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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Veränderungen in der Prostata von Rüden.
Hunde sind die einzigen Haustiere, für die Prostata-Erkrankungen veterinärmedizinisch rele- vant sind So kommt es beispielsweise mit zunehmendem Alter häufig zur Entwicklung von Prosta- ta-Hyperplasien in Rüden, nicht jedoch in Katzen. Dies ist wahrscheinlich auf die höhere Anfällig- keit des Urogenitaltraktes von Rüden gegenüber bakteriellen Infektionen zurückzuführen.
Da Prostata-Erkrankungen in Rüden relativ häufig auftreten und oft äusserst schmerzhaft sein können, kommt ihnen grosse veterinärmedizinische Bedeutung zu. Neben akuter und chronischer Prostatitis sind vor allem die benigne Hyperplasie, die squamöse Metaplasie, paraprostatische Zysten, die prostatische Neoplasie sowie nekrotische und bakterielle Prostatiden die am häufigsten beschriebenen Prostata-Erkrankungen beim Rüden.
Diese Erkrankungen sind häufig verbunden mit Fieber, Schmerzzuständen, Depression, Leu- kozytose und Inkontinenz.
Die bekannten Methoden zur Diagnose von Prostata-Erkrankungen beim Rüden, wie rectale Palpation, Ultraschall- oder Röntgenuntersuchungen sowie histologische Untersuchungen sind mit erheblichem Aufwand verbunden und werden in der Regel erst angewendet, wenn die typischen Symptome einer pathologischen Prostata gegeben sind. Vorbeugende Diagnoseverfahren, bei welchen Norm-abweichende Prostataparameter in einem frühen Stadium erkannt und somit behan- delt werden können, bevor möglicherweise irreversible pathologische Zustände eintreten, sind bislang nicht bekannt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Detektion von Veränderungen in der Prostata von Rüden, welches einfach durchzuführen ist, eine hohe Aussagekraft hat und geeignet ist, Prostataveränderungen in einem möglichst frühen Stadium, vorzugsweise bevor klinische Symptome auftreten, anzuzeigen
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch ein Verfahren zur Detektion von Verände- rungen in der Prostata, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Entnahme einer Harnprobe, - Bestimmen des Gehaltes an Prostata-spezifischem Protein (PSP) in der Harnprobe und - Vergleichen des bestimmten PSP-Gehaltes mit zumindest einem PSP-Referenzwert.
PSP erscheint als Hauptbande bei der SDS-PAGE-Untersuchung von caninem Prostatasekret mit einem Anteil von über 90 % des Gesamtproteins PSP besteht aus zwei unterschiedlichen Polypeptid-Untereinheiten, die über zwei Disulfidbrücken kovalent aneinander gebunden sind. Mit isoelektrischer Fokussierung konnten 10 bis 13 geladene Varianten mit pl-Werten im Bereich zwischen 6,5 und 8,4 nachgewiesen werden (Isaacs et al , Journal of Biological Chemistry 258 (10) (1983), S. 6610-6615). Die PSP-Biosynthese steht unter Androgenkontrolle, Kastration führt zum allmählichen Verschwinden dieses Proteins. Die Zuführung von exogenem Androgen führt jedoch auch in kastrierten Tieren zur Bildung von PSP in der Prostata.
PSP verfügt über eine hochspezifische enzymatische Aktivität, die auf die Hydrolyse von Argi- nin und Lysin enthaltenden Amid- und Esterproteasesubstraten beschränkt ist. Es wurde zwar vorgeschlagen, dieses Glykoprotein als Marker für die Prostatafunktion unter sich ändernden hor- monellen Bedingungen zu verwenden, indem Prostatapräparate mit spezifischen PSP-Antiseren untersucht werden (Isaacs et al., Endocrinology 117 (4) (1985), S. 1512-1520), ein Zusammenhang zwischen sich ändernden PSP-Gehalten und pathologischen Veränderungen in der Prostata wurde bislang nicht beschrieben. Auch wurden bislang Veranderungen des PSP-Gehaltes im Harn nicht beschrieben oder dessen pathologische Relevanz erkannt.
Das entsprechende Protein beim Menschen (das Prostata-spezifische Antigen (PSA)) ist in der Humanmedizin als Marker für Prostatatumoren bekannt (s. z.B Magklara et al., Clin. Chem. 45(11) (1999), S. 1960-1966). Dabei wird auf Grund eines erhöhten Gehaltes von PSA im Serum Prosta- takrebs diagnostiziert. Diese Markerfunktion ist beim Menschen jedoch streng auf Tumorerkran- kungen beschränkt. Andere Prostataveränderungen resultieren beim Menschen nicht in einer wesentlichen Veränderung des PSA-Gehaltes im Serum. Bemerkenswerterweise kommt PSP im Rüdenserum überhaupt nicht vor. PSP ist im Prostatagewebe und in der Prostataflüssigkeit sowie im Harn und Ejakulaten von Rüden nachweisbar (wobei PSP in Spermien aus Nebenhoden nicht detektiert werden kann (Isaacs et al., Journal of Biological Chemistry 259 (18) (1984), S. 11520- 11526)).
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Überraschenderweise hat sich erfindungsgemäss gezeigt, dass PSP im Harn von Rüden einen ausgezeichneten Marker für viele pathologische Veränderungen in der Prostata darstellt. Diese Abweichungen sind demgemäss nicht nur auf Tumorerkrankungen beschränkt, sondern ergeben für eine Vielzahl der im Rüden beschriebenen pathologischen Veränderungen der Prostata relevante Diagnoseinformationen.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens wird dem Rüden zunächst eine Harnprobe entnommen. Die Art der Entnahme ist nicht kritisch. Üblicherweise wird entweder Spontanharn oder Katheterharn gewonnen. Andere Arten, wie die Gewinnung von Zystozenteseharn, sind eben- falls geeignet.
Anschliessend wird der PSP-Gehalt in der Harnprobe bestimmt. Die Art der Bestimmungsme- thode ist hierbei ebenfalls nicht kritisch, vorzugsweise sollte aber eine gleiche oder zumindest eine ähnliche Bestimmung angewendet werden, wie sie bei der Bestimmung des PSP-Referenzwertes herangezogen wurde.
Im Stand der Technik sind verschiedenste Methoden zur Bestimmung von PSP beschrieben worden, darunter immunologische und enzymatische Methoden (s. z.B. Isaacs et al., J. B.C.
258 (10), S. 6610-6615). Diese eignen sich besonders gut zur schnellen diagnostischen Bestim- mung von PSP, da einerseits Antiserum gegen PSP leicht und spezifisch erhältlich ist und ande- rerseits die enzymatische Aktivität von PSP sehr spezifisch ist. Daher ist PSP in der Lage, synthe- tische Estersubstrate sehr spezifisch umzuwandeln, wodurch die Kombination derartiger enzymati- scher Umwandlungen mit colorimetrischen Detektionsmethoden möglich ist. Beispielsweise wurde
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len spezifischen Aktivität bei 25 C von 105 Mo1/min/mg und 33 Mo1/min/mg und Km-Werten von 7,4 und 9,1 mM hydrolysiert werden. PSP besitzt ein pH-Optimum bei 8,0 und kann durch Cu2+, Zn2+, Cd2+ und Cu + reversibel sowie durch Diisopropylfluorophosphat und Phenylmethansulfonyl- fluorid irreversibel inhibiert werden.
Eine geeignete enzymatisch colorimetrische Methode ist in Isaacs et al. (Journal of Biological Chemistry 259 (18) (1984),11520-11526) beschrieben.
Für die Reihentestung, insbesondere auch zur ständigen Überwachung von Rüden, die anfällig für Prostata-Erkrankungen sind, haben sich immunologische Methoden besonders bewährt. Bei- spielsweise kann PSP mit Hilfe von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern erkannt und quantifiziert werden. Hierbei können sowohl klassische Immunoassays, wie ELISA's, aber auch moderne Methoden, wie z. B. Chip-unterstützte Methoden, Immunassays in Kapillarröhrchen (WO 98/04920), verwendet werden.
Vorzugsweise können auch die beim Menschen für PSA beschriebenen Testmethoden für Se- rumproben (s. z. B. EP 0 904 397-A und EP 0 914 155-A) an die erfindungsgemässe PSP-Testung für Harnproben adaptiert werden.
Die Bestimmung des PSP-Gehaltes kann dabei bevorzugterweise in Reihenuntersuchungen mittels Mikrotiterplatten, Mikroassays oder Teststreifen durchgeführt werden.
Der ermittelte PSP-Gehalt in der Probe des jeweiligen Patienten wird dann mit einem Refe- renzwert verglichen. Dieser Referenzwert kann durch Anwendung der Testmethode an einer Standard-Harnprobe vorgenommen werden, wobei diese Bestimmung dann bevorzugterweise im gleichen Ansatz erfolgt wie die Bestimmung der Patientenprobe. Dieser Referenzharn kann dabei aus gesunden Rüden (oder einer Population von Rüden) entnommen worden sein. Als Standard- probe kann auch eine wässerige PSP-Lösung mit bekanntem PSP-Gehalt, die gegebenenfalls mit Puffer-, Konservierungs- oder Hilfsstoffen versetzt worden ist, dienen.
Andererseits kann als Referenzwert auch eine Tabelle oder eine Eichgerade bzw. eine Ver- gleichsskala dienen. Auch hierbei empfiehlt es sich, die Vergleichswerte oder die Vergleichsskala mit derselben Nachweismethode zu ermitteln, wie bei der Ermittlung des PSP-Gehaltes in der Patientenprobe. Es ist auch möglich, für die verschiedenen PSP-Bestimmungsmethoden jeweils eigene Eichwerte oder Eichgeraden zur Verfügung zu stellen, die den Laborspezifischen Voraus- setzungen Rechnung tragen. Beispielsweise kann aber auch einfach ein Referenzwert (oder meh- rere Referenzwerte) bzw. eine Referenzdetektion auf einem Teststreifen gemeinsam mit der Probe gemessen werden
Es hat sich gezeigt, dass im Regelfall ein Wert zwischen 20 und 300, in manchen Fällen bis 800, g PSP pro ml Harn als physiologisch angesehen werden kann.
Abweichungen hiervon kön- nen auf Grund des Alters oder der Rasse des Tieres vorkommen. Idealerweise wird als physiologi-
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scher Referenzwert der Normalwert des gleichen Rüden herangezogen. Dies ist vor allem bei stän- diger Überwachung des Rüden möglich. Dadurch können auch Veränderungen der Prostatafunk- tion sehr früh erkannt werden, weil es dann auch möglich ist, einen sehr viel schmaleren physio- logischen Referenzbereich (als z. B. zwischen 20 und 300 g PSP pro ml Harn) zu etablieren.
Abweichungen der Probe von diesem Referenzwert nach oben oder nach unten können auf ei- ne (pathologische) Veränderung in der Prostata hindeuten. Insbesondere gelten Werte von über 800 bzw. unter 15 g/ml Harn als pathologisch. Ein pathologischer Referenzwert enthält daher vor- zugsweise 800 bis 3000, insbesondere 1000 bis 2000 g, PSP/ml. Pathologische Referenzwerte unterhalb des physiologischen Wertes enthalten vorzugsweise von 2 bis 15, insbesondere 5 bis 10, g PSP/ml.
Es zeigte sich, dass erhöhte PSP-Gehalte mit einer akuten Entzündung der Prostata korrelie- ren. Besonders gut eignet sich das erfindungsgemässe Detektionssystem zur Diagnose von akuter Prostatitis, wobei im allgemeinen davon ausgegangen wird, dass bei PSP-Werten von 1000 bis 2500 g/ml Harn eine akute Prostatitis vorliegen kann.
Andererseits zeigen Werte unterhalb des physiologischen Bereiches eine nekrotisierende Ent- zündung der Prostata auf. So kann ein PSP-Gehalt von 5 bis 10 g/m1 eine nekrotische Prostatitis indizieren.
Wie erwähnt, zeigt das erfindungsgemässe System vor allem bei akuter und nekrotisierender Prostatitis seine Vorzüge, da diese Zustände eindeutig und im Bedarfsfall ohne Kombination mit weiteren Untersuchungsmethoden alleine aufgrund des PSP-Gehaltes im Harn diagnostiziert wer- den können Bei der Diagnose von anderen Prostata-Erkrankungen ist zwar das erfindungsgemä- #e Verfahren ebenfalls gut anwendbar, von einer Kombination mit anderen Diagnosemethoden sollte aber nur in den Fällen abgesehen werden, in denen die PSP-Werte des Rüden ständig gemessen werden und somit Abweichungen von physiologischen Zuständen viel genauer erfasst werden können als bei einmaligen Untersuchungen (z. B. erst nach Auftreten von Symptomen).
Aber selbst bei Erkrankungen, bei welchen die PSP-Konzentration im Harn alleine keine ein- deutige Diagnose ergibt, wie es beispielsweise bei Hyperplasie oder bei chronischer Prostatitis der Fall sein kann, kann die erfindungsgemässe Untersuchungsmethode herangezogen und bevorzug- terweise mit weiteren Untersuchungsmethoden kombiniert werden, um so zu einer sicheren Diag- nose zu kommen Diese weiteren Untersuchungsmethoden können selbstverständlich auch zur Verifizierung, beispielweise einer akuten oder einer nekrotischen Prostatitis, herangezogen wer- den. Besonders bevorzugt bei weiteren Untersuchungsmethoden sind dabei bildgebende Verfah- ren wie Ultraschall- oder Röntgenuntersuchungen sowie Blutuntersuchungen oder histologische und zytologische Untersuchungen.
Bei der Bestimmung des Gehaltes an PSP kann auch das Vorliegen und/oder die Verteilung der Proteinvarianten, z B durch isoelektrische Fokussierung oder das Vorliegen und/oder die Ver- teilung von PSP-Fragmenten, insbesondere nicht physiologischen PSP-Fragmenten, ermittelt wer- den. Auch bei einer derartigen qualitativen PSP-Analyse können Abweichungen vom physiologi- schen Zustand bzw. von der physiologischen Verteilung, insbesondere im jeweiligen Rüden, auf pathologische Zustände oder das Risiko von pathologischen Zuständen hindeuten. Erfindungsge- mäss ist daher auch diese qualitative Analyse von PSP unter "Bestimmen des PSP-Gehaltes" anzu- sehen.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Detek- tion von Veränderungen in der Prostata von Rüden, bei welchem eine Probe aus Prostatagewebe entnommen wird, darin der PSP-Gehalt bestimmt wird und mit einem Referenzwert verglichen wird Als Prostatagewebe können dabei punktiertes Material sowie operativ entnommenes Material, aber auch Prostatasekret oder Prostatalavagen herangezogen werden Auch hierbei beruht die Erfin- dung darauf, dass bei pathologischen Veränderungen in der Prostata der Gehalt an PSP gegen- über einem gesunden Wert verändert ist.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion von Veränderungen in der Prostata von Rüden, bei welchem eine Spermaprobe entnommen wird, der Gehalt an PSP in der Spermaprobe bestimmt und mit einem PSP-Gehalt eines Referenzwertes verglichen wird.
Schliesslich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Kit zur Durchführung der erfindungsge- mässen Detektionsverfahren, welcher die folgenden Komponenten umfasst:
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- einen oder mehrere Behälter zur Aufnahme von Proben, - Mittel zur Bestimmung des PSP-Gehaltes in der Probe und - einen oder mehrere Referenzwert(e).
Wie bereits zuvor erwähnt, können die Proben-Aufnahmebehälter auf beliebige Art verwirklicht werden. Es hat sich bewährt, hierfür bereits für andere Zwecke etablierte Systeme zu verwenden, insbesondere die bereits für die PSA-Analytik beim Menschen bekannte Methode auch für die erfindungsgemässen Anwendungen zu adaptieren. Dies ist für den Fachmann ohne weiteres mög- lich (wobei den Unterschieden in der Detektion von Proben aus Serum (bei PSA) und von den erfindungsgemäss zu bestimmenden Proben, insbesondere von Harnproben (bei PSP), für den Fachmann ohne weiteres Rechnung getragen werden kann).
Als Referenzwert kann im erfindungsgemässen Kit z. B. eine schriftliche bzw. tabellarische Form gewählt werden, etwa eine Referenzkurve oder eine Vergleichstabelle, oder aber eine Vergleichs- probe zur Verfügung gestellt werden. Auch die Verwendung von Barcodes oder Farbtabellen ist vorteilhaft.
Beispielsweise kann eine PSP enthaltende Vergleichsprobe im Kit enthalten sein, vorzugswei- se in einer lagerstabilen (lyophilisierten) Form, die bei Bedarf rekonstituiert werden kann.
Als Mittel zur Detektion von PSP können sämtliche in der Diagnostik bewährte Methoden zum Einsatz kommen, insbesondere diejenigen, die bereits in der Analyse von Harnproben bei Mensch und Tier Anwendung gefunden haben. Aus Gründen der einfacheren Handhabung können Refe- renzwerte gleichzeitig mit der Probenbestimmung ermittelt werden oder aber auf sonstige Weise unmittelbar bereitgestellt werden (z. B. bei Teststreifen mit Farbindikatoren durch Bereitstellung von Mustern (z.B. auf einer Vergleichsabbildung)).
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt sein soll, näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1: SDS-PAGE gesunder Hunde;
Fig. 2 : SDS-PAGE von Rüden mit Prostata-Erkrankung ; Fig. 3: mit Anti-PSP immungefärbte Prostata in 60-facher Vergrösserung.
Beispiele:
Untersuchte Tiere:
Es standen insgesamt 46 Hunde zur Verfügung. Als Kontrollgruppe dienten 22 reinrassige Beagles (16 Rüden, davon 2 kastriert, und 6 Hündinnen, alle im Alter von 2 bis 4 Jahren). Bei diesen Rüden wurden, ausser hämatologischen und klinisch-chemischen Blutuntersuchungen regelmässig klinische Untersuchungen durchgeführt. Von allen Tieren wurde Katheterharn, bei den Rüden mehrmals in der Früh Spontanharn und von zwei Rüden auch Zystozenteseharn gewonnen.
Sämtliche Rüden wurden auch einer einmaligen Ultraschalluntersuchung der Prostata unterzogen
Weiters standen Harnproben von 24 nicht kastrierten Rüden verschiedener Rassen, unter- schiedlichen Alters, mit klinischer Symptomatik einer Prostataerkrankung ("Patienten") zur Verfü- gung. Diese Tiere wurden ebenfalls alle klinisch untersucht und ein bildgebendes Verfahren (Ultra- schall, Röntgen) zur Abklärung der Diagnose angeschlossen.
Harnuntersuchungen :
Zur Harnuntersuchung wurden sämtliche Harnproben mittels Teststreifen (Combur-Test) und das Sediment mikroskopisch untersucht. Die verbleibenden Proben wurden portioniert und bei -20 C für die weiteren Untersuchungen tiefgefroren. Bei den gesunden Tieren zeigte sich gegen- über den Patienten ein wesentlich unauffälligerer Befund. Bei der Untersuchung der Harnprobe der Patienten mittels Teststreifen konnten keine einheitlichen Ergebnisse, die Hinweise auf pathologi- sche Veränderung der Prostata gegeben hätten, gewonnen werden.
Die in der Literatur beschriebenen Veränderungen im Harn (Hämaturie, Leukozyturie) konnten zwar in einzelnen Fällen beobachtet werden, jedoch konnten diese Befunde nicht in Einklang mit einer bestimmten Krankheit gebracht werden.
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Proteinbestimmung :
In den Harnproben wurde Eiweiss nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), 248-254); modifiziert fur Mikrotiterplatten) durchgeführt. Dabei lag die Gesamteiweisskonzentration im Harn der gesunden Rüden im Bereich bis 700 g/m1 Die Gesamtproteinkonzentration im Harn der kranken Tiere war in den meisten Fällen deutlich höher als die der gesunden Vergleichsgrup- pe. Die Proteinwerte der kastrierten Rüden und der Hündinnen bewegten sich im gleichen Kon- zentrationsbereich wie die der Rüden.
Im Harn intakter Rüden stellte sich PSP als Hauptprotein dar (Fig. 1; 1: Marker ; 2,3,6,7 : Rüde ; 4,8' Rüde, kastriert; 5,9' Hündin, @ @ PSP). Die anderen Proteinbanden stammten von physio- logisch im Harn vorkommenden Proteinen, vor allem Albumin, Transferrin und IgG. Bei Prostataer- krankungen war vor allem eine Veränderung in der Bandenstärke von PSP zu bemerken (Fig. 2, 1 Marker ; 2 : Hämoglobin ; 3. Ejakulat; 4,8 : Prostatahyperplasie; 5,9 : akute Prostatitis, 6,10 : sierende Prostatitis ; chronische Prostatitis; @ PSP).
Das Proteinverteilungsmuster im Harn zeigt, dass bei gesunden Rüden PSP meist den grössten Anteil des ausgeschiedenen Proteins darstellt. Es liess sich auch im Katheterharn und in jenen Harnprodukten, die mittels Zystozentese gewonnen wurden, nachweisen. Das lässt sich durch den Reflux von Harn aus dem Bereich der proximalen Urethra in die Harnblase erklären Ausserdem fand man Proteinbanden anderer physiologisch im Harn vorkommender Proteine. Bei unterschied- lichen Erkrankungen ändert sich das Proteinverteilungsmuster generell, bei Erkrankungen der Prostata kam es in erster Linie zu Veränderungen in der Bandenstärke des PSP.
Elektrophorese :
Bei der Durchführung der SDS-PAGE wurde die Methode nach Laemmli leicht modifiziert. Die anschliessende Silberfärbung wurde in modifizierter Form durchgeführt Als Markerproteine/Rein- substanzen wurden verwendet Rüde-Hämoglobin, Rüde-Myoglobin, Rude-IgG, Rüde-Transfernn (alle erhalten von der Fa. Sigma).
Im Anschluss an die Elektrophorese wurden die Proteine in einer Semi-dry-Blot-Apparatur bei 0,8 mA/cm2 aus dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran übertragen Dazu wurden 3 Blatt Filter- papier, Nitrocellulose (auf der anodischen Seite des Gels) das zu blottende Gel und zwei weitere Lagen von puffergetränktem Filterpapier übereinander geschichtet. Es wurde dabei ein Blotpuffer mit 48 mM Tns, 39 mM Glycin und 1,3 mM SDS verwendet Methanol wurde nicht zugesetzt. Nach erfolgter Proteinübertragung (1,5 Stunden Blotzeit) wurden die Proteine auf der Membran entspre- chend lokalisiert, das geblottete Gel durch Silberfärbung auf Effizienz der Proteinübertragung überprüft.
Nach der Elektrophorese wurden die Blots 30 min mit 1 % Gelatine in TBS (20 mM Tris, 0,5 M NaCI, pH 7,5) inkubiert, um freie Bindungsstellen an der Membran zu blockieren Diese und alle weiteren Inkubationen wurden unter leichtem Schütteln und bei Raumtemperatur durchgeführt Anschliessend wurde die Membran 2 h mit einer PSP-Antikörperlösung (20 1 Antiserum/20-50 ml
1 % Gelatine in TTBS (TBS + 0,05 % Tween20) inkubiert. Darauf folgte ein dreimaliges Waschen von je 5 min in TTBS und die Reaktion mit der Konjugatlösung (20 m1 Konjugat/20-50 ml 1 % Gela- tine in TTBS). Nach 2 h wurde unspezifisch anhaftendes Konjugat durch Waschen in TTBS (2 x 5 mim) und TBS (1 x 5 min) entfernt und die frisch zubereitete Substratlösung zugesetzt.
Nach etwa 5 bis 10 min wird die Reaktion durch Abgiessen der Lösung und zweimaliges Waschen der Membran mit Aqua Bidest. abgestoppt.
Immunhistochemie:
Paraffinpräparate der Prostata von vier Patienten dieser Studie und diverse archivierte Paraf- finpräparate von normalen und veränderten Prostatae sowie von Leber, Lunge, Hoden, Harnblase, Urethra, Pankreas, Speicheldrüse und frisches Ejakulat von Rüden wurden mit dem Antiserum gegen PSP immunhistochemisch untersucht (Avidin-Biotin-Complex-Technik).
Durchführung :
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Die Paraffinschnitte werden entparaffiniert und für 5 min in Aqua Bidest. gelegt.
Zur Demaskierung der Antigene werden die Schnitte 2 x 5 min in der Mikrowelle mit Citratpuffer erhitzt und anschliessend mit PBS gespült. Die Hemmung der endogenen Peroxidase erfolgt durch Inkubation über 30 min mit 1,5 % H202 in Methanol und anschliessender Spülung mit PBS für 20 min Daraufhin werden die Präparate 1 h mit Ziegennormalserum 1:10 mit Albuminzusatz in der feuchten Kammer überschichtet. Das Normalserum wird abgeschüttelt und die Präparate über Nacht mit dem Antikörper inkubiert Der Antikörper wird in der Verdünnung 1:8000 eingesetzt, die Inkubation erfolgt in der feuchten Kammer im Kühlschrank. Daran anschliessend wird ein neuerli- cher Spülvorgang über 4 x 5 min mit PBS durchgeführt.
Die Präparate werden für 30 min mit dem zweiten Antikörper - Biotin anti rabbit IgG - in der Verdünnung 1:400 in der feuchten Kammer überschichtet und anschliessend 10 min mit PBS gewaschen. Die Inkubation mit ABC-Peroxidase- Reagens dauert 1 h und wird von einem weiteren 10-minütigem Spülvorgang abgelöst. Daraufhin werden die Schnitte 1,5 h mit DAB (Diaminobenzidin) -Substrat inkubiert und die Reaktion mit H20 gestoppt. Die Gegenfärbung erfolgt mit Hämalaun.
Das frisch gewonnene Ejakulat wurde dreimal mit PBS gewaschen und mit 1000 U/min (91 g) zentrifugiert. Das Sediment wurde auf Objektträgern ausgestrichen und luftgetrocknet. Die Färbung erfolgt wie für Gewebeschnitte beschrieben.
In den immunhistochemischen Untersuchungen zeigte sich, dass mit Hilfe des Antkörpers Drü- senzellen der Prostata spezifisch angefärbt werden können (Fig. 3). Dies traf auch für pathologisch veränderte Prostatae zu, unabhängig von der Art der Läsion. Die einzige Ausnahme bildeten schlecht differenzierte Karzinomzellen der Prostata, in denen PSP immunhistochemisch nicht nachzuweisen war. In den untersuchten anderen Organen und in den Ausstrichen der gewasche- nen Samenzellen konnte keinerlei positive Reaktion nachgewiesen werden.
Diese immunhistochemischen Untersuchungen der verschiedenen Organe zeigten, dass sich PSP nur in der Prostata lokalisieren liess. Eine Anfärbung der Spermien sowie eine schwach positive Reaktion in Pankreas und Speicheldrüse, wie sie in der Literatur schon beschrieben wor- den ist, konnte nicht nachvollzogen werden.
Ultraschalluntersuchungen:
Die Tiere wurden in Seitenlage fixiert. Die Prostata wurde im Transversalschnitt und im Sagit- talschnitt dargestellt, vermessen und die Parenchymdichte und die Homogenität beurteilt.
Die Ultraschalluntersuchungen der Beaglerüden ergab ein physiologisches Bild der Prostata mit der der Rasse entsprechenden Grösse und mit homogenem Parenchym. Die Prostata der kastrierten Rüden stellte sich entsprechend verkleinert dar und zeigte ebenfalls keinerlei Paren- chymveränderungen. Bei allen Patienten konnte eine Prostatavergrösserung festgestellt werden.
Bei Patienten, die neben der Vergrösserung mässig inhomogenes Parenchym aufwiesen, wurde die Diagnose Hyperplasie gestellt. Patienten, die deutliche Parenchymhomogenitäten mit Verkalkungs- herden und ebenfalls intraprostatische Zysten zeigten, wurden der Gruppe mit chronischer Prosta- titis zugeordnet.
ELISA:
Zur quantitativen Bestimmung des PSP wurde ein indirekter, kompetitiver ELISA herangezo- gen. Der eingesetzte Antikörper wurde mit gereinigtem PSP in Kaninchen gewonnen. Die Optimie- rung des Systems erfolgte nach der Methode von Crowther (Crowther "Competitive ELISA" in : The Protein Protocols, Walker M., ed. CD-ROM (1998), Sect. 12. 7 und 12. 9). Die Harne der gesunden Rüden wurden anfangs in den Verdünnungen 1 :500, 1 :2000 1 :4000 gemessen.Im Verlauf der Untersuchungen stellte sich heraus, dass die Verdünnungen 1:1000 und 1:2000 aus- reichend waren. Die Harnproben der kastrierten Rüden und der Hündinnen wurden zusätzlich unverdünnt eingesetzt.
Zur Kontrolle der Sensitivität wurden je eine Harnprobe und eine Spermaprobe in einer Ver- dünnungsreihe sowie eine additive Mischung der beiden Proben eingesetzt. Im linearen Bereich der Messkurve liess sich die Addition der Gehalte an PSP beider Proben über die Konzentrations- berechnung mit Hilfe der Eichkurve sowie im Kurvenverlauf eindeutig nachvollziehen. Die Kontrolle
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der Spezifität diente dazu zu überprüfen, inwieweit Fremdprotein (Serum) bzw. Eigenfärbung der Probe (Blut) einen Einfluss auf die Ergebnisse des ELISA zeigten. Dazu wurde die PSP-Konzentra- tion einer Harnprobe sowohl "nativ" als auch nach Zusatz von definierten Mengen an Serum und Blut bestimmt. Es zeigte sich, dass weder unterschiedliche Konzentrationen an Protein noch Farb- stoff einen Einfluss auf die Ergebnisse der PSP-Bestimmung im Harn hatten.
Die mit dem ELISA ermittelten Ergebnisse zeigen, dass PSP als Marker für Veränderungen der Prostata verwendet werden kann. Es zeigte sich, dass ein PSP-Konzentrationsbereich für gesunde Rüden bei dieser Gruppe etwa im Bereich zwischen 20 und 300 g PSP pro ml Harn vorliegt (siehe Tabelle 1 mit den gesunden Vergleichstieren). Eindeutig nicht nachweisbar war das Protein bei Hündinnen und kastrierten Rüden. Kurz nach der Kastration Hessen sich jedoch noch Spuren an PSP nachweisen.
Im Harn der Tiere mit Prostata-Hyperplasie und chronischer Prostatitis lagen die PSP-Konzen- trationen grösstenteils in einem Bereich, der mit jenem der gesunden Tiere überlappt, nicht jedoch einen physiologischen Wert für den jeweiligen Rüden darstellen muss (siehe Tabelle 2 mit den PSP-Konzentrationen in Harnen von Patienten). Jene Tiere mit akuter und nekrotisierender Prosta- titis liessen sich alleine durch die Bestimmung von PSP im Harn eindeutig abgrenzen. Die Diagnose der Prostataerkrankung wurde durch Ultraschall und klinische Untersuchung gestellt, bei den Fällen mit nekrotisierender Prostatitis durch pathohistologische Untersuchungen.
Bei akuter Pros- tatitis kam es zu sehr hohen PSP-Konzentrationen (1077 bis 2085 g PSP/ml Harn), während bei Patienten mit nachgewiesener nekrotisierender Prostatitis sehr niedrige PSP-Konzentrationen (5,8 bis 7,7 g PSP/mi) gemessen wurden
Es zeigte sich, dass sich sogar trotz der geringen Anzahl an untersuchten Einzeltieren akute und nekrotisierende Prostatitiden alleine durch Bestimmung der PSP-Konzentration im Harn ein- deutig diagnostizieren lassen.
Es zeigte sich aber auch, dass bereits stattfindende Veränderungen der Prostata auf zellulärer Ebene sich auch auf die PSP-Konzentration auswirken können, insbesondere, wenn Referenzwer- te vom selben Tier herangezogen werden. Demgemäss bietet sich mit der vorliegenden Erfindung eine breitgestreute Untersuchung gesunder junger, geschlechtsreifer Rüden an, dass durch regel- mässige Messungen auch differenzierte Aussagen bei Erkrankungen, wie Hyperplasien und chroni- schen Prostatitiden, möglich sind. Das erfindungsgemässe System eignet sich daher speziell auch für die Früherkennung von Organveränderungen (z. B. in erster Linie Hyperplasien). Die Vorteile der erfindungsgemässen Methode gegenüber herkömmlichen diagnostischen Verfahren liegt vor allem in der relativ einfachen und nichtinvasiven Technik.
Durch die Früherkennung der Verände- rungen in der Prostata bietet sich demgemäss die Möglichkeit der rechtzeitigen Therapie und somit wesentlich günstigere prognostische Aussichten
Tabelle 1
PSP-Konzentration in Harnen gesunder Beagles
EMI7.1
<tb> Rasse <SEP> Alter <SEP> Geschlecht <SEP> Erkrankung <SEP> Konzentration
<tb>
<tb> (Jhare) <SEP> g/m1
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 99
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 82
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 33
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 95
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 205
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 116
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 1 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 125
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 49
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> m.
<SEP> 1 <SEP> 132
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 99
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 5 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 310
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 6 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 530
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 25
<tb>
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EMI8.1
<tb> Rasse <SEP> Alter <SEP> Geschlecht <SEP> Erkrankung <SEP> Konzentration
<tb>
<tb> (Jahre) <SEP> g/m1
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 164
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 7 <SEP> 2 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 100
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 129
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 9 <SEP> 2 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 244
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 10 <SEP> 2 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 114
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 11 <SEP> 2 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 79
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 12 <SEP> 2 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 133
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 13 <SEP> 2 <SEP> m.
<SEP> 1 <SEP> 428
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 14 <SEP> 2 <SEP> m. <SEP> 1 <SEP> 81
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 15 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> k. <SEP> 1 <SEP> 0,051
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 16 <SEP> 4 <SEP> m. <SEP> k. <SEP> 1 <SEP> 0,065
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 17 <SEP> 4 <SEP> w. <SEP> 1 <SEP> 0,011
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> w. <SEP> 1 <SEP> 0,016
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 19 <SEP> 4 <SEP> w. <SEP> 1 <SEP> 0,051
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 20 <SEP> 4 <SEP> w <SEP> 1 <SEP> 0,050
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 21 <SEP> 4 <SEP> w. <SEP> 1 <SEP> 0,012
<tb>
<tb> Beagle <SEP> 22 <SEP> 4 <SEP> w.
<SEP> 1 <SEP> 0,037
<tb>
Tabelle 2 PSP-Konzentrationen in Harnen von Patienten
EMI8.2
<tb> Rasse <SEP> Alter <SEP> Geschlecht <SEP> Erkran- <SEP> Konzentra-
<tb>
<tb> (Jahre) <SEP> kung <SEP> tion <SEP> g/m1
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 10 <SEP> m <SEP> 2 <SEP> 34
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 10 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 258
<tb>
<tb> Schäfer <SEP> 6 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 130
<tb>
<tb> kl.Münsterländer <SEP> 6 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 293
<tb>
<tb> Dobermann <SEP> 8 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 75
<tb> Schäfer <SEP> 10 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 21
<tb>
<tb> Irisch <SEP> Setter <SEP> 7 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 917
<tb>
<tb> Hirtenrüde <SEP> 14 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 662
<tb>
<tb> Schäfer <SEP> 9 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 111
<tb>
<tb>
<tb> Spaniel <SEP> 11 <SEP> m. <SEP> 2 <SEP> 475
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 7 <SEP> m.
<SEP> 2 <SEP> 403
<tb>
<tb> Spaniel <SEP> 4 <SEP> m <SEP> 3 <SEP> 1970
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 10 <SEP> m. <SEP> 3 <SEP> 1077
<tb> Rottweiler <SEP> 6 <SEP> m. <SEP> 3 <SEP> 2085
<tb>
<tb>
<tb> Spaniel <SEP> 14 <SEP> m. <SEP> 4 <SEP> 52
<tb> WHW-Terrier <SEP> 11 <SEP> m. <SEP> 4 <SEP> 28
<tb>
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 15 <SEP> m. <SEP> 4 <SEP> 73
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 12 <SEP> m. <SEP> 4 <SEP> 33
<tb> Dobermann <SEP> 7 <SEP> m. <SEP> 4 <SEP> 190
<tb>
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 8 <SEP> m <SEP> 4 <SEP> 36
<tb> Sheltie <SEP> 9 <SEP> m. <SEP> 4 <SEP> 49
<tb>
<tb> Alask. <SEP> Malamute <SEP> 11 <SEP> m. <SEP> 4 <SEP> 41
<tb>
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 13 <SEP> m. <SEP> 5 <SEP> 6
<tb>
<tb> Mischling <SEP> 12 <SEP> m <SEP> 5 <SEP> 8
<tb>
m. = männlich; w. = weiblich;
m. k. = männlich/kastriert
<Desc/Clms Page number 9>
Art der Erkrankung (Zuordnung zur Erkrankungsform erfolgte aufgrund der klin Untersuchung und des Ultraschallbefundes):
1 = gesund
2 = Hyperplasie
3 = akute Prostatitis
4 = chronische Prostatitis
5 = nekrotische Prostatitis
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Detektion von Veränderungen in der Prostata von Rüden, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte.
- Entnahme einer Harnprobe, - Bestimmen des Gehaltes an Prostata-spezifischem Protein (PSP) in der Harnprobe und - Vergleichen des bestimmten PSP-Gehaltes mit zumindest einem PSP-Referenzwert.