ES2264239T3

ES2264239T3 - Complejo de proteinas p53/p90'.

Info

Publication number: ES2264239T3
Application number: ES99124768T
Authority: ES
Inventors: Arnold J. Levine; Thomas E. Shenk; Cathy A. Finlay
Original assignee: Princeton University
Current assignee: Princeton University
Priority date: 1990-06-27
Filing date: 1991-06-27
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2011-06-27
Also published as: WO1992000311A1; JPH05505241A; ATE207075T1; EP0489149B1; EP1013666A2; EP0489149A4; ATE325813T1; EP1013666A3; AU8221191A; DE69132771D1; DE69133528T2; DK0489149T3; EP0489149A1; CA2064555A1; EP1013666B1; JP3179481B2; DE69132771T2; DE69133528D1; JP2000184888A; US5382510A

Abstract

Un complejo p53 / p90 aislado, en el que el p90 se puede obtener a partir de células de fibroblasto de embrión de rata transformado, y que tiene la secuencia parcial VAQMLLSQESDDYSQPST, u homólogo del mencionado p90 de rata.

Description

Complejo de proteínas p53/p90.

La presente invención se dirige a un complejo de proteínas p53/p90 para uso en la detección de los estados de cáncer y precáncer. De manera más particular, la invención se dirige a los diferentes estados de cáncer y precáncer por medio de sondas de anticuerpos y ADN. Los estados de cáncer y precáncer son aquellos asociados con la proteína p53.

Se está reconociendo cada vez más que las mutaciones de proto-oncogenes en células somáticas son significativas en la inducción de cánceres humanos. Algunos ejemplos de oncogenes formados mediante dichas mutaciones incluyen: neu, fes, fos, myc, myb, fms, Ha-ras, y Ki-ras. Las mutaciones que convierten los proto-oncogenes en oncogenes son a menudo mutaciones puntuales. Se necesita aprender mucho más con el fin de comprender cómo funcionan los oncogenes y sus productos de expresión para transformar las células normales en células cancerosas.

Se cree de manera general que los oncogenes actúan de manera dominante. Se considera de manera general que esto significa que la conversión de un proto-oncogén en un oncogén da como resultado la adquisición de una nueva función, es decir, una transformación mejorante.

Se produce un tipo diferente de mutación asociada con cáncer cuando se altera un gen supresor del tumor de forma que haga que el producto del gen pierda su función supresora del tumor. Un ejemplo de dicho gen supresor del tumor es el gen de la sensibilidad al retinoblastoma, Rb. Los genes supresores del tumor se denominan algunas veces oncogenes recesivos, aunque hablando de manera estricta, los productos de los genes supresores del tumor no contribuyen a la formación del tumor. El fenotipo es recesivo ya que, cuando mutan ambos alelos, la ausencia de un gen supresor del tumor da como resultado un aumento en la tumorigénesis.

Los productos de algunos oncogenes víricos son también capaces de transformar las células. Entre los ejemplos de dichos productos se incluyen las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano, el antígeno T grande del SV40, y el E1a procedente del adenovirus. Se cree que las proteínas de oncogenes víricos se enlazan con, y por tanto, inactivan las proteínas supresoras del tumor, tal como la proteína del retinoblastoma.

Un producto de gen que presenta algunas propiedades de un oncogén tanto dominante como recesivo es la fosfoproteína de 53kd p53. Crece la evidencia que las mutaciones en el gen p53 están asociadas con un gran número de tipos de cáncer. Por ejemplo, Iggo y col, Lancet 335, 675-679 (1990) han expresado la opinión que el p53 es el proto-oncogén que experimenta mutaciones de manera más habitual común en cánceres de pulmón.

Mucho de lo que se conoce acerca del p53 se ha derivado de los estudios acerca del efecto de la transfección de p53 de murina de tipo salvaje y mutante en células de fibroblastos de embrión de rata. Este trabajo ha sido revisado por Levine y col, "The P53 Proto-Oncogene And Its product", en Common Mechamisms of Transformation By Small DNA Tumor Viruses, L. Villarreal, ed., American Society for Microbiology, capítulo 2 (1989); Hnds y col., ibid, Capítulo 7; y Levine, BioEssays 12, 60-66 (1990).

De manera breve, numerosas mutaciones puntuales entre los aminoácidos 130 y 240 del p53 (de los 390 aminoácidos) conducen a cambios significativos iniciadores de tumores en el fenotipo. El p53 de tipo tanto salvaje como mutante se encuentra a menudo a niveles mayores en las células transformadas debido a un incremento en sus estabilidades metabólicas. Se cree que la estabilización del mutante p53 se produce mediante la formación de un complejo con las proteínas celulares, tales como la proteína del shock térmico de 70 kd, hsc70. Se cree que la estabilización del p53 de tipo salvaje está asociada con su capacidad para formar un complejo con el complejo mutante p53-hsc70. Estos resultados son consistentes con la proposición que las alteraciones en la función del p53 se implican en el proceso de transformación celular. Es también evidente la implicación del p53 de la murina mutante en la transformación de las células en el cultivo a partir de la capacidad del p53 mutante, pero no de tipo salvaje, para cooperar con el Ha-ras activado para transformar las células primarias de embrión de rata.

El gen p53 reside en el cromosoma 17p. Muchos cánceres, tales como aquellos descritos anteriormente, se asocian con delecciones en el cromosoma 17p. Dichas delecciones alélicas indican a menudo la presencia de un gen supresor del tumor. La mutación de un alelo da como resultado el desarrollo de un estado de precáncer benigno. La mutación de un segundo alelo da como resultado el desarrollo de un estado de cáncer maligno.

Finlay y col, Cell 57, 1083-1093 (1989), han presentado evidencias adicionales que el p53 de la murina de tipo salvaje despliega las propiedades de un supresor de la transformación. Tres observaciones son consistentes con esta teoría.

En primer lugar, la introducción del p53 de murina de tipo salvaje en células primarias de roedores, junto con dos genes transformadores cooperantes, ras y E1a, da como resultado una disminución en el número de foci transformados. Se encontró que las líneas de células que se obtuvieron contenían el gen p53 de la murina, pero o bien fracasaron en expresar este, o produjeron altos niveles de un producto de murina alterado. De esta manera, la sobreexpresión del p53 de murina de tipo salvaje parece ser perjudicial para el proceso de transformación de los oncogenes mediante células de rata cultivadas.

En segundo lugar se cree que la inactivación del gen p53 está asociada con el desarrollo de la eritroleucemia inducida por el virus de Friend en ratones (Mowat y col., Nature 314, 633-636 (1985). Existen numerosos ejemplos en la bibliografía de células tumorales derivadas de los bazos de ratones infectados con el complejo del virus de Friend que contienen reordenamientos u otras mutaciones en el locus del gen p53; véase, por ejemplo, Ben-David, Oncogene 3, 179-185 (1988).

La tercera línea de evidencia consistente con la posibilidad que la proteína del p53 de tipo salvaje sea un integrante de un grupo de proteínas implicado en la supresión de la transformación es la capacidad, mencionada anteriormente, del p53 para formar complejos de proteínas oligoméricas con oncogenes víricos, tales como el antígeno T grande del SV40, la proteína E1b de 55 kd de tipo 5 del adenovirus, y el producto E6 de tipo 16 o 18 del virus del papiloma humano (HPV); véase, por ejemplo, Werness, Science 248, 76-79 (1990). Se han observado también complejos análogos entre p105, el producto del gen de la susceptibilidad al retinoblastoma, y el antígeno T grande del SV40 (DeCaprio y col., Cell 54, 275-283 (1988)); la proteína E1a del adenovirus (Whyte y col., Nature 334, 124-129 (1988)); y la proteína E7 del HPV-16 o 18 (Muenger y col, EMBO J. 8, 4099-4105 (1989)).

Se piensa que estas interacciones entre las proteínas víricas y el p105 inactivan una función supresora del crecimiento de p105, simulando de esta manera las delecciones y mutaciones que se encuentran de manera habitual en el gen del retinoblastoma en las células tumorales. De manera similar, la formación del complejo de proteína oligomérica entre estas mismas proteínas víricas y el p53 puede eliminar o alterar la función supresora del crecimiento de p53; véase Finlay y col. id.

La naturaleza clónica de los tumores relacionados con p53 es consistente con un modelo de progresión del tumor en el que las células precancerosas neoplásicas que llevan un gen p53 de tipo salvaje y un gen p53 mutado tienen una ventaja proliferativa distinta sobre las células normales, que contienen dos genes de tipo salvaje. La ventaja es debida a la interferencia mediada por el mutante p53 con la función p53 de tipo salvaje. El aumento de la capacidad proliferativa de dichas células neoplásticas incrementa la probabilidad de una segunda mutación inactivante, es decir, la conversión o delección del gen, en el locus p53. Las células resultantes, que no contienen mutaciones en ambos alelos p53, son capaces de expresar el fenotipo neoplásico completo; véase Finlay y col., id., y Baker y col., Science 244, 217-221 (1989).

El modelo anterior se soporta por el descubrimiento que las células tumorales humanas de las cuales se ha eliminado un alelo del cromosoma 17p, contienen mutaciones en el resto del alelo. Las mutaciones tienden a agruparse en cuatro "puntos calientes", que coinciden con las cuatro regiones más altamente conservadas del gen p53; véase Nigro y col, Nature 342, 705-708 (1989).

Gannon y col., EMBO J. 9, 1595-1602 (1990), proponen que todas las proteínas p53 mutantes humanas se reconozcan por un anticuerpo monoclonal, Pab240. Estos autores sugieren que todos los mutantes p53 ejercen un efecto conformacional común, que da como resultado la expresión del epítopo de Pab240.

Hinds y col (diciembre de 1990, Cell Growth and Differentiation, 1(12):571-58/0) describen mutantes de la proteína p53 y la existencia de una proteína de 90 Kd que se asocia y coinmunoprecipita con las proteínas p53.

Observaciones de los inventores que forman la base de la presente invención

La invención se refiere a complejos aislados p53/p90 y a su uso como marcadores tumorales.

Forman la base de la presente invención experimentos anteriores no publicados de los inventores relacionados con el p53 humano. Diferentes clones de p53 humanos aislados de carcinomas colorectales poseen mutaciones en los residuos de aminoácidos 143, 175, 273 o 281 (de un total de 393 residuos). Dichos mutantes p53, cuando se cotransfectan en fibroblastos de embrión de rata (REF) con oncogenes ras de tipo salvaje activados, cooperan con los oncogenes para transformar los REF en el cultivo. Todas las líneas de células transformadas derivadas de estos experimentos producen la proteína p53 humana en niveles elevados.

En la Tabla 1 se resumen las mutaciones. En la Tabla 2 se muestra el efecto de las mutaciones sobre las propiedades de las proteínas mutantes p53 humanas.

TABLA 1 Mutaciones de la proteína p53 humana

\hskip4,5cmADN\hskip2,3cmProteína

Alteración del Clon	Nucleótido	Alteración	Residuo
p53-c143A	430	T -> C	143 val -> ala
p53-175H	526	G -> A	175 arg -> his
p53-273H	820	G -> A	273 arg -> his
p53-281G	844	A -> G	281 asp -> gly

TABLA 2 Propiedades de las proteínas mutantes p53 humanas

\vskip1.000000\baselineskip

	Tx relativa	Semivida	\hskip1,5cm hsc \hskip2,5cm p90
Tumores en
ratones clónicos	Frecuencia	Proteína	Enlace	Enlace	Nudo
p53.cWT^{1}	0	20 min	-	+	+
p53-c143A^{1}	1,6	1,5-2 h	+	+	+
p53-WT^{2}	0	ND^{3}	ND^{3}	ND^{3}	ND^{3}
p53-175H^{2}	11,5	3,6-6,4 h	+	+	+
p53-273H^{2}	4,7	7 h	-	+	+
p53-281G^{2}	1,9	3,5 h^{4}	-	+	ND^{3}

1 - ADNc. No contiene intrones
2 - Contiene intrones
3 - Sin determinar
4 - Semivida estimada en líneas de células que expresan ras + E1a + mutante p53.

Con el fin de obtener los resultados que se muestran en la Tabla 2, se cotransfectaron clones de ADNc o clones genómicos de ADNc parciales de p53, mas el oncogén ras activado, en fibroblastos primarios de embrión de rata. En cada lote de transfecciones, se puntuaron los foci transformados dos o tres semanas más tarde en cultivos de células duplicados.

Los resultados de la Tabla 2 demuestran que el ADNc del p53 humano mutante o los clones híbridos genómicos de ADNc derivados de los carcinomas de cólon pueden comportarse como oncogenes dominantes y cooperar con el oncogén ras en los fibroblastos transformados de embrión de rata. Cuatro mutaciones invertidas diferentes, en los residuos de aminoácidos 143, 175, 273 y 281, contribuyen cada una al fenotipo transformado. En todos estos casos la proteína mutante del p53 humano se produjo en elevados niveles en la célula transformada, al menos en parte debido a la mayor semivida de estas proteínas mutantes.

De manera inesperada, los fenotipos de las células que contienen los diferentes mutantes no son iguales. Por ejemplo, en un experimento, los tres clones del ADN de p53 que contienen las mutaciones de "punto caliente" en los codones 175, 273, y 281, es decir., p53-175H, p53-273H, y p53-281G, tienen características y frecuencias de transformación reproducibles (número de foci producidos) en una relación de 6:2. 4:1, indicando que estas mutaciones de "punto caliente" no son equivalentes en sus fenotipos. En otro experimento, el alelo mutante 175 fue 3-10 veces más eficiente que el alelo mutante 273 en cooperación con el oncogén ras en la transformación de las células primarias de rata en cultivo.

Más sorprendente es el hecho que las proteínas mutantes p53-175H y p53-c143A enlazan con hsc70 en las células transformadas, mientras que las proteínas p53-273H y p53-281G mutantes no interactúan de manera detectable, o se enlazan, con hsc70. Los experimentos anteriores han demostrado que algunas proteínas p53 de la murina mutante tienen una conformación alterada (Hinds y col, Mol. Cell. Biol. 7, 2863-2869 (1987); Finlay y col, Ibid.. 8, 531-539 (1988)). Es posible que dichas moléculas p53 alteradas enlacen con hsc70 y secuestren el p53 de tipo salvaje en un complejo que bloquea el plegado, ensamblado o localización correctos de p53. De esta manera, p53-c143A y p53-175H pueden representar proteínas mutantes que nunca se pliegan de manera correcta y de esta manera retienen su afinidad por hsc70. Si se incorpora el p53 de tipo salvaje en este complejo, el complejo p53-mutante-hsc70-p53 de tipo salvaje podría envenenar la función del p53 de tipo salvaje.

Este no es el caso de los mutantes p53-273H y p53-281G, que, tal como se ha mencionado anteriormente no enlazan con hsc70. La proteína mutante humana p53-273H puede asociarse con la proteína p53 de rata y formar un complejo oligomérico tal como se demuestra por la coinmunoprecipitación con un anticuerpo específico humano, Ab-2. Este complejo no está mediado por hsc70 y puede ser menos eficiente en el secuestro de la proteína celular p53 de tipo salvaje de rata. Esto es consistente con una peor capacidad para transformar las células en el cultivo.

A diferencia de las co-transfecciones con ras activado más p53 humano mutante, las co-transfecciones con ras activado más p53 humano de tipo salvaje dan como resultado una frecuencia muy baja de la formación de focus, y únicamente podría clonarse un focus en una línea de células establecida. De esta manera, parece probable que la mutación del p53 humano active una función transformadora dominante que no es detectable en un p53 de tipo salvaje.

En resumen, parece ahora que todas las proteínas p53 mutantes humanas de tipo salvaje se diferencian de la proteína p53 humana de tipo salvaje que tiene un período de semivida extendido, que se expresa a niveles más elevados, y que posee la capacidad para transformar las células en el cultivo. Estos datos apoyan la sugerencia que la mutación de p53 en un alelo tendría un fenotipo que promovería el crecimiento en vivo, que aumenta el número de células con dichas mutaciones y favorece la selección de un segundo episodio mutacional (delección o conversión del gen) en las células cancerosas. La observación que muchas células tumorales retienen únicamente el alelo p53 mutante sugiere que estas proteínas mutantes no son completamente dominantes sobre el alelo de tipo salvaje o que los mutantes continúan para conferir una ventaja proliferativa en las células en ausencia del p53 de tipo salvaje. Dicho efecto positivo del p53 mutante sobre la proliferación celular en ausencia del p53 de tipo salvaje sería una función intrínseca de la molécula, y se mediaría mediante la valoración de otras proteínas celulares diferentes de la p53 endógena, por ejemplo, mediante la proteína p90.

De manera más significativa, los resultados establecen que existen clases de mutaciones de la p53 human que ocasionan el aumento de las células precancerosas y cancerosas con fenotipos diferentes. Es evidente que estos fenotipos diferentes pueden dar lugar a cánceres que toman cursos diferentes y tienen pronósticos diferentes.

Un problema con los procedimientos actuales para detectar el cáncer es que no se han tenido en cuenta estos cambios fenotípicos diferentes. Este problema se resuelve mediante la presente invención.

Un segundo problema resuelto mediante la presente invención es determinar cómo los diferentes cambios fenotípicos afectan el curso y el pronóstico del cáncer. Una vez se ha resuelto este problema, un problema adicional es ser capaz de detectar los diversos cambios fenotípicos con el fin de ser capaces de predecir el curso que un cáncer tomará y el mejor camino para tratar dicho cáncer.

Resumen de la invención

La invención se refiere a un complejo p53/p90 aislado. El p53 puede ser de tipo salvaje o un mutante. El mutante p53 puede ser p53-143A, p53-175H, p53-273H, o p53-281G.

La invención se refiere de manera adicional al uso del complejo p53/p90 como marcador tumoral.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Para los objetivos de la presente memoria, el término p53 de "tipo salvaje" significa el nucleótido o secuencia de aminoácidos informada por Matlashewski y col., EMBO J. 13, 3257-3262 (1984); Zakut-Houri y col, EMBO J. 4, 1251-1255 (1985); y Lamb y Crawford, Mol. Cell. Biol. 5, 1379-1385 (1986). Las secuencias están disponibles del Genbank. El p53 de tipo salvaje incluye un polimorfismo prolina/arginina en el aminoácido 72 y el polimorfismo del nucleótido correspondiente.

Es importante la detección de mutaciones en los genes y proteínas p53 de tipo salvaje, debido a que dichas mutaciones indican estados precancerosos y cancerosos. No existen limitaciones aparentes con respecto al tipo de cáncer que se asocia con una mutación p53. Dicho cáncer incluye, de manera general, los cánceres colorectal, de pulmón, de ovarios, cervical, de la corteza adrenal, de hueso, de vejiga, de pecho, de cerebro, y del mesénquima y, de manera más específica, la leucemia mielocítica crónica, la leucemia mielógena crónica y el sarcoma osteogénico.

Una célula precancerosa se define como una célula que tiene un alelo p53 normal y un alelo p53 mutado. La mutación es usualmente una mutación puntual. En una célula cancerosa, ambos alelos están mutados. Una mutación es usualmente una mutación puntual, tal como se ha descrito anteriormente para una célula precancerosa. La otra mutación es usualmente una delección de todo o una parte significativa del gen p53.

Mutaciones

La invención se basa en el descubrimiento inesperado que existen conjuntos de mutaciones en p53 que se corresponden con los conjuntos de diferentes conformaciones y diferentes fenotipos. Es importante determinar tantos conjuntos de mutaciones como sea posible. No es necesario, sin embargo, determinar cada mutación individual dentro de un conjunto. Se define que un conjunto de mutaciones tiene al menos una mutación, dando lugar a un fenotipo que es diferente del de tipo salvaje y al menos un conjunto diferente de mutaciones.

Cada conjunto de fenotipos lleva a un desarrollo y a la gravedad distinguible de la misma enfermedad. Por tanto, determinando los conjuntos de mutaciones, un médico puede no sólo determinar que un paciente tiene un cáncer particular, sino que puede distinguir diferentes subconjuntos de pronósticos y prescribir el mejor tratamiento.

Por ejemplo, muchos cánceres colorectales dan lugar a mutaciones en, o próximas a, los aminoácidos en posiciones 143, 175, 273 y 281 de p53. En la Tabla 1 se describen estas mutaciones.

Las familias que padecen con el síndrome de Li-Fraumeni presentan mutaciones en el p53 que se agrupan entre los codones 245 y 258. Es particularmente prevalente una mutación en el codón 248. Estas familias tienen una elevada incidencia de cáncer.

Se debería enfatizar que cualquier nucleótido o aminoácido individual que muta, o cualquier región del gen o proteína p53 dentro de la cual se producen una o más mutaciones, constituye un conjunto de mutaciones tan largo cuanto el conjunto de mutaciones satisfaga la definición dada anteriormente. En una forma de realización de la invención, por ejemplo, los conjuntos de mutaciones comprenden los residuos 117-142, 171-181, 234-258, y 270-286 de la proteína p53 así como los nucleótidos correspondientes del gen p53.

En otra forma de realización de la invención, un conjunto de mutaciones comprende las mutaciones en los aminoácidos 143 y 175. Un segundo conjunto de mutaciones comprende las mutaciones en los aminoácidos 273 y 281.

Panel de sondas (no es parte de esta invención)

De manera general, un panel de sondas incluye al menos dos miembros. Puede haber, por ejemplo, ser como mucho tres, cuatro, cinco o seis conjuntos de mutaciones y, por tanto, el mismo número de sondas. Estas pueden ser como mucho 8, 10, o 12 sondas, y, de hecho, incluso más.

Las mutaciones en un conjunto se encuentran de manera común en diversos tipos de tumores humanos. La naturaleza ubicua de estas mutaciones puede ser resultado de su incidencia frecuente o, como se ha explicado anteriormente, debido a que proporcionan una ventaja proliferativa en las células que las contienen y, por tanto, se seleccionan cuatro.

Se pueden evaluar las alteraciones en cualquier secuencia de nucleótidos del gen o en la secuencia de aminoácidos de la proteína con el fin de determinar si existe una mutación dentro de uno de los conjuntos de mutaciones de acuerdo con la presente invención. Pueden probarse las alteraciones en la secuencia de aminoácidos mediante anticuerpos. Pueden probarse las alteraciones en la secuencia de nucleótidos por medio de sondas de nucleótidos o, en algunos casos, mediante las endonucleasas de restricción. Los nucleótidos tal como se usan en el presente documento se refieren a ARN o ADN.

Sondas de anticuerpo (no es parte de esta invención)

Se define ampliamente un "anticuerpo" de acuerdo con la presente memoria como un polipéptido que se enlaza de manera específica con un epítopo. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Los anticuerpos incluyen de manera adicional fragmentos Fab policlonales o monoclonales recombinantes preparados de acuerdo con el procedimiento de Huse y col, Science 246, 1275-1281 (1989).

Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales y monoclonales que presentan especificidad hacia las diferencias entre aminoácidos únicos y oncogenes se describen por McCormick y col en la Patente de los Estados unidos 4.798.787.

De manera breve, se pueden producir anticuerpos policlonales inyectando en un mamífero huésped, tal como un conejo, un ratón, una rata, o una cabra, la proteína p53 o un fragmento de la misma capaz de producir anticuerpos que distingan entre el p53 mutante y el p53 de tipo salvaje. El péptido o fragmento de péptido inyectado puede contener la secuencia de tipo salvaje o la secuencia mutante. Se extrae y se selecciona suero del mamífero para obtener anticuerpos policlonales que son específicos para el péptido o el fragmento del péptido.

Con el fin de producir anticuerpos monoclonales, se inocula un huésped con un péptido o fragmento de péptido tal como se ha descrito anteriormente, y a continuación se potencia. Se recogen los bazos de los mamíferos inoculados unos pocos días después de la potenciación final. Se fusionan las suspensiones celulares de los bazos con una célula tumoral de acuerdo con el procedimiento general descrito por Kohler y Milstein en Nature 256, 495-497 (1975). Con el fin de ser útil, un fragmento de péptido debe contener residuos aminoácidos suficientes para definir el epítopo de la molécula de p53 que está siendo detectada.

Si el fragmento es demasiado corto para ser inmunógeno, se puede conjugar con una molécula vehículo. Algunas moléculas vehículo adecuadas incluyen hemocianina de Diodora cayenensis y albúmina de suero bovino. Se puede llevar a cabo la conjugación mediante procedimientos conocidos en la técnica. Uno de dichos procedimientos es combinar un residuo de cisteína del fragmento con un residuo de cisteína sobre la molécula del vehículo.

Se pueden sintetizar los fragmentos de péptido mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se describen algunos procedimientos adecuados por Stuart y Young en "Solid Phase Peptide Synthesis", Segunda Edición, Pierce Chemical Company (1984).

Están disponibles una variedad de ensayos para detectar las proteínas con anticuerpos marcados. Dichos procedimientos pueden implicar una etapa o dos etapas. En un ensayo de una etapa, se inmoviliza la molécula p53 diana, si ésta está presente, y se incuba con un anticuerpo marcado. El anticuerpo marcado enlaza con el p53 inmovilizado. Tras el lavado para eliminar moléculas sin enlazar, se ensaya la muestra para la presencia de la marca.

En un ensayo en dos etapas, el p53 inmovilizado se incuba con un anticuerpo sin marcar. El complejo p53-anticuerpo sin marcar, si está presente, se enlaza a continuación con un segundo anticuerpo marcado que es específico del anticuerpo sin marcar. La muestra se lava y se ensaya para la presencia de la marca tal como se ha descrito anteriormente.

La marca puede ser un átomo radioactivo, un enzima, o una fracción cromófora. Algunos ejemplos de átomos radioactivos incluyen P^{32}, I^{125}, H^{3}, y C^{14}. Algunos ejemplos de enzimas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Algunos ejemplos de fracciones cromóforas incluyen fluoresceína y rodamina. Se pueden conjugar los anticuerpos con estas marcas mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden conjugar los enzimas y moléculas cromóforas con los anticuerpos por medio de agentes de acoplamiento, tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, y similares. De manera alternativa, se puede producir la conjugación mediante una par ligando-receptor. Algunos pares ligando-receptor adecuados incluyen, por ejemplo, biotina-avadina o-estreptavadina, y anticuerpo-antígeno.

Sondas de oligonucleótidos (no es parte de esta invención)

Las sondas pueden ser también oligonucleótidos que distinguen entre ADN o ARN de tipo salvaje y mutante. Se pueden preparar sondas de oligonucleótidos mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se describen por Caruthers en Science 230, 281-285 (1985) los procedimientos adecuados para sintetizar sondas de oligonucleótidos

Las sondas de oligonucleótidos pueden contener una secuencia complementaria con una secuencia de p53 de tipo salvaje o mutante que comprende un nucleótido implicado en una mutación. Por ejemplo, el nucleótido implicado en una mutación puede estar en la posición 430, 526, 820, u 844 del p53 de tipo salvaje o mutante.

No es crítica la longitud de la sonda de oligonucleótido, siempre que sea capaz de hibridar con una muestra de ensayo que contiene p53 de tipo salvaje o mutante y distinguir entre los dos. El oligonucleótido contendría al menos 6 nucleótidos, de manera preferible al menos 10 nucleótidos, y, de manera más preferible, al menos 15 nucleó-
tidos.

Las sondas de oligonucleótidos se marcan para detección. Las marcas que se pueden conjugar con las sondas de oligonucleótidos para la detección son las mismas que aquellas que se conjugan con los anticuerpos. Dichas marcas se han descrito anteriormente. Se consigue conjugar las marcas con los oligonucleótidos mediante procedimientos conocidos en la técnica.

No existe límite superior en la longitud de las sondas de oligonucleótidos. Las sondas más largas son más difíciles de preparar y requieren tiempos de hibridación más largos. Por tanto, la sonda no deberá ser más larga de lo necesario. Normalmente, la sonda de oligonucleótido no contendrá más de 50 nucleótidos, de manera preferible no más de 40 nucleótidos, y, de manera más preferible, no más de 30 nucleótidos.

En la Solicitud PCT WO 87/07646 se describen los procedimientos para distinguir los oncogenes de tipo salvaje de los mutantes que contienen un cambio de nucleótido único.

De manera breve, los oligonucleótidos que contienen cualquier secuencia de tipo salvaje o mutante se hibridan bajo condiciones restrictivas en geles de agarosa secos que contienen el ARN o el ADN del p53 diana digerido con una endonuclesa de restricción apropiada. Las condiciones de restricción adecuadas incluyen dos grados por debajo del T_{m} calculado de un dúplex perfecto. La sonda de oligonucleótido híbrida con el p53 diana mejor detectable cuando la sonda y el p53 diana son perfectamente complementarios.

El ADN del p53 diana se amplifica de manera opcional con el fin de mejorar la sensibilidad del ensayo. Se puede llevar a cabo la amplificación mediante procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento adecuado es el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa, tal como se describe en Mullis y col, Patentes de los Estados Unidos 4.683.195 y 4.683.202.

Se describe por Segev, Solicitud PCT WO 90/01069, licenciada a ImClone Systems Incorporated, New York City un procedimiento particularmente conveniente para ensayar una mutación puntual única por medio de oligonucleótidos. Este procedimiento se limita en los casos en los que el nucleótido en el p53 de tipo salvaje que muta y el nucleótido correspondiente en el mutante no son complementarios.

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De manera breve, se preparan dos sondas de oligonucleótidos por cada cepa de p53 de tipo salvaje o mutada que se va a ensayar. Cada sonda de oligonucleótido es complementaria de una secuencia que porta el nucleótido que llega a estar o ha sido mutado. De esta manera, se forma un hiato entre las dos sondas hibridadas.

Por ejemplo, con el fin de distinguir entre las formas de p53 de tipo salvaje y mutante, en las que la guanina en la posición 526 en la forma de tipo salvaje se muta por la adenina, se prepara las sondas que permiten un hiato en la posición 526. El hiato se rellena con una mezcla de una polimerasa, una ligasa, y el nucleótido complementario al de la posición 526 para formar un producto de oligonucleótido ligado. Por ejemplo, si se está detectando el p53 de tipo salvaje, el hiato se rellena con citosina. No se detectará la forma mutante bajo estas condiciones.

Por otro lado, si se está detectando la forma mutante, se rellenará el hiato con timina. No se detectará el p53 de tipo salvaje bajo estas condiciones. Pueden marcarse mediante procedimientos conocidos en la técnica cualquiera de los oligonucleótidos o el nucleótido de relleno.

Se puede amplificar el producto de oligonucleótido ligado mediante la desnaturalización de este a partir del p53, hibridando este con un par complementario de oligonucleótidos adicionales, y rellenando el hiato de nuevo, esta vez con el complemento del nucleótido que rellenó el hiato en la primera etapa.

Para ilustrar el procedimiento, la estructura (1) muestra un par de sondas de oligonucleótidos con el p53 de tipo salvaje que contiene la guanina en la posición 526. La estructura (2) muestra el hiato entre las dos sondas que está siendo rellenado con citosina. La estructura (3) muestra el producto de oligonucleótido ligado de la estructura (2) que híbrida con dos oligonucleótidos complementarios adicionales. La estructura (4) muestra el hiato en la Estructura (3) que está siendo rellenado con guanina. Se puede repetir este procedimiento tan a menudo como se
desee.

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Tras la ligadura de un producto de oligonucleótido ligado, de manera opcional, la amplificación, se separa el producto de oligonucleótido por tamaño y se detecta la marca mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Sondas de endonucleasa de restricción (no es parte de esta invención)

Se pueden detectar también las mutaciones si crean o suprimen emplazamientos de restricción. Por ejemplo, el emplazamiento del Hha I es GCGC. La mutación en el gen p53 humano en el nucleótido 430 de timina por citosina crea un emplazamiento Hha I. Dicha mutación altera la secuencia de aminoácidos en el residuo 143 de valina por alanina; véase la Tabla 1

Una mutación del gen p53 humano en el nucleótido 526 de guanina por adenina suprime un emplazamiento Hha I. Dicha mutación produce una alteración en el residuo 175 de la arginina por histidina; véase la Tabla 1.

De acuerdo con esto, se pueden detectar las mutaciones indicadas en la Tabla 1 en los residuos 430 y 526 del gen p53 humano mediante el análisis de restricción; véase Baker y col, Science 244, 217-221 (1989). Se presentan en Weinberg y col., Patente de los Estados Unidos 4.786.718 algunos ejemplos adicionales del uso del análisis de restricción para ensayar mutaciones puntuales

Se describen por De Ley y col., J. Bacteriol. 101, 738-754 (1970); Wood y col., Proc. Natl. Acad. USA 82, 1585-1588 (1985); Myers y col, Nature 313, 495-497 (1985); y Myers y col., Science 230, 1242-1246 (1985) algunos procedimientos adicionales para distinguir secuencias de polinucleótidos que difieren por un nucleótido. Estos procedimientos se incorporan como referencia en el presente documento.

Ensayos (no es parte de esta invención)

Las sondas marcadas descritas anteriormente son capaces de distinguir formas de tipo salvaje y conjuntos de mutantes de p53. Se puede obtener la confirmación comparando la respuesta de las sondas con las diferentes formas. Se conocen el gen y la proteína p53 de tipo salvaje, y se pueden obtener mediante procedimientos conocidos, tales como aquellos descritos en Matlashewski y col., EMBO J. 13, 3257-3262 (1984); Zakut-Houri y col, EMBO J. 4, 1251-1255 (1985); y Lamb y Crawford, Mol. Cell. Biol. 5, 1379-1385 (1986). Se pueden preparar mutantes a partir de p53 de tipo salvaje mediante mutagénesis dirigida al emplazamiento; véase, por ejemplo, Zoller y Smith, Nucl. Acid Res. 10, 6487-6500 (1982); Methods in Enzymology 100, 468-500 (1983); y DNA 3. 479-488 (1984).

Se pueden también sintetizar genes estructurales p53 de tipo salvaje y mutante mediante procedimientos conocidos, tales como preparando oligonucleótidos de cadena doble solapados, rellenando en los hiatos, y ligando conjuntamente los extremos. Se puede clonar el ADN en una célula huésped adecuada y expresarse. Se pueden recuperar el ADN y la proteína de p53 a partir de la célula huésped. Véase, de manera general, Sambrook y col, "Molecular Cloning", Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987).

Los ensayos que implican sondas de anticuerpo y ADN se llevan a cabo de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. Se puede diseñar el ensayo de tal manera que el ensayo de sondas sea positivo para el p53 de tipo salvaje y negativo para el p53 mutante. En dicho caso, es preferible usar una sonda de oligonucleótido, que no se verá afectada por la mutación específica.

Por otra parte, las sondas pueden ser positivas al ensayo para el p53 mutante y negativas para el p53 de tipo salvaje. En dicho caso es preferible usar anticuerpos, que detectan la proteína. La preferencia por las sondas de anticuerpo se debe a la presencia de concentraciones más altas de proteína p53 mutante que de la proteína p53 de tipo salvaje en las células transformadas.

Se ha encontrado de manera inesperada que al menos un conjunto de mutantes p53 humanos no enlaza de manera detectable con la proteína del shock térmico hsc70 o, al menos, enlazan de manera significativa menos fuertemente que el p53 de tipo salvaje. Este conjunto comprende mutaciones en los aminoácidos de las posiciones 273 y 281. Por tanto, puede distinguirse este conjunto del resto de conjuntos de mutantes, tales como el conjunto que comprende las mutaciones en las posiciones de los aminoácidos 143 y 175, determinando si existe alguna mutación y, si existe, si los mutantes enlazan con hsc70. Se pueden llevar a cabo los procedimientos para determinar las afinidades de enlace relativas mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se describe por Finlay y col., en Mol. and Cell. Biol. 8, 531-539 (1988) y por Hinds y col., en Mol. and Cell. Biol., 7, 2863-2869 (1987) un procedimiento para determinar si una proteína p53 enlaza con hsc70. El procedimiento descrito en estos papeles implica experimentos de coinmunoprecipitación con anticuerpos anti-p53 y anti-hsc70.

Se puede preparar, por ejemplo, un anticuerpo adecuado específico para hsc70 a partir de suero de conejos inmunizados con 21 aminoácidos carboxiterminales de un miembro de la familia de la proteína del shock térmico de 70 kd, hps70, tal como se describe en el artículo de Hinds y col., Id.

p90

Cuando se transfecta el gen p53 de tipo salvaje o mutado en células de fibroblasto de embrión de rata (REF), las células REF expresan la proteína p53; véase anteriormente. Se puede aislar y purificar p53 mediante procedimientos conocidos. Por ejemplo, se pueden lisar las células y la proteína p53 inmunoprecipitada añadiendo anticuerpos específicos de p53 a las soluciones o suspensiones de la proteína. Los inmunoprecipitados se recuperan mediante centrifugación. Véase Hinds y col., Cell Growth and Differentiation 1, 571-580 (1990); Finlay y col., Cell 57, 1083-1093 (1989) y Hinds y col., molecular and Cell Biology 7, 2863-2869 (1987).

Se puede llevar también a cabo la coinmunoprecipitación por medio de una columna de afinidad de anticuerpos usando condiciones adecuadas para purificar p53 con una columna de inmunoafinidad Pab421. Véase Clarke y col. en Molecular and Cellular Biology 8, 1206-1215 (1988).

Se ha encontrado de manera sorprendente que, cuando se somete a los procedimientos anteriores, la proteína p53 coinmunoprecipita con una proteína que tiene un peso molecular de 90 kD, denominada p90. Los anticuerpos adecuados para la coinmunoprecipitación incluyen Pab421 y Ab2. Pab421 reconoce el término carboxilo de p53 de diversas especies, incluyendo el p53 del ser humano, el ratón y la rata, y se describe por Harlow y col., en el Journal of Virology 39, 861-869 (1981). Ab2 es específico para el término amino del p53 humano, y está disponible de Oncogene Science, Inc. of Manhasset, Nueva York. La proteína no inmunoprecipita cuando las células REF que no expresan p53 se tratan de la misma forma con los mismos anticuerpos.

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Tras la centrifugación o elución de la columna, se puede separar el p90 del complejo p53/p90 por medio de SDS PAGE. La banda única a 90 kD se corta y se secuencia. Una secuencia parcial de p90 obtenida a partir de células de fibro2blasto de embrión de rata transformadas es:

VAQMLLSQESDDYSQPST

Otro procedimiento para purificar p90 es el generalmente descrito por Aebersold y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6970-6974 (1987).

Mamíferos diferentes que las ratas tienen proteínas que son homólogas con el p90 de la rata. Una proteína es homóloga con p90 si coinmunoprecipita con p53 bajo las condiciones descritas anteriormente y tiene sustancialmente la misma secuencia que p90 - es decir, es al menos aproximadamente un 30% idéntica, de manera preferible al menos aproximadamente un 50% idéntica, y de manera más preferible al menos aproximadamente un 75% idéntica que el gen p90 de la rata.

Se puede preparar también la proteína p90 o su homóloga mediante procedimientos de ADN recombinante bien conocidos, tales como aquellos descritos por Sambrook, Frischt y Maniatis (eds) en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). De manera breve, este procedimiento implica proporcionar el AND que codifica la proteína; amplificando o clonando el ADN en un huésped adecuado; expresando el ADN en un huésped adecuado; y cosechando la proteína.

ADN proporcionado

Se aísla el ADN que codifica p90 usando la secuencia parcial de aminoácidos proporcionada anteriormente, o un fragmento de la misma, para preparar una o más sondas de oligonucleótidos. La sonda se marca y usa para seleccionar una librería genómica o de ADN de mamíferos en un vector adecuado, tal como un fago lambda. Se tiene en cuenta la homología entre el ADN del p53 de las especies que están siendo seleccionadas y la del p53 de rata, determinando las condiciones para la hibridación.

Se secuencia el ADN aislado, y la secuencia usada para preparar las sondas de oligonucleótidos adicionales. Se puede repetir este procedimiento para obtener fragmentos solapados hasta que se produce un marco abierto de lectura completo.

Selección del ADN genómico con sondas de oligonucleótidos

Se conocen en la técnica los procedimientos para determinar si una sonda de oligonucleótido reconoce una molécula específica de ácido nucleico en una muestra. De manera preferible se inmoviliza la molécula de ácido nucleico diana. La presencia de la sonda hibridada con la molécula de ácido nucleico diana indica la presencia de la molécula de ácido nucleico en la muestra.

Se describen los ejemplos de algunos procedimientos de selección adecuados por Dallas y col. en "The Characterization of an Escherichia Coli Plasmid Determinant that Encodes for the Production of a Heat-labile Enterotoxin". en K. N. Timmis y A. Puehler eds., Plasmids of medical, Environmental, and Comercial Importance, Elsevier / North-Holland Publishing Co., Amsterdam, páginas 113-122 (1975); Grunstein y Hogness en Proc. Natl. Acad. Sci USA 72, 3961-3965 (1975); Palva y col. en la Patente de los Estados Unidos 4.731.325 que se transfiere a Orion-yhtyma, Espoo, Finlandia; Mullis y col. en la Patente de los Estados Unidos 4.683.195, que se transfiere a Cetus Corporation, Emeryville, California; Schneider y col en la Patente de los Estados Unidos 4.822.269, que se transfiere a la Princeton University, y Segev en la Solicitud PCT WO 90/01069. La patente de Schneider y la Solicitud de Segev se han licenciado a ImClone Systems Inc., Ciudad de Nueva York.

Amplificación de ADN

Se puede amplificar el ADN obtenido mediante procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento adecuado es el procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por Saiki y col. en Science 239, 487 (1988), por Mullis y col en la Patente de los Estados Unidos 4.683.195 y por Sambrook, Fristch y Maniatis (eds) en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Es conveniente amplificar los clones en los vectores lambda-gt10 o lambda-gt11 usando oligómeros específicos de lambda-gt10 o lambda-gt11 tales como los Amplimers (disponibles de Clontech, palo Alto, California).

Secuenciamiento de ADN

Se clonan los fragmentos de restricción en un vector adecuado, tal como un plásmido o un bacteriófago, y se secuencian de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica. Un procedimiento de secuenciamiento adecuado es el procedimiento de terminación de la cadena dideoxi descrito por Sanger y col. en Proc. Natl. Acad. Sci USA 74, 5463-5467 (1977). Se conocen los vectores y polimerasas adecuados para el secuenciamiento. Un vector adecuado es el vector Bluescript de Stratagene. Una polimerasa adecuada es Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio).

Expresión del ADN

El ADN que codifica la proteína de la invención puede ser replicado y usado para expresar la proteína recombinante tras inserción en una amplia variedad de células huésped en una amplia variedad de vectores de clonación y expresión. El huésped puede ser procariota o eucariota. Se puede obtener el ADN a partir de fuentes naturales y, de manera opcional, modificadas. Se pueden sintetizar también los genes por completo o en parte.

El vector en el que el vector se ayusta puede comprender segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Algunos vectores de clonación procariotas adecuados incluyen plásmidos de E. coli, tales como colE1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM, y RP4. Los vectores procariotas incluyen también derivados de ADN de fago tales como fd, M13, y otros fagos filamentosos con ADN de cadena única.

Se conocen también los vectores que expresan proteínas en bacterias, de manera especial E. coli. Dichos vectores incluyen la familia del plásmido pKK233 (o alguno de la familia tac de plásmidos), T7, y lambda P_{L}. Los ejemplos de los vectores que expresan las proteínas de fusión incluyen los vectores PATH descritos por Dieckmann y Tzagoloff en J. Biol.: Chem. 260, 1513-1520 (1985). Los vectores PATH contienen secuencias de ADN que codifican la antranilato sintetasa (TrpE) seguido por un polienlazante en el término carboxilo. Otros sistemas de vectores de expresión se basan en la beta-galactosidasa (pEX); la proteína que enlaza la maltosa (pMAL); la glutatión S-transferasa (pGST) - véase Gene 67, 31 (1988) y Peptide Research 3, 167 (1990).

Están disponibles los vectores útiles en levaduras. Un ejemplo adecuado es el plásmido 2u.

Se conocen también los vectores adecuados para uso en células de mamíferos. Dichos vectores incluyen derivados bien conocidos de SV-40, adenovirus, secuencias de ADN derivadas de retrovirus y vectores derivados de la combinación de plásmidos y ADN de fago.

Se conocen en la técnica vectores de expresión eucariota adicionales (por ejemplo, P. J. Southern y P. Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982); S. Subramani y col., Mol. Cell. Biol. 1, 854-864 (1981); R. J. Kaufmann y P. A. Sharp, "Amplification And Expression Of Sequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene", J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); R. J. Kaufmann y P. A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); S. I. Scahill y col., "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chine Hamster Ovary Cells", Pro. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4654-4659 (1983); G. Urlaub y L. A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-4220, (1980).

Los huéspedes de expresión útil incluyen célula procariotas y eucariotas bien conocidas. Algunos huéspedes procariotas adecuados incluyen, por ejemplo, E. coli, tales como E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI, y E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis, y Streptomyces. Las células eucariotas adecuadas incluyen levaduras y otros hongos, insectos, células animales, tales como células COS y células CHO, células humanas y células de plantas en cultivo de tejidos.

Los vectores de expresión útiles en la presente invención contienen al menos una secuencia control de la expresión que se enlaza de manera operativa con la secuencia o fragmento de ADN que se va a expresar. La secuencia de control se inserta en el vector con el fin de controlar y regular la expresión de la secuencia de ADN clonada. Los ejemplos de secuencias control de la expresión útiles son el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, las regiones del operador y promotor mayores del fago lambda, la región de control de la proteína recubierta fd, los promotores glicolíticos de levaduras, por ejemplo, el promotor para la 3-fosfoglicerato quinasa, los promotores de la fosfatasa ácida de levaduras, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de alfa-acoplamiento de levaduras, y lo promotores derivados del polioma, adenovirus, retrovirus, y virus de los simios, por ejemplo, los promotores temprano y tardíos o SV40, y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de los genes de las células procariotas o eucariotas y sus virus o las combinaciones de los mismos.

Proteínas de fusión

Se pueden purificar las proteínas mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede expresar la proteína entera o porciones de la misma en forma de una proteína de fusión con un compañero de fusión apropiado. El compañero de fusión facilita de manera preferible la purificación y la identificación. Algunos compañeros de fusión útiles incluyen la beta-galactosidasa (Gray, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 79, 6598 (1982)); trpE (Itakura y col., Science 198, 1056 (1977)); proteína A (Uhlen y col., Gene 23 369 (1983)); glutatión S-transferasa (Johnson, Nature 338, 585 (1989)); Van Etten y col., Cell 58, 669 (1989)); y la proteína que enlaza la maltosa (Guan y col., Gene 67, 21-30 (1987); Maina y col., Gene 74, 36-373 (1988); Riggs, P., en Ausebel, F. M. y col (eds) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Associates/Wiley Interscience, Nueva York (1990)).

Se pueden purificar dichas proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad usando reactivos que enlacen con el compañero de fusión. El reactivo puede ser un ligando específico del compañero de fusión o un anticuerpo, de manera preferible un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, se pueden purificar las proteínas de fusión que contienen beta-galactosidasa mediante cromatografía de afinidad usando una columna de anticuerpo anti-beta-galactosidasa (Ullman, Gene. 29, 27-31 (1984)). De manera similar, se pueden purificar las proteínas de fusión que contienen la proteína que enlaza la maltosa mediante cromatografía de afinidad usando una columna que contiene amilosa entrecruzada; véase Guan, Solicitud de Patente Europea 286.239.

De manera opcional, se diseña el ADN que codifica la proteína de fusión de tal manera que la proteína de fusión contenga un emplazamiento entre la proteína y el compañero de fusión que se pueda romper. Se conocen en la técnica emplazamientos químicos y enzimáticos que se pueden romper. Los ejemplos adecuados de emplazamientos que se pueden romper de manera enzimática incluyen los emplazamientos que se reconocen y rompen de manera específica por la colagenaza (Keil y col., FEBS Letters 56, 292-296 (1975)); enteroquinasa (Hopp y col., Biotechnology 6, 1204-1210 (1988)); factor Xa (Nagai y col., Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987)); y la trombina (Eaton y col., Biochemistry 25, 505 (1986)). La colagenaza rompe entre la prolina y X en la secuencia Pro-X-Gly-Pro en la que X es un aminoácido neutro. La enteroquinasa rompe tras la lisina en la secuencia Asp-Asp-Asp-Asp-Lys. El factor Xa rompe la arginina en la secuencia Ile-Glu-Gly-Arge. La trombina rompe entre la arginina y la glicina en la secuencia Arg-Gly-Ser-Pro.

Se conocen también los agentes químicos de rotura específica. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno rompe los residuos de metionina en las proteínas.

Purificación de proteínas

La proteína recombinante se purifica mediante procedimientos conocidos en la técnica. Dichos procedimientos incluyen la cromatografía de afinidad usando anticuerpos específicos. De manera alternativa, se puede purificar la proteína recombinante usando una combinación de intercambio iónico, exclusión por tamaño, y cromatografía de interacción hidrófoba usando procedimientos conocidos en la técnica. Estos y otros procedimientos adecuados se describen por Marston, "The Purification of Eukaryotic Proteins Expressed in E. coli" en DNA Cloning, D. M. Glover, Ed., Volume III, IRL Press Ltd., Inglaterra, 1987.

Se puede usar p90 para preparar anticuerpos que sean capaces de coinmunoprecipitar p53. Se puede aislar p53 del precipitado y purificarse. Los anticuerpos anti-p90 pueden ser policlonales o monoclonales.

Se pueden preparar anticuerpos policlonales y monoclonales mediante procedimientos conocidos en la técnica. Véase lo mencionado anteriormente y Campbell, "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" en Burdon y col., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985).

Claims

1. Un complejo p53/p90 aislado, en el que el p90 se puede obtener a partir de células de fibroblasto de embrión de rata transformado, y que tiene la secuencia parcial VAQMLLSQESDDYSQPST, u homólogo del mencionado p90 de rata.

2. El complejo de la reivindicación 1 en el que el p53 es un p53 de tipo salvaje.

3. El complejo de la reivindicación 1 en el que el p53 es un p53 mutante.

4. El complejo de la reivindicación 3 en el que el p53 mutante es un p53-143A.

5. El complejo de la reivindicación 3 en el que el p53 mutante es un p53-175H.

6. El complejo de la reivindicación 3 en el que el p53 mutante es un p53-273H.

7. El complejo de la reivindicación 3 en el que el p53 mutante es un p53-281G.

8. El uso in vitro de cualquiera de los complejos de las reivindicaciones 1 a 7 como marcador tumoral.