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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation
von Proben sowie einen Kit, welcher ein Identifikationssystem für
Proben zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens enthält.
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Es
besteht im Bereich der Diagnostik ein Bedarf an Verfahren, bei welchen
mit Sicherheit festgestellt werden kann, ob eine biologische Probe
von einem bestimmten Probanden stammt oder nicht. Dies kann z. B.
im Rahmen von therapeutischen Maßnahmen, prophylaktischen
Routineuntersuchungen oder forensischen Untersuchungen, aber auch
bei der Untersuchung auf Drogenmissbrauch oder bei möglichen
Dopingvergehen im Sport notwendig werden. Im Straßenverkehr
hat z. B. in letzter Zeit die Zahl der Fahrer stark zugenommen,
die illegale Drogen bzw. Betäubungsmittel genommen haben,
bevor sie sich ans Steuer setzen. In all diesen Fällen
ist es für die Aussagekraft einer Untersuchung absolut
unerlässlich, dass eine abgegebene Probe auch eindeutig
einer die Probe abgebenden Person (nachfolgend auch „Probenspender” oder
einfach „Spender” genannt) zugeordnet werden kann.
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Wenn
z. B. ein Fahrer eines Autos von der Polizei kontrolliert und dabei
vermutet wird, dass er illegale Drogen zu sich genommen hat, dann
kann dies heute anhand eines Schnelltests relativ leicht festgestellt
werden. Gerichtsverwertbar sind diese Schnelltests in der Regel
jedoch nicht. Es ist daher notwendig, dass noch eine ausführlichere
toxikologische Untersuchung erfolgt. Üblicherweise wird
dazu eine Analyse des Urins vorgenommen. Urin hat gegenüber
alternativen Probenmaterialien (wie z. B. Blut) den Vorteil, dass
die Probennahme nicht-invasiv erfolgt und aufgrund der renalen Filtration
eine Anreicherung der Analyten im Urin erfolgt, was auch zu verhältnismäßig
langen Nachweisdauern führt. Außerdem kann eine
Blutentnahme bei Substitutionspatienten häufig schwierig
sein.
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Ein
Problem bei Urintests ist jedoch, dass Urinproben unter Aufsicht
einer weiteren Person abgegeben werden müssen, da ansonsten
nicht ausgeschlossen werden kann, dass der Probenspender bzw. Proband
die Probe manipuliert. Bei der Manipulation einer Probe wird der
Urin meist mit Wasser, Säften oder Chemikalien gemischt.
Diese Manipulationen sind im Labor relativ leicht nachweisbar, da sich üblicherweise
durch diese Manipulationen charakteristische Parameter des Urins
(wie z. B. pH-Wert, Dichte, Farbe, Protein- und Zuckergehalt etc.) ändern.
Eine Manipulation kann jedoch auf diese Weise nicht entdeckt werden,
wenn die Manipulation darin besteht, dass der (belastete) Eigenurin durch
einen (unbelasteten) Fremdurin ausgetauscht worden ist.
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Um
sicherzustellen, dass von Probanden bzw. Spender Eigenurin nicht
durch Fremdurin ausgetauscht wird, sind nunmehr Verfahren vorgeschlagen
worden, bei denen die Probanden vor der Urinabgabe gesundheitlich
unbedenkliche Markersubstanzen schlucken müssen, die entweder
unverändert oder deren charakteristische Stoffwechselprodukte
später im abgegebenen Urin wieder auftauchen müssen.
Fehlen diese charakteristischen Markersubstanzen in der abgegebenen
Urinprobe ist dies ein Hinweis darauf, dass ein Urinaustausch stattgefunden
hat.
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Das
europäische Patent
Nr. 1 410 014 B1 beschreibt ein Verfahren zur Untersuchung
biologischer Proben von einem Säugetier auf zumindest einen
Inhaltsstoff. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) orales Verabreichen
einer Kombination von mindestens zwei Markersubstanzen an ein Säugetier,
(b) Abwarten über einen Zeitraum, welcher ausreichend ist, dass
die Kombination der mindestens zwei Markersubstanzen an den Ort
der Probenentnahme gelangt, (c) Entnahme einer biologischen Probe
von dem Säugetier, (d) Untersuchen der biologischen Probe auf
die Anwesenheit und/oder Menge der Kombination der mindestens zwei
Markersubstanzen oder Derivaten davon, und (e) wenn die Kombination
der mindestens zwei Markersubstanzen oder der Derivate davon in
der biologischen Probe nachweisbar ist, Untersuchen der biologischen
Probe auf einen Analyten. Die biologische Probe, die von dem Säugetier dabei
entnommen wird, ist Urin, der in einem Sammelgefäß aufgefangen
wird. Das Verfahren gemäß des
europäischen Patents Nr.
1 410 014 B1 ist dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens
zwei Markersubstanzen ausgewählt werden aus Isoprenoiden,
Lipiden, Sacchariden, Polyolen, Polyethylenglykolen oder Derivaten
davon.
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Wie
oben dargestellt, muss bei dem aus dem
europäischen Patent Nr.
1 410 014 B1 bekannten Nachweisverfahren abgewartet werden,
bis die verabreichten Markersubstanzen an den Ort der Probenentnahme
gelangen. Bei oraler Verabreichung der Markersubstanzen kann es
mehrere Stunden dauern, bis die Markersubstanzen im Urin nachweisbar
sind. Wenn z. B. Führerscheinbewerber, denen der Führerschein
wegen einer Fahrt unter Drogeneinfluss abgenommen wurde, um eine
neue Fahrerlaubnis nachsuchen, müssen sie nachweisen, dass sie über
einen längeren Zeitraum drogenfrei gelebt haben. Dazu werden
sie mehrmals in zeitlichen Abständen aufgefordert, Urinproben
abzugeben, die dann daraufhin untersucht werden, ob sie frei von Rückständen
unerlaubter Mittel sind. Nach dem aus dem
europäischen Patent Nr.
1 410 014 B1 bekannten Verfahren wird als nachteilig empfunden,
dass die Probenden jedes Mal mehrere Stunden zwischen der Einnahme
der Markersubstanzen und der Urinabgabe warten müssen.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren sowie ein
Kit für ein Identifakationssystem anzugeben, bei dem die
nach dem
europäischen
Patent Nr. 1 410 014 B1 notwendige Wartezeit bei mehrmaliger
Probenabgabe wegfällt.
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Diese
Aufgabe löst die vorliegende Erfindung durch das Verfahren
gemäß des unabhängigen Patentanspruchs
1 sowie den Kit gemäß des unabhängigen
Patentanspruchs 6. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen, Aspekt
und Details der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen
Ansprüchen sowie der Beschreibung.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum eindeutigen
Zuordnen einer biologischen Probe zu einem Spender der Probe. Das
Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
- (a)
Gewinnen einer DNA-Probe des Spenders;
- (b) Bestimmen von DNA-Sequenzen nicht-kodierender Bereiche aus
der DNA-Probe des Spenders;
- (c) Gewinnen einer biologischen Probe des Spenders;
- (d) Isolieren von DNA-haltigen Zellen aus der biologischen Probe
des Spenders;
- (e) Bestimmen von DNA-Sequenzen nicht-kodierender Bereiche aus
den DNA-haltigen Zellen aus der biologischen Probe des Spenders;
und
- (f) Vergleichen der DNA-Sequenzen nicht-kodierender Bereiche
aus der DNA-Probe des Spenders mit DNA-Sequenzen nicht-kodierender
Bereiche aus den DNA-haltigen Zellen aus der biologischen Probe
des Spenders.
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Als „Spender” im
Sinne der vorliegenden Erfindung wird jede männliche oder
weibliche Person angesehen, der eindeutig eine biologische Probe
zugeordnet werden soll. Es kann sich bei diesem Spender beispielsweise
um einen Patienten einer Arztpraxis oder eines Krankenhauses, einen
Drogenabhängigen, einen Strafgefangenen, einen Sportler
oder einen Führerscheinwiederbewerber handeln. Ein klassischer
Spender ist z. B. eine Person, die an einer Methadontherapie teilnimmt.
Methadon ist ein Drogenersatzstoff (Opiatersatz), der unter ärztlicher
Aufsicht verabreicht wird mit dem langfristigen Ziel, Personen von
ihrer Drogenabhängigkeit zu befreien. Methadon wirkt als
Substitutionsmittel gegen körperliche Entzugserscheinungen
bei Heroinabhängigkeit. Personen, die an einem Methadonprogramm
teilnehmen, müssen regelmäßig nachweisen,
dass sie keine anderen (illegalen) Drogen konsumieren. Dies geschieht
z. B. durch wöchentliche Überprüfung
des Urins auf Rückstände von Drogen. Auch Führerscheinwiederbewerber,
denen die Fahrerlaubnis wegen Führens eines Kraftfahrzeugs
unter Drogeneinfluss entzogen worden ist, müssen vor einer
Wiederaustellung der Fahrerlaubnis oftmals nachweisen, dass sie über
einen längeren Zeitraum (z. B. mehrere Monate) drogenfrei
gelebt haben. Diese Überprüfung erfolgt üblicherweise
durch die regelmäßige Überprüfung
des Urins dieser Führerscheinwiederbewerber auf Drogenrückstände.
Auch im professionellen Sport (z. B. Radfahren, Leichtathletik,
Schwimmen, Gewichtheben) werden Dopingkontrollen immer wichtiger.
Diese Kontrollen basieren zu einem Großteil auf der Untersuchung
von Urinproben. Schließlich werden auch Strafgefangene
bei vorliegen entsprechender Verdachtsmomente häufig in
regelmäßigen Abständen wegen der möglichen
Einnahme illegaler Drogen untersucht. Auch hier wird häufig
mit Urinproben gearbeitet.
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Die
Gewinnung der DNA-Probe des Spenders kann auf vielerlei Wegen geschehen.
Bevorzugt ist die Entnahme eines Wangenabstrichs, da es sich dabei
um ein gut etabliertes, nicht-invasives und damit den Spender nicht
belastendes Verfahren handelt. Aus dieser DNA-Probe des Spenders
(Schritt (a) des oben beschriebenen Verfahrens) werden Muster definierter
DNA-Sequenzen aus nicht-kodierenden Abschnitten der Erbinformation
bestimmt und als Vergleichs- oder Referenzwert gespeichert. Die nicht-kodierenden
Abschnitte von DNA-Sequenzen (intervenierende Sequenzen oder „Introns”)
aus menschlichen Zellen sind praktisch individuenspezifisch und
erlauben damit die eindeutige Zuordnung einer biologischen Probe
(Schritt (c) des oben skizzierten Verfahrens) zu einem Spender.
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Als
biologische Probe können z. B. Blut, Urin oder andere Körperflüssigkeiten
verwendet werden. Vorzugsweise wird Urin eingesetzt.
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Ergibt
der Vergleich der nicht-kodierenden DNA-Sequenz der DNA-Probe des
Spenders mit der DNA-Sequenzen nicht-kodierender Bereiche aus den
DNA-haltigen Zellen aus der biologischen Probe des Spenders eine Übereinstimmung,
kann davon ausgegangen werden, dass die biologische Probe vom Spender
stammt. Ergeben sich jedoch bei dem DNA-Abgleich Unterschiede in
den jeweiligen Sequenzen, so spricht dies dafür, dass der
Spender eine Fremdprobe, z. B. Fremdurin, abgegeben hat.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass
die Probenabgabe, z. B. die Urinabgabe, nicht durch eine weitere
Person überwacht werden muss. Kommt der Spender zum ersten
Mal zur Probenabgabe, dann kann der Spender seine biologische Probe,
z. B. seine Urinprobe, abgeben und sich einen Wangenabstrich entnehmen
lassen. Eine Wartezeit von mehreren Stunden, wie sie z. B. nach dem
in dem
europäischen
Patent Nr. 1 410 014 B1 beschriebenen Verfahren notwendig
ist, entfällt nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren. Ist das DNA-Profil eines Spenders erst einmal gespeichert, dann
muss der Spender bei folgenden Besuchen, wie es bei Substitutionspatienten,
Führerscheinwiederbewerbern oder Sportlern die Regel ist,
nur noch seine biologische Probe, z. B. seinen Urin, abgeben, da für
den Identitätsabgleich auf das bereits vorliegende DNA-Profil
zurückgegriffen werden kann. Dies führt für
den Spender zu einer erheblichen Beschleunigung der Probenabgabe
und damit zu einer höheren Akzeptanz des gesamten Verfahrens.
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Ergibt
der Vergleich der DNA-Sequenz der DNA-Probe des Spenders mit der
DNA-Sequenz aus den DNA-haltigen Zellen aus der biologischen Probe, welche
der Spender abgegeben hat, keine Übereinstimmung, so ist
klar, dass die abgegebene biologische Probe manipuliert wurde bzw.
nicht vom Spender stammt. Der Spender muss dann so lange aufgefordert
werden, eine neue biologische Probe abzugeben, bis die DNA der DNA-haltigen
Zellen aus der biologischen Probe, welche der Spender abgibt, mit dem
z. B. aus einem Wangenabstrich des Spenders gewonnenen DNA-Profil übereinstimmt.
Eine sichere Zuordnung von biologischen Proben zu ihren Spender
ist eine Grundvoraussetzung für eine chemisch toxikologische
Untersuchung bei dem oben genannten Spender-Personenkreis. Nur dann
können die Richtigkeit von Analyseergebnissen sichergestellt und
falsch negative Befunde ausgeschlossen werden.
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Liegt
dann eine biologische Probe, z. B. eine Urinprobe, vor, die eindeutig
vom Spender stammt, so wird diese Probe mit herkömmlichen
Methoden auf Inhaltsstoffe (Analyte) untersucht. Diese herkömmlichen
Methoden sind z. B. Elektrophoresen und Chromatographieverfahren,
wie Gaschromatographieverfahren oder HPLC (High Performance Liquid
Chromatography/Hochleistungsflüssigkeitschromatographie).
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Besonders
geeignet ist es, wenn die DNA-haltigen Zellen aus der biologischen
Probe Epithelzellen sind. Ist die biologische Probe eine Urinprobe,
dann sind die Epithelzellen vorzugsweise Epithelzellen der Harnröhre
und/oder Harnblase des Spenders.
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Die
Analyse der DNA aus den DNA-haltigen Zellen der biologischen Probe
sollte zeitnah zur Probenentnahme erfolgen, da ansonsten die Gefahr
besteht, dass die Zellen in der Probe lysiert sind, was eine DNA-Isolierung
und damit auch Sequenzierung erheblich erschwert oder gar unmöglich
macht.
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Außerdem
betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung
des oben beschriebenen Verfahrens. Der Kit enthält in einem
Behälter eine Vorrichtung für die Entnahme einer
DNA-Probe eines Spenders, z. B. eines Wangenabstrichs. Diese Vorrichtung
zur Entnahme einer DNA-Probe eines Spenders kann z. B. ein Wattestäbchen
sein, das abgedichtet in einem Reagenzglas aufbewahrt werden kann,
sowie einen Sammelbehälter zur Aufnahme der biologischen
Probe, die auf das Vorhandensein von Analyten untersucht werden
soll. Der Sammelbehälter ist vorzugsweise verschließbar.
Vorzugsweise ist der Behälter ein Urinsammelbehälter.
Des weiteren kann der Kit noch einen Identifikationsbogen für die
erste Entnahme der DNA des Spenders enthalten. Außerdem
kann in dem Kit auch noch ein Versandcontainer vorhanden sein, mit
dem die DNA-Probe des Spenders und/oder die biologische Probe zu
einem Analyselabor gebracht oder geschickt werden können,
wenn diese Analyse nicht unmittelbar am Ort der Probenentnahme vorgenommen werden
kann. Schließlich kann der Kit auch noch einen Anforderungsschein
für die Analytik (z. B. Drogenanalytik) und/oder eine Informationsbroschüre enthalten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - EP 1410014
B1 [0006, 0006, 0007, 0007, 0008, 0015]