CN116773825B - 诊断急性川崎病的血液生物标志物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在临床环境中用于诊断川崎病(KD)的血液生物标志物组合和表征方法。特别地，本发明请求保护利用生物标志物的组合和它们的体液浓度来得出KD得分，以协助诊断、风险评估以及KD的治疗/监测。更具体地说，这些用于表征生物标志物的试剂将被打包在一种试剂盒中，与测试系统（例如Luminex xMAP）一起使用，该测试系统测量生物标志物浓度以生成KD得分，可以用于区分KD和其他发热的儿科诊断。

Description

诊断急性川崎病的血液生物标志物和方法
技术领域
本发明涉及一种在临床环境中用于诊断川崎病（KD）的生物标志物组合和表征方法。具体而言，本发明请求保护利用生物标志物的组合及其浓度来推导一个KD得分，以帮助诊断、风险评估以及KD的治疗/监测。更具体地，这些表征生物标志物的试剂将与测定系统（如Luminex xMAP）一起打包在一个试剂盒中，该系统测量生物标志物的浓度，生成可以用于区分KD和其他幼儿发热症状的KD得分。
背景技术
川崎病（KD）是一种罕见的儿童急性炎症性疾病，与血管炎和持续发热相关。 KD是美国儿童获得性心脏病的主要原因，KD在发展中国家有明显增加的趋势。如果未能及早治疗，严重的并发症可能会发生，约25％的儿童会患冠状动脉损伤。KD死亡率很低，然而，由于受损动脉的血管重构，可以稍后发展狭窄病变。长期的结果研究表明，50％的患有KD初始冠状动脉瘤的儿童需要重新血管化手术或处于心肌梗死的高危风险之中。
KD的病因目前尚不清楚。然而，广泛认为它是特定遗传易感个体对感染因子异常持续的免疫反应。不幸的是，到目前为止尚未确定一致的感染因子，进一步增加了诊断难度。此外，还观察到不同的KD种族分布。 KD在白种人中显著较低，发病率为9-17 / 100,000；KD在东亚的发病率最高，在5岁以下儿童中日本的发病率为265 / 100,000，其他亚洲国家的平均发病率为51-194 / 100,000。
目前，KD 的诊断主要基于临床症状，没有可用的客观分子测试辅助该过程。由于KD 与儿童常见的自限性发热疾病（如发热、皮疹、粘膜皮肤表现、淋巴结肿大和炎症）共享许多症状和特征，因此临床诊断很困难。大约有 15-36.2％ 的 KD 病例被认为是不完全的KD，不显示完全的临床特征，即根据美国心脏协会的标准，KD 临床表现超过四个 KD 临床症状，这显著地导致延迟诊断。KD 的延迟诊断会增加永久性心脏损伤和冠状动脉瘤的风险。对于表现出“不完全” KD 的患者，并且不符合完整的临床诊断标准，诊断时间至关重要。发热开始十天内进行早期诊断和静脉免疫球蛋白（IVIG）治疗，可极大地减少冠状动脉疾病的发生率。
及时认识、诊断和治疗对许多临床医生来说常常是具有挑战性的。对于不熟悉或困惑于复杂临床算法的医生，按照已发布的指南根据持续发热和临床标准诊断 KD，KD 临床诊断通常会延迟。因此，迫切需要一种基于客观血液生物标志物的测试，以帮助医生识别不符合所有临床标准但需要治疗以防止心血管损害的 KD 患者。
我们研究了17种生物标志物，包括心肌功能或应激(NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I)，心脏缺血和斑块不稳定/破裂(FABP3和LIGHT(TNFSF14))，炎症(CXCL6、CXCL16、ST2(IL1RL1)、FABP4和Oncostatin M（OSM）)、细胞生长和迁移(MMP-8、MMP-9、HGF和VEGFA)，这些生物标志物与KD的发展和诊断有关(图1)。我们使用Luminex的多重免疫测定平台测定了血浆样品中这些分子的浓度。然后基于能够区分KD和其他发热患者的关键生物标志物的血清浓度开发了一个KD诊断模型。
发明内容
本发明公开了利用血/血浆/血清蛋白生物标志物对 KD 进行诊断、风险评估和治疗监测的方法。特别地，发明人已经发现并启用了一组蛋白质生物标志物血液浓度来计算KD 风险得分，可用于 KD 的诊断、风险评估和治疗监测，并区分 KD 和其他发热性疾病。这些生物标志物可以使用适当的检测系统（例如 Luminex 平台系统）的试剂盒来确定，以确定生物标志物的浓度，以推导可用于单独或与其他 KD 临床标准结合使用的 KD 得分，以确认 KD 的诊断。
蛋白质生物标志物的浓度，例如但不限于 NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT（TNFSF14）、CXCL6、CXCL16、ST2（IL1RL1）、FABP4 和Oncostatin M、VEGFA、HGF、MMP-8 和 MMP-9，在血/血浆/血清中以组合形式出现，已被发现可以利用多重免疫测定系统（例如 Luminex）将 KD 患者与其他发热性患者区分开来，以准确测量血液生物标志物浓度以推导 KD 得分。这些生物标志物包括但不限于 NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT（TNFSF14）、CXCL6、CXCL16、ST2（IL1RL1）、FABP4 和 Oncostatin M、VEGFA、HGF、MMP-8 和 MMP-9，这些生物标志物已被发现与 KD 的发展和诊断有关（见图1）。
本发明公开了一种使用生物标志物的方法，其中包括生物标志物的完整蛋白质或其肽序列，包括但不限于NTproBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT、OSM和ST2。
在某些实施例中，使用这些生物标志物的组合来诊断KD。用于KD诊断的生物标志物组合可以包括至少2个生物标志物，最多包括上述8个生物标志物的全部组合。这将包括至少包含2、3、4、5、6、7和8个上述生物标志物的任何组合。较小的生物标志物组合足以区分KD和其他发热疾病，并且更经济实惠。然而，更大的组合可能会提供更详细的信息，并且可以用于不同区域人群的实践中。
在二进制得分系统中，基于计算KD得分的方法来区分患者和其他发热疾病。低的KD得分表明患者不太可能患有KD。高的KD得分表明患者很可能患有KD（确诊）。
本发明基于上述生物标志物和方法描述，计算一个KD得分，并确定患有KD的三个不同风险范围，以确定患有KD的风险。低于低得分截止值的低KD风险表明患者患KD的风险低。高于高得分截止值的高KD风险表明患者患KD的风险高。低和高KD得分截止值之间的得分表示中间的KD风险。
在某些情况下，临床参数与本文所述的生物标志物组合用于诊断KD。例如，本发明包括一种方法，用于确定患有5天连续发热的患者的KD得分。该方法包括按照患者的标准护理测量至少七项临床参数，包括发热持续时间、血红蛋白浓度、血液中C-反应蛋白浓度、白细胞计数、百分比嗜酸性粒细胞、百分比单核细胞和百分比未成熟中性粒细胞。
KD得分可以通过血液生物标志物的测量值采用几何平均数、多元线性判别分析（LDA）或分布式梯度提升决策树（GBDT）机器学习（如XGBoost）来计算。在二元模型中，可以从血液生物标志物组合中导出受试者工作特征曲线（ROC曲线）。根据所述方法，KD得分可以被分类为低风险KD临床得分、中等风险KD临床得分或高风险KD临床得分。
另一方面，本发明还包括使用所述生物标志物组合和计算KD得分的方法和程序诊断患者的KD的方法。该方法包括1）从患者获取生物样品，2）测量生物样品中每个生物标志物的血液浓度，3）将每个生物标志物的水平与生物标志物的相应参考值范围进行比较。参考值范围可以代表正常样本中一个或多个未患KD（即正常样本）的受试者的生物标志物水平，或代表一个或多个患有KD的受试者的生物标志物水平。生物样品中生物标志物组的血液生物标志物的差异水平与控制受试者的生物标志物参考值相比，表明患者患有KD。在某些实施例中，该方法还包括计算KD得分以区分患者是否患有发热性疾病的方式。
可以使用特定的抗体和报告系统测量血液生物标志物的浓度。例如，但不限于，执行酶联免疫吸附测定（ELISA），放射免疫测定（RIA），免疫荧光测定（IFA），免疫组织化学（IHC），夹心法，磁性捕获，微球捕获，Western Blot，表面增强拉曼光谱（SERS），流式细胞术或质谱法来确定这些生物标志物的血液浓度。在某些实施例中，测量生物标志物的量来自于特定抗体与生物标志物的结合，其中抗体特异性结合整个生物标志物或生物标志物的片段、抗原表位。在本发明实施中可以使用的抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、重组抗体片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、F片段或scF片段。
本发明还包括一种评估用于治疗患有KD的患者的干预剂的疗效的方法。该方法包括：使用本说明书中描述的生物标志物组分析患者在接受治疗之前和之后的样本中每种血液生物标志物的浓度。可以结合相应的生物标志物参考值范围和计算的KD得分来确定治疗的有效性。
该发明特别涉及一种用于选择疑似患有川崎病（KD）的患者进行静脉免疫球蛋白（IVIG）治疗的方法，包括：1）根据本文所述的方法对患者进行诊断，和b）如果患者被诊断为KD阳性，则选择患者进行IVIG给药。在另一实施例中，该方法包括：1）确定患者的KD得分，和b）如果患者具有高危KD得分或中等风险范围的KD得分，并且基于上述描述中包括的生物标志物组合的表达谱呈阳性KD诊断，则选择患者进行IVIG给药。
该发明还涉及一种治疗疑似患有KD的患者的方法，包括：1）根据本文所述的方法对患者进行诊断或接收有关患者诊断的信息；和2）向患者治疗静脉免疫球蛋白（IVIG）的治疗有效量，如果患者被诊断为KD阳性。在一方面，该方法包括：1）确定患者的KD临床得分；和2）如果受试者具有高危KD临床得分或中等风险KD临床得分，并且基于上述段落中的生物标志物组合的表达谱呈阳性KD诊断，则向受试者给予治疗有效量的静脉免疫球蛋白（IVIG）。
本发明涉及用于在体液中测量生物标志物的多重免疫体系试剂盒，即LuminexxMAP系统。该试剂盒可以包括用于收集并分离疑似患有KD的人体患者的生物样品的容器。该试剂盒至少含有一种测量KD生物标志物的试剂，以及打印说明书，用于将试剂与生物样品或生物样品的一部分反应以测量生物样品中的至少一种KD生物标志物。试剂可以包装在单独的容器中。该试剂盒还可以包括一个或多个控制参考样品和用于执行检测生物标志物的免疫测定的试剂，如上所述。
另一方面，本发明涉及一种测定方法，包括：a) 在从疑似患有KD的患者采集的血液、血浆或血清样本中测量生物标志物组（如上所述）的每种生物标志物浓度；以及b) 将血液、血浆或血清样本中每种生物标志物的测量值与对照组中每种生物标志物的参考值进行比较，其中血液、血浆或血清样本中生物标志物的差异表达与参考值相比表明患者患有KD。在一个方面，该检测方法进一步包括根据患者的这些生物标志物浓度确定KD得分。
在某些情况下，通过抗体针对生物标志物进行测量，其中抗体特异性结合于生物标志物或其含有生物标志物抗原决定簇的片段。在某些实施例中，该抗体选自以下群组：单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、F片段或scF片段。在一个例子中，至少有一个抗体选自以下群组：特异性结合于NT-ProBNP的抗体，特异性结合于FABP4的抗体，特异性结合于MMP8的抗体，特异性结合于CXCL16的抗体，特异性结合于HGF的抗体，特异性结合于LIGHT的抗体，特异性结合于OSM的抗体和特异性结合于ST2的抗体。
用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的试剂盒中的用途，其特征在于，所述确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的方法包括：
a. 评估来自受试者的样品中的一组川崎病生物标志物浓度，所述样品为血液、血清或血浆，以确定样品中每个川崎病生物标志物的水平；
b. 基于组中每个川崎病生物标志物的水平获得川崎病生物标志物的水平表示；
c. 其中，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT（TNFSF14）、CXCL6、CXCL16、ST2（IL1RL1）、FABP4、OncostatinM、VEGFA、HGF、MMP-8和MMP-9中的一种或多种。
进一步的，测量每个川崎病生物标志物的完整蛋白质或其肽序列、DNA、RNA水平。
进一步的，所述组包括NT-proBNP和FABP4。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4和MMP-8。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8和CXCL16。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16和HGF。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF和LIGHT（TNFSF14）。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT（TNFSF14）和OSM。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT（TNFSF14）、OSM和ST2（IL1RL1）。
进一步的，包括提供川崎病生物标志物水平呈现的报告，例如绝对浓度或中位数倍数（MoM）。
进一步的，所述川崎病生物标志物水平呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：
a. 通过几何平均值、多元线性判别分析（LDA）或分布式梯度提升决策树（GBDT）机器学习，例如XGBoost，从所测量的血液生物标志物的值导出；或
b. 是每个生物标志物水平的乘积，例如浓度或MoM，归一化以适应0-10的等级，例如可以通过以下公式导出：[生物标志物1]×[生物标志物2]×[生物标志物3]×……×[生物标志物n]/[标准化因子]× 10 =川崎病得分。
用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于对受试者提供川崎病诊断的试剂盒中的用途，其特征在于，所述用于对受试者提供川崎病诊断的方法包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物的水平表示，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT（TNFSF14）、CXCL6、CXCL16、ST2（IL1RL1）、FABP4、Oncostatin M、VEGFA、HGF、MMP-8和MMP-9中的一种或多种。
进一步的，测量每种川崎病生物标志物的完整蛋白质或其肽序列、DNA、RNA水平。
进一步的，所述组包括NT-proBNP和FABP4。
进一步的，所述组包括NT-proBNP，FABP4和MMP-8。
进一步的，所述组包括NT-proBNP，FABP4，MMP-8和CXCL16。
进一步的，所述组包括NT-proBNP，FABP4，MMP-8，CXCL16和HGF。
进一步的，所述组包括NT-proBNP，FABP4，MMP-8，CXCL16，HGF和LIGHT（TNFSF14）。
进一步的，所述组包括NT-proBNP，FABP4，MMP-8，CXCL16，HGF，LIGHT（TNFSF14）和OSM。
进一步的，所述组包括NT-proBNP，FABP4，MMP-8，CXCL16，HGF，LIGHT（TNFSF14），OSM和ST2（IL1RL1）。
进一步的，进一步包括提供川崎病生物标志物水平呈现的报告，例如绝对浓度或中位数倍数（MoM）。
进一步的，所述川崎病生物标志物呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：
a. 通过几何平均值、多元线性判别分析（LDA）或分布式梯度提升决策树（GBDT）机器学习，例如XGBoost，从所测量的血液生物标志物的值导出；或
b. 每种生物标志物的水平的乘积，例如浓度或MoM，归一化以适应0-10的等级，例如可以通过以下公式导出：[生物标志物1]×[生物标志物2]×[生物标志物3]×……×[生物标志物n]/[标准化因子]× 10 =川崎病得分；
诊断时，川崎病得分大于3.274是一个例子，但需要针对人群进行调整，当没有足够的临床症状来确认川崎病诊断时，确认川崎病。
用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于受试者川崎病风险评估的试剂盒中的用途，其特征在于，所述用于受试者川崎病风险评估的方法，包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物的水平表示，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT（TNFSF14）、CXCL6、CXCL16、ST2（IL1RL1）、FABP4、Oncostatin M、VEGFA、HGF、MMP-8和MMP-9中的一种或多种。
进一步的，测量每种川崎病生物标志物的完整蛋白质或其肽序列、DNA、RNA水平。
进一步的，所述组包括NT-proBNP和FABP4。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4和MMP-8。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8和CXCL16。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16和HGF。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF和LIGHT（TNFSF14）。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT（TNFSF14）和OSM。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT（TNFSF14）、OSM和ST2（IL1RL1）。
进一步的，进一步包括提供川崎病生物标志物水平呈现的报告，例如绝对浓度或中位数倍数（MoM）。
进一步的，所述川崎病生物标志物的呈现以两种方式导出川崎病得分以及诊断的截止值：
a. 通过几何平均值、多元线性判别分析（LDA）或分布式梯度提升决策树（GBDT）机器学习，例如XGBoost，从所测量的血液生物标志物的值导出；
b. 或者将每种生物标志物的水平（例如浓度或MoM）相乘，归一化以适应0-10的等级，例如可以通过以下公式导出：[生物标志物1]×[生物标志物2]×[生物标志物3]×……×[生物标志物n]/[标准化因子]× 10 =川崎病得分；
对于川崎病风险评估，川崎病得分在三个不同范围内评估患川崎病的风险，以确定患川崎病的风险；低于低得分截止值（例如3.17，但受人群调整影响）的低川崎病风险表明患者患川崎病的风险较低；高于高得分截止值（例如3.47，但受人群调整影响）的高川崎病风险表明患者患川崎病的风险较高；在低和高川崎病得分截止值之间的得分表明中间的川崎病风险。
用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于为受试者提供川崎病治疗监测的试剂盒中的用途，其特征在于，所述用于为受试者提供川崎病治疗监测的方法，包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物水平表示，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT（TNFSF14）、CXCL6、CXCL16、ST2（IL1RL1）、FABP4、Oncostatin M、VEGFA、HGF、MMP-8和MMP-9中的一种或多种。
进一步的，测量每个KD生物标志物的蛋白质、其肽序列、DNA、RNA水平。
进一步的，所述组包括NT-proBNP和FABP4。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4和MMP-8。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8和CXCL16。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16和HGF。
进一步的，其中所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF和LIGHT（TNFSF14）。
进一步的，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT（TNFSF14）、OSM和ST2（IL1RL1）。
进一步的，所述组包括生物标志物NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT（TNFSF14）、OSM和ST2（IL1RL1）。
进一步的，还包括提供川崎病生物标志物水平呈现的报告，如绝对浓度或中位数倍数（MoM）。
进一步的，所述川崎病生物标志物呈现以两种方式导出川崎病得分以及诊断的截止值：
a. 通过血液生物标志物的值的几何平均数、多元线性判别分析（LDA）或分布式梯度增强决策树（GBDT）机器学习，例如XGBoost，从所测量的血液生物标志物的值导出；或
b. 通过每个生物标志物的水平的乘积，例如浓度或MoM，归一化以适合0-10的等级，例如可以通过以下公式导出：[生物标志物1]×[生物标志物2]×[生物标志物3]×……×[生物标志物n]/[标准化因子]× 10 =川崎病得分；
对于川崎病治疗监测，川崎病得分最初应该大于例如3.274，但在治疗前需要对川崎病进行群体调整；治疗后，川崎病得分应显著降低，低于3.274的得分。
进一步的，包括选择疑似患有川崎病的患者用于静脉注射免疫球蛋白（IVIG）治疗，所述方法包括：
a. 确定患者的川崎病得分，
b. 根据所述的方法诊断患者，并且如果患者确诊川崎病，则选择患者进行IVIG给药，
c. 如果患者的川崎病得分在高风险范围和中等风险范围内，则选择患者进行IVIG给药。
进一步的，还包括监测对患有川崎病的患者的川崎病治疗效果，包括：
a. 确定患者的川崎病得分，
b. 根据所述的方法诊断患者，并在如果患者确诊川崎病，则选择患者进行IVIG给药，
c. 如果患者的川崎病得分在高风险范围和中等风险范围内，则选择患者进行IVIG给药， 以及
d. 有效的治疗将导致川崎病得分下降。
一种用于从样品生成川崎病得分的试剂盒，所述样品为血液、血清或血浆，所述试剂盒包括：
a. 一种或多种检测试剂，用于测量一组川崎病生物标志物含量，所述组包括选自NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT、CXCL6、CXCL16、FABP4、Endocan-1、Oncostatin M、VEGFA、HGF、MMP-8和MMP-9的一个或多个生物标志物。
进一步的，试剂盒还包括：
a. 一种平台系统，用于测量川崎病生物标志物，例如Luminex xMAP系统；
b. 一张计算表，用于计算川崎病得分；以及
c. 一份说明用于确定患者是否患有川崎病。
用于测量选自以下生物标志物组的一种或多种川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于川崎病样品测定的试剂盒中的用途，其特征在于，所述用于川崎病样品测定包括川崎病样品测定的处理过程，以保留必要的数据，包括：
a. 测量从疑似患有川崎病的患者采集的血液、血浆或血清样品中的生物标志物组中的每个生物标志物浓度，
b. 将每个生物标志物的测量值与对照受试者的每个生物标志物的参考值进行比较，其中差异表达表明患者患有川崎病；该测定进一步包括根据患者的这些生物标志物浓度确定川崎病得分；
c. 所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT（TNFSF14）、CXCL6、CXCL16、ST2（IL1RL1）、FABP4、Oncostatin M、VEGFA、HGF、MMP-8和MMP-9中的一种或多种。
用于测量选自以下一种或多种靶向生物标志物的抗体的量的检测试剂在制备用于计算川崎病得分的试剂盒中的用途，其特征在于，所述抗体特异性结合到所述生物标志物或含有生物标志物抗原决定簇的生物标志物片段上，
a. 抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、抗体的重组片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、F片段和scF片段；
b. 至少一种抗体选自特异性结合到NT-ProBNP的抗体、专门结合到FABP4的抗体、专门结合到MMP8的抗体、专门结合到CXCL16的抗体、特异性结合到HGF的抗体、特异性结合到LIGHT的抗体、特异性结合到OSM的抗体和特异性结合到ST2的抗体。
附图说明
图1是川崎病血清学生物标志物的发现和验证过程。潜在的血清学生物标志物首先通过GEO分析、通路发现和血清蛋白数据库进行鉴定。首先确定了主要表型通路，并进一步将相关通路的分析物包括在Luminex发现组中。
图2是基于前四个分析物的几何平均值构建的模型，其中a使用Luminex多重抗原检测方法测定了每种生物标志物的血清浓度； 其中b在ROC分析中实现了0.946的AUC值，并具有3.274的最佳截断点；c是该模型的整体表现。
图3是基于截断值的风险预测，其中a为两个阈值和三个风险级别得分模型将队列人口分为高风险、中间和低风险群体；b为基于风险得分系统的队列人口分类；c为高风险PPV在3.47的最佳截止值下达到了86.4%的PPV，低于3.17风险得分的患者人群具有94.2%的NPV。
图4是根据KD风险分类对冠状动脉Z得分进行分类。我们的组捕获了大部分动脉瘤病例，该组还可以识别冠状动脉正常或扩张的KD患者。
具体实施方式
提供了川崎病 (KD) 生物标志物、KD 生物标志物组和用于获得样品的 KD 生物标志物水平表示的方法。 这些组合物和方法可用于许多应用，包括例如诊断 KD、KD 的风险评估、监测患有 KD 的受试者的治疗以及确定治疗 KD 的必要性。 此外，提供了可用于实践主题方法的系统、装置及其套件。 在阅读如下所述的组合物和方法的细节后，本领域的技术人员将清楚本发明的这些和其他目的、优点和特征。
在描述本方法和组合物之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法或组合物，因为它们当然可以变化。 还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。 尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试，但现在描述一些可能的和优选的方法和材料。 本文提及的所有出版物均通过引用并入本文以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开取代并入的出版物的任何公开。
如本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见的，本文描述和图示的各个实施例中的每一个都具有分立的组件和特征，这些组件和特征可以容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分离或结合。 在不脱离本发明的范围或精神的情况下的实施例，任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。
必须注意，如本文和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一个”和“这个”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。 因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞并且提及“肽”包括提及一种或多种肽及其等同物，例如 多肽，本领域技术人员已知的，等等。
如上所概括，本发明的方面包括方法、组合物、系统（即 Luminex xMAP)和可用于提供 KD 评估的试剂盒，例如 受试者 KD 的诊断、风险评估、监测和/或治疗决策。 “川崎病”或“KD”是指多系统炎症和发热性疾病并发症，可能伴有皮疹、手脚肿胀（水肿）、刺激和眼白发红中的一种或多种 、颈部淋巴腺肿胀，以及口腔、嘴唇和喉咙的刺激和炎症。 KD 主要发生于 5 岁以下的儿童，但年龄较大的儿童、青少年和成人仍可患 KD。 如果在发烧后10 天内未得到处理，KD 会导致心血管疾病和动脉瘤。 通过“诊断”KD 或“提供 KD 诊断”，通常意味着提供 KD 确定，例如 确定受试者（例如具有 KD 临床症状的受试者，无论是完全的还是不完全的 KD）目前是否受 KD 影响； 将受试者的 KD 分类为疾病或病症的亚型；确定 KD 的严重程度； 之类的。 KD 的“风险评估”或“提供 KD 风险得分作为临床体征之一”通常意味着提供 KD 预测作为额外的临床体征，例如 在存在其他临床症状的情况下诊断受试者患有 KD 的易感性或风险； 疾病进展过程和/或疾病结果的预测，例如 确认 KD和不完全性 KD 的诊断； 预测受试者对 KD 治疗的反应性，例如阳性反应、阴性反应、完全无反应； 之类的。 通过“监测”KD，它通常意味着监测受试者的状况，例如 告知 KD 诊断，告知 KD 预后/风险连同其他临床体征，提供关于 KD 治疗的效果或功效的信息，等等。“治疗”KD 是指在哺乳动物中开具或提供任何 KD 疗法，包括：(a) 防止 KD 和相关心血管事件发生在可能易患 KD 但尚未 诊断为患有它； (b) 抑制 KD 和心脏事件，即阻止其症状和心脏动脉瘤的发展； 或 (c) 减轻 KD，即导致 KD 消退和心脏动脉瘤风险降低。
在描述本发明时，将首先描述可用于提供 KD 评估的组合物，然后是使用它们的方法、系统和试剂盒。
川崎病生物标志物和组合
在本发明的一些方面，提供了 KD 生物标志物和 KD 生物标志物组。 “KD 生物标志物”是指一种分子实体，其在样品中的表现与 KD 表型相关。 例如，与健康个体相比，KD生物标志物可能在来自将发展或已经发展为 KD 的个体的样品中有差异地表示，即以不同水平表示。 在某些情况下，生物标志物如 NT-proBNP 水平升高与 KD 表型相关。 例如，样品中生物标志物的浓度可以是相关样品中的 1.5 倍、2 倍、2.5 倍、3 倍、4 倍、5 倍、7.5倍、10 倍或更高 与 KD 表型相比，在与 KD 表型无关的样本中。 在其他情况下，生物标志物水平降低与 KD 表型相关，例如 VEGFA。 例如，与 KD 表型相关的样品中的生物标志物浓度可以比与 KD 表型无关的样品中低 10%、低 20%、低 30%、低 40%、低 50% 或更多 KD表型。
KD 生物标志物可以包括与 KD 相关的蛋白质和肽及其相应的遗传序列，即mRNA、DNA 等。“基因”或“重组基因”是指包含编码 蛋白质。
编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子决定。 转录终止序列可位于编码序列的3'。 此外，基因可以任选地包括其天然启动子（即，在非重组细胞，即天然存在的细胞中，基因的外显子和内含子与其可操作连接的启动子）和相关的调节序列，并且可以 或者在 AUG 起始位点的上游可能没有序列，并且可能包括也可能不包括未翻译的前导序列、信号序列、下游未翻译序列、转录起始和终止序列、聚腺苷酸化信号、翻译起始和终止序列、核糖体结合位点。
如在本公开的实施例中所证明的，发明人已经鉴定出许多与 KD 相关的分子实体，并且在提供 KD 风险评估中发现组合使用（即作为一组），例如 诊断 KD、评估患有 KD的风险、监测患有 KD 的受试者、决定治疗患有 KD 的受试者，等等。 这些包括但不限于NTproBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT (TNFSF14)、OSM 和 ST2 (IL1RL1)。
如上所述，本文还提供了 KD 组。 KD 生物标志物“组”是指两种或更多种 KD 生物标志物，例如 2 种或更多种、3 种或更多种、或 4 种或更多种生物标志物，其水平在组合考虑时可用于提供 KD 评估，例如 进行 KD 诊断、预后、监测和/或治疗。 特别的是包含KD 生物标志物 NTproBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF 的组。 例如，在一些实施方案中，KD组可包含 NTproBNP、FABP4、MMP-8 和 CXCL16。
在本方法中用作 KD 组的 KD 生物标志物的其他组合可以由普通技术人员使用任何方便的统计方法，例如 如本领域已知的或在本文的工作实施例中描述的。 例如，可以通过组合遗传算法（GA）和所有配对（AP）支持向量机（SVM）方法来选择分析物组用于KD分类分析。 预测特征是自动确定的，例如 通过迭代 GA/SVM，产生非常紧凑的非冗余 KD 相关分析物集，具有最佳分类性能。 虽然不同的分类器集通常只包含适度的重叠基因特征，但它们在提供 KD 评估方面与上述和本文工作示例中的那些具有相似的准确度水平。
方法
在本发明的一些方面，提供了用于获得受试者的 KD 生物标志物水平表示的方法。 KD 生物标志物水平表示是指一种或多种主题 KD 生物标志物的水平表示，例如 来自受试者的生物样品中的一组 KD 生物标志物。 术语“生物样品”包括从生物体获得的多种样品类型，可用于诊断、预后或监测分析。 该术语包括血液和其他生物来源的液体样品或从中衍生的细胞及其后代。 该术语包括在采购后以任何方式处理过的样本，例如通过试剂处理、溶解或富集某些成分。 该术语包括临床样品，还包括细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液和组织样品。 可从多种来源获得用于本发明方法的临床样品，特别是血液样品。
特别的样品源包括血液样品或其制备物，例如全血或血清或血浆。 在许多实施例中，人类样本的合适初始来源是血液样本。 因此，在主题测定中使用的样品通常是血液来源的样品。 源自血液的样品可以源自全血或其部分，例如血清、血浆等，其中在一些实施方案中，样品源自血液，使其凝结，分离并收集血清以供使用 化验。
在一些实施方案中，样品是血清或血清衍生样品。 可以采用任何用于产生流体血清样品的方便的方法。 在许多实施例中，该方法使用通过皮肤穿刺（例如指尖、静脉穿刺）将静脉血抽取到凝血管或血清分离管中，使血液凝结，并将血清从凝固的血液中离心分离。然后收集并储存血清直至进行测定。 一旦获得源自患者的样本，就对样本进行化验以确定KD 生物标志物的水平。
受试者样品通常是在患者持续和反复发烧时在临床就诊期间从个体获得的。 KD最有可能发生在五岁以下的儿童中，但它也可能发生在任何年龄段，包括青少年和成人。
一旦获得样品，它可以直接使用、冷冻或在合适的培养基中短时间保存。 通常，样本将来自人类患者，尽管动物模型可能有用，例如 马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物，例如 小鼠、大鼠、仓鼠、灵长类动物等。证明本文公开的一种或多种KD生物标志物在患有KD的患者中的差异表现的任何方便的组织样品可以在主题方法中进行评估。 通常，合适的样品源将来自可以分析的分子实体的流体，即蛋白质、肽和 RNA已被释放。
主题样品可以以多种方式处理以增强一种或多种KD生物标志物的检测。 例如，在样本是血液的情况下，可以在化验之前从样本中去除红细胞（例如，通过离心）。 这种处理可用于降低使用亲和试剂检测KD生物标志物水平的非特异性背景水平。 KD 生物标志物的检测也可以通过使用本领域熟知的程序（例如酸沉淀、醇沉淀、盐沉淀、疏水沉淀、过滤）浓缩样品来增强。在一些实施方案中，测试和对照样品的pH将是 调整至并保持在接近中性的pH。这种 pH 调整将防止复合物形成，从而提供样品中生物标志物水平的更准确定量。在样品是尿液的实施例中，pH 调整样品，浓缩样品以增强生物标志物的检测。
在实施主题方法时，评估个体生物样品中 KD 生物标志物的水平。 可以通过任何方便的方法评估受试者样品中一种或多种 KD 生物标志物的水平。 例如，可以通过测量一种或多种蛋白质/多肽的水平/量来检测蛋白质生物标志物。 KD 基因表达水平可以通过测量一种或多种核酸转录物的水平/量来检测，例如 一种或多种 KD 基因的 mRNA。 术语“评估”、“测定”、“测量”、“评估”和“确定”可互换使用，指任何形式的测量，包括确定元素是否存在，并包括定量和定性测定，评估可以是相对的或绝对的。
例如，至少一种 KD 生物标志物的水平可以通过检测样品中一种或多种蛋白质/多肽或其片段的量或水平来评估，以达到蛋白质水平表示。 本申请中使用的术语“蛋白质”和“多肽”可以互换。 “多肽”是指氨基酸(氨基酸序列)的聚合物，并不是指特定长度的分子。 因此肽和寡肽包括在多肽的定义内。 该术语还指或包括翻译后修饰的多肽，例如糖基化多肽、乙酰化多肽、磷酸化多肽等。 包括在该定义内的是，例如，含有一种或多种氨基酸类似物的多肽、具有取代连接的多肽，以及本领域已知的天然存在和非天然存在的其他修饰。
当要检测蛋白质水平时，可以使用任何用于评估蛋白质水平的方便的方案，其中测定被测定样品中的一种或多种蛋白质的水平。 例如，一种具有代表性且方便的蛋白质水平测定方案是酶联免疫吸附测定 (ELISA)。 在 ELISA 和基于 ELISA 的测定中，可以将一种或多种对的蛋白质具有特异性的抗体固定到选定的固体表面上，优选表现出蛋白质亲和力的表面，例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。 洗涤去除未完全吸附的物质后，测定板孔涂有一种非特异性“封闭”蛋白，该蛋白已知对测试样品呈抗原中性，例如牛血清白蛋白 (BSA)、酪蛋白或溶液 奶粉。 这允许封闭固定表面上的非特异性吸附位点，从而减少由抗原非特异性结合到表面上引起的背景。 洗涤去除未结合的封闭蛋白后，固定表面在有利于免疫复合物（抗原/抗体）形成的条件下与待测样品接触。 这些条件包括用磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tweenor PBSATriton-X 100 中的 BSA 或牛丙种球蛋白 (BGG) 等稀释剂稀释样品，这也有助于减少非特异性背景并允许样品孵育在大约 25-27°C 的温度下保持大约 2-4 小时（尽管可以使用其他温度）。 温育后，洗涤接触抗血清的表面以去除非免疫复合物材料。 示例性洗涤程序包括用诸如 PBS/Tween、PBS/Triton-X 100 或硼酸盐缓冲液的溶液洗涤。 然后可以通过使结合的免疫复合物接触对不同于第一抗体的靶标具有特异性的第二抗体并检测第二抗体的结合来确定免疫复合物形成的发生和数量。 在某些实施方案中，第二抗体将具有相关的酶，例如 脲酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶，与适当的显色底物孵育后会产生颜色沉淀。 例如，可以在有利于形成免疫复合物形成的条件下使用脲酶或过氧化物酶缀合的抗人 IgG 一段时间（例如，在室温下在含 PBS 的溶液（例如 PBS）中孵育 2 小时 /吐温）。 在与第二抗体孵育并洗涤以去除未结合的物质后，标记的量被量化，例如，通过与显色底物孵育，例如尿素和溴甲酚紫（在脲酶标记或 2,2'-叠氮基的情况下） -二-(3-乙基-苯并噻唑啉)-6-磺酸 (ABTS) 和 H2O2，在过氧化物酶标记的情况下。 然后通过测量颜色生成的程度实现定量，例如，使用可见光谱分光光度计。
可以通过首先将样品结合到测定板上来改变前述形式。然后，将一抗与测定板一起孵育，然后使用对一抗具有特异性的标记二抗检测结合的一抗。
抗体固定在其上的固体基质可以由多种材料制成并具有多种形状，例如微量滴定板、微珠、试纸、树脂颗粒等。可以选择基质 以最大化信噪比，最小化背景结合，以及便于分离和成本。 洗涤可以以最适合所用底物的方式进行，例如，通过从容器中取出珠子或试纸，清空或稀释容器（例如微量滴定板孔），或冲洗珠子、颗粒、色谱柱或 用洗涤液或溶剂过滤。
或者，可以使用用于测量样品中一种或多种蛋白质水平的非基于ELISA的方法。代表性示例包括但不限于质谱、蛋白质组阵列、xMAP™ 微球技术、流式细胞术、蛋白质印迹和免疫组织化学。
作为另一个例子，至少一种 KD 生物标志物的水平可以通过检测患者样品中一种或多种 RNA 转录物或其片段的量或水平来评估，该转录物或片段由目的基因编码以到达核酸 生物标志物表示。 可以使用任何方便的方案检测样品中的核酸水平。 虽然检测核酸的各种不同方式是已知的，例如差异基因表达分析领域中采用的那些方式，但用于生成生物标志物表示的一种具有代表性且方便的方案类型是基于阵列的基因表达谱方案。 此类应用是杂交测定，其中使用了一种核酸，该核酸显示待生成的生物标志物表示中待测定/概况分析的每个基因的“探针”核酸。 在这些测定中，首先从被测定的初始核酸样品制备靶核酸样品，其中制备可以包括用标记物例如信号产生系统的成员标记靶核酸。 在靶核酸样品制备之后，样品在杂交条件下与阵列接触，由此在与附着于阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。 然后定性或定量检测杂交复合物的存在。
可用于产生主题方法中采用的生物标志物表现的特定杂交技术包括美国专利号：5，143，854；5，143，854； 5,288,644； 5,324,633； 5,432,049； 5,470,710； 5,492,806；5,503,980； 5,510,270； 5,525,464； 5,547,839； 5,580,732； 5,661,028; 5,800,992；其公开内容通过引用并入本文； 以及WO 95/21265； WO 96/31622； WO 97/10365； WO 97/27317； EP 373 203； 和EP 785 280。在这些方法中，“探针”核酸阵列包括针对其表达被测定的表型决定基因中的每一个的探针，如上所述与靶核酸接触。 接触在杂交条件下进行，例如严格杂交条件，然后去除未结合的核酸。 本文所用的术语“严格测定条件”是指与产生核酸结合对相容的条件，例如，表面结合和溶液相核酸，具有足够的互补性以提供测定中所需水平的特异性，同时 与互补性不足以提供所需特异性的结合成员之间结合对的形成相容性较低。 严格测定条件是杂交和洗涤条件的总和或组合（整体）。
杂交核酸的所得模式提供了关于已被探测的每个基因的表达的信息，其中表达信息是关于基因是否被表达，通常是在什么水平，表达在哪里 数据，即生物标志物表示（例如，以转录体的形式），可以是定性和定量的。
或者，可以使用用于定量样品中一种或多种核酸水平的非基于阵列的方法，包括那些基于扩增方案的方法，例如基于聚合酶链反应（PCR)的测定，包括定量PCR 、逆转录PCR(RT-PCR)、实时PCR等。
结果数据提供了关于样品中已探测的每个生物标志物的水平的信息，其中该信息是关于生物标志物是否存在以及通常以什么水平存在的信息，并且其中数据可以 既要定性又要定量。 因此，在检测是定性的情况下，该方法提供了目标生物标志物，例如核酸或蛋白质，是否存在于被测定的样品中的读数或评估，例如评估。 在其他实施例中，该方法提供目标生物标志物是否存在于被测定样品中的定量检测，即，评估或评价样品中目标分析物例如核酸或蛋白质的实际量或相对丰度 正在化验。 在这样的实施方案中，定量检测可以是绝对的，或者如果该方法是检测样品中的两种或更多种不同分析物（例如靶核酸或蛋白质）的方法，则可以是相对的。 因此，当在量化样品中的目标分析物（例如核酸或蛋白质）的上下文中使用时，术语“量化”可以指绝对或相对量化。 绝对定量可以通过包含已知浓度的一种或多种对照分析物并通过将目标分析物的检测水平与已知对照分析物进行参考（例如，通过生成标准曲线）来实现。 或者，可以通过比较两种或更多种不同目标分析物之间的检测水平或量来实现相对定量，以提供两种或更多种不同分析物中每一种的相对定量，例如，相对于彼此。
一旦确定了一种或多种 KD 生物标志物的水平，可以以多种方式分析测量值以获得 KD 生物标志物水平表示。
例如，可以单独分析一种或多种KD生物标志物的测量值以形成KD得分。 如本文所用，“KD 得分”是患者样品中一种或多种 KD 生物标志物的标准化水平，例如，患者样品中血清学蛋白质浓度的标准化水平。概况可以通过许多 例如，每个生物标志物的水平可以相对于所选管家基因的表达、相对于整个组的信号等进行 log2 转换和归一化。计算 KD 概况的其他方法将是普通技术人员很容易知道。
作为另一个例子，可以共同分析一组 KD 生物标志物的测量值以得出单个 KD 得分。 “KD 得分”是指代表 KD 组中每个 KD 生物标志物的加权水平的单个度量值。 因此，在一些实施方案中，主题方法包括检测样品中 KD 组的生物标志物水平和基于 KD 生物标志物的加权水平计算 KD 得分。 可以通过本领域已知的用于计算生物标志物得分的多种方法和算法中的任一种来计算患者样品的KD得分。 例如，加权生物标志物水平，例如 已通过例如将每个标准化生物标志物水平乘以加权因子加权的 log2 转换和标准化生物标志物水平可以被加总，并且在一些情况下，被平均以获得代表所分析的 KD 生物标志物组的单个值。
在一些情况下，组中每个生物标志物的加权因子或简单的“权重”可以反映样品中分析物水平的变化。 例如，每个 KD 生物标志物的分析物水平可以进行对数转换并加权为1（对于 KD 水平升高的那些生物标志物）或-1（对于 KD 水平降低的那些生物标志物），并且 增加的生物标志物总和与确定达到 KD 特征的减少的生物标志物之间的比率。 在其他情况下，权重可以反映每个生物标志物对生物标志物组在进行诊断、预后或监测评估时的特异性、敏感性和/或准确性的重要性。 这样的权重可以通过任何方便的统计机器学习方法来确定，例如 可以使用从中获得样本的数据集的主成分分析 (PCA)、线性回归、支持向量机 (SVM) 和/或随机森林。 在一些情况下，每个生物标志物的权重由从中获得患者样本的数据集定义。 在其他情况下，每个生物标志物的权重可以基于参考数据集或“训练数据集”来定义。
这些分析方法可以由本领域的普通技术人员通过使用基于计算机的系统容易地执行，例如 使用本领域已知的任何硬件、软件和数据存储介质，并采用便于进行此类分析的任何算法。 例如，可以通过“云计算”、基于智能手机或基于客户端-服务器的平台等应用数据挖掘算法。
在某些实施例中，表述，例如 评估仅一种生物标志物的多肽水平以产生生物标志物水平表示。在其他实施例中，评估两种或更多种生物标志物的水平，即一组生物标志物。因此，在主题方法中，评价样品中至少一种生物标志物的表达。 在某些实施例中，所进行的评估可被视为对蛋白质组的评估，因为该术语在本领域中使用。
在一些情况下，确定或获得受试者的 KD 生物标志物表示（例如 KD 得分或 KD概况）的主题方法进一步包括提供 KD 生物标志物表示作为报告。 因此，在一些情况下，主题方法还可以包括生成或输出提供样品中 KD 生物标志物评估结果的报告的步骤，该报告可以电子介质（例如，电子显示器）的形式提供 在计算机显示器上），或以有形媒体的形式（例如，打印在纸上或其他有形媒体上的报告）。 可以提供任何形式的报告，例如 如本领域已知的或如下文更详细描述的。
效用
如此获得的 KD 生物标志物水平表示具有许多用途。 例如，生物标志物水平表示可用于诊断KD； 也就是说，确定受试者是否受 KD、KD 的类型（完全 KD 和不完全 KD）、KD的严重程度（正常心脏表型、扩张或动脉瘤等）。在某些情况下， 受试者可能会出现 KD 的临床症状，例如发烧、皮疹、手脚肿胀、眼白发炎和发红、颈部淋巴结肿大以及口腔、嘴唇和喉咙发炎和发炎。
作为另一个例子，当患者具有不完全 KD 时，可以采用 KD 生物标志物水平表示来确定患有 KD 的风险； 也就是说，提供 KD 临床体征作为预后。 例如，KD 生物标志物水平表示可用于通过替代作为附加临床体征来预测受试者对 KD 的诊断。 “如果个体患有KD，则添加生物标记体征”是指确定个体患有 KD 的可能性，即使根据 AHA 指南存在少于四种临床体征。 KD 生物标志物水平表示和 KD 得分可用作疾病进展过程和/或疾病结果的临床标志，例如 预期确认 KD 的诊断、KD 的预期持续时间、关于 KD 是否会发展心脏表型的预期等。KD 生物标志物水平表示可用于预测受试者对 KD 治疗的反应性，例如， 正面回应、负面回应或根本没有回应。
作为另一个例子，可以采用 KD 生物标志物水平表示来监测 KD。 通过“监测”KD，它通常意味着监测受试者的状况，例如 告知 KD 诊断、告知 KD 预后、提供关于 KD 治疗的效果或功效的信息等。
作为另一个例子，可以采用 KD 生物标志物水平表示来确定受试者的治疗必要性。 本文使用的术语“治疗、治疗”等通常表示获得所需的药理和/或生理作用。 该作用在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性的和/或在部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用方面可以是治疗性的。 如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物疾病的任何治疗，包括： (b) 抑制疾病，即阻止其发展； (c) 缓解疾病，即导致疾病消退。 治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。 正在进行的疾病的治疗，其中治疗稳定或减少患者的不良临床症状，是特别令人的。 主题疗法可以在疾病的症状阶段之前施用并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。 术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指任何需要诊断、治疗或治疗的哺乳动物受试者，尤其是人类。 KD治疗是本领域众所周知的并且可以包括卧床休息、多喝水、低盐饮食、控制血压的药物、皮质类固醇、诱导怀孕等。
在一些实施例中，提供 KD 评估的主题方法，例如 诊断 KD、KD 的风险评估、监测KD、治疗 KD 等可包括将获得的 KD 生物标志物水平表示与 KD 表型确定元素进行比较，以识别与表型确定元素的相似性或差异性，其中相似性 然后使用识别出的差异来提供 KD评估，例如 KD 的诊断、KD 的预后、KD 的监测、KD 治疗的确定等。“表型确定要素”是指要素，例如组织样本、生物标志物概况、值（例如得分）、 代表表型（在这种情况下，KD 表型）的值范围等，可用于确定受试者的表型，例如，受试者是否健康或受 KD 影响，如果 如果受试者的 KD 对治疗有反应，则受试者的 KD 可能会进展为完成/确认 KD，等等。
例如，KD 表型确定元件可以是来自具有或不具有 KD 的个体的样品，其可以用作例如在生物标志物水平表示的实验确定中的参考/对照 给定的主题。 作为另一个例子，KD表型确定元素可以是生物标志物水平表示，例如 生物标志物概况或得分，代表 KD 状态，可用作参考/对照来解释给定受试者的生物标志物水平表示。 表型确定元素可以是阳性参考/对照，例如来自患有 KD 或将从不完全 KD 发展为完全 KD 或具有可通过已知治疗控制的 KD 的儿童的样品或生物标志物水平代表， 或者已经确定对 IVIG 有反应的 KD。 或者，表型确定元素可以是阴性参考/对照，例如来自未患有 KD 的儿童或患有其他发热性疾病的儿童的样品或其生物标志物水平表示。 表型确定元件优选是相同类型的样品，或者如果生物标志物水平表示是从与用于为被监测的个体产生生物标志物水平表示的样品相同类型的样品中获得的。 例如，如果评估个体的血清，则表型确定元素将优选为血浆。
在某些实施方案中，将获得的生物标志物水平表示与单个表型确定元素进行比较以获得关于正在测试KD的个体的信息。 在其他实施方案中，将获得的生物标志物水平表示与两个或更多个表型确定元素进行比较。 例如，可以将获得的生物标志物水平表示与阴性参考和阳性参考进行比较以获得关于个体是否将发展为KD的确认信息。 作为另一个例子，可以将获得的生物标志物水平表示与代表对治疗有反应的 KD 的参考和代表对治疗无反应的 KD 的参考进行比较以获得关于是否对治疗有反应的信息。 患者会对治疗产生反应。
可以使用任何方便的方法将获得的生物标志物水平表示与一种或多种表型确定元素进行比较，其中多种方法是本领域技术人员已知的。 例如，ELISA领域的技术人员将知道ELISA数据可以通过例如比较来比较。 归一化为标准曲线，比较归一化值等。比较步骤产生关于所获得的生物标志物水平概况与对照/参考概况有多相似或不相似的信息，相似性/相异性信息用于，例如， 预测 KD 的发作、诊断 KD、监测 KD 患者等。类似地，阵列领域的技术人员将知道阵列概况可以通过例如比较表达概况的数字图像、通过比较数据库来比较描述比较表达谱的方法的专利包括但不限于美国专利号 6,308,170 和 6,228,575，其公开内容通过引用并入本文。 上文还描述了比较生物标志物水平概况的方法。 相似性可以基于相对生物标志物水平、绝对生物标志物水平或两者的组合。 在某些实施例中，使用其上存储有程序的计算机进行相似性确定，该程序被设计为接收从受试者，例如，从用户获得的生物标志物水平表示的输入，确定与一个或多个参考概况或参考得分的相似性 ，并返回KD 临床体征诊断，例如，给用户（例如，实验室技术员、医生、发热儿童等）。 下面描述本发明的计算机实现的方面的进一步描述。 在某些实施方案中，相似性确定可以基于生物标志物水平表示（例如 KD 得分）与表型确定元素范围（例如 KD 得分范围）的视觉比较，以确定最重要的参考 KD 得分 与题主相似。 根据所获得的生物标志物水平概况与之比较的表型确定元件的类型和性质，上述比较步骤产生关于被测定的细胞/体液的各种不同类型的信息。 因此，上述比较步骤可以产生 KD 发作的阳性/阴性预测、KD 的阳性/阴性诊断、KD 的表征、关于 KD 对治疗的反应性的信息等。
在其他实施例中，直接采用生物标志物水平表示，即不与表型确定元件比较，以进行 KD 预后、KD 诊断或监测 KD。
主题方法可以用于多种不同类型的主题。 在许多实施例中，受试者属于哺乳动物纲，包括食肉目（例如，狗和猫）、啮齿目（例如，小鼠、豚鼠和大鼠）、兔形目（例如，兔）和灵长类（例如，人、 黑猩猩和猴子）。 在某些实施方案中，动物或宿主，即受试者（在本文中也称为患者）是人类。
在一些实施方案中，提供 KD 评估的主题方法包括提供诊断、预后或监测结果。在一些实施例中，本公开的 KD 评估通过提供，即生成，包括技术人员评估的书面报告来提供，例如，技术人员确定患者当前是否受 KD 影响，其类型、阶段、 或受试者 KD 的严重程度等（“KD 诊断”）； 技术人员对患者发展为 KD 的易感性、疾病进展过程、患者对治疗的反应等的预测（即，技术人员的“KD 预后”）； 或技术人员对 KD 的监测结果。 因此，主题方法还可以包括生成或输出提供技术人员评估结果的报告的步骤，该报告可以以电子介质的形式提供（例如，计算机监视器上的电子显示），或以 有形媒体的形式（例如，打印在纸上或其他有形媒体上的报告）。 可以提供任何形式的报告，例如 如本领域已知的或如下文更详细描述的。
报告
如本文所述，“报告”是电子或有形文件，其包括报告元素，该报告元素提供与受试者及其结果的评估相关的信息。 在一些实施例中，受试者报告至少包括 KD 生物标志物表示，例如 KD 概况或 KD 得分，如上文更详细讨论的。 在一些实施例中，受试者报告至少包括技术人员的 KD 评估，例如 KD 诊断、作为 KD 临床征兆的 KD 预后、KD 监测分析、治疗建议等。主题报告可以完全或部分电子生成。 受试者报告还可以包括以下一项或多项：1)关于测试机构的信息； 2) 服务提供商信息； 3) 患者资料； 4）样本数据； 5) 评估报告，其中可以包括各种信息，包括 a) 使用的参考值，和 b) 测试数据，其中测试数据可以包括例如蛋白质水平测定； 6）其他功能。
该报告可以包括关于测试设施的信息以及哪些信息与进行样品收集和/或数据生成的医院、诊所或实验室相关。 样品收集可以包括获得流体样品，例如 血液、唾液、尿液等； 组织样本，例如 来自受试者的组织活检等。 数据生成可以包括测量 KD 患者与健康个体（即没有和/或没有发展为 KD 的个体）的生物标志物浓度。 该信息可以包括一个或多个相关详细信息，例如，测试设施的名称和位置、进行化验的实验室技术人员的身份和/或输入输入数据的人、进行化验的日期和时间 和/或分析、样品和/或结果数据的存储位置、测定中使用的试剂（例如，试剂盒等）的批号，等等。 通常可以使用用户提供的信息填充包含此信息的报告字段。
该报告可以包括关于服务提供者的信息，该服务提供者可以位于用户所在的医疗保健机构之外或医疗保健机构内。 此类信息的示例可以包括服务提供者的名称和位置、审阅者的姓名，以及在必要或需要时进行样本收集和/或数据生成的个人的姓名。 包含此信息的报告字段通常可以使用用户输入的数据来填充，这些数据可以从预先编写的选项中进行选择（例如，使用下拉菜单）。 报告中的其他服务提供商信息可以包括有关结果和/或解释报告的技术信息的联系信息。
报告可包括患者数据部分，包括患者病史（其可包括例如年龄、种族、血清型、之前的 KD 发作和患者的任何其他特征），以及管理患者数据，例如 识别患者的信息（例如，姓名、患者出生日期 (DOB)、性别、邮寄和/或居住地址、病历号 (MRN)、医疗机构的房间和/或床位号）、保险信息等），患者的医生或下令进行监测评估的其他卫生专业人员的姓名，如果与下令医生不同，则为负责患者护理的职员医生（例如，初级保健医生）的姓名。
报告可以包括样本数据部分，其可以提供关于在监测评估中分析的生物样本的信息，例如从患者获得的生物样本的来源（例如血液、唾液或组织类型等）、样品的处理方式（例如储存温度、准备方案）以及收集的日期和时间。 包含此信息的报告字段通常可以使用用户输入的数据来填充，其中一些可以作为预先编写的选择提供（例如，使用下拉菜单）。该报告可能包括结果部分。
报告可包括评估报告部分，其可包括在如本文所述处理数据之后生成的信息。 解释性报告可以包括对受试者将发展为 KD 的可能性的预测。 解释报告可以包括 KD 的诊断。 解释性报告可以包括 KD 的表征。 报告的评估部分还可以选择性地包括建议。 例如，在结果表明可能患有 KD 的情况下，建议可以包括改变饮食、施用血压药物等的建议，如本领域所建议的那样。
也将容易理解，报告可以包括附加元素或修改的元素。例如，在电子版的情况下，报告可以包含指向内部或外部数据库的超链接，这些数据库提供有关报告选定元素的更详细信息。 例如，报告的患者数据元素可以包括指向电子患者记录的超链接或用于访问此类患者记录的站点，该患者记录保存在机密数据库中。 后一实施例可能对住院系统或临床环境。 当采用电子格式时，报告记录在合适的物理介质上，例如计算机可读介质，例如计算机内存、闪存驱动器、CD、DVD 等。
容易理解的是，该报告可以包括上述所有或一些元素，条件是该报告通常至少包括足以提供用户请求的分析的元素（例如，计算的 KD 生物标志物水平表示 ；KD 的预测、诊断或表征）。
试剂、系统和试剂盒
还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂、系统和试剂盒。主题试剂、系统及其试剂盒可能有很大差异。 的试剂包括专门设计用于从样品中产生 KD 生物标志物的上述生物标志物水平表示的试剂，例如一种或多种检测元件，例如 用于检测蛋白质的抗体或肽、用于检测核酸的寡核苷酸等。在一些情况下，检测元件包括用于检测单个KD生物标志物的丰度的试剂； 例如，检测元件可以是试纸、板、阵列或包含一种或多种检测元件的混合物，例如 可用于同时检测一种或多种KD生物标志物的丰度的一种或多种抗体、一种或多种寡核苷酸、一组或多组PCR引物等。
一种专门为生成生物标志物水平表征而定制的试剂，例如 KD 生物标志物水平表示是特异性结合蛋白质生物标志物的抗体的集合，例如 在 ELISA 格式中，在 xMAP™ 微球格式中，在蛋白质组阵列上，悬浮液中，用于通过流式细胞术、蛋白质印迹法、斑点印迹法或免疫组织化学进行分析。 使用它们的方法在本领域中是众所周知的。 这些抗体可以在溶液中提供。 或者，它们可以预先结合到固体基质上，例如，多孔盘的孔或 xMAP 微球体的表面。
另一种类型的此类试剂是探针核酸阵列，其中代表的基因（生物标志物）。 多种不同的阵列形式是本领域已知的，具有多种不同的探针结构、底物组合物和连接技术（例如，斑点印迹阵列、微阵列等）。 的代表性阵列结构包括美国专利号 5,143,854 中描述的那些； 5,288,644； 5,324,633； 5,432,049； 5,470,710； 5,492,806； 5,503,980； 5,510,270； 5,525,464； 5,547,839； 5,580,732； 5,661,028; 5,800,992； 其公开内容通过引用并入本文； 以及WO 95/21265； WO 96/31622； WO 97/10365； WO 97/27317； EP 373203； 和 EP 785 280。
另一种类型的试剂，其专门用于生成基因的生物标志物水平表征，例如 KD 基因是基因特异性引物的集合，其设计用于选择性扩增此类基因（例如，使用基于 PCR 的技术，例如实时 RT-PCR）。 基因特异性引物及其使用方法在美国专利号 5,994,076 中有所描述，其公开内容通过引用并入本文。
特别的是探针阵列、引物集合或抗体集合，其包括探针、引物或抗体（也称为试剂），其对选自以下的至少一种基因/蛋白质/脂质具有特异性 NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT、CXCL6、CXCL16、FABP4、Endocan-1 和制瘤素 M、VEGFA、HGF、MMP-8 和 MMP-9 ，或与它们相关的特定生化底物。 主题探针、引物或抗体集合或试剂可能包括仅对上面列出的基因/蛋白质/脂质/辅助因子具有特异性的试剂，或者它们可能包括对其他基因/蛋白质/脂质/辅助因子具有特异性的试剂，这些基因/蛋白质/脂质/辅助因子不是 上面列出的，例如基因/蛋白质/脂质/辅助因子特异的探针、引物或抗体，其表达模式在本领域中已知与 KD 相关，例如 以及 NT-proBNP 和 MMP8。
在一些情况下，可以提供系统。 如本文所用，术语“系统”是指试剂集合，然而，例如通过从相同或不同来源购买试剂集合来编译。 在某些情况下，可以提供套件。 如本文所用，术语“试剂盒”是指一起提供（例如出售）的试剂的集合。 例如，样品核酸或蛋白质的基于核酸或抗体的检测可以分别与电化学生物传感器平台结合，该平台将允许对这些生物标志物进行多重测定，以实现个性化 KD 护理。
本发明的系统和试剂盒可以包括上述阵列、基因特异性引物集合或蛋白质特异性抗体集合。 系统和试剂盒还可以包括一种或多种在各种方法中使用的额外试剂，例如用于产生靶核酸、dNTP和/或rNTP的引物，其可以是预混合的或分开的，一种或多种独特标记的dNTP和/或 rNTP，例如生物素化或 Cy3 或 Cy5 标记的 dNTP，具有不同散射光谱的金或银颗粒，或其他合成后标记试剂，例如荧光染料的化学活性衍生物，酶，例如逆转录酶，DNA 聚合酶，RNA 聚合酶， 等等，各种缓冲介质，例如 杂交和洗涤缓冲液，预制探针阵列，标记的探针纯化试剂和组件，如离心柱等，信号产生和检测试剂，例如 标记二抗、链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物、化学荧光或化学发光底物等。
主题系统和试剂盒还可以包括一种或多种 KD 表型确定元件，在许多实施方案中，该元件是可以例如通过合适的实验或计算手段使用的参考或对照样品或生物标志物表示， 基于“输入”生物标志物水平概况做出KD预后，例如，其已经用上述生物标志物确定元件确定。 代表性的 KD 表型确定元素包括来自已知患有或不患有 KD 的个体的样本、生物标志物水平表示的数据库，例如，参考或对照概况或得分等，如上所述。
除了上述组分之外，主题试剂盒将进一步包括用于实施主题方法的说明。 这些说明书可以多种形式存在于主题试剂盒中，其中一种或多种形式可以存在于试剂盒中。 这些说明可以存在的一种形式是在合适的介质或基底上打印信息，例如，在其上打印信息的一张或多张纸、在试剂盒的包装中、在包装插页中等。 然而 另一种方式是计算机可读介质，例如软盘、CD 等，其上记录了信息。 可能存在的另一种方式是网站地址，可以通过互联网使用该网站地址访问已删除站点上的信息。 试剂盒中可以存在任何方便的方法。
以下实施例是通过说明而非限制的方式提供的。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供如何制作和使用本发明的描述，而不是为了限制发明人认为是他们的发明的范围，也不是 他们打算表示下面的实验是全部或唯一进行的实验。 已努力确保所用数字（例如数量、温度等）的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。 除非另有说明，份数为重量份数，分子量为重均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或接近大气压。
材料和方法
KD 患者验证队列、人口统计信息和临床标准。血液样本是从确诊的 KD 中获取的，发热对照样本是从同一队列中抽取的，但后来确定不是 KD。 KD 患者符合美国心脏协会的完全和不完全 KD 临床标准，并在首次发热后 10 天内接受 IVIG 治疗。(3) 在 IVIG或药物治疗前获取患者血液样本并在基线进行分析。
已确定血管炎和 KD 微阵列的荟萃分析。从 PBMC 微阵列实验的七个数据集中提取差异表达基因 (DEG)。 七个数据集包括 PBMC 微阵列实验分析原发性血管炎，包括 KD、来自 NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) 20:4 KD 数据集的受试者、GSE15297（KD 与FC）、GSE18606（KD 与正常对照）、GSE9864（ KD 与正常对照）； GSE9863（KD 与正常对照）；3 个其他血管炎数据集，GSE33910（Takayasu 动脉炎与正常对照），GSE17114（Bechet 病与正常对照），GSE16945（Takayasu 动脉炎与正常对照）。 在每个数据集中发现 DEG 后，执行Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 以识别与七个数据集中每个数据集中的 DEG 相关的路径。 基因生物标志物存在于至少一个数据集中的 DEG 列表中，并且涉及至少一个在七个数据集中共享的常见富集途径，构成了集体血管炎元特征。 为了识别潜在的候选生物标志物，基因制造者通过人类生物流体蛋白质组数据库进一步过滤，其中包含已知的血清和尿液可检测蛋白质，其中包含来自 HUPO 血浆蛋白质组项目的数据，一个来自血浆蛋白质组研究所的非冗余列表，MAPU 蛋白质组数据库，和尿外泌体数据库。
通过多重免疫测定平台进行生物标志物测试。来自 KD 和发热对照组的血浆是从血液中分离出来的。 分离后不久将血浆储存在 -80℃，并在分析前解冻。 这些测定是在Luminex 200 xMap IVD 平台上使用血浆对 17 种蛋白质靶标进行的，使用市售试剂盒定制添加了几种 KD 相关蛋白。 根据试剂制造商推荐的程序和稀释度进行测定，并确定了每种分析物的线性、LOQ/LOD 和浓度。
统计分析。总体研究人群包括 184 名患者，其中 91 名确诊为 KD，93 名发热控制病例。 测量每种分析物的血液浓度。 使用 Fisher 精确性别检验和年龄秩和检验在 KD患者和发热控制之间测试患者特征。 与来自发热对照的那些相比，对来自 KD 患者的个体分析物进行了单变量分析。 进行了接受者操作特征 (ROC) 分析，并确定了每种分析物的特异性、敏感性、阳性预测值 (PPV)、阴性预测值 (NPV) 和曲线下面积 (AUC) 值。Wilcoxon 秩和检验和倍数变化分析也用于将所有 KD 患者的分析物浓度值与发热对照进行比较。 使用类似的秩和检验比较确诊的 KD 诊断与发热对照的年龄差异。 为帮助统计分析，将低于 LOQ 的任何测定值外推为 LOQ 值的一半，将高于定量上限 (ULQ) 的任何分析物值外推为 ULQ 值的两倍。 这确保了低于 LOQ 或高于 ULQ 的值的更具包容性的数据。 将值设置为 LOQ 和 ULQ 都不会影响分析。 使用标准秩和检验 p 值小于 0.05、倍数变化大于 1.5 或小于 0.67 以及 AUC 大于 0.6，选择了 10 种分析物来挑选具有显著差异的分析物。
通过迭代搜索所有十种分析物组合以找到最大ROC AUC值，通过线性显著不同的分析物分析分析物浓度。 计算每种不同分析物组合的几何平均值，对几何平均值应用对数变换，然后缩放到 0 和 10 的范围，并进行 ROC 分析。 对于第一次迭代，根据单变量分析一次选择一个 AUC>0.5 的最佳分析物。 在下一次迭代期间，将每种保留分析物添加到之前的最佳 AUC 组合组中。 如果新的分析物通过最大化 AUC 提高了模型的性能，它会保留在组中，反之亦然。 重复该过程，直到达到最大 AUC，其余特征构成最终组。
KD 生物标志物组和诊断得分。然后使用样本内验证对模型进行测试，以评估接受者操作特征曲线下面积的性能。 使用最终组的几何平均值生成 KD 得分。 对于二元模型中的单个截止值，最佳截止值是使用最佳约登指数确定的。 其他操作特征，如敏感性、特异性、阳性预测值 (PPV) 和阴性预测值 (NPV) 是根据所有指标的最佳截止得分和 95% 置信区间计算的。 所有统计数据均通过 R 软件 4.1 版（R 统计计算基金会）执行。 计算了双侧 p 值，p<0.05 被认为是显著的。
结果
患者的人口统计学和特征。 本研究重点关注持续高烧的儿科人群，其中 91 例后来确诊的 KD 病例和 93 例发热儿童（表 1a）。 49 名患者有 5 个临床体征，26 名 KD 患者（28.5%）有 4 个临床体征，符合 AHA 采血时完全 KD 诊断标准（表 1b），其余 16 例诊断为不完全 在采血的时候。 确诊 KD 诊断的年龄（1.4 岁，0.9 – 3 岁）比发热对照者（2.8 岁，1.7 – 3.9 岁）年轻，p<0.001。
表1a：患者人口统计信息。患有KD的患者比热性对照组年轻一些。
表1b. 研究队列中的KD症状摘要。
荟萃分析鉴定了 KD 生物标志物的 Luminex 发现组的组合。 通过对七种血管炎和 KD 微阵列数据的荟萃分析，十三种途径重叠。 共有 82 个基因被鉴定并通过人类生物流体蛋白质组数据库进行筛选。 这导致识别出可能在血液中差异表达的 53 种血管炎特异性基因标记（元特征）（图 1）。 据报道，血管炎元特征中的 VEGF、MMP8 和 HGF 在 KD 和FC（p 值<0.0001）以及 KD 和正常对照（p 值<0.001）受试者之间的血清中差异表达。 这一观察结果提供了直接证据支持我们整体生物标志物发现方法的有效性以及我们的假设，即血管炎 PBMC 微阵列数据集的荟萃分析可以产生特定的 KD 诊断生物标志物。 这一观察结果也符合我们在应用相同方法识别新型先兆子痫生物标志物方面的成功经验。 为了将这一发现应用到一个通用平台中，根据心脏压力、免疫反应、血管生长和重塑确定了 17 种生物标志物，包括心肌功能障碍或压力标志物（NT-proBNP、BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I)、心肌缺血 (FABP3)、斑块不稳定/破裂 (LIGHT)、炎症（CXCL6、CXCL16、FABP4、Endocan-1 和制瘤素 M）以及细胞生长和迁移（VEGFA、HGF、MMP-8 和 基质金属蛋白酶-9)。
二元和风险分类模型性能。 通过单变量分析分别分析探索性发现组中每种蛋白质生物标志物的 KD 和发热对照队列的 Luminex 分析结果（表 2）。 随后，使用线性方法构建具有最大 AUC 的最佳组。 排名前四的分析物 NTproBNP、CXCL16、FABP4 和 MMP-8 通过几何平均数得出最高 AUC 为 0.946 的组合（图 2中a 和 b）。
表2. 应用Luminex多重免疫检测方法研究了17种生物标志物。这些生物标志物根据单变量分析下接受者工作特征曲线下面积进行排序。
该诊断模型具有用于诊断 KD 的稳健 AUC 0.945（图 2中a）。 AUC（ROC 曲线下面积）量化了诊断测试区分患有和未患有疾病的个体的能力。 不产生假阳性或假阴性的完美测试的 AUC 为 1.00； 在识别真阳性方面并不比随机机会更好的测试的 AUC 为 0.5。 基于使用 Youden 指数确定的 6.64 的 Kawasaki 得分（KD 得分）的最佳截止值，确定诊断截止值以优化有效 KD 诊断的灵敏度和特异性。 总人口的总体二元分类模型性能具有93.2% (87.5 – 97.7%) 的敏感性、81.3% (72.5% – 89%) 的特异性、82.8% 的阳性预测值(PPV) 和阴性预测值 预测值 (NPV) 为 92.5%（图 2中c）。
此外，还创建了基于两个阈值的量表以将患者分类为三级风险得分系统以进行有效的 KD 风险分层以帮助 KD 的临床诊断：低风险（KD 得分<6.590）， 图 3中a 的中等风险 (6.590 – 6.710) 和高风险（KD 得分>6.710）。 对于高风险 KD 组，PPV 为 86.4%，低风险 KD（发热性疾病）组的 NPV 为 93.2%（图 3中b）。 该结果表明，高风险组中 10 名患者中超过 8 名患者和低风险组中 10 名患者中少于 1 名患者为 KD 阳性（图 3中c）。 来自诊断测试的 KD 得分旨在作为一种体外诊断测试来帮助医生做出决定，尤其是对于不完全的 KD。
我们还在诊断为 KD 的研究队列中检查了冠状动脉异常与我们的 KD 得分系统的相关性。 计算个别 KD 患者的 Z 得分并将其分为三类：无冠状动脉受累（z 得分<2）、仅扩张（z 得分 2 至<2.5）和动脉瘤（z 得分>2.5）。 我们的测试捕获了高风险组中大多数患有动脉瘤的 KD 患者，24 名患者中有 18 名 (75%)，并且可以识别具有正常冠状动脉的KD 患者（图 4）。 数据还表明，我们的小组不需要明显的心脏压力信号或表型就可以被积极地识别为 KD。
我们开发了诊断组来协助诊断川崎病，ROC AUC 为 0.946。 血清学检测可准确识别 KD 患者并将其与其他发热病例区分开来。 四种分析物模型是使用基于线性几何平均数的统计模型构建的，AUC 为 0.946。 基于组合生物标志物的线性几何平均值的简单模型避免了导致验证集中过度拟合和不良预测结果的训练偏差。 该模型也更有可能从其他地区转移不同的患者群体。
我们的小组包含四种与心脏健康、炎症和细胞生长和重塑相关的血清学生物标志物，Ntpro-BNP、CXCL16、FABP4 和 MMP-8。 BNP 和 Ntpro-BNP 是由心脏合成的利钠肽。NT-proBNP 是 BNP 的裂解产物，与 BNP 一样，在血液中的含量通常很低。 当心脏承受压力时，血液中 NTproBNP 的水平会升高，升高的水平与心力衰竭有关。然而，众所周知，并非所有 KD 患者都会遭受心脏压力或损伤。 因此，NTproBNP 的增加不一定单独作为 KD 的诊断标志物。 FABP4 表达与冠状动脉粥样硬化的发展有关。 它还与心血管系统相关的炎症有关。 抑制 FABP4 表达可通过花生四烯酸-环氧合酶 2 途径减少心脏炎症反应。 最近，血液中 FABP4 水平的升高也被认为是心力衰竭的潜在生物标志物。FABP4 主要由巨噬细胞分泌，有助于动脉粥样硬化和心血管疾病的发展。 它与 CXCL16 相关，后者通过其趋化特性控制巨噬细胞的运动和定位。
该小组还可能涉及免疫系统的失调。 CXC 趋化因子家族先前已被报道在 KD 中上调。CXCL16 是一种小细胞因子和控制 T 细胞和自然杀伤 T (NKT) 细胞迁移和定位的子集。CXCL16 的上调 在 KD 患者血浆中，T 细胞和 NKT 细胞异常激活，这在自身免疫中起着至关重要的作用。 CXCL16 还控制巨噬细胞和中性粒细胞的定位和积累。 CXCL16 的下调也减轻了缺血事件后的心脏缺血再灌注损伤，这表明在川崎病中观察到的动脉损伤中起作用。
基质金属蛋白酶(MMP)调节细胞基质的重塑和降解。 先前的研究表明，特定的MMPs，如 MMP2、MMP3 和 MMP9 与冠状动脉病变和动脉瘤的易感性、严重性和进展有关。然而，研究表明，MMP9 仅在 KD 患者中显著上调患有心脏应激，但它是区分 KD 患者和其他发热性疾病的不良生物标志物。令人惊讶的是，MMP8 在 KD 和其他发热患者之间显示出显著差异。 已知 MMP8 在 LPS 刺激的中性粒细胞趋化因子和与先天免疫相关的白细胞介素加工中起关键作用。 MMP8 还在协调炎症事件中发挥作用，包括其消退。在 MMP-8 缺失小鼠中，观察到持续的炎症并且未消退，导致皮肤伤口愈合延迟。MMP8 的表达具有 最近在IVIG 耐药的 KD 患者中观察到，MMP8 的血清水平也被报道在 KD 的急性期显著升高，这与我们的小组观察结果一致。
我们的生物标志物小组表明，KD 是一种影响多种生物途径和器官系统的复杂疾病，例如自身/先天免疫失调、持续炎症反应以及由这些功能失调的信号事件引起的异常血管重塑。 通过这些分析物的组合，在 KD 高风险组中确定了最严重的 KD 冠状动脉瘤病例（23 例中的 18 例）（图 3）。 然而，当患者具有高 KD 风险得分时，大多数没有或仅具有轻度冠状动脉扩张的 KD 患者也被准确识别。
以前，一些研究旨在通过基于 LC 质谱的技术或基因微阵列方法发现特定生物标志物或包含血清学蛋白质分析物、细胞因子或基因表达谱的多重生物标志物组，以鉴定潜在的 KD 生物标志物。 最近针对三种血清学生物标志物、骨髓相关蛋白 8/14 (MRP8/14)、人中性粒细胞弹性蛋白酶 (HNE) 和 C 反应蛋白作为前瞻性生物标志物组的研究取得了高达 0.82 的 ROC AUC 值，但相对 阴性预测值差。 另一项研究使用随机森林模型组成了16 种临床可用的蛋白质，以使用分析物浓度的几何平均值和最佳约登指数来确定截止值，从而获得与我们简单的四种分析物组相似的 AUC 值。 复杂的统计模型（例如随机森林）比简单的等权重线性模型更难以解释和实施。 随机森林模型也更难将模型从原始队列转移到来自不同地区的另一个队列，这可能会限制其作为实际临床试验的实用性。
赖特等人使用微阵列数据还开发了一个 13 转录本血液基因表达特征组合，能够区分 KD 病例和发热患者。 该研究使用平行正则化回归模型搜索来区分 KD 病例。 该小组在最终验证集中实现了 0.946 的 AUC。 然而，训练和验证队列都仅使用研究生成的微阵列数据，并通过更定量的分析（例如 13 个基因的 qPCR）进一步验证基因表达数据。 需要在单独的队列中使用聚焦基因组的定量 qPCR 分析重新检查和验证该组。基因表达特征分析最近表明，由于 COVID-19 感染，KD 在儿童多系统炎症综合征中具有相似的宿主免疫反应，但没有通常相关的心脏表型。这表明基因特征主要捕获宿主免疫反应 到 KD 但不是心脏事件。 通过定量 PCR 分析，我们的血清生物标志物的基因表达是否也从全血基因表达分析中上调。
在本发明中，我们使用美国 FDA 批准的 Luminex 仪器测定结合可用的临床测定，以快速适应临床以进行 KD 诊断。 组模型还基于生物标志物的几何平均值，其性能优于常用的机器学习算法，显著提高了模型在队列之间的可移植性，而不会过度拟合数据。如果通过现有方式处理数据，复杂的统计模型或 AI 机器学习算法通常会发生过度拟合。KD是美国食品和药物管理局认定的一种罕见孤儿病，KD 最重要的医疗需求是患有不完全 KD并且经常被误诊为其他发热性疾病的患者，如果在发烧开始后的十天内不进行 IVIG 治疗，则这些患者在以后的生活中出现心脏事件的可能性要高得多。本发明提供的KD 诊断测试方法与当前可用的临床测试和标准统计算法一起部署，可以显著提高 KD 诊断速度和准确性。

Claims (44)

1.用于测量以下川崎病生物标志物组的川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的试剂盒中的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8和CXCL16，所述确定受试者川崎病生物标志物水平呈现的方法包括：
a. 评估来自受试者的样品中的一组川崎病生物标志物浓度，所述样品为血液、血清或血浆，以确定样品中每个川崎病生物标志物的水平；
b. 基于组中每个川崎病生物标志物的水平获得川崎病生物标志物的水平表示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，测量每个川崎病生物标志物的完整蛋白质水平。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组还包括BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT、CXCL6、ST2、OSM、VEGFA、HGF和MMP-9中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16和HGF。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF和LIGHT。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT和OSM。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT、OSM和ST2。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，进一步包括提供川崎病生物标志物水平呈现的报告。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物水平呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：
a. 通过几何平均值、多元线性判别分析或分布式梯度提升决策树机器学习，从测量的血液生物标志物的值导出；或
b. 是每个生物标志物水平的乘积，归一化以适应0-10的等级，通过以下公式导出：[生物标志物1]×[生物标志物2]×[生物标志物3]×……×[生物标志物n]/[标准化因子]×10 =川崎病得分。
10.用于测量以下川崎病生物标志物组的川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于对受试者提供川崎病诊断的试剂盒中的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8和CXCL16，所述用于对受试者提供川崎病诊断的方法包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物的水平表示。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，测量每种川崎病生物标志物的完整蛋白质水平。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述组还包括BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT、CXCL6、ST2、OSM、VEGFA、HGF和MMP-9中的一种或多种。
13.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16和HGF。
14.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF和LIGHT。
15.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT和OSM。
16.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT、OSM和ST2。
17.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，进一步包括提供川崎病生物标志物水平呈现的报告。
18.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物呈现导出川崎病得分，其中所述川崎病得分：
a. 通过几何平均值、多元线性判别分析或分布式梯度提升决策树机器学习，从测量的血液生物标志物的值导出；或
b. 每种生物标志物的水平的乘积，归一化以适应0-10的等级，通过以下公式导出：[生物标志物1]×[生物标志物2]×[生物标志物3]×……×[生物标志物n]/[标准化因子]×10 =川崎病得分；
当没有足够的临床症状来确认川崎病诊断时，川崎病得分大于阈值，确认川崎病。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，还包括选择疑似患有川崎病的患者用于静脉注射免疫球蛋白治疗，包括：
a. 确定患者的川崎病得分，
b. 根据所述的方法诊断患者，并且如果患者确诊川崎病，则选择患者进行IVIG给药。
20.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，还包括监测对患有川崎病的患者的川崎病治疗效果，包括：
a. 确定患者的川崎病得分，
b. 根据所述的方法诊断患者，并在如果患者确诊川崎病，则选择患者进行IVIG给药，以及
c.有效的治疗将导致川崎病得分下降。
21.用于测量以下川崎病生物标志物组的川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于受试者川崎病风险评估的试剂盒中的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8和CXCL16，所述用于受试者川崎病风险评估的方法，包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物的水平表示。
22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，测量每种川崎病生物标志物的完整蛋白质水平。
23.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述组还包括BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT、CXCL6、ST2、OSM、VEGFA、HGF和MMP-9中的一种或多种。
24.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16和HGF。
25.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF和LIGHT。
26.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT和OSM。
27.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT、OSM和ST2。
28.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，进一步包括提供川崎病生物标志物水平呈现的报告。
29.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物的呈现以两种方式导出川崎病得分以及诊断的截止值：
a. 通过几何平均值、多元线性判别分析或分布式梯度提升决策树机器学习，从测量的血液生物标志物的值导出；
b. 或者将每种生物标志物的水平相乘，归一化以适应0-10的等级，通过以下公式导出：[生物标志物1]×[生物标志物2]×[生物标志物3]×……×[生物标志物n]/[标准化因子]× 10 =川崎病得分；
对于川崎病风险评估，川崎病得分在三个不同范围内评估患川崎病的风险，以确定患川崎病的风险；低于低得分截止值的低川崎病风险表明患者患川崎病的风险较低；
高于高得分截止值的高川崎病风险表明患者患川崎病的风险较高；
在低和高川崎病得分截止值之间的得分表明中间的川崎病风险。
30.根据权利要求29所述的用途，其特征在于，还包括选择疑似患有川崎病的患者用于静脉注射免疫球蛋白治疗，包括：
a. 确定患者的川崎病得分，
b.如果患者的川崎病得分在高风险范围和中等风险范围内，则选择患者进行IVIG给药。
31.根据权利要求29所述的用途，其特征在于，还包括监测对患有川崎病的患者的川崎病治疗效果，包括：
a. 确定患者的川崎病得分，
b. 如果患者的川崎病得分在高风险范围和中等风险范围内，则选择患者进行IVIG给药， 以及
c. 有效的治疗将导致川崎病得分下降。
32.用于测量以下川崎病生物标志物组的川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于为受试者提供川崎病治疗监测的试剂盒中的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8和CXCL16，所述用于为受试者提供川崎病治疗监测的方法，包括获得来自受试者的样品的川崎病生物标志物水平表示。
33.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，测量每个川崎病生物标志物的蛋白质水平。
34.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，所述组还包括BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT、CXCL6、ST2、OSM、VEGFA、HGF和MMP-9中的一种或多种。
35.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16和HGF。
36.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF和LIGHT。
37.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，所述组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT、OSM和ST2。
38.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，所述组包括生物标志物NT-proBNP、FABP4、MMP-8、CXCL16、HGF、LIGHT、OSM和ST2。
39.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，进一步包括提供川崎病生物标志物水平呈现的报告。
40.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物呈现以两种方式导出川崎病得分以及诊断的截止值：
a. 通过血液生物标志物的值的几何平均数、多元线性判别分析或分布式梯度增强决策树机器学习，从测量的血液生物标志物的值导出；或
b. 通过每个生物标志物的水平的乘积，归一化以适合0-10的等级，通过以下公式导出：[生物标志物1]×[生物标志物2]×[生物标志物3]×……×[生物标志物n]/[标准化因子]× 10 =川崎病得分；
对于川崎病治疗监测，川崎病得分最初应该大于阈值；治疗后，川崎病得分应显著降低，低于阈值。
41.用于测量以下川崎病生物标志物组的川崎病生物标志物的量的检测试剂在制备用于川崎病样品测定的试剂盒中的用途，其特征在于，所述川崎病生物标志物组包括NT-proBNP、FABP4、MMP-8和CXCL16，所述用于川崎病样品测定方法包括川崎病样品测定的处理过程，以保留必要的数据，包括：
a. 测量从疑似患有川崎病的患者采集的血液、血浆或血清样品中的生物标志物组中的每个生物标志物浓度，
b. 将每个生物标志物的测量值与对照受试者的每个生物标志物的参考值进行比较，其中差异表达表明患者患有川崎病；该测定进一步包括根据患者的这些生物标志物浓度确定川崎病得分。
42.根据权利要求41所述的用途，其特征在于，所述组还包括BNP、CK-MB、Endocan-1、PlGF、心肌肌钙蛋白I、FABP3、LIGHT、CXCL6、ST2、OSM、VEGFA、HGF和MMP-9中的一种或多种。
43.用于测量以下靶向生物标志物的抗体的量的检测试剂在制备用于计算川崎病得分的试剂盒中的用途，其特征在于，所述抗体特异性结合到所述生物标志物或含有生物标志物抗原决定簇的生物标志物片段上，所述抗体包括特异性结合到NT-ProBNP的抗体、特异性结合到FABP4的抗体、特异性结合到MMP-8的抗体和特异性结合到CXCL16的抗体；并且所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、抗体的重组片段。
44.根据权利要求43所述的用途，其特征在于，所述抗体还包括特异性结合到HGF的抗体、特异性结合到LIGHT的抗体、特异性结合到OSM的抗体和特异性结合到ST2的抗体。
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