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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Sammeln von Mundschleimhautzellen
und/oder -zellfragmenten bzw. DNA.
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Die
Gewinnung von DNA erfolgt üblicherweise aus Zellmaterial.
In vielen Fällen ist es erforderlich, sofern nicht genügend
Zellen isoliert werden konnten, diese mittels PCR etc. zu vermehren.
Mit aus gesammelten Zellen und/oder Zellfragmenten isolierter DNA
können verschiedene Untersuchungen durchgeführt
werden. Dazu gehören diagnostische Verfahren zur Risikoanalyse
für Erkrankungswahrscheinlichkeiten oder zum Beginn oder
zur Optimierung einer Arzneimitteltherapie. Auch können
anhand gewonnener DNA Genpolymorphismen für genealogische
Untersuchungen oder Vaterschaftstests herangezogen werden. Auch
für rein informative Zwecke kann die DNA gewonnen, extrahiert
und untersucht werden. Geschäftsmodelle mehrerer Firmen
basieren auf der Neugier des Menschen an der Entschlüsselung
des eigenen Erbgutes (z. B. 23 andme, USA). Auch hier findet das
beschriebene Verfahren Anwendung. Die Sammlung von Zellen und/oder
Zellfragmenten mit kompakten Kaumassen sowie die Extraktion von
DNA und deren Aufarbeitung und Analytik sind Teil der hier vorgelegten
Schrift.
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Zur
Gewinnung von Zellmaterial eignet sich unter anderem auch Speichel,
in welchem sich Zellen und Zellmaterial aus der Mundschleimhaut
befindet.
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Aus
dem Stand der Technik sind Kaugummis bekannt, in welchen Speichel
zu Diagnosezwecken verwendet wird. In der
DE 36 32 133 wird z. B. eine kaubare
Masse offenbart, die ein für Diagnosezwecke geeignetes
Material enthält, das beim Kontakt mit einem im Speichel
des gesunden Menschen normalerweise nicht oder in höherer
oder geringerer Konzentration vorhandenen Stoffes mit einer charakteristischen
Farb- und/oder Geschmacksänderung reagiert.
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In
der
WO 01/21156 wird
ein pharmazeutisches Kaugummi offenbart, welches zur kontinuierlichen
Abgabe eines Medikaments eingesetzt wird. Dieses Kaugummi enthält
ein Medikament, das beim Kauen des Kaugummis in die Mundhöhle
des Patienten freigesetzt wird und durch das kontinuierliche Kauen
wird ein Flüssigkeitsdruck aufgebaut, der bewirkt, dass
das Arzneimittel über die Mundschleimhaut in das systemische
System des Patienten eintritt.
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Aus
dem Stand der Technik sind Verfahren zum Sammeln von Mundschleimhautzellen
bekannt, mit welchem das Zellmaterial mit Hilfe von Wattestäbchen
oder Zellabstreifer entnommen werden. Die Hilfsmittel können
in vielen Fällen nicht vom Patienten selbst eingesetzt
werden. Insbesondere bei kranken und älteren Menschen besteht
die Gefahr, dass, wenn diese die Hilfmittel ohne Unterstützung
oder Hilfe von medizinischem Personal verwenden, nicht ausreichend
Zellen einschließlich Speichel entnommen werden und insgesamt
zuwenig Zellen für die medizinische oder genetischen Analyse
und Diagnostik vorliegen.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren
zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten von
Patienten (Proband/Mensch), in welchen der Mensch oder Patient eine
wasserunlösliche, unverdauliche Kaumasse kaut, wobei die
Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmente und/oder DNA bzw.
DNA-Fragmente während des Kauvorgangs von der Kaumasse
aufgenommen werden und die aufgenommenen Zellen und/oder Zellfragmente
nach Abschluss des Kauvorgangs von der Kaumasse abgetrennt werden
können.
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Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich,
auf einfache und unkomplizierte Weise Zellen zu sammeln. Die Zellen/Zellfragmente
können zur Gewinnung von DNA, DNA-Fragementen, Zellbestandteilen,
Human-Zellen, Bakterien und Viren und weitere analytische Zwecke
eingesetzt werden. Ferner kann das erfindungsgemäße
Verfahren dazu dienen, eine individuelle Therapie durch Arzneimittel
in Bezug auf Dosis, Art und Qualität der verwendeten Wirkstoffe
hin zu optimieren. Das Verfahren kann zur Erkennung von Genpolymorphismen
benutzt werden, so zum Zwecke der Diagnostik individueller Eigenschaften,
sowie von Erkrankungen sowie Genexpressionsmustern, die eine Identifikation
der Person als auch ihrer Gefährdung durch Umwelt, Erkrankungen
oder auch therapeutische Maßnahmen ermöglichen.
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Soweit
in der vorliegenden Anmeldung der Begriff DNA verwendet wird, sind
nicht nur die vollständige DNA sondern auch DNA-Fragmente
gemeint.
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Durch
das Kauen von Kaugummi werden die Zellen und Zellfragmente schnell
und effizient über ein nicht-invasives Verfahren gesammelt.
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Die
gewonnenen Zellen und/oder Zellfragmente können in an sich
bekannter Weise aus der Kaumasse abgetrennt werden, beispielsweise
durch Spülen oder Extraktion der Kaumasse mit Wasser oder
einem anderen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemischen.
Als organische Lösungsmittel sind Alkohole (Methanol, Ethanol,
iso-Propanol), Aceton, DMSO, DMF etc. die auch im Gemisch mit Wasser
eingesetzt werden. Darüber hinaus kann das Lösungsmittel
bzw. -gemisch Tenside, Enzyme und andere Substanzen enthalten, die
das Abtrennen der des Zellmaterials von der Kaumasser unterstützen.
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In
einer möglichen Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung
werden die erhaltenen Zellen und/oder Zellfragmente in einem nachfolgenden
Verfahrensschritt einer DNA-Extraktion unterworfen. Die DNA-Extraktion
kann in an sich bekannter Weise erfolgen, indem die isolierten Zellen
zunächst aufgebrochen werden und die DNA von den Zelltrümmern
und anderen Stoffen abgetrennt und gereinigt wird. Das Aufbrechen
der Zellen kann mechanisch, durch Erhitzen, durch enzymatisches
Auflösen oder durch chemisches Auflösen mittels Tensiden
erfolgen. Die Aufreinigung der DNA ist ebenfalls dem Fachmann gut
bekannt und kann beispielsweise durch Fällen mit Alkohol,
Phenol/Chloroform oder Satz bzw. Salzlösung erfolgen, auch
eine Auftrennung durch Chromatographie ist möglich.
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Die
erhaltene Lösung kann aufkonzentriert werden, anschließend
kann die DNA durch Zentrifugieren abgetrennt werden.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Gewinnen von DNA aus Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten,
in welchem die Person, deren DNA zu extrahieren ist, eine wasserunlösliche,
unverdauliche Kaumasse kaut und nach Abschluss des Kauvorgangs die
Zellen und/oder Zellfragmente von der Kaumasse abgetrennt werden
und die DNA in an sich bekannter Weise aus den Zellen extrahiert
wird.
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Als
Kaumasse kann im erfindungsgemäßen Verfahren ein übliches
Kaugummi oder Bubblegum verwendet werden. Eine Kaumasse, die beispielsweise
eingesetzt werden kann, ist in der internationalen Patentanmeldung
WO 01/21156 offenbart.
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Die
verwendete Kaumasse enthält üblicherweise eine
wasserunlösliche, beim Kauen plastisch werdende Kaugummi-Base,
einen wasserlöslichen Anteil und ggf. Geschmacksstoffe.
Der wasserlösliche Anteil tritt während des Kauens
mit den optional vorhandenen Geschmacksstoffen aus. Die unlösliche
Kaugummi-Base enthält üblicherweise Elastomere,
Harze, Fette und Öle, Weichmacher und anorganische Füllstoffe. Ferner
kann die Kaugummi-Base Wachse enthalten.
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Die
unlösliche Kaugummi-Base kann etwa 5 bis etwa 95 Gewichtsprozent,
bezogen auf die gesamte Kaumasse, insbesondere von 10 bis etwa 50
Gewichtsprozent und bevorzugt 25 bis 35 Gewichtsprozent betragen.
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In
einer möglichen Ausführungsform enthält
die Kaugummi-Base etwa 20 bis 60 Gewichtsprozent synthetisches Elastomer,
von 0 bis etwa 30 Gewichtsprozent natürliches Elastomer
und 5 bis 55 Gewichtsprozent elastomeren Weichmacher, 4 bis 35 Gewichtsprozent
Füllstoff, 5 bis 35 Gewichtsprozent Weichmacher und ggf.
geringe Mengen (bis zu 1 Gewichtsprozent) verschiedene Inhaltsstoffe,
wie Farbstoffe, Antioxidantien, antimikrobiell wirkende Inhaltsstoffe
usw.
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Der
wasserunlösliche Anteil der Kaugummi-Base kann neben den
bereits genannten Geschmacksstoffen, Weichmacher, Emulgiermittel,
Farbstoffe, wasserlösliche Füllstoffe, wasserlösliche
Antioxidantien und andere antimikrobiell wirkende Substanzen, Säuerungsmittel
und weitere übliche Inhaltsstoffe enthalten.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform enthält die
erfindungsgemäß verwendete Kaumasse einen Farbstoff
bzw. eine farbgebende Substanz, die während des Kauens
einen Farbwechsel vollzieht und auf diese Weise das Ende des Kauvorgangs
anzeigt, d. h. das ausreichend Zellmaterial und/oder DNA aufgenommen wurde.
Zu den farbgebenden Substanzen können z. B. zählen
solche, die in der Lebensmittelherstellung eingesetzt werden oder
auch enzymatische Komponten oder andere Substanzen, die die Proteinbindung
anzeigen. Die Anzeige des Farbwechsels sollte nach einem Zeitraum
von ca. 30 Sek. bis 3 Minuten erfolgen.
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In
einer weiteren Ausführungsform enthält die Kaumasse
Geschmacksstoffe, die sich während des Kauvorgangs derart
verändern, dass das Ende des Kauvorgangs durch eine Änderung
im Geschmack des Kaumasse angezeigt wird, wobei eine Änderung
des Geschmacks auch eine Freisetzung von Säure o. ä.
sein kann, die vom kauenden Menschen/Patienten wahrgenommen wird.
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Die
Gewinnung von Zellen-/Zellfragmenten und/oder DNA kann optimiert
werden, wenn die Kaumasse Abrasivstoffe enthält. Diese
Abrasivstoffe bewirken eine verstärkte Freisetzung von
Zellen und Zellmaterial von der Mundschleimhaut und zur Binding
im Kaugummi und können selbst auch als Absorbentien dienen.
Hierzu zählen insbesondere schwerlösliche Stoffe,
wie Siliciumoxid, (komlexe) Silikate, Kieselgele, Glas, Aluminiumoxide,
Aluminiumsilikate, pulverförmige Kunststoffe, Titandioxid,
Talkum, schwerlösliche Calciumverbindungen, wie Calcium-phosphat,
Hydroxylapatit, Calciumcarbonat, schwerlösliche Phosphate
sowie beliebige andere schwerlösliche Salze, die lebensmittelgeeignet
sind. Die Abrasivstoffe können in einer Menge zwischen 0,1
bis 10 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtkaumasse, enthalten
sind. Es können auch Gemische von Abrasivstoffen eingestzt
werden.
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Um
die von der Kaumasse aufgenommenen Zellen bei Lagerung und/oder
Transport zu stabilisieren und vor Zerstörung durch äußere
Einflüsse, wie durch bakterielle Kontamination und ggf.
durch Inhaltstoffe der Luft, zu schützen, enthält
die erfindungsgemäße Kaumasse vorzugsweise einen
oder mehrere antimikrobiell wirkende(n) und/oder antioxidativ wirkende(n)
Inhaltsstoff(e). Diese(r) weitere(n) Inhaltsstoff(e) sollte vorzugsweise
lebensmittelgeeignet sein, die Zellen selbst nicht zerstören.
Ein Beispiel für einen geeigneten antimikrobiell wirkenden
Inhaltsstoff ist Zimtöl.
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Die
Kaumasse sollte über einen solchen Zeitraum gekaut werden,
dass eine ausreichende Anzahl von Mundschleimhautzellen und/oder
-zellfragmenten aufgenommen wird. Ein Zeitraum von 30 Sekunden bis
3 Minuten hat sich als geeignet erwiesen. Um eine ausreichende Menge
an Zellen aufzunehmen hat sich eine Kaumasse von 1 bis 4 Gramm,
vorzugsweise 1,5–3 Gramm, als geeignet erwiesen.
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Die
mit den Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten beauflagte
Kaumasse kann nach Abschluss des Kauvorgangs gewisse Zeit gelagert
werden. Üblicherweise wird das Kaugummi vom Patienten/Menschen
verpackt und an das Labor, welches die DNA-Analyse durchführt, übermittelt.
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In
einer möglichen Ausführungsform kann das nach
einer gewissen Zeit des Kauens vom Probanden gewonnene Kaugummi
in einem üblichen Puffer extra lysiert werden, so dass
die DNA nach üblichen Methoden isoliert, vermehrt (amplifiziert),
und schließlich hinsichtich bestimmter Abschnitte sequenziert
werden kann.
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Die
entsprechenden Sequenzen, auf die es ankommt z. B. SNPs, werden
vorab auf Basis wissenschaftlicher Erkenntnisse festgelegt, passend
zu dem zu erwartenden Nachweis von Therapiemöglichkeiten, metabolischer
Umwandlungsenzyme und deren Gensequenzen.
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Zum
Beispiel kann die selektive Erkennung bestimmter Gensequenzen im
Vordergrund stehen, denn sie enthält den Hinweis auf die
im Menschen insbesondere in Patienten typische Ausprägung
dieser Merkmale. Das Verfahren zur Isolierung des genetischen Materials,
seine Aufreinigung und seine Analyse (individuelle Genomanalyse)
zur Untersuchung von Genpolymorphismen ist Gegenstand der Erfindung.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zum Durchführen einer genetischen Analyse, in welcher zunächst
Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmente gemäß dem
oben beschriebenen Verfahren mittels einer Kaumasse gesammelt werden,
die Zellen und/oder Zellfragmente von der Kaumasse abgetrennt und
die DNA in an sich bekannter Weise extrahiert wird, in einem nachfolgenden
Schritt die DNA analytisch untersucht und die aus der Analyse erhaltenen
Ergebnisse ausgewertet werden.
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Zur
Isolierung von DNA und Lyse von Extrakten sind die üblichen
Methoden zur Freisetzung brauchbar, wie Ultraschall, Mörser
und Pistill, schütteln sowie Auftaumethoden geeignet. Ferner
sind auch kommerzielle Systeme, wie sie von bestimmten Firmen angeboten
werden, z. B. Qiagen und HoffmannLa Roche einsetzbar zum Isolieren,
Binden und Waschen des Analysematerials. Gegebenenfalls kann auch
ein enzymatischer Verdauungsschritt verwendet werden. Zur Analyse
von DNA-Sequenzen können Standardmethoden herangezogen
werden, die entweder mit Hilfe von entsprechenden Automaten oder
auch Biochip-Methoden verfügbar sind. Geeignete Methoden
sind dem Fachmann bekannt.
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Die
aus der DNA-Analyse gewonnenen Ergebnisse finden in den unterschiedlichsten
Bereichen der Medizin Anwendung, beispielsweise bei der Bestimmung
von krankheitsprädisponierenden genetischen Faktoren, bei
der Arzneimitteltherapie, hier insbesondere bei der Optimierung
der Auswahl an geeigneten Medikamenten und der Anpassung der geeigneten
Dosis, in der Pränataldiagnostik, Transplantationsmedizin
und in der medizinischen Forschung, beispielsweise bei der Durchführung
von klinischen Studien, in der Forensik, bei genealogischen Untersuchungen
und Vaterschaftstests sowie bei nicht konkret zweckgebundenen Analysen
und Untersuchungen des Genoms und/oder Teilen des Genoms, wie bei
Lifestyle-Anwendungen.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
einer Kaumasse, enthaltend Kaugummi-Base und ggf. weitere wasserlösliche
Inhaltsstoffe zum Sammeln von Mundschleimhautzellen und/oder Zellfragmenten.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Arzneimittel-Kit
bestehend aus einem Arzneimittel und einer Kaumasse, die zum Sammeln
von Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmenten dient.
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Das
Arzneimittel-Kit ermöglicht es, bei einer bereits abgeschlossenen
Diagnose das zu verabreichende Medikament individuell zu dosieren.
Die abgetrennten Mundschleimhautzellen und/oder -zellfragmente werden
wie oben beschrieben abgetrennt und einer Genanalyse unterworfen,
wobei eine individuelle Genexpressionsanalyse zur Therapieoptimierung
besonders sinnvoll ist. Hier können insbesondere Untersuchungen zu
bestimmten so genannten Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) wichtig
sein. So können bestimmte Ausprägungsmuster z.
B. von Cytochrom P450 Oxidasen Aufschluss darüber geben,
in welchem Maße eine Substanz metabolisiert wird. Im Fall
von Tamoxifen kann so anhand von Allelkombinationen, die durch SNP-Analyse
gewonnen wird, ermittelt werden, in welchem Umfang Tamoxifen zum
aktiven Metaboliten Endoxifen umgebaut wird, und somit, ob eine
Arzneimitteltherapie mit Tamoxifen sinnvoll ist, bzw. welcher Dosisbereich
sinnvoll ist.
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In
der beigefügten Figur ist ein Fließdiagramm, in
welchem dargestellt wird, auf welche Weise die mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren gewonnenen Zellen und Zellfragmente der medizinischen
Diagnostik und Therapie zugeführt werden können.
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Üblicherweise
existiert für den Patienten oder Menschen, der das erfindungsgemäße
Verfahren anwenden soll, bereits eine Diagnose, vielfach ist auch
bereits bekannt, mit welchem Medikament die Erkrankung behandelt
werden kann. Im vorliegenden Fall wurde dem Patienten Tamoxifen,
ein Cytostatikum und Antiestrogen, verordnet. Zu bestimmen ist noch
die Dosis des Wirkstoffs, diese hängt von der spezifischen
Konstitution des Patienten ab. In einem ersten Schritt kauft der
Patient den Wirkstoff gemeinsam mit einem Indikatorsystem, welches
die erfindungsgemäß verwendete Kaumasse enthält.
Der Patient kaut das Kaugummi, um Mundschleimhautzellen und/oder
-zellfragmente zu gewinnen. Das Kauen erfolgt nach einer vorgegebenen
Zeit, nach Abschluss des Kauvorgangs wird die Kaumasse versiegelt, üblicherweise
in einem Kunststoffbehälter. Die versiegelte und mit dem
Namen versehene Masse wird anschließend an das analysierende
Labor geschickt. In dem Labor werden die Zellen und/oder Zellfragmente
von der Kaumasse abgetrennt und der Analyse hinsichtlich der spezifischen
Eigenschaften der Zellen in Bezug auf den Wirkstoff Tamoxifen. Das
Ergebnis dieser Analyse wird vom Labor an den behandelnden Arzt
weitergeleitet, der aufgrund des Analyseergebnisses eine individuelle
Dosierungsempfehlung an den Patienten gibt.
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In
den nachfolgenden Beispielen sind beispielhafte Rezepturen für
geeignete Kaumassen wiedergeben: Beispiele
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 3632133 [0004]
- - WO 01/21156 [0005, 0015]
