JP2004530871A - 神経変性疾患の管理のための方法及びキット - Google Patents
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Abstract
さらに本発明は、この方法を実行するためのキットに関する。
Description
【0001】
本発明の課題は神経変性疾患の管理のための方法及びキットである。
本発明は特に医療分野及び免疫学分野において適用できる。
【背景技術】
【0002】
ここ50年で医療が大きく進歩したにも関わらず、長年に渉って知られているか又は近年明らかになった疾患の中には、公衆衛生に多額を投じても、厳密には治癒できないままのものがある。具体的には、パーキンソン病、多発性硬化症(MS)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、自己免疫疾患、肝炎、関節リウマチ(RA)等の萎縮性及び炎症性のリウマチ等の神経変性疾患が挙げられる。
【0003】
上記疾患においては、疾病分類学的診断が行われ、病変過程機構及び病変期が知られているものもあり、非常に高価であることが多い兆候学的治療が行われているが、結果は期待した程ではない。
【0004】
多発性硬化症は中枢神経系の多房性脱髄疾患であり、脳や脊髄の白質に影響を及ぼし、進行が潜行性で予測できず、非常に重い障害を与える疾患である。
【0005】
フランスでは成人1000人のうち1人(国民10万人に対し40〜60例)、即ち、フランス国民のうち50000人がMSに冒されており、毎年2000例の新症例が計上されている。世界中では200万例にのぼる。
【0006】
この病気は成人初期である15〜50歳(特に20〜40歳)の間に始まる。女性の発症率は男性の2倍である。
【0007】
MSには3つの性質の異なる臨床形態がある:弛張性、進行性及び弛張進行性である。
【0008】
筋萎縮性側索硬化症(ALS)又はシャルコー病は、進行が早い原因不明の神経疾患である。この疾患は脳の運動ニューロン、脳幹及び脊髄の前角を冒して変性させることが特徴であるが、一方知覚ニューロンは影響を受けず、知的機能は無傷のままである。従って患者は、病気が進行し、機能的能力が低下していくことを完全に自覚させられる。
【0009】
ALSの有病率はMSの有病率に匹敵する。その率はハンチントン病の5倍高い。MSやハンチントン病によるよりも多くの人がALSによって亡くなっている。
【0010】
ALSは45〜70歳で最も多く発症し、女性よりも男性の方が1.5〜2倍多くこの病気に冒される。この病気の患者はどんどん若年化して、40歳になる前に発症する症例も存在する。
【0011】
その発病率、即ち各年の新症例数は世界中で増加傾向にあるが、その原因は不明である。フランスでは5000〜10000人がこの病気に冒されていると予想され、毎年約1100の新症例が計上されている。
【0012】
この疾患の進行は劇的であり、常に命にかかわる。つまり、この疾患は進行性悪化へと進行し、肋間筋と横隔筋を冒して寝たきりの状態及び呼吸困難を招き、急速(3〜5年以内)に死をもたらす。
【0013】
ALSは生物学的異種と考えられるべき進行性の臨床上の異種である。
【0014】
関節リウマチ(RA)は、昔は萎縮性関節炎と呼ばれた慢性進行性多発関節炎性炎症性疾患であって、骨軟骨破壊の原因であり、変形と強直を経て、痛みを伴う機能不全に至る。
【0015】
従って、RAは深刻な疾患となる可能性があり、兆候が表れ始めてから10年後には半数を超える患者に重大な障害を引き起こし、彼らの平均余命を数年減少させることとなる。
【0016】
フランスにおける有病率はおよそ1%であろう。最も多いのは慢性炎症性リウマチである。1年当たり7000人が新しくこの疾患に冒され、まだ若い女性がこの疾患に冒されることが多い。
【0017】
脊椎関節炎(SAR)は、腰仙部を冒して強直を進行させるという症状を示す慢性リウマチ疾患である。この免疫学的炎症性疾患は組織適合性抗原B27の過剰発現(症例の90%で見られる)に繋がる。
【0018】
従って、発病者数と公衆衛生にかかる費用の点から上記疾患の重大性は無視できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0019】
これまでのところ、上記疾患のステージを見極めるため及び/又は進行を予測するための生物学的試験は存在しない。唯一臨床試験によってのみ(但し補足的な試験により完成されるものでもよい)上記疾患を診断することができる。従って、自由に使えて、病院の不十分さを補う、特異的で、かつ、進歩的な診断試験を得ることが是非とも望まれる。
【課題を解決するための手段】
【0020】
出願人は、神経変性疾患が免疫担当細胞によって統合されている抗原の変性に関連して発症し、A−イソタイプ及び/又はM−イソタイプの循環抗体を生産するという症状を示すことを明らかにした。これらの抗体は下記の表1に示す抗原に対するものである。表1は上記疾患が慢性的であることに関与する抗原の変性及び細菌性因子を示している。
【0021】
【表1】
【0022】
従って、上記抗体の検出を、神経変性疾患の一般的な診断及び上記疾患の管理の中に加えることができる。
【0023】
このような、生体液中の上記抗原の検出方法は、以下の段階、
−上記生体液を以下の抗原のいずれか1つ:Pal、Ole、Myr、PI、MAD、Ach、FarCys、Aze、NO−Cys、NO−Tyr、NO−Trp、NO−His、NO2−Tyr、NO−Phe、NO−Arg、NO−Asn、NO−Met、NO−Cr、NO−BSA、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17及びIg19:に接触させる段階、
−上記抗原とそれに対応する抗体の間に任意に形成される複合体を検出する段階
を含んでいてよい。
【0024】
表1に示すように、細菌性抗原「Ig」に対する抗体の存在が検出される場合、この抗体はA−イソタイプ及び/又はM−イソタイプである可能性がある。
【0025】
任意にニトロシル化されているウシ血清アルブミンを除く非細菌性抗原は、好ましく結合する。
【0026】
本発明の意味において「結合した抗原」という語は、担体分子、好ましくはウシ血清アルブミンに、直接又はグルタルアルデヒド若しくはグルタル酸無水物を介して結合する抗原(Pal、FarCys、NO−Cys等)として理解される。このような結合は、例えばBoullerneら(1995、1996)、Geffardら(1998)の文献に記載されているような当業者に公知の方法によって行われる。
【0027】
上記細菌性抗原は、表1に記載の細菌の培養物を超音波処理して得られる。
【0028】
上記生体液は、具体的には、血清、血漿、全血液、尿、脳脊髄液であってよい。
【0029】
方法としては、好ましくは「サンドイッチ」型の方法を用いてよい。
【0030】
任意に形成される複合体の存在は、蛍光標識、ビオチン/ストレプトアビジン法の標識、(放射性)同位元素等の標識、又は、酵素に結合しているA又はM抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いて明らかにされることができる。
【0031】
本発明の方法は、好ましくは、適切な固形の担体を用いて行うことができる。
【0032】
固形の担体としては、細胞懸濁液の取り扱いに適した手段であれば用いることができ、好ましくは、マイクロウェルを含む、チューブ、特定の磁気担体、又は、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ(塩化ビニル)若しくはニトロセルロース製の硬質の若しくは柔軟性のある微量滴定プレートを用いることができる。
【0033】
NH2末端を有し、あらかじめ活性化させた微量滴定プレートを用いる場合、担体分子に抗原を「結合させる」ことは必須ではない。
【0034】
「(放射性)同位元素に結合した抗体」という表現は、上記抗体が、その構造に特有の元素上、例えば構成要素であるチロシン残基上、又は、それに固定された特有のラジカル上のどちらかに放射性同位元素を有し、この放射性同位元素に付随する放射能の計数により上記抗体の測定を可能にするということを示している。
【0035】
上記抗体が酵素に結合している場合、この酵素は、適切な試薬を用いて、上記抗体の定量を可能にする。
【0036】
基質及び上記試薬は、上記酵素によって起こる、これらの物質を用いる1つ又は一連の反応の最終産物が、
−細胞周辺の液体媒質中に拡散し、最後に行う分光光度測定又は蛍光定量測定の被験物質である着色物質又は蛍光物質であり、
−細胞上及び細胞壁に固定的に付着し、任意的に各種標準色調と比較する場合に反射光度測定又は目視評価の被験物質である可能性がある不溶性着色物質である
ように選択される。
【0037】
例えばヨウ素125等の(放射性)同位元素を用いる場合、試料に付随する放射能を適切な方法によりガンマーカウンターを用いて計数する。
【0038】
酵素を用いる場合、上記酵素の基質と、着色物や不溶性着色物や可溶性蛍光物が上述の媒質に溶解した状態で最終的に得られるようにする1種以上の試薬とを含有する溶液を上記固形の担体に加えることにより、着色物又は蛍光物が得られる。この後、上記処理した試料から発生する光信号を、それぞれの場合に適した器具(それぞれ、透過・反射光度計又は蛍光光度計)を用いて測定した。固形の担体が微量滴定プレートである場合、光信号の測定値は同一プレートの全ウェルにおいて、生物学研究室で一般的に用いられる普通の自動読み取り装置を用いて連続して行ってよい。
【0039】
アルカリフォスファターゼを酵素として用いてよい。その選択的基質は、最後に分光光度測定を行う場合はp−ニトロフェニルフォスフェート、蛍光光度測定を行う場合は4−メチルウンベリフェリルフォスフェート、不溶性着色反応産物を得る場合は5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォスフェートである。選択的基質がo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシドであるβ−ガラクトシダーゼも酵素として同様に用いてよい。
【0040】
好ましくは、上記抗Ig抗体は従来通りペルオキシダーゼに結合させてよい。上記抗Ig抗体に結合しているペルオキシダーゼを検出するために用いる試薬は、酵素の基質である過酸化水素、及び、不溶性最終反応産物を得るためのo−フェニレンジアミン、3,3’−ジアミノベンジジン若しくはTMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)等の、又は、更には媒質に可溶な蛍光反応産物を得るためのp−ヒドロキシフェニルプロピオン酸等の適切な色原体を含有する。比色反応は硫酸を用いて停止する。
【0041】
本発明の別の好ましい態様は、アセチルコリンエステラーゼに結合した抗免疫グロブリン抗体を用いることである。
【0042】
アセチルコリンエステラーゼは、好ましくはフランス特許出願FR2550799号に記載の方法に由来する方法、又は、公知の方法による上記抗体断片の調製、適切な異種二価性試薬を用いた反応による上記酵素の変性、及び、最終的にこうして得られた産物を結合することを概略的に含む方法により上記抗体に結合している。
【0043】
酵素活性の検出は、酵素の基質としてアセチルチオコリンを、かつ、色原体としてエルマン試薬(又は5,5’−ジチオ−2−ニトロ安息香酸)を用いる公知の方法によって、検討した事例に応じて方法を変えながら(例えばAnal.Chem.57(1985)1170−1173に記載の方法により)行うことが好ましい。
【0044】
上記色原体は、そのまま又は水溶性の塩として用いる。
【0045】
本発明の別の課題は、上記に記載の方法を実行するためのキットである。このキットは、好ましくは、
−以下の抗原のいずれか1つ:Pal、Ole、Myr、PI、MAD、Ach、FarCys、Aze、NO−Cys、NO−Tyr、NO−Trp、NO−His、NO2−Tyr、NO−Phe、NO−Arg、NO−Asn、NO−Met、NO−Cr、NO−BSA、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17及びIg19:、
−任意に少なくとも1種の上記A−イソタイプ及び/又はM−イソタイプのヒト抗免疫グロブリン抗体
を含む。
【0046】
このキットは、適切な固形の担体もまた含んでいてよい。
【0047】
この試験は特に、
−上記疾患、特に、危険な状態の人における上記疾患の早期診断を確立すること、及び、その結果として上記疾患の治療において遅れのないようにすること、
−上記疾患の進行を管理すること、及び、その結果として上記治療を適切に行うこと
を可能にする。
【0048】
以下の抗原:PI、Ach、Aze、NO−Cys、NO−Tyr、NO−Trp、NO2−Tyr、NO−Asn、NO−Met、Ig5(A−イソタイプ抗体)、Ig12(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体)、Ig13(A−イソタイプ抗体)、Ig16(A−イソタイプ抗体)、Ig17(M−イソタイプ抗体)及びIg19(A−イソタイプ抗体):に対する抗体の検出は、特にMSの診断の確立を可能にする。以下の抗原:NO2−Tyr、NO−Tyr、Ach及びIg16(A−イソタイプ抗体):に対する抗体の定量は、MSの特定の形態(進行性、弛張性、弛張進行性)の識別を可能にする。
【0049】
同様にして、以下の抗原:Ole、PI、MAD、Aze、NO−Cys、FarCys、Ig3(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体)、Ig5(A−イソタイプ抗体)、Ig12(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体)、Ig13(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体)、Ig16(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体)及びIg17(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体):に対する抗体の検出は、ALSの診断を確立すること、及び、抗体力価の関数としてこの疾患の3クラスを識別することを可能にする。
【0050】
以下の抗原:Pal、Ole、Myr、PI、MAD、FarCys、Aze、NO−Cys、NO−Phe、Ig3(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体)、Ig5(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体)、Ig12(A−イソタイプ抗体及びM−イソタイプ抗体)、Ig13(M−イソタイプ抗体)及びIg19(A−イソタイプ抗体):に対する抗体の検出は、RAの診断の確立を可能にする。
【0051】
請求の範囲における記載の中で、以下の略称を用いることとする。
BSA:ウシ血清アルブミン
G:グルタルアルデヒド残基
GA:グルタル酸無水物残基
PBS:リン酸緩衝食塩水
OPD:o−フェニレンジアミン
H2O2:過酸化水素
H2SO4:硫酸
PI:ホスファチジルイノシトール
CaCl2:塩化カルシウム
NaCl:塩化ナトリウム
OD:光学濃度
HSA:ヒト血清アルブミン
HSA−EA:エチレンジアミン付加ヒト血清アルブミン
Ig:免疫グロブリン
Ach:アセチルコリン
Ole:オレイン酸
Pal:パルミチン酸
Myr:ミリスチン酸
FarCys:ファルネシルシステイン
【0052】
【化1】
【0053】
MDA:マロンジアルデヒド(脂質過酸化に起因するネオエピトープ)
【0054】
【化2】
【0055】
(R=タンパク質)
NO−Cys:NO−システイン(システインのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0056】
【化3】
【0057】
NO−Trp:NO−トリプトファン(トリプトファンのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0058】
【化4】
【0059】
NO−Asn:NO−アスパラギン(アスパラギンのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0060】
【化5】
【0061】
NO−Tyr:NO−チロシン(チロシンのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0062】
【化6】
【0063】
NO2−Tyr:NO2−チロシン(過酸化亜硝酸(NO+O2−)の形成に起因するネオエピトープ)
【0064】
【化7】
【0065】
NO−His:NO−ヒスチジン(ヒスチジンのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0066】
【化8】
【0067】
NO−Phe:NO−フェニルアラニン(フェニルアラニンのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0068】
【化9】
【0069】
NO−Met:NO−メチオニン(メチオニンのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0070】
【化10】
【0071】
NO−Arg:NO−アルギニン(アルギニンのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0072】
【化11】
【0073】
NO−Cr:NO−クレアチン(クレアチンのニトロシル化に起因するネオエピトープ)
【0074】
【化12】
【発明を実施するための最良の形態】
【0075】
本発明は、単に例証として記載する以下の節及び実施例によってよりよく理解されるであろう。
【0076】
<1節:抗NO−システイン抗体の検査>
MERCK−EUROLAB(POLYLABO)社より市販されている96ウェルのMaxisorp(R)微量滴定プレートを用いる。NO−システイン−G−BSA共役体(Boullerneら(1995、1996)、Geffardら(1998)の文献に記載の方法により調製)を炭酸バッファー(pH9.6)(反応ブランク:BSA−G)に10μg/mLで溶解した溶液を各ウェルに添加し、プレートの光暴露を避けて撹拌しながら4℃で1晩置く。その後、Tween(R)、10%グリセロール及び1g/LのBSAを含有するPBSバッファーをウェルに添加し、37℃で1時間後、ウェルの表面がタンパク質で飽和したものを得る。洗浄はPBSで3回行う。
【0077】
その後、被験血清をTween(R)、10%グリセロール及び1g/LのBSA−Gを含有するPBSバッファーに1000倍希釈したものを添加し、37℃で2時間インキュベートする。
【0078】
その後、ペルオキシダーゼ標識ヒト抗IgM抗体(Sanofi Pasteurより市販、75061参照)をTween(R)及び1g/LのBSAを含有するPBSバッファーに5000倍希釈した溶液をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0079】
プレートをひっくり返してウェルの中身を出す。検出試薬を各ウェルに添加し(クエン酸・リン酸バッファー20mLに対して、H2O2(酵素の基質)10μL及び4%OPD0.5mLを添加したもの)、暗所で10分間呈色させる。4N硫酸50μLで反応を停止し、492nmにおけるODを測定する。
【0080】
結果を、以下の方法でコントロールの数に対して示す。
抗体力価=(ODserum−ODav.controls)/ODav.controls
【0081】
<2節:抗ホスファチジルイノシトール抗体の検査>
Maxisorp(R)微量滴定プレートを用いる。10−2Mリン酸バッファーと10−3MCaCl2の混合物(pH7)20mLから調製した20μg/mLの被覆溶液を各ウェルに添加し(Faiderbeら(1990)、Brochetら(1991))、各ウェルをクロロホルムで飽和させ、ホスファチジルイノシトール(SIGMAより市販、P−5766参照)の母液40μLをハミルトンシリンジで、及び、ヘキサン/クロロホルム(84/16)混合物100μLを添加し、PIを溶液(反応ブランク:BSA)内に到達させる。ウェルは、白色沈殿が得られるまでボルテックスする。その後、プレートは撹拌しながら37℃で1晩放置する。そしてプレートを少なくとも30分間オーブンで乾燥させ、洗浄をPBSで3回行う。
【0082】
その後、以下の方法で得られる被験血清を添加する。その方法とは、検査の前夜にあらかじめ上記血清を27g/LのNaClを含有するPBSバッファーに10倍に希釈したものを調製し、4℃で1晩撹拌する。10000rpmで15分間遠心分離を行う。上清を50倍希釈する(10%グリセロール及び1g/LのHSA−EAを含有するPBSバッファーで最終的に500倍に希釈したことになる)。
【0083】
最後に、ペルオキシダーゼ標識ヒト抗IgM抗体(SANOFI−PASTEUR、75061参照)をTween(R)及び1g/LのBSAを含有するPBSバッファーに5000倍希釈した溶液をウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0084】
プレートをひっくり返してウェルの中身を出す。検出試薬を各ウェルに添加し(クエン酸・リン酸バッファー20mLに対して、H2O220μL及び4%OPD1mLを添加したもの)、暗所で10分間呈色させる。4N硫酸50μLで反応を停止し、492nmにおけるODを測定する。
【0085】
結果を、以下の方法でコントロールの数に対して示す。
抗体力価=(ODserum−ODav.controls)/ODav.controls
【0086】
<3節:抗アセチルコリン抗体の検査>
Maxisorp微量滴定プレートを用いる。コリン−GA−BSA共役体(Souanら(1986)の文献に記載の方法により調製)を炭酸バッファー(pH9.6)(反応ブランク:BSA)に10μg/mLで溶解した溶液を各ウェルに添加し、撹拌しながら4℃で1晩置く。その後、Tween(R)、10%グリセロール及び1g/LのBSA−GAを含有するPBSバッファーをウェルに添加し、37℃で1時間後、ウェルの表面がタンパク質で飽和したものを得る。洗浄はPBSで3回行う。
【0087】
その後、Tween(R)及び1g/LのBSA−GAを含有するPBSバッファーで1000倍希釈した被験血清を添加し、37℃で2時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0088】
最後に、ペルオキシダーゼ標識ヒト抗IgM抗体(SANOFI−PASTEUR、75061参照)をTween(R)及び1g/LのBSAを含有するPBSバッファーに10000倍希釈した溶液をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0089】
プレートをひっくり返してウェルの中身を出す。検出試薬を各ウェルに添加し(クエン酸・リン酸バッファー20mLに対して、H2O210μL及び4%OPD0.5mLを添加したもの)、暗所で10分間呈色させる。4N硫酸50μLで反応を停止し、492nmにおけるODを測定する。
【0090】
結果を、以下の方法でコントロールの数に対して示す。
抗体力価=(ODserum−ODav.controls)/ODav.controls
【0091】
<4節:抗アゼライン酸抗体の検査>
Maxisorp微量滴定プレートを用いる。Aze−BSA共役体(Daveratら(1989)の文献に記載の方法により調製)を炭酸バッファー(pH9.6)(反応ブランク:BSA)に10μg/mLで溶解した溶液を各ウェルに添加し、撹拌しながら4℃で1晩置く。その後、Tween(R)、10%グリセロール及び1g/LのHSA−EAを含有するPBSバッファーをウェルに添加し、37℃で1時間後、ウェルの表面がタンパク質で飽和したものを得る。洗浄はPBSで3回行う。
【0092】
その後、Tween(R)、10%グリセロール及び1g/LのHSA−EAを含有するPBSバッファーで500倍希釈した被験血清を添加し、37℃で2時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0093】
最後に、ペルオキシダーゼ標識ヒト抗IgM抗体(SANOFI−PASTEUR、75061参照)をTween(R)及び1g/LのBSAを含有するPBSバッファーに10000倍希釈した溶液をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0094】
プレートをひっくり返してウェルの中身を出す。検出試薬を各ウェルに添加し(クエン酸・リン酸バッファー20mLに対して、H2O210μL及び4%OPD0.5mLを添加したもの)、暗所で10分間呈色させる。4N硫酸50μLで反応を停止し、492nmにおけるODを測定する。
【0095】
結果を、以下の方法でコントロールの数に対して示す。
抗体力価=(ODserum−ODav.controls)/ODav.controls
【0096】
<5節:抗ファルネソール−システイン抗体の検査>
Maxisorp(R)微量滴定プレートを用いる。FarCys−BSA共役体(クロロギ酸エチルでFarCysを活性化した後、下記の7節に記載の脂肪酸について示す方法を用いてBSAと結合させることにより調製)を炭酸バッファー(pH9.6)(反応ブランク:BSA)に20μg/mLで溶解した溶液を各ウェルに添加し、撹拌しながら4℃で1晩置く。洗浄をPBSで3回行う。その後、27g/LのNaCl及び2g/Lの脱脂BSAを含有するPBSバッファーをウェルに添加し、37℃で1時間後、ウェルの表面がタンパク質で飽和したものを得る。洗浄はPBSで3回行う。
【0097】
その後、27g/LのNaCl及び2g/Lの脱脂BSAを含有するPBSバッファーで250倍希釈した被験血清を添加し、37℃で2時間インキュベートする。洗浄はPBSで3回行う。
【0098】
最後に、ペルオキシダーゼ標識ヒト抗IgM抗体(SANOFI−PASTEUR、75061参照)をTween(R)及び1g/LのBSAを含有するPBSバッファーに5000倍希釈した溶液をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0099】
プレートをひっくり返してウェルの中身を出す。検出試薬を各ウェルに添加し(クエン酸・リン酸バッファー20mLに対して、H2O220μL及び4%OPD1mLを添加したもの)、暗所で10分間呈色させる。4N硫酸50μLで反応を停止し、492nmにおけるODを測定する。
【0100】
結果を、以下の方法でコントロールの数に対して示す。
抗体力価=(ODserum−ODav.controls)/ODav.controls
【0101】
<6節:抗MDA抗体の検査>
Maxisorp(R)微量滴定プレートを用いる。MDA−BSA共役体(Amaraら(1995)の文献に記載の方法により調製)を炭酸バッファー(pH9.6)(反応ブランク:BSA)に80μg/mLで溶解した溶液を各ウェルに添加し、撹拌しながら4℃で1晩置く。その後、Tween(R)、10%グリセロール及び5g/LのBSAを含有するPBSバッファーをウェルに添加し、37℃で1時間後、ウェルの表面がタンパク質で飽和したものを得る。洗浄はPBSで3回行う。
【0102】
その後、Tween(R)及び5g/LのBSAを含有するPBSバッファーで1000倍希釈した被験血清を添加し、37℃で2時間インキュベートする。洗浄はPBSで3回行う。
【0103】
最後に、ペルオキシダーゼ標識ヒト抗IgM抗体(SANOFI−PASTEUR、75061参照)をTween(R)及び5g/LのBSAを含有するPBSバッファーに5000倍希釈した溶液をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0104】
プレートをひっくり返してウェルの中身を出す。検出試薬を各ウェルに添加し(クエン酸・リン酸バッファー20mLに対して、H2O210μL及び4%OPD0.5mLを添加したもの)、暗所で10分間呈色させる。4N硫酸50μLで反応を停止し、492nmにおけるODを測定する。
【0105】
結果を、以下の方法でコントロールの数に対して示す。
抗体力価=(ODserum−ODav.controls)/ODav.controls
【0106】
<7節:抗脂肪酸抗体の検査>
Maxisorp(R)微量滴定プレートを用いる。Ole−BSA、Pal−BSA又はMyr−BSA共役体(Manetaら(1987)、Amaraら(1994a及びb)、Constansら(1995)、Boullerneら(1996)の文献に記載の方法により調製)を10−3MCaCl2含有炭酸バッファー(pH9.6)(反応ブランク:脱脂BSA)に50μg/mLで溶解した溶液を各ウェルに添加し、撹拌しながら4℃で1晩置く。洗浄は10−3MCaCl2含有PBSで3回行う。
【0107】
その後、CaCl210−3M及び1g/Lの脱脂BSAを含有するPBSバッファーで1000倍希釈した被験血清を添加し、37℃で2時間インキュベートする。洗浄は10−3MCaCl2含有PBSで3回行う。
【0108】
最後に、ペルオキシダーゼ標識ヒト抗IgM抗体(SANOFI−PASTEUR、75061参照)をCaCl210−3M及び1g/Lの脱脂BSAを含有するSPBバッファーに5000倍希釈した溶液をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するSPBで3回洗浄する。
【0109】
プレートをひっくり返してウェルの中身を出す。検出試薬を各ウェルに添加し(クエン酸・リン酸バッファー20mLに対して、H2O210μL及び4%OPD0.5mLを添加したもの)、暗所で10分間呈色させる。4N硫酸50μLで反応を停止し、492nmにおけるODを測定する。
【0110】
結果を、以下の方法でコントロールの数に対して示す。
抗体力価=(ODserum−ODav.controls)/ODav.controls
【0111】
<8節:抗−抗原性細菌の抗体の検査>
Maxisorp(R)微量滴定プレートを用いる。対応する細菌(表1参照)の培養物を超音波処理して得た細菌性抗原を炭酸バッファー(pH9.6)(反応ブランク:BSA)に34μg/mLで溶解した溶液を各ウェルに添加し、撹拌しながら4℃で1晩置く。その後、5g/LのBSAを含有するPBSバッファーをウェルに添加し、37℃で1時間後、ウェルの表面がタンパク質で飽和したものを得る。洗浄はTween(R)を含有するPBSで3回行う。
【0112】
その後、Tween(R)及び2.5g/LのBSAを含有するPBSバッファーで500倍希釈した被験血清を添加し、37℃で2時間インキュベートする。洗浄はTween(R)を含有するPBSで3回行う。
【0113】
最後に、ペルオキシダーゼ標識ヒト抗IgA又は抗IgM抗体(SANOFI−PASTEUR、75041又は75061参照)をTween(R)及び2.5g/LのBSAを含有するPBSバッファーに5000倍希釈した溶液をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをTween(R)を含有するPBSで3回洗浄する。
【0114】
プレートをひっくり返してウェルの中身を出す。検出試薬を各ウェルに添加し(クエン酸・リン酸バッファー20mLに対して、H2O210μL及び4%OPD0.5mLを添加したもの)、暗所で10分間呈色させる。4N硫酸50μLで反応を停止し、492nmにおけるODを測定する。
【0115】
結果を、以下の方法でコントロールの数に対して示す。
抗体力価=(ODserum−ODav.controls)/ODav.controls
【実施例1】
【0116】
<MSにおける循環抗体の定量>
以下の表1は、前述の節に記載の方法により多数の対象について行った酵素抗体検査の結果を集めたものである。
【0117】
【表2】
【0118】
MSに有利であることを示す統計学的に有意な抗体反応が、33の共役体のうち23についてみられた。
【0119】
例えば、MSに対する抗NO−Cysの反応の特異性を、ラジカルの過程の関与が分かったコントロールとしての神経変性疾患(筋萎縮性側索硬化症、てんかん及びパーキンソン病)の特異性と比較した。結果は、多様な病状間のMSに有利なこの反応において有意差があることを示した。
【0120】
以下の表2は、16の有意な共役体のうちMSの多様な形態(P:進行性、R:弛張性、RP:弛張進行性、CON:コントロール)間の関係を示す。
【0121】
【表3】
【0122】
【表4】
【0123】
MSの臨床形態は、各共役体によって、それぞれ固有の方法で識別される。
・抗NO2−Tyr抗体は、進行性形態及び弛張進行性形態を識別するために特に適切である(マン・ホイットニー、(上記2試料間のp)=0.0167)。
・進行性MSについては低い値が目立つ。
・抗NO−Trp抗体は、進行性形態及び弛張性形態を識別するための良好な指標である(マン・ホイットニー、p<0.0001)。
・抗Ach抗体は、弛張性形態を他の2つの形態から識別するために適切である(マン・ホイットニー、p<0.0001)。
・抗A−イソタイプIg16抗体は、進行性形態及び弛張性形態を識別するために適切である(マン・ホイットニー、p<0.01)。
上記循環抗体は、MSの形態及び1つの進行性形態から別の形態(弛張性形態/進行性形態)へ経過する上記全経路の識別を可能にする。この進行は、他の一般的な臨床又は調査のアプローチを用いても識別することができない。
【実施例2】
【0124】
<ALSにおける循環抗体の定量>
図2〜4は、ALSの3クラスを明示している。
・試験した血清の39%(全118検体中)により構成されるクラス1は、以下の抗原の値が高いことが特徴である:FarCys、Ig3、Ig5、Ig16、Ig12、Ig13、及び、これらより低い値でIg17(これら全てのIgについて検出された抗体はA−イソタイプである)。図2参照。
・試験した血清の34%により構成されるクラス2は、上記全21種の抗原の値が低い(これらのうち19種については平均値が0よりも小さい)ことが特徴である。FarCys及びPIのみがコントロールと同じ程度の値に達している。図3参照。
・試験した血清の27%により構成されるクラス3は、値が高く、特に以下の値が高いことが特徴である:Ole、Aze、MDA、PI、NOCys、Ig3、Ig16、Ig12、Ig13、Ig17(これら全てのIgについて検出された抗体はM−イソタイプである)、及び、これらより低い値でIg5(このIgについて検出された抗体はA−イソタイプである)。図4参照。
【0125】
上記生物学的特徴は、進行型の様々なALSに帰属するべきものである。
【0126】
更に、試験した患者の80%は、疾患が臨床的に進行する間、発症時と同じ群に属している。
【実施例3】
【0127】
<RAにおける循環抗体の定量>
RA(全ステージ及び全経過)において、多くの抗体は、以下の表3に示すように、脂肪酸、アゼライン酸、ファルネシルシステイン、マロンジアルデヒド、ホスファチジルイノシトール、NO−システイン、NO−フェニルアラニン、並びに、免疫グロブリンIg3(A−イソタイプ及びM−イソタイプ抗体)、Ig5(A−イソタイプ及びM−イソタイプ抗体)、Ig12(A−イソタイプ及びM−イソタイプ抗体)、Ig13(M−イソタイプ抗体)、Ig17(M−イソタイプ抗体)及びIg19(A−イソタイプ抗体)に対する抗体である。
【0128】
【表5】
【0129】
これより、循環M−イソタイプ抗体の力価を調べることによって、RAに起因する対象となる害の管理を補助できるということが分かる。
【0130】
参照
・AMARA A.,CHAUGIER C.,GEFFARD M.「HIV−1に感染している患者の血清における共役脂肪酸に対する自己抗体(Autoantibodies directed against conjugated fatty acids in sera of HIV−1 infected patients.)」AIDS,(1994a)8,711−713.
・AMARA A.,CHAUGIER C.,RAGNAUD J.−M.,GEFFARD M.「HIV−1に感染している患者の血清における共役脂肪酸に対する循環自己抗体(Circulating autoantibodies directed against conjugated fatty acids in sera of HIV−1 infected patients.)」Clinical and Experimental Immunology,(1994b)96,379−383.
・AMARA A.,CONSTANS J.,CHAUGIER C.,SEBBAN A.,DUBOURG L.,PEUCHANT E.,PELLEGRIN J.L.,LENG B.,CONRI C.,GEFFARD M.「結合組織疾患及び血管炎におけるマロンジアルデヒド変性エピトープに対する自己抗体(Autoantibodies to malondialdehyde−modified epitope in connective tissue diseases and vasculitides.)」Clinical and Exp.Immunol.,(1995)101,1−6.
・BOULLERNE A.,PETRY K.G.,MEYNARD M.,GEFFARD M.「共役S−ニトロソシステインに対する循環抗体の特徴付けによる、多発性硬化症におけるNOの関与についての間接的証拠(Indirect evidence for NO involvement in multiple sclerosis by characterization of circulating antibodies directed against conjugated S−nitrosocysteine.)」J.of Neuroimmunol.,(1995)60,117−124.
・BOULLERNE A.I.,PETRY K.G.,GEFFARD M.「多発性硬化症の患者の血清における共役脂肪酸に対する循環抗体(Circulating antibodies directed against conjugated fatty acids in sera of patients with multiple sclerosis.)」J.of Neuroimmunol.,(1996)65,75−81.
・BROCHET B.,FAIDERBE S.,AUDHUY S.,GOSSET I.,GEFFARD M.,ORGOGOZO J.M.「多発性硬化症におけるホスファチジルイノシトールに対する自己抗体 多発性硬化症における現在の概念−ECTRIMS第6回大会議事録(Antibodies against phosphatidylinositol in multiple sclerosis. Current Concepts in Multiple Sclerosis−proceedings of the 6th congress of the ECTRIMS.(Wietholter M.,Dichgans J.))」MERTIN J.,Eds Excerpta Medica,Amsterdam,(1991)97−102.
・CONSTANS J.,CONRI C.,PELLEGRIN J.L.,SERGEANT C.,SIMONOFF M.,PEUCHANT E.,DUBOURG L.,THOMAS M.J.,PELLEGRIN I.,BROSSARD G.,BARBEAU P.,AMARA A.,GEFFARD M.,CLERC M.,FLEURY H.,LENG B.「酸化的ストレスとHIV感染:特定されるべき概念と検討するべき治療方法(Stress oxydatif and infection a VIH:unconcept a preciser and une voie therapeutique a explorer(<Oxidative stress and infection with HIV:a concept to be specified and a therapeutic route to be explored>).Annales de Medecine Interne,(1995)146,514−520.
・DAVERAT P.,GEFFARD M.,ORGOGOZO J.M.「多発性硬化症における抗共役アゼライン酸抗体の同定と特徴付け(Identification and characterization of anti−conjugated azelaic acid antibodies in multiple sclerosis.)」J.of Neuroimmunology,(1989),22,129−134.
・FAIDERBE S.,CHAGNAUD J.L.,WAFFLART J.,GEFFARD M.「悪性腫瘍を持つ病気対象の血清における膜リン脂質に対する自己抗体(Autoanticorps diriges contre un phospholipide membranaire dans les serums de malades porteurs de tumeurs malignes.(<Auto−antibodies directed against a membrane phospholipid in the sera of ill subjects having malignant tumours>))」CRAS,(1990)310,49−52.
・GEFFARD M.,BODET D.,CLAUDEPIERRE P.,METZGER J.M.,SIBILIA J.「神経疾患及びリウマチ疾患におけるNO変性抗原に対する循環血清抗体(Anticorps seriques circulants diriges contre des antigenes modifies par le NO dans les affections neurologiques and rhumatismales.(<Circulating serum antibodies directed against antigens modified by NO in neurological and rheumatic disease>))」,Immunoanal.Biol.Spec.,(1998)13,209−217.
・MANETA−PEYRET L.,DAVERAT P.,GEFFARD M.,CASSGANE C.,ORGOGOZO J.M.「多発性硬化症における天然絹抗脂肪酸抗体(Natural seric anti−fatty acid antibodies in multiple sclerosis.)」Neurosc.Letters,(1987)80,235−239.
・SOUAN M.L.,GEFFARD M.,LEBRUN−GRANDIE P.,ORGOGOZO J.M.「筋無力症患者における抗アセチルコリン抗体の検出(Detection of anti−acetylcholine antibodies in myasthenic patients.)」Neurosc.Letters.(1986)64,23−28.
【図面の簡単な説明】
【0131】
【図1】MSの各形態及びコントロールのデータの分布を示す。
【図2】ALSクラス1について示す。
【図3】ALSクラス2について示す。
【図4】ALSクラス3について示す。
Claims (15)
- 生体液中の神経変性疾患の発症又は進行に関与する抗体の検出方法であって、以下の段階、
−前記生体液を以下の抗原のいずれか1つ:Pal、Ole、Myr、PI、MAD、Ach、FarCys、Aze、NO−Cys、NO−Tyr、NO−Trp、NO−His、NO2−Tyr、NO−Phe、NO−Arg、NO−Asn、NO−Met、NO−Cr、NO−BSA、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17及びIg19:に接触させる段階、及び
−前記抗原とそれに対応する抗体の間に任意に形成される複合体を検出する段階
を含む方法。 - 生体液中の神経変性疾患の発症又は進行に関与する抗体の検出方法であって、以下の段階、
−前記生体液を以下の抗原のいずれか1つ:PI、Ach、Aze、NO−Cys、NO−Tyr、NO−Trp、NO2−Tyr、NO−Asn、NO−Met、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17及びIg19:に接触させる段階、及び
−前記抗原とそれに対応する抗体の間に任意に形成される複合体を検出する段階
を含む方法。 - 生体液中の神経変性疾患の発症又は進行に関与する抗体の検出方法であって、以下の段階、
−前記生体液を以下の抗原のいずれか1つ:Ole、PI、MAD、Aze、NO−Cys、FarCys、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16及びIg17:に接触させる段階、及び
−前記抗原とそれに対応する抗体の間に任意に形成される複合体を検出する段階
を含む方法。 - 生体液中の神経変性疾患の発症又は進行に関与する抗体の検出方法であって、以下の段階、
−前記生体液を以下の抗原のいずれか1つ:Pal、Ole、Myr、PI、MAD、FarCys、Aze、NO−Cys、NO−Phe、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig17及びIg19:に接触させる段階、及び
−前記抗原とそれに対応する抗体の間に任意に形成される複合体を検出する段階
を含む方法。 - NO−BSAを除く非細菌性抗原は担体分子、好ましくはウシ血清アルブミンに結合している請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 任意に形成される複合体がM−イソタイプ、又は、必要であればA−イソタイプの抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いて検出され、前記抗体は標識、好ましくは酵素標識されたものである請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素はペルオキシダーゼである請求項6に記載の方法。
- 固形の担体、好ましくは微量滴定プレートを用いて行う請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記神経変性疾患が多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、関節リウマチ、又は脊椎関節炎である請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を実行するためのキットであって、以下の抗原のいずれか1つ:Pal、Ole、Myr、PI、MAD、Ach、FarCys、Aze、NO−Cys、NO−Tyr、NO−Trp、NO−His、NO2−Tyr、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17及びIg19を含むキット。
- 請求項2に記載の方法を実行するためのキットであって、以下の抗原のいずれか1つ:PI、Ach、Aze、NO−Cys、NO−Tyr、NO−Trp、NO2−Tyr、NO−Asn、NO−Met、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16、Ig17及びIg19を含むキット。
- 請求項3に記載の方法を実行するためのキットであって、以下の抗原のいずれか1つ:Ole、PI、MAD、Aze、NO−Cys、FarCys、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig16及びIg17を含むキット。
- 請求項4に記載の方法を実行するためのキットであって、以下の抗原のいずれか1つ:Pal、Ole、Myr、PI、MAD、FarCys、Aze、NO−Cys、NO−Phe、Ig3、Ig5、Ig12、Ig13、Ig17及びIg19を含むキット。
- NO−BSAを除く非細菌性抗原は担体分子、好ましくはウシ血清アルブミンに結合している請求項10〜13のいずれか1項に記載のキット。
- M−イソタイプの抗ヒト免疫グロブリン抗体を少なくとも1種、及び/又は、A−イソタイプの抗ヒト免疫グロブリン抗体を少なくとも1種更に含む請求項10〜14のいずれか1項に記載のキット。
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