DE69817338T2

DE69817338T2 - Verfahren zum nachweis von autoimmun-pathologien

Info

Publication number: DE69817338T2
Application number: DE69817338T
Authority: DE
Inventors: Klaus Petry; Anne Boullerne
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2004-06-24
Anticipated expiration: 2018-04-29
Also published as: DE69817338D1; WO1998049558A1; CA2287973A1; EP0980525A1; EP0980525B1; FR2762602B1; ATE247831T1; JP2002506516A; FR2762602A1

Description

Die Erfindung betrifft Mittel zur Früherkennung von entzündlichen Auto-Immun-Pathologien des zentralen oder peripheren Nervensystems.
Sie betrifft besonders Hilfsmittel und Methoden, welche die frühzeitige Vorhersage des Auftretens von klinischen Schüben oder Läsionen voraussagen, wie sie bei den Auto-Immu-Krankheiten des zentralen oder peripheren Nervensystems beobachtet werden, beispielsweise im Fall der Multiplen Sklerose oder peripherer Neuropathien, die zusammenhängen mit IgM-Gammopathien oder dem Guillem-Barre-Strahl-Syndrom.
Man erinnert sich, daß die Multiple Sklerose (abgekürzt MS), eine entmyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems, gekennzeichnet ist von entzündlichen Schädigungen (Läsionen) und Entmyelinisierungen („plaques"), die in der weißen Gehirn- und Medullasubstanz verteilt auftreten.
Die Mechanismen der Bildung neuer Läsionen der MS sind allmählich gut bekannt. Sie umfassen die folgenden Stufen: 1) Zellen der Makrophagen-Linie präsentieren den Hilfs-T-Lymphozyten in Gegenwart von pro-entzündlichen Zytokinen ein Antigen, 2) Lymphozyten vermehren und differenzieren sich, 3) die Blut-Gehirnschranke bricht und diese immunokompetenten Zellen gelangen in das Parenchym und bewirken eine Entmyelinisierung.
Die Läsionen können sich in Richtung auf einen axonalen Verlust und/oder eine astrozytäre Gliose entwickeln.
Man unterscheidet drei Hauptentwicklungsformen von MS, die gekennzeichnet sind durch ihre klinische Entwicklung, jedoch auch durch die Lokalisierung der Läsionen, die Anomalien im NMR-Bild und den verbundenen immunologischen Störungen.
Die häufigste Form ist die remittierende Form, die gekennzeichnet ist durch eine Entwicklung mit in Abständen auftretenden Schüben und dazwischen mehr oder weniger vollständigen Remissionen.
Die primäre progressive Form ist gekennzeichnet durch eine von Beginn der Krankheit an regelmäßige und fortschreitende Entwicklung.
In der sekundären progressiven Form folgt eine progressive Entwicklung auf eine Remissionsphase.
Die Frequenz der Schübe ist von einem zum anderen Patienten sehr verschieden und ihre Schwere ist nicht vorhersehbar.
So ist die Seltenheit von Schüben gewöhnlich ein Faktor zur Vorhersage einer geringen Behinderung. Bestimmte Patienten entwickeln jedoch schwere Folgen im Verlauf einer geringen Zahl von Schüben. Dagegen zeigen andere Patienten nur geringe Folgen trotz einer erhöhten Häufigkeit von Schüben. Die NMR-Untersuchungen haben gezeigt, daß die Mehrzahl der Patienten eine Aktivität ihrer Krankheit (Auftreten von neuen Läsionen) außerhalb von klinischen Schüben zeigt, jedoch ist diese Aktivität von einem zum anderen Patienten sehr verschieden.
Dieser Prozeß der Remission gefolgt von Schüben findet sich auch in den anderen oben erwähnten entzündlichen Auto-Immun-Pathologien, beispielsweise in der rheumatischen Polyarthritis.
Die gegenwärtigen Therapien bestehen im wesentlichen in einer Behandlung der klinischen Symptome. Sie bestehen tatsächlich in der Unterdrückung von Schüben durch Immunosuppressoren oder der Gabe von Corticosteroiden.
Diese therapeutischen Maßnahmen müssen jedoch unter sorgfältiger Beachtung der nicht vernachlässigbaren Nebenwirkungen der verabreichten Medikamente und ihrer hohen Kosten verordnet werden.
Diese Situation hat dazu geführt, biologische Marker zu suchen, welche die Vorhersage des Auftretens eines Schubs ermöglichen.
Beispielsweise wurden für die MS mehrere Strategien angewandt.
So wurde gezeigt, daß die von benignen Formen der MS befallenen Patienten über ein Jahr hinweg im NMR-Bild zu einer geringeren Häufung von neuen Läsionen neigten. Jedoch ist das eine rückblickende Feststellung, die in der therapeutischen Praxis wenig nützlich ist.
Die Produktion von TNF-α durch zirkulierende mononukleare Zellen des Blutes wurde als ein vorhersagekräftiger Marker des Auftretens eines klinischen Schubs oder einer neuen Läsion angesehen, jedoch bleiben die Daten von einer zur anderen Untersuchung widersprüchlich und dieser Marker gestattet nicht die Vorhersage weder der Schwere noch der Folgen des Schubs. Dieser Marker wird daher nicht routinemäßig benutzt.
Die Arbeiten der Erfindung auf den Gebiet dieser Neuropathien (1) und (2) haben sie dazu geführt, hohe Gehalte an Anti-NO-Cystein-Antikörpern oder auch Anti-Fettsäure-Antikörpern bei den von Krankheiten dieses Typs betroffenen Kranken aufzuzeigen.
Unter Verwendung eines Tiermodells von experimenteller Auto-Immun-Enzephalitis (EAE), deren Symptome denen der menschlichen MS nahekommen, haben die Erfinder die Rolle dieser Antikörper als vorhersagekräftige Marker der Entwicklung der Krankheit aufgezeigt.
Die durchgeführten Untersuchungen haben es ermöglicht, diese Ergebnisse für entzündliche Auto-Immun-Krankheiten des zentralen Nervensystems oder peripheren Nervensystems zu generalisieren.
Die Erfindung bezweckt daher, neue Marker und Tests zu liefern, welche die Vorhersage des Auftretens, der Schwere und der Entwicklung eines Schubs und damit die Durchführung einer genauen präventiven Behandlung dieser Schübe ermöglichen.
Die Erfindung beabsichtigt so die in vitro Verwendung von Antikörpern, wie sie während einer entzündlichen Auto-Immun-Pathologie des zentralen Nervensystems oder peripheren Nervensystems gebildet werden, wobei diese Antikörper zu der Gruppe gehören, die aus den Anti-NO-P-Antikörpern besteht, worin P ein Protein, ein Protein in rekombinanter Form, ein Peptid oder eine Aminosäure, die NO akzeptieren kann, oder den Anti-Fettsäuren-Antikörpern besteht, als Frühindikatoren, welche einen klinischen Schub oder eine neue pathologische Läsion ankündigen.
In den erfindungsgemäß als Marker verwendeten Anti-NO-P-Antikörpern bedeutet P besonders als Protein ein mit Myelin assoziiertes Glycoprotein (MAG) oder ein Hauptglycoprotein der Oligodendrozyten (MOG) oder als Aminosäure P einen Cysteinrest.
Allgemein gesagt kann das durch P wiedergegebene Protein in rekombinanter Form vorliegen.
In den Anti-Fettsäuren-Antikörpern ist die Fettsäure beispielsweise ausgewählt unter Laurinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentansäure und Docosahexaensäure.
In überraschender Weise kann die Anwesenheit dieser Antikörper im Serum der Kranken mit dem späteren Auftreten eines Schubs oder einer Läsion korreliert werden. Die an einem EAE-Modell durchgeführten Untersuchungen, die in den folgenden Beispielen dargelegt sind, ermöglichen die Herstellung einer Korrelation zwischen dem Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern, dem funktionalen Defizit, gemessen durch die Muskelkraft, und dem Grad der Entmyelinisierung des Kleinhirns.
Ebenso wurde eine Korrelation festgestellt zwischen der Bildung von Anti-Fettsäure-Antikörpern in einem vorklinischen Stadium und der späteren Entwicklung der Krankheit.
Die Erfindung liefert auch einen diagnostischen Frühtest für das Auftreten des Schubs und von Läsionen in einer entzündlichen Auto-Immun-Pathologie des zentralen Nervensystems oder peripheren Nervensystems, welcher dadurch gekennzeichnet ist, daß die Marker des Entzündungsprozesses, der Entmyelinisierung und des Muskeldefizits aus Anti-NO-P-Antikörpern bestehen, worin P wie oben definiert und/oder Anti-Fettsäure ist.
Dieser Test umfaßt vorteilhafterweise die qualitative und quantitative Messung von Anti-NO-P- und/oder Anti-Fettsäure-Antikörpern im Serum eines Patienten, indem eine Serumprobe mit einem nitrosylierten Antigen, das P oder eine Fettsäure aufweist, in Berührung gebracht und die Antigen-Antikörper-Reaktion festgestellt wird, wenn sie eintritt.
Das Inberührungbringen umfaßt die Inkubation der untersuchten Probe und des Antigens bei einer zur Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes geeignete Temperatur. Man arbeitet im allgemeinen bei einer Temperatur in der Größenordnung von 37°C.
Das Antigen ist gewöhnlich an ein Trägerprotein gekoppelt.
Die gewöhnlich verwendeten Proteine umfassen das KLH (Patella-Hämozyanin) oder das BSA (Rinderserumalbumin), das in entfetteter Form verwendet wird, wenn der Test zur Bestimmung von Anti-Fettsäure-Antikörpern angewandt wird.
Das Trägerprotein wird im allgemeinen vom Hapten durch einen Spacer-Arm getrennt. Es handelt sich beispielsweise um Glutaraldehyd.
Das Antigen weist vorzugsweise als P-Einheit einen Cysteinrest und als Fettsäure eine beliebige Fettsäure auf, die beispielsweise ausgewählt ist unter Laurinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentansäure und Docosahexaensäure.
Das Antigen ist vorzugsweise an einen Träger, wie einer Multiwell-Mikroplatte.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entspricht der Test einer ELISA-Methode, wobei ein zweiter Antikörper am Antigen fixiert ist und nach den bekannten Methoden erkannt wird.
Parallel zu den serologischen Untersuchungen ermöglicht die Erfindung einerseits eine Antigen-Charakterisierung der nitrosylierten Myelin-Moleküle und andererseits eine molekulareAnalyse beispielsweise von Zytokinen, Metallo-Proteinasen, freien Radikalen, Wechselwirkungen von mikroglialen Zellen und SNC-Zellen (Astrozyten), die bei den Myelin-Läsionen eine Rolle spielen.
Die Antigen-Charakterisierung wird vorteilhafterweise an nitrosylierten rekombinanten Proteinen vorgenommen. Verschiedene Aufbaumaßnahmen ermöglichen so beispielsweise die Synthese von Fragmenten des rekombinanten MOG. Um die verschiedenen Formen und Entwicklungsstadien der MS zu unterscheiden, nutzt man dann mit Vorteil eine Serumbank von Patienten gegen diese nitrosylierten rekombinanten Proteine.
Die Erfindung wird mit weiteren Einzelheiten und Vorteilen erläutert durch die folgenden Beispiele.
Diese Beispiele beziehen sich auf die 1 bis 4, in denen jeweils dargestellt ist:
1 die optische Dichte (Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern) und das während einer EAE bei der Ratte gemessene funktionelle Defizit;
2 Photographien mit dem optischen Mikroskop von Kleinhirnschnitten während des EAE;
3 die Koeffizienten der Korrelation zwischen den Anti-NO-Cystein-Antikörpern am 6. Tag nach der Induktion des EAE und der Muskelkraft; und
4 das Photo eines Western-Blot, welches humane Myelin-Antigene zeigt, die durch die Seren von Patienten mit MS nitrolysiert sind.
Beispiel 1: Materialien und Methoden
a) Koppeln von Cystein an BSA (Rinderserumalbumin oder Albumin des Rinderserums) über Glutaraldehyd
Für ein Kopplungsverhältnis von 9 verfährt man wie folgt: Man bereitet zunächst

– 5 ml einer Lösung von 5%-igem Glutaraldehyd (1 ml 2,5%-iger Glutaraldehyd + 4 ml Wasser);
– Natriumacetatpuffer (1,5 M, pH 8–8,5);
– eine Lösung von Na-Borhydrid (Wasser in einem 3 ml-Reagenzglas mit einer kleinen Spatelspitze NaBH₄).

Man wiegt getrennt 3 mg L-Cystein und 10 mg BSA.
Man nimmt das L-Cystein in 1 ml Acetatpuffer auf und gibt dann 1 μl tritiertes (³H) Tyrosin 1,9 TBq/mmol in die L-Cystein-Lösung und außerdem 100 μl des 5%-igen Glutaraldehyds sowie die BSA. Die Mischung wird mit dem Vortexgerät behandelt. Man läßt die Mischung während mindestens 5 Minuten reifen, wobei man von Zeit zu Zeit die Vortex-Behandlung fortsetzt.
Man fügt dann 100 μl des Natriumborhydrids zu und läßt die Reaktion während etwa 30 Minuten unter regelmäßigem Rühren ablaufen.
Man unterwirft dann die Reaktionsmischung während 24 Stunden einer Dialyse gegen Wasser unter Verwendung von drei Bädern.
Die Radioaktivität wird an Aliquots von 100 μl gemessen, die vor und nach der Analyse genommen sind, um die Kopplungsrate der Aminosäure an das BSA zu berechnen. Die Konzentration des BSA wird ermittelt, indem man die optische Dichte (OD) bei 280 nm mißt. Das Kopplungsverhältnis beträgt 9. Dieses Verhältnis bleibt erhalten, wenn man alle Volumina mit 2 multipliziert.
Das gebildete Kopplungsprodukt, das hiernach abgekürzt als Cys-g-BSA bezeichnet ist, worin g = Glutaraldehyd, entspricht der Formel:
b) Nitrosylierung von Cys-g-BSA mit NaNO₂ Man wiegt 2 mg NaNO₂ für 1 mg Cys-g-BSA in ein Reagenzglas unter Ausschluß von Licht ein.
Man fügt dann das NaNO₂ zu 1 ml Cys-g-BSA und dann HCl (41,7 μl konzentrierte 12 N HCl auf 1 ml) zu. Man beobachtet eine Farbveränderung der Lösung zu blaßgelb. Die Mischung wird dann 4 Stunden bei 34°C unter Schütteln inkubiert, dann während 24 Stunden gegen 0,01 M Tris-Puffer, pH 7,4 (HCl) dialysiert. Für die zwei folgenden Bäder verwendet man Wasser.
Das Konjugat NO-Cys-g-BSA wird durch Spektrophotometrie zwischen 240 und 500 nm analysiert: das NO absorbiert zwischen 320 und 360 nm (3).
c) Synthese von BSA-g
Man gibt 100 mg BSA in 1 ml 3M-Acetatpuffer, pH 8, und 2 ml Wasser.
Dann gibt man hinzu 1 ml 1%-iger Glutaraldehyd und nach 5 Minuten 200 μl NaBH₄, wobei man die Mischung von Zeit zu Zeit im Vortex behandelt.
Man läßt die Reaktion während 30 Minuten unter regelmäßigem Schütteln ablaufen und dialysiert das Reaktionsgemisch während 24 Stunden gegen H₂O unter Verwendung von drei Bädern.
d) Herstellung von entfettetem BSA (dBSA)
Man wiegt 8 × 1 g BSA in 50 ml Reagenzgläser ein und fügt dann 10 ml H₂O zu und unterwirft einer Vortex-Behandlung für eine vollständige Auflösung. Anschließend fügt man 10 ml Freon(1,1,2-Trichlortrifluorethan C₂Cl₃F₃) zu, das bei 4°C gelagert wird.
Nach einer Minute Vortex-Behandlung zum Mischen der zwei Phasen (das Reagenzglas ist mit weißem Schaum gefüllt) zentrifugiert man 10 Minuten bei 2.000 UpM, um die zwei Phasen zu trennen und gewinnt die obere wäßrige Phase, die man in einem großen Becher unter Abdeckung mit Parafilm oder in acht schräg gestellten eingefrorenen Reagenzgläsern lyophilisiert.
e) Entfetten des Serums oder eines Proteins
Das Entfetten geschieht Volumen/Volumen mit Freon unter Schütteln während 2 bis 3 Minuten und dann 15 Minuten Zentrifugieren mit 10.000 UpM. Die wäßrige Phase (obere Schicht) wird gewonnen.
f) Synthese von dBSA-Fettsäuren mittels Chlorethylformiat
In zuvor mit Methanol entfettete Reagenzgläser wiegt man ein oder gibt mit einer Pipette 1 mg; 2,5 mg oder 5 mg Fettsäuren entsprechend dem gewünschten Kopplungsverhältnis von jeweils 10; 20 und 40.
Anschließend wiegt man 20 mg dBSA ab.
Man nimmt die Fettsäure in 1 ml wasserfreiem Methanol + 10 μl wasserfreiem Triethylamin + 1 μl C¹⁴-Palmitat auf und läßt mindestens eine habe Stunde über Silicagel stehen. Anschließend nimmt man die dBSA in 2 ml 1 mM CaCl₂-Phosphat + 10 μl Triethylamin auf.
Man arbeitet in der Kühlkammer und fügt 200 μl Chlorethylformiat auf 1/16 verdünnt in wasserfreiem Dimethylformamid (12,5 μl Chlorethylformiat in 187,5 μl Dimethylformamid) in die Fettsäure zu. Man unterwirft das Reaktionsgemisch 30 Sekunden einer Vortex-Behandlung und läßt 3 Minuten stehen (Aktivierung der COOH). Anschließend gibt man die dBSA zu unter Rühren mit dem Vortex.
Man fügt 2 ml der Lösung des ersten Dialysebades zu, um die Löslichkeit des Konjugats zu begünstigen und mißt dann die Radioaktivität (10 μl der Probe + 90 μl H₂O in 2 ml Szintillationsflüssigkeit). Anschließend dialysiert man 12 Stunden in einem Gemisch von 1/3 Methanol, 1/3 Dimethylformamid und 1/3 1 mM-CaCl₂-Phosphat und anschließend mit zwei Bädern von 1 mM-CaCl₂-Phosphat.
Man mißt die Radioaktivität mit 100 μl der Probe in 2 ml Szintillationsflüssigkeit.
Man mißt ein Spektrum von 240 bis 320 nm, um seine Konzentration zu bestimmen, indem man die optische Dichte (OD) bei 300 und 280 nm bestimmt (ε BSA : 34500). Die Fettsäurekonjugate sind bei –80° C mehrere Monate beständig.
g) ELISA-Test mit NO-Cys-g BSA
Man verwendet Nunc Maxisorp^®-Platten mit 96 Wells (Test mit 200 μl). Die Beschichtung der Platten erfolgt mit Hilfe von 10 μg NO-Cys-g-BSA/ml in Carbonat-Puffer pH 9,6 (Vergleich BSA-g) während etwa 16 Stunden bei 4°C unter Bewegung.
Um alle nicht spezifischen Stellen abzusättigen, verwendet man als Puffer PBS Tween 20^®, dem man 10% Glycerin und 1 mg/ml BSA (Puffer X) zusetzt, während einer Stunde bei 37°C.
Man spült zweimal mit PBS Tween 20^®.
Das Serum oder die Antikörper des Patienten sowie die Vergleiche werden auf 1/500 verdünnt im Puffer X unter Zusatz von 0,1% BSA-g.
Man spült zweimal mit PBS Tween^®.
Man verwendet als sekundären Antikörper einen Human-Anti-IgM-Antikörper (Anti-IgM, IgA, IgG von Pasteur Diagnostics) auf 1/5000 verdünnt im Puffer PBS Tween^® unter Zusatz von 1 mg/ml BSA während einer Stunde bei 37°C. Man spült dreimal mit PBS Tween^®.
Der Nachweis erfolgt mit Hilfe von OPD 2 g/l in Citrat-Phosphat-Puffer + 0,1% H₂O₂ während 10 Minuten im Dunkeln.
Um die Reaktion abzubrechen, fügt man 50 μl 4N-H₂SO₄ zu. Die Messungen der optischen Dichte (OD) erfolgen bei 490 nm.
h) ELISA-Test mit Ole-dBSA
(Ole = Ölsäure)
Tests für die Kranken
Man verwendet Platten von Polystyrol Polysorp^® Nunc, die man mit 200 μl einer Lösung beschichtet, welche das Konjugat Fettsäure-dBSA oder die dBSA in einer Konzentration von 50 μg/ml in Carbonatpuffer (pH 9,6) + 1 nM CaCl₂ enthält, während 16 Stunden bei 4°C unter Bewegung (Vergleich: dBSA).
Man führt keine Sättigung durch.
Die Platten werden zweimal mit 1 mM CaCl₂ und PBS gespült.
Man fügt den Antikörper I (AcI) verdünnt auf Y₂₅₀ in PBS-Puffer (450 nM, NaCl), 1 mM CaCl₂ + 1 mg/ml BSA zu während 2 Stunden bei 37°C. Man spült zweimal mit PBS + 1 mM CaCl₂.
Man fügt den zweiten Antikörper (AcII) verdünnt auf 1/5000 zu (Human-Anti-IgM, Anti-IgA und Anti-IgG, Institut Pasteur, Diagnostics) im Puffer PBS + 1 mM CaCl₂ + 1 mg/ml dBSA während einer Stunde bei 37°C.
Man spült dreimal mit PBS-Tween^® und bei einer Entwicklung mit OPD 1 g/l + 0,05% H₂O₂ während 10 Minuten (halbdunkel).
Man bricht die Reaktion ab durch Zugabe von 4 N H₂SO₄ und mißt die optische Dichte (OD) bei 490 nm.
Tests für die Ratten
Man arbeitet wie oben angegeben, jedoch wird AcI auf 1/500 verdünnt und AcII (Ratten-Anti-IgM und Anti-IgG, Jackson Immunoresearch) im Verhältnis von 0,12 mg/l Puffer verwendet. i) Puffer Acetat, pH 8

3 M 12,3 g/50 ml
HCl 0,5 M

41,7 μl/ml

PBS pH 7,2

NaCl 9 g/l Wasser

Na₂HPO₄ 1,42 g/l Wasser

Na₂HPO₄, H₂O 0,276 g/l Wasser
PBS-Tween

50 μl Tween 20^®/l PBS

Beschichtung (Carbonatpuffer für ELISA-Test)

Na₂CO₃ 2,65 g/500 ml Wasser

NaHCO₃ 4,2 g/l Wasser
Der pH wird durch Zugabe von Na₂CO₃ in NaHCO₃ auf 9,6 eingestellt. Citrat-Phosphat pH 5

Na-Citrat 10,5 g/l Wasser

Na₂HPO₄ 17,8 g/l Wasser

Orthophenylendiamin

OPD 4 g/100 ml Wasser
Beispiel 2: Untersuchung der experimentellen Auto-Immun-Enzephalitis (EAE bei der Ratte
Beziehung zwischen dem Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern und der Intensität des späteren muskulären Defizits und der späteren Entmyelinisierung
Man arbeitet nach Wekerle (4) und bewirkt bei der Lewis-Ratte eine experimentelle aktive Auto-Immun-Enzephalitis durch Injektion eines Peptids des Myelin-Basisproteins (von Aminosäure 68 bis Aminosäure 84).
Im Verlauf einer Untersuchung, die sich über 4 Wochen erstreckte, wurden drei Parameter analysiert und korreliert: (a) der Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern im Serum, (b) das funktionelle Defizit, das durch die Muskelkraft während der Entwicklung der EAE bestimmt wurde, und (c) der Grad der Entmyelinisierung des Kleinhirns.
In einer erste Stufe mißt man mittels ELISA den Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern im Serum, wobei die Werte ausgedrückt sind in mittlere optische Dichte (OD) +/– SEM.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 1a wiedergegeben, welche die gemessene optische Dichte angibt.
Ab dem 6. Tag nach der Induktion beobachtet man ein signifikantes Auftreten (Response) von IgM-Anti-NO-Cystein in den Seren der EAE-Tiere im Vergleich mit den Kontrollen. Die optische Dichte OD beträgt tatsächlich 0,51 ± 0,05 (Mittelwert ± Standardabweichung S. D.; Intervall von 0,32 bis 0,72) gegenüber 0,13 ± 0,01 (Intervall von 0,08 bis 0,15) bei den Kontrollen [F₄ _,48 = 21,43; p < ,001].
Die Verdrängungsuntersuchungen zeigen, daß die Antikörper spezifisch gegen das NO-Cystein-Epitop gerichtet sind.
In den Seren von Ratten mit EAE beobachtet man keinerlei IgG-Entwicklung, sondern nur eine IgM-Entwicklung, die gegen das NO-Cystein gerichtet ist, wobei diese Entwicklung anschließend während der EAE nicht mehr nachweisbar ist.
In einer zweiten Stufe untersucht man, ob die Veränderung der Anti-NO-Cystein-Antikörper-Titer mit Veränderungen klinischer Anzeichen zusammenhängt, indem man die Veränderungen der muskulären Kraft der hinteren Gliedmaßen bestimmt.
In 1b sind die erhaltenen Ergebnisse angegeben, wobei die muskulären Defizite in % der Muskelkraft der hinteren Gliedmaßen der Kontrolltieren (n = 5) angegeben sind. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± S.E.M..
Man nahm 10 Messungen pro Tag an jedem Tier (n = 9) vor.
Das funktionelle Defizit ist signifikant am 18. Tag nach der Injektion und dauert an bis zum 26. Tag.
Die EAE-Ratten zeigen einen erheblichen Verlust ihrer Muskelkraft in der Größenordnung von 50 bis 60% im Vergleich mit den Kontrolltieren.
Man beobachtet auch bei den EAE-Ratten im Vergleich mit den Kontrollen eine Verringerung des Körpergewichts zum Zeitpunkt, wo die klinischen Zeichen auftreten, jedoch wurde keine Korrelation zwischen den klinischen Zeichen und dem Körpergewicht gefunden.
Korrelation zwischen dem Gehalt an Antikörpern und der Entmyelinisierung des Kleinhirns
Am Ende der Untersuchung wird das Ausmaß der Entmyelinisierung bei den EAE-Tieren gemessen.
Man nimmt eine spezifische Färbung des Myelines vor, indem man nach der Methode von SPIELMEYER (1) arbeitet.
In 2 sind mit dem Mikroskop aufgenommene Photos von sagittalen Schnitten des Kleinhirns von Kontrollen (a, b, c) und EAE-Ratten (d, e, f) wiedergegeben.
Die Pfeile in den a) und d) zeigen die Teile an, die jeweils in den b) und e) wiedergegeben sind.
Die benachbarten sagittalen Schnitte sind immunokoloriert mit Hilfe von polyklonalen Antikörpern, die gegen das Myelin-Basisprotein (PBM) gerichtet sind (c, f).
Die Quantifizierung des Myelins wird vorgenommen, indem man die immunohistochemische Reaktion mit den Anti-PBM-Antikörpern bestimmt unter Verwendung des Systems Samba 2640 (Alcatel, TITN, Answare, Frankreich). Für jedes Tier untersucht man vier Schnitte, indem die mittlere optische Dichte (ODm) pro definierte Fläche gemessen wird ( ). Für jeden Schnitt wird die PBM-Markierung im unteren Teil der granulären Schicht im Inneren von drei verschiedenen Lappen (4, 6, 8) gemessen. Als Vergleichswerte verwendet man die molekulare Schicht des Kleinhirns, von der bekannt ist, daß sie hauptsächlich myelinfreie Fasern enthält. Die quantitativen Daten werden in willkürlichen Einheiten (ODn/Oberfläche) ausgedrückt. Die verwendeten Symbole haben die folgenden Bedeutungen: cp = Stiel des Kleinhirns; m = Mark des Kleinhirns; gl = granuläre Schicht der Rinde des Kleinhirns; die Spitze des Pfeils zeigt den distalen Teil des Marks des Kleinhirns an. Die Striche bedeuten Strecken von 350 μm (für a, c, d, f) und 85 μm für die in b und e gezeigten Einzelheiten.
Die Verringerung der Myelinfasern erscheint am ausgeprägtesten im Stiel und Mark des Kleinhirns sowie im ersten Drittel der granulären Schicht der Kleinhirnrinde.
Außerdem scheint die Schwere der Krankheit korreliert mit dem Vorgang der Entmyelinisierung, wie sich im vollständigen Verschwinden der Myelinfasern im distalen Mark in Kontakt mit der Kleinhirnrinde der am stärksten betroffenen Tiere zeigt (2e).
Die quantitative Analyse der immunohistochemischen Markierung des Kleinhirnmyelins mit den Anti-Myelin-Basisprotein-Antikörpern bestätigt die Ergebnisse des Verschwindens des Myelins im Kleinhirn (2f).
Die am meisten betroffenen EAE-Tiere zeigen eine Verringerung von 28% des PBM mit Bezug auf Kontrollratten (df = 8; t = 2,64; O = 0,02).
Koeffizient der Korrelation zwischen den Anti-NO-Cystein-Antikörpern am 6.
Tag und der Muskelkraft
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß der Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern eine Vorhersage der pathophysiologischen Zeichen in der EAE ermöglicht.
Tatsächlich besteht ein direktes umgekehrtes Verhältnis zwischen einerseits dem Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern am 6. Tag nach der Induktion und andererseits der Muskelkraft der hinteren Gliedmaßen am 22. Tag (Bravais-Pearson-Koeffizient, r = –0,72; p = 0,016) bei 24 dpi (r = 0,81; p = 0,008) bei 26 dpi (r = 0,96; p = 0,0001) und den Myelinwerten der EAE-Ratten (r = 0,77; p = 0,014).
In 3 ist der Koeffizient der Korrelation zwischen dem Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern am 6. Tag nach der Induktion und den Werte der Muskelkraft der hinteren Gliedmaßen im Verlauf der Untersuchung für die EAE-Ratten (n = a) vom Tag 0 bis zum 26. Tag dargestellt.
Jedes Symbol (⧫) stellt den Wert r des Koeffizienten der Bravais-Pearson-Korrelation dar. Die strichpunktierte Linie gibt das signifikante Niveau von 0,05 an (df = 7).
Für jeden Wert r ist die Verteilung der individuellen Anti-NO-Cystein-Werte gegen die Muskelkraft der hinteren Gliedmaßen in Zusammenhang mit der Regressionskurve dargestellt.
Die Erhöhung des Korrelationskoeffizienten zwischen den Anti-NO-Cystein-Antikörpern am 6. Tag und der Muskelkraft während der EAE zeigt eine zeitlich dynamische Funktion.
Außerdem sind das Verschwinden des Myelins und der Verlust an Muskelkraft der hinteren Gliedmaßen am 24. Tag signifikant korreliert für den 24. Tag (r = 0,72; p = 0,029) und den 26. Tag (r = 0,72; p = 0,027).
Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse:

1) das Vorhandensein von Anti-NO-Cystein-Antikörpern in den Serumproben von Patienten, die von MS betroffen sind;
2) das Vorhandensein dieser Anti-NO-Cystein-Antikörper in einem prä-klinischen Stadium im Verlauf einer EAE bei der Ratte; und
3) der Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern ist ein Frühindikator der pathologischen Entwicklung der Krankheit.

Beispiel 3: Klinische Untersuchung
Eine Gruppe von 10 Patienten mit einer schubweisen auftretenden MS, charakterisiert durch eine erhebliche klinische Aktivität während des der Aufnahme vorangehenden Jahres wurde auf der klinischen und biologischen Ebene verfolgt.
Die Kriterien der Aufnahme der 10 Patienten in die Studie sind im folgenden angegeben:
Es handelt sich um Patienten

– die eine gesicherte MS nach den Kriterien von Poser et al. (5) zeigen,
– die eine remittierende Form mit oder ohne Folgeerscheinungen nach Lublin und Reingold (6) haben,
– die eine mäßige Behinderung haben gemessen nach dem Maßstab „Expanded Disability Status Scale" von Kurtzke (11) (EDSS), EDSS-Wert < 5,5 bei der Aufnahme,
– die eine aktive MS zeigen, d. h. mindestens zwei Schübe während der zwei der Aufnahme vorangehenden Jahre hatten,
– mit mehr als einem Monat vom Ende des letzten Schubs bei der Aufnahme,
– bei denen zum Zeitpunkt der Aufnahme das Ende des letzten Schubs mindestens einen Monat zurücklag,
– die zum Zeitpunkt der Aufnahme mindestens einen Monat lang keine Corticosteroide genommen hatten,
– die gegebenenfalls unter einer Grundbehandlung mit Azathioprin oder Beta-Interferon waren, die jedoch mindestens seit drei Monaten begonnen hatte,
– die eine Erklärung des aufgeklärten Einverständnisses unterzeichnet hatten, nachdem sie einen Brief erhalten hatten, der sie über die Ziele der Untersuchung informierte.

Man nimmt zunächst eine klinische Bewertung vor (nach Prüfung der Kriterien der Aufnahme, der Unterzeichnung der Einverständniserklärung, neurologischer Untersuchung zur Messung des EDSS-Standes (score) und des ambulatorischen Index von Hauser et al. (7) und des Rine-Hole-peg-Test (9 HPT) zum Messen der motorischen Funktionen der oberen Gliedmaßen).
Anschließend werden die biologischen Proben entnommen.
Man nimmt 0,5 ml Blut ab in das trockene Reagenzglas durch digitale Punktion bei der Aufnahme und dann alle 15 Tage in der Wohnung des Patienten durch die an der Forschung beteiligte Krankenschwester während der ganzen Dauer der Untersuchung.
Im Fall eines klinischen Schubs bestimmt man den höchsten EDSS-Stand (score) im Verlauf des Schubes. Die Schübe werden in üblicher Weise behandelt (Methylprednisolon 1 g/d/Sd IV).
Eine Blutabnahme wurde bei dieser klinischen Bewertung vorgenommen und der Patient wurde für eine klinische Kontrolluntersuchung einen Monat nach dem Schub einbestellt (EDSS, ambulatorischer Index, 9 HPT). Die biologischen Werte wurden anschließend bis zum Ende der Untersuchung verfolgt.
Dosierungen
Durch ELISA wurde der Gehalt (optische Dichte – OD) von Anti-NO-Cystein-Antikörpern nach der oben angegebenen Methode gemessen.
Das Hauptkriterium der Bewertung bestand darin, eine Korrelation zwischen dem gemessenen Gehalt an Anti-NO-Cystein-Antikörpern (optische Dichte) einerseits und den drei folgenden Variablen andererseits aufzufinden:

– Auftreten eines Schubs in den zwei folgenden Wochen;
– im Fall des Schubs: EDSS-Maximum im Verlauf des Schubs;
– im Fall des Schubs: EDSS-Wert einen Monat nach dem Schub abzüglich EDSS bei der Aufnahme.

Die ausgehend vom ambulatorischen Index und von 9 HPT gewonnenen Variablen wurden als zusätzliche Bewertungskriterien verwendet.
Diese Ergebnisse zeigen, daß ihre Bestimmung interessant ist bei der Verfolgung der von MS betroffenen Patienten, um das Auftreten und die Schwere der Schübe vorherzusagen. Ihre Anwendung eröffnet neue Wege in der Erforschung der präventiven Behandlung der MS.
In einer prospektiven Untersuchung wurde dann vorteilhafterweise eine klinische Verfolgung und Bildgebung und quantitative Messung dieser Antikörper in einer Gruppe von Patienten vorgenommen, die von einer aktiven remittierenden MS betroffen waren.
Beispiel 4: Identifizierung von nitrosylierten Protein-Antigenen des Myelins
a) Herstellung des rekombinanten MOG-Proteins
Man verwendet 2 Plasmide mit der Expression vom Typ pGEX (Pharmacia), die jeweils die vollständige kodierende Sequenz des humanen MOG oder die für den extrazellulären Teil des MOG kodierende Sequenz (Dautigny, CNRS U1488, Paris) enthalten.
Die Seren der Patienten entsprechen verschiedenen Kategorien von MS.
1. Gewinnung von kompetenten Bakterien
Bakterien, E. Coli vom Typ XL1Blue werden kompetent gemacht, indem man ihre Membran mittels 0,1 M MgCl₂ und dann 50 mM CaCl₂ aufbricht. Die Bakterien sind dann außerordentlich empfindlich und man muß rasch die Transformation vornehmen.
2. Transformation der Bakterien
Die Bakterien werden mit dem Plasmid während 30 Minuten bei 4°C in Berührung gebracht. Während dieser Phase heftet sich die DNA an die Bakterienmembran. Man nimmt dann einen Wärmeschock bei 42°C während einer Minute vor. Die DNA dringt in die Bakterien ein. Diese werden eine Stunde bei 37°C inkubiert, um sie zu regenerieren, und schließlich auf einem selektiven Milieu LBAgar + Ampicillin aufgetragen. Die Integration des Plamids in die Bakterien verleiht ihnen Resistenz gegen das Ampicillin.
3. Plasmidextraktion
Zum Nachweis der Anwesenheit des Plasmids in den Kolonien wurde eine isolierte Kolonie in 5 ml LBAmp geimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag werden die in TNE gewaschenen Bakterien einer Lyse und einer Extraktion mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol in einem Volumenverhältnis von 25/24/1 unterworfen. Nach Zentrifugieren finden sich die Proteine und die Genom-DNA an der Grenze der wäßrigen Phase und der organischen Phase, während die Plasmid-DNA (wie die RNA) in der wäßrigen Phase löslich ist. Diese Phase wird gewonnen und die Plasmide werden mit Ammoniumacetatsalzen (0,2 M am Ende) und absolutem Alkohol bei –20° C ausgefällt. Durch Zentrifugieren mit 12.000 UpM werden die Plasmide im Bodensatz konzentriert. Die Plasmide werden anschließend mit 75%-igem Ethanol gewaschen, getrocknet, in einem kleinen Volumen Wasser wieder suspendiert und dann mit RNase behandelt.
Schließlich werden die Plasmide mit EcoHI oder BamHI geschnitten, um nach Wanderung auf einem Agarose- oder Polyacrylamidgel ihre Restriktionskarte und damit ihre Identität zu verifizieren.
4. Induktion der Expression von pGEX
Eine Vorkultur von 5 ml von mit einem der zwei Plasmide transformierten Bakterien wird in LBAmp während etwa 14 Stunden inkubiert. Anschließend überträgt man nacheinander diese Vorkultur in 20 und dann 200 ml LBAmp. Die Bakterien werden erneut bei 37°C gezüchtet, bis sie ihre exponentielle Wachstumsphase erreichen, gemessen durch eine optische Dichte OD von 0,5 bei 595 nm. In diesem Stadium ist die Zugabe von Isopropylthiogalactosid (IPTG), 5 mM Endkonzentration, verantwortlich für die Aktivierung der Transkription der kodierenden Sequenz des Fusionsproteins. Das IPTG heftet sich an den Promotor pTac, der vom Gen der β-Galactosidase herrührt und induziert die Transkription des offenen Leserahmens, der das Insert: totale oder partielle Sequenz des MOG enthält, und anschließend der für die Glutathion-S-Transferase GST kodierenden Sequenz. Das resultierende Protein entspricht der Fusion der GST und der partiellen oder totalen MOG. Man läßt die Kultur 2 Stunden 30 Minuten inkubieren, die Zeit um eine verhältnismäßig erhebliche Menge der Proteine zu erhalten.
5. Extraktion der Proteine
Die Arbeitsgänge werden bei 4°C durchgeführt.
Nach Zentrifugieren der obigen Kultur (3.000 UpM) wird der Bakterien-Bodensatz in einem basischen Lyse-1- Puffer aufgenommen (1 oder 2 ml Puffer für 50 ml der Ausgangskultur). Man fügt 80 μl Lysosym (10 mg/ml) bei und beläßt auf Eis 20 Minuten.
4 mg Desoxycholsäure werden jedem Präparat zugesetzt. Die Mischung wird nach Rühren viskos. Die Genom-DNA wird durch Ansaugen/Zurückdrücken mit einer Mikropipette zerbrochen. 100 μl DNase digerieren die DNA während 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Die so erhaltene Mischung entspricht den Resten der Bakterien und den Proteinen, die im Lysepuffer löslich gemacht wurden oder nicht. Ein erstes Zentrifugieren mit 12.000 UpM während mindestens einer Stunde ermöglicht die Trennung von einerseits den löslich gemachten Produkten im Überstand und andererseits dem Debris, Membranen und restliche DNA sowie die nicht löslich gemachten Proteine im Bodensatz.
Der Bodensatz wird in einem Lyse-2-Puffer wieder suspendiert, der ein Netzmittel, das Triton X100, enthält. Ein zweites Zentrifugieren während 15 Minuten bei 12.000 UpM trennt die letzten löslichen Proteine vom Bodensatz, der die hydrophoben Bestandteile enthält. Dieser Bodensatz wird in 100 oder 200 μl Wasser erneut suspendiert und liefert eine Dispersion.
6. Elektrophorese und Western-Blot
Die diskontinuierliche Gel-Elektrophorese (Konzentrationsgel, Trennungsgel) ermöglicht die Auftrennung der Proteine nur entsprechend ihrem Molekulargewicht, in Gegenwart von SDS.
Anschließend an die Elektrophorese kann man mit einer Lösung von Coomassie-Blau alle Proteine färben, die auf dem Gel gewandert sind, oder man nimmt einen Western-Blot vor, der am Ende ermöglicht, nur bestimmte Proteine nachzuweisen. Für diese letztgenannte Methode werden die Proteine vom Gel auf eine Membran (Immobilon^®, Millipore) übertragen, indem man einen Strom von 0,8 mA/cm² während 2 Stunden anlegt.
Die Membran wird gewaschen, gesättigt mit einer Lösung, die 3% entrahmte Milch enthält. Die Membran wird während 14 Stunden in einer Lösung inkubiert, die einen ersten Antikörper enthält, der das Fusionsprotein erkennt.
Für die Kontrollen handelt es sich um den Überstand von Hybridomkulturen, hergestellt ausgehend von Mäusezelllinien, welche monoklonale Anti-GST-Antikörper bilden.
Die Membran wird anschließend gewaschen, erneut mit 3%-iger Milch gesättigt, dann 2 Stunden mit einem sekundären Ac inkubiert, der den ersten am Protein fixierten Ac erkennt. Dieser zweite Ac ist ein an die Peroxydase gekoppelter Anti-Ig-Ac der Maus.
Nach einem letzten Waschen wird der Komplex Protein-primärer Ac-sekundärer Ac in Gegenwart von H₂O₂ durch die Reaktion zwischen der Peroxydase und einem Chromogen, das 4-Chlor-1-naphtol nachgewiesen, das schwarz wird und in dem Bereich ausfällt, wohin das Protein gewandert ist.
Die oben angegebene Methode ermöglicht über Fragmente der rekombinanten MOG zu verfügen.
b) Tests, die mit den GST-MOG-Fusionsproteinen durchgeführt wurden
Um die verschiedenen Evolutionsformen und -stadien von MS zu unterscheiden, verwendet man Banken von Seren von Patienten gegen diese nitrosylierten rekombinanten Proteine.
Für die Patiententests entspricht der erste Ac einer Verdünnung der Seren auf 100-stel und der zweite Ac ist ein humaner Anti-IgG, IgA, IgM-Ac gekoppelt an die Peroxydase.
c) Ausgehend von einer in vitro nitrosylierten Präparation von Human-Myelin führt man eine Antikörpertrennung verschiedener Formen von MS durch Western-Blot durch. Zwei Hauptproteine von etwa 100 kDa und 25 kDa wurden gefunden (4).
Um diese nitrosylierten und dadurch immunogen gemachten Proteine zu charakterisieren, wurden Tests an Seren von MS-Patienten gegen die nitrosylierte MAG durch ELISA/dot-Blot vorgenommen. Eine erste Analyse von 58 Seren von Patienten, die von MS betroffen sind, und Kontrollen zeigt eine starke Anwesenheit von Antikörpern gegen die MAG in nitrosylierter Form bei den Patienten mit aktiven Formen. Die Patienten im Schub (n = 12) oder in evolvierender Progression (n = 10) zeigen einen Gehalt an anti-nitrosyliertes MAG-Antikörpern, der im Vergleich mit den Patienten in stabilem Zustand (n = 12), in Remission (n = 12) und den gesunden Subjekten (n = 12) stark erhöht ist (one way ANOVA; F (4,53) = 22,261, p < 0,0001).
Bibliographie

1. A. I. Boullerne et al., J. Neuroimmunol. 60, 117–124 (1995)
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4. H. Wekerle, Curr. Opin. Neurobiol. 3, 779 (1993)
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7. S. L. Hauser et al., N. Engl. J. Med., 308, 173–180 (1983)

Claims

Verwendung in vitro von Antikörpern, wie sie während einer entzündlichen Auto-Immun-Pathologie des Zentralnervensystems oder peripheren Nervensystems gebildet werden, wobei diese Antikörper zu der Gruppe gehören, die aus den Anti-NO-P-Antikörpern besteht, worin P ein Protein, ein Protein in rekombinanter Form, ein Peptid oder eine Aminosäure, die NO akzeptieren kann, oder den Anti-Fettsäuren-Antikörpern besteht, als Frühindikatoren, welche einen klinischen Schub oder eine neue pathologische Schädigung ankündigen.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in den Anti-NO-P-Antikörpern P ein mit Myelin assoziiertes Glykoprotein (MAG) oder ein Hauptglykoprotein der Oligodendrocyten (MOG) oder als Aminosäure P einen Cysteinrest bedeutet.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in den Anti-Fettsäuren-Antikörpern die Fettsäure ausgewählt ist unter Laurinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolensäuse, Arachidonsäure, Eicosapentansäure und Docosahexaensäure.
Frühdiagnosetest des Auftretens von Schüben und Schädigungen in einer entzündlichen Auto-Immun-Pathologie des Zentralnervensystems oder peripheren Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß bei ihm eine Serumprobe des Patienten in Berührung gebracht wird mit einem nitrosylierten Antigen NO-P, worin P ein Protein, ein Protein in rekombinanter Form, ein Peptid oder eine Aminosäure, die NO akzeptieren kann, bedeutet, oder eine Serumprobe des Patienten mit einem durch eine Fettsäure repräsentierten Antigen in Berührung gebracht wird und die Antigen-Antikörperreaktion festgestellt wird, wenn sie eintritt.
Test nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serum und das Antigen bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.
Test nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen an ein Trägerprotein gekoppelt ist.
Test nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerprotein KLH oder Rinderserum-Albumin ist, das in entfetteter Form verwendet wird, wenn der Test zur Bestimmung von Anti-Fettsäure-Antikörpern angewandt wird.
Test nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerprotein durch einen Spacer vom Hapten getrennt ist.
Test nach einen der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen als Protein P einen Cysteinrest und als Fettsäure eine Säure umfaßt, die ausgewählt ist unter Laurinsäure, Palmitinsäure, Palmitoleinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolensäure, Arachidonsäure, Eicosapentansäure und Docosahexaensäure.
Test nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die fixierten Antikörper nach der ELISA-Methode ermittelt, wobei die Antigene an einem festen Träger fixiert sind und ein zweiter Antikörper dem biologischem Milieu zugesetzt wird.