WO2011010372A1 - 物質の評価方法及び評価用キット、物質のスクリーニング方法、並びに、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法及び判定用キット - Google Patents

物質の評価方法及び評価用キット、物質のスクリーニング方法、並びに、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法及び判定用キット Download PDF

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diabetic nephropathy
risk
marker
onset
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敏一 吉川
憲一 三原
準 向井
亜尚 山口
豊 高橋
泰士 矢野原
一樹 柳田
裕二 内藤
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株式会社バイオマーカーサイエンス
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Definitions

  • the present invention relates to a substance evaluation method and evaluation kit, a substance screening method, and a method and a determination kit for determining whether or not diabetic nephropathy has occurred or in the future, and more specifically, ingesting a test substance
  • Diabetes is a complex disease caused by hyperglycemia due to insufficient action of insulin.
  • non-insulin dependent diabetes mellitus insulin-resistant diabetes, type 2 diabetes
  • overeating and obesity are one of the major causes.
  • the amount of insulin secretion in the pancreas increases dramatically due to obesity, conversely, the pancreas is fatigued and the amount of insulin secretion decreases, eventually resulting in insufficient insulin action and hyperglycemia.
  • insulin receptors decrease due to an increase in fat, resulting in insufficient insulin action and hyperglycemia.
  • surplus glucose born from insufficient action of insulin is stored as fat, and obesity further progresses.
  • obesity and diabetes are closely related in the onset mechanism.
  • diabetic complications include retinopathy, nephropathy, and neuropathy.
  • nephropathy diabetes nephropathy
  • retinopathy nephropathy
  • neuropathy nephropathy
  • nephropathy diabetic nephropathy
  • nephrotic syndrome in which protein is excreted in the urine due to poor filtration function, and uremia, which accumulates waste products in the blood, eventually becomes renal failure, permanent artificial Dialysis may be required.
  • QOL human quality of life
  • Non-patent Document 1 Many studies have revealed that oxidative stress is deeply involved in the progression of diabetes and the onset of its complications. For example, when astaxanthin, one of the antioxidants, is administered to a diabetic model mouse, the amount of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG) in urine is decreased, and at the same time, mesangial cells in the kidney glomerular region are reduced. It has been reported that proliferation has been suppressed (Non-patent Document 2). 8-OHdG is a substance excreted in the urine by oxidative stress. In addition, mesangial cells show abnormal growth in the glomerular region of the kidney where nephropathy occurs, which impairs renal function.
  • 8-OHdG 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine
  • diabetic nephropathy since diabetic nephropathy has no subjective symptoms at the beginning of onset and progresses, it becomes difficult to treat, so prevention is particularly important. For example, it is necessary to develop a technique for grasping the risk of future onset of diabetic nephropathy and a technique for screening a substance effective for reducing the risk of the onset.
  • One of the measures is to identify biomarkers (onset risk markers, preventive markers) that reflect the future risk of developing diabetic nephropathy, and to diagnose onset risks and screen for substances using the biomarkers as indicators.
  • biomarkers onset risk markers, preventive markers
  • Patent Document 1 discloses a technique for diagnosing diabetic nephropathy using the expression level of a neurocalcin delta gene as an index.
  • Patent Document 2 discloses a similar technique using serum IgG having a specific sugar chain as an index.
  • Patent Document 1 uses the gene expression level as an index, it is necessary to extract nucleic acid from the test sample.
  • a sugar chain is used as an index, but the analysis of the sugar chain structure is not as easy as the analysis of proteins and nucleic acids.
  • the usefulness of the markers in the prior art as a risk marker for the onset of diabetic nephropathy and a preventive marker is not necessarily clear, and further studies are considered necessary. Under such circumstances, a new biomarker that can reflect the risk of developing diabetic nephropathy is desired.
  • An object of the present invention is to identify a new biomarker that reflects the future risk of developing diabetic nephropathy and to provide a series of techniques using the biomarker.
  • the present inventors comprehensively analyzed the body fluid of a model animal that develops diabetic nephropathy by proteomic analysis using a mass spectrometer, and searched for a marker substance that reflects the risk of developing diabetic nephropathy. As a result, a plurality of proteins that can serve as risk markers were found. Then, an evaluation / screening technique for the improvement effect of diabetic nephropathy or the reduction effect of future onset risk using the marker substance as an index, and the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the future A technique for determining the onset risk was established, and the present invention was completed.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • One aspect of the present invention is that an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future is allowed to ingest a test substance, and the following marker substances (A1) to (A8) in the body fluid of the animal: It is a method for evaluating a substance characterized in that at least one concentration is compared with a reference value, and a test substance has a diabetic nephropathy improving effect or a future risk of reducing onset risk.
  • (A1) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 2340 when subjected to mass spectrometry;
  • (A2) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 2780 when subjected to mass spectrometry;
  • (A3) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 3340 when subjected to mass spectrometry;
  • (A4) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 5820 when subjected to mass spectrometry;
  • (A5) a protein that binds to a strong anion exchanger at pH 9.0 and produces an ion peak with a mass
  • an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future is allowed to ingest the test substance, and the above 8 (A1) to (A8) in the body fluid of the animal.
  • the concentration of at least one kind of marker substance is compared with a reference value to evaluate the effect of improving the diabetic nephropathy or the risk of reducing the future onset of the test substance.
  • Each of the marker substances (A1) to (A8) is a protein that is specifically detected in the body fluid of an animal immediately before the onset of diabetic nephropathy, and is a preventive marker / risk risk marker for diabetic nephropathy As useful as.
  • the method for evaluating a substance of this aspect it is possible to easily and accurately evaluate the improvement effect of diabetic nephropathy or the reduction effect of the future risk of onset of the test substance. Further, in the method for evaluating a substance of this aspect, since the body fluid is an object to be measured, the concentration of the marker substance can be easily measured. Furthermore, since protein is used as a marker, various established protein analysis techniques can be applied.
  • the “animal” in this aspect includes humans as well as animals that can be bred such as mice.
  • values of “about 2340”, “about 7930”, “about 13700”, etc. of the mass / charge ratio (hereinafter sometimes abbreviated as “m / z”) in each marker substance are This is a value that takes into account the error range of the measured value, and has a width of approximately ⁇ 0.2%. That is, about 2340 represents about 2340 ⁇ 0.2%, about 7930 represents about 7930 ⁇ 0.2%, and about 13700 represents about 13700 ⁇ 0.2%.
  • the other mass / charge ratios have a width of approximately ⁇ 0.2% in a similar manner.
  • these marker substances are mainly proteins present in blood.
  • the concentrations of the marker substances (A1), (A5), and (A8) in the body fluid of the animal show lower values, The concentrations of (A2), (A3), (A4), (A6), and (A7) are higher.
  • the marker substance (A5) is apolipoprotein A2 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A6) is complement C3 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A7) is pro-apolipoprotein A2 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A8) is transthyretin or a modified form thereof.
  • marker substances (A5) to ( Analysis of A8) is easy.
  • modified protein is a protein in which at least one of the amino acid residues constituting the protein is modified.
  • Modification includes not only addition of a compound or functional group (eg, phosphorylation) but also removal (eg, dephosphorylation).
  • the “protein or a modified form thereof” includes an isoform of the protein.
  • protein or a modified form thereof includes substantially the same protein in which several amino acid residues are deleted, substituted or added in the primary structure of the protein.
  • protein or a modified product thereof includes a protein fragment derived from the protein that has been cleaved by a protease. In the case of a complex protein, “protein or a modified product thereof” includes its subunits.
  • Another aspect of the present invention for solving the same problem is that an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing it ingests the test substance, and the following marker substance in the body fluid of the animal:
  • a method for evaluating a substance characterized in that at least one concentration of (B1) to (B4) is compared with a reference value to evaluate the improvement effect of diabetic nephropathy or the reduction effect of future onset risk of the test substance It is.
  • (B1) Apolipoprotein A2 or a modified product thereof,
  • B2) complement C3 or a modified product thereof,
  • B4) Transthyretin or a modified product thereof Apolipoprotein A2 or a modified product thereof.
  • an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future is allowed to ingest the test substance, and the above four (B1) to (B4) in the body fluid of the animal are used.
  • the concentration of at least one kind of marker substance is compared with a reference value to evaluate the effect of improving the diabetic nephropathy or the risk of reducing the future onset of the test substance.
  • Each of the marker substances (B1) to (B4) is a protein that is specifically detected in the body fluid of an animal immediately before the onset of diabetic nephropathy, and is a preventive marker / risk risk marker for diabetic nephropathy As useful as.
  • the method for evaluating a substance of this aspect it is possible to easily and accurately evaluate the improvement effect of diabetic nephropathy or the reduction effect of the future risk of onset of the test substance.
  • the concentration of the marker substance can be easily measured.
  • protein since protein is used as a marker, various established protein analysis techniques can be applied.
  • apolipoprotein A2, complement C3, pro-apolipoprotein A2, and transthyretin are all well known in physicochemical properties, they are easy to analyze.
  • “animal” includes not only animals such as mice but also humans.
  • All of the marker substances (B1) to (B4) are mainly present in the blood.
  • the concentrations of the marker substances (B1) and (B4) in the body fluid of the animal show lower values, (B2), and The concentration of (B3) shows a higher value.
  • modified protein is a protein in which at least one of the amino acid residues constituting the protein is modified, and “modification” includes not only addition of a compound or functional group but also omission. Is also included.
  • protein or a modified form thereof includes an isoform of the protein, a substantially identical protein in which several amino acid residues are deleted, substituted or added in the primary structure of the protein, and Protein fragments derived from the protein that have been cleaved by a protease are included.
  • the “protein or a modified form thereof” includes its subunits.
  • the reference value is obtained by adding a known substance having no effect of improving diabetic nephropathy or reducing the risk of future onset to an animal having diabetic nephropathy or an animal having a high risk of developing in the future.
  • concentration of the marker substance in the body fluid of the animal when ingested is obtained by adding a known substance having no effect of improving diabetic nephropathy or reducing the risk of future onset to an animal having diabetic nephropathy or an animal having a high risk of developing in the future.
  • the animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future is a naturally occurring model animal or a genetically engineered model animal.
  • a naturally occurring model animal or a genetically engineered model animal is used as an animal that develops diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future.
  • it is easy to breed animals and the effect of improving the diabetic nephropathy or the risk of reducing the future onset of the test substance can be evaluated very easily.
  • Examples of such animals include type 2 diabetes onset model mice (db / db mice and the like).
  • the body fluid is blood.
  • the body fluid as the measurement sample can be easily collected, and the effect of improving the diabetic nephropathy or the risk of reducing the future onset of the test substance can be evaluated more easily and quickly. .
  • the test substance is a food material.
  • the bodily fluid or bodily fluid component is brought into contact with a carrier on which a substance having affinity for the marker substance is immobilized to capture the marker substance in the body fluid on the carrier, and the amount of the trapped marker substance Based on the above, the concentration of the marker substance in the body fluid is calculated.
  • a carrier on which a substance having affinity for a marker substance is immobilized is used. Then, the body fluid or body fluid component is brought into contact with the carrier, and the marker substance contained in the body fluid or body fluid component is captured on the carrier via a substance having affinity for the marker substance, and the amount of the marker substance captured is increased. Based on this, the concentration of the marker substance in the body fluid is calculated.
  • the concentration of the marker substance in the body fluid is calculated.
  • the concentration of the marker substance can be measured.
  • the body fluid component include serum or plasma when the body fluid is blood.
  • the carrier has a flat portion, and the substance having affinity for the marker substance is immobilized on a part of the flat portion.
  • a carrier having a planar portion is used, and the substance having affinity for the marker substance is immobilized on a part of the planar portion.
  • a substance having affinity for the marker substance can be spot-fixed at a plurality of locations on the carrier.
  • work efficiency is improved.
  • concentration of the marker substance can be measured even from a very small amount of measurement sample.
  • An example of the carrier having a planar portion is a substrate such as a chip.
  • the substance having affinity for the marker substance is an ion exchanger or an antibody.
  • an ion exchanger or an antibody is used as a substance having an affinity for the marker substance, and the marker substance in the measurement sample is captured on the carrier via the ion exchanger or the antibody.
  • the substance is an ion exchanger
  • various substances are easily available, and a carrier for capturing the marker substance can be easily prepared.
  • the substance is an antibody, the marker substance can be captured more specifically. Examples of the method for measuring the amount of the captured marker substance include mass spectrometry and immunoassay (in the case of an antibody).
  • Still another aspect of the present invention is a substance characterized in that a test substance is evaluated by the method for evaluating a substance of the present invention, and a substance having an effect of improving diabetic nephropathy or a risk of reducing future risk of development is screened. Screening method.
  • This aspect relates to a method for screening a substance, and compares at least one concentration of a marker substance selected from the above (A1) to (A8) and (B1) to (B4) in a body fluid of an animal with a reference value, Screening for a substance that has an effect of improving nephropathy or a risk of reducing the risk of future onset.
  • Each of the marker substances (A1) to (A8) and (B1) to (B4) is a protein specifically detected in the body fluid of an animal immediately before the onset of diabetic nephropathy. It is useful as a preventive marker / risk marker for symptoms.
  • a substance having an effect of improving diabetic nephropathy or a risk of reducing the future risk of onset can be screened easily and with high accuracy.
  • the test substance is a food material
  • kits for use in the method for evaluating a substance of the present invention comprising a carrier on which a substance having affinity for the marker substance is immobilized. It is.
  • the substance evaluation kit of this aspect includes a carrier on which a substance having affinity for the marker substance is immobilized. With this configuration, it is not necessary to prepare the carrier separately when measuring the concentration of the marker substance, and the concentration of the marker substance can be measured very simply.
  • the substance having affinity for the marker substance is an ion exchanger or an antibody.
  • it is used for screening a substance having an effect of improving diabetic nephropathy or reducing the risk of developing future disease.
  • At least one concentration of the following marker substances (A1) to (A8) in a body fluid collected from a test animal is compared with a reference value, and the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy in the test animal: Or it is the determination method of the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy, or the future onset risk characterized by determining the future onset risk.
  • (A1) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 2340 when subjected to mass spectrometry;
  • (A2) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 2780 when subjected to mass spectrometry;
  • (A3) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 3340 when subjected to mass spectrometry;
  • (A4) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 5820 when subjected to mass spectrometry;
  • (A5) a protein that binds to a strong anion exchanger at pH 9.0 and produces an ion peak with a mass
  • the method for determining the presence or absence or future risk of developing diabetic nephropathy in this aspect is to compare at least one concentration of the marker substances (A1) to (A8) in a body fluid collected from a test animal with a reference value, The presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the future risk of onset is determined.
  • each of the marker substances (A1) to (A8) is a protein that is specifically detected in the body fluid of an animal immediately before the onset of diabetic nephropathy, and is a prophylactic marker for diabetic nephropathy -It is useful as an onset risk marker.
  • the concentration of the marker substance can be easily measured.
  • protein is used as a marker, various established protein analysis techniques can be applied. When diabetic nephropathy is developed or when the risk of future onset is high, the concentrations of the marker substances (A1), (A5), and (A8) in the body fluid in the test animal show higher values, and (A2) , (A3), (A4), (A6), and (A7) have lower concentrations.
  • determining the risk of future onset means whether or not there is a possibility (risk) of being affected by the disease in the future, or the degree of the possibility (risk). It means judging.
  • the marker substance (A5) is apolipoprotein A2 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A6) is complement C3 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A7) is pro-apolipoprotein A2 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A8) is transthyretin or a modified form thereof.
  • the marker substances (A5) to (A8) can be easily analyzed.
  • a representative example of a “modified protein” is a protein in which at least one of the amino acid residues constituting the protein is modified.
  • the “modification” includes addition of a compound or a functional group (eg, phosphorylation). ) As well as omission (eg dephosphorylation).
  • protein or a modified form thereof includes an isoform of the protein, a substantially identical protein in which several amino acid residues are deleted, substituted or added in the primary structure of the protein, and Protein fragments derived from the protein that have been cleaved by a protease are included.
  • the “protein or a modified form thereof” includes its subunits.
  • At least one concentration of the following marker substances (B1) to (B4) in a body fluid of a test animal is compared with a reference value to determine whether or not diabetic nephropathy has developed or is a future risk of developing it.
  • This is a method for determining the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the risk of future onset.
  • (B1) Apolipoprotein A2 or a modified product thereof,
  • B2) complement C3 or a modified product thereof,
  • B4 Transthyretin or a modified product thereof.
  • the method for determining the presence or absence or future risk of developing diabetic nephropathy of this aspect is to compare at least one concentration of the marker substances (B1) to (B4) in a body fluid collected from a test animal with a reference value, The presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the future risk of onset is determined.
  • each of the marker substances (B1) to (B4) is a protein that is specifically detected in the body fluid of an animal immediately before the onset of diabetic nephropathy, and is a prophylactic marker for diabetic nephropathy -It is useful as an onset risk marker.
  • a marker specific to diabetic nephropathy is used instead of a marker that widely detects diabetes itself, the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the risk of future onset can be determined with high accuracy.
  • the concentration of the marker substance can be easily measured.
  • protein is used as a marker, various established protein analysis techniques can be applied. In particular, since apolipoprotein A2, complement C3, pro-apolipoprotein A2, and transthyretin are all well known in physicochemical properties, they are easy to analyze.
  • the concentrations of the marker substances (B1) and (B4) in the body fluid in the test animal show higher values, and (B2) and (B3) The concentration of is lower.
  • modified protein is a protein in which at least one of the amino acid residues constituting the protein is modified, and “modification” includes not only addition of a compound or functional group but also omission. Is also included.
  • protein or a modified form thereof includes an isoform of the protein, a substantially identical protein in which several amino acid residues are deleted, substituted or added in the primary structure of the protein, and Protein fragments derived from the protein that have been cleaved by a protease are included.
  • the “protein or a modified form thereof” includes its subunits.
  • the test animal is a human.
  • the subject is not particularly limited, such as a diabetic patient who has not yet developed diabetic nephropathy, a person who belongs to the diabetic reserve arm, or a healthy person.
  • the body fluid is blood.
  • the bodily fluid or bodily fluid component is brought into contact with a carrier on which a substance having affinity for the marker substance is immobilized to capture the marker substance in the body fluid on the carrier, and the amount of the trapped marker substance Based on the above, the concentration of the marker substance in the body fluid is calculated.
  • the carrier has a planar portion, and the substance having affinity for the marker substance is immobilized on a part of the planar part.
  • the substance having affinity for the marker substance is an ion Exchanger or antibody.
  • Still another aspect of the present invention is a kit for use in the method for determining the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy of the present invention or the risk of future onset, wherein a substance having affinity for the marker substance is immobilized. It is a kit for judging the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the future onset risk characterized by including a carrier.
  • the kit for determining whether or not the onset of diabetic nephropathy of this aspect or the risk of future onset includes a carrier on which a substance having affinity for the marker substance is immobilized. According to this preferable aspect, it is not necessary to prepare the carrier separately when measuring the concentration of the marker substance, and the concentration of the marker substance can be measured very simply.
  • the substance having affinity for the marker substance is an ion exchanger or an antibody.
  • the kit for determining whether or not the onset of diabetic nephropathy of this aspect or the risk of future onset includes a carrier on which a substance having affinity for the marker substance is immobilized. According to this preferable aspect, it is not necessary to prepare the carrier separately when measuring the concentration of the marker substance, and the concentration of the marker substance can be measured very simply.
  • the substance having affinity for the marker substance is an ion exchanger or an antibody.
  • the method for evaluating a substance of the present invention it is possible to easily and accurately evaluate the improvement effect of diabetic nephropathy or the effect of reducing the risk of future onset of a test substance.
  • the concentration of the marker substance can be easily measured.
  • protein is used as a marker, various established protein analysis techniques can be applied.
  • the test substance can have a diminished effect on diabetic nephropathy or a future risk of reducing onset risk.
  • a substance having an effect of improving diabetic nephropathy or a reduction effect of future risk of onset can be easily and accurately screened.
  • the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the risk of the future onset of the present invention since a marker specific to diabetic nephropathy is used, the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the future The risk of onset can be determined.
  • the kit for determining the onset or future onset risk of diabetic nephropathy of the present invention it is possible to determine the onset or future onset risk of diabetic nephropathy very easily.
  • the method for evaluating a substance of the present invention includes two aspects.
  • an animal that develops diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing the disease ingests the test substance, and at least one of the following marker substances (A1) to (A8) in the body fluid of the animal:
  • the concentration is compared with a reference value, and the test substance has an effect of improving diabetic nephropathy or a future risk of reducing the onset risk.
  • (A1) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 2340 when subjected to mass spectrometry;
  • (A2) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 2780 when subjected to mass spectrometry;
  • (A3) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 3340 when subjected to mass spectrometry;
  • (A4) a protein that binds to a weak cation exchanger at pH 3.0 and produces an ion peak with a mass / charge ratio of about 5820 when subjected to mass spectrometry;
  • (A5) a protein that binds to a strong anion exchanger at pH 9.0 and produces an ion peak with a mass
  • marker substances are all proteins mainly present in blood, and are specifically detected in the animal body immediately before the onset of diabetic nephropathy.
  • Each of the marker substances (A1), (A5), and (A8) (hereinafter, a group consisting of these marker substances may be referred to as “Group 1”) develops diabetic nephropathy.
  • the test substance has an effect of improving diabetic nephropathy or reducing the risk of future onset. Lower values are found in animals fed the test substance.
  • the marker substances (A2), (A3), (A4), (A6), and (A7) (hereinafter, a group consisting of these marker substances may be referred to as “group 2”).
  • the test substance Since the test substance shows a lower value in the state of developing diabetic nephropathy or in the state of high risk of future development of diabetic nephropathy, the test substance is effective in improving diabetic nephropathy or the risk of future onset. When it has a reducing effect, it shows a higher value in the animal ingested with the test substance.
  • the marker substance (A5) is apolipoprotein A2, the marker substance (A6) is complement C3, the marker substance (A7) is pro-apolipoprotein A2, and the marker substance (A8) is transthyretin.
  • the marker substance (A5) is apolipoprotein A2 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A6) is complement C3 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A7) is pro-apolipoprotein A2 or a modified form thereof.
  • the marker substance (A8) is transthyretin or a modified form thereof.
  • an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future is allowed to ingest the test substance, and the following marker substance (B1) in the body fluid of the animal:
  • the concentration of at least one of (B4) is compared with a reference value, and the effect of improving the diabetic nephropathy or reducing the risk of future onset of the test substance is evaluated.
  • (B1) Apolipoprotein A2 or a modified product thereof, (B2) complement C3 or a modified product thereof, (B3) pro-apolipoprotein A2 or a modified form thereof, (B4) Transthyretin or a modified product thereof.
  • protein modifications include methylation, acetylation, adenylylation, myristylation, etc. of N-terminal ⁇ -amino group and lysine ⁇ -amino group; addition of sugar or sugar chain to serine / threonine / asparagine; serine / threonine / Examples include phosphorylation of tyrosine, arginine, and histidine; cysteine cysteinylation, homocysteinylation, sulfonylation, etc .; ⁇ -carboxylation of glutamic acid; conversion of N-terminal glutamic acid to pyroglutamic acid, and the like. Further, removal of these modifications (demethylation, removal of sugar or sugar chain, dephosphorylation, etc.) is also included in “modification”.
  • Protein or modified form thereof includes isoforms of the protein. Isoforms include proteins generated by alternative splicing in addition to the various modifications described above. Furthermore, the “protein or a modified form thereof” includes substantially the same protein in which several amino acid residues are deleted, substituted or added in the primary structure of the protein. Furthermore, “protein or a modified product thereof” includes a protein fragment derived from the protein that has been cleaved by a protease. For example, a protein fragment having a length that can be recognized as derived from the protein, for example, a protein fragment composed of 20 or more amino acid residues, a protein fragment having a molecular weight of 2,000 or more, and the like can be mentioned.
  • complement C3 has C3a, C3b, C3c, and C3d domains
  • “complement C3 or a modification thereof” includes a protein fragment of complement C3 (for example, complement C3a) consisting of each domain. included.
  • transthyretin is a complex protein composed of four subunits
  • transthyretin or a modified form thereof includes a subunit of transthyretin.
  • the substance evaluation method of the present invention only one of the above (A1) to (A8) and (B1) to (B4) may be used, or a plurality may be used in combination.
  • the combination method in the case of using a plurality, but for example, the marker substance (s) selected from group 1 and the marker substance (s) selected from group 2 can be combined. .
  • the reference value is an effect of improving diabetic nephropathy or risk of future onset in an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future.
  • the concentration of the marker substance in the body fluid of the animal when a known substance that does not have a reduction effect is taken. That is, when an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future has been ingested with a known substance that does not have an effect of improving diabetic nephropathy or a risk of reducing the risk of developing the future,
  • the concentration of the marker substance in the body fluid is an “abnormal value”.
  • the value (measured value) in the animal ingested with the test substance is compared with the reference value (abnormal value), and the measured value is significantly different from the reference value and is on the normal side (to the normal side)
  • the test substance has an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • the marker substance belonging to group 1 is used as an index
  • the measured value is significantly lower than the reference value
  • the marker substance belonging to group 2 is used as an index
  • the measured value Is significantly higher than the reference value it can be evaluated that the test substance has an effect of improving diabetic nephropathy or reducing the risk of developing the future.
  • a value in addition to the above abnormal value, a value (normal value, negative control) in an animal that does not develop diabetic nephropathy or an animal that has a low risk of developing diabetic nephropathy can be added to the reference value.
  • a group (group showing normal values) in which an animal that has not developed diabetic nephropathy or an animal that has a low risk of developing diabetic nephropathy is ingested with a normal diet or a test substance
  • (2 ) A group in which an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing diabetic nephropathy is ingested with a known substance that does not have an effect of improving diabetic nephropathy or a risk of reducing future onset risk ( A group showing abnormal values)
  • test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or a risk of reducing future risk of onset.
  • (4) ingesting a known substance having an effect of improving diabetic nephropathy or reducing the risk of future onset into an animal having diabetic nephropathy or an animal having a high risk of developing in the future The value in the animals of the group to be allowed (positive control) can also be added.
  • the group of (4) above is set and animals are raised.
  • there is a significant difference between (1) and (2) there is a significant difference between (3) and (2), and (3) is normal ((1) and (2) compared to (2). 4)
  • it can be evaluated that the test substance has an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset. That is, such a test substance exhibits the same behavior as the known substance adopted in (4) and can be said to have a similar action.
  • Astaxanthin is a kind of carotenoid and is known to have a strong antioxidant effect. Even a substance other than astaxanthin can be the known substance as long as it has an antioxidant action.
  • an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future there is no particular limitation on the type of animal in “an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future”, and for example, a mouse, a rat, a rabbit, or a pig can be employed.
  • an animal that has developed diabetic nephropathy or an animal that has a high risk of developing in the future a naturally occurring model animal of diabetic nephropathy or a genetically engineered model animal by transgenic or gene targeting is preferably used.
  • Specific examples of the animal include type 2 diabetes onset model mice such as db / db mice. Since db / db mice usually develop diabetic nephropathy when reared, rearing experiments can be carried out easily and are particularly suitable.
  • Non-Patent Document 2 the db / db mouse before the 12th week of breeding, for example, the 10th week of breeding, is in the stage immediately before the onset of diabetic nephropathy.
  • the marker substances (A1) to (A8) used in the substance evaluation method of the present invention are present in the body fluid of db / db mice at 10 weeks of breeding and are not in the stage immediately before the onset of diabetic nephropathy (for example, Compared with normal mice), the concentration in the body fluid is significantly different. Therefore, when db / db mice are used in the present invention, for example, the concentration of each marker substance may be measured using a body fluid around the 10th week of breeding as a measurement sample.
  • a naturally occurring model animal that develops diabetic nephropathy when a specific substance is ingested can also be used.
  • a system in which streptozotocin is administered to induce diabetic nephropathy is known, and by causing the animal to simultaneously ingest the test substance and streptozotocin, the test substance has an improvement effect or future onset of diabetic nephropathy The risk reduction effect can be evaluated.
  • humans can be employed as animals. In this case, the substance will be evaluated according to the results of clinical trials.
  • Blood is preferably used as the animal body fluid used in the method for evaluating a substance of the present invention.
  • serum or plasma body fluid component
  • Serum or plasma can be prepared from blood by a known method such as centrifugation.
  • test substances in the substance evaluation method of the present invention include food materials and drug substances.
  • food materials when food materials are to be evaluated, it can be used for the development of functional foods.
  • the screening method for a substance of the present invention evaluates a test substance by the method for evaluating a substance of the present invention, and screens for a substance having an effect of improving diabetic nephropathy or a risk of reducing future risk of onset.
  • the same embodiment as the above-described embodiment of the method for evaluating a substance of the present invention can be employed.
  • the determination method of the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the risk of future onset includes two aspects.
  • at least one concentration of the marker substances (A1) to (A8) in a body fluid collected from a test animal is compared with a reference value, and whether or not diabetic nephropathy has occurred in the test animal or a future onset Determine the risk.
  • the concentrations of the marker substances (A1), (A5), and (A8) in the body fluid in the test animal show higher values, and (A2) , (A3), (A4), (A6), and (A7) have lower concentrations.
  • At least one concentration of the marker substances (B1) to (B4) in the body fluid of the test animal is used as a reference value.
  • the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the risk of future onset is determined.
  • the concentrations of the marker substances (B1) and (B4) in the body fluid in the test animal show higher values, and the concentrations of (B2) and (B7) are Indicates a lower value.
  • the test animal is a human.
  • the subject is not particularly limited, such as a diabetic patient who has not yet developed diabetic nephropathy, a person who belongs to the diabetic reserve arm, or a healthy person. If the present invention is applied to a person who is a diabetic patient but has not developed diabetic nephropathy at the present time, subsequent lifestyle guidance can be accurately performed based on the determination result.
  • the reference value used in the method for determining the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the risk of future onset of the present invention is, for example, collecting concentration data in the body fluid of the marker substance in a healthy person who does not develop diabetes, It can be set based on the concentration value (ie, healthy value). It is also possible to set a plurality of reference values in stages and quantitatively determine whether or not there is onset of diabetic nephropathy or the risk of future onset.
  • the method for evaluating a substance of the present invention the method for screening a substance, and the method for determining the presence or absence of onset of diabetic nephropathy or the risk of developing the future, the method of measuring the concentration of a marker substance is characterized by the specific concentration of the marker substance.
  • a method generally used for protein quantification can be used as it is.
  • various immunoassays, mass spectrometry (MS), chromatography, electrophoresis and the like can be used.
  • the concentration of the marker substance can be accurately measured even with a sample having a lot of contaminants.
  • immunoassays include classical methods such as precipitation, agglutination, and hemolysis, which directly or indirectly measure antigen-antibody conjugates, and enzyme immunoassays (EIA) with increased detection sensitivity in combination with labeling methods. , Radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA) and the like.
  • the antibody specific for the marker substance used in these immunoassays may be monoclonal or polyclonal.
  • an ion peak derived from each marker substance can be specified, and the amount (concentration) of each marker substance can be measured with the ion peak intensity.
  • the ionization method for measuring the concentration of the marker substance by mass spectrometry either matrix-assisted laser ionization (MALDI) or electrospray ionization (ESI) can be applied.
  • MALDI matrix-assisted laser ionization
  • ESI electrospray ionization
  • MALDI is preferred because it produces less multivalent ions.
  • TOF time-of-flight mass spectrometer
  • the test material is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to separate the target marker substance, and the gel is prepared with an appropriate dye or fluorescent substance. It is only necessary to stain and measure the intensity and fluorescence intensity of the band corresponding to the target marker substance.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • two-dimensional electrophoresis combined with isoelectric focusing (IEF) can be used.
  • Western blotting can also be performed to measure the amount of marker substance on the membrane.
  • a method by liquid high-performance chromatography can be used. That is, the concentration of the marker substance in the sample can be measured by subjecting the sample to HPLC to separate the target marker substance and measuring the peak area of the chromatogram.
  • a marker substance is captured on a carrier, and the captured marker substance is a measurement target. That is, a substance having affinity for the marker substance is immobilized on the carrier, and the marker substance is captured on the carrier via the substance having the affinity. Then, the concentration of the marker substance in the body fluid is calculated based on the amount of the captured marker substance. According to this embodiment, it is possible to reduce the influence of contaminants contained in the sample, and to measure the concentration of the marker substance with higher sensitivity and higher accuracy.
  • a carrier having a flat portion such as a substrate can be used in addition to a general one such as beads, metal, glass, resin, and the like.
  • a substance having affinity for the marker substance it is preferable to immobilize a substance having affinity for the marker substance on a part of the planar portion.
  • a carrier in which a chip is used as a substrate and a substance having affinity for a marker substance is immobilized in spots on a plurality of locations on the surface.
  • affinity include ion binding, affinity between metal chelate and histidine residue in protein, antigen and antibody, enzyme and substrate, bioaffinity such as hormone and receptor, and hydrophobicity. Chemical interactions such as interactions.
  • the ion exchanger When the marker substance is captured on the carrier by ion binding, the ion exchanger is immobilized on the carrier.
  • a cation exchanger or an anion exchanger can be used as the ion exchanger, and further, a strong cation exchanger, a weak cation exchanger, a strong anion exchanger, and a weak anion exchanger. Either of these can be used, but a strong anion exchanger and a weak cation exchanger are preferably used.
  • strong anion exchangers include quaternary ammonium (trimethylaminomethyl) (QA), quaternary aminoethyl (diethyl, mono-2-hydroxybutylaminoethyl) (QAE), quaternary ammonium (trimethylammonium) ( And those having a strong anion exchange group such as QMA).
  • weak cation exchangers include those having weak cation exchange groups such as carboxymethyl (CM).
  • strong cation exchangers include those having a strong cation exchange group such as sulfopropyl (SP).
  • the weak anion exchanger include those having a weak anion exchange group such as dimethylaminoethyl (DE) and diethylaminoethyl (DEAE).
  • a metal chelate such as Cu 2+ , Zn 2+ , Ni 2+ , Co 2+ , Al 3+ , Fe 3+ , Ga 3+ is fixed.
  • a fluorinated carrier can be used.
  • an antibody specific for the marker substance may be immobilized on the carrier.
  • hydrophobic groups include C4 to C20 alkyl groups, phenyl groups, and the like.
  • an immunoassay when used as a method for measuring a marker substance, it is preferable to use a carrier on which an antibody is immobilized.
  • an immunoassay system using the antibody immobilized on the carrier as the primary antibody can be easily constructed.
  • two types of antibodies specific to a marker substance and having different epitopes are prepared, one is immobilized on a carrier as a primary antibody, and the other is enzyme-labeled as a secondary antibody to construct a sandwich EIA system.
  • immunoassay systems based on binding inhibition methods and competitive methods can be constructed.
  • a substrate is used as a carrier, immunoassay using an antibody chip is possible. According to the antibody chip, the concentration of a plurality of marker substances can be measured simultaneously, and rapid measurement is possible.
  • an ion exchanger for example, an ion exchanger, a metal chelate, or a carrier on which a hydrophobic group is immobilized can be used in addition to an antibody. Since binding by these substances is not as specific as bioaffinity such as antigens and antibodies, when using a carrier on which these substances are immobilized, substances other than the marker substance can also be captured on the carrier. According to the analysis, there is no problem because it is quantified by the mass spectrometer spectrum reflecting the molecular weight.
  • a substrate as a carrier, surface-enhanced laser desorption / ionization-time-of-flight mass measurement (hereinafter referred to as "SELDI-TOF-MS") ), The concentration of the marker substance can be measured more accurately.
  • substrates that can be used, cation exchange substrates, anion exchange substrates, normal phase substrates, reverse phase substrates, metal ion substrates, antibody substrates, etc. can be used, but cation exchange substrates, particularly weak cation exchanges.
  • a substrate and an anion exchange substrate, particularly a strong anion exchange substrate are preferably used.
  • the necessary reagents are put together and a substance evaluation kit, substance screening Kit for determining the presence or absence of onset of diabetic nephropathy or future risk of onset.
  • the kit of the present invention includes a carrier on which a substance having affinity for the marker substance described above is immobilized.
  • the substance having affinity for the marker substance is an ion exchanger or an antibody.
  • kits including a substrate on which a weak cation exchanger such as CM is immobilized (weak cation exchange substrate) or a substrate on which a strong anion exchanger such as QA or QAE is immobilized (strong anion exchange substrate).
  • the kit may contain other reagents, for example, standard products of various marker substances, various buffers and the like. Examples of the configuration of the kit of the present invention are given below.
  • the marker substances (A1) to (A8) and (B1) to (B4) are related to diabetic nephropathy, for example, the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy, the improvement of diabetic nephropathy Also provided is use as a biomarker to detect a condition, future risk of developing diabetic nephropathy, and the like.
  • the following four groups with different combinations of mouse types and feeds were set and breeding was started. The number of individuals in each group was 5 or more.
  • Group 1 Breeding normal mice with normal feed
  • Group 2 Breeding nephropathy developing mice with normal feed
  • Group 3 Breeding nephropathy developing mice with feed containing astaxanthin
  • Group 4 Breeding normal mice with feed containing astaxanthin That is, the first group corresponds to a group that does not develop diabetic nephropathy, the second group corresponds to a group that develops diabetic nephropathy, and the third group corresponds to a group in which the onset of diabetic nephropathy is suppressed.
  • the fourth group is a group for verifying the action of astaxanthin.
  • SPA-H sinapinic acid
  • SPA-L sinapinic acid
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • SELDI-TOF-MS SELDI-TOF-MS was performed.
  • the measurement molecular weight range (m / z) was in the range of 3000 to 200000. Moreover, the measurement was performed in duplicate and the average value of m / z was calculated. Data analysis was performed using Protein® Chip® Software, Ciphergen Express® Data® Manager, and Biomarker® Patterns® Software (all from Bio-Rad).
  • Candidate peak search There is a significant difference in ionic strength between the first and second groups (p ⁇ 0.05).
  • Astaxanthin effect verification There is a significant difference in ionic strength between the second group and the third group (p ⁇ 0.05), and the value of the third group is first than the value of the second group. It is close to the value of the group (the value of the third group has returned to the first group side).
  • the upper and lower edges of the basket are the maximum and minimum values, respectively
  • the top and bottom sides of the box are the third quartile (75th percentile) and the first quartile (25th percentile), respectively
  • the line in the box is the center Value (the same applies to FIG. 2 and subsequent figures).
  • the ROC area (first group vs second group) of this peak is 0.86
  • the p value (first group vs second group) is 0.002
  • the p value (second group vs third group) is 0.070.
  • the protein (marker substance (A1)) that produces a peak with a mass / charge ratio of about 2340 when subjected to SELDI-TOF-MS is a mouse that has developed diabetic nephropathy, or the future of diabetic nephropathy. It was found to be a substance specific to mice with a high risk of developing and can be a marker for diabetic nephropathy.
  • diabetic nephropathy possessed by the test substance using as an index the concentration of the marker substance (A1) in the body fluid of the animal that has developed diabetic nephropathy ingested by the test substance or that has a high risk of developing in the future It has been shown that it is possible to evaluate the effect of improving or reducing the risk of developing the disease in the future, and to screen for such substances. Furthermore, it was shown that the presence or absence of diabetic nephropathy or the risk of future onset can be determined using the concentration of the marker substance (A1) in the blood of the test animal as an index.
  • test substance when a body fluid sample is prepared by performing the same animal experiment using a desired test substance and SELDI-TOF-MS is performed by the same procedure, a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 2340 When the concentration of is maintained at a normal value, the test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • FIG. 2 shows a box diagram when the peak intensity of this peak is plotted for each group.
  • the ROC area (first group vs second group) of this peak is 0.82
  • the p value (first group vs second group) is 0.008
  • the p value (second group vs third group) is 0.070.
  • the protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 2780 when subjected to SELDI-TOF-MS is a mouse that has developed diabetic nephropathy, or the future of diabetic nephropathy. It was found to be a substance specific to mice with a high risk of developing and can be a marker for diabetic nephropathy.
  • diabetic nephropathy possessed by the test substance using as an index the concentration of the marker substance (A2) in the body fluid of the animal that has developed diabetic nephropathy ingested by the test substance or that has a high risk of developing in the future It has been shown that it is possible to evaluate the effect of improving or reducing the risk of developing the disease in the future, and to screen for such substances. Furthermore, it was shown that the presence or absence of diabetic nephropathy or the risk of future onset can be determined using the concentration of the marker substance (A2) in the blood of the test animal as an index.
  • test substance when a body fluid sample is prepared by performing the same animal experiment using a desired test substance and SELDI-TOF-MS is performed by the same procedure, a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 2780 When the concentration of is maintained at a normal value, the test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 3340 when subjected to SELDI-TOF-MS is a mouse that has developed diabetic nephropathy, or the future of diabetic nephropathy. It was found to be a substance specific to mice with a high risk of developing and can be a marker for diabetic nephropathy.
  • diabetic nephropathy possessed by the test substance using as an index the concentration of the marker substance (A3) in the body fluid of the animal that has developed diabetic nephropathy ingested by the test substance or that has a high risk of developing in the future It has been shown that it is possible to evaluate the effect of improving or reducing the risk of developing the disease in the future, and to screen for such substances. Furthermore, it was shown that the presence or absence of diabetic nephropathy or the risk of future onset can be determined using the concentration of the marker substance (A3) in the blood of the test animal as an index.
  • concentration of is maintained at a normal value, the test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • the protein (marker substance (A4)) that produces a peak with a mass / charge ratio of about 5820 when subjected to SELDI-TOF-MS is a mouse that has developed diabetic nephropathy, or the future of diabetic nephropathy. It was found to be a substance specific to mice with a high risk of developing and can be a marker for diabetic nephropathy.
  • the diabetic nephropathy that the test substance has using as an index the concentration of the marker substance (A4) in the body fluid of the animal that has developed diabetic nephropathy ingested by the test substance or that has a high risk of developing in the future It has been shown that it is possible to evaluate the effect of improving or reducing the risk of developing the disease in the future, and to screen for such substances. Furthermore, it was shown that the presence or absence of diabetic nephropathy or the risk of future onset can be determined using the concentration of the marker substance (A4) in the blood of the test animal as an index.
  • test substance when a body fluid sample is prepared by performing the same animal experiment using a desired test substance and SELDI-TOF-MS is performed in the same procedure, a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 5820 When the concentration of is maintained at a normal value, the test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • FIG. 5 shows a box diagram when the peak intensity of this peak is plotted for each group.
  • the ROC area (first group vs second group) of this peak is 0.78
  • the p value (first group vs second group) is 0.028
  • the p value (second group vs third group) is 0.007.
  • a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 7930 when subjected to SELDI-TOF-MS is a mouse that has developed diabetic nephropathy, or the future of diabetic nephropathy. It was found to be a substance specific to mice with a high risk of developing and can be a marker for diabetic nephropathy.
  • diabetic nephropathy possessed by the test substance using as an index the concentration of the marker substance (A5) in the body fluid of an animal that has ingested the test substance or has developed a diabetic nephropathy or that has a high risk of developing in the future It has been shown that it is possible to evaluate the effect of improving or reducing the risk of developing future diseases, and to screen for such substances. Furthermore, it was shown that the presence or absence of diabetic nephropathy or the risk of future onset can be determined using the concentration of the marker substance (A5) in the blood of the test animal as an index.
  • a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 7930 when a body fluid sample is prepared by performing the same animal experiment using a desired test substance and SELDI-TOF-MS is performed in the same procedure.
  • the concentration of is maintained at a normal value, the test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • the protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 9070 when subjected to SELDI-TOF-MS is a mouse that has developed diabetic nephropathy, or the future of diabetic nephropathy. It was found to be a substance specific to mice with a high risk of developing and can be a marker for diabetic nephropathy.
  • the diabetic nephropathy that the test substance has using as an index the concentration of the marker substance (A6) in the body fluid of the animal that has developed diabetic nephropathy that has been ingested by the test substance or that has a high risk of developing in the future It has been shown that it is possible to evaluate the effect of improving or reducing the risk of developing the disease in the future, and to screen for such substances. Furthermore, it was shown that the presence or absence of the onset of diabetic nephropathy or the future onset risk can be determined using the concentration of the marker substance (A6) in the blood of the test animal as an index.
  • a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 9070 when a body fluid sample is prepared using the desired test substance and SELDI-TOF-MS is performed in the same procedure.
  • concentration of is maintained at a normal value, the test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • the protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 9310 when subjected to SELDI-TOF-MS is a mouse that has developed diabetic nephropathy, or the future of diabetic nephropathy. It was found to be a substance specific to mice with a high risk of developing and can be a marker for diabetic nephropathy.
  • diabetic nephropathy possessed by the test substance using as an index the concentration of the marker substance (A7) in the body fluid of the animal that has developed diabetic nephropathy ingested by the test substance or that has a high risk of developing in the future It has been shown that it is possible to evaluate the effect of improving or reducing the risk of developing the disease in the future, and to screen for such substances. Furthermore, it was shown that the presence or absence of diabetic nephropathy or the risk of future onset can be determined using the concentration of the marker substance (A7) in the blood of the test animal as an index.
  • a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 9310 when a bodily fluid sample is prepared using the desired test substance and SELDI-TOF-MS is performed in the same procedure.
  • concentration of is maintained at a normal value, the test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • the protein (marker substance (A8)) that produces a peak with a mass / charge ratio of about 13700 when subjected to SELDI-TOF-MS is a mouse that has developed diabetic nephropathy, or the future of diabetic nephropathy. It was found to be a substance specific to mice with a high risk of developing and can be a marker for diabetic nephropathy.
  • diabetic nephropathy possessed by the test substance using as an index the concentration of the marker substance (A8) in the body fluid of the animal that has developed diabetic nephropathy ingested by the test substance or that has a high risk of developing in the future It has been shown that it is possible to evaluate the effect of improving or reducing the risk of developing the disease in the future, and to screen for such substances. Furthermore, it was shown that the presence or absence of diabetic nephropathy or the risk of future onset can be determined using the concentration of the marker substance (A8) in the blood of the test animal as an index.
  • a protein that produces a peak with a mass / charge ratio of about 13700 when a body fluid sample is prepared by performing the same animal experiment using the desired test substance and SELDI-TOF-MS is performed in the same procedure.
  • the concentration of is maintained at a normal value, the test substance can be evaluated as having an effect of improving diabetic nephropathy or an effect of reducing the risk of future onset.
  • FIG. 9 A part of the collected fraction was subjected to TCA precipitation treatment and then subjected to two-dimensional electrophoresis (FIG. 9).
  • Immobiline® DryStrip® pH 4-7, 7 cm from GE Healthcare was used, and in the second dimension, a polypeptide separating gel (15-20%) NTH-5A2T manufactured by DRC was used.
  • the spot indicated by the arrow in FIG. 9 is cut out, protein is extracted, SELDI-TOF-MS analysis is performed, and mass / charge equivalent to that of the marker substance (A5) is within the range of error due to oxidation modification in the purification process. A peak indicating the ratio was confirmed (FIG. 10).
  • a similar two-dimensional electrophoresis is performed again to cut out the band containing the target protein, reductive alkylation treatment, and 0.01 ⁇ g / ⁇ L trypsin solution (dissolved in 50 mM ammonium bicarbonate (pH 8.0)) is allowed to act. And digested in the gel. 1 ⁇ L of the digested sample was dropped on a metal plate, 0.4 ⁇ L of saturated CHCA solution was further dropped and dried, and then measured with a mass spectrometer Proteomics Analyzer 4700 (Applied Biosystems). At least three peaks Were detected, and their exact masses were calculated as “1019.53”, “119.68”, and “1831.96”.
  • mature mouse-derived apolipoprotein A2 is composed of 78 amino acids represented by SEQ ID NO: 4, has a molecular weight of 8736, and an isoelectric point of 4.94.
  • the molecular weight of the protein identified as apolipoprotein A2 in this example was about 7900, and the isoelectric point was 4.94.
  • the protein is a fragment of apolipoprotein A2 corresponding to amino acid numbers 1 (Glu) to 70 (Leu) of SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence of the apolipoprotein A2 fragment is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the fraction collected was subjected to acetone precipitation, and then subjected to SDS-PAGE using a polypeptide separation gel DRC NTH-5AOT gel (DRC) (FIG. 11).
  • DRC NTH-5AOT gel DRC NTH-5AOT gel
  • the separated band (arrow in FIG. 11) was cut out, protein was extracted, and SELDI-TOF-MS analysis was performed, and a peak showing a mass / charge ratio equivalent to that of the marker substance (A6) was confirmed (FIG. 12).
  • the peptides of “58”, “123.67”, “1312.63”, and “148.74” match the peptides of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6 to 13, respectively, and the target protein has a probability of 99% or more.
  • Table 2 shows the correspondence between the exact mass, amino acid sequence, and SEQ ID NO of each peptide.
  • the reported amino acid sequence of mouse-derived complement C3a consists of 78 amino acids represented by SEQ ID NO: 14, with a molecular weight of 9225 and an isoelectric point of 9.45.
  • the protein identified as “Complement C3a” in this example had a molecular weight of about 9100 and an isoelectric point of 9.27.
  • the protein is a protein “complement C3a des Arg” which corresponds to the amino acid number 1 (Ser) to 77 (Ala) portion of SEQ ID NO: 14 and lacks the Arg of the C-terminal amino acid from complement C3a. It was suggested that there is.
  • the amino acid sequence of “Complement C3a des Arg” is shown in SEQ ID NO: 15.
  • FIG. 13 A portion of the collected fraction was subjected to acetone precipitation, and then two-dimensional electrophoresis was performed (FIG. 13).
  • Immobiline® DryStrip® pH6-11, 7 cm manufactured by GE Healthcare was used, and in the second dimension, a polypeptide separation gel (15-20%) NTH-5AOT manufactured by DRC was used.
  • the spot indicated by the arrow in FIG. 13 is cut out, protein is extracted, SELDI-TOF-MS analysis is performed, and mass / charge equivalent to that of the marker substance (A7) is within the range of error due to oxidation modification in the purification process.
  • a peak indicating the ratio was confirmed (FIG. 14).
  • mouse-derived pro-apolipoprotein A2 is as shown in SEQ ID NO: 19, which is obtained by adding a propeptide consisting of 5 amino acids to the N-terminal side of apolipoprotein A2 shown in SEQ ID NO: 4. It is the same as the structure.
  • the collected fraction was subjected to acetone precipitation, and then subjected to SDS-PAGE using a polypeptide separation gel DRC NTH-5AOT gel (FIG. 15).
  • the separated band (arrow in FIG. 15) is cut out, protein is extracted, SELDI-TOF-MS analysis is performed, and mass / charge equivalent to that of the marker substance (A8) is within the range of error due to oxidation modification in the purification process. A peak indicating the ratio was confirmed (FIG. 16).
  • the reported amino acid sequence of mouse-derived transthyretin is as shown in SEQ ID NO: 26.

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Abstract

　糖尿病性腎症の将来の発症リスクを反映する新たなバイオマーカーを特定し、当該バイオマーカーを利用した一連の技術を提供する。　糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体にマーカー物質を捕捉して、体液中のマーカー物質の濃度を算出することもできる。該評価方法を利用した物質のスクリーニング方法、並びに、該マーカー物質を指標とした糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法も提供される。

Description

物質の評価方法及び評価用キット、物質のスクリーニング方法、並びに、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法及び判定用キット
　本発明は物質の評価方法及び評価用キット、物質のスクリーニング方法、並びに、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法及び判定用キットに関し、さらに詳細には、被験物質を摂取させた動物の体液中における特定のマーカー物質の濃度を指標として被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する物質の評価方法、当該評価方法に用いるための物質の物質評価用キット、当該評価方法を利用した物質のスクリーニング方法、被験動物から採取した体液における特定のマーカー物質の濃度を指標として糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定する糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法、並びに、当該判定方法に用いるための糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットに関する。
　近年、食生活の欧米化が進み、それに起因すると考えられる糖尿病、肥満、動脈硬化等の生活習慣病が増加している。これらの発症増加は遺伝的なものではなく、主に環境因子によるものである。例えば、高脂肪食や高カロリー食の摂取による脂質代謝異常が、血中脂質上昇、インスリン抵抗性の発現、脂肪細胞肥大化、インスリン分泌不全等の原因となっている。その結果、糖尿病、肥満、動脈硬化等が高確率で発症し、病態の進展へとつながっている。
　糖尿病は、インスリンの作用不足による高血糖が引き起こす複合疾患である。特に、インスリン非依存型糖尿病（インスリン抵抗性糖尿病、２型糖尿病）は、環境因子が引き金になって発病するとされ、過食や肥満が大きな原因の一つである。例えば、肥満のために膵臓のインスリン分泌量が激増した結果、逆に膵臓が疲労してインスリン分泌量が減少し、結局インスリンの作用不足となり高血糖となる。あるいは、脂肪の増加によってインスリン受容体が減少し、その結果、インスリンの作用不足となり高血糖となる。逆に、インスリンの作用不足から生まれる余剰のグルコースが脂肪となって蓄えられ、さらに肥満が進むこととなる。このように、肥満と糖尿病はその発症メカニズムにおいて密接に関係している。
　糖尿病は、他の疾患との合併症を引き起こすことが多い。糖尿病合併症の例としては、網膜症、腎症、神経障害が挙げられる。この中で、腎症（糖尿病性腎症）は、高血糖状態が続くことによって糸球体の毛細血管が損傷を受け、腎臓のろ過機能が侵されることによって発症する。糖尿病性腎症が発症すると、ろ過機能の不調によってタンパク質が尿中に排出されるネフローゼ症候群や、血中に老廃物がたまる尿毒症が引き起こされ、最終的には腎不全となり、永続的な人工透析が必要となることがある。このように、糖尿病性腎症は、人間のＱｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ（ＱＯＬ）に重大な影響を及ぼすおそれがある疾患である。
　糖尿病の進行及びその合併症の発症に、酸化ストレスが深く関与していることが多くの研究により明らかにされている（非特許文献１）。例えば、糖尿病モデルマウスに抗酸化剤の１つであるアスタキサンチンを投与すると、尿中の８－ヒドロキシ－２’－デオキシグアノシン（８－ＯＨｄＧ）量が減少し、同時に腎糸球体領域におけるメザンギウム細胞の増殖が抑制された旨が報告されている（非特許文献２）。なお、８－ＯＨｄＧは酸化ストレスにより尿中に多く排出される物質である。また、メザンギウム細胞は腎症を起こしている腎臓の糸球体領域において異常な増殖がみられ、腎機能に障害を与えるものである。
　このように、糖尿病性腎症は発症初期に自覚症状がない上に進行すると治療困難となるため、予防をすることが特に重要となる。例えば、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを把握する技術や、当該発症リスクを低減する効果のある物質をスクリーニングする技術の開発が求められる。そのための方策の１つとして、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを反映するバイオマーカー（発症リスクマーカー、予防マーカー）を特定し、当該バイオマーカーを指標として発症リスクの診断や物質のスクリーニングを行うことが挙げられる。関連する従来技術としては、例えば特許文献１に、ニューロカルシンデルタ遺伝子の発現量を指標として糖尿病性腎症の診断等を行う技術が開示されている。また特許文献２には、特定の糖鎖を有する血清ＩｇＧを指標とする同様の技術が開示されている。
特開２００７－１２９９０５号公報 特開２００４－６７７３２号公報
ジャネット・シュルツ・ジョハンセン（Jeanette Schultz Johansen）ら，カルディオバスキュラー・ダイアベトロジー（Cardiovascular Diabetology），第４巻，２００４年，ｐ５－１５ 内藤ら，バイオファクターズ（BioFactors），第２０巻，２００４年，ｐ４９－５９
　しかし特許文献１に開示された技術では遺伝子発現量を指標とするので、検査試料から核酸を抽出する必要がある。例えば、血液を検査試料とする場合には核酸原となる白血球等を単離する必要があり操作が煩雑である。また特許文献２に開示された技術では糖鎖を指標とするが、糖鎖構造の解析はタンパク質や核酸の解析ほど容易ではない。さらに、従来技術におけるマーカーの糖尿病性腎症の発症リスクマーカーや予防マーカーとしての有用性については必ずしも明確でなく、更なる検討が必要と考えられる。このような背景の下、糖尿病性腎症の発症リスクを反映できる新規のバイオマーカーが求められている。
　本発明の目的は、糖尿病性腎症の将来の発症リスクを反映する新たなバイオマーカーを特定し、当該バイオマーカーを利用した一連の技術を提供することにある。
　本発明者らは、糖尿病性腎症を発症するモデル動物の体液を質量分析計によるプロテオーム解析により網羅的に解析し、糖尿病性腎症の発症リスクを反映するマーカー物質を検索した。その結果、発症リスクマーカーとなり得る複数のタンパク質を見出した。そして、当該マーカー物質を指標とした糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価・スクリーニング技術、並びに、当該マーカー物質を指標とした糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定する技術等を確立し、本発明を完成した。本発明の要旨は以下の通りである。
　本発明の１つの様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
　本様相の物質の評価方法は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ａ１）～（Ａ８）の８種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また本様相の物質の評価方法では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。なお本様相における「動物」には、マウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
　ここで、各マーカー物質における質量／電荷比（以下、「ｍ／ｚ」と略記することもある。）の「約２３４０」、「約７９３０」、「約１３７００」等の値は、質量分析における測定値の誤差範囲を考慮した値であり、概ね±０．２％の幅を有する。すなわち、約２３４０は概ね２３４０±０．２％、約７９３０は概ね７９３０±０．２％、約１３７００は概ね１３７００±０．２％を表す。他の質量／電荷比についても全く同様に、概ね±０．２％の幅を有する。また、これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質である。被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより低値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより高値を示す。
　好ましくは、下記（１）～（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
　アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ－アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相の物質の評価方法によればマーカー物質（Ａ５）～（Ａ８）の解析が容易である。
　「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質である。「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱落（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。さらに「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。なお、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
　同様の課題を解決するための本発明の他の様相は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
　本様相の物質の評価方法は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における上記（Ｂ１）～（Ｂ４）の４種のマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価するものである。上記マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また本発明の物質の評価方法では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。特に、アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ－アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。なお本様相においても「動物」にはマウス等の飼育可能な動物の他、ヒトも含むものとする。
　マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）はいずれも主に血液中に存在する。被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合、動物の体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより低値を示し、（Ｂ２）、及び（Ｂ３）の濃度はより高値を示す。
　本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱落も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
　好ましくは、前記基準値は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度である。
　この好ましい様相によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、より容易かつ高精度に評価することができる。
　好ましくは、前記糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物である。
　この好ましい様相の物質の評価方法では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物として、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物を用いる。この好ましい様相によれば、動物の飼育が容易となり、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、きわめて容易に評価することができる。なお当該動物の例としては、２型糖尿病発症型モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス等）が挙げられる。
　好ましくは、前記体液は、血液である。
　この好ましい様相によれば、測定試料となる体液を簡単に採取でき、より簡便かつ迅速に、被検物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
　好ましくは、前記被験物質は、食品素材である。
　この好ましい様相によれば、機能性食品の開発を目的として、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。
　好ましくは、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。
　この好ましい様相の物質の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を使用する。そして、該担体に体液又は体液成分を接触させて、体液又は体液成分に含まれるマーカー物質を、マーカー物質に対する親和性を有する物質を介して担体上に捕捉し、捕捉されたマーカー物質の量に基づいて体液中のマーカー物質の濃度を算出する。本様相の物質の評価方法によれば、担体上に捕捉されたマーカー物質を測定対象とするので、測定試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、体液成分の例としては、体液が血液である場合の血清又は血漿が挙げられる。
　好ましくは、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている。
　この好ましい様相の物質の評価方法では、平面部分を有する担体を用い、マーカー物質に対する親和性を有する物質は該平面部分の一部に固定化されている。かかる構成により、マーカー物質に対する親和性を有する物質を、担体上の複数箇所にスポット的に固定化することができる。その結果、１個の担体で複数の測定試料を同時処理することや、１個の担体で複数のマーカー物質の濃度を同時測定することが可能となり、作業効率がよい。さらに、各スポットの面積を小さくすることにより、微量の測定試料からでもマーカー物質の濃度を測定することができる。なお、平面部分を有する担体の例としては、チップ等の基板が挙げられる。
　好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
　この好ましい様相の物質の評価方法においては、マーカー物質に対する親和性を有する物質としてイオン交換体又は抗体を用い、イオン交換体又は抗体を介して測定試料中のマーカー物質を担体上に捕捉する。当該物質がイオン交換体の場合は各種のものが入手容易であり、マーカー物質を捕捉するための担体を容易に調製することができる。また、当該物質が抗体の場合は、より特異的にマーカー物質を捕捉することができる。捕捉されたマーカー物質の量を測定する方法としては、質量分析、イムノアッセイ（抗体の場合）が挙げられる。
　本発明のさらに他の様相は、本発明の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法である。
　本様相は物質のスクリーニング方法にかかり、動物の体液中における上記（Ａ１）～（Ａ８）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）から選択されるマーカー物質の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。上記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・リスクマーカーとして有用なものである。本様相の物質のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。特に、被験物質が食品素材の場合には、糖尿病性腎症の改善効果を有する機能性食品又は将来の発症リスクの低減効果を有する機能性食品の開発に有用な食品素材をスクリーニングすることができる。
　本発明のさらに他の様相は、本発明の物質の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする物質評価用キットである。
　本様相の物質の評価用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。かかる構成により、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
　好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
　好ましくは、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用される。
　本発明のさらに他の様相は、被験動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法である。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
　本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法は、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定するものである。上述したように、マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相では糖尿病自体を広く検出するマーカーではなく、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することができる。また本様相では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより高値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより低値を示す。
　ここで「将来の発症リスクを判定する」とは、疾病を発症していない時点において、将来、その疾病に罹患する可能性（危険性）の有無、又はその可能性（危険性）の程度を判定することをいう。
　好ましくは、下記（１）～（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
　アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ－アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、この好ましい様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法によればマーカー物質（Ａ５）～（Ａ８）の解析が容易である。
　本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加（例：リン酸化）のみならず、脱落（例：脱リン酸化）も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
　本発明のさらに他の様相は、被験動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法である。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
　本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法は、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定するものである。上述したように、マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）は、いずれも糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物の体液中で特異的に検出されるタンパク質であり、糖尿病性腎症の予防マーカー・発症リスクマーカーとして有用なものである。本様相では糖尿病自体を広く検出するマーカーではなく、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することができる。また本様相では体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。特に、アポリポタンパク質Ａ２、補体Ｃ３、プロ－アポリポタンパク質Ａ２、トランスサイレチンはいずれも物理化学的性質がよく知られているので、解析が容易である。
　なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより高値を示し、（Ｂ２）、及び（Ｂ３）の濃度はより低値を示す。
　本様相においても「タンパク質の修飾体」の代表例は、当該タンパク質を構成するアミノ酸残基の少なくとも１つが修飾されたタンパク質であり、「修飾」には化合物や官能基の付加のみならず、脱落も含まれる。また「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォーム、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質、並びに、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。さらに、複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。
　好ましくは、被験動物がヒトである。なお被験者としては、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者、糖尿病予備軍に属する者、健常者など、特に限定はない。
　好ましくは、前記体液が血液である。
　好ましくは、前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。
　好ましくは、前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されている
　好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
　本発明のさらに他の様相は、本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットである。
　本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。この好ましい様相によれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
　好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
　本様相の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットは、マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。この好ましい様相によれば、マーカー物質の濃度測定に際して当該担体を別途用意する必要がなく、きわめて簡便にマーカー物質の濃度を測定することができる。
　好ましくは、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体である。
　本発明の物質の評価方法によれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を、容易かつ高精度に評価することができる。また、体液を測定対象とするので、マーカー物質の濃度測定が容易に行える。さらにタンパク質をマーカーとするので、確立された種々のタンパク質解析技術を適用することができる。
　本発明の物質の評価用キットによれば、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果をきわめて簡便に評価することができる。
　本発明の物質のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質を、容易かつ高精度にスクリーニングすることができる。
　本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法によれば、糖尿病性腎症に特異的なマーカーを用いるので、高精度で糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することができる。
　本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットによれば、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクをきわめて簡便に判定することができる。
質量／電荷比が２３３９（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が２７８１（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が３３４２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が５８１５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が７９２５（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が９０７２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 質量／電荷比が１３７３４（平均値）のイオンピークについての箱髭図である。 マーカー物質（Ａ５）の精製過程で行った２次元電気泳動の結果を示す写真である。 マーカー物質（Ａ５）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。 マーカー物質（Ａ６）の精製過程で行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 マーカー物質（Ａ６）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。 マーカー物質（Ａ７）の精製過程で行った２次元電気泳動の結果を示す写真である。 マーカー物質（Ａ７）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。 マーカー物質（Ａ８）の精製過程で行ったＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 マーカー物質（Ａ８）の精製過程で行ったＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析の結果を示すイオンピーク図である。
　本発明の物質の評価方法は２つの様相を含む。１つの様相では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
（Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
　これらのマーカー物質はいずれも主に血液中に存在するタンパク質であり、糖尿病性腎症の発症直前段階にある動物体内で特異的に検出されるものである。なお、（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ１」と称することがある。）は、糖尿病性腎症を発症している状態又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高い状態でより高値を示すものであるので、被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより低値を示す。一方、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の各マーカー物質（以下、これらのマーカー物質からなるグループを「グループ２」と称することがある。）は、糖尿病性腎症を発症している状態又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高い状態でより低値を示すものであるので、被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する場合には、当該被験物質を摂取させた動物においてより高値を示す。
　ある条件のペプチドマッピングによれば、マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３、マーカー物質（Ａ７）はプロ－アポリポタンパク質Ａ２、マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチンと同定される。すなわち、ある実施形態では、下記（１）～（４）の少なくとも１つを満たす。
（１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
（３）マーカー物質（Ａ７）はプロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
（４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
　本発明の物質の評価方法の他の様相では、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価する。
（Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
（Ｂ３）プロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
（Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
　タンパク質の修飾の例としては、Ｎ末端αアミノ基やリジンεアミノ基のメチル化、アセチル化、アデニリル化、ミリスチル化等；セリン・スレオニン・アスパラギンへの糖又は糖鎖の付加；セリン・スレオニン・チロシン・アルギニン・ヒスチジンのリン酸化；システインのシステイニル化、ホモシステイニル化、スルホニル化等；グルタミン酸のγ－カルボキシル化；Ｎ末端グルタミン酸のピログルタミン酸への変換、等が挙げられる。また、これらの修飾の脱落（脱メチル化、糖又は糖鎖の脱落、脱リン酸化等）も「修飾」に含まれる。
　「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質のアイソフォームが含まれる。アイソフォームとしては、前記した各種の修飾の他、選択的スプライシングによって生じたタンパク質が挙げられる。さらに、「タンパク質又はその修飾体」には、当該タンパク質の１次構造において数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたような実質的に同一のタンパク質が含まれる。またさらに、「タンパク質又はその修飾体」には、プロテアーゼによる切断を受けた当該タンパク質由来のタンパク質断片が含まれる。例えば、当該タンパク質由来と認められうる長さのタンパク質断片、例えば２０個以上のアミノ酸残基からなるタンパク質断片、分子量が２千以上のタンパク質断片、等が挙げられる。例えば、補体Ｃ３はＣ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｃ、Ｃ３ｄの各ドメインを有するので、「補体Ｃ３又はその修飾体」には、各ドメインからなる補体Ｃ３のタンパク質断片（例えば、補体Ｃ３ａ）が含まれる。
　複合体タンパク質の場合には「タンパク質又はその修飾体」にはそのサブユニットも含まれるものとする。例えば、トランスサイレチンは４個のサブユニットからなる複合体タンパク質であるので、「トランスサイレチン又はその修飾体」にはトランスサイレチンのサブユニットが含まれる。
　本発明の物質の評価方法では、上記（Ａ１）～（Ａ８）並びに（Ｂ１）～（Ｂ４）の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
　本発明の物質の評価方法の好ましい実施形態では、上記基準値として、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度を用いる。すなわち、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた場合、その体液中の上記マーカー物質の濃度は「異常値」となる。そして、被験物質を摂取させた上記動物における値（測定値）と当該基準値（異常値）とを比較し、測定値が基準値と有意に差がありかつ正常側である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。具体的には、グループ１に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が当該基準値に比べて有意に低いときに、一方、グループ２に属するマーカー物質を指標とする場合は、測定値が基準値に比べて有意に高いときに、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
　さらに、基準値は複数あってもよい。例えば、上記の異常値に加え、糖尿病性腎症を発症していない動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが低い動物における値（正常値。陰性対照。）を基準値に加えることができる。具体的には、（１）糖尿病性腎症を発症していない動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが低い動物に、普通食又は被験物質を摂取させる群（正常値を示す群）、（２）糖尿病性腎症を発症している動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させる群（異常値を示す群）、及び、（３）糖尿病性腎症を発症している動物又は糖尿病性腎症の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させる群、の計３群を設定し、動物を飼育する。そして、各動物の体液中の上記マーカー物質を測定し、各測定値を比較する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）に近い側）である場合（正常側に維持された場合）に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
　さらに、基準値として、（４）糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質を摂取させる群、の動物における値（陽性対照）を加えることもできる。具体的には、上記（１）～（３）に加えて、上記（４）の群を設定し、動物を飼育する。このとき、（１）と（２）とで有意差があり、（３）と（２）とで有意差があり、かつ（３）が（２）に比べて正常側（（１）及び（４）に近い側）である場合に、当該被験物質が糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。すなわち、このような被験物質は、（４）で採用した上記既知物質と同様の挙動を示し、同様の作用を有する物質といえる。
　「糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する既知物質」の例としては、アスタキサンチンが挙げられる。アスタキサンチンはカロテノイドの一種であり、強力な抗酸化作用を有することが知られている。アスタキサンチン以外の物質でも、抗酸化作用を有する物質であれば前記既知物質となり得る。
　「糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」における動物の種類には特に限定はなく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ等を採用することができる。また、「糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物」としては、糖尿病性腎症の自然発症モデル動物、あるいはトランスジェニックやジーンターゲッティングによる遺伝子操作モデル動物が好ましく用いられる。当該動物の具体例としては、ｄｂ／ｄｂマウス等の２型糖尿病発症型モデルマウスが挙げられる。ｄｂ／ｄｂマウスは通常飼育で糖尿病性腎症を発症するので、飼育実験を容易に行うことができ、特に好適である。
　なお、ｄｂ／ｄｂマウスを通常飼育するといずれ糖尿病性腎症を発症するが、尿中８－ＯＨｄＧを指標とした検討によると、その発症は飼育１２週目ごろから検出可能となることがわかっている（前記非特許文献２）。よって、飼育１２週目以前、例えば飼育１０週目のｄｂ／ｄｂマウスは糖尿病性腎症の発症直前段階にあるといえる。本発明の物質の評価方法で用いるマーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）は、飼育１０週目のｄｂ／ｄｂマウスの体液中に存在し、糖尿病性腎症の発症直前段階にないマウス（例えば、正常マウス）と比較してその体液中の濃度に有意差を示す。したがって、本発明においてｄｂ／ｄｂマウスを用いる場合には、例えば、飼育１０週目ごろの体液を測定試料として各マーカー物質の濃度を測定すればよい。
　一方、特定の物質を摂取すると糖尿病性腎症を発症するような自然発症モデル動物を用いることもできる。例えば、ストレプトゾトシンを投与して糖尿病性腎症を誘発する系が知られており、動物に被験物質とストレプトゾトシンとを同時摂取させることにより、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することができる。さらに、動物としてヒトを採用することもできる。この場合には、臨床試験の結果によって物質を評価することになる。
　本発明の物質の評価方法において使用する動物の体液としては、血液が好ましく用いられる。特に、血液から調製した血清又は血漿（体液成分）を測定試料とすることが好ましい。血清又は血漿は遠心分離等の公知の方法で血液から調製することができる。
　本発明の物質の評価方法における被検物質としては、食品素材、医薬原体などが挙げられる。特に、食品素材を評価対象とする場合は、機能性食品の開発に役立てることができる。
　本発明の物質のスクリーニング方法は、本発明の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするものである。本発明の物質のスクリーニング方法においても、上記した本発明の物質の評価方法の実施形態と全く同様の実施形態をとることができる。
　本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法は２つの様相を含む。１つの様相では、被験動物から採取した体液における上記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定する。なお、糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ａ１）、（Ａ５）、及び（Ａ８）の濃度はより高値を示し、（Ａ２）、（Ａ３）、（Ａ４）、（Ａ６）、及び（Ａ７）の濃度はより低値を示す。
　本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法の他の様相では、被験動物の体液中における上記マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定する。糖尿病性腎症を発症しているか将来の発症リスクが高い場合、被験動物における体液中のマーカー物質（Ｂ１）及び（Ｂ４）の濃度はより高値を示し、（Ｂ２）及び（Ｂ７）の濃度はより低値を示す。
　好ましい実施形態では、被験動物はヒトである。なお被験者としては、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者、糖尿病予備軍に属する者、健常者など、特に限定はない。なお、糖尿病患者であるが現時点では糖尿病性腎症を発症していない者に本発明を適用すれば、その判定結果を元にその後の生活習慣指導を正確に行うことができる。
　本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法で使用する基準値は、例えば、糖尿病を発症していない健常人における上記マーカー物質の体液中の濃度データを収集し、その濃度値（すなわち健常値）を元に設定することができる。なお、基準値を段階的に複数設定し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを定量的に判定することも可能である。
　本発明の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法では、上記（Ａ１）～（Ａ８）並びに（Ｂ１）～（Ｂ４）の１つだけを用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を用いる場合の組み合わせ方については特に限定はないが、例えば、グループ１から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とグループ２から選択したマーカー物質（１つ又は複数）とを組み合わせることができる。
　本発明の物質の評価方法、物質のスクリーニング方法、及び糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法において、マーカー物質の濃度を測定する方法は、そのマーカー物質の濃度を特異的に測定できる方法であれば、タンパク質の定量に一般に用いられている方法をそのまま用いることができる。例えば、各種のイムノアッセイ、質量分析（ＭＳ）、クロマトグラフィー、電気泳動等を用いることができる。
　イムノアッセイによれば、夾雑物質の多い試料のままでも正確にマーカー物質の濃度を測定することができる。イムノアッセイの例としては、抗原抗体結合物を直接的又は間接的に測定する沈降反応、凝集反応、溶血反応などの古典的な方法や、標識法と組み合わせて検出感度を高めたエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）等の方法が挙げられる。なお、これらのイムノアッセイに用いるマーカー物質に特異的な抗体は、モノクローナルでもよいし、ポリクローナルでもよい。
　質量分析によれば、各マーカー物質由来のイオンピークを特定し、そのイオンピーク強度をもって各マーカー物質の量（濃度）を測定することができる。質量分析によってマーカー物質の濃度を測定する場合のイオン化の方法としては、マトリクス支援レーザーイオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization、ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（electrospray ionization、ＥＳＩ）のいずれも適用可能であるが、多価イオンの生成が少ないＭＡＬＤＩが好ましい。特に、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer、ＴＯＦ）と組み合わせたＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによれば、より正確にマーカー物質由来のイオンピークを特定することができる。
　電気泳動によりマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、検査材料をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に供して目的のマーカー物質を分離し、適宜の色素や蛍光物質でゲルを染色し、目的のマーカー物質に相当するバンドの濃さや蛍光強度を測定すればよい。ＳＤＳ－ＰＡＧＥだけではマーカー物質の分離が不十分な場合は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）と組み合わせた２次元電気泳動を用いることもできる。さらに、ゲルから直接検出するのではなく、ウエスタンブロッティングを行って膜上のマーカー物質の量を測定することもできる。
　クロマトグラフィーによってマーカー物質の濃度を測定する場合は、例えば、液体高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による方法を用いることができる。すなわち、試料をＨＰＬＣに供して目的のマーカー物質を分離し、そのクロマトグラムのピーク面積を測定することにより試料中のマーカー物質の濃度を測定することができる。
　好ましい実施形態では、マーカー物質を担体上に捕捉し、その捕捉されたマーカー物質を測定対象とする。すなわち、マーカー物質に対する親和性を有する物質を担体に固定化し、その親和性を有する物質を介してマーカー物質を担体上に捕捉する。そして、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出する。本実施形態によれば、試料中に含まれる夾雑物質の影響を低減させることができ、より高感度かつ高精度でマーカー物質の濃度を測定することができる。本実施形態において用いることができる担体の例としては、ビーズ、金属、ガラス、樹脂等のような一般的なものの他、基板のような、平面部分を有する担体を用いることができる。基板を用いる場合は、その平面部分の一部にマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化することが好ましい。例としては、基板としてチップを用い、その表面の複数箇所にスポット的にマーカー物質に親和性を有する物質を固定化した担体が挙げられる。なお「親和性」の例としては、イオン結合、金属キレート体とタンパク質中のヒスチジン残基等とのアフィニティ、抗原と抗体、酵素と基質、若しくはホルモンとレセプターのようなバイオアフィニティ、及び、疎水性相互作用のような化学的な相互作用、が挙げられる。
　イオン結合によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、イオン交換体を担体に固定化する。この場合、イオン交換体には陽イオン交換体、陰イオン交換体のいずれも用いることができ、さらに、強陽イオン交換体、弱陽イオン交換体、強陰イオン交換体、弱陰イオン交換体のいずれも用いることができるが、強陰イオン交換体と弱陽イオン交換体が好ましく用いられる。強陰イオン交換体の例としては、４級アンモニウム（トリメチルアミノメチル）（ＱＡ）、４級アミノエチル（ジエチル，モノ・２－ヒドロキシブチルアミノエチル）（ＱＡＥ）、４級アンモニウム（トリメチルアンモニウム）（ＱＭＡ）等の強陰イオン交換基を有するものが挙げられる。また、弱陽イオン交換体の例としては、カルボキシメチル（ＣＭ）等の弱陽イオン交換基を有するものが挙げられる。また、強陽イオン交換体の例としては、スルホプロピル（ＳＰ）等の強陽イオン交換基を有するものが挙げられる。さらに、弱陰イオン交換体の例としては、ジメチルアミノエチル（ＤＥ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）等の弱陰イオン交換基を有するものが挙げられる。
　金属キレート体を介してマーカー物質を捕捉する場合は、例えば、Ｃｕ2+、Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｃｏ2+、Ａｌ3+、Ｆｅ3+、Ｇａ3+等の金属キレート体を固定化した担体を用いることができる。
　抗体によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、マーカー物質に特異的な抗体を担体に固定化すればよい。
　疎水性相互作用によってマーカー物質を担体に捕捉する場合は、担体に疎水基をもつ物質を固定化する。疎水基の例としては、Ｃ４～Ｃ２０のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。
　本実施形態においてマーカー物質の測定方法にイムノアッセイを用いる場合は、抗体を固定化した担体を用いることが好ましい。このようにすれば、担体に固定化された抗体を１次抗体としたイムノアッセイの系を簡単に構築することができる。例えば、マーカー物質に特異的でエピトープの異なる２種類の抗体を用意し、一方を１次抗体として担体に固定化し、他方を２次抗体として酵素標識し、サンドイッチＥＩＡの系を構築することができる。その他、結合阻止法や競合法によるイムノアッセイの系も構築可能である。さらに、担体として基板を用いる場合は、抗体チップによるイムノアッセイが可能である。抗体チップによれば、複数のマーカー物質の濃度を同時に測定でき、迅速な測定が可能である。
　一方、本実施形態において質量分析を用いる場合は、例えば、抗体の他、イオン交換体、金属キレート体又は疎水基を固定化した担体を用いることができる。なお、これらの物質による結合は抗原と抗体等のバイオアフィニティほどの特異性がないので、これらの物質を固定化した担体を用いる場合はマーカー物質以外の物質も担体上に捕捉されうるが、質量分析によれば分子量を反映した質量分析計スペクトルによって定量するので、問題はない。特に、担体として基板を用い、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（surface-enhanced laser desorption/ionization）－飛行時間質量分析（time-of-flight mass spectrometry）（以下、「ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ」と称する）を行うことにより、マーカー物質の濃度をより正確に測定することができる。使用できる基板の種類としては、陽イオン交換基板、陰イオン交換基板、順相基板、逆相基板、金属イオン基板、抗体基板等を用いることができるが、陽イオン交換基板、特に弱陽イオン交換基板と、陰イオン交換基板、特に強陰イオン交換基板が好ましく用いられる。
　本発明の物質の評価方法、物質のスクリーニング方法、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法を簡便に行なうために、必要な試薬類をまとめて物質評価用キット、物質スクリーニング用キット、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キットを構築することができる。本発明のキットは、上記したマーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含む。好ましい実施形態では、マーカー物質に対する親和性を有する物質が、イオン交換体又は抗体である。例えば、ＣＭ等の弱陽イオン交換体を固定化した基板（弱陽イオン交換基板）、あるいはＱＡやＱＡＥ等の強陰イオン交換体を固定化した基板（強陰イオン交換基板）を含めたキットによれば、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ等を簡便に行なうことができる。本キット中には他の試薬類、例えば、各マーカー物質の標準品、各種バッファー等を含めてもよい。本発明のキットの構成例を以下に挙げる。
〔キットの構成例〕
（１）弱陽イオン交換基板：１枚
（２）強陰イオン交換基板：１枚
（３）基板洗浄用バッファーＡ（ｐＨ３．０）：適量
（４）基板洗浄用バッファーＢ（ｐＨ９．０）：適量
（５）各マーカー物質の標準品：各適量
　また本発明により、マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）及び（Ｂ１）～（Ｂ４）の、糖尿病性腎症に関係する事象、例えば、糖尿病性腎症の発症の有無、糖尿病性腎症の改善状態、糖尿病性腎症の将来の発症リスク、等を検出するためのバイオマーカーとしての使用、も提供される。
　以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
１．２型糖尿病発症型モデル動物を使った動物実験
　２型糖尿病発症型モデル動物としてｄｂ／ｄｂマウス（日本クレア社。以下、単に「腎症発症マウス」と略記することがある。）、正常動物としてｄｂ／ｍマウス（日本クレア社。以下、単に「正常マウス」と略記することがある。）を採用した。また、与える飼料としてＣＥ－２（日本クレア社。以下、単に「通常飼料」と略記する。）と、アスタキサンチン（富士化学工業社）を０．０２％（１０ｍｇ／ｋｇ体重に相当）含有するＣＥ－２（以下、単に「アスタキサンチン含有飼料」と略記する。）を採用した。
　マウスの種類と与える飼料の組み合わせが異なる以下の４つの群を設定し、飼育を開始した。各群の個体数は５匹以上とした。
　第１群：正常マウスを通常飼料で飼育
　第２群：腎症発症マウスを通常飼料で飼育
　第３群：腎症発症マウスをアスタキサンチン含有飼料で飼育
　第４群：正常マウスをアスタキサンチン含有飼料で飼育
すなわち、第１群は糖尿病性腎症を発症しない群、第２群は糖尿病性腎症を発症する群、第３群は糖尿病性腎症の発症が抑制される群、に相当する。第４群はアスタキサンチンの作用検証用の群である。
　６週齢から飼育を開始し、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて糖尿病性腎症が発症し始める飼育期間である１０週目に各群のマウスから血漿を採取し、体液試料とした。これにより、糖尿病性腎症の発症直前段階の体液試料が得られた。
２．プロテインチップによる解析とイオンピークの選抜
　採取した各体液試料２０μＬに、変性バッファー（９Ｍ 尿素、２％ ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０））３０μＬを加えて前処理を行い、タンパク質を変性させた。次に、前処理した各体液試料を強陰イオン交換樹脂カラム（Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥヘルスケア社）にアプライした。次いで、ｐＨ９．０の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１％（ｗ／ｖ）１－ｏ－Ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド（以下、「ＯＧＰ」と称する。））、ｐＨ５．０の緩衝液（１００ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、ｐＨ３．０の緩衝液（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）、０．１％（ｗ／ｖ）ＯＧＰ）、及び有機溶媒（０．１％トリフルオロ酢酸、５０．０％アセトニトリルからなる混合液）各２００μＬで順に溶出させ、画分１（ｐＨ９．０で溶出、素通り）、画分２（ｐＨ５．０で溶出）、画分３（ｐＨ３．０で溶出）、画分４（有機溶媒で溶出）の４つの粗分画画分を得た。
　得られた各画分１０μＬをｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ クエン酸ナトリウム）で１０倍希釈した後、弱陽イオン交換チップＣＭ１０（バイオラッド社）に添加した。同様に、得られた各画分１０μＬをｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０））で１０倍希釈した後、強陰イオン交換チップＱ１０（バイオラッド社）に添加した。各チップを各結合バッファーで３回洗浄した後に脱イオン水で１回洗浄し、乾燥させた。次に、エネルギー吸収分子であるシナピン酸（ＳＰＡ－Ｈ、ＳＰＡ－Ｌ）又はα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を添加し、プロテインチップリーダーＭｏｄｅｌ ＰＢＳ ＩＩｃ（バイオラッド社）を用いて、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった。なお、測定分子量範囲（ｍ／ｚ）は、３０００～２０００００の範囲で行なった。また、測定は２連で行い、ｍ／ｚの平均値を算出した。データ解析は、Protein Chip Software、CiphergenExpress Data Manager、及びBiomarker Patterns Software（いずれもバイオラッド社）を用いて行なった。具体的には、ベースライン補正、分子量校正、スペクトルの正規化処理を行なった後、シングルマーカー解析及び数本のマーカーを組み合わせたマルチフロー解析を行なった。その結果、粗分画画分の種類、プロテインチップの種類、チップの洗浄条件等の組み合わせによって多数のピークが検出された。各ピークについて、ｐ値（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定法）、ＲＯＣ面積、及びイオンピーク強度を算出し、さらに、以下の（１）～（４）の条件を指標として８個の候補ピークを選抜した。
（１）候補ピーク探索（基本）
　第１群と第２群との間でイオン強度に有意差がある（ｐ＜０．０５）。
（２）アスタキサンチン効果検証
　第２群と第３群との間でイオン強度に有意差があり（ｐ＜０．０５）、かつ第３群の値の方が第２群の値よりも第１群の値に近い（第３群の値が第１群側に復帰している）。
（３）増減パターン解析
　第２群のみが高値または低値を示し、第１群、第３群および第４群の間ではあまり差がない。なお、第３群と第４群との間に差があっても、第４群の値の方が第３群の値よりも第２群から離れている場合には本条件を満たすものとして取り扱う。
３．マーカー物質（Ａ１）の特定
　画分１（ｐＨ９．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が２３３９（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図１に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。図中、髭の上端と下端はそれぞれ最大値と最小値、箱の上辺と下辺はそれぞれ第３四分位（７５パーセンタイル）と第１四分位（２５パーセンタイル）、箱の中の線は中央値である（図２以降も同じ）。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８６、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０７０であった。
　以上より、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供すると質量／電荷比が約２３４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ１））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ１）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ１）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２３４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
４．マーカー物質（Ａ２）の特定
　画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が２７８１（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図２に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．８２、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．００８、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０７０であった。
　以上より、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供すると質量／電荷比が約２７８０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ２））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ２）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ２）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約２７８０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
５．マーカー物質（Ａ３）の特定
　画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が３３４２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図３に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７４、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４１、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０２８であった。
　以上より、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供すると質量／電荷比が約３３４０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ３））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ３）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ３）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約３３４０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
６．マーカー物質（Ａ４）の特定
　画分４（有機溶媒）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＡＭ：ＣＨＣＡ）を行なった場合に、質量／電荷比が５８１５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図４に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０８２であった。
　以上より、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供すると質量／電荷比が約５８２０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ４））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ４）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ４）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約５８２０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
７．マーカー物質（Ａ５）の特定
　画分３（ｐＨ３．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ－Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が７９２５（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図５に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０２８、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００７であった。
　以上より、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供すると質量／電荷比が約７９３０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ５））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ５）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ５）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約７９３０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
８．マーカー物質（Ａ６）の特定
　画分２（ｐＨ５．０）を弱陽イオン交換チップＣＭ１０に接触させ、ｐＨ３．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ－Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が９０７２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．７８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０４１、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．００４であった。
　以上より、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供すると質量／電荷比が約９０７０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ６））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ６）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ６）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９０７０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
９．マーカー物質（Ａ７）の特定
　画分１（ｐＨ９．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ－Ｌ）を行なった場合に、質量／電荷比が９３１２（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で高値を示し、第２群で低値を示した。図６に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００２、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０９６であった。
　以上より、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供すると質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ７））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ７）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ７）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約９３１０のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
１０．マーカー物質（Ａ８）の特定
　画分２（ｐＨ５．０）を強陰イオン交換チップＱ１０に接触させ、ｐＨ９．０のプロテインチップ結合バッファーで洗浄してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＥＡＭ：ＳＰＡ－Ｈ）を行なった場合に、質量／電荷比が１３７３４（平均値）のイオンピークが検出された。増減パターン解析の結果、本ピークは第１群、第３群および第４群で低値を示し、第２群で高値を示した。図８に、各群に分けて本ピークのピーク強度をプロットした場合の箱髭図を示す。その結果、本ピークのＲＯＣ面積（第１群ｖｓ第２群）は０．９８、ｐ値（第１群ｖｓ第２群）は０．０００３、ｐ値（第２群ｖｓ第３群）は０．０３４であった。
　以上より、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳに供すると質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質（マーカー物質（Ａ８））が、糖尿病性腎症を発症しているマウス、又は糖尿病性腎症の将来の発症リスクが高いマウスに特異的な物質であり、糖尿病性腎症のマーカーとなり得ることがわかった。これにより、被験物質を摂取させた糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物の体液中におけるマーカー物質（Ａ８）の濃度を指標として、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果の評価、並びに、そのような物質のスクリーニングが行なえることが示された。さらに、被験動物の血中におけるマーカー物質（Ａ８）の濃度を指標として、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定できることが示された。例えば、所望の被験物質を使用して同様の動物実験を行なって体液試料を調製し、同様の手順でＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳを行なった場合に、質量／電荷比が約１３７００のピークを生じるタンパク質の濃度が正常値に維持されたとき、該被験物質は、糖尿病性腎症の改善効果、又は将来の発症リスクの低減効果を有すると評価することができる。
１．マーカー物質（Ａ５）の精製と同定
　強陰イオン交換樹脂Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、及び１００ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）で順に洗浄した後、溶出バッファー（３３．３％ イソプロパノール、１６．７％ アセトニトリル、０．１％ トリフルオロ酢酸）でステップワイズ溶出し、ピーク画分を分取した。
　分取した画分の一部をＴＣＡ沈澱処理した後、２次元電気泳動を行った（図９）。１次元目にはＧＥヘルスケア社製Immobiline DryStrip pH4-7, 7cmを、２次元目にはＤＲＣ社製ポリペプチド分離用ゲル（１５－２０％）ＮＴＨ－５Ａ２Ｔを用いた。さらに、図９の矢印で示したスポットを切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ５）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１０）。
　あらためて同様の２次元電気泳動を行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、還元アルキル化処理した後、０．０１μｇ／μＬのトリプシン溶液（５０ｍＭ　炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解）を作用させてゲル内で消化した。消化したサンプル１μＬを金属プレート上に滴下し、飽和ＣＨＣＡ溶液０．４μＬをさらに滴下して乾燥させた後、質量分析計Proteomics Analyzer 4700（アプライドバイオシステムズ社)で測定したところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１０１９．５３」、「１１９３．６８」、及び「１８３１．９６」と算出された。これらのデータを元にＭａｓｃｏｔデータベース（マトリックスサイエンス社）によって既知タンパク質を検索し、ペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１０１９．５３」、「１１９３．６８」、及び「１８３１．９６」のペプチドはそれぞれ配列番号１～３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第１表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　なお、成熟型のマウス由来アポリポタンパク質Ａ２は、配列番号４で表わされる７８個のアミノ酸からなり、分子量が８７３６、等電点が４．９４、と報告されている。一方、本実施例でアポリポタンパク質Ａ２と同定されたタンパク質の分子量は約７９００、等電点は４．９４であった。このことから、当該タンパク質は配列番号４のアミノ酸番号１（Ｇｌｕ）から７０（Ｌｅｕ)に相当するアポリポタンパク質Ａ２の断片であることが示唆された。当該アポリポタンパク質Ａ２断片のアミノ酸配列を配列番号５に示す。
２．マーカー物質（Ａ６）の精製と同定
　強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社）を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿５００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を７５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。添加時の素通り画分を回収した。
　強陽イオン交換カラムＭｏｎｏＳ ５／５０ ＧＬ（ＧＥヘルスケア社）を前記平衡化バッファーで平衡化した。このカラムに回収画分を添加した。バッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）とバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１Ｍ ＮａＣｌ）を用いたグラジエント溶出（バッファーＢ：０％－１５％／２０ＣＶ，１５％－１００％／５ＣＶ，流速：１ｍＬ／分）により、２０ｍＬ付近に溶出されたピークを分取した。このピークに対してＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した。
　分取した画分をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲルＤＲＣ ＮＴＨ－５Ａ０Ｔゲル（ＤＲＣ社）を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った（図１１）。分離されたバンド（図１１の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を行い、マーカー物質（Ａ６）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１２）。
　あらためて同様のＳＤＳ－ＰＡＧＥを行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも８個のピークが検出され、それらの精密質量は、「７２５．３５」、「８６２．４５」、「９９４．５７」、「１０１８．５５」、「１１０８．５８」、「１２３６．６７」、「１３１２．６３」、及び「１４８２．７４」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「７２５．３５」、「８６２．４５」、「９９４．５７」、「１０１８．５５」、「１１０８．５８」、「１２３６．６７」、「１３１２．６３」、及び「１４８２．７４」のペプチドはそれぞれ配列番号６～１３で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「補体Ｃ３ａ」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第２表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、報告されているマウス由来補体Ｃ３ａのアミノ酸配列は配列番号１４で表される７８個のアミノ酸からなり、分子量が９２２５、等電点が９．４５、と報告されている。一方、本実施例で「補体Ｃ３ａ」と同定されたタンパク質の分子量は約９１００、等電点は９．２７であった。このことから、当該タンパク質は配列番号１４のアミノ酸番号１（Ｓｅｒ）から７７（Ａｌａ）の部分に相当する、補体Ｃ３ａからＣ末端アミノ酸のＡｒｇが欠失したタンパク質「補体Ｃ３ａ　ｄｅｓ　Ａｒｇ」であることが示唆された。「補体Ｃ３ａ　ｄｅｓ　Ａｒｇ」のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
３．マーカー物質（Ａ７）の精製と同定
　強陰イオン交換樹脂Ｑ－Ｃｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤＦ（日本ポール社）を充填したカラム（１ｍＬ)を平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿３００μＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を４５０μＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。添加時の素通り画分を回収した。
　分取した画分の一部をアセトン沈澱処理した後、２次元電気泳動を行った（図１３）。１次元目にはＧＥヘルスケア社製Immobiline DryStrip pH6-11, 7cmを、２次元目にはＤＲＣ社製ポリペプチド分離用ゲル（１５－２０％）ＮＴＨ－５Ａ０Ｔを用いた。さらに、図１３の矢印で示したスポットを切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ７）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１４）。
　上記１と同様にして２次元電気泳動による精製、ゲル内消化、及び質量分析を行ったところ、少なくとも３個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１１９３．６６」、「１６５７．７９」、及び「１８３１．９７」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１１９３．６６」、「１６５７．７９」、及び「１８３１．９７」のペプチドはそれぞれ配列番号１６～１８で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「プロ－アポリポタンパク質Ａ２」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第３表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　なお、マウス由来プロ－アポリポタンパク質Ａ２のアミノ酸配列は配列番号１９のとおりであり、これは、配列番号４に示したアポリポタンパク質Ａ２のＮ末端側に５個のアミノ酸からなるプロペプチドが付加された構造と同じである。
４．マーカー物質（Ａ８）の精製と同定
　強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰを平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，１Ｍ 尿素，０．２２％ ＣＨＡＰＳ）にて平衡化した。マウス標準血漿１ｍＬに対して変性バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０，９Ｍ 尿素，２％ ＣＨＡＰＳ）を１．５ｍＬ加えて変性処理した後、平衡化した前記カラムに添加した。洗浄バッファーＡ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ９．０）でカラムを洗浄し、さらに洗浄バッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．０）にてカラムを洗浄した。次に溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．０，５０ｍＭ ＮａＣｌ）にてステップワイズ溶出し、ピーク画分を分取した。
　分取した画分をアセトン沈殿処理した後、ポリペプチド分離用ゲルＤＲＣ ＮＴＨ－５Ａ０Ｔゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った（図１５）。分離されたバンド（図１５の矢印）を切り出してタンパク質を抽出し、ＳＥＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析を行い、精製過程における酸化修飾などによる誤差の範囲内でマーカー物質（Ａ８）と同等の質量／電荷比を示すピークを確認した（図１６）。
　あらためて同様のＳＤＳ－ＰＡＧＥを行って目的のタンパク質を含むバンドを切り出し、上記１と同様にしてゲル内消化及び質量分析を行ったところ、少なくとも６個のピークが検出され、それらの精密質量は、「１３８２．６３」、「１５１０．７３」、「１５５４．８２」、「２４３８．１７」、「２５１７．２０」、及び「３１２３．４８」と算出された。これらのデータを元に上記１と同様にしてペプチドマスフィンガープリンティングを行ったところ、精密質量「１３８２．６３」、「１５１０．７３」、「１５５４．８２」、「２４３８．１７」、「２５１７．２０」、及び「３１２３．４８」のペプチドはそれぞれ配列番号２０～２５で表わされるアミノ酸配列のペプチドと一致し、目的のタンパク質は９９％以上の確率で「トランスサイレチン」と同定された。各ペプチドの精密質量、アミノ酸配列、及び配列番号の対応関係を第４表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　なお、報告されているマウス由来トランスサイレチンのアミノ酸配列は配列番号２６に示すとおりである。

Claims (24)

  1. 　糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
    （Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
  2. 　下記（１）～（４）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１に記載の物質の評価方法。
    （１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
    （２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
    （３）マーカー物質（Ａ７）はプロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
    （４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
  3. 　糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に被験物質を摂取させ、該動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、被験物質が有する糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を評価することを特徴とする物質の評価方法。
    （Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
    （Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
    （Ｂ３）プロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
    （Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
  4. 　前記基準値は、糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物に、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有さない既知物質を摂取させた際の、該動物の体液中における前記マーカー物質の濃度であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
  5. 　前記糖尿病性腎症を発症している動物又は将来の発症リスクが高い動物は、自然発症モデル動物又は遺伝子操作モデル動物であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
  6. 　前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
  7. 　前記被験物質は、食品素材であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
  8. 　前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の物質の評価方法。
  9. 　前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項８に記載の物質の評価方法。
  10. 　前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の物質の評価方法。
  11. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の物質の評価方法によって被験物質を評価し、糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングすることを特徴とする物質のスクリーニング方法。
  12. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載の物質の評価方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする物質評価用キット。
  13. 　前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項１２に記載の物質評価用キット。
  14. 　糖尿病性腎症の改善効果又は将来の発症リスクの低減効果を有する物質をスクリーニングするために使用されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の物質評価用キット。
  15. 　被験動物から採取した体液における下記マーカー物質（Ａ１）～（Ａ８）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、前記被験動物における糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
    （Ａ１）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ２）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約２７８０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ３）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約３３４０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ４）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約５８２０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ５）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約７９３０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ６）ｐＨ３．０で弱陽イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９０７０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ７）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約９３１０のイオンピークを生じるタンパク質、
    （Ａ８）ｐＨ９．０で強陰イオン交換体に結合し、かつ質量分析に供すると質量／電荷比が約１３７００のイオンピークを生じるタンパク質。
  16. 　下記（１）～（４）の少なくとも１つを満たすことを特徴とする請求項１５に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
    （１）マーカー物質（Ａ５）はアポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
    （２）マーカー物質（Ａ６）は補体Ｃ３又はその修飾体である、
    （３）マーカー物質（Ａ７）はプロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体である、
    （４）マーカー物質（Ａ８）はトランスサイレチン又はその修飾体である。
  17. 　被験動物の体液中における下記マーカー物質（Ｂ１）～（Ｂ４）の少なくとも１つの濃度を基準値と比較し、糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクを判定することを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
    （Ｂ１）アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
    （Ｂ２）補体Ｃ３又はその修飾体、
    （Ｂ３）プロ－アポリポタンパク質Ａ２又はその修飾体、
    （Ｂ４）トランスサイレチン又はその修飾体。
  18. 　被験動物は、ヒトであることを特徴とする請求項１５～１７のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
  19. 　前記体液は、血液であることを特徴とする請求項１５～１８のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
  20. 　前記体液又は体液成分を、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体に接触させて、体液中の前記マーカー物質を担体上に捕捉し、捕捉された前記マーカー物質の量に基づいて体液中の前記マーカー物質の濃度を算出することを特徴とする請求項１５～１９のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
  21. 　前記担体は平面部分を有し、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、該平面部分の一部に固定化されていることを特徴とする請求項２０に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
  22. 　前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項２０又は２１に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法。
  23. 　請求項１５～２２のいずれか１項に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定方法に用いるためのキットであって、前記マーカー物質に対する親和性を有する物質を固定化した担体を含むことを特徴とする糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キット。
  24. 　前記マーカー物質に対する親和性を有する物質は、イオン交換体又は抗体であることを特徴とする請求項２３に記載の糖尿病性腎症の発症の有無又は将来の発症リスクの判定用キット。
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