CN113030318B

CN113030318B - 血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物的应用

Info

Publication number: CN113030318B
Application number: CN202110254727.2A
Authority: CN
Inventors: 肖勤; 杨晓东; 何晓勤; 钱逸维
Original assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2021-03-09
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2041-03-09
Also published as: CN113030318A

Abstract

本发明公开了血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物的应用，属于生物医药技术领域。血浆短链脂肪酸为乙酸和丙酸，其筛选方法包括：收集多系统萎缩患者、帕金森病患者和健康对照者的血浆样本若干份，基于气相色谱‑质谱联用分别提取其中血浆短链脂肪酸，筛选得到多系统萎缩患者和帕金森病患者的差异血浆短链脂肪酸后进行受试者工作特征曲线分析，确定乙酸和丙酸作为多系统萎缩诊断标志物，可用于与帕金森病的鉴别诊断。本发明以血浆为样本,首次筛选出血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物，可用于与帕金森病的辅助鉴别诊断，操作简单、价格低廉、检测时间短、灵敏度高和特异性强。

Description

血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物的应用，可用于与帕金森病的鉴别诊断。

背景技术

多系统萎缩(Multiple system atrophy，MSA)是一种散发、成年起病、进展相对较快的神经系统退行性疾病，主要临床特征为：帕金森样症状、小脑性共济失调、自主神经功能障碍及锥体束征症状，多系统萎缩根据临床症状分为两个亚型：以帕金森病样症状为主的多系统萎缩帕金森型(multiple system atrophy with predominant parkinsonism，MSA-P)和以小脑性共济失调为主的多系统萎缩小脑型(multiple system atrophy withpredominant cerebellar ataxia，MSA-C)。多系统萎缩的病理特征为少突胶质细胞胞质内出现以α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)异常积聚体为核心成分的细胞质包涵体，其病因和发病机制目前仍不明确。由于多系统萎缩与帕金森病(Parkinson's disease，PD)同为神经系统退行性疾病，二者在临床症状上有重叠，临床表现常常很相似，单靠临床症状很难区分，特别是在疾病早期很难鉴别，尤其是多系统萎缩帕金森型与帕金森病。多系统萎缩疾病进展相对较快，且对左旋多巴治疗暂时有效甚至无效，因此目前仅有对症治疗，缺乏特异性治疗，准确的诊断对患者的治疗、预后显得尤为重要。因此，一方面亟需找到灵敏可靠的生物学标志物，另一方面需要操作简便、经济的辅助检查手段为多系统萎缩诊断提供帮助。

目前已有的关于多系统萎缩诊断的生物学标志物研究主要集中在临床症状、神经影像和生物化学几方面：(1)临床症状；多系统萎缩主要临床特征为：帕金森样症状、小脑性共济失调、自主神经功能障碍及锥体束征症状。多系统萎缩确诊难度大，且与帕金森病等其他神经系统退行性疾病具有相似的临床表现，单靠临床表现很难区分。(2)神经影像；目前已知的多系统萎缩诊断影像学方法有超声、CT、MRI及核医学等，但是单一的影像学征象不具有单独的高度敏感性与特异性，需要综合多个影像学表现才能提高诊断的准确性，且影像学方法因价格昂贵、实践性不强难以推广。(3)生物化学。关于多系统萎缩生物化学标志物研究涉及免疫、炎症、氧化应激、细胞凋亡等多个领域，Borghi等首次在脑脊液中检测到α-Syn后，有关该项生物学标志物的研究备受关注，但关于α-Syn研究结果不一致，且由于腰穿为有创操作，也限制脑脊液检测在临床应用价值。有研究者开始关注外周血生物标志物，但是来自血液的研究结果也并不完全相同，且单一的体液标志物敏感度和特异度较低，两种及以上的标志物组合可提高诊断和鉴别诊断的特异度和敏感度。因此，需要找到敏感度和特异性高且可在临床广泛应用的多系统萎缩诊断生物学标记物。

肠道菌群作为肠道内最重要的功能组分，对人类健康和疾病有重要影响。近几年来，肠道菌群在肠-脑轴中所扮演的角色逐渐被认识并成为研究热点，一个涉及中枢神经系统、神经内分泌和神经免疫系统、自主神经系统、肠神经系统和肠道微生物的全新概念肠道微生物-肠-脑轴已被提出，肠-脑轴功能障碍在运动障碍疾病中扮演重要角色，如多系统萎缩和帕金森病。目前研究提示肠道菌群和肠道炎症是多系统萎缩发病的一个重要环境因素。现有研究肠道菌群与多系统萎缩的关系发现MSA患者的确存在肠道菌群紊乱。除了多系统萎缩，现有大量研究也表明不同人群的PD患者也存在肠道菌群紊乱及其代谢物失调。但是基于多系统萎缩和帕金森病具有不同的肠道菌群基因诊断标志物，提示两种疾病的肠道菌群代谢致病模式可能不同。短链脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFAs)，主要由结肠细菌发酵膳食纤维产生，在调节肠道稳态和免疫功能以及维持肠壁紧密连接方面发挥重要作用，更有研究发现肠道中产生SCFAs的细菌通过促进血脑屏障的紧密连接蛋白的表达加强血脑屏障功能，SCFAs可由肠道吸收，经过门静脉系统到达肝脏进入血液循环。目前有报道MSA患者血液中存在菌群改变，血浆SCFAs与帕金森病的疾病严重程度和抗帕金森病药物有关，既往关于MSA患者的肠道菌群研究也主要在肠道菌群差异，但未见报道MSA患者血液中SCFAs的变化。MSA患者的粪便SCFAs(包括丁酸、乙酸和丙酸)水平较低，与粪便SCFAs相比，血浆SCFAs可能更好地代表进入血液的SCFAs在多系统萎缩发病中的潜在作用。

发明内容

针对现有技术诊断多系统萎缩如下缺陷：(1)多系统萎缩与其他神经系统退行性疾病具有相似的临床表现，尤其是帕金森病，单靠临床表现很难区分；(2)多系统萎缩单一的影像学征象不具有高度敏感性与特异性，多影像学方法因价格昂贵、实践性不强难以推广；(3)生物化学方法结果不一，无法正确鉴别，本发明的第一目的是，提供血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物的应用，为多系统萎缩的诊断及其与帕金森病的鉴别诊断提供操作简便且经济的辅助检查手段。

本发明的第二目的是，提供所述多系统萎缩诊断标志物在制备与帕金森病鉴别诊断的多系统萎缩诊断产品中的应用。

本发明的第三目的是，提供基于气相色谱-质谱检测数据判断建立所述多系统萎缩和帕金森病鉴别诊断的模型。

本发明的第四目的是，提供基于气相色谱-质谱检测数据判断建立所述多系统萎缩帕金森型和帕金森病鉴别诊断的模型。

为实现上述第一目的，本发明采用的技术方案是：血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物的应用。

一些实施例中，所述血浆短链脂肪酸包括乙酸和丙酸。

一些实施例中，所述血浆短链脂肪酸为乙酸，可用于诊断多系统萎缩。

一些实施例中，所述血浆短链脂肪酸为乙酸和丙酸，可用于与帕金森病的鉴别诊断。

一些实施例中，所述血浆短链脂肪酸的筛选方法包括以下步骤：

(1)收集多系统萎缩患者、帕金森病患者和健康对照者的血浆样本若干份；

(2)基于气相色谱-质谱联用(Gas chromatography–Mass spectrometry，GC-MS)分别提取步骤(1)中所述血浆样本中短链脂肪酸；

(3)比较步骤(2)中所述血浆短链脂肪酸，筛选多系统萎缩患者和帕金森病患者及健康对照的差异血浆短链脂肪酸；

(4)对步骤(3)中所述差异血浆短链脂肪酸进行受试者工作特征曲线分析，确定血浆短链脂肪酸乙酸和丙酸作为多系统萎缩诊断标志物，可用于与帕金森病的鉴别诊断。

一些实施例中，所述多系统萎缩是以帕金森病样症状为主的多系统萎缩帕金森型。

为实现上述第二目的，本发明采用的技术方案是：所述多系统萎缩诊断标志物在制备与帕金森病鉴别诊断的多系统萎缩诊断产品中的应用。

一些实施例中，所述多系统萎缩诊断产品为试剂盒，其包含截点浓度的所述血浆短链脂肪酸。

一实施例中，所述血浆短链脂肪酸为乙酸，以乙酸为诊断标志物的截点浓度为39.02μmol/L。

一实施例中，所述血浆短链脂肪酸为乙酸和丙酸，单独以乙酸为诊断标志物的截点浓度为30.85μmol/L，单独以丙酸为诊断标志物的截点浓度为3.82μmol/L。

一些实施例中，当所述多系统萎缩为多系统萎缩帕金森型时，单独以乙酸为诊断标志物的截点浓度为37.50μmol/L，单独以丙酸为诊断标志物的截点浓度为3.82μmol/L。

为实现上述第三目的，本发明采用的技术方案是：基于气相色谱-质谱检测数据判断建立多系统萎缩和帕金森病鉴别诊断的模型，所述模型如下：

X1＝-0.132+0.0127*A+0.0658*B；Prob1＝1/(1+e^X1)(截点值(Cutoff)＝0.5)；

其中，A、B分别为乙酸和丙酸根据气相色谱-质谱得到的血浆浓度值；

Prob1表示判断为帕金森病的概率，截点值Cutoff＝0.5。

为实现上述第四目的，本发明采用的技术方案是：基于气相色谱-质谱检测数据判断建立多系统萎缩帕金森型和帕金森病鉴别诊断的模型，所述模型如下：

X2＝0.0973+0.0119*A+0.0525*B；

Prob2＝1/(1+e^X2)(截点值(Cutoff)＝0.5)；

Prob2表示判断为帕金森病的概率，截点值Cutoff＝0.5。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明首次提出通过检测血浆短链脂肪酸发现MSA患者、PD患者与健康对照者的血浆短链脂肪酸存在差异，筛选出差异血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩的诊断标志物，可用于与帕金森病的鉴别诊断，可用于MSA患者与PD患者的辅助鉴别诊断，对早期诊断、早期干预，以及深入了解多系统萎缩和帕金森病的病理机制等有重要意义。

(2)本发明以血浆为样本，相较于脑脊液等样本易得、收集方便、数量大，价格相较于神经影像低且检测周期短，通过检测血浆标志物就可以进行鉴别诊断，适合我国人群中大范围临床诊断多系统萎缩，并且辅助鉴别诊断多系统萎缩和帕金森病，为多系统萎缩诊断提供新的思路与方向。

(3)本发明提出的血浆短链脂肪酸辅助诊断多系统萎缩操作简单、价格低廉、检测时间短、灵敏度高和特异性强。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

附图作为本申请的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1是本发明的一实施例中血浆短链脂肪酸的筛选方法流程图。

图2是经过筛选得到的差异短链脂肪酸，A：乙酸在MSA患者、PD患者、HC(healthycontrol)中的差异；B：丙酸在MSA患者、PD患者和HC中的差异；C：乙酸在MSA-P患者和PD患者中的差异；D：丙酸在MSA-P患者和PD患者中的差异。

图3是血浆短链脂肪酸区别MSA与HC(A)、MSA与PD(B)、MSA-P型与PD(C)的ROC曲线；A：乙酸区分25例多系统萎缩患者和46例健康对照结果；B：乙酸、丙酸区分25例多系统萎缩患者和46例帕金森病患者结果；C：乙酸、丙酸区分11例多系统萎缩帕金森型患者和46例帕金森病患者结果。

具体实施方式

下面通过具体实例和附图，对本发明的技术方案做进一步的菌体说明。应当理解，以下描述的具体实例仅用于解释文本发明，并不用于限定本发明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员咋没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下通过临床实验筛选确定血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩的诊断标志物，可用于与帕金森病的鉴别诊断，本临床实验得到上海交通大学医学附属瑞金医院伦理委员会批准，所有受试者自愿参加，均被口头告知实验目的并签署知情同意书。

实验对象：从门诊收集MSA患者、PD患者及健康对照者。MSA患者入组标准包括：临床诊断为可能的或者很有可能的多系统萎缩，诊断标准参照第二版多系统萎缩诊断专家共识。PD患者入组标准包括临床确诊的原发性帕金森病患者，诊断标准参照英国脑库帕金森病诊断标准，其他入组标准包括：(1)自愿参加本次研究；(2)近3个月内未服用抗生素；(3)近3个月内未使用免疫抑制剂；(4)排除继发性帕金森病、痴呆等其他神经系统疾病；(5)排除乳糜泻、慢性胰腺炎、炎症性肠病等消化道疾病；(6)无恶性疾病，如肿瘤、心衰等；(7)无影响肠道菌群的其他慢性疾病：包括糖尿病、肝硬化、心血管疾病等。健康配偶入组要求无疾病史。得到符合条件的25个MSA患者(其中16名为女性患者，平均年龄61.60±6.81岁)、46个PD患者(其中32个女性，平均年龄为64.08±7.87岁)及46个健康对照者(其中24个女性，平均年龄为64.67±7.94岁)。

临床资料采集：所有入组的患者均记录基本人口学信息，同时采用统一的体重秤和皮尺，在光线好的空间内测量身高与体重，并计算身体质量指数(body mass index，BMI)。所有的MSA患者和PD患者由至少两个资深运动障碍病专家确诊，相关临床资料的收集采取面对面访谈的形式。MSA患者、PD患者基本临床资料包括：起病年龄、病程、用药情况。患者的用药当量按照经典文献计算方法换算成左旋多巴等效剂量(Levodopa equivalentdoses，LED)。便秘评定和便秘严重度分别使用经典罗马III诊断标准和Wexner便秘评分系统。营养评估采用食物频率量表。

样本收集：所有入组实验对象用统一的血液采样器收集血液样本。所有收集的血液样本送至瑞金医院实验室，在实验室将收集的血液样本进行离心(3000rpm，10分钟)，得到血浆，提取至1.5mL离心管并标记，置于-80℃冰箱储存备用。

实施例1

筛选血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物，可用于与帕金森病的鉴别诊断。具体方法如图1所示，具体步骤如下：

步骤一、检测血浆短链脂肪酸的含量。针对收集的上述实验对象血浆样本，使用GC-MS检测血浆短链脂肪酸的含量，具体步骤如下：

(1)取血浆100μL加50μL 50％水稀释的浓硫酸，再加入200μL乙醚溶液(含内标0.5μg/ml)，混匀1分钟，4℃，12000rpm离心20分钟，4℃静置30分钟，取上清液乙醚层后上机测定。

(2)采用7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS，Agilent Technologies)进行短链脂肪酸检测,提取包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸和己酸的血浆短链脂肪酸，气相色谱-质谱条件如下：

色谱柱：使用FFAP毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um，Agilent，USA)；升温程序：初始温度100℃保持1分钟，以5℃/min升到160℃，之后以40℃/min升到240℃保持10分钟；载气：氦气(纯度≥99.999％)，流速1.0mL/min；进样口温度250℃，以5：1分流进样，进样体积为1μL。

质谱条件：电子电离源，电子能量70eV；气相色谱质谱接口温度270℃，离子源温度230℃；扫描模式：单离子扫描模式(single ion monitoring，SIM)，质谱范围20-350m/z。

(3)GC-MS产生的原始数据采用MassHunter软件(Agilent Tech.，USA)对每种血浆短链脂肪酸进行峰积分、校正及定量分析，将使用峰面积进行代谢物浓度的计算。

步骤二、筛选差异短链脂肪酸。通过GC-MS得到血浆短链脂肪酸的具体浓度，根据Mann-Whitney U test得到差异短链脂肪酸，并且使用线性回归方法校正混杂因素，明确差异短链脂肪酸乙酸和丙酸，如图2所示，MSA患者的血浆乙酸浓度不仅比健康对照组低(29.58±12.73vs 39.88±16.46μmol/L；P＝0.013)，还比PD患者低(29.58±12.73vs40.13±10.72μmol/L；P＝0.001)(A)；与PD患者相比，MSA患者的血浆丙酸浓度较低(5.27±1.89vs 3.95±1.28μmol/L；P＝0.001)(B)；与PD患者相比，MSA-P患者血浆乙酸、丙酸浓度均较低(乙酸：40.13±10.72vs 28.01±9.74μmol/L；P＝0.002；丙酸：5.27±1.89vs 3.64±0.85；P＝0.002)(C和D)。

步骤三、对上述差异短链脂肪酸进行受试者工作特征曲线分析，确定血浆短链脂肪酸作为多系统萎缩诊断标志物，可用于与帕金森病的鉴别诊断。由图3可以得出：①基于健康对照者与MSA患者数据建立使用乙酸判别健康对照者与MSA患者：血浆乙酸浓度诊断多系统萎缩最佳截点是39.02μmol/L，此时敏感度为57％、特异度为76％，曲线下面积(AUC)为0.68(95％CI：0.55-0.81)，小于该截点值，指示所述受试者患有多系统萎缩。

②基于MSA患者与PD患者数据建立使用乙酸和丙酸判别多系统萎缩与帕金森病：乙酸单独鉴别诊断多系统萎缩与帕金森病最佳截点是30.85μmol/L，此时敏感度为87％、特异度为60％，曲线下面积(AUC)为0.73(95％CI：0.60-0.87)，小于该截点值，指示所述受试者患有多系统萎缩；丙酸单独鉴别诊断多系统萎缩与帕金森病的最佳截点3.82μmol/L，此时敏感度为83％、特异度为56％，曲线下面积(AUC)为0.74(95％CI：0.61-0.86)，小于该截点值，指示所述受试者患有多系统萎缩；乙酸和丙酸联合判别多系统萎缩与帕金森病得到的曲线下面积(AUC)为0.82(95％CI：0.71-0.93)，此时敏感度为76％、特异度为84％。乙酸和丙酸联合鉴别诊断多系统萎缩和帕金森病的模型如下：

X1＝-0.132+0.0127*A+0.0658*B；

Prob1＝1/(1+e^X1)(截点值(Cutoff)＝0.5)；

其中A、B分别为乙酸和丙酸根据气相色谱-质谱得到的血浆浓度值。

Prob1表示判断为帕金森病的概率，截点值Cutoff＝0.5。

③基于MSA-P患者与PD患者数据建立使用乙酸和丙酸判别多系统萎缩帕金森型与帕金森病：乙酸单独鉴别诊断多系统萎缩帕金森型与帕金森病最佳截点是37.50μmol/L，此时敏感度为63％、特异度为91％，曲线下面积(AUC)为0.81(95％CI：0.66-0.96)，小于该截点值，指示所述受试者患有多系统萎缩帕金森型；丙酸单独鉴别诊断多系统萎缩帕金森型与帕金森病的最佳截点3.82μmol/L，此时敏感度为83％、特异度为64％，曲线下面积(AUC)为0.80(95％CI：0.67-0.93)，小于该截点值，指示所述受试者患有多系统萎缩帕金森型；乙酸和丙酸联合判别多系统萎缩帕金森型与帕金森病得到的曲线下面积(AUC)为0.89(95％CI：0.80-0.97)，此时敏感度为80％、特异度为91％。乙酸和丙酸联合鉴别诊断多系统萎缩帕金森型与帕金森病的模型如下：

X2＝0.0973+0.0119*A+0.0525*B；

Prob2＝1/(1+e^X2)(截点值(Cutoff)＝0.5)；

Prob2表示判断为帕金森病的概率，截点值Cutoff＝0.5。

综上可知，筛选得到的血浆短链脂肪酸乙酸和丙酸可作为多系统萎缩诊断标志物，可用于多系统萎缩与帕金森病、多系统萎缩帕金森型与帕金森病的鉴别诊断。血浆短链脂肪酸用于MSA患者与PD患者的辅助鉴别诊断操作简单、价格低廉、检测时间短、灵敏度高和特异性强，具有重要的临床意义。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.检测血浆短链脂肪酸的试剂在制备用于鉴别诊断多系统萎缩与帕金森病的试剂中的应用，所述血浆短链脂肪酸为乙酸和丙酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述血浆短链脂肪酸的筛选方法包括以下步骤：

（1）收集多系统萎缩患者、帕金森病患者和健康对照者的血浆样本若干份；

（2）基于气相色谱-质谱联用分别提取步骤（1）中所述血浆短链脂肪酸；

（3）比较步骤（2）中所述血浆短链脂肪酸，筛选多系统萎缩患者、帕金森病患者和健康对照者的差异血浆短链脂肪酸；

（4）对步骤（3）中所述差异血浆短链脂肪酸进行受试者工作特征曲线分析，确定血浆短链脂肪酸乙酸和丙酸作为多系统萎缩诊断标志物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多系统萎缩为多系统萎缩帕金森型。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Prob1表示判断为帕金森病的概率，Prob1＝1/(1+e^X1)；

其中，截点值Cutoff＝0.5；

X1＝-0.132+0.0127×A+0.0658×B；

A、B分别为乙酸和丙酸根据气相色谱-质谱得到的血浆浓度值。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，Prob2表示判断为帕金森病的概率，Prob2＝1/(1+e^X2)；

其中，截点值Cutoff＝0.5；

X2＝0.0973+0.0119×A+0.0525×B；

A、B分别为乙酸和丙酸根据气相色谱-质谱得到的血浆浓度值；

所述多系统萎缩为多系统萎缩帕金森型。