JP6755649B2 - 虚血性疾患の診断マーカー - Google Patents
虚血性疾患の診断マーカー Download PDFInfo
- Publication number
- JP6755649B2 JP6755649B2 JP2015199070A JP2015199070A JP6755649B2 JP 6755649 B2 JP6755649 B2 JP 6755649B2 JP 2015199070 A JP2015199070 A JP 2015199070A JP 2015199070 A JP2015199070 A JP 2015199070A JP 6755649 B2 JP6755649 B2 JP 6755649B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- acid sequence
- seq
- sequence represented
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000003550 marker Substances 0.000 title description 15
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 276
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 103
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 102
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 93
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 81
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 81
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 31
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 claims description 30
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 28
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 25
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 claims description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 11
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 claims description 10
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 claims description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 6
- 206010003658 Atrial Fibrillation Diseases 0.000 claims description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000006193 Pulmonary infarction Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000007575 pulmonary infarction Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 14
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 130
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 22
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 11
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000000091 biomarker candidate Substances 0.000 description 8
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 7
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000002586 coronary angiography Methods 0.000 description 5
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 5
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 5
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 4
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 102400000524 Fibrinogen alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 101710137044 Fibrinogen alpha chain Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000011241 immuno-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 238000013513 substance screening Methods 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N Apixaban Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1C(C(=O)N(CC2)C=3C=CC(=CC=3)N3C(CCCC3)=O)=C2C(C(N)=O)=N1 QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000007718 Stable Angina Diseases 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 102000004903 Troponin Human genes 0.000 description 2
- 108090001027 Troponin Proteins 0.000 description 2
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 2
- 229940047562 eliquis Drugs 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 2
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000000074 matrix-assisted laser desorption--ionisation tandem time-of-flight detection Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010202 multivariate logistic regression analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100533230 Caenorhabditis elegans ser-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 229910005540 GaP Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001218 Gallium arsenide Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000004186 Pulmonary Heart Disease Diseases 0.000 description 1
- 229910004541 SiN Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000013394 Troponin I Human genes 0.000 description 1
- 108010065729 Troponin I Proteins 0.000 description 1
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 1
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000001567 anti-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000013130 cardiovascular surgery Methods 0.000 description 1
- 238000003163 cell fusion method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000009207 exercise therapy Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007941 film coated tablet Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910052732 germanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002534 molecular mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108010091748 peptide A Proteins 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007694 polyacrylamide gel isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003746 solid phase reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000007940 sugar coated tablet Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 238000007740 vapor deposition Methods 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、ペプチドマーカーを用いた血液凝固反応を随伴する疾患の検出方法に関し、より詳細には、ペプチドマーカーを用いた血液凝固反応を随伴する疾患の判定、予防効果の判定、治療効果の判定、早期診断のための検査方法、早期治療のための検査方法、及び物質のスクリーニング方法に関する。
心疾患は近年日本人の死因の第２位であり、心臓病の死亡原因の約８割は虚血性心疾患であり、その患者数は80万人を超え増加傾向にある。急性冠症候群（ＡＣＳ）は致死的な冠動脈疾患であるため、正確かつ迅速な診断を得ることが重要である。さらに、最も急性の合併症である不安定性狭心症（ＵＡＰ）と急性心筋梗塞（ＡＭＩ）の基礎には血栓が存在すると認識されている。歴史的には、クレアチンキナーゼアイソザイムと比較して優れた診断および予後性能を示す初期の研究後、ＡＣＳの罹患が疑われるＡＣＳ患者の評価には心筋トロポニンＴ及びＩが代表的な基準として採用されており、臨床の場面では高感度トロポニンＴまたはＩを測定することも可能である。
しかしながら、これらの高感度トロポニンＴまたはＩの特異度がそれぞれ４１％及び４６％と低く（非特許文献１）、ＡＣＳを検出するための高い陽性予測値（ＰＰＶ）を有するバイオマーカーが強く求められている。
一方で、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF/MS)等の質量分析の進歩により小サイズのペプチドが検出できるようになっているが（非特許文献２）、大半のペプチド解析では質量分析の前に血漿タンパク質の大部分を除去する必要があり、この操作により内因性ペプチドも除かれ、有用なバイオマーカー候補ペプチドがこれまでに見落とされている（非特許文献３，４）。
BMC Medical Genomics 2013, 6:16
Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988;2(8):151-153
Clin. Chem. 2005;51(10):1933-45
Proteomics. 2005;5(18):4713-8
本願発明者らはMALDI-TOF/MSに、ペプチドの新たなターゲットプレートとしてBLOTCHIP(登録商標)を用い、一つのステップでペプチドを直接転写できる技術の開発に成功した。この方法によるとペプチドが主要な血液タンパク質から効果的に分離されるため、アルブミン等によるサンプルの前処理が不要であり、従来は検出できなかった低濃度（フェムトモル〜ピコモル）のペプチドも検出できる。
本発明の目的は、被験者の生物試料中のバイオマーカー候補ペプチドを同定かつ確認し、かかる候補ペプチドの血液凝固反応を随伴する疾患、特にＡＣＳ等の血液凝固反応を随伴する疾患の検出のための有用性を実証することにある。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、ＡＣＳを含む血液凝固反応を随伴する疾患の被験者の血清サンプルを調べたところ、６種類のバイオマーカー候補ペプチドを発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドを測定することを含む、該被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の検出方法。
［２］被験者の生物試料中の、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２種又は３種のペプチドを測定することを含む、項１に記載の方法。
［３］前記血液凝固反応を随伴する疾患が、急性冠症候群、深部大腿静脈血栓症、弁膜症、脳梗塞、肺梗塞、固形がん、播種性血管内凝固症候群(ＤＩＣ)、心房細動、心筋梗塞、狭心症、または無症候性心筋虚血である項１または２に記載の方法。
［４］前記血液凝固反応を随伴する疾患が、虚血性心疾患、心房細動、または弁膜症である項１または２に記載の方法。
［５］前記虚血性心疾患が、心筋梗塞または狭心症である項４に記載の方法。
［６］前記血液凝固反応を随伴する疾患が、急性冠症候群である項１または２に記載の方法。
［７］前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［８］生体試料を質量分析にかけることを含む、項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
［９］配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［１０］配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドに対する抗体を含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出キット。
［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドに対する抗体を検出試薬として含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出剤。
［１２］被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性を判定するための、コンピュータにより実行される方法であって、被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドについての定量的データを取得する工程と、前記取得したデータを、前記１種又は２種以上のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用し、被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性の予測確率を求める工程と
を含む方法。
［１３］配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２種以上のペプチドの定量的データを取得し、前記取得したデータを、前記２種以上のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用する項１２に記載の方法。
［１４］配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
［１］被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドを測定することを含む、該被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の検出方法。
［２］被験者の生物試料中の、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２種又は３種のペプチドを測定することを含む、項１に記載の方法。
［３］前記血液凝固反応を随伴する疾患が、急性冠症候群、深部大腿静脈血栓症、弁膜症、脳梗塞、肺梗塞、固形がん、播種性血管内凝固症候群(ＤＩＣ)、心房細動、心筋梗塞、狭心症、または無症候性心筋虚血である項１または２に記載の方法。
［４］前記血液凝固反応を随伴する疾患が、虚血性心疾患、心房細動、または弁膜症である項１または２に記載の方法。
［５］前記虚血性心疾患が、心筋梗塞または狭心症である項４に記載の方法。
［６］前記血液凝固反応を随伴する疾患が、急性冠症候群である項１または２に記載の方法。
［７］前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［８］生体試料を質量分析にかけることを含む、項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
［９］配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
［１０］配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドに対する抗体を含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出キット。
［１１］配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドに対する抗体を検出試薬として含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出剤。
［１２］被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性を判定するための、コンピュータにより実行される方法であって、被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種又は２種以上のペプチドについての定量的データを取得する工程と、前記取得したデータを、前記１種又は２種以上のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用し、被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性の予測確率を求める工程と
を含む方法。
［１３］配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２種以上のペプチドの定量的データを取得し、前記取得したデータを、前記２種以上のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用する項１２に記載の方法。
［１４］配列番号１〜６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
本発明によれば、血液凝固反応を随伴する疾患、特には急性冠症候群を迅速かつ極めて高い信頼性で判定できるため、該疾患の判定、予防効果の判定、治療効果の判定、早期診断、早期治療のための検査方法、及び物質のスクリーニング方法が可能となる。
本発明は、新規かつ有用な血液凝固反応を随伴する疾患の検出マーカーペプチド（以下、包括して「本発明のペプチド」という場合もある）を提供する。
なお、本明細書において、血液凝固反応を随伴する疾患の「検出」には、血液凝固反応を随伴する疾患の判定、予防効果の判定、治療効果の判定、診断（特には早期診断）のための検査方法、及び治療（特には早期治療）のための検査方法が含まれる。血液凝固反応を随伴する疾患の「判定」には、血液凝固反応を随伴する疾患の有無を判定することのみならず、予防的に血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性を判定することや、治療後の血液凝固反応を随伴する疾患の予後を予測すること、及び血液凝固反応を随伴する疾患の治療剤の治療効果を判定することが含まれる。物質のスクリーニング方法には、血液凝固反応を随伴する疾患の「検出」、「判定」及び「治療」に有用な物質のスクリーニング方法が含まれる。
本明細書において、「罹患」には「発症」が含まれる。
本明細書において、「治療」とは、疾患もしくは症状の治癒又は改善、或いは症状の抑制を意味し、「予防」を含む。「予防」とは、疾患又は症状の発現を未然に防ぐことを意味する。
配列番号１から６で表されるアミノ酸配列解析結果から、これらのペプチドは、血液凝固第I因子（フィブリノーゲン）と血液凝固第XIII因子（γグルタミルトランスフェ
ラーゼ）の部分配列であることが判明した。血液凝固第XIII因子は血液凝固カスケードの最終段階で、可溶性フィブリンクロットを不溶性のフィブリンクロット（血餅）に転換するために、可溶性フィブリン分子上にあるリジン残基のアミノ基とグルタミン酸残基のカルボキシル基を脱水重合させる酵素であり、この基質タンパク質と酵素タンパク質断片がＡＣＳで減少したことは、これら両タンパクが血液凝固反応の進行の結果消尽したことを強く示唆した。このようなＡＣＳ発病により両凝固因子とりわけ血液凝固第XIII因子が激減するデータは今までに存在しなかった。以上の成績と理論から、本特許がカバーするペプチドとそれを使用した検査、判定、診断、診察、物質スクリーニング法は、血液凝固反応を随伴する疾患（血液凝固反応が原因となるＡＣＳ、深部大腿静脈血栓症等の疾患、疾患の発症に伴い血液凝固反応が開始される弁膜症、脳梗塞、肺梗塞等の疾患、上記の心室及び／又は心房への血液供給が減少している心疾患、フィブリンクロットの生成を伴う固形がん、及び凝固反応と線溶反応が交互あるいは同時に進行する播種性血管内凝固症候群(ＤＩＣ)等）に遍く適応可能である。本明細書において、心疾患には心室及び／又は心房への血液供給が減少している心疾患には、例えば虚血性心疾患、心房細動、および弁膜症が含まれ、虚血性心疾患には心筋梗塞、狭心症、および無症候性心筋虚血が含まれる。狭心症には不安定狭心症、安定狭心症、および冠攣縮性狭心症が含まれる。急性冠症候群は、虚血性心疾患のうち、急性心筋梗塞および不安定狭心症のうちの少なくともいずれか一方の症状（発症を含む）を含む。
ラーゼ）の部分配列であることが判明した。血液凝固第XIII因子は血液凝固カスケードの最終段階で、可溶性フィブリンクロットを不溶性のフィブリンクロット（血餅）に転換するために、可溶性フィブリン分子上にあるリジン残基のアミノ基とグルタミン酸残基のカルボキシル基を脱水重合させる酵素であり、この基質タンパク質と酵素タンパク質断片がＡＣＳで減少したことは、これら両タンパクが血液凝固反応の進行の結果消尽したことを強く示唆した。このようなＡＣＳ発病により両凝固因子とりわけ血液凝固第XIII因子が激減するデータは今までに存在しなかった。以上の成績と理論から、本特許がカバーするペプチドとそれを使用した検査、判定、診断、診察、物質スクリーニング法は、血液凝固反応を随伴する疾患（血液凝固反応が原因となるＡＣＳ、深部大腿静脈血栓症等の疾患、疾患の発症に伴い血液凝固反応が開始される弁膜症、脳梗塞、肺梗塞等の疾患、上記の心室及び／又は心房への血液供給が減少している心疾患、フィブリンクロットの生成を伴う固形がん、及び凝固反応と線溶反応が交互あるいは同時に進行する播種性血管内凝固症候群(ＤＩＣ)等）に遍く適応可能である。本明細書において、心疾患には心室及び／又は心房への血液供給が減少している心疾患には、例えば虚血性心疾患、心房細動、および弁膜症が含まれ、虚血性心疾患には心筋梗塞、狭心症、および無症候性心筋虚血が含まれる。狭心症には不安定狭心症、安定狭心症、および冠攣縮性狭心症が含まれる。急性冠症候群は、虚血性心疾患のうち、急性心筋梗塞および不安定狭心症のうちの少なくともいずれか一方の症状（発症を含む）を含む。
本発明の被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の検出方法に用いられるペプチドは、被験者の生物試料中に見出される、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドからなるペプチドである。これらのペプチドの測定値は心疾患、特には虚血性心疾患、心房細動、および弁膜症等の、心室及び／又は心房への血液供給が減少している心疾患の罹患と相関する。配列番号１〜６のアミノ酸配列は以下の表１に示す通りである。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる１番目のペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる２番目のペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる３番目のペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる４番目のペプチド、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる６番目のペプチドは、いずれも血液凝固第I因
子（フィブリノーゲン）α鎖の部分配列である。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる５番目のペプチドは血液凝固第XIII因子（γグルタミルトランスフェラーゼ）の部分配列である。
子（フィブリノーゲン）α鎖の部分配列である。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる５番目のペプチドは血液凝固第XIII因子（γグルタミルトランスフェラーゼ）の部分配列である。
配列番号１〜６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの質量分析による見かけの分子量［Ｍ＋Ｈ］+は、それぞれ約1545.62、約1616.66、約2553.10、約3277.46、約3949.98、約5901.70である。
本発明においては、上記のインタクトなペプチドをマーカーとして用いるが、配列番号１〜６に表されるアミノ酸配列において、１個または数個（好ましくは１ないし３個,より好ましくは１または２個）のアミノ酸が欠失、置換、付加したアミノ酸配列からなるペプチドも含み得、これらの修飾ペプチドも本発明の方法においてバイオマーカーとして用いることができる。さらに、本発明のペプチドは、特定のアミノ酸に酸素原子が結合して酸化されたり、リン酸化されたり、N-アセチル化されたり、S-システイン化されたりしている場合がある。好ましくは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはN末端側から２番目（フィブリノペプチドＡのＮ末端から２２番目）のセリンがリン酸化されていてもよく、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはN末端側から３番目（フィブリノペプチドＡのＮ末端から２２番目）のセリンがリン酸化されていてもよく、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはN末端側から２８番目（フィブリノーゲンα鎖のＮ末端から６０３番目）のメチオニンが酸素で酸化されていてもよく、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドはN末端側から１番目（血液凝固因子第XIII因子サブユニットのＮ末端から１番目）のセリンがＮ−アセチル化されていてもよい。
このような場合も、配列番号１〜６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである限り、本発明の範囲に包含される。なお、配列番号１〜６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの上記修飾体は、質量分析にて非修飾体（インタクト）と区別が可能であり、疾患の検出、判定及び治療等には修飾ペプチドまたは非修飾ペプチドのいずれを適切な状況で使用することも本発明の範囲に包含される。
本発明は、被験者の生物試料中の、上記の６個の本発明のペプチドのうちの１種、又は２種以上を測定することを含む、該被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の検出又は判定方法を包含する。
さらに好ましい一つの実施形態では、被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の検出又は判定方法は、被験者の生物試料中の、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する２種又は３種のペプチドを測定することを含む。
被験者には、血液凝固反応を随伴する疾患に罹患していると疑われる患者を含み、「血液凝固反応を随伴する疾患に罹患していると疑われる被検者」は、被検者本人が主観的に疑いを抱く者（何らかの自覚症状がある者に限らず、単に予防検診の受診を希望する者を含む）であっても、何らかの客観的な根拠に基づく者（例えば、従来公知の臨床検査（例、心拍、血圧、血液又は尿検査）および／または診察の結果、血液凝固反応を随伴する疾患の合理的な罹患可能性があると医師が判断した者）であってもよい。「ペプチドを測定する」とはペプチドの濃度、量、又はシグナル強度を測定することを指す。
被験試料となる被検者由来の生体試料は特に限定されないが、被検者への侵襲が少ないものであることが好ましく、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、涙液など生体から容易に採取できるものや、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、眼房水、硝子体液、リンパ液など比較的容易に採取されるものが挙げられる。一実施形態では、生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる。血清や血漿を用いる場合、常法に従って被検者から採血し、前処理を施さず直接、又は液性成分を分離することにより分析にかける被験試料を調製することができる。検出対象である本発明のペプチドは必要に応じて、抗体カラムやスピンカラムなどを用いて、予め高分子量の蛋白質画分などを分離除去しておくこともできる。
生体試料中の、本発明のペプチドの検出は、例えば、生体試料を各種の分子量測定法、例えば、ゲル電気泳動や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィなど）、表面プラズモン共鳴法、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、および質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計、免疫質量分析計、安定同位体ペプチドを内部標準にした質量分析計、免疫顕微鏡計など）を組み合わせる方法等に供し、該ペプチドの分子量と一致するバンドもしくはスポット、あるいはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。
本発明のペプチドを精製してそれらを認識する抗体を作製し、ELISA, RIA,イムノクロマト法、表面プラズモン共鳴法、ウェスタンブロッティング、免疫質量分析法や各種イムノアッセイ、免疫顕微鏡法により該ペプチドを検出する方法もまた、好ましく用いられ得る。さらに上記方法のハイブリッド型検出法も有効である。
本発明の検出又は判定方法における特に好ましい測定法の１つは、飛行時間型質量分析に使用するプレートの表面に被験試料を接触させ、該プレート表面に捕捉された成分の質量を飛行時間型質量分析計で測定する方法が挙げられる。飛行時間型質量分析計に適合可能なプレートは、検出対象である本発明のペプチドを効率よく吸着し得る表面構造（例：官能基付加ガラス、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改質シリコン、種々のゲルまたはポリマーのコーティング）を有している限り、いかなるものであってもよい。
好ましい実施態様においては、質量分析用プレートとして用いられる支持体は、ポリビニリデンジフロリド（PVDF）、ニトロセルロースまたはシリカゲル、特に好ましくはPVDFで薄層コーティングされた基材である（WO 2004/031759を参照）。かかる基材は、質量分析用プレートにおいて使用されているものであれば、特に限定されず、例えば、絶縁体、金属、導電性ポリマー、それらの複合体などが挙げられる。かかるPVDFで薄層コーティングされた質量分析用プレートとして、好ましくは株式会社プロトセラ社のブロットチップ（BLOTCHIP，登録商標）などが挙げられる。代わりに、質量分析用プレートは、支持体表面を塗布、噴霧、蒸着、浸漬、印刷、スパッタリング等の公知の手段でコーティングすることにより、公知の方法により調製することもできる。また、質量分析用プレート上の分子を質量分析する方法自体は公知である（例えばWO 2004/031759）。WO 2004/031759に記載の方法を、必要に応じて適宜改変して使用することができる。
被験試料の質量分析用プレート（支持体）への移行は、被験試料となる被検者由来の生体試料を未処理のままで、あるいは抗体カラムその他の方法で高分子タンパク質を除去、濃縮した後に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動もしくは等電点電気泳動に付し、泳動後ゲルをプレートと接触させて転写（ブロッティング）することにより行われる。転写の方法自体は公知であり、好ましくは電気転写が用いられる。電気転写時に使用する緩衝液としては、pH 7〜9、低塩濃度の公知の緩衝液を用いることが好ましい（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）。
上記の方法により支持体表面上に捕捉された被験試料中の分子を質量分析することにより、分子量に関する情報から、標的分子である本発明のペプチドの存在および量を同定することができる。質量分析装置からの情報を、任意のプログラムを用いて、非罹患がん患者、処置後の患者（フォローアップ）、もしくは健常人由来の生体試料における質量分析データと比較して、示差的な（differential）情報として出力させることも可能である。そのようなプログラムは周知であり、また、当業者は、公知の情報処理技術を用いて、容易にそのようなプログラムを構築もしくは改変することができることが理解されよう。
高精度な質量分析結果を得るためには、高速液体クロマトグラフィに接続した三連四重極型等の質量分析装置を用いて分析する。標的分子の安定同位体標識ペプチドを合成して、それを既知量の内部標準品として被験試料に混合し、逆相固相担体等でペプチド画分の粗精製を実施する。高速液体クロマトグラフィに導入後、分離された各ペプチドは質量分析装置内でイオン化され、その後コリジョンセル内で断片化、得られたペプチドフラグメントをmultiple reaction monitoring法により定量する。この際、安定同位体標識ペプチドを内部標準として用いることでCV値が5%以下の実測データを取得できる。安定同位体標識ペプチドは、Cambridge Isotope Laboratory（MA, USA）より購入した安定同位体標識アミノ酸（アミノ酸a(13C6,15N2)は、安定同位体炭素（原子量13）6個と、安定同位体窒素（原子量15）2個で置換された質量数が元のアミノ酸より８原子量増加したアミノ酸aを例示）を元のアミノ酸の配列位置に置換して既存の合成法（たとえばF-mocによる固相反応）により得られる。質量分析は株式会社プロトセラ社のBLOTCHIP（登録商標）システムでも実施可能であり、これらの方法は抗体を使用しない検出装置として臨床使用できる。
上記の質量分析による検出において、タンデム質量分析（MS/MS）法を用いてペプチドを同定することができ、かかる同定法としては、MS/MSスペクトルを解析してアミノ酸配列を決定するde novo sequencing法と、MS/MSスペクトル中に含まれる部分的な配列情報（質量タグ）を用いてデータベース検索を行い、ペプチドを同定する方法等が挙げられる。また、MS/MS法を用いることにより、直接本発明のペプチドのアミノ酸配列を同定し、該配列情報に基づいて該ペプチドの全部もしくは一部を合成し、これを以下の抗体に対する抗原として利用することもできる。
本発明のペプチドの測定は、それに対する抗体を用いて行うこともできる。よって、本発明は、ペプチドを特異的に認識する抗体を用いた血液凝固反応を随伴する疾患の検出又は判定方法、かかる抗体を含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出又は判定剤、ならびにかかる抗体を含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出又は判定キットを含む。かかる方法は、最適化されたイムノアッセイ系を構築してこれをキット化すれば、上記質量分析装置のような特殊な装置を使用することなく、高感度かつ高精度に該ペプチドを検出することができる点で、特に有用である。
本発明のペプチドに対する抗体は、例えば、本発明のペプチドを、これを発現する患者由来の生体試料から単離・精製し、該ペプチドを抗原として動物を免疫することにより調製することができる。あるいは、得られるペプチドの量が少量である場合は、RT-PCRによる該ペプチドをコードするcDNA断片の増幅等の周知の遺伝子工学的手法によりペプチドを大量に調製することができ、あるいはかかるcDNAを鋳型として、無細胞転写・翻訳系を用いて本発明のペプチドを取得することもできる。さらに有機合成法により大量に調製することも可能である。
本発明のペプチドに対する抗体（以下、「本発明の抗体」と称する場合がある）は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、該抗体は完全抗体分子だけでなくそのフラグメントをも包含し、例えば、Fab、F(ab')2、ScFv、およびminibody等が挙げられる。
例えば、ポリクローナル抗体は、本発明のペプチドを抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2〜3週間おきに2〜4回程度投与し、最終免疫後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、モルモット、ハムスターなど、目的の抗体を得ることができる哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。モノクローナル抗体を調製するための技法の説明は、Stites et al, Basic and Clinical Immunology. (Lang Medical Publications Los Altos. CA. 4th Edition） and references therein, 、in particular Koehler, G. & Milstein, C. Nature 256, 495-497 (1975).に見出され得る。例えば、本発明のペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
抗体を用いる本発明の検出又は判定方法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法等が好適に用いられる。測定に際し、抗体または抗原は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、または発光物質等の標識剤と結合され得る。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-アビジン系を用いることもできる。これら個々の免疫学的測定法は、当業者の通常の技能により、本発明の定量方法に適用可能である。
本発明のペプチドはタンパク質分解産物からなるため、未分解のタンパク質や、切断部位が共通の類似ペプチド等様々な分子が測定値に影響を与える可能性がある。そこで、第１工程において、生体試料を抗体により免疫アフィニティ精製し、抗体に結合したフラクションを、第２工程において質量分析に付し、精緻な分子量を基準に同定、定量する、いわゆる免疫質量分析法を利用することができる（例えば、Rapid Commun. Mass Spectrom. 2007, 21: 352-358を参照）。免疫質量分析法によれば、未分解のタンパク質も類似ペプチドも、質量分析計で完全に分離され、バイオマーカーの正確な分子量を基準に高い特異度と感度で定量が可能となる。
あるいは、本発明の抗体を用いる別の本発明の検出又は判定方法として、該抗体を上記したような質量分析計に適合し得るチップの表面上に固定化し、該チップ上の該抗体に被検試料を接触させ、該抗体に捕捉された生体試料成分を質量分析にかけ、該抗体が認識するマーカーペプチドの分子量に相当するピークを検出する方法が挙げられる。
上記のいずれかの方法により測定された被検者由来試料中の本発明のペプチドのレベルが、非血液凝固反応を随伴する疾患患者、処置後の患者もしくは健常人由来の対照試料中の該ペプチドレベルに比べて有意に変動している場合、該被検者は血液凝固反応を随伴する疾患に罹患している可能性が高いと判定することができる。
本発明のペプチドは、それぞれ単独でも血液凝固反応を随伴する疾患の検出マーカーとして利用することができるが、2種以上を組み合わせることにより、感度（有病正診率）および特異度（無病正診率）をより高めることができる。
２種以上のペプチドをマーカーとして用いる場合の検出手法としては、例えば、(1) 測定対象であるすべてのペプチドについてレベルが有意に変動する場合に血液凝固反応を随伴する疾患に罹患していると判定し、いずれかのペプチドについてレベルが有意に変動しない場合に血液凝固反応を随伴する疾患に罹患していないと判定する方法、(2) 測定対象であるすべてのペプチドについてレベルが有意に変動しない場合に血液凝固反応を随伴する疾患に罹患していないと判定し、いずれかのペプチドについてレベルが有意に変動した場合に血液凝固反応を随伴する疾患に罹患していると判定する方法、(3) 測定対象であるn個のペプチドのうち、例えば、2〜(n-1)個以上のペプチドについて、レベルが有意に変動する場合に血液凝固反応を随伴する疾患に罹患していると判定する方法、さらに各ペプチド間で重みを持たせる方法、ならびに(4) バギング法、ブースティング法、ランダムフォレスト法などの機械学習法、などが考えられるが、特には複数のマーカーペプチドを１つのマーカーセットとして取り扱うことが出来る解析手法である多変量ロジスティック回帰分析を用いることが好ましい。この場合、マーカーとして用いるペプチドの数は特に限定されないが、好ましくは２種以上、より好ましくは３〜６種、さらにより好ましくは３〜５種である。
一つの実施形態において、上記の解析に用いられるペプチドは、配列番号１〜配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる６種のペプチドのうちの少なくとも１種であり、好ましくは２種以上である。
好ましい実施形態において、上記の解析に用いられるペプチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのうちの少なくとも１種であり、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上、さらに好ましくは４種以上である。
さらに好ましい実施形態において、上記の解析に用いられるペプチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの３種を包含する。
本願では、質量分析により特定された候補ペプチドの多変量ロジスティック回帰モデルを最尤法により構築したところ、ＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）が高い（５つのマーカーペプチドで０．９を超える）極めて信頼性の高い血液凝固反応を随伴する疾患の検出又は判定が可能であることを見出した。検出又は測定されるペプチドの数が多いほど、検査の精度は向上する。
検出又は測定されるペプチドの数は、本発明の検査方法におけるＡＵＣが或る閾値を超える値となる数であることが好ましい。通常、閾値は０．９であり、好ましくは０．９２、より好ましくは０．９５、さらに好ましくは０．９８である。ペプチドの数を増やすほど約１に近づけることが可能である。
例えば、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの２つのペプチドの血中濃度の関数であるロジスティック回帰モデルによれば、特異度に対して感度をプロットしたＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）が０．９を超え、高い精度で血液凝固反応を随伴する疾患を検出することができる。また、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチドと、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの３つのペプチドの血中濃度の関数であるロジスティック回帰モデルによれば、ＡＵＣがほぼ１となり、極めて高い精度で血液凝固反応を随伴する疾患を検出することができる。
本発明の検出方法は、患者から時系列で生体試料を採取し、各試料における本発明のペプチドの発現の経時変化を調べることにより行うこともできる。生体試料の採取間隔は特に限定されないが、患者のQOLを損なわない範囲でできるだけ頻繁にサンプリングすることが望ましく、例えば、血漿もしくは血清を試料として用いる場合、約1日〜約1月間の間隔で採血を行うことが好ましい。本発明のペプチドは、血液凝固反応を随伴する疾患が進行するに従って血清・血漿レベルが各ペプチドで低下する傾向にある。従って、これらのマーカーのレベルが経時的に低下した場合には、該患者における血液凝固反応を随伴する疾患が改善または悪化している可能性が高いと判定することができる。
さらに、上記時系列的なサンプリングによる血液凝固反応を随伴する疾患の検出方法は、前回サンプリングと当回サンプリングとの間に、被検者である患者に対して該疾患の治療措置が講じられた場合に、当該措置による治療効果を評価するのに用いることができる。即ち、治療の前後にサンプリングした試料について、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められると判定された場合に、当該治療の効果があったと評価することができる。一方、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められない、あるいはさらに悪化していると判定された場合には、当該治療の効果がなかったと評価することができる。
さらに、上記時系列的なサンプリングによる血液凝固反応を随伴する疾患の検出のための検査方法は、健康食品等の摂取、禁煙、運動療法、有害環境からの隔離等、血液凝固反応を随伴する疾患の罹患リスク低減措置後の予防効果を評価するのに用いることができる。即ち、罹患リスクの低減措置の施行の前後にサンプリングした試料について、施行後の状態が施行前の状態と比較して病態の発症もしくは進行が認められないと判定された場合に、当該措置の施行の効果があったと評価することができる。一方、治療後の状態が治療前の状態と比較して病態の改善が認められない、あるいはさらに悪化していると判定された場合には、当該措置の施行の効果がなかったと評価することができる。
従って、本発明のペプチドならびに方法は、血液凝固反応を随伴する疾患を診断または検出するマーカーのみならず、血液凝固反応を随伴する疾患の予後を予測するマーカー、ならびに治療効果判定のマーカーともなり得る。すなわち、本発明のペプチドならびに方法は、血液凝固反応を随伴する疾患の治療の創薬標的分子のスクリーニングに、および／または患者（リスポンダー）の選別もしくは薬の投与量（用量）の調節のためのコンパニオン診断薬として使用することができる。
また、本発明のペプチドならびに方法は、物質のスクリーニング方法に使用できる。この場合の物質には、血液凝固反応を随伴する疾患を未病段階で防止する健康食品やトクホ製品などの食品類、血液凝固反応を随伴する疾患を診断または検出するマーカー類、及び罹患後の血液凝固反応を随伴する疾患を治療する治療薬医薬品類が含まれる。
一実施形態において、本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種、２種、３種、４種、５種または６種のペプチドに対する抗体を含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出キットを包含する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種、２種又は３種のペプチドに対する抗体を含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出キットを包含する。
別の実施形態において、本発明は、 配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種、２種、３種、４種、５種又は６種のペプチドに対する抗体を検出試薬として含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出剤を包含する。
別の実施形態において、本発明は、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種、２種又は３種のペプチドに対する抗体を検出試薬として含む血液凝固反応を随伴する疾患の検出剤を包含する。
また別の実施形態において、本発明は、被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性を判定するための、コンピュータにより実行される方法であって、被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種、２種、３種、４種、５種又は６種のペプチドについての定量的データを取得する工程と、前記取得したデータを、前記１種、２種、３種、４種、５種又は６種のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用し、被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性の予測確率を求める工程とを含む方法を包含する。ここで、ペプチドの定量的データとは、例えば質量分析やペプチドに対する抗体を用いて測定されたペプチドの発現量、血中濃度等の定量的な測定値を指す。
別の実施形態において、本発明は、被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性を判定するための、コンピュータにより実行される方法であって、被験者の生物試料中の、配列番号３で表されるアミノ酸配列、配列番号５で表されるアミノ酸配列、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する１種、２種、又は３種のペプチドについての定量的データを取得する工程と、前記取得したデータを、前記１種、２種、又は３種のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用し、被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性の予測確率（予測罹患確率）を求める工程とを含む方法を包含する。
好ましい実施形態において、定量的データを取得するペプチドは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチドの３つのペプチドである。
上記コンピュータにより実行される方法は、予測確率を求めた後で、該予測確率に基づいて被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性を判定する工程をさらに含んでもよい。例えば求めた予測確率が或る閾値を超えた場合に、その被験者を血液凝固反応を随伴する疾患に罹患していると判定する。通常、閾値は０．５であり、好ましくは０・１以下である。
別の実施形態において、本発明のペプチドは、検出以外に積極的な血液凝固反応を随伴する疾患の創薬ターゲットを提供することもできる。即ち、該ペプチドそれ自体が該疾患の治療（寛解）方向に生理機能を持つ（「治療ペプチド」という）場合、該ペプチドの量もしくは活性を増大させる物質（例えばワーファリン等の抗凝固剤、エリキュース等の凝固因子阻害剤、TS23 （Translational Sciences社）等の抗線溶因子阻害剤等）を患者に投与することにより、該疾患を治療することができる。
別の実施形態において、本発明はまた、本発明のペプチドが治療ペプチドとして作用する場合に、該ペプチドの量もしくは活性を増大させることによる、血液凝固反応を随伴する疾患の治療方法を提供する。該治療方法は、具体的には、治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質の有効量を、血液凝固反応を随伴する疾患の患者に投与することを含む。従って、本発明はまた、治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質を含有してなる、（例えばワーファリン等の抗凝固剤、エリキュース等の凝固因子阻害剤、TS23 （Translational Sciences社）等の抗線溶因子阻害剤等）の血液凝固反応を随伴する疾患の治療剤を提供する。
具体的には、治療ペプチドとしての本発明のペプチドの活性を増大させる物質としては、該ペプチド自体あるいはそれと同様のアゴニスト作用を有する分子が挙げられる。あるいは、治療ペプチドとしての本発明のペプチドの活性を増大させる物質として、該ペプチドの非中和抗体、好ましくはアゴニスト抗体なども挙げることができる。
治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質は、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。かかる経口剤には、脳血管障壁(BBB)を通過する性状を持つものも含まれる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤F、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。注射剤、坐剤などでは、有効成分（該ペプチド）の血中濃度の延長や吸収効率の増加を目的に、既存の方法による化学修飾（糖鎖、ＰＥＧその他）体が使用される。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。かかる注射剤には、脳血管障壁(BBB)を通過する性状を持つものも含まれる。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり非生物学的製剤では通常5〜500ｍｇ、とりわけ注射剤では5〜100ｍｇ、その他の剤形では10〜250ｍｇの上記化合物が含有され、生物学的製剤の注射剤では10〜50000mgの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質との配合により、好ましくない相互作用を生じない限り、他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトに対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
治療ペプチドとしての本発明のペプチドの量もしくは活性を増大させる物質の投与量は、その作用、投与ルート、患者の重篤度、年齢、体重、薬物受容性などにより差異はあるが、例えば、成人１日あたり活性成分量として非生物学的製剤では約0.0008〜約25ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約0.008〜約2ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを1回もしくは数回に分けて投与することができる。生物学的製剤の注射剤では10〜5000mg/kg, 好ましくは約10〜約2000ｍｇ／ｋｇの範囲であり、これを1回もしくは数回に分けて投与することができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
本明細書中に引用されているすべての特許出願および文献の開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
実施例１
（材料および方法）
本研究は大阪市立大学医学部の倫理委員会の承認を得て行った。すべての患者は大阪市立大学医学部付属病院の心臓血管外科の診療科に来た者であり、すべての患者に書面による同意書を配布してから本研究を行った。
１．患者
急性心筋梗塞に罹患した７名の成人患者と不安定狭心症に罹患した３名の成人患者が本研究に参加した。これらの患者は疾患発症の24時間以内に冠血管造影（ＣＡＧ）により急性冠症候群（ＡＣＳ）と診断された。
２．血液サンプルの採取
急性冠症候群（ＡＣＳ）の患者を明確に診断し、急性期における冠動脈疾患の重度を評価するために、冠血管造影（ＣＡＧ）ですべてのＡＣＳ患者を調べた。冠動脈血のサンプルを、疾患の原因となっている冠動脈に冠ガイドワイヤを介して導入した吸引カテーテルを用いて採取した。また、21ゲージ針を用いて発症時の下肢静脈と退院6か月後の上腕静脈から静脈血サンプルを得、5ml 真空血液採取管に入れた。それらのサンプルを室温で1時間静置し、3,000rpmで10分間室温にて遠心分離し、血清を得た。上清を使用するまで-80℃で分けて保存した。
３．BLOTCHIP（登録商標）による質量分析
血清中の質量分析によるペプチド解析を、ペプチドームプロファイリングの迅速定量法である、ワンステップの直接転写技術のBLOTCHIP（登録商標）質量分析により行った（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009;379(1):110-4）。
（材料および方法）
本研究は大阪市立大学医学部の倫理委員会の承認を得て行った。すべての患者は大阪市立大学医学部付属病院の心臓血管外科の診療科に来た者であり、すべての患者に書面による同意書を配布してから本研究を行った。
１．患者
急性心筋梗塞に罹患した７名の成人患者と不安定狭心症に罹患した３名の成人患者が本研究に参加した。これらの患者は疾患発症の24時間以内に冠血管造影（ＣＡＧ）により急性冠症候群（ＡＣＳ）と診断された。
２．血液サンプルの採取
急性冠症候群（ＡＣＳ）の患者を明確に診断し、急性期における冠動脈疾患の重度を評価するために、冠血管造影（ＣＡＧ）ですべてのＡＣＳ患者を調べた。冠動脈血のサンプルを、疾患の原因となっている冠動脈に冠ガイドワイヤを介して導入した吸引カテーテルを用いて採取した。また、21ゲージ針を用いて発症時の下肢静脈と退院6か月後の上腕静脈から静脈血サンプルを得、5ml 真空血液採取管に入れた。それらのサンプルを室温で1時間静置し、3,000rpmで10分間室温にて遠心分離し、血清を得た。上清を使用するまで-80℃で分けて保存した。
３．BLOTCHIP（登録商標）による質量分析
血清中の質量分析によるペプチド解析を、ペプチドームプロファイリングの迅速定量法である、ワンステップの直接転写技術のBLOTCHIP（登録商標）質量分析により行った（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009;379(1):110-4）。
まず、血清サンプルをドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）に供し、ペプチドをタンパク質と分離した。次に、ゲル中のペプチドをBLOTCHIP（登録商標）（株式会社プロトセラ、尼崎市所在）に電気転写した。転写終了後、チップの表面を超純水でリンスし、BLOTCHIP（登録商標）に直接マトリックス（α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸, Sigma-Aldrich Co., アメリカ合衆国ミズーリ州）を塗布後、UltraFlexII TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics社製、アメリカ州マサチューセッツ州)の反射モードで、Proteomics 11:2727-2737.に記載された通りに質量分析を行い、ペプチドプロファイルを得た。
４．ペプチドの統計解析
サンプルはBLOTCHIP（登録商標）質量分析により4回繰り返し解析した。より統計学的に有意なピークを見出すために、4つのデータを独立データとして使用し、解析ソフトClinProTools 2.2 (Bruker Daltonics社製)を使用してウィルコクソン検定のｐ値を計算し、p値が0.05以下の場合に有意差ありとみなした。
４．ペプチドの統計解析
サンプルはBLOTCHIP（登録商標）質量分析により4回繰り返し解析した。より統計学的に有意なピークを見出すために、4つのデータを独立データとして使用し、解析ソフトClinProTools 2.2 (Bruker Daltonics社製)を使用してウィルコクソン検定のｐ値を計算し、p値が0.05以下の場合に有意差ありとみなした。
統計解析ソフトR（R Core Team (2013). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL http://www.R-project.org/.）によりウィルコクソン検定のｐ値を計算するために、一つのサンプル当たりの4つのデータの平均値を用いてペプチドの診断性能を評価した。モデルの構築には統計解析ソフトR（R Core Team (2013)を使用した。
構築したモデルの診断能の評価のためにROC分析を実施した。Rのパッケージである"Epi パッケージ"（A package for statistical analysis in epidemiology、Version 1.149、http://cran.r-project.org/web/packages/Epi/index.html）を用いた。AUCはROC曲線から計算した。診断のための最適カットオフ値は、Cancer 1950;3:32-5のYouden's indexに従って決定でき、95%信頼区間は、ノンパラメトリックなブートストラップ抽出を用いて推定した。
５．ペプチドの同定
各標的ペプチドを含む血清を、その同定のために採取した。ペプチドは、Sep-Pak C18固相抽出カートリッジ（Waters Corporation、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて、0.1%トリフルオロ酢酸を含む水に80%v/v アセトニトリル(ACN)で抽出した。溶出液をCC-105 遠心濃縮器(株式会社トミー精工, 東京)を用いて100μL以下に濃縮した。次に溶液を0.065% TFAを含む2%v/v CAN水溶液400μL（溶離液Aと称する）に希釈し、Ｃ１８シリカカラム(COSMOSIL（登録商標） 5C18-AR-II)(ナカライテスク株式会社、京都)を装備したAEKTA精製装置(GE Healthcare UK Ltd, 英国バッキンガムシャー州)にかけた。溶出液を、溶離液Aに対し0.05% TFAを含む80%v/v CANの水溶液で1.0mL/分の流速で0-100%の線形勾配により20個の画分(各1mL)に分けた。各画分をCC-105遠心濃縮器で10μL以下に濃縮し、ペプチドの配列をMALDI-TOF/TOF（UltraFlex II TOF/TOF）及びLC-MS/MS(Q-Exactive;Thermo Fisher Scientific Inc, アメリカ合衆国マサチューセッツ州ワルサム)を用いて分析した。
（結果）
１．ＡＣＳ血清のペプチド解析
合計で３０血清のペプチド解析をBLOTCHIP（登録商標）質量分析により行った。各ペプチドームプロファイルより得られた質量スペクトルのデータをデータベースに保存した。すべてのＭＳ測定が完了した後、解析ソフトFlexAnalysis2.4を用いて、Ａ群（発症時の閉塞した冠動脈から採取した血液のサンプル／コントロールとしての退院から6か月後の患者の上腕静脈から採取した血液のサンプル）及びＢ群（発症時の下肢静脈から採取した血液のサンプル／コントロールとしての退院から6か月後の患者の上腕静脈から採取した血液のサンプル）でのディファレンシャル解析を行った。その結果、m/z 1,500-20,000の領域に79個のピークが確認された(p<0.05)。統計解析により得られたすべてのピークの形状を目視により精査し、MALDI-MS測定にランダムに現れるノイズ、弱いピーク、及び微かなピークを除外した。これにより、22個のシャープなピークが得られた。
２．同定されたバイオマーカー候補ペプチド
逆相クロマトグラフィで部分的に精製した血清ペプチドによりMALDI-TOF/TOF及びLC-MS/MSペプチド配列決定分析を行った。22個のピークのうち6個のペプチドを最終的に同定した（表２）。M/z 1616.66のペプチドはトロンビンによりフィブリノーゲンのα鎖から放出されたフィブリノペプチドＡであることが明らかとなった。M/z 1545.62のペプチドはタンパク質分解によりフィブリノペプチドＡからさらにＮ−末端のアラニンが放出されることにより形成されたペプチドである。m/z 3949.98のペプチドはトロンビンにより不活性血液凝固因子第XIII因子サブユニットA（酵素前駆体）から放出され、血液凝固因子第XIII因子サブユニットA（活性酵素）となった活性化ペプチドである。さらに、残りの３つのペプチドであるm/z 2553.10, 3277.45及び5901.70 はフィブリノーゲンα鎖の中間領域を異なる部位でタンパク質分解したものであり、これまで報告されていないペプチドであった。m/z 1545.62 及び1616.66のペプチド (フィブリノペプチドA)は Ser22 の位置でリン酸化により修飾されており、m/z 3277.46のペプチド (フィブリノゲンα鎖)はMet603で酸化されており、m/z 3949.98のペプチドXIII因子サブユニットA 活性化ペプチド）はSer2の位置でＮ−アセチル化により修飾されていた。
５．ペプチドの同定
各標的ペプチドを含む血清を、その同定のために採取した。ペプチドは、Sep-Pak C18固相抽出カートリッジ（Waters Corporation、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード）を用いて、0.1%トリフルオロ酢酸を含む水に80%v/v アセトニトリル(ACN)で抽出した。溶出液をCC-105 遠心濃縮器(株式会社トミー精工, 東京)を用いて100μL以下に濃縮した。次に溶液を0.065% TFAを含む2%v/v CAN水溶液400μL（溶離液Aと称する）に希釈し、Ｃ１８シリカカラム(COSMOSIL（登録商標） 5C18-AR-II)(ナカライテスク株式会社、京都)を装備したAEKTA精製装置(GE Healthcare UK Ltd, 英国バッキンガムシャー州)にかけた。溶出液を、溶離液Aに対し0.05% TFAを含む80%v/v CANの水溶液で1.0mL/分の流速で0-100%の線形勾配により20個の画分(各1mL)に分けた。各画分をCC-105遠心濃縮器で10μL以下に濃縮し、ペプチドの配列をMALDI-TOF/TOF（UltraFlex II TOF/TOF）及びLC-MS/MS(Q-Exactive;Thermo Fisher Scientific Inc, アメリカ合衆国マサチューセッツ州ワルサム)を用いて分析した。
（結果）
１．ＡＣＳ血清のペプチド解析
合計で３０血清のペプチド解析をBLOTCHIP（登録商標）質量分析により行った。各ペプチドームプロファイルより得られた質量スペクトルのデータをデータベースに保存した。すべてのＭＳ測定が完了した後、解析ソフトFlexAnalysis2.4を用いて、Ａ群（発症時の閉塞した冠動脈から採取した血液のサンプル／コントロールとしての退院から6か月後の患者の上腕静脈から採取した血液のサンプル）及びＢ群（発症時の下肢静脈から採取した血液のサンプル／コントロールとしての退院から6か月後の患者の上腕静脈から採取した血液のサンプル）でのディファレンシャル解析を行った。その結果、m/z 1,500-20,000の領域に79個のピークが確認された(p<0.05)。統計解析により得られたすべてのピークの形状を目視により精査し、MALDI-MS測定にランダムに現れるノイズ、弱いピーク、及び微かなピークを除外した。これにより、22個のシャープなピークが得られた。
２．同定されたバイオマーカー候補ペプチド
逆相クロマトグラフィで部分的に精製した血清ペプチドによりMALDI-TOF/TOF及びLC-MS/MSペプチド配列決定分析を行った。22個のピークのうち6個のペプチドを最終的に同定した（表２）。M/z 1616.66のペプチドはトロンビンによりフィブリノーゲンのα鎖から放出されたフィブリノペプチドＡであることが明らかとなった。M/z 1545.62のペプチドはタンパク質分解によりフィブリノペプチドＡからさらにＮ−末端のアラニンが放出されることにより形成されたペプチドである。m/z 3949.98のペプチドはトロンビンにより不活性血液凝固因子第XIII因子サブユニットA（酵素前駆体）から放出され、血液凝固因子第XIII因子サブユニットA（活性酵素）となった活性化ペプチドである。さらに、残りの３つのペプチドであるm/z 2553.10, 3277.45及び5901.70 はフィブリノーゲンα鎖の中間領域を異なる部位でタンパク質分解したものであり、これまで報告されていないペプチドであった。m/z 1545.62 及び1616.66のペプチド (フィブリノペプチドA)は Ser22 の位置でリン酸化により修飾されており、m/z 3277.46のペプチド (フィブリノゲンα鎖)はMet603で酸化されており、m/z 3949.98のペプチドXIII因子サブユニットA 活性化ペプチド）はSer2の位置でＮ−アセチル化により修飾されていた。
３．各バイオマーカー候補ペプチドの変化率とACSの診断性能
表３に示すように、Ａ群では、発症時の閉塞した冠動脈におけるフィブリノーゲンＡα鎖に対応する5つのペプチドの量は、コントロールと比較して、31% (m/z 1545.62)、30% (m/z 1616.66)、29% (m/z 2553.10)、 (33%) m/z 3277.46及び37% (m/z 5901.70)に有意に減少した。驚いたことに、発症時の閉塞した冠動脈におけるm/z 3949.98ペプチド（血液凝固因子第XIII因子サブユニットA活性化ペプチド））の量の変化はコントロールと比較して３%にまで減少した。6つのすべてのバイオマーカー候補ペプチドは、緊急CAGにより診断されたACSを、非常に高い診断性能でもっぱら区別できた：m/z 1545.62 (AUC 0.87，感度100%，特異度80%，p 0.004), m/z 1616.66 (AUC 0.76，感度100%，特異度60%，p 0.052), m/z 2553.10 (AUC 0.90，感度90%，特異度80%，p 0.002), m/z 3277.46 (AUC 0.83，感度100%，特異度70%，p 0.011), m/z 3949.98 (AUC 1.00，感度100%，特異度100%，p 0.00001), and m/z 5901.70 (AUC 0.88，感度90%，特異度90%， p 0.003)。
表３に示すように、Ａ群では、発症時の閉塞した冠動脈におけるフィブリノーゲンＡα鎖に対応する5つのペプチドの量は、コントロールと比較して、31% (m/z 1545.62)、30% (m/z 1616.66)、29% (m/z 2553.10)、 (33%) m/z 3277.46及び37% (m/z 5901.70)に有意に減少した。驚いたことに、発症時の閉塞した冠動脈におけるm/z 3949.98ペプチド（血液凝固因子第XIII因子サブユニットA活性化ペプチド））の量の変化はコントロールと比較して３%にまで減少した。6つのすべてのバイオマーカー候補ペプチドは、緊急CAGにより診断されたACSを、非常に高い診断性能でもっぱら区別できた：m/z 1545.62 (AUC 0.87，感度100%，特異度80%，p 0.004), m/z 1616.66 (AUC 0.76，感度100%，特異度60%，p 0.052), m/z 2553.10 (AUC 0.90，感度90%，特異度80%，p 0.002), m/z 3277.46 (AUC 0.83，感度100%，特異度70%，p 0.011), m/z 3949.98 (AUC 1.00，感度100%，特異度100%，p 0.00001), and m/z 5901.70 (AUC 0.88，感度90%，特異度90%， p 0.003)。
他方、Ｂ群では、発症時の下肢静脈における6つのペプチドの量は、コントロールと比較して5%〜74%の変化率に減少した。AUC 0.86，感度70%，特異度90%， p 0.005でACSを区別できたm/z 3949.98 ペプチドを除くと、Ａ群と異なり、バイオマーカー候補ペプチド単独ではACSを区別できなかった。一つのバイオマーカー候補ペプチドの変化率を箱ひげ図で図１に示す。
４．多変量ロジスティック回帰分析
表３の結果から、1つのペプチドではACSを検出するのに診断性能が十分ではない場合があると思われたため、6つの候補ぺプチドから多変量ロジスティック回帰モデルを用いてランダムに選択した2つ又は3つのペプチドの組み合わせを用いて、回帰モデル構築を調べた。種々のペプチドセットのモデルを調べた後、以下の1つまたは複数のペプチドを用いて、ロジスティックモデルによりACSの予測確率を計算した（表４）：
(1)1つのペプチド( m/z 3949.98のペプチド)、予測確率=1/{1+exp[-(-0.00008×[m/z 3949.98] +1.96)]}
(2)2つのペプチド( m/z 3949.98のペプチド及びm/z 5901.70のペプチド)、予測確率=1/{1+exp[-(-0.00029×[m/z 3949.98] + 0.00018×[m/z 5901.70] + 0.82)]}
(3)3つのペプチド( m/z 2553.10のペプチド, m/z 3949.98のペプチド及びm/z 5901.70のペプチド)、予測確率=1/{1+exp[-(-0.00466×[m/z 2553.10] -0.00278×[m/z 3949.98] + 0.00257×[m/z 5901.70] + 15.07)]}
なお、[m/z ***] は各ペプチドの血中濃度を表す。
表３の結果から、1つのペプチドではACSを検出するのに診断性能が十分ではない場合があると思われたため、6つの候補ぺプチドから多変量ロジスティック回帰モデルを用いてランダムに選択した2つ又は3つのペプチドの組み合わせを用いて、回帰モデル構築を調べた。種々のペプチドセットのモデルを調べた後、以下の1つまたは複数のペプチドを用いて、ロジスティックモデルによりACSの予測確率を計算した（表４）：
(1)1つのペプチド( m/z 3949.98のペプチド)、予測確率=1/{1+exp[-(-0.00008×[m/z 3949.98] +1.96)]}
(2)2つのペプチド( m/z 3949.98のペプチド及びm/z 5901.70のペプチド)、予測確率=1/{1+exp[-(-0.00029×[m/z 3949.98] + 0.00018×[m/z 5901.70] + 0.82)]}
(3)3つのペプチド( m/z 2553.10のペプチド, m/z 3949.98のペプチド及びm/z 5901.70のペプチド)、予測確率=1/{1+exp[-(-0.00466×[m/z 2553.10] -0.00278×[m/z 3949.98] + 0.00257×[m/z 5901.70] + 15.07)]}
なお、[m/z ***] は各ペプチドの血中濃度を表す。
結果として、最も高い1.00のAUCを示す最適モデルを以下の方程式（１）として得た：
予測確率=1/{1+exp[-(-0.00466×[m/z 2553.10] -0.00278×[m/z 3949.98] + 0.00257×[m/z 5901.70] + 15.07)]} (1)
上記の3つの回帰モデルは、以下の診断性能で、ACSをコントロールに対し区別した；1つのペプチド(AUC 0.86，感度100%，特異度60%，p 0.005),2つのペプチド(AUC 0.95，感度90%，特異度100%，p 0.0002)及び3つのペプチド(AUC 1.00，感度100%，特異度100%， p 0.00001)（表４）。
予測確率=1/{1+exp[-(-0.00466×[m/z 2553.10] -0.00278×[m/z 3949.98] + 0.00257×[m/z 5901.70] + 15.07)]} (1)
上記の3つの回帰モデルは、以下の診断性能で、ACSをコントロールに対し区別した；1つのペプチド(AUC 0.86，感度100%，特異度60%，p 0.005),2つのペプチド(AUC 0.95，感度90%，特異度100%，p 0.0002)及び3つのペプチド(AUC 1.00，感度100%，特異度100%， p 0.00001)（表４）。
1つ又は2つ又は3つのペプチドを用いた場合の多変量ロジスティック回帰モデルによるＡ群及びB群の予測確率を箱ひげ図で図２に示す。
最後の回帰モデルは3つのペプチドm/z 2553.10のペプチド, m/z 3949.98及び m/z 5901.70のペプチドから構成されており、回帰モデルによりコントロール群からACS群が十分に区別されることは明らかである。
実施例２
以下の表５に示される心疾患患者の血液サンプルを、実施例１に記載した通りに採取した。血液サンプルは、Ａ／Ｕ群は大阪市立大学医学部付属病院の患者から採取した以外は、守口生野記念病院（大阪府守口市）の患者より採取した。
以下の表５に示される心疾患患者の血液サンプルを、実施例１に記載した通りに採取した。血液サンプルは、Ａ／Ｕ群は大阪市立大学医学部付属病院の患者から採取した以外は、守口生野記念病院（大阪府守口市）の患者より採取した。
図３に示す通り、AMI群とUAP群ではFU群と比較して予測確率が高く、AMI群とUAP群は共に診断可能と推察され、A/U群、rMI群、及びCSA群も予測確率が高かった。
SAP群ではばらつきがあるが、患者を疾患別に個別に見たところ測定可能な場合があることが判明した（データ非図示）。
Other群の場合も、弁膜症の患者のように、測定可能な場合があることが判明した（データ非図示）。
Claims (11)
- 被験者における血液凝固反応を随伴する疾患を検出するための方法であって、
該被験者の生物試料中の、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを質量分析により測定することを含み、
前記測定したペプチドのレベルが、前記疾患の処置後の患者又は健常人由来のペプチドのレベルと比較して低下している場合に、該被験者は血液凝固反応を随伴する疾患に罹患している可能性が高いことを示す、方法。 - 被験者の生物試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドをさらに測定することを含む、請求項１に記載の方法。
- 被験者の生物試料中の、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される１種又は２種のペプチドを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記血液凝固反応を随伴する疾患が、急性冠症候群、深部大腿静脈血栓症、弁膜症、脳梗塞、肺梗塞、固形がん、播種性血管内凝固症候群(ＤＩＣ)、心房細動、心筋梗塞、狭心症、または無症候性心筋虚血である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液凝固反応を随伴する疾患が、虚血性心疾患、心房細動、または弁膜症である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記虚血性心疾患が、心筋梗塞または狭心症である請求項５に記載の方法。
- 前記血液凝固反応を随伴する疾患が、急性冠症候群である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の罹患可能性を判定するための、コンピュータにより実行される方法であって、被験者の生物試料中の、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドと、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するペプチド及び配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から１種以上のペプチドとの定量的データを質量分析を用いて取得し、前記取得したデータを、２種以上のペプチドの関数である多変量ロジスティック回帰モデルに適用する方法。
- 被験者における血液凝固反応を随伴する疾患を検出するための方法であって、
該被験者の生物試料中の、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを質量分析により測定することを含み、
前記測定したペプチドのレベルが、経時的に低下している場合に、該被験者は血液凝固反応を随伴する疾患が悪化している可能性が高いことを示す、方法。 - 被験者における血液凝固反応を随伴する疾患の治療効果を評価するための方法であって、
該被験者の生物試料中の、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを質量分析により測定することを含み、
治療後のペプチドのレベルが、治療前のペプチドのレベルよりも増大している場合に、治療の効果があることを示し、治療後のペプチドのレベルが、治療前のペプチドのレベルよりも低下している場合に、治療の効果がないことを示す、方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015199070A JP6755649B2 (ja) | 2015-10-07 | 2015-10-07 | 虚血性疾患の診断マーカー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015199070A JP6755649B2 (ja) | 2015-10-07 | 2015-10-07 | 虚血性疾患の診断マーカー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017072460A JP2017072460A (ja) | 2017-04-13 |
| JP6755649B2 true JP6755649B2 (ja) | 2020-09-16 |
Family
ID=58538650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015199070A Active JP6755649B2 (ja) | 2015-10-07 | 2015-10-07 | 虚血性疾患の診断マーカー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6755649B2 (ja) |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7634360B2 (en) * | 2003-09-23 | 2009-12-15 | Prediction Sciences, LL | Cellular fibronectin as a diagnostic marker in stroke and methods of use thereof |
| EP1673465A4 (en) * | 2003-09-29 | 2008-04-30 | Biosite Inc | PROCESS AND COMPOSITIONS FOR SEPSIS DIAGNOSIS |
| US20060105419A1 (en) * | 2004-08-16 | 2006-05-18 | Biosite, Inc. | Use of a glutathione peroxidase 1 as a marker in cardiovascular conditions |
| JP4318085B2 (ja) * | 2005-09-20 | 2009-08-19 | 株式会社キューメイ研究所 | 抗体およびハイブリドーマ、並びにこれらを用いた免疫学的測定法 |
| EP1870712A1 (en) * | 2006-06-20 | 2007-12-26 | Universität Bern | Method for assaying a thrombotic event |
| WO2008072676A1 (ja) * | 2006-12-12 | 2008-06-19 | Kagoshima University | 新規疾患マーカーおよびそれを用いた診断 |
| JP5453667B2 (ja) * | 2008-09-30 | 2014-03-26 | 株式会社バイオス医科学研究所 | 動脈硬化症の検出方法及び動脈硬化症マーカー |
| US9057731B2 (en) * | 2010-06-23 | 2015-06-16 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Methods and kits for predicting a response to an erythropoietic agent |
-
2015
- 2015-10-07 JP JP2015199070A patent/JP6755649B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2017072460A (ja) | 2017-04-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5337096B2 (ja) | 動脈硬化の評価法 | |
| JP5960717B2 (ja) | 自閉症の診断、治療におけるバイオマーカーおよびその使用 | |
| EP3260866B1 (en) | Novel biomarkers for cognitive impairment and methods for detecting cognitive impairment using such biomarkers | |
| JP2011501133A (ja) | 心血管または脳血管主要有害事象を検出するための方法 | |
| JP2011501133A5 (ja) | ||
| JP2014506244A6 (ja) | 自閉症の診断、治療におけるバイオマーカーおよびその使用 | |
| WO2010032458A1 (ja) | 新規非アルコール性脂肪性肝疾患バイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた非アルコール性脂肪性肝疾患の検出方法 | |
| Snipsøyr et al. | Towards identification of novel putative biomarkers for infective endocarditis by serum proteomic analysis | |
| JP5714285B2 (ja) | 妊娠高血圧症候群マーカーおよびそれを用いた診断 | |
| JP6755649B2 (ja) | 虚血性疾患の診断マーカー | |
| JP2010071953A (ja) | 乳癌マーカーおよびそれを用いた診断 | |
| JP6830899B2 (ja) | 冠動脈疾患の診断マーカー | |
| JP2015108515A (ja) | 大腸癌の診断のための検査方法 | |
| KR102177280B1 (ko) | 호모시스테인 설핀산 또는 시스테인산을 포함하는 급성심근경색 진단용 바이오마커 조성물 | |
| JP7300660B2 (ja) | 大腸がんの検出方法 | |
| JP7336097B2 (ja) | 乳がんに関するペプチドマーカー | |
| JP7032764B2 (ja) | 大腸がんの検出方法 | |
| JP7457300B2 (ja) | 神経変性疾患の診断用ペプチドマーカー | |
| JP5410997B2 (ja) | うつ病およびうつ状態のマーカーおよびそれを用いた検出・診断 | |
| JP2016148623A (ja) | 大腸がんの検出方法 | |
| JP2020016453A (ja) | 敗血症に関連する疾患のペプチドマーカー | |
| CN113287019A (zh) | 亚临床动脉粥样硬化的生物标志物 | |
| JP2014020941A (ja) | 大腸癌のマーカーおよびそれを用いた診断 | |
| WO2022091793A1 (ja) | 糞便由来タンパク質を用いた膵臓がんバイオマーカーの開発 | |
| JP2024117521A (ja) | 膵臓がんの検出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180928 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181012 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190612 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190709 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20190724 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190830 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200114 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200302 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200728 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200826 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6755649 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |