JP6430413B2 - アルツハイマー病の診断のための方法と組成物 - Google Patents
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Description
アルツハイマー病（ＡＤ）は、現在のところ進行性認知障害、および重症の認知症を引き起こす記憶の喪失によって特定される慢性神経変性疾患である。ＡＤは典型的には年配者の疾患であり、６５歳を超える人物において最も一般的である。ＡＤは年配者の中で、且つ、平均余命がますます長くなっているなかでの認知症の主因であり、その集団における有病率はまさに増加し始めたところである。ＡＤは通常は命に係わるものではない。しかしながらその疾患が重症の認知症に進行するにつれて患者は自分自身の世話をすることができなくなり、通常は全時間の専門の介護を必要とする。
ＡＤの治療法は現在のところ分かっていないが、その疾患の進行を遅らせることができる処置が存在する。したがって、ＡＤを有する患者を特定することができ、処置に対するそれらの患者の応答をモニターすることができる可能がある方法は非常に貴重なアッセイ（臨床医にとってのツール）であろう。
ＡＤの診断の現行の方法は精神状態評価（ＭＭＳＥなど）、ＣＴ／ＭＲＩ、ＡＤと関連することが当技術分野において知られている特定のタウまたはβ‐アミロイドのアイソフォームについての脳脊髄液の測定、またはアポリポプロテインＥ４（ＡｐｏＥ４異型体）などの遺伝的リスク因子の遺伝子型判定を伴う。臨床的に検証されたＡＤの血液バイオマーカーは現在のところ存在しない。これらの方法の欠陥は特異度の欠如を含む場合があり、それらの欠陥は解釈に間違いを起こしやすい場合があり、且つ、非常に侵襲的である場合がある。概して、事後的にしか正しい診断を行うことができない。ＡＤについての能動的診断を支援するための日常的に使用されるバイオマーカー方法は現在のところ存在しない。
ＡＤの発病は充分に理解されていないが、患者の病理学的検討により（タウタンパク質の蓄積が原因の）神経原線維濃縮体とβ‐アミロイドプラークの存在が明らかにされている。広範囲に及ぶニューロンとシナプスの欠損も存在し、その欠損が認知機能と記憶機能の低下の根底にあると考えられている。プラークの形成が神経変性の原因であることが示されている。しかしながら、プラーク形成の原因は不明である。これらのタンパク質の特定のアイソフォームを特定する診断検査が診断アッセイの開発の主要な焦点とされている。しかしながら、これらのタンパク質の存在はその疾患が治療的に生存可能なステージを越えて進行してしまったことを表す場合もあり、したがって早期リスクマーカーがより有益であり得る。
血液バイオマーカーを使用してＡＤを診断するための方法について記載している幾つかの発明が存在しており、これらには欧州特許出願公開第２２９３０７５（Ａ２）号明細書および国際公開第２０１１／１４３５９７（Ａ１）号パンフレットが含まれる。欧州特許出願公開第２２９３０７５号明細書は２Ｄゲル電気泳動を用いて血小板で発現している幾つかのマーカーを特定しており、それらのマーカーはＡＤ患者と対照患者の間で差次的に発現した。これらのマーカーにはＡＤに対する遺伝的感受性に対応する可能性があるタンパク質の異型体が含まれた。これらの発明者（欧州特許出願公開第２５０７６３８号明細書）によって、アルゴリズムの中でタンパク質バイオマーカーが診断モデルを改善するために遺伝子型判定と共に組み合わされるさらなる発明が記載された。このアルゴリズムではＡｐｏＥ４陽性である患者は、ＡｐｏＥ４陰性であるが２コピーの野生型グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ１オメガ（ｗｔＧＳＴＯ）遺伝子を発現する患者のようにＡＤを有する可能性が高かった。この以前の発明の背景ではｗｔＧＳＴＯはｒｓ４８２５突然変異（残基１４０においてアラニンの代わりにアスパラギン酸をコードする［Ａ１４０Ｄ］
）を含まないあらゆるＧＳＴＯ遺伝子として定義された。この発明は血液ベースのバイオマーカーと疾患の診断を補助する遺伝子型判定の組合せの有効性を強調している。国際公開第２０１１／１４３５９７（Ａ１）号パンフレットによって、ＡＤ患者と対照患者の血清の間で差次的に発現する複数のバイオマーカーが多重化アッセイを使用して特定された。この発明では、分類アルゴリズムを開発するためにランダムフォレストを用いて臨床的測定および人口統計学的変数と組み合わせてバイオマーカーの複数の組合せを使用すると、より高い診断の真度が観察される。しかしながら、これらの方法には臨床的有用性が見出されておらず、ＡＤの診断を支援するために日常的に使用され得る方法の緊急の必要性が存在する。
）を含まないあらゆるＧＳＴＯ遺伝子として定義された。この発明は血液ベースのバイオマーカーと疾患の診断を補助する遺伝子型判定の組合せの有効性を強調している。国際公開第２０１１／１４３５９７（Ａ１）号パンフレットによって、ＡＤ患者と対照患者の血清の間で差次的に発現する複数のバイオマーカーが多重化アッセイを使用して特定された。この発明では、分類アルゴリズムを開発するためにランダムフォレストを用いて臨床的測定および人口統計学的変数と組み合わせてバイオマーカーの複数の組合せを使用すると、より高い診断の真度が観察される。しかしながら、これらの方法には臨床的有用性が見出されておらず、ＡＤの診断を支援するために日常的に使用され得る方法の緊急の必要性が存在する。
本発明はアルツハイマー病の診断のための方法と組成物に関する。
本発明は標準状態における発現と比べてアルツハイマー病状態において差次的に発現するタンパク質を特定し、且つ、説明する。
本発明の第一の態様によれば、対象においてアルツハイマー病を診断する方法であって、その対象から採取された試料の中に表１より選択される２つ以上の差次的に発現するタンパク質を検出することを含み、これらのタンパク質のうちの１つがアファミンである前記方法が提供される。より具体的には、対象から採取された試料の中のアファミンのレベルとα１‐アンチキモトリプシン、α２‐マクログロブリン、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、セリントレオニンキナーゼＴＢＫ‐１、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲンまたは補体Ｃ５のうちのいずれかのレベルを検出することを含む方法。その試料は血清または血漿であることが好ましい。
本発明のさらなる態様によれば、ＡＤを発症する恐れがある患者、またはＡＤを有する患者とＡＤのリスクが無い患者、またはＡＤを有しない患者を区別する能力を上昇させるために、前記の差次的に発現するタンパク質の相対レベルが対象のＡｐｏＥまたはＧＳＴＯ１の遺伝子型または表現型と併せて使用される。
本発明のさらなる態様によれば、対象から採取された試料の中に表１より選択される差次的に発現するタンパク質を検出する方法であって、そのタンパク質の特異的プローブが器具の表面に結合している前記方法が提供される。試料中のこれらのタンパク質のそれぞれのレベルは、ビオチン化トレーサー物質と競合するそれらのタンパク質の能力に基づいて算出される。そのトレーサー物質は、含まれるタンパク質がビオチンと複合体化されている修飾型血漿である。
本発明のさらなる態様によれば、対象がアルツハイマー病を患っている、またはアルツハイマー病を発症する恐れがあると明確にされ得る可能性を予測するための方法であって、統計学的モデリングまたは機械学習方法を用いる分類別予測モデルの開発を介した前記方法。そのような方法にはパーセプションニューラルネットワーク、サポートベクターマシン、ロジスティック回帰、決定木およびランダムフォレストが含まれ得るが、これらに限定されない。
本発明はアルツハイマー病（ＡＤ）の診断を補助するバイオマーカーベースの方法について記載する。具体的には、アルツハイマー病を有することが疑われる患者、またはアルツハイマー病を発症する恐れがある患者から採取された液体試料内のバイオマーカーの相対レベルまたは濃度の測定が測定される。本発明の背景ではＡＤの診断に対する有用性が例として使用されている。しかしながら、ＡＤの進行のモニタリング、ならびに他の形態の認知症および認知障害の診断およびモニタリングにも本発明を用いてよいことが考えられる。これらの他の形態の認知症および認知障害にはパーキンソン認知症、レビー小体型認知症、血管性認知症、軽度認知障害、前頭側頭型認知症が含まれるが、これらに限定されない。「バイオマーカー」という用語は本発明の背景では患者の生体試料中に存在する分子を指し、前記生体液中の分子のレベルがアルツハイマー病を示す場合があり得る。そのような分子にはペプチド／タンパク質または核酸およびそれらの派生物が含まれ得る。「相対レベル」という用語は本発明の背景では、所与の生体試料中のバイオマーカーのレベルを既知の濃度（この濃度はゼロであり得る）のバイオマーカーまたはレベルを有する基準物質と比較することにより生じる生物学的アッセイ由来の光強度または吸光度の示数（しかしながら本発明はこれらの技術を用いる測定に限定されず、当業者は測定値を決定するために可視光部の特性の測定を活用しない生体分子測定のための他の方法を理解する）を指し、その生物学的アッセイによって生体試料内のバイオマーカーが前記バイオマーカーを含むことが知られている基準物質と直接的に競合して前記バイオマーカーへの特異的プローブに結合し、後者の方法がそのバイオマーカーの濃度に逆相関するレベルを生成する。「プローブ」という用語は本発明の背景ではバイオマーカーのある領域に特異的に結合する合成分子または生体分子を指す。「アルツハイマー病を発症する恐れがある」という用語は本発明の背景では、早期臨床徴候、例えば、当技術分野において知られている方法（ＭＭＳＥなど）によって判定される軽度認知障害（ＭＣＩ）または血管性認知症を示し、アルツハイマー病の家族歴を有し、アルツハイマー病の遺伝的有病率を有し、また
は生活習慣（例えば、年齢、食事、一般健康状態、職業、地理的位置）のために「リスクがある」と分類される患者を指す。「遺伝的有病率」という用語は本発明の背景ではＡＤを発症する患者において変化することが当技術分野において知られているある特定のタンパク質の特定の遺伝子型を含むことを意味する場合があり得、そのようなタンパク質にはアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）およびグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼオメガ１（ＧＳＴＯ）が含まれるが、これらに限定されない。これは遺伝子型判定、またはその患者の生体液中にその疾患に関連の型の発現タンパク質を特定することにより判定され得る。より具体的には、ＡｐｏＥ４異型体および野生型ＧＳＴＯ（ｗｔＧＳＴＯ）異型体をコードするアレルの数が測定されるものとする。ｗｔＧＳＴＯという用語は本発明の背景ではゲノム配列中にｒｓ４８２５突然変異を含まない、またはタンパク質配列の残基１４０においてアラニンからアスパラギン酸への置換を含まないＧＳＴＯのあらゆる異型体を指す。本発明は単独で、または他の診断方法と組み合わせてＡＤの診断に使用される、または相補的バイオマーカーとしてＡＤの診断に使用される様々なバイオマーカーを記載する。本背景における相補的バイオマーカーはＡＤ用に他のバイオマーカーと併せて使用され得るバイオマーカーを意味する。
は生活習慣（例えば、年齢、食事、一般健康状態、職業、地理的位置）のために「リスクがある」と分類される患者を指す。「遺伝的有病率」という用語は本発明の背景ではＡＤを発症する患者において変化することが当技術分野において知られているある特定のタンパク質の特定の遺伝子型を含むことを意味する場合があり得、そのようなタンパク質にはアポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）およびグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼオメガ１（ＧＳＴＯ）が含まれるが、これらに限定されない。これは遺伝子型判定、またはその患者の生体液中にその疾患に関連の型の発現タンパク質を特定することにより判定され得る。より具体的には、ＡｐｏＥ４異型体および野生型ＧＳＴＯ（ｗｔＧＳＴＯ）異型体をコードするアレルの数が測定されるものとする。ｗｔＧＳＴＯという用語は本発明の背景ではゲノム配列中にｒｓ４８２５突然変異を含まない、またはタンパク質配列の残基１４０においてアラニンからアスパラギン酸への置換を含まないＧＳＴＯのあらゆる異型体を指す。本発明は単独で、または他の診断方法と組み合わせてＡＤの診断に使用される、または相補的バイオマーカーとしてＡＤの診断に使用される様々なバイオマーカーを記載する。本背景における相補的バイオマーカーはＡＤ用に他のバイオマーカーと併せて使用され得るバイオマーカーを意味する。
本発明の第一の態様は、ＡＤを有することが疑われる患者、ＡＤを発症する恐れがある患者、またはＡＤを有する患者においてＡＤを診断するための方法であって、その患者からインビトロ試料を採取すること、アファミンと表１より選択される１つ以上のバイオマーカーの相対レベルまたは濃度を決定すること、およびアファミンと１つ以上のバイオマーカーのその相対レベルまたは濃度の有意性を確定することを含む前記方法を説明する。その相対レベルまたは濃度の有意性は、特異的バイオマーカーについて対照値に対して前記相対レベルまたは濃度を比較することにより評価される。その対照値は、臨床評価により判定されたＡＤを有しない固体から採取した生体資料中の前記バイオマーカーの相対レベルまたは濃度の決定により求められる。アファミンについて、ＡＤを有する患者における相対レベルまたは濃度が対照値と比較して減少する。本発明の好ましい実施形態は、アファミンとα１‐アンチキモトリプシン、α２‐マクログロブリン、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、セリントレオニンキナーゼＴＡＮＫ結合キナーゼ‐１（ＴＢＫ１）、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲンまたは補体Ｃ５から選択される少なくとも１つの他のバイオマーカーの組合せを用いる方法を活用する。本発明のさらに好ましい実施形態は、アファミンの相対レベルまたは濃度をα１‐アンチキモトリプシンの相対レベルまたは濃度で除算してアファミン／α１‐アンチキモトリプシンの比率を生成する方法を用いる。「比率」という用語は本発明の本実施形態の背景では一方のバイオマーカーの値の他方による除算に関連し、この値は両方のバイオマーカーについて同一であるべきであり、且つ、所与の体積中のバイオマーカーの重量またはモル数（濃度）として、またはアッセイにより生成される光強度または吸光レベル（相対レベル）により表され得る。本発明の追加の実施形態は、α１‐アンチキモトリプシン、α２‐マクログロブリン、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、セリントレオニンキナーゼＴＢＫ‐１、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲンまたは補体Ｃ５から選択される１つ以上のバイオマーカーの相対レベルまたは濃度と組み合わせてアファミン／α１‐アンチキモトリプシンの比率の値を活用する。例えば、本発明の好ましい組合せは補体Ｃ３の相対レベルまたは濃度と組み合わせたアファミン／α１‐アンチキモトリプシンの比率である。本発明の別の好ましい組合せはセリントレオニンキナーゼＴＢＫ‐１の相対レベルまたは濃度と組み合わせたアファミン／α１‐アンチキモトリプシンの比率である。
本発明の追加の態様は、ＡＤの相補的バイオマーカーとしてのアファミン、α１‐アンチキモトリプシン、α２‐マクログロブリン、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、セリントレオニンキナーゼＴＢＫ‐１、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲンまたは補体Ｃ５のうちの１つ以上の使用に関する。相補的バイオマーカーとしてそれらは精神状態評価（ＭＭＳＥ）、神経学的画像法、β‐アミロイドペプチド、リン酸化タウ、ＡｐｏＥ遺伝子型、および野生型ＧＳＴＯ１遺伝子型（ｗｔＧＳＴＯ）などの他の臨床的証拠と併せてＡＤ診断に使用され得る。本発明の背景ではこの臨床的証拠は出力測定値に基づいて予測モデルに追加され得る。例えば、患者のＡｐｏＥ状態は、遺伝的レベル（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）で発現するその疾患に関連の型のタンパク質を特定することにより、またはその患者から採取された液体試料に由来する特定の発現型のタンパク質の存在を検出することにより、遺伝子型判定を介して判定され得る。本発明の背景ではこの出力値は、患者がＡｐｏＥ４遺伝子またはタンパク質について陽性であるかそうでないか表す二分値として表されるか、または患者ゲノムＤＮＡ中に存在するＡｐｏＥ４アレルの数（０〜２）についての序数的出力値として表され、その出力値はその患者から採取された試料内のその遺伝子またはタンパク質の相対レベルを用いて計算され得る。
バイオマーカー相対レベルまたは濃度はバイオマーカーの組合せに含まれるバイオマーカーの各々に特異的なプローブに、好ましくは基材上に固定化されたプローブに試料を接触させることにより決定され得る。バイオマーカーとその各プローブとの間の相互作用は様々な当技術分野においてよく知られている技術を用いてモニターおよび定量され得る。適切な技術の例は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡの実施は特定の抗原への特異性を有する少なくとも１種類の抗体を伴う。不明の量の抗原を有する試料を固形支持体（通常はポリスチレンマイクロタイタープレート）上に非特異的に（表面への吸着を介して）または特異的に（「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおいて、同じ抗原に対して特異的な別の抗体による捕捉を介して）固定する。抗原が固定化された後に検出抗体を添加し、その抗原との複合体を形成する。その検出抗体を酵素に共有結合することができ、または生体複合化反応により酵素に結合している二次抗体によってその検出抗体自体を検出することができる。通常は各ステップの間で特異的に結合していないあらゆるタンパク質または抗体を除去するためにプレートを洗浄する。最後の洗浄ステップの後に酵素の基質を添加することによりプレートを現像して視認可能なシグナルを生成し、そのシグナルが試料中の抗原の量を示す。
本発明の好ましい実施形態では「試料」は、本明細書において言及される場合、血清または血漿である。しかしながら試料はバイオマーカーレベルまたは濃度を決定することができる患者由来のどのような試料であってもよい。これらの試料には全血、尿、唾液、脳脊髄液および血小板が含まれるが、これらに限定されない。
前記基材はそれぞれ個々のバイオマーカーに対して特異的である少なくとも２種類のプローブ、好ましくは３種類、または４種類のプローブを備える。本明細書において使用される場合、「特異的」という用語はプローブが本発明のバイオマーカーのうちの１つにだけ結合し、本発明の他のバイオマーカーまたは分析されている生体試料中の他の分析物への結合が無視できることを意味する。このことにより、本発明のバイオマーカーを使用する本診断アッセイとその診断アッセイの結果の完全性がその他の結合事象により毀損されないことが確実になる。
前記基材は１種類以上のプローブを支持することができるあらゆる面であり得るが、好ましくはバイオチップである。「バイオチップ」は、医療診断、薬物検出などに必要とさ
れ得る化学検査、生化学検査、プロテオーム検査、または分子検査を開催するための反応プラットフォームの一般的用語である。通常、バイオチップは（多くの場合、約１ｃｍ2以下の程度の表面積の）シリコン、ガラス、またはセラミックスなどの不活性基材を備え、その基材の上に１つの反応部位または複数の反応部位が提供される。それらの部位は概して実施される検査（または「アッセイ」）用に選択され、そのチップに塗布された試料（例えば、血液試料）および／または試薬と組み合わさると活性化されるそのチップの表面に吸着されている１種類以上のリガンド、例えば、１種類以上の抗体を担持する。それらの反応は、反応によって生成した化学発光の検出を含む多数の代替的技術を用いて検出され得る。通常はグリッド状またはアレイ状に配置されており、多数のアッセイを同時に、且つ、同じ一つの試料を使用して実行することを可能とする非常に多数（数百または数千）のそのような検査部位を担持するバイオチップもある。本発明の様々なバイオマーカー／タンパク質を特定するとき、このバイオチップによってタンパク質の正確な特定が可能になることを条件として、全長タンパク質の特定と同様にタンパク質の断片または幾つかの断片の特定が可能であることが当業者に明らかである。同様に、本発明の好ましいプローブはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、アプタマー、分子インプリントポリマー、ファージ、短鎖抗体断片および他の抗体ベースのプローブなどの他のプローブを使用してもよい。本発明は核酸配列プローブも考慮する。
れ得る化学検査、生化学検査、プロテオーム検査、または分子検査を開催するための反応プラットフォームの一般的用語である。通常、バイオチップは（多くの場合、約１ｃｍ2以下の程度の表面積の）シリコン、ガラス、またはセラミックスなどの不活性基材を備え、その基材の上に１つの反応部位または複数の反応部位が提供される。それらの部位は概して実施される検査（または「アッセイ」）用に選択され、そのチップに塗布された試料（例えば、血液試料）および／または試薬と組み合わさると活性化されるそのチップの表面に吸着されている１種類以上のリガンド、例えば、１種類以上の抗体を担持する。それらの反応は、反応によって生成した化学発光の検出を含む多数の代替的技術を用いて検出され得る。通常はグリッド状またはアレイ状に配置されており、多数のアッセイを同時に、且つ、同じ一つの試料を使用して実行することを可能とする非常に多数（数百または数千）のそのような検査部位を担持するバイオチップもある。本発明の様々なバイオマーカー／タンパク質を特定するとき、このバイオチップによってタンパク質の正確な特定が可能になることを条件として、全長タンパク質の特定と同様にタンパク質の断片または幾つかの断片の特定が可能であることが当業者に明らかである。同様に、本発明の好ましいプローブはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であるが、アプタマー、分子インプリントポリマー、ファージ、短鎖抗体断片および他の抗体ベースのプローブなどの他のプローブを使用してもよい。本発明は核酸配列プローブも考慮する。
好ましくは、本発明の方法において固形状態の器具、好ましくはバイオチップアレイテクノロジーシステム（ＢＡＴ）（Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より入手可能）を使用する。より好ましくは、試料中のバイオマーカーのレベルを決定するためにＥｖｉｄｅｎｃｅ ＥｖｏｌｕｔｉｏｎおよびＥｖｉｄｅｎｃｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ装置（Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より入手可能）を使用してよい。
本発明に従って使用される統計学的方法の真度はそれらの方法の受信者動作特性（ＲＯＣ）によって最も良く説明され得る。ＲＯＣ曲線は前記検査の感度、つまり、真の陽性の数と特異度、つまり、真の陰性の数の両方を処理する。したがって、所与の組合せのバイオマーカーの感度と特異度の値はそのアッセイの真度の指標である。例えば、バイオマーカーの組合せが８０％という感度と特異度の値を有する場合、１００人の患者のうちの８０人が特定の組合せのバイオマーカーの存在の判定から疾患について陽性であると正確に特定され、一方で疾患を有しない１００人の患者のうちの８０人がその疾患について陰性を正確に示す。
本診断方法において２つ以上のバイオマーカーが使用される予定の場合、適切な数理分類モデルまたは機械学習分類モデル、例えば、ロジスティック回帰方程式を求めることができる。そのロジスティック回帰方程式は患者の年齢および性別などの他の変数を含み得る。そのロジスティック回帰モデルの真度を評価するためにＲＯＣ曲線を使用することができる。そのロジスティック回帰方程式は独立して、または臨床決定を支援するためのアルゴリズムの中で使用され得る。ロジスティック回帰方程式はそのような事例において使用される一般的な数理／統計方法であり、本発明の背景では好ましいが、他の数理／統計方法、決定木方法または機械学習方法を使用することもできる。
例として、ＡＤを有することが疑われる患者、またはＡＤを発症する恐れがある患者においてＡＤ対非ＡＤ（対照）を示すバイオマーカーの組合せについての（０．５の分類カットオフ値における）本発明に適用可能なロジスティック回帰方程式は次のように算出される。
追加の例として、集団を分類群に分類するために各ノード（亜集団）から決定分岐が生じている決定木が生じ得る。図２１はこの発明に記載されるデータを使用して生じたツリーの例を表し、そのツリーは比較的に小さな誤差で全てのＡＤ患者を正確に分類することができた。
方法
１．標準化血漿／Ｑｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標）
血漿標準化は米国特許出願公開第２００９／０１３６９６６号明細書に従って実施された。簡単に説明すると、その妥当な方法を活用して多量のタンパク質を除去することによりヒト血漿を標準化した。その後に多重アフィニティー除去システム（ＭＡＲＳ）技術を使用して多量のタンパク質を除去した。その後、その結果生じた血漿を多重免疫親和性標準化（ＭＩＡＮ）カラムに負荷し、流速を変えることにより標準化ストリンジェンシーを調節した。流速と試料洗浄を組み合わせて差次的に標準化された試料を産生した。その後、この標準化された血漿のうちの幾らかを一様にビオチン化してＱｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標）として知られるトレーサー物質を提供した。
１．標準化血漿／Ｑｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標）
血漿標準化は米国特許出願公開第２００９／０１３６９６６号明細書に従って実施された。簡単に説明すると、その妥当な方法を活用して多量のタンパク質を除去することによりヒト血漿を標準化した。その後に多重アフィニティー除去システム（ＭＡＲＳ）技術を使用して多量のタンパク質を除去した。その後、その結果生じた血漿を多重免疫親和性標準化（ＭＩＡＮ）カラムに負荷し、流速を変えることにより標準化ストリンジェンシーを調節した。流速と試料洗浄を組み合わせて差次的に標準化された試料を産生した。その後、この標準化された血漿のうちの幾らかを一様にビオチン化してＱｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標）として知られるトレーサー物質を提供した。
２．抗体作製
モノクローナル抗体は米国特許出願公開第２００９／０１３６９６６号明細書に従って作製された。標準化血漿を免疫原として使用してポリクローナル抗体を産生した。その後、Ｂ細胞を単離し、モノクローナルハイブリドーマを作製した。ＥＬＩＳＡを用いてハイブリドーマの最初の選択を行った。プレートをマウスＩｇガンマＦｃ特異的ＧＡＭで被覆し、次にそのｍＡｂハイブリドーマの上清とインキュベートし、続いて洗浄ステップの後にこの複合体をＱｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標）とインキュベートし、その後に酵素基質反応を誘導してビオチン化血漿（Ｑｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標））のそのｍＡｂへの結合を検出した。この選択により１０００を超えるｍＡｂが特定された。この研究において使用されるモノクローナル抗体のタンパク質標的を特定するため、ウエスタンブロッティング技術、免疫沈殿技術およびマススペクトロメトリー技術を使用した。しかしながら、この時点では特定することができなかった幾つかの抗原が存在するが、それらの抗原はヒト血漿プロテオーム中に存在することが知られているのでそれらの抗原を含めた。
モノクローナル抗体は米国特許出願公開第２００９／０１３６９６６号明細書に従って作製された。標準化血漿を免疫原として使用してポリクローナル抗体を産生した。その後、Ｂ細胞を単離し、モノクローナルハイブリドーマを作製した。ＥＬＩＳＡを用いてハイブリドーマの最初の選択を行った。プレートをマウスＩｇガンマＦｃ特異的ＧＡＭで被覆し、次にそのｍＡｂハイブリドーマの上清とインキュベートし、続いて洗浄ステップの後にこの複合体をＱｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標）とインキュベートし、その後に酵素基質反応を誘導してビオチン化血漿（Ｑｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標））のそのｍＡｂへの結合を検出した。この選択により１０００を超えるｍＡｂが特定された。この研究において使用されるモノクローナル抗体のタンパク質標的を特定するため、ウエスタンブロッティング技術、免疫沈殿技術およびマススペクトロメトリー技術を使用した。しかしながら、この時点では特定することができなかった幾つかの抗原が存在するが、それらの抗原はヒト血漿プロテオーム中に存在することが知られているのでそれらの抗原を含めた。
３．Ｑｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標）を使用する臨床的バイオマーカーの特定
１９人の臨床的に確認されたアルツハイマー病（ＡＤ）患者と１９人の年齢／性別が一致する正常な認知機能を有する対照被検者から血清試料を得た。これらの試料を採取後短時間で凍結し、分析が実施されるまで（−８０℃）で保存した。その他の臨床的情報をこれらの対象について集め、この情報には基本的な個人の病歴および家族の病歴が含まれた。これに加え、当技術分野において知られている方法によりＡｐｏＥ遺伝子型とＧＳＴＯ遺伝子型を決定した。各患者について、ゲノムＤＮＡを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を活用してＡｐｏＥの３種類のアイソフォーム（Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）またはＧＳＴＯ（野生型、Ａ１４０［ｒｓ４８２５］変異体）の各々をコードするＤＮＡの存在を判定した。さらに分析してそれらのアイソフォームの各々のアレル頻度を当技術分野において知られている方法により決定することが可能になった。
１９人の臨床的に確認されたアルツハイマー病（ＡＤ）患者と１９人の年齢／性別が一致する正常な認知機能を有する対照被検者から血清試料を得た。これらの試料を採取後短時間で凍結し、分析が実施されるまで（−８０℃）で保存した。その他の臨床的情報をこれらの対象について集め、この情報には基本的な個人の病歴および家族の病歴が含まれた。これに加え、当技術分野において知られている方法によりＡｐｏＥ遺伝子型とＧＳＴＯ遺伝子型を決定した。各患者について、ゲノムＤＮＡを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を活用してＡｐｏＥの３種類のアイソフォーム（Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）またはＧＳＴＯ（野生型、Ａ１４０［ｒｓ４８２５］変異体）の各々をコードするＤＮＡの存在を判定した。さらに分析してそれらのアイソフォームの各々のアレル頻度を当技術分野において知られている方法により決定することが可能になった。
第２節により作製された１０００を超えるカタログから一団の６９種類のｍＡｂ抗体（
表１）を選択した。その後、競合的免疫アッセイにより抗体を評価した。それらの抗体をまず、免疫反応のための基材であるバイオチッププラットフォーム（９ｍｍ×９ｍｍ）上に固定化した。半自動ベンチトップ分析機であるＥｖｉｄｅｎｃｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒを使用した（ＥＶ３６０２、Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、クラムリン、英国、欧州特許出願公開第９８３０７７０６号明細書、欧州特許出願公開第９８３０７７３２号明細書、欧州特許出願公開第０９０２３９４号明細書、欧州特許出願公開第１２２７３１１号明細書、欧州特許出願公開第１４３４９９５号明細書および欧州特許出願公開第１３５４６２３号明細書）。アッセイの原理は遊離抗原（患者試料）と標識トレーサー血漿（Ｑｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標））との間でのモノクローナル抗体の結合部位に対する競合に基づく。
表１）を選択した。その後、競合的免疫アッセイにより抗体を評価した。それらの抗体をまず、免疫反応のための基材であるバイオチッププラットフォーム（９ｍｍ×９ｍｍ）上に固定化した。半自動ベンチトップ分析機であるＥｖｉｄｅｎｃｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒを使用した（ＥＶ３６０２、Ｒａｎｄｏｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、クラムリン、英国、欧州特許出願公開第９８３０７７０６号明細書、欧州特許出願公開第９８３０７７３２号明細書、欧州特許出願公開第０９０２３９４号明細書、欧州特許出願公開第１２２７３１１号明細書、欧州特許出願公開第１４３４９９５号明細書および欧州特許出願公開第１３５４６２３号明細書）。アッセイの原理は遊離抗原（患者試料）と標識トレーサー血漿（Ｑｕａｎｔｉｐｌａｓｍａ（商標））との間でのモノクローナル抗体の結合部位に対する競合に基づく。
試料と試薬を前記バイオチップに添加し、制御条件下でインキュベートする。基質の添加後に光信号が生成され、その光信号が次にデジタル画像撮影技術を用いて検出される。そのシステムは生成されたデータの自動処理、レポート、および記録保管に専用のソフトウェアを組み込んでいる。試料とトレーサーを含むバイオチップ（テスト）とトレーサーだけを含むバイオチップ（ブランク）の上のそれぞれの抗体の位置における光信号（ＲＬＵ）の間の差を比較することにより、患者試料における特定のタンパク質のレベルを決定する。検査試料と対照試料との間の比率が次のように決定され、
高い比率は試料中に存在するその各ｍＡｂに特異的なタンパク質の比較的に高いレベルを表し、低い比率は試料中に存在する相対的に少ないそのタンパク質、または全く無いそのタンパク質を表す。全てのｍＡｂについてＡＤ患者と対照患者の比率を決定し（図１〜９の例）、ＡＤ患者と対照患者を区別することができるｍＡｂを特定するためにノンパラメトリック分析を実施した（表２）。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を全てのｍＡｂについて算出した。これらは表３に詳細に記載されている。
４．疾患分類モデル
この研究により特定されたどれくらいの数のマーカーが組み合わされると疾患状態が不明の患者を分類するためのモデルを提供することができるかの例として、我々はモデル決定の方法としてロジスティック回帰を使用した。最初の調査により、α１‐アンチキモトリプシン（ＢＳＩ０２２１）の相対レベルと組み合わされたアファミン（ＢＳＩ０２６８）の相対レベルを使用することで個々の測定の予測力の著しい改善である０．９０６のＡＵＣ（図１０〜１３）を有するモデルが作成されることが示された。規模を大きくすること無くそのモデルへ追加の分析物を加えるため、α１‐アンチキモトリプシン（ＢＳＩ０２２１）の割合としてのアファミン（ＢＳＩ０２６８）の関数を一つの変異形（ＡＵＣ＝０．８７５）として使用し、そのモデルへ他の全ての分析物を系統的に追加することの効果を分析した。補体Ｃ３（ＢＳＩ０２１７）、α２‐マクログロブリン（ＢＳＩ０１９５）、セリントレオニンプロテインキナーゼＴＢＫ１（ＢＳＩ０１１２）または補体Ｃ５（ＢＳＩ０７８２）のそのモデルへの追加はそのモデルを改善し、ＡＵＣはそれぞれ０．８８９、０．９０６、０．８９２および０．９２０であった（図１４〜１７）。さらに、患者のＡｐｏＥ遺伝子型が考慮されると改善点が明らかになった。Ａｐｏｅ４アレルを持たない（０）、または１つ以上のＡｐｏｅ４アレルを有する（１）と各患者を特定する分類変数をその分析に追加した。これは各患者が有するＡｐｏＥ４アレルの数（０、１または２）を特定することによってさらに改良された。この研究では６３％のＡＤ患者が少なく
とも１つのＡｐｏｅ４アレルを有し、１９人の対照被検者のうちのわずかに１人（５％）がＡｐｏｅ４陽性であった。アファミン／α１‐アンチキモトリプシン率と組み合わせたＡｐｏＥ４遺伝子型が０．９２５のＡＵＣを生成し、ＡｐｏＥ４アレルの数を考慮に入れるとこれは０．９５３まで上昇する。さらに、補体Ｃ５を追加するとＡＵＣは０．９６４まで上昇する。これらのデータは本発明を用いて非常に正確なモデルが作成され得ることを示唆する。これらのデータは表４に要約されている。この予備的なデータセットを使用するモデル開発に使用され得る変数の数が次元の呪いによって限定されるが、最適モデルを提供するためにこの研究に含まれる幾つかのマーカーを組み合わせてよいことが予測される。ロジスティック回帰と同様に、このデータを使用して他の教師有り学習モデル、例えば、多層型パーセプションニューラルネットワーク、ランダムフォレスト、サポートベクターマシンおよび決定木（図２１）を作成した。これらの全てがロジスティック回帰と同様の真度を有するモデルを提供し、新しい分析物がそのモデルに追加されているので好ましくあり得る。
この研究により特定されたどれくらいの数のマーカーが組み合わされると疾患状態が不明の患者を分類するためのモデルを提供することができるかの例として、我々はモデル決定の方法としてロジスティック回帰を使用した。最初の調査により、α１‐アンチキモトリプシン（ＢＳＩ０２２１）の相対レベルと組み合わされたアファミン（ＢＳＩ０２６８）の相対レベルを使用することで個々の測定の予測力の著しい改善である０．９０６のＡＵＣ（図１０〜１３）を有するモデルが作成されることが示された。規模を大きくすること無くそのモデルへ追加の分析物を加えるため、α１‐アンチキモトリプシン（ＢＳＩ０２２１）の割合としてのアファミン（ＢＳＩ０２６８）の関数を一つの変異形（ＡＵＣ＝０．８７５）として使用し、そのモデルへ他の全ての分析物を系統的に追加することの効果を分析した。補体Ｃ３（ＢＳＩ０２１７）、α２‐マクログロブリン（ＢＳＩ０１９５）、セリントレオニンプロテインキナーゼＴＢＫ１（ＢＳＩ０１１２）または補体Ｃ５（ＢＳＩ０７８２）のそのモデルへの追加はそのモデルを改善し、ＡＵＣはそれぞれ０．８８９、０．９０６、０．８９２および０．９２０であった（図１４〜１７）。さらに、患者のＡｐｏＥ遺伝子型が考慮されると改善点が明らかになった。Ａｐｏｅ４アレルを持たない（０）、または１つ以上のＡｐｏｅ４アレルを有する（１）と各患者を特定する分類変数をその分析に追加した。これは各患者が有するＡｐｏＥ４アレルの数（０、１または２）を特定することによってさらに改良された。この研究では６３％のＡＤ患者が少なく
とも１つのＡｐｏｅ４アレルを有し、１９人の対照被検者のうちのわずかに１人（５％）がＡｐｏｅ４陽性であった。アファミン／α１‐アンチキモトリプシン率と組み合わせたＡｐｏＥ４遺伝子型が０．９２５のＡＵＣを生成し、ＡｐｏＥ４アレルの数を考慮に入れるとこれは０．９５３まで上昇する。さらに、補体Ｃ５を追加するとＡＵＣは０．９６４まで上昇する。これらのデータは本発明を用いて非常に正確なモデルが作成され得ることを示唆する。これらのデータは表４に要約されている。この予備的なデータセットを使用するモデル開発に使用され得る変数の数が次元の呪いによって限定されるが、最適モデルを提供するためにこの研究に含まれる幾つかのマーカーを組み合わせてよいことが予測される。ロジスティック回帰と同様に、このデータを使用して他の教師有り学習モデル、例えば、多層型パーセプションニューラルネットワーク、ランダムフォレスト、サポートベクターマシンおよび決定木（図２１）を作成した。これらの全てがロジスティック回帰と同様の真度を有するモデルを提供し、新しい分析物がそのモデルに追加されているので好ましくあり得る。
Claims (18)
- アルツハイマー病（ＡＤ）を発症する、または有する恐れがある人物を診断またはモニターすることを支援する方法であって、
前記人物から採取された液体試料中の、少なくともアファミンと、α１‐アンチキモトリプシンを含むバイオマーカーの、濃度または相対レベルを測定すること、および前記の濃度または相対レベルの有意性を確定することを含む、前記方法。 - 前記バイオマーカーは、α２‐マクログロブリン、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、セリントレオニンプロテインキナーゼＴＢＫ１、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ Ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲンおよび補体Ｃ５から選択される１つ以上の追加のバイオマーカーを更に含む、請求項１に記載の方法。
- アファミンとα１‐アンチキモトリプシンの前記濃度または相対レベルが比率に変換される、請求項１又は２に記載の方法。
- α１‐アンチキモトリプシンに対するアファミンの比率が計算される、請求項３に記載の方法。
- α１‐アンチキモトリプシンに対するアファミンの比率が計算され、セリントレオニンプロテインキナーゼＴＢＫ１、α２‐マクログロブリン、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ Ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲン、および補体Ｃ５から選択される少なくとも１つの追加のバイオマーカーの濃度または相対レベルも測定される、請求項４に記載の方法。
- １つの追加のバイオマーカーがセリントレオニンプロテインキナーゼＴＢＫ１である、請求項５に記載の方法。
- １つの追加のバイオマーカーが補体Ｃ５である、請求項５に記載の方法。
- １つの追加のバイオマーカーがα２‐マクログロブリンである、請求項５に記載の方法。
- １つの追加のバイオマーカーがアポリポプロテインＢ１００である、請求項５に記載の方法。
- １つの追加のバイオマーカーが補体Ｃ３である、請求項５に記載の方法。
- 前記人物のアポリポプロテインＥおよびグルタチオンＳ‐トランスフェラーゼ１オメガのうちの少なくとも一方のタンパク質の遺伝子型を、ゲノム中の前記タンパク質をコードする核酸配列の特定により、または前記人物から採取された液体試料中で産生された前記タンパク質の型の判定により決定することをさらに含む、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
- 前記人物がＡＤを有する、またはＡＤを発症する恐れがある可能性を計算するために分類方法を使用することを含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
- 前記分類方法が、人工ニューラルネットワーク、ロジスティック回帰、決定木、ランダムフォレスト、サポートベクターマシンまたは当技術分野において知られている分類モデルを開発する他のあらゆる方法のうちの少なくとも１つである、請求項１２に記載の方法。
- 前記液体試料が血漿または血清である、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
- 請求項１から１４の何れか一項に記載の方法において使用するための
（ａ）アファミンに特異的なプローブと、α１‐アンチキモトリプシンに特異的なプローブと、所望によりα２‐マクログロブリン、セリントレオニンプロテインキナーゼＴＢＫ１、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ Ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ５、ＡｐｏＥ４、またはｗｔＧＳＴＯから選択される１種類以上のバイオマーカーに特異的なプローブ、からなる２種類以上のプローブ；または
（ｂ）アファミンのタンパク質および／または核酸配列と、α１‐アンチキモトリプシンのタンパク質および／または核酸配列と、所望によりα２‐マクログロブリン、セリントレオニンプロテインキナーゼＴＢＫ１、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ Ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ５、ＡｐｏＥ４、またはｗｔＧＳＴＯから選択される１種類以上のタンパク質および／または核酸配列、からなる２種類以上のタンパク質および／または核酸配列
のどちらかを含む基材。 - 前記プローブ、タンパク質または核酸配列が表面に対して安定化されている、請求項１５に記載の基材。
- アファミン、α１‐アンチキモトリプシン、α２‐マクログロブリン、セリントレオニ
ンプロテインキナーゼＴＢＫ１、アポリポプロテインＢ１００、補体Ｃ３、ビタミンＤ結合タンパク質、α１Ｂ‐グリコプロテイン、ヘモペキシン、血清アルブミン、セルロプラスミン、α２‐アンチプラスミン、アポリポプロテインＡ１、補体因子Ｈ、ＩｇＧ、ＩｇＧ Ｆｃ結合タンパク質、ホルネリン、フィブリノーゲン、または補体Ｃ５に対する前記１種類以上のプローブがモノクローナル抗体である、請求項１５または１６に記載の基材。 - バイオチップである、請求項１５から１７の何れか一項に記載の基材。
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