JP2002506516A

JP2002506516A - 自己免疫の病理を検出するための方法

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Publication number: JP2002506516A
Application number: JP54667598A
Authority: JP
Inventors: クラウスペトリー; アンヌブールーヌ
Original assignee: アンスティテュナシオナルドゥラサーントエドゥラルシェルシュメディカル（イエンエスウエルエム）
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2002-02-26
Also published as: DE69817338T2; FR2762602B1; FR2762602A1; CA2287973A1; EP0980525B1; WO1998049558A1; ATE247831T1; DE69817338D1; EP0980525A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、炎症性自己免疫性病理の予知手段に関する。これは、疾患の経過中に発達させた抗体である抗ＮＯ−Ｐ抗体（ペプチドあるいはアミノ酸）若しくは脂肪酸抗体の定性的および定量的測定に基づく。

Description

【発明の詳細な説明】自己免疫の病理を検出するための方法当発明の主題は炎症的自己免疫の病理を早期に検出する手段である。特に、中枢あるいは末梢神経系の自己免疫疾患において観察される、臨床的発症あるいは病変の発生を早期に予見することを可能とする、材料、方法、キットに関する。例えばその疾患とは、多発性硬化症や、ＩｇＭ性高ガンマグロブリン血症をともなう末梢神経障害、Ｇｕｉｌｌｅｍ−Ｂａｒｒｅ症候群などの場合や、慢性関節リューマチなどの自己免疫疾患である。多発性硬化症(ＭｕｌｔｉｐｌｅＳｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＭＳと略す)は中枢神経系の脱髄病である。これは脳あるいは小脳白質における散在する炎症の発生と脱髄障害（ｐｌａｔｌｅｔｓ）によって特徴づけられていることが想起されるであろう。多発性硬化症の新しい病変が構成されるメカニズムはよく知られるようになりつつある。それらは、以下の過程よりなる。１）炎症性サイトカインの存在下にマクロファージなどの細胞から抗原がヘルパーT細胞に提示される、２）リンパ球の増殖と分化、３）血液脳関門の破壊と活性化された免疫細胞の実質への移行。これが脱髄を惹起する。病変は軸策の消失や星状神経膠細胞（アストロサイト）性の神経膠腫へと進行する。多発性硬化症は３つの主要な進行形態に分類されている。それらは臨床的所見の進行によって特徴づけられたものであるが、病巣の部位、核磁気共鳴画像(MRI )の異常、病態に伴う免疫的障害によっても特徴づけられている。最も多く見られる形態は弛張型で、程度の差はあるが完全な寛解期が発症期の間に散在するパターンによって特徴づけられる。第１の進行型は病気の初期から変化の無い継続的な進行によって特徴づけられる。第２の進行型では、弛張期につづいて病状の継続的な進行がおこる。発症の頻度は個体によって差があり、病気の重度は予測不可能である。それゆえ、発症の“頻度”が通常わずかな身体的障害の予測指標とされる。しかしながら、患者のうちのある者は少数回の発症のうちに深刻な後遺障害を進行させてしまう。一方で、別の患者は頻回の発症にかかわらず、わずかな後遺障害しか示さない場合もありうる。MRIによる研究では、大多数の患者は臨床的発症に関係なく病態の活動（新しい病巣の徴候）を示している。しかし、この活動は個々の患者で非常に異なるのである。発症期を次にともなう弛張期の過程は上記で述べた例えば慢性関節リューマチなど他の炎症性自己免疫の病理でも見られることである。現在の治療は臨床的徴候の手当てによって主に成っている。事実、免疫抑制剤やコルチコイド投与によって発症を抑えることよりそれらは構成されているのである。しかしながら、これらの治療法は、投与される薬物の無視できない副作用があること、それらが高価なことを理解させる相応の警告をもって処方されるべきである。この状況は発症の発生の予見を可能とする生物学的マーカーの探索へと促してきた。例えば、多発性硬化症に対してはいくつかの戦略が取られてきた。この一つで、ＭＲＩによる長年の研究によって、良性の多発性硬化症に罹患している患者は、新しい病巣の集積が少ない傾向があることが示されてきたが、これらは実際の治療にはほとんど使用されない追想的な発見であった。全身を循環する血液単核細胞によるＴＮＦ−αの産生は臨床的発症や新しい病変の発生の予測マーカーと考えられた。しかし、おのおのの研究のデータを比較すると矛盾点があり、さらにこのマーカーは疾患の重症度も発症による後遺障害も予見できない。このマーカーはそれゆえ日常に使用されていない。当発明者によるこれらの神経傷害の分野における研究（１）と（２）において、このタイプの疾患に罹患している患者において高レベルの抗ＮＯ−システイン抗体または抗脂肪酸抗体が存在していることを当発明者は発表するに至った。徴候がヒトの多発性硬化症に類似する実験的自己免疫性脳炎（ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＥｎｃｅｐｈｌｉｔｉｓ：ＥＡＥ）動物モデルを使用することによって、当発明者は当疾患の進行の早期マーカーとしてのこれらの抗体の役割を示した。行われた実験はこの結果が一般的な自己免疫疾患に対しても拡大可能であることを示した。つまり中枢または末梢神経系をおかしているか、あるいはそうでないかを一般の自己免疫疾患においても見分けることが可能である。それゆえ、発明の目的は発症の発生・重症度・パターンを予見する新しいマーカーとテストを供与することであり、発症に対する的確な防衛的な手当てを実行することにある。臨床的発症や中枢あるいは末梢神経系の自己免疫疾患の新しい病変を予見する新しいマーカーは、それらが病気の間に出来てきた抗体であるということで特徴づけられる。それらは、抗ＮＯ−Ｐ抗体（ここで、ＰはＮＯを結合できるタンパク質・ペプチド・アミノ酸を示す）または抗脂肪酸抗体からなるグループを構成する。抗ＮＯ−Ｐ抗体では、マーカーとしての発明に従った使用では、特にＰはタンパク質としてミエリン関連糖タンパク質（Ｍｙｅｌｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＡＧ）あるいは主要オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭａｊｏｒＯｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＭＯＧ）を、アミノ酸としてＰはシステイン残基を示す。常法通り、Ｐによって示されたタンパク質はリコンビナントフォームでも可である。抗脂肪酸抗体においては、これらは例えばラウリン酸・パルミチン酸・パルミトレイン酸・ステアリン酸・オレイン酸・リノール酸・アラキドン酸・エイコサペンタエン酸・ドコサヘキサエン酸などから選ばれる。これまでに知られていない機構により、患者血清中のこれらの抗体の存在は将来の発症や病変の発生に関連することができる。ＥＡＥモデルにおいて行われた、後述する実施例に報告する実験により、抗NO -システイン抗体のレベルと筋力で測定された機能不全や小脳の脱髄の程度との間に相関を確立することができる。同様に、抗脂肪酸抗体の発症前の段階における産生と疾病の以後の進行の間にも相関が確立された。当発明はまた、炎症的過程・脱髄・筋肉不全のマーカーが抗ＮＯ−Ｐ抗体（ここでPは上で定義したもの）あるいは抗脂肪酸抗体によって構成されることを特徴とする発症や病変の発生を早期に診断するテストを提供する。このテストは好ましくは、患者血清中の抗ＮＯ−Ｐ抗体あるいは抗脂肪酸抗体の定性的または定量的な測定を含んでいる。その測定は血清をPを有するニトロソ化された抗原や脂肪酸に接触させ、抗原抗体反応の結果により検出する。接触はテストサンプルと抗原の抗原抗体複合体を形成するのに適切な温度でインキュベーションすることによってなる。その操作は通常３７℃のオーダーの温度でなされる。抗原は通常キャリアタンパク質と結合される。キャリアタンパク質としてはＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ−ｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：スカシ貝ヘモシアニン）またはＢＳＡ（ＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ：ウシ血清アルブミン）等が用いられる。抗脂肪酸抗体の測定に用いるときには脂質を除いた形状にして用いる。キャリアタンパク質は一般的にスペーサー分子によってハプテン（抗原）と離されて結合されている。スペーサーとしては、例えばグルタルアルデヒドがある。抗原は好ましくは、Pの実体としてシステイン残基を、さらに脂肪酸として例えばラウリン酸・パルミチン酸・パルミトレイン酸・ステアリン酸・オレイン酸・リノール酸・アラキドン酸・エイコサペンタエン酸・ドコサヘキサエン酸などから選択される任意の脂肪酸を含んでなる。抗原は好ましくはマルチウェルマイクロプレートなどの固相上に固定される。発明の好ましい実施形態においては、当テストはELISA法であり、その２次抗体は抗原に固定され、公知の技術に従って検出される。血清学的研究にさらに加えて、当発明はニトロソ化されたミエリンの分子の抗原的解析を可能にする一方、他方では例えばサイトカイン・メタロプロテアーゼ・フリーラジカル・ミクログリア細胞とSNC細胞（神経膠細胞）の相互作用などミエリンの病変に関与する分子的解析を可能にする。抗原的解析は好ましくはニトロソ化されたリコンビナントタンパク質で実行される。つまり異なったコンストラクションは例えば数種のリコンビナントMOGの断片の生成を可能にする。多発性硬化症の異なった形態や異なった進行ステージを区別するために、これらニトロソ化されたリコンビナントタンパク質に対する患者血清のバンクを有利に作製することがなされる。当発明は上記テストの実施のための診断試薬のキットあるいはセットにも関する。これらのキットはこれらを包含することによって特徴づけられる。： −該抗原、好ましくはマルチウェルマイクロプレート等の固相に固定されたもの。さらに好ましくは、 −少なくとも一つの洗浄用緩衝液 −少なくとも一つの反応用緩衝液、好ましくは、特異的にPもしくは脂肪酸に反応しない抗体の吸着が可能なある種のタンパク質を含んでおり、EL ISAテストを実施可能にしているもの。 −マーカー。好ましくは２次抗体、特に抗ヒトＩｇＭから成るもの。 −発色剤。オルソフェニレンジアミンなど。さらに、 −患者由来の陽性コントロール血清。健常人由来の陰性コントロール血清。 −当テストとその実施が説明されている使用説明書が好ましくは添付されているもの。発明の他の特徴と特長は以下の実施例中に述べる。それらの実施例中では図１から４への言及がなされる。図１-４はそれぞれ次のことを示す。図１：光学密度＝吸光度（ＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ：ＯＤ。抗NO-システイン抗体の量を示す）とラットにおけるＥＡＥの時に測定された機能的欠損。図２：ＥＡＥ時の小脳切片の光学顕微鏡写真。図３：ＥＡＥの誘導後６日目の抗NO-システイン抗体と筋力との相関係数。図４：多発性硬化症に罹患している患者の血清による、ニトロソ化された種々のヒトミエリン抗原のウエスタンブロッティングの写真。実施例１：材料と方法 a ）グルタルアルデヒド法によるシステインのＢＳＡ（牛胎児血清アルブミン）への結合結合比９となる方法は以下の通りである：最初に以下を準備する：・５mlの5％グルタルアルデヒド溶液（１ｍｌの25％グルタルアルデヒドに水４ｍｌを加える）；・酢酸塩緩衝液（1.5M,pH8-8.5）・テトラヒドロ硼酸ナトリウム溶液（3ｍｌ試験管に入れた水に小スパーテル一杯のテトラヒドロ硼酸ナトリウム）３mgのL-システインと１０mgのＢＳＡを別々に秤量する。そのL-システインを１ｍｌの酢酸緩衝液に添加し、１μlのトリチウム（³H）標識したチロシン1.9ＴＢｑ／ｍｍｏｌを含むＬ−システイン溶液を加え、直ちに１００μlの５％グルタルアルデヒドとＢＳＡを添加する。その混合液をボルテックスミキサーで攪拌する。混合液が黄色に変化するまで、少なくとも５分間時々攪拌しながら放置する。 100μlのテトラヒドロ硼酸ナトリウムを添加し、攪拌しながら約30分間反応させる。次に、反応液を水に対して、３回取り替えながら24時間透析する。透析の前後で100μlの反応液の放射活性を測定し、ＢＳＡに結合したアミノ酸量を計算する。280nmの吸光度を測定してＢＳＡ濃度を定量する。結合比は９。すべての反応容積を２倍にしてもこの結合比は変わらない。結合反応産物は以下にＣｙｓ-ｇ-ＢＳＡで略され、ｇはグルタルアルデヒドである。これは以下の化学式に相当する b ）亜硝酸ナトリウムによるＣｙｓ-ｇＢＳＡのニトロソ化１ｍｇのＣｙｓ-ｇＢＳＡに対し２mgの亜硝酸ナトリウムを秤量し遮光した試験管に添加する。次に、亜硝酸ナトリウムを１mlのＣｙｓ-ｇＢＳＡに添加し、塩酸を添加する（1mlに対し41.7μlの12N塩酸）。反応液は青みがかった黄色に変化する。反応液を振盪しながら37℃で４時間反応させた後、0.01Mトリス塩酸緩衝液（pH7.4）に対して24時間透析する。２回目から透析液を水に替える。結合したNO-Ｃｙｓ-ｇＢＳＡを240から500nmの吸光度測定をして分析する：N Oの吸収波長は320から360nmの間である（３）。c ）ＢＳＡ-ｇの合成１mlの３M酢酸緩衝液（pH8）と２mlの水に100ｍｇのＢＳＡを添加する。次に、１mlの１％グルタルアルデヒドを添加し、５分後に時々ボルテックスミキサーで攪拌しながら、200μlのテトラヒドロ硼酸ナトリウムを添加する。振盪しながら30分間反応させ、反応液を水に対し、３回交換しながら24時間透析する。d ）脱脂ＢＳＡ（dBSA）の調製８Ｘ１ｇのＢＳＡを50mlの試験管に秤量し、10mlの水を加えて、完全に溶解するまで反応液をボルテックスミキサーで攪拌する。次に、４℃保存された10mlのフレオン（1,1,2−トリクロロトリフルオロエタンC₂Cl₃F₃）を添加する。２相を混合するため１分間ボルテックスミキサーで攪拌した後（試験管は白い泡で充満する）、２相を分離するため2000rpmで10分間遠心分離し、上層の液体を回収し、凍結乾燥するため、大型ビーカーに残しパラフィルムで覆うか、８つの50ml傾斜凍結乾燥試験管に移す。e ）血清および蛋白の脱脂脱脂は等容積のフレオンで行う。２−３分間振盪し、10000rpmで15分間遠心分離する。水溶液相（上層）を回収する。f ）クロロぎ酸エチルによる脂肪酸−dBSAの合成必要とする結合比10、20または40に応じて、１ｍｇ,2.5ｍｇまたは５ｍｇのあらかじめメタノールで脱脂した脂肪酸を秤量するか又は試験管にピペットで添加する。次に20ｍｇのdBSAを秤量する。脂肪酸を１ｍｌの無水メタノール＋10μl無水トリエチルアミン＋１μlパルミチン酸塩C¹⁴に添加し、シリカゲル上に少なくとも30分放置する。次に、dBSAを２mlの１mM塩化カルシウムりん酸塩＋10μlのトリエチルアミンに添加する。氷室内で、無水ジメチルホルムアミドで1／16に希釈した200μlのクロロぎ酸エチルを（12.5μlのクロロぎ酸エチルを187.5μlのジメチルホルムアミドに溶解する）脂肪酸に添加する。反応液をボルテックスミキサーで30秒間攪拌し、３分間放置する（カルボキシル基の活性化）。次にボルテックスミキサーで攪拌しながらdBSAを添加する。標識物の溶解度を増加させるために一回目の透析外液２mlを加え、放射活性を測定する（10μlのサンプル＋90μlのH₂Oを含む２mlのシンチレーション液）。次の透析を1/3容メタノール、1/3容ジメチルホルムアミド、1/3容1mM塩化カルシウムりん酸塩混合液に対して１回、１mM塩化カルシウムりん酸塩に対して２回、 12時間行う。 100μlのサンプルを２mlのシンチレーション液に添加して放射活性を測定する。 300nmと280nmの吸収波長を記録しながら、濃度を測定するため240nm から320nmまでの連続スペクトルを測定する（εＢＳＡ:34500）。脂肪酸標識物は−80℃で数ヶ月保存できる。g ）NO-Ｃｙｓ-ｇ-ＢＳＡのELISAテスト 96ウエルのNunc Maxisorpプレートを用い、200μlでテストする。プレートのコーチィングは10μg/mlのNO-Ｃｙｓ-ｇＢＳＡを含む炭酸緩衝液pH9.6（ネガティブコントロール＝ＢＳＡ-ｇ）を４℃で振盪しながら約16時間行う。すべての非特異部位をブロックするために10％グリセロールと１mg/ml ＢＳＡを含むTween 20 PBS緩衝液（緩衝液X）を添加し37℃で１時間反応させる。反応液をTween 20 PBS緩衝液で２回洗浄する。患者血清か抗体およびコントロールを0.1％ＢＳＡ-ｇを添加した緩衝液Ｘで5 00倍希釈する。反応液をTween PBS緩衝液で２回洗浄する。２次抗体として１mg/ml ＢＳＡを添加したTween PBS緩衝液で5000倍希釈した抗ヒトIgM抗体を用い（Pasteur Diagnostics社の抗IgM,IgA,IgG）、37℃で１時間反応させる。反応液をTween PBS緩衝液で３回洗浄する。検出反応は2g/lのオルトフェニレンジアミンと0.1％H₂O₂を含むりん酸クエン酸緩衝液を暗所で10分間反応させる。反応を停止するため4N硫酸50μlを添加する。490nmの吸光度を測定する。h ）Ole-dBSAのELISAテスト（Ole=オレイン酸）・患者の試験 50μg/mlの脂肪酸−dBSA化合物あるいはdBSAを含む200μlの炭酸緩衝液（pH9. 6）＋１mMの塩化カルシウムでNuncのPolystyrene Polysorpシートを覆い、振盪しながら４℃で16時間反応させる（ネガティブコントロール：dBSA）。ブロッキングは行わない。シートを１mMの塩化カルシウムを含むPBSで２回洗浄する。１mMの塩化カルシウム、１mg/mlのＢＳＡを含むPBS(450mM，塩化ナトリウム）で250倍希釈した抗体１(AbI)を添加し、37℃で２時間反応させる。反応液を１mM の塩化カルシウムを含むPBSで２回洗浄する。１mg/ml dBSAと１mMの塩化カルシウムを含むPBS緩衝液で5000倍希釈した二次抗体(AbII)(Institute Pasteur,Diagnostics社の抗IgM，抗IgA，ヒト抗IgG)を添加し、37℃で１時間反応させる。反応液をTween PBS緩衝液で３回洗浄し、1g/lのオルトフェニレンジアミンと0 .05％H₂O₂で10分間発色反応させる（準暗所）。反応を4N硫酸で停止し、490nmの吸光度を測定する。・ラットの試験・上記の方法に順ずる。但し、AbIは500倍希釈、AbII(ラット抗IgM、抗IgG，J ackson Immunoresearch社)は緩衝液で0.12mg/mlに希釈して用いる。 i）緩衝液酢酸塩pH８３Ｍ 12.3g/50ml塩酸0.5M 41.7μl/mlPBSpH7.2 塩化ナトリウム９g/l H₂O りん酸二ナトリウム 1.42g/l H₂O りん酸一ナトリウム一水和物 0.276g/l H₂OPBS-Tween （ELISA test用炭酸緩衝）以下の化合物を含む50μl Tween 20/1l PBS 炭酸二ナトリウム 2.65g/500ml H₂O 炭酸水素ナトリウム 4.2g/l H₂O 炭酸水素ナトリウムに炭酸二ナトリウムを添加してpHを9.6に調製する。クエン酸りん酸塩pH５クエン酸ナトリウム 10.5g/l H₂O りん酸二ナトリウム 17.8g/l H₂Oオルトフェニレンジアミンオルトフェニレンジアミン 4g/100ml H₂O実施例２：ラットの実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）の研究抗NOシステイン抗体含有量と筋肉不全の強さと脱髄の強さの相関Wekerleの方法（4）によればLewisラットにミエリン塩基性蛋白ペプチド（アミノ酸68から84 番目）を注射することによって活動性の実験的自己免疫性脳炎を引き起こすことができる。４週間の研究期間中、３つのパラメーターを測定し比較した：（a）抗NOシステイン漿液抗体のレベル、（b）筋力から測定したＥＡＥ発症中の筋肉機能不全、（c）小脳の脱髄の程度。第一段階として、抗NO−システイン漿液抗体量をELISAで定量した。抗体量は吸光度の平均値±S.E.M.で現した。結果は吸光度を図1aに示した。注射から６日後、コントロールと比較してＥＡＥ動物群の血清中で顕著な抗NO -システインIgMの反応が観察される。実際のODはコントロールの0.13±0.01（0. 08から0.15の幅）に対し、0.51±0.05（平均値±S.D.；0.32から0.72の幅）[F_4. ₄₈ =21.43；p<0.001]。競合試験により抗体はNO-システインエピトープに直接反応していることが示された。ＥＡＥラットの血清にはIgGの反応は認められず、NO-システインに対するIgM のみが反応し、ＥＡＥの間はIgG反応は検出できない。第二段階として、抗NO-システイン抗体量の変化が臨床症状の多様性に関連するかどうかを調べるために、後足の筋力の変化を調べた。結果はコントロール（n=5）に対する実験群の後足の筋力の割合で表し、図1b に示す。数字は平均値±S.E.M.。各動物（n=9）について一日あたり10回ずつ測定した。筋力の低下は注射から18日目で著しく、26日目まで続いた。ＥＡＥラットはコントロールと比較して50から60％の著しい筋力低下を示した。ＥＡＥラットはコントロールと比較して、臨床症状が現れると体重の減少も観察された。しかし、体重減少と臨床症状とは相関が成立しなかった。・抗体量と小脳の脱髄の相関研究の最後に、ＥＡＥ動物の脱髄を測定した。ミエリンの特異染色をSPIELMEYERらの方法に従って実施した(1)。図２は、コントロール(a，b，c)とＥＡＥラット(d，e，f)小脳の縦方向切片の顕微鏡写真を示す。 a)とd)の矢印で示された場所はb)とe)に相当する。切片はミエリン塩基性蛋白質（MBP）に対するポリクローナル抗体で免疫染色した(c,f)。ミエリンの定量は抗MBP抗体の免疫組織化学的反応をSamba 2640システム（Alc atel，TITN，Answare，France）を用いて決定することにより行った。各動物毎、４切片を観察し、特定した表面のODの平均を測定した（◆）。各切片毎に、顆粒相内の３つの異なる葉の内部の標識されたMBPを測定した(4,6,8)。コントロールとして、ミエリンを持たない神経繊維で主に構成されていることが知られている小脳の分子層を用いた。定量的なデータは特定のユニットで表現した（ODn/su rface）。使用した記号は以下の意味をさす：cp=小脳脚；m=小脳髄；gl=小脳皮質の顆粒層；矢印の頭部は小脳髄の先端を示す。バーはa,c,d,fでは350μmを示し、b,eでは85μmを示す。ミエリン繊維の減少は小脳脚と小脳髄で最も著しく、また、小脳皮質顆粒層の三分の一の部分で見られる。更に、最も症状が出た動物において、小脳髄の先端の小脳髄質との接点でミエリン繊維の全部の消失で示されるように、疾患の程度はミエリン消失過程と相関があるように見える（図2e）。抗ミエリン塩基性蛋白質抗体を用いたミエリンの免疫組織化学的染色の定量的分析によって、小脳のミエリンの消失が証明された（図2f）。最も症状が現れたラットはコントロールと比較して28％のMBPが消失した（df=８；t=2.64；o=0.02）。・６日目の抗NO-システイン抗体と筋力の相関係数得られた結果は、抗NO-システイン抗体含量がＥＡＥにおいて病理生理学的予測の可能性を示す。実際、注射から６日目の抗NO-システイン抗体含量と22日目の後足の筋力（Bra vais Pearson係数、r=-0.72;p=0.016）、24dpi(r=0.81;p=0.008)、26dpi(r=0.96 ;p=0.0001)、ＥＡＥラットのミエリン量(r=0.77;p=0.014)の間には直接逆比が存在する。図３は注射６日目の抗NO-システイン抗体含量と観察期間中０日から26日までのＥＡＥラット（n=a）の筋力の相関係数を示す。各記号（◆）はBravais Pearson相関係数のr値を示す。点−破線は0.05（df=7 ）の顕著な数字を示す。各r値について、抗NO-システイン抗体の分散を筋力の回帰曲線に対して示す。６日目の抗NO-システイン抗体とＥＡＥ期間中の筋力の相関係数の上昇は時間依存的に動く。更に、24日目の筋力消失とミエリン消失は24日目（r=0.72;p=0.029）と26日目（r=0.72;0.027）で著しく相関する。まとめとして、これらのデータは；１）MS患者血清中には抗NO-システイン抗体の存在。２）それらの抗NO-システイン抗体の前臨床的ＥＡＥラットにおける存在。３）抗NO-システイン抗体量は病気の病理的発症の初期指標である。実施例３：臨床研究多発性硬化症に罹患しており、明らかに発作を起こしている１０人の患者群（前年度のかなりの治療活動を特徴とする）が臨床的かつ生物学的モニタリングの対象となった。１０人の患者の選択基準は以下のごとしである。：彼らは、以下の様な患者である。 −Poser(ポーザー)らによる基準に従って、ある多発性硬化症の徴候を示している。（５） −弛張性の形態の期間がある。このとき、後遺障害を伴うかあるいは伴わない。後遺障害の分類はLubin(ルビン)とReingold(レインゴールド)に従う。（６） −Kurtzkeによる拡大された障害状態指標（Expanded Disability Status Scal e:EDSS）に従い測定し、中程度のハンディキャップを持っている。患者群においては、EDSSスコア＜５．５である。（11） −活動性の多発性硬化症の徴候を示している。すなわち、過去２年で少なくとも２回の発症を起こしている。 −選択された時最後の発症の終息から少なくとも１ヶ月以上経過している。 −選択された時少なくとも１ヶ月間以上コルチコイドを投与されていない。 −あるいは、アザチオプリン(azathioprine)またはベータ・インターフェロン (beta-interferon)による基礎的な治療が実施されているが、少なくとも３ヶ月以上前には開始されていた。 −研究の目的を彼らに知らせる手紙を受け取った後、インフォームド・コンセント書式にサインしている。まず最初に、臨床的評価が実行された。（選択基準の確認・インフォームドコンセントのサイン・EDSSスコアとHauserらの歩行インデックス（７）を測定するための神経学的試験・９穴ペグ試験(Nine Hole Peg Test:9HPT)）臨床的発症の場合は、発症期間中の最大のEDSSスコアが評価された。発症に対する通常の手当てが実行された。（メチルプレドニゾロン1g/d/5d IV）この臨床的評価の間、血液サンプルが採取され、患者は発症後１ヶ月臨床的評価管理下に入った。（EDSS・歩行インデックス・9HPT）生物学的モニタリングはこのようにして研究の終了まで継続した。測定抗NO-システイン抗体の濃度（ＯＤ）は上記で述べたELISAに従って測定した。主な評価基準は、一方の抗NO-システイン抗体の濃度（吸光度）の測定ともう一方における以下の３つの変化との間の相関を探ることからなる。即ち、 −次の２週間における発症の発生 −１回の発症が起きている場合には、発症期間中の最大ＥＤＳＳ −発症が起きた場合には、発症後１月のEDSSと選択時ＥＤＳＳの差歩行インデックスと９ＨＰＴから確立された変異が追加の評価基準として用いられた。これらの結果は、多発性硬化症の患者モニタリングにおいて、病気の発生と、発症の重篤性の予知のために、抗NO-システイン抗体を測定することが有用であることを証明している。これらの使用は多発性硬化症の予防的処置のための研究において新たな路を開くものである。病態予測のは、研究において、活動的弛張性多発性硬化症を患う患者群において好ましくはイメージングとこれら抗体の測定の両者の臨床的なモニタリングが使われうるであろう。実施例４：ミエリンにおけるニトロソ化蛋白抗原の同定ａ）リコンビナントＭＯＧタンパク質の調製それぞれヒトのＭＯＧをコードする全長配列、あるいはMOGの細胞外部分をコードする配列を含む２つのpGEXタイプの発現プラスミド（ファルマシア社）が用いられた。（Dautingny,CNRS U1488,Pari）。多発性硬化症の異なるカテゴリーに対応する患者血清１．コンピテントバクテリアの調製 XL1Blue型の大腸菌が0.1M MgCl₂と50mM CaCl₂を用いて透過しやすくすることにより、コンピテントにした。バクテリアは非常に感受性となり、形質転換は素早く行われた。２．バクテリアの形質転換バクテリアは４℃で３０分間プラスミドと接触させられる。この間に、ＤＮＡはバクテリアの膜に接着する。４２℃で１分間熱ショックを与えられる。このＤＮＡはバクテリアに入り込む。後者は再生のために３７℃で１時間インキュベートされ、最終的にLBアガー＋アンピシリン選択培地に播く。バクテリア内へのプラスミドの導入はバクテリアをアンピシリン抵抗性にする。３．プラスミドの抽出コロニー中のプラスミドの存在をチェックするために、単離したコロニーを５ｍｌのＬＢアンピシリン培地に植菌して、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、バクテリアはＴＮＥ中で洗浄し、溶解して容量比２５／２４／１のフェノール／クロロホルム／イソアミールアルコール中で抽出した。遠心した後、タンパク質とゲノムＤＮＡは有機相と水相の境界に位置し、一方プラスミドＤＮＡは（ＲＮＡのように）水相に溶解性である。水相は回収され、プラスミドは酢酸アンモニウム塩（最終濃度０．２Ｍ）及び−２０℃の無水エタノールで沈殿させられる。１２０００ｒｐｍの遠心によってプラスミドはペレット中に濃縮される。プラスミドは７５％のエタノールで洗浄され、乾燥された後、少量の水に懸濁されて、ＲＮａｓｅで処理される。最後にプラスミドはＥｃｏＲＩあるいはＢａｍＨＩで消化され、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル中で泳動後、制限酵素地図をチェックし、それによって同定する。４．ｐＧＥＸ発現の誘導二つのプラスミドのうちの一つで形質転換した５ｍｌのバクテリアのプレカルチャーはＬＢアンピシリン培地で約１４時間インキュベートされる。このプレカルチャーはＬＢアンピシリン培地の２０ｍｌに移し、次に200mlの培地へと段階的に移される。このバクテリアは５９５ｎｍの吸光度を測定して、０．５になり対数増殖期に至るまで３７℃で再度培養される。この段階において、最終濃度５ｍＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加は融合タンパク質をコードした配列の転写の活性化に必須である。ＩＰＴＧはβガラクトシダーゼ遺伝子に由来するｐＴａｃプロモーターに結合し、全長若しくは部分ＭＯＧ配列のインサートを含むオープンリーディングフレームと、それに続くグルタチオンＳトランスフェレース（ＧＳＴ）をコードする配列の転写を誘導する。最終的なタンパク質はＧＳＴと部分あるいは全長ＭＯＧの融合に相当する。培養は２時間３０分のインキュベートにおかれ、これは比較的大量の蛋白質を得るのに必要とされる時間である。５．蛋白質の抽出工程は４℃で行われる。先の培養の遠心（３０００ｒｐｍ）の後、バクテリアのペレットは基本溶解緩衝液１（当初の培養５０ｍｌに対し１あるいは２ｍｌの緩衝液）に溶解される。８０μｌのリゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、反応混合液は２０分間０分間氷上に放置する。各調製液に４ｍｇのデオキシコール酸を加える。混液は攪拌の後、粘澄性となり、ゲノムＤＮＡはマイクロピペットによる吸引／排出で破壊される。１００μｌのＤＮａｓｅは室温３０分間でＤＮＡを消化する。このようにして得られた混合液は溶解緩衝液中での溶解された、あるいは溶解されないバクテリアの残渣及び蛋白質に相当する。少なくとも１時間の１２０００ｒｐｍでの１回目の遠心により、上清中における一方の溶解産物と、ペレット中の溶解されなかった蛋白質同様、膜及び残ったＤＮＡである他方の残渣に分けられる。ペレットは界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む溶解緩衝液２に懸濁される。１２０００ｒｐｍ１５分間の第２の遠心によって、疎水性分画を含むペレットから最終的な可溶性蛋白質が分離される。このペレットは１００μ ｌ若しくは２００μｌの水に懸濁され、分散される。６．電気泳動及びウエスターンブロット不連続ゲル（濃縮ゲル及び分離ゲル）中での電気泳動により、ＳＤＳの存在下で蛋白質はその分子量のみに従って分離される。電気泳動の後、ゲル中に移動したすべての蛋白質はクマーシーブルー溶液で染色され、あるいはウエスターンブロットが行われて最後に特定の蛋白質だけが同定される。後者の技術を実行するために、蛋白質はゲルからメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、ミリポア社）に、２時間０．８ｍＡ／ｃｍ²の電流で転写される。このメンブレンは洗浄し、３％のスキムミルクを含む溶液で飽和される。メンブレンは融合タンパク質を認識する一次抗体を含む溶液中で、約１４時間インキュベートされる。コントロールとしてマウスの細胞株から作られ、抗ＧＳＴモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を用いた。メンブレンは洗浄し、再度３％のスキムミルクで飽和した後、蛋白質上に固定した一次抗体を認識する二次抗体で２時間インキュベートした。この二次抗体はペルオキシダーゼを結合したマウスの抗イムノグロブリン抗体である。最終洗浄の後、蛋白質−一次抗体−二次抗体の複合体は、Ｈ₂Ｏ₂の存在下で、ペルオキシダーゼと発色源である４クロロ−１−ナフトール（これは蛋白質の移動した場所を黒くし、沈着させる）との反応により発色される。上記で示された方法論はリコンビナントＭＯＧの分画を得るのに用いられる。ｂ）ＧＳＴ−ＭＯＧ融合タンパク質を用いて行われた試験多発性硬化症の異なる形態及び進行段階を区別するために、ニトロソ化されたリコンビナントタンパク質に対して患者血清のバンクが使用された。患者の試験において、一次抗体は血清の１００倍希釈に相当し、第二抗体はペルオキシダーゼを結合した抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭである。ｃ）ｉｎｖｉｔｒｏでニトロソ化されたヒトミエリンの調製から始まり、多発性硬化症の多様な形態の抗体がウエスターンブロットでスクリーニングされた。約１００ｋＤａ及び２５ｋＤａの二つの主な蛋白質が明らかになった（図４）。ニトロソ化されて免疫原性を持ったこれらの蛋白質の特性を探るため、多発性硬化症の患者の血清がＥＬＩＳＡ／ドットブロットによりニトロソ化ＭＡＧに対して試験された。多発性硬化症を患っている患者５８人の血清とコントロールの最初の分析は、活動型の患者のにおいてトロソ化された形態のＭＡＧに対するかなりの抗体の存在を示している。発症を受けている患者（ｎ＝１２）若しくは進行しつつある患者（ｎ＝１０）は、安定状態（ｎ＝１２）若しくは寛解期（ｎ＝１２）あるいは健常者（ｎ＝１２）に比較してずっと高い抗ニトロソ化ＭＡＧ抗体濃度を示す（ｏｎｅｗａｙＡＮＯＶＡ；Ｆ（４．５３）＝２２，２６１，ｐ＜０．０００１）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月２日（１９９９．４．２）【補正内容】請求の範囲１／中枢若しくは末梢神経系の炎症性自己免疫性病理の経過中に発達した抗体の使用であって、これらの抗体は抗ＮＯ−Ｐ抗体若しくは抗脂肪酸抗体よりなる群に属しており、ＰはＮＯを結合することのできる蛋白質、リコンビナント型の蛋白質、ペプチド若しくはアミノ酸を示しており、臨床的発症若しくは上記病理の新規な病変の予知のためのマーカーとしての使用。２／抗ＮＯ−Ｐ抗体において、Ｐがミエリン関連糖蛋白質（ＭＡＧ）若しくは主要オリゴデンドロサイト糖蛋白質（ＭＯＧ）、あるいはアミノ酸としてシステイン残基を表すことを特徴とする請求項１記載の使用。３／抗脂肪酸抗体において、脂肪酸がラウリル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸より選ばれるものであることを特徴とする請求項１記載の使用。４／患者の血清検体をニトロ化ＮＯ−Ｐ抗原（ＰはＮＯを結合することのできる蛋白質、リコンビナント型の蛋白質、ペプチド若しくはアミノ酸又は脂肪酸を表す）と接触させ、抗原抗体反応が生じたときにそれを検出することを特徴とする中枢あるいは末梢神経系の炎症性自己免疫性病理における発症及び病変の発生の早期診断のための試験。５／血清と抗原が３７℃の温度でインキュベートされることを特徴とする請求項４記載の試験。６／抗原がキャリアー蛋白質に結合していることを特徴とする請求項４または５記載の試験。７／キャリアー蛋白質がＫＬＨ若しくはウシ血清アルブミンであって、試験が抗脂肪酸抗体の測定に用いられるとき、脱脂した形態で用いられることを特徴とする請求項６記載の試験。８／キャリヤー蛋白質がスペーサー要素によってハプテンから離されていることを特徴とする請求項６または７記載の試験。９／抗原が、蛋白質Ｐとしてシステイン残基、及び脂肪酸としてラウリル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸より選ばれる酸よりなうことを特徴とする請求項４から８のいずれか記載の試験。１０／固着した抗体がＥＬＩＳＡ法によって検出され、該抗原は固相担体に固着しており、生物学的メディウムに２次抗体が添加されることを特徴とする請求項４から９のいずれか記載の試験。１１／中枢若しくは末梢神経系の炎症性自己免疫性病変における発症若しくは病巣の発生の診断のためのキット若しくはセットであって、試験及びその実施について記載された使用のための説明書と共に以下を含むことを特徴とするキット若しくはセット； −請求項４または９記載の、担体に固着された、ニトロソ化ＮＯ−Ｐ抗原若しくは脂肪酸 −少なくとも一つの洗浄用緩衝液 −請求項１で定義されたＰ若しくは脂肪酸に対して特異的でない抗体の固着を許す蛋白質を含み、ＥＬＩＳＡ試験を実施するための少なくとも一つの反応用緩衝液 −２次抗体よりなるマーカー −発色剤及び −陽性コントロール血清と陰性コントロール血清。

Claims

【特許請求の範囲】１／炎症性自己免疫性病理における臨床的発症若しくは新しい病変を予知するマーカーであって、それらが疾患の経過中に発達させた抗体であり、抗ＮＯ−Ｐ抗体（Ｐは、ＮＯを結合することのできる蛋白質、好ましくはリコンビナントの形態、ペプチド、あるいはアミノ酸を表す）若しくは脂肪酸抗体よりなる群の抗体であることを特徴とするマーカー。２／抗ＮＯ−Ｐ抗体において、Ｐがミエリン関連糖蛋白質（ＭＡＧ）あるいは、アミノ酸としてシステイン残基を示すことを特徴とする請求項１記載のマーカー。３／抗脂肪酸抗体において、この脂肪酸が例えばラウリル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から選ばれることを特徴とする請求項１記載のマーカー。４／脱随及び筋力の欠乏の炎症性自己免疫性病理において、炎症過程におけるマーカーが抗ＮＯ−Ｐ抗体よりなり、ここでＰは請求項２または３で定義されるものであることを特徴とする、発症及び病変の発生の早期診断のための試験。５／Ｐを含むニトロ化された抗原または脂肪酸と血清を接触させ、それが生じたときに、抗原抗体反応を可視化することによる患者血清中の抗ＮＯ−Ｐ抗体及び／若しくは抗脂肪酸抗体の定性的及び定量的測定を含むことを特徴とする請求項４記載の試験。６／血清と抗原が約３７℃でインキュベートされることを特徴とする請求項４記載の試験。７／抗原がＫＬＨやウシ血清アルブミンのようなキュリアー蛋白質に結合しており、試験が抗脂肪酸抗体の測定に用いられるときに、抗原が脱脂された形態で用いられることを特徴とする、請求項５または６記載の試験。８／キャリアー蛋白質がグルタルアルデヒドのようなスペーサー因子によってハプテンから離されていることを特徴とする請求項７記載の試験。９／抗原が好ましくは、蛋白質Ｐとしてシステイン残基及び脂肪酸としてラウリル酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸より選ばれる酸であることを特徴とする請求項５から８のいずれか記載の試験。１０／ＥＬＩＳＡ法に従って実施され、抗原に固定された２次抗体を用い、既知の技術によって検出されることを含むことを特徴とする請求項２から９のいずれか記載の試験。１１／炎症性自己免疫性病変において発症あるいは病変の発生を診断するためのキット若しくはセットであって、以下を含むことを特徴とするもの； −請求項５から９のいずれか記載の試験の遂行のために定義された抗原であって、好ましくはマルチウエルマイクロプレートのような固相に結合しており、さらに好ましくは、 −少なくとも一つの洗浄用緩衝液と、 −少なくとも一つの反応用緩衝液であって、好ましくはＥＬＩＳＡ試験を実施するために請求項１で定義されるＰ若しくは脂肪酸に対して特異的でない抗体を吸着させる蛋白質を含む緩衝液と、 −２次抗体、特に抗ヒトＩｇＭからなるマーカーと、 −オルトフェニレンジアミンのような発色剤と −陽性コントロール血清及び陰性コントロール血清と、試験及びその実施について記載した使用説明書からなるキット若しくはセット。