡＰ−１に特異的なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製するための免疫原として用い得る。
【０３５４】
（実施例９：抗原性プロフィールおよび二次構造）
図５〜９および図５ａ〜９ａは、それぞれ、８Ｐ１Ｄ４改変体１および８Ｐ１Ｄ４改変体３の５つのアミノ酸プロフィール（各々の評価は、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバのＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト（ＵＲＬ ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）にアクセスすることにより利用可能である）を図示する。
【０３５５】
これらのプロフィール：図５、親水性（Ｈｏｐｐ Ｔ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓ Ｋ．Ｒ．，１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８）；図６、ヒドロパシー（Ｋｙｔｅ Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．，１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）；図７、接近可能な残基の百分率（Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９ Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２）；図８、平均可撓性（Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，およびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．１９８８．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５）；図９、βターン（Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．１９８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４）；および、必要に応じて、例えば、ＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイトにあるような、当該分野で利用可能な他のもの、を用いて、８Ｐ１Ｄ４タンパク質の抗原領域を同定した。８Ｐ１Ｄ４の上記のアミノ酸プロフィールの各々を、分析のために以下のＰｒｏｔＳｃａｌｅパラメーターを用いて作製した：１）ウィンドウサイズ９；２）ウィンドウセンターと比較したウィンドウエッジの１００％ウェイト；および３）０と１との間にあるように正規化されたアミノ酸プロフィール値。
【０３５６】
疎水性プロフィール（図５）、ヒドロパシープロフィール（図６）および接近可能な残基百分率プロフィール（図７）を使用して、疎水性アミノ酸（すなわち、ヒドロパシープロフィールおよび接近可能な残基百分率プロフィールにて値が０．５より大きく、ヒドロパシープロフィールにて値が０．５より小さい）のストレッチを決定した。そのような領域は、水性環境に曝される可能性があり、タンパク質表面上に存在する可能性があり、したがって、（例えば、抗体による）免疫認識に利用可能である。
【０３５７】
平均可撓性プロフィール（図８）およびβターンプロフィール（図９）は、二次構造（例えば、βシートおよびαヘリックス）に拘束されていないアミノ酸（すなわち、βターンプロフィールおよび平均可撓性プロフィールにて値が０．５より大きい）のストレッチを決定する。そのような領域はまた、タンパク質の露出した部分である可能性がより高く、従って、（例えば、抗体による）免疫認識に利用可能である。
【０３５８】
例えば、図５、図６、図７、図８、および／または図９に示されるプロフィールにより示される、８Ｐ１Ｄ４タンパク質およびその改変体タンパク質の抗原性配列を使用して、免疫原（ペプチド、またはペプチドをコードする核酸のいずれか）を調製して、治療的および診断的な抗８Ｐ１Ｄ４抗体を生成する。その免疫原は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、または５０個より長く連続する、図２および３に列挙される８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体由来の任意のアミノ酸、またはそれをコードする対応核酸であり得る。特に、本発明のペプチド免疫原は、図５の疎水性プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２および３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図６のヒドロパシープロフィールにおいて０．５未満の値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２および３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図７の接近可能な残基百分率プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２および３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；図８の平均可撓性プロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２および３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；および図９のβ−ターンプロフィールにおいて０．５を超える値を有するアミノ酸位置を含む任意の整数増分にて図２および３の少なくとも５個のアミノ酸のペプチド領域；を含み得る。本発明のペプチド免疫原はまた、上記のいずれかをコードする核酸もまた含み得る。
【０３５９】
本発明の免疫原、ペプチド、または核酸はすべて、ヒト単位投薬形態で具現化され得るか、またはヒトの生理に適合する薬学的賦形剤を含む組成物により含有され得る。
【０３６０】
８Ｐ１Ｄ４改変体１および８Ｐ１Ｄ４改変体３の二次構造（すなわち、推定されるαヘリックス、伸長鎖、およびランダムコイルの存在および位置）は、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）（ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ．／ｔｏｏｌｓ／からアクセスされる）を使用して、それぞれの一次アミノ酸配列から推定される。この分析は、８Ｐ１Ｄ４改変体１が、６４．６０％のαヘリックス、４．７２％の伸長鎖、および３０．６８％のランダムコイルから構成されることを示す（図１３ａ）。８Ｐ１Ｄ４改変体２は、６２．７９％のαヘリックス、３．１０％の伸長鎖、および３４．１１％のランダムコイルから構成される（図１３ｂ）。８Ｐ１Ｄ４改変体３は、５８．８７％のαヘリックス、５．３２％の伸長鎖、および３５．８２％のランダムコイルから構成される（図１３ｃ）。
【０３６１】
８Ｐ１Ｄ４改変体中の膜貫通ドメインの潜在的存在についての分析を、ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）からアクセスされる種々の膜貫通推定アルゴリズムを使用して実行した。図示されるのは、ＴＭｐｒｅｄプログラムを使用した６つの膜貫通ドメインの存在および位置を示す改変体１の分析の結果（図１３ｄ）およびＴＭＨＭＭプログラムを使用した６つの膜貫通ドメインの存在および位置を示す改変体１の分析の結果（図１３ｅ）である。また、ＴＭｐｒｅｄを使用した４つの膜貫通ドメインの存在および位置を示す改変体２の分析の結果（図１３ｆ）およびＴＭＨＭＭを使用した３つの膜貫通ドメインの存在および位置を示す改変体２の分析の結果（図１３ｇ）も示される。改変体３の分析は、ＴＭｐｒｅｄを使用して４つの膜貫通ドメインの存在（図１３ｈ）およびＴＭＨＭＭを使用して３つの膜貫通ドメインの位置（図１３ｉ）を示す。各プログラムの結果（すなわち、膜貫通ドメインをコードするアミノ酸）を、表ＸＸにまとめる。
【０３６２】
（実施例１０：８Ｐ１Ｄ４ポリクローナル抗体の生成）
ポリクローナル抗体を、例えば、免疫因子および（所望される場合は）アジュバントの１回以上の注射によって、哺乳動物において惹起し得る。代表的には、その免疫因子および／またはアジュバントを、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、その哺乳動物中に注射する。全長８Ｐ１Ｄ４タンパク質で免疫することに加えて、アミノ酸配列分析に基づいて、抗原性でありかつ免疫される宿主の免疫系による認識に利用可能な特徴を含む免疫原の設計において、コンピューターアルゴリズムが使用される（実施例の標題「抗原性プロフィール」を参照のこと）。そのような領域は、一般的には、親水性であり、可撓性であり、β−ターン立体配座の状態であり、そしてそのタンパク質の表面上に露出されていることが予期される（例えば、８Ｐ１Ｄ４および改変体のそのような領域を示すアミノ酸プロフィールについて、図５、図６、図７、図８、または図９を参照のこと）。
【０３６３】
例えば、８Ｐ１Ｄ４改変体タンパク質の親水性領域、可撓性領域、β−ターン領域を含む、８Ｐ１Ｄ４細菌組換え融合タンパク質または８Ｐ１Ｄ４細菌組換え融合ペプチドを、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄホワイトウサギにおいてポリクローナル抗体を生成するための抗原として使用する。例えば、このような領域は、８Ｐ１Ｄ４改変体１、８Ｐ１Ｄ４改変体２および８Ｐ１Ｄ４改変体３のアミノ酸１〜４０、アミノ酸１４３〜１６５、アミノ酸１８０〜２２０、８Ｐ１Ｄ４改変体１のアミノ酸３１２〜３３９、８Ｐ１Ｄ４改変体３のアミノ酸２５０〜２８２が挙げられるが、これらに限定されない。免疫される哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質に、その免疫因子を結合体化することが有用である。そのような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、およびダイズトリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、８Ｐ１Ｄ４改変体３のアミノ酸２５０〜２８２をコードするペプチドを、ＫＬＨに結合体化し、ウサギを免疫するために使用する。あるいは、その免疫因子は、８Ｐ１Ｄ４改変体タンパク質、そのアナログまたは融合タンパク質のすべてもしくは一部を含み得る。例えば、８Ｐ１Ｄ４改変体１アミノ酸配列を、当該分野で周知の種々の融合タンパク質パートナー（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ化融合タンパク質およびＨＩＳタグ化融合タンパク質）のいずれか１つに、組換えＤＮＡ技術を使用して融合し得る。そのような融合タンパク質を、適切なアフィニティーマトリックスを使用して誘導した細菌から精製する。
【０３６４】
１つの実施形態において、第２の推定細胞外ループを含むアミノ酸２５０〜２８２をコードするＧＳＴ−融合タンパク質を、生成し、精製し、そして免疫原として使用する。使用し得る他の組換え細菌融合タンパク質としては、マルトース結合タンパク質、ＬａｃＺ、チオレドキシン、ＮｕｓＡ、または免疫グロブリン定常領域が挙げられる（標題「原核生物系における８Ｐ１Ｄ４の生成」の節、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｕｎｉｔ １６，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｂｒａｄｙ，Ｗ．，Ｕｒｎｅｓ，Ｍ．，Ｇｒｏｓｍａｉｒｅ，Ｌ．，Ｄａｍｌｅ，Ｎ．，およびＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｌ．（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，５６１〜５６６を参照のこと）。
【０３６５】
細菌由来融合タンパク質に加えて、哺乳動物により発現されるタンパク質抗原もまた、使用する。これらの抗原を、哺乳動物発現ベクター（例えば、Ｔａｇ５融合ベクターおよびＦｃ融合ベクター）から発現させる（実施例の標題「真核生物系における組換え８Ｐ１Ｄ４の生成」の節を参照のこと）。これらの抗原は、ネイティブタンパク質で見出される翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を保持する。１つの実施形態において、改変体１の推定細胞外ループ（アミノ酸１８５〜２１８）を、Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングする。その組換えタンパク質を、その組換えベクターを安定に発現する２９３Ｔ細胞の組織培養上清から、金属キレートクロマトグラフィーによって精製する。その後、精製Ｔａｇ５ ８Ｐ１Ｄ４タンパク質を、免疫原として使用する。
【０３６６】
この免疫プロトコルの間、宿主動物の免疫応答を増強するアジュバント中に抗原を混合または乳濁することが、有用である。アジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）およびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６７】
代表的プロトコルにおいて、ウサギに、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に混合した、ＫＬＨに結合体化した融合タンパク質または融合ペプチド２００μｇまで（代表的には、１００〜２００μｇ）を、まず皮下免疫する。その後、ウサギに、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中の２００μｇまで（代表的には、１００〜２００μｇ）の免疫原を、２週間ごとに皮下注射する。各免疫の約７〜１０日後に、試験採血を行い、そしてＥＬＩＳＡにより抗血清の力価をモニターするために使用する。
【０３６８】
免疫血清（例えば、改変体３のアミノ酸２５０〜２８２をコードするＫＬＨ結合体化ペプチドでの免疫により得られたウサギ血清）の反応性および特異性を試験するために、全長８Ｐ１Ｄ４改変体１ｃＤＮＡを、ｐＣＤＮＡ３．１ｍｙｃ−ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；実施例の標題「真核生物系における組換え８Ｐ１Ｄ４の生成」を参照のこと）中にクローニングする。２９３Ｔ細胞中にその構築物をトランスフェクションした後、細胞溶解物を、抗８Ｐ１Ｄ４血清および抗Ｈｉｓ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でプローブし、ウェスタンブロット技術を使用して変性８Ｐ１Ｄ４タンパク質に対する特異的反応性を決定する。２９３Ｔ−８Ｐ１Ｄ４細胞に対するウェスタンブロット技術により、その免疫血清を試験する。さらに、２９３Ｔ細胞および他の組換え８Ｐ１Ｄ４発現細胞に対する蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーおよび免疫沈降により、免疫血清を試験して、ネイティブタンパク質の特異的認識を決定する。８Ｐ１Ｄ４を内因的に発現する細胞を使用したウェスタンブロット技術、免疫沈降技術、蛍光顕微鏡技術、およびフローサイトメトリー技術もまた行って、反応性および特異性を試験する。
【０３６９】
８Ｐ１Ｄ４改変体融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合タンパク質およびＭＢＰ融合タンパク質）で免疫したウサギに由来する抗血清を、融合パートナーを単独でかまたは無関係な融合タンパク質のいずれかの状況で含むアフィニティーカラムに通すことにより、融合パートナー配列に対して反応性である抗体を除去することによって精製する。例えば、８Ｐ１Ｄ４改変体３のアミノ酸２５０〜２８２をコードするＧＳＴ−８Ｐ１Ｄ４融合タンパク質から誘導された抗血清を、最初に、ＡｆｆｉＧｅｌマトリックス（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ）に共有結合したＧＳＴタンパク質のカラムに通すことによって、精製する。次いで、その抗血清を、ＡｆｆｉＧｅｌマトリクスに共有結合させた、アミノ酸２５０〜２８２もまたコードする、ＭＢＰ融合タンパク質から構成されるカラムを通過させることによって、アフィニティー精製する。その後、その血清を、プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製して、ＩｇＧ画分を単離する。他のＨｉｓタグ化抗原およびＨｉｓタグ化ペプチドで免疫したウサギ由来の血清、ならびに融合パートナー除去血清を、もとのタンパク質免疫原または遊離ペプチドから構成されるカラムマトリックスを通すことによってアフィニティー精製する。
【０３７０】
（実施例１１：８Ｐ１Ｄ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成）
１つの実施形態において、８Ｐ１Ｄ４改変体に対する治療的ｍＡｂは、各改変体タンパク質に対して特異的であるエピトープと反応するｍＡｂを含むか、または８Ｐ１Ｄ４改変体の生物学的機能を破壊するかもしくは調整する改変体の間で共通する配列に対して特異的であるｍＡｂ（例えば、リガンドおよび基質との相互作用を破壊するかまたは８Ｐ１Ｄ４改変体の生物学的活性を破壊するｍＡｂ）を含む。そのようなｍＡｂの生成のための免疫原としては、８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体配列全体、アミノ酸配列のコンピューター分析から抗原性であると推定される８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体の領域をコードするかもしくは含むように設計された免疫原が挙げられる（例えば、図５、図６、図７、図８、または図９、ならびに「抗原性プロフィール」と題する実施例を参照のこと）。免疫原としては、ペプチド、組換え細菌タンパク質、ならびに哺乳動物に発現されるＴａｇ５タンパク質、ならびにヒトＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質およびマウスＩｇＧ Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。さらに、高レベルの各々の８Ｐ１Ｄ４改変体を発現するように操作された細胞（例えば、２９３Ｔ−８Ｐ１Ｄ４改変体１または３００．１９−８Ｐ１Ｄ４改変体１マウスＰｒｅ−Ｂ細胞）を使用して、マウスを免疫する。
【０３７１】
８Ｐ１Ｄ４改変体に対するｍＡｂを生成するために、マウスを、代表的には、完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原または１０７個の８Ｐ１Ｄ４発現細胞で、まず腹腔内（ＩＰ）免疫する。その後、マウスを、代表的には、不完全フロイントアジュバント中に混合した１０〜５０μｇのタンパク質免疫原または１０７個の細胞で、２〜４週間ごとにＩＰ免疫する。あるいは、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバントを、免疫に使用する。上記のタンパク質ベースの免疫ストラテジーおよび細胞ベースの免疫ストラテジーに加えて、８Ｐ１Ｄ４改変体配列をコードする哺乳動物発現ベクターを使用してプラスミドＤＮＡの直接注射によりマウスを免疫する、ＤＮＡベースの免疫プロトコルを使用する。例えば、アミノ酸１８５〜２１８を、Ｔａｇ５哺乳動物分泌ベクター中にクローニングし、そしてその組換えベクターを免疫原として使用する。別の例において、同じアミノ酸を、Ｆｃ−融合分泌ベクター中にクローニングし、そのベクターにおいて、８Ｐ１Ｄ４改変体１配列がアミノ末端でＩｇＫリーダー配列に融合しており、カルボキシ末端でヒトまたはマウスのＩｇＧ Ｆｃ領域コード配列に融合している。その後、この組換えベクターを免疫原として使用する。プラスミド免疫プロトコルを、同じベクターから発現された精製タンパク質と、それぞれの８Ｐ１Ｄ４改変体を発現する細胞と組み合わせて、使用する。
【０３７２】
その免疫プロトコルの間に、試験採血を、注射の７〜１０日後に行って、その免疫応答の力価および特異性をモニターする。一旦適切な反応性および特異性を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリー分析により決定されるように得ると、その後、融合物およびハイブリドーマの生成を、当該分野で周知の確立された手順（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８を参照のこと）を用いて実行する。
【０３７３】
８Ｐ１Ｄ４改変体３特異的モノクローナル抗体を生成するための１つの実施形態において、アミノ酸２５０〜２８２をコードするＧＳＴ−８Ｐ１Ｄ４改変体３抗原を、発現させ、そして細菌から精製する。ＢａｌｂＨＣマウスを、最初に、完全フロイントアジュバント中に混合した２５μｇのＧＳＴ−８Ｐ１Ｄ４改変体３タンパク質で腹腔内免疫する。その後、マウスを、合計３回の免疫について、不完全フロイントアジュバント中に混合した２５μｇの抗原で２週間ごとに免疫する。アミノ酸２５０〜２８２をコードするＭＢＰ融合タンパク質を使用するＥＬＩＳＡによって、免疫したマウス由来の血清の力価を決定する。全長８Ｐ１Ｄ４改変体３タンパク質に対する血清の反応性および特異性を、８Ｐ１Ｄ４改変体３ ｃＤＮＡをコードする発現ベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用して、改変体１および２のｃＤＮＡでトランスフェクトした細胞と比較して、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、およびフローサイトメトリーによってモニターする（例えば、「真核生物系における組換え８Ｐ１Ｄ４の生成」と題する実施例を参照のこと）。他の組換え８Ｐ１Ｄ４改変体３発現細胞または８Ｐ１Ｄ４改変体３を内因性発現する細胞もまた、使用する。８Ｐ１Ｄ４改変体３に対して最強の特異的反応性を示すマウスを、休息させ、そしてＰＢＳ中にあるＧＳＴ抗原で最終注射し、そして４日後に屠殺した。屠殺したマウスの脾臓を採取し、そして標準的手順（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）を使用してＳＰＯ／２ミエローマ細胞に融合させた。ＨＡＴ選択した増殖ウェル由来の上清を、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、蛍光顕微鏡、およびフローサイトメトリーによってスクリーニングして、８Ｐ１Ｄ４特異的抗体産生クローンを同定する。８Ｐ１Ｄ４モノクローナル抗体の結合親和性を、標準的技術を使用して決定する。親和性測定によって、エピトープ結合に対する抗体の強度を定量し、親和性測定を使用して、どの８Ｐ１Ｄ４モノクローナル抗体が、当業者により認識されるような診断用途または治療用途のために好ましいかを規定するのを補助する。ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）は、結合親和性を決定するために好ましい方法である。このＢＩＡｃｏｒｅシステムは、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ，Ｗｅｌｆｏｒｄ Ｋ．１９９１，Ｏｐｔ．Ｑｕａｎｔ．Ｅｌｅｃｔ．２３：１；ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２９５：２６８）を使用して、リアルタイムで生体分子相互作用をモニターする。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数、および親和性定数を簡便に生じる。
【０３７４】
（実施例１２：ＨＬＡクラスＩ結合アッセイおよびＨＬＡクラスＩＩ結合アッセイ）
精製ＨＬＡ分子を使用するＨＬＡクラスＩ結合アッセイおよびＨＬＡクラスＩＩ結合アッセイを、開示されたプロトコル（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４））に従って、実施する。簡単に述べると、精製ＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を、種々の非標識ペプチドインヒビターおよび１〜１０ｎＭの記載されるような１２５Ｉ放射標識プローブペプチドとともにインキュベートする。インキュベーション後、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、ゲル濾過により遊離ペプチドから分離し、そして結合ペプチドの画分を、測定する。代表的には、予備実験において、各ＭＨＣ調製物を、一定量の放射標識ペプチドの存在下で力価決定して、全放射能のうちの１０〜２０％を結合するのに必要なＨＬＡ分子の濃度を決定する。その後のすべての阻害アッセイおよび直接結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度を使用して実施する。
【０３７５】
これらの条件下では［標識］＜［ＨＬＡ］かつＩＣ５０≧［ＨＬＡ］であるので、測定したＩＣ５０値は、真のＫＤ値の妥当な近似である。ペプチドインヒビターを、代表的には、１２０μｇ／ｍｌ〜１．２ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で試験し、そして完全に独立した２つ〜４つの実験において試験する。異なる実験において得られたデータの比較を可能にするために、相対的結合数を、各ペプチドについて計算する。この計算は、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０を、試験した各ペプチド（代表的には、放射標識プローブペプチドの非標識バージョン）についてのＩＣ５０で除算することによる。データベース目的のため、および実験間比較のために、相対的結合値を集計する。これらの値を、その後、ＩＣ５０ｎＭ値へと変換して戻し得る。この変換は、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０ｎＭを、目的のペプチドの相対的結合によって除算することによる。このデータ集計方法は、正確であり、そして異なる日に試験したペプチドまたは異なるロットの精製ＭＨＣを用いて試験したペプチドを比較することについて、一貫性がある。
【０３７６】
上記に概略したような結合アッセイを使用して、ＨＬＡスーパーモチーフ保有ペプチドおよび／またはＨＬＡモチーフ保有ペプチドを分析し得る（表ＩＶを参照のこと）。
【０３７７】
（実施例１３：ＨＬＡスーパーモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープおよびＨＬＡモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープの同定）
本発明のＨＬＡワクチン組成物は、複数エピトープを含み得る。その複数エピトープは、広範な集団適用範囲を達成するために、複数のＨＬＡスーパーモチーフまたはＨＬＡモチーフを含み得る。本実施例は、そのようなワクチン組成物中に含めるための、スーパーモチーフ保有エピトープおよびモチーフ保有エピトープの同定および確認を示す。集団適用範囲の計算を、下記のストラテジーを使用して実施する。
【０３７８】
（スーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープの同定のためのコンピューター検索およびアルゴリズム）
「抗原性プロフィール」と題する実施例および表Ｖ〜ＸＶＩＩＩおよびＸＸＩＩ〜ＬＩにおいてモチーフ保有ペプチド配列を同定するために実施された検索は、図２および図３に示されるＳＴＥＡＰ−１の遺伝子産物からのタンパク質配列データを使用する；表を作成するために使用した特定のペプチドを、表ＬＸＩに列挙する。
【０３７９】
ＨＬＡクラスＩスーパーモチーフもしくはＨＬＡクラスＩモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフもしくはＨＬＡクラスＩＩモチーフを保有するエピトープについてのコンピューター検索を、以下のように実施する。翻訳されるすべてのＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列を、文字列検索ソフトウェアプログラムを使用して分析して、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む可能性なペプチド配列を同定する；そのようなプログラムを、公知のモチーフ／スーパーモチーフの開示を考慮して、当該分野における情報に従って容易に作成する。さらに、そのような計算は、頭でなし得る。
【０３８０】
同定したＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列、およびＤＲスーパーモチーフ配列を、多項アルゴリズムを使用してスコア付けして、それらのモチーフが、特定のＨＬＡ−クラスＩ分子またはＨＬＡ−クラスＩＩ分子に結合する能力を推測する。これらの多項アルゴリズムは、種々の位置にある異なるアミノ酸の影響を考慮する。これらの多項アルゴリズムは、ペプチド−ＨＬＡ分子相互作用の全親和性（すなわちΔＧ）は、
「ΔＧ」＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．×ａｎｉ
の型の線形多項関数として近似され得るという仮定に本質的に基づき、ここで、ａｊｉは、ｎアミノ酸のペプチド配列に沿って所定の位置（ｉ）にある所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を示す係数である。この方法の重大な仮定は、各位置での効果は、互いに本質的に独立している（すなわち、個々の側鎖の独立した結合である）ということである。残基ｊが、そのペプチド中の位置ｉに存在する場合、そのペプチドの残りの配列とは関係なく、そのペプチドの結合の自由エネルギーに一定量ｊｉを付与すると仮定する。
【０３８１】
特定のアルゴリズム係数の誘導方法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８〜１２６，１９９７に記載されている（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９〜９３，１９９６；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３〜３３７３，１９９８もまた参照のこと）。簡単に述べると、すべてのｉ位置について、アンカーおよび非アンカーを問わず、ｊを保有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の相乗平均を、その群の残りに対して計算し、そしてｊｉの推定値として使用する。クラスＩＩペプチドについて、多重アライメントが可能である場合、反復手順に従って、最高スコアリングアライメントのみを利用する。試験セット中の所定のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するＡＲＢ値を乗算する。その積が、選択した閾値を超える場合、そのペプチドは結合すると推定される。適切な閾値を、望ましい推定のストリンジェンシーの程度の関数として選択する。
【０３８２】
（ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択）
ＳＴＥＡＰ−１由来のタンパク質配列を、モチーフ同定ソフトウェアを利用してスキャンして、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ主要アンカー特異性を含む、８マー配列、９マー配列、１０マー配列、および１１マー配列を同定する。代表的には、その後、これらの配列を、上記のプロトコルを使用してスコア付けし、そして正のスコアを持つ配列に対応するペプチドを合成し、インビトロで、精製ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子に結合する能力について試験する（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１は、プロトタイプＡ２スーパータイプ分子とみなされる）。
【０３８３】
その後、これらのペプチドを、さらなるＡ２スーパータイプ分子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６、およびＡ＊６８０２）に結合する能力について試験する。試験した５つのＡ２スーパータイプ対立遺伝子のうちの少なくとも３つに結合するペプチドを、代表的には、Ａ２スーパータイプ交差反応性結合剤と見なす。好ましいペプチドは、３つ以上のＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ分子に５００ｎＭ以下の親和性で結合する。
【０３８４】
（ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
上記でスキャンしたＳＴＥＡＰ−１タンパク質配列を、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ主要アンカーを含むペプチドの存在についても試験する。その後、ＨＬＡＨＡ３スーパーモチーフ保有配列に対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ａ＊０３０１分子およびＨＬＡ−Ａ＊１１０１分子（最も優勢の２つのＡ３スーパータイプ対立遺伝子によりコードされる分子）への結合について試験する。その後、≦５００ｎＭ、しばしば≦２００ｎＭの結合親和性を有するその２つの対立遺伝子のうちの少なくとも１つに結合するペプチドを、他の一般的なＡ３スーパータイプ対立遺伝子（例えば、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１）に対する結合交差反応性について試験して、試験した５つのＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ分子のうちの少なくとも３つを結合し得る分子を同定する。
【０３８５】
（ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択）
上記でスキャンしたＳＴＥＡＰ−１タンパク質を、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを含む、８マーペプチド、９マーペプチド、１０マーペプチド、または１１マーペプチドの存在についても分析する。対応するペプチドを合成し、そしてＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（最も一般的なＢ７スーパータイプ対立遺伝子（すなわち、プロトタイプＢ７スーパータイプ対立遺伝子）によりコードされる分子）への結合について試験する。ＩＣ５０≦５００ｎＭでＢ＊０７０２を結合するペプチドを、標準的方法を使用して同定する。その後、これらのペプチドを、他の一般的なＢ７スーパータイプ分子（例えば、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５３０１およびＢ＊５４０１）への結合について試験する。それによって、試験した５つのＢ７スーパータイプ対立遺伝子のうちの３つ以上に結合し得るペプチドを、同定する。
【０３８６】
（Ａ１モチーフ保有エピトープおよびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択）
集団適用範囲をさらに増大するために、ＨＬＡ−Ａ１エピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４エピトープもまた、ワクチン組成物中に組み込まれ得る。ＳＴＥＡＰ−１タンパク質の分析もまた、ＨＬＡ−Ａ１モチーフ含有配列およびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ含有配列を同定するために実施し得る。
【０３８７】
他のモチーフおよび／またはスーパーモチーフを保有する、高親和性結合エピトープおよび／または交差反応性結合エピトープを、同様の方法論を使用して同定する。
【０３８８】
（実施例１４：免疫原性の確認）
本明細書中に記載されるように同定される交差反応性候補ＣＴＬ Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを、インビトロでの免疫原性を確認するために選択する。以下の方法論を使用して確認を実施する。
【０３８９】
（細胞スクリーニングのための標的細胞株）
ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子をＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃヌル変異体ヒトＢリンパ芽球細胞株である７２１．２２１に移入することによって生成した．２２１Ａ２．１細胞株を、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束ＣＴＬの活性を測定するためのペプチド負荷標的として使用する。この細胞株を、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、および１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させる。目的の抗原を発現する細胞、または目的の抗原をコードする遺伝子を含むトランスフェクタントを、ペプチド特異的ＣＴＬが内因性抗原を認識する能力を確認するための標的細胞として使用し得る。
【０３９０】
（一次ＣＴＬ誘導培養）
（樹状細胞（ＤＣ）の産生） ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ中で解凍し、完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０＋５％ ＡＢヒト血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン）で２回洗浄し、この完全培地中に再懸濁する。その単球を、６ウェルプレート中に１０×１０６ＰＢＭＣ／ウェルでプレートすることによって精製する。３７℃にて２時間後、そのプレートを穏やかに振盪し、その上清を吸引することによって、非接着細胞を除去する。ウェルを、３ｍｌのＲＰＭＩで合計３回洗浄して、非接着細胞および緩く接着する細胞のほとんどを除去する。その後、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含む３ｍｌの完全培地を、各ウェルに添加する。６日目に、７５ｎｇ／ｍｌにてＴＮＦαを、ＤＣに添加し、７日目に、その細胞を、ＣＴＬ誘導培養に使用する。
【０３９１】
（ＤＣおよびペプチドを用いてのＣＴＬの誘導） ＣＤ８＋Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｌ免疫磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０）およびｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬を用いるポジティブ選択によって単離する。代表的には、約２００×１０６個〜２５０×１０６個のＰＢＭＣを、２４×１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞（４８ウェルプレート培養のために十分である）を得るために処理する。簡単に述べると、ＰＢＭＣを、３０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅを含むＲＰＭＩ中で解凍し、そして１％ヒトＡＢ血清を含むＰＢＳで１回洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＡＢ血清中に、濃度２０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁する。磁気ビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ血清を用いて３回洗浄し、細胞に添加（１４０μｌビーズ／２０×１０６細胞）し、そして継続して混合しながら４℃で１時間インキュベートする。そのビーズおよび細胞を、ＰＢＳ／ＡＢ血清を用いて４回洗浄して、非接着細胞を除去し、そして１００μｌ／ｍｌ ｄｅｔａｃｈａ−ｂｅａｄ（登録商標）試薬および３０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅを含むＰＢＳ／ＡＢ血清中に、１００×１０６細胞／ｍｌ（もとの細胞数に基く）で再懸濁する。その混合物を、継続して混合しながら室温にて１時間インキュベートする。そのビーズを、ＰＢＳ／ＡＢ／ＤＮａｓｅで再び洗浄し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を収集する。ＤＣを収集し、そして１３００ｒｐｍにて５〜７分間遠心分離し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、計数し、そして３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下で、２０℃で４時間、細胞濃度１×１０６〜２×１０６／ｍｌで、４０μｇ／ｍｌのペプチドを用いてパルスする。その後、そのＤＣに照射（４，２００ｒａｄ）し、培地で１回洗浄し、そして再び計数する。
【０３９２】
（誘導培養の設定） ０．２５ｍｌのサイトカイン産生ＤＣ（１×１０５細胞／ｍｌ）を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７の存在下で、４８ウェルプレートの各ウェル中で０．２５ｍｌのＣＤ８＋Ｔ細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）とともに共培養する。翌日、組換えヒトＩＬ−１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、４８時間後に、ｒヒトＩＬ−２を、１０ＩＵ／ｍｌで添加する。
【０３９３】
（ペプチドでパルスした接着細胞を用いる、誘導培養物の再刺激） 一次誘導の７日後および１４日後に、その細胞を、ペプチドでパルスした接着細胞を用いて再刺激する。そのＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩおよびＤＮａｓｅで２回洗浄する。その細胞を、５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、そして約４２００ｒａｄで照射する。ＰＢＭＣを、１ウェルあたりの０．５ｍｌ完全培地中に２×１０６にてプレートし、３７℃で２時間インキュベートする。そのプレートを穏やかにタッピングすることによってＲＰＭＩで２回洗浄して非接着細胞を除去し、１ウェル当たり０．２５ｍｌのＲＰＭＩ／５％ＡＢ中の３μｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリンの存在下で１０μｇ／ｍｌのペプチドで接着細胞を３７℃で２時間パルスする。各ウェルからペプチド溶液を吸引し、そのウェルを、ＲＰＭＩで１回洗浄する。その培地のほとんどを、誘導培養物（ＣＤ８＋細胞）から吸引し、そして新鮮な培地で０．５ｍｌにする。その後、その細胞を、ペプチドでパルスした接着細胞を含むウェルへと移す。２４時間後に、組換えヒトＩＬ−１０を、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌで添加し、そして翌日および２〜３日後に再度、組換えヒトＩＬ２を５０ＩＵ／ｍｌで添加する（Ｔｓａｉら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８（１〜２）：６５〜７５，１９９８）。７日後に、その培養物を、５１Ｃｒ放出アッセイにおいてＣＴＬ活性についてアッセイする。いくつかの実験において、その培養物を、２回目の再刺激の際にインサイチュＩＦＮγ ＥＬＩＳＡにおいてペプチド特異的認識についてアッセイし、７日後に、内因的認識のアッセイを行う。増殖後、並列比較のために両方のアッセイにおいて活性を測定する。
【０３９４】
（５１Ｃｒ放出によるＣＴＬ溶解活性の測定）
２回目の再刺激の７日後、単一のＥ：Ｔにて個々のウェルをアッセイすることによって、標準的（５時間）５１Ｃｒ放出アッセイにおいて細胞傷害性を測定する。細胞を１０μｇ／ｍｌペプチドとともに３７℃で一晩インキュベートすることによって、ペプチドでパルスした標的を調製する。
【０３９５】
接着標的細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養フラスコから除去する。標的細胞を、２００μＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｄｕｐｏｎｔ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を用いて３７℃で１時間標識する。標識した標的細胞を、１ｍｌあたり１０６で再懸濁し、Ｋ５６２細胞（非特異的溶解を減少するために使用されるＮＫ感受性赤芽球腫細胞株）を用いて濃度３．３×１０６／ｍｌで１：１０希釈する。標的細胞（１００μｌ）およびエフェクター（１００μｌ）を、９６ウェル丸底プレート中にプレートし、そして３７℃で５時間インキュベートする。その時、１００μｌの上清を各ウェルから収集し、そして式：
［試験サンプルのｃｐｍ−自然発生５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）／（最大５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ−自然発生５１Ｃｒ放出サンプルのｃｐｍ）］×１００
に従って、溶解パーセントを決定する。
【０３９６】
最大放出および自然発生放出を、それぞれ、標識標的を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および培地単独とともにインキュベートすることによって、決定する。特異性溶解（サンプル−バックグラウンド）が個々のウェルの場合１０％以上であり、増殖した培養物をアッセイする場合には最高の２つのＥ：Ｔ比にて１５％以上である培養物として、ポジティブ培養物を規定する。
【０３９７】
（ペプチド特異的および内因性認識の指標としてのヒトＩＦＮγ生成のインサイチュ測定）
ＩｍｍｕｌｏｎＨ２プレートを、マウス抗ヒトＩＦＮγモノクローナル抗体（４μｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２）を使用して、４℃にて一晩コーティングする。このプレートをＣａ２＋、Ｍｇ２＋非含有ＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＰＢＳ／１０％ ＦＣＳを使用して２時間ブロッキングし、その後、ＣＴＬ（１００μｌ／ウェル）および標的（１００μｌ／ウェル）を各ウェルに添加する（標準物質およびブランクのためのウェルは、培地のみを入れ、空にしておく）。標的細胞（ペプチドパルス標的または内因性標的いずれか）を１×１０６細胞／ｍｌの濃度にて使用する。プレートを、５％ ＣＯ２により３７℃にて４８時間インキュベートする。
【０３９８】
組換えヒトＩＦＮ−γを、４００ｐｇまたは１２００ｐｇ／１００μｌ／ウェルにて開始した標準ウェルに添加し、プレートを３７℃にて２時間インキュベートする。プレートを洗浄し、１００μｌのビオチン化マウス抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ＰＢＳ／３％ＦＣＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に２μｇ／ｍｌ）を添加し、室温にて２時間インキュベートする。再び洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：４０００）を添加し、プレートを室温にて１時間インキュベートする。次いで、このプレートを洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μｌ／ウェルの発色溶液（ＴＭＢ １：１）を添加し、プレートを５〜１５分間、発色させる。５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ３ＰＯ４を使用して反応を停止し、ＯＤ４５０にて読み取る。バックグラウンドを超える、少なくとも５０ｐｇのＩＦＮ−γ／ウェルにて測定されかつ発現のバックグラウンドレベルの２倍である場合、培養物をポジティブとみなす。
【０３９９】
（ＣＴＬ発現）
ペプチドパルスした標的および／または腫瘍標的に対する特異的溶解活性を示す培養物を、抗ＣＤ３とともに２週間にわたり増殖させる。簡潔には、５×１０４ ＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する：ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２５μＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含有する）中、１×１０６照射（４，２００ｒａｄ）ＰＢＭＣ（自己または同種異系）／ｍｌ、２×１０５照射（８，０００ｒａｄ）ＥＢＶ形質転換細胞／ｍｌ、および３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（抗ＣＤ３）。組換えヒトＩＬ２を２００ＩＵ／ｍｌの最終濃度にて２４時間後に添加し、その後３日間毎に、５０ＩＵ／ｍｌにて新たな培地を加える。細胞濃度が１×１０６／ｍｌを超えたら細胞を分け、培養物を、５１Ｃｒ放出アッセイにて３０：１、１０：１、３：１および１：１のＥ：Ｔ比で１３日目と１５日目との間にアッセイするか、または増殖前と同じ標的を使用してインサイチュＩＦＮγアッセイにて１×１０６／ｍｌでアッセイする。
【０４００】
培養物を、以下の通り、抗ＣＤ３＋の非存在下で増殖させる。ペプチドおよび内因性標的に対する特異的溶解活性を示す培養物を選択し、５×１０４ ＣＤ８＋細胞を、以下を含むＴ２５フラスコに添加する：ＲＰＭＩ−１６４０（１０％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清、非必須ＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、２５ｍＭ ２−ＭＥ、Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを含有する）１ｍｌあたり中、１×１０６自己ＰＢＭＣ／ｍｌ（１０μｇ／ｍｌペプチドを用いて３７℃にて２時間ペプチドパルスし、そして照射（４，２００ｒａｄ）した）；２×１０５照射（８，０００ｒａｄ）ＥＢＶ形質転換細胞／ｍｌ。
【０４０１】
（Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの免疫原性）
Ａ２スーパーモチーフ交差反応性結合ペプチドを、正常個体におけるペプチド特異的ＣＴＬを誘導する能力について細胞アッセイにて試験する。この分析において、ペプチドは、代表的には、少なくとも個体におけるペプチド特異的ＣＴＬを誘導し、好ましくは、内因的に発現されたペプチドもまた認識する場合、エピトープであるとみなされる。
【０４０２】
ＳＴＥＡＰ−１を発現する腫瘍を保有する患者から単離されたＰＢＭＣを使用して、免疫原性もまた確認し得る。簡潔には、ＰＢＭＣを患者から単離し、ペプチドパルスした単球を用いて再刺激し、ペプチドパルスした標的細胞および抗原を内因的に発現するトランスフェクト細胞を認識する能力についてアッセイする。
【０４０３】
（Ａ＊０３／Ａ１１免疫原性の評価）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有交差反応性結合ペプチドもまた、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドの免疫原性を評価するために使用される方法論と同様の方法論を使用して、免疫原性について評価する。
【０４０４】
（Ｂ７免疫原性の評価）
本明細書中で示されるように同定されたＢ７スーパータイプ交差反応性結合ペプチドの免疫原性スクリーニングを、Ａ２スーパーファミリー保有ペプチドおよびＡ３スーパーファミリー保有ペプチドの確認と同様の様式で確認する。
【０４０５】
他のスーパーモチーフ／モチーフ（例えば、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２４など）を保有するペプチドもまた、同様の方法論を使用して確認する。
【０４０６】
（実施例１５：アナログを作製することによるネイティブエピトープの結合能力を改善するための拡張スーパーモチーフの実施）
ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフ（一次残基および／または二次残基を含む）は、本明細書中に実証されるように、高度に交差反応性のネイティブペプチドの同定および調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフの規定はまた、ネイティブペプチド配列内の残基を同定することにより高度に交差反応性のエピトープを操作することを可能にする。このネイティブペプチド配列は、ペプチドに特定の特性（例えば、スーパータイプを含むＨＬＡ分子の群内のより大きな交差反応性および／またはそれらのＨＬＡ分子のいくつかもしくは全てに対するより大きな結合親和性）を付与するためにアナログ化され得る（ａｎａｌｏｇｅｄ）。調節された結合親和性を示すアナログ化ペプチドの例は、本実施例に示される。
【０４０７】
（一次アンカー残基でのアナログ化）
ペプチド操作ストラテジーを、エピトープの交差反応性をさらに増大させるために実施する。例えば、Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドの主要アンカーを、例えば、好ましくは、２位にＬ、Ｉ、ＶまたはＭ、およびＣ末端にＩまたはＶを導入するために改変する。
【０４０８】
アナログペプチドの交差反応性を分析するために、各操作アナログを、最初に、プロトタイプＡ２スーパータイプ対立遺伝子Ａ＊０２０１に対する結合について、次いで、Ａ＊０２０１結合能力が維持されていれば、Ａ２スーパータイプ交差反応性について試験する。
【０４０９】
あるいは、ペプチドを、１つまたは全てのスーパータイプメンバーを結合すると確認し、次いで、スーパータイプメンバーのいずれか１つ（または１以上）に対する結合親和性を調節するためにアナログ化して、集団適用範囲を付加する。
【０４１０】
細胞スクリーニング分析における免疫原性についてのアナログの選択は、代表的には、親野生型（ＷＴ）ペプチドが、３以上のＡ２スーパータイプ対立遺伝子に少なくとも弱く結合する（すなわち、５０００ｎＭ以下のＩＣ５０にて結合する）能力によりさらに制限される。この要件についての原理は、ＷＴペプチドが生物学的に妥当な十分な量にて内因的に存在しなければならないということである。アナログ化ペプチドは、親エピトープに特異的なＴ細胞による増大した免疫原性および交差反応性を有することが示された（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９，１９９６；およびＰｏｇｕｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：８１６６，１９９５を参照のこと）。
【０４１１】
これらのペプチドアナログの細胞スクリーニングにおいて、アナログ特異的ＣＴＬもまた、野生型ペプチド、および可能である場合は、このエピトープを内因的に発現する標的細胞を認識することが可能であることを確認することが重要である。
【０４１２】
（ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７のスーパーモチーフを保有するペプチドのアナログ化）
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープのアナログは、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドのアナログ化において使用されるストラテジーと同様のストラテジーを使用して生成される。例えば、Ａ３スーパータイプ分子の３／５に結合するペプチドは、２位に好ましい残基（Ｖ、Ｓ、ＭまたはＡ）を保有するように一次アンカー残基にて操作される。
【０４１３】
次いで、このアナログペプチドは、Ａ＊０３およびＡ＊１１（プロトタイプＡ３スーパータイプ対立遺伝子）を結合する能力について試験される。次いで、≦５００ｎＭの結合能を示すペプチドは、Ａ３スーパータイプ交差反応性を有すると確認される。
【０４１４】
Ａ２モチーフ保有ペプチドおよびＡ３モチーフ保有ペプチドと同様に、３以上のＢ７スーパータイプ対立遺伝子を結合するペプチドを改善して、可能な場合、増大した交差反応結合性またはより大きな結合親和性もしくは結合半減期を達成し得る。Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドは、Ｓｉｄｎｅｙら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０，１９９６）に示されるように、例えば、Ｃ末端一次アンカー位置にて好ましい残基（Ｖ、Ｉ、ＬまたはＦ）を有するように操作される。
【０４１５】
他のモチーフおよび／またはスーパーモチーフ保有エピトープの一次アンカー残基でのアナログ化は、同様の様式で実施される。
【０４１６】
次いで、アナログペプチドは、代表的には、細胞スクリーニングアッセイにおいて免疫原性について確認される。繰り返すと、アナログ特異的ＣＴＬもまた、野生型ペプチド、および可能な場合、このエピトープを内因的に発現する標的を認識することが可能であることを実証することが一般に重要である。
【０４１７】
（二次アンカー残基でのアナログ化）
さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、高度に交差反応性のペプチドおよび／または増大した親和性でＨＬＡ分子を結合するペプチドを、このような特性と関連する二次アンカー位置にて特定の残基を同定することにより、操作することにおいて価値がある。例えば、１位にＦ残基を有するＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドの結合能力を分析する。次いで、このペプチドを、例えば、１位のＦをＬで置換するようにアナログ化する。このアナログ化ペプチドを、増大した結合親和性、結合半減期および／または増大した交差反応性について評価する。このような手順は、増強した特性を有するアナログ化ペプチドを同定する。
【０４１８】
十分に改善された結合能力または交差反応性を有する操作されたアナログを、例えば、ＩＦＡ免疫またはリポペプチド免疫後に、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスにおいて免疫原性についてもまた試験し得る。アナログ化ペプチドを、ＳＴＥＡＰ−１発現腫瘍を有する患者由来のＰＢＭＣを使用してリコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を刺激する能力についてさらに試験する。
【０４１９】
（他のアナログ化ストラテジー）
ペプチドアナログ化の別の形態は、アンカー位置とは無関係に、システインを、α−アミノ酪酸で置換することを包含する。その化学的性質に起因して、システインは、ジスルフィド架橋を形成し、かつ結合能力を減少させるに十分、ペプチドを構造的に変化させる特性を有する。システインの代わりにα−アミノ酪酸での置換は、この問題を軽減するだけでなく、いくつかの場合において、結合能力および交差結合能力を改善することもまた示される（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈｅｎ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９９９による総説を参照のこと）。
【０４２０】
従って、単一アミノ酸置換の使用により、ＨＬＡスーパータイプ分子についてのペプチドリガンドの結合特性および／または交差反応性が調節され得る。
【０４２１】
（実施例１６：ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフを有するＳＴＥＡＰ−１由来配列の同定および確認）
ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩモチーフを有するペプチドエピトープは、ＨＬＡクラスＩペプチドについて記載された方法と類似の方法論を使用して、以下に概説されるように同定および確認される。
【０４２２】
（ＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープの選択）
ＳＴＥＡＰ−１由来のＨＬＡクラスＩＩ ＨＴＬエピトープを同定するために、ＳＴＥＡＰ−１抗原を、ＨＬＡ−ＤＲモチーフまたはＨＬＡ−ＤＲスーパーモチーフを保有する配列の存在について分析する。具体的には、ＤＲスーパーモチーフを含む（９マーのコアおよび３残基のＮ末端および３残基のＣ末端隣接領域を含む（計１５アミノ酸））１５マーの配列を選択する。
【０４２３】
ＤＲ分子に結合するペプチドを推定するためのプロトコルを開発した（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３，１９９８）。個々のＤＲ分子に対して特異的なこれらのプロトコルは、９マーコア領域のスコア付けおよび順位付けを可能にする。各プロトコルは、９マーコア内のＤＲスーパーモチーフ一次アンカー（すなわち、１位および６位）の存在についてペプチド配列をスコア付けするのみならず、二次アンカーの存在についての配列もさらに評価する。対立遺伝子特異的選択表（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら，同書を参照のこと）を使用して、これらのプロトコルが、特定のＤＲ分子を結合する確率が高いペプチド配列を効率的に選択することを見いだした。さらに、これらのプロトコルを連携して（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ）実施することは、具体的に、ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４、およびＤＲ７に対する実施が、ＤＲ交叉反応性ペプチドを効率的に選択し得ることを見いだした。
【０４２４】
上記で同定されたＳＴＥＡＰ−１由来ペプチドは、種々の一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子についてのそれら結合能力について試験される。全てのペプチドは、一次パネル：ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７においてＤＲ分子に対する結合について最初に試験される。次いで、これら３つのＤＲ分子のうちの少なくとも２つを結合するペプチドを、二次アッセイにおいてＤＲ２ｗ２β１、ＤＲ２ｗ２β２、ＤＲ６ｗ１９、およびＤＲ９分子に対する結合について試験する。最後に、この４つの二次パネルＤＲ分子のうちの少なくとも２つを結合するペプチド、従って、７つの異なるＤＲ分子のうちの少なくとも４つを累積的に結合するペプチドは、ＤＲ４ｗ１５、ＤＲ５ｗ１１、およびＤＲ８ｗ２分子に対する結合について三次アッセイにおいてスクリーニングされる。一次スクリーニングアッセイ、二次スクリーニングアッセイおよび三次スクリーニングアッセイを含む、この１０個のＤＲ分子のうちの少なくとも７つを結合するペプチドは、交叉反応性ＤＲ結合因子（ｂｉｎｄｅｒ）と考えられる。一般的なＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を結合することが見いだされたＳＴＥＡＰ−１由来のペプチドは、特に興味深い。
【０４２５】
（ＤＲ３モチーフペプチドの選択）
ＨＬＡ−ＤＲ３が白色人種集団、黒色人種集団およびラテンアメリカ系集団において優勢である対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能力は、ＨＴＬエピトープの選択において適切な基準である。従って、候補であることが示されたペプチドはまた、それらのＤＲ３結合能力についてアッセイされ得る。しかし、ＤＲ３モチーフの結合特異性を考慮すると、ＤＲ３に対してのみ結合するペプチドはまた、ワクチン処方物中に含めるための候補物と考えられ得る。
【０４２６】
ＤＲ３を結合するペプチドを効率的に同定するために、標的ＳＴＥＡＰ−１抗原を、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８，１９９４）により報告された２つのＤＲ３特異的結合モチーフのうちの１つを有する配列について分析する。次いで、対応するペプチドを合成し、１μＭまたはより良好な（すなわち、１μＭ未満）の親和性でＤＲ３を結合する能力を有すると確認する。この結合基準を満たし、ＨＬＡクラスＩＩ高親和性結合因子とみなされるペプチドが見いだされる。
【０４２７】
このようにして同定されるＤＲ３結合エピトープは、ＤＲスーパーモチーフ保有ペプチドエピトープとともにワクチン組成物中に含められる。
【０４２８】
ＨＬＡクラスＩモチーフ保有ペプチドの場合と同様に、クラスＩＩモチーフ保有ペプチドは、親和性または交叉反応性を改善するようにアナログ化される。例えば、９マーコア配列の４位のアスパラギン酸は、ＤＲ３結合についての最適残基であり、その残基についての置換は、しばしば、ＤＲ３結合を改善する。
【０４２９】
（実施例１７：ＳＴＥＡＰ−１由来ＨＴＬエピトープの免疫原性）
この実施例は、本明細書中で記載された方法論を使用して同定されたものの中から、免疫原性のＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよびＤＲ３モチーフ保有エピトープを決定する。
【０４３０】
ＨＴＬエピトープの免疫原性を、ＨＴＬ応答を刺激する能力を評価することにより、そして／または適切なトランスジェニックマウスモデルを使用することにより、ＣＴＬエピトープの免疫原性の決定に類似の様式にて確認する。免疫原性を、以下についてスクリーニングすることにより決定する：１．）通常ＰＢＭＣを使用するインビトロ初代誘導または２．）ＳＴＥＡＰ−１発現腫瘍を有する患者からのリコール応答。
【０４３１】
（実施例１８：集団の範囲の幅を決定するための種々の人種バックグラウンドにおけるＨＬＡスーパータイプの表現型頻度の算出）
この実施例は、複数のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを含む複数のエピトープから構成されるワクチン組成物の集団範囲の幅の評価を示す。
【０４３２】
集団範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を決定する。各ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を、二項分布式ｇｆ＝１−［ＳＱＲＴ（１−ａｆ）］を利用し、抗原または対立遺伝子頻度から計算する（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら，Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３，１９９６を参照のこと）。表現型頻度全体を得るために、累積的遺伝子頻度を計算し、累積的抗原頻度を、逆方程式（ｉｎｖｅｒｓｅ ｆｏｒｍｕｌａ）［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）２］を使用することにより導出する。
【０４３３】
頻度データがＤＮＡ型決定のレベルにて利用可能でない場合、血清学的に規定された抗原頻度に対する対応が想定される。潜在的スーパータイプ集団範囲全体を得るために、連鎖不平衡は想定されず、スーパータイプの各々に属すると確認された対立遺伝子のみが含められる（最小評価（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｔｉｍａｔｅ））。遺伝子座間の組み合わせにより達成される潜在的な範囲全体の評価を、考えられたＢ対立遺伝子により包含されると予測され得るＡに含まれない集団の割合をＡ範囲に加えることにより行う（例えば、合計＝Ａ＋Ｂ＊（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１、およびＡ＊６８０１である。Ａ３様スーパータイプは、Ａ３４、Ａ６６、およびＡ＊７４０１もまた含み得るが、これらの対立遺伝子は、頻度計算全体には含められなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリーの確認されたメンバーは、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２、およびＡ＊６９０１である。最後に、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ＊３５０１−０３、Ｂ５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１−２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１、およびＢ＊７８０１である（Ｂ＊１４０１、Ｂ＊３５０４−０６、Ｂ＊４２０１、およびＢ＊５６０２も潜在的にはメンバーである）。
【０４３４】
Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプを組み合わせることにより達成される集団範囲は、５つの主要な人種群において約８６％である。範囲は、Ａ１モチーフおよびＡ２４モチーフを保有するペプチドを含めることにより拡げられ得る。平均すると、Ａ１は、５つの異なる主要人種群（白人、北アメリカの黒人、中国人、日本人、およびラテンアメリカ系人）にまたがる集団の１２％に存在し、Ａ２４は、２９％に存在する。まとめると、これらの対立遺伝子は、これらの同じ人種集団において３９％の平均頻度に相当する。Ａ１およびＡ２４が、Ａ２スーパータイプ対立遺伝子、Ａ３スーパータイプ対立遺伝子およびＢ７スーパータイプ対立遺伝子の範囲と組み合わせられると、主要人種にまたがる合計範囲は、９５％を超える。類似のアプローチが、クラスＩＩモチーフ保有エピトープの組み合わせにより達成される集団範囲を評価するために使用され得る。
【０４３５】
ヒトにおける免疫原性研究（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３，１９９７；Ｄｏｏｌａｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：９７，１９９７；およびＴｈｒｅｌｋｅｌｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８，１９９７）は、高度に交叉反応性の結合ペプチドが、エピトープとしてほぼ常に認識されることを示した。高度に交叉反応性の結合ペプチドを使用することは、多様な集団において免疫原性であるワクチンに含めるための候補エピトープを同定することにおける重要な選択基準である。
【０４３６】
（本明細書中開示されるとおりであり、そして当該分野による）十分な数のエピトープを用いることにより、平均集団範囲は、５つの主要人種集団の各々において９５％を超えると推定される。ゲームの理論であるモンテカルロシミュレーション分析（これは、当該分野で公知である（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｍ．Ｊ．およびＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ａ．「Ａ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｇａｍｅ ｔｈｅｏｒｙ」ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ，１９９４を参照のこと））は、白人、北アメリカ黒人、日本人、中国人、およびラテンアメリカ人の人種群から構成される集団中のどの程度の百分率の個体が本明細書中に記載されるワクチンエピトープを認識するかを推定するために使用され得る。好ましい百分率は、９０％である。より好ましい百分率は、９５％である。
【０４３７】
（実施例１９：プライミング後に内因的にプロセシングされた抗原のＣＴＬ認識）
この実施例では、本明細書中で記載されるように同定され、選択されたネイティブペプチドまたはアナログ化ペプチドのエピトープにより誘導されたＣＴＬが、内因的に合成された抗原（すなわち、ネイティブ抗原）を認識することを確認する。
【０４３８】
ペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープ）で免疫したトランスジェニックマウスから単離したエフェクター細胞を、ペプチドでコーティングした刺激性因子細胞（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｃｅｌｌ）を用いてインビトロで再刺激する。６日後、エフェクター細胞を、細胞傷害性についてアッセイし、ペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株を、さらに再刺激する。さらに６日後、これらの細胞株を、ペプチドの存在下または非存在下で５１Ｃｒ標識Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ標的細胞に対する細胞傷害性活性について試験し、内因的に合成された抗原を有する５１Ｃｒ標識標的細胞（すなわち、ＳＴＥＡＰ−１発現ベクターで安定にトランスフェクトされた細胞）に対しても試験する。
【０４３９】
結果は、ペプチドエピトープでプライムされた動物から得られたＣＴＬ株が、内因的に合成されたＳＴＥＡＰ−１抗原を認識することを実証する。このような分析のために使用されるトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されるエピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスに加えて、ヒトＡ１１（これはまた、Ａ３エピトープを評価するために使用され得る）およびＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかの他のトランスジェニックマウスモデルが特徴付けられ、他（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３のマウスモデルもまた開発され、これは、ＨＴＬエピトープを評価するために使用され得る。
【０４４０】
（実施例２０：トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピトープの活性）
この実施例は、ＳＴＥＡＰ−１由来のＣＴＬおよびＨＴＬのペプチドワクチン組成物の使用により、トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を示す。本明細書中で使用されるワクチン組成物は、ＳＴＥＡＰ−１発現腫瘍を有する患者に投与されるペプチドを含む。このペプチド組成物は、複数のＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含み得る。これらのエピトープは、本明細書中に記載される方法論を用いて同定される。この実施例はまた、増強された免疫原性が、ＣＴＬワクチン組成物中に１以上のＨＴＬエピトープを含めることにより達成され得ることを示す；このようなペプチド組成物は、ＣＴＬエピトープに結合体化されたＨＴＬエピトープを含み得る。このＣＴＬエピトープは、５００ｎＭ以下の親和性にて、複数のＨＬＡファミリーメンバーに結合するエピトープまたはそのエピトープのアナログであり得る。このペプチドは、所望であれば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。
【０４４１】
免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫を、記載（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１，１９９７）のように行う。例えば、Ａ２／Ｋｂマウス（これは、ヒトＨＬＡ Ａ２．１対立遺伝子についてトランスジェニックであり、かつＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフを保有するエピトープの免疫原性を確認するために使用される）を、フロイント不完全アジュバント中、あるいはこのペプチド組成物が脂質化ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合は、ＤＭＳＯ／生理食塩水中、またはこのペプチド組成物がポリペプチドである場合はＰＢＳもしくはフロイント不完全アジュバント中で、０．１ｍｌのペプチドとともに皮下で（尾の基部）プライムする。プライムして７日後、これらの動物から得た脾細胞を、ペプチドでコーティングした同系の照射ＬＰＳ活性化リンパ芽球で再刺激する。
【０４４２】
細胞株：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂキメラ遺伝子（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７，１９９１）を使用してトランスフェクトしたＪｕｒｋａｔ細胞である。
【０４４３】
インビトロでのＣＴＬ活性化：プライムして１週間後、１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコ中にて脾臓細胞（３０×１０６細胞／フラスコ）を、３７℃にて同系の照射（３０００ｒａｄ）ペプチドコーティングリンパ芽球（１０×１０６細胞／フラスコ）とともに共存培養する。６日後、エフェクター細胞を採取し、細胞傷害性活性についてアッセイする。
【０４４４】
細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０６）を、２００μｌの５１Ｃｒの存在下で、３７℃にてインキュベートする。６０分後、細胞を３回洗浄し、Ｒ１０培地中に再懸濁する。ペプチドを、必要であれば１μｇ／ｍｌの濃度にて添加する。アッセイのために、１０４の５１Ｃｒ標識標的細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中の異なる濃度のエフェクター細胞（最終容積は２００μｌ）に添加する。３７℃にて６時間インキュベートした後、上清の０．１ｍｌのアリコートを各ウェルから取り出し、放射能を、Ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ自動ガンマカウンタにて測定する。特異的溶解％を、以下の式により決定する：％特異的放出＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。同じ条件下で行った別個のＣＴＬアッセイの間の比較を容易にするために、％５１Ｃｒ放出データを、溶解単位／１０６細胞として表す。１溶解単位は、６時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて１０，０００個の標的細胞の３０％溶解を達成するために要したエフェクター細胞の数として任意に規定される。特異的溶解単位／１０６を得るために、ペプチドの非存在下で得た溶解単位／１０６を、ペプチドの存在下で得た溶解単位／１０６から差し引く。例えば、３０％の５１Ｃｒ放出が、ペプチドの非存在下では、５０：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００個の標的に対して５×１０５個のエフェクター細胞）にて得られ、そしてペプチドの存在下では５：１（すなわち、１０，０００個の標的に対して５×１０４個のエフェクター細胞）にて得られる場合、特異的溶解単位は、以下の通りである：［（１／５０，０００）−（１／５００，０００）］×１０６＝１８ＬＵ。
【０４４５】
結果を分析して、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体ワクチン調製物を注射した動物のＣＴＬ応答の大きさを評価し、実施例標題「免疫原性の確認」において上記で解説したように、例えば、ＣＴＬエピトープを使用して達成されたＣＴＬ応答の大きさと比較する。これと類似の分析を行って、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を確認し得る。これらの手順に従って、ＣＴＬ応答が誘導され、同時に、ＨＴＬ応答がこのような組成物の投与の際に誘導されることが見いだされる。
【０４４６】
（実施例２１：ＳＴＥＡＰ−１特異的ワクチン中に含めるためのＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープの選択）
この実施例は、本発明のワクチン組成物のためのペプチドエピトープを選択するための手順を示す。この組成物中のペプチドは、ペプチドをコードする単一の配列または１以上の配列（すなわち、ミニ遺伝子）のいずれかの核酸配列の形態であり得るか、あるいは単一エピトープおよび／またはポリエピトープのペプチドであり得る。
【０４４７】
以下の原理を、ワクチン組成物中に含めるための複数のエピトープを選択する場合に利用する。以下の原理の各々を、選択を行うために釣り合わせる。
【０４４８】
投与の際に、ＳＴＥＡＰ−１クリアランスと相関する免疫応答を模倣するエピトープを選択する。使用されるエピトープの数は、自発的にＳＴＥＡＰ−１を浄化する患者の観察に依存する。例えば、自発的にＳＴＥＡＰ−１発現細胞を浄化する患者が、ＳＴＥＡＰ−１抗原由来の少なくとも３つのエピトープに対する免疫応答を生じることが観察された場合、ＨＬＡクラスＩについて３つのエピトープが含められるべきである。同様の原理が、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを決定するために使用される。
【０４４９】
しばしば、ＨＬＡクラスＩ分子については５００ｎＭ以下のＩＣ５０、もしくはクラスＩＩについては１０００ｎＭ以下のＩＣ５０という結合親和性を有するエピトープ；またはＢＩＭＡＳウェブサイト（ＵＲＬ ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からの高結合スコアを有するＨＬＡクラスＩペプチドが選択される。
【０４５０】
多様な集団全体を通じたワクチンの広い範囲を達成するために、十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイを選択して、広い集団範囲が与えられる。１つの実施形態において、エピトープは、少なくとも８０％の集団範囲を提供するように選択される。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計学的評価法）は、集団範囲の幅、すなわち重複を評価するために使用され得る。
【０４５１】
ポリエピトープ組成物、またはこれをコードするミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを含む、可能性のある最も小さなペプチドを生成することが代表的に所望される。使用される原理は、同じでないとしても、ネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用されるものと同様である。例えば、ワクチン組成物についてのタンパク質配列は、この配列が、配列内に含まれるエピトープの最大数を有する（すなわち、高濃度のエピトープを有する）ので、選択される。エピトープは、ネスト化されてもよいし、重複（すなわち、互いにフレームシフトしている）していてもよい。例えば、重複するエピトープを使用する場合、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸ペプチド中に存在し得る。各エピトープは露出され得、このようなペプチドの投与の際にＨＬＡ分子により結合される。マルチエピトープのペプチドは、合成により、組換えにより、またはネイティブの供給源からの切断により生成され得る。あるいは、このネイティブ配列からアナログが生成され得、それにより１以上のエピトープは、このポリエピトープのペプチドの交叉反応性特性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。このようなワクチン組成物は、治療目的または予防目的のために投与される。この実施形態は、免疫系の未だ発見されていない局面として、プロセシングをネイティブのネスト化された配列に適用し、それにより治療的または予防的免疫応答誘導ワクチン組成物の生成を容易にするという可能性を提供する。さらに、このような実施形態は、現在未知のＨＬＡ構造についてのモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（アナログを作製しない）は、免疫応答を、ＳＴＥＡＰ−１に実際存在する複数のペプチド配列に方向付け、従って、何らかの連結エピトープを評価する必要性が避けられる。最後に、この実施形態は、核酸ワクチン組成物を生成する際のスケールの経済性を提供する。この実施形態に関連して、コンピュータープログラムが当該分野の原理に従って導出され得、このプログラムは、標的配列において配列長さあたりのエピトープの最大数を同定する。
【０４５２】
選択されたペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与される場合、安全で、有効であり、かつＳＴＥＡＰ−１を有するか、またはこれを過剰発現する細胞を制御または消去する免疫応答に大きさが類似の免疫応答を惹起する。
【０４５３】
（実施例２２：「ミニ遺伝子」マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築）
本実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築を議論する。ミニ遺伝子プラスミドは、当然、本明細書中に記載される種々の構成のＢ細胞、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬのエピトープまたはエピトープアナログを含み得る。
【０４５４】
ミニ遺伝子発現プラスミドは、代表的に、複数のＣＴＬペプチドエピトープおよびＨＴＬペプチドエピトープを含む。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープならびにＨＬＡ−Ａ１モチーフ保有ペプチドエピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ保有ペプチドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはＤＲ３エピトープと組み合わせて使用する。ＳＴＥＡＰ−１由来のＨＬＡクラスＩスーパーモチーフまたはＨＬＡクラスＩモチーフを保有するペプチドエピトープを、複数のスーパーモチーフ／モチーフが提示されて広範な集団の範囲を確実にするように、選択する。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、広範な集団の範囲を提供するように、ＳＴＥＡＰ−１から選択する。すなわち、ＨＬＡ ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトープおよびＨＬＡ ＤＲ−３モチーフ保有エピトープの両方を、ミニ遺伝子構築物に含有させるために選択する。選択されたＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを、次いで、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子へと組み込む。
【０４５５】
このような構築物は、ＨＴＬエピトープを小胞体に指向させる配列をさらに含み得る。例えば、Ｉｉタンパク質（Ｉｉ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、当該分野において記載されるように１つ以上のＨＴＬエピトープに融合され得、ここでこのＩｉタンパク質のＣＬＩＰ配列は、除去され、そしてＨＬＡクラスＩＩエピトープ配列と置換され、その結果、ＨＬＡクラスＩＩエピトープが、小胞体に指向され、このエピトープは、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する。
【０４５６】
本実施例は、ミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築のために使用される方法を例示する。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターは、当業者に利用可能であり、かつ公知である。
【０４５７】
本実施例のミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列およびコンセンサスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列と、それに続く本明細書中に開示される原理に従い選択されるＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含む。この配列は、ｐｃＤＮＡ３．１Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターによりコードされるＭｙｃおよびＨｉｓの抗体エピトープタグに融合されたオープンリーディングフレームをコードする。
【０４５８】
例えば、１５ヌクレオチドがオーバーラップしている、平均約７０ヌクレオチド長であり得るオーバーラップオリゴヌクレオチドを合成し、そしてＨＰＬＣ精製する。これらのオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープならびに適切なリンカーヌクレオチド、Ｋｏｚａｋ配列、およびシグナル配列をコードする。最終的なマルチエピトープミニ遺伝子を、ＰＣＲを用いる３セットの反応においてオーバーラップオリゴヌクレオチドを伸長することによってアセンブリする。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ ９６００ ＰＣＲ機を用い、そして合計３０サイクルを、以下の条件を用いて実施する：９５℃で１５秒、（各々のプライマー対の最も低い計算値Ｔｍより５℃低い）アニーリング温度で３０秒、そして７２℃で１分間。
【０４５９】
例えば、ミニ遺伝子を以下のように調製する。第一のＰＣＲ反応において、各々５μｇの２つのオリゴヌクレオチドを、アニーリングし、そして伸長する。８つのオリゴヌクレオド（すなわち、４対のプライマー）を使用する実施例において、オリゴヌクレオチド１とオリゴヌクレオチド２、オリゴヌクレオチド３とオリゴヌクレオチド４、オリゴヌクレオチド５とオリゴヌクレオチド６、およびオリゴヌクレオチド７とオリゴヌクレオチド８とを、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（１×＝１０ｍＭ ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−クロリド（ｐＨ ８．７５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、各々０．２５ｍＭのｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応物中で合わせる。全長二量体産物を、ゲル精製し、そして１と２および３と４との産物、ならびに５と６および７と８との産物を含む２つの反応物を混合し、アニーリングし、そして１０サイクルにわたり伸長する。次いで、２つの反応物の半分を混合し、そして隣接するプライマーを添加して、全長の産物を増幅する前に５サイクルのアニーリングおよび伸長を実施した。この全長産物を、ゲル精製し、ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、そして個々のクローンを配列決定によりスクリーニングする。
【０４６０】
（実施例２３：プラスミド構築物およびそのプラスミド構築物が誘導する免疫原性の程度）
プラスミド構築物（例えば、前出の実施例に従い構築されたプラスミド）が誘導し得る免疫原性の程度を、エピトープ発現核酸構築物を用いてＡＰＣを形質導入またはトランスフェクトした後、このＡＰＣによるエピトープ提示を決定することによりインビトロで確認する。このような研究により「抗原性」を決定し、そしてヒトＡＰＣの使用を可能とする。このアッセイによりこの細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによって、Ｔ細胞により認識される状態においてＡＰＣにより提示されるエピトープの能力を決定する。定量を、ＡＰＣから溶出されたペプチドの量を直接測定することにより実施し得る（例えば、Ｓｉｊｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：６８３〜６９２、１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：６８２〜６８４、１９８９を参照のこと）か；またはペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数を、罹患したかまたはトランスフェクトされた標的細胞により誘導された溶解またはリンホカインの放出の量を測定し、次いで等しいレベルの溶解またはリンホカインの放出を得るために必要なペプチドの濃度を決定することにより、評価し得る（例えば、Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５６７〜５７６、１９９５を参照のこと）。
【０４６１】
あるいは、免疫原性を、マウスへのインビボでの注射、引き続くＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性（これらの活性を、細胞傷害性および細胞増殖性のアッセイ（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１〜７６１、１９９４において詳述される）を用いて、それぞれ、分析する）のインビトロでの評価を介して確認する。
【０４６２】
例えば、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドを有するＤＮＡミニ遺伝子構築物がＣＴＬをインビボで誘導する能力を確認するために、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて筋肉内で免疫する。ｃＤＮＡ免疫により誘導されたＣＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール群の動物もまた、ミニ遺伝子によりコードされるような単一のポリペプチドとして合成された複数のエピトープを含む実際のペプチド組成物そのものを用いて免疫する。
【０４６３】
免疫した動物由来の脾臓細胞を、各々の組成物（ミニ遺伝子においてコードされるペプチドエピトープまたはポリエピトープペプチド）をそれぞれ用いて２回刺激し、次いで５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的な細胞傷害性活性についてアッセイする。これらの結果は、Ａ２拘束エピトープに対するＣＴＬ応答の大きさを示し、従ってミニ遺伝子ワクチンおよびポリエピトープワクチンのインビボでの免疫原性を示す。
【０４６４】
従って、ミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンが誘発するような、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対する免疫応答を誘発することが見いだされる。ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７のモチーフエピトープまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために他のＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて同様の分析もまた実施され、それにより、このミニ遺伝子が、提供されたエピトープに対して指向される適切な免疫応答を誘発することもまた見出される。
【０４６５】
クラスＩＩエピトープをコードするミニ遺伝子がＨＴＬをインビボで誘導する能力を確認するためには、ＤＲトランスジェニックマウスにか、または適切なマウスＭＨＣ分子と交叉反応するエピトープについては、例えば、Ｉ−Ａｂ拘束マウスに、１００μｇのプラスミドＤＮＡを筋肉内免疫する。ＤＮＡ免疫により誘導されたＨＴＬのレベルを比較する手段として、コントロール動物の群も、フロイントの完全アジュバンド中に乳化した実際のペプチド組成物で免疫する。ＣＤ４＋Ｔ細胞（すなわちＨＴＬ）を、免疫した動物の脾臓細胞から精製し、そして各々の組成物（ミニ遺伝子中にコードされるペプチド）のそれぞれを用いて刺激する。ＨＴＬ応答を、３Ｈ−チミジン取り込み増殖アッセイを用いて測定する（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：７５１〜７６１、１９９４を参照のこと）。この結果は、ＨＴＬ応答の大きさを示し、従って、このミニ遺伝子のインビボでの免疫原性を実証する。
【０４６６】
前出の実施例において記載されるように構築されたＤＮＡミニ遺伝子をまた、プライムブーストプロトコル（ｐｒｉｍｅ ｂｏｏｓｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いてブースト剤と組み合わせたワクチンとして確認し得る。このブースト剤は、組み換えタンパク質（例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ａｉｄｓ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ １４、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３：Ｓ２９９〜Ｓ３０９、１９９８）または例えば、完全な目的のタンパク質をコードするミニ遺伝子もしくはＤＮＡを発現する組み換えワクチン（例えば、Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４３９〜４４５、１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：７６４８〜５３、１９９８；ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６：１７７〜１８１、１９９９；ならびにＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：５２６〜３４、１９９９を参照のこと）からなり得る。
【０４６７】
例えば、プライムブーストプロトコルにて用いられるＤＮＡミニ遺伝子の有効性を、最初に、トランスジェニックマウスにおいて評価する。本実施例において、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、免疫原性ペプチド（少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む）をコードする１００μｇのＤＮＡミニ遺伝子でＩＭ免疫する。インキュベーション期間（３〜９週間の範囲をとる）の後、このマウスを、ＤＮＡミニ遺伝子によりコードされるのと同じ配列を発現する１０７ｐｆｕ／マウスの組み換えワクシニアウイルスを用いてＩＰでブーストする。コントロールマウスを、ミニ遺伝子配列を有さない１００μｇのＤＮＡもしくは組み換えワクシニアをもちいるか、またはこのミニ遺伝子をコードするＤＮＡを用いるが、ワクシニアブーストを伴わずに免疫する。２週間のさらなるインキュベーション期間の後、このマウス由来の脾臓細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的な活性について直ちにアッセイする。さらに、脾臓細胞を、ミニ遺伝子中にコードされるＡ２拘束ペプチドエピトープおよび組み換えワクシニアを用いてインビトロで刺激し、次いでαＩＦＮ ＥＬＩＳＡ、βＩＦＮ ＥＬＩＳＡ、および／またはγＩＦＮ ＥＬＩＳＡにおいてペプチド特異的な活性についてアッセイする。
【０４６８】
プライムブーストプロトコルにおいて利用されるミニ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドに対してＤＮＡ単独より高い免疫応答を誘発することが見出される。そのような分析をまた、ＨＬＡ−Ａ３またはＨＬＡ−Ｂ７のモチーフエピトープまたはスーパーモチーフエピトープによるＣＴＬ誘導を評価するために、ＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスモデルまたはＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて実施し得る。ヒトにおけるプライムブーストプロトコルの使用を、「プライムブーストプロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導」と題した以下の実施例において記載する。
【０４６９】
（実施例２４：予防使用のためのペプチド組成物）
本発明のワクチン組成物を使用して、この抗原を保有する腫瘍についての危険性を有するヒトにおけるＳＴＥＡＰ−１発現を予防し得る。例えば、上記実施例において選択されるエピトープのような複数のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含むポリエピトープペプチドエピトープ組成物（またはポリエピトープペプチドエピトープを含む核酸）（これらはまた、集団の８０％より多くを標的化するように選択される）を、ＳＴＥＡＰ−１関連腫瘍についての危険性がある個体に投与する。
【０４７０】
例えば、ペプチドベースの組成物を、複数のエピトープを包含する単一のポリペプチドとして提供する。代表的には、アジュバント（例えば、フロイントの不完全アジュバンド）を含む生理学的溶液中でワクチンを投与する。最初の免疫のためのペプチド用量は、７０ｋｇの患者について約１μｇ〜約５０，０００μｇであり、一般的には１００μｇ〜５，０００μｇである。ワクチンの最初の投与に引き続いて、４週間目にブースター投与をし、さらに引き続いてＰＢＭＣサンプル中のエピトープ特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術により患者における免疫応答の大きさの評価をする。さらなるブースター用量を、必要である場合に投与する。この組成物は、ＳＴＥＡＰ−１関連疾患に対する予防薬として、安全かつ効果的の両方であることが見出される。
【０４７１】
あるいは、代表的にトランスフェクト薬剤を含む組成物を、当該分野において公知の方法論および本明細書中で開示される方法論に従い、核酸ベースのワクチンの投与のために使用する。
【０４７２】
（実施例２５：ネイティブのＳＴＥＡＰ−１配列由来のポリエピトープワクチン組成物）
ネイティブのＳＴＥＡＰ−１ポリタンパク質配列を、複数のエピトープを含むポリタンパク質の「比較的短い」領域を同定するために、好ましくは、各々のクラスＩおよび／またはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフについて規定されるコンピューターアルゴリズムを用いて分析する。好ましくは、この「比較的短い」領域は、全長のネイティブの抗原より長さが短い。複数の、別個であるかまたはオーバーラップする「ネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）」エピトープを含むこの比較的短い領域を、ミニ遺伝子構築物を作製するために使用し得る。この構築物を、ネイティブのタンパク質配列に対応するペプチドを発現するように操作する。この「比較的短い」ペプチドは、一般的に２５０アミノ酸長未満であり、しばしば１００アミノ酸長未満であり、好ましくは７５アミノ酸長未満であり、より好ましくは５０アミノ酸長未満である。このワクチン組成物のタンパク質配列は、この配列中に含有される最大数のエピトープを有する（すなわち、それは、高濃度のエピトープを有する）ので、このワクチン組成物のタンパク質配列を選択する。本明細書中に示されるように、エピトープモチーフは、ネスト化されていても、オーバーラップしてもよい（すなわち、互いに対してフレームシフトしてもよい）。例えば、オーバーラップエピトープを用いて、２つの９マーエピトープおよび１つの１０マーエピトープが、１０アミノ酸のペプチド中に存在し得る。そのようなワクチン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
【０４７３】
このワクチン組成物は、例えば、ＳＴＥＡＰ−１抗原由来の複数のＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。このポリエピトープネイティブ配列を、ペプチドとしてかまたはこのペプチドをコードする核酸配列としてかのいずれかで投与する。あるいは、アナログを、そのネイティブ配列から作製し得、それにより１つ以上のエピトープが、そのポリエピトープペプチドの交叉反応性特性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。
【０４７４】
本実施例の実施形態は、免疫系の未だ開発されていない局面として、プロセシングを、ネイティブのネスト化された配列に適用し、それにより治療的または予防的な免疫応答を誘導するワクチン組成物の産生を容易にする可能性を提供する。さらに、そのような実施形態は、現在未知のＨＬＡ構造についてのモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、この実施形態（類似の実施形態を除く）は、免疫応答をネイティブのＳＴＥＡＰ−１中に実際に存在する複数のペプチド配列に向け、従って、任意の連結するエピトープを評価する必要性を除外する。最後に、この実施形態は、ペプチドワクチン組成物または核酸ワクチン組成物を産生する場合のスケールの経済性を提供する。
【０４７５】
この実施形態に関して、標的配列において、配列長あたり最も多数のエピトープを同定するために使用され得るコンピュータプログラムが、当該分野において利用可能である。
【０４７６】
（実施例２６：複数の抗原由来のポリエピトープワクチン組成物）
本発明のＳＴＥＡＰ−１ペプチドエピトープを、他の標的腫瘍関連抗原由来のエピトープと組み合わせて使用して、ＳＴＥＡＰ−１およびそのような他の抗原を発現する癌の予防および処置に有用なワクチン組成物を作製する。例えば、ワクチン組成物を、ＳＴＥＡＰ−１由来の複数のエピトープおよびＳＴＥＡＰ−１発現に関連する標的の癌でしばしば発現される腫瘍関連抗原を組み込む単一のポリペプチドとして提供し得るか、または１つ以上の別個のエピトープのカクテルを含む組成物として投与し得る。あるいは、このワクチンを、ミニ遺伝子構築物として、またはインビトロでペプチドエピトープを充填した樹状細胞として投与し得る。
【０４７７】
（実施例２７：免疫応答を評価するためのペプチドの使用）
本発明のペプチドを、ＳＴＥＡＰ−１に対する特異的抗体、ＣＴＬまたはＨＴＬの存在についての免疫応答を分析するために使用し得る。そのような分析を、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：２１０３〜２１０６、１９９８に記載される様式で実施し得る。本実施例において、本発明に従うペプチドを、診断目的または予防目的のための試薬として（免疫原としてではなく）使用する。
【０４７８】
本実施例において、高度に感受性なヒト白血球抗原四量複合体（「四量体））を、例えば、疾患の異なる病期またはＡ＊０２０１モチーフを含むＳＴＥＡＰ−１ペプチドを含む免疫後でのＨＬＡ Ａ＊０２０１陽性個体由来のＳＴＥＡＰ−１ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ頻度の縦断解析のために使用する。四量複合体を、記載される（Ｍｕｓｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６７、１９９７）ように合成する。簡単には、精製したＨＬＡ重鎖（本実施例におけるＡ＊０２０１）およびβ２−ミクログロブリンを、原核生物発現系によって合成する。この重鎖を、膜貫通−細胞質ゾルテールの欠失およびＢｉｒＡ酵素ビオチン化部位を含む配列のＣＯＯＨ末端付加により改変する。重鎖、β２−ミクログロブリン、およびペプチドを、希釈により再折り畳みをする。この４５ｋＤの再折り畳み産物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いて単離し、次いでビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデノシン５’三リン酸およびマグネシウムの存在下でＢｉｒＡによりビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、１：４のモル比で添加し、四量体産物を１ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。得られた産物を、四量体フェコエリトリンという。
【０４７９】
患者の血液サンプルの分析のために、約１００万のＰＢＭＣを、３００ｇで５分間遠心分離し、５０μｌの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。三色分析を、抗ＣＤ８−トリカラー（Ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、および抗ＣＤ３８と共に四量体−フィコエリトリンを用いて実施する。ＰＢＭＣを、氷上で四量体および抗体と共に３０〜６０分間インキュベートし、次いでホルムアルデヒド固定の前に２回洗浄する。９９．９８％より多くのコントロールサンプルを含むようなゲートを適用する。四量体についてのコントロールは、Ａ＊０２０１陰性の個体およびＡ＊０２０１陽性の罹患していないドナーの両方を含む。次いで、この四量体を用いて染色された細胞の百分率を、フローサイトメトリーを用いて決定する。この結果は、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ拘束ＣＴＬ含有細胞の数を示し、これによりＳＴＥＡＰ−１エピトープに対する免疫応答の程度、従って、ＳＴＥＡＰ−１への曝露の状態、または予防的応答もしくは治療的応答を誘発するワクチンへの曝露の状態を容易に示す。
【０４８０】
（実施例２８：リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を評価するためのペプチドエピトープの使用）
本発明のペプチドエピトープを、患者におけるＴ細胞応答（例えば、急性またはリコール応答）を評価するための試薬として使用する。そのような分析を、ＳＴＥＡＰ−１関連疾患から回復した患者またはＳＴＥＡＰ−１ワクチンでワクチン接種した患者において実施し得る。
【０４８１】
例えば、ワクチン接種したヒトのクラスＩ拘束ＣＴＬ応答を分析し得る。このワクチンは、任意のＳＴＥＡＰ−１ワクチンでよい。ＰＢＭＣを、ワクチン接種した個体およびＨＬＡ型が決定された個体から回収する。次いで、複合的ＨＬＡスーパータイプファミリーメンバーとの交叉反応性を提供するスーパーモチーフを必要に応じて保有する本発明の適切なペプチドエピトープを、ＨＬＡ型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
【０４８２】
ワクチン接種した個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３回洗浄し、１０％の熱で非働化ヒトＡＢ血清を含む、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびＨｅｐｅｓ（１０ｍＭ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（完全ＲＰＭＩ）中に再懸濁し、マイクロ培養形式を用いてプレートする。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、各々のウェルに１０μｇ／ｍｌで添加し、そしてＨＢＶコア１２８〜１４０エピトープを、刺激の第一週目の間、Ｔ細胞ヘルプの供給源として各々のウェルに１μｇ／ｍｌ添加する。
【０４８３】
マイクロ培養形式において、４×１０５ＰＢＭＣを、１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩの９６ウェルの丸底プレート中の８つの複製培養物にてペプチドで刺激する。３日目および１０日目に、１００μｌの完全ＲＰＭＩおよび２０Ｕ／ｍｌの最終濃度のｒＩＬ−２を、各々のウェルに添加する。７日目に、この培養物を、９６ウェルの平底プレートに移し、そしてペプチド、ｒＩＬ−２および１０５の放射性（３，０００ｒａｄ）の自己フィーダー細胞を用いて再刺激する。この培養物を、１４日目に細胞傷害性について試験する。陽性ＣＴＬ応答は、以前に記載されるような（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１１０４、１１０８、１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５〜１６６５、１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１４３２〜１４４０、１９９６）、罹患していないコントロール被験体との比較に基づいて、８つの複製培養物のうち２つ以上が１０％より多い特異的５１Ｃｒ放出を示すことを必要とする。
【０４８４】
標的細胞株は、自己由来であり、そして同種異系のＥＢＶ形質転換したＢ−ＬＣＬであり、これらは、両方Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入されたか、または記載されるように（Ｇｕｉｌｈｏｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０〜２６７８、１９９２）患者のプールから樹立されるかのいずれかである。
【０４８５】
細胞傷害性アッセイを、以下の様式で実施する。標的細胞は、同種異系のＨＬＡが適合するＢリンパ芽球細胞株または自己由来のＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株のいずれかからなり、これらを、１０μＭでの本発明の合成ペプチドエピトープと共に一晩インキュベートし、そして１００μＣｉの５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて１時間にわたり標識し、その後これらを、ＨＢＳＳを用いて４回洗浄する。
【０４８６】
細胞溶解活性を、３，０００標的／ウェルを含むＵ底の９６ウェルプレートを用いる標準的な４時間の、別々のウェルの５１Ｃｒ放出アッセイにおいて決定する。刺激されたＰＢＭＣを、２０〜５０：１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）の比率で１４日目に試験する。細胞傷害性％を、式：１００×［（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）］から決定する。最大放出を、界面活性剤（２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）による標的の溶解により決定する。自発的放出は、全ての実験について最大放出の２５％未満である。
【０４８７】
このような分析の結果は、ＨＬＡ拘束ＣＴＬ集団が、上記のＳＴＥＡＰ−１またはＳＴＥＡＰ−１ワクチンへの曝露により刺激される程度を示す。
【０４８８】
同様に、クラスＩＩ拘束ＨＴＬ応答もまた分析し得る。精製されたＰＢＭＣを、１．５×１０５細胞／ウェルの密度での９６ウェルの平底プレート中で培養し、１０μｇ／ｍｌの本発明の合成ペプチド、ＳＴＥＡＰ−１抗原全体、またはＰＨＡを用いて刺激する。細胞を、各々の条件について４〜６ウェルの繰り返しで慣用的にプレートする。７日間の培養の後、培地を除去し、そして１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新しい培地と置換する。２日後、１μＣｉの３Ｈチミジンを、各々のウェルに添加し、そしてさらに１８時間にわたりインキュベーションを続ける。次いで、細胞ＤＮＡを、ガラスファイバーマット上で回収し、そして３Ｈチミジン取り込みについて分析する。抗原特異的Ｔ細胞増殖を、抗原の存在下での３Ｈチミジン取り込みを抗原の非存在下での３Ｈチミジン取り込みで割った比として計算する。
【０４８９】
（実施例２９：ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導）
本発明のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物についてのヒト臨床試験を、ＩＮＤフェーズＩ、用量上昇研究として設定し、そして無作為化した二重盲検偽薬制御試験として実施する。そのような試験を、例えば、以下のように設計した：
全体で約２７人の個体を登録し、そして３つのグループに分ける；
グループＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５０μｇのペプチド組成物を注射する；
グループＩＩＩ：３人の被験体に偽薬を注射し、そして６人の被験体に５００μｇのペプチド組成物を注射する。
【０４９０】
最初の注射の４週間後に、全ての被験体に同じ投与量で追加免疫接種した。
【０４９１】
この研究において測定される終点は、このペプチド組成物の安全性および許容度、ならびにその免疫原性に関連する。このペプチド組成物に対する細胞性免疫応答は、このペプチド組成物の固有の活性の指標であり、従って生物学的有効性の尺度として見られ得る。以下は、安全性および有効性の終点に関する臨床データおよび研究室データを要約する。
【０４９２】
安全性：有害事象の影響を、偽薬処置群および薬物処置群においてモニターし、そしてその程度および可逆性をもって評価する。
【０４９３】
ワクチン有効性の評価：ワクチン有効性の評価のために、注射前後に、被験体から採血する。末梢血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新しいヘパリン化血液から単離し、凍結媒体中にアリコート化し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０４９４】
ワクチンが、安全かつ有効の両方であることが見出される。
【０４９５】
（実施例３０：ＳＴＥＡＰ−１を発現する患者におけるフェーズＩＩ試験）
フェーズＩＩ試験を、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を有する患者へのＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物の投与の有効性を研究するために実施する。この試験の主要な目的は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌患者においてＣＴＬを誘導するために有効な用量とレジメンを決定すること、これらの患者におけるＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答の誘導の安全性を確立すること、ならびに、どの程度のＣＴＬの活性化が、これらの患者の臨床像を改善するかを確認すること（例えば、病変の減少および／または萎縮により明らかになるように）である。このような研究を、例えば、以下のように設計する。
【０４９６】
この研究を、複数の中枢において実施する。この試験の設計は、オープンラベル（ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ）、未制御、用量上昇プロトコルであり、ここで、このペプチド組成物を、単回容量として投与し、続いて、６週間後に同じ用量の単回の追加免疫注射を行う。この投与量は、注射一回あたり５０μｇ、５００μｇ、および５，０００μｇである。薬物関連の有害事象（重篤度および可逆性）を記録する。
【０４９７】
３つの患者のグループ分けをする。第一のグループに５０μｇのこのペプチド組成物を注射し、第二および第三のグループにそれぞれ、５００μｇおよび５，０００μｇのペプチド組成物を注射する。各々のグループ内の患者は、２１歳〜６５歳の範囲であり、そして種々の人種集団背景を示す。彼らの全ては、ＳＴＥＡＰ−１を発現する腫瘍を有する。
【０４９８】
臨床的発現または抗原特異的Ｔ細胞応答を、このペプチド組成物を投与する効果を評価するためにモニタリングする。このワクチン組成物が、ＳＴＥＡＰ−１関連疾患の処置において安全かつ有効の両方であることが見出される。
【０４９９】
（実施例３１：プライム追加免疫プロトコルを用いるＣＴＬ応答の誘導）
「プラスミド構築物およびそのプラスミド構築物が誘導する免疫原性の程度」と題された上記実施例において記載されるような、トランスジェニックマウスにおけるＤＮＡワクチンの有効性を確認するために使用される原理に対して基礎となる原理に類似するプライム追加免疫プロトコルをまた、ヒトにワクチンを投与するために使用し得る。このようなワクチンレジメンは、例えば、裸のＤＮＡの最初の投与と、続いて、そのワクチンをコードする組み換えウイルス、またはアジュバント中で投与される組み換えタンパク質／ポリペプチドもしくはペプチド混合物の投与を用いる追加投与を含み得る。
【０５００】
例えば、最初の免疫を、発現ベクター（例えば、「「ミニ遺伝子」マルチエピトープＤＮＡプラスミドの構築」と題した実施例において構築されるような発現ベクター）を、複数の部位で０．５ｍｇ〜５ｍｇの量でＩＭ（またはＳＣまたはＩＤ）投与される裸の核酸の形態で用いて実施し得る。この核酸（０．１μｇ〜１０００μｇ）をまた、遺伝子銃を用いて投与し得る。３〜４週間のインキュベーション期間の後、次いで、追加用量を投与する。この追加用量は、５×１０７ｐｆｕ〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組み換え鶏痘ウイルスであり得る。代替的な組み換えウイルス（例えば、ＭＶＡウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス）をまた、追加投与のために使用し得るか、またはポリエピトープタンパク質もしくはこれらのペプチドの混合物を投与し得る。ワクチン有効性の評価のために、免疫前ならびに最初のワクチンおよびワクチンの追加用量の投与後間隔を空けて患者の血液サンプルを得る。抹消血液単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により新しいヘパリン化血液から単離し、凍結培体中にアリコート化し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０５０１】
これらの結果の分析は、ＳＴＥＡＰ−１に対する治療的免疫または保護免疫を達成するのに十分な強度の応答が産生されることを示す。
【０５０２】
（実施例３２：樹状細胞（ＤＣ）を用いるワクチン組成物の投与）
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンを、ＡＰＣまたは「プロフェッショナル」ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を用いて投与し得る。本実施例において、ペプチドパルスされたＤＣを、患者に投与して、インビボでのＣＴＬ応答を刺激する。この方法において、樹状細胞を、単離し、増殖させ、そして本発明のペプチドＣＴＬエピトープおよびペプチドＨＴＬエピトープを含むワクチンでパルスする。これらの樹状細胞を患者に注入して戻し、インビボでＣＴＬ応答およびＨＬＴ応答を誘発させる。次いで、誘導されたＣＴＬおよびＨＴＬは、このワクチンおけるエピトープが由来するＳＴＥＡＰ−１タンパク質を保有する標的細胞をそれぞれ破壊するか、または破壊を促進する。
【０５０３】
例えば、エピトープ含有ペプチドのカクテルを、ＰＢＭＣにエキソビボで投与するか、またはそれからＤＣを単離する。ＤＣの回収を容易にするための医薬（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）を用い得る。ペプチドを用いてＤＣをパルスした後、および患者への再注入の前に、このＤＣを洗浄して、結合していないペプチドを除去する。
【０５０４】
臨床的に理解され、そして臨床的結果に基づいて当業者により容易に決定されるように、患者に再注入されるＤＣの数は変化し得る（例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．４：３２８、１９９８；Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：５２、１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ ３２：２７２、１９９７を参照のこと）。患者１人あたり２〜５０×１０６ＤＣを代表的に投与するが、より多い数のＤＣ（例えば、１０７または１０８）もまた、提供し得る。そのような細胞集団は、代表的に、５０％〜９０％の間のＤＣを含む。
【０５０５】
いくつかの実施形態において、ペプチド充填ＰＢＭＣを、ＤＣを精製することなく患者に注射する。例えば、薬剤（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ）での処理の後に産生されたＰＢＭＣを、ＤＣを精製することなく患者に注射する。投与されるＰＢＭＣの総数は、しばしば、１０８〜１０１０の範囲をとる。一般的に、患者に注射される細胞用量は、例えば、特異的な抗ＤＣ抗体を用いる免疫蛍光分析により決定されるような、各々の患者の血液中のＤＣのパーセンテージに基づく。従って、例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭが所定の患者の末梢血液中の２％のＤＣを起動し（ｍｏｂｉｌｉｚｅ）、そしてその患者が５×１０６ＤＣを受容している場合、次いで、この患者に、合計２．５×１０８ペプチド充填ＰＢＭＣを注射する。薬剤（例えば、ＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎＴＭ）により動員されたＤＣ％は、代表的に、２〜１０％の間であると評価されるが、当業者に理解されるように変化し得る。
【０５０６】
（エキソビボでのＣＴＬ／ＨＴＬ応答の活性化）
あるいは、エキソビボのＳＴＥＡＰ−１抗原に対するＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、ＤＣのようなＡＰＣの供給源および免疫原性ペプチドと共に、患者の、または遺伝的に適合性のＣＴＬ前駆体細胞またはＨＴＬ前駆体細胞を、組織培養中でインキュベーションすることによって誘導され得る。適切なインキュベーション時間（代表的には約７〜２８日間）後、その前駆該細胞は活性化され、そしてエフェクター細胞中に拡大された。このエフェクター細胞は患者中に注入され、特異的標的細胞（すなわち、腫瘍細胞）を破壊する（ＣＴＬ）かまたは破壊を促進する（ＨＴＬ）。
【０５０７】
（実施例３３：モチーフ保有ペプチドの同定および確認の代替方法）
モチーフ保有ペプチドを同定および確認する別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を保有する細胞からそのペプチドを溶出することである。例えば、組織型決定に使用されるＥＢＶで形質転換されたＢ細胞株は、どのＨＬＡ分子をこれらが発現するかを決定するように広範に特徴付けられている。特定の場合において、これらの細胞は、ＨＬＡ分子の単一型のみを発現する。これらの細胞は、目的の抗原（例えば、ＳＴＥＡＰ−１）を発現する核酸でトランスフェクトされ得る。次いで、トランスフェクトの結果として産生されるペプチドの内因性抗原プロセシングによって産生されるペプチドは、細胞内のＨＬＡ分子に結合し、そして輸送されて細胞表面に提示される。次いで、温和な酸条件にさらすことによって、ペプチドをＨＬＡ分子から溶出し、そしてこれらのアミノ酸配列を決定する（例えば、質量分析器（例えば、Ｋｕｂｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３，１９９４）を使用して）。特定のＨＬＡ分子に結合するペプチドの大部分はモチーフを保有しているために、これは、細胞上で発現される特定のＨＬＡ分子と関連するモチーフ保有ペプチドを得るための代替の様式である。
【０５０８】
あるいは、内因性ＨＬＡ分子を発現しない細胞株は、単一のＨＬＡ対立遺伝子をコードする発現構築物でトランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、記載されるように使用され得る（すなわち、これらの細胞は、細胞表面上に提示されるＳＴＥＡＰ−１に対応するペプチドを単離するために、ＳＴＥＡＰ−１をコードする核酸でトランスフェクトされ得る）。このような分析から得られたペプチドは、細胞中で発現される単一のＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
【０５０９】
当業者に理解されるように、１つより多いＨＬＡ対立遺伝子を保有する細胞における同様の分析を実施し、そしてそれに続く発現された各々のＨＬＡ対立遺伝子に対して特異的なペプチドの決定が実施し得る。さらに、当業者はまた、タンパク質抗原でのローディングのようなトランスフェクション以外の手段が、細胞に対する抗原供給源の提供のために使用され得ることを認識する。
【０５１０】
（実施例３４：相補ポリヌクレオチド）
ＳＴＥＡＰ−１コード配列またはその任意の部分に相補的な配列を使用して、天然に存在するＳＴＥＡＰ−１の発現を検出するか、減少するか、または阻害する。約１５〜３０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用が記載されるが、実質的には、より小さい配列フラグメントまたはより大きい配列フラグメントを用いて同一の手段を使用する。適切なオリゴヌクレオチドは、例えば、ＯＬＩＧＯ４．０６ソフトウエア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳＴＥＡＰ−１のコード配列を使用して設計される。転写を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを、最も独特な５’側配列から設計し、そしてその相補オリゴヌクレオチドを使用して、コード配列へのプロモーターの結合を阻止する。翻訳を阻害するために、相補オリゴヌクレオチドを設計して、ＳＴＥＡＰ−１をコードする転写産物へのリボソーム結合を阻止する。
【０５１１】
（実施例３５：ＳＴＥＡＰ−１特異的抗体を使用する、天然に存在するＳＴＥＡＰ−１または組換えＳＴＥＡＰ−１の精製）
天然に存在するＳＴＥＡＰ−１または組換えＳＴＥＡＰ−１は、ＳＴＥＡＰ−１に特異的な抗体を使用して、免疫親和性クロマトグラフィーによって実質的に精製される。免疫親和性カラムを、活性化されたクロマトグラフィー樹脂（例えば、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ））に抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を共有結合させることによって構築する。この結合後、樹脂をブロックし、そして製造者の指示書に従って洗浄する。
【０５１２】
ＳＴＥＡＰ−１を含む培地を、免疫親和性カラムを通過させ、そしてそのカラムをＳＴＥＡＰ−１を優先的に吸着する条件下（例えば、界面活性剤の存在下における高イオン強度緩衝液）で洗浄する。このカラムを、抗体／ＳＴＥＡＰ−１の結合を妨害する条件下（例えば、ｐＨ２〜ｐＨ３の緩衝液、または高濃度のカオトロープ（例えば、尿素またはチオシアネートイオン））で溶出し、そしてＧＣＲ．Ｐを回収する。
【０５１３】
（実施例３６：ＳＴＥＡＰ−１と相互作用する分子の同定）
ＳＴＥＡＰ−１または生物学的に活性なそのフラグメントを、１２１ １ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬で標識する。（例えば、Ｂｏｌｔｏｎら（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５２９．を参照のこと。）マルチウエルプレートのウェル中に事前に並べられた候補分子を、標識したＳＴＥＡＰ−１とともにインキュベートし、洗浄し、そして標識されたＳＴＥＡＰ−１複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度のＳＴＥＡＰ−１を使用して得られたデータを使用して、ＳＴＥＡＰ−１の数、親和性、およびＳＴＥＡＰ−１と候補分子との会合の値を算出する。
【０５１４】
（実施例３７：ＳＴＥＡＰ−１腫瘍増殖促進についてのインビボアッセイ）
腫瘍細胞増殖に対するＳＴＥＡＰ−１タンパク質の効果を、ＳＴＥＡＰ−１を発現または欠損している細胞の腫瘍発生および増殖の評価によってインビボで評価する。例えば、ＳＣＩＤマウスに、１×１０６個の、３Ｔ３細胞、前立腺癌細胞（例えば、ＰＣ３細胞）のいずれか（ｔｋＮｅｏ空ベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）またはＳＴＥＡＰ−１を含む）を、各側腹部に皮下注射する。以下の少なくとも２つのストラテジーを使用し得る：（１）ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（ＵＫ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日公開））、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムまたは異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）（これらのプロモーターが宿主細胞系と適合性である限り）から得られる構築プロモーターのようなプロモーターの制御下での構成的ＳＴＥＡＰ−１の発現、ならびに（２）誘導性ベクター系（例えば、エクジソン、テトラサイクリンなど）の制御下での調節された発現（これらのプロモーターが宿主細胞系と適合性である限り）。次いで、腫瘍体積を、明らかな腫瘍の出現においてキャリパー測定によってモニターし、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞がより早い速度で増殖する場合に、ＳＴＥＡＰ−１発現細胞によって産生される腫瘍が変化された病原力（例えば、増強された転移、血管新生、化学療法薬物に対する減少された応答）の特徴を示すか否かを決定する時間続ける。
【０５１５】
さらに、マウスに１×１０５個の同じ細胞を同所移植して、ＳＴＥＡＰ−１が、前立腺における局所増殖に対する効果または細胞がリンパ節、および骨に特異的に転移する能力に対する効果を有するか否かを決定し得る（Ｍｉｋｉ Ｔら、Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ．２００１；１２：２０９；Ｆｕ Ｘら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ。９９１、４９：９３８）。骨腫瘍形成および増殖に対するＳＴＥＡＰの効果は、前立腺腫瘍細胞を脛骨内に注射することによって評価し得る。
【０５１６】
このアッセイはまた、候補治療組成物（例えば、ＳＴＥＡＰ−１細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ＳＴＥＡＰ−１アンチセンス分子およびリボザイム）のＳＴＥＡＰ−１阻害効果を決定するために有用である。
【０５１７】
（実施例３８：インビボにおける前立腺腫瘍のＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体媒介性阻害）
癌組織および表面局在化におけるＳＴＥＡＰ−１の有意な発現は、正常組織におけるその制限された発現とともに、ＳＴＥＡＰ−１を、抗体治療の優れた標的にする。同様にＳＴＥＡＰ−１は、Ｔ細胞ベースの免疫治療のための標的である。従って、ヒト前立腺癌異種移植マウスモデルにおける抗ＳＴＥＡＰ−１ｍＡｂの治療有効性を、組み換え細胞株（例えば、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１および３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ−１）（例えば、Ｋａｉｇｈｎ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｕｒｏｌ，１９７９．１７（１）：１６−２３頁を参照のこと）ならびにヒト前立腺異種移植モデル（例えば、ＬＡＰＣ９ＡＤ（Ｓａｆｆｒａｎら ＰＮＡＳ １９９９、１０：１０７３〜１０７８））を使用することにより評価する。
【０５１８】
腫瘍増殖および転移形成に対する抗体効果は、例えば、マウス同所性前立腺癌異種移植片モデルにおいて研究される。この抗体は、当該分野において理解されるような治療様式と実施例に議論されるように組み合わせられ得ないか、または組み合わせられ得る。抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂは、肺異種移植片および前立腺異種移植片の両方の形成を阻害する。抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂはまた、確立された同所性腫瘍の増殖を遅らせ、そして腫瘍保有マウスの生存を延長させる。これらの結果は、局在的段階および進行した段階の前立腺癌の処置における抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂの有効性を示す（例えば、Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ １０：１０７３−１０７８またはｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ ＵＲＬ ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５１６２４６９８を参照のこと）。
【０５１９】
抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂの投与は、確立された同所性腫瘍増殖を遅らせ、そして離れた部位への転位を阻害し、腫瘍保有マウスの生存の有意な延長を生じる。これらの研究は、ＳＴＥＡＰ−１が、免疫治療のための魅力的な標的であることを示し、そして局所性および転移性の前立腺癌の処置のための抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂの治療可能性を示す。この実施例は、ＳＣＩＤマウス中で増殖されるヒト前立腺腫瘍異種移植片の増殖を阻害するために、非結合体化ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体が有効であることを示し；従って、このような有効なモノクローナル抗体の組み合わせがまた、有効である。
【０５２０】
（複数の非結合体化ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂを使用する腫瘍阻害）
（材料および方法）
（ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体）：
モノクローナル抗体は、表題「ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の作製」の実施例に記載されるように、ＳＴＥＡＰ−１に対して惹起される。この抗体は、ＳＴＥＡＰ−１に結合し得るそれらの能力について、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫沈降によって特徴付けられる。ＥＬＩＳＡおよびウェスタン分析によって測定されるような抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂについてのエピトープマッピングデータは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質上のエピトープを認識する。前立腺癌組織および細胞の、これらの抗体を用いる免疫組織化学分析が実施される。
【０５２１】
モノクローナル抗体が、プロテインＧセファロースクロマトグラフィー、ＰＢＳに対する透析、フィルター滅菌、および−２０℃での貯蔵によって腹水またはハイブリドーマ組織培養上清から精製される。タンパク質測定をＢｒａｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって実施する。治療モノクローナル抗体または個々のモノクローナル抗体の混合物を含むカクテルを調製し、ＵＭ−ＵＣ３およびＣａＬｕ１の腫瘍異種移植片の皮下的または同所的な注射を受けるマウスの処置のために使用する。
【０５２２】
（細胞株および異種移植片）
前立腺癌細胞株ＰＣ３およびＬＮＣａＰならびに線維芽細胞株ＮＩＨ ３Ｔ３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、Ｌ−グルタミン酸および１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ中およびＤＭＥＭ中のそれぞれで維持する。
【０５２３】
ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞集団および３Ｔ３ ＳＴＥＡＰ−１細胞集団を、Ｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，１９９９．９６（２５）：１４５２３に記載されるようにレトロウイルス遺伝子の移送によって作製する。
【０５２４】
ＬＡＰＣ−９異種移植片（野生型アンドロゲンレセプターを発現し、そして前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を産生する）を、皮下トロカール移植により、６〜８週齢の雄性ＩＣＲ重篤複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ）において継代する（Ｃｒａｆｔ、Ｎ．ら、Ｎａｔ Ｍｅｄ．１９９９、５：２８０）。ＬＡＰＣ−９腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を、Ｃｒａｆｔらに記載されるように調製する。
【０５２５】
（異種移植片マウスモデル）
皮下（ｓ．ｃ．）腫瘍を、雄ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と１：１の希釈で混合された１×１０６個の細胞を注射することによって作製する。腫瘍形成に対する抗体効果を試験するために、すなわち、抗体注射を、腫瘍細胞注射と同じ日に開始する。コントロールとして、マウスに、精製マウスＩｇＧ（ＩＣＮ）もしくはＰＢＳ；またはヒト細胞中に発現されない無関係の抗原を認識する精製モノクローナル抗体のいずれかを注射する。予備研究において、腫瘍増殖におけるマウスＩｇＧまたはＰＢＳの間に差異は見られない。腫瘍サイズは、ノギス測定によって決定され、そして腫瘍体積は、長さ×幅×高さから算出される。１．５ｃｍよりも大きい直径の皮下腫瘍を有するマウスを屠殺する。
【０５２６】
同所性の注射をケタミン／キシラジンを使用することによって、麻酔下で実施する。前立腺同所性研究のために、前立腺を曝露するために背部を切開し、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合されたＬＡＰＣ腫瘍細胞またはＰＣ３腫瘍細胞（５×１０５個）を１０μｌ容量で前立腺カプセルに注射する。腫瘍成長をモニターするために、マウスを触診し、ＰＳＡレベルを測定するために１週間おきにマウスを採血する。ｉ．ｐを注射される抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂまたはコントロールｍＡｂを用いて、このマウスを適切な処置のためにグループに分離する。
【０５２７】
（抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂは、ＳＴＥＡＰ−１発現異種移植癌腫瘍の増殖を阻害する）
腫瘍形成に対する抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂの効果を、ＬＮＣａＰおよびＬＡＰＣ９同所性モデルを使用して試験する。皮下腫瘍モデルと比較して、同所性モデルは、マウスの前立腺における腫瘍細胞の直接的な注射を必要とし、局所的腫瘍増殖、遠位部位への転移の発達、マウスの健康の悪化、およびそれに続く死を、それぞれ生じる（Ｓａｆｆｒａｎ，Ｄ．ら，ＰＮＡＳ（前出））。この特徴は、同所性モデルをより代表的なヒトの疾患進行のモデルとし、そして臨床的に関連する終点におけるｍＡｂの治療効果をもたらすことを可能にする。
【０５２８】
従って、腫瘍細胞をマウスの前立腺に注射し、そして２日後、このマウスを２つのグループに分けて以下のいずれかで処理する：ａ）２００〜５００μｇの抗ＳＴＥＡＰ−１ Ａｂ、またはｂ）ＰＢＳ（２〜５週間の間、１週間に３度）。
【０５２９】
同所性癌モデルの主要な利点は、転移の発達を研究するための能力である。確立された同所性腫瘍を保有するマウス中の転移の形成は、腫瘍特異的細胞表面タンパク質（例えば、前立腺癌に対する抗ＣＫ−２０）に対する抗体を使用して肺切片におけるＩＨＣ分析によって研究される（Ｌｉｎ Ｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｒｅｖ．２００１；２５：２０２）。
【０５３０】
異種移植癌モデルの別の利点は、新生血管形成および新脈管形成を研究し得ることである。腫瘍増殖は、新しい血管発生に部分的に依存している。毛細管系および血管ネットワークは、宿主起源であるが、新生血管形成の開始および構築は、異種移植腫瘍によって調節される（Ｄａｂｉｄｏｆｆ ＡＭら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１；７：２８７０；Ｓｏｌｅｓｖｉｋ Ｏら、Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．１９８４、２０：１２９５）。新生血管形成に対する抗体および低分子の効果は、当該分野で公知の手順（例えば、腫瘍組織およびそれらの周辺環境のＩＨＣ分析によって）に従って試験する。
【０５３１】
樹立された同所性腫瘍を保有するマウスは、４週間にわたって抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂまたはＰＢＳのいずれかの１０００μｇ注射を投与される。両方のグループのマウスは、高い腫瘍組織量を確立し得、マウスの肺における転移形成を確実に高頻度にさせる。次いで、マウスを殺傷し、それらの膀胱、肝臓、骨および肺ＩＨＣ分析によって腫瘍細胞の存在について分析する。
【０５３２】
これらの研究は、異種移植片マウスモデル中の前立腺癌の発生および進行における、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の広範な抗腫瘍効果を示す。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、腫瘍形成を阻害し、既に確立された腫瘍の増殖を遅らせ、処置されたマウスの生存を延長させる。さらに、抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂは、大きい腫瘍量の存在下でさえも局所的な前立腺腫瘍の、遠位部位への拡散に対して劇的な阻害効果を示す。従って、抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂは、主要な臨床的に関連する終点（腫瘍増殖）、生存性の延長および健康に対して効果的である。
【０５３３】
（実施例３９：ヒトにおける抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の治療的使用および診断使用）
抗ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体は、ヒトにおける診断目的、予防目的、予後目的および／または治療目的のために、安全かつ有効に使用される。抗ＳＴＥＡＰ−１ｍＡｂを有する癌組織および癌異種移植のウェスタンブロットおよび免疫組織化学的分析は、癌において強く広範な染色を示すが、正常組織においては、それより有意に低いか、または検出できないレベルである。癌および転移性疾患におけるＳＴＥＡＰ−１の検出は、ｍＡｂが診断指標および／または指標として有用であることを示す。それゆえに、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、診断適用（例えば、腎臓生検検体の免疫組織化学）に使用し、癌が疑われている患者から癌を検出する。
【０５３４】
フローサイトメトリによって測定されるように、抗ＳＴＥＡＰ−１ ｍＡｂは、癌細胞に特異的に結合する。従って、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、ＳＴＥＡＰ−１の発現を示す局在化した転移性癌の検出のために、診断全身画像化適用（例えば、放射性免疫シンチグラフィおよび放射性免疫治療（例えば、Ｐｏｔａｍｉａｎｏｓ Ｓ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０（２Ａ）：９２５〜９４８（２０００）を参照のこと）において使用される。ＳＴＥＡＰ−１の細胞外ドメインの細胞外環境への分断または解放（例えば、アルカリホスホジエステラーゼＢ１０（Ｍｅｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｒ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２７：５６３〜５６８（１９９８））において見られる）は、疑われる患者からの血清サンプルおよび／または尿サンプル中の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体によりＳＴＥＡＰ−１の診断検出を可能にする。
【０５３５】
ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌の処置のための治療的適用において使用する。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、非結合体化様式として、そして抗体が、当該分野で周知の種々の治療様式または画像化様式の１つと結合される結合体化形態（例えば、プロドラッグ、酵素または放射性同位体）として使用される。前臨床試験において、非結合体化抗ＳＴＥＡＰ−１抗体および結合体化抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、ＳＣＩＤマウス癌異種移植モデル（例えば、腎臓癌モデルＡＧＳ−Ｋ３およびＡＧＳ−Ｋ６（例えば、「インビボにおける膀胱腫瘍および肺腫瘍のＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体媒介性阻害」と題された実施例を参照のこと））における腫瘍予防および増殖阻害の効果について試験する。非結合体化抗ＳＴＥＡＰ−１抗体および結合体化抗ＳＴＥＡＰ−１抗体のいずれかは、単独か、または以下の実施例で記載される他の処置と組み合わせて、ヒト臨床試験における治療様式として使用される。
【０５３６】
（実施例４０：インビボにおけるヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の使用を介するヒト癌の治療および診断についてのヒト臨床試験）
ＳＴＥＡＰ−１に対するエピトープを認識する本発明に従った抗体を使用し、表Ｉに列挙した特定の腫瘍の処置において使用する。多数の因子（ＳＴＥＡＰ−１発現レベル、腫瘍（例えば、表Ｉに列挙される腫瘍））に基づいて、これらは、現在では好ましい指標である。これらの指標の各々を組み合わせて、３つの臨床アプローチを首尾よく遂行する。
【０５３７】
Ｉ）付属治療：付属治療において、化学療法薬剤もしくは抗新生物薬剤および／または放射線治療と組み合わせた抗ＳＴＥＡＰ−１抗体により患者を処置する。初期の癌の標的（例えば、表Ｉに列挙される癌）を、標準的な第１および第２の系統治療に対するさらなる抗ＳＴＥＡＰ−１抗体による標準プロトコールの下で処置する。プロトコール設計は、腫瘍塊における減少ならびに標準化学療法の通常用量を減少させる能力によって評価される有効性に関係する。これらの投薬量減少により、化学療法薬剤の用量関連毒性を減少させることによるさらなる治療および／または延長治療が可能になる。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、幾つかの付属の臨床試験において、化学療法薬剤または抗新生物薬剤であるアドリアマイシン（進行前立腺癌）、シスプラチン（進行頭部癌および進行頸部癌ならびに進行肺癌）、タキソール（乳癌）、およびドキソルビシン（前臨床）を組み合わせて使用する。
【０５３８】
ＩＩ）単一療法：腫瘍の単一療法における抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の使用に関連して、これらの抗体を、化学療法剤または抗新生物薬剤を用いることなく患者に投与する。１つの実施形態において、単一療法は、広範な転移性癌を有する終末期癌患者において臨床的に実施される。患者は、幾分かの疾患安定性を示す。試験は、癌性腫瘍を有する無反応性患者において効果を示す。
【０５３９】
ＩＩＩ）画像化剤：放射性核種（例えば、ヨウ素またはイットリウム（Ｉ１３１、Ｙ９０））の抗ＳＴＥＡＰ−１抗体への結合を介して、放射標識された抗体を、診断薬剤および／または画像化剤として利用する。このような役割において、標識された抗体は、固形腫瘍、ならびにＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞の転移性病変の両方に局在化する。画像化剤としての抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の使用に関連して、これらの抗体を、外科手術前スクリーニングおよび術後フォローアップの両方の場合で、固形腫瘍の外科的処置の付属として使用し、腫瘍が残っているか、そして／または再発しているか否かを決定する。１つの実施形態において、（１１１Ｉｎ）−ＳＴＥＡＰ−１抗体を、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌を有する患者におけるフェーズＩヒト臨床試験において画像化剤として使用する（同様に、例えば、Ｄｉｖｇｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：９７〜１０４（１９９１）を参照のこと）。患者を、標準的な前方および後方からのガンマカメラによりフォローする。結果は、初期病変および転移病変が同定されたことを示す。
【０５４０】
（投与用量および投与経路）
当業者によって理解されるように、用量の考慮は、臨床でのアナログ産物との比較を通じて決定され得る。従って、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、５〜４００ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で投与し得、そして例えば、安全性試験と関連させて、より低い用量も使用し得る。標的に対する公知の抗体の親和性に対する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の親和性は、類似の用量レジメンを投与するために当業者によって使用される１つのパラメータである。さらに、完全ヒト抗体である抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、キメラ抗体と比較して、より遅い浄化値を有する；従って、このような完全ヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を有する患者における用量は、おそらく５０〜３００ｍｇ／ｍ２の範囲とより低く、そしてそれでも効果的なままである。従来のｍｇ／ｋｇ単位での用量の測定と対するように、ｍｇ／ｍ２単位の用量は、表面積に基づく測定値であり、幼児から成人まで患者の全てのサイズを含むように設計されている用量測定値である。
【０５４１】
３つの個別の送達アプローチは、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の送達について有用である。従来の静脈内送達は、多くの腫瘍に対する１つの標準的送達である。しかし、腹膜腔における腫瘍（例えば、卵巣、総胆管、他の胆管などの腫瘍）に関連して、腹腔内投与は、腫瘍での高用量の抗体を得るのに有利であり、また抗体浄化値を最小限にすることが証明され得る。類似の様式にて、特定の固形癌は、領域灌流に適切な脈管構造を有する。領域灌流により、腫瘍部位に対する高用量の抗体を可能にし、そして抗体の短期間浄化値を最小限にし得る。
【０５４２】
（臨床的開発計画（ＣＤＰ））
概論：ＣＤＰは、補助的治療、単独療法に関して、および造影剤としての、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の処置を追跡および開発する。試験は、最初に安全性を実証し、その後反復用量で効力を確認する。試験は、標準的な化学療法を、標準的治療＋抗ＳＴＥＡＰ−１抗体と比較する、オープンラベルである。理解されるように、患者の登録に関して利用され得る１つの基準は、生検によって決定されるような、患者の腫瘍におけるＳＴＥＡＰ−１の発現レベルである。
【０５４３】
任意のタンパク質または抗体注入ベースの治療を用いるときのように、安全性の考慮は、主に以下に関連する：（ｉ）サイトカイン放出症候群（すなわち、低血圧、発熱、震せん、寒気）；（ｉｉ）物質に対する免疫応答の発生（すなわち、患者による、抗体療法に対するヒト抗体の発生、またはＨＡＨＡ応答）；および（ｉｉｉ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する正常細胞に対する毒性。標準的な試験および追跡を、これらの安全性の考慮の各々をモニタリングするために利用する。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、ヒト投与の際に安全であることが見出される。
【０５４４】
（実施例４１：ヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体および化学療法剤を用いる、ヒト臨床試験補助治療）
第Ｉ期のヒト臨床試験を、固形腫瘍（例えば、表Ｉに列挙される組織の癌）の処置に関して、ヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の６つの静脈内用量の安全性を評価するために開始する。この研究において、抗新生物剤または化学療法剤（例えば、シスプラチン、トポテカン、ドキソルビシン、アドリアマイシン、タキソールなどであるが、これらに限定されない）に対する補助的治療として利用される場合、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の単回用量の安全性を、評価する。試験設計は、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の６つの単回用量の送達を含み、抗体の投薬量は、以下のスケジュールに従う処置過程にわたって、ほぼ約２５ｍｇ／ｍ２から約２７５ｍｇ／ｍ２まで増大する：
【０５４５】
【化２】
Figure 2005505271
抗体および化学治療剤のそれぞれの投与後、患者を１週間密接にフォローする。特に、上記の安全性の懸念：（ｉ）サイトカイン放出症候群（すなわち、低血圧、発熱、振せん（ｓｈａｋｉｎｇ）、悪寒）；（ｉｉ）その物質に対する免疫原性応答の発生（すなわち、ヒト抗体治療剤に対する、患者によるヒト抗体の発生、またはＨＡＨＡ応答）；ならびに（ｉｉｉ）ＳＴＥＡＰ−１を発現する正常細胞に対する毒性について、患者を評価する。標準的な試験および追跡試験を利用して、これらの安全性の懸案のそれぞれをモニターする。患者はまた、臨床結果について、そして特に、ＭＲＩまたは他の画像化によって証明されるような腫瘍重量の低減について、評価される。
【０５４６】
この抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、安全かつ有効であることが実証され、そして臨床試験フェーズＩＩはこの有効性を確認し、そして最適な投薬を洗練する。
【０５４７】
（実施例４２：ヒト臨床試験：ヒト抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を用いる単独治療法（ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ））
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、上で考察した付属試験に関して安全であり、フェーズＩＩヒト臨床試験は、単独治療法についての有効性および最適な投薬を確認する。このような試験が達成され、そして患者が抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の用量を受けると同時の化学療法を受けないことを除外する上記の付属試験に対して、同じ安全性および結果の分析を必要とする。
【０５４８】
（実施例４３：ヒト臨床試験：抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を用いる診断的画像化）
繰り返すと、上で考察した付属の治療法が上で考察した安全性の判定基準内で安全であるので、ヒト臨床試験は診断的造影剤としての抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の使用に関して行われる。このプロトコルは、当該分野で記載される様式と実質的に類似の様式で設計される（例えば、Ｄｉｖｇｉら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８３：９７−１０４（１９９１））。この抗体は、診断モダリティーとして使用される場合、安全かつ有効の両方であることが見出される。
【０５４９】
（実施例４４：既知配列とのＳＴＥＡＰ−１の相同性の比較）
ヒトＳＴＥＡＰタンパク質は、任意の公知のヒトタンパク質に対して高度の相同性を示さない。ＳＴＥＡＰファミリーのプロトタイプメンバー、ＳＴＥＡＰ−１ｖ．１、は、３３９アミノ酸からなるＩＩＩａ型膜タンパク質である。ＳＴＥＡＰ−１は、６回膜貫通ドメインのタンパク質であり、細胞内Ｎ末端および細胞内Ｃ末端を有する。
【０５５０】
ＳＴＥＡＰ−１は、以前にクローニングされた遺伝子、すなわち、マウスＴＮＦａ誘導関連タンパク質（ｇｉ｜１６９０５１３３｜）に対して幾分相同である。ＳＴＥＡＰ−１ｖ．１は、ＴＩＡＲＰと４０％の同一性および６３％の相同性を共有する。さらに、ＳＴＥＡＰ−１は、ラットｐＨｙｄｅタンパク質に対して相同性を示し、そのタンパク質に対して、４９％の同一性および７１％の相同性を共有する。ＴＩＡＲＰタンパク質は、細胞表面に局在する未知の機能の６膜貫通タンパク質である（Ｍｏｌｄｅｓ Ｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２００１、２７６：３３９３８）。ラットｐＨｙｄｅは、Ｄｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌細胞株において発現されたタンパク質である。ＤＵ１４５細胞におけるｐＨｙｄｅの過剰発現は、それらの腫瘍増殖特性を減少させる（Ｓｔｅｉｎｅｒ Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００、６０：４４１９）。さらに、ＳＴＥＡＰ１は、マウスの前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ｇｉ｜２０８２０４９２｜）に対して有意な相同性を示す。
【０５５１】
モチーフ分析により、いくつかのタンパク質機能モチーフの存在が示された（表ＸＸＩ）。プリント予測は、形質転換タンパク質Ｐ２１ ｒａｓサイン、およびフィブロネクチンＩＩＩ型繰り返しサインを同定したが、ブロック予測は、Ｈａｌｆ−Ａ−ＴＰＲ繰り返し、および砒素ポンプ膜タンパク質サインを同定した。フィブロネクチンＩＩＩ型繰り返し領域は、１００アミノ酸ドメインであり、これは、ＤＮＡ、ヘパリン、基底膜、および細胞表面への結合を媒介した。これらの繰り返しの主な役割は、細胞表面への結合であり、細胞接着を可能にし、シグナル伝達事象を媒介する。Ｈａｌｆ−Ａ−ＴＰＲ繰り返しは、いくつかのＲＮＡプロセシングタンパク質において見られるモチーフである。砒素ポンプは、イオンおよび低分子の流出において機能する（Ｗａｌｍｓｌｅｙ ＡＲら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１、２７６：６３７８−９１）。モチーフは、腫瘍化の初期の段階（例えば、腫瘍取り込みまたは腫瘍の樹立）を増強することにより、基底膜および周囲細胞への接着を可能にすることにより、イオンの細胞連絡および輸送を媒介することにより、腫瘍増殖および進行に関与し得る。
【０５５２】
従って、ＳＴＥＡＰ−１が、腫瘍樹立、腫瘍形成、腫瘍増殖、細胞シグナル伝達のレギュレーターとして、または生存、浸潤、腫瘍化、または増殖と関連した遺伝子の活性化に関与する転写のモジュレーターとして機能する場合、ＳＴＥＡＰ−１は、治療目的、診断目的、予後目的および／または予防目的のために使用される。さらに、分子（例えば、ＳＴＥＡＰ−１の改変体またはＳＮＰ）は、表Ｉに列挙された組織のような、癌性組織で発現される場合、それらは、治療目的、診断目的、予後目的および／または予防目的のために使用される。
【０５５３】
（実施例４５：転写の調節）
その配列内のＲＮＡプロセシングモチーフの存在に連結したＳＴＥＡＰ−１の局在は、ＳＴＥＡＰ−１が、真核生物の遺伝子の転写調節を調整することを示す。遺伝子発現の調節を、例えば、ＳＴＥＡＰ−１を発現するかまたは欠損する細胞における遺伝子発現を研究することによって確認する。この目的のために、２つの型の実験を行う。
【０５５４】
第１のセットの実験において、親細胞およびＳＴＥＡＰ−１発現細胞由来のＲＮＡを、抽出し、そして市販される遺伝子アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にハイブリダイズさせる（Ｓｍｉｄ−Ｋｏｏｐｍａｎ Ｅら Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０００．８３：２４６）。休止細胞とＦＢＳ、アンドロゲンまたは成長因子で処理した細胞とを比較する。示差的に発現した遺伝子を、当該分野で公知の手順に従って同定する。次いで、示差的に発現した遺伝子を、生物学的経路にマッピングする（Ｃｈｅｎ Ｋら Ｔｈｙｒｏｉｄ．２００１．１１：４１．）。
【０５５５】
第２のセットの実験において、特定の転写経路活性化を、市販されるルシフェラーゼレポーター構築物（ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＥＬＫ１−ｌｕｃ、ＡＲＥ−ｌｕｃ、ｐ５３−ｌｕｃおよびＣＲＥ−ｌｕｃを含む）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して評価する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に位置する公知の転写因子に対するコンセンサスな結合部位を含み、そして経路活性化を確かめるため、経路活性化のポジティブなモジュレーターおよびネガティブなモジュレーターについてスクリーニングするための良好なツールを表す。
【０５５６】
従って、ＳＴＥＡＰ−１は、遺伝子調節で役割を果し、そして診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
【０５５７】
（実施例４６：潜在的なシグナル伝達経路の同定および確認）
多くの哺乳動物のタンパク質は、シグナル伝達分子と相互作用し、そしてシグナル伝達経路を調節する役割を担うことが報告されている（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００１；７６：２１７−２２３）。特に、フィブロネクチンは、細胞有糸分裂を制御するＭＡＰＫシグナル伝達カスケードと関連している（Ｊｉａｎｇ Ｆ、Ｊｉａ Ｙ、Ｃｏｈｅｎ Ｉ．Ｂｌｏｏｄ．２００２、９９：３５７９）。さらに、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、いくつかのリン酸化部位を含み（表ＸＸＩを参照のこと）、これは、特異的なシグナル伝達カスケードとの関連を示す。免疫沈降技術およびウェスタンブロッティング技術を使用して、ＳＴＥＡＰ−１と結合し、そしてシグナル伝達事象を媒介するタンパク質を同定する。リン脂質経路（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴなど）、接着経路および移動経路（ＦＡＫ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ−１、β−カテニンなどを含む）、ならびにＥＲＫ、ｐ３８などのような有糸分裂／生存カスケードを含む、癌の生物学において役割を果たすことが知られるいくつかの経路（Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２０００，１１：２７９；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９９，２７４：８０１；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００，１９：３００３；Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７，１３８：９１３）が、ＳＴＥＡＰ−１によって調節され得る。ＳＴＥＡＰ−１の発現が、他になければ休止ＰＣ３細胞において活性でない、特異的なシグナル伝達経路を調節するのに十分であるか否かを決定するために、ｐ３８ＭＡＰＫカスケードの活性化におけるこれらの遺伝子の効果を、前立腺癌細胞株ＰＣ３において調査した（図２１Ａ〜Ｂ）。ｐ３８キナーゼの活性化は、チロシン残基およびセリン残基におけるそのリン酸化に依存する。リン酸化ｐ３８は、ホスホ−ｐ３８ ｍＡｂによって非リン酸化状態から区別され得る。このホスホ特異的Ａｂを用いて、操作されたＰＣ３細胞株においてｐ３８のリン酸化状態を研究した。
【０５５８】
ＳＴＥＡＰ−１ ｎｅｏを安定に発現するＰＣ３細胞を、１％または１０％のいずれかのＦＢＳ中で一晩増殖させた。全細胞溶解物を、ウェスタンブロッティングによって分析した。公知のｐ３８アクチベーター、ＮａＳａＩ、またはＴＮＦで処理したＰＣ３細胞をポジティブコントロールとして使用した。この結果は、コントロールのｎｅｏ遺伝子の発現が、ｐ３８リン酸化に何の影響も有さないが、ＰＣ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現が、ｐ３８経路の活性化を誘導することが十分であることを示す（図２１Ａ）。この結果は、抗ｐ３８ Ａｂを用いるウェスタンブロッティングを用いて確認した。このことは、ゲル上にローディングした等しいタンパク質を示す（図２１Ｂ）。
【０５５９】
別のセットの実験では、前立腺癌細胞株ＰＣ３におけるＳＴＥＡＰ−１の発現が有糸分裂ＭＡＰＫ経路（すなわち、ＥＲＫカスケード）を活性化するために十分であることを調べた（図２２Ａ〜Ｂ）。ＥＲＫの活性化は、チロシン残基およびセリン残基におけるそのリン酸化に依存する。リン酸化ＥＲＫは、ホスホ−ＥＲＫ ｍＡｂによる非リン酸化状態とは区別され得る。このホスホ特異的Ａｂを用いて、操作されたＰＣ３細胞株においてＥＲＫのリン酸化状態を研究した。ＰＣ３細胞（Ｒａｓの活性化形態を発現する）をポジティブコントロールとして使用した。
【０５６０】
この結果は、コントロールｎｅｏ遺伝子の発現はＥＲＫリン酸化において効果を有さないが、ＰＣ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現は、ＥＲＫリン酸化における増大を誘導するのに十分であることを示す（図２２Ａ）。これらの結果を、抗ＥＲＫウェスタンブロッティング（図２２Ｂ）を用いて確証し、そしてこのことは、ＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２によるＥＲＫ経路の活性化を確認する。
【０５６１】
ＦＢＳは、レセプター媒介ＥＲＫ活性化に寄与し得るいくつかの成分を含むので、本発明者らは、低いレベルおよび至適レベルのＦＢＳにおけるＳＴＥＡＰ−１の効果を調べた。ｎｅｏまたはＳＴＥＡＰ−１を発現するＰＣ３細胞を、０．１％または１０％のいずれかのＦＢＳ中で一晩増殖させた。抗ホスホ−ＦＲＫウェスタンブロッティングによって細胞を分析した。この実験は、ＳＴＥＡＰ−１が０．１％ＦＢＳ中でＥＲＫのリン酸化を誘導することを示し、そしてＳＴＥＡＰ−１の発現が、さらなる刺激因子の不在下でＥＲＫシグナル伝達カスケードの活性化を誘導するのに十分であることを確認する。
【０５６２】
ＳＴＥＡＰ−１が細胞内で、直接的または間接的に既知のシグナル伝達経路を活性化することを確認するために、個々の遺伝子を発現する細胞において、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ベースの転写レポーターアッセイを実行する。これらの転写レポーターは、十分に特徴付けられたシグナル伝達経路の下流に存在する、既知の転写因子についてのコンセンサス結合部位を含む。これらの関連転写因子、シグナル伝達経路、ならびに活性化刺激のレポーターおよび例を、以下に列挙する。
【０５６３】
１．ＮＦκＢ−ｌｕｃ、ＮＦκＢ／Ｒｅｌ；Ｉκ−キナーゼ／ＳＡＰＫ；増殖／アポトーシス／ストレス
２．ＳＲＥ−ｌｕｃ、ＳＲＦ／ＴＣＦ／ＥＬＫ１；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ；増殖／分化
３．ＡＰ−１−ｌｕｃ、ＦＯＳ／ＪＵＮ；ＭＡＰＫ／ＳＡＰＫ／ＰＫＣ；増殖／アポトーシス／ストレス
４．ＡＲＥ−ｌｕｃ、アンドロゲンレセプター；ステロイド／ＭＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
５．ｐ５３−ｌｕｃ、ｐ５３；ＳＡＰＫ；増殖／分化／アポトーシス
６．ＣＲＥ−ｌｕｃ、ＣＲＥＢ／ＡＴＦ２；ＰＫＡ／ｐ３８；増殖／アポトーシス／ストレス
７．ＴＣＦ−ｌｕｃ、ＴＣＦ／Ｌｅｆ；β−カテニン、接着／浸潤。
【０５６４】
遺伝子媒介性の影響を、ｍＲＮＡ発現を示す細胞においてアッセイし得る。ルシフェラーゼレポータープラスミドを、脂質媒介性トランスフェクション（ＴＦＸ−５０、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって導入し得る。細胞抽出物をルシフェリン基質と共にインキュベートすることによって、相対的な転写活性の指標であるルシフェラーゼ活性を測定し、そしてこの反応の発光をルミノメーターでモニタリングする。
【０５６５】
ＳＴＥＡＰ−１によって活性化されるシグナル伝達経路をマップし、そして治療標的の同定および確認のために使用する。ＳＴＥＡＰ−１は細胞シグナル伝達に関与するので、これは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的の標的として使用される。
【０５６６】
（実施例４７：腫瘍進行との関与）
形質転換および進行におけるタンパク質の形質転換の考証された役割に基づいて、このＳＴＥＡＰ−１遺伝子は、癌細胞の増殖および形質転換に寄与し得る。腫瘍増殖におけるＳＴＥＡＰ−１の役割は、種々の初代細胞株およびトランスフェクトした細胞株（前立腺細胞株、ならびにＳＴＥＡＰ−１を安定に発現するよう操作されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞が挙げられる）において確認される。ＳＴＥＡＰ−１を欠いた親細胞およびＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を、十分に記載された増殖アッセイ（Ｆｒａｓｅｒ ＳＰ、Ｇｒｉｍｅｓ ＪＡ、Ｄｊａｍｇｏｚ ＭＢ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ．２０００；４４：６１，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＥ，Ｏｃｈｉｅｎｇ Ｊ，Ｅｖａｎｓ ＳＬ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ．１９９６，７：２８８）を使用して細胞増殖について評価する。
【０５６７】
形質転換プロセスにおけるＳＴＥＡＰ−１の役割を確認するために、コロニー形成アッセイにおいてその影響を調査する。ストリンジェントな条件下およびより許容的な条件下でのソフトアガーアッセイ（Ｓｏｎｇ Ｚ．ら Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００；６０：６７３０）を使用して、ＳＴＥＡＰ−１を欠いた親ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、ＳＴＥＡＰ−１を発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞と比較する。
【０５６８】
癌細胞の浸潤および転移におけるＳＴＥＡＰ−１の役割を確認するために、十分に確立されたアッセイを使用する（例えば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｉｎｓｅｒｔ Ｓｙｓｔｅｍアッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：６０１０）。コントロール細胞（ＳＴＥＡＰ−１を欠損する前立腺細胞株、胸部細胞株、および腎細胞株を含む）を、ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞と比較する。細胞に、蛍光染料（カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）をロードし、そして細胞を基底膜アナログでコートされたトランスウェル挿入物（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ））の上部ウェル中にプレートする。浸潤を、細胞集団全体の蛍光に対する、下方チャンバー中の細胞の蛍光によって決定する。
【０５６９】
ＳＴＥＡＰ−１はまた、細胞周期およびアポトーシスにおいて役割を果たし得る。親細胞およびＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を、十分に確立されたＢｒｄＵアッセイ（Ａｂｄｅｌ−Ｍａｌｅｋ ＺＡ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８８，１３６：２４７）を使用して細胞周期調節における差異について比較する。簡単に言えば、細胞を、最適な条件下（十分な血清）および制限条件下（低血清）の両方で増殖させ、ＢｒｄＵで標識し、そして抗ＢｒｄＵ Ａｂおよびヨウ化プロピジウムで染色する。細胞を、細胞周期のＧ１期、Ｓ期およびＧ２Ｍ期への進入について分析する。あるいは、アポトーシスに対するストレスの効果を、コントロール親細胞およびＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞（正常および腫瘍性の前立腺細胞を含む）において評価する。操作された細胞および親細胞を、様々な化学療法剤（例えば、エトポシド、タキソールなど）およびタンパク質合成インヒビター（例えば、シクロヘキシミド）で処理する。細胞を、アネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色し、そして細胞死をＦＡＣＳ分析によって測定する。ＳＴＥＡＰ−１による細胞死の調整は、腫瘍進行および腫瘍負荷の調節において重大な役割を果し得る。
【０５７０】
ＳＴＥＡＰ−１が細胞増殖、形質転換、浸潤またはアポトーシスにおいて役割を果す場合、それは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
【０５７１】
（実施例４８：新脈管形成との関係）
新脈管形成または新しい毛細血管形成は、腫瘍増殖に必要である（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ，Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．；Ｃｅｌｌ．１９９６，８６：３５３；Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９９８ １３９：４４１）。ホスホジエステラーゼインヒビターの効果に基づいて、ＳＴＥＡＰ−１は、新脈管形成において役割を演じる）ＤｅＦｏｕｗ Ｌら、Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ２００１、６２：２６３）。いくつかのアッセイが、インビトロおよびインビボでの新脈管形成を測定するために開発された（例えば、内皮細胞管形成および内皮細胞増殖についての組織培養アッセイ）。これらのアッセイおよびインビトロでの新血管新生を使用して、新脈管形成におけるＳＴＥＡＰ−１の役割（増強または阻害）を確認する。
【０５７２】
例えば、ＳＴＥＡＰ−１を発現するように操作された内皮細胞を、管形成アッセイおよび増殖アッセイを使用して評価する。ＳＴＥＡＰ−１の効果はまた、インビボで動物モデルにおいて確認する。例えば、ＳＴＥＡＰ−１を発現するかまたは欠損するいずれかの細胞を、免疫無防備状態マウスの皮下に移植する。内皮細胞遊走および新脈管形成を、５〜１５日後、免疫組織化学的技術を使用して評価する。ＳＴＥＡＰ−１は、新脈管形成に影響し、そしてそれは、診断目的、予後目的、予防目的および／または治療目的のための標的として使用される。
【０５７３】
（実施例４９：タンパク質−タンパク質相互作用における関与）
フィブロネクチンモチーフは、他のタンパク質（細胞表面タンパク質を含む）との相互作用を媒介することが示されている。免疫沈降技術および酵母ツーハイブリッドシステムを使用して、ＳＴＥＡＰ−１と会合するタンパク質を同定する。ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞およびＳＴＥＡＰ−１を欠損する細胞からの免疫沈降物を、特定のタンパク質−タンパク質会合について比較する。
【０５７４】
研究を、エフェクター分子（例えば、核タンパク質、転写因子、キナーゼ、ホスファターゼなど）とＳＴＥＡＰ−１との会合の程度を確認するために行う。ＳＴＥＡＰ−１ポジティブ細胞およびＳＴＥＡＰ−１ネガティブ細胞を比較する研究、および刺激されない細胞／休止細胞と上皮細胞アクチベーター（例えば、サイトカイン、成長因子、アンドロゲンおよび抗インテグリンＡｂ）で処理された細胞を比較する研究は、独特の相互作用を明らかにする。
【０５７５】
さらに、タンパク質−タンパク質相互作用を、酵母ツーハイブリッド方法論を使用して確認する（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１９９９，３：６４）。転写因子の活性化ドメインに融合したタンパク質のライブラリーを保有するベクターを、ＳＴＥＡＰ−１−ＤＮＡ−結合ドメイン融合タンパク質およびレポーター構築物を発現する酵母へと導入する。タンパク質−タンパク質相互作用を、比色レポーター活性によって検出する。エフェクター分子と転写因子との特異的会合は、当業者をＳＴＥＡＰ−１の作用様式に導き、従って、癌に対する治療的、予後的および／または予防的標的を同定する。このアッセイおよび類似のアッセイをまた使用してＳＴＥＡＰ−１と相互作用する低分子を同定し、そしてこのような低分子についてスクリーニングする。
【０５７６】
従って、ＳＴＥＡＰ−１は、タンパク質および低分子と会合することが見出される。従って、ＳＴＥＡＰ−１ならびにこれらのタンパク質および低分子を、診断的、予後的、予防的および／または治療的目的のために使用する。
【０５７７】
（実施例５０：低分子輸送および細胞−細胞連絡におけるＳＴＥＡＰ−１の関与）
細胞−細胞連絡は、器官の完全性および恒常性（この両方は、腫瘍形成および腫瘍増殖の間、調節不全となる）を維持するのに必須である。細胞間連絡は、２つの型のアッセイを使用して測定され得る（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５：２５２０７）。第１のアッセイにおいて、蛍光色素を用いてロードされた細胞を、標識されていないレシピエント細胞の存在下でインキュベートし、そして細胞集団を、蛍光顕微鏡下で調べる。この定性的アッセイは、隣接する細胞の間の色素の交換を測定する。第２のアッセイ系において、ドナー細胞集団およびレシピエント細胞集団を、上記のように処理し、そしてレシピエント細胞集団の定量測定を、ＦＡＣＳ分析によって行う。これらの２つのアッセイ系を使用して、ＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞が、ＳＴＥＡＰ−１を発現しないコントロールと比較され、そしてＳＴＥＡＰ−１が細胞連絡を増強することが見出される。図１９および図２０は、ＳＴＥＡＰ−１が、隣接細胞間での低分子カルセインの転移を媒介し、それにより、前立腺癌細胞における細胞−細胞連絡を調節することを示す。この実験では、レシピエントＰＣ３細胞をデキストラン−テキサスレッドで標識し、そしてドナーＰＣ３細胞をカルセインＡＭ（緑色）で標識した。ドナー（緑色）細胞およびレシピエント（赤色）細胞を３７℃で同時培養し、テキサスレッドおよびカルセインの同時局在について顕微鏡によって分析した。この結果は、ＰＣ３コントロール細胞（検出可能なＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現なし）がカルセイン転移をほとんど示さないのに対し、ＳＴＥＡＰ−１の発現は、細胞間での低分子の転移を可能にし（図１９）、それにより開始時に赤色のレシピエント細胞が、褐色がかった色になり、赤色分子および緑色分子が同時局在することを示す。ＳＴＥＡＰ−１により媒介された細胞−細胞連絡を調整する低分子および／または抗体は、ＳＴＥＡＰ−１を発現する癌についての治療薬として使用される。図２０は、ＳＴＥＡＰ−１により媒介される細胞−細胞連絡の時間依存性様式を示し、ここでは、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞における転移が、６時間ではほとんど見られず、多くの転移が２４時間で見られる。図２３は、ＳＴＥＡＰ−１の発現が、低分子の転移が生じるために、ドナー集団およびレシピエント集団の両方において必要であることを示す。この実験では、デキストランレッドで標識されたドナー細胞をカルセイン（緑色）で標識されたレシピエント細胞とインキュベートした。しかし、ＰＣ３ドナー集団をＰＣ３レシピエント集団と、またはＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１レシピエント集団とインキュベートするように、ドナー集団およびレシピエント集団とを交代した。同様に、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１ドナー集団をＰＣ３またはＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１レシピエント集団と同時培養した。この結果は、コントロールＰＣ３およびＰＣ３細胞の同時培養が、カルセイン転移を媒介し得ないことを示す。同様に、コントロールＰＣ３およびＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１の同時インキュベーションは、カルセインを転移させない。しかし、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１ドナーおよびＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１レシピエント細胞の同時培養は、同じ細胞における緑色色素および赤色色素の同時局在によって示されるように、低分子転移を媒介する。まとめると、図１９、２０、および２３に示されたデータは、ＳＴＥＡＰ−１が、低分子転移を媒介し、そしてギャップ接合部に対する機能が類似する細胞間連絡チャネルを形成することにより、細胞−細胞連絡を調節することを示す。
【０５７８】
従って、ＳＴＥＡＰ−１は、細胞−細胞連絡および低分子輸送において機能するので、これは、診断的、予後的、予防的および／または治療的目的のための標的またはマーカーとして使用される。
【０５７９】
（実施例５１：イオン輸送におけるＳＴＥＡＰ−１の関与）
ＳＴＥＡＰ−１の位置決めおよび位相幾何学は、トランスポーターとしてのその機能を支持する。ＳＴＥＡＰ−１がイオンチャネルとして機能することを確認するために、ＦＡＣＳ分析および蛍光顕微鏡技術を使用する（Ｇｅｒｇｅｌｙ Ｌら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７；４：７０；Ｓｋｒｙｍａ Ｒら、Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０００，５２７：７１）。ＦＡＣＳ分析および市販の指標（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、親細胞およびＳＴＥＡＰ−１を発現する細胞を、カルシウムを輸送する能力についてそれらを比較した。前立腺癌ＰＣ３細胞株を、これらの研究に使用した。例えば、カルシウム応答性指標（Ｆｌｕｏ４およびＦｕｒａ ｒｅｄ）をロードされたＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞を、カルシウムおよびリポホスファチド（ｌｉｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＰＡ）の存在または非存在下でインキュベートし、そしてフローサイトメトリーによって分析した。図１７は、ＳＴＥＡＰ−１が、ＬＰＡに応じてカルシウム流動を増大したことを示す。このデータは、癌細胞が調節される重要な機構を評価する。これは、カルシウムチャネルインヒビターが、特定の癌細胞（前立腺癌細胞株を含む）の死を誘導することが報告されたので、カルシウムの場合に特にあてはまる（Ｂａｔｒａ Ｓ、Ｐｏｐｐｅｒ ＬＤ、Ｈａｒｔｌｅｙ−Ａｓｐ Ｂ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ．１９９１、１９：２９９）。
【０５８０】
さらに、図１８は、ＳＴＥＡＰ−１媒介カルシウム輸送は、カルシウムの細胞内レベルを調節することにより、前立腺癌増殖を調節することを示す。この研究において、コントロールＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞をイオンチャネルインヒビター（すなわち、アミロリド、ＮＤＧＡ、およびＴＥＡと呼ばれ、これらは、それぞれ、ナトリウム、カルシウム、およびカリウムの輸送を阻害する）の存在または不在下で増殖させた。ＳＴＥＡＰ−１発現は、ＰＣ３細胞をＣａ＋＋チャネルインヒビターＮＤＧＡでの処理に感受性とした。ＰＣ３コントロール細胞は、インヒビターＮＤＧＡの存在下で１００％増殖を示したが、５０μＭで、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞の増殖を４２％阻害し、そして１０例の５１μＭ ＮＤＧＡは増殖を２０％阻害した。これらの所見は、このタンパク質を発現する癌細胞の増殖におけるカルシウム輸送のレギュレーターとしてのＳＴＥＡＰ−１の重要性を確証する。従って、ＳＴＥＡＰ−１は、前立腺癌細胞の増殖を制御する治療様式において使用される。ＳＴＥＡＰ−１は、イオン輸送において機能するので、それは、診断的、予後的、予防的および治療的目的のための標的またはマーカーとして使用される。
【０５８１】
（実施例５２：ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡｉ））
ＲＮＡインターフェアレンス（ＲＮＡｉ）は、遺伝子発現を妨害するために配列特異的な二本鎖ＲＮＡを使用する。低分子の干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、哺乳動物細胞にトランスフェクトされ、そしてそれにより配列特異的なｍＲＮＡ分解を媒介する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１；ｖｏｌ．４１１：４９４−４９８）。以下のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド配列を使用した：
【０５８２】
【化３】
Figure 2005505271
ＳＴＥＡＰ−１のセンス鎖（１）をフルオロセイン、６−ＦＡＭ（ＡＢＳ ４９４ｎｍ、ＥＭＭ ５２５ｎｍ、緑色）で３’に標識する。ｓｉＲＮＡをＲＮＡ非含有滅菌緩衝液（１００ｍＭ ＫＯＡｃ、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＫＯＨ，２ｍＭ ＭＯＡｃ（ｐＨ７．４））中に溶解し、２０μＭストック（２００×）を作製する。ｓｉＲＮａを、オリゴフェクタミン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するウェルプレート上に播種されたＬＮＣａＰ細胞、３Ｔ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞、およびＲａｔ−１−ＳＴＥＡＰ−１細胞にトランスフェクトする。ｓｉＲＮＡの最終濃度は１００×ｎＭであった。以下のオリゴヌクレオチドをコントロールとして使用し、ＳＴＥＡＰ−１ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドのいかなる非特異的効果も排除した：
【０５８３】
【化４】
Figure 2005505271
免疫染色、その後のフローサイトメトリーによって、トランスフェクション２４時間後のタンパク質発現を検出した。さらに、遺伝子発現変化の確認をウェスタンブロッティングによって行った。結果（図２４）は、ＳＴＥＡＰ−１特異的ＲＮＡｉの導入が組換え３Ｔ３細胞およびＲａｔ−１細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を減少したことを示す。３Ｔ３細胞およびＲａｔ−１細胞を透過処理し、抗ＳＴＥＡＰ−１ポリクローナル抗体で染色した。細胞全体免疫染色により、ＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡｉは、Ｒａｔ−１細胞および３Ｔ３細胞においてＳＴＥＡＰ−１発現を減少することを明らかにした。この減少は、ウェスタンブロット分析によって確認された。ウェスタンブロット分析では、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質が、コントロール細胞および未処理細胞に対して、ＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡｉ処理細胞において実質的に減少した。さらに、図２５に示されるように、ＲＮＡｉは、前立腺癌細胞株およびＬＮＣａＰ細胞株においてＳＴＥＡＰ−１の内因性発現を減少する。
【０５８４】
従って、このＲＮＡオリゴヌクレオチド配列は、治療的および予防的適用において使用される。さらに、ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列は、ＳＴＥＡＰ−１遺伝子の発現の調整がいかにして癌の細胞および／または組織の機能に影響するかを評価するために使用される。
【０５８５】
（実施例５３：ＳＴＥＡＰ−１機能の調整）
イオン輸送は、細胞増殖細胞内透過性、分子輸送およびシグナル伝達を調節する重要な役割を演じ（Ｍｉｎｋｅ Ｂ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００１、２１：６２９；Ｇｏｌｏｖｉｎａら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１、２８０：Ｈ７４６）、これらは、新生物性状態に特に関連する機能である。細胞−細胞連絡は、恒常性、細胞増殖、および細胞死を調節し（Ｅｖａｎｓ ＷＨ、Ｍａｒｔｉｎ ＰＥ、Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２００２ １９：１２１；Ｃａｒｒｕｂａ Ｇら、Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２００２、９６３：１５６）、これらは、新生物性状態に特に関連する機能である。
【０５８６】
コントロール細胞株およびＳＴＥＡＰ−１発現細胞株を用いて、ＳＴＥＡＰ−１機能のインヒビターを同定する。例えば、ＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞は、ｍＡｂまたは低分子インヒビターの存在または不在下でインキュベートされ得る。これらのｍＡｂまたは低分子インヒビターの効果を、上記のイオン流動アッセイ、細胞連絡アッセイ、増殖アッセイおよびシグナル伝達アッセイを用いて調べる。
【０５８７】
輸送因子により媒介されるシグナル伝達および生物学的発現（ｏｕｔｐｕｔ）は、種々の機構（レセプターおよびリガンド結合の阻害、イオンアンタゴニスト、タンパク質相互作用、イオンおよび低分子輸送の調節などを含む）を通じて媒介され得る（Ｔａｎｇ Ｗら、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ ２００２、７：１５８３）。コントロール細胞株およびＳＴＥＡＰ−１発現細胞株を用いて、ＳＴＥＡＰ−１機能のモジュレーター（インヒビターまたはエンハンサー）を同定する。例えば、ＰＣ３細胞およびＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞を、ｍＡｂまたは低分子モジュレーターの存在または不在下でインキュベートする。本明細書中に開示されたＳＴＥＡＰ−１の機能を考慮して、本発明の文脈において使用されるイオンチャネル遮断因子であるモジュレーターとしては、アミロジピン、アズレン、ジヒドロピリジン、チアニン、ニフェジピン、バラパミル、およびそれらの誘導体のような化合物が挙げられ（Ｔａｎａｋａ Ｙ、Ｓｈｉｇｅｎｏｂｕ Ｋ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖ．２００１ １９：２９７；Ｄｊｕｒｉｃ Ｄ、Ｍｉｔｏｖｉｃ Ｖ、Ｊａｋｏｖｌｊｅｖｉｃ Ｖ．Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．２００２、５２：３６５；Ｋｏｕｒｉｅ ＪＩ、Ｗｏｏｄ ＨＢ．Ｐｒｏｇ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０００；７３：９１）；そして、本発明の文脈において使用される細胞連絡のインヒビターであるモジュレーターとしては、βグリシルレチン酸、レチノイド、ＴＰＡのような化合物が挙げられる（Ｋｒｕｔｏｖｓｋｉｋｈ ＶＡら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００２、２１：１９８９；Ｒｕｄｋｉｎら、Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ．２００２、１０３：１８３；Ｒｕｃｈ Ｊら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１、８３：１６３）。従って、ｍＡｂまたは低分子インヒビターの効果を、上記実施例に記載のイオン流動アッセイ、細胞連絡アッセイ、増殖アッセイおよびシグナル伝達アッセイを用いて調べる。
【０５８８】
ｍＡｂおよび低分子は、ＳＴＥＡＰ−１の輸送および腫瘍形成機能を調整（例えば、阻害）する場合、それらは、診断的、予後的、予防的および／または治療的目的のために使用される。
【０５８９】
本出願の全体にわたって、様々なウェブサイトのデータコンテンツ、刊行物、特許出願および特許を参照する。ウェブサイトは、Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌｏｃａｔｏｒ（またはＵＲＬ）によって、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ＷＷＷ．）上のアドレスを付与される。
【０５９０】
本発明は、本明細書中に開示される実施形態によって範囲を限定されるべきでなく、この実施形態は、本発明の個々の局面の一つの例示として意図され、そして任意の機能的な等価物も、本発明の範囲内である。本明細書中に記載される改変に加えて、本発明のモデルおよび方法に対する種々の改変が、先の説明および教示から当業者に明らかになり、そして本発明の範囲内にあることが同様に意図される。このような改変または他の実施形態は、本発明の真の範囲および精神から逸脱することなく実行され得る。
【０５９１】
表：
（表Ｉ：悪性である場合にＳＴＥＡＰ−１を発現する組織）
胃
直腸
（表ＩＩ：アミノ酸略号）
【０５９２】
【表２】
Figure 2005505271
（表ＩＩＩ：アミノ酸置換マトリクス）
ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリクス（ブロック置換マトリクス）ＧＣＧソフトウェア９．０から適合した。より値が高いほど、関連する天然のタンパク質において、より多くの置換が見出される。（ＷＷＷ ＵＲＬ：ｉｋｐ．ｕｎｉｂｅ．ｃｈ／ｍａｎｕａｌ／ｂｌｏｓｕｍ６２．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【０５９３】
【表３】
Figure 2005505271
（表ＩＶ）
ＨＬＡクラスＩ／ＩＩモチーフ／スーパーモチーフ
（表ＩＶ（Ａ）：ＨＬＡクラスＩ スーパーモチーフ／モチーフ）
【０５９４】
【表４Ａ】
Figure 2005505271
太字の残基が、好ましく、イタリック体の残基はそれほど好ましくない。ペプチドが上の表で特定されるモチーフまたはスーパーモチーフに関する一次アンカー位置に一次アンカーを有している場合に、そのペプチドはモチーフを有していると考えられる。
【０５９５】
（表ＩＶ（Ｂ）；ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフ）
【０５９６】
【表４Ｂ】
Figure 2005505271
【０５９７】
【表４Ｃ】
Figure 2005505271
【０５９８】
【表４Ｄ】
Figure 2005505271
【０５９９】
【表４Ｅ−１】
Figure 2005505271
【０６００】
【表４Ｅ−２】
Figure 2005505271
【０６０１】
【表４Ｅ−３】
Figure 2005505271
【０６０２】
【表５】
Figure 2005505271
Figure 2005505271
Figure 2005505271
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【図面の簡単な説明】
【０６０３】
【図１】４３６ヌクレオチドのＳＴＥＡＰ−１ ＳＳＨ配列。
【図２Ａ】ＳＴＥＡＰ−１改変体１（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１」または「ＳＴＥＡＰ−１改変体１」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ａに示す。開始メチオニンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸６６〜１０８５にまたがる。
【図２Ｂ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体２（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｂに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｂ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体２（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｂに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｃ】ＳＴＥＡＰ−１改変体３（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｃに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜９４４にまたがる。
【図２Ｄ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体４（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図２Ｄに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｄ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体４（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図２Ｄに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｅ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体５のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．５」とも呼ばれる）を、図２Ｅに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｅ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体５のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．５」とも呼ばれる）を、図２Ｅに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｆ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体６（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．６」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｆに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｆ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体６（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．６」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｆに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｇ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体７（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．７」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｇに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｇ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体７（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．７」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｇに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｈ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体８（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．８」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｈに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｈ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体８（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．８」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｈに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｉ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体９（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．９」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｉに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｉ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体９（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．９」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｉに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｊ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体１０（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１０」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｊに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｊ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体１０（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１０」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｊに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｋ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体１１（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１１」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｋに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｋ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体１１（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１１」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｋに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｌ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体１２（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１２」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｌに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｌ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体１２（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１２」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｌに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｍ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体１３（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１３」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図２Ｍに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｍ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体１３（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１３」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図２Ｍに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｎ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体１４（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１４」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｎに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｎ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体１４（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１４」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｎに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｏ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体１５（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１５」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図２Ｏに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｏ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体１５（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１５」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図２Ｏに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。このオープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｐ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体１６（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１６」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｐに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｐ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体１６（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１６」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｐに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。
【図２Ｑ−１】ＳＴＥＡＰ−１改変体１７（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１７」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｑに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。本明細書中で用いられる場合、ＳＴＥＡＰ−１に対する言及は、図１０および図１２に示す改変体を含め、それらの全ての改変体を包含する。
【図２Ｑ−２】ＳＴＥＡＰ−１改変体１７（「ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１７」とも呼ばれる）のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、図２Ｑに示す。開始メチオニンについてのコドンに下線を付す。オープンリーディングフレームは、停止コドンを含め、核酸９６〜８７２にまたがる。本明細書中で用いられる場合、ＳＴＥＡＰ−１に対する言及は、図１０および図１２に示す改変体を含め、それらの全ての改変体を包含する。
【図３】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１のアミノ酸配列を図３Ａに示す；これは、３３９アミノ酸を有する。ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．２のアミノ酸配列を、図３Ｂに示す；これは、２５８アミノ酸を有する。ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．３のアミノ酸配列を、図３Ｃに示す；これは、２８２アミノ酸を有する。ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．４のアミノ酸配列を、図３Ｄに示す；これは、２５８アミノ酸を有する。本明細書中で用いられる場合、ＳＴＥＡＰ−１に対する言及は、図１１に示す改変体を含め、それらの全ての改変体を包含する。
【図４Ａ】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１とマウスＴＮＦα誘発性脂肪関連タンパク質（ｇｉ／１６９０５１３３）とのアミノ酸配列整列を、図４Ａに示す。
【図４Ｂ】ＳＴＥＡＰ−１ ｖ．１とラットｐＨｙｄｅタンパク質（ｇｉ／２１７１７６６５／）とのアミノ酸配列整列を、図４Ｂに示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＳＴＥＡＰ−１と前立腺のマウス６回膜貫通上皮抗原（ｇｉ｜２０８２０４９２｜）との相同性を示す。
【図５】ＳＴＥＡＰ−１改変体１の親水性アミノ酸プロファイル。
【図５Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスしたＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓの方法（Ｈｏｐｐ Ｔ．Ｐ．，Ｗｏｏｄｓ Ｋ．Ｒ．，１９８１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４−３８２８）の方法を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定した、ＳＴＥＡＰ−１改変体３の親水性アミノ酸プロファイル。
【図６】ＳＴＥＡＰ−１改変体１のヒドロパシーアミノ酸プロファイル。
【図６Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスしたＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｋｙｔｅ Ｊ．，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ．Ｆ．，１９８２．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２）を用いたコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定した、ＳＴＥＡＰ−１改変体３のヒドロパシーアミノ酸プロファイル。
【図７】ＳＴＥＡＰ−１改変体１のパーセント接触可能残基アミノ酸プロファイル。
【図７Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスしたＪａｎｉｎの方法（Ｊａｎｉｎ Ｊ．，１９７９ Ｎａｔｕｒｅ ２７７：４９１−４９２）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定した、ＳＴＥＡＰ−１改変体３のパーセント接触可能残基アミノ酸プロファイル。
【図８】ＳＴＥＡＰ−１改変体１の平均可橈性アミノ酸プロファイル。
【図８Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスしたＢｈａｓｋａｒａｎおよびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙの方法（Ｂｈａｓｋａｒａｎ Ｒ．，およびＰｏｎｎｕｓｗａｍｙ Ｐ．Ｋ．，１９８８．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３２：２４２−２５５）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定した、ＳＴＥＡＰ−１改変体３の平均可橈性アミノ酸プロファイル。
【図９】ＳＴＥＡＰ−１改変体１のβ−ターンアミノ酸プロファイル。
【図９Ａ】ＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバを通してワールドワイドウェブ（ＵＲＬ ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ．ｐｌ）に位置するＰｒｏｔＳｃａｌｅウェブサイト上でアクセスしたＤｅｌｅａｇｅおよびＲｏｕｘの方法（Ｄｅｌｅａｇｅ，Ｇ．，Ｒｏｕｘ Ｂ．１９８７ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：２８９−２９４）を用いてコンピュータアルゴリズム配列解析によって決定した、ＳＴＥＡＰ−１改変体３のβ−ターンアミノ酸プロファイル。
【図１０】８Ｐ１Ｄ４のＳＮＰ改変体の模式的整列。改変体８Ｐ１Ｄ４ ｖ．４〜８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１７は、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２と比較して１ヌクレオチドの相違を有する改変体である。これらのＳＮＰ改変体は別々に示されているが、これらはまた、任意の組み合わせで、そしてこれらの塩基対を含む任意の転写産物改変体（例えば、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１および８Ｐ１Ｄ４ ｖ．３）において生じ得る。番号は、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２の番号に対応する。黒四角は、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２と同じ配列を示す。ＳＮＰをこの四角の上に示す。
【図１１】８Ｐ１Ｄ４の転写産物改変体のエキソン構成。この図は、ポリＡテールを含まない転写産物改変体の構造を示す。改変体８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２および８Ｐ１Ｄ４ ｖ．３は、同じエキソン２およびエキソン３を共有する、転写産物改変体である。８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１の第１エキソンは、他の２つの転写産物改変体の第１エキソンよりも、５’末端にて３０塩基短い。８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２の第４エキソンは、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１のエキソン４、イントロン４およびエキソン５の組み合わせと同じである。８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１と比較して、改変体８Ｐ１Ｄ４ ｖ．３は、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１のイントロン４からスプライシングされたさらなるエキソンを有する。イントロンおよびエキソンの長さは、比例していない。
【図１２】８Ｐ１Ｄ４のタンパク質改変体の模式的整列。タンパク質改変体は、ヌクレオチド改変体に対応する。図１０におけるヌクレオチド改変体８Ｐ１Ｄ４ ｖ．５〜８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１７は、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．２と同じタンパク質をコードする。図１１に示されるような転写産物改変体８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１および８Ｐ１Ｄ４ ｖ．３から翻訳されたタンパク質は、アミノ酸Ｆ（Ｐｈｅ）またはＬ（Ｌｅｕ）を１６９位に含み得る。１アミノ酸の相違を四角の上に示した。黒四角は、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１と同じ配列を表す。塗りつぶしパターンの異なる四角は、異なる配列を示す。四角の下の数字は、８Ｐ１Ｄ４ ｖ．１に対応する。
【図１３Ａ】８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体についての二次構造および膜貫通ドメイン推定。８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体１（配列番号９３）（図１３ａ）の二次構造を、ワールドワイドウェブの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）に位置するＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバからアクセスした、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）を用いて推定した。この方法は、αヘリックス、延びた鎖、およびランダムコイルの存在および位置を、一次タンパク質配列から推定する。所定の二次構造におけるタンパク質のパーセントもまた列挙する。
【図１３Ｂ】８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体についての二次構造および膜貫通ドメイン推定。８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体２（配列番号９４）（図１３ｂ）の二次構造を、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）に位置するＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバからアクセスした、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）を用いて推定した。この方法は、αヘリックス、延びた鎖、およびランダムコイルの存在および位置を、一次タンパク質配列から推定する。所定の二次構造におけるタンパク質のパーセントもまた列挙する。
【図１３Ｃ】８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体についての二次構造および膜貫通ドメイン推定。８Ｐ１Ｄ４タンパク質改変体３（配列番号９５）（図１３ｃ）の二次構造を、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）に位置するＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバからアクセスした、ＨＮＮ−Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ法（Ｇｕｅｒｍｅｕｒ，１９９７，ｈｔｔｐ：／／ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｎｎ．ｈｔｍｌ）を用いて推定した。この方法は、αヘリックス、延びた鎖、およびランダムコイルの存在および位置を、一次タンパク質配列から推定する。所定の二次構造におけるタンパク質のパーセントもまた列挙する。
【図１３Ｄ−Ｅ】図１３（ｄ）：ＴＭＢＡＳＥを利用するＨｏｆｍａｎｎおよびＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ．ＴＭＢＡＳＥ−Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４：１６６，１９９３）に基づく、８Ｐ１Ｄ４改変体１の膜貫通領域の存在確率および配向の模式的表示（図１３（ｄ））。図１３（ｅ）：Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、およびＫｒｏｇｈのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Ｅｒｉｋ Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈ：Ａ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｉｎ Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７５−１８２頁、Ｊ．Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｔ．Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ，Ｆ．Ｍａｊｏｒ，Ｒ．Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ，およびＣ．Ｓｅｎｓｅｎ編、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ：ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）に基づく、８Ｐ１Ｄ４改変体１の膜貫通領域の存在確率ならびに細胞外および細胞内配向の模式的表示（図１３（ｅ））。ＴＭｐｒｅｄアルゴリズムおよびＴＭＨＭＭアルゴリズムは、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）に位置するＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバからアクセスされる。
【図１３Ｆ−Ｇ】図１３（ｆ）：ＴＭＢＡＳＥを利用するＨｏｆｍａｎｎおよびＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ．ＴＭＢＡＳＥ−Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４：１６６，１９９３）に基づく、８Ｐ１Ｄ４改変体２の膜貫通領域の存在確率および配向の模式的表示（図１３（ｆ））。図１３（ｇ）：Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、およびＫｒｏｇｈのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Ｅｒｉｋ Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈ：Ａ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｉｎ Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７５−１８２頁、Ｊ．Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｔ．Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ，Ｆ．Ｍａｊｏｒ，Ｒ．Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ，およびＣ．Ｓｅｎｓｅｎ編、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ：ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）に基づく、８Ｐ１Ｄ４改変体２の膜貫通領域の存在確率ならびに細胞外および細胞内配向の模式的表示（図１３（ｇ））。ＴＭｐｒｅｄアルゴリズムおよびＴＭＨＭＭアルゴリズムは、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）に位置するＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバからアクセスされる。
【図１３Ｈ−Ｉ】図１３（ｈ）：ＴＭＢＡＳＥを利用するＨｏｆｍａｎｎおよびＳｔｏｆｆｅｌのＴＭｐｒｅｄアルゴリズム（Ｋ．Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｗ．Ｓｔｏｆｆｅｌ．ＴＭＢＡＳＥ−Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔｓ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４：１６６，１９９３）に基づく、８Ｐ１Ｄ４改変体３の膜貫通領域の存在確率および配向の模式的表示（１３（ｈ））。図１３（ｉ）：Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、およびＫｒｏｇｈのＴＭＨＭＭアルゴリズム（Ｅｒｉｋ Ｌ．Ｌ．Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ，Ｇｕｎｎａｒ ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓ Ｋｒｏｇｈ：Ａ ｈｉｄｄｅｎ Ｍａｒｋｏｖ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｉｎ Ｐｒｏｃ．ｏｆ Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ．ｏｎ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７５−１８２頁、Ｊ．Ｇｌａｓｇｏｗ，Ｔ．Ｌｉｔｔｌｅｊｏｈｎ，Ｆ．Ｍａｊｏｒ，Ｒ．Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ，およびＣ．Ｓｅｎｓｅｎ編、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ：ＡＡＡＩ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）に基づく、８Ｐ１Ｄ４改変体３の膜貫通領域の存在確率ならびに細胞外および細胞内配向の模式的表示（図１３（ｉ））。ＴＭｐｒｅｄアルゴリズムおよびＴＭＨＭＭアルゴリズムは、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂの（．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／）に位置するＥｘＰａｓｙ分子生物学サーバからアクセスされる。
【図１４】胃癌患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１発現。ＲＮＡを、正常な胃（Ｎ）および１０の異なる胃癌患者標本（Ｔ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡ／レーンを有するノーザンブロットをＳＴＥＡＰ−１配列でプローブした。結果は、胃腫瘍組織における約１．６ｋｂ ＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。下のパネルは、このブロットの臭化エチジウム染色を表し、これは、ＲＮＡサンプルの品質を示す。
【図１５】直腸癌患者標本におけるＳＴＥＡＰ−１発現。ＲＮＡを、正常な直腸（Ｎ）、直腸がん患者腫瘍（Ｔ）、および直腸癌転移物（Ｍ）から抽出した。１０μｇの総ＲＮＡを有するノーザンブロットをＳＴＥＡＰ−１配列でプローブした。結果は、直腸癌患者組織におけるＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。下のパネルは、このブロットの臭化エチジウム染色を表し、これは、ＲＮＡサンプルの品質を示す。
【図１６】ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＳＴＥＡＰ−１発現。第１鎖ｃＤＮＡを、ＨＵＶＥＣ細胞、ＬＡＰＣ−４ＡＤ前立腺癌異種移植片およびＬＡＰＣ−９ＡＤ前立腺癌異種移植片、ならびにヒト脳組織から調製した。アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いたＰＣＲによって、正規化を行った。ＳＴＥＡＰ−１に対するプライマーを用いた半定量的ＰＣＲを、増幅の２７サイクル目および３０サイクル目で行った。コントロールとして、アクチンに対するプライマーを用いたＰＣＲを（Ｂ）に示す。結果は、前立腺癌異種移植片組織において検出された発現と同様に、ＨＵＶＥＣ細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の強力な発現を示す。ＨＵＶＥＣ細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現は、標的ＳＴＥＡＰ−１がまた、腫瘍の新脈管構造の内皮細胞を標的化し得ることを示す。
【図１７】ＳＴＥＡＰ−１が、ＬＰＡに応答して、カルシウムフラックスを増大させたことを示す。
【図１８】ＳＴＥＡＰ−１媒介カルシウム輸送が、カルシウムの細胞内レベルを調節することによって、前立腺癌増殖を調節することを示す。
【図１９】この図は、ＳＴＥＡＰ−１が、隣接細胞間での低分子カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）の輸送を媒介し、それによって、前立腺癌細胞における細胞間連絡を調節することを実証する。この結果は、ＰＣ３コントロール細胞（ＳＴＥＡＰ−１タンパク質発現が検出可能でない）が、カルセイン輸送をほとんど示さず、ＳＴＥＡＰ−１の発現が、細胞間の低分子の輸送を可能にし、それによって、最初に赤色のレシピエント細胞を茶色を帯びるようにし、そして赤色および緑色の分子を共存させることを実証した。
【図２０】この図は、ＳＴＥＡＰ−１が、隣接細胞間での低分子カルセインの輸送を媒介し、それによって、前立腺癌細胞中の細胞間連絡を調節することを実証する。この図は、ＳＴＥＡＰ−１によって媒介される細胞間連絡の時間依存性様式を示し、ここで、ＰＣ３−ＳＴＥＡＰ−１細胞中の輸送は、６時間ではほとんど見られず、ずっと多くの輸送が２４時間で見られる。
【図２１】この図は、ＳＴＥＡＰ−１の発現が、休止ＰＣ３細胞において他の点では活性ではない特定のシグナル伝達経路を調節するために充分であるか否かを示し、ｐ３８ ＭＡＰＫカスケードの活性化に対するこれらの遺伝子の影響を、前立腺癌細胞株ＰＣ３において調査した。図２１Ａは、コントロールのｎｅｏ遺伝子の発現はｐ３８のリン酸化に影響を及ぼさない一方、ＰＣ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現が、ｐ３８経路の活性化を誘導するに充分であることを示す。図２１Ｂは、これらの結果が、ゲルにおける等しいタンパク質ローディングを示す、抗ｐ３８ Ａｂを用いたウェスタンブロッティングを用いて確認されたことを示す。
【図２２】この図は、マイトジェンＭＡＰＫ経路（すなわち、ＥＲＫカスケード）を活性化する、前立腺癌細胞株ＰＣ３のＳＴＥＡＰ−１の発現の充分さを示す。図２２Ａは、コントロールのｎｅｏ遺伝子の発現がＥＲＫリン酸化に対して影響を及ぼさない一方、ＰＣ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−１が、ＥＲＫリン酸化の増加を誘導するに充分であることを示す。図２２Ｂは、これらの結果が、抗ＥＲＫウェスタンブロッティングを用いて確認されたことを示し、そしてＳＴＥＡＰ−１およびＳＴＥＡＰ−２によるＥＲＫ経路の活性化を確認する。
【図２３】ドナー細胞およびレシピエント細胞上でのＳＴＥＡＰ−１の必要な発現を示す。
【図２４】ＳＴＥＡＰ−１特異的ＲＮＡｉの導入が、組換え３Ｔ３細胞および組換えＲａｔ−１細胞におけるＳＴＥＡＰ−１の発現を低下させることを示す。細胞全体での免疫染色は、ＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡｉが、Ｒａｔ−１細胞および３Ｔ３細胞におけるＳＴＥＡＰ−１発現を低下させることを示した。この低下を、ウェスタンブロット解析によって確認し、ここでは、ＳＴＥＡＰ−１タンパク質は、コントロール細胞および未処理細胞と比較して、ＳＴＥＡＰ−１ ＲＮＡｉ処理細胞中で実質的に低下した。
【図２５】ＲＮＡｉが、前立腺癌およびＬＮＣａＰ細胞株におけるＳＴＥＡＰ−１の内因性発現を低下させることを示す。

Claims (51)

  1. 組成物であって、以下：
    ａ）図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のタンパク質の状態を調節する物質、またはｂ）図２のタンパク質によって調節され、それによって図２のタンパク質を発現する細胞の状態が調節される分子
    を含む、組成物。
  2. 生理学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. ヒト単位用量形態で請求項１に記載の組成物を含む、薬学的組成物。
  4. 前記物質が、図２のタンパク質に関するタンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
  5. モノクローナルである、請求項４に記載の抗体またはそのフラグメント。
  6. ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項４に記載の抗体。
  7. 請求項４に記載の抗体を産生する、非ヒトトランスジェニック動物。
  8. 請求項５に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
  9. 図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のタンパク質を発現する細胞に細胞傷害性薬剤または診断剤を送達する方法であって、該方法は：
    請求項４に記載の抗体またはそのフラグメントに結合体化した該細胞傷害性薬剤または該診断剤を提供する工程；および
    該細胞を抗体−薬剤結合体またはフラグメント−薬剤結合体に曝露する工程
    を包含する、方法。
  10. 前記物質が、抗体またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含み、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが、図２のタンパク質に免疫特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記物質が、図２のタンパク質に関するタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
  12. 図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）に示されるアミノ酸配列全体に対して少なくとも９０％相同である、請求項１１に記載のタンパク質。
  13. 請求項１に記載の組成物であって、前記物質が以下：
    ａ）図２のタンパク質のうちの８個、９個、１０個または１１個連続したアミノ酸のペプチド；
    ｂ）表Ｖ〜表ＸＶＩＩＩ（配列番号３、５、７、９）に記載のペプチド；
    ｃ）表ＸＸＩＩ〜表ＸＬＶＩＩ（配列番号３、５、７、９）に記載のペプチド；または
    ｄ）表ＸＬＶＩＩＩ〜表ＬＩ（配列番号３、５、７、９）に記載のペプチド
    を含む、組成物。
  14. 前記物質が、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のタンパク質のアミノ酸配列由来のＣＴＬポリペプチドまたはそのアナログを含む、請求項１に記載の組成物。
  15. 請求項１４に記載の組成物であって、ただし、エピトープは、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
  16. 前記物質が、表Ｖ〜表ＸＶＩＩＩ（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）に記載されるＣＴＬポリペプチドを含む、請求項１４に記載の組成物。
  17. 請求項１６に記載の組成物であって、ただし、前記ポリペプチドは、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のタンパク質のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
  18. 前記物質が、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のアミノ酸配列由来の抗体ポリペプチドエピトープを含む、請求項１に記載の組成物。
  19. 請求項１８に記載の組成物であって、ただし、前記エピトープは、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
  20. 前記抗体エピトープが、前記ペプチドの末端まで任意の整数で増える、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のうちの少なくとも５アミノ酸のペプチド領域を含み、ここで該エピトープが、以下：
    ａ）図５のヒドロパシープロファイルにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位置；
    ｂ）図６のヒドロパシープロファイルにおいて０．５よりも小さい値を有するアミノ酸位置；
    ｃ）図７の接近可能残基の％のプロファイルにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位置；
    ｄ）図８の平均可橈性プロファイルにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位置；
    ｅ）図９のβ−ターンプロファイルにおいて０．５よりも大きい値を有するアミノ酸位置；
    ｆ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも２つの組み合わせ；
    ｇ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも３つの組み合わせ；
    ｈ）ａ）〜ｅ）のうちの少なくとも４つの組み合わせ；または
    ｉ）ａ）〜ｅ）のうちの５つの組み合わせ；
    から選択されるアミノ酸位置を含む、請求項１８に記載の組成物。
  21. 請求項２０に記載の組成物であって、ただし、前記エピトープは、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のアミノ酸配列全体ではない、組成物。
  22. 請求項１１に記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
  23. 図２に記載の核酸分子を含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  24. 請求項２２に記載のポリヌクレオチドであって、ただし、前記コードされたタンパク質は、図２（配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５）のアミノ酸配列全体ではない、ポリヌクレオチド。
  25. ＴがＵで置換されている、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記物質が、図２（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４）の核酸配列のコード配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
  27. 請求項１１に記載のさらなるタンパク質をコードするさらなるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  28. 請求項２２に記載のポリヌクレオチドに対して完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
  29. 請求項２５に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
  30. 請求項２７に記載のポリヌクレオチドに完全に相補的であるポリヌクレオチドを含む、組成物。
  31. 前記物質が、ａ）ＳＴＥＡＰ−１コード配列を有するポリヌクレオチドを切断するリボザイム、またはｂ）該リボザイムをコードする核酸分子；および生理学的に受容可能なキャリアを含む、請求項１に記載の組成物。
  32. 前記物質がヒトＴ細胞を含み、該Ｔ細胞が、特定のＨＬＡ分子の状況においてＳＴＥＡＰ−１ペプチド部分配列を特異的に認識する、請求項１に記載の組成物。
  33. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、
    該細胞に請求項１に記載の組成物を投与する工程
    を包含する、方法。
  34. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法が：
    該細胞に、抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含し、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に特異的に結合する、方法。
  35. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
    該細胞に、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を投与する工程
    を包含する、方法。
  36. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
    該細胞に、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチド、またはＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質のコード配列に相補的であるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを投与する工程
    を包含する、方法。
  37. 図２のタンパク質を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって
    、該方法は：
    該細胞に、図２のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを切断するリボザイムを投与する工程
    を包含する、方法。
  38. 図２のタンパク質および特定のＨＬＡ分子を発現する癌細胞の増殖を阻害する請求項３３に記載の方法であって、該方法は：
    ヒトＴ細胞を該癌細胞に投与する工程であって、該Ｔ細胞が図２のタンパク質のペプチド部分配列を特異的に認識する一方で、該部分配列が特定のＨＬＡ分子の状況にある、工程
    を包含する、方法。
  39. 請求項３３に記載の方法であって、該方法が：
    単鎖モノクローナル抗体をコードするヌクレオチドを送達するベクターを投与し、それにより、該コードされた単鎖抗体が、図２のタンパク質を発現する癌細胞内で細胞内発現される、工程
    を包含する、方法。
  40. 図２のタンパク質に対する哺乳動物免疫応答を生じる方法であって、該方法は：
    該哺乳動物の免疫系の細胞を、以下：
    ａ）ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質および／または
    ｂ）該タンパク質をコードするヌクレオチド配列
    の一部分に曝露し、それにより、該タンパク質に対する免疫応答が生じる工程
    を包含する、方法。
  41. 請求項４０に記載の免疫応答を生じる方法であって、該方法は：
    少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたは少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含むＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を提供する工程；および
    該エプトープを哺乳動物免疫系のＴ細胞またはＢ細胞とそれぞれ接触させ、それによって該Ｔ細胞またはＢ細胞が活性化される工程、
    を包含する、方法。
  42. 前記免疫系細胞がＢ細胞であり、それによって誘導されたＢ細胞が前記ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記免疫系細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）であるＴ細胞であり、それによって活性化された該ＣＴＬが、前記ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質を発現する自己細胞を殺傷する、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記免疫系細胞が、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）であるＴ細胞であり、それによって前記活性化された該ＨＴＬが、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の細胞傷害活性またはＢ細胞の抗体産生活性を促進するサイトカインを分泌する、請求項４１に記載の方法。
  45. サンプル中のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質またはＳＴＥＡＰ−１関連ポリヌクレオチドの存在を検出するための方法であって、該方法は：
    該サンプルを、ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質またはＳＴＥＡＰ−１関連ポリヌクレオチドとそれぞれ特異的に結合する請求項１に記載の物質と接触させる工程；および
    該物質と該ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質との複合体、または該物質と該ＳＴＥＡＰ−１関連ポリヌクレオチドとの複合体がそれぞれ存在するか否かを決定する工程、
    を包含する、方法。
  46. サンプル中のＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質の存在を検出するための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
    該サンプルを、抗体またはそのフラグメントと接触させる工程であって、該抗体またはそのフラグメントのいずれかが該ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質と特異的に結合する、工程；および
    該抗体またはそのフラグメントと該ＳＴＥＡＰ−１関連タンパク質との複合体が存在するか否かを決定する工程、
    を包含する、方法。
  47. 癌を有しているかまたは癌を有する疑いのある患者からサンプルを採取する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の方法。
  48. サンプル中の図２のタンパク質のｍＲＮＡの存在を検出するための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
    少なくとも１つのプライマーを用いた逆転写によって該サンプルからｃＤＮＡを生成する工程；
    ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして使用してこのように生成されたｃＤＮＡを増幅させる工程であって、該センスプライマーおよび該アンチセンスプライマーとして使用された該ＳＴＥＡＰ−１ポリヌクレオチドが、ＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡを増幅させるために役立つ、工程；ならびに
    該増幅されたＳＴＥＡＰ−１ ｃＤＮＡの存在を検出する工程、
    を包含する、方法。
  49. 癌を有しているかまたは癌を有する疑いのある患者由来の生物学的サンプルにおいて１つ以上のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物をモニタリングするための請求項４５に記載の方法であって、該方法は：
    個体由来の組織サンプル中の細胞によって発現される１つ以上のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態を決定する工程；
    このように決定された状態を、対応する正常なサンプルにおける１つ以上のＳＴＥＡＰ−１遺伝子産物の状態と比較する工程；および
    該正常なサンプルに対する該サンプル中のＳＴＥＡＰ−１の１つ以上の異常な遺伝子産物の存在を同定する工程、
    を包含する、方法。
  50. ＳＴＥＡＰ−１ ｍＲＮＡまたはＳＴＥＡＰ−１タンパク質の１つ以上の上昇した遺伝子産物が存在するか否かを決定する工程をさらに包含し、それによって前記正常な組織サンプルと比較した前記試験サンプル中の１つ以上の上昇した遺伝子産物の存在が、癌の存在または状態を示す、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記癌が、表Ｉに記載の組織中で生じる、請求項５０に記載の方法。
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