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Querverweis
auf verwandte Anmeldung
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Die
vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität und die Vergünstigung
der vorläufigen
US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 60/122,177, eingereicht
am 25. Februar 1999.
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Technisches
Gebiet
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Die
Erfindung stellt Verfahren zur Extraktion von Deoxyribonucleinsäure ("DNA") aus einer biologischen
Probe bereit. Genauer betrifft die Erfindung Verfahren zur Extraktion
von DNA mit hoher Ausbeute aus einer heterogenen biologischen Probe
durch Hemmung des DNA-Abbaus.
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Hintergrund
der Erfindung
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DNA
ist ein relativ stabiles Molekül,
das routinemäßig aus
biologischen Proben isoliert wird. In jüngerer Zeit wurden viele Krankheiten,
an denen Instabilitäten
(z.B. Mutationen) in genomischer DNA beteiligt sind, charakterisiert.
Auch viele Pathogene wurden durch die Anwesenheit oder Abwesenheit
einer bestimmten DNA in einer biologischen Probe identifiziert.
Viele Krankheiten, wie Krebs, werden optimalerweise früh in ihrem
Verlauf erkannt. Damit die Früherkennung
wirksam ist, müssen
relativ geringe Gehalte an DNA, die Krebs anzeigen, gegen einen
hohen Hintergrund an anderer DNA (z.B. normaler menschlicher DNA,
bakterieller DNA, etc.) nachgewiesen werden. Diese Art Nachweis
ist technisch schwierig und führt
typischerweise zu einer geringen Nachweisempfindlichkeit. Darüber hinaus
wird in bestimmten komplexen Untersuchungsmaterialien, einschließlich Stuhl,
die wenige Spezies-spezifische DNA, die es gibt, rasch abgebaut,
was einen effizienten Sequenz-spezifischen Nachweis sogar noch schwieriger
macht. Daher gibt es einen Bedarf an Verfahren, die Unversehrtheit
von DNA in einer Probe zu bewahren, insbesondere in Proben, in denen
die nachzuweisen de DNA relativ zu anderer DNA in der Probe in einem
geringen Anteil vorhanden ist und schnell abgebaut wird.
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WO
93/20235 A offenbart ein Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäuren aus
Stuhlproben, das zum Nachweis von Mutationen, die mit gastrointestinaler
Neoplasie im Zusammenhang stehen, verwendet wird. Reagenzien, die
zur Durchführung
der Isolierung von Nucleinsäuren
verwendet werden, sind ebenfalls offenbart.
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WO
98/58081 A offenbart Verfahren zum Präparieren von Stuhlproben, um
die Ausbeute an relevanter DNA zu erhöhen, und stellt außerdem Verfahren
zum Isolieren und Analysieren von Ziel-DNA hinsichtlich Eigenschaften,
die ein kolorektales Karzinom anzeigen, bereit. Verfahren zum Durchmustern
von Patienten auf die Anwesenheit kanzeröser oder präkanzeröser kolorektaler Läsionen werden
ebenfalls bereitgestellt.
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DE 195 30 132.3 offenbart
ein Verfahren zum Reinigen, Stabilisieren und/oder Isolieren von
Nucleinsäuren
aus biologischen Materialien, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet
ist, dass eine Adsorptionsmatrix auf der Basis von Kohlehydraten
(z.B. Kartoffelmehl) zu einer Probe von Nucleinsäuren enthaltendem biologischen
Material zugegeben wird, um Verunreinigungen zu binden.
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Science,
Vol. 256, 1992, Seiten 102–105,
Sidransky et al., lehrt, dass kolorektale (CR) Tumore üblicherweise
heilbar sind, wenn sie vor der Metastase erkannt werden. Weil mit
der Entwicklung dieser Tumore genetische Veränderungen verbunden sind, können im
Stuhl von Individuen mit CR-Neoplasmen mutierte Gene zu finden sein.
Die Stühle
von neun Patienten, deren Tumore Mutationen von K-ras enthielten,
wurden analysiert. In acht der neun Fälle waren die ras-Mutationen
in DNA, die aus dem Stuhl gereinigt wurde, nachweisbar. Diese Patienten
umfassten jene mit gutartigen und bösartigen Neoplasmen von proximalem
und distalem Kolonepithel. So können
kolorektale Tumore durch ein nicht-invasives Verfahren auf der Basis
der molekularen Pathogenese der Krankheit nachgewiesen werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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In
einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhalten der
Unversehrtheit von DNA in einer Probe, die ausgewählt ist
aus einer Stuhlprobe oder einer Probe, die abgeschälte Zellen
enthält,
aufweisend Aussetzen der Probe gegenüber EDTA in einem Bereich von
0,250 g EDTA pro Gramm Probe bis etwa 0,782 g EDTA pro Gramm Probe,
wobei die Konzentration an EDTA in der Probe mindestens 16 mM ist,
um die Unversehrtheit von DNA in der Probe zu erhalten.
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Bevorzugte
Aspekte der Erfindung sind in den Ansprüchen 2 bis 6 angeführt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erhalten der Unversehrtheit
von DNA in einer Probe bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform
verhindern Verfahren der Erfindung einen Enzym-vermittelten DNA-Abbau.
Die Erhaltung der Unversehrtheit von DNA erleichtert die Isolierung
und den Nachweis von DNA.
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Verfahren
der Erfindung sind besonders nützlich
zum Extrahieren oder Nachweisen von DNA in einer biologischen Probe,
insbesondere einer, die niedrige Gehalte an relevanter DNA enthält. Ein
gutes Beispiel für eine
Probe, die niedrigere Gehalte an relevanter DNA enthält, ist
Stuhl. Typischer menschlicher Stuhl enthält nur kleine Mengen an intakter
menschlicher DNA. Das meiste der menschlichen DNA im Stuhl eines
gesunden Individuums ist vermutlich von abgeschälten Epithelzellen und hat
einen apoptotischen Abbau durchgemacht. Wenn der sich bildende Stuhl
durch das Kolon hindurchgeht, werden Kolon-Epithelzellen als Teil
des Zellumsatzes, der in dem Kolon geschieht, auf den Stuhl abgeschilfert.
Stuhl enthält
auch abgeschilferte Zellen von anderen Hohlraum-Quellen (z.B. Lunge,
Magen, Speiseröhre,
etc.). Abgeschilferte Zellen haben typischerweise eine Apoptose
durchgemacht oder machen eine Apoptose durch, wobei sie zelluläre DNA in
kleinen Fragmenten zurücklassen.
Enzyme, wie Deoxyribonuclease ("DNase") und Mikrokokken-Nuclease,
tragen zum Abbau irgendwelcher intakter menschlicher DNA, die verbleibt,
bei. Verfahren des Stands der Technik ist es, obwohl sie DNase-Inhibitoren
verwendeten, nicht gelungen, signifikante Ausbeuten an intakter,
Spezies-spezifischer DNA aus Stuhl zu erzielen. Daher haben derartige
Verfahren versagt, die Optimierung der Hemmung des DNA-Abbaus zu
erwägen.
Verfahren der Erfindung basieren auf der Erkenntnis, dass eine optimale Hemmung
von DNA abbauendem Enzym bzw. DNA abbauenden Enzymen DNA wirkungsvoll
erhält,
insbesondere große,
diagnostisch relevante DNA-Fragmente, die in einer Probe vorliegen.
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In
einem Aspekt umfasst die Erfindung die Hemmung des Nucleinsäure-Abbaus
in einer Probe, und optional das Extrahieren einer Ziel-DNA mittels,
beispielsweise, einer Phenol-Chloroform-Extraktion. Bevorzugt ist
die Hemmung des Nucleinsäure-Abbaus
ausreichend, um eine kritische Anzahl an Molekülen von analysierbarer DNA
zu erzeugen. In einer Ausführungsform
umfassen Verfahren der Erfindung die Hemmung eines Enzyms, das zum
DNA-Abbau in einer Stuhlprobe in der Lage ist. In einer bevorzugten
Ausführungsform umfassen
Verfahren der Erfindung, dass eine Stuhlprobe einem Ionen-Chelatbildner
bzw. einem Ionenchelatierenden Mittel, wie einem zweiwertigen Ionen-Chelatbildner,
ausgesetzt wird. Ionen-Chelatbildner hemmen in bestimmten Ausführungsformen
DNase. Zu Beispielen bevorzugter Inhibitoren gehören Ethylendiamintetraessigsäure ("EDTA"). Zusätzliche
bevorzugte Verfahren der Erfindung umfassen, dass eine Stuhlprobe
einem Mikrokokken-Nuclease-Inhibitor, wie EGTA, ebenfalls ein zweiwertiger
Ionen-Chelatbildner, ausgesetzt wird. Inhibitoren des DNA-Abbaus
können
entweder alleine oder in Kombination verwendet werden, um optimale Grade
an DNA-Erhaltung
zu erzielen.
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Verfahren
der Erfindung werden unter Verwendung irgendeines Inhibitors des
DNA-Abbaus praktiziert. Die Menge an Inhibitor variiert in Abhängigkeit
von dem Inhibitor, der verwendet wird. Ein Inhibitor muss jedoch in
einer Menge verwendet werden, die signifikante Gehalte an DNA in
der Probe für
eine nachfolgende Analyse erhält.
Verfahren zur Bestimmung ausreichender Gehalte an DNA sind unten
angegeben. Derartige Verfahren erlauben es dem Fachmann, unabhängig von
dem verwendeten Inhibitor die Erfindung mit Spezifizität auszuführen. Gemäß bevorzugten
Verfahren wird eine Menge an Inhibitor verwendet, die in der Probe
ausreichend DNA zum Nachweis einer Ziel-DNA mit einem gewünschten
Grad an statistischer Konfidenz erhält. Unter Verwendung von hierin
beschriebenen Verfahren kann der Fachmann eine geeignete Menge eines
jeden Inhibitors zur Verwendung bei Verfahren der Erfindung bestimmen.
Die Verwendung verschiedener spezifischer Inhibitoren ist unten
beispielhaft dargelegt.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
umfassen Verfahren der Erfindung das Erhalten einer repräsentativen
(Umfangs- oder Querschnitts-)Stuhlprobe, das Aussetzen der Probe
oder eines Teils davon einem DNase-Inhibitor und das Isolieren von
DNA aus der Probe. Ein bevorzugter DNase-Inhibitor ist EDTA. Bevorzugte
Mengen an EDTA sind von etwa 0,042 g pro Gramm Stuhl bis etwa 0,782
g pro Gramm Stuhl, und insbesondere von 0,250 g pro Gramm Stuhl
bis etwa 0,521 g pro Gramm Stuhl. DNA kann, beispielsweise, durch
eine Phenol-Chloroform-Extraktion
extrahiert werden. Nach der Extraktion kann die DNA durch in der Technik
bekannte Verfahren analysiert werden. Beispielsweise offenbaren
das US-Patent Nr. 5,830,665 und das US-Patent Nr. 5,670,325 Verfahren
zum Analysieren von DNA, die aus einer Stuhlprobe extrahiert wurde.
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Verfahren
der Erfindung sind bei jeder beliebigen Probe brauchbar, bei der
eine Hemmung des DNA-Abbaus erwünscht
ist. Beispielsweise sind Verfahren der Erfindung besonders wirkungsvoll
bei Proben, die abgeschälte
Zellen, insbesondere abgeschälte
Epithelzellen, aufweisen. Die in solchen Proben enthaltene DNA baut
sich typischerweise rasch ab, was die Analyse einer bestimmten DNA,
insbesondere einer, die in der Probe in einem geringen Anteil vorliegt,
schwierig macht. Zu solchen Proben gehören beispielsweise Stuhl, Auswurf,
Urin, Eiter und Vormilch. Verfahren der Erfindung beinhalten die
Hemmung des DNA-Abbaus in solchen Proben, so dass eine ausreichende
Menge an DNA für
einen spezifischen, empfindlichen Nachweis erhalten bleibt. Jedes
der oben beschriebenen Merkmale, wie DNA-Abbau-Inhibitoren oder
Mengen an Inhibitoren, die verwendet werden, kann in Proben, die
abgeschälte
Zellen enthalten, nützlich
sein.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 zeigt
ein Ablaufdiagramm, das einen Aspekt der Erfindung beschreibt.
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2 zeigt
ein Trenngel von DNA, die aus mehreren verschiedenen homogenisierten
Stuhl-Überständen, die
verschiedene Konzentrationen an EDTA enthielten, isoliert wurde.
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3 zeigt
ein Trenngel von DNA, die aus homogenisiertem Stuhl-Überstand
isoliert wurde, der verschiedene Konzentrationen an EDTA enthielt,
gefolgt von Abfangen und Amplifizieren.
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4 zeigt
ein Trenngel von DNA, die aus homogenisiertem Stuhl-Überstand
isoliert wurde, der verschiedene Konzentrationen an EDTA enthielt,
gefolgt von Abfangen, Zugeben von mehr DNA, und Amplifizieren.
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5 zeigt
einen Satz Kurven, der durch eine Regressionsanalyse der unter Verwendung
des Modells, wie es beispielsweise für die Tabellen 1 und 2 beschrieben
ist, erhaltenen Daten erzeugt wurde.
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Genaue Beschreibung der
Erfindung
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I. Einführung
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verfahren für eine erhöhte Ausbeute an DNA in einer
biologischen Probe durch Erhalten der Unversehrtheit der DNA in
der Probe bereit. Derartige Verfahren sind insbesondere nützlich,
wenn die interessierende DNA ("die
Ziel-DNA") in der
Probe mit einer geringen Häufigkeit
vorhanden ist oder rasch abgebaut wird. Genauer beinhalten Verfahren
der Erfindung beispielsweise das Hemmen von Enzymen, die DNA abbauen.
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Vor
der vorliegenden Erfindung waren die Fachleute nicht mit dem Verhindern
des DNA-Abbaus vor der Extraktion aus einer Probe befasst. Typischerweise
ist entweder die interessierende DNA in den Proben in relativ großen Mengen
vorhanden (z.B. Tumorzellen, Blut), oder die Verfahren sind auf
ein Erhöhen
der Empfindlichkeit für
DNA geringer Häufigkeit
gerichtet, und nicht auf ein Erhalten ihrer Unversehrtheit. Jedoch
insbesondere in dem Fall von DNA geringer Häufigkeit in einer heterogenen
Probe (z.B. einer Probe mit Zellen und/oder Zellresten von vielen
Zelltypen und/oder Organismen) waren Verfahren zur Erhöhung der
Empfindlichkeit für
DNA nicht völlig
erfolgreich. Verfahren der Erfindung stellen durch Erhalten der
Unversehrtheit von DNA einen neuen Weg bereit. Verfahren der Erfindung
erhöhen
die Wahrscheinlichkeit, eine spezifische Ziel-DNA nachzu weisen,
weil derartige Verfahren mehr intakte Ziel-DNA in der Probe verfügbar machen.
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Bezugnehmend
auf 1 beinhaltet ein verallgemeinertes Verfahren der
Erfindung das Erhalten einer Probe (Schritt 2) und das
Aussetzen der Probe einem DNA-Abbau-Inhibitor (Schritt 4).
Wenn die Probe dem DNA-Abbau-Inhibitor ausgesetzt wurde, wird Ziel-DNA
extrahiert (Schritt 6). Dann wird die Anwesenheit oder Abwesenheit
dieser extrahierten Ziel-DNA nachgewiesen (Schritt 8).
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In
heterogenen Proben, wie Stuhl, bauen endogene menschliche DNasen
und/oder bakterielle Nucleasen DNA ab. Beispiele von Nucleasen umfassen
DNasen wie Deoxyribonuclease I ("DNase
I") und Mikrokokken-Nuclease.
DNase und Mikrokokken-Nuclease brauchen beide ein zweiwertiges Kation,
um optimal zu funktionieren. Für
DNase umfassen geeignete Ionen Mn+2 und
Mg+2. Für
Mikrokokken-Nuclease ist Ca+2 ein geeignetes
Ion. Ionen-Chelatbildner, und insbesondere zweiwertige Ionen-Chelatbildner
sind in der Lage, Nucleasen zu hemmen. Ionen-Chelatbildner entfernen
Ionen aus der Beziehung mit der Nuclease, so dass sie die Funktion
der Nuclease hemmen. Beispielsweise sind EDTA oder EGTA, in optimalen
Mengen verwendet, als Ionen-Chelatbildner zur Verwendung bei der
vorliegenden Erfindung brauchbar.
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Andere
Verbindungen, die den Enzym-vermittelten Abbau von DNA inaktivieren,
damit wechselwirken oder ihn verlangsamen, sind brauchbar. Beispielsweise
sind Liganden und/oder Antikörper,
die um die aktive Stelle von DNA abbauenden Enzymen konkurrieren
oder mit ihr wechselwirken, die jene Enzyme inaktivieren und/oder
die Botensysteme, die DNA abbauende Enzyme kontrollieren, blockieren,
bei der Durchführung
der Erfindung brauchbar. Phenol-Chloroform-Extraktionskomponenten
in höheren
Konzentrationen als denen, die typischerweise bei der Extraktion
verwendet werden, sind ebenfalls in der Lage, Nucleasen durch Abtrennung und
Denaturierung zu hemmen. Beispielsweise denaturiert Phenol DNA-Abbau-Enzyme
und wird in Verfahren der Erfindung zum Erhalten der DNA-Unversehrtheit
verwendet. Auch Proteinasen, die DNA abbauende Enzyme abbauen und/oder
denaturieren, sind brauchbar.
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Verfahren
der Erfindung weisen die Verwendung optimaler Mengen an DNA-Abbau-Inhibitoren
auf, um ausreichend hochgradig unversehrte DNA für eine diagnostische Durchmusterung
zu erhalten. In heterogenen Proben, wie Stuhl, liegt Ziel-DNA (z.B.
mutierte DNA oder Verringerungen an aufgezählter DNA vom Wild-Typ, die eine Mutation
anzeigen) in niedrigen Mengen vor. Eine optimale Menge eines DNA-Abbau-Inhibitors
ist eine Menge, die zu einer messbaren Verbesserung der Menge an
in der Probe verfügbarer
DNA führt.
So kann der Fachmann empirisch optimale Mengen an DNA-Abbau-Inhibitoren
zur Verwendung in Verfahren der Erfindung bestimmen, indem er Inhibitor-Mengen
verwendet, die notwendig sind, um einen diagnostisch relevanten Bruchteil
an Ziel-DNA mit hoher Unversehrtheit zu erhalten. Ein Verfahren
zur Bestimmung diagnostisch relevanter DNA-Mengen ist unten angegeben.
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Die
Amplifizierung von DNA und andere stochastische Prozesse, die an
heterogenen Proben durchgeführt
werden, können
tatsächlich
zu der Unfähigkeit
beitragen, DNA geringer Häufigkeit
zu messen. Beispielsweise macht eine typische, mit Krebs im Zusammenhang
stehende (mutierte) DNA in den frühen Stadien der Onkogenese
etwa 1% der DNA in einer heterogenen Probe (z.B. Stuhl) aus. Wenn
DNA in der Probe mit 30%-iger PCR-Effizienz amplifiziert wird, hat
jede beliebige bestimmte DNA nur eine 30%-ige Chance, in einer beliebigen
PCR-Runde amplifiziert
zu werden. Wenn daher eine mutierte DNA, die zu Beginn als 1% einer
Probe vorliegt, nicht in der ersten Runde amplifiziert wird, macht
die mutierte DNA nach Runde 1 nur etwa 0,7% der DNA in der Probe
aus. Wenn keine Mutante in den ersten zwei Runden amplifiziert wird
(0,7 × 0,7,
oder eine Wahrscheinlichkeit von 49%), macht die mutierte DNA nur
etwa 0,6% der DNA in der Probe aus, die in Runde 3 der PCR geht.
Wenn der Assay nach der Amplifizierung, der zum Nachweisen der Mutante
verwendet wird, für
die Mutante eine Empfindlichkeit von nicht mehr als 0,5% hat, mag
es unmöglich
sein, das Vorliegen der mutierten DNA verlässlich nachzuweisen. So kann
das Nachweisverfahren selbst tatsächlich zu Schwierigkeiten beim
Nachweisen von DNA geringer Häufigkeit
beitragen, insbesondere, wenn in einer Probe keine ausreichenden
Mengen an intakter DNA vorhanden sind. So besteht ein Mittel zur
Bestimmung einer geeigneten Menge an Inhibitor, die in Verfahren
der Erfindung zu verwenden ist, darin, die minimale Menge an intakter DNA
zu bestimmen, die in einer Probe vorhanden sein muss, um die oben
beschriebenen stochastischen Effekte zu vermeiden, und dann ausreichend
Inhibitor zu verwenden, um zumindest die minimale Anzahl an DNA-Molekülen in der
Probe zu erzeugen. Verfahren zur Berechnung der minimalen Anzahl
an DNA-Molekülen,
die notwendig sind, um die Effekte stochastischer Prozesse, wie
PCR, zu überwinden,
sind unten angegeben.
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Ein
Modell, das brauchbar ist, um genügend DNA-Moleküle für eine genaue
Messung zu erzeugen, arbeitet durch Wiederholen stochastischer Prozesse über eine
Anzahl von PCR-Runden. Im Zusammenhang mit molekularer Krankheits-Diagnostik diktiert
das Modell die Anzahl von Molekülen,
die der PCR dargeboten werden müssen,
um zuverlässig
eine Amplifizierung der gewünschten
Ziel-DNA sicherzustellen.
Das Modell beinhaltet eine vorgegebene PCR-Effizienz (festgelegt,
um separate Spezifizitäts-Erfordernisse
zu erfüllen) und
ein vorgegebenes Verhältnis
von mutierter DNA zu Gesamt-DNA in der zu analysierenden Probe (was eine
Eigenschaft der nachzuweisenden Krankheit und der Natur der Probe
ist). Auf der Basis jener Eingabewerte sagt das Modell die Anzahl
an Molekülen
voraus, die der PCR dargeboten werden müssen, um innerhalb eines vorbestimmten
statistischen Konfidenzniveaus sicherzustellen, dass ein (Ziel-)Molekül geringer
Häufigkeit
amplifiziert und nachgewiesen wird. Wenn die Anzahl an Molekülen bestimmt
ist, kann der Fachmann die zu verwendende Probengröße (z.B.
das Gewicht, Volumen, etc.) in Abhängigkeit von den Eigenschaften
der Probe (z.B. ihrer Herkunft, ihres molekularen Aufbaus, etc.)
bestimmen. Das Modell diktiert die Anzahl an Molekülen, die
der PCR dargeboten werden müssen,
um zuverlässig
eine Amplifizierung und einen Nachweis sicherzustellen.
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Das
beispielhafte Modell simuliert die Auswahl von DNA zur Amplifizierung über mehrere
PCR-Runden. Für
die Zwecke des Modells wird eine Probe gewählt, die ein Verhältnis von
mutierter DNA zu Gesamt-DNA von 1:100 enthält, wovon angenommen wird,
dass es an der klinischen Krankheits-Schwelle liegt. Bei einem kolorektalen
Karzinom beispielsweise ist 1% der menschlichen DNA in einer Probe
(z.B. Stuhl) mutiert (d.h. hat eine Deletion, Substitution, Umordnung,
Inversion oder eine andere Sequenz, die von einer entsprechenden
Sequenz des Wild-Typs verschieden ist). Über eine große Anzahl
von PCR-Runden werden unter der Annahme, dass es überhaupt
abnormale Moleküle
in der Probe gibt, sowohl die mutierten Moleküle als auch die Moleküle vom Wild-Typ
entsprechend ihrem Verhältnis
in der Probe (hier nominell 1 in 100) ausgewählt (d.h. amplifiziert). In
jeder Runde bestimmt sich jedoch die Anzahl jeder Spezies, die amplifiziert
wird, nach einer Poisson-Verteilung. Über viele Runden unterliegt
der Prozess stochastischen Fehlern, die die Fähigkeit, mutierte DNA geringer
Häufigkeit
nachzuweisen, verringern. Die früheren
PCR-Runden (im Prinzip die ersten zwei Runden) sind jedoch, wenn
eine Spezies geringer Häufigkeit
nachgewiesen werden soll, proportional wichtiger, und irgendwelche
Runden nach Runde 10 sind praktisch unwichtig. So bestimmt das Modell
die kombinierte Wahrscheinlichkeit, dass (1) genügend mutierte Moleküle der PCR
dargeboten werden, und (2) die Wirkungen der stochastischen Amplifizierung
auf diese Moleküle,
so dass es an der Ausgabe der PCR eine ausreichende Anzahl an Molekülen und
ein ausreichendes Verhältnis
von mutierten Molekülen
zu Gesamt-Molekülen
gibt, um einen zuverlässigen
Nachweis sicherzustellen.
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Das
Modell, das zur Bearbeitung der Anzahl von Molekülen, die in der ersten PCR-Runde
notwendig sind, verwendet wurde, wurde als eine „Monte Carlo"-Simulation von 1000
Experimenten erzeugt, wobei jedes Experiment aus 10 PCR-Zyklen bestand, die
auf jedes Molekül
in der Probe einwirkten. Die Simulation analysierte (1) das Nehmen
einer Probe von dem Untersuchungsmaterial; und (2) jede PCR-Runde
wiederholt, um für
jede Runde zu bestimmen, ob eine mutierte DNA, falls in der Probe
anwesend, amplifiziert wurde. Bei Beendigung der wiederholten Probenahme
bestimmte das Modell den Prozentsatz an Runden, in denen ein mutierter
Strang amplifiziert wurde, den Prozentsatz an Mutanten, die eine
vorbestimmte Nachweisgrenze überschritten
(in diesem Beispiel 0,5% auf der Basis des Verhältnisses Mutante:Insgesamt
von 1%), den Abweichungskoeffizienten (CV, coefficient of variation)
für die
stochastischen Probenahme in jeder Runde alleine, und den Varianzkoeffizienten
für die
stochastischen Probenahme und PCR in Kombination.
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Bei
der PCR wird ein stochastisches Rauschen erzeugt, wenn die PCR-Effizienz
irgend etwas anderes ist als 0% oder 100% (diese zwei Fälle stellen
dar, dass es entweder überhaupt
keine Amplifizierung oder eine perfekte Genauigkeit einer spezifischen
Amplifizierung gibt). Die Signalstärke des Rauschens oder des
Hintergrunds in einer PCR, die zwischen 0% und 100% liegt, variiert
mit der Effizienz der PCR. Die Standardabweichung des stochastischen
Rauschens, S, in ei ner PCR ist gegeben durch die Gleichung S
= √npq , worin n die Anzahl
an Molekülen
in der Probe ist, p die Effizienz der PCR ist und q 1 – p ist.
Tabelle 1 gibt Ergebnisse an, die für wiederholte Probenahmen mit
einer auf 100% und 20% gesetzten PCR-Effizienz und einem Mutante:Gesamtheit-Verhältnis von
0,5% erhalten wurden.
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Tabelle
1 gibt die Ausgabe des Modells in 12 Experimenten, die unter verschiedenen
Bedingungen durchgeführt
wurden, an. Die erste Reihe zeigt die nominelle Anzahl an Molekülen, die
in die erste Runde der PCR eintreten (d.h. die Gesamtzahl an Molekülen, die
zur Amplifizierung zur Verfügung
stehen). Die zweite Reihe zeigt den Prozentsatz an Molekülen (DNA)
in dem biologischen Untersuchungsmaterial, von denen erwartet wird,
dass sie mutiert sind. Für
einen Hinweis auf ein kolorektales Karzinom in aus Stuhl gewonnener DNA
ist die klinische Relevanzschwelle beim Nachweis von Krebs im Frühstadium
1%. Das heißt,
1% der DNA in einer Probe, die aus einem heterogenen Untersuchungsmaterial
(z.B. Stuhl) stammt, enthält
eine Mutation, die mit kolorektalem Karzinom im Zusammenhang steht.
Die sechste Reihe ist die Nachweisgrenze des Assays, der zur Messung
des PCR-Produkts nach der Beendigung der PCR verwendet wurde. Diese
Zahl ist signifikant, wie man unten sehen wird, weil von der PCR
genügend
mutierte DNA erzeugt werden muss, um über abweichende Signale vom
Wild-Typ und zufälliges Hintergrundrauschen
hinaus nachweisbar zu sein. Unter der Überschrift "Ausgaben" liefert die erste Zeile die Wahrscheinlichkeit,
dass mindestens ein mutiertes Molekül der ersten PCR-Runde dargeboten
wird. Die zweite Zeile unter der Überschrift "Ausgaben" liefert die Wahrscheinlichkeit des
Nachweises von Mutanten (nach der PCR) über der vorbestimmten Nachweisgrenze.
In Experiment 4 beispielsweise zeigen die Ergebnisse an, dass in
87,9% der Experimente, die unter den für Experiment 4 spezifizierten
Bedingungen durchgeführt
wurden, die Anzahl an Mutanten die Schwellenzahl für den Nachweis überschreiten
wird. Die letzten zwei Reihen schließlich liefern den Abweichungskoeffizienten
für die Probenahme,
und für
die Kombination von Probenahme und PCR.
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Wie
in Tabelle 1 gezeigt ist, wird mutierte DNA selbst bei 100% PCR-Effizienz
nur in 97,1% der Proben nachgewiesen, wenn 1000 Eingabe-Moleküle verwendet
werden (d.h. 1000 DNA-Moleküle
sind zum Primen beim anfänglichen
PCR-Zyklus verfügbar), obwohl
100% der DNA in jeder gegebenen PCR-Runde amplifiziert werden. Wenn
10.000 Moleküle
dargeboten werden, ist es praktisch sicher, dass die mutierte DNA
amplifiziert und nachgewiesen wird, wie in den Ergebnissen für Experiment
6 in Tabelle 1 gezeigt. Stochastische Fehler wegen einer Abweichung
der Anzahl von Eingabe-Molekülen
werden weniger signifikant bei etwa 500 Eingabe-Molekülen und
höher (d.h.
der CV für
stochastische Abweichungen ist etwa derselbe, unabhängig davon, ob
die PCR-Effizienz 20% oder 100% ist). Bei einer geringeren PCR-Effizienz
(20% in Tabelle 1) zeigt das Modell, dass das Einführen von
50, 100, 200, 500 oder sogar 1000 Molekülen in die PCR weder die Amplifizierung noch
den Nachweis sicherstellt. Wie in Experiment 12 gezeigt ist, führt das
Einführen
von 10.000 Molekülen zur
Amplifizierung des mutierten Ziels und einer hohen Wahrscheinlichkeit
seines nachfolgenden Nachweises. So treten selbst bei 100% effizienter
PCR signifikant falsch-negative Ergebnisse auf, wenn die Eingabe-Moleküle unter
500 fallen.
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Die
vorstehende Analyse zeigt, dass es für die Anzahl an Molekülen, die
einer PCR dargeboten werden, einen eindeutigen Bereich gibt, um
eine Amplifizierung einer DNA mit geringer Häufigkeit zu erzielen und ihren
Nachweis zu erlauben. Der Bereich ist eine Funktion der PCR-Effizienz
und des Prozentsatzes an (mutierter) DNA geringer Häufigkeit
in der Probe und der Nachweisschwelle bzw. Nachweisgrenze. Das vorgenannte
Modell wurde entwickelt und in Visual Basic für Anwendungscodes (Microsoft,
Office 97) laufen lassen, um eine PCR wie oben beschrieben zu simulieren.
Das statistische Konfidenzniveau, in dem die Ergebnisse gemessen
wurden, wurde konstant bei näherungsweise
99% gehalten. Nur die PCR-Effizienz und der Prozentsatz mutierter
DNA wurde variiert. Wie oben diskutiert nimmt das Modell über 1000
Experimente wiederholt DNA-Proben in einer "Monte Carlo"-Simulation, wobei jedes Experiment
aus 10 PCR-Runden besteht. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle
2 gezeigt.
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Die
Regression der Daten, die unter Verwendung des Modells, wie oben
beschrieben, erhalten wurden, ergab den Kurvensatz, der unten in 5 dargelegt
ist.
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Unter
Verwendung von 5 wird die optimale Anzahl an
Molekülen,
die der PCR darzubieten sind, durch Wählen einer PCR-Effizienz (oder
durch Bestimmen der Effizienz durch empirische Mittel) und durch Wählen eines
Prozentsatzes der Probe, von der angenommen wird, dass sie mit einer
Krankheit im Zusammenhang stehende, mutierte DNA ist, bestimmt.
Dies wiederum diktiert eine Nachweisschwelle. Nicht alle Nachweisstrategien
haben ähnliche
zugrunde liegende Nachweisschwellen, so dass eine geeignete Technologie
gewählt
werden muss. Der Prozentsatz an mutierter DNA kann durch klinische
Erwägungen
bestimmt werden, wie oben für
das kolorektale Karzinom dargelegt.
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Man
kann die PCR-Effizienz und den Prozentsatz an erwarteter Mutante
bestimmen, um die Wahrscheinlichkeit, amplifizierte, nachweisbare
mutierte DNA zu erhalten, zu maximieren. Beispielsweise kann man N,
die Anzahl an Eingabe-Molekülen
aus der "1%"-Kurve in 5,
wählen,
wenn erwartet wird, dass 5% der Probe mutierte DNA ist, um die Konfidenz
des Ergebnisses des Assays zu erhöhen.
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Dieses
Modell, und insbesondere 5, sind nützlich, wenn man optimale Konzentrationen
eines DNA-Abbau-Inhibitors bestimmt. Wenn PCR verwendet wird, um
DNA zu analysieren, nachdem die DNA-Probe einem DNA-Inhibitor ausgesetzt
wurde, gibt 5 an, wie viele Moleküle Ziel-DNA
erhalten werden müssen,
um ausreichend analysierbare DNA zu haben. So kann die optimale
Menge irgendeines DNA-Abbau-Inhibitors als die Menge, oder der Mengenbereich,
an Inhibitor, der eine ausreichende Anzahl analysierbarer DNA gemäß 5 erzeugt,
bestimmt werden. Natürlich
kann dieses Modellsystem auf andere DNA-Nachweistechniken als PCR
angewendet werden. Speziell können
Fachleute dieses Modellsystem auf jeden beliebigen Prozess und/oder
jede beliebige Nachweistechnik, worin stochastisches Rauschen problematisch
ist, anwenden. So kann die optimale Menge irgendeines DNA-Abbau-Inhibitors
auf der Basis der Anzahl an DNA-Molekülen, die ausreichend sind,
um analysierbare DNA zu erzeugen, bestimmt werden.
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Wenn
die Anzahl an Molekülen
zur Eingabe in die PCR bestimmt ist, wird eine Probe, die jene Anzahl an
Molekülen
(oder mehr) enthält,
nach Standardverfahren für
die PCR vorbereitet. Die Anzahl an Molekülen in einer Probe kann direkt,
beispielsweise durch Zählverfahren
wie diejenigen, die in dem US-Patent Nr. 5,670,325 gelehrt sind,
bestimmt werden. Alternativ kann die Anzahl an Molekülen in einer
komplexen Probe durch die molare Konzentration, das Molekulargewicht,
oder durch andere in der Technik bekannte Mittel bestimmt werden.
Die Menge an DNA in einer Probe kann durch Massenspektrometrie,
optische Dichte, oder andere in der Technik bekannte Mittel bestimmt
werden. Die Anzahl an Molekülen
in einer Probe, die aus einem biologischen Untersuchungsmaterial
stammen, kann durch zahlreiche Mittel der Technik bestimmt werden, einschließlich jenen,
die in den US-Patenten Nr. 5,741,650 und Nr. 5,670,325 offenbart
sind.
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Verfahren,
wie sie oben beschrieben sind, werden verwendet, um minimale oder
optimale Mengen an DNA-Abbau-Inhibitoren zur Verwendung in irgendeinem
Verfahren zur Isolierung, zum Nachweis oder zur Amplifizierung von
DNA, in dem stochastische Prozesse auftreten, zu bestimmen. Unter
Verwendung des oben beschriebenen Modells zur Bestimmung der minimalen
Anzahl an Molekülen,
die gemessen werden müssen, um
eine Spezies geringer Häufigkeit
zuverlässig
nachzuweisen, kann man empirisch bestimmen, wie viel von irgendeinem
gegebenen Inhibitor verwendet werden sollte.
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II. Beispiel – Nachweis
von DNA in Stuhl mit EDTA als ein DNA-Abbau-Inhibitor
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A. Einführung
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Verfahren
der Erfindung sind brauchbar zum Analysieren von DNA aus Stuhl,
um ein kolorektales Karzinom nachzuweisen. Wenn ein kolorektales
Karzinom frühzeitig
diagnostiziert wird, kann es durch chirurgische Entfernung des kanzerösen Gewebes
wirkungsvoll behandelt werden. Kolorektale Karzinome entstehen in
dem kolorektalen Epithel und sind typischerweise während der
frühen
Stadien der Entwicklung nicht extensiv mit Blutgefäßen versorgt
(und daher nicht invasiv). Der Übergang
zu einem hochgradig mit Blutgefäßen versorgten,
invasiven und am Ende metastasierenden Karzinom, das sich überall im
Körper
ausbreitet, dauert üblicherweise
10 Jahre oder länger.
Wenn der Krebs vor der Infiltration nachgewiesen wird, stellt eine
chirurgische Entfernung des kanzerösen Gewebes eine wirkungsvolle
Heilung dar. Ein kolorektales Karzinom wird jedoch oft erst bei
Erkennbarkeit klinischer Symptome, wie Schmerzen und schwarzer Teerstuhl,
entdeckt. Im Allgemeinen gibt es derartige Symptome erst, wenn die
Krankheit gut ausgebildet ist, oft nach dem Auftreten von Metastasen,
und die Prognose für
die Patienten ist schlecht, selbst nach chirurgischer Resektion
des kanzerösen
Gewebes. Ein früher
Nachweis des kolorektalen Karzinoms ist daher wichtig, weil ein
früher
Nachweis die Patienten-Sterblichkeit signifikant verringern kann.
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B. Experimente
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Die
folgenden Experimente demonstrieren, dass EDTA, ein Inhibitor von
DNase, die Ausbeute an hochgradig unversehrter DNA aus einer Stuhlprobe
erhöht,
begleitet von einer Erhöhung
der Menge an amplifizierbarer DNA. In diesen Experimenten wurden
drei Stuhl-Teilmengen (jeweils 5 g) in Puffer (0,5 M Tris, 10 mM
NaCl, EDTA) homogenisiert. Das Verhältnis von Puffer zu Stuhl war
7:1; so wurden 35 ml Puffer für
jeweils 5 g Stuhl verwendet. Der Puffer enthielt entweder 0 mM EDTA,
16 mM EDTA oder 96 mM EDTA. Jede der drei Teilmengen wurde dann
mit zusätzlichem
Puffer (der kein EDTA enthielt) auf ein Endverhältnis von Puffer zu Stuhl von
20:1 verdünnt.
Jede Teilmenge wurde dann zentrifugiert, und der Überstand,
der die aktive DNA-abbauende Fraktion enthielt, wurde in ein sauberes
Röhrchen
entfernt. Dann wurde ein DNA-Gemisch aus 2 μg E. coli-DNA und 100 ng menschlicher
genomischer DNA zu jedem Röhrchen
zugegeben. Jedes Röhrchen wurde
75 Minuten lang bei 37°C
inkubiert. Dann wurden 42 μl
Proteinase K und 250 μl
10%-iges SDS (Natrium-dodecylsulfat) zu jedem Röhrchen zugegeben, gefolgt von
einer Inkubation bei 37°C über Nacht.
Nach der Inkubation über
Nacht wurde die DNA in jeder Probe mit Standardtechniken behandelt.
Siehe z.B. Short Protocols in Molecular Biology §§ 2.1–2.4 (Ausubel et al., 3. Ausgabe,
1995). Im Allgemeinen wurden vor der Isolierung der DNA eine Phenol-Extraktion,
eine Phenol/Chloroform-Extraktion und eine Phenol-Extraktion durchgeführt. Dann
wurde die isolierte DNA in einen Standard-Tris-Puffer gebracht.
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Drei
Experimente wurden an der isolierten DNA durchgeführt. Das
erste Experiment demonstrierte, dass die DNA abbauende Aktivität, die in
einem homogenisierten Stuhl-Überstand
vorhanden ist, durch optimale Mengen an EDTA gehemmt wird, was die
Menge an hochgradig unversehrter DNA erhöht. In diesem Experiment wurde
DNA aus einem homogenisierten Stuhl-Überstand isoliert, der von
Teilmengen von Stuhl, der in Puffer mit 0 mM, 16 mM oder 96 mM EDTA
homogenisiert worden war, genommen wurde. Die Gesamt-Nucleinsäure wurde
auf einem Trenngel laufen lassen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt,
in der Pfeile die Stelle des Ausstrichs (oder sein Fehlen), der
die interessierende DNA enthält,
identifizieren.
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Die
Bahnen 4, 5 und 6 repräsentieren
DNA-Proben, die zu homogenisiertem Stuhl-Überstand zugegeben wurden,
der von Stuhl erhalten wurde, der in Puffern, die 0 mM, 16 mM bzw.
96 mM EDTA enthielten, homogenisiert wurde, der nachfolgend isoliert
wurde. Man beachte, dass jede Bahn eine Bande mit hohem Molekulargewicht,
die endogene DNA von der Stuhlprobe repräsentiert, und einen Ausstrich
der exogenen DNA zeigt. Die Intensität der Bande und des Ausstrichs
in der Fotografie (die mit der Menge an DNA in der Bande korreliert,
wobei eine größere Intensität einer
größeren Menge
an DNA entspricht) erhöhten
sich, wenn sich die Konzentration an EDTA in dem Ausgangspuffer
erhöhte.
Die Bahnen 7 bis 9 und 10 bis 12 sind Wiederholungsversuche der
Bahnen 4 bis 6. Die steigende Intensität der Banden und der Ausstriche
bei steigender EDTA-Konzentration
zeigte an, dass die DNA-Unversehrtheit erhalten blieb, wenn die
Konzentration an EDTA in dem Puffer anstieg. So wurde die DNA abbauende
Aktivität
des homogenisierten Stuhl-Überstands durch
die EDTA in einer grob Dosis-abhängigen
Weise gehemmt.
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Die
Bahnen 1, 2 und 3 und die Bahnen 13, 14 und 15 waren Kontrollproben,
die 2 μg
E. coli-DNA und 100 ng exogene menschliche DNA in Puffer, der mit
16 mM EDTA hergestellt war, enthielten. Wie erwartet, zeigte jede
Bahn einen Ausstrich, der für
die zugegebene DNA repräsentativ
war.
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In
einem zweiten Experiment wurde die isolierte DNA, wie oben beschrieben,
abgefangen und amplifiziert. Die Ergebnisse dieses Experiments demonstrierten,
dass EDTA nicht nur die in Stuhl-Überstand vorhandene DNA abbauende
Aktivität
hemmt, sondern auch die Menge an amplifizierbarer DNA erhöht. In diesem Experiment
wurde nach einer Vorbereitung der DNA, wie oben beschrieben, eine
Standard-Hybridabfangreaktion unter Verwendung von Kras-spezifischen
Abfangsonden durchgeführt,
um Kras-DNA abzufangen. Die Kras-DNA wurde dann PCR-amplifiziert. 3 zeigt
die Wirkung von EDTA auf die Erhaltung von Kras-DNA. Die Lage der Bande (oder ihr Fehlen),
die Kras-DNA repräsentiert,
ist mit einem Pfeil identifiziert.
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Die
Bahnen 4, 5 und 6 repräsentieren
Kras-DNA, die von Matritzen-DNA, die zu homogenisiertem Stuhl-Überstand,
der von Stuhl erhalten worden war, der in 0 mM, 16 mM bzw. 96 mM
EDTA enthaltendem Puffer homogenisiert worden war, zugegeben wurde,
amplifiziert wurde. Man beachte, dass die Kras-Bande in Bahn 4 nahezu
fehlte, während
die Kras-Bande in den Bahnen 5 und 6 an Intensität zunahm (was eine Erhöhung der
Menge an tatsächlich
vorhandener Kras-DNA re präsentiert),
als die Konzentration an EDTA in dem Puffer stieg. Die Bahnen 7
bis 9 sind Wiederholungsversuche der Bahnen 4 bis 6 und zeigen eine ähnliche Steigerung
der Bandenintensität
(eine Erhöhung
der Menge an vorhandener DNA), als die Konzentration an EDTA in
dem Ausgangspuffer anstieg. So wurde mehr Kras-DNA amplifiziert,
was zu einem kräftigeren
Signal bei höheren
Konzentrationen an EDTA führte.
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Außerdem variieren
in der Bevölkerung
die DNA-Gehalte, die aus Stuhl amplifiziert werden können, über die
Individuen. Diese Individuen wurden in Gruppen von A bis F gekennzeichnet,
wobei A der höchste DNA-Gehalt
und F ein nicht nachweisbarer DNA-Gehalt ist. Die hohen Gehalte
an DNA in Gruppe A liegen an einer geringen DNA-Abbau-Aktivität in ihrem
Stuhl ("Stuhl mit
hochgradiger Unversehrtheit").
Man würde
nicht erwarten, dass eine Zugabe von EDTA zu dem Puffer, in dem
eine Stuhl-Teilmenge von einem Individuum der Gruppe A homogenisiert
wird, eine große
Wirkung erzeugt, weil Stuhl der Gruppe A wenig DNA abbauende Aktivität hat. Tatsächlich wurde,
wenn Kras-DNA von Matrizen-DNA amplifiziert wurde, die zu homogenisiertem
Stuhl-Überstand
zugegeben wurde, der von Stuhl der Gruppe A erhalten wurde, der
in 0 mM, 16 mM oder 96 mM EDTA enthaltendem Puffer homogenisiert
wurde, weniger Unterschied in der Menge an amplifizierter Kras-DNA
beobachtet (Bahnen 10, 11 bzw. 12). Nur eine leichte Erhöhung der
Kras-Bandenintensität
ist zwischen 0 mM EDTA und 76 mM oder 96 mM EDTA zu sehen, was nur
eine leichte Erhöhung
der Menge an Kras-DNA
bei hemmenden Konzentrationen an EDTA repräsentiert.
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Die
Bahnen 1 bis 3 sowie die Bahnen 13 bis 15 repräsentieren Proben von amplifizierter
Kras-DNA, die keinem homogenisierten Stuhl-Überstand ausgesetzt wurde.
Wie erwartet zeigen jene Kontrollbahnen eine Bande gleicher Intensität über die
Kras-DNA repräsentierenden
Bahnen. Die Bahnen 16 und 17 sind negative Kontrollen und zeigen,
wie erwartet, keine Kras-repräsentierende
Bande, was anzeigt, dass jegliche beobachtete Kras-DNA von abgefangener
DNA und nicht von einer Verunreinigung bedingt ist. Bahn 18 ist
eine negative Kontrolle und hat, wie erwartet, keine das Kras-Gen
repräsentierende
Bande, was anzeigt, dass die PCR-Produkte aus der Probe und nicht
von einer Verunreinigung sind. Die Bahnen 19 bis 21 sind positive
Kontrollen, bei denen 50 pg, 100 pg oder 200 pg menschliche DNA
bei einem Hintergrund von E. coli-DNA amplifiziert werden, was anzeigt,
dass menschliche DNA in diesem Modellsystem bei einem E. coli-Hintergrund amplifiziert
werden kann. Bahn 22 schließlich
ist eine Molekulargewicht-Markersubstanz.
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In
einem dritten Experiment wurde dasselbe Protokoll verwendet wie
in dem zweiten Experiment mit der Ausnahme, dass nach dem Abfangen
zu jeder Probe menschliche genomische DNA zugegeben wurde. Kras-DNA
wurde wiederum durch PCR amplifiziert. So war ein Überschuss
an Matrizen-DNA für
die PCR verfügbar.
Dieses Experiment demonstrierte, dass die variierenden Grade an
PCR-Amplifizierung
in dem zweiten Experiment nicht daran lagen, dass EDTA mit normaler
PCR wechselwirkte oder sie verstärkte,
sondern an variierenden Gehalten an zur Amplifizierung verfügbarer Matrizen-DNA
lagen, die sich aus verschiedenen Graden von DNA-Abbau-Hemmung durch
EDTA ergaben. 4 zeigt die Ergebnisse dieses
Experiments. Die Lage der Bande (oder ihr Fehlen), die Kras repräsentiert,
ist mit einem Pfeil identifiziert. Die Bahnen 1 bis 6 und 8 bis
13 entsprechen den Bahnen 1 bis 12 in dem zweiten Experiment (d.h.
die Bahnen 1 bis 3 waren Kontrollen, die Bahnen 4 bis 6 und 8 bis
10 waren überschüssige Kras-DNA, die in Proben
amplifiziert wurde, die homogenisiertem Stuhl-Überstand aus Stuhl, der in
0 mM, 16 mM oder 96 mM EDTA homogenisiert worden war, ausgesetzt
wurden, und die Bahnen 11 bis 13 waren überschüssige Kras-DNA, die in Proben
amplifiziert wurde, die homogenisiertem Stuhl-Überstand aus Stuhl mit hochgradiger
Unversehrtheit, der in 0 mM, 16 mM oder 96 mM EDTA homogenisiert
worden war, ausgesetzt wurden). Wie erwartet, zeigen die Bahnen
1 bis 6 und 8 bis 13 ein PCR-Produkt von grob gleicher Intensität, weil
ein Überschuss
an Matrizen-DNA verfügbar
ist. Es gibt keine Wechselwirkung mit oder Verstärkung von normaler PCR durch
EDTA. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die variierenden Grade an PCR-Amplifizierung
in den Proben mit 0 mM, 16 mM oder 96 mM EDTA in dem zweiten Experiment
an variierenden Gehalten an Matrizen-DNA und nicht an Inhibitor
lagen. Bahn 14 zeigt eine Probe von menschlicher genomischer DNA.
Die Bahnen 15 bis 18 sind dieselben Kontrollen wie die Bahnen 17
und 19 bis 21 in dem zweiten Experiment.
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Aus
den oben beschriebenen experimentellen Daten wurde die Menge an
EDTA berechnet, die zur Hemmung von DNase erforderlich ist. Die
Konzentration an EDTA in den verschiedenen Puffern, die in den drei
Experimenten verwendet wurden, wurde als Gramm EDTA pro Gramm Stuhl
normiert. Allgemein wurde die Konzentration an EDTA mit dem Molekulargewicht
von EDTA und mit dem Puffervolumen, in dem der Stuhl homogenisiert
wurde, multipliziert. Das Produkt wurde durch die Menge an Stuhl,
die homogenisiert wurde, dividiert. Beispielsweise wurden die folgenden
Gleichungen zur Normierung der EDTA-Konzentration verwendet.
Für 16 mM
EDTA (Vergleich): (0,016 EDTA M/L × 372,2
g/M × 0,035
L) + 5 g = 0,042 g EDTA pro Gramm StuhlFür 96 mM EDTA: (0,096
EDTA M/L × 372,2
g/M × 0,035
L) + 5 g = 0,250 g EDTA pro Gramm Stuhl
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So
sollten für
irgendeine Menge an zu homogenisierendem Stuhl mindestens 0,250
g EDTA pro Gramm Stuhl in dem Homogenisierungspuffer verwendet werden,
um die Ausbeute an DNA zu maximieren. Der EDTA-Bereich, der verwendet
werden kann, beträgt
von 0,250 g EDTA pro Gramm Stuhl bis etwa 0,782 g EDTA pro Gramm
Stuhl. Bevorzugter werden 0,250 g EDTA pro Gramm Stuhl bis etwa
0,521 g EDTA pro Gramm Stuhl verwendet. Am meisten bevorzugt werden
etwa 0,391 g EDTA pro Gramm Stuhl verwendet.
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Diese
Berechnungen zeigen an, dass bei üblicherweise verwendeten Puffervolumina
und Stuhlmengen die Menge an in der homogenisierten Probe vorhandener
EDTA ein wichtigerer Faktor als die Endkonzentration von EDTA in
der homogenisierten Probe ist. An einem gewissen Punkt jedoch kann,
wie ein Fachmann erkennt, wenn auch die Menge an EDTA in einem gegebenen
Volumen dieselbe bleibt, das Volumen so groß werden, dass die Wirkung
von EDTA auf die DNA-Unversehrtheit
verwässert
wird. Bei der Untersuchung einer Stuhlprobe innerhalb der üblicherweise
verwendeten Parameter ist dieser Verwässerungseffekt nicht zu sehen.
In alternativen Ausführungsformen
ist die Konzentration von EDTA jedoch ein relevanter Faktor. In
diesen Ausführungsformen
sind von etwa 16 mM EDTA bis etwa 300 mM EDTA brauchbar. Bevorzugter
sind von etwa 100 mM EDTA bis 200 mM EDTA brauchbar. Am meisten
bevorzugt sind etwa 150 mM EDTA brauchbar.
