KR102064060B1 - 뇌의 베타 아밀로이드 축적 감별용 혈중 바이오마커 - Google Patents

뇌의 베타 아밀로이드 축적 감별용 혈중 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본원은 알츠하이머성 치매 원인물질인 아밀로이드 베타의 뇌 침착에 대한 혈액 바이오마커에 관한 것이다. 본원에 따른 마커는 혈액을 이용하여 간편하고 신속하게 뇌 아밀로이드 베타 축적을 예측할 수 있어, 임상이 나타나기 전의 경도 인지장애 등을 포함하는 이와 관련된 질환의 진단 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

뇌의 베타 아밀로이드 축적 감별용 혈중 바이오마커{Blood biomarker for detecting accumulation of beta amyloid in brain}
본원은 알츠하이머성 치매 원인물질인 아밀로이드 베타의 뇌침착에 대한 혈액 바이오 마커에 관한 것이다.
뇌의 베타 아밀로이드가 축적되어 발생하는 대표적 질환인 알츠하이머병 또는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease: AD 또는 ADD)는, 치매 중 가장 일반적인 형태로서, 대표적인 신경 퇴행성 질환이다. 80세 이상 노인의 20% 이상이 알츠하이머병의 영향을 받고 있을 것으로 추정되며, 고령화 사회가 될수록 그 수가 급격히 증가하고 있다. 알츠하이머병은, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein: APP)이 β, γ- 시크리테아제에 의해 순차적으로 절단되어 생성되는 β-아밀로이드(Aβ peptide)가 뇌조직에 침착되는 노인반(senile plaque)과 미세소관 연관단백질인 타우(Tau) 단백질의 과인산화로 인한 신경섬유 덩어리(neurofibrillary tangle: NTF)가 주된 병리학적 특징이다. 알츠하이머병 환자의 뇌조직에서 일어나는 변화는, 환경 및 다양한 병인학적인 요인들에 의한 것으로서, 아직까지 뚜렷한 진단 방법과 치료 요법이 없다.
현재, 가장 일반적인 AD 진단 방법으로는, MRI(Magnetic resonance Imaging), PET(positron emission tomography) 등의 이미지 방법이나, 미니-인지 상태 검사(Mini mental state examination: MMSE), 문진 등의 간접적인 방법이 사용되고 있으나, MMSE를 통한 진단은 나이, 학력 등에 의해 그 결과가 달라지므로, 진단의 정확성이 문제가 되고 있다. MRI 및 PET은 비용이 높은 단점이 있다. 또한 AD 환자의 뇌 조직에서 노인반 및 신경섬유 덩어리 두 가지 병변을 확인하는 방법도 사용되고 있으나, 병을 진단하거나 진행 정도를 확실하게 파악할 수 있는 방법은 알려져 있지 않다.
AD 진단을 위한 생화학적 진단 표지자를 찾기 위한 연구는 중요한 연구 분야로서 혈액, 뇌척수액 등의 체액을 포함한 다양한 조직에서 이루어지고 있다. 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF)은, 뇌의 세포 외부 부분과 직접 접촉하는 부위로, 뇌의 단백질 변화를 반영하고 있으며, 정상 노인에 비해 알츠하이머병 환자의 CSF에서 Aβ42 농도의 감소, 전체 타우와 자가인산화 타우의 증가 등이 보고되고 있다. 그러나, 대부분의 AD 환자가 65세 이상의 고령임을 고려하면, 뇌척수액을 얻기 위한 요부천공(lumber puncture)의 경우, 상당한 위험을 동반한다.
알츠하이머성 치매의 원인물질이며 질병의 진행에 따라 뇌에 축적되는 아밀로이드 베타에 대해 특이적으로 결합하는 물질로 최근 개발된 Pittsburgh compound B (PIB)는 알츠하이머성 치매의 진단에 유용한 물질이다. PIB를 투여한 후 PET 영상을 찍음으로써 뇌의 아밀로이드 베타의 축적 정도를 측정하고 이를 알츠하이머성 치매의 진단에 효율적으로 이용할 수 있기 때문이다. 하지만 이 진단 방법은 고가의 비용과 장비의 제한성 때문에 보편적인 알츠하이머성 치매의 진단 방법으로 사용하기에 한계가 있다.
이와 비교하여 채취의 상대적인 용이성, 검사의 경제성, 시간절약 등을 고려하면, 혈액 진단 표지자는 많은 장점이 있다. 혈액 진단 표지자는 알츠하이머병 진행에 따른 뇌의 기능적 병리적 변화를 잘 반영할 수 있어야 하는 반면 알츠하이머병 진행에 따른 다양한 뇌 단백질들의 변화가 항상 혈액내에서 감지되지는 않아 진단 표지자 발굴의 어려움을 겪고 있다. 또한 대개의 알츠하이머병의 진행에 따라 증감되는 뇌 단백질이 뇌척수액이나 혈액 내에서는 반대의 증감 경향성을 보이고 있는 것이 일반화된 현상이다. 예를 들면, 알츠하이머병의 진행에 따라 뇌 아밀로이드베타42(Aβ42)는 증가하는 반면 뇌척수액 아밀로이드베타42는 감소하고, 트렌스 사이레틴은 뇌에서는 증가, 반면 혈액에서 감소함으로 알려져있다(Scheuner et al., Nature Medicine 2, 864-870 (1996); Galasko et al., Arch Neurol 55(7):937-45 (1998); Li et al., Journal of Neuroscience 31(35):12483-12490 (2011); 및 Han et al., Journal of Alzheimer disease 25(1)77-84 (2011)).
대한민국 공개특허공보 제2012-0041823호는 알츠하이머병 조기진단용 단백질성 마커에 관한 것으로 ATP synthase subunit beta 및 adenosine kinase(Isoform Long) 및 regucalcin을 이용한 알츠하이머병 조기 진단용 마커를 개시한다.
대한민국 공개특허 제2010-0049363호는 비타민 D 결합 단백질을 이용한 알츠하이머병의 진단장치 및 진단방법에 관한 것으로 비타민 D 결합 단백질과 결합하는 항체를 이용한 진단방법 및 장치에 대하여 개시한다.
대한민국 공개특허 제2014-0042331호는 인지장애 질환 진단용 다중 마커 및 그 용도에 관한 것으로 인지장애 질환 진단 마커로서 트랜스싸이레틴(Transthyretin), ApoE, 알파-사이뉴클레인(α-synuclein), 비타민 D 결합 단백질, 뉴로그레닌(neurogranin), 비멘틴(vimentin), 스테쓰민(stathmin), 컨텍틴(contactin), 및 HDL-콜레스테롤을 개시하고 있다.
하지만 알츠하이머병이 조기 진단이 어렵고, 병증이 계속 진행되면 사회적 비용이 많이 요구되는 정상 생활이 어려운 심각한 질환임을 고려하면, 혈액과 같은 간편한 시료를 통해 알츠하이머병의 조기 진단을 포함한 알츠하이머 중증도 진단은 물론 증상이 나타나기 전인 전임상(preclinical) 단계에서도 진단할 수 있는 새로운 마커 개발의 필요성이 있다.
최근 활발한 연구에 의해 다양한 알츠하이머성 치매 진단의 혈액 바이오 마커 후보물질들이 발굴되고 있으나 각각의 바이오 마커는 민감도와 정확성에 있어서 요구 기준을 충족시키지 못하고 있는 현실이다.
본원은 혈액을 이용하여 뇌의 베타 아밀로이드 플라크 축적 여부 예측 또는 이와 관련된 질환의 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 혈액에서 검출용 용도로서, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 알츠하이머성 치매를 포함하는 치매군을 포함하는 전주기에서 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이다.
다른 양태에서 본원은 상기 마커의 검출용 물질을 포함하는 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 조성물, 키트 또는 방법을 제공한다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커에서 상기 혈장 아밀로이드 베타는 MPP로 처리된 것이다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 혈액 특히 혈장에서 검출될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 상기 마커에 추가하여 ApoE를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커가 사용되는 인지장애 정상군은 특히 AchEI(억제제) 미복용군이다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 상기 마커에 추가하여 혈액검사의 통상적인 항목인 인, 유리 T3 및/또는 HDL 콜레스테롤을 마커로 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본원에 따른 마커는 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단 또는 PIB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography) 검사가 필요한 지 여부의 판단으로 사용되며, 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 아밀로이드 베타 축적으로 인한 질환 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환 진단은 인지장애 중증도 판단에 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부의 검출이 필요한 검사 대상자 유래의 혈액 샘플을 제공하는 단계; 상기 혈액 샘플에서 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커를 정량하는 단계로, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군을 대상자 혈액, 상기 마커 중 LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin 경도인지장애 환자군 대상자 혈액, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군 혈액, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 전주기 환자군의 혈액 시료에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부를 검출하며; 그리고 상기 정량된 각 마커의 양을 상기 대상자의 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부와 관련시키는 단계를 포함하는, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에서 연관시키는 단계는 대조군에서 결정된 정량 결과와 비교하여, 상기 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, 및 VE-cadherin은 모두 감소하는 경우, 상기 혈액이 유래된 대상자는 아밀로이드 베타가 축적된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것이다.
본원에 따른 상기 방법은 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단, 또는 PiB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography)검사가 필요한 지 또는 인지장애 중증도 판단에 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 마커는 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환 진단은 인지장애 중증도 판단에 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 마커는 혈액 특히 혈장에서 검출될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 마커는 상기 마커에 추가하여 ApoE를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 마커가 사용되는 인지장애 정상군은 특히 AchEI(억제제) 미복용군이다.
본원에 따른 바이오마커는 알츠하이머성 치매 원인물질인 아밀로이드 베타의 뇌 축적을 조기에 혈액에서 간편하고 신속하게 검출할 수 있다.
뇌의 아밀로이드 베타의 축적은 치매나 건망증 등의 임상적 증상이 나타나기 15~20년 전부터 시작되므로, 임상적 증상이 없거나 또는 경미한 임상적 증상을 나타내는 환자의 혈액검사를 통해 뇌 아밀로이드 베타 축적여부를 확인할 수 있는 본원에 따른 마커는 알츠하이머 치매를 조기에 검출할 수 있음은 물론, 조기에 그 진행을 늦추거나 막을 수 있어, 환자의 삶의 질을 획기적으로 개선할 수 있다.
나아가, 본원에 따른 마커는 인지기능 정도에 따른 세분화된 환자군, 즉 인지기능 정상군, 경도인지 장애군, 알츠하이머성 치매군 및 전주기 군에 따라 더욱 유효한 조합으로 구성될 수 있고, 이를 이용하여 정확도 및 유효성이 더욱 향상된다.
또한, 최근 뇌영상으로 뇌 아밀로이드베타의 축적을 확인할 수 있는 일부 대학병원에서만 시행할 수 있는 고가의 검사인 PiB-PET 영상을 대체 또는 영상 검사가 필요한 환자의 스크리닝 등에 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서 뇌 아밀로이드 베타의 축적을 혈액에서 간편에서 확인할 수 있는 본원에 따른 혈액 바이오마커는 환자의 편리성 및 비용 절감의 측면에서도 효과가 매우 크다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c는 혈액에서 본원의 바이오마커 검출을 통한 뇌 베타 아밀로이드 축적여부 감별을 위해 확립된 모델을 도식적으로 나타낸 것으로, 도 1a는 본원에서 마커 발굴 시료 별 아밀로이드 베타 축적을 촬영한 PET 영상결과로, PET영상 결과는 뇌 아밀로이드 베타 축적을 측정하는 표준 방법으로, 혈액 바이오마커와 뇌의 베타의 축적과 연관이 있는지 확인할 수 있다. 도 1b 및 도 1c는 세분화된 환자군에 따른 모델 별 마커를 나타낸 것이다. PiB-PET 양성자에서 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, VE-cadherin은 모두 감소한다. 이는 PiB-PET 결과와 본원에 따른 마커의 높은 관련성을 나타내는 것으로, 본원에 따른 마커가 뇌의 베타 아밀로이드 축적에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
도 2a는 모델 1로 인지기능 정상군(CN)에서 뇌 베타 아밀로이드 축적군(CN 중 A베타+ vs A베타-) 감별 결과를 나타낸다.
도 2b는 도 2a와 동일하나, 인(Phosphorous)을 추가의 바이오마커로 사용한 결과이다.
도 3a는 모델 2로 경도인지장애 환자군(MCI)에서 뇌 베타 아밀로이드 축적군(MCI 중 A베타+ vs A베타-) 감별 결과를 나타낸다.
도 3b는 도 3a와 동일하나, 인을 추가의 바이오마커로 사용한 결과이다.
도 4a는 모델 3으로 중증치매가 아닌 환자군(CN과 MCI)에서 뇌 베타 아밀로이드 축적군(CN+MCI 중 A 베타+ vs A 베타-) 감별 결과를 나타낸다.
도 4b는 도 4a와 동일하나, 인을 추가의 바이오마커로 사용한 결과이다.
도 5a는 모델 4로 전주기에서 아밀로이드 축적군(인지기능 관계없이 전체 대상자에서 A 베타+ vs A 베타-) 감별 결과를 나타낸다.
도 5b는 도 5a와 동일하나, HDL 콜레스테롤 및 유리 T3(free triiodothyronine)를 추가의 바이오마커로 사용한 결과이다.
도 6은 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD, Alzheimer Disease Dementia), 및 전주기(PIB- vs PIB+) 혈액에서 LGALS3BP를 ELISA로 정량한 실험 결과이다. 이는 LGALS3BP의 정량 값을 인지기능 정상군, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매군, 및 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군(-)과 양성군(+)을 비교하였을 때 유의한 변화를 보이므로 본원에 따른 모델 1 내지 4에 모두 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다.
도 7은 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 및 전주기(PIB- vs PIB+) 혈액에서 ACE를 ELISA로 정량한 실험 결과이다. 이는 ACE의 정량값을 인지기능 정상군, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매군, 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군(-)과 양성군(+)을 비교하였을 때 경도인지장애 및 전주기에서 유의한 변화를 보이고 정상군, 알츠하이머성 치매군에서 감소경향을 보이므로 본원에 따른 모델 1 내지 4에 모두 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다.
도 8은 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 및 전주기(PIB- vs PIB+) 혈액에서 TSP-1를 ELISA로 정량한 실험 결과이다. 이는 TSP-1의 정량값이 인지기능 정상군, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매군, 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군과 양성군을 비교하였을 때 전주기에서 유의한 변화를 보였으므로 본원에 따른 모델 4에 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다.
도 9는 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 및 전주기(PIB- vs PIB+)의 혈액에서 AChE를 ELISA로 정량한 실험 결과이다. 이는 AChE의 정량값이 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군(-)과 양성군(+) 을 비교하였을 때 정상군에서 유의한 변화를 보였으므로 본원에 따른 모델 1에 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다. AChE 억제제 (AChEI)미복용 그룹을 사용하였다. 절반 이상의 MCI환자나 거의 모든 AD 환자가 AChE 억제제를 복용하고 있기 때문에 AChE는 특이 인지기능 정상군의 마커로서 유용하다. AChE 억제제를 복용하고 있는 경우, 뇌 아밀로이드 축적에 의해 혈중 AChE의 농도 변화가 있는지를 확인하기 어렵고, 인지기능 정상군에서는 AChE 억제제를 복용하지 않아 뇌 아밀로이드 축적과의 연관성을 확인할 수 있다.
도 10은 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 및 전주기(PIB- vs PIB+) 혈액에서 MPP-아밀로이드베타를 ELISA로 정량한 실험결과이다. 이는 MPP 아밀로이드베타 40 및 42의 정량값이 정상군, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매군, 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군(-)과 양성군(+)을 비교하였을 때 42/40비율이 정상군 및 전주기에서 유의한 변화를 보였으므로 본원에 따른 모델 1 내지 4에 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다.
본원은 인지기능 및 PIB PET 영상에 따라 6개 그룹의 환자군에서 대규모 코호트 개별 검증을 실시하여 뇌의 베타 아밀로이드 침착 또는 축적과 유의적으로 상관관계를 보이는 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)의 바이오마커 발굴을 기초로 한 것이다. 나아가 상기 마커는 각 세분화된 환자에 따라 더욱 유효한 조합으로 구성될 수 있고, 이를 이용하여 정확도와 유효성이 향상된 환자 군별 혈중 바이오마커의 이용이 가능하게 되어, 정상군, 인지경도장애군 또는 모든 그룹에서 사용가능한, 뇌에 아밀로이드가 축적되었는지를 예측할 수 있는 마커이다.
이에 한 양태에서 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 베타 아밀로이드 축적 여부 감별 또는 판단용 용도에 관한 것이다.
이러한 용도는 상기 마커를 인비트로 또는 인비보에서 검출할 수 있는 검출용 물질을 포함하는 조성물, 키트의 형태, 또는 상기 마커 자체를 포함하는 조성물의 형태, 또는 상기 마커를 이용한 베타 아밀로이드 축적 검출 방법의 형태로 구현될 수 있다.
현재까지 아밀로이드베타 플라크 축적 여부 검출 또는 예측은 아밀로이드 베타 플라크의 축적의 검출은 알츠하이머성 치매환자의 사후 뇌 조직검사에 의해 확인되었고 알츠하이머성 치매를 확진했다. 최근 뇌영상으로 뇌 아밀로이드베타의 축적을 확인할 수 있는 PIB-PET 등의 기술이 개발되었으나 이는 매우 고가의 검사이고 일부 대학병원에서만 시행할 수 있는 고가의 장비이며 환자에게도 여러 불편을 준다. 따라서 뇌 아밀로이드 베타의 축적을 확인할 수 있는 본원에 따른 혈액 바이오마커는 그 중요성이 매우 크다.
뇌 아밀로이드 베타의 축적은 치매나 건망증 등의 임상적 증상이 나타나기 15~20년 전부터 시작되므로 임상적 증상이 없거나 또는 경미한 임상적 증상을 나타내는 환자의 혈액검사를 통해 뇌 아밀로이드 베타 축적여부를 확인할 수 있다면 알츠하이머 치매를 조기 진단할 수 있고 조기에 그 진행을 늦추거나 막을 수 있다. 또한 뇌 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 알츠하이머병 환자로 확인할 수 있어, 이러한 환자에 대한 치료전략을 달리 할 수 있다.
또한 본원에 따른 마커를 이용한 뇌의 베타 아밀로이드 축적 검출은 또한 베타 아밀로이드가 축적되어 발생되는 질환의 진단에 또한 사용될 수 있다.
구체적으로, 뇌에 베타 아밀로이드가 축적되어 발생되는 다양한 질환이 알려져 있고 (Head, E., and Lott, I. T. (2004) Down syndrome and beta-amyloid deposition. Curr Opin Neurol 17; Primavera et al., (1999) Brain Accumulation of Amyloid-beta in Non-Alzheimer Neurodegeneration. J Alzheimers Dis; Masliah et al., (2001) beta-amyloid peptides enhance alpha-synuclein accumulation and neuronal deficits in a transgenic mouse model linking Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci), 따라서 본원에 따른 마커는 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 다양한 질환의 진단, 검출 등에 사용될 수 있다.
일 구현예에서 이러한 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환은 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함한다.
본원에서 “인지장애”는 신경 퇴행성 질환을 일컫는 것으로 예를 들면 알츠하이머(AD : Alzheimer Disease)성 치매, 파킨슨병 치매, 루이소체치매 또는 헌팅톤병 치매, 알츠하이머성 치매증상(ADD) 보유군, 치매로 진행되기 전단계인 약한 인지기능 장애, 즉 경도 인지장애(MCI : Mild Cognitive Impairment)를 포함하는 것으로, 이런 의미에서 치매 또는 비치매 환자군을 모두 포함할 수 있다. 이러한 인지장애의 중증도는 MMSE (Mini mental state examination, 2006_Benson et al., Journal of clinical Psychiatry, 2008_O’Bryant et al., Arch Neurol) 스코어 등과 같은 방법으로 분류될 수 있다.
본원에서 “치매”는 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 또는 헌팅톤병 치매를 포함한다.
본원에서 “비치매”는 인지기능 정상군 및 경도인지 장애군을 포함한다.
본원에서 “인지기능 정상군”은 베타 아밀로이드 축적 여부와 관계없이, 상술한 MMSE 등의 검사를 통해 인지기능이 정상으로 판별된 군을 의미한다. 인지기능이 정상인 경우라도, 인지기능 저하 없고 뇌 아밀로이드 베타 축적이 있는 정상인을 포함한다. 베타 아밀로이드가 뇌에 축적이 되어 있는 경우에는 경도 인지장애를 거쳐 치매로 진행될 수 있기 때문에, 인지기능 정상군에서의 베타 아밀로이드 축적 여부를 판별하는 것은 치매의 조기 발견에 매우 중요하다.
본원에서 “경도인지 장애군”은 인지기능 저하가 있지만 일상생활이 가능한 치매의 전단계로서 뇌 아밀로이드 베타 축적이 없는 환자 및 베타 축적이 있는 환자로서 인지기능 저하가 있지만 일상생활이 가능한 치매의 전단계를 포함한다.
이런 측면에서 인지기능의 저하 정도에 따라, 인지기능 정상군, 경도인지 장애군 및 알츠하이머성 치매증상(ADD) 보유군을 포함하는 치매군의 순서로 인지기능의 저하 정도가 심화된다.
본원에서 치매 환자군은 인지기능저하가 있고, 알츠하이머성 치매증상(ADD) 보유군, 치매로 진단받은 환자로서 뇌 아밀로이드 베타 축적이 없는 환자는 물론 인지기능저하가 있고 치매로 진단받은 환자로서 뇌 아밀로이드 베타 축적이 있는 환자를 포함한다.
본원에서 “전주기”는 치매로 진단되는 과정에 이르기까지의 모든 환자군을 포함하는 것으로, 인지기능 정상군, 경도인지장애군 및 치매 환자군을 포함하는 것이다. 또한 PiB-PET 양성 및 음성 환자를 모두 포함하는 것이다.
본원에 따른 일 구현예에서 특히, 치매는 알츠하이머성 치매이다.
본원에서 “알츠하이머성 치매” 또는 “알츠하이머 병”은 신경 퇴행성 뇌질환으로 기억력을 포함한 인지기능의 약화가 점진적으로 진행되는 병으로, AD 또는 ADD(알츠하이머성 치매)로도 불린다. 이는 임상증상이 나타나기 전인 전임상(preclinical) 알츠하이머병 뿐만 아니라, 치매로 진행되기 전단계인 약한 인지기능 장애 즉 경도 인지장애를 포함할 수 있다. 대다수의 알츠하이머병 환자의 뇌에는 신경반(혹은 노인반) 또는 신경섬유다발이 생성되는데, 신경반(혹은 노인반)은 베타 아밀로이드 단백질의 침착과 신경섬유다발은 타우 단백질(tau protein)의 과인산화, 염증반응, 산화적 손상 때문인 것으로 알려져 있다. 상기 전임상 알츠하이머병은 임상적 소견은 보이지 않지만 뇌의 아밀로이드 플라크 침착이 나타나는 단계를 말한다.
본원에서 “아밀로이드 베타 플라크” 또는 “베타 아밀로이드 플라크”는 아밀로이드 베타를 포함하는 불용성 섬유성 단백질 응집체이며, 본원에서 A-베타로도 표기되며, 주성분은 A-베타40 또는 A-베타42 이다. 일 구현예에서는 상기 아밀로이드 플라크는 세포 내, 세포 표면에, 및/또는 세포 사이의 공간에 존재하는 것일 수 있다. 특히 신경조직의 세포 사이의 공간에 존재하는 것이며, 알츠하이머 치매 진단의 표지 물질로 사용되며, 플라크의 축적 정도에 따른 치매 진단은 개시된 바를 참고할 수 있다(Mawuenyega et al., Science, 2010_Querfurth and LaFerla, The New England journal of medicine). 문맥에 따른 아밀로이드 베타 플라크를 아밀로이드 베타로 칭할 수 있으며, 이는 당업자가 용이하게 판단할 수 있을 것이다.
본원에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본원에서 “조기 진단”은 경도인지장애, 또는 임상증상이 나타나기 전인 전임상(preclinical) 단계에서 진단하는 것을 포함한다.
본 발명에서 용어 “진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 알츠하이머병을 정상과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 적절한 대조군에 비하여 질환을 가진 대상자의 혈액에서 증가 양상을 보이는 단백질 등을 포함한다. 본원에 따른 마커 중 Periostin은 아밀로이드 베타 플라크의 축적과 함께, 혈중 농도가 증가하며, LGAL, ACE, AChE, TSP1, VE-cadherin은 아밀로이드 베타 플라크의 축적과 함꼐, 혈중 농도가 감소한다(도 6 내지 도 10 참조). 본원에서 상기 마커에 더하여 추가로 사용되는 마커는, 정상 대조군 또는 PiB-PET 음성 대상자의 결과와 비교하여, 혈액의 인, Free T3 농도는 낮아지고, HDL cholesterol의 농도는 유의적으로 높아진다.
본원에 따른 마커 Periostin, VE-cadherin, ACHE, TSP-1, LGALS3BP 및 ACE은 단백질 및 핵산 서열, 세포내 프로세싱, 변형 등은 하기 표 1과 같이 공지된 것으로, 당업자라면, 상기 마커의 검출에 필요한 서열 및 검출 방법을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
[표 1]
Figure 112018028043189-pat00001
본원에 따른 마커 중 혈장 아밀로이드 베타는 혈장 전처리 조성물(MPP)은 프로테아제 억제제 및 포스파타아제 억제제를 혼합한 혼합물(Mixture of protease inhibitors and phosphatase inhibitors)로 처리된 것이다. 이에 대하여는 원 발명자가 출원한 대한민국 공개특허 제2016-0129444호에 상세하게 개시된 것을 참조할 수 있다.
본원에 따른 마커는 특히 혈액 시료에서 검출된다. 혈액시료는 치매의 진단에 사용되는 뇌 척수액과 같은 시료와 비교하여, 매우 용이하게 얻을 수 있는 것으로, 비용의 절감은 물론 편리성이 매우 증대된다. 본원에 따른 마커가 사용되는 검체는 전혈, 혈소판, 혈장 또는 혈청 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서는 혈장이 사용된다. 본원에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 진단 또는 검출이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 질환을 갖는 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다.
본원의 마커는 특히 인지기능 저하 정도에 따라 세분화된 환자 즉, 인지기능 정상군, 인지경도장애군 또는 전주기 군에 따른 마커로 조합되어, 정확도와 유효성이 향상된 환자군 별 검출이 가능하다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커 중 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다. 일구현예에서, 특히 ACHE 마커는 ACHE 억제제 미복용 환자에서 사용된다.
다른 구현예에서 본원에 따른 마커 중 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 치매군을 포함하는 전주기의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다.
또 다른 구현예에서 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 치매군을 포함하는 전주기의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 마커는 상기 각 군의 검출 마커에, 후술하는 ApoE 유전자형 검사를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 마커는 상기 각 군의 검출 마커에, 후술하는 통상적인 혈액 검사에서 측정하는 항목인, 인, 유리 T3 및/또는 HDL 콜레스테롤을 추가의 마커로 포함할 수 있다. 이러한 마커는 ApoE의 존재 또는 부재하에 사용될 수 있다.
또한 본원의 마커는 인지장애의 발병 및 진행 정도에 대한 지표가 될 수 있으며, 발병, 질환의 진행 정도, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.
따라서 다른 측면에서 본원은 상술한 바와 같은 본원에 따른 마커 또는 마커의 조합을 아밀로이드 베타 플라크 축적의 예측, 조기 진단, 또는 PiB-PET 영상 검사가 필요한지를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 마커를 이용한 혈액검사에서 뇌에 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 것으로 판단된 경우는 PiB-PET 영상을 검사할 필요가 없고, 축적된 것으로 판단된 경우는 확진을 위해 PiB-PET 영상 검사를 할 수 있다.
본원에 따르면 알츠하이머성 치매의 진단에 널리 사용되는 PiB-PET의 뇌영상 결과에 근거한 알츠하이머성 치매의 원인물질로 알려진 아밀로이드 베타 플라크 축적 결과와 본원에 따른 혈액 마커의 농도가 높은 연관성이 있는 것으로 나타났다. 즉 PiB-PET 양성 대상자에서는 PiB-PET 음성 대상자의 결과와 비교하여, 혈액에서 본원에 따른 마커들의 농도가 유의적으로 증가 또는 감소하는 것으로 나타났다. 즉 도 1a를 참조하면, PiB-PET 양성자에서 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, VE-cadherin은 모두 감소한다. 이는 본원에 따른 마커가 뇌의 베타 아밀로이드 축적에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다. 본원에서 상기 마커에 더하여 추가로 사용되는 마커는, 정상 대조군 또는 PiB-PET 음성 대상자의 결과와 비교하여, 혈액의 인, Free T3 농도는 낮아지고, HDL cholesterol의 농도는 유의적으로 높아진다.
본원에서 용어 “검출시약”은 본원에 따른 마커를 검출 또는 정량할 수 있는 시약으로, 예를 들면 본원의 마커를 단백질 및/또는 유전자 또는 mRNA와 같은 핵산수준에서 검출할 수 있는 물질이거나, 그 외의 경우, 본원 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.
본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 하기 실시예를 포함한 본원의 기재를 고려하여 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것 방법을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어 본원에 따른 각 마커의 검출 방법은 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.
예를 들면 단백질 수준의 검출 방법 및 시약은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다. 일 구현예에서 항원-항체 반응을 효소 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 면역 측정법(sandwich ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴블랏, 면역 점 블랏 분석법(Immuno dot blotting assay), 면역형광측정법(Immuno-fluorescence Assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence Assay), 면역 조직 화학 염색법 또는 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography, Rapid), 비드나 디스크를 이용한 항원항체 반응(X-MAP technology) 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면 본원에 따른 조성물은 마커를 단백질 수준에서의 검출에 필요한 시약을 포함한다. 예를 들면 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자 등을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 필요한 경우 나노입자 또는 칩에 통합하여 사용할 수 있다.
본원의 다른 구현예에 따르면 검출시약은 항체를 포함하며, 본원의 마커의 검출은 이에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 이용하여 실시된다.
본원에 이용될 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
다른 양태에서 본원은 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부의 검출이 필요한 검사 대상자 유래의 혈액 샘플을 제공하는 단계; 상기 혈액 샘플에서 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커를 정량하는 단계로, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 치매군을 포함하는 전주기 환자 유래의 혈액에서 검출하는 것이고; 그리고 상기 검출된 마커의 양을 검사 대상자의 뇌의 아밀로이드 베타 축적 또는 이외 관련된 질환 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 대상자의 검체로부터 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 아밀로이드 베타는 앞서 언급한 바와 같이 MPP로 처리된 것이 사용된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 ApoE 마커의 사용을 추가로 포함할 수 있다.
ApoE 유전자는 ApoE 2, ApoE 3, ApoE 4의 세가지 유전자 타입이 있는데 ApoE 4를 가지고 있는 사람이 AD에 걸릴 확률이 안 가지고 있는 사람에 비해서 매우 높음이 이미 널리 알려져 있는 리스크 인자이다. 따라서 AD의 유전적 위험요소라고 알려져 있고 이 유전자 검사를 함으로서 AD를 예측할 수 있다. ApoE (Apolipoprotein E)는 E2(cys112, cys158), E3(cys112, arg158), 및 E4(arg112, arg158)라고 불리는 세 종류의 대립형질이 존재하여 한 개체의 유전체형은 E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, 또는 E4/E4 형으로 존재한다. 이중 E4 대립형질은 인구의 약 20% 정도에서 발견되며, 알츠하이머 치매 발병 위험도를 증가시키는 것으로 알려졌다. 본원에 따르면 ApoE 유전자형 마커를 본원에 따른 마커에 추가하여 사용하는 경우 특이성과 민감도가 향상될 수 있다. ApoE 유전자형의 검출은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 실시예에 개시된 바와 같이 대립유전자 특이적 프라이머를 이용한 PCR 방법이 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 통상적 혈액 검사 항목인, 인, 유리 T3, HDL 콜레스테롤 중 하나 이상의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 HDL 콜레스테롤, 유리 T3, 및 인의 각 마커는 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.
본원에 따른 방법은 특히 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단용으로 사용되며, 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함한다.
본원에 따른 방법은 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환 진단은 인지장애 중증도 판단을 포함한다.
본원의 방법은 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), 또는 MMSE(mini-mental status examination) 또는 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET) 중 하나 이상을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원 방법은 마커의 검출 결과를 뇌의 아밀로이드 베타 플라크 축적과 관련된 질환의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 양을 대조군과 비교한다.
일 구현예에서 본원에서 대조군으로서 PIB-PET 결과에서 음성으로 판단된 사람의 혈액시료에서 결정된 수치를 포함하는 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커의 검출결과와 비교, 예를 들면 그 증감을 비교한 후, 이를 근거로 축적을 예측 또는 진단하는 것이다.
예를 들면 대조군의 값과 비교하여 본원에 따른 마커 중 하나 이상이 유의하게 증가 또는 감소된 경우, 대상자에서 플라크의 축적 또는 상기 질환이 발생한 것으로 진단하는 정보를 제공할 수 있다.
예를 들면 상기 연관시키는 단계는 PIB PET 결과에서 음성으로 판단된 사람 또는 정상 대조군의 혈액시료에서 결정된 수치를 포함하는 정량 결과와 비교하여, 상기 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, 및 VE-cadherin은 모두 감소한다. 또한 예를 들면 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 양을 PIB PET 결과에서 음성으로 판단된 사람 또는 정상 대조군의 혈액시료에서 결정된 정량 결과와 비교하여, 인, 유리 T3 농도는 낮아지고, HDL cholesterol 농도는 유의적으로 높아진다.
예를 들면 또한 한 개 이상의 마커를 동시에 사용하여(다중마커) 그 증감 등 변화의 정도를 한 개의 수치로 산출하였을 때 수치가 일정 기준 이상 또는 이하인 경우 뇌 아밀로이드 베타 축적을 예측할 수 있다. 인지기능정도(즉, 인지기능 정상군, 경도인지장애군, 알츠하이머성 치매군)에 따른 환자에서 아밀로이드 베타 축적을 위한 본원에 따른 모델 1 내지 4의 다중마커의 조합은 예를 들면 본원 실시예 2에 개시된 것과 같은 식을 이용하여, 컷오프 수치를 결정하고, 이를 아밀로이드 베타 축적 판별에 사용될 수 있다.
또한 본원 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 정상 대조군과 대상자의 시료를 비교한 후, 상기 각 마커에 대하여 플라크의 축적 예측 또는 질환의 발병여부를 진단할 수 있는 임계값을 설정한 후, 대상자의 검출 결과를 상기 임계값과 비교할 수 있다. 예를 들면 본원 실시예에 기재된 바와 같이 뇌 아밀로이드 베타 플라크의 축적 여부 즉 음성과 양성을 판별하는, 즉 PiB-PET 음성과 양성을 판별하는 각 마커의 임계값은 본원에 따른 결과를 메드 칼큘레이트 프로그램을 이용하여 ROC커브 분석에 의해 결정된 Youden index를 근거로 결정될 수 있다. 상기 임계값은 뇌에 아밀로이드 베타 플라크 축적 양성을 나타내는 것으로, PiB-PET 검사 대상자 선별, 뇌 아밀로이드 베타 플라크 축적과 관련된 질환의 진단 등에 사용될 수 있다.
PIB-PET 검사는 환자에게 불편함을 물론 많은 비용과 시간이 소요되기 때문에, 아밀로이드 플라크 축적의 가능성이 높은 사람을 대상으로 하는 선별과정이 절실한 실정이다.
다른 양태에서 본원에 따른 방법은 알츠하이머성 치매를 포함하는 뇌의 아밀로이드 베타 플라크 축적의 판단이 필요한 검사 대상자가 뇌의 PIB-PET 검사가 필요한 지 여부에 대한 정보를 제공하기 위해, 상기 대상자 유래의 혈액시료를 제공하는 단계; 상기 혈액시료에서 본원에 따른 마커를 정량하는 단계; 및 상기 마커의 농도를 대조군으로서 PIB-PET 검사 음성으로 판단된 대조군과 비교하여 상기 대상자를 PIB-PET 검사 대상자로 결정하는 단계를 포함하는, PIB-PET 검사가 필요한 대상자 선별을 위한 마커의 검출 방법을 제공한다. 예를 들면 본원에 따른 마커를 이용한 혈액검사에서 뇌에 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 것으로 판단된 경우는 PiB-PET 영상을 검사할 필요가 없고, 축적된 것으로 판단된 경우는 확진을 위해 PiB-PET 영상 검사를 할 수 있다.
아울러 상술한 본원에 따른 모든 방법에서 상기 각 마커에 대하여는 상술한 바를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 바이오마커의 발굴 및 측정 방법
1-1. 코호트 대상자 모집 및 선별평가
외래/치매지원센터/포스터 등을 통해 대상자를 모집하고, 임상/신경심리 평가 시행하여 선정기준/제외기준 해당여부를 평가하였다. 이때 제외기준은 만족하지 않으면서 선정기준을 모두 만족하는 경우에만 다음 단계인 기저평가(상세평가)를 진행하였으며, 해당사항 없을 경우 탈락(Screening failure)하였다.
선정기준은 임상진단(National Institute on Aging and the Alzheimer's Association (NIA/AA)에서 발행하는 알츠하이머성 치매 진단 임상기준, Nihon Rinsho. 2016 Mar;74(3):386-94 등 참조)을 적용하므로 경도인지장애 임상기준, 알츠하이머성 치매 임상기준이 적용되었다. 경도인지장애는 특정 검사 항목의 z-score가 cut-off 보다 낮아야 선정기준을 만족하였다. Z-score란 원점수를 대상자의 연령, 성별, 교육년수를 고려한 평균과 표준편차를 적용했을 때 (원점수-평균)/(표준편차) 공식으로 구한 점수이다.
기저평가는, 위 선별평가를 통과하여 선정/제외기준을 모두 만족하는 군에 대해서 뇌영상 평가(PET-MRI) 및 혈액 검사, 상세 임상평가 및 상세 신경심리평가 등 그 외 추가적인 설문지 평가를 수행하였다.
위와 같은 단계를 거쳐 총 429명의 정상군, 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매 환자가 선별되었으며 이들에 대하여 12시간 금식을 한 후 아침에 병원내원하여 채혈을 하고 하기와 같이 PIB PET 스캔 등을 실시하였다. 채혈한 혈액을 이용하여 단백질을 검출 및 정량을 실시하였다.
1-2. PiB - PET영상 스캔
참가자는 Biograph mMR scanner (Siemens, Washington DC, USA)를 이용하여 T1-강조 MR 및 3차원 PiB-PET 영상을 측정하였다. 555 MBq의 11C-PiB를 정맥 주입한지 40분 후에, 30분 송출 스캔을 얻었다. 데이터는 반복 방법(21 서브세트의 6 반복)을 사용하여 256 X 256 영상 매트리스로 변환하여, 균일성, 초단파 에코타임9UTE)-기초 감쇠(attenuation), 및 붕괴 감소(decay reduction)에 대해 교정하였다. Sagittal T1-강조(반복 타임 - 1370ms; 에코 타임 = 1.89ms; 관측 시야, 250nm; 256 x 256 1.0 mm 슬라이스 두께의 매트릭스)를 얻었다. MATLAB 2014a (MathWorks, Natick, MA)에 있는 Statistical Parametric Mapping 8 (SPM8)을 사용하여 영상을 전-처리하였다. PiB-PET 데이터를 개인 T1 영상으로 공동-등록하여 표준 Montreal Neurological Institute (MNI) 템플레이트에 대한 변형 파라미터를 계산하였다. Individual Brain Atlases using Statistical Parametric Mapping 소프트웨어(IBASPM)를 사용하여 AAL(automatic anatomic labeling) 116 atlas (Weiss, 1989)로부터의 좌표를 각 개체에 대한 개별 공간으로 변형시키는 역 변형 파라미터를 계산하였다(resampling voxel size = 1 × 0.98 × 0.98 mm). T1-coregistered PiB-PET 영상에서 얻은 individual AAL116 atlas를 사용하여 국소 뇌 평균 11C-PiB 업테이크를 계산하였고 정량적 표준화(normalization)를 위하여 소뇌 회백질 11C-PiB 업테이크 수치를 사용하였다. ROI(region of interest)을 결정하기 위하여, AAL 알고리듬 및 영역-병합 방식 region-combining method (Yaffe et al., 2011)을 적용하여, 뇌 영역을 정면, 외측 두정엽, 대상-설전부(posterior cingulate-precuneus, PC-PRC), 및 현저한 11C-PiB 리텐션(retention)이 있는 것으로 보고된(Klunk W. E. et al., 2004. Imaging brain amyloid in Alzheimer's disease with Pittsburgh Compound-B. Ann Neurol 55(3), 306-319.) 측변 측두부(lateral temporal region)로 나누었다. 각 ROI 내의 모든 복셀(voxel)에 대한 평균치를 동일 영상에서의 평균 소뇌 엡테이크 수치로 나누어 SUVR(standardized uptake value ratio) 수치를 계산하였다. 4개의 ROI(i.e., frontal, lateral temporal, lateral parietal, and PC-PRC) 중 최소 하나에서 SUVR 수치가 1.4가 넘으면 PiB 양성(PiB+)으로 개체를 분류하거나, 4개 ROI 모두의 SUVR 수치가 1.4 이하이면 PiB 음성(PiB-)으로 분류하였다. PiB-는 아밀로이드 침착이 음성인 개체를 의미하는 반면 PiB+는 아밀로이드 침착이 양성인 개체를 의미한다. 뇌 전체 아밀로이드 침착 수치(SUVR)는 피질 전체 ROI의 모든 복셀에 대한 평균치를 동일 영상의 평균 소뇌 업테이크 수치로 나누어 계산하였다.
PIB PET 스캔 영상 촬영 결과 총 429명 중에 282 PET 음성, 그리고 147 PET 양성 환자인 것으로 나타났다. 이들의 PIB PET 결과(양성 음성 판별 결과, PIB PET의 정량적 결과인 SUVR 값)와 혈액에서 마커의 정량을 통한 ROC 커브 분석을 통해 상관관계, 특이성(specificity), 민감성(sensitivity) 및 AUC 등을 분석하였다(실시예 2 참조, 도 1 내지 도 5).
1-3. 혈액 바이오마커 선별
각 군의 환자 10명의 샘플로 질량분석 실험을 통한 글로벌 및 당쇄화 프로테오믹스 분석(Li et al, 2014, Journal of Proteome Res 13, 3488-3497)을 실시하여 3948 단백질 그룹을 동정하였고 이 결과를 바이오인포마틱스 분석(Kang et al., 2016, Journal of Alzheimer’s disease 53, 1563-1576)에 의해 이중 각 군별로 차이가 나는 바이오마커 후보 단백질들을 선별하였다. 동정된 바이오마커 후보 단백질 중 순위가 높은 단백질 즉, 뇌 아밀로이드 베타 음성 정상군 대비 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성군인 경도인지장애, 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성군인 알츠하이머병 환자에서 증가하거나 감소한 단백질 순서로, 혈액에서 ELISA을 통해 정량을 한 결과 본원의 마커를 선별하였다.
1-4. 혈중 단백질 농도의 측정 (ELISA, 효소 결합 면역 침강 분석법)
혈중의 아밀로이드 베타의 농도는 혈장 전처리 조성물의 처리 후, 그 농도를 X-MAP 기술을 이용하여 측정하였다. 혈장 전처리 조성물은 상기 프로테아제 억제제 및 포스파타아제 억제제를 1:1(v/v)로 포함한다. 또한, MPP는 프로테아제 억제제 칵테일(Protease inhibitor cocktail, PIC):PMSF(Serine protease inhibitor):포스파타제 억제제 칵테일 Ⅰ:포스파타제 억제제 칵테일 Ⅱ를 1:1:1:1(v/v)로 혼합한 것일 수 있다. 이는 기허가 받은 특허[혈장 내 아밀로이드베타의 농도를 통해 알츠하이머병을 임상학적 및 병리학적으로 모니터링하는 방법, 특허번호 10-1786859] 에 자세히 기술되어있다. 측정 방법을 간단히 기술하면, 아밀로이드 베타 42와 40의 농도를 동시에 측정하기 위하여 INNO-BIA plasma Aβ forms kit (Fujirebio 사) 제품을 사용하였다. 항체가 결합되어있는 비드를 먼저 플레이트에 통과시켜 비드를 플레이트에 장착 후, MPP를 처리한 혈장 용액 샘플을 30분간 인큐베이션 한 후, standard(표준농도) 샘플들과 함께 플레이트에 넣어주었다. 이후 conjugate 항체가 붙은 비드를 넣고 하루 동안 냉장보관 하였다. 다음날, 플레이트를 워시한 이후, detection 항체를 넣어 주고 1시간을 인큐베이션 하였다. 마지막 단계로 reading 용액을 넣어서 X-MAP 기술을 이용하여 혈장 내 MPP로 전처리된 아밀로이드 베타를 측정하였다.
혈중 단백질 LGALS3BP, ACE, AChE, TSP1, Periostin, 그리고 VE cadherin의 농도는 ELISA(효소 결합 면역 침강 분석법) 방식을 이용하여 측정하였다. 이는 항원-항체 반응과 전량분석(colometric analysis)을 이용하여, 생체시료에 들어있는 특정 단백질 양을 측정하는 실험 방법이다. 상세한 실험방법은 각 제품(LGALS3BP, abnova사, KA0140; ACE, R&D사, DACE00; AChE, R&D사, DACHE0; TSP1, R&D사, DTSP10; Periostin, CUSABIO사, CSB-E16444h; VE-cadherin, R&D사, DCADV0)의 안내서를 따라 실험하였다. 간단히 설명하자면, 분리된 혈장 용액 샘플과 standard(표준농도) 샘플을 타겟 항체가 코팅된 플레이트에 넣어주고 상온에서 1시간 반에서 2시간을 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 이후, 각 웰은 wash 용액으로 5회 씻어준 뒤 conjugate 항체를 넣어주고 다시 2시간 인큐베이션 하였다. 다시 한번 각 웰을 씻어준 뒤, HRP의 활성도를 측정하기 위하여 Tetramethylbenzidine (TMB) 용액을 넣어주었다. 30분 뒤, 포화를 방지하기 위하여 stop 용액을 넣어주고, 플레이트는 450 nm에서 신호를 측정하였다.
1-5. 혈액검사
(1) 콜레스테롤 : 비색법 ( Colorimetric method)
검사장비로는 ADVIA 1800 Auto Analyzer(Siemens, USA), 검사시약은 HDL-Cholesterol(Siemens,UK)를 사용하였으며, 참조 수치(reference)는 40-60mg/dL이다. 검사원리는 다음과 같다. HDL 콜레스테롤 직접 측정법(D-HDL method)은 Izawa, Okada, 및 Matsui가 개발한 절차에 근거하여, 전 분리(prior separation) 없이 혈청 및 혈장 내 HDL 콜레스테롤을 측정하였다. 비-HDL 입자 유래의 콜레스테롤은 반응의 첫 단계에서 유리되어 제거되었다. HDL 입자 유래 콜레스테롤은 R2의 detergent에 의해 두 번째 단계에서 유리되었고, HDL 콜레스테롤은 Trinder reaction으로 측정하였다.
상기 방법은 하기 두 단계로 이루어져 있다:
a.콜레스테롤 에스터라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제에 의한 킬로미크론, VLDL-콜레스테롤, 및 LDL-콜레스테롤의 제거. 상기 옥시다아제에 의해 생성된 과산화물을 카탈라아제로 제거하였다.
b. 시약 2의 계면활성제에 의한 HDL-콜레스테롤 유리 후의 HDL-콜레스테롤의 specific measurement. 상기 단계 a의 카탈라아제는 R2의 소디운 아자이드로 저해하였다. 596nm에서 측정한, Trinder 반응에서 생성되는 퀴논이민의 강도는 콜레스테롤 농도에 정비례한다.
(2) 유리 T3 : 화학발광면역측정법( Chemiluminescence immunoassay, CIA)
검사장비로는 ADVIA Centaur XP(Siemens, USA), 검사시약은 Free T3(Siemens, USA)를 사용하였으며, 참조 수치(reference)는 1-23개월 3.3-5.2 pg/mL, 2-12세 3.3-4.8 pg/mL, 13-21세 3.0-4.7 pg/mL, >21세 2.30-4.2 pg/mL이다. 검사원리는 다음과 같다: chemiluminescent를 이용한 Two-step sandwich immunoassay. 혈청중의 FrT3와 FrT3 reagent가 경쟁적으로 결합하여 solid phase의 paramagnetic particle을 형성하고, 여기에 Lite reagent의 acridinium ester-labeled mouse anti-T3 antibody가 결합하여 나타나는 RLU(relative light units)를 측정하였다.
(3) 인 : 비색법 ( Colorimetric method)
검사장비로는 ADVIA 1800 Auto Analyzer(Siemens, USA), 검사시약은 Pi(Siemens, UK)를 사용하였으며, 참조 수치(reference)는 2.4-5.1 mg/dL이다. 검사원리는 다음과 같다. 무기 인은 황산 존재시에 암모늄 몰리브데이트와 반응하여 비환원 포스포몰리브데이트 복합체를 생성하는데, 종결반응으로서의 상기 복합체를 340/658 nm에서 측정하였다.
1-6. MPP-처리된 아밀로이드 베타 측정
대한민국 공개특허 2016-0129444 “혈장내 아밀로이드베타의 농도를 통해 알츠하이머병을 임상학적 및 병리학적으로 모니터링하는 방법”에 기재된 방법을 참조하였다. 사용된 시약은 다음과 같다. protease inhibitor cocktail (PI), phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF, a serine protease inhibitor; Sigma Aldrich, CA, USA) and phosphatase inhibitor cocktail I and II (PPI I and II; A. G. Scientific, Inc., CA, USA)로 구성된 프로테아제 및 포스파타제 억제제(MPP)가 동일한 비율로 혼합된 혼합물을 사용하였다. Aβ 펩타이드는 American Peptide Company, Inc. (Sunnyvale, CA, USA)에서 구입하고 인간 혈청 알부민은 Sigma Aldrich에서 구입하였다.
혈액시료
하룻밤 금식 후에 정맥혈을 채취하여 K2 EDTA tubes (BD Vacutainer Systems, Plymouth, UK)로 수집하고, 700 ×g 에서 5분 동안 실온에서 원심분리를 수행하여 혈장을 분리하여 15 ml 원심분리 튜브에 수득하였다. 고순도 시료를 얻기 위해, 혈장 시료는 동일한 조건에서 다시 원심분리를 한 후 분주하여 즉시 -80도에 얼렸다.
Aβ 측정
Aβ42 및 Aβ40의 혈중 농도를 동시에 측정하기 위하여, INNO-BIA plasma Aβ forms kit (Innogenetics, Gent, Belgium)를 제조자의 방법대로 사용하였다. 요약하면, 혈장을 MPP 처리된 혈장 희석 완충액 또는 MPP 비처리된 혈장 희석 완충액으로 3배 희석하고 실온에서 30분간 두었다. 이어 필터 플레이트를 세척하고, 희석된 베드 믹스를 플레이트의 각 웰에 옮겼다. 이어 플레이트를 조심스럽게 말린 후 세척하고, 25μL의 컨쥬게이트 1 워킹 용액 A 및 75μL의 표준물질, 블랭크, 대조군 및 혈장 시료를 각 웰에 추가하였다. 이어 플레이트를 섭씨 4도에서 하룻밤 배양하고, 각 웰에 100μL 검출용액을 추가하였다. 1시간 후에 플레이트를 세적하고 각 웰에 판독 용액을 추가하였다. 혈장 아밀로이드 베타 농도는 X-map technology (Bioplex 200 systems; Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였다.
1-7. ApoE 유전자형 분석: 대립유전자특이적 중합효소연쇄반응법 (ASP- PCR : Allele specific primer-polymerase chain reaction)
특정 유전자 변이가 있는 대립유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭반응의 유무로 특정 유전자 변이를 확인할 수 있는 방법을 사용하였다.
구체적으로, Salting out method 이용하여 검체로부터 DNA를 추출하였다. 이어 ApoE PCR Master Mixture (Biocore)를 제조자의 방법대로 사용하여 분석하였다. 타입에 따른 PCR 산물의 크기는 표 2에 기재되어 있다. 알츠하이머성 치매의 위험요소로서 E4를 가지고 있는 경우 병에 걸릴 위험이 크다. 즉 E4/4가 가장 병에 걸릴 위험이 크고 그 다음 E4/3형이다.
[표 2]
Figure 112018028043189-pat00002
실시예 2. 본원의 바이오마커를 조합으로 사용한 인지기능 정도에 따른 베타 아밀로이드 축적 판별
Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme) 마커들은 상술한 바와 같은 ELISA 실험방식으로 실시예 1의 각 환자의 혈액에서 정량하고 아밀로이드 베타는 X-MAP 기술(2017 Park et al., Alzheimer’s research & Therapy)로 혈액내 농도를 정량하였다.
도 2 내지 도 5 서는 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군 및 알츠하이머성 치매군의 각 군에 해당하는 환자 혈액에서 특히 유효성을 보이는 마커들을 조합한 후, 각 마커의 조합에 대하여, 하기 식과 같은 로지스틱 회귀분석을 통하여 pi로 표시되는 값 또는 통합적 지수를 산출하였고 상기 수치에 따라 뇌 아밀로이드 베타 축적여부를 예측하는 분석을 하였으며, 산출된 통합적 지수 Pi 값이 Youden’s J statistic (Ruopp et al. Biom J. 2008 Jun; 50(3): 419-430)을 이용하여 각 모델별로 결정된 cut off 기준보다 증가 시 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성, 낮으면 음성으로 판별하였다. 또한 상기 통합적 지수를 이용한 ROC 커브 분석을 통하여 특이성 및 민감도를 결정하여 예측 유효성/정확도를 산출하였다.
또한 상기 도 2 내지 도 5의 각 마커의 조합은 ApoE의 유전자형 검사와 조합으로 사용하여 판별되었다.
또한 상기 도 2 내지 도 5의 각 마커의 조합은 ApoE의 존재 또는 부재하에서, 인, 자유 T3 및/또는 HDL 콜레스테롤과 함께 사용되어 판별되었다.
[수식 1a]
ln{pi/(1-pi)} = β0+β1x1,i+β2x2,i+…+βmxm,i
(pi: 예측 확률, β0: 상수, β1~m: 변수의 계수)
변수의 개수는 사용되는 마커 개수에 따라 변하며, 6개의 마커를 사용하는 경우의 식은 다음과 같다.
[수식 1b]
ln{pi/(1-pi)} = β0+β1x1,i+β2x2,i+β3x3,i+β4x4,i+β3x5,i+β3x6,i
(β0: 회귀분석 방정식 모델의상수, β1: MPP-Aβ42/40 비율의 계수, β2: LGAL의 계수, β3: ACE의 계수, β4: TSP-1의 계수, β5: AChE의 계수, β6: Periostin의 계수, x1: MPP-Aβ42/40 비율값, x2: LGAL의 정량값 x3: ACE의 정량값, x4: TSP-1의 정량값, x5: AChE의 정량값, x6:Periostin의 정량값)
상기 식 1a로부터 Pi 값은 다음과 같은 식을 통해 구하였다.
[수식 2]
Figure 112018028043189-pat00003
본원에서 X-MAP 기술(2017 Park et al., Alzheimer’s research & Therapy)을 통해 얻은 혈장 아밀로이드 베타 농도, ELISA 실험을 기반으로 하여 얻은 각 마커의 혈중 단백질 농도는 통계분석을 통하여 다중 바이오마커 변수로 활용되었다.
통계분석은 Graphpad Prism 5(GraphPad Software, Sandiego, CA, USA) 및 MedCalc(MedCalc Software, Ostend, Belgium) 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 모든 데이터는 평균의 표준오차(mean ± standard error of the mean, SEM)로 표기되었다. 또한 단일 스튜던트 t-검정(unpaired student’s t test)을 이용하여 혈장 내 단백질농도를 통해 PiB-PET 양성 또는 음성군을 비교하였다. ANOVA 분석 후에는 GraphPad Prism 5로 Tukey’s 다중비교 검정을 수행하였다. 진단 테스트의 성능을 평가하기 위하여, MedCalc로 ROC(Reveiver Operating Characteristic) 커브분석에 따른 로지스틱 회귀분석(Logistic regression)을 수행하였다. 또한 이 데이터를 활용하여 ROC curve를 그리고 AUC(Area under the curve)를 Wilcoxon 통계를 이용하여 측정하였다. 다중 로지스틱 회귀 분석 시엔 각각의 변수들을 독립변수로 활용하여, 최종적인 모델을 도출해 내었고, 이때 성별과 나이 같은 공변수는 보정변수로 활용되었다.
또한 로지스틱 회귀분석으로 도출된 새로운 종합변수는 ROC 커브 분석을 통해 뇌 아밀로이드 축적 여부를 가리는데 활용되었으며, 회귀분석을 통해 얻은 cut-off 값(Criterion 값)을 통해 PiB-PET 양성과 PiB-PET 음성을 구별하는 것의 기준점으로 활용되었다.
결과는 도 2 내지 도 5에 개시되어 있다. 도 2 내지 도 5는 각각 각 모델의 특이성 및 민감도, 정확도를 결정하는 AUC(Area Under curve) 수치를 나타낸다. 또한 ApoE를 추가로 포함하는 경우의 특이성과 민감도가 향상되는 결과를 나타낸다.
상기 각 모델에서 Youden’s J statistic를 통해 결정된 Pi 컷오프 값은 다음과 같다: 모델 1: 0.63, 모델 1(ApoE 추가): 0.67; 모델 2: 0.46, 모델 2(ApoE 추가): 0.68; 모델 3: 0.51, 모델 3(ApoE 추가): 0.59; 모델 4: 0.49, 모델 4(ApoE 추가): 0.58.
하지만 상기 컷오프 값은 일예로 검사 목적 등에 따라 변동될 수 있다. 예를 들면 건강검진에서 스크리닝 목적으로 수행하는 경우에는 가능한 모든 대상자를 포괄하기 위해, 컷오프 값을 낮게 잡을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (16)

  1. Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme) 마커의 혈액에서의 검출용 물질을 포함하며,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 알츠하이머성 치매군를 포함하는 치매군을 포함하는 전주기에서 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 혈장 아밀로이드 베타는 MPP로 처리된 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군은 AchE 억제제 비복용자인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 ApoE를 추가로 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 인, HDL(High Density Lipoprotein) 및 유리 T3(free triiodothyronine) 중 하나 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단, 또는 PIB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography) 검사가 필요한 지 여부의 판단용으로 사용되며,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단은 인지장애 중증도 판단을 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  8. 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부의 검출이 필요한 검사 대상자 유래의 혈액 샘플을 제공하는 단계;
    상기 혈액 샘플에서 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme) 마커를 정량하는 단계로,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군 대상자 혈액, 상기 마커 중 LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin 경도인지장애 환자군 대상자 혈액, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군 혈액, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 전주기 환자군의 혈액 시료에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부를 검출하며; 그리고
    상기 정량된 각 마커의 양을 상기 대상자의 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부와 관련시키는 단계를 포함하는, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 혈장 아밀로이드 베타는 MPP로 처리된 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군은 AchE 억제제 비복용자인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 ApoE를 추가로 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 인, HDL (High Density Lipoprotein) 및 유리 T3 중 하나 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  13. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 관련시키는 단계는 대조군에서 결정된 정량 결과와 비교하여, 상기 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, 및 VE-cadherin은 모두 감소하는 경우, 상기 혈액이 유래된 대상자는 아밀로이드 베타가 축적된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 관련시키는 단계는 대조군에서 결정된 정량 결과와 비교하여, 상기 인, 유리 T3의 농도는 감소하고, HDL의 농도는 증가하는 경우, 상기 검사 대상자를 뇌 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  15. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단 또는 PiB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography)검사가 필요한 지 여부의 판단용으로 사용되며,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    뇌 아밀로이드 베타 축적 질환 진단은 인지장애 중증도 판단을 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
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