JP4388886B2 - アルツハイマー病の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、メタロチオネイン−３（以下、ＭＴ−３と称する）を分析する、アルツハイマー病の検出方法に関する。本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。

高齢化社会の中で、アルツハイマー病をはじめとする老人性痴呆は大きな関心を集めている。特にアルツハイマー病は進行性の痴呆症でありながら、確実な治療法が見いだされておらず、治療薬開発に多くの努力が払われている。開発段階の治療薬の有効性を検定するためには、適切なアルツハイマー病の診断が必要であるのみならず、痴呆の進行程度を診断するためのバイオマーカーが必要である。しかし、現在のところ、確実な診断のためには複数のバイオマーカー（例えば、脳脊髄液中のβアミロイド、タウ、又はリン酸化タウ）の組み合わせが必要であり、また、痴呆の進行程度を反映するバイオマーカーは見いだされていないため、さらなるバイオマーカーの確立が要望されている。

一方、メタロチオネイン−３は、アルツハイマー病患者の脳中成分を研究する過程で見出されたタンパク質（特許文献１，２）であり、アルツハイマー病（非特許文献１，２）、筋萎縮性側索硬化症（非特許文献３）、又はクロイツフェルト・ヤコブ病（非特許文献４）の病変部位で減少し、減少の程度は病気の進行に伴い大きくなることが明らかとなっている。

特許第２８１５４６１号明細書 特許第２９０４９３５号明細書 「ニューロン（Neuron）」，（米国），1991年，7巻，337-347頁 ケー・ティー・鈴木ら（K. T. Suzuki et al.）編，ワイ・内田（Y. Uchida）著，「メタロチオネインIII（Metallothionein III）」，（スイス），ビルクハウザー・フェアラーク・バーゼル（Birkhauser Verlag Basel），1993年，315-328 「ジャーナル・オブ・ヘルス・サイエンス（Journal of Health Science）」，（日本），2004年，50巻，323-331頁 「ディメンシア・アンド・ジェリアトリック・コグナティブ・ディスオーダーズ（Dementia and Geriatric Cognitive Disorders）」，（スイス），2000年，11巻，251-262頁

本発明者は、アルツハイマー病の検出に有用な指標となるバイオマーカーを鋭意探索したところ、患者脳の病変部位で減少することが知られていたＭＴ−３が、意外にも、脳脊髄液中では逆に健常者よりも高値を示すことを見出した。また、ＭＴ−３は、公知のバイオマーカーであるβアミロイド、タウ、又はリン酸化タウよりも特異性の高いバイオマーカーとなることも見出し、本発明を完成させた。
本発明の課題は、アルツハイマー病の新規の検出方法及び検出用キットを提供することにある。

前記課題は、本発明による、体液中のメタロチオネイン−３（ＭＴ−３）を分析することを特徴とする、アルツハイマー病の検出方法により解決することができる。
また、本発明は、ＭＴ−３に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、アルツハイマー病の検出用キットに関する。

本発明によるアルツハイマー病の検出方法又は検出用キットによれば、公知のバイオマーカーと比較して、より正確にアルツハイマー病を検出することができる。

［１］アルツハイマー病の検出方法
本発明の検出方法では、ＭＴ−３を分析することにより、アルツハイマー病を検出する。
ＭＴ−３は、メタロチオネイン−１（ＭＴ−１）又はメタロチオネイン−２（ＭＴ−２）と類似したアミノ酸配列を有する、分子量約７０００の含金属タンパク質である。ＭＴ−３は、健常者の脳中に存在するが、アルツハイマー病患者の脳では減少するタンパク質であって、神経栄養活性抑制作用を有するタンパク質であり、成長抑制因子（Growth Inhibitory Factor；ＧＩＦ）とも称される。ＭＴ−３は、哺乳動物を含む種々の生物に存在し、例えば、ヒトＭＴ−３として、６８個のアミノ酸残基からなるペプチドが公知である（特許第２９０４９３５号明細書）。本発明の検出方法は、ヒトを始めとする種々の生物に適用することができるが、例えば、ヒトに適用する場合には、ＭＴ−３として、特許第２９０４９３５号明細書に記載のヒトＭＴ−３を分析対象とすることができる。

本発明における検出対象であるアルツハイマー病は、老人斑、神経原線維変性化などの病理学的特徴と、進行性痴呆という臨床的特徴とを有する基質性疾患である。アルツハイマー病の原因は不明であるが、シナプスや神経細胞の変性が痴呆発症に関与していると考えられる。

本発明の検出方法において、ＭＴ−３を分析する方法としては、ＭＴ−３量を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＭＴ−３の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、抗ＭＴ−３抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、又はウエスタンブロット等）、生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）、又はｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる。

ＭＴ−３分析方法として免疫学的手法を用いる場合には、抗ＭＴ−３抗体又はその断片は、周知の抗体調製方法に従って調製することができ、各種免疫学的測定も、前記抗ＭＴ−３抗体又はその断片を用いること以外は、それぞれ、周知方法に従って実施することができる。
また、酵素学的測定法を用いる場合には、例えば、特許第２８１５４６１号に記載の方法に従って、ＭＴ−３の神経栄養活性抑制活性を測定することにより、ＭＴ−３の量又は存在の有無を分析することができる。

本発明において、ＭＴ−３の分析に用いる被検試料としては、ＭＴ−３を含有する可能性のある体液である限り、特に限定されるものではなく、例えば、脳脊髄液を挙げることができる。

本発明の検出方法では、ＭＴ−３の存在の有無、あるいは、ＭＴ−３量を測定することにより、アルツハイマー病を検出することができる。
例えば、被検試料として脳脊髄液を用いる場合、アルツハイマー病の疑いのある患者から脳脊髄液を採取し、脳脊髄液中のＭＴ−３量を測定し、健常者から採取した脳脊髄液中のＭＴ−３量と比較することにより、前記患者がアルツハイマー病であるか否かを判定することができる。なお、前記健常者は、アルツハイマー病でない者であれば、特に限定されるものではないが、好ましくは非痴呆老齢者である。

より具体的には、健常者のＭＴ−３量と比べて、前記患者のＭＴ−３量が有意に多い場合に、前記患者はアルツハイマー病であると判定することができる。一方、健常者のＭＴ−３量と前記患者のＭＴ−３量との間に有意な差がない場合、前記患者はアルツハイマー病でないと判定することができる。
ここで、健常者のＭＴ−３量は、前記患者と同時に測定することもできるし、あるいは、予め健常者群の平均値及び／又は正常濃度範囲として決定しておくこともできる。好ましくは、予め健常者群におけるＭＴ−３の平均値及び正常濃度範囲から閾値を設定し、前記患者のＭＴ−３量が前記閾値を超えた場合、前記患者はアルツハイマー病であると判定することができる。一方、前記患者のＭＴ−３量が前記閾値を超えない場合、前記患者はアルツハイマー病でないと判定することができる。

なお、アルツハイマー病と健常者との間の閾値は、種々の条件、例えば、判定対象であるアルツハイマー病の種類、患者の状態（例えば、性別、年齢、又はアルツハイマー病以外の病気の有無若しくは状態）、又は被検試料の種類などに応じて異なるため、一概には規定することはできないが、当業者であれば、例えば、後述の実施例１の手順に従って、適宜決定することができる。

［２］アルツハイマー病の検出用キット
本発明の検出用キットは、ＭＴ−３に特異的に結合する抗体又はその断片を含む。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、ＭＴ−３への特異的結合能を保持する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖを用いることができる。

本発明の検出用キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態で、抗ＭＴ−３抗体又はその断片を含むことができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として^３Ｈ、^１４Ｃ、又は^１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。

また、ラテックス凝集免疫測定法の場合には、抗体を担持させる固相担体としては、例えば、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、赤血球、シリカ、スチレン−ブタジエン共重合体、アルミナ、又はセラミックス等の粒子を用いることができる。中でもラテックス粒子が好ましく用いられ、例えば、ポリスチレンラテックス、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とスチレンの共重合体、スチレンとマレイン酸の共重合体、スチレンとメタクリル酸の共重合体、スチレンとアクリル酸とアルキルアクリレートなどの共重合体、又は酢酸ビニルとアクリル酸の共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては、０．１〜１．０μｍ程度が好ましい。これらの担体粒子に、物理的吸着法又は化学結合法等を利用して抗ＭＴ−３抗体を担持させることができる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：アルツハイマー病患者脳脊髄液中のＭＴ−３濃度の定量》
本実施例では、アルツハイマー病患者（９例）、非痴呆老齢患者（１０例）、及び進行性核上性麻痺患者（１例）から採取した脳脊髄液について、２種類の抗体を用いるツーサイト（two site）ＥＬＩＳＡ法により、ＭＴ−３濃度を定量した。

具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、抗ＭＴ−３モノクローナル抗体Ａ９Ｃ２溶液（マウス由来、１／１０００希釈）１００μＬを添加し、４℃で一晩静置することにより固相化した。なお、前記モノクローナル抗体Ａ９Ｃ２は、ヒトＭＴ−３を免疫原として取得した候補ハイブリドーマを、ＭＴ−１〜ＭＴ−３に対する反応性（ＭＴ−３と反応するが、ＭＴ−１及びＭＴ−２と反応しない）を指標としてスクリーニングすることにより取得したハイブリドーマＡ９Ｃ２（Brain Res., 741, 197-204, 1996）から分泌されるモノクローナル抗体である。

抗体溶液を除去した後、ブロッキング液（Block Ace；大日本製薬社）１００μＬを加え、室温で３０分間静置した。ブロッキング液を除去し、洗浄した後、既知濃度（７８ｐｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ）のヒトＭＴ−３溶液又は脳脊髄液サンプル１００μＬを添加し、４℃で一晩反応させた。ウェル内溶液を除去し、洗浄した後、抗ＭＴ−３ポリクローナル抗体溶液［ウサギ由来、第５３〜６４番目のアミノ酸残基（配列番号１）からなるヒトＭＴ−３断片に反応、１／１０００希釈）１００μＬを添加し、３７℃で３時間反応させた。なお、前記抗ＭＴ−３ポリクローナル抗体は、第５３〜６４番目のアミノ酸残基からなるヒトＭＴ−３断片を免疫原として得られた抗体である（Neuron, 7, 337-347, 1991）。

抗体溶液を除去し、洗浄した後、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体溶液（Vector社、１／２００希釈）１００μＬを添加し、室温で３０分間反応させた。溶液を除去し、洗浄した後、アビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体溶液（Roche社；１／６０００希釈）１００μＬを添加し、室温で３０分間反応させた。溶液を除去し、洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質であるＡＢＴＳ［2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)］溶液１００μＬを加え、５分間発色させた後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

得られたヒトＭＴ−３の検量線を図１に、前記検量線から算出した各患者における脳脊髄液中ＭＴ−３濃度を図２に、それぞれ示す。
図１から明らかなように、このツーサイトＥＬＩＳＡでは、７８〜２５００ｐｇ／ｍＬの濃度範囲でＭＴ−３濃度を定量可能であることが判明した。

また、図２に示すように、アルツハイマー病患者（ＡＤ）の脳脊髄液中のＭＴ−３濃度は、非痴呆老齢患者（ＣＮＴ）又は進行性核上性麻痺患者（ＰＳＰ）の脳脊髄液中のＭＴ−３濃度と比べて高値を示した。また、アルツハイマー患者と非痴呆老齢患者との間のオーバーラップも、公知のアルツハイマー病診断マーカーであるタウやリン酸化タウに比べはるかに少ないことがわかった。例えば、Neuroscience Letters, 270, 91-94, 1999には、タウ値に関して、ＡＤ患者と非ＡＤ者の約半数がオーバーラップしていること、リン酸化タウ（ＰＴ２３１ＰＳ２３５；^２３１Ｔ及び^２３５Ｓがリン酸化）値に関して、ＡＤ患者の約半数が非ＡＤ者と同様に検出下限以下になっていること、リン酸化タウ（ＰＳ１９９；^１９９Ｓがリン酸化）値に関して、非ＡＤ者の約１／４がＡＤ患者とオーバーラップしていることが開示されている。

本発明の検出方法及び検出用キット並びに免疫学的分析方法及び分析用キットは、アルツハイマー病の検出の用途に適用することができる。

ヒトＭＴ−３濃度と吸光強度との関係を示すグラフである。 各患者における脳脊髄液中ＭＴ−３濃度の示すグラフである。

Claims (2)

1. 脳脊髄液中のメタロチオネイン−３を分析し、健常者と比較して、ＭＴ−３の量が有意に多い場合にアルツハイマー病であると判定することを特徴とする、アルツハイマー病の検出方法。
2. 請求項１に記載の検出方法に用いるアルツハイマー病の検出用キットであって、メタロチオネイン−３に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、アルツハイマー病の検出用キット。

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