JP2019523758A - 神経変性障害を治療するための腸内微生物叢の制御 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下、2016年5月23日に出願された米国仮出願第62/340408号、2016年8月3日に出願された米国仮出願第62/370578号および2017年1月9日に出願された米国仮出願第62/443952号に基づく優先権を主張するものである。これらの関連出願の内容は、参照によりその全体が明示的に本明細書に援用される。
本発明は、米国国立衛生研究所によって供与された助成金(No.NS085910)に基づく政府支援を得てなされたものである。米国政府は本発明に関し一定の権利を保有する。
別段の記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。たとえば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994);Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)を参照されたい。本発明の開示を目的として以下の用語を以下のように定義する。
神経機能障害は様々なヒト疾患の基礎疾患である。行動障害、精神障害および神経変性障害では、中枢神経系(CNS)に特徴的な神経病変が見られることが多い。神経病変の一つであるアミロイドーシスは、特定の神経タンパク質の異常な凝集から生じ、様々な細胞機能を破壊する。罹患組織では、構造変化を起こした不溶性タンパク質凝集体がしばしば見られ、このような凝集体の構造変化は推定で50種のヒト疾患の要因となっていると考えられている。アミロイドによる神経変性障害(アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病(PD)など)は、アミロイドタンパク質と関連している。これらの疾患の中でもPDは、米国で2番目に罹患率の高い神経変性疾患であり、推定で100万人あるいは60歳以上の米国人口の1%が罹患している。世界中で約300万人のPD患者およびその介護者が、消耗性症状をきたすことが多いPDに苦しんでおり、その症状としては、振戦、筋強剛、運動緩慢、歩行障害などの運動障害が見られる。PDは、環境要因の影響が強く見られる多因子疾患であり、遺伝的要因により発症する症例は10%未満に留まっている。また、α−シヌクレイン(αSyn)の凝集は、シヌクレイノパチーと総称される疾患群(PD、多系統萎縮症、レビー小体疾患などを含む)において病原性であると考えられている。αSynの凝集は段階的に進み、オリゴマーと非一過性線維が神経細胞内に蓄積する。黒質緻密部(SNpc)のドーパミン作動性ニューロンは、αSyn凝集体の作用による傷害を特に受けやすいと見られている。ドーパミン調節薬は、PDの第一線治療薬であるが、重大な副作用を起こすことがあり、効力が失われることが多い。高齢化し続ける社会においてますます増大するPDの負担に対処するため、安全で効果的な治療薬を見出すことが必要とされている。
本明細書において開示されているように、腸内微生物叢の組成の調節を必要とする対象において、たとえば、腸内微生物叢中のPDを増悪させる微生物を減少させたり除去することによって、または健常者由来の微生物叢を導入することによって、またはこれらの両方を実施することによって、腸内微生物叢の組成を調節することができ、これにより、該対象のPDの進行を遅延させることができるという恩恵が得られる。
本明細書において開示されているように、対象において特定のPD関連腸内微生物を同定することによって、重度の運動症状を発症する前にPDを診断することができ、かつ/またはこのようなPD関連腸内微生物を、疾患の進行重症度のマーカーとして使用することができる。
本明細書はさらに、パーキンソン病(PD)に対して保護作用を有する1種以上の細菌種を含む組成物を開示する。PDに対して保護作用を有する細菌種としては、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、リケネラ科(Rikenellaceae)、ペプトストレプトコッカス科(Peptostreptococcaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、クロストリジウム属(Clostridium)、バクテロイデス属(Bacteroides)またはブチリシコッカス属(Butyricicoccus)に属する細菌種が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記組成物は、PDを増悪させる細菌種を含んでいない。たとえば、いくつかの実施形態において、前記組成物は、プロテウス属(Proteus)、ビロフィラ属(Bilophila)、ロゼブリア属(Roseburia)、シュードラミバクター属(Pseudoramibacter)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)およびベイヨネラ科(Veillonellaceae)の少なくとも1つに属する細菌種を含んでいない。いくつかの実施形態において、前記組成物は、プロテウス属(Proteus)、ビロフィラ属(Bilophila)、ロゼブリア属(Roseburia)、シュードラミバクター属(Pseudoramibacter)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)またはベイヨネラ科(Veillonellaceae)に属する細菌種を含んでいない。
後述の実施例1〜8において以下の実験材料および実験方法を使用した。
X染色体上にヘテロ接合型のThy1-α-シヌクレイン外来遺伝子を導入したBDF1系統雌性Thy1-αSynマウスを、野生型雄性BDF1マウスと交配させて、雄性ASOマウスおよび雄性WTマウスを同腹仔として得て研究に使用した。雄性BDF1マウスは、雌性C57BL/6マウスと雄性DBA/2マウスを交配することによって得た(チャールス・リバー、カリフォルニア州ホリスター)。交配ペアは、雌性トランスジェニックマウスと新たに作製した雄性BDF1マウスを6ヶ月ごとに補充した。6ヶ月ごとに新たに作製した雄性マウスを使用して、無菌(GF)Thy1-αSyn交配ペアを帝王切開により得た。外科手術によって子宮を取り出し、胎仔を娩出させ、微生物学的に無菌状態で得られたマウスを無菌(GF)Swiss-Webster里親マウスにより哺育させた。SPF(抗生物質処置)マウスおよびEx-GFマウスは、オートクレーブ滅菌され、換気されたマイクロアイソレーターケージ内で飼育した。GFマウスおよび短鎖脂肪酸(SCFA)処置マウスは、軟質フィルム製のアイソレーター内に設置したオープンケージで飼育し、微生物学的に無菌状態で維持した。糞便由来DNAから16s rRNAをPCRにより解析するとともに、嫌気条件下のブルセラ血液寒天培地および好気条件下のトリプチックソイ血液寒天培地に糞粒を播種することによって、2週に1回無菌状態の確認を行った。
ヒトドナーは、ラッシュ大学のMovement Disorder Clinicで診察した患者から選択した。パーキンソン病(PD)はUK Brain Bank Criteriaに従って診断した。PD患者の除外基準は、非定型パーキンソニズムまたは二次性パーキンソニズムであること;試料採取の3ヶ月前からプロバイオティクスまたは抗生物質を使用していること;NSAIDを使用していること;原発性消化管疾患を有していること;慢性消化管疾患(IBDおよびセリアック病を含む)の既往歴があること;不安定な内科疾患、神経疾患、精神疾患のいずれかを有していること;血小板数が少ないこと(<8万);治療不能なPT時間の延長(9〜15秒)があること;または生検不能な出血の既往歴があることとした。S状結腸鏡検査およびH&E組織染色で患者の直腸粘膜およびS字結腸粘膜を検査したところ、いずれも正常であった。健常コントロールは、可能な限りPD患者群とマッチさせた。健常者の選択基準は、健康診断および血液検査の結果が正常であること;消化器系に関する愁訴、症状、既往歴がいずれもないこと;神経変性疾患がないこと;試料採取の少なくとも3ヶ月前からプロバイオティクス、抗生物質、NSAID、処方薬をいずれも使用していないこととした。
ヒト化マウスを除き、運動機能評価はいずれも、同一のノトバイオート動物施設において行った。ヒト化マウスの実験は、同一施設内のラミナーフローバイオセイフティーキャビネット内で行った。運動機能試験はいずれのマウスにおいても、明期の7時間目〜9時間目に行った。試験はすべて、Fleming et al., 2004, Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human alpha-synuclein. J. Neurosci. 24, 9434-9440(この文献はその内容全体が本明細書に援用される)に記載の研究と同様にして行った。ビームテスト(ビーム横断)を最初に実施し、マウスを約1時間休ませた後、ポールテスト(ポール降下)を行った。翌日に粘着テープ除去テストおよび後肢スコアリングを行った。排泄された糞粒数のカウントは3日以内に行い、その直後に組織を採取した。
長さ0.25mの部材を4つ組み合わせて、長さ1mのプレキシガラス製ビーム(Stark’s Plastics、オハイオ州フォレストパーク)を作製した。各部材の幅をそれぞれ3.5cm、2.5cm、1.5cmおよび0.5cmと段階的に狭め、ビームの上面から1cm下に1cmの張出しを設けた。最も幅の広い部材を、マウスを乗せるためのプラットホームとして使用し、最も幅の狭い端部にホームケージを設置した。試験を実施する前に、ビームの全長を横断できるように2日間マウスを訓練した。1日目の訓練では、ホームケージをプラットホームに近づけて配置し、段階的に幅を狭めたビーム上を前進するようにマウスを前方に誘導して、1回目の試行を行った。次いで、補助を減らして、あるいは全く補助を行わずに、ビーム上でマウスが安定して前進するように促して、さらに2回の試行を行った。2日目の訓練では、ビームの横断試行を3回行った。訓練後のマウスは、ほとんど補助を必要とせずに前進することができた。3日目に、マウスがビームを横断してプラットホームからホームケージに到達するまでの時間を3回の試行で測定した。到達するまでの時間は、マウスが幅2.5cmの部材の上に前肢を乗せてから計測を開始し、前肢の片方がホームケージに到達した時点で計測を終了した。
マウスが掴まりやすいように、長さ0.5m、直径1cmのポールに非粘着性の棚敷きシートを巻き付け、ホームケージに配置した。ポールの最上部からホームケージまで降りるようにマウスを2日間訓練した。1日目の訓練では3回の試行を行った。1回目の試行では、床から1/3の高さにマウスを下向きに掴まらせ、2回目の試行では床から2/3の高さに掴まらせ、3回目の試行では最上部に掴まらせた。2日目の訓練では、ポールの最上部にマウスを下向きに掴まらせ、ホームゲージまで降りるように試行を3回行った。試験当日に、ポールの最上部にマウスを下向きに掴まらせ、ホームケージに降りるまでの時間を計測した。ポールを降りるまでの時間は、実験者がマウスから手を離した瞬間から計測を開始し、マウスの後肢の片方がホームケージの床に到達した時点で計測を終了した。
直径1/4インチの円形粘着ラベル(Avery、カリフォルニア州グレンデール)を鼻孔と前頭の間の鼻梁に貼り付けた。(他のマウスを移動させた)ホームケージにマウスを入れ、粘着ステッカーを完全に剥がすまでの時間を計測した。テストを3回行い、結果を記録した。
Zhang et al., 2014, Motor impairments, striatal degeneration, and altered dopamine-glutamate interplay in mice lacking PSD-95. J. Neurogenet. 28, 98-111(この文献はその内容全体が本明細書に援用される)に記載されている方法と同様にして実験を行った。マウスの尾の中央部をつまんでゆっくりと上に持ち上げ、約5〜10秒間観察した。後肢を内側に屈曲させた程度に基づいて、スコア0、スコア1、スコア2、スコア3のいずれかでマウスを評価した。四肢を自由に動かして四肢を外側に伸ばしたマウスは、抱擁反射を示さなかったものとしてスコア0と評価した。持ち上げられている間に後肢の一方が内側に屈曲したか、あるいは四肢の一部が内側に屈曲した場合はスコア1と評価した。観察時間の大部分において四肢を内側に屈曲させたが、それでもある程度の柔軟性を示していた場合はスコア2と評価した。マウスが直ちに後肢を内側に屈曲させ完全に麻痺した状態になり、柔軟性を全く示さなかった場合はスコア3と評価した。
1cm幅の網目を有する30cm×30cmの金網の中心にマウスを乗せた。金網を逆さまにひっくり返して、床敷きを深くしたオープンケージから約40cmの高さに設置した支持台に置いた。マウスが金網から落ちるまでの時間を計測し、落ちずにしがみついたままの場合は60秒を測定値とした。
マウスをホームケージから取り出し、12cm×25cmの半透明の円筒形容器に入れた。糞粒を5分毎にカウントし、15分間の累積数をカウントした。また、少なくとも3種の課題を実施した対象から収集した行動データを使用して、MATLABソフトウェア(MathWorks)上ですべての運動機能について主成分分析を行った。データをセンタリングし、正規化(s=1)してから、PCA関数を実行した。各対象に対応する因子負荷量を使用して、分散の70.5%を占めるPC1とPC2のみをプロットした。
ペントバルビタールを投与してマウスを鎮静させ、リン酸緩衝生理食塩水を十分に灌流させた後、脳を切断して、脳半球を4%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定した。ビブラトームを使用して50mmの矢状断面切片を作製した。浮遊切片を、抗凝集化/線維化αSyn抗体MJFR1(1:1000;ウサギ;AbCam、英国ケンブリッジ)、抗リン酸化Ser129 αSyn抗体(1:1000;マウス;Biolegend、カリフォルニア州サンディエゴ)およびNeurotrace(ライフテクノロジーズ、カリフォルニア州カールスバッド)、または抗Iba1抗体(1:1000;ウサギ;和光純薬、バージニア州リッチモンド)で染色し、次いで抗マウスIgG-AF488抗体および抗ウサギIgG-AF546抗体(1:1000;ライフテクノロジーズ)で染色した。染色した切片をProFade Diamond(ライフテクノロジーズ)で封入し、10倍の対物レンズを備えたツァイス社製LSM800共焦点顕微鏡で撮影した。マウス1匹につき1領域あたり2〜3視野を撮影し、ImageJソフトウェアを使用して画像を1つにまとめ、分析を行った。ミクログリア像を再構築するため、Erny et al., 2015, Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nat. Neurosci. 18, 965-977(この文献はその内容全体が本明細書に援用される)に記載されている方法と同様にして、Imarisソフトウェアを使用してzスタックデータを1mmごとに画像化し、分析を行った。ミクログリアの細胞体および細胞突起を半自動で再構築し、個々の細胞体に名称を振り、Imarisソフトウェアを使用して各細胞体の直径、突起長および分岐数を測定した。マウス1匹につき1領域あたり20〜60個の細胞を分析した。
灌流後に摘出した全脳を、100mmのメッシュフィルタを通してPBS中でホモジナイズし、メーカーの説明書に従ってMyelin Removal Beads(ミルテニーバイオテク、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用してミエリン断片を磁気分離により除去した。同様に、メーカーの説明書に従ってMicroglia Microbeads(ミルテニーバイオテク、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用した磁気濃縮によりCD11b細胞を濃縮した。免疫蛍光顕微鏡法で濃縮細胞を確認したところ、概して、CD11b陽性に染色された細胞は90%を超えていた。RNA分析を行うため、切断した組織(前頭皮質、尾状核被殻、中脳下部および小脳)またはCD11b細胞を濃縮した細胞ペレットをTrizolで溶解し、DirectZol RNAキット(Zymo Research、カリフォルニア州アーヴィン)を使用してRNAを抽出した。続いて、iScript cDNΑ Synthesis kit(バイオ・ラッド、カリフォルニア州ハーキュリーズ)を使用してcDNAを作製した。前記標的遺伝子に対するプライマーをPrimerBankから入手し、SYBR Greenマスターミックス(アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティー)を使用して、アプライドバイオシステムズ社製7900HT装置でqRT-PCRを行い、DDCT法で定量し、gapdhで補正した(使用したプライマーを前記表1に示す)。
プロテアーゼ阻害剤カクテル(サーモフィッシャー、ペンシルベニア州ピッツバーグ)を含むRIPAバッファー中で組織ホモジネートを調製し、PBSで希釈した。メーカーの説明書に従って、TNF-α ELISAおよびIL-6 ELISA(eBioscience、カリフォルニア州サンディエゴ)ならびにαSyn ELISA(サーモフィッシャー)を行った。ドットブロット分析によるαSyn線維の定量を行うため、前記組織領域から得た1mgの組織ホモジネートから調製した試料1mLを、0.45mmのニトロセルロース膜上にスポットした。トリトンX可溶性画分とトリトンX不溶性画分をウエスタンブロットで比較するため、1%トリトンX-100を含むRIPAバッファー中で脳半球をホモジナイズし、4℃、15,000×gで60分間遠心分離して不溶性タンパク質を沈殿させ、トリトン可溶性上清から分離した。Kluckenら(2006, Clinical and biochemical correlates of insoluble alpha-synuclein in dementia with Lewy bodies. Acta Neuropathol. 111, 101-108(この文献はその内容全体が本明細書に援用される))による過去の報告に従って、不溶性画分を10%ドデシル硫酸ナトリウムに溶解させた。各画分5mgを4%〜20%SDS-PAGE(サーモフィッシャー)で分離し、PVDF膜にブロットした。膜はすべて0.1%Tween-20を含むトリス緩衝食塩水中に溶解した5%ドライスキムミルクでブロッキングした。抗凝集化αSyn抗体(1:2000;ウサギ;Abcam)または抗αSyn抗体(1:1000;ウス;BD)をスキムミルクで希釈し、膜に添加して4℃で一晩インキュベートした。抗ウサギIgG HRPまたは抗マウスIgG HRP(1:1000;Cell Signaling Technology)を膜に添加してタンパク質を検出した。ブロットはすべてバイオ・ラッド社製のGelDoc XR上でClarity化学発光基質(バイオ・ラッド)により検出した。ブロットの濃度測定はImageJソフトウェアを使用して行った。
インビトロにおける凝集動態を調べるため、Chorell et al., 2015, Bacterial chaperones CsgE and CsgC differentially modulate human α-synuclein amyloid formation via transient contacts. PLoS ONE 10, e0140194(この文献はその内容全体が本明細書に援用される)に記載されている方法と同様にして、70mMのαSynを精製した。12mMチオフラビンT(ThT;シグマ アルドリッチ)の存在下において、SCFAの濃度を段階的に上昇させながら、リン酸緩衝生理食塩水(0.01Mリン酸緩衝液、0.0027M塩化カリウム、0.137M塩化ナトリウム、pH7.4)中で70mM精製αSynをインキュベートした。ノンバインディング96ウェルハーフエリアプレート(コーニング#3881)を各実験に使用し、凝集を促すため各ウェルに直径2mmのガラスビーズを加えた。マイクロプレートリーダー(Fluostar OPTIMAマイクロプレートリーダー、BMG Labtech)を使用し、励起フィルタを440±10nmとし、発光フィルタを490±10nmとして、37℃で断続的に振盪しながらThTの蛍光シグナルを記録した。動態曲線は最大蛍光強度で正規化し、最大強度の半分の値に達するまでの時間を求めた。さらに、原子間力顕微鏡(AFM)を用いたイメージングを行うため、試料を超純水で希釈して総タンパク質濃度が約3mMになるように調整し、新たに劈開したマイカ上に希釈試料50mlをピペットで乗せ、そのまま乾燥させた。共振周波数が約150kHzの金コーティング単結晶シリコンカンチレバー(ばね定数:約5.1N/m)を備えたモジュール型走査プローブ顕微鏡NTEGRA Prima(NT-MDT)を使用して、断続的コンタクトモードで試料のイメージングを空気中で行った。AFM像は、オープンソースのGwyddionソフトウェアで加工した。
糞便試料は12週齢のマウスから採取した。各糞粒を18Ωの滅菌脱イオン水1mLと混合した。ペレットと水の混合物を、3200rpmで5分間振盪することによりホモジナイズし、4℃、13,000rpmで15分間遠心分離した。0.2mmのPVDF膜を備えた直径13mmのAcrodisc LC滅菌シリンジフィルタ(Pall Life Sciences)を使用して上清を濾過した。この濾液を使用して高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析を行った。糖分析カラム(アミネックスHPX-87Hカラム、バイオ・ラッド)とフォトダイオードアレイ検出器(PDA、島津製作所)を備えたHPLC(LC-20AT、島津製作所)を使用して短鎖脂肪酸(SCFA)を分析した。溶離液として5mM H2SO4を使用し、0.6mL/分の流速で通液した。カラム温度は50℃とし、分析時間は60分とした。標準曲線は、10mM揮発性脂肪酸標準溶液(酢酸、酪酸、ギ酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、イソカプロン酸およびヘプタン酸)を50nM〜5000nMに希釈することによって作製した。SCFAの濃度は溶解性化学的酸素要求量で正規化した。糞便上清中のsCOD値は、メーカーの推奨に従って高域(20〜1500mg/L)Hach COD digestionチューブ(Hach Company、ラブランド)を使用して測定した。Hach社製分光光度計を使用して波長620nmでCODを測定した。
遺伝子型およびドナー別に1〜3匹の群に分けて収容したマウスから、糞便移植後7日目、14日目、21日目および49日目に糞粒を回収した。Gilbert et al., 2014, The Earth Microbiome project: successes and aspirations. BMC Biol. 12, 69(この文献はその内容全体が本明細書に援用される)に記載の、Earth Microbiome Projectで使用されたプロトコルに従って試料のシーケンシングを行った。簡潔に説明すると、MoBio Power soilキット(カリフォルニア州カールスバッド)を使用してDNAを抽出し、Waltersら(2015)に記載のバーコードプライマーを使用して16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅した。シーケンシングはイルミナ社製のMiSeqを使用して行った。OTU(operational taxonomic unit)のクラスタリングは、QIIME1.9(Caporasoら(2010)に記載)においてSortMeRNA2.0(Kopylovaら(2012)に記載)を使用して、2013年8月に更新されたGreengenesデータベース(McDonaldら(2012)に記載)と照合したclosed reference pickingにより行った。レアファクション解析によって1試料あたり7500リードを再サンプリングしたOTU tableを作製し、α多様性およびβ多様性を算出した。群間の存在度の比較は、リード数が7500個未満の試料を除外したOTU tableを使用して行った。weighted UniFrac距離およびunweighted UniFrac距離(LozuponeおよびKnight(2005)に記載)はQIIME1.9で算出した。Emperor0.9.4(Vazquez-Baezaら(2013)に記載)を使用して、UniFrac距離を主座標分析(PCoA)で視覚化した。機能予測は、PICRUSt1.0(Langilleら(2013)に記載)を使用して行い、予測された機能のレパートリーはBray Curtis距離を使用して比較した。有意差検定は、scikit-bio0.4.2を使用してpermanovaを実施するとともに、QIIME1.9を使用して並べ替えt試験を実施することによって行い、いずれの検定でも1検定あたりの並べ替えは999回とした。群間の存在度の比較の算出は、属レベルでの分類群およびKEGGデータベースに基づく相対存在度を使用して行い、この際、合計が1となるようにカウントの微調整を行った。この試験は、scikit-bio0.4.2においてANCOM(Mandalら(2015)に記載)を使用して行い、ボンフェローニ法で補正したα=0.1を棄却閾値とした一元配置分散分析で評価した。健常ドナーまたはPDドナーから得た試料の定着は、BDF1系統マウスまたはThy1-αSyn遺伝子型マウスにおいて比較した。各群間で有意に異なる分類群を比較し、BDF1系統とThy1-αSyn系統の両方に有意、Thy1-αSyn系統のみに有意、またはBDF1系統に有意に分類した。グラフのプロットはSeaborn0.7.0を使用して行った。
マイクロバイオーム集団の統計分析は上記で詳述したとおりである。これ以外のデータセットはGraphPad Prism 6ソフトウェアで分析した。一対比較は両側t検定で実施した。群間比較は一元配置分散分析で実施した。p値、n値、分布の中心の定義および分散の測定は、各図面の凡例に示した。
16sの配列データおよびメタデータはオンラインで入手可能であり、QIITAウェブサイト(https://qiita.ucsd.edu/)のstudy accession No.10483や、EMBL ENAデータベース(http://www.ebi.ac.uk/ena)のstudy accession No.ERP019564から入手することができる。
腸内微生物による運動機能障害および消化管機能障害の増悪
本実施例では、複雑な微生物叢を有するASOマウスと野生型マウスとを使用して、腸内微生物により運動機能障害および消化管機能障害が増悪することを示す。
αSyn病変における腸内微生物叢の必要性
本実施例は、腸内微生物叢を有するマウスにおいてαSyn病変が増加することを示す。
微生物叢によるαSyn依存性ミクログリア活性化
本実施例では、微生物叢によってαSyn依存性にミクログリアが活性化されることを示す。
出生後における微生物からのシグナルによるαSyn依存性の病的機能変化の調節
本実施例は、出生後における微生物からのシグナルが、αSyn依存性の病的機能変化を調節することを示す。
短鎖脂肪酸(SCFA)のみによるαSyn介在性神経炎症の促進
本実施例では、αSynを介した神経炎症が短鎖脂肪酸(SCFA)のみで促進されることを示す。
SCFAのみによる運動障害の増悪
本実施例では、αSynで刺激されたミクログリアの活性化および運動機能障害がSCFAによって促進されることを示す。
PDにおけるマイクロバイオームの乱れ(ディスバイオシス(dysbiosis))
本実施例では、PDにおけるマイクロバイオームの乱れ(ディスバイオシス(dysbiosis))を示す。
PD患者から得られた腸内微生物叢による運動機能障害の促進
本実施例では、PD患者から得られた腸内微生物叢が運動機能障害を促進することを示す。
パーキンソン病(PD)の治療
本実施例はPD患者の治療について示す。
Claims (80)
- 対象のシヌクレイノパチーを治療する方法であって、
シヌクレイノパチーに罹患しており、該シヌクレイノパチーの治療を必要とする対象の腸内微生物叢の組成を調節することを含む方法。 - 対象におけるシヌクレイノパチーの発症を遅延させるか、またはその発症の可能性を低下させる方法であって、
シヌクレイノパチーを発症するリスクがあり、該シヌクレイノパチーの発症の遅延またはその発症の可能性の低下を必要とする対象の腸内微生物叢の組成を調節することを含む方法。 - 対象の運動障害を改善する方法であって、
運動障害の改善を必要とする対象の腸内微生物叢の組成を調節することを含む方法。 - 前記方法を必要とする対象を特定することを含み、前記方法を必要とする該対象がα−シヌクレイン(αSyn)の凝集異常を示す、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法を必要とする対象を特定することが、該対象におけるαSynの凝集率および/もしくは凝集度を測定すること、該対象における不溶性αSynタンパク質凝集体の除去率および/もしくは除去度を測定すること、またはこれらの組み合わせを測定することを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記対象の脳におけるαSynの凝集率および/もしくは凝集度、前記対象の脳における不溶性αSynタンパク質凝集体の除去率および/もしくは除去度、またはこれらの組み合わせを測定する、請求項5に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節した後に、該対象におけるαSynの凝集率および/もしくは凝集度を測定すること、該対象における不溶性αSynタンパク質凝集体の除去率および/もしくは除去度を測定すること、またはこれらの組み合わせを測定することをさらに含む、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の1つ以上の身体障害を改善することができる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の1つ以上の消化管機能を改善することができる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の便秘を緩和することができる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記運動障害が、振戦、筋強剛、運動緩慢、歩行障害またはこれらの任意の組み合わせである、請求項3〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ミクログリアの活性化の低下を必要とする対象においてミクログリアの活性化を低下させる方法であって、該対象の腸内微生物叢の組成を調節することを含む方法。
- α−シヌクレイン(αSyn)凝集体の減少を必要とする対象においてαSyn凝集体を減少させる方法であって、該対象の腸内微生物叢の組成を調節することを含む方法。
- 不溶性αSynタンパク質凝集体の除去を促進することができるか、αSynタンパク質の凝集を減少させることができるか、またはこれらの両方を行うことができる、請求項13に記載の方法。
- 前記対象におけるαSynの凝集率および/もしくは凝集度を測定すること、前記対象における不溶性αSynタンパク質凝集体の除去率および/もしくは除去度を測定すること、またはこれらの組み合わせを測定することを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記対象の脳におけるαSynの凝集率および/もしくは凝集度、前記対象の脳における不溶性αSynタンパク質凝集体の除去率および/もしくは除去度、またはその組み合わせを測定する、請求項13に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節した後に、該対象におけるαSynの凝集率および/もしくは凝集度を測定すること、該対象における不溶性αSynタンパク質凝集体の除去率および/もしくは除去度を測定すること、またはこれらの組み合わせを測定することをさらに含む、請求項13〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 神経炎症の緩和を必要とする対象において神経炎症を緩和する方法であって、該対象の腸内微生物叢の組成を調節することを含む方法。
- 前記方法を必要とする対象が、シヌクレイノパチーに罹患している対象である、請求項3〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症またはこれらの任意の組み合わせである、請求項1、2および19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シヌクレイノパチーがパーキンソン病である、請求項20に記載の方法。
- 前記シヌクレイノパチーが、原発性もしくは特発性のパーキンソニズム、二次性もしくは後天性のパーキンソニズム、遺伝性パーキンソニズム、パーキンソンプラス症候群もしくは多系統変性症、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項20に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を正常レベルに回復させる、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、該対象に1種以上の抗生物質を投与することを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1種以上の抗生物質が、アンピシリン、バンコマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシンまたはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記1種以上の抗生物質が、リファンピシンおよび/またはミノサイクリンを含まない、請求項24に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、パーキンソン病(PD)を増悪させる1種以上の微生物代謝産物に対する阻害剤を、該対象に投与することを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、パーキンソン病(PD)を増悪させる1種以上の微生物代謝産物に対する抗体、PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物のインビボ合成中間体に対する抗体、またはPDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物のインビボ合成基質に対する抗体を、該対象に投与することを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、パーキンソン病(PD)を増悪させる1種以上の微生物代謝産物のインビボ合成に関与する酵素に対する阻害剤を、該対象に投与することを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物が、1種以上の脂肪酸、その塩もしくはエステル、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項28または29に記載の方法。
- 前記PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物が、1種以上の短鎖脂肪酸(SCFA)、その塩もしくはエステル、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項28または29に記載の方法。
- 前記PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物が、1種以上の中鎖脂肪酸、1種以上の長鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸の塩もしくはエステル、長鎖脂肪酸の塩もしくはエステル、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項28または29に記載の方法。
- 前記PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物が、短鎖脂肪酸(SCFA)である酢酸塩、短鎖脂肪酸(SCFA)であるプロピオン酸塩、短鎖脂肪酸(SCFA)である酪酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項28または29に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、該対象において、パーキンソン病(PD)に対して保護作用を有する1種以上の細菌種の量を増加させることを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、パーキンソン病(PD)に対して保護作用を有する1種以上の細菌種を含む組成物を、該対象に投与することを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PDに対して保護作用を有する1種以上の細菌種のうち少なくとも1種が、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、リケネラ科(Rikenellaceae)、ペプトストレプトコッカス科(Peptostreptococcaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、クロストリジウム属(Clostridium)、バクテロイデス属(Bacteroides)またはブチリシコッカス属(Butyricicoccus)に属する細菌種である、請求項35に記載の方法。
- 前記組成物が、プロバイオティクス組成物、栄養機能組成物、医薬組成物またはこれらの任意の組み合わせである、請求項35または36に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、糞便移植、微生物叢の正常化、微生物の定着、腸内微生物叢の再構築、プロバイオティクス処置またはこれらの組み合わせを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、該対象において、パーキンソン病(PD)を増悪させる1種以上の細菌種の量を減少させることを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PDを増悪させる1種以上の細菌種のうち少なくとも1種が、プロテウス属(Proteus)、ビロフィラ属(Bilophila)、ロゼブリア属(Roseburia)、シュードラミバクター属(Pseudoramibacter)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)またはベイヨネラ科(Veillonellaceae)に属する細菌種である、請求項39に記載の方法。
- 前記PDを増悪させる1種以上の細菌種のうち少なくとも1種が、短鎖脂肪酸(SCFA)産生細菌である、請求項39に記載の方法。
- 前記SCFA産生細菌が、KEGGのK00929ファミリー、K01034ファミリーまたはK01035ファミリーに属する細菌である、請求項41に記載の方法。
- 前記対象の腸内微生物叢の組成を調節することが、処置を受ける該対象に、健常な対象から得た腸内微生物叢を導入することを含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のシヌクレイノパチーを治療する方法であって、
前記対象に抗生物質を投与すること;および
パーキンソン病(PD)を増悪させる微生物代謝産物に対する阻害剤を前記対象に投与すること
の1つ以上を含む方法。 - 対象におけるシヌクレイノパチーの発症を遅延させるか、またはその発症の可能性を低下させる方法であって、
前記対象に抗生物質を投与すること;および
パーキンソン病(PD)を増悪させる微生物代謝産物に対する阻害剤を前記対象に投与すること
の1つ以上を含む方法。 - 前記抗生物質が、リファンピシンでもなくミノサイクリンでもない、請求項44または45に記載の方法。
- 前記シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項44または45に記載の方法。
- パーキンソン病様症状の改善を必要とする対象のパーキンソン病様症状を改善する方法であって、
前記対象に抗生物質を投与すること;
前記対象に抗炎症剤を投与すること;および
パーキンソン病(PD)を増悪させる1種以上の微生物代謝産物に対する阻害剤を前記対象に投与すること
の1つ以上を含む方法。 - 前記抗炎症剤および前記抗生物質がミノサイクリンではない、請求項48に記載の方法。
- 前記パーキンソン病様症状が、運動機能障害、α−シヌクレイン(αSyn)の凝集の増強、ミクログリアの異常活性化またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項48または49に記載の方法。
- 前記パーキンソン病様症状が、振戦、運動緩慢、筋強剛、姿勢異常およびバランス異常、自動運動の消失、発語障害、筆記障害またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項48または49に記載の方法。
- PDを増悪させる微生物代謝産物に対する前記阻害剤が、PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物に対する抗体、PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物のインビボ合成中間体に対する抗体、PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物のインビボ合成基質に対する抗体、PDを増悪させる1種以上の微生物代謝産物のインビボ合成に関与する酵素に対する阻害剤、またはこれらの組み合わせである、請求項44〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象または前記方法を必要とする対象が抗生物質による処置を受けていない、請求項1〜23および請求項27〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象または前記方法を必要とする対象に抗生物質を投与することを含まない、請求項1〜23および請求項27〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象または前記方法を必要とする対象が、リファンピシンおよび/またはミノサイクリンによる処置を受けていない、請求項1〜23および請求項27〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象または前記方法を必要とする対象が、腸内微生物叢の組成の調節またはその他の処置を行う前の少なくとも12時間、1日間、5日間、10日間または20日間に、抗生物質による処置を受けていない、請求項1〜23および請求項27〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象または前記方法を必要とする対象が、腸内微生物叢の組成の調節またはその他の処置を行った後の少なくとも12時間、1日間、5日間、10日間または20日間に、抗生物質による処置を受けない、請求項1〜23および請求項27〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象において、PDに関連する1種以上の細菌種の存在および/またはその量を測定することによって、前記方法を必要とする対象を特定することをさらに含む、請求項1〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 対象のパーキンソニズムを診断する方法であって、
該対象において、パーキンソン病(PD)に関連する1種以上の細菌種の存在および/またはその量を測定することを含み、PDに関連する1種以上の細菌種が存在していること、および/またはその量が異常であることから、該対象がパーキンソニズムの症状を発症するリスクがあること、またはパーキンソニズムの症状を患っていることが示される方法。 - 前記PDに関連する1種以上の細菌種のうち少なくとも1種が、プロテウス属(Proteus)、ビロフィラ属(Bilophila)、ロゼブリア属(Roseburia)、シュードラミバクター属(Pseudoramibacter)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)またはベイヨネラ科(Veillonellaceae)に属する細菌種である、請求項59に記載の方法。
- 前記対象の腸において、PDに関連する1種以上の細菌種の存在および/またはその量を測定する、請求項59または60に記載の方法。
- PDに関連する1種以上の細菌種が存在すること、および/またはその量が異常であることから、前記対象がパーキンソニズムを発症するリスクがあることが示される、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。
- PDに関連する1種以上の細菌種が存在すること、および/またはその量が異常であることから、前記対象がパーキンソニズムに罹患していることが示される、請求項59〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パーキンソニズムが、原発性もしくは特発性のパーキンソニズム、二次性もしくは後天性のパーキンソニズム、遺伝性パーキンソニズム、パーキンソンプラス症候群もしくは多系統変性症、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項59〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パーキンソニズムがパーキンソン病である、請求項64に記載の方法。
- 前記対象が成人である、請求項1〜65のいずれか1項に記載の方法。
- パーキンソン病(PD)に対して保護作用を有する1種以上の細菌種を含む組成物。
- 前記PDに対して保護作用を有する1種以上の細菌種のうち少なくとも1種が、ラクノスピラ科(Lachnospiraceae)、リケネラ科(Rikenellaceae)、ペプトストレプトコッカス科(Peptostreptococcaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、クロストリジウム属(Clostridium)、バクテロイデス属(Bacteroides)またはブチリシコッカス属(Butyricicoccus)に属する細菌種である、請求項67に記載の組成物。
- PDを増悪させる細菌種を含まない、請求項67または68に記載の組成物。
- プロテウス属(Proteus)、ビロフィラ属(Bilophila)、ロゼブリア属(Roseburia)、シュードラミバクター属(Pseudoramibacter)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)およびベイヨネラ科(Veillonellaceae)の少なくとも1つに属する細菌種を含まない、請求項67または68に記載の組成物。
- プロテウス属(Proteus)、ビロフィラ属(Bilophila)、ロゼブリア属(Roseburia)、シュードラミバクター属(Pseudoramibacter)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)またはベイヨネラ科(Veillonellaceae)に属する細菌種を含まない、請求項67または68に記載の組成物。
- 病原性クロストリジウム属細菌を含まない、請求項67〜71のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記PDに対して保護作用を有する1種以上の細菌種のうち少なくとも1種が、生きている細菌である、請求項67〜72のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記PDに対して保護作用を有する1種以上の細菌種が、生きている細菌である、請求項67〜72のいずれか一項に記載の組成物。
- プロバイオティクス組成物、栄養機能組成物、医薬組成物またはこれらの任意の組み合わせである、請求項67〜71のいずれか一項に記載の組成物。
- 1種以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である、請求項67〜71のいずれか一項に記載の組成物。
- パーキンソン病(PD)を増悪させる微生物代謝産物に対する阻害剤と1種以上の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 前記PDを増悪させる微生物代謝産物が、脂肪酸またはその塩もしくはエステルである、請求項77に記載の医薬組成物。
- 前記PDを増悪させる微生物代謝産物が、短鎖脂肪酸(SCFA)、中鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸、短鎖脂肪酸の塩もしくはエステル、中鎖脂肪酸の塩もしくはエステル、または長鎖脂肪酸の塩もしくはエステルである、請求項77に記載の医薬組成物。
- 前記阻害剤が、PDを増悪させる微生物代謝産物に対する抗体、PDを増悪させる微生物代謝産物のインビボ合成中間体に対する抗体、PDを増悪させる微生物代謝産物のインビボ合成基質に対する抗体、PDを増悪させる微生物代謝産物のインビボ合成に関与する酵素に対する阻害剤、またはこれらの組み合わせである、請求項77〜79のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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