DE102008022609A1

DE102008022609A1 - Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege

Info

Publication number: DE102008022609A1
Application number: DE102008022609A
Authority: DE
Inventors: Werner Prof. Dr. Hoffmann
Original assignee: Otto Von Guericke Universitaet Magdeburg
Current assignee: Otto Von Guericke Universitaet Magdeburg
Priority date: 2008-05-05
Filing date: 2008-05-05
Publication date: 2009-11-19
Anticipated expiration: 2028-05-06
Also published as: DE102008022609B4; WO2009135463A1; US20110117583A1; EP2277051A1

Abstract

Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege. Die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege anzugeben, das nichtinvasiv durchführbar ist und dabei relativ schnell und kostengünstig erste Hinweise z. B. bezüglich des Vorkommens von Nierensteinen und/oder Entzündungen (z. B. nach HWI) der ableitenden Harnwege ermöglicht, um u. a. durch Entzündungen hervorgerufene Mikrohämaturien schnell und kostengünstig aufzuklären, wird dadurch gelöst, dass die TFF-Peptid-Anwesenheit oder -konzentration im Urin bestimmt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege gemäß der Gattung der Patentansprüche. Es ist zur Detektion spezifischer Erkrankungen geeignet.
Verschiedene Erkrankungen der ableitenden Harnwege [bspw. verschiedene Nierensteine oder Harnwegsinfekte (HWI)] lassen sich zur Zeit nur mit relativ teuren Methoden und auch oft nicht sicher diagnostizieren (z. B. Ultraschall, Anlegen von Kulturen). Besonders bei Steinen ist eine sichere Diagnose oft problematisch und erfordert teure Geräte und sehr erfahrene Ärzte.
DE 696 19 416 T2 offenbart ein Verfahren und Reagenzien zum immunologischen Nachweis von Cortisol im Urin
Aus DE 695 23 707 T2 ist ein Verfahren zum Nachweis von Kreatinin und von in Urin enthaltenen Proteinen bekannt.
DE 44 44 533 A1 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung eines Tests zum Nachweis von Partikeln im Urin (Test zur Bestimmung der Anfälligkeit einer Testperson für Nierensteine).
Aus DE 38 87 314 T2 sind eine Methode zum Nachweis basischer fötaler Proteine im Urin und ein dafür geeigneter Analysesatz bekannt.
DE 18 12 584 offenbart einen schnellen und empfindlichen Nachweis von Bakterien in Blutprodukten, Urin und anderen Flüssigkeiten.
DE 38 38 718 A1 offenbart ein Verfahren zum Aufspüren von Krankheiten, die in Verbindung mit Stoffwechselabnormalitäten von L-Fucose, wie Magengeschwüren, Leberzirrhosen und Karzinomen in Menschen, in Verbindung stehen. Dieses Verfahren besteht in einem Vergleich der Konzentrationen an freier L-Fucose mit ihrem normalen Wert in einer Probe aus dem Subjekt.
TFF(Trefoil Factor Family)-Peptide stellen eine Familie von luminalen Schutzpeptiden dar, die u. a. eine Schlüsselrolle für den Schutz, die Regeneration und die Reparatur muköser Epithelien spielen.
Beim Menschen wurden bis jetzt die Peptide TFF1, TFF2 und TFF3 beschrieben. Das physiologische Vorkommen von TFF1 (frühere Namen: pS3, BCEI, pNR-2, pNR-105) und TFF2 ist vor allem auf den Magen beschränkt, während TFF3 (frühere Namen: Intestinal Trefoil Factor/ITF, hP1.B) von vielen mukösen Epithelien synthetisiert wird. So ist TFF2 (frühere Namen: Pancreatic Spasmolytic Polypeptide/PSP, Spasmolytic Polypeptide/SP, human Spasmolytic Polypeptide/hSP) ein Bestandteil des Magensafts und kommt da sowohl in einer glykosylierten als auch in einer nichtglykosylierten Form vor.
Außerdem ist gastrales TFF2, im Unterschied zu TFF1, an Muzine gebunden (Kouznetsova et al. (2007) Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908).
Eine Überexpression von TFF3 ist im Zusammenhang mit Prostata-Krebs bekannt.
Im normalen menschlichen Urin sind TFF-Peptide nur in sehr geringer Konzentration vorhanden. So sind in der Regel weder TFF1 noch TFF2 noch TFF3 über Westernblot-Analysen nachweisbar.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege anzugeben, das nicht-invasiv durchführbar ist und dabei relativ schnell und kostengünstig erste Hinweise z. B. bezüglich des Vorkommens von Nierensteinen und/oder Entzündungen (z. B. nach HWI) der ableitenden Harnwege ermöglicht, um u. a. durch Entzündungen hervorgerufene Mikrohämaturien schnell und kostengünstig abzuklären.
Gemäß der Erfindung wird die Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des ersten Patentanspruchs gelöst. In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindungen angegeben.
Es wurde festgestellt, dass TFF2 (und in geringerem Maße auch TFF1 sowie mitunter auch TFF3) im Urin von Nierensteinträgern und Patienten mit HWI gegenüber gesunden Personen in stark erhöhter Konzentration vorliegt und nachweisbar ist.
Dabei ist die TFF2-Konzentration in HWI-Patienten gegenüber Nierensteinträgern erhöht, so dass dadurch eine Differentialdiagnostik möglicht ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt der semiquantitative Nachweis von TFF2 durch Westernblotanalysen von Urinproben nach Acetonfällung und nachfolgender Detektion mit Hilfe der Chemilumineszenz (ECL-System) sowie digitaler Auswertung gemäß dem Stand der Technik.
Dies stellt eine Kombination von biochemischen Standardmethoden dar (siehe z. B. Kouznetsova et al. (2007) Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908). Dadurch wird sichergestellt, dass nur glykosyliertes TFF2 in die Analyse einbezogen wird, das im Urin dieser Patienten vorliegt.
Neben diesem hochspezifischen quantitativen Nachweisverfahren für TFF2 im Urin, können auch andere Detektionsmethoden im erfindungsgemäßen Verfahren angewendet werden, wie bspw. ELISA, Streifentest, RIA, IRMA oder verschiedene chromatographische Verfahren.
Ein entsprechender Immunoassay für TFF2 gehört zum Stand der Technik (Vestergaard et al. (2004) Scand. J Clin. Lab. Invest. 64: 146–156).
Der Vorteil des erfindungsgemäßen, biochemischen Verfahrens besteht darin, dass es einen kostengünstigen Schnelltest darstellt, dessen Ergebnisse eine Entscheidungsgrundlage hinsichtlich ggf. weiterer erforderlicher Anwendungen/Untersuchungen, die oft teuer und für den Patienten belastend sind, liefern. Dadurch ist eine ökonomische Verwendung der z. Z. besonders begrenzten finanziellen Ressourcen auf dem Gesundheitssektor möglich, wobei gleichzeitig unnötige und für den Patienten belastende Untersuchungen vermieden werden können.
Die Erfindung soll nachfolgend an Hand der Ausführungsbeispiele näher erläutert werden, ohne dadurch auf diese beschränkt zu sein.
1. Ausführungsbeispiel
(Bestimmung der TFF2-Konzentration im Urin von Patienten mit vermutetem HWI)
1 Volumen (z. B. 500 μL) einer Urinprobe (z. B. morgendlicher Mittelstrahlurin) eines Patienten mit vermutetem HWI wird mit 4 Volumina (z. B. 2000 μL) kaltem Aceton (–20°C) versetzt und die Proteine bei –20°C für mindestens 2 Stunden gefällt. Dann werden die gefällten Proteine für 10 Minuten bei 4°C und 12.000 × g abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen; das Pellet wird an der Luft getrocknet und dann in 0.5% SDS aufgenommen (in der Hälfte des ursprünglichen Urinvolumens, z. B. in 250 μL).
Anschließend werden 15 μL dieser so vorbereiteten Probe mit 5 μL 4-fach Probenpuffer für die Gelelektrophorese versetzt, 4 Minuten im kochenden Wasserbad erhitzt und sofort einer SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE; 15%) unterzogen. Alle nachfolgend aufgeführten Schritte erfolgen dann analog Kouznetsova et al. (Kouznetsova I, Laubinger W, Kalbacher H, Kalinski T, Meyer F, Roessner A, Hoffmann W (2004) Biosynthesis of gastrokine-2 in the human gastric mucosa: restricted spatial expression along the antral gland axis and differential interaction with TFF1, TFF2 and mucins. Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908):
Nach der SDS-PAGE werden die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran übertragen, mit 0.1% Glutaraldehyd fixiert und in PBS mit einem affinitätsgereinigten polyklonalen Antiserum gegen TFF2 (z. B. anti-hTFF2-1; Jagla W, Wiede A, Dietzmann K, Rutkowski K, Hoffmann W (2000) Co-localization of TFF3 peptide and oxytocin in the human hypothalamus. FASER J. 14: 1126–1131) inkubiert. Die TFF2-enthaltenden Banden werden mit einem kommerziellen ECL-Detektionssystem (z. B. GE Healthcare) sichtbar gemacht. Das Bild dieser Westernblotanalyse wird dann elektronisch gespeichert (GeneGnome System, Syngene). Die semi-quantitative Auswertung der Banden erfolgt mit der GeneTools Gel-Analyse-Software (Syngene). Dabei können entweder die glykosylierten oder die nicht-glykosylierten TFF2-Formen getrennt ausgewertet werden.
Die Eichung kann über rekombinantes TFF2 erfolgen. Deutlich erhöhte TFF2-Werte gegenüber den Kontrollwerten gesunder Personen sind ein Hinweis auf eine Entzündung, z. B. durch HWI.
2. Ausführungsbeispiel
(Bestimmung der TFF2-Konzentration im Urin von Patienten mit Mikrohämaturie)
10 mL einer Urinprobe (z. B. morgendlicher Mittelstrahlurin) eines Patienten mit ungeklärter Mikrohämaturie werden für 15 Minuten bei 5.000 × g zentrifugiert und ein Aliquot des Überstands wird dann einem spezifischen ELISA zur quantitativen Bestimmung der TFF2-Konzentration unterzogen. Dabei werden entsprechende Verdünnungen entsprechend dem Protokoll von Vestergaard et al. (Vestergaard EM, Brynskov J, Ejskjaer, Clausen JT, Thim L, Nexo E, Poulsen SS (2004) Immunoassays of human trefoil factors 1 and 2: measured on serum from patients with inflammatory bowel disease. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 64: 146–156) behandelt.
Deutlich erhöhte TFF2-Werte gegenüber den Kontrollwerten gesunder Personen sind ein Hinweis auf eine Entzündung im Bereich der ableitenden Harnwege (z. B. durch HWI oder Nierensteine) und könnten die Mikrohämaturie erklären. Bei Vorliegen von Daten aus einem größeren Patientenkollektiv könnte in Zukunft über die Bestimmung der TFF2-Konzentration auch eine Differentialdiagnose zur Unterscheidung von HWI bzw. Nierensteinen möglich sein.
3. Ausführungsbeispiel
[Bestimmung der TFF2-Konzentration im Urin von Patienten mit Nephrolithiasis nach extrakorporaler Stoßwellenlithotripsie (ESWL)]
Die Behandlung von hochgradiger Nephrolithiasis erfolgt heute zunehmend durch extrakorporale Stoßwellenlithotripsie (ESWL). Dadurch werden die Steine zerkleinert und dann ausgespült. Allerdings kommt es dadurch auch zu Läsionen des Nierenepithels bzw. der ableitenden Harnwege sowie zu temporären Entzündungen. Deshalb wird in der Regel nach einer ESWL-Behandlung ein Anstieg der TFF2-Konzentration im Urin beobachtet. Dieser Anstieg spiegelt den Grad der Entzündung wider und erreicht normalerweise nach einigen Tagen wieder einen Basalwert. Mitunter kommt es aber auch zu Komplikationen durch nachfolgende Entzündungen.
Durch wiederholte Messung des TFF2-Spiegels (z. B. im Abstand von 2 Tagen mit Hilfe eines ELISA; siehe 2. Ausführungsbeispiel) kann nun die Abheilung nach ESWL-Behandlung verfolgt werden und so bei Bedarf rechtzeitig einer Infektion vorgebeugt werden.
Alle in der Beschreibung und den Ausführungsbeispielen dargestellten Merkmale können einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- DE 69619416 T2 [0003]
- DE 69523707 T2 [0004]
- DE 4444533 A1 [0005]
- DE 3887314 T2 [0006]
- DE 1812584 [0007]
- DE 3838718 A1 [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Kouznetsova et al. (2007) Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908 [0011]
- Kouznetsova et al. (2007) Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908 [0019]
- Vestergaard et al. (2004) Scand. J Clin. Lab. Invest. 64: 146–156 [0021]
- Kouznetsova et al. (Kouznetsova I, Laubinger W, Kalbacher H, Kalinski T, Meyer F, Roessner A, Hoffmann W (2004) Biosynthesis of gastrokine-2 in the human gastric mucosa: restricted spatial expression along the antral gland axis and differential interaction with TFF1, TFF2 and mucins. Cell. Physiol. Biochem. 20: 899–908) [0025]
- Jagla W, Wiede A, Dietzmann K, Rutkowski K, Hoffmann W (2000) Co-localization of TFF3 peptide and oxytocin in the human hypothalamus. FASER J. 14: 1126–1131 [0025]
- Vestergaard et al. (Vestergaard EM, Brynskov J, Ejskjaer, Clausen JT, Thim L, Nexo E, Poulsen SS (2004) Immunoassays of human trefoil factors 1 and 2: measured on serum from patients with inflammatory bowel disease. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 64: 146–156) [0027]

Claims

Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege bei dem die TFF-Peptid-Anwesenheit eines oder mehrerer TFF-Peptide (TFF1, TFF2, TFF3) im Urin bestimmt wird.
Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung vermittels Westernblot-Analyse, ELISA, Streifentest, RIA oder IRMA erfolgt.
Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die TFF2-Anwesenheit im Urin bestimmt wird.
Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass TFF1- und/oder TFF3-Anwesenheit im Urin bestimmt wird.
Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege bei dem die Konzentration von einem oder mehrer TFF-Peptide (TFF1, TFF2, TFF3) im Urin bestimmt wird.
Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die TFF2-Konzentration im Urin vermittels Westernblot-Analyse, ELISA, Streifentest, RIA oder IRMA bestimmt wird.
Verfahren zum Nachweis von Erkrankungen der ableitenden Harnwege gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass TFF1- und/oder TFF3-Konzentration im Urin vermittels Westernblot-Analyse, ELISA, Streifentest, RIA oder IRMA bestimmt wird.