DE4444969C1

DE4444969C1 - Nachweis von Antikörpern gegen p53 in Körperflüssigkeiten

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Publication number: DE4444969C1
Application number: DE19944444969
Authority: DE
Original assignee: ORGA MED DR MED ERWIN KLOPFER
Current assignee: BIODIAGNOSTICS GMBH, 24149 KIEL, DE
Priority date: 1994-12-16
Filing date: 1994-12-16
Publication date: 1996-10-24
Anticipated expiration: 2014-12-17
Also published as: WO1996018906A1; AU4261496A

Description

Die Erfindung betrifft Systeme zum Nachweis von Antikörpern ge gen Wildtyp- und Mutanten-p53-Proteine in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Humanserum. Weiterhin betrifft sie Verfahren zum Nachweis von Wildtyp- und Mutanten-p53-Protein.

p53 ist das in menschlichen Tumoren am häufigsten mutierte zel luläre Gen. Das von diesem Gen kodierte p53-Protein spielt als Wachstumssuppressorprotein eine regulatorische Rolle bei Proli ferationsvorgängen der Zelle. p53 ist an der Kontrolle des Zellzyklus, der DNA-Reparatur und -Synthese, der zellulären Differenzierung und dem programmierten Zelltod beteiligt. Gene tische Veränderungen dieses wachstumsregulierenden Gens können einen schwerwiegenden Einfluß auf die Ausprägung eines malignen Phänotyps der Zelle nehmen. Offenbar verursachen diese Mutatio nen im p53-Gen den Verlust der Wachstumskontrollfunktion, und die Zelle gerät infolge dieses Funktionsverlustes in eine un kontrollierte Proliferation.

Eine Expression eines nicht mutierten Wildtyp-p53 führt dagegen zu einer deutlichen Inhibition des Zellwachstums. p53 repri miert die Transkription zahlreicher Promotoren, wobei diese Suppression sequenzunabhängig und möglicherweise über die In teraktion des p53 mit zellulären Transkriptionsfaktoren er folgt. p53 besitzt eine spezifische DNA-Bindungsaktivität und ist-in der Lage, die Expression verschiedener Gene zu stimulie ren. Zu den Genen, die durch p53 transaktiviert werden, zählen das GADD45-, MDM2- und das WAF1-Gen.

p53 bindet an eine Vielzahl von viralen und zellulären Protei nen. Die Interaktion mit den E6-Proteinen der humanen Papillom viren HPV16 und HPV18 steht in einem engen Zusammenhang mit dem Auftreten von Cervix-Karzinomen. Die Komplexbildung von p53 mit dem Hepatitis B-Antigen spielt eine Rolle bei der Ausbildung von hepatozellulären Karzinomen. Die Assoziation von p53 mit viralen Proteinen führt zu einer Inaktivierung der Wachstums suppressoreigenschaft des p53. Auch die Assoziation von p53 mit dem zellulären mdm2-Protein hat eine Inaktivierung der Wachs tumssuppressoreigenschaften des p53 zur Folge. Im Falle anderer zellulärer Proteine wie z. B. der Proteinkinase CK2 oder der p34cdc-2-Kinase hat die Komplexbildung mit p53 möglicherweise Einfluß auf wachstumsregulierende Aktivitäten des p53-Proteins. p53 übt seine wachstumsregulierenden Funktionen demnach über verschiedene ineinandergreifende Mechanismen aus, an denen ne ben p53 weitere zelluläre Faktoren beteiligt sind.

Zellen, die DNA-schädigenden Einflüssen ausgesetzt werden, rea gieren mit einer p53-Akkumulation im Zellkern. Gleichzeitig ist ein Stop des Zellzyklus in der G1-Phase des Zellzyklus zu beob achten. Zellen ohne endogenes p53 zeigen einen solchen G1-Ar rest nicht. Eine künstliche Überexpression von Wildtyp p53 in duziert entweder einen Wachstumsstop der Zellen in der G1-Phase oder den programmierten Zelltod. Die nach Exposition gegenüber DNA-schädigenden Agentien zu beobachtende p53-Zunahme und Akku mulation im Zellkern sowie der gleichzeitige Zellzyklusarrest in der G1-Phase spricht für eine Rolle des p53 bei DNA-Repara turmechanismen.

Auf der anderen Seite scheint p53 auch direkt und unmittelbar in die Vermittlung des programmierten Zelltods der Apoptose involviert zu sein. Zellen mit nur einer Kopie des p53-Gens sind gegenüber einer durch Strahlung induzierten Apoptose sehr viel resistenter als Zellen mit zwei intakten p53-Genkopien. Ein solcher Gen-Dosis-Effekt hat schwerwiegende Konsequenzen für Patienten mit Keimbahnmutationen im p53-Gen, wie z. B. Li- Fraumeni-Syndrom-Patienten. Zellen, in denen ein p53-Allel mu tiert oder deletiert ist, haben in Gegenwart gentoxischer Agen tien einen Überlebensvorteil gegenüber Zellen mit intakten p53- Gen Kopien. Sowohl der Wachstumsarrest und damit die Möglich keit zur DNA-Reparatur vor Ausführung der Replikation als auch die Auslösung der Apoptose verhindern die Vermehrung einer Tu morzelle und damit die Manifestation eines malignen Tumors.

Das p53-Protein wird in vielen Tumorzellen in größeren Mengen exprimiert. In vielen, aber nicht in allen Fällen korreliert das Vorliegen von erhöhten p53-Mengen mit der Gegenwart von Mutationen im p53-Gen. In normalen Zellen liegt das p53-Protein dagegen in kaum nachweisbaren Mengen vor. Der Nachweis des p53- Proteins kann mit einer Reihe verschiedener monoklonaler Anti körper immunhistochemisch im Tumorgewebe erfolgen.

DeLeo et al. (Detection of a transformation-related antigen in chemically induced sarcomas and other tranformed cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 2420-2424, 1979) konnten schon 1979 zeigen, daß die humorale Immunantwort in Mäusen ge gen Methylcholanthren induzierte Tumore gegen p53 gerichtet ist. Crawford et al. (Detection of antibodies against the cel lular protein p53 in sera from patients with breast cancer. Int. J. Cancer 30: 403-408, 1982) beschrieben 1982 Antikörper gegen p53 im Serum von Brustkrebspatientinnen. Caron de Fromen tel et al. (Presence of circulating antibodies against cellular protein p53 in a notable proportion of children with B-cell lymphoma. Int. J. Cancer 39: 185-189, 1987) fanden später, daß p53-Antikörper auch in humanen Seren von Kindern mit einer gro ßen Vielfalt von verschiedenen Tumoren zu finden sind. Die Häu figkeit einer Immunantwort gegen p53 lag bei diesen Kindern bei etwa 12%, wobei im Falle des Burkitt-Lymphoms etwa 20% der Tu morpatienten Antikörper gegen p53 aufwiesen.

Davidof f et al. (Immune response to p53 is dependent upon p53/HSP70 complexes in breast cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3439-3442, 1992) zeigten 1992, daß das Auftreten von p53-Autoantikörpern in Patienten mit Brustkrebs mit einer spe zifischen Subklasse von p53 korreliert, die sehr effizient das 70 kDa Hitzeschock-Protein bindet. Patienten mit diesen Autoan tikörpern wiesen zudem p53-Mutationen im Tumormaterial auf.

Winter et al. (Development of antibodies against p53 in lung cancer patients appears to be dependent on the type of p53 mu tation. Cancer Res. 52: 4168-4174, 1992) konnten 1992 zeigen, daß die Entwicklung von Autoantikörpern gegen p53 in Lungen krebspatienten vom Typ der p53-Mutationen im Tumor abhing. An tikörper gegen p53 wurden sowohl mit Hilfe der Immunpräzipita tion wie auch im Immunblot nachgewiesen. Bei primären Brust krebspatienten wiesen etwa 15% aller Patienten Antikörper gegen p53 auf. Dabei wurde auch eine Korrelation zwischen dem Auftre ten solcher Antikörper und einer schlechten Prognose gefunden, die im wesentlichen mit dem histologischen Grad und der Abwe senheit des Hormonrezeptors korreliert werden konnte.

Andere Untersuchungen konnten zeigen, daß die Antikörper gegen p53 aus humanen Patientenseren sowohl Wildtyp- als auch Mutan ten-p53 erkennen konnten. Im wesentlichen ist die B-Zellantwort gegen das p53-Protein mit zwei immundominanten Regionen im car boxyterminalen und im aminoterminalen Bereich der Polypeptid ketten von p53 gerichtet. In den meisten Fällen korreliert die Gegenwart von p53-Autoantikörpern mit einer p53-Akkumulation oder mit p53-Mutationen. Zur Durchführung solcher serologischer Analysen gibt es eine Reihe von verschiedenen experimentellen Möglichkeiten.

Aus der WO94/10575 ist ein Verfahren zum Nachweis von Krebs be kannt, wobei Humanserumproben mit Testzusammensetzungen in Kontakt gebracht werden, die je ein einzelnes Mutanten-p53-Pro tein oder mehrere verschiedene Mutanten-p53-Proteine umfassen.

Hierdurch werden spezifische p53-Antikörper im Serum durch Wechselwirkung mit Mutanten-p53-Proteinen nachgewiesen. Das verwendete Mutanten-p53-Protein (m-p53) stammt aus Bakterien, beispielsweise E. coli, oder aus viralen Vektoren, beispielswei se Vaccinia-Vektoren. Demnach werden die verschiedenen m-p53- Proteine aus unterschiedlichen Tumoren isoliert und dann unter Verwendung an sich bekannter Klonierungsverfahren kloniert und exprimiert. Die exprimierten m-p53-Proteine werden isoliert und zum Nachweis von Antikörpern eingesetzt.

Posttranslationale Modifizierungen der Polypeptidkette von p53 sind für die Regulation von Funktionen des p53 aber offensicht lich von großer Bedeutung. Solche posttranslationale Verände rungen erfährt p53 in Abhängigkeit von der zellulären Umgebung. So kann Wildtyp-p53 in einer Tumorzelle eine andere Konforma tion einnehmen als in einer normalen, nicht-transformierten Umgebung. Mutanten-p53 verhält sich in einer normalen Zelle anders als in einer Tumorzelle. p53, das in Bakterien expri miert wird, erfährt eine andere posttranslationale Modifizie rung als ein p53-Protein, das in einer Säugerzelle exprimiert wird. Die unterschiedlichen posttranslationalen Modifizierungen von p53 haben einen entscheidenden Einfluß auf die Konformation des Proteins und damit zu einem ganz wesentlichen Teil auf die Erkennbarkeit durch p53-spezifische Antikörper.

Das in der W094/10575 offenbarte Verfahren berücksichtigt je doch derartige posttranslationale Modifizierungen der Polypep tidkette von p53 nicht. Klonierte und in Prokaryonten oder Fremd-Eukaryonten exprimierte Proteine unterscheiden sich häu fig von der nativen Konformation des Proteins, wie es in der normalen Zellumgebung vorliegt. Die Aussagekraft von Nachweis systemen, die derartige rekombinante p53-Proteine verwenden, ist darum eingeschränkt.

Die WO 94/08241 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von p53- spezifischen Antikörpern in Körperflüssigkeiten, wobei an ein Trägermaterial gebundenes p53 und/oder Bindungsregionen für p53-spezifische Antikörper aufweisende Fragmente hiervon mit Körperflüssigkeiten inkubiert und man die spezifischen, an das p53 und/oder die Fragmente gebundenen Antikörper (a) mit mar kierten, gegen die Antikörper (a) gerichteten Antikörper (b), oder mit unmarkierten Antikörpern (b) und letztere mit mar kierten, gegen die Antikörper (b) gerichteten Antikörpern (c) reagieren läßt. Die Markierung soll nicht-radioaktiv sein. Es wird darauf hingewiesen, daß die Verwendung von Zellextrakten vielfach zu unspezifischer Antikörperbindung führe.

Die WO 92/00311 offenbart verschiedene Klassen von Mutationen im menschlichen p53-Gen, die präkarzinogene und karzinogene Zellen mit unterschiedlichen Phänotypen hervorrufen. Diese unterschiedlichen Phänotypen können mit verschiedenen Ver laufsformen und verschiedener Prognostik von Karzinomen korre liert sein. Es werden Sonden offenbart, die diese Mutationen oder Gruppen von Mutationen und damit die unterschiedlichen Phänotypen erkennen können.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein System zum Nachweis von p53-spezifischen Antikörpern bereitzustellen, das die oben genannten Nachteile des Standes der Technik vermeidet.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die im Anspruch 1 nä her gekennzeichneten Merkmale gelöst.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von p53-spezifischen Antikörpern bereit zustellen, das die aus dem Stand der Technik bekannten Nachtei le vermeidet.

Diese Aufgabe wird durch das im Anspruch 6 näher gekennzeichne te Verfahren gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren und Nachweissystem haben den Vorteil, daß der Nachweis von Antikörpern in p53-enthaltenden Seren in einer Tumorzellumgebung ermöglicht wird. Erfindungs gemäß werden Zellextrakte verschiedener Tumorzellen verwendet, die je ein mutiertes p53 und/oder oder ein Wildtyp-p53 enthal ten. Als Kontrolle und zum Ausschluß einer unspezifischen Bin dung an Tumorzellproteine werden erfindungsgemäß Tumorzellen verwendet, die kein p53-Protein exprimieren.

Positive Seren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie mit p53- enthaltenden Tumorzellextrakten ein deutlich höheres Signal liefern als mit Extrakten, die kein p53 enthalten. Die Verwen dung von Zellextrakten mit Wildtyp und/oder mit Mutanten-p53 erlaubt eine Charakterisierung der Seren in Bezug auf die Fest legung, ob das Serum Wildtyp- oder Mutanten-p53 erkennt oder ob die Antikörper gegen beide p53-Formen gerichtet sind.

Erfindungsgemäß werden Antikörper gegen beide p53-Formen in tierischen Organismen, bevorzugt im Menschen, nachgewiesen.

Der Nachweis positiver Seren gegen p53 erfolgt beispielsweise über einen sekundären Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase verknüpft ist. Die Auswertung kann qualitativ visuell oder quantitativ mit einem Laser-Plattenlesegerät erfolgen.

Das erfindungsgemäße Testsystem ist bevorzugt ein ELISA-System, wobei eine Trägeroberfläche mit einem das p53-Protein (Wildtyp und/oder mutiert) enthaltenden Zellextrakt beschichtet ist.

Dazu werden Tumorzellen wie z. B. die Tumorzellinie HT29 (HT29: ATCC Zugangsnummer HTB 38), die ein p53 mit einer Mutation in der Aminosäure 273 exprimiert, mit Extraktionspuffer 100 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% NP40, pH9.0 aufgeschlossen. Alternativ werden MCF-7 (MCF-7:ATCC Zugangsnummer HTB 22) Zellen, die Wild-Typ p53 exprimieren, mit dem Extraktionspuffer aufge schlossen. Nach dem gleichen Verfahren können andere Tumorzel len herangezogen werden, die entweder Mutanten- oder Wildtyp p53 exprimieren. Als Kontrolle werden Zellextrakte von Tumor zellen (z. B. SAOS2:ATCC Zugangsnummer HTB 85)) verwandt, die kein p53 exprimieren. Der Zellextrakt wird durch eine Zentrifu gation von partikulären Bestandteilen befreit. Der so geklärte Zellextrakt wird für 3 h in Kavitäten mit der Plastikoberfläche von Platten inkubiert. Bevorzugt werden die Platten vor der Bindung der p53-Proteine mit gegen p53 gerichteten monoklonalen Antikörpern beschichtet, um die Spezifität der Bindung von p53 zu erhöhen. Im Anschluß daran werden nicht gebundene Bestand teile des Zellextraktes beseitigt und die Kavitäten mit Wasch puffer 3× gewaschen.

Die zu analysierenden Körperflüssigkeiten, z. B. Serum oder Urin, werden mit dem in den Kavitäten immobilisierten p53 aus Zellextrakten inkubiert. Zur Kontrolle werden die zu untersu chenden Körperflüssigkeiten ebenfalls mit Kavitäten inkubiert, die p53-freie Tumorzellextrakte enthalten. Eine weitere Kon trolle stellt ein humanes Serum gegen p53 dar, das ein positi ves Signal ergibt.

Der Nachweis von Antikörpern gegen p53 erfolgt mit einem gegen menschliche Immunglobuline gerichteten zweiten Antikörper, der beispielsweise mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert ist.

Die Bindung des zweiten Antikörpers gegen p53 Antikörper wird über eine Chromogenreaktion mit z. B. Tetramethylbenzidin sicht bar gemacht. Die Auswertung erfolgt automatisch mit einem Eli sa-Reader oder photometrisch bei einer für die Farbreaktion spezifischen Wellenlänge (z. B. 450 nm).

Zur Durchführung des Tests wird die das Wildtyp- und/oder Mutan ten-p53-Protein enthaltende Testanordnung mit der zu untersu chenden Probe in Kontakt gebracht, und die Bindung der Antikör per in der zu untersuchenden Probe an die p53-Proteine der Testanordnung wird bestimmt. Das p53-Protein in der Testanord nung kann in suspendierter Form in einem wäßrigen Medium oder an einen Festträger gebunden vorliegen. Beispiele für erfin dungsgemäß verwendbare Festträger sind Kugeln, Mikrokugeln, Gelteilchen, die Oberflächen von Mikrotiterplatten usw.

Die Bestimmung der Bindung der Antikörper in der zu untersu chenden Probe an das p53-Protein in der Testanordnung ist durch eine Vielzahl von Verfahren durchführbar. Beispiele hierfür sind die Immunpräzipitation, der Radio-Immunoassay (RIA), der Fluoreszenz-Immunoassay (FIA), der Enzym-gekoppelte Immunosor bensassay (ELISA) usw. Die genaue Zusammensetzung der Testan ordnung, d. h., ob das p53-Protein suspendiert oder an einen Festträger gebunden vorliegt, wird von der Art des gewählten Testverfahrens abhängen.

Die Testanordnung kann ein einzelnes p53-Protein oder mehrere verschiedene p53-Proteine umfassen, die aus unterschiedlichen Zellsystemen stammen. Als Zellsysteme können an sich bekannte Wildtyp- und/oder Mutanten-p53 exprimierende Zellen verwendet werden, die dem Fachmann entweder zugänglich sind oder die noch zu etablieren sind.

Die verschiedenen p53-Proteine können entweder in einer Kavität oder in mehreren Kavitäten getrennt voneinander enthalten sein. Damit wird der gleichzeitige Nachweis von mehreren verschiede nen Antikörpern ermöglicht, die sowohl gegen Wildtyp- als auch gegen Mutanten-p53-Protein gerichtet sind.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Figuren und einem Ausführungsbeispiel näher beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf dieses spezielle Beispiel beschränkt. Der Fachmann kann erkennen, daß Abänderungen im beanspruchten Umfang ohne erfinderisches Zutun möglich sind. Derartige Veränderungen kön nen beispielsweise umfassen: die verwendete Tumorzellinie, die Puffer, und alle übrigen Lösungssysteme, das Bindungsverfahren der Tumorzellen an die Festträgeroberfläche, den monoklonalen Antikörper, mit dem das p53-Protein an die Festträgeroberfläche gebunden ist, das Verfahren zum Nachweis der Bindung der Auto antikörper an das oder die p53-Proteine, die Mengen der verwen deten Reagenzien, die Zusammensetzung und die Art der verwende ten Reagenzien usw. Diese Varianten liegen im Bereich des Fach wissens und Fachkönnens eines auf diesem Gebiet erfahrenen Fachmanns. Alle diese Abwandlungen werden von der vorliegenden Erfindung mitumfaßt.

Die beiliegenden Figuren zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des "Endprodukts" einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah rens (ELISA);

Fig. 2 ein Beispiel einer Mikrotiterplatten-Aufteilung; L, Reagenzien-Leerwert; K, Positives Kontrollserum; x markierte Mikrotiterplattenstreifen; leere Felder sind für die Testung von Patientenproben reser viert;

Fig. 3 die graphische Auswertung für einen Patienten. Gemessene Extinktionen für 1, Reagenzien-Leerwert- Kontrolle in markierten Kavitäten; 2, Reagenzien- Leerwert-Kontrolle in unmarkierten Kavitäten; 3, Positives Kontrollserum, inkubiert in markierten Mikrotiterplatten-Kavitäten (p53-Antikörper in der Probe enthalten); 4, Positives Kontrollserum inku biert in unmarkierter Mikrotiterplatten-Kavität (Serum-Kontrolle); 5, Normalserum-Probe inkubiert in markierten Mikrotiterplatten-Kavitäten (keine p53-Antikörper in der Probe enthalten); 6, Normal serum-Probe, inkubiert in unmarkierter Mikrotiter platten-Kavität.

Testprinzip

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren von p53-Autoantikörpern wird bevorzugt als ELISA-Verfahren und insbesondere bevorzugt als Sandwich-ELISA-Verfahren aufgebaut. Erfindungsgemäß werden Zellextrakte von Tumorzellen benutzt, die entweder Mutanten- p53-Antigen oder Wildtyp-p53-Antigen enthalten. Damit kann un terschieden werden, ob die Patientenseren Antikörper gegen Mu tanten-p53 oder gegen Wildtyp-p53 enthalten. Als Kontrolle wer den Tumorzellen ohne p53 verwendet. Alternativ hierzu können die Testsysteme in einer Platte in mehreren Kavitäten oder auch in einer Kavität Mutanten- oder auch Wildtyp-p53-Antigene ent halten.

Beim p53-Autoantikörper-ELISA wird die Probe (Serum oder Plas ma) in einem ersten Schritt mit dem p53-Antigen, das mit Hilfe eines monoklonalen p53-Antikörpers an die Mikrotiterplatte fi xiert ist, inkubiert. Die Erzeugung von monoklonalen Antikör pern gegen p53 liegt im Bereich des Fachwissens eines Fachmanns (Goding, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, New York, Academic Press, 1983). Weiterhin sind solche monoklonalen Antikörper bereits von verschiedenen Firmen kommerziell erhält lich (beispielsweise Anti-p53-Protein pan (Klon PAb 122) von der Fa. Boehringer, Mannheim). Nach einem Waschschritt werden die vorhandenen p53-Autoantikörper durch eine zweite Inkubation mit anti-Human-IgG-Peroxidase-Konjugat markiert. Nach einem weiteren Waschschritt wird Substrat zugegeben. Bei Anwesenheit von p53-Autoantikörpern wird Peroxidase gebunden, die ihrer seits das Substrat enzymatisch umsetzt; die dabei entstehende Farbe kann photometrisch gemessen werden. Als Bestätigungstest werden die Proben gleichzeitig in Kavitäten inkubiert, in denen zwar die monoklonalen p53-Antikörper vorhanden sind, das p53- Protein jedoch fehlt.

Als Mikrotiterplatte können kommerziell erhältliche Mikrotiter platten verwendet werden. Die Art der verwendeten Platte hängt von der Art des Bestimmungsverfahrens ab. Sie kann vom Fachmann ohne weiteres ausgewählt werden. Sowohl die beschichteten Mi krotiterplatten als auch die Testreagenzien werden bevorzugt bei 4°-8°C gelagert, um eine gleichbleibend hohe Qualität zu gewährleisten. Die Durchführung des Nachweisverfahrens ist dem Immunologen an sich bekannt. Die Auswahl des Nachweisverfahrens liegt ebenfalls im Bereich des Fachwissens und Fachkönnens des Fachmanns.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand eines Ausführungsbeispiels dargestellt.

ELISA zum Nachweis von Autoantikörpern gegen p53

Es werden die nachfolgenden Lösungen und Antikörper verwendet:

Lösungen, Antikörper

1. Carbonatpuffer:
15 mmol/l Carbonat/Hydrogencarbonat-Puffer, pH 9, 6 (1,59 g Na₂CO₃, 2,94 g NaHCO₃, 0,2 g NaN₃ ad 11 Aqua dest.)
2. PAb421:
Mausantikörper, monoklonal, Antikörper gegen p53, Konzen tration 1 mg/ml.
3. ELISA-Puffer A:
PBS-Puffer pH 7,1 + 18 g/l Tween 20 = Waschpuffer 1×
4. ELISA-Puffer B:
PBS-Puffer pH 7,1 + 1% BSA
5. Zellen:
HT29: p53-positive Zellinie
SAOS2: p53-negative Zellinie
6. Extraktionspuffer:
100 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% NP40, ad 300 ml Aqua bidest: pH 9,0.
7. Anti-Human-IgG-POD-Konjugat:
Firma: Sigma, Product No. A-0170
Vorverdünnung: 1 : 500 in ELISA-Puffer B
Endverdünnung: 1 : 50000 in ELISA-Puffer B
POD = Peroxidase
8. Acetatpuffer:
25 mmol/l Natriumacetat pH 4,6
9. Substratlösung A:
TMB=Tetramethylbenzidin; Firma: Sigma; Produkt No. T-8768 Konzentration: 2,5 mg/ml
6 ml Substratlösung A für eine Mikrotiterplatte: 15 mg TMB in 3 ml DMSO gelöst + 3 ml Acetatpuffer
10. Substratlösung B:
0,02% H₂O₂ in Acetatpuffer
11. Stoplösung:
0,5 N H₂SO₄

A. Beschichtung der Mikrotiterplatten

1. Antikörperbeschichtung:
Antikörper: PAb421, monoklonaler Mausantikörper
gegen p53
Konzentration: 1 mg/ml
Konzentration für die Beschichtung: 1 µg/ml
Antikörper in Carbonatpuffer auf 1 µg/ml verdünnen
Beschichtung der Mikrotiterplatten mit 100 µl Anti körperverdünnung pro Kavität;
Inkubation bei 4°C über Nacht.
2. Nachbeschichtung mit BSA:
Mikrotiterplatten 3× waschen mit Waschpuffer (=ELISA-Puffer A)
2% BSA in Carbonatpuffer; 200 µl pro Kavität; Inkubation bei 4°C über Nacht.
3. Zellextraktbeschichtung:
Herstellung der Zellextrakte:
Der Zellrasen einer jeden Schale (106 Zellen) wird in 360 µl Extraktionspuffer + 40 µl Trasylol aufge nommen und 1 h auf Eis inkubiert;
Zentrifugation: 10 min bei 4°C und 1000 rpm
30 min bei 4°C und 13000 rpm
Pellet verwerfen; Überstand wird zur Beschichtung verwendet
Beschichtung: waschen der Mikrotiterplatten ent fällt, da der Probenpuffer auch BSA enthält; BSA-Lösung absaugen
Zellextrakte 1 : 5 in Probenpuffer (=ELISA-Puffer B) verdünnen; 100 µl pro Kavität; Inkubation 3 h bei 37°C 3× waschen mit Waschpuffer (=ELISA- Puffer A).

B. Durchführung des Sandwich-ELISA

1. Waschen: 3× mit Waschpuffer (=ELISA-Puffer A);
2. Antiserum: Alle Proben werden 1 : 20 in Probenpuffer (=ELISA-Puffer B) verdünnt, auch die Po sitivkontrolle. Von jeder Serumverdünnung werden 100 µl in eine SAOS2-beschichtete und in eine HT29-beschichtete Kavität pipettiert. Negativkontrolle: 100 µl Pro benpuffer in eine SAOS2-beschichtete und in eine HT29-beschichtete Kavität pipet tieren; 1 h Inkubation bei 37°C;
3. Waschen: 3× mit Waschpuffer (=ELISA-Puffer A);
4. Konjugat: anti-Human-IgG-POD-Konjugat 1 : 100 in Pro benpuffer (=ELISA-Puffer B) verdünnen; 0,1 ml in jede Kavität pipettieren; 1 h Inkubation bei 37°C;
5. Waschen: 3× mit Waschpuffer (=ELISA-Puffer A)
6. Substrat: 50 µl Substratlösung A und anschließend (!) 50 µl Substratlösung B in jede Kavität pipettieren; 10-30 Min. Inkubation bei Raumtemperatur;
7. Stoplösung: Substratreaktion durch Zugabe von 100 µl Stoplösung abstoppen;
8. Auswertung: Extinktion bei 450 nm mit einem ELISA- Reader bestimmen.

Bedingt durch die Schwierigkeiten bei der Standardisierung von Enzymimmunoassays, sollte jedes Klinisch-Chemische Labor eige ne, laborinterne Meßwerte verwenden.

Die Fig. 3 zeigt eine graphische Auswertung für einen Patien ten.

Bei der Beurteilung der Daten einer Patientenprobe ist es wich tig, daß ein deutlicher Unterschied zwischen dem Extinktions- Wert, der in der markierten Kavität für diese Probe erhalten wurde und dem Extinktions-Wert, der in der unmarkierten Kavität für die gleiche Probe gemessen wurde, gefunden wird.

Als Auswertungshilfe für einen positiven Befund kann folgende Beziehung verwendet werden:

E = E₁ - E₂

E = erhaltene Extinktionsdifferenz (dabei sollte E₁ immer größer sein als [E₂ + 20%])
E₁ = Extinktion der Probe aus markierter Kavität;
E₂ = Extinktion der Probe aus unmarkierter Kavität.

Claims

1. Testanordnung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Wildtyp- und/oder Mutanten-p53- Proteine aus einem oder mehreren Tumorzellextrakten um faßt.

2. Testanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere Human-p53-Proteine vom Wildtyp und/ oder Mutantentyp umfaßt.

3. Testanordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die p53-Protein(e) auf einem festen Träger gebunden vorliegen.

4. Testanordnung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die p53-Protein(e) über einen gegen Wildtyp- und/oder Mutanten-p53 gerichteten monoklonalen oder poly klonalen Antikörper an dem Träger gebunden vorliegen.

5. Testanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin ein oder mehrere Reagenzien zum qualita tiven und/oder quantitativen Nachweis und/oder zur Bestim mung der Bindung von Antikörpern an die p53-Proteine in der Testanordnung umfaßt.

6. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen ein oder mehrere Wildtyp- oder Mutanten-p53-Proteine in einer Test probe, gekennzeichnet durch

a) in Kontakt bringen einer Testprobe mit einer Testan ordnung, die ein oder mehrere Wildtyp- und/oder Mu tanten-p53-Proteine aus einem oder mehreren Tumor zellextrakten umfaßt; und
b) quantitatives und/oder qualitatives Bestimmen der Anti-Wildtyp- oder Mutanten-p53-Immunreaktion in ei nem Individuum durch Nachweis der Antikörperbindung an das Wildtyp- oder Mutanten-p53-Protein.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der gegen das Wildtyp- und/oder Mutanten- p53-Protein gerichteten Antikörper in der Testprobe be stimmt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Testprobe eine Serumprobe, Plasmaprobe, Urin oder eine andere Körperflüssigkeit ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Human-Testprobe verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanten- und/oder Wildtyp-p53-Proteine in wäß rigem Medium suspendiert sind.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanten- und/oder Wildtyp-p53-Proteine an einen festen Träger gebunden werden.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellextrakte aus HT29- und/oder MCF-7- Tumorzellinien hergestellt werden.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Antikörperbindung durch einen per oxidase-gekoppelten, gegen Human-IgG gerichteten Anti körper erfolgt.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Antikörperbindung zur Immunpräzipi tation, Radio-Immunoassay (RIA), Fluoreszenz-Immunoassay (FIA) oder enzym-gekoppelten Immunosorbensassay (ELISA) geführt wird.

15. Verwendung der Testanordnung und des Verfahrens nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zum Nachweis oder zur Prophylaxe von Tumoren.