WO2018174585A2 - 뇌의 베타 아밀로이드 축적 감별용 혈중 바이오마커 - Google Patents

뇌의 베타 아밀로이드 축적 감별용 혈중 바이오마커 Download PDF

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Definitions

  • the present application relates to a blood biomarker for brain deposition of amyloid beta, an Alzheimer's dementia cause.
  • Alzheimer's disease or Alzheimer's disease a representative disease caused by the accumulation of beta amyloid in the brain, is the most common form of dementia and is a representative neurodegenerative disease. It is estimated that more than 20% of elderly people over 80 years of age are affected by Alzheimer's disease, and the number is rapidly increasing in an aging society.
  • Alzheimer's disease includes senile plaque and microparticles in which amyloid precursor protein (APP) is sequentially cleaved by ⁇ and ⁇ -secretase to deposit ⁇ -amyloid (A ⁇ peptide) in brain tissue.
  • Neurofibrillary tangles (NTFs) due to hyperphosphorylation of the canal associated protein Tau protein are the main pathological features. Changes in the brain tissue of Alzheimer's disease patients are due to environmental and various etiological factors, and there are no clear diagnostic methods and treatment regimens yet.
  • AD diagnostic methods include imaging methods such as magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography (PET), and indirect methods such as mini mental state examination (MMSE) and questionnaire.
  • imaging methods such as magnetic resonance imaging (MRI) and positron emission tomography (PET)
  • MMSE mini mental state examination
  • MRI and PET have a high cost disadvantage.
  • a method of identifying two lesions of senile plaques and nerve fiber masses in the brain tissue of AD patients has been used, but there is no known method for diagnosing the disease or clarifying progress.
  • Cerebrospinal fluid is a site of direct contact with extracellular parts of the brain and reflects changes in the protein of the brain and decreases A ⁇ 42 levels, total tau and autophosphorylation in CSF in patients with Alzheimer's disease, compared to the normal elderly. Tau increases have been reported. However, considering that most AD patients are older than 65 years of age, there is a significant risk of lumbar puncture for cerebrospinal fluid.
  • Pittsburgh compound B which is a causative agent of Alzheimer's dementia and which specifically binds to amyloid beta that accumulates in the brain as the disease progresses, is useful for the diagnosis of Alzheimer's dementia.
  • PET images can be used to measure the degree of amyloid beta accumulation in the brain and to effectively use it for the diagnosis of Alzheimer's dementia.
  • this diagnostic method is limited to the general diagnosis of Alzheimer's dementia.
  • Blood diagnostic marker In comparison with this, in consideration of the relative ease of collection, the economics of the test, and the time saving, the blood diagnostic marker has many advantages. Blood diagnostic markers should be able to reflect the functional pathological changes of the brain as the disease progresses, while various brain proteins are not always detected in the blood as Alzheimer's disease progresses. . In addition, it is a general phenomenon that brain proteins, which increase or decrease with the progression of Alzheimer's disease, show opposite trends in cerebrospinal fluid or blood.
  • brain amyloid beta42 (A ⁇ 42)
  • cerebrospinal fluid amyloid beta42 decreases, while trans-cyretin is known to increase in the brain but decrease in blood (Scheuner et al., Nature Medicine 2, 864-870 (1996); Galasko et al., Arch Neurol 55 (7): 937-45 (1998); Li et al ., Journal of Neuroscience 31 (35): 12483-12490 (2011); And Han et al., Journal of Alzheimer disease 25 (1) 77-84 (2011)).
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 2012-0041823 relates to protein markers for early diagnosis of Alzheimer's disease, and discloses markers for early diagnosis of Alzheimer's disease using ATP synthase subunit beta and adenosine kinase (Isoform Long) and regucalcin.
  • Korean Unexamined Patent Publication No. 2010-0049363 relates to a diagnosis apparatus and diagnostic method for Alzheimer's disease using a vitamin D binding protein, and discloses a diagnosis method and apparatus using an antibody binding to a vitamin D binding protein.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2014-0042331 relates to multiple markers for diagnosing cognitive disorders and uses thereof.
  • a marker for diagnosing cognitive disorders transthyretin, ApoE, alpha-synuclein, vitamin D binding Proteins, neurorogranin, vimentin, stathmin, contactin, and HDL-cholesterol are disclosed.
  • Alzheimer's disease is a serious disease that is difficult to diagnose early and that it is difficult for normal life to be socially costly if the disease continues to progress, simple samples such as blood diagnose Alzheimer's severity, including early diagnosis of Alzheimer's disease.
  • simple samples such as blood diagnose Alzheimer's severity, including early diagnosis of Alzheimer's disease.
  • new markers that can be diagnosed even in the preclinical stage before they appear.
  • the present application is to provide a biomarker that can predict the accumulation of beta amyloid plaques in the brain using the blood or diagnose a disease related thereto.
  • the present invention is directed to Periostin, VE-cadherin, Acetylcholinesterase (ACHE), Thrombospondin-1 (TSP-1), plasma amyloid beta, LGALS3BP (Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) and Angiotensin I converting enzyme (ACE).
  • ACHE Acetylcholinesterase
  • TSP-1 Thrombospondin-1
  • plasma amyloid beta Thrombospondin-1
  • LGALS3BP Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein
  • Angiotensin I converting enzyme ACE
  • plasma amyloid beta in the marker LGALS3BP, ACE, Periostin and VE-cadherin are for the detection of brain amyloid beta accumulation in mild cognitive impairment group
  • plasma amyloid beta, LGALS3BP and ACE among the markers are non-carriers including normal cognitive function group and mild cognitive impairment group It is used to detect brain amyloid beta accumulation in the group.
  • plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE and TSP-1 are used in the non-hawk group and egg. It is used to detect brain amyloid beta accumulation in the whole cycle including dementia group including Zheimer's dementia.
  • the present disclosure provides a composition, kit or method for detecting amyloid beta accumulation including a substance for detecting the marker.
  • the plasma amyloid beta in the marker according to the present application is treated with MPP.
  • the markers according to the invention can be detected in blood, in particular plasma.
  • the marker according to the present application may further comprise ApoE in addition to the marker.
  • the cognitive impairment normal group in which the marker according to the invention is used is in particular an AchEI (inhibitor) untreated group.
  • the marker according to the present application may further include, as a marker, free T3 and / or HDL cholesterol, which is a common item in blood tests, in addition to the marker.
  • the marker according to the present application is used for the diagnosis of a disease related to brain amyloid beta accumulation or to determine whether a Pittsburgh compound B (PET) -positron emission tomography (PIB) test is necessary, wherein the brain amyloid beta accumulation disease is an amyloid Diseases caused by beta accumulation include, but are not limited to, Alzheimer's disease, Parkinson's dementia, Lewy body dementia, Huntington's dementia, or preclinical Alzheimer's disease, down syndrome, or cognitive impairment.
  • PTT Pittsburgh compound B
  • PIB positron emission tomography
  • the markers according to the invention can also be used to determine the severity of cognitive impairment in diagnosing brain amyloid beta accumulation disease.
  • the present invention also provides a method of providing a blood sample from a test subject in need of detection of accumulation of brain amyloid beta; Periostin, VE-cadherin, Acetylcholinesterase (ACHE), Thrombospondin-1 (TSP-1), plasma amyloid beta, LGALS3BP (Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) and ACE (Angiotensin I converting enzyme) in the blood sample
  • the step of quantifying one or more markers selected from the group wherein the plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE and ACHE of the cognitive function group blood, LGALS3BP, ACE, Periostin and VE-cadherin mild cognitive impairment Blood of the patient group, plasma amyloid beta, LGALS3BP and ACE of the markers are normal and mild cognitive impairment blood, and plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE and TSP-1 of the markers are brain amyloid Detect whether beta accumulates; And it provides a method of providing
  • the step of associating in the method according to the present invention is compared with the quantitative result determined in the control group, when the Periostin is increased, LGAL, ACE, AChE, TSP1, and VE-cadherin are all reduced, the blood-derived subject is amyloid beta It further comprises the step of determining that the accumulated.
  • the method according to the invention can also be used for the diagnosis of diseases associated with cerebral amyloid beta accumulation, or for determining the severity of cognitive impairment, whether Pittsburgh compound B (PiB) -positron emission tomography (PET) testing is required.
  • PiB Pittsburgh compound B
  • PET positron emission tomography
  • the markers in the method according to the invention can also be used to determine brain amyloid beta accumulation disease diagnosis for cognitive impairment severity.
  • the markers in the method according to the invention can be detected in blood, in particular plasma.
  • the marker in the method according to the present disclosure may further comprise ApoE in addition to the marker.
  • the cognitive impaired normal group in which the marker is used in the method according to the invention is in particular an AchEI (inhibitor) untreated group.
  • the present invention provides Periostin, VE-cadherin, Acetylcholinesterase (ACHE), Thrombospondin-1 (TSP-1), Plasma Amyloid Beta, LGALS3BP (Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) for detecting brain amyloid beta accumulation in blood.
  • ACHE Acetylcholinesterase
  • TSP-1 Thrombospondin-1
  • LGALS3BP Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein
  • biomarkers selected from the group consisting of ACE (Angiotensin I converting enzyme), plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE and ACHE of the markers for detecting brain amyloid beta accumulation in the normal cognitive function group, Among the markers, plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE, Periostin and VE-cadherin are for detecting brain amyloid beta accumulation in mild cognitive impairment group, and plasma amyloid beta, LGALS3BP and ACE are normal cognitive function group and mild cognitive impairment group.
  • ACE Angiotensin I converting enzyme
  • plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE, Periostin and VE-cadherin are for detecting brain amyloid beta accumulation in mild cognitive impairment group
  • plasma amyloid beta, LGALS3BP and ACE are normal cognitive function group and mild cognitive impairment group.
  • brain amyloid beta accumulation in the non-solvent group comprising a plasma amyloid beta, LGA LS3BP, ACE and TSP-1 provide a biomarker for detecting brain amyloid beta accumulation in the whole cycle including dementia group including non-sick group and Alzheimer's dementia group.
  • plasma amyloid beta provides a biomarker for detecting brain amyloid beta accumulation, which is treated with MPP.
  • each cognitive normal group provides a biomarker for detecting brain amyloid beta accumulation, which is an AchE inhibitor non-administrator.
  • the marker for detecting brain amyloid beta accumulation of each cognitive function normal group, mild cognitive impairment group, non-false group and dementia group further comprises ApoE, biomarker for detecting brain amyloid beta accumulation to provide.
  • the markers for detecting brain amyloid beta accumulation in the normal cognitive function group, mild cognitive impairment group, non-false group and dementia group are at least one of phosphorus, HDL (high density lipoprotein) and free triiodothyronine (T3). It further comprises a marker, it provides a biomarker for detecting brain amyloid beta accumulation.
  • the brain amyloid beta accumulation is used to diagnose a disease associated with brain amyloid beta accumulation, or to determine whether a Pittsburgh compound B (PET) -positron emission tomography (PIB) test is required.
  • PET Pittsburgh compound B
  • PIB positron emission tomography
  • the disease provides a biomarker for detecting brain amyloid beta accumulation, including Alzheimer's disease, Parkinson's dementia, Lewy body dementia, Huntington's disease dementia, or preclinical Alzheimer's disease, down syndrome, or cognitive impairment.
  • the diagnosis of a disease related to brain amyloid beta accumulation provides a biomarker for detecting brain amyloid beta accumulation, which includes determining the severity of cognitive impairment.
  • the biomarker according to the present invention can detect brain accumulation of amyloid beta, which is a cause of Alzheimer's dementia, easily and quickly in the blood at an early stage.
  • Accumulation of amyloid beta in the brain begins 15-20 years before clinical symptoms such as dementia and forgetfulness, so the blood test of patients with no clinical symptoms or mild clinical symptoms confirms the accumulation of brain amyloid beta.
  • the markers according to the present application can detect Alzheimer's dementia early, as well as slow or prevent its progression early, thereby dramatically improving the quality of life of the patient.
  • the marker according to the present application may be composed of more effective combinations according to the patient group segmented according to the degree of cognitive function, that is, the normal cognitive function group, mild cognitive impairment group, Alzheimer's dementia group and the whole cycle group, using the accuracy And the effectiveness is further improved.
  • the PiB-PET image which is an expensive test that can be performed only in some university hospitals that can confirm the accumulation of brain amyloid beta with recent brain imaging, can be effectively used for screening of patients requiring replacement or imaging tests. Therefore, the blood biomarker according to the present application, which can easily confirm accumulation of brain amyloid beta, is very effective in terms of convenience and cost reduction of patients.
  • FIG 1a, Figure 1b and Figure 1c is a schematic representation of a model established for discriminating whether the brain beta amyloid accumulation through the detection of the biomarker of the present application in the blood
  • Figure 1a is a photograph of the amyloid beta accumulation by marker excavation sample in the present application
  • PET imaging results are a standard method for measuring brain amyloid beta accumulation, and can be verified whether blood biomarkers and brain beta accumulation are related.
  • 1B and 1C show markers for each model according to the segmented patient group. Periostin increases in PiB-PET protons, and LGAL, ACE, AChE, TSP1, and VE-cadherin all decrease. This indicates a high correlation between the PiB-PET result and the marker according to the present application, which indicates that the marker according to the present invention can be usefully used for beta amyloid accumulation in the brain.
  • Figure 2a shows the brain beta amyloid accumulation group (A beta + vs A beta-) of CN in the normal cognitive function group (CN) as a model 1.
  • FIG. 2B is the same as FIG. 2A, but with phosphorus (Phosphorous) as a further biomarker.
  • Figure 3a shows the results of differentiation of brain beta amyloid accumulation group (Abeta + vs Abeta-) of MCI in patients with mild cognitive impairment group (MCI) as a model 2.
  • FIG. 3b is the same as FIG. 3a but with phosphorus as an additional biomarker.
  • Figure 4a shows the results of differentiation of the brain beta amyloid accumulation group (A beta + vs A beta-in CN + MCI) in the non-severe dementia patients group (CN and MCI) as a model 3.
  • FIG. 4B is the same as FIG. 4A, but with phosphorus as an additional biomarker.
  • Figure 5a shows the differentiation of amyloid accumulation group (A beta + vs A beta-in all subjects regardless of cognitive function) in the full cycle with model 4.
  • FIG. 5B is the same as FIG. 5A, but with HDL cholesterol and free triiodothyronine (T3) as additional biomarkers.
  • T3 triiodothyronine
  • FIG. 6 shows the results of quantifying LGALS3BP by ELISA in normal cognitive function (CN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's disease dementia (ADD), and whole cycle (PIB- vs PIB +) blood.
  • the quantitative value of LGALS3BP was significantly changed when the negative group of cognitive function, mild cognitive impairment, Alzheimer's dementia group, and the negative group of brain amyloid beta (+) and positive group (+) were observed in the whole cycle. It can be used for both Models 1 to 4 according to the present application.
  • These quantitative values were also used to determine specificity, sensitivity, and AUC values through the calculation of the integrated index (see Example 2) and ROC curve analysis using logistic regression equations.
  • FIG. 7 shows the results of quantification of ACE by ELISA in normal cognitive function (CN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's dementia (ADD), and full cycle (PIB- vs PIB +) blood.
  • the quantitative value of ACE was compared with normal cognitive function, mild cognitive impairment, Alzheimer's dementia group, and in the whole cycle. It shows a significant change and shows a tendency to decrease in the normal group, Alzheimer's dementia group, indicating that it can be used in both models 1 to 4 according to the present application.
  • These quantitative values were also used to determine specificity, sensitivity, and AUC values through the calculation of the integrated index (see Example 2) and ROC curve analysis using logistic regression equations.
  • FIG. 8 shows the results of quantifying TSP-1 by ELISA in normal cognitive function (CN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's dementia group (ADD), and full cycle (PIB- vs PIB +) blood.
  • CN normal cognitive function
  • MCI mild cognitive impairment
  • ADD Alzheimer's dementia group
  • PIB- vs PIB + full cycle
  • AChE 9 is a test result of quantifying AChE by ELISA in blood of normal cognitive function group (CN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's dementia group (ADD), and full cycle (PIB- vs PIB +).
  • the quantitative value of AChE was compared with normal group of cognitive function (CN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's dementia group (ADD), and negative group of brain amyloid beta accumulation (-) and positive group (+) in the whole cycle, respectively. It showed significant changes in the normal group when it can be used in Model 1 according to the present application.
  • These quantitative values were also used to determine specificity, sensitivity, and AUC values through the calculation of the integrated index (see Example 2) and ROC curve analysis using logistic regression equations.
  • AChE inhibitor (AChEI) untreated group was used.
  • AChE is useful as a marker of specific cognitive normals because more than half of MCI patients or almost all AD patients are taking AChE inhibitors.
  • AChE inhibitors it is difficult to determine whether there is a change in blood AChE concentration due to brain amyloid accumulation, and the normal cognitive function group does not take AChE inhibitors and can confirm the association with brain amyloid accumulation.
  • FIG. 10 shows the results of quantifying MPP-amyloid beta in ELISA in normal cognitive function (CN), mild cognitive impairment (MCI), Alzheimer's dementia (ADD), and full cycle (PIB- vs PIB +) blood.
  • the quantitative values of MPP amyloid beta 40 and 42 were 42/40 ratio in the normal group, mild cognitive impairment, Alzheimer's dementia group, and the negative group of brain amyloid beta accumulation (-) and positive group (+), respectively. Significant changes were seen in this normal group and in the entire cycle, indicating that they can be used in models 1-4 according to the present application.
  • These quantitative values were also used to determine specificity, sensitivity, and AUC values through the calculation of the integrated index (see Example 2) and ROC curve analysis using logistic regression equations.
  • the markers may be composed of more effective combinations according to each subdivided patient, thereby enabling the use of blood biomarkers for each patient group with improved accuracy and effectiveness, and thus, in the normal group, the cognitive hardness disorder group, or all groups. Usable markers for predicting whether amyloid has accumulated in the brain.
  • Periostin VE-cadherin, ACHE (Acetylcholinesterase), TSP-1 (Thrombospondin-1), plasma amyloid beta, LGALS3BP (Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) and ACE (Angiotensin I converting enzyme) It relates to the use for the discrimination or determination of the accumulation of beta amyloid of one or more markers selected from the group.
  • Such use is intended for use in a composition comprising a detection material capable of detecting the marker in vitro or in vivo, in the form of a kit, or in the form of a composition comprising the marker itself, or a method for detecting beta amyloid accumulation using the marker. It may be implemented in the form.
  • amyloid beta plaque accumulation has been confirmed by detection of amyloid beta plaque accumulation by post-mortem brain biopsy of Alzheimer's dementia patients and confirmed Alzheimer's dementia.
  • a technology such as PIB-PET has been developed to confirm the accumulation of brain amyloid beta in brain imaging, but this is a very expensive test, expensive equipment that can be performed only in some university hospitals, and also causes many inconveniences for patients. Therefore, the blood biomarker according to the present application which can confirm the accumulation of brain amyloid beta is very important.
  • Alzheimer's dementia begins 15-20 years before clinical symptoms such as dementia and forgetfulness. Therefore, if the blood amyloid beta can be confirmed by blood tests of patients with no clinical symptoms or mild clinical symptoms, Alzheimer's dementia can be diagnosed early and can slow or stop its progress at an early stage. In addition, it can be identified as a patient with Alzheimer's disease that does not accumulate brain amyloid beta, and thus the treatment strategy for these patients can be changed.
  • detection of beta amyloid accumulation in the brain using the markers according to the invention can also be used for the diagnosis of diseases caused by the accumulation of beta amyloid.
  • markers according to the invention can also be used for the diagnosis, detection, etc. of various diseases associated with brain amyloid beta accumulation.
  • the diseases associated with such brain amyloid beta accumulation include, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's dementia, Lewy body dementia, Huntington's disease dementia, or preclinical Alzheimer's disease, down syndrome, or cognitive impairment.
  • cognitive impairment refers to neurodegenerative diseases such as Alzheimer's (AD) dementia, Parkinson's dementia, Lewy body dementia or Huntington's disease dementia, Alzheimer's dementia (ADD), and dementia. It includes mild cognitive impairment (MCI: Mild Cognitive Impairment), which is a stage before progression, and in this sense may include both dementia or non-sick patient groups.
  • MCI Mild Cognitive Impairment
  • the severity of cognitive impairment can be classified by methods such as Mini mental state examination, 2006_Benson et al., Journal of clinical Psychiatry, 2008_O'Bryant et al., Arch Neurol (Score) score.
  • ementia includes Alzheimer's disease, Parkinson's disease dementia, Lewy body dementia, or Huntington's disease dementia.
  • non-dementia includes cognitive normal and mild cognitive impairment groups.
  • cognitive function normal group refers to a group in which cognitive function is determined to be normal through the above-described test such as MMSE regardless of whether beta amyloid accumulates. Even if the cognitive function is normal, it includes a normal person without brain cognitive decline and brain amyloid beta accumulation. Since beta amyloid accumulates in the brain, it can progress to dementia through mild cognitive impairment. Therefore, it is very important to detect beta amyloid accumulation in the normal cognitive function group for early detection of dementia.
  • the "hard cognitive impairment group” herein is a stage of dementia that has cognitive decline but is a daily life, and includes a patient without brain amyloid beta accumulation and a stage of dementia that has a cognitive decline but a daily life with beta accumulation. do.
  • the degree of cognitive deterioration is intensified in the order of dementia groups including the normal cognitive function group, the mild cognitive impairment group, and the Alzheimer's dementia (ADD) group.
  • dementia groups including the normal cognitive function group, the mild cognitive impairment group, and the Alzheimer's dementia (ADD) group.
  • the dementia patient group has cognitive impairment, Alzheimer's dementia (ADD) group, a patient diagnosed with dementia, a patient without brain amyloid beta accumulation, as well as a patient with cognitive impairment and diagnosed with dementia, brain amyloid beta Include patients with accumulation.
  • ADD Alzheimer's dementia
  • the “full cycle” herein includes all groups of patients up to the process diagnosed with dementia, including the normal cognitive function group, mild cognitive impairment group and dementia patient group. It also includes both PiB-PET positive and negative patients.
  • the dementia is Alzheimer's dementia.
  • Alzheimer's dementia or “Alzheimer's disease” is a neurodegenerative brain disease in which cognitive function, including memory, gradually progresses, also called AD or ADD (Alzheimer's Dementia). This may include preclinical Alzheimer's disease before the onset of clinical symptoms, as well as mild cognitive impairment, or mild cognitive impairment, which is a stage prior to dementia.
  • the majority of Alzheimer's disease brains produce neural plaques (or senile plaques) or nerve fiber bundles, which are characterized by the deposition of beta amyloid protein and the neurofibrous bundle by hyperphosphorylation and inflammation of tau protein. It is known to be due to reaction and oxidative damage.
  • the preclinical Alzheimer's disease refers to a stage in which amyloid plaque deposition in the brain appears, although there is no clinical finding.
  • amyloid beta plaque or “beta amyloid plaque” is an insoluble fibrous protein aggregate comprising amyloid beta, also referred to herein as A-beta, with the main component being A-beta40 or A-beta42.
  • the amyloid plaques may be present in cells, on the cell surface, and / or in spaces between cells. In particular, it exists in the spaces between cells of neural tissues, and is used as a marker for diagnosing Alzheimer's dementia, and the diagnosis of dementia according to the degree of plaque accumulation may be referred to the disclosure (Mawuenyega et al., Science, 2010_Querfurth and LaFerla, The New England journal of medicine).
  • Amyloid beta plaques according to the context may be referred to as amyloid beta, which will be readily appreciated by those skilled in the art.
  • diagnosis refers to determining the susceptibility of an object, or test subject, to a particular disease or condition, determining whether an object currently has a particular disease or condition, Determining the prognosis of one object at hand or therametrics (eg, monitoring the condition of the object to provide information about treatment efficacy).
  • “Early diagnosis” herein includes diagnosing at the preclinical stage, before mild cognitive impairment, or clinical symptoms appear.
  • the term "diagnosis marker or diagnostic marker” refers to a substance that can be diagnosed by distinguishing Alzheimer's disease from normal, and includes a protein showing an increase in blood of a subject with a disease as compared to an appropriate control group. .
  • Periostin increases blood concentration with accumulation of amyloid beta plaque
  • LGAL, ACE, AChE, TSP1 VE-cadherin decreases blood concentration with accumulation of amyloid beta plaque (FIGS. 6 to 6). See FIG. 10).
  • the markers used further in addition to the markers herein have a lower phosphorus, free T3 concentration in blood and a significantly higher concentration of HDL cholesterol, as compared to results from normal controls or PiB-PET negative subjects.
  • the markers Periostin, VE-cadherin, ACHE, TSP-1, LGALS3BP and ACE according to the present application are known as shown in Table 1 below, protein and nucleic acid sequences, intracellular processing, modifications, and the like. Sequences and detection methods will be readily available.
  • Plasma amyloid beta in the marker according to the present invention is a plasma pretreatment composition (MPP) treated with a mixture of protease inhibitors and phosphatase inhibitors (Mixture of protease inhibitors and phosphatase inhibitors).
  • MPP plasma pretreatment composition
  • Matture of protease inhibitors and phosphatase inhibitors For this, reference may be made to what is disclosed in detail in Korean Patent Application Publication No. 2016-0129444 filed by the original inventor.
  • Markers according to the invention are especially detected in blood samples.
  • a blood sample can be obtained very easily compared to a sample such as cerebrospinal fluid used for the diagnosis of dementia, and the cost is greatly reduced and the convenience is greatly increased.
  • Samples in which the markers according to the invention are used include, but are not limited to, whole blood, platelets, plasma or serum samples. In one embodiment plasma is used.
  • plasma is used.
  • specimens from test subjects in need of diagnosis or detection, as well as samples from a normal control group or a control group having a specific disease can also be used.
  • the markers of the present application are combined with markers according to the patients classified according to the degree of cognitive decline, that is, the normal cognitive function group, the cognitive hardness disorder group, or the whole cycle group, and thus, the accuracy and effectiveness of each patient group can be detected.
  • amyloid beta, LGALS3BP, ACE and ACHE of the markers according to the present application is used to detect whether the brain amyloid beta accumulation in the normal cognitive function group.
  • the ACHE marker is used in patients not receiving an ACHE inhibitor.
  • amyloid beta, LGALS3BP, ACE, Periostin and VE-cadherin among the markers according to the present application are used to detect brain amyloid beta accumulation in the mild cognitive impairment patient group.
  • the plasma amyloid beta, LGALS3BP and ACE in the markers according to the present application are used for the detection of brain amyloid beta accumulation in the non-hawk group including the cognitive normal group and the mild cognitive impairment group.
  • the plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE and TSP-1 of the marker according to the present application is used for the detection of brain amyloid beta accumulation in the whole cycle including the non-sick group and the dementia group.
  • plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE and TSP-1 are used to detect brain amyloid beta accumulation throughout the cycle, including non-sick and dementia groups.
  • the marker according to the present application may further include ApoE genotyping, which will be described later, in the detection markers of the respective groups.
  • the marker according to the present application may include, as additional markers, the detection markers of the respective groups, phosphorus, free T3 and / or HDL cholesterol, which are items measured in a conventional blood test described below. Such markers can be used in the presence or absence of ApoE.
  • the marker of the present application may be an indicator of the onset and progression of cognitive impairment, and may be used for the onset, the progression of the disease, the diagnosis or prognosis of the disease.
  • the present application can be used to determine whether a marker or combination of markers as described above is necessary for the prediction of amyloid beta plaque accumulation, early diagnosis, or PiB-PET imaging testing. For example, in the blood test using the marker according to the present application, it is not necessary to test the PiB-PET image when it is determined that amyloid beta is not accumulated in the brain, and when it is determined that it is accumulated, the PiB-PET image for confirmation You can check.
  • the concentration of blood markers according to the present invention was highly correlated with the amyloid beta plaque accumulation known as a causative agent of Alzheimer's dementia based on brain imaging results of PiB-PET widely used for the diagnosis of Alzheimer's dementia. That is, in the PiB-PET positive subjects, the concentration of the markers according to the present application was significantly increased or decreased in the blood compared to the results of the PiB-PET negative subjects. That is, referring to Figure 1a, Periostin is increased in the PiB-PET proton, LGAL, ACE, AChE, TSP1, VE-cadherin all decreases. This indicates that the marker according to the present application can be usefully used for beta amyloid accumulation in the brain.
  • the markers used further in addition to the markers herein have a lower phosphorus, free T3 concentration in blood and a significantly higher concentration of HDL cholesterol, as compared to results from normal controls or PiB-PET negative subjects.
  • detection reagent refers to a reagent capable of detecting or quantifying a marker according to the present disclosure, for example, a substance capable of detecting the marker of the present disclosure at a nucleic acid level such as a protein and / or a gene or mRNA, or otherwise. In that case, reference may be made to what is described in the Examples herein.
  • Detection herein includes quantitative and / or qualitative analysis, including the detection of presence, absence, and expression level detection. Such methods are known in the art and are described in the context of the present disclosure, including the following examples. Those skilled in the art will be able to select the appropriate method for the practice herein. For example, the method of detecting each marker according to the present application may refer to, for example, the method described in the Examples herein.
  • methods and reagents for detecting protein levels include, for example, antigen-antibody reactions, substrates that specifically bind to the markers, receptors or ligands or cofactors that specifically interact with the markers. Can be detected via reaction.
  • Reagents or materials that specifically interact with or bind to the markers of the present disclosure may be used with chip or nanoparticles.
  • the antigen-antibody response is subjected to enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich ELISA, western blot on polyacrylamide gel, immune dot blot Immuno dot blotting assay, immunofluorescence assay (IFA), immunoluminescence assay (Immunochemiluminescence Assay), immunohistochemical staining or immunochromatography (Immunochromatography, Rapid), antigen antibodies using beads or discs Reaction (X-MAP technology) or the like.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • sandwich ELISA western blot on polyacrylamide gel
  • IFA immunofluorescence assay
  • IFA immunoluminescence assay
  • immunohistochemical staining or immunochromatography Immunochromatography, Rapid
  • antigen antibodies using beads or discs Reaction X-MAP technology
  • the composition according to the present disclosure comprises a reagent required for the detection of the marker at the protein level.
  • reagents detectable at the protein level may include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, substrates, aptamers, receptors, ligands, cofactors, and the like. Such reagents can be incorporated into nanoparticles or chips as needed.
  • the detection reagent comprises an antibody
  • the detection of the marker of the present application is performed by using an antibody molecule that specifically binds thereto.
  • Antibodies that can be used herein are polyclonal or monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies.
  • Antibodies may be commonly used in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4,816,56) Or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)).
  • fusion methods Kellow and Milstein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)
  • recombinant DNA methods US Pat. No. 4,816,56
  • the present invention provides a blood sample derived from a test subject that requires the detection of brain amyloid beta accumulation; Periostin, VE-cadherin, Acetylcholinesterase (ACHE), Thrombospondin-1 (TSP-1), plasma amyloid beta, LGALS3BP (Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) and ACE (Angiotensin I converting enzyme) in the blood sample
  • the plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE and ACHE of the markers for detecting the brain amyloid beta accumulation of the normal cognitive function group plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE, Periostin and VE-cadherin are used to detect brain amyloid beta accumulation in the mild cognitive impairment group, and plasma amyloid beta, LGALS3BP and ACE are the brains of the non-falcon group including normal cognitive function group and mild cognitive impairment group.
  • plasma amyloid beta, LGALS3BP, ACE and TSP-1 among the markers include non-sick group and dementia group Detection in blood from a full cycle patient; And correlating the detected amount of marker with amyloid beta accumulation or other related disease diagnosis or prognosis in the brain of the subject.
  • amyloid beta is used that has been treated with MPP as mentioned above.
  • the method according to the present disclosure may further comprise the use of an ApoE marker.
  • ApoE Apolipoprotein E
  • E2 cys112, cys158
  • E3 cys112, arg158
  • E4 arg112, arg158
  • the genotype of an individual is E2 / E2, E2 / E3. , E2 / E4, E3 / E3, E3 / E4, or E4 / E4 types.
  • E4 alleles are found in about 20% of the population and are known to increase the risk of Alzheimer's dementia. According to the present disclosure, specificity and sensitivity may be improved when the ApoE genotype marker is used in addition to the marker according to the present application. Detection of the ApoE genotype can be performed using known methods, and those skilled in the art will be able to select the appropriate one. In one embodiment according to the present invention, a PCR method using allele specific primers may be used as disclosed in the Examples.
  • the method according to the present disclosure may further comprise the use of one or more of phosphorus, free T3, HDL cholesterol, which is a common blood test item.
  • each marker of HDL cholesterol, free T3, and phosphorus may be referred to, for example, the methods described in the Examples herein.
  • the method according to the present invention is particularly used for the diagnosis of brain amyloid beta accumulation associated with brain amyloid beta accumulation, the brain amyloid beta accumulation disease is Alzheimer's disease, Parkinson's dementia, Lewy body dementia, Huntington's dementia, or preclinical Alzheimer's disease , Down syndrome, or cognitive impairment.
  • the method according to the present invention also includes the diagnosis of brain amyloid beta accumulation disease cognitive impairment severity.
  • the present method may further use non-protein clinical information of the patient, that is, clinical information other than the marker.
  • nonprotein clinical information may include, for example, the age, sex, weight, diet, body mass, underlying disease, magnetic resonance imaging (MRI), single-photon emission computed tomography (SPECT), or mini-mental status of a patient. examinations or positron emission tomography (PET), including but not limited to.
  • the method includes correlating the detection result of a marker with the diagnosis or prognosis of a disease associated with amyloid beta plaque accumulation in the brain, and according to one embodiment the associating step compares the amount of each marker determined with the control.
  • the accumulation is predicted or diagnosed.
  • information may be provided to diagnose the accumulation of plaque or the diagnosis of the disease in the subject.
  • the associating step may be compared with a quantitative result including a value determined in blood samples of a person or a normal control group judged to be negative in the PIB PET result, wherein Periostin is increased, LGAL, ACE, AChE, TSP1, and VE. -cadherin decreases all.
  • the associating step may be performed by comparing the amount of each marker determined with a quantitative result determined in blood samples of a person or normal control judged as negative in the PIB PET result, and thus, the phosphorus and free T3 levels are lowered and the HDL cholesterol concentration is lowered. Is significantly higher.
  • the cutoff value can be determined and used to determine amyloid beta accumulation.
  • the step of associating a sample of a normal control group with a subject, and after setting a threshold value for predicting plaque accumulation or diagnosing a disease for each marker, the subject Can be compared with the threshold.
  • the threshold value of each marker that determines whether the brain amyloid beta plaques accumulate ie, negative and positive, that is, PiB-PET negative and positive
  • Results according to the present application can be determined based on the Youden index determined by ROC curve analysis using the Med Calculate program.
  • the threshold value indicates positive amyloid beta plaque accumulation in the brain, and may be used for screening PiB-PET test subjects and diagnosing diseases related to brain amyloid beta plaque accumulation.
  • the PIB-PET test is not only inconvenient for the patient but also expensive and time-consuming. Therefore, the screening process for people with high possibility of amyloid plaque accumulation is urgently needed.
  • the method according to the present invention is intended to provide information on whether a test subject in need of judging amyloid beta plaque accumulation in the brain, including Alzheimer's dementia, needs information on whether a PIB-PET test of the brain is required.
  • the PiB-PET image For example, in the blood test using the marker according to the present application, it is not necessary to test the PiB-PET image when it is determined that amyloid beta is not accumulated in the brain, and when it is determined that it is accumulated, the PiB-PET image for confirmation You can check.
  • Subjects were recruited through an outpatient / dementia support center / poster, and clinical / neuropsychological evaluation was conducted to evaluate the selection criteria / exclusion criteria. At this time, if the exclusion criteria were not satisfied and all the selection criteria were satisfied, the next step, the basic evaluation (detailed evaluation), was carried out. If not, the screening failure occurred.
  • the criteria for selection are based on clinical diagnostics (see National Institute on Aging and the Alzheimer's Association (NIA / AA), Alzheimer's Dementia Diagnostic Clinical Criteria, Nihon Rinsho. 2016 Mar; 74 (3): 386-94, etc.). Cognitive impairment clinical criteria and Alzheimer's dementia clinical criteria were applied. Mild cognitive impairment did not meet the selection criteria when the z-score of a specific test item was lower than cut-off. Z-score is the score obtained from the formula (score-average) / (standard deviation) when the raw score is applied to the mean and standard deviation considering the subject's age, gender, and years of education.
  • the additional screening evaluation such as brain imaging evaluation (PET-MRI), blood test, detailed clinical evaluation, and detailed neuropsychological evaluation, was performed on the group that passed the screening evaluation and satisfied the selection / exclusion criteria.
  • PET-MRI brain imaging evaluation
  • a total of 429 patients with normal, mild cognitive impairment, and Alzheimer's dementia were selected through the above steps. After fasting for 12 hours, blood was collected at the hospital in the morning and PIB PET scan was performed as follows. The collected blood was used to detect and quantify the protein.
  • the standardized uptake value ratio (SUVR) values were calculated by dividing the mean for all voxels in each ROI by the mean cerebellar eptake value in the same image. If at least one of the four ROIs (ie, frontal, lateral temporal, lateral parietal, and PC-PRC) has a SUVR level greater than 1.4, classify the subject as PiB positive (PiB +), or if the SUVR levels of all four ROIs are less than 1.4 The back side was classified as PiB negative (PiB-). PiB- means an individual with amyloid deposition negative, while PiB + means an individual with amyloid deposition positive.
  • Total brain amyloid deposition (SUVR) was calculated by dividing the mean value for all voxels of the total cortical ROI by the average cerebellar uptake value of the same image.
  • PIB PET scans revealed 282 PET-negative and 147 PET-positive patients among 429 patients. Analyze correlation, specificity, sensitivity and AUC through PIC PET results (positive and negative discrimination results, quantitative results of PIB PET) and ROC curve analysis through quantification of markers in blood (See Example 2, FIGS. 1 to 5).
  • the concentration of amyloid beta in blood was measured using the X-MAP technique after treatment of the plasma pretreatment composition.
  • the plasma pretreatment composition comprises the protease inhibitor and the phosphatase inhibitor at 1: 1 (v / v).
  • MPP may be a mixture of Protease inhibitor cocktail (PIC): Serine protease inhibitor (PMSF): Phosphatase inhibitor cocktail I: Phosphatase inhibitor cocktail II at 1: 1: 1: 1: 1 (v / v). .
  • PIC Protease inhibitor cocktail
  • PMSF Serine protease inhibitor
  • Phosphatase inhibitor cocktail I Phosphatase inhibitor cocktail II at 1: 1: 1: 1 (v / v).
  • the INNO-BIA plasma A ⁇ forms kit (Fujirebio) was used to simultaneously measure the concentrations of amyloid beta 42 and 40.
  • the beads bound to the antibody was first passed through the plate, the beads were mounted on the plate, and the plasma solution sample treated with MPP was incubated for 30 minutes, and then placed in the plate together with the standard samples. After adding the beads with conjugated antibody and refrigerated for one day. The next day, after washing the plate, the detection antibody was added and incubated for 1 hour. Finally, the reading solution was added to measure the amyloid beta pretreated with MPP in plasma using X-MAP technology.
  • TMB Tetramethylbenzidine
  • the test equipment used was ADVIA 1800 Auto Analyzer (Siemens, USA) and the test reagent was HDL-Cholesterol (Siemens, UK).
  • the reference value is 40-60mg / dL.
  • the inspection principle is as follows.
  • the direct HDL cholesterol assay (D-HDL method) measured HDL cholesterol in serum and plasma without prior separation, based on procedures developed by Izawa, Okada, and Matsui. Cholesterol from non-HDL particles was liberated and removed at the first stage of the reaction. HDL particle-derived cholesterol was released in the second step by detergent of R2, and HDL cholesterol was measured by Trinder reaction.
  • the method consists of two steps:
  • step b Specific measurement of HDL-cholesterol after HDL-cholesterol free by the surfactant of Reagent 2.
  • the catalase of step a was inhibited with a soy azide of R2.
  • the intensity of quinoneimine produced in the Trinder reaction, measured at 596 nm, is directly proportional to cholesterol concentration.
  • test equipment used was ADVIA Centaur XP (Siemens, USA) and the test reagent was Free T3 (Siemens, USA) .
  • the reference values were 3.3-5.2 pg / mL for 1-23 months and 3.3- for 2-12 years.
  • the test principle was as follows: Two-step sandwich immunoassay using chemiluminescent.
  • FrT3 and FrT3 reagents in serum were competitively combined to form paramagnetic particles in the solid phase, and relative light units (RLUs) generated by binding acridinium ester-labeled mouse anti-T3 antibody of Lite reagent were measured.
  • RLUs relative light units
  • test equipment used was ADVIA 1800 Auto Analyzer (Siemens, USA) and the test reagent Pi (Siemens, UK).
  • the reference value was 2.4-5.1 mg / dL.
  • the inspection principle is as follows. Inorganic phosphorus reacts with ammonium molybdate in the presence of sulfuric acid to produce a non-reducing phosphoromolybdate complex, which was measured at 340/658 nm as a terminating reaction.
  • proteases consisting of protease inhibitor cocktail (PI), phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF, a serine protease inhibitor; Sigma Aldrich, CA, USA) and phosphatase inhibitor cocktail I and II (PPI I and II; AG Scientific, Inc., CA, USA)
  • PI protease inhibitor cocktail
  • PMSF phenylmethanesulfonylfluoride
  • PPI I and II phosphatase inhibitor cocktail I and II
  • a ⁇ peptides are provided by American Peptide Company, Inc. (Sunnyvale, CA, USA) and human serum albumin was purchased from Sigma Aldrich.
  • venous blood was collected and collected on K2 EDTA tubes (BD Vacutainer Systems, Madison, UK) and centrifuged at 700 x g for 5 minutes at room temperature to separate plasma and obtain in 15 ml centrifuge tubes. To obtain a high purity sample, the plasma sample was centrifuged again under the same conditions, aliquoted and immediately frozen to -80 degrees.
  • K2 EDTA tubes BD Vacutainer Systems, Madison, UK
  • the INNO-BIA plasma A ⁇ forms kit (Innogenetics, Gent, Belgium) was used according to the manufacturer's method.
  • plasma was diluted three-fold with MPP treated plasma dilution buffer or MPP untreated plasma dilution buffer and left at room temperature for 30 minutes.
  • the filter plates were then washed and the diluted bed mix was transferred to each well of the plate. Plates were then carefully dried and washed and 25 ⁇ L of Conjugate 1 Working Solution A and 75 ⁇ L of standard, blank, control and plasma samples were added to each well.
  • the plates were then incubated overnight at 4 degrees Celsius and 100 ⁇ L detection solution was added to each well. After 1 hour the plates were flushed and reading solution was added to each well.
  • Plasma amyloid beta concentrations were measured using X-map technology (Bioplex 200 systems; Bio-rad, Hercules, CA, USA).
  • a primer capable of specifically amplifying alleles with specific gene mutations a method for identifying specific gene mutations with or without an amplification reaction was used.
  • VE-cadherin Periostin, VE-cadherin, Acetylcholinesterase (ACHE), Thrombospondin-1 (TSP-1), Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein (LGAS3BP), and Angiotensin I converting enzyme (ACE) markers were described in the ELISA assay as described above. Quantification was made in the blood of each patient of Example 1 and amyloid beta was quantified in blood by X-MAP technology (2017 Park et al., Alzheimer's research & Therapy).
  • 2 to 5 is a combination of markers that are particularly effective in the blood of the patient corresponding to each group of cognitive normal group, mild cognitive impairment group and Alzheimer's dementia group, and then for each combination of markers, the logistic The regression analysis yielded a value expressed as pi or an integrated index, and an analysis was performed to predict brain amyloid beta accumulation according to the numerical values.
  • the calculated integrated index Pi was calculated by Youden's J statistic (Ruopp et al. Biom J. 2008). Jun (50 (3): 419-430) was used to determine whether the brain amyloid beta accumulation was positive when the cut-off criterion was increased.
  • specificity and sensitivity were determined through ROC curve analysis using the integrated index to calculate the prediction effectiveness / accuracy.
  • Plasma amyloid beta concentration obtained by X-MAP technology (2017 Park et al., Alzheimer's research & Therapy), blood protein concentration of each marker obtained based on ELISA experiment are utilized as multiple biomarker variables through statistical analysis. It became.
  • FIGS. 2-5 show AUC (Area Under curve) values that determine specificity, sensitivity, and accuracy of each model.
  • AUC Area Under curve
  • Model 1 0.63, Model 1 (Add ApoE): 0.67; Model 2: 0.46, model 2 (with ApoE): 0.68; Model 3: 0.51, model 3 (with ApoE): 0.59; Model 4: 0.49, Model 4 (with ApoE): 0.58.
  • cutoff value may vary depending on, for example, an inspection purpose. For example, if performed for screening purposes in a health examination, cutoff values may be set low to cover all possible subjects.

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Abstract

본원은 알츠하이머성 치매 원인물질인 아밀로이드 베타의 뇌 침착에 대한 혈액 바이오마커에 관한 것이다. 본원에 따른 마커는 혈액을 이용하여 간편하고 신속하게 뇌 아밀로이드 베타 축적을 예측할 수 있어, 임상이 나타나기 전의 경도 인지장애 등을 포함하는 이와 관련된 질환의 진단 등에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

뇌의 베타 아밀로이드 축적 감별용 혈중 바이오마커
본원은 알츠하이머성 치매 원인물질인 아밀로이드 베타의 뇌침착에 대한 혈액 바이오 마커에 관한 것이다.
뇌의 베타 아밀로이드가 축적되어 발생하는 대표적 질환인 알츠하이머병 또는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease: AD 또는 ADD)는, 치매 중 가장 일반적인 형태로서, 대표적인 신경 퇴행성 질환이다. 80세 이상 노인의 20% 이상이 알츠하이머병의 영향을 받고 있을 것으로 추정되며, 고령화 사회가 될수록 그 수가 급격히 증가하고 있다. 알츠하이머병은, 아밀로이드 전구 단백질(amyloid precursor protein: APP)이 β, γ- 시크리테아제에 의해 순차적으로 절단되어 생성되는 β-아밀로이드(Aβ peptide)가 뇌조직에 침착되는 노인반(senile plaque)과 미세소관 연관단백질인 타우(Tau) 단백질의 과인산화로 인한 신경섬유 덩어리(neurofibrillary tangle: NTF)가 주된 병리학적 특징이다. 알츠하이머병 환자의 뇌조직에서 일어나는 변화는, 환경 및 다양한 병인학적인 요인들에 의한 것으로서, 아직까지 뚜렷한 진단 방법과 치료 요법이 없다.
현재, 가장 일반적인 AD 진단 방법으로는, MRI(Magnetic resonance Imaging), PET(positron emission tomography) 등의 이미지 방법이나, 미니-인지 상태 검사(Mini mental state examination: MMSE), 문진 등의 간접적인 방법이 사용되고 있으나, MMSE를 통한 진단은 나이, 학력 등에 의해 그 결과가 달라지므로, 진단의 정확성이 문제가 되고 있다. MRI 및 PET은 비용이 높은 단점이 있다. 또한 AD 환자의 뇌 조직에서 노인반 및 신경섬유 덩어리 두 가지 병변을 확인하는 방법도 사용되고 있으나, 병을 진단하거나 진행 정도를 확실하게 파악할 수 있는 방법은 알려져 있지 않다.
AD 진단을 위한 생화학적 진단 표지자를 찾기 위한 연구는 중요한 연구 분야로서 혈액, 뇌척수액 등의 체액을 포함한 다양한 조직에서 이루어지고 있다. 뇌척수액(cerebrospinal fluid: CSF)은, 뇌의 세포 외부 부분과 직접 접촉하는 부위로, 뇌의 단백질 변화를 반영하고 있으며, 정상 노인에 비해 알츠하이머병 환자의 CSF에서 Aβ42 농도의 감소, 전체 타우와 자가인산화 타우의 증가 등이 보고되고 있다. 그러나, 대부분의 AD 환자가 65세 이상의 고령임을 고려하면, 뇌척수액을 얻기 위한 요부천공(lumber puncture)의 경우, 상당한 위험을 동반한다.
알츠하이머성 치매의 원인물질이며 질병의 진행에 따라 뇌에 축적되는 아밀로이드 베타에 대해 특이적으로 결합하는 물질로 최근 개발된 Pittsburgh compound B (PIB)는 알츠하이머성 치매의 진단에 유용한 물질이다. PIB를 투여한 후 PET 영상을 찍음으로써 뇌의 아밀로이드 베타의 축적 정도를 측정하고 이를 알츠하이머성 치매의 진단에 효율적으로 이용할 수 있기 때문이다. 하지만 이 진단 방법은 고가의 비용과 장비의 제한성 때문에 보편적인 알츠하이머성 치매의 진단 방법으로 사용하기에 한계가 있다.
이와 비교하여 채취의 상대적인 용이성, 검사의 경제성, 시간절약 등을 고려하면, 혈액 진단 표지자는 많은 장점이 있다. 혈액 진단 표지자는 알츠하이머병 진행에 따른 뇌의 기능적 병리적 변화를 잘 반영할 수 있어야 하는 반면 알츠하이머병 진행에 따른 다양한 뇌 단백질들의 변화가 항상 혈액내에서 감지되지는 않아 진단 표지자 발굴의 어려움을 겪고 있다. 또한 대개의 알츠하이머병의 진행에 따라 증감되는 뇌 단백질이 뇌척수액이나 혈액 내에서는 반대의 증감 경향성을 보이고 있는 것이 일반화된 현상이다. 예를 들면, 알츠하이머병의 진행에 따라 뇌 아밀로이드베타42(Aβ42)는 증가하는 반면 뇌척수액 아밀로이드베타42는 감소하고, 트렌스 사이레틴은 뇌에서는 증가, 반면 혈액에서 감소함으로 알려져있다(Scheuner et al., Nature Medicine 2, 864-870 (1996); Galasko et al., Arch Neurol 55(7):937-45 (1998); Li et al., Journal of Neuroscience 31(35):12483-12490 (2011); 및 Han et al., Journal of Alzheimer disease 25(1)77-84 (2011)).
대한민국 공개특허공보 제2012-0041823호는 알츠하이머병 조기진단용 단백질성 마커에 관한 것으로 ATP synthase subunit beta 및 adenosine kinase(Isoform Long) 및 regucalcin을 이용한 알츠하이머병 조기 진단용 마커를 개시한다.
대한민국 공개특허 제2010-0049363호는 비타민 D 결합 단백질을 이용한 알츠하이머병의 진단장치 및 진단방법에 관한 것으로 비타민 D 결합 단백질과 결합하는 항체를 이용한 진단방법 및 장치에 대하여 개시한다.
대한민국 공개특허 제2014-0042331호는 인지장애 질환 진단용 다중 마커 및 그 용도에 관한 것으로 인지장애 질환 진단 마커로서 트랜스싸이레틴(Transthyretin), ApoE, 알파-사이뉴클레인(α-synuclein), 비타민 D 결합 단백질, 뉴로그레닌(neurogranin), 비멘틴(vimentin), 스테쓰민(stathmin), 컨텍틴(contactin), 및 HDL-콜레스테롤을 개시하고 있다.
하지만 알츠하이머병이 조기 진단이 어렵고, 병증이 계속 진행되면 사회적 비용이 많이 요구되는 정상 생활이 어려운 심각한 질환임을 고려하면, 혈액과 같은 간편한 시료를 통해 알츠하이머병의 조기 진단을 포함한 알츠하이머 중증도 진단은 물론 증상이 나타나기 전인 전임상(preclinical) 단계에서도 진단할 수 있는 새로운 마커 개발의 필요성이 있다.
최근 활발한 연구에 의해 다양한 알츠하이머성 치매 진단의 혈액 바이오 마커 후보물질들이 발굴되고 있으나 각각의 바이오 마커는 민감도와 정확성에 있어서 요구 기준을 충족시키지 못하고 있는 현실이다.
본원은 혈액을 이용하여 뇌의 베타 아밀로이드 플라크 축적 여부 예측 또는 이와 관련된 질환의 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 혈액에서 검출용 용도로서, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 알츠하이머성 치매를 포함하는 치매군을 포함하는 전주기에서 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이다.
다른 양태에서 본원은 상기 마커의 검출용 물질을 포함하는 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 조성물, 키트 또는 방법을 제공한다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커에서 상기 혈장 아밀로이드 베타는 MPP로 처리된 것이다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 혈액 특히 혈장에서 검출될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 상기 마커에 추가하여 ApoE를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커가 사용되는 인지장애 정상군은 특히 AchEI(억제제) 미복용군이다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 상기 마커에 추가하여 혈액검사의 통상적인 항목인 인, 유리 T3 및/또는 HDL 콜레스테롤을 마커로 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본원에 따른 마커는 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단 또는 PIB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography) 검사가 필요한 지 여부의 판단으로 사용되며, 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 아밀로이드 베타 축적으로 인한 질환 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환 진단은 인지장애 중증도 판단에 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부의 검출이 필요한 검사 대상자 유래의 혈액 샘플을 제공하는 단계; 상기 혈액 샘플에서 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커를 정량하는 단계로, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군을 대상자 혈액, 상기 마커 중 LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin 경도인지장애 환자군 대상자 혈액, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군 혈액, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 전주기 환자군의 혈액 시료에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부를 검출하며; 그리고 상기 정량된 각 마커의 양을 상기 대상자의 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부와 관련시키는 단계를 포함하는, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에서 연관시키는 단계는 대조군에서 결정된 정량 결과와 비교하여, 상기 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, 및 VE-cadherin은 모두 감소하는 경우, 상기 혈액이 유래된 대상자는 아밀로이드 베타가 축적된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것이다.
본원에 따른 상기 방법은 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단, 또는 PiB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography)검사가 필요한 지 또는 인지장애 중증도 판단에 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 마커는 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환 진단은 인지장애 중증도 판단에 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 마커는 혈액 특히 혈장에서 검출될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 마커는 상기 마커에 추가하여 ApoE를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 마커가 사용되는 인지장애 정상군은 특히 AchEI(억제제) 미복용군이다.
또 다른 양태에서 본원은 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커로, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 알츠하이머성 치매군를 포함하는 치매군을 포함하는 전주기에서 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커를 제공한다.
일 구현예에서, 혈장 아밀로이드 베타는 MPP로 처리된 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커를 제공한다.
일 구현예에서 각 인지기능 정상군은 AchE 억제제 비복용자인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커를 제공한다.
일 구현예에서, 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 ApoE를 추가로 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커를 제공한다.
일 구현예에서 상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 인, HDL(High Density Lipoprotein) 및 유리 T3(free triiodothyronine) 중 하나 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커를 제공한다.
일 구현예에서 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단, 또는 PIB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography) 검사가 필요한 지 여부의 판단으로 사용되며, 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커를 제공한다.
일 구현예에서 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단은 인지장애 중증도 판단을 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커를 제공한다.
본원에 따른 바이오마커는 알츠하이머성 치매 원인물질인 아밀로이드 베타의 뇌 축적을 조기에 혈액에서 간편하고 신속하게 검출할 수 있다.
뇌의 아밀로이드 베타의 축적은 치매나 건망증 등의 임상적 증상이 나타나기 15~20년 전부터 시작되므로, 임상적 증상이 없거나 또는 경미한 임상적 증상을 나타내는 환자의 혈액검사를 통해 뇌 아밀로이드 베타 축적여부를 확인할 수 있는 본원에 따른 마커는 알츠하이머 치매를 조기에 검출할 수 있음은 물론, 조기에 그 진행을 늦추거나 막을 수 있어, 환자의 삶의 질을 획기적으로 개선할 수 있다.
나아가, 본원에 따른 마커는 인지기능 정도에 따른 세분화된 환자군, 즉 인지기능 정상군, 경도인지 장애군, 알츠하이머성 치매군 및 전주기 군에 따라 더욱 유효한 조합으로 구성될 수 있고, 이를 이용하여 정확도 및 유효성이 더욱 향상된다.
또한, 최근 뇌영상으로 뇌 아밀로이드베타의 축적을 확인할 수 있는 일부 대학병원에서만 시행할 수 있는 고가의 검사인 PiB-PET 영상을 대체 또는 영상 검사가 필요한 환자의 스크리닝 등에 효과적으로 사용될 수 있다. 따라서 뇌 아밀로이드 베타의 축적을 혈액에서 간편에서 확인할 수 있는 본원에 따른 혈액 바이오마커는 환자의 편리성 및 비용 절감의 측면에서도 효과가 매우 크다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c는 혈액에서 본원의 바이오마커 검출을 통한 뇌 베타 아밀로이드 축적여부 감별을 위해 확립된 모델을 도식적으로 나타낸 것으로, 도 1a는 본원에서 마커 발굴 시료 별 아밀로이드 베타 축적을 촬영한 PET 영상결과로, PET영상 결과는 뇌 아밀로이드 베타 축적을 측정하는 표준 방법으로, 혈액 바이오마커와 뇌의 베타의 축적과 연관이 있는지 확인할 수 있다. 도 1b 및 도 1c는 세분화된 환자군에 따른 모델 별 마커를 나타낸 것이다. PiB-PET 양성자에서 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, VE-cadherin은 모두 감소한다. 이는 PiB-PET 결과와 본원에 따른 마커의 높은 관련성을 나타내는 것으로, 본원에 따른 마커가 뇌의 베타 아밀로이드 축적에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
도 2a는 모델 1로 인지기능 정상군(CN)에서 뇌 베타 아밀로이드 축적군(CN 중 A베타+ vs A베타-) 감별 결과를 나타낸다.
도 2b는 도 2a와 동일하나, 인(Phosphorous)을 추가의 바이오마커로 사용한 결과이다.
도 3a는 모델 2로 경도인지장애 환자군(MCI)에서 뇌 베타 아밀로이드 축적군(MCI 중 A베타+ vs A베타-) 감별 결과를 나타낸다.
도 3b는 도 3a와 동일하나, 인을 추가의 바이오마커로 사용한 결과이다.
도 4a는 모델 3으로 중증치매가 아닌 환자군(CN과 MCI)에서 뇌 베타 아밀로이드 축적군(CN+MCI 중 A 베타+ vs A 베타-) 감별 결과를 나타낸다.
도 4b는 도 4a와 동일하나, 인을 추가의 바이오마커로 사용한 결과이다.
도 5a는 모델 4로 전주기에서 아밀로이드 축적군(인지기능 관계없이 전체 대상자에서 A 베타+ vs A 베타-) 감별 결과를 나타낸다.
도 5b는 도 5a와 동일하나, HDL 콜레스테롤 및 유리 T3(free triiodothyronine)를 추가의 바이오마커로 사용한 결과이다.
도 6은 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD, Alzheimer Disease Dementia), 및 전주기(PIB- vs PIB+) 혈액에서 LGALS3BP를 ELISA로 정량한 실험 결과이다. 이는 LGALS3BP의 정량 값을 인지기능 정상군, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매군, 및 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군(-)과 양성군(+)을 비교하였을 때 유의한 변화를 보이므로 본원에 따른 모델 1 내지 4에 모두 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다.
도 7은 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 및 전주기(PIB- vs PIB+) 혈액에서 ACE를 ELISA로 정량한 실험 결과이다. 이는 ACE의 정량값을 인지기능 정상군, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매군, 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군(-)과 양성군(+)을 비교하였을 때 경도인지장애 및 전주기에서 유의한 변화를 보이고 정상군, 알츠하이머성 치매군에서 감소경향을 보이므로 본원에 따른 모델 1 내지 4에 모두 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다.
도 8은 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 및 전주기(PIB- vs PIB+) 혈액에서 TSP-1를 ELISA로 정량한 실험 결과이다. 이는 TSP-1의 정량값이 인지기능 정상군, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매군, 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군과 양성군을 비교하였을 때 전주기에서 유의한 변화를 보였으므로 본원에 따른 모델 4에 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다.
도 9는 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 및 전주기(PIB- vs PIB+)의 혈액에서 AChE를 ELISA로 정량한 실험 결과이다. 이는 AChE의 정량값이 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군(-)과 양성군(+) 을 비교하였을 때 정상군에서 유의한 변화를 보였으므로 본원에 따른 모델 1에 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다. AChE 억제제 (AChEI)미복용 그룹을 사용하였다. 절반 이상의 MCI환자나 거의 모든 AD 환자가 AChE 억제제를 복용하고 있기 때문에 AChE는 특이 인지기능 정상군의 마커로서 유용하다. AChE 억제제를 복용하고 있는 경우, 뇌 아밀로이드 축적에 의해 혈중 AChE의 농도 변화가 있는지를 확인하기 어렵고, 인지기능 정상군에서는 AChE 억제제를 복용하지 않아 뇌 아밀로이드 축적과의 연관성을 확인할 수 있다.
도 10은 인지기능 정상군(CN), 경도인지장애(MCI), 알츠하이머성 치매군(ADD), 및 전주기(PIB- vs PIB+) 혈액에서 MPP-아밀로이드베타를 ELISA로 정량한 실험결과이다. 이는 MPP 아밀로이드베타 40 및 42의 정량값이 정상군, 경도인지장애, 알츠하이머성 치매군, 전주기에서 각각 뇌아밀로이드 베타의 축적 음성군(-)과 양성군(+)을 비교하였을 때 42/40비율이 정상군 및 전주기에서 유의한 변화를 보였으므로 본원에 따른 모델 1 내지 4에 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 이러한 정량값은 로지스틱리그레션 식을 이용하여 통합적 지수(실시예 2 참조) 산출 및 ROC 커브 분석을 통한 특이성, 민감도 및 AUC 값 결정에 사용되었다.
본원은 인지기능 및 PIB PET 영상에 따라 6개 그룹의 환자군에서 대규모 코호트 개별 검증을 실시하여 뇌의 베타 아밀로이드 침착 또는 축적과 유의적으로 상관관계를 보이는 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)의 바이오마커 발굴을 기초로 한 것이다. 나아가 상기 마커는 각 세분화된 환자에 따라 더욱 유효한 조합으로 구성될 수 있고, 이를 이용하여 정확도와 유효성이 향상된 환자 군별 혈중 바이오마커의 이용이 가능하게 되어, 정상군, 인지경도장애군 또는 모든 그룹에서 사용가능한, 뇌에 아밀로이드가 축적되었는지를 예측할 수 있는 마커이다.
이에 한 양태에서 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 베타 아밀로이드 축적 여부 감별 또는 판단용 용도에 관한 것이다.
이러한 용도는 상기 마커를 인비트로 또는 인비보에서 검출할 수 있는 검출용 물질을 포함하는 조성물, 키트의 형태, 또는 상기 마커 자체를 포함하는 조성물의 형태, 또는 상기 마커를 이용한 베타 아밀로이드 축적 검출 방법의 형태로 구현될 수 있다.
현재까지 아밀로이드베타 플라크 축적 여부 검출 또는 예측은 아밀로이드 베타 플라크의 축적의 검출은 알츠하이머성 치매환자의 사후 뇌 조직검사에 의해 확인되었고 알츠하이머성 치매를 확진했다. 최근 뇌영상으로 뇌 아밀로이드베타의 축적을 확인할 수 있는 PIB-PET 등의 기술이 개발되었으나 이는 매우 고가의 검사이고 일부 대학병원에서만 시행할 수 있는 고가의 장비이며 환자에게도 여러 불편을 준다. 따라서 뇌 아밀로이드 베타의 축적을 확인할 수 있는 본원에 따른 혈액 바이오마커는 그 중요성이 매우 크다.
뇌 아밀로이드 베타의 축적은 치매나 건망증 등의 임상적 증상이 나타나기 15~20년 전부터 시작되므로 임상적 증상이 없거나 또는 경미한 임상적 증상을 나타내는 환자의 혈액검사를 통해 뇌 아밀로이드 베타 축적여부를 확인할 수 있다면 알츠하이머 치매를 조기 진단할 수 있고 조기에 그 진행을 늦추거나 막을 수 있다. 또한 뇌 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 알츠하이머병 환자로 확인할 수 있어, 이러한 환자에 대한 치료전략을 달리 할 수 있다.
또한 본원에 따른 마커를 이용한 뇌의 베타 아밀로이드 축적 검출은 또한 베타 아밀로이드가 축적되어 발생되는 질환의 진단에 또한 사용될 수 있다.
구체적으로, 뇌에 베타 아밀로이드가 축적되어 발생되는 다양한 질환이 알려져 있고 (Head, E., and Lott, I. T. (2004) Down syndrome and beta-amyloid deposition. Curr Opin Neurol 17; Primavera et al., (1999) Brain Accumulation of Amyloid-beta in Non-Alzheimer Neurodegeneration. J Alzheimers Dis; Masliah et al., (2001) beta-amyloid peptides enhance alpha-synuclein accumulation and neuronal deficits in a transgenic mouse model linking Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci), 따라서 본원에 따른 마커는 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 다양한 질환의 진단, 검출 등에 사용될 수 있다.
일 구현예에서 이러한 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환은 예를 들면 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함한다.
본원에서 “인지장애”는 신경 퇴행성 질환을 일컫는 것으로 예를 들면 알츠하이머(AD : Alzheimer Disease)성 치매, 파킨슨병 치매, 루이소체치매 또는 헌팅톤병 치매, 알츠하이머성 치매증상(ADD) 보유군, 치매로 진행되기 전단계인 약한 인지기능 장애, 즉 경도 인지장애(MCI : Mild Cognitive Impairment)를 포함하는 것으로, 이런 의미에서 치매 또는 비치매 환자군을 모두 포함할 수 있다. 이러한 인지장애의 중증도는 MMSE (Mini mental state examination, 2006_Benson et al., Journal of clinical Psychiatry, 2008_O’Bryant et al., Arch Neurol) 스코어 등과 같은 방법으로 분류될 수 있다.
본원에서 “치매”는 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 또는 헌팅톤병 치매를 포함한다.
본원에서 “비치매”는 인지기능 정상군 및 경도인지 장애군을 포함한다.
본원에서 “인지기능 정상군”은 베타 아밀로이드 축적 여부와 관계없이, 상술한 MMSE 등의 검사를 통해 인지기능이 정상으로 판별된 군을 의미한다. 인지기능이 정상인 경우라도, 인지기능 저하 없고 뇌 아밀로이드 베타 축적이 있는 정상인을 포함한다. 베타 아밀로이드가 뇌에 축적이 되어 있는 경우에는 경도 인지장애를 거쳐 치매로 진행될 수 있기 때문에, 인지기능 정상군에서의 베타 아밀로이드 축적 여부를 판별하는 것은 치매의 조기 발견에 매우 중요하다.
본원에서 “경도인지 장애군”은 인지기능 저하가 있지만 일상생활이 가능한 치매의 전단계로서 뇌 아밀로이드 베타 축적이 없는 환자 및 베타 축적이 있는 환자로서 인지기능 저하가 있지만 일상생활이 가능한 치매의 전단계를 포함한다.
이런 측면에서 인지기능의 저하 정도에 따라, 인지기능 정상군, 경도인지 장애군 및 알츠하이머성 치매증상(ADD) 보유군을 포함하는 치매군의 순서로 인지기능의 저하 정도가 심화된다.
본원에서 치매 환자군은 인지기능저하가 있고, 알츠하이머성 치매증상(ADD) 보유군, 치매로 진단받은 환자로서 뇌 아밀로이드 베타 축적이 없는 환자는 물론 인지기능저하가 있고 치매로 진단받은 환자로서 뇌 아밀로이드 베타 축적이 있는 환자를 포함한다.
본원에서 “전주기”는 치매로 진단되는 과정에 이르기까지의 모든 환자군을 포함하는 것으로, 인지기능 정상군, 경도인지장애군 및 치매 환자군을 포함하는 것이다. 또한 PiB-PET 양성 및 음성 환자를 모두 포함하는 것이다.
본원에 따른 일 구현예에서 특히, 치매는 알츠하이머성 치매이다.
본원에서 “알츠하이머성 치매” 또는 “알츠하이머 병”은 신경 퇴행성 뇌질환으로 기억력을 포함한 인지기능의 약화가 점진적으로 진행되는 병으로, AD 또는 ADD(알츠하이머성 치매)로도 불린다. 이는 임상증상이 나타나기 전인 전임상(preclinical) 알츠하이머병 뿐만 아니라, 치매로 진행되기 전단계인 약한 인지기능 장애 즉 경도 인지장애를 포함할 수 있다. 대다수의 알츠하이머병 환자의 뇌에는 신경반(혹은 노인반) 또는 신경섬유다발이 생성되는데, 신경반(혹은 노인반)은 베타 아밀로이드 단백질의 침착과 신경섬유다발은 타우 단백질(tau protein)의 과인산화, 염증반응, 산화적 손상 때문인 것으로 알려져 있다. 상기 전임상 알츠하이머병은 임상적 소견은 보이지 않지만 뇌의 아밀로이드 플라크 침착이 나타나는 단계를 말한다.
본원에서 “아밀로이드 베타 플라크” 또는 “베타 아밀로이드 플라크”는 아밀로이드 베타를 포함하는 불용성 섬유성 단백질 응집체이며, 본원에서 A-베타로도 표기되며, 주성분은 A-베타40 또는 A-베타42 이다. 일 구현예에서는 상기 아밀로이드 플라크는 세포 내, 세포 표면에, 및/또는 세포 사이의 공간에 존재하는 것일 수 있다. 특히 신경조직의 세포 사이의 공간에 존재하는 것이며, 알츠하이머 치매 진단의 표지 물질로 사용되며, 플라크의 축적 정도에 따른 치매 진단은 개시된 바를 참고할 수 있다(Mawuenyega et al., Science, 2010_Querfurth and LaFerla, The New England journal of medicine). 문맥에 따른 아밀로이드 베타 플라크를 아밀로이드 베타로 칭할 수 있으며, 이는 당업자가 용이하게 판단할 수 있을 것이다.
본원에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본원에서 “조기 진단”은 경도인지장애, 또는 임상증상이 나타나기 전인 전임상(preclinical) 단계에서 진단하는 것을 포함한다.
본 발명에서 용어 “진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)”란 알츠하이머병을 정상과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 적절한 대조군에 비하여 질환을 가진 대상자의 혈액에서 증가 양상을 보이는 단백질 등을 포함한다. 본원에 따른 마커 중 Periostin은 아밀로이드 베타 플라크의 축적과 함께, 혈중 농도가 증가하며, LGAL, ACE, AChE, TSP1, VE-cadherin은 아밀로이드 베타 플라크의 축적과 함꼐, 혈중 농도가 감소한다(도 6 내지 도 10 참조). 본원에서 상기 마커에 더하여 추가로 사용되는 마커는, 정상 대조군 또는 PiB-PET 음성 대상자의 결과와 비교하여, 혈액의 인, Free T3 농도는 낮아지고, HDL cholesterol의 농도는 유의적으로 높아진다.
본원에 따른 마커 Periostin, VE-cadherin, ACHE, TSP-1, LGALS3BP 및 ACE은 단백질 및 핵산 서열, 세포내 프로세싱, 변형 등은 하기 표 1과 같이 공지된 것으로, 당업자라면, 상기 마커의 검출에 필요한 서열 및 검출 방법을 용이하게 선택할 수 있을 것이다.
[표 1]
Figure PCTKR2018003340-appb-I000001
본원에 따른 마커 중 혈장 아밀로이드 베타는 혈장 전처리 조성물(MPP)은 프로테아제 억제제 및 포스파타아제 억제제를 혼합한 혼합물(Mixture of protease inhibitors and phosphatase inhibitors)로 처리된 것이다. 이에 대하여는 원 발명자가 출원한 대한민국 공개특허 제2016-0129444호에 상세하게 개시된 것을 참조할 수 있다.
본원에 따른 마커는 특히 혈액 시료에서 검출된다. 혈액시료는 치매의 진단에 사용되는 뇌 척수액과 같은 시료와 비교하여, 매우 용이하게 얻을 수 있는 것으로, 비용의 절감은 물론 편리성이 매우 증대된다. 본원에 따른 마커가 사용되는 검체는 전혈, 혈소판, 혈장 또는 혈청 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예에서는 혈장이 사용된다. 본원에 사용되는 검체는, 비교 분석을 위해, 진단 또는 검출이 필요한 검사 대상자의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 질환을 갖는 대조군 유래의 검체가 또한 사용될 수 있다.
본원의 마커는 특히 인지기능 저하 정도에 따라 세분화된 환자 즉, 인지기능 정상군, 인지경도장애군 또는 전주기 군에 따른 마커로 조합되어, 정확도와 유효성이 향상된 환자군 별 검출이 가능하다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커 중 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다. 일구현예에서, 특히 ACHE 마커는 ACHE 억제제 미복용 환자에서 사용된다.
다른 구현예에서 본원에 따른 마커 중 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 치매군을 포함하는 전주기의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다.
또 다른 구현예에서 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 치매군을 포함하는 전주기의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출에 사용된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 마커는 상기 각 군의 검출 마커에, 후술하는 ApoE 유전자형 검사를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 마커는 상기 각 군의 검출 마커에, 후술하는 통상적인 혈액 검사에서 측정하는 항목인, 인, 유리 T3 및/또는 HDL 콜레스테롤을 추가의 마커로 포함할 수 있다. 이러한 마커는 ApoE의 존재 또는 부재하에 사용될 수 있다.
또한 본원의 마커는 인지장애의 발병 및 진행 정도에 대한 지표가 될 수 있으며, 발병, 질환의 진행 정도, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.
따라서 다른 측면에서 본원은 상술한 바와 같은 본원에 따른 마커 또는 마커의 조합을 아밀로이드 베타 플라크 축적의 예측, 조기 진단, 또는 PiB-PET 영상 검사가 필요한지를 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 마커를 이용한 혈액검사에서 뇌에 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 것으로 판단된 경우는 PiB-PET 영상을 검사할 필요가 없고, 축적된 것으로 판단된 경우는 확진을 위해 PiB-PET 영상 검사를 할 수 있다.
본원에 따르면 알츠하이머성 치매의 진단에 널리 사용되는 PiB-PET의 뇌영상 결과에 근거한 알츠하이머성 치매의 원인물질로 알려진 아밀로이드 베타 플라크 축적 결과와 본원에 따른 혈액 마커의 농도가 높은 연관성이 있는 것으로 나타났다. 즉 PiB-PET 양성 대상자에서는 PiB-PET 음성 대상자의 결과와 비교하여, 혈액에서 본원에 따른 마커들의 농도가 유의적으로 증가 또는 감소하는 것으로 나타났다. 즉 도 1a를 참조하면, PiB-PET 양성자에서 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, VE-cadherin은 모두 감소한다. 이는 본원에 따른 마커가 뇌의 베타 아밀로이드 축적에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다. 본원에서 상기 마커에 더하여 추가로 사용되는 마커는, 정상 대조군 또는 PiB-PET 음성 대상자의 결과와 비교하여, 혈액의 인, Free T3 농도는 낮아지고, HDL cholesterol의 농도는 유의적으로 높아진다.
본원에서 용어 “검출시약”은 본원에 따른 마커를 검출 또는 정량할 수 있는 시약으로, 예를 들면 본원의 마커를 단백질 및/또는 유전자 또는 mRNA와 같은 핵산수준에서 검출할 수 있는 물질이거나, 그 외의 경우, 본원 실시예에 기재된 것을 참조할 수 있다.
본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 하기 실시예를 포함한 본원의 기재를 고려하여 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것 방법을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어 본원에 따른 각 마커의 검출 방법은 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.
예를 들면 단백질 수준의 검출 방법 및 시약은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다. 일 구현예에서 항원-항체 반응을 효소 면역흡착 분석법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 면역 측정법(sandwich ELISA), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴블랏, 면역 점 블랏 분석법(Immuno dot blotting assay), 면역형광측정법(Immuno-fluorescence Assay, IFA), 면역발광측정법(Immunochemiluminescence Assay), 면역 조직 화학 염색법 또는 면역크로마토그래피측정법(Immunochromatography, Rapid), 비드나 디스크를 이용한 항원항체 반응(X-MAP technology) 등을 사용하여 수행될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면 본원에 따른 조성물은 마커를 단백질 수준에서의 검출에 필요한 시약을 포함한다. 예를 들면 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자 등을 포함할 수 있다. 이러한 시약은 필요한 경우 나노입자 또는 칩에 통합하여 사용할 수 있다.
본원의 다른 구현예에 따르면 검출시약은 항체를 포함하며, 본원의 마커의 검출은 이에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 이용하여 실시된다.
본원에 이용될 수 있는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
다른 양태에서 본원은 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부의 검출이 필요한 검사 대상자 유래의 혈액 샘플을 제공하는 단계; 상기 혈액 샘플에서 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커를 정량하는 단계로, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 치매군을 포함하는 전주기 환자 유래의 혈액에서 검출하는 것이고; 그리고 상기 검출된 마커의 양을 검사 대상자의 뇌의 아밀로이드 베타 축적 또는 이외 관련된 질환 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 대상자의 검체로부터 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서 상기 아밀로이드 베타는 앞서 언급한 바와 같이 MPP로 처리된 것이 사용된다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 ApoE 마커의 사용을 추가로 포함할 수 있다.
ApoE 유전자는 ApoE 2, ApoE 3, ApoE 4의 세가지 유전자 타입이 있는데 ApoE 4를 가지고 있는 사람이 AD에 걸릴 확률이 안 가지고 있는 사람에 비해서 매우 높음이 이미 널리 알려져 있는 리스크 인자이다. 따라서 AD의 유전적 위험요소라고 알려져 있고 이 유전자 검사를 함으로서 AD를 예측할 수 있다. ApoE (Apolipoprotein E)는 E2(cys112, cys158), E3(cys112, arg158), 및 E4(arg112, arg158)라고 불리는 세 종류의 대립형질이 존재하여 한 개체의 유전체형은 E2/E2, E2/E3, E2/E4, E3/E3, E3/E4, 또는 E4/E4 형으로 존재한다. 이중 E4 대립형질은 인구의 약 20% 정도에서 발견되며, 알츠하이머 치매 발병 위험도를 증가시키는 것으로 알려졌다. 본원에 따르면 ApoE 유전자형 마커를 본원에 따른 마커에 추가하여 사용하는 경우 특이성과 민감도가 향상될 수 있다. ApoE 유전자형의 검출은 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 실시예에 개시된 바와 같이 대립유전자 특이적 프라이머를 이용한 PCR 방법이 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 방법은 통상적 혈액 검사 항목인, 인, 유리 T3, HDL 콜레스테롤 중 하나 이상의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 HDL 콜레스테롤, 유리 T3, 및 인의 각 마커는 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법을 참고할 수 있다.
본원에 따른 방법은 특히 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단용으로 사용되며, 상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함한다.
본원에 따른 방법은 또한 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환 진단은 인지장애 중증도 판단을 포함한다.
본원의 방법은 마커 분석 결과에 추가하여, 환자의 비단백질 임상정보 즉, 마커이외의 임상정보를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 비단백질 임상정보란, 예를 들면 환자의 나이, 성별, 체중, 식습관, 체질량, 기저질환, 자기공명영상법(MRI), SPECT(single-photon emission computed tomography), 또는 MMSE(mini-mental status examination) 또는 양전자 방사 단층촬영(positron emission tomography; PET) 중 하나 이상을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원 방법은 마커의 검출 결과를 뇌의 아밀로이드 베타 플라크 축적과 관련된 질환의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하며, 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 양을 대조군과 비교한다.
일 구현예에서 본원에서 대조군으로서 PIB-PET 결과에서 음성으로 판단된 사람의 혈액시료에서 결정된 수치를 포함하는 정상 대조군에서 결정된 상기 각 마커의 검출결과와 비교, 예를 들면 그 증감을 비교한 후, 이를 근거로 축적을 예측 또는 진단하는 것이다.
예를 들면 대조군의 값과 비교하여 본원에 따른 마커 중 하나 이상이 유의하게 증가 또는 감소된 경우, 대상자에서 플라크의 축적 또는 상기 질환이 발생한 것으로 진단하는 정보를 제공할 수 있다.
예를 들면 상기 연관시키는 단계는 PIB PET 결과에서 음성으로 판단된 사람 또는 정상 대조군의 혈액시료에서 결정된 수치를 포함하는 정량 결과와 비교하여, 상기 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, 및 VE-cadherin은 모두 감소한다. 또한 예를 들면 상기 연관시키는 단계는 결정된 각 마커의 양을 PIB PET 결과에서 음성으로 판단된 사람 또는 정상 대조군의 혈액시료에서 결정된 정량 결과와 비교하여, 인, 유리 T3 농도는 낮아지고, HDL cholesterol 농도는 유의적으로 높아진다.
예를 들면 또한 한 개 이상의 마커를 동시에 사용하여(다중마커) 그 증감 등 변화의 정도를 한 개의 수치로 산출하였을 때 수치가 일정 기준 이상 또는 이하인 경우 뇌 아밀로이드 베타 축적을 예측할 수 있다. 인지기능정도(즉, 인지기능 정상군, 경도인지장애군, 알츠하이머성 치매군)에 따른 환자에서 아밀로이드 베타 축적을 위한 본원에 따른 모델 1 내지 4의 다중마커의 조합은 예를 들면 본원 실시예 2에 개시된 것과 같은 식을 이용하여, 컷오프 수치를 결정하고, 이를 아밀로이드 베타 축적 판별에 사용될 수 있다.
또한 본원 일 구현예에 따르면 상기 연관시키는 단계는 정상 대조군과 대상자의 시료를 비교한 후, 상기 각 마커에 대하여 플라크의 축적 예측 또는 질환의 발병여부를 진단할 수 있는 임계값을 설정한 후, 대상자의 검출 결과를 상기 임계값과 비교할 수 있다. 예를 들면 본원 실시예에 기재된 바와 같이 뇌 아밀로이드 베타 플라크의 축적 여부 즉 음성과 양성을 판별하는, 즉 PiB-PET 음성과 양성을 판별하는 각 마커의 임계값은 본원에 따른 결과를 메드 칼큘레이트 프로그램을 이용하여 ROC커브 분석에 의해 결정된 Youden index를 근거로 결정될 수 있다. 상기 임계값은 뇌에 아밀로이드 베타 플라크 축적 양성을 나타내는 것으로, PiB-PET 검사 대상자 선별, 뇌 아밀로이드 베타 플라크 축적과 관련된 질환의 진단 등에 사용될 수 있다.
PIB-PET 검사는 환자에게 불편함을 물론 많은 비용과 시간이 소요되기 때문에, 아밀로이드 플라크 축적의 가능성이 높은 사람을 대상으로 하는 선별과정이 절실한 실정이다.
다른 양태에서 본원에 따른 방법은 알츠하이머성 치매를 포함하는 뇌의 아밀로이드 베타 플라크 축적의 판단이 필요한 검사 대상자가 뇌의 PIB-PET 검사가 필요한 지 여부에 대한 정보를 제공하기 위해, 상기 대상자 유래의 혈액시료를 제공하는 단계; 상기 혈액시료에서 본원에 따른 마커를 정량하는 단계; 및 상기 마커의 농도를 대조군으로서 PIB-PET 검사 음성으로 판단된 대조군과 비교하여 상기 대상자를 PIB-PET 검사 대상자로 결정하는 단계를 포함하는, PIB-PET 검사가 필요한 대상자 선별을 위한 마커의 검출 방법을 제공한다. 예를 들면 본원에 따른 마커를 이용한 혈액검사에서 뇌에 아밀로이드 베타가 축적되지 않은 것으로 판단된 경우는 PiB-PET 영상을 검사할 필요가 없고, 축적된 것으로 판단된 경우는 확진을 위해 PiB-PET 영상 검사를 할 수 있다.
아울러 상술한 본원에 따른 모든 방법에서 상기 각 마커에 대하여는 상술한 바를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. 바이오마커의 발굴 및 측정 방법
1-1. 코호트 대상자 모집 및 선별평가
외래/치매지원센터/포스터 등을 통해 대상자를 모집하고, 임상/신경심리 평가 시행하여 선정기준/제외기준 해당여부를 평가하였다. 이때 제외기준은 만족하지 않으면서 선정기준을 모두 만족하는 경우에만 다음 단계인 기저평가(상세평가)를 진행하였으며, 해당사항 없을 경우 탈락(Screening failure)하였다.
선정기준은 임상진단(National Institute on Aging and the Alzheimer's Association (NIA/AA)에서 발행하는 알츠하이머성 치매 진단 임상기준, Nihon Rinsho. 2016 Mar;74(3):386-94 등 참조)을 적용하므로 경도인지장애 임상기준, 알츠하이머성 치매 임상기준이 적용되었다. 경도인지장애는 특정 검사 항목의 z-score가 cut-off 보다 낮아야 선정기준을 만족하였다. Z-score란 원점수를 대상자의 연령, 성별, 교육년수를 고려한 평균과 표준편차를 적용했을 때 (원점수-평균)/(표준편차) 공식으로 구한 점수이다.
기저평가는, 위 선별평가를 통과하여 선정/제외기준을 모두 만족하는 군에 대해서 뇌영상 평가(PET-MRI) 및 혈액 검사, 상세 임상평가 및 상세 신경심리평가 등 그 외 추가적인 설문지 평가를 수행하였다.
위와 같은 단계를 거쳐 총 429명의 정상군, 경도인지장애 및 알츠하이머성 치매 환자가 선별되었으며 이들에 대하여 12시간 금식을 한 후 아침에 병원내원하여 채혈을 하고 하기와 같이 PIB PET 스캔 등을 실시하였다. 채혈한 혈액을 이용하여 단백질을 검출 및 정량을 실시하였다.
1-2. PiB - PET영상 스캔
참가자는 Biograph mMR scanner (Siemens, Washington DC, USA)를 이용하여 T1-강조 MR 및 3차원 PiB-PET 영상을 측정하였다. 555 MBq의 11C-PiB를 정맥 주입한지 40분 후에, 30분 송출 스캔을 얻었다. 데이터는 반복 방법(21 서브세트의 6 반복)을 사용하여 256 X 256 영상 매트리스로 변환하여, 균일성, 초단파 에코타임9UTE)-기초 감쇠(attenuation), 및 붕괴 감소(decay reduction)에 대해 교정하였다. Sagittal T1-강조(반복 타임 - 1370ms; 에코 타임 = 1.89ms; 관측 시야, 250nm; 256 x 256 1.0 mm 슬라이스 두께의 매트릭스)를 얻었다. MATLAB 2014a (MathWorks, Natick, MA)에 있는 Statistical Parametric Mapping 8 (SPM8)을 사용하여 영상을 전-처리하였다. PiB-PET 데이터를 개인 T1 영상으로 공동-등록하여 표준 Montreal Neurological Institute (MNI) 템플레이트에 대한 변형 파라미터를 계산하였다. Individual Brain Atlases using Statistical Parametric Mapping 소프트웨어(IBASPM)를 사용하여 AAL(automatic anatomic labeling) 116 atlas (Weiss, 1989)로부터의 좌표를 각 개체에 대한 개별 공간으로 변형시키는 역 변형 파라미터를 계산하였다(resampling voxel size = 1 × 0.98 × 0.98 mm). T1-coregistered PiB-PET 영상에서 얻은 individual AAL116 atlas를 사용하여 국소 뇌 평균 11C-PiB 업테이크를 계산하였고 정량적 표준화(normalization)를 위하여 소뇌 회백질 11C-PiB 업테이크 수치를 사용하였다. ROI(region of interest)을 결정하기 위하여, AAL 알고리듬 및 영역-병합 방식 region-combining method (Yaffe et al., 2011)을 적용하여, 뇌 영역을 정면, 외측 두정엽, 대상-설전부(posterior cingulate-precuneus, PC-PRC), 및 현저한 11C-PiB 리텐션(retention)이 있는 것으로 보고된(Klunk W. E. et al., 2004. Imaging brain amyloid in Alzheimer's disease with Pittsburgh Compound-B. Ann Neurol 55(3), 306-319.) 측변 측두부(lateral temporal region)로 나누었다. 각 ROI 내의 모든 복셀(voxel)에 대한 평균치를 동일 영상에서의 평균 소뇌 엡테이크 수치로 나누어 SUVR(standardized uptake value ratio) 수치를 계산하였다. 4개의 ROI(i.e., frontal, lateral temporal, lateral parietal, and PC-PRC) 중 최소 하나에서 SUVR 수치가 1.4가 넘으면 PiB 양성(PiB+)으로 개체를 분류하거나, 4개 ROI 모두의 SUVR 수치가 1.4 이하이면 PiB 음성(PiB-)으로 분류하였다. PiB-는 아밀로이드 침착이 음성인 개체를 의미하는 반면 PiB+는 아밀로이드 침착이 양성인 개체를 의미한다. 뇌 전체 아밀로이드 침착 수치(SUVR)는 피질 전체 ROI의 모든 복셀에 대한 평균치를 동일 영상의 평균 소뇌 업테이크 수치로 나누어 계산하였다.
PIB PET 스캔 영상 촬영 결과 총 429명 중에 282 PET 음성, 그리고 147 PET 양성 환자인 것으로 나타났다. 이들의 PIB PET 결과(양성 음성 판별 결과, PIB PET의 정량적 결과인 SUVR 값)와 혈액에서 마커의 정량을 통한 ROC 커브 분석을 통해 상관관계, 특이성(specificity), 민감성(sensitivity) 및 AUC 등을 분석하였다(실시예 2 참조, 도 1 내지 도 5).
1-3. 혈액 바이오마커 선별
각 군의 환자 10명의 샘플로 질량분석 실험을 통한 글로벌 및 당쇄화 프로테오믹스 분석(Li et al, 2014, Journal of Proteome Res 13, 3488-3497)을 실시하여 3948 단백질 그룹을 동정하였고 이 결과를 바이오인포마틱스 분석(Kang et al., 2016, Journal of Alzheimer’s disease 53, 1563-1576)에 의해 이중 각 군별로 차이가 나는 바이오마커 후보 단백질들을 선별하였다. 동정된 바이오마커 후보 단백질 중 순위가 높은 단백질 즉, 뇌 아밀로이드 베타 음성 정상군 대비 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성군인 경도인지장애, 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성군인 알츠하이머병 환자에서 증가하거나 감소한 단백질 순서로, 혈액에서 ELISA을 통해 정량을 한 결과 본원의 마커를 선별하였다.
1-4. 혈중 단백질 농도의 측정 (ELISA, 효소 결합 면역 침강 분석법)
혈중의 아밀로이드 베타의 농도는 혈장 전처리 조성물의 처리 후, 그 농도를 X-MAP 기술을 이용하여 측정하였다. 혈장 전처리 조성물은 상기 프로테아제 억제제 및 포스파타아제 억제제를 1:1(v/v)로 포함한다. 또한, MPP는 프로테아제 억제제 칵테일(Protease inhibitor cocktail, PIC):PMSF(Serine protease inhibitor):포스파타제 억제제 칵테일 Ⅰ:포스파타제 억제제 칵테일 Ⅱ를 1:1:1:1(v/v)로 혼합한 것일 수 있다. 이는 기허가 받은 특허[혈장 내 아밀로이드베타의 농도를 통해 알츠하이머병을 임상학적 및 병리학적으로 모니터링하는 방법, 특허번호 10-1786859] 에 자세히 기술되어있다. 측정 방법을 간단히 기술하면, 아밀로이드 베타 42와 40의 농도를 동시에 측정하기 위하여 INNO-BIA plasma Aβ forms kit (Fujirebio 사) 제품을 사용하였다. 항체가 결합되어있는 비드를 먼저 플레이트에 통과시켜 비드를 플레이트에 장착 후, MPP를 처리한 혈장 용액 샘플을 30분간 인큐베이션 한 후, standard(표준농도) 샘플들과 함께 플레이트에 넣어주었다. 이후 conjugate 항체가 붙은 비드를 넣고 하루 동안 냉장보관 하였다. 다음날, 플레이트를 워시한 이후, detection 항체를 넣어 주고 1시간을 인큐베이션 하였다. 마지막 단계로 reading 용액을 넣어서 X-MAP 기술을 이용하여 혈장 내 MPP로 전처리된 아밀로이드 베타를 측정하였다.
혈중 단백질 LGALS3BP, ACE, AChE, TSP1, Periostin, 그리고 VE cadherin의 농도는 ELISA(효소 결합 면역 침강 분석법) 방식을 이용하여 측정하였다. 이는 항원-항체 반응과 전량분석(colometric analysis)을 이용하여, 생체시료에 들어있는 특정 단백질 양을 측정하는 실험 방법이다. 상세한 실험방법은 각 제품(LGALS3BP, abnova사, KA0140; ACE, R&D사, DACE00; AChE, R&D사, DACHE0; TSP1, R&D사, DTSP10; Periostin, CUSABIO사, CSB-E16444h; VE-cadherin, R&D사, DCADV0)의 안내서를 따라 실험하였다. 간단히 설명하자면, 분리된 혈장 용액 샘플과 standard(표준농도) 샘플을 타겟 항체가 코팅된 플레이트에 넣어주고 상온에서 1시간 반에서 2시간을 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 이후, 각 웰은 wash 용액으로 5회 씻어준 뒤 conjugate 항체를 넣어주고 다시 2시간 인큐베이션 하였다. 다시 한번 각 웰을 씻어준 뒤, HRP의 활성도를 측정하기 위하여 Tetramethylbenzidine (TMB) 용액을 넣어주었다. 30분 뒤, 포화를 방지하기 위하여 stop 용액을 넣어주고, 플레이트는 450 nm에서 신호를 측정하였다.
1-5. 혈액검사
(1) 콜레스테롤 : 비색법 ( Colorimetric method)
검사장비로는 ADVIA 1800 Auto Analyzer(Siemens, USA), 검사시약은 HDL-Cholesterol(Siemens,UK)를 사용하였으며, 참조 수치(reference)는 40-60mg/dL이다. 검사원리는 다음과 같다. HDL 콜레스테롤 직접 측정법(D-HDL method)은 Izawa, Okada, 및 Matsui가 개발한 절차에 근거하여, 전 분리(prior separation) 없이 혈청 및 혈장 내 HDL 콜레스테롤을 측정하였다. 비-HDL 입자 유래의 콜레스테롤은 반응의 첫 단계에서 유리되어 제거되었다. HDL 입자 유래 콜레스테롤은 R2의 detergent에 의해 두 번째 단계에서 유리되었고, HDL 콜레스테롤은 Trinder reaction으로 측정하였다.
상기 방법은 하기 두 단계로 이루어져 있다:
a.콜레스테롤 에스터라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제에 의한 킬로미크론, VLDL-콜레스테롤, 및 LDL-콜레스테롤의 제거. 상기 옥시다아제에 의해 생성된 과산화물을 카탈라아제로 제거하였다.
b. 시약 2의 계면활성제에 의한 HDL-콜레스테롤 유리 후의 HDL-콜레스테롤의 specific measurement. 상기 단계 a의 카탈라아제는 R2의 소디운 아자이드로 저해하였다. 596nm에서 측정한, Trinder 반응에서 생성되는 퀴논이민의 강도는 콜레스테롤 농도에 정비례한다.
(2) 유리 T3 : 화학발광면역측정법( Chemiluminescence immunoassay, CIA)
검사장비로는 ADVIA Centaur XP(Siemens, USA), 검사시약은 Free T3(Siemens, USA)를 사용하였으며, 참조 수치(reference)는 1-23개월 3.3-5.2 pg/mL, 2-12세 3.3-4.8 pg/mL, 13-21세 3.0-4.7 pg/mL, >21세 2.30-4.2 pg/mL이다. 검사원리는 다음과 같다: chemiluminescent를 이용한 Two-step sandwich immunoassay. 혈청중의 FrT3와 FrT3 reagent가 경쟁적으로 결합하여 solid phase의 paramagnetic particle을 형성하고, 여기에 Lite reagent의 acridinium ester-labeled mouse anti-T3 antibody가 결합하여 나타나는 RLU(relative light units)를 측정하였다.
(3) 인 : 비색법 ( Colorimetric method)
검사장비로는 ADVIA 1800 Auto Analyzer(Siemens, USA), 검사시약은 Pi(Siemens, UK)를 사용하였으며, 참조 수치(reference)는 2.4-5.1 mg/dL이다. 검사원리는 다음과 같다. 무기 인은 황산 존재시에 암모늄 몰리브데이트와 반응하여 비환원 포스포몰리브데이트 복합체를 생성하는데, 종결반응으로서의 상기 복합체를 340/658 nm에서 측정하였다.
1-6. MPP-처리된 아밀로이드 베타 측정
대한민국 공개특허 2016-0129444 “혈장내 아밀로이드베타의 농도를 통해 알츠하이머병을 임상학적 및 병리학적으로 모니터링하는 방법”에 기재된 방법을 참조하였다. 사용된 시약은 다음과 같다. protease inhibitor cocktail (PI), phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF, a serine protease inhibitor; Sigma Aldrich, CA, USA) and phosphatase inhibitor cocktail I and II (PPI I and II; A. G. Scientific, Inc., CA, USA)로 구성된 프로테아제 및 포스파타제 억제제(MPP)가 동일한 비율로 혼합된 혼합물을 사용하였다. Aβ 펩타이드는 American Peptide Company, Inc. (Sunnyvale, CA, USA)에서 구입하고 인간 혈청 알부민은 Sigma Aldrich에서 구입하였다.
혈액시료
하룻밤 금식 후에 정맥혈을 채취하여 K2 EDTA tubes (BD Vacutainer Systems, Plymouth, UK)로 수집하고, 700 ×g 에서 5분 동안 실온에서 원심분리를 수행하여 혈장을 분리하여 15 ml 원심분리 튜브에 수득하였다. 고순도 시료를 얻기 위해, 혈장 시료는 동일한 조건에서 다시 원심분리를 한 후 분주하여 즉시 -80도에 얼렸다.
Aβ 측정
Aβ42 및 Aβ40의 혈중 농도를 동시에 측정하기 위하여, INNO-BIA plasma Aβ forms kit (Innogenetics, Gent, Belgium)를 제조자의 방법대로 사용하였다. 요약하면, 혈장을 MPP 처리된 혈장 희석 완충액 또는 MPP 비처리된 혈장 희석 완충액으로 3배 희석하고 실온에서 30분간 두었다. 이어 필터 플레이트를 세척하고, 희석된 베드 믹스를 플레이트의 각 웰에 옮겼다. 이어 플레이트를 조심스럽게 말린 후 세척하고, 25μL의 컨쥬게이트 1 워킹 용액 A 및 75μL의 표준물질, 블랭크, 대조군 및 혈장 시료를 각 웰에 추가하였다. 이어 플레이트를 섭씨 4도에서 하룻밤 배양하고, 각 웰에 100μL 검출용액을 추가하였다. 1시간 후에 플레이트를 세적하고 각 웰에 판독 용액을 추가하였다. 혈장 아밀로이드 베타 농도는 X-map technology (Bioplex 200 systems; Bio-rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였다.
1-7. ApoE 유전자형 분석: 대립유전자특이적 중합효소연쇄반응법 (ASP- PCR : Allele specific primer-polymerase chain reaction)
특정 유전자 변이가 있는 대립유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 증폭반응의 유무로 특정 유전자 변이를 확인할 수 있는 방법을 사용하였다.
구체적으로, Salting out method 이용하여 검체로부터 DNA를 추출하였다. 이어 ApoE PCR Master Mixture (Biocore)를 제조자의 방법대로 사용하여 분석하였다. 타입에 따른 PCR 산물의 크기는 표 2에 기재되어 있다. 알츠하이머성 치매의 위험요소로서 E4를 가지고 있는 경우 병에 걸릴 위험이 크다. 즉 E4/4가 가장 병에 걸릴 위험이 크고 그 다음 E4/3형이다.
[표 2]
Figure PCTKR2018003340-appb-I000002
실시예 2. 본원의 바이오마커를 조합으로 사용한 인지기능 정도에 따른 베타 아밀로이드 축적 판별
Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme) 마커들은 상술한 바와 같은 ELISA 실험방식으로 실시예 1의 각 환자의 혈액에서 정량하고 아밀로이드 베타는 X-MAP 기술(2017 Park et al., Alzheimer’s research & Therapy)로 혈액내 농도를 정량하였다.
도 2 내지 도 5 서는 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군 및 알츠하이머성 치매군의 각 군에 해당하는 환자 혈액에서 특히 유효성을 보이는 마커들을 조합한 후, 각 마커의 조합에 대하여, 하기 식과 같은 로지스틱 회귀분석을 통하여 pi로 표시되는 값 또는 통합적 지수를 산출하였고 상기 수치에 따라 뇌 아밀로이드 베타 축적여부를 예측하는 분석을 하였으며, 산출된 통합적 지수 Pi 값이 Youden’s J statistic (Ruopp et al. Biom J. 2008 Jun; 50(3): 419-430)을 이용하여 각 모델별로 결정된 cut off 기준보다 증가 시 뇌 아밀로이드 베타 축적 양성, 낮으면 음성으로 판별하였다. 또한 상기 통합적 지수를 이용한 ROC 커브 분석을 통하여 특이성 및 민감도를 결정하여 예측 유효성/정확도를 산출하였다.
또한 상기 도 2 내지 도 5의 각 마커의 조합은 ApoE의 유전자형 검사와 조합으로 사용하여 판별되었다.
또한 상기 도 2 내지 도 5의 각 마커의 조합은 ApoE의 존재 또는 부재하에서, 인, 자유 T3 및/또는 HDL 콜레스테롤과 함께 사용되어 판별되었다.
[수식 1a]
ln{pi/(1-pi)} = β0+β1x1,i+β2x2,i+…+βmxm,i
(pi: 예측 확률, β0: 상수, β1 ~m: 변수의 계수)
변수의 개수는 사용되는 마커 개수에 따라 변하며, 6개의 마커를 사용하는 경우의 식은 다음과 같다.
[수식 1b]
ln{pi/(1-pi)} = β0+β1x1,i+β2x2,i+β3x3,i+β4x4,i+β3x5,i+β3x6,i
(β0: 회귀분석 방정식 모델의상수, β1: MPP-Aβ42/40 비율의 계수, β2: LGAL의 계수, β3: ACE의 계수, β4: TSP-1의 계수, β5: AChE의 계수, β6: Periostin의 계수, x1: MPP-Aβ42/40 비율값, x2: LGAL의 정량값 x3: ACE의 정량값, x4: TSP-1의 정량값, x5: AChE의 정량값, x6:Periostin의 정량값)
상기 식 1a로부터 Pi 값은 다음과 같은 식을 통해 구하였다.
[수식 2]
Figure PCTKR2018003340-appb-I000003
본원에서 X-MAP 기술(2017 Park et al., Alzheimer’s research & Therapy)을 통해 얻은 혈장 아밀로이드 베타 농도, ELISA 실험을 기반으로 하여 얻은 각 마커의 혈중 단백질 농도는 통계분석을 통하여 다중 바이오마커 변수로 활용되었다.
통계분석은 Graphpad Prism 5(GraphPad Software, Sandiego, CA, USA) 및 MedCalc(MedCalc Software, Ostend, Belgium) 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 모든 데이터는 평균의 표준오차(mean ± standard error of the mean, SEM)로 표기되었다. 또한 단일 스튜던트 t-검정(unpaired student’s t test)을 이용하여 혈장 내 단백질농도를 통해 PiB-PET 양성 또는 음성군을 비교하였다. ANOVA 분석 후에는 GraphPad Prism 5로 Tukey’s 다중비교 검정을 수행하였다. 진단 테스트의 성능을 평가하기 위하여, MedCalc로 ROC(Reveiver Operating Characteristic) 커브분석에 따른 로지스틱 회귀분석(Logistic regression)을 수행하였다. 또한 이 데이터를 활용하여 ROC curve를 그리고 AUC(Area under the curve)를 Wilcoxon 통계를 이용하여 측정하였다. 다중 로지스틱 회귀 분석 시엔 각각의 변수들을 독립변수로 활용하여, 최종적인 모델을 도출해 내었고, 이때 성별과 나이 같은 공변수는 보정변수로 활용되었다.
또한 로지스틱 회귀분석으로 도출된 새로운 종합변수는 ROC 커브 분석을 통해 뇌 아밀로이드 축적 여부를 가리는데 활용되었으며, 회귀분석을 통해 얻은 cut-off 값(Criterion 값)을 통해 PiB-PET 양성과 PiB-PET 음성을 구별하는 것의 기준점으로 활용되었다.
결과는 도 2 내지 도 5에 개시되어 있다. 도 2 내지 도 5는 각각 각 모델의 특이성 및 민감도, 정확도를 결정하는 AUC(Area Under curve) 수치를 나타낸다. 또한 ApoE를 추가로 포함하는 경우의 특이성과 민감도가 향상되는 결과를 나타낸다.
상기 각 모델에서 Youden’s J statistic를 통해 결정된 Pi 컷오프 값은 다음과 같다: 모델 1: 0.63, 모델 1(ApoE 추가): 0.67; 모델 2: 0.46, 모델 2(ApoE 추가): 0.68; 모델 3: 0.51, 모델 3(ApoE 추가): 0.59; 모델 4: 0.49, 모델 4(ApoE 추가): 0.58.
하지만 상기 컷오프 값은 일예로 검사 목적 등에 따라 변동될 수 있다. 예를 들면 건강검진에서 스크리닝 목적으로 수행하는 경우에는 가능한 모든 대상자를 포괄하기 위해, 컷오프 값을 낮게 잡을 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (23)

  1. Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 혈액에서의 검출용 물질을 포함하며,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 알츠하이머성 치매군를 포함하는 치매군을 포함하는 전주기에서 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 혈장 아밀로이드 베타는 MPP로 처리된 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군은 AchE 억제제 비복용자인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 ApoE를 추가로 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 인, HDL(High Density Lipoprotein) 및 유리 T3(free triiodothyronine) 중 하나 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단, 또는 PIB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography) 검사가 필요한 지 여부의 판단으로 사용되며,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단은 인지장애 중증도 판단을 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 조성물.
  8. 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부의 검출이 필요한 검사 대상자 유래의 혈액 샘플을 제공하는 단계;
    상기 혈액 샘플에서 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커를 정량하는 단계로, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군을 대상자 혈액, 상기 마커 중 LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin 경도인지장애 환자군 대상자 혈액, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군 혈액, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 전주기 환자군의 혈액 시료에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부를 검출하며; 그리고
    상기 정량된 각 마커의 양을 상기 대상자의 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부와 관련시키는 단계를 포함하는, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 혈장 아밀로이드 베타는 MPP로 처리된 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군은 AchE 억제제 비복용자인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 ApoE를 추가로 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 인, HDL (High Density Lipoprotein) 및 유리 T3 중 하나 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  13. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연관시키는 단계는 대조군에서 결정된 정량 결과와 비교하여, 상기 Periostin은 증가, LGAL, ACE, AChE, TSP1, 및 VE-cadherin은 모두 감소하는 경우, 상기 혈액이 유래된 대상자는 아밀로이드 베타가 축적된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 연관시키는 단계는 대조군에서 결정된 정량 결과와 비교하여, 상기 인, 유리 T3의 농도는 감소하고, HDL의 농도는 증가하는 경우, 상기 검사 대상자를 뇌 아밀로이드 베타 축적된 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  15. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단 또는 PiB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography)검사가 필요한 지 여부의 판단용으로 사용되며,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    뇌 아밀로이드 베타 축적 질환 진단은 인지장애 중증도 판단을 포함하는 것인, 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출 방법.
  17. 혈액에서 뇌 아밀로이드 베타 축적 여부 검출용 Periostin, VE-cadherin, ACHE(Acetylcholinesterase), TSP-1(Thrombospondin-1), 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP(Lectin, galactoside-binding, soluble3 binding protein) 및 ACE(Angiotensin I converting enzyme)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커로,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 ACHE는 인지기능 정상군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE, Periostin 및 VE-cadherin은 경도인지장애 환자군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고, 상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP 및 ACE은 인지기능 정상군 및 경도인지장애 환자군을 포함하는 비치매 군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용이고,
    상기 마커 중 혈장 아밀로이드 베타, LGALS3BP, ACE 및 TSP-1은 비치매군 및 알츠하이머성 치매군를 포함하는 치매군을 포함하는 전주기에서 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 혈장 아밀로이드 베타는 MPP로 처리된 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군은 AchE 억제제 비복용자인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 ApoE를 추가로 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 각 인지기능 정상군, 경도인지장애 환자군, 비치매군 및 치매군의 뇌 아밀로이드 베타 축적여부 검출용 마커는 인, HDL(High Density Lipoprotein) 및 유리 T3(free triiodothyronine) 중 하나 이상의 마커를 추가로 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커.
  22. 제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적은 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단, 또는 PIB (Pittsburgh compound B)-PET (positron emission tomography) 검사가 필요한 지 여부의 판단으로 사용되며,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병 치매, 루이소체치매, 헌팅톤병 치매, 또는 전임상 알츠하이머병, 다운 신드롬, 또는 인지장애를 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커.
  23. 제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 아밀로이드 베타 축적과 관련된 질환의 진단은 인지장애 중증도 판단을 포함하는 것인, 뇌 아밀로이드 베타 축적 검출용 바이오마커.
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