WO2010054639A2 - Verfahren zum sammeln von mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten - Google Patents

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WO2010054639A2
WO2010054639A2 PCT/DE2009/001594 DE2009001594W WO2010054639A2 WO 2010054639 A2 WO2010054639 A2 WO 2010054639A2 DE 2009001594 W DE2009001594 W DE 2009001594W WO 2010054639 A2 WO2010054639 A2 WO 2010054639A2
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Hanns-Christian Tillmann
Wolfgang Greb
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Eucro European Contract Research Gmbh & Co. Kg
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to a method for collecting oral mucosal cells and / or cell fragments or DNA or RNA.
  • DNA or RNA is usually carried out from cell material. In many cases, if enough cells could not be isolated, it is necessary to multiply the nucleic acids by means of PCR, etc.
  • Various studies can be performed on DNA and RNA isolated from collected cells and / or cell fragments. These include diagnostic methods for risk analysis for disease probabilities or to initiate or optimize drug therapy.
  • DNA can be used to make genetic polymorphisms for genealogical or paternity testing. Also for purely informative purposes, the DNA can be recovered, extracted and examined. Business models of several companies are based on the curiosity of humans in the decoding of their own genetic material (for example, 23andme, USA). Again, the method described uses.
  • RNA transcription patterns helps to differentiate between different physiological and pathophysiological states. Important examples here are the study of RNA expression patterns in tumors, which allow an individualized, adapted to the specific tumor pharmacotherapy.
  • DNA and RNA analysis can be used to draw conclusions about life habits and circumstances as well as health-promoting and harmful factors to which a person is exposed.
  • nucleic acids For example, human DNA can be isolated from microbial DNA by using specific primers (defined oligonucleotides) be differentiated. Furthermore, it is possible to distinguish between different microbial species by means of other defined primers.
  • Saliva which contains cells and cell material from the oral mucosa, is also suitable for obtaining cell material.
  • Chewing gums are known in the prior art in which saliva is used for diagnostic purposes.
  • DE 36 32 133 z. B. discloses a chewable mass containing a suitable for diagnostic purposes material that reacts upon contact with a saliva in the normal person normally not or in higher or lower concentration present substance with a characteristic color and / or taste change.
  • WO 01/21156 a pharmaceutical chewing gum is disclosed which is used for the continuous delivery of a medicament.
  • This chewing gum contains a drug that is released into the oral cavity of the patient as the chewing gum is being chewed, and continuous chewing establishes a fluid pressure that causes the drug to enter the systemic system of the patient through the oral mucosa.
  • the present invention accordingly provides a method for collecting oral mucosa cells and / or cell fragments of patients (test person / human) in which the human or patient chews a water-insoluble, indigestible gum, the oral mucosal cells and / or cell fragments and / or DNA and / or RNA or the fragments thereof are taken up by the chewing mass during the chewing process, and the recorded cells and / or cell fragments can be separated from the chewing mass after completion of the chewing process.
  • the method according to the invention it is possible to collect cells in a simple and uncomplicated way.
  • the cells / cell fragments can be used to recover DNA, DNA fragments, RNA, RNA fragments, cell components, human cells, bacteria, fungi, protozoa and viruses, and for other analytical purposes.
  • the method according to the invention can serve to optimize an individual therapy by drugs with respect to dose, type and quality of the active ingredients used.
  • the method can be used for the detection of gene polymorphisms, such as the diagnosis of individual characteristics, as well as diseases and gene expression patterns that allow identification of the person as well as their endangerment by the environment, diseases or therapeutic measures.
  • DNA or RNA is used in the present application, not only the complete DNA or RNA but also DNA fragments or RNA fragments are meant.
  • the recovered cells and / or cell fragments can be separated from the chewing gum in a manner known per se, for example by rinsing or extraction of the chewing gum with water or another solvent or solvent mixtures.
  • organic solvents are alcohols (methanol, ethanol, isopropanol), acetone, DMSO, DMF etc. which are also used in a mixture with water.
  • the solvent or mixture may contain surfactants, enzymes and other substances that assist in separating the cellular material from the chewing gum.
  • the cells and / or cell fragments obtained are subjected to DNA extraction / RNA extraction in a subsequent method step.
  • the extraction can be carried out in a manner known per se by first breaking up the isolated cells and separating and purifying the DNA and / or RNA from the cell debris and other substances.
  • the disruption of the cells can be carried out mechanically, by heating, by enzymatic dissolution or by chemical dissolution by means of surfactants.
  • the purification of the DNA or the RNA is also A is well known to the person skilled in the art and can be effected, for example, by precipitation with alcohol, phenol / chloroform or salt or saline solution, and separation by chromatography is also possible.
  • the resulting solution can be concentrated, then the DNA can be separated by centrifugation.
  • DNA extraction and processing can also be done according to a Qiagen protocol, as described in http://www1.qiaqen.com/literature/protocols/pdf/ma47.pdf.
  • Another object of the present invention relates to a method for obtaining DNA from oral mucosal cells and / or cell fragments, in which the person whose DNA is to be extracted, chewing a water-insoluble, indigestible gum and after completion of the chewing process the cells and / or cell fragments of the gum are separated and the DNA and / or RNA is extracted from the cells in a manner known per se.
  • a further subject of the present invention relates to a method for obtaining DNA or RNA from oral mucosal cells and / or cell fragments, in which the person whose DNA or RNA is to be extracted chews a water-insoluble, indigestible gum into which specific oligonucleotides (primers) are integrated.
  • chewing gum a conventional chewing gum or bubble gum can be used in the process according to the invention.
  • a chewing gum which can be used, for example, is disclosed in international patent application WO 01/21156.
  • the chewing gum used usually contains a water-insoluble chewing gum base that becomes plastic when it is chewed, a water-soluble portion and possibly flavorings.
  • the water-soluble portion occurs during chewing with the optionally present flavors.
  • the insoluble chewing gum base usually contains elastomers, resins, fats and oils, plasticizers and inorganic fillers. Further, the chewing gum base may contain waxes.
  • the insoluble chewing gum base may be from about 5 to about 95 weight percent, based on the total chewing gum, more preferably from 10 to about 50 weight percent, and preferably from 25 to 35 weight percent.
  • the chewing gum base contains about 20 to 60 weight percent synthetic elastomer, from 0 to about 30 weight percent natural elastomer and 5 to 55 weight percent elastomeric plasticizer, 4 to 35 weight percent filler, 5 to 35 weight percent plasticizer and possibly small amounts ( up to 1% by weight) of various ingredients such as dyes, antioxidants, antimicrobial ingredients, etc.
  • the water-insoluble fraction of the chewing gum base may contain, in addition to the already mentioned flavoring agents, dyes and antioxidants, also plasticizers, emulsifiers, water-soluble fillers, water-soluble antioxidants and other antimicrobial substances, acidulants and other conventional ingredients, as well as preservatives stabilizing the cells or cell fragments.
  • the gum used in the present invention contains a dye or colorant which undergoes a color change during chewing, thus indicating the end of the masticatory process, i. the sufficient cell material and / or DNA or RNA was recorded.
  • a dye or colorant which undergoes a color change during chewing, thus indicating the end of the masticatory process, i. the sufficient cell material and / or DNA or RNA was recorded.
  • coloring substances include, for example, those used in food production or also enzymatic components or other substances which indicate protein binding.
  • the color change should be displayed after a period of about 30 seconds to 3 minutes.
  • the chewing mass contains flavors that change during the chewing process such that the end of the chewing process is indicated by a change in the taste of the chewing gum, a change in taste including release of acid or the like. which is perceived by the chewing person / patient.
  • the recovery of cell / cell fragments and / or DNA or RNA can be optimized if the chewing mass contains abrasives.
  • abrasives cause increased release of cells and cell material from the oral mucosa and binding in the chewing gum and can themselves serve as absorbents.
  • These include in particular sparingly soluble substances such as silica, (complex) silicates, silica gels, glass, aluminum oxides, aluminum silicates, powdered plastics, titanium dioxide, talc, sparingly soluble calcium compounds such as calcium phosphate, hydroxyapatite, calcium carbonate, sparingly soluble phosphates and any other sparingly soluble salts are suitable for food.
  • the abrasives can be present in an amount of between 0.1 and 10 percent by weight, based on the total masticatory mass. It is also possible to use mixtures of abrasives.
  • the chewing gum according to the invention preferably contains one or more antimicrobial active substances. and / or antioxidant ingredient (s).
  • This other ingredient (s) should preferably be food grade, which does not destroy the cells themselves.
  • An example of a suitable antimicrobial ingredient is cinnamon oil.
  • the gum may contain components which stabilize the DNA and / or RNA, for example suitable buffer systems for the pH. If specific RNA is to be obtained, it is preferable to use a chewing gum which contains sodium citrate as a pH-stabilizing component. Thus, the RNA is stabilized in a system of suitable pH.
  • the chewing gum should be chewed for such a period of time that a sufficient number of oral mucosal cells and / or cell fragments are taken up. A period of 30 seconds to 3 minutes has been found suitable. In order to take up a sufficient amount of cells, a chewing gum of 1 to 4 grams, preferably 1 to 5 to 3 grams, has been found suitable.
  • the chewing gum applied with the oral mucosal cells and / or cell fragments can be stored for a certain time after completion of the chewing process.
  • the chewing gum is packaged by the patient / human and sent to the laboratory performing the DNA analysis.
  • the chewing mass is deep-frozen after completion of the chewing process.
  • the possible enzymatic degradation of DNA and / or RNA during storage or transport can be prevented.
  • the deep-freezing of the samples is particularly advantageous when RNA is to be isolated.
  • SNPs The corresponding sequences that are important, e.g. SNPs are determined in advance based on scientific evidence, consistent with the expected evidence of therapeutic options, metabolic transformation enzymes and their gene sequences.
  • the selective recognition of certain gene sequences may be in the foreground, because it contains the reference to the characteristic of these features which is typical in humans, especially in patients.
  • the process for the isolation of the genetic material, its purification and its analysis (individual genome analysis) for the investigation of gene polymorphisms is the subject of the invention.
  • Another object of the present invention is a method for performing a genetic analysis in which first oral mucosal cells and / or cell fragments are collected according to the method described above using a chewing gum, the cells and / or cell fragments separated from the chewing gum and the DNA in In a known manner, the DNA is analyzed analytically, and the results obtained from the analysis are evaluated.
  • results obtained from DNA analysis are used in many different areas of medicine, for example in the determination of disease-predisposing genetic factors, in drug therapy, in particular in the optimization of the selection of suitable drugs and the adaptation of the appropriate dose, in prenatal diagnosis , Transplantation medicine and in medical research, for example in the conduct of clinical trials, in forensics, genealogy and paternity tests, as well as not specifically earmarked analyzes and studies of the genome and / or parts of the genome, as in lifestyle applications.
  • Another object of the present invention relates to the use of a chewing gum containing chewing gum base and optionally other water-soluble ingredients for collecting oral mucosal cells and / or cell fragments.
  • the chewing gland contains specific primers (oligonucleotides) by means of which DNA and / or RNA can be selectively identified and recovered. This is followed by amplification of the DNA and / or RNA by known methods (e.g., PCR).
  • human DNA or RNA may be derived from non-human, e.g. microbial; Distinguish DNA / RNA and selectively win with the chewing gum.
  • primers can be used, as described in Labuhn et al. (The International Journal of Biological Markers, 2006).
  • DNA and / or RNA of pathogenic bacteria may e.g. using primers known to be used in the amplification of bacterial DNA (e.g., the CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG sense primer, also used in the so-called Looxster® method of SIRS-Lab GmbH).
  • primers known to be used in the amplification of bacterial DNA e.g., the CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG sense primer, also used in the so-called Looxster® method of SIRS-Lab GmbH.
  • Another object of the present invention relates to a drug kit consisting of a drug and a chewing gum, which is used for collecting oral mucosal cells and / or cell fragments.
  • the drug kit makes it possible to individually dose the drug to be administered if the diagnosis has already been completed.
  • the separated oral mucosal cells and / or cell fragments are separated as described above and subjected to gene analysis, wherein an individual gene expression analysis for therapy optimization is particularly useful.
  • studies on certain so-called single nucleotide polymorphisms (SNPs) may be important.
  • certain patterns of expression of, for example, cytochrome P450 oxidases can shed light on the extent to which a substance is metabolized.
  • tamoxifen In the case of tamoxifen, it is thus possible to determine, based on allelic combinations obtained by SNP analysis, to what extent tamoxifen is converted into the active metabolite endoxifen, and thus whether a drug therapy with tamoxifen makes sense or which dose range makes sense.
  • tamoxifen In the attached Figure is a flow chart illustrating how the cells and cell fragments obtained by the method of the invention can be supplied to medical diagnostics and therapy in a soft manner.
  • the patient buys the active ingredient together with an indicator system which contains the gum used according to the invention.
  • the patient chews the chewing gum to recover oral mucosal cells and / or cell fragments.
  • the chewing takes place after a predetermined time, after completion of the chewing process, the chewing mass is sealed, usually in a plastic container. The sealed and labeled mass is then sent to the analyzing laboratory.
  • the cells and / or cell fragments are separated from the chewing gum and analyzed for the specific properties of the cells with respect to the drug tamoxifen.
  • the result of this analysis is forwarded by the laboratory to the attending physician who, based on the results of the analysis, gives an individual dosage recommendation to the patient.
  • the talc used is used to scrape off the chewing masses, in order to avoid the sticking of the mass during storage.
  • Candida albicans DNA 5 1 -CGCCTCTTGATGGTGATGAT-3 I (disclosed in US Pat

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Abstract

Es wird ein Verfahren zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten von Patienten (Proband/Mensch) beansprucht, in welchen der Mensch oder Patient eine wasserunlösliche, unverdauliche Kaumasse kaut, wobei die Mundschleimhautzellen und/oder DNA und/oder RNA und/oder deren Fragmente während des Kauvorgangs von der Kaumasse aufgenommen werden und die aufgenommenen Zellen und/oder Zellfragmente nach Abschluss des Kauvorgangs von der Kaumasse abgetrennt werden können. Die Zellen/Zellfragmente können zur Gewinnung von DNA, Zellbestandteilen, Human-Zellen, Bakterien und Viren und weitere analytische Zwecke eingesetzt werden.

Description

Verfahren zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfraqmenten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten bzw. DNA oder RNA.
Die Gewinnung von DNA oder RNA erfolgt üblicherweise aus Zellmaterial. In vielen Fällen ist es erforderlich, sofern nicht genügend Zellen isoliert werden konnten, die Nukleinsäuren mittels PCR etc. zu vermehren. Mit aus gesammelten Zellen und/oder Zellfragmenten isolierter DNA und RNA können verschiedene Untersuchungen durchgeführt werden. Dazu gehören diagnostische Verfahren zur Risikoanalyse für Erkrankungswahrscheinlichkeiten oder zum Beginn oder zur Optimierung einer Arzneimitteltherapie. Auch können anhand gewonnener DNA Genpolymorphismen für genealogische Untersuchungen oder Vaterschaftstests herangezogen werden. Auch für rein informative Zwecke kann die DNA gewonnen, extrahiert und untersucht werden. Geschäftsmodelle mehrerer Firmen basieren auf der Neugier des Menschen an der Entschlüsselung des eigenen Erbgutes (z.B. 23andme, USA). Auch hier findet das beschriebene Verfahren Anwendung.
Untersuchungen der RNA geben Aufschluss über die Transkription der DNA. In der Tumordiagnostik, bei metabolischen Erkrankungen, bei Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, bei Infektionskrankheiten hilft die Analyse der RNA Transkriptionsmuster, verschiedene physiologische und pathophysiologische Zustände voneinander abzugrenzen. Wichtige Beispiele sind hier die Untersuchung von RNA Expressionmustern in Tumoren, die eine individualisierte, auf den spezifischen Tumor angepasste Pharmakotherapie ermöglichen. Auch können mittels DNA und RNA Analyse Rückschlüsse auf Lebensgewohnheiten und -umstände sowie gesundheitsfördernde und -schädigende Faktoren, denen eine Person ausgesetzt ist, gezogen werden. Diese Aspekte werden heute unter dem Fachbegriff der Epigenetik zusammengefasst.
Da zwischen den Genomen unterschiedlicher Spezies klar charakterisierbare Unterschied bestehen lässt sich anhand von Nukleinsäuren deren Spezies Herkunft bestimmen. So kann z.B. humane DNA anhand spezieller Primer (definierte Oligonukleotide) von mikrobieller DNA unterschieden werden. Des weiteren kann mittels anderer definierter Primer zwischen verschiedenen mikrobiellen Spezies unterschieden werden.
Die Sammlung von Zellen und/oder Zellfragmenten mit kompakten Kaumassen sowie die Extraktion von DNA oder RNA und deren Aufarbeitung und Analytik sind Teil der vorligenden Erfindung.
Zur Gewinnung von Zellmaterial eignet sich unter anderem auch Speichel, in welchem sich Zellen und Zellmaterial aus der Mundschleimhaut befindet.
Aus dem Stand der Technik sind Kaugummis bekannt, in welchen Speichel zu Diagnosezwecken verwendet wird. In der DE 36 32 133 wird z. B. eine kaubare Masse offenbart, die ein für Diagnosezwecke geeignetes Material enthält, das beim Kontakt mit einem im Speichel des gesunden Menschen normalerweise nicht oder in höherer oder geringerer Konzentration vorhandenen Stoffes mit einer charakteristischen Färb- und/oder Geschmacksänderung reagiert.
In der WO 01/21156 wird ein pharmazeutisches Kaugummi offenbart, welches zur kontinuierlichen Abgabe eines Medikaments eingesetzt wird. Dieses Kaugummi enthält ein Medikament, das beim Kauen des Kaugummis in die Mundhöhle des Patienten freigesetzt wird und durch das kontinuierliche Kauen wird ein Flüssigkeitsdruck aufgebaut, der bewirkt, dass das Arzneimittel über die Mundschleimhaut in das systemische System des Patienten eintritt.
Aus dem Stand der Technik sind Verfahren zum Sammeln von Mundschleimhautzellen bekannt, mit welchem das Zellmaterial mit Hilfe von Wattestäbchen oder Zellabstreifer entnommen werden. Die Hilfsmittel können in vielen Fällen nicht vom Patienten selbst eingesetzt werden. Insbesondere bei kranken und älteren Menschen besteht die Gefahr, dass, wenn diese die Hilfmittel ohne Unterstützung oder Hilfe von medizinischem Personal verwenden, nicht ausreichend Zellen einschließlich Speichel entnommen werden und insgesamt zuwenig Zellen für die medizinische oder genetischen Analyse und Diagnostik vorliegen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten von Patienten (Proband/Mensch), in welchen der Mensch oder Patient eine wasserunlösliche, unverdauliche Kaumasse kaut, wobei die Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmente und/oder DNA und/oder RNA bzw. deren Fragmente während des Kauvorgangs von der Kaumasse aufgenommen werden und die aufgenommenen Zellen und/oder Zellfragmente nach Abschluss des Kauvorgangs von der Kaumasse abgetrennt werden können.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, auf einfache und unkomplizierte Weise Zellen zu sammeln. Die Zellen/Zellfragmente können zur Gewinnung von DNA, DNA- Fragementen, RNA, RNA-Fragmenten, Zellbestandteilen, Human-Zellen, Bakterien, Pilze, Protozoen und Viren und weitere analytische Zwecke eingesetzt werden. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren dazu dienen, eine individuelle Therapie durch Arzneimittel in Bezug auf Dosis, Art und Qualität der verwendeten Wirkstoffe hin zu optimieren. Das Verfahren kann zur Erkennung von Genpolymorphismen benutzt werden, so zum Zwecke der Diagnostik individueller Eigenschaften, sowie von Erkrankungen sowie Genexpressionsmustern, die eine Identifikation der Person als auch ihrer Gefährdung durch Umwelt, Erkrankungen oder auch therapeutische Maßnahmen ermöglichen.
Soweit in der vorliegenden Anmeldung der Begriff DNA bzw. RNA verwendet wird, sind nicht nur die vollständige DNA bzw. RNA sondern auch DNA-Fragmente bzw. RNA-Fragmente gemeint.
Durch das Kauen von Kaugummi werden die Zellen und Zellfragmente schnell und effizient über ein nicht-invasives Verfahren gesammelt.
Die gewonnenen Zellen und/oder Zellfragmente können in an sich bekannter Weise aus der Kaumasse abgetrennt werden, beispielsweise durch Spülen oder Extraktion der Kaumasse mit Wasser oder einem anderen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemischen. Als organische Lösungsmittel sind Alkohole (Methanol, Ethanol, iso-Propanol), Aceton, DMSO, DMF etc. die auch im Gemisch mit Wasser eingesetzt werden. Darüber hinaus kann das Lösungsmittel bzw. -gemisch Tenside, Enzyme und andere Substanzen enthalten, die das Abtrennen der des Zellmaterials von der Kaumasse unterstützen.
In einer möglichen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung werden die erhaltenen Zellen und/oder Zellfragmente in einem nachfolgenden Verfahrensschritt einer DNA-Extraktion/RNA- Extraktion unterworfen. Die Extraktion kann in an sich bekannter Weise erfolgen, indem die isolierten Zellen zunächst aufgebrochen werden und die DNA und/oder RNA von den Zelltrümmern und anderen Stoffen abgetrennt und gereinigt wird. Das Aufbrechen der Zellen kann mechanisch, durch Erhitzen, durch enzymatisches Auflösen oder durch chemisches Auflösen mittels Tensiden erfolgen. Die Aufreinigung der DNA bzw. der RNA ist ebenfalls - A - dem Fachmann gut bekannt und kann beispielsweise durch Fällen mit Alkohol, Phenol/Chloroform oder Salz bzw. Salzlösung erfolgen, auch eine Auftrennung durch Chromatographie ist möglich.
Die erhaltene Lösung kann aufkonzentriert werden, anschließend kann die DNA durch Zentrifugieren abgetrennt werden.
Die DNA Extraktion und -Weiterverarbeitung kann im Wesentlichen auch nach einem Protokoll der Firma Qiagen erfolgen, wie es in http://www1.qiaqen.com/literature/protocols/pdf/ma47.pdf beschrieben wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen von DNA aus Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten, in welchem die Person, deren DNA zu extrahieren ist, eine wasserunlösliche, unverdauliche Kaumasse kaut und nach Abschluss des Kauvorgangs die Zellen und/oder Zellfragmente von der Kaumasse abgetrennt werden und die DNA und/oder RNA in an sich bekannter Weise aus den Zellen extrahiert wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen von DNA oder RNA aus Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten, in welchem die Person, deren DNA oder RNA zu extrahieren ist, eine wasserunlösliche, unverdauliche Kaumasse kaut, in die spezifische Oligonukleotide (Primer) integriert sind.
Als Kaumasse kann im erfindungsgemäßen Verfahren ein übliches Kaugummi oder Bubblegum verwendet werden. Eine Kaumasse, die beispielsweise eingesetzt werden kann, ist in der internationalen Patentanmeldung WO 01/21156 offenbart.
Die verwendete Kaumasse enthält üblicherweise eine wasserunlösliche, beim Kauen plastisch werdende Kaugummi-Base, einen wasserlöslichen Anteil und ggf. Geschmacksstoffe. Der wasserlösliche Anteil tritt während des Kauens mit den optional vorhandenen Geschmacksstoffen aus. Die unlösliche Kaugummi-Base enthält üblicherweise Elastomere, Harze, Fette und öle, Weichmacher und anorganische Füllstoffe. Ferner kann die Kaugummi-Base Wachse enthalten.
Die unlösliche Kaugummi-Base kann etwa 5 bis etwa 95 Gewichtsprozent, bezogen auf die gesamte Kaumasse, insbesondere von 10 bis etwa 50 Gewichtsprozent und bevorzugt 25 bis 35 Gewichtsprozent betragen. In einer möglichen Ausführungsform enthält die Kaugummi-Base etwa 20 bis 60 Gewichtsprozent synthetisches Elastomer, von 0 bis etwa 30 Gewichtsprozent natürliches Elastomer und 5 bis 55 Gewichtsprozent elastomeren Weichmacher, 4 bis 35 Gewichtsprozent Füllstoff, 5 bis 35 Gewichtsprozent Weichmacher und ggf. geringe Mengen (bis zu 1 Gewichtsprozent) verschiedene Inhaltsstoffe, wie Farbstoffe, Antioxidantien, antimikrobiell wirkende Inhaltsstoffe usw.
Der wasserunlösliche Anteil der Kaugummi-Base kann neben den bereits genannten Geschmacksstoffen, Farbstoffen und Antioxidantien, auch Weichmacher, Emulgiermittel, wasserlösliche Füllstoffe, wasserlösliche Antioxidantien und andere antimikrobiell wirkende Substanzen, Säuerungsmittel und weitere übliche Inhaltsstoffe sowie die Zellen bzw. Zellfragmente stabilisierende Konservierungsmittel enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäß verwendete Kaumasse einen Farbstoff bzw. eine farbgebende Substanz, die während des Kauens einen Farbwechsel vollzieht und auf diese Weise das Ende des Kauvorgangs anzeigt, d.h. das ausreichend Zellmaterial und/oder DNA bzw. RNA aufgenommen wurde. Zu den farbgebenden Substanzen können z. B. zählen solche, die in der Lebensmittelherstellung eingesetzt werden oder auch enzymatische Komponenten oder andere Substanzen, die die Proteinbindung anzeigen. Die Anzeige des Farbwechsels sollte nach einem Zeitraum von ca. 30 Sek. bis 3 Minuten erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform enthält die Kaumasse Geschmacksstoffe, die sich während des Kauvorgangs derart verändern, dass das Ende des Kauvorgangs durch eine Änderung im Geschmack des Kaumasse angezeigt wird, wobei eine Änderung des Geschmacks auch eine Freisetzung von Säure o.a. sein kann, die vom kauenden Menschen/Patienten wahrgenommen wird.
Die Gewinnung von Zellen-/Zellfragmenten und/oder DNA bzw. RNA kann optimiert werden, wenn die Kaumasse Abrasivstoffe enthält. Diese Abrasivstoffe bewirken eine verstärkte Freisetzung von Zellen und Zellmaterial von der Mundschleimhaut und zur Binding im Kaugummi und können selbst auch als Absorbentien dienen. Hierzu zählen insbesondere schwerlösliche Stoffe, wie Siliciumoxid, (komlexe) Silikate, Kieselgele, Glas, Aluminiumoxide, Aluminiumsilikate, pulverförmige Kunststoffe, Titandioxid, Talkum, schwerlösliche Calciumverbindungen, wie Calcium-phosphat, Hydroxylapatit, Calciumcarbonat, schwerlösliche Phosphate sowie beliebige andere schwerlösliche Salze, die lebensmittelgeeignet sind. Die Abrasivstoffe können in einer Menge zwischen 0,1 bis 10 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtkaumasse, enthalten sind. Es können auch Gemische von Abrasivstoffen eingestzt werden.
Um die von der Kaumasse aufgenommenen Zellen bei Lagerung und/oder Transport zu stabilisieren und vor Zerstörung durch äußere Einflüsse, wie durch bakterielle Kontamination und ggf. durch Inhaltstoffe der Luft, zu schützen, enthält die erfindungsgemäße Kaumasse vorzugsweise einen oder mehrere antimikrobiell wirkende(n) und/oder antioxidativ wirkende(n) lnhaltsstoff(e). Diese(r) weitere(n) lnhaltsstoff(e) sollte vorzugsweise lebensmittelgeeignet sein, die Zellen selbst nicht zerstören. Ein Beispiel für einen geeigneten antimikrobiell wirkenden Inhaltsstoff ist Zimtöl.
Als weitere Inhaltsstoffe kann die Kaumasse Komponenten enthalten, die die DNA und/oder RNA stabilisieren, beispielseweise geeignete Puffersysteme für den pH-Wert. Soll spezifisch RNA gewonnen werden, ist die Verwendung einer Kaumasse bevorzugt, die als eine den pH- Wert stabilisierende Komponente Natriumeitrat enthält. So wird die RNA in einem System mit geeignetem pH stabilisiert.
Die Kaumasse sollte über einen solchen Zeitraum gekaut werden, dass eine ausreichende Anzahl von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten aufgenommen wird. Ein Zeitraum von 30 Sekunden bis 3 Minuten hat sich als geeignet erwiesen. Um eine ausreichende Menge an Zellen aufzunehmen hat sich eine Kaumasse von 1 bis 4 Gramm, vorzugsweise 1 ,5 - 3 Gramm, als geeignet erwiesen.
Die mit den Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten beauflagte Kaumasse kann nach Abschluss des Kauvorgangs gewisse Zeit gelagert werden. Üblicherweise wird das Kaugummi vom Patienten / Menschen verpackt und an das Labor, welches die DNA-Analyse durchführt, übermittelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kaumasse nach Abschluss des Kauvorgangs tiefgefroren. Dadurch kann der mögliche enzymatischen Abbau von DNA und/oder RNA während der Lagerung bzw. des Transports verhindert werden. Das Tieffrieren der Proben ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn RNA isoliert werden soll.
In einer möglichen Ausführungsform kann das nach einer gewissen Zeit des Kauens vom
Probanden gewonnene Kaugummi in einem üblichen Puffer extra lysiert werden, so dass die DNA und/oder RNA nach üblichen Methoden isoliert, vermehrt (simplifiziert), und schließlich hinsichtich bestimmter Abschnitte sequenziert werden kann.
Die entsprechenden Sequenzen, auf die es ankommt z.B. SNPs, werden vorab auf Basis wissenschaftlicher Erkenntnisse festgelegt, passend zu dem zu erwartenden Nachweis von Therapiemöglichkeiten, metabolischer Umwandlungsenzyme und deren Gensequenzen.
Zum Beispiel kann die selektive Erkennung bestimmter Gensequenzen im Vordergrund stehen, denn sie enthält den Hinweis auf die im Menschen insbesondere in Patienten typische Ausprägung dieser Merkmale. Das Verfahren zur Isolierung des genetischen Materials, seine Aufreinigung und seine Analyse (individuelle Genomanalyse) zur Untersuchung von Genpolymorphismen ist Gegenstand der Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Durchführen einer genetischen Analyse, in welcher zunächst Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmente gemäß dem oben beschriebenen Verfahren mittels einer Kaumasse gesammelt werden, die Zellen und/oder Zellfragmente von der Kaumasse abgetrennt und die DNA in an sich bekannter Weise extrahiert wird, in einem nachfolgenden Schritt die DNA analytisch untersucht und die aus der Analyse erhaltenen Ergebnisse ausgewertet werden.
Zur Isolierung von DNA und Lyse von Extrakten sind die üblichen Methoden zur Freisetzung brauchbar, wie Ultraschall, Mörser und Pistill, schütteln sowie Auftaumethoden geeignet. Ferner sind auch kommerzielle Systeme, wie sie von bestimmten Firmen angeboten werden, z.B. Qiagen und HoffmannLa Roche einsetzbar zum Isolieren, Binden und Waschen des Analysematerials. Gegebenenfalls kann auch ein enzymatischer Verdauungsschritt verwendet werden. Zur Analyse von DNA-Sequenzen können Standardmethoden herangezogen werden, die entweder mit Hilfe von entsprechenden Automaten oder auch Biochip-Methoden verfügbar sind. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt.
Die aus der DNA-Analyse gewonnenen Ergebnisse finden in den unterschiedlichsten Bereichen der Medizin Anwendung, beispielsweise bei der Bestimmung von krankheitsprädisponierenden genetischen Faktoren, bei der Arzneimitteltherapie, hier insbesondere bei der Optimierung der Auswahl an geeigneten Medikamenten und der Anpassung der geeigneten Dosis, in der Pränataldiagnostik, Transplantationsmedizin und in der medizinischen Forschung, beispielsweise bei der Durchführung von klinischen Studien, in der Forensik, bei genealogischen Untersuchungen und Vaterschaftstests sowie bei nicht konkret zweckgebundenen Analysen und Untersuchungen des Genoms und/oder Teilen des Genoms, wie bei Lifestyle-Anwendungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung einer Kaumasse, enthaltend Kaugummi-Base und ggf. weitere wasserlösliche Inhaltsstoffe zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder Zellfragmenten.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Kaumasse spezifische Primer (Oligonukleotide), mit Hilfe derer selektiv DNA und/oder RNA identifiziert und gewonnen werden kann. Es folgt eine Amplifikation der DNA und/oder RNA mittels bekannter Methoden (z.B. PCR). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lässt sich so humane DNA bzw. RNA von nicht-humaner, also z.B. mikrobieller; DNA/RNA unterscheiden und selektiv mit der Kaumasse gewinnen. Dazu können Primer verwendet werden, wie sie in Labuhn et al. (The International Journal of Biological Markers, 2006) aufgeführt sind.
DNA und/oder RNA pathogener Bakterien kann z.B. unter Verwendung von Primern erfolgen, die bekanntermaßen bei der Amplifikation bakterieller DNA eingesetzt werden (z.B. der Sense-Primer CCA GCA GCC GCG GTA ATA CG, der auch im sogenannten Looxster® Verfahren der Firma SIRS-Lab GmbH verwendet wird).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Arzneimittel-Kit bestehend aus einem Arzneimittel und einer Kaumasse, die zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten dient.
Das Arzneimittel-Kit ermöglicht es, bei einer bereits abgeschlossenen Diagnose das zu verabreichende Medikament individuell zu dosieren. Die abgetrennten Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmente werden wie oben beschrieben abgetrennt und einer Genanalyse unterworfen, wobei eine individuelle Genexpressionsanalyse zur Therapieoptimierung besonders sinnvoll ist. Hier können insbesondere Untersuchungen zu bestimmten so genannten Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) wichtig sein. So können bestimmte Ausprägungsmuster z.B. von Cytochrom P450 Oxidasen Aufschluss darüber geben, in welchem Maße eine Substanz metabolisiert wird. Im Fall von Tamoxifen kann so anhand von Allelkombinationen, die durch SNP-Analyse gewonnen wird, ermittelt werden, in welchem Umfang Tamoxifen zum aktiven Metaboliten Endoxifen umgebaut wird, und somit, ob eine Arzneimitteltherapie mit Tamoxifen sinnvoll ist, bzw. welcher Dosisbereich sinnvoll ist. In der beigefügten Figur ist ein Fließdiagramm, in welchem dargestellt wird, auf weiche Weise die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Zellen und Zellfragmente der medizinischen Diagnostik und Therapie zugeführt werden können.
Üblicherweise existiert für den Patienten oder Menschen, der das erfindungsgemäße Verfahren anwenden soll, bereits eine Diagnose, vielfach ist auch bereits bekannt, mit welchem Medikament die Erkrankung behandelt werden kann. Im vorliegenden Fall wurde dem Patienten Tamoxifen, ein Cytostatikum und Antiestrogen, verordnet. Zu bestimmen ist noch die Dosis des Wirkstoffs, diese hängt von der spezifischen Konstitution des Patienten ab. In einem ersten Schritt kauft der Patient den Wirkstoff gemeinsam mit einem Indikatorsystem, welches die erfindungsgemäß verwendete Kaumasse enthält. Der Patient kaut das Kaugummi, um Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmente zu gewinnen. Das Kauen erfolgt nach einer vorgegebenen Zeit, nach Abschluss des Kauvorgangs wird die Kaumasse versiegelt, üblicherweise in einem Kunststoffbehälter. Die versiegelte und mit dem Namen versehene Masse wird anschließend an das analysierende Labor geschickt. In dem Labor werden die Zellen und/oder Zellfragmente von der Kaumasse abgetrennt und der Analyse hinsichtlich der spezifischen Eigenschaften der Zellen in Bezug auf den Wirkstoff Tamoxifen. Das Ergebnis dieser Analyse wird vom Labor an den behandelnden Arzt weitergeleitet, der aufgrund des Analyseergebnisses eine individuelle Dosierungsempfehlung an den Patienten gibt.
In den nachfolgenden Beispielen" sind beispielhafte Rezepturen für geeignete Kaumassen wiedergeben:
Beispiele
REZEPTUR 1 REZEPTUR 2
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
REZEPTUR 3 REZEPTUR 4
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Figure imgf000012_0002
REZEPTUR 5
Figure imgf000012_0003
REZEPTUR 6 REZEPTUR 7
Figure imgf000013_0001
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Das eingesetzte Talkum dient dazu, die Kaumassen abzupudem, um das Verkleben der Masse während der Lagerung zu vermeiden.
Beispiele für geeignete Primer:
Für bakterielle DNA: δ'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-S'
Für DNA von S. aureus: 5'-AGATGCACGT ACTGCTGAAA TGAG-3' (offenbart in
European Patent Application EP1082465)
Für DNA von P. aeruginosa: 5'-CTTCGATGCC CTGAGCGGTA TTC-3' (offenbart in
European Patent Application EP1082465)
Für DNA von E. coli: 5'-GTTCTGTGCA TATTGATGCC CGCG-3' (offenbart in
European Patent Application EP1082465)
Für DNA von Candida albicans: 51-CGCCTCTTGATGGTGATGAT-3I (offenbart in US Patent
Number 5,462,026) Für DNA von Aspergillus spez.: δ'-CGGCCCTTAAATAGCCCGGTC-S' (aus Melchers WJ, et al. J Clin Microbiol 1994)
Für humane DNA: 5'-CTTGCTCTTGGACAGGAACCA-S' (humaner ERa; aus
Labuhn M, et al. Int J Biol Markers, 2006) δ'-TGTCGAGCTCACAGCGTTTC-S' (humaner PgR; aus Labuhn M, et al. Int J Biol Markers, 2006)

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten von Patienten (Proband/Mensch), in welchem der Mensch oder Patient eine wasserunlösliche, unverdauliche Kaumasse kaut, wobei die Mundschleimhautzellen und/oder DNA und/oder RNA und/oder deren Fragmente während des Kauvorgangs von der Kaumasse aufgenommen werden und die Zellen und/oder Zellfragmente nach Abschluss des Kauvorgangs von der Kaumasse abgetrennt werden können.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten Zellen und/oder Zellfragmente einer DNA und/oder RNA-Extraktion unterworfen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kaumasse ausgewählt ist aus Kaugummi oder Bubble-Gum.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kaumasse ein die Zellen/Zellfragmente stabilisierendes Konservierungsmittel enthält.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kaumasse einen pH-Puffer, insbesonder Na-Citrat, enthält
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kaumasse über einen Zeitraum von 30 Sekunden bis 3 Minuten gekaut wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kaumasse einen Farbstoff enthält, welcher nach einer Kauzeit von 0,5 bis 3 Minuten einen Farbwechsel durchläuft.
8. Verfahren zum Gewinnen von DNA und/oder RNA aus Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten, in welchem die Person, deren DNA und/oder RNA zu extrahieren ist, eine wasserunlösliche, unverdauliche Kaumasse kaut und nach
Abschluss des Kauvorgangs die Zellen und/oder Zellfragmente und/oder DNA und/oder
RNA in an sich bekannter Weise isoliert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass in die Kaumassen spezifische Oligonukleotide (Primer) integriert sind.
10. Verfahren zum Durchführen einer genetischen Analyse, in welcher zunächst Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmente gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 gesammelt werden, die Zellen von der Kaumasse abgetrennt, der DNA- und/oder RNA -Extraktion unterworfen werden und eine DNA- und/oder RNA-Analyse durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine individuelle Genexpressions-Analyse durchgeführt wird.
12. Verwendung einer Kaumasse enthaltend Kaugummi-Base und ggf. weitere Inhaltsstoffe zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder DNA und/oder RNA und/oder deren Fragmente.
13. Arzneimittel-Kit, welches ein Arzneimittel und eine Kaumasse, die zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder DNA und/oder RNA und/oder deren Fragmente dient, enthält.
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