CN105849566B - 肾脏疾病生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于患者慢性肾病检测和分期的方法及固态装置，其中，与健康个体样品中的生物标志物水平相比，患者样品中的生物标志物的水平有所提高或降低。本发明还涉及所述方法和固态装置的应用，用于测定特定生物标志物，进而用于判断慢性肾病的治疗效果和确定慢性肾病患者的药物治疗方案。

Description

肾脏疾病生物标志物
技术领域
本发明涉及肾脏疾病及其诊断方法。
背景技术
肾脏疾病是一个通用术语，用于描述一类肾脏不能过滤和除去血液中废弃产物的病情。有两种类型的肾脏疾病：急性肾损伤(AKI)和慢性肾病(CKD)。CKD通常是无症状的，除非是在其最晚期的状态。因此，通常需要进行血液和/或尿液检查做出诊断。
由肾脏疾病预后质量倡议(Kidney Disease Outcomes Quality Initiative,KDOQI)提出的CKD定义是：
1.肾脏损伤持续至少三个月，肾脏损伤指肾脏结构或功能异常(通常白蛋白尿如尿白蛋白/肌酐比升高[UACR]≥30mg/g)，和/或
2.肾小球滤过率(GFR)<60mL/min/1.73m2持续至少三个月。
在这一框架内，KDOQI将CKD分为五期，分别如下：
1期：肾脏损伤伴随GFR≥90mL/min/1.73m2；
2期：肾脏损伤伴随GFR 60-89mL/min/1.73m2；
3期：GFR 30-59mL/min/1.73m2；
4期：GFR 15-29mL/min/1.73m2；
5期：GFR<15mL/min/1.73m2或肾衰竭，通过透析或移植治疗。
根据1999-2006年国家健康与营养调查(NHANES)研究的数据，在美国，估计有11.1％(2240万)的20岁或20岁以上的成年人患有CKD 1-3期。还有80万20岁或20岁以上的成年人患有CKD 4期，有超过30万的人患有CKD 5期并接受血液透析。
对1988-1994年和1999-2004年NHANES数据的分析表明，CKD每期的患病率都在上升，尤其是CKD 3期的个体患病率有所增加。CKD 5期且需要透析的患者的数量也有所增加。据估计，到2015年，将会有超过700,000的个体患有终末期肾病(ESRD)。
虽然CKD可能是由原发性肾病(如肾小球疾病、肾小管间质疾病，梗阻和多囊性肾病)引起的，但是在绝大多数CKD患者中，肾脏损伤与糖尿病和高血压等其他病症有关。2008年，除了ESRD患者，48％的患有CKD的医保患者患有糖尿病，91％患有高血压，并且46％患有动脉粥样硬化性心脏病。其他CKD的危险因素包括年龄、肥胖、家族史和种族。
CKD与许多不良健康后果有关。许多研究已经报道了GFR 30-59mL/min/1.73m2与死亡率、心血管疾病、骨折、骨质疏松、感染、认知障碍和虚弱的风险增加有关。类似地，蛋白尿(proteinuria)或白蛋白尿(albuminuria)的严重性和不良健康后果(包括死亡、ESRD和心血管疾病)之间表现出梯度关系。而且，因GFR减少和白蛋白尿(或蛋白尿)升高引起的不良后果风险呈现出独立的和倍增的。
考虑早期CKD筛查的理由包括：CKD患病率高且不断增加，已知的危险因素，许多不良健康后果，长期无症状，可提供潜在的CKD筛查试验，以及可提供可能改变早期CKD的进程、减少早期CKD的并发症或与其相关的健康病症的治疗。
一些组织已经建议对选定的人群进行CKD筛查。改善全球肾脏病预后组织(KidneyDisease:Improving Global Outcomes,KDIGO)建议所有患有高血压、糖尿病或心血管疾病的患者进行筛查。基于“专家共识或临床经验”，美国糖尿病协会建议所有成年糖尿病患者每年进行筛查。美国预防、检测、评估与治疗高血压全国联合委员会(JNC7)建议所有糖尿病合并高血压的患者每年进行筛查。并且为提倡选择性筛查，美国肾脏病基金会赞助所有成年高血压、糖尿病患者或其主要亲属中有肾脏疾病、高血压或糖尿病史的成年人免费进行CKD筛查。
大多数CKD 1-3期患者的GFR下降缓慢。但是，个体间的下降速率有所不同，许多因素会影响其进程。因为CKD 1-2期通常无症状，早期CKD的检查需要进行实验室测试。
一些组织机构建议监测CKD患者的肾脏功能变化或损伤情况。例如，肾脏疾病预后质量倡议(KDOQI)建议成年CKD患者至少每年进行GFR预估测量，从而预测ESRD的发病以及评价CKD治疗的效果。JNC7建议所有患有“肾脏疾病”的患者每年进行白蛋白尿的定量测量。KDOQI还建议当CKD患者出现肾功能恶化时，则需更频繁地监测。
尽管测量血清或尿液中的CKD临床参数极为重要，但很少有用于早期CKD检测以及疾病进程监测的诊断测试。GFR的测量对肾脏疾病的早期检测不够敏感，尿蛋白的测量不是肾脏疾病特有的，也不适用于监测该疾病的进程。因此，早期CKD诊断和肾脏疾病分期需要有一个特异、敏感的临床标志物或标志物的组合。
发明内容
本发明提供了肾脏疾病的诊断方法。更具体地，本发明提供了用于CKD早期诊断和分期的生物标志物。
基于发明者惊人的发现：与对照个体血清相比，可检测到CKD 1期、CKD 2期和CKD3期患者的血清中个别生物标志物水平发生变化。与对照个体血清相比，CKD 1期、CKD 2期和CKD 3期患者的血清中检测到水平变化的生物标志物包括：补体C3a desArg(C3adesArg)、白介素8(IL-8)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP 1α)、脂联素(ADPN)、二肽基肽酶4(CD26)、肌酐、C反应蛋白(CRP)、胱抑素C(CYSC)、D-二聚体、内皮生长因子(EGF)、E-选择素(ESEL)、脂肪酸结合蛋白1(肝脂肪酸结合蛋白；FABP1或LFABP)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、细胞间粘附分子1(ICAM1)、干扰素γ(IFNγ)、白介素10(IL10)、白介素15(IL15)、白介素1α(IL1α)、白介素1β(IL1β)、白介素2(IL2)、白介素4(IL4)、白介素5(IL5)、白介素6(IL6)、L-选择素(LSEL)、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、P-选择素(PSEL)、可溶性白介素2α(sIL2α)、可溶性白介素6受体(sIL6R)、可溶性肿瘤坏死因子受体1(STNFR1)、可溶性肿瘤坏死因子受体2(STNFR2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、血管内皮生长因子(VEGF)和血管细胞间粘附分子1(VCAM1)。
第一方面，本发明提供了一种对象肾脏疾病的检测方法，所述方法包括测量从对象采集的样品中的生物标志物的量，并与正常对照比较，判断所述生物标志物的量是否发生变化，其中所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。
第二方面，本发明提供了一种包含基板的固态装置，所述基板包含与生物标志物结合的抗体，所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。
第三方面，本发明提供了一种慢性肾病治疗效果的判断方法，所述方法包括测量从接受所述治疗的对象采集的样品中的生物标志物的量，并与从未接受治疗的对照采集的样品的生物标志物水平相比较，从而判断所述治疗是否有改变生物标志物水平的效果，其中所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。
第四方面，本发明提供了一种慢性肾病治疗效果的判断方法，所述方法包括测量从接受所述治疗的对象采集的样品中生物标志物的量，并与从接受治疗前的所述对象采集的样品中的生物标志物水平相比较，其中，若治疗后，慢性肾病分期降低或不变或者慢性肾病进程减缓，表明所述治疗已经成功，其中所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。
第五方面，本发明提供了一种慢性肾病患者的药物治疗方案的确定方法，所述方法包括比较从接受所述药物治疗的对象采集的样品和从未接受治疗的对照采集的样品中的生物标志物水平，从而确定所述药物是否有改变所述生物标志物水平的效果，并根据所述对象是否患有1期、2期或3期慢性肾病，选择一种药物治疗方案，其中所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。
第六方面，本发明提供了一种试剂盒的应用，该试剂盒用于本发明的前述任一方面提及的方法中筛查肾脏疾病，所述试剂盒包括与生物标志物特异性结合的探针，所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组；或通过免疫检测或1D或2D凝胶电泳来检测生物标志物水平时用到的试剂，所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、FABP1、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。
附图说明
本发明将参考附图进行说明：
图1示出箱线图，概括了健康对照者、CKD 1期或2期患者和CKD 3期患者的血清样品中C3a desArg水平；
图2示出箱线图，概括了健康对照者、CKD 1期或2期患者和CKD 3期患者血清样品中MIP 1α水平；
图3示出箱线图，概括了健康对照者、CKD 1期或2期患者和CKD 3期患者血清样品中STNFR1水平；
图4示出箱线图，概括了健康对照者、CKD 1期或2期患者和CKD 3期患者血清样品中STNFR2水平；
图5示出箱线图，概括了健康对照者、CKD 1期或2期患者和CKD 3期患者血清样品中IL-8水平；
图6示出箱线图，概括了健康对照者、CKD 1期或2期患者和CKD 3期患者血清样品中EGF水平；
图7示出箱线图，概括了健康对照者、CKD 1期或2期患者和CKD 3期患者血清样品中肌酐水平；
图8示出包含每一种生物标志物的所有组合的汇总的AUC值，用以将对照者和1期、2期和3期慢性肾病患者区分；
图9示出包含每一种生物标志物的所有组合的汇总的AUC值，用以将1期或2期慢性肾病患者和对照者区分；
图10示出包含每一种生物标志物的所有组合的汇总的AUC值，用以将3期慢性肾病患者和对照者区分；和
图11示出包含每一种生物标志物的所有组合的汇总的AUC值，整体区分所有三组患者(对照、1/2期、3期)。
具体实施方式
本发明提供了一种肾脏疾病的检测方法，该方法通过测定患者样品中的生物标志物的水平，并与对照水平相比较，所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。与对照相比，样品中的生物标志物水平发生变化，则表明患者患有肾脏疾病或有发病的风险。
在本发明背景下，术语“肾脏疾病”是指，与正常人相比，以肾功能下降为特征的病症或疾病。肾脏疾病可能包括慢性肾病(CKD)、急性肾损伤(AKI)、糖尿病性肾病，肾小球肾炎、局灶性肾小球硬化症、免疫复合物性肾病或狼疮性肾炎。肾脏疾病可能由药源性肾损伤或肾移植排斥反应引起。肾脏疾病可能表现为肾病综合征或肾功能不全。
生物标志物的“量”指的是样品中生物标志物的数量、表达水平或浓度。生物标志物的量也可以指用与一种或多种其他分析物量的比例或百分比表示的生物标志物的量度。所述一种或多种其他分析物的量可以在大多数样品或病症中保持一致。举例来说，所述其他分析物可能是白蛋白、β-肌动蛋白或总基质蛋白。
生物标志物的量也可以指用与一种或多种其他分析物的量的比例或百分比表示的生物标志物的量度，其中所述一种或多种其他分析物的量的提出对有关的临床病症存在一定的生化意义。
术语“探针”是指一种可与靶分子特异性结合的分子，由于特异性结合，所述靶分子可以被检测出。本发明中使用的探针包括，例如，抗体、适配子和寡核苷酸。
术语“抗体”是指一种免疫球蛋白，其可特异性识别靶抗原上的表位，所述识别由重链和轻链(VHS和VLS)的免疫球蛋白可变区的结合特性决定，更具体地说，由互补决定区(CDRs)的结合特性确定。许多潜在的抗体形式在本领域是已知的，可能包括但不限于：多个完整的单克隆抗体或包含完整的单克隆抗体的多克隆混合物、抗体片段(如Fab、Fab’和Fv片段，包含抗体片段的多特异性抗体和线性单链抗体)、单链可变片段(scFvS)、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和融合蛋白，其包含识别靶抗原上给定的表位所必需的结构域。优选地，在本发明背景下引用的抗体指的是单克隆抗体。抗体也可以与各种可检测的标记偶联从而使检测成为可能，这些标记包括但不限于放射性核素、荧光探针、染料或酶类，例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶等。
术语“适配子”是指寡核苷酸分子或多肽分子，其可与靶分子特异性结合。寡核苷酸适配子可以是核苷酸(RNA)或脱氧核苷酸(DNA)，通常由短链寡核苷酸组成。多肽适配子通常由短肽结构域组成，所述短肽结构域可以附到蛋白骨架的一端或两端。
术语“特异性结合”，在抗体-表位相互作用的背景下，指的是一种相互作用，其中，与抗体或表位中的任意一个被替代物，如非相关蛋白质，所代替的情况相比，所述抗体和表位的结合更频繁或更快，或持续时间更长或存在更大的亲和力，或以上述的任一方式的组合结合。通常，但不是必然地，提及的结合指的是特异性识别。此外，应当理解的是，一种抗体可以特异性识别一种以上的抗原。本领域中已知的通过单克隆抗体测定靶的特异性结合或其缺失的技术包括但不限于：FACS分析、免疫细胞化学染色法、免疫组织化学、蛋白质印迹法/斑点印迹法、ELISA和亲和层析。作为示例而不是限制，特异性结合或其缺失可以通过有对照的对比分析来测定，所述对照包含本领域中已知可特异性识别所述靶的抗体，和/或不特异性识别或最小限度地特异性识别所述靶的对照(例如，所述对照包含非特异性抗体的使用)。所述对比分析可以是定性或定量分析。但是，应当理解的是，据报道，与抗体，例如同时特异性识别给定靶和同源蛋白质的抗体相比，专门地特异性识别所述给定靶的抗体或结合部分对所述靶有更高的特异性。
在本发明背景下，“对照值”是指特定生物标志物在健康个体中通常发现的水平，这些生物标志物包括C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1等。生物标志物的对照水平可以通过分析测定健康个体样品或可以是技术人员认可的健康个体的生物标志物的一般水平。“对照值”可以是技术人员认可的健康个体的生物标志物正常水平的数值范围。本领域技术人员可以理解的是，生物标志物的对照值可以通过用户分析健康个体样品中的生物标志物水平来计算，或通过引用制造商所提供的用于确定样品中生物标志物水平的常见值来计算。
优选地，从患者分离的样品是血清样品，但也可以是血液、血浆、尿液或唾液(特别指的是唾液肌酐)。生物标志物水平的测定可以是对患者的一个或多个样品进行测定。患者样品可以用本领域中常用方法采集。
本发明人已经发现，通过检测样品中生物标志物水平的变化，可用于鉴别CKD患者或对该病的进程分期，所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。因此，本发明可以用于早期CKD诊断。在本发明背景下，“早期”指的是KDOQI分类定义的CKD 1期或2期。
在第一方面，本发明提供了一种鉴别CKD患者或对CKD进程进行分期的方法，该方法包括测量对象样品中生物标志物的量，并与正常对照相比，判断所述生物标志物的量是否发生变化，其中所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。生物标志物的对照值范围可能因人口统计和被测样品的不同而变化。举例来说，健康个体的血液样品与尿液样品的对照值范围可能有所不同。某个样品和病人人口统计的上限和下限，可以由本领域技术人员通过分析一个患者群的样品找到平均值来确定。下述表1列出了对照患者和CKD患者的每种生物标志物的水平。
在另一方面，本发明提供了一种鉴别处于不同分期的CKD患者或对CKD的进程进行分期的方法，所述方法包括测量一个或多个样品中的两种或以上的生物标志物的量，并判断与正常对照相比所述生物标志物的量是否发生变化，其中所述两种或以上的生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。
诊断方法的准确性最好是由其受试者工作特征(receiver-operatingcharacteristics,ROC)来描述(Zweig,M.H.和Campbell,G.，临床化学39(1993)561-577)。ROC曲线图是所有灵敏度/特异性的图，所述灵敏度/特异性对是通过在观察到的整个数据范围内不断变化判定阈值而得到的。ROC曲线图通过绘制完整判定阈值范围内的灵敏度与1-特异性曲线示出了两个分布间的重叠部分。y轴是灵敏度，或是定义为[(真阳性测试结果数)/(真阳性+假阴性测试结果数)]的真阳性率。在疾病或病症情况中，这也被称为阳性。它仅由受影响的子群计算得到。x轴是假阳性率，或是1-特异性[定义为：(假阳性结果数)/(真阴性+假阳性结果数)]。这是特异性的一个指标，并完全由未受影响的子群计算得到。因为真、假阳性率是通过两个不同子群的测试结果而完全独立地计算地，ROC曲线图与样品中的患病率无关。ROC曲线图中的每一个点表示与一个特定判定阈值对应的一个灵敏度/特异性对。一个具有优秀鉴别力的测试(两个结果的分布没有重叠)的ROC曲线图穿过左上角，其中真阳性率为1.0或100％(完美的灵敏度)，并且假阳性率为0(完美的特异性)。一个没有鉴别力的测试的理论图(两个群的结果分布相同)是一条从左下角到右上角的45°斜线。大多数曲线图落在这两个极端之间。定性地，曲线图离左上角越近，测试的整体准确性越高。
将实验室测试的诊断准确性量化的一个目的是用单个数字来表示实验测试的表现。最常见的全球计量是ROC曲线图中的曲线下面积(AUC)。ROC曲线下面积是一种概率的度量，使病症的正确鉴别成为可能。按照惯例，这个面积通常大于0.5。数值范围在1.0(两个群的测试数值完全分离)和0.5(两组测试数值之间没有明显的分布差异)之间。此面积不仅依赖于曲线图的某一特定部分，比如最接近斜线的点或特异性为90％的灵敏度，而取决于整个曲线图。这定量地、描述性地表达了ROC曲线图与完美曲线(面积＝1.0)的相近程度。在本发明的背景下，表2列出了个别生物标志物的AUC值，其中生物标志物水平的变化被用于鉴别CKD患者或对CKD的进程的分期。
根据本发明，当使用两种或以上的生物标志物时，可以推导出合适的数学或机器学习分类模型，如逻辑回归方程。熟练的统计学家明白这样一个合适的可能包含病人的年龄和性别等变量的模型是如何推导出的。ROC曲线可用于评估模型的准确性，模型可独立使用或用于算法中以辅助制定临床决策。在本发明的背景下，尽管逻辑回归方程是此种情况下常用的数学/统计学过程，是本发明的一种选择，也会用到其他的数学/统计学、决策树或机器学习过程。技术人员会理解将针对某一给定人群生成的模型应用到不同人群或患者群获取的数据集时，模型可能需要调整。
本发明人进一步发现，检测两种或以上的生物标志物组合水平的变化可以用于鉴别CKD患者或用于对该疾病进程分期，所述两种或以上的生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。在本发明的背景下，表3列出了两种或以上的生物标志物组合的AUC值，其中变化的生物标志物水平被用于鉴别CKD患者或对CKD进程的分期，所述生物标志物组合的AUC值大于任何一个单独的生物标志物的AUC值。
另一方面，本发明提供了一种方法来支持对疑似患有肾脏疾病的患者的治疗干预有影响的决定，该方法包括测量从对象采集的样品中生物标志物的量，并与正常对照相比判断所述生物标志物的量是否发生变化，其中所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组，并且基于测量的生物标志物的量，减少或影响治疗干预。
由医生给出影响治疗干预的决定，并且所述干预用于抵抗肾脏疾病。治疗干预可能包括一种或多种成人干细胞治疗、移植治疗、透析、饮食管理、运动或药物治疗。药物治疗可以选自由利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、β-肾上腺素能拮抗剂、α-肾上腺素能拮抗剂、钙通道拮抗剂、他汀类药物、促红细胞生成素、维生素D、维生素C、维生素B、叶酸、降尿酸药、磷酸盐结合剂、钾结合树脂、免疫抑制剂和钙补充剂组成的组。
所述生物标志物的测量步骤可以被替换为测量一种免疫复合物，该免疫复合物由加入患者样品的可以与生物标志物特异性结合的抗体形成。抗体与所述生物标志物结合形成一种免疫复合物，其可以利用现有技术中已知的标准技术进行检测和测量。
表1列出了血清中每种生物标志物的测量水平。为免产生疑义，C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、ICAM1、IL10、IL1β、IL5、IL6、MCP1、MMP9、NGAL、PSEL、sIL2α、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1的表达水平的增加(与健康未患病对照相比)表明患有1期或2期慢性肾病或有患该病的风险。C3a desArg、IL-8、MIP1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IL10、IL15、IL1β、IL5、IL6、MCP1、MMP9、NGAL、PSEL、sIL2α、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1的表达水平的增加(与健康未患病对照或1期或2期慢性肾病患者相比)表明患有3期慢性肾病或有患该病的风险。肌酐、IL4、LSEL或NSE的表达水平的降低(与健康未患病对照相比)表明患有1期或2期慢性肾病或有患该病的风险。IL1α、IL4或NSE的表达水平的降低(与健康未患病对照或1期或2期慢性肾病患者相比)表明患有3期慢性肾病或有患该病的的风险。
表2列出了单个生物标志物的AUC值，其中生物标志物的水平的变化被用于鉴别CKD患者或对CKD进程分期。数据表明单个生物标志物的AUC值可用于区分健康对照者和慢性肾病患者(对照v CKD)、区分健康对照者和1期或2期慢性肾病患者(对照v 1/2期)、区分健康对照者和3期慢性肾病患者(对照v 3期)和区分健康对照者、1期或2期慢性肾病患者和3期慢性肾病患者(总体)。
表3列出了两种或以上的生物标志物组合的AUC值，其中生物标志物的水平变化可用于鉴别CKD患者或CKD进程的分期。数据表明生物标志物组合的AUC值被用于区分健康对照者和慢性肾病患者(对照v CKD)、区分健康对照者和1期或2期慢性肾病患者(对照v 1/2期)、区分健康对照者和3期慢性肾病患者(对照v 3期)以及区分健康对照者、1期或2期慢性肾病患者和3期慢性肾病患者(总体)。
表1
血清中生物标志物水平总结
Figure BDA0001010589120000111
Figure BDA0001010589120000121
表2
在CKD的诊断和分期中，变化的单个生物标志物水平的AUC值
Figure BDA0001010589120000131
表3
在CKD的诊断和分期中，变化的两种或以上的生物标志物组合水平的AUC值
Figure BDA0001010589120000141
依据CKD分期将患者分类，可用于评估，与其他治疗类型相比，患者是否会受益于一种治疗类型，并且可以用于监测治疗是否成功。患者的分类还有助于确定患者的预后，从而可满足未来护理需求。
本发明中的方法可以采用本领域已知的方法，如基于酶和/或化学蛋白质测定或免疫检测的方法，测定C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1的水平。用于测定C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1水平的免疫检测，有多种检测方式，包括夹心法检测如(ELISA)、竞争性检测(竞争性RIA)、桥梁免疫检测、免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学(ICC)。用于测定C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1水平的方法，包括：使患者样品与抗体接触，所述抗体与C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1结合，并检测所述结合。对C3a desArg、IL-8、MIP1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1有特异性的抗体可以通过常规方法固定在支撑材料上。C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1与支撑物上的抗体的结合，可以利用另外的对C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1有特异性或反应性(可能对于生物标志物或其他有识别能力的分析物)的抗体进行检测，或通过表面等离子体共振(Biacore Int,Sweden)等物理方法进行检测。
优选地，固态装置可以用于测定患者样品中的一种或多种生物标志物水平，所述一种或多种生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1组成的组中。所述固态装置包含一个具有活化表面的基板，将C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1的抗体涂敷在所述活化表面的不连续的区域。优选地，所述固态装置可以进行多分析物检测，从而可以同时测定患者样品中的C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1的水平，和样品中的C3a desArg、IL-8、MIP1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1中的任何其他生物标志物的水平。在此实施例中，所述固态装置具有许多个不连续的反应位点，每一个反应位点存在一个所需的抗体，所述抗体通过共价键结合到所述基板上，并且相对于目标生物标志物，所述反应位点之间的基板表面是惰性的。因此，本发明中的固态、多分析物装置可能表现出很少或没有非特异性结合。
本发明中可用的装置可以通过以下步骤制备：将合适基板的表面活化，并将一系列抗体涂敷到所述表面的不连续位点上。合适的基板由塑料、陶瓷或玻璃等惰性材料制成。如果需要，其他活性区域可以被封闭。配位体可以通过连接子等结合到所述基板上。特别地，优选地，所述活化表面依次与有机硅烷、双官能团连接子和抗体反应。用于本发明方法中的所述固态装置可以根据，如GB-A-2324866(其中的内容在此整体引用)所公开的方法制造。优选地，本发明方法中用到的固态装置是一个生物芯片，是生物芯片阵列技术系统(BAT)(朗道实验诊断有限公司提供)的一部分。
本发明方法用到的固态装置包含C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1的抗体。优选地，所述抗体特异于C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1，并且与其他抗原的交叉反应性小于0.5％，最好是小于0.1％。优选地，所述抗体是单克隆抗体。本发明方法中用到的固态装置可以利用朗道实验诊断有限公司的BAT分析器进行处理。
本发明还提供了从对象分离得到的样品中的两种或以上的生物标志物的量的检测方法，其中所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF和VCAM1组成的组。本发明中的检测方法可以用于测量样品中的三、四、五、六、七种或以上的所述生物标志物组合的水平。所述检测方法可以利用本发明中的所述固态装置进行，并且可以用于本发明中的方法中。
本发明中的方法可以用于术后监测患者，以评估患者肾脏并发症患病的风险。特别地，手术后，间隔一定的时间采集患者样品，并测定样品中的任何一种或多种生物标志物的水平，所述生物标志物选自由C3a desArg、IL-8、MIP 1α、ADPN、CD26、肌酐、CRP、CYSC、D-二聚体、EGF、ESEL、FABP1、GMCSF、ICAM1、IFNγ、IL10、IL15、IL1α、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、LFABP、LSEL、MCP1、MMP9、NGAL、NSE、PSEL、sIL2α、sIL6R、STNFR1、STNFR2、TNFα、VEGF或VCAM1组成的组。对特定时间段内的一种或多种生物标志物水平的评估，为临床医生提供了患者是否患有早期CKD的指示以及是否可以采取相应的医疗干预的指示。
实施例
利用本领域中已知的方法，通过静脉穿剌术采集376名慢性肾病患者和211名健康对照的血清样品，并储存于-80℃以备用。利用KDOQI指南对患者的CKD进行分期，并且因为早期肾脏疾病难于用常规基于生物标志物的方法进行测定，为了便于分析，CKD 1期和2期的患者统称为肾脏疾病早期患者。
所述样品组包括：
总共587个血清样品
271个CKD 1/2期患者
105个CKD 3期患者
211个供体对照。
采用利用生物芯片阵列技术(BAT)的免疫检测测定样品中的生物标志物(不包括肌酐)水平。利用市售的临床化学检测(产品号CR3814；朗道实验诊断有限公司)测量肌酐，在RX Daytona(由朗道实验诊断有限公司提供)上分析样品。
协议说明
出具报告时，数据用各自的检测单位表示，并且分析之前不使用任何的标准化技术。首先通过常规的单变量非参数测试分析数据。表1报告了每个分析物的中位数和5-95％的值。在多重比较(对照vs 1/2期，对照vs 3期，1/2期vs 3期)时，利用具备Bonferroni校正的曼-惠特尼U检验确定重要性。对此数据进行受试者工作特征(ROC)分析，并测定曲线下面积用于区分：所有的CKD患者(1/2/3期)与健康对照，1/2期与健康对照，3期与健康对照；和用于区分健康对照、1/2期和3期(总体)。这些AUC值总结在表2中。
采用两种方法确定生物标志物的潜在组合是否可能具有改善的诊断和分级性能。第一种方法采用了逻辑回归，利用该群的一个子集建立一个模型，用以区分CKD患者和健康对照。利用反向进入选择需要的最优变量。利用一个验证子集验证所述模型，利用逻辑回归方程计算CKD的预测概率，随后进行ROC分析。
第二种方法用以充分观察这些生物标志物组合的值，从而提高诊断性能和疾病分期，利用一个随机选择的针对所有可能的单个、两个、三个和四个生物标志物组合的数据子集，建立随机森林。总共建立66675个模型，并利用一个独立的验证子集计算AUC值。对所有组合的AUC值进行汇总，其中这些AUC值包含每个生物标志物的值，将汇总AUC平均值最高的生物标志物作为最重要的生物标志物。根据显示，C3a desArg几乎在任何组合中是表现最好的，是最佳表现模型的78％。表3列出了，在CKD鉴别和疾病进程分期中，一些组合的AUC值。

Claims (18)

1.一种用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，包括两个或以上的探针，分别与两种或以上的生物标志物中的相应生物标志物特异性结合，或者包括通过免疫检测或1D或2D凝胶电泳来检测所述两种或以上的生物标志物的蛋白水平时用到的试剂，
所述两种或以上的生物标志物包括C3a desArg、CYSC和MIP 1α，
其中，所述的肾脏疾病是慢性肾病。
2.根据权利要求1所述的用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述的慢性肾病是1期或2期慢性肾病。
3.根据权利要求1所述的用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述的慢性肾病是3期慢性肾病。
4.根据权利要求1-3中的任意一项所述的用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述探针是抗体。
5.根据权利要求4所述的用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
6.根据权利要求1-3中的任意一项所述的用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述生物标志物的量是利用生物芯片阵列技术进行测量的。
7.根据权利要求1-3中的任意一项所述的用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述两种或以上的生物标志物包括C3a desArg、GMCSF、CYSC和MIP 1α。
8.根据权利要求1-3中的任意一项所述的用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述两种或以上的生物标志物包括C3a desArg、TNFA、CYSC和MIP 1α。
9.根据权利要求1-3中的任意一项所述的用于检测对象肾脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述两种或以上的生物标志物包括C3a desArg、CRP、CYSC、EGF、FABP1、IL8、sTNFR1、sTNFR2、D-二聚体、NGAL和MIP 1α。
10.一种用于检测对象肾脏疾病的固态装置，该固态装置包含基板，所述基板包含与两种或以上的生物标志物中的相应生物标志物特异性结合的抗体，
其中所述两种或以上的生物标志物包括C3a desArg、CYSC和MIP 1α，
其中，所述肾脏疾病是慢性肾病。
11.根据权利要求10所述的用于检测对象肾脏疾病的固态装置，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
12.根据权利要求10所述的用于检测对象肾脏疾病的固态装置，其特征在于，所述的慢性肾病是1期或2期慢性肾病。
13.根据权利要求10所述的用于检测对象肾脏疾病的固态装置，其特征在于，所述的慢性肾病是3期慢性肾病。
14.根据权利要求10或11所述的用于检测对象肾脏疾病的固态装置，其特征在于，所述两种或以上的生物标志物包括C3a desArg、GMCSF、CYSC和MIP 1α。
15.根据权利要求10或11所述的用于检测对象肾脏疾病的固态装置，其特征在于，所述两种或以上的生物标志物包括C3a desArg、TNFA、CYSC和MIP 1α。
16.根据权利要求10或11所述的用于检测对象肾脏疾病的固态装置，其特征在于，所述两种或以上的生物标志物包括C3a desArg、CRP、CYSC、EGF、FABP1、IL8、sTNFR1、sTNFR2、D-二聚体、NGAL和MIP 1α。
17.根据权利要求10或11所述的用于检测对象肾脏疾病的固态装置，其特征在于，所述基板由塑料、陶瓷或玻璃制成。
18.根据权利要求10或11所述的用于检测对象肾脏疾病的固态装置，其特征在于，所述固态装置是生物芯片。
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