JP3179481B2 - 突然変異体ｐ５３検出用プローブ - Google Patents

突然変異体ｐ５３検出用プローブ

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、癌および前癌状態の検出における分子プロ
ーブ類の使用に関する。さらに詳細には、本発明は、抗
体およびDNAプローブ類による癌および前癌状態の識別
に関する。前記癌および前癌状態は、p53タンパク質類
に関連するものである。
体細胞中におけるプロトオンコジーン（癌原遺伝子,p
roto−oncogene）類の変異は、ヒト癌の誘発において重
大であるとしてますます認識されつつある。このような
変異によって形成されるオンコジーンのいくつかの例と
して、neu,fes,fos,myc,myb,fms,Ha−rasおよびKi−ras
がある。プロトオンコジーン類をオンコジーン類に変換
する変異は、しばしば、点突然変異である。オンコジー
ン類およびそれらの発現生成物類がどのようにして正常
細胞を癌細胞に形質変換するように作用するのかについ
て理解するため、多くのことを知る必要がある。
オンコジーン類は、一般に、優性様式で作用すると考
えられている。このことは、一般に、１個のプロトオン
コジーンから１個のオンコジーンへの変換の結果、新規
機能、すなわち形質転換増強の取得を意味すると考えら
れている。
癌関連の異なるタイプの変異は、腫瘍抑制遺伝子の生
成物にその腫瘍抑制機能を喪失させるようにこの遺伝子
が変化したときに出現する。このような腫瘍抑制遺伝子
の例として、網膜芽細胞腫感受性遺伝子Rbがある。腫瘍
抑制遺伝子類は、時に、劣性オンコジーン類とも呼ばれ
るが、但し、厳密に言えば、腫瘍抑制遺伝子類の生成物
は腫瘍形成には寄与しない。両対立遺伝子類が変異した
とき腫瘍抑制遺伝子が欠けている結果腫瘍化が促進され
るので、この表現型は劣性である。
あるウイルスオンコジーン類の生成物類も、また、細
胞を形質転換できる。このような生成物類の例として、
ヒトパピローマウイルス由来E6およびE7タンパク質類、
SV40由来大きいＴ抗原、およびアデノウイルス由来Ela
が挙げられる。ウイルスオンコジーンタンパク質類は、
網膜芽細胞腫タンパク質のような腫瘍抑制タンパク質類
に結合し、それによって、この腫瘍抑制タンパク質類を
不活化すると考えられている。
優性および劣性オンコジーンの両方の特性をいくつか
発現する遺伝子生成物は、53kdのリンタンパク質、p53
である。このp53遺伝子における変異が多くの種類の多
数の癌に関連している証拠が増えている。たとえば、Ig
goら〔ランセット（Lancet）335,675−679（1990）〕
は、p53が肺癌において変異を受ける最も一般的なプロ
トオンコジーンであるという意見を述べている。
p53について知られていることの多くは、野生型かつ
変異マウスp53をラット胎児線維芽細胞中に移入する効
果を研究することから由来している。この研究は、Levi
neら、“p53プロトオンコジーンおよびその生成物（The
p53 Proto−Oncogene And Its Product）”、小さいDN
A腫瘍ウイルスによる形質転換の一般的メカニズム（Com
mon Mechanisms of Transformation By Small DNA Tumo
r Viruses）、L.Villarreal編著、アメリカンソサイア
ティ・フォア・マイクロバイオロジー（Ameican Societ
y of Microbiology）、２章（1989）;Hindsら、同上、
７章；およびLevine、バイオアッセイズ（BioEssays）1
2,60−66（1990）によって、レビューされている。
簡単に述べれば、p53の（アミノ酸390個から）アミノ
酸130および240の間のいくつかの点変異が、表現型にお
ける重要な腫瘍促進性変化をもたらす。野生型および変
異p53の両方で、それらの代謝安定性増加の故に形質転
換細胞におけるレベル増加がしばしば見られる。変異p5
3の安定化は、70kdの熱ショックタンパク質、hsc70のよ
うな細胞性タンパク質類との複合体を形成して出現する
と考えられている。野生型p53の安定化は、変異p53−hs
c70複合体との複合体を形成する能力に関連していると
考えられている。これらの結果は、p53機能における変
化が細胞性形質転換過程に関与しているという説と矛盾
しない。変異マウスp53が培養細胞の形質転換に関与し
ていることは、また、野生型ではない変異p53の活性化H
a−rasとの相互作用で初代ラット胎児細胞類を形質転換
する能力からも明らかである。
p53遺伝子は、染色体17p上にある。上記で検討したよ
うに多くの癌が、染色体17pの欠失に関連している。こ
のような対立遺伝子の欠失は、しばしば、腫瘍抑制遺伝
子の存在を示唆している。１個の対立遺伝子の変異は、
良性の前癌状態を生じる。第２対立遺伝子の変異は、悪
性腫瘍状態をもたらす。
Finlayら〔セル（Cell）57,1083−1093（1989）〕
は、さらに、野生型マウスp53が形質転換抑制因子の特
性を示すことを発表した。３つの観察がこの説と一致し
ている。
第１に、２種の協同する形質転換遺伝子類、rasおよ
びElaとともに野生型マウスp53を初代げっ歯細胞へ導入
した結果、形質転換された細胞増殖巣の数が減少する。
得られたこの形質転換された細胞系統は、マウスp53遺
伝子を含有することが判明したが、それを発現すること
も、また高レベルの改変マウス生成物を産生することも
なかった。したがって、野生型マウスp53タンパク質の
過剰発現は、培養ラット細胞のオンコジーン類による形
質転換過程にとって有害であるらしい。
第２に、p53遺伝子の不活化は、フレンド（Friend）
ウイルス誘発赤白血病細胞のマウスにおける発生に関連
していると考えられている〔Mowatら、ネーチャー（Nat
ure）314,633−636（1985）〕。文献には、p53遺伝子座
における再配列または他の変異を含むFriendウイルス複
合体感染マウス脾臓由来腫瘍細胞の例が数多くある〔た
とえば、BenDavid,オンコジーン（Oncogene）３,179−1
85（1988）参照〕。
野生型p53タンパク質が形質転換抑制に関与している
タンパク質群の１員であるという可能性と一致する第３
の証拠として、上記にも記載したが、SV40の大きいＴ抗
原、アデノウイルス５型Elb−55kdタンパク質、および
ヒトパピローマウイルス（HPV）16型または18型E6生成
物のようなウイルスオンコジーン類とのオリゴマータン
パク質複合体類を形成するp53の能力が挙げられる〔た
とえば、Werness,サイエンス（Science）248,76−79（1
990）参照〕。網膜芽細胞腫感受性遺伝子の生成物であ
るp105およびSV40の大きいＴ抗原〔DeCaprioら、セル
（Cell）54,275−283（1988）〕、アデノウイルスElaタ
ンパク質〔Whyteら、ネーチャー（Nature）334,124−12
9（1988）〕、およびHPV−16または−18のE7タンパク質
〔Muengerら、EMBOジャーナル（EMBO J.）８,4099−410
5（1989）〕の間で、同様の複合体類が観察されてい
る。
ウイルスタンパク質類とp105との間のこれらの相互作
用は、p105の生体抑制性機能を不活化し、したがって、
腫瘍細胞中の網膜芽細胞腫遺伝子中によくみられる欠失
および変異を模倣すると考えられている。同様に、これ
らの同一ウイルスタンパク質類とp53とのオリゴマータ
ンパク質複合体形成は、p53の生長抑制機能を消失させ
るかまたは改変させることができる〔Finlayら、同上、
参照〕。
p53関連腫瘍類のクローン性質は、野生型p53遺伝子お
よび変異p53遺伝子保持非新生性前癌細胞が２個の野生
型遺伝子類を含有する正常細胞に対して著明な増殖上の
利点を有している腫瘍促進モデルと一致している。この
利点は、変異p53媒介野生型p53機能の干渉による。この
ような非新生性細胞の増殖能上昇は、p53座における第
２の不活化変異、すなわち、遺伝子転換または欠失の確
率を増大させる。結果として生じた細胞類は、p53対立
遺伝子類の両方に現在変異を有しており、完全に新生性
の表現型を発現できる〔Finlayら、同上、およびBaker
ら、サイエンス（Science）244,217−221（1989）参
照〕。
上記モデルは、17p染色体対立遺伝子を欠失したヒト
腫瘍細胞類が残りの対立遺伝子中に変異を有していると
いう発見によって裏付けられる。この変異は、前記p53
の最も高度に保存される４領域に一致する４個の“ホッ
トスポット”中に密集する（cluster）傾向があった〔N
igroら、ネーチャー（Nature）342,705−708（1989）参
照〕。
Gannonら〔EMBO J.９,1595−1602（1990）〕は、全て
のヒト変異p53タンパク質類がモノクローナル抗体PAb24
0によって認識されると提案している。これらの著者ら
は、全てのp53変異体が共通の構造上の効果を発現し、
その結果、PAb240エピトープの発現が起こると示唆して
いる。
本発明の基礎を形成する本発明者らの観察事項 ヒトp53に関連した本発明者らのこれまで未公表の実
験が、本発明の基礎を形成している。結腸直腸癌由来の
異なるヒトp53クローン類は、（総数393個の残基から）
アミノ酸残基143、175、273または281で変異を有してい
る。このようなp53変異体が活性化野生型rasオンコジー
ン類とともにラット胎児線維芽細胞（REFs）中に同時移
入されるとき前記オンコジーン類と協同して培養REFsを
形質転換する。これらの実験に由来する形質転換された
細胞系統の全てがヒトp53タンパク質産生レベルを上昇
させる。
前記変異を表１に要約した。ヒトp53変異タンパク質
類の特性に及ぼす変異の効果は、表２に示した。
表２の結果を得るため、p53のcDNAクローン類またはp
53の部分的cDNAゲノムクローン類と活性化rasオンコジ
ーンとを、初代ラット胎児線維芽細胞に同時移入した。
各組のトランスフェクションにおいて、形質転換された
細胞増殖巣の点数を二重細胞培養で２乃至３週後に調べ
た。
表２の結果は、結腸癌由来変異ヒトp53cDNAまたはcDN
Aゲノムハイブリッドクローン類が優性オンコジーン類
として挙動し、かつラット胎児線維芽細胞の形質転換で
ラットオンコジーンと協同できることを示している。ア
ミノ酸残基143、175、273および281における４つの異な
るミスセンス変異がそれぞれ、この形質転換された表現
型に寄与していた。これらの全ての場合において、ヒト
p53変異タンパク質がこの形質転換細胞中で少なくとも
部分的に高レベルに産生され、これらの変異タンパク質
類の半減期を延長した。
前記の異なる変異体を含む細胞の表現型が同一でない
ことは予測されなかった。たとえば、１実験では、コド
ン175、273および281における“ホットスポット”変異
を含有する３つのp53DNAクローン類、すなわち、p53−1
75H、p53−273H、およびp53−281Gは、6:2.4:1の割合で
特徴的かつ再現可能な形質転換頻度（産生された細胞増
殖巣の数）を有しており、これらの“ホットスポット”
変異がそられの表現型において同等でないことを示唆し
ている。別の実験では、175変異対立遺伝子は、初代ラ
ット培養細胞の形質転換に際し273変異対立遺伝子より
もrasオンコジーンとの協同で３−10倍効率的であっ
た。
p53−175Hおよびp53−c143A変異タンパク質類は形質
転換細胞においてhsc70に結合し、一方、p53−273Hおよ
びp53−281G変異タンパク質類はhsc70と検出可能なほど
相互作用しまたは結合することがないことは、いっそう
驚くべきことである。先の実験では、いくつかの変異マ
ウスp53タンパク質類が改変構造を有していることが示
された〔Hindsら、モレキュラー・エンド・セルラーバ
イオロジー（Mol.Cell.Biol.）７,2863−2869（1987）;
Finlayら、同上、８,531−539（1988）〕。このような
改変されたp53分子類がhsc70に結合しかつp53の適切な
折り畳み、集合または局在を阻害する複合体中において
野生型p53を隔離することが可能である。したがって、p
53−c143Aおよびp53−175Hは、決して正しく折り畳まれ
ず、したがってそれらのhsc70に対する親和性を保持し
ている変異タンパク質類を代表することができる。もし
野生型p53がこの複合体中に補充されると、このp53変異
hsc70−p53野生型複合体は、野生型p53の機能に悪影響
を与えるであろう。
このことは、p53−273Hおよびp53−281G変異体には当
てはまらず、これらは、上記にも述べたように、hsc70
に結合しない。このp53−273Hヒト変異タンパク質はラ
ットp53タンパク質と会合でき、ヒト特異的抗体Ab−２
との同時免疫沈降によって証明されるように、オリゴマ
ー複合体を形成できる。この複合体はhsc70によって媒
介されておらず、ラット細胞性野生型p53タンパク質を
隔離する点で効率が劣る。このことは、培養細胞の形質
転換能力がより劣っていることと矛盾しない。
活性化rasと変異ヒトp53との同時トランスフェクショ
ンに比較して、活性化rasと野生型ヒトp53との同時トラ
ンスフェクションは、細胞増殖巣形成の頻度が極めて低
い結果となり、そして、唯一の細胞増殖巣は、樹立され
た細胞１系統にクローニングできた。したがって、ヒト
p53の変異が野生型53では検出できない優性形質転換機
能を活性化するように見える。
要約すれば、ヒトp53変異タンパク質類の全てが、延
長された半減期を有することによって、高レベルで発現
されることによって、および培養細胞を形質転換する能
力を保持していることによって、野生型ヒトp53タンパ
ク質と異なるように見える。これらのデータは、p53の
１個の対立遺伝子上における変異が、インビボで増殖促
進性の表現型を有することができ、このことは、このよ
うな変異を有する細胞の数を拡大し、そして腫瘍細胞中
における第２の変異事象（欠失または遺伝子変換）の選
択に有利に利用するという示唆を裏付ける。多くの腫瘍
細胞がこの変異p53対立遺伝子のみを保持しているとい
う観察は、これらの変異タンパク質類が野生型対立遺伝
子に対して十分な優性ではないことまたはこの変異体が
野生型p53の不存在下で細胞に対して増殖促進性を付与
し続けることを示唆している。野生型p53の不存在下で
このような変異p53の細胞増殖に及ぼす正の効果はこの
分子に固有の機能でもありうるが、また、内因性p53以
外の細胞性タンパク質類の滴定によって、たとえば、タ
ンパク質p90により媒介されることもありうる。
最も重要であるのは、この結果が、異なる表現型を有
する前癌および癌細胞を生成するヒトp53変異体にクラ
スがあることを確立したことである。これらの異なる表
現型が異なる経過をとりかつ異なる予後を有する癌を発
生させることは明らかである。
現行の癌検出方法の問題点は、これらの異なる表現型
変化が考慮されていなかったことである。この問題は、
本発明によって解明される。
本発明によって解明された第２の問題点は、この異な
る表現型変化が癌の経過および予後にどのような影響を
及ぼすかを決定することである。いったんこの問題が解
決されれば、癌がたどる経過を予測しかつこの癌を治療
するための最善の方法を予測できるようになるため、さ
まざまな表現型変化を検出可能とすることがもうひとつ
の問題である。
発明の要旨 これらおよびその他の問題は、当業者に明らかなよう
に、前癌および癌細胞において頻繁に発生するかまたは
選択される何組かのヒトp53遺伝子またはp53タンパク質
の変異で、その各組が野生型p53のそれと異なりかつ少
なくとも他の１組（set）のp53変異体のそれと異なる表
現型を生成する組を検出しかつ識別する１パネルのプロ
ーブ類（a panel of probes）を提供することによって
解決された。
本発明は、さらに、前癌および癌細胞において頻繁に
発生するかまたは選択される何組かのヒトp53遺伝子ま
たはp53タンパク質の変異で、その各組が野生型p53のそ
れと異なりかつ少なくとも他の１組のp53変異体のそれ
と異なる表現型を生成する組を識別する方法に関し、こ
の方法は、p53遺伝子類またはp53タンパク質類試料中で
このような組を検出しかつ識別する１パネルのプローブ
類で変異を決定することからなる。
本発明は、また、前癌および癌細胞において頻繁に発
生するかまたは選択される何組かのヒトp53遺伝子変異
体を識別する方法を提供し、本方法は、このような変異
体が存在するかどうか、そして、もしそうであれば、こ
の変異タンパク質が野生型ヒトp53タンパク質に比べて
そのhsc70との結合が弱いかどうかを決定する段階から
なる方法である。
発明の詳細な説明 定義 本発明は、野生型p53遺伝子類およびp53タンパク質類
中の変異を検出することに関する。本明細書の目的のた
め、用語“野生型"p53は、Matlashewskiら〔EMBO J.13,
3257−3262（1984）〕;Zakut−Houriら〔EMBO J.４,125
1−1255（1985）〕；およびLambおよびGrawford〔モレ
キュラー・エンド・セルラーバイオロジー（Mol.Cell.B
iol.）５,1379−1385（1986）〕によって報告されたヌ
クレオチドまたはアミド酸配列を意味する。この配列類
は、ジーンバンク（GenBank）から入手可能である。野
生型p53には、アミノ酸72位におけるプロリン／アルギ
ニン多形性および対応するヌクレオチド多形性が含まれ
る。
野生型p53遺伝子類およびp53タンパク質類中における
変異の検出は、このような変異が前癌および癌状態を示
唆するので、重要である。p53変異に関連する癌の種類
に関して明らかな制限は全くない。このような癌として
は、一般に、結腸、直腸、肺、卵巣、子宮、副腎皮質、
骨、膀胱、胸、脳および間葉癌、およびさらに詳細に
は、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄形成白血病、骨原性肉
腫が挙げられる。
１個の前癌細胞とは、１個のp53対立遺伝子および１
個の変異p53対立遺伝子を有する細胞として定義され
る。変異は、通常、点変異である。
癌細胞において、両方の対立遺伝子が変異を受ける。
前癌細胞について上記したように、１個の変異は、通常
点変異である。他の変異は、通常、p53遺伝子の全体ま
たは重要部分の欠失である。
変異 本発明は、異なる構造および異なる表現型の組に対応
する組の変異がp53中にあるという予測外の発見に基づ
いている。可能な限り多くの変異の組を決定することが
重要である。しかし、ひとつの組内でそれぞれの各変異
を決定することは必要でない。１組の変異は、少なくと
も１個の変異を有しかつ野生型および少なくとも他の１
組の変異と異なる表現型を生成するものとして定義され
る。
各組の表現型は、同一疾患について識別可能な経過お
よび重篤度をもたらす。したがって、何組かの変異を決
定することによって、医師は、患者がある特定の癌を有
することを決定できるばかりでなく、異なるそれらの組
の予後を識別しかつ最善の治療を処方することができ
る。
たとえば、多くの結腸直腸癌は、アミノ酸143位、175
位、273位および281位においてまたはその近辺で変異を
生じる。これらの変異は、表１に記載されている。
リ・フラウメニ（Li−Fraumeni）症候群に罹患してい
る家族は、コドン245および258にクラスターを形成する
p53変異を含んでいる。コドン248における変異は、特
に、罹患率が高い。これらの家族は、高い癌発生率を有
している。
リ・フラウメニ症候群で指摘されたのと同一領域にお
けるp53変異は、また、肝細胞癌にも頻繁に見られる。
コドン249における変異は、肝癌患者で頻繁に見られ
る。
変異を受けた全ての単一ヌクレオチドまたはアミノ
酸、または、１個以上の変異が起こっているp53遺伝子
のいかなる領域またはタンパク質も、本発明による変異
体の組（set）を構成する。ただし、この変異の組が上
記に述べた定義を満足する限りにおいてである。本発明
の１態様において、たとえば、何組かの変異は、p53タ
ンパク質の残基117−142、171−181、234−258、および
270−286、およびこのp53遺伝子の対応するヌクレオチ
ド類からなる。
本発明のもうひとつの態様では、１組の変異は、アミ
ノ酸143および175における変異からなる。第２の変異の
組は、アミノ酸273および281における変異からなる。
プローブ類パネル 一般に、本発明によるプローブ類パネルは、少なくと
も２つの構成員を含んでいる。例えば、３、４、５また
は６組ほどの多くの変異があり、したがって、同一数の
プローブがあるかもしれない。８、10または12ほどの多
くのプローブがあり、実際にはそれ以上のプローブがあ
るかもしれない。
１組になった変異は、種々のタイプのヒト腫瘍で共通
に見られる。これらの変異の遍在性は、これらの高い発
生数、または先にも説明したように、それらがそれらを
含有する細胞に対して増殖促進性を提供し、そのために
選択されるので結果として生じるであろう。
前記遺伝子のヌクレオチド配列または前記タンパク質
のアミノ酸配列のいずれかにおける改変は、本発明によ
る何組かの変異の１組の中で変異が存在するかどうかを
決定するためにアッセイできる。アミノ酸配列における
改変は、抗体類によって探索できる。ヌクレオチド配列
における改変は、ヌクレオチドプローブ類またはある場
合には制限エンドヌクレアーゼによって探索できる。本
文で使用したヌクレオチド類とは、RNAまたはDNAを意味
する。
抗体プローブ類 本明細書による“抗体”とは、特異的にエピトープに
結合するポリペプチドとして広く定義される。この抗体
は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。さら
に、抗体類には、Huseら〔サイエンス（Science）246,1
275−1281（1989）〕の方法に従って調製した組換えポ
リクローナルまたはモノクローナルFab断片類も含まれ
る。
オンコジーン間の単一のアミノ酸の相違に対して特異
性を示すポリクローナルおよびモノクローナル抗体類の
調製方法は、米国特許第4,798,787号にMcCormickらによ
って記載されている。これらの方法は、本文で参考とし
て引用している。
簡単に述べると、ポリクローナル抗体類は、ウサギ、
マウス、ラットまたはヤギのような宿主哺乳類に対して
変異p53および野生型p53を識別する抗体類を産生可能な
p53タンパク質またはその断片を注射して産生できる。
注射されるペプチドまたはペプチド断片には、野生型配
列またはその変異体配列が含まれる。前記哺乳類から血
清を抽出しスクリーニング後、ペプチドまたはペプチド
断片に特異的なポリクローナル抗体類を得る。
モノクローナル抗体類を産生するため、上述のように
ペプチドまたはペプチド断片を宿主哺乳類に接種しその
後ブーストする。接種哺乳類から最終ブースト後に脾臓
を採取する。脾臓由来細胞懸濁物をKohlerおよびMilste
in、ネーチャー（Nature）256,495−497（1975）に記載
の一般的方法に従って腫瘍細胞と融合する。ペプチド断
片は、有用であるためには、検出しようとするp53分子
のエピトープを規定するアミノ酸残基を十分量含有して
いなければならない。
もし断片が余りにも短く免疫原性となりえなければ、
それを担体分子と連結することもできる。いくつかの適
切な分子類として、カブトガニヘモシアニンおよびウシ
血清アルブミンが挙げられる。連結は、当該技術分野で
公知の方法によって実施できる。このような方法の一つ
として、前記断片のシステイン残基を担体分子上のシス
テイン残基と結合する方法が挙げられる。
ペプチド断片類は、当該技術分野で公知の方法によっ
て合成できる。いくつかの適切な方法は、Stuartおよび
Youngによって“固相ペプチド合成（Solid Phase Pepti
de Synthesis）”、第２版、ピアス化学社（Pierce Che
mical Company）（1984）に記載されている。
さまざまなアッセイ手段が、標識抗体でタンパク質類
を検出するために利用可能である。このような方法で
は、１段階ないし２段階を行う。１段階アッセイでは、
ターゲットp53分子がもし存在するならばそれを固定化
し、標識抗体とインキュベートする。この標識抗体は、
固定化p53と結合する。未結合分子類を除去するために
洗浄後、標識の存在をアッセイする。
２段階アッセイでは、固定化p53を非標識抗体とイン
キュベートする。p53非標識抗体複合体がもし存在すれ
ば、非標識抗体に特異的な２次標識抗体と結合させる。
試料を洗浄し、この標識の存在を上述のようにアッセイ
する。
本標識は、放射性原子、酵素、または発色性分子であ
ることができる。放射性原子のいくつかの例として、32
P、125I、3Hおよび14Cが挙げられる。酵素のいつくかの
例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホス
ファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。発色性分
子類のいくつかの例として、フルオレセインおよびロー
ダミンが挙げられる。この抗体類は、これらの標識類に
当該技術分野で公知の方法によって連結できる。たとえ
ば、酵素類および発色分子類は、ジアルデヒド類、カル
ボジイミド類、ジマレイミド類等のような結合剤によっ
てこの抗体類に結合できる。これとは別に、連結は、リ
ガンド−レセプター体によっても起こり得る。いくつか
の適切なリガンド−レセプター対として、たとえば、ビ
オチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジ
ン、および抗体−抗原が挙げられる。
オリゴヌクレオチドプローブ類 本発明のプローブ類は、また、変異DNAまたはDNAから
野生型を識別するオリゴヌクレオチド類でもありうる。
オリゴヌクレオチドプローブ類は、当該技術分野で公知
の方法によって調製できる。オリゴヌクレオチドプロー
ブ類を合成する適切な方法は、Caruthersによってサイ
エンス（Science）230,281−285（1985）に記載されて
いる。
前記オリゴヌクレオチドプローブ類は、野生型または
変異p53の配列に相補的に変異した１個のヌクレオチド
からなる配列を含有していてもよい。たとえば、そのよ
うな変異をしたヌクレオチドは、野生型または変異p53
の430位、526位、820位、または844位において変異した
ものである。
オリゴヌクレオチドプローブの長さは、それが、野生
型または変異p53を含有する被験試料にハイブリダイズ
しかつこの２つを識別可能でありさえすれば、問題では
ない。前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも６個のヌ
クレオチド類、好適には少なくとも10個のヌクレオチド
類、およびさらに好適には少なくとも15個のヌクレオチ
ド類を含有すべきである。
前記オリゴヌクレオチドプローブ類は、検出用に標識
される。検出用にオリゴヌクレオチドプローブ類に連結
可能な標識類は、抗体類に連結するそれらと同一であ
る。このような標識は上記に記載されている。オリゴヌ
クレオチド類に本標識を連結することは、当該技術分野
で公知の方法によって達成される。
オリゴヌクレオチドプローブ類の長さには上限がな
い。プローブの長さが長ければ調製がより困難となりか
つ長いハイブリダイゼーション時間を必要とする。した
がって、前記プローブは、必要以上に長くすべきでな
い。オリゴヌクレオチドプローブは、通常、50個以上の
ヌクレオチド類を含有せず、好適には40個未満、さらに
好適には30個未満のヌクレオチド類を含有する。
野生型オンコジーン類を単一ヌクレオチド変化を有す
る変異体から識別する方法は、PCT出願WO 87/07646に
記載されている。これらの方法は、本文で参考として引
用している。
簡単に述べれば、野生型または変異配列のいずれかを
含有するオリゴヌクレオチド類は、厳重な条件下におい
て、適当な制限エンドヌクレアーゼによって消化したタ
ーゲットp53RNAまたはDNAを含有する乾燥アガロースゲ
ル類にハイブリダイズさせる。適切な条件として、完全
二重鎖の計算Tmより２度低いことが挙げられる。このオ
リゴヌクレオチドプローブは、前記プローブおよびター
ゲットp53が完全に相補性であるときにターゲットp53に
より検出可能なようにハイブリダイズする。
ターゲットp53DNAは、本アッセイの感受性を向上させ
るために、適宜、増幅される。増幅は、当該技術分野で
公知の方法によって達成される。適切な方法は、Mullis
らによって、米国特許第4,683,195号および同第4,683,2
02号に記載のように、ポリメラーゼチェーン反応法（PC
R法）である。
オリゴヌクレオチドによって単一点変異をアッセイす
るための特に便利な方法は、イムクローンシステムズ社
（ImClone Systems,ニューヨーク市）がライセンスを有
しているSegevによるPCT出願WO 90/01069に記載されて
いる。この方法は、異変を受ける野生型p53中のヌクレ
オチドおよび変異体中の対応するヌクレオチドが相補性
でない場合に限定される。
簡単に述べれば、アッセイするそれぞれの野生型また
は変異p53鎖のための２個のオリゴヌクレオチドプロー
ブ類を調製する。各オリゴヌクレオチドプローブは、変
異を受けるかまたは変異を受けたヌクレオチドをまたぐ
配列に相補性である。したがって、前記２個のハイブリ
ダイズされたプローブ類の間にギャップ（gap）が生じ
る。
たとえば、p53の野生型と野生型形態の526位のグアニ
ンがアデニンに変異されている変異形とを識別するた
め、526位のギャップを残すプローブ類を調製する。こ
のギャップを、ポリメラーゼ、リガーゼ、および526位
のそれに相補性のヌクレオチドの混合物によって充填
し、連結されたオリゴヌクレオチド生成物を形成する。
たとえば、もし野生型p53を検出しようとするならば、
このギャップをシトシンによって充填する。この変異形
は、これらの条件下では検出されないであろう。
一方、もし変異形を検出しようすとるならば、このギ
ャップをチミンによって充填する。野生型p53は、これ
らの条件下では検出されないであろう。前記ギャップを
充填するオリゴヌクレオチド類またはヌクレオチドのい
ずれかが、当該技術分野で公知の方法で標識できる。
連結されたオリゴヌクレオチド生成物は、それをp53
から変性させ、それを追加のオリゴヌクレオチド相補体
にハイブリダイズさせ、そして、第１段階でギャップを
充填したヌクレオチドの相補体で今度はこのギャップを
再度充填することによって増幅できる。
この方法を下記に模式的に示す。ここで構造（１）
は、526位にグアニンを含有する野生型p53にハイブリダ
イズするオリゴヌクレオチドプローブ類の対を示してい
る。構造（２）は、シトシンで充填した前記２個のプロ
ーブ間のギャップを示している。構造（３）は、２個の
付加相補性オリゴヌクレオチド類にハイブリダイズする
構造（２）由来連結オリゴヌクレオチド生成物を示して
いる。構造（４）は、グアニンで充填された構造（３）
のギャップを示している。このプロセスは、所望するだ
け何回でも繰り返すことができる。
連結されたオリゴヌクレオチド生成物の連結および適
宜増幅につづいて、このオリゴヌクレオチド生成物を大
きさによって分離後、標識を当該技術分野で公知の方法
によって検出する。上記操作のPCT出願WO 90/01069か
らの記載は、本文で参考として引用している。
制限エイドヌクレアーゼプローブ類 変異は、また、もしそれらが制限部位を作製するかま
たは消失させるならば検出できる。たとえば、Hha I部
位は、GCGCである。ヌクレオチド430におけるヒトp53遺
伝子中のチミンからシトシンへの変異は、Hha I部位を
作製する。このような変異は、残基143においてバリン
からアラニンへアミノ酸配列を変化させる（表１参
照）。
ヒトp53遺伝子のヌクレオチド526におけるグアニンか
らアデニンへの変異はHha I部位を消失させる。このよ
うな変異は、残基175においてアルギニンからヒスチジ
ンへの変化を誘発する（表１参照）。
したがって、表１に示した残基430および526における
ヒトp53遺伝子の変異は、制限分析によって検出できる
〔Bakerら、サイエンス（Science）244,217−221（198
9）参照〕。点変異アッセイのための制限分析の使用の
その他のいくつかの例は、Weinbergら、米国特許第4,78
6,718号に記載されている。
ヌクレオチド１個分だけ異なっているポリヌクレオチ
ド配列類を識別するためのいくつかのその他の方法は、
De Leyら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Ba
cteriol.）101,738−754（1970）;Woodら、プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナルアカデミーオブサイエンシ
ズ米国（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）82,1585−1588（198
5）;Myersら、ネーチャー（Nature）313,495−497（198
5）；およびMyersら、サイエンス（Science）230,1242
−1246（1985）に記載されている。これらの方法は、本
文で参考として引用してある。
アッセイ 上記に記載の標識プローブ類は、p53の野生型および
何組かの変異形態を識別可能である。前記プローブ類の
異なる形態に対する応答を比較することによって、確認
することができる。野生型p53遺伝子およびタンパク質
は公知であり、Matlashewskiら、EMBO J.13,3257−3262
（1984）;Zakut−Houriら、EMBO J.４,1251−1255（198
5）；およびLambおよびCrawford、モレキュラー・エン
ド・セルラーバイオロジー（Mol.Cell.Biol.）５,1379
−1385（1986）に記載されているような公知の方法によ
って得ることができる。変異体は、部位特異的変異によ
って野生型p53から調製できる。たとえば、Zollerおよ
びSmith,ヌクレイックアシズリサーチ（Nucl.Acids Re
s.）10,6487−6500（1982）；メソッズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology）100,468−500（1
983）；およびDNA ３,479−488（1984）によって野生型
P53から調製できる。
野生型および変異P53構造遺伝子類は、同様に、重複
する二重鎖オリゴヌクレオチド類を調製すること、前記
ギャップを充填すること、およびこの末端類を連結する
こと等のような公知の方法によって合成できる。このDN
Aは、適切な宿主細胞中にクローニングされ、発現でき
る。このp53DNAおよびタンパク質は、前記宿主細胞から
回収できる〔全般的に、Sambrookら、“モレキュラクロ
ーニング（Molecular Cloning）”、第２版、コールド
スプリングハーバーラボラトリプレス（Cold Spring Ha
rbor Press）（1987）を参照〕。
抗体およびDNAプローブ類を利用するアッセイは、当
該技術分野で公知の方法に従って行われる。本アッセイ
は、前記プローブ類が野生型p53に対して陽性でありか
つ変異p53に対して陰性であることを試験するように設
計することができる。このような場合オリゴヌクレオチ
ドプローブを使用することが好適であり、特異的変異に
よって影響を受けないであろう。
一方、前記プローブ類は、変異p53に対する陽性およ
び野生型p53に対する陰性を試験できる。このような場
合、タンパク質を検出する抗体類を使用するのが好適で
ある。抗体プローブ類を優先することは、形質転換細胞
中に野生型p53タンパク質よりも変異p53タンパク質がよ
り高濃度に存在するためである。
少なくとも１組のヒトp53変異体が検出可能なほどは
熱ショックタンパク質hsc70に結合しないこと、また
は、少なくとも野生型p53よりも有意に低い緊密さで結
合することを見いだしたことは予測外であった。この組
は、アミノ酸273位および281位における変異からなる。
したがって、この組は、アミノ酸143位および175位にお
ける変異体からなる組のような他の変異体の組とは、い
かなる変異が存在するかを決定することによって、そし
て、もしそうであれば、この変異体がhsc70に結合する
かどうかを決定することによって、識別できる。相対的
結合親和性を決定する方法は、当該技術分野で公知の方
法で行うことができる。たとえば、p53タンパク質がhsc
70に結合するかどうかを決定するための方法は、Finlay
らによって、モレキュラー・エンド・セルラーバイオロ
ジー（Mol.and Cell.Biol.）８,531−539（1988）に；
またはHindsらによってモレキュラー・エンド・セルバ
イオロジー（Mol.and Cell Biol.）７,2863−2869（198
7）に記載されている。これらの論文に記載された方法
は本文で参考として引用しており、抗p53および抗hsc70
抗体類との免疫沈降実験を行っている。
hsc70に特異的な適切な抗体は、Hindsらの論文（同
上）に記載のようにして、たとえば、70kd熱ショックタ
ンパク質属のhsp70のカルボキシ末端の21個のアミノ酸
によって免疫されたウサギ血清から調製できる。Hinds
らの論文に記載のようにして抗体を調製する方法は、本
文で参考として引用している。
p90 野生型または変異p53遺伝子がラット胎児線維芽細胞
（REF）細胞中に移入されたとき、このREF細胞は、p53
タンパク質を発現する（上記参照）。p53は、公知の方
法によって単離かつ精製できる。たとえば、細胞を溶解
して、このp53タンパク質の溶液または懸濁液にp53に特
異的な抗体類を添加することによって、p53タンパク質
を免疫沈降させる。免疫沈降物は、遠心分離によって回
収される〔Hindsら、セルグロース・エンド・ディファ
レンシエーション（Cell Growth and Differentiatio
n）１,571−580（199）;Finlayら、セル（Cell）57,108
3−1093（1989）およびHindsら、モレキュラー・エンド
・セルラーバイオロジー（Molecular and Cellular Bio
logy）７,2863−2869（1987）参照〕。
同時免疫沈降は、同様に、PAb421イムノアフィニティ
カラムでp53を精製するために適した条件を用いて抗体
アフィニティカラムによって行うことができる。〔Clar
keら、モレキュラー・エンド・セルバイオロジー（Mole
cular and Cell Biology）８,1206−1215（1988）参
照〕。
上記操作に供したときに、驚くべきことにこのp53タ
ンパク質はp90といわれる分子量90kdのタンパク質と同
時に免疫沈降することが発見された。同時免疫沈降のた
めに適切な抗体類は、PAb421およびAb2が挙げられる。P
Ab421は、ヒト、マウスおよびラットp53を含むさまざま
な種由来p53のカルボキシ末端を認識し、Harolwら、ジ
ャーナル・オブ・ビロロジー（J.Viol.）39,861−869
（1981）に記載されている。Ab2は、ヒトp53のアミノ末
端に特異的であり、ニューヨーク州、マンハセット（Ma
nhassett）、オンコジーンサイエンス（Oncogene Scien
ce）社から入手可能である。このp90タンパク質は、p53
を発現しないREF細胞を同一抗体で同一処理したときに
は免疫沈降しない。
遠心分離またはカラムからの溶出後、p90は、SDS PA
GEによってp53/p90系から分離できる。90kdにおける単
一バンドを切りとり配列決定する。形質転換ラット胎児
線維芽細胞から入手したp90の部分配列は、 VAQMLLSQESDDYSQPST である。
p90を精製するためのもうひとつの方法は、Aebersold
らプロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミーオ
ブサイエンシズ米国（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）84,697
0−6974（1987）に一般に記載されているものである。
ラット以外の哺乳類は、ラットp90に相同のタンパク
質類を有する。タンパク質は、それが上述の条件下にお
いてp53と同時免疫沈降するならば、p90に相同であり、
かつ、p90と実質的に同一の配列であり、すなわち、少
なくとも約30％同一で、好適には少なくとも約50％同一
で、そしてより好適には少なくとも約75％ラットp90遺
伝子と同一である。
このp90タンパク質またはそのホモログは、また、Sam
brook,FritschおよびManiatis（編著）、モレキュラー
クローニング（Molecular Cloning）、ア・ラボラトリ
マニュアル（A Laboratory Manual）、第２版、コール
ドスプリングハーバーラボラトリプレス（1989）に記載
されているような周知の組換えDNA法によって調製でき
る。簡単に述べれば、この方法は、前記タンパク質をコ
ードするDNAを提供すること；適切な宿主中でこのDNAを
増幅するかまたはクローニングすること；このDNAを適
切な宿主中で発現させること；および前記タンパク質を
採取することを含む。
DNAの提供 p90をコードするDNAは、上記で提供された部分アミノ
酸配列またはその断片を使用して単離され、１個以上の
オリゴヌクレオチドプローブ類を調製する。前記プロー
ブを標識し、これを用いてゲノムまたはcDNA哺乳類ライ
ブラリーをファージλのような適切なベクター中でスク
リーニングする。スクリーニングしようとする種由来p5
3のDNAとラットp53のそれとの相同性をハイブリダイゼ
ーション条件決定の際に考慮する。
単離したDNAを配列決定し、この配列を用いてさらに
オリゴヌクレオチドプローブ類を調製する。この操作を
繰り返して、完全読みとり枠が作製されるまで重複断片
類を得る。
オリゴヌクレオチドプローブ類によるゲノムDNAのスク
リーニング １個のオリゴヌクレオチドプローブが試料中の特異的
核酸分子を認識するかどうかを決定するための方法は、
当該技術分野で公知である。好適には、ターゲット核酸
分子を固定する。前記ターゲット核酸分子にハイブリダ
イズしたプローブの存在は、試料中における核酸分子の
存在を示唆する。いくつかの適切なスクリーニング方法
の例は、Dallasら、“熱不安定エンテロトキシン産生を
コードする大腸菌（E.coli）プラスミド決定因子の特性
解析（The Characterization of an Escherichia Coli
Plasmid Determinant that Encodes for the Productio
n of a Heat−labile Enterotoxin）”、K.N.Timmisお
よびA.Puehler編著、医療、環境および商業上重要なプ
ラスミド類（Plasmids of Medical、Environmental and
Commercial Importance）、エルスビア／ノース・オラ
ンダ出版社（Elsevier/North−Holland Publishing C
o.），アムステルダム（Amsterdam）,113−122頁（197
4）;GrunsteinおよびHogness、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナルアカデミーオブサイエンシズ米国（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）72,3961−3965（1975）;Palva
ら、米国特許第4,731,325号、Orion−yhtyma,エスプー
（Espoo），フィンランド（Finland）に譲渡;Mullis
ら、米国特許第4,683,195号、シータス（Cetus）社、エ
メリビル（Emeryville），カルフォルニア（Californi
a）に譲渡;Schneiderら、米国特許第4,882,269号、プリ
ンストン大学（Princeton University）に譲渡；および
Segev、PCT出願WO 90/01069に記載されている。Schnei
derらの特許およびSegev出願は、両方ともにイムクロー
ンシステムズ（ImClone Systems）社、ニューヨーク州
にライセンス許可されている。
DNA増幅 得られたDNAは、当該技術分野で公知の方法によって
増幅できる。ひとつの適切な方法は、Saikiら、サイエ
ンス（Science）239,487（1988）に、Mullisら、米国特
許第4,683,195号に、Sambrook,FritschおよびManiatis
（編著）、モレキュラークローニング、ア・ラボラトリ
マニュアル（Molecular Cloning、A Laboratory Manua
l）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリ
プレス（1989）に記載されているポリメラーゼチェーン
反応（PCR）法である。λ−gt10またはλ−gt11特異的
オリゴマー類をアンプリファイアーとして使用し、λ−
gt10またはλ−gt11ベクター中でこのクローン類を増幅
することが便利である。
DNA配列決定 制限断片類を、プラスミドまたはバクテリオファージ
のような適切なベクター中にクローニングし、当該技術
分野で公知の方法で配列決定する。適切な配列決定方法
は、Sangerら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
アカデミーオブサイエンシズ米国（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA）74,5463−5467（1977）に記載のジデオキシチェ
ーン法である。配列決定のための適切なベクター類およ
びポリメラーゼ類は、公知である。適切なベクターは、
ストラッタジーン（Stratagene）のブルースクリプト
（Bluescript）ベクターである。適切なポリメラーゼ
は、シークイナーゼ（Sequenase）（米国バイオケミカ
ル（United States Biochemical）社、クリーブランド
（Cleveland）、オハイオ州（Ohio））である。
DNA発現 本発明のタンパク質をコードするDNAは複製でき、か
つ、広範囲のクローニングおよび発現ベクター中の広範
囲の宿主細胞中に挿入後組換えタンパク質を発現させる
ために使用できる。宿主は、原核生物または真核生物で
ある。DNAは天然から入手でき、適宜改変できる。遺伝
子類は、また、全体としてまたは部分として合成でき
る。
ベクターをスプライスするベクターは、染色体、非染
色体および合成DNA配列類のセグメントからなることが
できる。いくつかの適切な原核クローニングベクター類
には、colE1、pCRI、pBR322、pMB9、pUC、pKSM、および
RP4のような大腸菌（E.coli）由来プラスミド類が挙げ
られる。真核生物ベクター類は、同様に、fd,M13および
他の線状１重鎖DNAファージ類のようなファージDNAの誘
導体が挙げられる。
細菌、特に大腸菌（E.coli）中でタンパク質類を発現
するベクター類もまた、公知である。このようなベクタ
ー類として、pKK233プラスミド属（またはプラスミド類
のtac属の全て）、T7、およびλPLが挙げられる。融合
タンパク質類を発現するベクター類の例として、Dieckm
annおよびTzagoloffによって、ジャーナル・オブ・バイ
オロジカルケミストリ（J.Biol.Chem.）260,1513−1520
（1985）に記載のPATHベクター類が挙げられる。PATHベ
クター類はアンスラニル酸合成酵素（TrpE）をコードす
るDNA配列類を含有し、その後にカルボキシ末端にポリ
リンカーが続いている。他の発現ベクター系は、β−ガ
ラクトシダーゼ（pEX）；マルトース結合タンパク質（p
MAL）；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（pGST）
に基づいている〔ジーン（Gene）67,31（1988）および
ペプチドリチーサ（Peptide Research）３,167（1990）
参照〕。
酵母で有用なベクター類も入手可能である。適切な例
は、2uプラスミドである。
哺乳類細胞中で使用するための適切なベクター類も、
同様に公知である。このようなベクター類として、SV4
0、アデノウイルス、レトロウイルス誘導DNA配列類およ
びプラスミド類およびファージDNAの組み合わせ由来ベ
クター類の周知の誘導体が挙げられる。
さらに、真核生物発現ベクター類も当該技術分野で公
知である〔例P.J.SouthernおよびP.Berg,J.Mol.Appl.Ge
net.１,327−341（1982）;S.Sabramaniら、モレキュラ
ー・エンド・セルラーバイオロジー（Mol.Cell.Biol.）
１,854−864（1981）;R.J.KaufmanおよびP.A.Sharp,
“モジュラージヒドロ葉酸レダクターゼ相補性DNA遺伝
子と同時移入された配列類の増幅と発見（Amplificatio
n and Expression of Sequences Cotransfected with a
Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA
Gene）”、ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオロ
ジー（J.Mol.Biol.）159,601−664（1982）;S.I.Scahil
lら、“チャイニーズハムスター卵巣細胞中におけるヒ
ト免疫インタフェロンの産物の発現と特性解析（Expres
sion and Characterization of the Product of a Huma
n Immune Interferon DNA Gene in Chinese Hamster Ov
ary Cells）”、プロシーディングズ・オブ・ナショナ
ルアカデミーオブサイエンシズ米国（Proc.Natl.Acad.S
ci.USA）80,4654−4659（1983）;G.UrlaubおよびL.A.Ch
asin,プロシーディングズ・オブ・ナショナルアカデミ
ーオブサイエンシズ米国（Proc.Natl.Acad,Sci.USA）7
7,4216−4220（1980）〕。
有用な発現宿主として、周知の原核生物および真核生
物細胞類が挙げられる。いくつかの適切な原核生物宿主
として、たとえば、大腸菌（E.coli）SG−936、大腸菌
（E.coli）HB101、大腸菌（E.coli）W3110、大腸菌（E.
coli）×1776、大腸菌（E.coli）X2282、大腸菌（E.col
i）DHI、および大腸菌（E.coli）MRC1のような大腸菌
（E.coli）、シュードモナス（Pseudomonas）、バチル
スサブチリス（Bacillus subtilis）のようなバチラス
（Bacillus）、およびストレプトミセス（Streptomyce
s）が挙げられる。適切な真核生物細胞として、酵母類
および他の真菌類、昆虫、COS細胞類およびCHO細胞類の
ような動物細胞類、ヒト細胞類および組織培養植物細胞
類が挙げられる。
本発明で有用な発現ベクター類には、発現されるDNA
配列または断片に操作上連結される少なくとも１個の発
現制御配列を含有する。この制御配列は、クローニング
されたDNA配列の発現のコントロールおよび制御のため
にベクター中に挿入される。有用な発現制御配列類の例
として、lac系、trp系、tac系、trc系、ファージλの腫
瘍オペレータおよびプロモータ領域類、td皮膜タンパク
質の制御領域、たとえば３−ホスホグリセレートキナー
ゼのためのプロモータのような酵母の解糖プロモータ
類、たとえばPho5のような酵母酸ホスファターゼのため
のプロモータ類、酵母α交配因子類のプロモータ類、お
よび、例えばSV40の初期および後期プロモータ類のよう
なポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、およ
びシミアンウイルス由来プロモータ類、および原核また
は真核細胞類およびそれらのウイルス類またはその組み
合わせの遺伝子類発現を制御することが公知の他の配列
類が挙げられる。
融合タンパク質類 前記タンパク質類は、当該技術分野で公知の方法によ
って精製できる。たとえば、タンパク質全体またはその
部分が融合タンパク質の形態で適当な融合相手とともに
発現できる。この融合相手は、好適には、精製および同
定を促進する。いくつかの有用な融合相手として、β−
ガラクトシダーゼ（Grayら、プロシーディングズ・オブ
・ナショナルアカデミーオブサイエンシズ米国（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA）79,6598（1982））;trpE（Itakura
ら、サイエンス（Science）198,1056（1977））；プロ
テインＡ（Uhlenら、ジーン（Gene）23,369（198
3））；グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Johnso
n;ネーチャー（Nature）338,585（1989））;Van Etten
ら、セル（Cell）58,669（1989））；およびマルトース
結合タンパク質（Guanら、ジーン（Gene）67,21−30（1
987））;Mainaらジーン（Gene）74,36−373（1988））;
Riggs、P.,Ausebel,F.M.編著、カラントプロトコールズ
・イン・モレキュラーバイオロジー（Current Protocol
s in Molecular Biology）、グリーン社／ウイレイイン
タサイエンス（Greene Associates/Wiley Interscienc
e）、ニューヨーク（New york）（1990）が挙げられ
る。
このような融合タンパク質は、融合相手に結合する試
薬類を用いてアフィニティクロマトグラフィによって精
製できる。前記試薬は、この融合相手の特異的リガンド
または抗体、好適にはモノクローナル抗体である。たと
えば、β−ガラクトシダーゼを含有する融合タンパク質
は、抗β−ガラクトシダーゼ抗体カラムを用いてアフィ
ニティクロマトグラフィによって精製できる（Ullman,
ジーン（Gene）29,27−31（1984））。同様に、マルト
ース結合タンパク質を含有するタンパク質類は架橋アミ
ロース含有カラムを用いるアフィニティクロマトグラフ
ィによって精製できる〔Guan,欧州特許出願286,239参
照〕。
融合タンパク質をコードするDNAは、適宜、工学処理
され、その結果、この融合タンパク質は、前記タンパク
質と融合相手との間に切断可能な部位を含有する。化学
的および酵素的切断可能部位が両方ともに当該技術分野
で公知である。酵素的に切断可能な部位の適切な例とし
て、コラゲナーゼ（Keilら、FEBSレターズ（Letters）5
6,292−296（1975）；エンテロキナーゼ（Hoppら、バイ
オテクロノジー（Biotechnology）６,1204−1210（198
8））；因子Xa（Nagaiら、メソッズエンザイモロジー
（Methods Enzymol.）153,461−481（1987））；および
トロンビン（Eatonら、バイオケミストリ（Biochemistr
y）25,505（1986））によって特異的に認識されかつ切
断される部位が挙げられる。コラゲナーゼは、プロリン
およびＸが中性アミノ酸であるPro−Ｘ−Gly−Pro配列
中のＸの間を切断する。エンテロキナーゼは、配列Asp
−Asp−Asp−Lys中のリジンの後で切断する。因子Xa
は、配列Ile−Glu−Gly−Arg中のアルギニンの後で切断
する。トロンビンは、Arg−Gly−Ser−Pro配列中でアル
ギニンおよびグリシンの間で切断する。
特異的な化学切断剤も公知である。たとえば、臭化シ
アンは、タンパク質中のメチオニン残基を切断する。
タンパク質類の精製 前記組換えタンパク質類は、当該技術分野で公知の方
法によって精製できる。このような方法として、特異的
抗体類を用いるアフィニティクロマトグラフィが挙げら
る。これとは別に、組換えタンパク質は、イオン交換、
サイズ排除、および疎水的相互作用クロマトグラフィを
用いて当該技術分野で公知の方法を用いて精製できる。
これらおよび他の適切な方法は、Marstoh、“大腸菌
（E.coli）中で発現された真核生物タンパク質類の精製
（The Purification of Eukaryotic Proteins Expresse
d in E.coli）”、DNAクローニング（DNA Cloning）、
D.M.Glover編著、第３巻、IRLプレス、英国、1987に記
載されている。
p90は、p53を同時免疫沈降可能な抗体類を調製するた
めに使用できる。p53は沈澱物から単離され精製でき
る。抗p90抗体類は、ポリクローナルでもモノクローナ
ルでもよい。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体類は、当該
技術分野で公知の方法によって調製できる〔上記および
Campbell、“モノクローナル抗体技術、げっ歯類および
ヒトハイブリドーマ類のと産生と特性解析（Monoclonal
Antibody Technology、The Production and Character
ization of Rodent and Human Hybridomas）”、Burdon
編著、ラボラトリテクニークス・イン・バイオケミスト
リ・エンド・モレキュラーバイオロジー（Laboratory T
echniques in Biochemistry and Molecular Biolog
y）、第13巻、エルスビアサイエンス出版社（Elsevier
Science Publishers）、アムステルダム（1985）を参
照〕。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フィンレイ，キャシー，エー. アメリカ合衆国 19067 ペンシルバニ ア州，ヤードレイ，ベイベリー レーン 660 (56)参考文献 特開 昭61−85327（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500002（ＪＰ，Ａ) 米国特許4871838（ＵＳ，Ａ) ＮＡＴＵＲＥ ＶＯＬ．342 ７ （1989）Ｐ．705−708 ＳＣＩＥＮＣＥ ＶＯＬ．244（1989) Ｐ．217−221 ＥＭＢＯ Ｊ． ＶＯＬ．９ ＮＯ. ５（1990）Ｐ．1595−1602 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/574 C12Q 1/68 G01N 33/53 G01N 33/577

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】前癌および癌細胞において頻繁に出現する
    かまたは選択されるヒトp53遺伝子またはp53タンパク質
    の変異の少なくとも２つの組を検出しかつ識別するため
    のプローブ類パネルであって、各組が野生型p53の表現
    型および少なくとも他の１組のp53変異体の表現型と異
    なる表現型を有し、第１組の変異が前記p53タンパク質
    の143位もしくは175位における変異からなり、かつ第２
    組の変異が前記p53タンパク質の273位もしくは281位に
    おける変異からなるか、またはそれに対応するp53遺伝
    子の位置における変異からなることを特徴とするプロー
    ブ類パネル。
  2. 【請求項２】前記変異がこのような変異体を含む細胞に
    対して増殖促進性を付与する請求の範囲第１項に記載の
    プローブ類パネル。
  3. 【請求項３】前記p53遺伝子類の起源が結腸直腸癌であ
    る請求の範囲第１項に記載のプローブ類パネル。
  4. 【請求項４】第１組の変異が前記p53遺伝子の430位また
    は526位における変異からなり、かつ第２組の変異が前
    記p53遺伝子の820位または844位における変異からなる
    請求の範囲第１項に記載のプローブ類パネル。
  5. 【請求項５】前記プローブ類が抗体類である請求の範囲
    第１項に記載のプローブ類パネル。
  6. 【請求項６】前記プローブ類がDNAプローブ類である請
    求の範囲第１項に記載のプローブ類パネル。
  7. 【請求項７】前記プローブ類が野生型p53に対して陽性
    であり変異p53に対して陰性であることを試験するもの
    である請求の範囲第１項に記載のプローブ類パネル。
  8. 【請求項８】前記プローブがDNAプローブである請求の
    範囲第７項に記載のプローブ類パネル。
  9. 【請求項９】前記プローブ類が変異p53に対して陽性で
    あり、野生型p53に対して陰性であることを試験するも
    のである請求の範囲第１項に記載のプローブ類パネル。
  10. 【請求項１０】前記プローブ類が抗体類である請求の範
    囲第９項に記載のプローブ類パネル。
  11. 【請求項１１】前記抗体類がモノクローナル抗体である
    請求の範囲第10項に記載のプローブ類パネル。
  12. 【請求項１２】前癌および癌細胞において頻繁に出現す
    るかまたは選択されるヒトp53遺伝子またはp53タンパク
    質の変異の少なくとも２つの組を検出しかつ識別する方
    法であって、このような変異が存在するかどうか、およ
    びもしそうであれば、この変異タンパク質が野生型ヒト
    p53タンパク質よりもhsc70に対する結合がより弱いもの
    であるかどうかを決定する段階からなることを特徴とす
    る方法。
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