WO2024005008A1 - シヌクレイノパチーを判定するための方法 - Google Patents

シヌクレイノパチーを判定するための方法 Download PDF

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WO2024005008A1
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synuclein
apoa1
synucleinopathy
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清隆 町田
尚智 藪下
和聡 能勢
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大塚製薬株式会社
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • Synucleinopathy is a general term for neurodegenerative diseases characterized by accumulation of ⁇ -synuclein in the brain, and includes Parkinson's disease, dementia with Lewy bodies, and multiple system atrophy (Non-patent Documents 1 and 2). Although drugs that can completely cure these diseases are still under development, symptomatic treatment using dopamine precursors and dopamine agonists has been established as dopamine replacement therapy for motor dysfunction caused by Parkinson's disease. However, the period during which dopamine replacement therapy is effective is relatively short, and it is important from the viewpoint of the patient's QOL to diagnose Parkinson's disease patients as early as possible and provide early therapeutic intervention.
  • Parkinson's disease has traditionally been diagnosed based on its characteristic clinical symptoms, but diagnosis is difficult in early stage patients with low levels of motor dysfunction.
  • a definitive diagnosis of Parkinson's disease requires nuclear medicine imaging diagnosis (MIBG myocardial scintigraphy, DAT scan), which requires advanced measurement equipment, so the facilities that can perform it are limited, and it takes a long time. Inspection is required, and the cost of the inspection is also high (Non-Patent Document 3).
  • Non-patent Document 4 Non-patent Document 4
  • collecting cerebrospinal fluid is highly invasive, which places a heavy burden on the patient, and is not suitable for screening tests aimed at early diagnosis.
  • Non-patent Document 5 Previous studies measuring ⁇ -synuclein in the blood (Non-patent Document 5) have reported that ⁇ -synuclein in the blood is significantly increased in Parkinson's disease, but the concentration distribution is different from that in healthy controls. There is a large overlap, making it difficult to use for Parkinson's disease diagnosis. In addition, research on Parkinson's disease biomarkers focusing on oxidized DJ-1 in red blood cells has been reported, but the ability to differentiate between Parkinson's disease and healthy individuals is insufficient, making it difficult to use for diagnosis (Non-patent Document 6 ).
  • Non-Patent Document 7 apolipoprotein A1 (ApoA1) protein in the blood of Parkinson's disease patients is significantly reduced compared to healthy individuals, but the ApoA1 concentration distributions overlap in Parkinson's disease and healthy individuals. , diagnostic performance that can be used to differentiate between the two cannot be expected. Furthermore, although ApoA1 has been reported as one of the ⁇ -synuclein binding proteins, there is no knowledge that the binding state between ⁇ -synuclein and ApoA1 can change in Parkinson's disease (Non-Patent Document 8).
  • One of the objectives of the present disclosure is to provide a method for determining whether a subject is suffering from a synucleinopathy.
  • the present inventors found that the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein is low in the blood of Parkinson's disease patients. Therefore, ApoA1 binding to alpha-synuclein can be used as a marker for synucleinopathies such as Parkinson's disease.
  • the present disclosure provides a method for determining whether a subject suffers from a synucleinopathy based on the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein in a sample taken from the subject. do.
  • the present disclosure provides a method for determining whether a subject has a synucleinopathy, the method comprising measuring the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein in a sample taken from the subject. provide a method.
  • the present disclosure provides a kit for determining whether a subject has a synucleinopathy, the kit comprising a reagent that specifically binds to ApoA1 and a reagent that specifically binds to alpha-synuclein. do.
  • the present disclosure provides methods and kits for determining whether a subject is suffering from a synucleinopathy.
  • 2 shows the results of mass spectrometry measurement of the amount of ApoA1 in the ⁇ -synuclein-binding fraction in the blood of healthy subjects and Parkinson's disease patients. The results of measuring the amount of ApoA1 in the blood of healthy subjects and Parkinson's disease patients by ELISA are shown. 2 shows the results of measuring the amount of ApoA1 in the ⁇ -synuclein-binding fraction in the blood of healthy subjects and Parkinson's disease patients by ELISA.
  • the subject may be any species, preferably a human.
  • the sample can be blood, plasma or serum taken from the subject. Blood samples may be taken in the usual manner, eg, from a vein or an artery. Plasma and serum samples may be prepared by appropriately processing blood by methods well known to those skilled in the art. This treatment is not particularly limited, and may be any clinically acceptable treatment. For example, addition of an anticoagulant, centrifugation, etc. are performed.
  • the sample may be other body fluids collected from the subject, such as cerebrospinal fluid, saliva, nasal secretions, sputum, pleural fluid, or ascites fluid.
  • the sample taken may be stored at low temperature prior to use, during or after its preparation, eg, frozen. Further, the collected sample can be used after being appropriately concentrated or diluted as necessary.
  • ⁇ -synuclein is a protein mainly expressed at presynaptic terminals. Abnormal deposition of ⁇ -synuclein has been confirmed in the brains of patients with synucleinopathy such as Parkinson's disease, Lewy body dementia, and multiple system atrophy.
  • the amino acid sequences of ⁇ -synuclein derived from various biological species can be easily obtained using known databases.
  • a representative amino acid sequence of human ⁇ -synuclein is registered as GenBank accession number NP_000336.1 (SEQ ID NO: 1).
  • alpha-synuclein includes the products of its naturally occurring alleles.
  • ApoA1 is known as a major component of HDL.
  • the amino acid sequences of ApoA1 derived from various biological species can be easily obtained using known databases.
  • a representative amino acid sequence of human ApoA1 is registered as GenBank accession number NP_000030.1 (SEQ ID NO: 2).
  • ApoA1 includes the products of its naturally occurring alleles.
  • ⁇ -synuclein and ApoA1 may have a single or It may contain a sequence in which several amino acids are deleted, substituted, or added.
  • “several” means preferably 2 to 7 amino acids, more preferably 2 to 5 amino acids, and most preferably 2 to 3 amino acids. Amino acid substitutions are preferably conservative substitutions between similar amino acid residues.
  • the original amino acid sequence and when calculated using BLAST etc. (for example, when using the default, i.e., initial condition parameters of BLAST) ), at least about 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, even more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, most preferably about 97%, about 98% or It may contain amino acid sequences having about 99% or more identity.
  • Parkinson's disease is a typical synucleinopathy. Therefore, it can be determined whether a subject is suffering from synucleinopathy using ApoA1 that binds to ⁇ -synuclein as a marker.
  • synucleinopathy includes Parkinson's disease, Lewy body dementia and multiple system atrophy, particularly Parkinson's disease.
  • Multiple system atrophy includes olivopontocerebellar atrophy, striatonigral degeneration, and Shy-Drager syndrome.
  • the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein can be determined by obtaining an ⁇ -synuclein fraction from a sample using a reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein, and then using the ⁇ -synuclein fraction that specifically binds to ApoA1.
  • the amount of bound reagent can be measured.
  • the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein can be determined by obtaining an ApoA1 fraction from a sample using a reagent that specifically binds to ApoA1, and dividing the obtained ApoA1 fraction into a reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein.
  • the amount of bound reagent can be measured by contacting the reagent with the reagent.
  • the reagent that specifically binds ⁇ -synuclein or ApoA1 can be, for example, an antibody, RNA, DNA, polypeptide, or aptamer. These binding reagents may be fragments, derivatives, or analogs as long as they can specifically bind to ⁇ -synuclein or ApoA1.
  • the reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein or ApoA1 is typically an antibody.
  • antibodies refer to affinity ligands based on immunoglobulin backbones, including monoclonal and polyclonal antibodies of any origin, including murine, rat, rabbit, goat, human and other antibodies, as well as antibodies from multiple species. including chimeric antibodies, eg, partially humanized antibodies, eg, partially humanized murine antibodies, comprising sequences derived from.
  • the antibody may be a fragment or derivative thereof as long as it can specifically bind to ⁇ -synuclein or ApoA1.
  • the antibody can be produced by existing general production methods using ⁇ -synuclein or ApoA1 or its antigenic partial peptide as an immunogen.
  • polyclonal antibodies may be produced by immunizing an animal with an antigen, and monoclonal antibodies may be produced using hybridoma technology.
  • commercially available antibodies may be used.
  • the reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein or ApoA1 may be labeled with a detectable substance.
  • detectable substances include radioisotopes, fluorescent labels, luminescent labels, bioluminescent labels, enzyme labels, and biotin.
  • the reagent may be unlabeled and a labeled substance recognizing the reagent, such as a secondary antibody, may be further used.
  • the reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein or ApoA1 may be bound to a suitable support.
  • the support is not particularly limited as long as it can immobilize the binding reagent, and may be of any shape or material. Examples include membranes such as nylon membranes, beads, glass, plastic, and metal supports.
  • any known protein purification method may be used to obtain the ⁇ -synuclein fraction or ApoA1 fraction from the sample, such as affinity chromatography. Dialysis, ultrafiltration, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, etc. may be combined as appropriate.
  • an ⁇ -synuclein fraction can be obtained by contacting a sample with a reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein immobilized on a support and collecting the substance bound to the support.
  • ApoA1 may be detected on the support without recovering the substance bound to the support.
  • an ApoA1 fraction can be obtained by contacting a sample with a reagent that specifically binds to ApoA1 immobilized on a support and collecting the substance bound to the support.
  • a reagent that specifically binds to ApoA1 immobilized on a support and collecting the substance bound to the support.
  • ⁇ -synuclein may be detected on the support without recovering the substance bound to the support.
  • Detection of ApoA1 or ⁇ -synuclein can be performed by immunological techniques using reagents that specifically bind to them. Immunological techniques include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, e.g., direct, indirect, sandwich, or competitive), immunochromatography, Western blotting, flow cytometry analysis, and radioisotope immunoassay (RIA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioisotope immunoassay
  • the sandwich ELISA method is preferable.
  • ApoA1 can be detected by purifying an ⁇ -synuclein fraction from a sample and using a sandwich ELISA method using a first ApoA1 antibody as a capture antibody and a second ApoA1 antibody as a detection antibody.
  • ApoA1 bound to ⁇ -synuclein in the sample can be detected by a sandwich ELISA method using a capture antibody that binds to ⁇ -synuclein and a detection antibody that binds to ApoA1.
  • ⁇ -synuclein can be detected by purifying the ApoA1 fraction from a sample and using a sandwich ELISA method using a first ⁇ -synuclein antibody as a capture antibody and a second ⁇ -synuclein antibody as a detection antibody.
  • ApoA1 bound to ⁇ -synuclein in the sample can be detected by a sandwich ELISA method using a capture antibody that binds to ApoA1 and a detection antibody that binds to ⁇ -synuclein.
  • ApoA1 contained in the ⁇ -synuclein fraction or ⁇ -synuclein contained in the ApoA1 fraction may be measured by proteomics analysis. Relative quantification methods (SILAC, ICAT, ICPL, isobaric tag, etc.) or absolute quantification methods (SRM method) can be used. For example, ApoA1 or alpha-synuclein can be measured by nanoLC-MS/MS analysis.
  • Relative quantification methods SILAC, ICAT, ICPL, isobaric tag, etc.
  • SRM method absolute quantification methods
  • a subject is determined to have a synucleinopathy if the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein in a sample taken from the subject is low compared to a cutoff value; is higher than the cutoff value, it is determined that the subject does not suffer from synucleinopathy. If the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein is equivalent to the cutoff value, it is determined whether the subject is suffering from synucleinopathy or not, depending on the purpose of the determination, etc. It can be set as desired.
  • a subject is determined to have a synucleinopathy if the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein is below a cutoff value, and the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein is determined to be below a cutoff value. If the level is equal to or higher than the cutoff value, it is determined that the subject does not suffer from synucleinopathy.
  • a subject is determined to have a synucleinopathy if the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein is below a cutoff value, and the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein is determined to be at or below a cutoff value. is higher than the cutoff value, it is determined that the subject does not suffer from synucleinopathy.
  • the cutoff value is a value that allows a statistically significant difference between a group of subjects suffering from synucleinopathy and a group of subjects not suffering from synucleinopathy.
  • the cutoff value can be set by a known method using various statistical analysis techniques. For example, the levels of ApoA1 bound to alpha-synuclein in samples obtained from subjects with synucleinopathy and those bound to alpha-synuclein in samples obtained from subjects without the disease.
  • a cutoff value can be set by statistically analyzing the level of ApoA1.
  • Statistically significant differences may be analyzed by known testing methods such as chi-square test, generalized Wilcoxon test, Wilcoxon signed rank test, Mann-Whitney test, log-rank test, Cox proportional hazards test, and the like.
  • known testing methods such as chi-square test, generalized Wilcoxon test, Wilcoxon signed rank test, Mann-Whitney test, log-rank test, Cox proportional hazards test, and the like.
  • statistical analysis software such as Prism can be used, for example.
  • the cutoff value may be set based on sensitivity and/or specificity. Preferably, the cutoff value exhibits both high sensitivity and high specificity.
  • sensitivity means true positive rate.
  • specificity means the true negative rate.
  • the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein which shows a high positive rate in a group of subjects suffering from synucleinopathy and a high negative rate in a group of subjects without synucleinopathy. , can be set as a cutoff value.
  • the cutoff value can be set by ROC analysis (receiver operating characteristic analysis), which is commonly used as a method for examining the usefulness of diagnostic tests.
  • ROC analysis receiver operating characteristic analysis
  • an ROC curve is created in which the sensitivity at each cutoff value is plotted on the vertical axis and the false positive rate (1-specificity) is plotted on the horizontal axis.
  • the ROC curve becomes a diagonal straight line in a test with no diagnostic ability, but as the diagnostic ability improves, the ROC curve curves upward toward the left. It can be said that the cutoff value that provides the point on the ROC curve with the minimum distance from the upper left corner has excellent sensitivity and specificity. It is also possible to set a cutoff value based on the Youden index.
  • sensitivity and specificity were determined from the level of ApoA1 binding to ⁇ -synuclein in a group of subjects suffering from synucleinopathy and a group of subjects not suffering from synucleinopathy, and based on these values, commercially available Create an ROC curve using analysis software. Then, a value when the sensitivity and specificity are as close to 100% as possible can be determined, and this value can be used as the cutoff value.
  • diagnostic efficiency i.e., cases in which a subject suffering from a synucleinopathy was correctly diagnosed as “affected” and a subject not suffering from a synucleinopathy as “not affected”.
  • the ratio of the total number of correctly diagnosed cases to the total number of cases can be determined, and the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein at which the highest diagnostic efficiency is calculated can be used as the cutoff value.
  • Cutoff values can also be set for patient groups that are subgrouped according to characteristics. For example, cutoff values may be set according to gender, age group, or race.
  • the method can assist in the diagnosis of synucleinopathy or provide information for the diagnosis of synucleinopathy.
  • the method includes providing the determination result as information for diagnosis.
  • the method includes obtaining a sample from the subject.
  • the method includes purifying an alpha-synuclein fraction from the sample.
  • the method includes measuring the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein.
  • treatment for a synucleinopathy is performed in a subject determined by the method to be suffering from a synucleinopathy.
  • a therapeutic agent for synucleinopathy is approved in the future, the therapeutic agent for synucleinopathy will be administered to a subject determined to be suffering from synucleinopathy by the present method.
  • a therapeutic agent for Parkinson's disease may be administered to treat parkinsonian symptoms of a synucleinopathy.
  • a subject determined to be suffering from synucleinopathy by this method may be further clinically diagnosed and treated.
  • a therapeutic agent for Parkinson's disease is administered to a subject determined to be suffering from synucleinopathy by the present method and clinically diagnosed with Parkinson's disease.
  • a therapeutic agent for Lewy body dementia is administered to a subject determined to be suffering from synucleinopathy by the present method and clinically diagnosed with Lewy body dementia.
  • a therapeutic agent for multiple system atrophy is administered to a subject determined to be suffering from synucleinopathy by the present method and clinically diagnosed with multiple system atrophy.
  • Parkinson's disease drugs include dopamine precursors (such as levodopa), dopamine agonists (such as pramipexole, ropinirole, apomorphine, rotigotine), dopamine release enhancers (such as amantadine), and dopamine degradation inhibitors (selegiline, rasagiline, safinamide). , entacapone, opicapone, carbidopa, etc.), non-dopamine drugs (such as zonisamide), adenosine receptor antagonists (such as istradefylline), anticholinergic agents, and serotonin 5-HT1A/1B agonists (such as eltoprazine).
  • dopamine precursors such as levodopa
  • dopamine agonists such as pramipexole, ropinirole, apomorphine, rotigotine
  • dopamine release enhancers such as amantadine
  • Examples of therapeutic drugs for Lewy body dementia include drugs for treating dementia (such as donepezil) and drugs for treating sleep disorders, in addition to drugs for treating Parkinson's disease.
  • Examples of drugs for treating multiple system atrophy include drugs for treating cerebellar ataxia (such as taltireline) in addition to drugs for treating Parkinson's disease.
  • a method for determining whether a subject has a synucleinopathy comprising measuring the level of ApoA1 bound to alpha-synuclein in a sample taken from the subject. be done.
  • This method is a method for determining whether a subject is suffering from synucleinopathy based on the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein in a sample collected from the subject. It can be implemented in accordance with.
  • kits for determining whether a subject suffers from a synucleinopathy comprising a reagent that specifically binds to ApoA1 and a reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein.
  • the reagents may be provided dissolved in water or a suitable buffer, such as phosphate buffered saline (PBS), or lyophilized, in a suitable container.
  • suitable containers include bottles, vials, syringes, test tubes, plates, membranes, and the like.
  • the container may be formed from a variety of materials such as glass, plastic, etc.
  • the kit may contain a reagent that specifically binds to ApoA1 and a reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein as one component or as separate components.
  • the kit may further contain other components and reagents necessary for detection of ApoA1 and/or ⁇ -synuclein.
  • the kit may further include a labeled secondary antibody, a chromogenic substrate, a blocking solution, a washing buffer, and the like.
  • the kit may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, such as a package insert containing instructions for use.
  • reagents that specifically bind to ApoA1 and reagents that specifically bind to alpha-synuclein are provided for determining whether a subject suffers from a synucleinopathy.
  • the use of a reagent that specifically binds to ApoA1 and a reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein to manufacture a kit for determining whether a subject has a synucleinopathy is provided. provided.
  • a method for determining whether a subject suffers from synucleinopathy based on the level of apolipoprotein A1 (ApoA1) bound to ⁇ -synuclein in a sample collected from the subject [2] The method according to item 1, wherein the subject is determined to be suffering from synucleinopathy when the level of ApoA1 binding to ⁇ -synuclein is low. [3] The method according to item 1, wherein it is determined that the subject does not suffer from synucleinopathy when the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein is high.
  • ApoA1 apolipoprotein A1
  • a method for determining comprising comparing the level of apolipoprotein A1 (ApoA1) bound to alpha-synuclein in a sample taken from the subject to a cutoff value; A method for determining.
  • the method comprising measuring the level of apolipoprotein A1 (ApoA1) bound to alpha-synuclein in a sample collected from the subject.
  • Method [11] The method according to item 10, which comprises purifying an ⁇ -synuclein fraction from a sample collected from the subject.
  • Paragraph 10 or Paragraph 11 for determining whether a subject suffers from synucleinopathy based on the level of ApoA1 bound to ⁇ -synuclein in a sample collected from the subject. The method described in.
  • synucleinopathy is Parkinson's disease.
  • a kit for determining whether a subject suffers from synucleinopathy comprising a reagent that specifically binds to ApoA1 and a reagent that specifically binds to ⁇ -synuclein.
  • the reagent is an antibody.
  • Parkinson's disease patients specimens were used from 4 patients with moderate motor dysfunction and 1 patient with severe motor dysfunction. Table 1 shows the patient background of each sample.
  • ⁇ -synuclein antibody beads 300 ⁇ g of anti- ⁇ -synuclein monoclonal antibody (Nippon Becton Dickinson, 610787) was reacted with 2 mL of magnetic beads (Dynabeads M-270 Epoxy, Thermo Fisher Scientific) (bead amount 40 mg) for 30 minutes at room temperature. ⁇ -synuclein monoclonal antibodies were covalently bound to the beads. Finally, 50 mM Tris pH 8.0 buffer was added to block unreacted amino groups. The prepared antibody-immobilized magnetic beads were stored at 4°C until use.
  • ⁇ -synuclein-binding protein After adding 10 ⁇ L of a protease inhibitor (Halt protease inhibitor cocktail SIGMA P8340) to 0.5 mL of plasma from a healthy person or Parkinson's disease patient, the mixture was centrifuged at 1500 g for 5 minutes at 4°C to obtain a supernatant. . 0.5 mL of binding buffer (1% BSA, PBS, 0.05% Tween 20) was added to the supernatant, 0.1 mL of the prepared ⁇ -synuclein antibody-immobilized magnetic beads was added, and the mixture was reacted overnight at 4°C. After collecting the sample, it was fixed on a magnetic plate and the magnetic beads were collected.
  • a protease inhibitor Halt protease inhibitor cocktail SIGMA P8340
  • the collected magnetic beads were washed three times with 1 mL of washing buffer (PBS, 0.05% Tween 20). After adding 60 ⁇ L of elution buffer (0.1 M citrate, pH 2.8) to the washed magnetic beads, the beads were incubated for 5 minutes, immobilized on a magnetic plate, and the eluted fraction was collected. The collected elution fraction was neutralized by adding 10 ⁇ L of 1M Tris pH 8.0. The prepared samples were stored at -80°C until mass spectrometry and ELISA analysis.
  • washing buffer PBS, 0.05% Tween 20
  • elution buffer 0.1 M citrate, pH 2.8
  • Proteomic analysis of ⁇ -synuclein binding protein was carried out at the National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition (6-8 Saito Asagi 7-chome, Ibaraki City, Osaka Prefecture). 10 ⁇ L of ⁇ -synuclein binding protein sample was purified using StageTip, dried in a speed vac, and then redissolved in 10 ⁇ L of buffer (0.1% formic acid 2% acetonitrile).
  • the prepared sample was subjected to nanoLC-MS/MS analysis using an ExactivePlus mass spectrometer (ThermoFisherScientific), UltiMate3000RSLCnanoHPLC (ThermoFisherScientific), and HTC-PAL autosampler (CTC Analytics).
  • the obtained peptide fragment data was used to calculate each peptide area value using Xcalibur2.4. Identification of binding proteins was performed using MaxQuant 1.6.14.0.
  • ELISA measurement ApoA1 protein concentration in blood and ⁇ -synuclein binding protein fraction samples was measured using Human APOA1 sandwich ELISA kit (proteintech, KE00157) and Apolipoprotein A1 (APOA1) Human SimpleStep ELISA Kit (Abcam, ab189576). did.
  • the Mann-Whitney U test which is a non-parametric test method, was used to test for statistical significance between the Parkinson's disease group and the healthy subjects group.
  • the amount of ApoA1 in the ⁇ -synuclein-binding fraction of each of the 5 samples showed a certain variation in healthy subjects, but in all 5 samples with Parkinson's disease, a marked decrease was observed, and there was a significant decrease between the healthy subjects and the Parkinson's disease group. A significant difference was observed ( Figure 1). While the amount of ⁇ -synuclein-binding ApoA1 protein in the blood showed individual differences in the healthy group, it was uniformly decreased in all samples from Parkinson's disease patients.
  • the ApoA1 concentration in the ⁇ -synuclein-binding fraction was similarly analyzed by ELISA measurement, as shown in Figure 3, the ApoA1 concentration in the ⁇ -synuclein-binding fraction was higher in the Parkinson's disease group (PD) than in the healthy control group (HC). ), and there was no overlap in the concentration range; in the Parkinson's disease group, all samples measured by mass spectrometry showed a uniformly significant decrease. Ta. This suggests that the decrease in the amount of ApoA1 in the ⁇ -synuclein-binding fraction may indicate some pathological condition in Parkinson's disease.

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Abstract

本開示は、対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルに基づいて、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法を提供する。

Description

シヌクレイノパチーを判定するための方法
　本特許出願は、日本国特許出願第２０２２－１０３７３１号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本開示は、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているかを判定するための方法およびキットに関する。
　シヌクレイノパチーは、脳におけるαシヌクレインの蓄積を特徴とする神経変性疾患の総称であり、パーキンソン病、レビー小体型認知症および多系統萎縮症を含む（非特許文献１、２）。これらの疾患を根治させ得る薬剤は未だ開発途上であるが、パーキンソン病の運動機能障害に対しては、ドパミン補充療法として、ドパミン前駆体やドパミン作動薬による対症療法が確立されている。しかしながら、ドパミン補充療法が有効である期間は比較的短く、パーキンソン病患者をできる限り早期に診断して、早期に治療介入することが、患者のＱＯＬの観点から重要である。
　従来からパーキンソン病はその特徴的な臨床症状によって診断されているが、早期の患者で運動機能障害の程度が低い場合には診断は難しい。また、パーキンソン病の確定診断には核医学的な画像診断（ＭＩＢＧ心筋シンチグラフィー、ＤＡＴスキャン）が必要で、高度な測定機器が必要とされるため、実施可能な施設は限定され、長時間の検査が必要で、検査費用も高額になる（非特許文献３）。
　これまでに体液（血液や脳脊髄液）を対象としたパーキンソン病バイオマーカーの研究が行われている。脳脊髄液中のαシヌクレインオリゴマーとαシヌクレインの比を測定した研究（非特許文献４）では、パーキンソン病と健常コントロールを有意に鑑別できているが、パーキンソン病と健常コントロールそれぞれの分布にオーバーラップが認められる。また、脳脊髄液の採取は侵襲性が高いため、患者の負担が大きく、早期診断を目的としたスクリーニング検査には適していない。
　これまでに、血液中のαシヌクレインを測定した研究（非特許文献５）では、パーキンソン病で血液中のαシヌクレインが有意に増加していることが報告されているが、濃度分布は健常コントロールと大きくオーバーラップしており、パーキンソン病診断に用いることは困難である。また、赤血球中の酸化ＤＪ－１に着目したパーキンソン病バイオマーカー研究が報告されているが、パーキンソン病と健常者の鑑別性能は十分ではなく、診断に用いることは困難である（非特許文献６）。
　パーキンソン病患者の血液中アポリポプロテインＡ１（ＡｐｏＡ１）タンパク質は、健常者に比較して有意に低下していることが報告されているが、パーキンソン病と健常者においてＡｐｏＡ１濃度分布はオーバーラップしており、両者の鑑別に用いる程の診断性能は期待できない（非特許文献７）。また、αシヌクレイン結合タンパク質の１つとしてＡｐｏＡ１が報告されているが、パーキンソン病においてαシヌクレインとＡｐｏＡ１の結合状態が変化し得ることについての知見は無い（非特許文献８）。
臨床神経学　53 巻 8 号（2013：8）若林　孝一 非特許文献２　神経治療　37,621-624(2020) 小野賢二郎 日本老年医学会雑誌 53巻 3 号（2016：7）織茂 智之 Neurology 2010;75:1766-1772 T. Tokuda, et al. Annals of Clinical and Translational Neurology 2019; 6(3): 615-619 Adeline S. L. Ng, et al. Sci. Rep. 6, 30793; doi: 10.1038/srep30793 (2016). Saito, Y., et al. Ann Neurol. 2013 July ; 74(1): 119-127. doi:10.1002/ana.23872. Judy K. Qiang, et al. J Mol Neurosci (2017) 63:165-172 DOI 10.1007/s12031-017-0967-0 Fatemeh Nouri Emamzadeh & David Allsop
　本開示の目的の１つは、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法を提供することである。
　本発明者らは、パーキンソン病患者の血中では、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが低いことを見出した。従って、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１を、パーキンソン病などのシヌクレイノパチーのマーカーとして使用し得る。
　ある態様では、本開示は、対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルに基づいて、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法を提供する。
　ある態様では、本開示は、対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルを測定することを含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法を提供する。
　ある態様では、本開示は、ＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬およびαシヌクレインに特異的に結合する試薬を含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するためのキットを提供する。
　本開示により、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているかを判定するための方法およびキットが提供される。
健常者およびパーキンソン病患者の血中のαシヌクレイン結合画分におけるＡｐｏＡ１量を質量分析により測定した結果を示す。 健常者およびパーキンソン病患者の血中ＡｐｏＡ１量をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。 健常者およびパーキンソン病患者の血中のαシヌクレイン結合画分におけるＡｐｏＡ１量をＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間のすべての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　本開示において、対象はいかなる種であってもよく、好ましくはヒトである。試料は、対象から採取された血液、血漿または血清であり得る。血液試料は、通常の方法で、例えば静脈または動脈から、採取され得る。血漿試料および血清試料は、当業者に周知の方法により血液を適宜処理することにより調製し得る。この処理は、特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理でもあってもよい。例えば、抗凝固剤の添加、遠心分離などが行われる。試料は、対象から採取された他の体液、例えば、脳脊髄液、唾液、鼻汁、痰、胸水または腹水であってもよい。採取された試料を、使用に先立ち、その調製中または調製後に低温下で保存してもよく、例えば、冷凍保存し得る。また、採取された試料を、必要に応じて適宜濃縮または希釈して使用し得る。
　αシヌクレインは、主に前シナプス終末に発現するタンパク質である。パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症などのシヌクレイノパチーの患者の脳において、αシヌクレインの異常沈着が確認されている。種々の生物種に由来するαシヌクレインのアミノ酸配列は、公知のデータベースを利用して、容易に入手できる。ヒトαシヌクレインの代表的なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号ＮＰ＿０００３３６．１（配列番号１）として登録されている。本開示において、αシヌクレインは、その天然に存在する対立遺伝子の産物を含む。
　ＡｐｏＡ１は、ＨＤＬの主要成分として知られている。種々の生物種に由来するＡｐｏＡ１のアミノ酸配列は、公知のデータベースを利用して、容易に入手できる。ヒトＡｐｏＡ１の代表的なアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号ＮＰ＿００００３０．１（配列番号２）として登録されている。本開示において、ＡｐｏＡ１は、その天然に存在する対立遺伝子の産物を含む。
　本開示に関して、αシヌクレインおよびＡｐｏＡ１は、その機能が維持されている限り、本来のアミノ酸配列（例えば、αシヌクレインは配列番号１のアミノ酸配列、ＡｐｏＡ１は配列番号２のアミノ酸配列）において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加した配列を含んでいてもよい。なお、「数個」とは、好ましくは２～７個、より好ましくは２～５個、最も好ましくは２～３個のアミノ酸を意味する。アミノ酸置換は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。
　また、αシヌクレインおよびＡｐｏＡ１質は、その機能が維持されている限り、本来のアミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ等を用いて計算したときに（例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルト、即ち初期条件のパラメーターを用いた場合に）、少なくとも約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９７％、約９８％もしくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。
　後述の実施例において、パーキンソン病患者の血中では、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが低いことが見出された。パーキンソン病は代表的なシヌクレイノパチーである。従って、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１をマーカーとして、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定することができる。
　本開示において、シヌクレイノパチーには、パーキンソン病、レビー小体型認知症および多系統萎縮症が含まれ、特にパーキンソン病である。多系統萎縮症には、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症、シャイ・ドレーガー症候群が含まれる。
　例えば、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルは、αシヌクレインに特異的に結合する試薬を用いて試料からαシヌクレイン画分を得、得られたαシヌクレイン画分を、ＡｐｏＡ１と特異的に結合する試薬と接触させ、結合した試薬の量を測定することにより、測定することができる。あるいは、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルは、ＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬を用いて試料からＡｐｏＡ１画分を得、得られたＡｐｏＡ１画分を、αシヌクレインと特異的に結合する試薬と接触させ、結合した試薬の量を測定することにより、測定することができる。
　αシヌクレインまたはＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬は、例えば、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリペプチドまたはアプタマーであり得る。これらの結合試薬は、αシヌクレインまたはＡｐｏＡ１と特異的に結合できるものであれば、断片、誘導体または類似体であってもよい。
　αシヌクレインまたはＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬は、典型的には抗体である。本開示に関して、抗体は、免疫グロブリン骨格をベースとする親和性リガンドを意味し、任意の起源のモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含み、ネズミ、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒトおよび他の抗体、並びに複数の種に由来する配列を含むキメラ抗体、例えば、部分的にヒト化された抗体、例えば、部分的にヒト化されたマウス抗体を含む。抗体は、αシヌクレインまたはＡｐｏＡ１と特異的に結合できるものであれば、その断片または誘導体であってもよい。
　抗体は、αシヌクレインまたはＡｐｏＡ１またはその抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造し得る。例えば、ポリクローナル抗体は、動物を抗原で免疫化することにより産生し得、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して産生し得る。あるいは、市販の抗体を使用してもよい。
　αシヌクレインまたはＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬は、検出可能な物質で標識されていてもよい。検出可能な物質の例としては、放射性同位元素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、酵素標識およびビオチンが挙げられる。あるいは、試薬は標識されていなくてもよく、その試薬を認識する標識された物質、例えば二次抗体をさらに使用し得る。
　αシヌクレインまたはＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬は、適切な支持体に結合されていてもよい。支持体としては、結合試薬を固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。例えば、ナイロン膜などのメンブレン、ビーズ、ガラス、プラスチック、および金属などの支持体を例示できる。
　試料からαシヌクレイン画分またはＡｐｏＡ１画分を得るために、公知のいかなるタンパク質精製方法を用いてもよく、例えば、アフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。透析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を適宜組み合わせてもよい。例えば、支持体に固定されたαシヌクレインに特異的に結合する試薬と試料を接触させ、支持体に結合した物質を回収することにより、αシヌクレイン画分を得ることができる。あるいは、支持体に結合した物質を回収せず、支持体上でＡｐｏＡ１を検出してもよい。例えば、支持体に固定されたＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬と試料を接触させ、支持体に結合した物質を回収することにより、ＡｐｏＡ１画分を得ることができる。あるいは、支持体に結合した物質を回収せず、支持体上でαシヌクレインを検出してもよい。
　ＡｐｏＡ１またはαシヌクレインの検出は、これらに特異的に結合する試薬を用いる免疫学的手法により行い得る。免疫学的手法としては、酵素免疫固相法（ＥＬＩＳＡ法、例えば、直接法、間接法、サンドイッチ法または競合法）、イムノクロマト法、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）などを例示でき、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡ法である。例えば、試料からαシヌクレイン画分を精製し、捕捉抗体として第一のＡｐｏＡ１抗体を、検出抗体として第二のＡｐｏＡ１抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、ＡｐｏＡ１を検出し得る。あるいは、試料からαシヌクレイン画分を精製せず、αシヌクレインに結合する捕捉抗体とＡｐｏＡ１に結合する検出抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、試料中のαシヌクレインに結合したＡｐｏＡ１を検出し得る。例えば、試料からＡｐｏＡ１画分を精製し、捕捉抗体として第一のαシヌクレイン抗体を、検出抗体として第二のαシヌクレイン抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、αシヌクレインを検出し得る。あるいは、試料からＡｐｏＡ１画分を精製せず、ＡｐｏＡ１に結合する捕捉抗体とαシヌクレインに結合する検出抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、試料中のαシヌクレインに結合したＡｐｏＡ１を検出し得る。
　あるいは、プロテオミクス解析により、αシヌクレイン画分に含まれるＡｐｏＡ１またはＡｐｏＡ１画分に含まれるαシヌクレインを測定してもよい。相対定量法（ＳＩＬＡＣ、ＩＣＡＴ、ＩＣＰＬ、アイソバリックタグなど）または絶対定量法（ＳＲＭ法）を利用できる。例えば、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によりＡｐｏＡ１またはαシヌクレインを測定し得る。
　後述の実施例において、パーキンソン病患者の血中では、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが低いことが見出された。従って、本方法では、対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが低い場合に、対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定され、レベルが高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定される。本方法により、シヌクレイノパチーの診断を補助すること、または、シヌクレイノパチーの診断のための情報を提供することができる。
　ある実施態様では、対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値と比較して低い場合に、対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定され、レベルがカットオフ値と比較して高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定される。αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値と同等である場合、対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定するか、罹患していないと判定するか、判定の目的などに応じて任意に設定できる。従って、ある実施態様では、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値未満である場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定し、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値以上である場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定する。別の実施態様では、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値以下である場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定し、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値より高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定する。
　カットオフ値は、シヌクレイノパチーに罹患している対象群と罹患していない対象群を、統計的に有意差をもって分けることができる値である。カットオフ値の設定は、種々の統計解析手法を用いて、公知の方法により実施できる。例えば、シヌクレイノパチーに罹患している対象群から取得された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルと、罹患していない対象群から取得された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルを統計解析的に処理することにより、カットオフ値を設定できる。統計的有意差は、カイ二乗検定、一般化Wilcoxon検定、Wilcoxonの符号順位検定、Mann-Whitney検定、ログランク検定、Cox比例ハザードなどの公知の検定方法により解析され得る。カットオフ値の設定には、例えば、Prism等の統計解析用ソフトウェアを使用し得る。
　カットオフ値は、感度および／または特異度に基づいて設定し得る。好ましくは、カットオフ値は、高い感度および高い特異度の両方を示す。ここで、感度とは、真の陽性率を意味する。また、特異度とは真の陰性率を意味する。例えば、シヌクレイノパチーに罹患している対象群で高い陽性率を示し、かつ、シヌクレイノパチーに罹患していない対象群で高い陰性率を示すαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルを、カットオフ値として設定し得る。
　例えば、診断検査の有用性を検討する手法として一般的に用いられているＲＯＣ解析（receiver operating characteristic analysis）により、カットオフ値を設定することができる。ＲＯＣ解析では、各カットオフ値における感度を縦軸に、偽陽性率（１－特異度）を横軸にプロットしたＲＯＣ曲線が作成される。ＲＯＣ曲線は、診断能のない検査では対角線上の直線となるが、診断能が向上するほど、左上方に弧を描く曲線となる。左上隅との距離が最小となるＲＯＣ曲線上の点を与えるカットオフ値は、感度と特異度に優れると言える。また、ヨーデン指標（Youden index）に基づいてカットオフ値を設定することもできる。具体的には、シヌクレイノパチーに罹患している対象群および罹患していない対象群のαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルから感度および特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してＲＯＣ曲線を作成する。そして、感度と特異度が可能な限り１００％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とし得る。
　また、例えば、診断効率（即ち、シヌクレイノパチーに罹患している対象を「罹患している」と正しく診断した症例と、シヌクレイノパチーに罹患していない対象を「罹患していない」と正しく診断した症例との合計数の全症例数に対する割合）を求め、最も高い診断効率が算出されるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルをカットオフ値とし得る。
　特徴に応じてサブグループ化された患者群についてカットオフ値を設定することもできる。例えば、性別、年齢層または人種に応じてそれぞれカットオフ値が設定されてよい。
　本方法により、シヌクレイノパチーの診断を補助すること、または、シヌクレイノパチーの診断のための情報を提供することができる。
　ある実施態様では、本方法は、判定結果を診断のための情報として提供することを含む。
　ある実施態様では、本方法は、対象から試料を採取することを含む。
　ある実施態様では、本方法は、試料からαシヌクレイン画分を精製することを含む。
　ある実施態様では、本方法は、αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルを測定することを含む。
　ある実施態様では、本方法によりシヌクレイノパチーに罹患していると判定された対象において、シヌクレイノパチーの治療が実施される。例えば、将来、シヌクレイノパチーの治療薬が承認されれば、本方法によりシヌクレイノパチーに罹患していると判定された対象に、シヌクレイノパチーの治療薬を投与する。例えば、シヌクレイノパチーのパーキンソニズム症状を処置するために、パーキンソン病の治療薬を投与し得る。
　本方法によりシヌクレイノパチーに罹患していると判定された対象をさらに臨床的に診断し、治療を実施してもよい。例えば、本方法によりシヌクレイノパチーに罹患していると判定され、臨床的にパーキンソン病と診断された対象に、パーキンソン病の治療薬を投与する。例えば、本方法によりシヌクレイノパチーに罹患していると判定され、臨床的にレビー小体型認知症と診断された対象に、レビー小体型認知症の治療薬を投与する。例えば、本方法によりシヌクレイノパチーに罹患していると判定され、臨床的に多系統萎縮症と診断された対象に、多系統萎縮症の治療薬を投与する。
　パーキンソン病の治療薬の例には、ドパミン前駆物質（レボドパなど）、ドパミンアゴニスト（プラミペキソール、ロピニロール、アポモルフィン、ロチゴチンなど）、ドパミン放出促進薬（アマンタジンなど）、ドパミン分解阻害剤（セレギリン、ラサギリン、サフィナミド、エンタカポン、オピカポン、カルビドパなど）、非ドパミン薬（ゾニサミドなど）、アデノシン受容体アンタゴニスト（イストラデフィリンなど）、抗コリン剤、セロトニン５－ＨＴ１Ａ／１Ｂ作動剤（エルトプラジンなど）などが含まれる。レビー小体型認知症の治療薬の例には、パーキンソン病の治療薬に加えて、認知症の治療薬（ドネペジルなど）、睡眠障害の治療薬などが含まれる。多系統萎縮症の治療薬の例には、パーキンソン病の治療薬に加えて、小脳性運動失調治療薬（タルチレリンなど）が含まれる。
　別の態様では、対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルを測定することを含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法が提供される。この方法は、上記の方法、即ち、対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルに基づいて、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法に準じて実施し得る。
　別の態様では、ＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬およびαシヌクレインに特異的に結合する試薬を含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するためのキットが提供される。試薬は、水または適当な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管、プレート、メンブレン等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチックなどの多様な材料から形成されていてよい。キットは、ＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬とαシヌクレインに特異的に結合する試薬を１つの構成要素として含んでもよく、別々の構成要素として含んでもよい。キットは、ＡｐｏＡ１および／またはαシヌクレインの検出に必要な他の成分や試薬をさらに含んでもよい。例えば、キットは、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液などをさらに含み得る。キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
　ある態様では、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための、ＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬およびαシヌクレインに特異的に結合する試薬が提供される。
　ある態様では、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するためのキットを製造するための、ＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬およびαシヌクレインに特異的に結合する試薬の使用が提供される。
　例えば、下記の実施態様が提供される。
［１］対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているアポリポプロテインＡ１（ＡｐｏＡ１）のレベルに基づいて、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法。
［２］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが低い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定される、第１項に記載の方法。
［３］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定される、第１項に記載の方法。
［４］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルをカットオフ値と比較することを含む、第１項に記載の方法。
［５］対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているアポリポプロテインＡ１（ＡｐｏＡ１）のレベルをカットオフ値と比較することを含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法。
［６］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値と比較して低い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定される、第４項または第５項に記載の方法。
［７］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定される、第４項～第６項のいずれかに記載の方法。
［８］対象から採取された試料からαシヌクレイン画分を精製することを含む、第１項～第７項のいずれかに記載の方法。
［９］対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルを測定することを含む、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているアポリポプロテインＡ１（ＡｐｏＡ１）のレベルを測定することを含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法。
［１１］対象から採取された試料からαシヌクレイン画分を精製することを含む、第１０項に記載の方法。
［１２］対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルに基づいて、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための、第１０項または第１１項に記載の方法。
［１３］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが低い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定される、第１０項～第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定される、第１０項～第１２項のいずれかに記載の方法。
［１５］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルをカットオフ値と比較することを含む、第１０項または第１１項に記載の方法。
［１６］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値と比較して低い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定される、第１５項に記載の方法。
［１７］αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定される、第１５項に記載の方法。
［１８］試料が、血液、血漿または血清である、第１項～第１７項のいずれかに記載の方法。
［１９］シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、レビー小体型認知症または多系統萎縮症である、第１項～第１８項のいずれかに記載の方法。
［２０］シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、第１項～第１９項のいずれかに記載の方法。
［２１］ＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬およびαシヌクレインに特異的に結合する試薬を含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するためのキット。
［２２］試薬が抗体である、第２１項に記載のキット。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、本発明は添付の特許請求の範囲において定義され、その技術的思想を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。以下、実施例にて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
［方法］
質量分析に用いた検体
　質量分析には、健常人由来（ｎ＝５）、パーキンソン病患者由来（ｎ＝５）の血漿を使用した。パーキンソン病患者は、運動機能障害の程度が中等度４例、重度１例の検体を用いた。各サンプルの患者背景について、表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
ＥＬＩＳＡ測定に用いた検体
　ＥＬＩＳＡ測定には、質量分析に用いた検体とは異なる、健常人由来（ｎ＝５）、パーキンソン病患者由来（ｎ＝５）の血漿を使用した。パーキンソン病患者は、運動機能障害の程度が中等度４例、重度１例の検体を用いた。各サンプルの患者背景について、表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
αシヌクレイン抗体ビーズの作製
　抗αシヌクレインモノクローナル抗体（日本ベクトンディッキンソン，６１０７８７）３００μｇを磁気ビーズ（Dynabeads M-２７０ Epoxy, Thermo Fisher Scientific）２ｍＬ（ビーズ量４０ｍｇ）と室温で３０反応させることで、Ｍ２７０磁気ビーズにαシヌクレインモノクローナル抗体を共有結合させた。最後に５０ｍＭのトリスｐＨ８．０緩衝液を加え、未反応のアミノ基をブロックした。作製した抗体固定化磁気ビーズは使用するまで４℃で保存した。
αシヌクレイン結合タンパク質の精製
　健常者あるいはパーキンソン病患者由来の血漿０．５ｍＬにプロテアーゼ阻害剤（Halt protease inhibitor cocktail SIGMA P8340）を１０μＬ添加後、４℃、１５００ｇで５分間遠心し、上清を得た。上清に結合バッファー（１％ＢＳＡ，ＰＢＳ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を０．５ｍＬ添加し、調整したαシヌクレイン抗体固定化磁気ビーズを０．１ｍＬ添加し、４℃でオーバーナイト反応させた。サンプルを回収後、マグネットプレートに固定し、磁気ビーズを回収した。回収した磁気ビーズは洗浄バッファー（ＰＢＳ，０．０５% Ｔｗｅｅｎ２０）１ｍＬで３回洗浄を行った。洗浄後の磁気ビーズに溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸塩，ｐＨ２．８）６０μＬを添加後、５分間インキュベートし、マグネットプレートに固定化して溶出画分を回収した。回収した溶出画分は、１ＭトリスｐＨ８．０を１０μＬ添加することで中和した。調整したサンプルは、質量分析、ＥＬＩＳＡ解析まで－８０℃で保管した。
αシヌクレイン結合タンパク質のプロテオーム解析
　αシヌクレイン結合タンパク質のプロテオミクス解析は、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所（大阪府茨木市彩都あさぎ７町目６－８）にて実施した。αシヌクレイン結合タンパク質サンプル１０μＬをStageTipで精製し、スピードバックで乾固した後、１０μＬの緩衝液（０．１％ギ酸２％アセトニトリル）に再溶解した。調整後のサンプルは、ExactivePlus 質量分析計（ThermoFisherScientific）、UltiMate3000RSLCnanoHPLC（ThermoFisherScientific）、ＨＴＣ－ＰＡＬオートサンプラー（CTC Analytics）を用いて、ｎａｎｏＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。得られたペプチド断片データは、Xcalibur2.4を使用して、各ペプチドエリア値を算出した。MaxQuant1.6.14.0を使用して結合タンパク質の同定を行った。
ＥＬＩＳＡ測定
　血液およびαシヌクレイン結合タンパク質画分サンプル中のＡｐｏＡ１タンパク質濃度は、Human APOA1 sandwich ELISA kit（proteintech社、KE00157）、およびApolipoprotein A1(APOA1)Human SimpleStep ELISA Kit（アブカム社、ab189576）を用いて測定した。
統計処理
　パーキンソン病群、健常者群間における統計的有意差検定は、ノンパラメトリックな検定法であるMann-WhitneyU検定を用いた。
［結果］
　健常者、パーキンソン病患者それぞれ５例の血漿を対象にαシヌクレイン抗体磁気ビーズを用いて、αシヌクレイン結合タンパク質のプロテオミクス解析を実施したところ、表３に示す１５種類のαシヌクレイン結合タンパク質が得られた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

　同定されたαシヌクレイン結合タンパク質結合タンパク質の健常者群とパーキンソン病（ＰＤ）群との存在比（５検体の平均値）を算出したところ、アポリポプロテインＡ１（Apolipoprotein A-I、ＡｐｏＡ１）が健常者群に比較してパーキンソン病群では平均して約４３分の一に低下していた。αシヌクレインタンパク自体は、健常者群に比較してパーキンソン病群では約２分の一に低下するのにとどまっていた。このことは、パーキンソン病では、健常者と比較して血中αシヌクレインが低下するが、αシヌクレインに結合するＡｐｏＡ１の量がより顕著に低下していることを示す結果である。
　５検体それぞれのαシヌクレイン結合画分のＡｐｏＡ１量は、健常者では一定のバラツキが認められるが、パーキンソン病の５検体では、いずれも顕著な低下が認められ、健常者群とパーキンソン病群で有意な差が認められた（図１）。血中のαシヌクレイン結合型ＡｐｏＡ１タンパク質の量は健常者群では個人差を示す一方、パーキンソン病患者ではすべてのサンプルで一様に低下していた。
　次に、血中ＡｐｏＡ１タンパク質の濃度とαシヌクレイン結合画分のＡｐｏＡ１量の関係について、同一検体を対象にＥＬＩＳＡ測定系を用いた解析を実施した。図２に示すように、血中ＡｐｏＡ１タンパク質濃度は、健常者群（ＨＣ）に比べ、パーキンソン病群（ＰＤ）では、有意に低下していたが、その濃度域にはオーバーラップが認められた。同様の傾向が異なる２種類の市販ＡｐｏＡ１ ＥＬＩＳＡキットを用いた測定結果から確かめられた。
　αシヌクレイン結合画分のＡｐｏＡ１量濃度を同様にＥＬＩＳＡ測定によって解析したところ、図３に示すように、αシヌクレイン結合画分のＡｐｏＡ１量は、健常者群（ＨＣ）に比べ、パーキンソン病群（ＰＤ）で有意に低下しており、その濃度域にはオーバーラップが全く認められず、パーキンソン病群では、質量分析により解析と同様に、測定した全てのサンプルで一様に顕著な低下を示していた。このことは、αシヌクレイン結合画分のＡｐｏＡ１量減少が、パーキンソン病における何らかの病態を示している可能性を示唆するものである。
　これらの結果は、αシヌクレイン結合画分のＡｐｏＡ１タンパク質をマーカーとすることで、健常者とシヌクレイノパチー患者を十分に鑑別できることを示唆する。
　本開示に従って、シヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定することができ、医療分野で有用である。

Claims (14)

  1. 　対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているアポリポプロテインＡ１（ＡｐｏＡ１）のレベルに基づいて、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法。
  2. 　αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが低い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定される、請求項１に記載の方法。
  3. 　αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルが高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定される、請求項１に記載の方法。
  4. 　αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルをカットオフ値と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 　αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値と比較して低い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していると判定される、請求項４に記載の方法。
  6. 　αシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルがカットオフ値と比較して高い場合に対象がシヌクレイノパチーに罹患していないと判定される、請求項４に記載の方法。
  7. 　対象から採取された試料からαシヌクレイン画分を精製することを含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルを測定することを含む、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  9. 　試料が、血液、血漿または血清である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  10. 　シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、レビー小体型認知症または多系統萎縮症である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  11. 　シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  12. 　対象から採取された試料におけるαシヌクレインに結合しているＡｐｏＡ１のレベルを測定することを含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するための方法。
  13. 　ＡｐｏＡ１に特異的に結合する試薬およびαシヌクレインに特異的に結合する試薬を含む、対象がシヌクレイノパチーに罹患しているか否かを判定するためのキット。
  14. 　試薬が抗体である、請求項１３に記載のキット。
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