JP2018163071A - 関節リウマチに関するペプチドマーカー - Google Patents
関節リウマチに関するペプチドマーカー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018163071A JP2018163071A JP2017060975A JP2017060975A JP2018163071A JP 2018163071 A JP2018163071 A JP 2018163071A JP 2017060975 A JP2017060975 A JP 2017060975A JP 2017060975 A JP2017060975 A JP 2017060975A JP 2018163071 A JP2018163071 A JP 2018163071A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- seq
- amino acid
- acid sequence
- sequence represented
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
【解決手段】被験者における関節リウマチの検出方法は、被験者の生物試料中の、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチドを測定することを含む。
【選択図】 図2
Description
ヒトのゲノム配列の全容が解明してから10年以上経過し、数十万人規模のゲノム情報が得られ、関節リウマチ領域でも、国際共同研究コンソーシアムによるゲノムワイド関連解析(GWAS)が行われ、42の新規関節リウマチ感受性遺伝子領域を含む計101領域が同定された。しかし、関節リウマチはヘテロな原因により生じる多遺伝子疾患であり、転写翻訳やエピジェネティクスの影響もあり、遺伝子データのみでは、診断や疾患活動性指標や真の原因分子の探索は容易ではない。そこで、ポストゲノム時代として、蛋白、ペプチドが、疾患バイオマーカーに応用が期待される。
すなわち、本発明によれば、以下の態様が提供される。
前記取得したデータを、前記1種又は2種以上のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用し、被験者における関節リウマチの罹患可能性の予測値を求める工程とを含む方法。
1.患者及び血液採取
京都府立医科大学にて、関節リウマチに罹患した患者(n=26名)にトシリツマブ(tocilizumab)を投与し、トシリツマブの投与前(ベースライン)、投与後4週間、投与後1年の時点(ポイント)で1.5μLの血清を採取した。採取した血液を、3,000rpmで10分間室温にて遠心分離し、血清を得た。上清を使用するまで-80℃で分けて保存した。
Ann Rheum Dis. 2004 Mar; 63(3):221-5に従い、患者の各ポイントでの臨床疾患活動性指数(Clinical Disease Activity Index, CDAI)の改善率を算出した(表2)。
血清中の質量分析によるペプチド解析を、ペプチドームプロファイリングの迅速定量法である、ワンステップの直接転写技術のBLOTCHIP(登録商標)質量分析により行った(Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009;379(1):110-4)。
まず、血清サンプルをドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)に供し、ペプチドをタンパク質と分離した。次に、ゲル中のペプチドをBLOTCHIP(登録商標)(株式会社プロトセラ、尼崎市所在)に電気転写した。転写終了後、チップの表面を超純水でリンスし、BLOTCHIP(登録商標)に直接マトリックス(α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸, Sigma-Aldrich Co., アメリカ合衆国ミズーリ州)を塗布後、UltraFlexII TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics社製、アメリカ州マサチューセッツ州)の反射モードで、Proteomics 11:2727-2737.に記載された通りに質量分析を行い、ペプチドプロファイルを得た。
サンプルはBLOTCHIP(登録商標)質量分析により4回繰り返し解析した。より統計学的に有意なピークを見出すために、4つのデータを独立データとして使用し、解析ソフトClinProTools 2.2 (Bruker Daltonics社製)を使用してウィルコクソン検定のp値を計算し、p値が0.05以下の場合に有意差ありとみなした。
統計解析ソフトR(R Core Team (2013). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL http://www.R-project.org/.)によりウィルコクソン検定のp値を計算するために、一つのサンプル当たりの4つのデータの平均値を用いてペプチドの診断性能を評価し、診断性能の高い有用なバイオマーカーペプチドを発見した。モデルの構築には統計解析ソフトR(R Core Team (2013)を使用した。
構築したモデルの診断能の評価のためにROC分析を実施した。Rのパッケージである”Epi パッケージ“(A package for statistical analysis in epidemiology、Version 1.149、http://cran.r-project.org/web/packages/Epi/index.html)を用いた。AUCはROC曲線から計算した。診断のための最適カットオフ値は、Cancer 1950;3:32-5のYouden’s indexに従って決定でき、95%信頼区間は、ノンパラメトリックなブートストラップ抽出を用いて推定した。
各標的ペプチドを含む血清を、その同定のために採取した。ペプチドは、Sep-Pak C18固相抽出カートリッジ(Waters Corporation、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード)を用いて、0.1%トリフルオロ酢酸を含む水に80%v/v アセトニトリル(ACN)で抽出した。溶出液をCC-105 遠心濃縮器(株式会社トミー精工, 東京)を用いて100μL以下に濃縮した。次に溶液を0.065% TFAを含む2%v/v CAN水溶液400μL(溶離液Aと称する)に希釈し、C18シリカカラム(COSMOSIL(登録商標) 5C18-AR-II)(ナカライテスク株式会社、京都)を装備したAEKTA精製装置(GE Healthcare UK Ltd, 英国バッキンガムシャー州)にかけた。溶出液を、溶離液Aに対し0.05% TFAを含む80%v/v CANの水溶液で1.0mL/分の流速で0-100%の線形勾配により20個の画分(各1mL)に分けた。各画分をCC-105遠心濃縮器で10μL以下に濃縮し、ペプチドの配列をMALDI-TOF/TOF(UltraFlex II TOF/TOF)及びLC-MS/MS(Q-Exactive;Thermo Fisher Scientific Inc, アメリカ合衆国マサチューセッツ州ワルサム)を用いて分析した。
上記4.で発見され、アミノ酸配列が決定されたペプチドの濃度を後に述べる多変量ロジスティック回帰法に適用することにより算出した予測値の診断性能を、異なるコホート、85%改善(N=10), 70%改善(N=17),50%改善(N=19)を対象に、安定同位体希釈選択反応モニタリング法(stable isotope dilution-selected reaction monitoring-MS technology:SID-SRM-MS 法)により検証した。アミノ酸構成原子の一部を質量数の大きな原子(安定同位体)に置換させて配列番号1〜5で表されるアミノ酸配列を有する5種類のペプチドを合成し、98%純度品を濃度測定時の内部標準品として使用した。Xevo(商標)TQ-S マイクロ質量分析計に結合したACQUITY UPLC I-Class システム(Waters社)を使用して、30マイクロリットルの患者血清に、5種類の既知濃度の安定同位体標識内部標準ペプチドを添加し、Bioanalysis 2015;7: 2991-3004. doi: 10.4155/bio.15.222に従い、一度に5種類のペプチドの血中濃度を測定した。
1.関節リウマチバイオマーカーペプチドの発見
表2においてトシリツマブの1年投与により関節リウマチが寛解した7検体の血清のペプチド解析をBLOTCHIP(登録商標)質量分析により行った。各ペプチドームプロファイルより得られた質量スペクトルのデータをデータベースに保存した。すべてのMS測定が完了した後、解析ソフトFlexAnalysis2.4を用いて、2タイムポイント(Baseline 対 1 year)でのディファレンシャル解析を行った。その結果、m/z 1,500-20,000の領域に63個のピークが確認された(p<0.05)。統計解析により得られたすべてのピークの形状を目視により精査し、MALDI-MS測定にランダムに現れるノイズ、弱いピーク、及び微かなピークを除外した。これにより、25個のシャープなピークが得られた。
逆相クロマトグラフィで部分的に精製した血清ペプチドによりMALDI-TOF/TOF及びLC-MS/MSペプチド配列決定分析を行った。25個のピークのうち5個のペプチドを最終的に同定した(表3)。m/z 1616.66のペプチド(PDA018)はトロンビンによりフィブリノーゲンのα鎖から放出されたフィブリノペプチドAであることが明らかとなった。2つのペプチドであるm/z 2659.26(PDA063)及び3277.46(PDB012)はフィブリノーゲンα鎖の中間領域を異なる部位でタンパク質分解したものである。m/z 2755.52のペプチド(PDA066)はα−2−HS−糖タンパク質の部分配列ペプチドである。m/z 3949.98のペプチド(PDB001)は血液凝固第XIII因子(酵素前駆体)がトロンビンにより活性化されるときに切断されて生成した、活性化ペプチドである。m/z 1616.66のペプチドは 3番目のSerの位置でリン酸化により修飾されており、m/z 2755.52のペプチドは18番目のCysの位置で酸化されており、m/z 3277.46のペプチドは28番目のMetの位置で酸化されており、m/z 3949.98のペプチドは1番目のSerの位置でN−アセチル化により修飾されていた。ディファレンシャル解析は、基準値(baseline)から調製した患者血清(N = 7)と、トシリツマブによる処理の1年後の同じ患者の血清(N = 7)との間で行った。
上記の番号1〜5のペプチドのアミノ酸配列を当業者に周知のペプチド配列決定法により決定した(表4)。
表5に示されるように、発見されたバイオマーカー候補ペプチドは、以前からリウマチ検査に使用されてきた検査項目と高い相関を示した。枠で囲んだ部分はR統計学的環境ソフトウェアを用いてMann-Whitney's U-検定により統計学的有意 (p<0.05 )であることが示された。とりわけ、C-反応性タンパク質(CRP)、赤血球沈降速度(ESR)、圧痛関節数(TJC)、腫脹関節数(SJC)、CDAI、DAS28-ESR、DAS28-CRP、血小板数(Plt)、血清総蛋白(TP)、アルブミン(Alb)、クレアチンキナーゼ(CK)値とは有意な相関が示された。
ボランティアより採取した血清を用いて、ペプチド1〜5の5つのペプチドの血中濃度をSID-SRM-MSにより8回測定した(表6)。
Claims (14)
- 被験者の生物試料中の、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチドを測定することを含む、該被験者における関節リウマチの検出方法。
- 被験者の生物試料中の、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される2種又は3種のペプチドを測定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、汗、涙液、眼房水、硝子体液及びリンパ液からなる群より選択される体液からなる、請求項1又は2に記載の方法。
- 生体試料を質量分析にかけることを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択されるペプチドを特異的に認識する抗体を用いる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関節リウマチの検出は、関節リウマチの判定、関節リウマチの予防効果の判定、関節リウマチの治療効果の判定、治療薬が奏効する関節リウマチ患者の判定、個々の関節リウマチ患者に奏効する治療薬の判定、関節リウマチの診断のための検査方法、又は関節リウマチの治療のための検査方法である請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチド又はそれらのフラグメントイオンが安定同位体で標識された内部標準品を備える関節リウマチの検出キット。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチドに対する抗体を含む関節リウマチの検出キット。
- 安定同位体で標識された、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチド又はそれらのフラグメントイオンを含む関節リウマチの検出剤。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチドに対する抗体を検出試薬として含む関節リウマチの検出剤。
- 被験者における関節リウマチの罹患可能性を判定するための、コンピュータにより実行される方法であって、被験者の生物試料中の、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチドについての定量的データを取得する工程と、
前記取得したデータを、前記1種又は2種以上のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用し、被験者における関節リウマチの罹患可能性の予測値を求める工程とを含む方法。 - 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される2種以上のペプチドの定量的データを取得し、前記取得したデータを、前記2種以上のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用する請求項11に記載の方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチドの、関節リウマチを検出するためのマーカーとしての使用方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチドの、治療薬へのリウマチ患者の応答性を検出するマーカーとしての使用方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017060975A JP2018163071A (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 関節リウマチに関するペプチドマーカー |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017060975A JP2018163071A (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 関節リウマチに関するペプチドマーカー |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018163071A true JP2018163071A (ja) | 2018-10-18 |
Family
ID=63860191
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017060975A Pending JP2018163071A (ja) | 2017-03-27 | 2017-03-27 | 関節リウマチに関するペプチドマーカー |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2018163071A (ja) |
-
2017
- 2017-03-27 JP JP2017060975A patent/JP2018163071A/ja active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8911960B2 (en) | Method for identifying idiopathic pneumonia progression by measuring the level of mannose-binding protein C | |
EP2851688B1 (en) | Use of glycoprotein C4BPA as marker for detecting pancreatic cancer | |
JP2011501133A (ja) | 心血管または脳血管主要有害事象を検出するための方法 | |
JP2011501133A5 (ja) | ||
SG173310A1 (en) | Apolipoprotein fingerprinting technique | |
WO2011136080A1 (ja) | 動脈硬化の評価法 | |
JP5363481B2 (ja) | 早産の危険性を評価するためのバイオマーカーの同定および定量化 | |
WO2017150681A1 (ja) | シグナルペプチドを指標にした筋萎縮性側索硬化症の診断方法 | |
JP5322556B2 (ja) | 新規非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法 | |
Snipsøyr et al. | Towards identification of novel putative biomarkers for infective endocarditis by serum proteomic analysis | |
KR20130010106A (ko) | 조산의 위험을 평가하기 위한 바이오마커의 확인 및 정량화 | |
WO2017150680A1 (ja) | シグナルペプチドを指標にしたアルツハイマー病の診断方法 | |
JP2015108515A (ja) | 大腸癌の診断のための検査方法 | |
JP7336097B2 (ja) | 乳がんに関するペプチドマーカー | |
JP2018163071A (ja) | 関節リウマチに関するペプチドマーカー | |
JP7457300B2 (ja) | 神経変性疾患の診断用ペプチドマーカー | |
JP2014020941A (ja) | 大腸癌のマーカーおよびそれを用いた診断 | |
JP7300660B2 (ja) | 大腸がんの検出方法 | |
CN113287019A (zh) | 亚临床动脉粥样硬化的生物标志物 | |
JP6755649B2 (ja) | 虚血性疾患の診断マーカー | |
JP2016148623A (ja) | 大腸がんの検出方法 | |
EP2491402B1 (en) | Blood coagulation status measurement in saliva | |
JP2019152671A (ja) | 大腸がんの検出方法 | |
JPWO2017069135A1 (ja) | 冠動脈疾患の診断マーカー | |
JP2020016453A (ja) | 敗血症に関連する疾患のペプチドマーカー |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A80 | Written request to apply exceptions to lack of novelty of invention |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A80 Effective date: 20170407 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200116 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20201023 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201104 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201215 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210202 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20210824 |