JP2020016453A - 敗血症に関連する疾患のペプチドマーカー - Google Patents
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(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、配列番号1〜10に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、配列番号1〜10に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド
アミノ酸配列からなる3番目のペプチドは、血液凝固第I因子(フィブリノーゲン)β鎖
の部分配列である。配列番号4で表されるアミノ酸配列からなる4番目のペプチドは、血清アルブミンの部分配列である。配列番号5で表されるアミノ酸配列からなる5番目のペプチド及び配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる6番目のペプチドは、コラーゲンα−1の部分配列である。配列番号7で表されるアミノ酸配列からなる7番目のペプチドは、血清アミロイドA−2タンパク質の部分配列である。配列番号8で表されるアミノ酸配列からなる8番目のペプチドは、血液凝固第XIII因子(γグルタミルトランスフェラーゼ)の部分配列である。配列番号9で表されるアミノ酸配列からなる9番目のペプチドは、血清アミロイドA−1タンパク質の部分配列である。配列番号10で表されるアミノ酸配列からなる10番目のペプチドは、血液凝固第I因子(フィブリノーゲン)α鎖の部分
配列である。
代わりに、質量分析用プレートは、支持体表面を塗布、噴霧、蒸着、浸漬、印刷、スパッタリング等の公知の手段でコーティングすることにより、公知の方法により調製することもできる。また、質量分析用プレート上の分子を質量分析する方法自体は公知である(例えばWO 2004/031759)。WO 2004/031759に記載の方法を、必要に応じて適宜改変して使用することができる。
(材料および方法)
1.被験者
入院中の敗血症に罹患した20名の成人患者が本研究に参加した。これらの患者はDIC発症の有無でDIC未発症検体群(non−DIC)およびDIC発症検体群(DIC)の2群に群分けされると共に、敗血症性ショックの有無で敗血症性ショックに罹患していない敗血症検体群(敗血症)と敗血症性ショックに罹患している敗血症性ショック検体群(敗血症性ショック)との群分けされた(表2)。
DICの診断基準
International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH)による DIC 診断基準 (Thromb Haemost.2001 Nov;86(5):1327-30参照)を用いた。
敗血症の診断基準
感染によって発症した全身性炎症反応症候群(SIRS)と定義し、SIRS はBoneらの基準 (Crit Care Med 1989; 17(5): 389-93参照) により診断した。
敗血症性ショックの診断基準
重症敗血症の中で、血圧低下を伴い、十分な急速輸液負荷をおこなっても血圧が回復しないものと定義し、American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conferenceによる診断基準 (Crit Care Med 1992; 20(6): 864-74参照) を用いた。
患者の動脈血のサンプルを22G針を用いて橈骨動脈より動脈血を採取し、血液採取管に入れた。それらのサンプルを室温で1時間静置し、3,000rpmで10分間室温にて遠心分離し、血清を得た。上清を使用するまで-80℃で分けて保存した。
血清中の質量分析によるペプチド解析を、ペプチドームプロファイリングの迅速定量法である、ワンステップの直接転写技術のBLOTCHIP(登録商標)質量分析により行った(Biochem.Biophys.Res.Commun.2009;379(1):110-4)。
サンプルはBLOTCHIP(登録商標)質量分析により4回繰り返し解析した。より統計学的に有意なピークを見出すために、4つのデータを独立データとして使用し、解析ソフトClinProTools 2.2 (Bruker Daltonics社製)を使用してウィルコクソン検定のP値を計算し、P値が0.05以下の場合に有意差ありとみなした。
各標的ペプチドを含む血清を、その同定のために採取した。ペプチドは、Sep-Pak C18固相抽出カートリッジ(Waters Corporation、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード)を用いて、0.1%トリフルオロ酢酸を含む水に80%v/v アセトニトリル(ACN)で抽出した。溶出液をCC-105 遠心濃縮器(株式会社トミー精工, 東京)を用いて100μL以下に濃縮した。次に溶液を0.065% TFAを含む2%v/v CAN水溶液400μL(溶離液Aと称する)に希釈し、C18シリカカラム(COSMOSIL(登録商標) 5C18-AR-II)(ナカライテスク株式会社、京都)を装備したAEKTA精製装置(GE Healthcare UK Ltd, 英国バッキンガムシャー州)にかけた。溶出液を、溶離液Aに対し0.05% TFAを含む80%v/v CANの水溶液で1.0mL/分の流速で0-100%の線形勾配により20個の画分(各1mL)に分けた。各画分をCC-105遠心濃縮器で10μL以下に濃縮し、ペプチドの配列をMALDI-TOF/TOF(UltraFlex II TOF/TOF)及びLC-MS/MS(Q-Exactive;Thermo Fisher Scientific Inc, アメリカ合衆国マサチューセッツ州ワルサム)を用いて分析した。
1.敗血症患者の血清のペプチド解析
血清のペプチド解析をBLOTCHIP(登録商標)質量分析により行った。各ペプチドームプロファイルより得られた質量スペクトルのデータをデータベースに保存した。すべてのMS測定が完了した後、解析ソフトFlexAnalysis2.4を用いて、non−DIC群とDIC群、敗血症群と敗血症性ショック群の各々の2群間でのディファレンシャル解析をそれぞれ行い、ピークごとに2群間で統計的に有意差があるか検討を行った。
上記で有意差のあったピークについて、逆相クロマトグラフィで部分的に精製した血清ペプチドによりMALDI-TOF/TOF及びLC-MS/MSペプチド配列決定分析を行い、10個のペプチドを同定した(表3)。
具体的には、5番目のペプチドは、アミノ酸配列のN末端から4番目のリシン、10番目のプロリン、17番目のプロリン、20番目のプロリン、29番目のプロリン、及び34番目のプロリンが酸素で酸化されていた。
6番目のペプチドは、アミノ酸配列のN末端から1番目のプロリン、10番目のプロリン、12番目のプロリン、31番目のプロリン、33番目のプロリン、及び36番目のプロリンが酸素により酸化されており、28番目のグルタミンが脱アミド化されていた。
配列番号8のペプチドは、アミノ酸配列のN末端から1番目のセリンがアセチル化されていた。
上記のディファレンシャル解析において有意差のあった10個のピークに対し、ピークごとに2群間で統計的に有意差があるか検討を行った。
Claims (16)
- 下記 (a)、(b)、(c)または(d)のペプチドを測定することを含む、該被験者における播種性血管内凝固症候群(DIC)の検出方法。
(a)被験者の生物試料中の、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、配列番号1〜10に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド - 配列番号5で表されるアミノ酸配列のN末端から4番目のリシン、10番目のプロリン、17番目のプロリン、20番目のプロリン、29番目のプロリン、及び34番目のプロリンが酸化されている請求項1に記載の検出方法。
- 配列番号6で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のプロリン、10番目のプロリン、12番目のプロリン、31番目のプロリン、33番目のプロリン、及び36番目のプロリンが酸化されており、28番目のグルタミンが脱アミド化されている請求項1に記載の方法。
- 配列番号8で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のセリンがアセチル化されている請求項1に記載の方法。
- 前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 生体試料を質量分析にかけることを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記 (a)、(b)、(c)または(d)のペプチドの各々を特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 下記 (a)、(b)、(c)または(d)のペプチドの各々を特異的に認識する抗体を含む播種性血管内凝固症候群(DIC)の検出キット。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、配列番号1〜10に表されるアミノ酸配列からなるペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド - 下記(a)、(b)、(c)または(d)のペプチドを測定することを含む、該被験者における敗血症性ショックの検出方法。
(a)被験者の生物試料中の、配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド - 配列番号8で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のセリンがアセチル化されている請求項9に記載の方法。
- 前記生物試料が血液、血漿、血清、唾液、尿、髄液、骨髄液、胸水、腹水、関節液、涙液、眼房水、硝子体液およびリンパ液からなる群より選択される体液からなる、請求項9又は10に記載の方法。
- 生体試料を質量分析にかけることを含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記 (a)、(b)、(c)または(d)のペプチドを特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 下記 (a)、(b)、(c)または(d)のペプチドを特異的に認識する抗体を含む敗血症性ショックの検出キット。
(a)配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド - 下記 (a)、(b)、(c)または(d)のペプチドからなる播種性血管内凝固症候群(DIC)の検出用ペプチド。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号2で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号3で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチド、
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド - 下記 (a)、(b)、(c)または(d)のペプチドからなる敗血症性ショックの検出用ペプチド。
(a)配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される1種又は2種以上のペプチド
(b)上記(a)の各ペプチドの一部であって、連続する10個以上のアミノ酸を有する、1種又は2種以上のペプチド
(c)上記(a)のアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を有する、1種又は2種以上のペプチド
(d)上記(a)のペプチドのアミノ酸配列の各々において、1〜3個のアミノ酸が付加、欠失又は置換されている、1種又は2種以上のペプチド
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