KR20220125640A - 알츠하이머병의 진단을 위한 트로포마이오신 알파-4 사슬 및 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알츠하이머병의 진단용 조성물, 진단 키트, 및 이들을 이용한 알츠하이머 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들이 신규 개발한 혈장 내 바이오마커인 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합은 정상인과 비교하여 알츠하이머 환자군의 혈장 내에서 낮은 수준으로 발현되므로, 이들 바이오마커의 발현수준 측정을 통하여 알츠하이머병 환자 여부를 조기에 정확하게 진단할 수 있다.

Description

알츠하이머병의 진단을 위한 트로포마이오신 알파-4 사슬 및 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬의 용도 {Use of tropomyosin alpha-4 chain and platelet glycoprotein Ib beta chain for diagnosis of Alzheimer's disease}

본 발명은 알츠하이머병의 진단을 위한 트로포마이오신 알파-4 사슬(TPM4) 및 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(GP1BB)의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 알츠하이머병의 진단용 조성물, 진단 키트, 및 이들을 이용한 알츠하이머 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

현재 알츠하이머병(Alzheimer's Disease, AD)의 확진은 사후 뇌 조직을 이용한 병리학적 검사방법을 통하여 노인성 반(senile plaque)과 신경섬유성 엉킴(neurofibrillary tangle, NFT)의 확인을 통하여 이루어진다. 그러나 임상적으로 인지 기능 장애가 있는 환자의 약 70%만이 알츠하이머병의 신경 병리학적인 진단 기준을 만족하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 임상에서 알츠하이머병은 개인병력 검토, 건강진단, 정신상태 검사, 신경계 검사 등의 방법들을 통하여 환자의 상태로 진단이 이루어지고 있다.

기존의 진단 방법들은 근본적인 치료기술의 개발에 필요한 조기진단 및 다른 치매와의 구분이 어렵고, 치료법의 효과측정이 제한적이라는 한계가 있다. 따라서 생물학적 바이오마커의 분석을 통해 알츠하이머병 진단의 특이성을 높이기 위한 노력이 이루어지고 있다. 알츠하이머병의 임상연구를 위해 많이 쓰이고 있는 진단기준인 NINCDS-ADRDA에 따르면, 알츠하이머병과 다른 종류의 치매를 감별하기 위해 생물학적 바이오마커가 추천되고 있다. 또한 2008년 새롭게 수정된 NINCDS-ADRDA에서는 진단 기준의 지지특성(supportive feature)으로서 생물학적 바이오마커가 포함되어 있다.

현재까지 국내에는 알츠하이머병 환자들의 뇌척수액에서 베타-아밀로이드(Aβ) 1-42 분획 및 총 타우(t-tau) 혹은 인산화 타우(p-tau) 단백의 농도를 측정하여 정상 대조군과 비교한 연구들은 있으나, 진단적 가치를 이야기하는 데는 시료의 보관 및 처치, 센터 간 혹은 센터 내부에서도 변이가 커서 어려움이 있다. 또한 Aβ 항체, 트렌스티레틴 단백질, 그외 다양한 바이오 마커를 규명하고 그 농도를 측정하여 알츠하이머병을 진단하는 방법이 개발 중인 것으로 알려져 있으나 아직 유용성이 입증되지 않은 실정이다.

현재 FDA로부터 승인받은 알츠하이머병 치료약제들은 증상 개선에만 긍정적인 효과를 보일 뿐, 근본적인 질환을 치료하는 약물은 아니다. 세계 각국에서 새로운 치료제(disease modifying drug)개발에 일부 바이오마커가 사용되어 연구가 진행되고 있으나, 정확하고 저비용이면서 동시에 약 적용의 효율성 제고가 가능한 바이오마커나 진단법이 사용되고 있는 지는 의문시되고 있다. 또한 새로운 약물개발 과정은 임상연구기간이 길고, 많은 대상자를 필요로 하기 때문에, 천문학적인 비용과 많은 대상자의 탈락 등의 한계점을 가지고 있다. 따라서 알츠하이머병의 병리를 반영하는 새로운 생물학적 바이오마커를 규명하고, 사용하는 것이 약물개발비용의 절감과 동시에 정확한 대상자 선택을 가능하게 할 수 있으리라는 기대를 받고 있다.

국내의 많은 임상실험은 임상진단과 신경심리검사에 의존하고 있다. 하지만 신경심리검사가 알츠하이머병의 인지장애정도를 평가할 수 있지만, 알츠하이머병의 병리를 평가할 수는 없다. 또한 신경심리검사로 측정되는 인지기능의 개선을 보는 데는 상대적으로 긴 시간이 소요되는 단점이 있다. 따라서, 알츠하이머병의 병리를 평가할 수 있으면서도 조기 진단이 가능한 신규한 바이오마커의 개발이 절실히 필요한 실정이다.

대한민국등록특허 제10-1658620호 (2016.09.23. 공고)

상술한 바와 같이, 알츠하이머병 환자의 조기진단과 신약개발, 기타 임상연구에 적용이 가능한 알츠하이머병의 생물학적 바이오마커의 개발이 필요하다. 그러나 임상연구자 및 기초 과학자들의 생물학적 바이오마커에 대한 연구를 위한 환자의 혈액시료 뿐만 아니라, 체계화된 임상정보가 포함된 혈액시료를 구하기도 어렵다. 한편 세계적으로 알츠하이머병의 임상연구에 생물학적 바이오마커가 진단기준에 추가되는 추세이며, 국내의 알츠하이머병 임상연구도 그 진단기준에 부합하기 위한 경제적인 생물학적 바이오마커에 대한 필요성이 부각되고 있다. 현재, 알츠하이머병의 치료약(disease modifying drug)이 개발되지 않았기 때문에 체액 및 혈액을 이용한 정확한 진단기술개발은 신약개발에서 매우 중요하며, 이중에서도 혈액에서의 생물학적 바이오마커의 개발은 뇌척수액에 비해 저비용과 비침습성이라는 강점을 가지고 있어 주목받고 있다.

본 발명자들은 혈장 내 바이오마커인 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합이 정상인과 비교하여 알츠하이머 환자군의 혈장 내에서 낮은 수준으로 발현되며, ROC 분석을 통하여 이들 바이오마커의 발현수준 측정을 통하여 알츠하이머병 환자 여부를 조기에 정확하게 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 트로포마이오신 알파-4 사슬(tropomyosin alpha-4 chain, TPM4), 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(platelet glycoprotein Ib beta chain, GP1BB), 또는 이들의 조합을 검출하기 위한 제제를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 알츠하이머병의 진단용 조성물을 포함하는 알츠하이머병 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 혈액 내 바이오마커인 트로포마이오신 알파-4 사슬(tropomyosin alpha-4 chain, TPM4), 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(platelet glycoprotein Ib beta chain, GP1BB), 또는 이들의 조합의 발현 수준을 측정함으로써 알츠하이머병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 용어 "바이오마커"는 샘플에서 검출될 수 있는 표지자, 예를 들어 진단 및/또는 예후 예측에 필요한 표지자를 지칭한다. 바이오마커는 특정의 분자, 병리학적적, 조직학적 및/또는 임상적 특징에 의해 특성화된 특정한 하위 유형의 질환 또는 장애 (예를 들어, 알츠하이머병)의 표지자로서 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 유전자이다. 바이오마커는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA), 폴리뉴클레오티드 카피수 변경 (예를 들어, DNA 카피수), 폴리펩티드, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 변형 (예를 들어, 번역후 변형), 탄수화물 및/또는 당지질-기재 분자 마커를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

개체에 대한 증가된 임상적 이익과 연관된 바이오마커의 "양" 또는 "수준"은 생물학적 샘플 중의 검출가능한 수준이다. 이것은 통상의 기술자에게 공지되고 또한 본 발명에 의해 개시된 방법에 의해 측정될 수 있다. 평가되는 바이오마커의 발현 여부, 발현 수준 또는 양은 질병의 유무, 질병의 경중, 및/또는 치료에 대한 반응을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "발현 수준"은 일반적으로 생물학적 샘플에서 바이오마커의 양을 지칭한다. "발현"은 일반적으로 유전적 정보(예를 들어, 유전자-코딩 및/또는 후성학)가 세포 내에 존재하고 작동하는 구조로 전환되는 과정을 지칭한다. 따라서, 본원에 사용된 "발현"은 폴리뉴클레오티드로의 전사, 폴리펩티드로의 번역 또는 심지어 폴리뉴클레오티드 및/또는 풀리펩티드 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 번역후 변형)을 지칭할 수 있다. 전사된 폴리뉴클레오티드, 번역된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 및/또는 풀리펩티드 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 번역후 변형)은 또한 이들이 대안적 스플라이싱에 의해 생성된 전사체 또는 분해된 전사체로부터 유래하든지 또는 예를 들어 단백질분해에 의한 폴리펩티드의 번역후 프로세싱으로부터 유래하든지, 모두 발현되는 것으로 여겨진다. "발현된 유전자"는 mRNA로서 폴리뉴클레오티드로 전사되고, 이어서 폴리펩티드로 번역되는 것, 또한 RNA로 전사되지만 폴리펩티드로 번역되지 않는 것 (예를 들어, tRNA 및 rRNA)을 포함한다. "발현된 단백질"은 mRNA가 폴리펩티드로 번역된 것, 번역후 프로세싱된 것을 포함한다.

"상승된 발현", "상승된 발현 수준" 또는 "상승된 수준"은 대조군, 예컨대 질환 또는 장애 (예를 들어, 알츠하이머병)를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들(정상인)로부터 수득한 시료, 또는 시료 내 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 바이오마커)에 비해 개체에서 바이오마커의 증가된 발현 또는 증가된 수준을 지칭한다.

"감소된 발현", "감소된 발현 수준" 또는 "감소된 수준"은 대조군, 예컨대 질환 또는 장애 (예를 들어, 알츠하이머병)를 앓고 있지 않은 개체 또는 개체들(정상인)로부터 수득한 시료, 또는 시료 내 내부 대조군 (예를 들어, 하우스키핑 바이오마커)에 비해 개체에서 바이오마커의 감소된 발현 또는 감소된 수준을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 감소된 발현은 발현이 거의 없거나 또는 전혀 없는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어 "하우스키핑 바이오마커"는 전형적으로 모든 세포 유형에서 유사하게 존재한 바이오마커 또는 바이오마커의 군 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 하우스키핑 바이오마커는 "하우스키핑 유전자"이다. "하우스키핑 유전자"는 본원에서 그의 활성이 세포 기능의 유지에 필수적이고 전형적으로 모든 세포 유형에서 유사하게 존재하는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자의 군을 지칭한다.

본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 또는 복수로 사용될 때 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 본원에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥영역을 포함하는 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일-가닥 또는 보다 전형적으로는 이중-가닥일 수도 있거나 또는 단일- 및 이중-가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA와 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 이러한 영역 내 가닥들은 동일한 분자 또는 상이한 분자로부터의 유래한 것일 수 있다. 상기 영역은 모두 1개 이상의 분자를 포함할 수 있지만, 보다 전형적으로는 오직 일부 분자의 영역을 포함한다. 삼중-나선 영역의 분자 중 1개는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 구체적으로 cDNA를 포함한다. 용어는 1개 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA (cDNA 포함) 및 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유로 인해 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 의도된 용어와 같은 "폴리뉴클레오티드"이다. 또한, 이노신과 같은 비통상적 염기 또는 삼중수소화 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 정의된 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드"에 포함된다. 일반적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태 뿐만 아니라 바이러스 및 세포 (단순 및 복합 세포 포함)의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "올리고뉴클레오티드"는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 단일-가닥 또는 이중-가닥 리보뉴클레오티드, RNA:DNA 하이브리드 및 이중-가닥 DNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드, 예컨대 단일-가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오티드는 종종 예를 들어 상업적으로 입수가능한 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 화학적 방법에 의해 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기술을 비롯한 다양한 다른 방법에 의해 및 세포 및 유기체에서 DNA의 발현에 의해 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 분자 또는 병리학적 상태, 질환 또는 상태 (예를 들어, 알츠하이머병)의 확인 또는 분류를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, "진단"은 의사에 의하여 대상체에 알츠하이머병의 존재하는 것으로 판단됨을 지칭할 수 있다. "진단"은 또한 예를 들어 조직병리학적 기준, 영상진단학적 기준, 또는 분자적 특징 (예를 들어, 바이오마커 (예를 들어, 특정한 유전자 또는 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질) 중 하나 또는 그의 조합의 발현에 의해 특성화된 하위유형)에 의한 특정한 유형의 분류를 지칭할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "시료" 또는 "샘플"은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징에 기초하여 특성화 및/또는 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는 관심 대상체 및/또는 개체로부터 얻거나 이들체로부터 유래된 조성물을 지칭한다. 예를 들어, "질환 샘플" 및 그의 변형 표현은 특성화되는 세포성 및/또는 분자 엔티티를 함유하는 것으로 예상되거나 공지된 관심 대상으로부터 얻은 임의의 샘플을 의미한다. 샘플은 1차 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 유액, 전혈, 혈액-유래 세포, 소변, 뇌척수액, 타액, 객담, 누액, 땀, 점액, 및 조직 배양 배지, 조직 추출물, 예컨대 혈액(전혈, 혈청, 혈장), 균질화된 조직, 세포 추출물, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본원에 사용된 "참조 샘플(시료)", "참조 세포", "참조 조직", "참조 혈액", "참조 혈장", "대조 샘플", "대조 세포" 또는 "대조 조직" 등은 비교 목적을 위해 사용되는 샘플, 세포, 조직, 표준 또는 수준을 지칭한다. 한 실시양태에서, 참조 샘플(시료), 참조 세포, 참조 조직, 참조 혈액, 참조 혈장, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 동일한 대상체 또는 개체의 건강한 및/또는 비-이환된 신체 일부 (예를 들어, 조직, 혈액 또는 세포)로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 동일한 대상체 또는 개체의 신체의 비처리 조직 및/또는 세포로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플(시료), 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 건강한 개체의 신체의 일부 (예를 들어, 조직, 혈액 또는 세포)로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플(시료), 참조 세포, 참조 조직, 대조 샘플, 대조 세포 또는 대조 조직은 대상체 또는 개체가 아닌 건강한 개체의 신체의 비처리 조직, 혈액 및/또는 세포로부터 수득한다.

본 명세서에서 용어 "개체", "대상" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 트로포마이오신 알파-4 사슬(tropomyosin alpha-4 chain, TPM4), 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(platelet glycoprotein Ib beta chain, GP1BB), 또는 이들의 조합을 검출하기 위한 제제를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 트로포마이오신 알파-4 사슬(tropomyosin alpha-4 chain, TPM4)은 TPM4 유전자에 의하여 코딩되는 단백질로, TM30p1 또는 트로포마이오신-4(Tropomyosin-4)라고 불리기도 한다. 트로포마이오신 알파-4 사슬은 근육 및 비근육 세포의 액틴 필라멘트 및 칼슘과 결합하고, 트로포닌 복합체와 연관되어, 척추동물의 가로무늬근(striated muscle)의 수축에 있어 칼슘 의존적 조절을 조절하는 것으로 알려져 있다. 트로포마이오신 알파-4 사슬은 알츠하이머병을 보이는 인간의 뇌조직이나 눈물 샘플 또는 마우스의 뇌조직에서 증가함이 알려져 있다.

본 명세서에서 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(platelet glycoprotein Ib beta chain, GP1BB)은 GP1BB 유전자에 의하여 코딩되는 단백질로, CD42b-beta, 또는 CD42c로 불리기도 하며, GP-Ib beta, GPIb beta, 또는 GPIbB로 표기된다. 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬은 혈소판의 표면 막 단백질로, 내피세포에 결합되어 있는 폰 빌레브란트 요소(von Willebrand factor)와 결합함으로써 혈소판의 혈병을 형성하는데 관여한다. 트로포마이오신 알파-4 사슬과 마찬가지로 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬 및 알츠하이머병의 발병 사이에는 어떠한 연관성도 알려져 있지 않다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 트로포마이오신 알파-4 사슬(tropomyosin alpha-4 chain, TPM4), 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(platelet glycoprotein Ib beta chain, GP1BB), 또는 이들의 조합을 검출하기 위한 제제는 상기한 본 발명의 바이오마커인 TPM4, GP1BB에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 타겟 결합 단백질, 또는 압타머이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타 올리고머를 검출하기 위한 제제를 추가적으로 포함하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제제는 상기한 본 발명의 바이오마커인 아밀로이드 베타 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 타겟 결합 단백질, 또는 압타머를 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 아밀로이드 베타 올리고머에 특이적으로 결합하는 항체는 6E10, FF51, 및 WO2 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “항체(antibody)”는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.

본 명세서에서, 상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단일 도메인 항체, 및 단쇄 가변 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체를 포함한다.

본 명세서에서, 용어 “항원 결합 단편(antigen binding fragment)”은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 구체적으로 Fab, scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다.

본 명세서에서, 용어 "타겟 결합 폴리펩타이드(target binding polypeptide)"는 항체와 같이 타겟 항원 또는 합텐에 대한 결합 친화성을 가지나, 항체와는 구조적으로 관련성이 없는 비면역글로불린 폴리펩타이드 분자를 말한다. 상기 타겟 결합 폴리펩타이드는 항체 유사 분자(antibody-like molecule) 또는 항체유사체(antibody mimetics)라고도 불리우며, 약 150 kDa의 분자량을 가지는 항체와는 달리 일반적으로는 3-20 kDa의 분자량을 가진다. 상기 타겟 결합 폴리펩타이드는 상기한 단백질 A(protein A)의 Z-도메인에서 유래한 어피바디, 감마-B 크리스탈린 또는 유비퀴틴에서 유래한 어필린(Affilin), 시스타틴(cystatin)에서 유래한 어피머(Affimer), Sulfolobus acidocaldarius의 Sac7d로부터 유래한 어피틴(Affitin), 트리플 헬릭스 코일드 코일로부터 유래한 알파바디(Alphabody), 리포칼린(lipocalin)으로부터 유래한 안티칼린(Anticalin), 세포막 수용체의 도메인으로부터 유래한 아비머(Avimer), 안키린 반복 모티프(ankyrin repeat motif)로부터 유래한 DARPin, Fyn의 SH3 도메인으로부터 유래한 피노머(Fynomer), 프로테아제 억제제(protease inhibitor)의 쿠니츠 도메인으로부터 유래한 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunits domain peptide), 피브로넥틴의 10번째 타입 3 도메인(10^th type III domain of fibronectin)으로부터 유래한 모노바디(Monobody), Clostridium perfringens의 NagH의 탄수화물 결합 모듈 32-2(carbohydrate binding module 32-2)로부터 유래한 나노클램프(nanoCLAMP) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기한 타겟 결합 폴리펩타이드는 파아지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 등 당업계에 알려진 다양한 스크리닝 방법을 통하여 임의의 타겟 항원 또는 합텐에 대한 결합친화성을 갖도록 엔지니어링 될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 알츠하이머병 진단용 조성물을 포함하는, 알츠하이머병 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키트는 상술한 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합을 검출하기 위한 제제를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 키트는 아밀로이드 베타 올리고머를 검출하기 위한 제제를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 TPM4, GP1BB, 아밀로이드 베타 올리고머, 또는 이들의 조합은 상기 키트를 이용하여 개체로부터 수득한 시료 및 참조 시료에서 검출된 TPM4, GP1BB, 아밀로이드 베타 올리고머, 또는 이들의 조합의 발현 수준을 비교하여 알츠하이머병 진단에 필요한 정보를 제공하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 알츠하이머병 진단용 키트는 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 알츠하이머병 진단용 조성물을 모두 포함하므로, 상술한 알츠하이머병 진단용 조성물과 공통되는 구성에 관한 내용은 모두 동일하게 적용되고, 서로 중복되는 내용의 범위 내에서 본 명세서의 기재의 복잡성을 피하기 위하여 생략된다.

본 발명의 또 다른 일양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 알츠하이머병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(a) 개체로부터 분리한 시료에서 트로포마이오신 알파-4 사슬(tropomyosin alpha-4 chain, TPM4), 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(platelet glycoprotein Ib beta chain, GP1BB), 또는 이들의 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 알츠하이머병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 개체로부터 분리한 시료에서 측정된 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 발현 수준이 참조 시료에서 측정된 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 발현 수준과 비교하여 더 낮은 경우, 알츠하이머병 환자일 가능성이 더 높다는 것을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 발현 수준은 혈장내 상기 단백질의 농도(w/v)로 나타낸다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 단백질 농도는 ng/ml 단위로 나타내나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 상기 개체로부터 분리한 시료에서 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 개체로부터 분리한 시료에서 측정된 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준이 참조 시료에서 측정된 아밀로이드 베타 올리고머의 수준과 비교하여 더 높은 경우, 알츠하이머병 환자일 가능성이 더 높다는 것을 나타낸다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 아밀로이드 베타 올리고머의 수준은 다음 식 1에 의해 도출되는 아밀로이드 베타 올리고머화 경향(OAβ tendency)의 ratio value 이다:

식 1

아밀로이드 베타 올리고머화 경향(OAβ tendency) = OAβ concentration of sample/average OAβ concentration of control A&B

- 여기서 상기 control A는 OAβ 가 존재하는 양성 검체이고, 상기 control B는 OAβ가 존재하지 않는 음성 검체임.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 방법은 개체로부터 분리한 시료 및 참조 시료에서 측정된 TPM4, GP1BB 또는 이들의 조합의 발현 수준, 및 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준을 각각 측정하고, 다음 식 2에 의해 도출되는 값(V2)을 비교하여 더 낮은 경우, 알츠하이머병 환자일 가능성이 더 높다는 것을 나타내는 것이다:

식 2

V2 = TPM4 발현 수준 X GP1BB 발현 수준.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 개체로부터 분리한 시료 및 참조 시료에서 측정된 i) TPM4, GP1BB 또는 이들의 조합의 발현 수준; 및 ii) 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준을 각각 측정하고, 다음 식 3 내지 5 중 어느 하나의 식에 의해 도출되는 값(V3, V4, 또는 V5)을 비교하여 더 높은 경우, 알츠하이머병 환자일 가능성이 더 높다는 것을 나타내는 것인, 방법:

식 3

V3 = 아밀로이드 베타 올리고머화 경향/TPM4 발현 수준;

식 4

V4 = 아밀로이드 베타 올리고머화 경향/GP1BB 발현 수준; 및

식 5

V5 = 아밀로이드 베타 올리고머화 경향/(TPM4 발현 수준 X GP1BB 발현 수준)

단, 상기 아밀로이드 베타 올리고머화 경향은 하기 식 1에 의하여 도출됨:

식 1

아밀로이드 베타 올리고머화 경향 (OAβ tendency) = OAβ concentration of sample/average OAβ concentration of control A&B

- 여기서 control A는 OAβ 가 존재하는 양성 검체이고, control B는 OAβ가 존재하지 않는 음성 검체임

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 발현 수준은 혈장내 상기 단백질의 농도로 나타낸다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 단백질 농도는 ng/ml 단위로 나타내나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식 1 내지 식 5에 의해 도출되는 값은 하기 표 3에 나타낸 컷-오프 값을 기준으로 알츠하이머병 환자인지 여부를 판단할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자들이 신규 개발한 혈장 내 바이오마커인 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합은 정상인과 비교하여 알츠하이머 환자군의 혈장 내에서 낮은 수준으로 발현되므로, 이들 바이오마커의 발현수준 측정을 통하여 알츠하이머병 환자 여부를 조기에 정확하게 진단할 수 있다.

도 1은 TMT-labeled LC-MS/MS 를 이용한 본 발명의 혈장 프로테옴 프로파일링의 전체적인 순서를 나타낸 도이다.
도 2는 연령에 의해 매칭된 정상군과 AD 환자군의 혈장에서 TPM4의 농도와 ROC 곡선 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 연령에 의해 매칭된 정상군과 AD 환자군의 혈장에서 GP1BB의 농도와 ROC 곡선 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 연령에 의해 매칭된 정상군과 AD 환자군의 혈장에서 TPM4 농도 및 GP1BB 농도의 곱셈 값과, 이에 따른 ROC 곡선 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 연령에 의해 매칭된 정상군과 AD 환자군의 혈장에서 아밀로이드 베타 올리고머의 검출값과, 이에 따른 ROC 곡선 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 연령에 의해 매칭된 정상군과 AD 환자군의 혈장에서 아밀로이드 베타 올리고머의 검출값을 TPM4의 농도로 나눈 값과, 이에 따른 ROC 곡선 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 연령에 의해 매칭된 정상군과 AD 환자군의 혈장에서 아밀로이드 베타 올리고머의 검출값을 GP1BB의 농도로 나눈 값과, 이에 따른 ROC 곡선 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 연령에 의해 매칭된 정상군과 AD 환자군의 혈장에서 아밀로이드 베타 올리고머의 검출값을 TPM4의 농도 및 GP1BB의 농도로 나눈 값과, 이에 따른 ROC 곡선 분석 결과를 나타낸 도이다.

실험재료 및 방법

1. 대상

나이 55세 이상 90세 이하의 남녀 대상자를 모집하고, 임상/신경심리 평가를 진행하여 선정기준/제외기준 해당 여부를 평가하였다. 선정기준에 만족하는 경우에만 뇌 영상 평가(Brain MRI), 아밀로이드 PET 스캔(amyloid PET scan), 혈액검사 및 상세 신경심리검사 등을 진행하였다.

알츠하이머 환자군(Alzheimer's disease dementia, AD dementia)의 선정기준은 다음과 같은 요건을 충족하는 대상을 선택하였다.

1) 나이 55세 이상 90세 이하의 남녀

- 이중 조발형(early onset Alzheimer's disease; EOAD, 50-64세) 및 후발형(late onset Alzheimer's disease; LOAD, 65-85세)을 구분하였다.

2)“Clinically well-characterized Alzheimer's disease”의 경우, 상급종합병원에서 치매를 전문으로 진료해온 의사의 판단에 의해 Alzheimer's disease로 판단되는 임상경과를 가진 환자

3) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 4th Edition (DSM-IV-TR) 기준에 따라 치매(dementia)의 범주에 들어가는 사람

4) NIA-AA(National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups, 2011)의 진단 기준에 따라 probable AD dementia 로 진단받은 환자

- 다음과 같은 증상을 갖는 진행성 치매가 있어야 한다

i) 수 개월 이상 지속되는 인지기능의 장애

ii) 일화성기억장애와 최소 하나 이상의 다른 인지기능의 장애

iii) formal neuropsychological test에서 확인

- 단, 인지장애에 영향을 줄 수 있는 뇌졸중 병력 또는 다발성 뇌경색, 백질고신호강도가 CREDOS 기준 Grade3 은 제외

제외 기준

1) 알츠하이머병 외의 다른 신경계 뇌 질환이나 정신병, 간질, 인지장애를 줄 수 있다고 판단되는 뇌졸중, 또는 뇌 MRI상 출혈의 증거나, 임상적으로 중요한 비정상을 보이는 경우

2) 중증이거나 불안정한 신체적 질환의 증거, 즉 급성 및 중증 천식, 중증이거나 불안정한 심혈관계 질환, 활동성 소화성 궤양, 심한 간질환이나 신장 투석을 받을 정도의 신장병 또는 임상시험을 수행하는 데 방해가 될 수 있는 의학적 상태의 환자

3) MRI scan, pacemaker를 진행할 수 없는 환자 또는 claustrophobia

4) 문맹

5) 임상병리검사에서 치매에 영향을 초래할 수 있는 소견이 있다고 임상가에 의해 판단되는 환자: 갑상선 기능 이상, 비타민 B12나 엽산 결핍, 매독 등

6) 최근 10년 이내에 약물 중독이나 알코올 중독 (매일 3잔 이상의 술을 마심)의 기왕력이 있는 환자

2. 혈액 바이오마커 선별

각 군의 환자 10명의 샘플로 TMT(Tandem Mass Tag)-labeling 질량분석 실험을 통해 프로테오믹스 분석을 실시하여 1160개의 단백질 그룹을 동정하였다. 각 그룹별로 차이나는 바이오마커 후보 단백질들을 선별하였다. 동정된 바이오마커 후보 단백질 중 정상군 대비 알츠하이머병 환자에서 증가하거나 감소한 단백질 순서로 혈액에서 ELISA를 통해 정량을 한 결과로부터 본 발명의 혈액 바이오마커를 선별하였다.

3. MS 분석 및 단백질 동정(Mass spectrometry and protein identification)

풍부한 단백질(Abundant Protein)의 제거 및 펩타이드의 분해

풀링된 혈장 샘플은 Pierce^TM Top 2 abundant protein depletion spin column (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) 또는 High Select Top 14 abundant protein depletion mini spin column (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 제거되었다. 간략히, 10 mL의 풀링된 혈장 샘플은 단백질 제거 스핀 칼럼(depletion spin columns) 내의 레진 슬러리에 직접 첨가된 후, 10분간 인큐베이션하고, 1,000 x g에서 2분간 원심분리되었다. 제거된 샘플은 S-Trap 스핀 칼럼(Protifi, Huntington, NY)을 사용하여 분해되었다. 샘플은 DTT에 의해 환원된 후 IAA(alkylated by iodoacetamide) 되었다. 알킬화 반응을 퀀칭한 후, 추가적인 SDS 및 인산(phosphoric acid)를 최종 5% SDS 및 1.2% 인산이 되도록 첨가하였다. 산성화된 샘플을 90% 메탄올에 녹인 100 mM TEAB와 혼합하고, S-Trap 마이크로 칼럼에 로딩하였다. 트립신을 S-Trap 마이크로 칼럼에 첨가하고, 47°C에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 용리된 펩타이드를 진공 농축기를 이용하여 농축시키고, C18 스핀 칼럼 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)을 이용하여 정제하였다.

TMT Labeling

펩타이드 샘플을 100mM TEAB에 재구성시킨 후, 제조사의 지시에 따라 TMT6plex 시약(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 라벨링하였다. 간략히, 각각의 준비된 TMT 시약을 펩타이드 샘플에 넣고, 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 8mL의 5% 하이드록실아민(hydroxylamine)을 첨가하여 퀀칭하고 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다.

각 세트의 6 TMT로 라벨링된 펩타이드 샘플들은 풀링되고 진공 농축기로 건조되었다.

중간-pH 역상 액체 크로마토그래피 분획(Mid-pH Reverse Phase Liquid Chromatography Fractionation)

풀링된 6plex TMT-라벨링된 샘플은 Agilent 1260 Infinity HPLC system (Agilent, Palo Alto, CA)을 사용하여 분리되었다. Xbridge C18 분석 칼럼 (4.6 mm Х 250 mm, 130

, 5 um) 및 가드 칼럼 (4.6 mm Х 20 mm, 130

, 5 um)은 펩타이드 분리에 사용되었다. 용매 A 및 용매 B는 각각 물(pH 7.5)에 녹인 10 mM TEAB (triethylammonium bicarbonate) 및 90% 아세토니트릴(acetonitrile, ACN, pH 7.5)에 녹인 10 mM TEAB 이었다. 펩타이드 분획화(Peptide fractionation)는 500 mL/min의 flow rate로 115분간의 농도구배에 의해 수행되었다(0% 용매 B(10 mM TEAB in 90% acetonitrile) 10 분, 0~5% 용매 B 10분, 5~35% 용매 B 60분, 35~ 70% 용매 B 15분, 70% 용매 B 10분, 70~0% 용매 B 10분). 전체 96개의 분획을 15분~110까지 매분 수집하고, 24개의 비연속 펩타이드 분획마다 풀링하였다 (즉, #1-#25-#49-#73, #2-#26-#50-#74, …, #24-#48-#72-#96).

LC-MS/MS 분석

TMT-라벨링 된 24개의 펩타이드 분획은 Ultimate 3000 RSLCnano system (Thermo Scientific)와 커플링 된 Q Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer (Thermo Scientific)로 분석되었다. 펩타이드들은 Acclaim PepMap100 C18 수지로 패킹된 트랩 칼럼 (100μm x 2cm)에 로딩된 후, 7~ 36%의 농도구배를 가진 용매 B (0.1% formic acid in ACN)에서 flow rate 0.3 mL/min로 200 분 동안 용리되었다. 상기 분석 칼럼(EASY-Spray column, 75μm x 50cm, Thermo Fisher Scientific)에 의해 분리된 용리된 펩타이드는 2.1 kV의 전자 스프레이 전압을 가진 nano-ESI source 내로 스프레이 되었다. Q Exactive Orbitrap 질량 분석기(Orbitrap mass analyzer)는 top 10 data-dependent method로 작동되었다. Full MS scan이 140,000 (at m/z 200)의 질량 분해능(mass resolution)를 가진 m/z 350-2000 범위에서 획득되었다. AGC 타겟 값은 3.00E+06 였다. 전하 상태(charge state)가 2 이상인, 10개의 가장 강렬한 피크가 정규화된 충돌 에너지가 32인, HCD(higher-energy collisional dissociation) 충돌 셀에서 조각화되었고, m/z 200에서 35,000 의 질량 분해능을 가진 Orbitrap 질량 분석기에서 탠덤 질량 스펙트럼이 획득되었다.

데이터베이스 검색

모든 원시 데이터 파일의 데이터베이스 검색은 Proteome Discoverer 2.4 소프트웨어 (Thermo Fisher Scientific)에서 수행되었다. SEQUEST-HT는 Swissprot-Human 데이터베이스에 대한 데이터베이스 검색에 사용되었다. 펩티드 식별의 거짓 발견 비율 (false discovery rate, FDR)을 평가하기 위해 상응하는 역방향 데이터베이스에 대한 데이터베이스 검색도 수행되었다.

데이터베이스 검색 매개 변수에는 전구체 이온 질량 허용 오차(precursor ion mass tolerance) 10 ppm, 단편 이온 질량 허용 오차(fragment ion mass tolerance) 0.08 Da, 카바미도 메틸 시스테인(carbamidomethyl cysteine) (+57.021 Da / C) 및 TMT 태그 (+229.163 Da / K 및 N- 말단)에 대한 고정 변형(fixed modification) 및 산화(+15.995 Da / M)를 위한 가변 변형(variable modifications)이 포함되었다. 본 발명자들은 펩티드 수준에서 1 % 미만의 FDR을 얻었고 높은 펩티드 신뢰도로 여과하였다.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

혈중 단백질 GP1BB와 TPM4의 농도는 ELISA(효소 결합 면역 침강 분석법) 방식을 이용하여 측정하였다. ELISA는 항체나 항원에 효소를 표지하여 효소의 활성을 측정하여 항원-항체 반응의 강도와 그 양을 정량적으로 측정하는 방법으로 생체시료에 들어있는 특정 단백질의 양을 측정할 수 있다. 상세하게는 GP1BB ELISA KIT(MyBioSource, catalog#: MBS945024); TPM4 ELISA KIT(MyBioSource, catalog#: MBS944560)의 안내서를 따라 실험을 수행하였다.

혈중 아밀로이드 베타 올리고머화 경향 측정

혈중 아밀로이드 베타 올리고머화 경향의 측정은 MDS-OAβ test (cat. # - MD1002PE, ㈜피플바이오)을 이용하여 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출함으로써 측정하였다. 항체로는 인간 Aβ 펩타이드 서열의 각각, 아미노산 3-8 및 4-10을 에피토프로 하는 아밀로이드 베타의 특이적 결합 항체 6E10 (Biolegend) 및 WO2-HRP (Absolute)를 사용하였다. 6E10 항체(항 Aβ 단백질, Biolegend) 30 μg을 코팅 버퍼(Sigma-Aldrich) 10 ml에 희석하고 플레이트(Nunc)에 100 μl를 각 웰에 분주 후 4℃ 냉장고에 하루 동안 반응시키고 PBS로 3번 세척한 후, D.W에 1% Block Ace가 녹여진 블록킹 버퍼 240 μl를 분주 후 실온에서 2시간 반응시켰다. 상기 플레이트는 PBS로 3번 세척하고 실온에 30분간 건조시킨 뒤 사용하였다.

샘플은 얼려진 혈장 샘플을 실온에서 녹인 후 볼텍싱(vortexing) 후 사용하였다. 혈장 25 μl에 Assay buffer 235 μl, 응집형 형성 유도 재조합 Aβ (1 ng/10 μl) 25 μl를 혼합하여 전체 285 μl가 되도록 준비하였다. 상기 응집형 형성 유도 재조합 Aβ를 스파이킹 하여 준비된 샘플은 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션 시켰다.

마지막으로 6E10 코팅 플레이트(3 μg/ml)에 혈장샘플과 표준농도(standard) 샘플을 각각 100 μl씩 분주 한 후 실온에서 1시간 반응 시켰다. 상기 플레이트를 TBST로 3번 세척하고 WO2-HRP 항체를 Dilution buffer에 50,000 ng/ml이 되도록 희석하여 100 μl씩 분주한 후 실온에서 1시간 반응시켰다. 상기 플레이트를 TBST로 3번 세척 후 TMB 또는 ECL (electrochemical luminescence) 용액을 100 μl 씩 분주 후 TMB 용액이 들어간 경우에는 15 분 뒤 50 μl의 stop solution을 추가하였다. 플레이트는 루미노미터 기기 (perkin elmer)에 삽입하여 450 nm filter 또는 발광(luminescent) 시그널을 측정하였다.

실시예 1. 연령별로 매칭된 정상군과 알츠하이머병 군의 혈장의 포괄적 프로테오믹 분석 (Comprehensive proteomic analysis of plasma in age-matched normal control and Alzheimer's disease group)

본 발명자들은 정상군과 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 환자의 진단 및 Aβ oligomerization의 변화에 관여하는 혈장 단백질을 규명하기 위해 다음과 같이 실험을 설계하였다. 우선적으로 amyloid PET scan 및 상급종합병원에서 치매를 전문으로 진료해온 의사의 판단에 의해 AD로 판단되는 임상경과를 바탕으로 정상군과 AD 환자를 모집하였다. 이중, amyloid PET scan의 결과가 negative이며 정상의 임상을 보이는 정상군 10명과 amyloid PET scan의 결과가 positive이며 AD의 임상을 보이는 AD 환자 10명을 선정하였다(표 1).

위와 같은 정상군과 AD 환자군의 혈장 샘플을 각각 채취하여 풀링하였고, 도 1과 같은 순서에 따라 프로테오믹 분석을 진행하였다. 프로테오믹 분석을 진행하기에 앞서 혈장에 존재하는 다른 풍부한 단백질의 영향을 배제하고자, 풀링된 혈장 샘플을 depletion 처리(albumin과 IgG, 또는 14개의 abundant protein을 제거)하였다. 결과적으로 정상군과 AD 환자군에서 각각 i)/ii) depletion하지 않은 샘플, iii)/iv) albumin과 IgG를 depletion한 샘플, 및 v)/vi) 14개의 abundant protein을 depletion한 샘플, 총 6개의 풀링된 플라즈마 샘플을 얻었다. 이후, 이 샘플들을 바탕으로 tandem mass　tags　(TMT)-labeled LC-MS/MS analysis를 진행하였다.

그 결과, 총 1160개의 단백질이 동정되었다. 1160개의 단백질 중, 정상군과 AD 환자군 사이에 발현량의 차이를 보이는 수십가지의 단백질들을 AD의 진단에 사용할 수 있는 신규 바이오마커의 후보물질로 선정하였고, 검증을 진행하였다.

실제 개인별 혈장 샘플을 1:10으로 희석하여 ELISA 기법으로 발현량의 차이를 확인하였다. 그 결과, 후보물질 중 일부만이 정상군과 AD 환자군에서 차이를 보였으며, 그 결과를 바탕으로 tropomyosin alpha-4 chain(TPM4), platelet glycoprotein Ib beta chain(GP1BB) 총 두 가지의 최종 후보 물질을 선정하였다.

실시예 2. 연령별 매칭된 정상군 대비 TPM4 및 GP1BB의 발현량 비교

선정된 두 개의 신규 바이오마커들의 임상적 유용성을 확인하기 위해, 검증 코호트(Validation cohort)에서 ELISA 분석을 수행하였다. 이후, ELISA 분석의 정량적 결과를 바탕으로 점 그래프(dot plot)와 ROC 곡선 분석을 수행하였다. 검증 코호트(Validation cohort)는 정상군 32명과 AD 환자군 30명으로, 앞서 풀링된 혈장 샘플과 동일한 기준으로 정상군과 AD 환자군을 선정하였으며, 풀링된 각 10명의 사람들이 각 그룹에 포함되어 있다(표 2).

TPM4는 근육 세포(muscle cell) 및 비-근육 세포(non-muscle cell)에서 액틴-결합(actin-binding)에 관여하는 단백질로, 근수축에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 기존 연구에 의하면, TPM4의 발현 정도는 AD pathology를 보이는 인간의 뇌조직이나 눈물 샘플, 또는 마우스의 뇌조직에서 증가한다. 그러나 본 연구 결과, 정상군과 비교해 AD 환자군에서 TPM4가 정량적으로 유의미하게 감소되어 있는 것을 확인하였다(도 2, a). 또한 TPM4를 이용한 ROC 곡선 분석 결과, 0.818의 AUC(area under the curve) 값이 도출되었다(도 2, b).

GP1BB는 blood와 brain에 높은 발현량을 보이는 세포막 protein으로, blood coagulation, cell adhesion, hemostasis의 생물학적 기능을 한다고 알려져 있다. GP1BB에 대한 진단용 biomarker로서의 가능성에 대한 연구는 미비한 편이며, 특히 AD 진단의 용도로서의 가능성은 제시되지 않고 있다. ELISA assay의 결과, 정상군과 비교하여 AD 환자군에서 GP1BB의 농도는 유의미하게 감소되었다(도 3, a). 또한 각 group에서 GP1BB의 정량값을 이용한 ROC curve analyses를 통해 0.635의 AUC 값을 얻게 되었다(도 3, b).

상기 결과로부터, 프로테오믹스로부터 선정된 본 발명의 TPM4와 GP1BB가 정상군과 AD 환자군을 진단할 수 있는 신규한 혈장 내 바이오마커로서의 유용하게 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 3. TPM4 및 GP1BB의 조합에 의한 AUC 분석

TPM4와 GP1BB의 AD 진단 바이오마커로서의 가능성을 확인한 후, 본 발명자들은 두 가지 후보물질을 조합하여 AD 진단의 AUC value를 향상시킬 수 있는 방안을 모색하였다. 가장 먼저, 각 개인에서 수행한 ELISA 분석 결과로부터 얻어진 두 단백질의 농도를 곱하였고(TPM4 X GP1BB), 그 결과값을 점 그래프(dot plot)와 ROC 곡선으로 분석하였다. TPM4과 GP1BB를 조합한 결과, AD 환자군이 정상군에 비해 유의미하게 감소하였다(도 4, a).

또한, TPM4와 GP1BB를 조합한 진단의 AUC 값이 0.830으로 TPM4 단독(0.818)이나 GP1BB 단독(0.635) 진단 결과보다 향상되었다 (도 4, b). 상기 결과는 TPM4와 GP1BB가 단독으로도 AD 진단을 위한 바이오마커로서 사용될 수 있지만, 나아가 두 바이오마커를 적절히 조합하면 더 좋은 정확도를 높일 수 있음을 의미한다.

실시예 3. TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합 및 OAβ 경향의 조합에 의한 AUC 분석

기존의 MDS (multimer detection system)은 혈장의 아밀로이드 베타 올리고머(OAβ)화 경향(oligomerization tendency of amyloid beta, OAβ tendency)을 반영하며, AD 환자에서 증가해 있다고 알려져 있다. 실제 검증 코호트에서 MDS를 시행한 결과 역시 정상군에 비해 AD 환자군에서 OAβ 경향이 유의미하게 증가 되어있음을 확인하였다(도 5, a). 또한 OAβ 경향 분석의 AUC 값 역시 0.817을 나타내어 MDS의 AD 진단 효용성을 다시 한번 확인할 수 있었다.

상기 OAβ 경향(OAβ ratio value로 나타냄)은 다음과 같은 방법으로 계산하였다.

식 1

OAβ 경향 (OAβ tendency) = OAβ concentration of sample/average OAβ concentration of control A&B

- 상기 OAβ 경향의 표준 곡선의 r² 값은 0.985 이상임 (r² ≥ 0.985)

- 빈(blank) 샘플의 OD 값은 0.2 미만임 (blank < 0.2)

- 여기서 상기 control A는 OAβ 가 존재하는 양성 검체이고, 상기 control B는 OAβ가 존재하지 않는 음성 검체임

- 상기 control A 또는 control B의 올리고머화 경향은 0.9보다 크고 2보다 작음 (0.9 < OAβ tendency of control A or B < 2)

[즉, OAβ concentration of Control A or B)/(Average OAβ concentration of Control A&B)의 값이 0.9보다 크고 2보다 작음]

상기 결과로부터, 본 발명자들은 AD 진단의 AUC 값을 더욱 향상시키기 위하여 새롭게 발굴한 바이오마커와 MDS와의 적절한 조합을 시도하였다.

TPM4 및 OAβ 경향의 조합

가장 먼저 OAβ 경향과 TPM4를 조합하였다. 정상군 대비 AD 환자군에서 OAβ 경향은 높은 양상을 보이고 TPM4는 낮게 정량되기 때문에, OAβ 경향을 TPM4 농도로 나누어 보정해주었다. 그 결과, 'OAβ 경향/ TPM4 농도' 값이 AD 환자군에서 현저하게 증가되는 것을 확인하였으며(도 6, a), ROC 곡선 분석을 통해 AUC 값이 0.883으로 MDS 단독(0.817)이나 TPM4 단독(0.818)보다 향상되었음을 확인할 수 있었다(도 6, b)

GP1BB 및 OAβ 경향의 조합

이어서 OAβ 경향을 GP1BB 농도로 나누어 보정하였다. 그 결과, 'OAβ 경향 / TPM4 농도'와 마찬가지로 'OAβ 경향 / GP1BB 농도' 역시 AD 환자군에서 정상군에 비해 유의미하게 증가되어 있었으며(도 7, a), AUC 값 또한 0.851로 단독 진행시(MDS; 0.817, GP1BB; 0.830)보다 향상되었음을 알 수 있었다(도 7, b).

마지막으로, MDS로 얻어진 OAβ 경향과 새롭게 발굴한 TPM4, 및 GP1BB를 모두 조합하였다. 'OAβ 경향 / (TPM4 농도 X GP1BB 농도)'의 값을 바탕으로 점 그래프(dot plot)과 ROC 곡선 분석을 진행하였다. 'OAβ 경향 / (TPM4 농도 X GP1BB 농도)' 값은 정상군에서 0값에 수렴할 정도로 작은 값으로 얻어지는 것에 비해 AD 환자군에서는 현저하게 높게 유지됨을 확인할 수 있었다(도 8, a). 이 값을 바탕으로 얻은 ROC 곡선 분석의 AUC 값으로는 1.000이 도출되었다(도 8, b).

상기 결과로부터, 본 발명자들은 TPM4와 GP1BB가 AD 진단을 위한 혈장 바이오마커로서 단독으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라, TPM4와 GP1BB 사이의 조합, TPM4, GP1BB 및 MDS와의 적절한 조합을 통해 AD 진단의 정확도를 향상시킬 수 있는 중요한 요소가 될 수 있음을 확인하였다.

현재 AD의 확진은 사후 뇌 조직을 이용한 병리학적 검사방법을 통하여 노인성 반(senile plaque)과 신경섬유성 엉킴(neurofibrillary tangle, NFT) 확인 시에만 가능하며, 임상에서 AD 진단은 개인병력 검토, 건강진단, 정신상태 검사, 신경계 검사 등의 방법들을 통하여 이루어지고 있다. 하지만 이러한 기존의 진단 방법들은 AD의 근본적인 치료기술 개발에 필요한 조기진단, 또는 치매를 일으키는 다른 질병과의 구분이 어려울 뿐만 아니라 치료법의 효과측정이 제한적이라는 한계가 있다. 따라서 생물학적 바이오마커 분석을 통해 AD 진단의 특이성과 정확도를 높이기 위한 노력이 계속되고 있으며, 뇌척수액과 혈액에서의 접근이 가장 주목받고 있다. 그 중에서도 혈액에서의 생물학적 바이오마커의 개발은 뇌척수액에 비해 저비용과 비침습성이라는 강점을 가지고 있다는 점에서 관심이 집중되고 있다.

출원인이 이전에 개발한 MDS(Multimer Detection System) 기술은 AD의 병인이 되는 아밀로이드 베타 올리고머(Amyloid beta oligomer) 형태만 선택적으로 측정 가능하다. 그러나, MDS로 측정한 OAβ 경향은 정상군에 비해 AD 환자군에서 통계적으로 유의한 증가를 보였으며, 이는 뇌척수액 바이오마커, PIB PET 모두와 연관성을 보임을 확인하였다. 따라서 MDS로 측정한 AD 환자군과 정상군의 OAβ 경향의 차이는 AD 진단에 도움을 주는 혈액 기반 바이오마커로서의 효용성이 높다고 할 수 있다.

본 발명자들은 아밀로이드 PET 스캔과 임상을 기준으로 모집한 정상군과 AD 환자군으로부터 얻은 혈장 샘플을 이용하여 두 그룹 간의 차이를 야기하는 혈장 단백질을 규명하고자 하였다. 각 그룹에서 얻은 10개씩의 혈장 샘플을 풀링하고 혈장 내 풍부하게 존재하는 단백질의 결손 (plasma abundant protein depletion) 여부에 따라 분류하여 TMT-labeled LC-MS/MS를 진행하였다. 그 결과로 얻은 1160개의 단백질 중, AD 환자군에서 정상군에 비해 유의하게 높거나 낮은 단백질들을 AD 진단의 바이오마커 후보물질로 선정하였다. 이후, 검증 과정을 거쳐 TPM4와 GP1BB를 AD 진단이 가능한 신규한 바이오마커의 최종 후보물질로 선정하였다. 검증 코호트(Validation cohort)에서 ELISA 분석을 통해 TPM4와 GP1BB의 농도를 측정한 결과, 정상군에 비해 AD 환자군에서 통계적으로 유의하게 증가되어 있었으며, AUC value가 각각 0.818, 0.635를 나타냈다(표 3).

이후, AD 진단의 유효성을 높이기 위해 TPM4, GP1BB를 MDS로 측정한 OAβ 경향과 조합하는 과정을 진행하였다. 기본적으로 TPM4와 GP1BB를 곱한 값은 AUC가 0.830으로 각 바이오마커의 단독 진단 AUC 보다 향상되었다. 이어서 MDS로 측정한 OAβ tendency를 TPM4와 GP1BB로 각각 나누어 준 결과, AUC가 0.883, 0.851로 단독 시행하였을 때보다 향상되었음을 확인하였다. 마지막으로 MDS로 측정한 OAβ tendency를 TPM4 농도와 GP1BB 농도를 곱한 값으로 나누어준 결과, AUC가 1.000이 도출되었다.

종합하면, 본 발명은 아밀로이드 PET 스캔과 임상이라는 엄격한 기준에 의해 얻은 정상군과 AD 환자군의 혈장 프로테옴 프로파일링(plasma proteome profiling)을 통해 AD 환자의 진단을 위한 새로운 바이오마커로 TPM4, 및 GP1BB를 규명했다는 점에서 우선적인 의의를 가진다. 또한 선정된 TPM4, GP1BB가 단독으로 사용하여도 AD 진단이 가능한 신규 바이오마커임을 확인하였을 뿐만 아니라, 이들의 적절한 조합 역시 AD 진단의 유효성을 높일 수 있음을 입증하였다. 더욱이 기존 MDS 기술을 보다 향상시킬 수 있는 보조적인 바이오마커로서의 가능성도 제시하였다.

Claims (13)

1. 트로포마이오신 알파-4 사슬(tropomyosin alpha-4 chain, TPM4), 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(platelet glycoprotein Ib beta chain, GP1BB), 또는 이들의 조합을 검출하기 위한 제제를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아밀로이드 베타 올리고머를 검출하기 위한 제제를 추가적으로 포함하는 것인, 알츠하이머병의 진단용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 타겟 결합 단백질, 또는 압타머인, 알츠하이머병의 진단용 조성물.
   
4. 제2항에 있어서, 상기 제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 타겟 결합 단백질, 또는 압타머인, 알츠하이머병의 진단용 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 알츠하이머병 진단용 키트.
   
6. 다음 단계를 포함하는 알츠하이머병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
   개체로부터 분리한 시료에서 트로포마이오신 알파-4 사슬(tropomyosin alpha-4 chain, TPM4), 혈소판 당단백질 Ib 베타 사슬(platelet glycoprotein Ib beta chain, GP1BB), 또는 이들의 조합의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   알츠하이머병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 단계.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 개체로부터 분리한 시료에서 측정된 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 발현 수준이 참조 시료에서 측정된 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 발현 수준과 비교하여 더 낮은 경우, 알츠하이머병 환자일 가능성이 더 높다는 것을 나타내는 것인, 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 TPM4, GP1BB, 또는 이들의 조합의 발현 수준은 혈장내 상기 단백질의 농도로 나타낸 것인, 방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 방법은 상기 개체로부터 분리한 시료에서 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 개체로부터 분리한 시료에서 측정된 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준이 참조 시료에서 측정된 아밀로이드 베타 올리고머의 수준과 비교하여 더 높은 경우, 알츠하이머병 환자일 가능성이 더 높다는 것을 나타내는 것인, 방법.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준은 다음 식에 의해 도출되는 아밀로이드 베타 올리고머화 경향(OAβ tendency)인, 방법:
    식 1
    아밀로이드 베타 올리고머화 경향(OAβ tendency) = OAβ concentration of sample/average OAβ concentration of control A&B
    - 여기서 control A는 OAβ 가 존재하는 양성 검체이고, control B는 OAβ가 존재하지 않는 음성 검체임.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 방법은 개체로부터 분리한 시료 및 참조 시료에서 측정된 TPM4, GP1BB 또는 이들의 조합의 발현 수준, 및 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준을 각각 측정하고, 다음 식 2에 의해 도출되는 값(V2)을 비교하여 더 낮은 경우, 알츠하이머병 환자일 가능성이 더 높다는 것을 나타내는 것인, 방법:
    식 2
    V2 = TPM4 발현 수준 X GP1BB 발현 수준.
    
13. 제9항에 있어서, 상기 방법은 개체로부터 분리한 시료 및 참조 시료에서 측정된 TPM4, GP1BB 또는 이들의 조합의 발현 수준; 및 아밀로이드 베타 올리고머의 발현 수준을 각각 측정하고, 다음 식 3 내지 5 중 어느 하나의 식에 의해 도출되는 값(V3, V4, 또는 V5)을 비교하여 더 높은 경우, 알츠하이머병 환자일 가능성이 더 높다는 것을 나타내는 것인, 방법:
    식 3
    V3 = 아밀로이드 베타 올리고머화 경향/TPM4 발현 수준;
    식 4
    V4 = 아밀로이드 베타 올리고머화 경향/GP1BB 발현 수준; 및
    식 5
    V5 = 아밀로이드 베타 올리고머화 경향/(TPM4 발현 수준 X GP1BB 발현 수준,
    단, 상기 아밀로이드 베타 올리고머화 경향은 하기 식 1에 의하여 도출됨:
    식 1
    아밀로이드 베타 올리고머화 경향(OAβ tendency) = OAβ concentration of sample/average OAβ concentration of control A&B
    - 여기서 상기 control A는 OAβ 가 존재하는 양성 검체이고, 상기 control B는 OAβ가 존재하지 않는 음성 검체임.
    

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