CN109642904A - 调节肠微生物群来治疗神经退行性病症 - Google Patents

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Abstract

本文公开了可用于在有需要的受试者(例如患有神经退行性病症(例如帕金森氏病)的受试者)中改善运动缺陷和神经炎症的方法和组合物。还公开了可用于诊断神经退行性病症(例如帕金森氏病)的方法和组合物。

Description

调节肠微生物群来治疗神经退行性病症
相关申请
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2016年5月23日提交的美国临时申请No.62/340408、2016年8月3日提交的美国临时申请No.62/370,578和2017年1月9日提交的美国临时申请No.62/443952的优先权。通过引用将这些相关申请中每一个的内容明确地整体并入本文。
关于联邦政府资助研发的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院授予的资助号NS085910的政府支持下完成的。美国政府对本发明拥有一定权利。
技术领域
本公开总体涉及对神经退行性病症(neurodegenerative disorders)(例如帕金森氏病)进行诊断和治疗的领域。
背景技术
神经功能障碍是许多人类疾病的基础。行为性病症、精神病性病症和神经退行性病症通常在中枢神经系统(CNS)内显示出标志性神经病理学。一种神经病理学，即淀粉样变性，是由破坏许多细胞功能的特定神经元蛋白的异常聚集引起的。受影响的组织通常含有显示出改变的构象的不溶性蛋白聚集体，认为这一特征导致估计50种不同的人类疾病(Sacchettini和Kelly，2002)。包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和帕金森氏病(PD)在内的神经退行性淀粉样病症与各种不同的淀粉样蛋白有关(Brettschneider等，2015)。PD是美国第二常见的神经退行性疾病，影响了估计100万人和1％的超过60岁的美国人口(Nalls等，2014)。在全世界范围内，大约300万患者和护理人员受PD常使人衰弱的症状所累，其涉及运动缺陷，包括震颤、肌肉僵硬、运动迟缓和步态受损。这是一种具有强烈环境成分的多因素病症，因为不到10％的病例是遗传性的(Nalls等，2014)。认为α-突触核蛋白(αSyn)的聚集在称为突触核蛋白病的疾病家族中是致病性的，该疾病家族包括PD、多系统萎缩和路易体病(Brettschneider等，2015；Luk等，2012；Prusiner等，2015)。αSyn聚集是一个渐进的过程，导致寡聚物质和在神经元内积累的非瞬时原纤维(intransient fibrils)。黑质致密部(SNpc)的多巴胺能神经元似乎特别容易受到αSyn聚集体的影响。多巴胺调节剂是PD中的一线治疗剂；然而，治疗可能带来严重副作用并且往往会失去效果(Jenner，2008)。需要发现安全且有效的治疗方法，以解决人口老龄化中日益严重的PD负担，这是人类在延长寿命方面所取得的成就的矛盾结果。
发明内容
本文公开了可用于在有需要的受试者(例如患有神经退行性病症(例如帕金森氏病)的受试者)中改善运动缺陷和神经炎症的方法和组合物。还公开了可用于诊断神经退行性病症(例如帕金森氏病)的方法和组合物。
一些实施方式提供了用于在受试者中治疗神经退行性病症的方法，其中，该方法包括在有需要的受试者中调整肠微生物群的组成，其中，所述有需要的受试者患有神经退行性病症。一些实施方式提供了用于在受试者中延迟或降低神经退行性病症发作可能性的方法，其中，该方法包括在有需要的受试者中调整肠微生物群的组成，其中，所述有需要的受试者具有发展为神经退行性病症的风险。在一些实施方式中，神经退行性病症是突触核蛋白病，例如帕金森氏病(PB)、伴路易体病的痴呆、多系统萎缩或它们的任何组合。
一些实施方式提供了用于在有需要的受试者(例如具有突触核蛋白病(包括帕金森氏病)的受试者)中改善运动缺陷的方法，其中，该方法包括在受试者中调整肠微生物群的组成。一些实施方式提供了用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞活化的方法，其中，该方法包括在受试者中调整肠微生物群的组成。一些实施方式提供了用于在有需要的受试者中减少α-突触核蛋白(αSyn)聚集体的方法，其中，该方法包括在受试者中调整肠微生物群的组成。在一些实施方式中，该方法促进不溶性αSyn蛋白聚集体的清除、减少αSyn蛋白的聚集，或这两者。在一些实施方式中，该方法包括测量受试者中αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。在一些实施方式中，测量受试者脑中αSyn聚集的速度和/或水平、受试者脑中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。在一些实施方式中，该方法还包括在受试者中调整肠微生物群的组成后测量受试者中αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。
一些实施方式提供了用于在有需要的受试者中减少神经炎症的方法，其中，该方法包括在受试者中调整肠微生物群的组成。
本文公开的方法中的有需要的受试者可以是例如患有神经退行性淀粉样病症(例如突触核蛋白病)的受试者。突触核蛋白病的非限制性实例包括帕金森氏病、伴路易体病的痴呆、多系统萎缩及它们的任何组合。在一些实施方式中，有需要的受试者是患有帕金森氏病的受试者。在一些实施方式中，本文公开的方法还可以包括鉴定有需要的受试者，其中，所述有需要的受试者具有异常水平的α-突触核蛋白(αSyn)聚集。在一些实施方式中，鉴定有需要的受试者包括测量受试者中αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。在一些实施方式中，测量受试者脑中αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者脑中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。在一些实施方式中，该方法还包括在受试者中调整肠微生物群的组成后测量受试者中αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。在一些实施方式中，该方法改善受试者中的一种或多种身体损伤。在一些实施方式中，该方法改善受试者的一种或多种GI功能。在一些实施方式中，该方法减轻受试者的便秘。在一些实施方式中，运动缺陷是震颤、肌肉僵硬、运动迟缓、步态受损或它们的任何组合。
在一些实施方式中，本文公开的方法可以将受试者中肠微生物群的组成恢复至正常水平。在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括向受试者给予一种或多种抗生素。抗生素可以是天然的、合成的或半合成的。一种或多种抗生素可以包括例如氨苄青霉素、万古霉素、新霉素、庆大霉素、红霉素、替考拉宁、多西环素、四环素、诺氟沙星、环丙沙星、奥格门汀、头孢氨苄(例如Keflex)、青霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、利福霉素、利福昔明、新霉素、甲硝唑或它们的任何组合。抗生素可以通过口服、静脉内、直肠方式或它们的组合给药。在一些实施方式中，一种或多种抗生素不包含利福平和/或米诺环素。在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括向受试者给予一种或多种PD增强性微生物代谢物的抑制剂。在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括向受试者给予针对一种或多种PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、或针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的底物的抗体。
在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括向受试者给予参与体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的酶的抑制剂。一种或多种PD增强性微生物代谢物可以包括例如一种或多种脂肪酸、其盐或酯，或它们的任何组合。在一些实施方式中，一种或多种PD增强性微生物代谢物包括一种或多种短链脂肪酸(SCFA)、其盐或酯，或它们的任何组合。在一些实施方式中，一种或多种PD增强性微生物代谢物包括一种或多种中链脂肪酸、一种或多种长链脂肪酸、中链脂肪酸的盐或酯、长链脂肪酸的盐或酯，或它们的任何组合。在一些实施方式中，一种或多种PD增强性微生物代谢物包括SCFA乙酸盐/酯、SCFA丙酸盐/酯、SCFA丁酸/酯，或它们的任何组合。
在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括增强受试者中一种或多种PD防护性细菌种类的水平。在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括向受试者给予包含一种或多种PD防护性细菌种类的组合物。一种或多种PD防护性细菌种类中的至少一种可以属于例如毛螺菌科(Lachnospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、肠球菌属(Enterococcus)、梭菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)或丁酸梭菌属(Butyricicoccus sp.)家族。在一些实施方式中，组合物是益生菌组合物、营养医学(nutraceutical)组合物、药物组合物或它们的任何组合。
在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括粪便移植、微生物群常规化(microbiota conventionalization)、微生物定殖、肠微生物群重建、益生菌处理或它们的组合。在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括降低受试者中一种或多种PD增强性细菌种类的水平。一种或多种PD增强性细菌种类中的至少一种可以属于例如变形杆菌属(Proteus sp.)、嗜胆菌属(Bilophila sp.)、罗斯氏菌属(Roseburiasp.)、Pseudoramibacter Eubacterium或韦荣球菌科(Veillonellaceae family)。在一些实施方式中，一种或多种PD增强性细菌种类中的至少一种是产SCFA细菌。产SCFA细菌的非限制性实例包括属于KEGG家族K00929、K01034和K01035的细菌。
在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括将来自健康受试者的肠微生物群引入待治疗的受试者。
一些实施方式提供了用于在受试者中治疗神经退行性病症的方法，其中，该方法包括以下中的一种或多种：向受试者给予抗生素；以及向受试者给予PD增强性微生物代谢物的抑制剂。一些实施方式提供了用于在受试者中延迟或降低神经退行性病症发作可能性的方法，其中，该方法包括以下中的一种或多种：向受试者给予抗生素；以及向受试者给予PD增强性微生物代谢物的抑制剂。神经退行性病症可以是例如突触核蛋白病(例如帕金森氏病、伴路易体病的痴呆、多系统萎缩或它们的组合)。
一些实施方式提供了在有需要的受试者中改善帕金森氏病症状的方法，其中，该方法包括以下中的一种或多种：向受试者给予抗生素；向受试者给予抗炎剂；以及向受试者给予一种或多种PD增强性微生物代谢物的抑制剂。在一些实施方式中，抗炎剂和抗生素不是米诺环素。在一些实施方式中，帕金森氏病症状包括运动功能受损、α-突触核蛋白(αSyn)聚集增强、小胶质细胞活化异常或它们的任何组合。在一些实施方式中，帕金森氏病症状包括震颤、运动迟缓、肌肉僵硬、姿态和平衡受损、自发运动丧失、语言障碍、书写障碍或它们的任何组合。在一些实施方式中，PD增强性微生物代谢物的抑制剂是针对一种或多种PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的底物的抗体、参与体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的酶的抑制剂，或它们的组合。在一些实施方式中，受试者或有需要的受试者未接受抗生素治疗。在一些实施方式中，该方法不包括向受试者或有需要的受试者给予任何抗生素。在一些实施方式中，受试者或有需要的受试者未用利福平和/或米诺环素治疗。在一些实施方式中，受试者或有需要的受试者在调整肠微生物群的组成或其它治疗之前至少12小时、1天、5天、10天或20天未接受任何抗生素治疗。在一些实施方式中，受试者或有需要的受试者在调整肠微生物群的组成或其它治疗之后至少12小时、1天、5天、10天或20天不接受任何抗生素治疗。在一些实施方式中，该方法还包括确定受试者中一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平，以鉴定有需要的受试者。
一些实施方式提供了在受试者中诊断帕金森症(parkinsonism)的方法，其中，该方法包括确定受试者中一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平，由此一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或异常水平表明受试者具有发展为帕金森症症状的风险或患有帕金森症症状。在一些实施方式中，一种或多种PD相关细菌种类中的至少一种属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、Pseudoramibacter Eubacterium或韦荣球菌科。在一些实施方式中，确定受试者肠中一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平。在一些实施方式中，一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或异常水平表明受试者具有发展为帕金森症的风险。在一些实施方式中，一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或异常水平表明受试者患有帕金森症。在一些实施方式中，帕金森症是原发性或特发性帕金森症、继发性或获得性帕金森症、遗传性帕金森症、帕金森叠加综合征(Parkinson plus syndrome)或多系统变性，或它们的任何组合。在一些实施方式中，帕金森症是帕金森氏病。在一些实施方式中，受试者是成人。
一些实施方式提供了包含一种或多种PD防护性细菌种类的组合物。在一些实施方式中，组合物不包含PD增强性细菌种类。在一些实施方式中，一种或多种PD防护性细菌种类中的至少一种属于毛螺菌科、理研菌科、消化链球菌科、梭菌科、肠球菌属、梭菌属、拟杆菌属或丁酸梭菌属家族。在一些实施方式中，组合物不包含属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、Pseudoramibacter Eubacterium和韦荣球菌科中的至少一种的细菌种类。在一些实施方式中，组合物不包含属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、PseudoramibacterEubacterium和韦荣球菌科的细菌种类。在一些实施方式中，组合物不包含致病性梭菌属细菌。在一些实施方式中，一种或多种PD防护性细菌种类中的至少一种是活细菌(viablebacteria)。在一些实施方式中，一种或多种PD防护性细菌种类是活细菌。组合物可以是例如益生菌组合物、营养医学组合物、药物组合物或它们的任何组合。在一些实施方式中，组合物是包含一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。
一些实施方式提供了药物组合物，该药物组合物包含PD增强性微生物代谢物的抑制剂以及一种或多种药学上可接受的载体。PD增强性微生物代谢物可以是任何微生物代谢物，例如脂肪酸或其盐或酯。在一些实施方式中，PD增强性微生物代谢物是短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸、长链脂肪酸、短链脂肪酸的盐或酯、中链脂肪酸的盐或酯、或长链脂肪酸的盐或酯。PD增强性微生物代谢物的抑制剂可以是例如针对PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、针对用于体内合成PD增强性微生物代谢物的底物的抗体、参与体内合成PD增强性微生物代谢物的酶的抑制剂，或它们的组合。
附图说明
图1是示出帕金森氏病(PD)模型中神经炎症应答以及标志性胃肠和α-突触核蛋白依赖性运动缺陷需要来自肠微生物的信号的示意图。肠微生物促进α-突触核蛋白介导的运动缺陷和脑病理，并且肠细菌的耗竭(depletion)降低小胶质细胞活化。短链脂肪酸处理的动物(SCFA)调制小胶质细胞并提高PD病理生理，并且来自PD患者的人肠微生物群在小鼠中诱导增强的运动功能障碍。
图2A-图2F示出肠微生物促进运动和胃肠功能障碍。在12-13周龄时测试动物。N＝4-6，误差棒代表来自每只动物3次试验的平均值和标准误差。数据代表2次实验。*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。缩写：SPF，无特定病原体；GF，无菌；WT，野生型；ASO，Thy1-α-突触核蛋白基因型。图2A示出相比野生型同窝动物(littermate)(SPF-WT)，带有复合微生物群的ASO动物(SPF-ASO)需要显著更多的时间来跨越挑战性梁(beam)，这是粗大运动功能的量度。图2B示出相比野生型同窝动物，带有复合微生物群的ASO动物表现出沿杆下降的时间增加，这是粗大运动功能的另一量度。图2C示出相比SPF-WT小鼠，从鼻梁去除粘合剂(这是精细运动控制的测试)在SPF-ASO小鼠中受损。图2D示出后肢抓握反射(这是纹状体功能障碍的量度)在SPF-ASO小鼠中有缺陷。图2A-图2D还示出在无菌条件下重新获得的12-13周龄的ASO小鼠(GF-ASO)和野生型小鼠(GF-WT)在梁跨越、沿杆下降、粘合剂去除和后肢抓握中呈现出减少的缺陷。图2E-图2F示出在12-13周龄时，在SPF-ASO动物中观察到粪球总输出明显减少，而在GF-ASO动物中粪便输出未改变。图2E示出在15分钟内在新环境中粪便输出的经时过程。图2F示出在15分钟内产生的总粪球。还参见图3A-图3K。
图3A-图3K示出SPF和GF动物的体重以及老化小鼠的分析(与图2A-图2F相关)。N＝4-6，误差棒代表平均值和标准误差。来自用于运动测试的每只动物3次试验。数据代表2次实验。0.1>p>0.05；*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。SPF＝无特定病原体；GF＝无菌；WT＝野生型；ASO＝Thy1-α-突触核蛋白基因型。图3A示出相比12-13周龄SPF-ASO动物，12-13周龄GF-ASO小鼠在体重方面没有表现出差异。图3B示出SPF-ASO和GF-ASO动物在倒置栅格(inverted grid)测定中均显示出缺陷，这是基于由倒置栅格掉落的时间的肢体强度的量度。图3C-图3G示出在较晚的年龄(24-25周龄)，SPF-ASO动物表现出运动功能的进行性下降，这在GF-ASO动物中显著延迟。图3C示出24-25周龄动物跨越梁的时间。图3D示出24-25周龄动物沿杆下降的时间。图3E示出24-25周龄动物从鼻梁去除粘合剂的时间。图3F示出24-25周龄动物的后肢抓握反射得分。图3G示出24-25周龄动物的体重。图3H-图3I示出在24-25周龄时，在SPF-ASO动物中观察到粪球总输出明显减少，而在GF-ASO动物中粪便输出未改变(图3H和图3I)。图3H示出24-25周龄动物在15分钟内在新环境中粪便输出的经时过程。图3I示出24-25周龄动物在15分钟内产生的总粪球。图3J示出相比12-13周龄GF-ASO小鼠，12-13周龄SPF-ASO小鼠产生的粪球包含降低的含水量，揭示GF动物中GI缺陷减少。图3K示出编译(compiling)来自SPF-WT、SPF-ASO、GF-WT和GF-ASO定群(cohorts)的所有运动功能得分的主成分分析(PCoA)。将所有运动表型编译至主成分分析中显示出SPF-ASO组的很醒目的偏离(segregation)，而GF-ASO动物聚类更类似于WT小鼠。
图4A-图4G示出αSyn病理在带有肠微生物群的小鼠中增加。从12-13周龄小鼠收集的组织。N＝3-4，误差棒代表平均值和标准误差。*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001。缩写：SPF，无特定病原体；GF，无菌；WT，野生型；ASO，Thy1-α-突触核蛋白基因型。还参见图5A-图5H。图4A和图4B示出在SPF条件下观察到ASO动物的尾壳核(caudoputamen，CP)和黑质(SN)中αSyn的明显聚集。图4A示出利用聚集特异性αSyn抗体、磷酸-Ser129-αSyn抗体和Neurotrace/Nissl染色的来自SPF-ASO或GF-ASO动物的尾壳核(CP)的代表性图像。图4B示出来自SPF-ASO或GF-ASO动物的黑质(SN)的代表性图像，染色同上。图4C为triton可溶性和不溶性脑匀浆物的代表性蛋白印迹(用抗αSyn抗体进行免疫染色以定量αSyn聚集)。图4D和图4E示出在GF-ASO动物的脑中观察到显著较少的不溶性αSyn。图4D示出就所有αSyn染色而言抗αSyn蛋白印迹的光密度法定量。图4E示出就不溶性αSyn染色与可溶性αSyn染色之比而言抗αSyn蛋白印迹的光密度法定量。图4F和图4G示出确定了在SPF-ASO和GF-ASO动物之间下中脑(inferior midbrain)和CP中的αSyn转录物和蛋白的水平是相似的。图4F示出CP或下中脑(Mid)中人αSyn的qRT-PCR分析。图4G示出存在于来自CP或下中脑(Mid)的匀浆物中的总αSyn的ELISA分析。
图5A-图5H示出肠微生物促进区域特异性αSyn病理(与图4A-图4G和图6A-图6H相关)，并且图5I(在来自脑匀浆物的CD11b+细胞中就bdnf和ddit4进行的qPCR分析)示出神经保护性Bdnf和细胞周期标志物Ddit4水平在GF动物中上调。在12-13周龄时测试动物。N＝3-4，误差棒代表平均值和标准误差。*p≤0.05。SPF＝无特定病原体；GF＝无菌；WT＝野生型；ASO＝Thy1-α-突触核蛋白基因型。图5A-图5C示出相对于图4C-图4E，观察到GF-ASO动物中αSyn聚集的类似减少。图5A示出源于来自SPF-ASO和GF-ASO动物的尾壳核(CP)和下中脑(Mid)匀浆物的聚集特异性αSyn斑点印迹。图5B和图5C示出(B)CP或(C)下中脑的斑点印迹的光密度法定量。图5D-图5H示出观察到αSyn聚集的区域特异性：在额叶皮质(FC)中，GF-ASO动物相比SPF动物带有较少的αSyn聚集；而在小脑(CB)中，在SPF和GF小鼠中观察到几乎等量的αSyn。图5D示出利用聚集特异性αSyn抗体、磷酸-Ser129-αSyn抗体和Neurotrace/Nissl染色的来自SPF-ASO或GF-ASO动物的额叶皮质(FC)的代表性图像。图5E示出来自SPF-ASO或GF-ASO动物的小脑(CB)的代表性图像，染色同上。图5F示出源于来自SPF-ASO和GF-ASO动物的FC或CB匀浆物的斑点印迹图像(用聚集特异性αSyn抗体进行免疫染色)。图5G和图5H示出来自(G)FC和(H)CB的斑点印迹的光密度法定量。
图6A-图6H示出由微生物群进行αSyn依赖性小胶质细胞活化。从12-13周龄小鼠收集的组织。N＝3-4(每只动物每个区域分析20-60个细胞)；误差棒代表平均值和标准误差。*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。缩写：SPF，无特定病原体；GF，无菌；WT，野生型；ASO，Thy1-α-突触核蛋白基因型。还参见图5A-图5I。图6A-图6C示出在CP和SN中，相比SPF-WT动物，GF-WT小鼠中的小胶质细胞显示出增加的数量以及小胶质细胞总分支长度。图6A示出驻留(residing)在SPF-WT、SPF-ASO、GF-WT和GF-ASO动物的尾壳核(CP)中的Iba1染色的小胶质细胞的代表性3D重建。图6B示出CP驻留小胶质细胞的参数：直径、分支点数量和总分支长度。图6C示出黑质(SN)驻留小胶质细胞的参数：直径、分支点数量和总分支长度。图6D和图6E示出相比GF-ASO小鼠，来自SPF-ASO小鼠的CP和下中脑的组织匀浆物包含明显增加的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-a(TNF-a)和白介素-6(IL-6)。图6D示出来自CP的匀浆物中存在的TNF-α和IL-6的ELISA分析。图6E示出来自下中脑(Mid)的匀浆物中存在的TNF-α和IL-6的ELISA分析。图6F示出在来自脑匀浆物的CD11b+细胞中就tnfa和il6进行的qPCR分析揭示出在SPF-ASO动物中Tnfα和Il6表达增加，而这在GF动物中几乎不存在。图6G和图6H示出神经炎性应答是区域特异性的，FC中的小胶质细胞直径和TNF-α产生增加，而CB中不增加。图6G示出驻留在额叶皮质(FC)或小脑(CB)中的小胶质细胞的直径。图6H示出来自FC或CB的匀浆物中存在的TNF-α的ELISA分析。
图7A-图7I示出出生后的(postnatal)微生物信号促进运动和胃肠功能障碍。在12-13周龄时测试动物。N＝6-12；误差棒代表来自每只动物3次试验并由所分析的2个独立定群或每个区域20-60个小胶质细胞编译而来的平均值和标准误差。#0.05<p<0.1；*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。缩写：SPF，无特定病原体；GF，无菌；Abx，抗生素处理；Ex-GF，再定殖(recolonized)无菌动物；WT，野生型；ASO，Thy1-α-突触核蛋白基因型。还参见图8A-图8O。图7A是动物处理和测试的经时过程示意图。图7B-图7E示出抗生素处理(Abx)的动物显示出极少的αSyn依赖性运动功能障碍，非常类似于GF条件下出生的小鼠。图7B-图7E还示出先前GF动物的出生后定殖(Ex-GF)重述了在SPF小鼠中观察到的基因型效应，过表达αSyn的小鼠显示出显著的运动功能障碍。图7B示出跨越梁器械的时间。图7C示出沿杆下降的时间。图7D示出去除鼻粘合剂的时间。图7E示出后肢抓握反射得分。图7F和图7G示出GI功能(如通过粪便输出所测量的)在Abx处理的动物中也显著改善，而Ex-GF小鼠在总粪便输出方面表现出αSyn依赖性降低。图7F示出在15分钟内在新环境中粪便输出的经时过程。图7G示出在15分钟内产生的总粪球。图7H和图7I示出在转基因ASO系中，来自Ex-GF动物的小胶质细胞的细胞体直径增加，堪比SPF小鼠中的情况。图7H和图7I还示出然而Abx-ASO动物带有直径与GF动物类似的小胶质细胞。图7H示出驻留在Abx-ASO或Ex-GF-ASO动物的尾壳核(CP)中的Iba1染色的小胶质细胞的代表性3D重建。图7I示出驻留在CP或黑质(SN)中的小胶质细胞的直径。
图8A-图8O示出Abx、Ex-GF和SCFA小鼠中的SCFA改变和增加的αSyn病理(与图7A-图7I和图9A-图9H相关)。在12-13周龄时测试动物。N＝3-6，每个区域分析20-60个小胶质细胞。误差棒代表平均值和标准误差。*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。缩写：SPF＝无特定病原体；GF＝无菌；Abx＝抗生素处理的动物；Ex-GF＝再定殖无菌动物；SCFA＝短链脂肪酸处理的动物；WT＝野生型；ASO＝Thy1-α-突触核蛋白基因型。图8A示出相比SPF小鼠，在GF和Abx处理的动物中观察到较低的粪便SCFA浓度。在图8A中，将乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的粪便浓度通过可溶性化学需氧量(sCOD)进行归一化。图8B-图8C示出在受影响的脑区域(即CP和SN)内，相比未处理的小鼠，给予SCFA的动物中的小胶质细胞显示出指示活化提高的形态，类似于来自Ex-GF和SPF小鼠的细胞。然而，Abx处理的动物显示出类似于GF动物的小胶质细胞形态。图8B示出尾壳核(CP)驻留小胶质细胞的参数：分支点数量和总分支长度。图8C示出黑质(SN)驻留小胶质细胞的参数：分支点数量和总分支长度。图8D和图8E示出在FC中也观察到小胶质细胞直径改变，但在CB中未观察到，表明这是区域特异性应答。图8D示出驻留在额叶皮质(FC)中的小胶质细胞的直径。图8E示出驻留在小脑(CB)中的小胶质细胞的直径。图8F-图8O示出相比未处理的和Abx处理的小鼠，αSyn在给予SCFA的小鼠中聚集，类似于Ex-GF动物。图8F-图8I示出利用聚集特异性αSyn抗体、磷酸-Ser129-αSyn抗体和Neurotrace/Nissl染色的分别来自Abx-ASO、Ex-GF-ASO或SCFA-ASO动物的CP、SN、FC和CB的代表性图像。图8J示出来自Abx-ASO、Ex-GF-ASO和SCFA-ASO动物的CP、下中脑(Mid)、FC和CB匀浆物的斑点印迹图像(用聚集特异性αSyn抗体进行免疫染色)。图8K-图8N示出来自(K)CP、(L)下中脑、(M)FC和(N)CB的斑点印迹的光密度法定量。图8O示出源于来自Abx-ASO和SCFA-ASO动物的CP匀浆物的Triton可溶性和不溶性馏分的αSyn的蛋白印迹。
图9A-图9H示出SCFA促进αSyn刺激的小胶质细胞活化和运动功能障碍。在12-13周龄时测试动物。N＝6-12；误差棒代表来自每只动物3次试验并由所分析的2个独立定群或每个区域20-60个小胶质细胞编译而来的平均值和标准误差。为清楚起见，用来自图7A-图7I的对照绘制数据。*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。缩写：SPF，无特定病原体；GF，无菌；SCFA，短链脂肪酸处理；WT，野生型；ASO，Thy1-α-突触核蛋白基因型。还参见图8A-图8O、图10A-图10M和图11A-图11H。图9A和图9B示出在受影响的脑区域(即CP和SN)内，相比未处理的小鼠，给予SCFA的动物中的小胶质细胞显示出指示活化提高的形态，类似于来自Ex-GF和SPF小鼠的细胞。然而，Abx处理的动物显示出类似于GF动物的小胶质细胞形态。图9A示出驻留在SCFA处理的野生型或ASO动物的尾壳核(CP)中的Iba1染色的小胶质细胞的代表性3D重建。图9B示出驻留在CP或黑质(SN)中的小胶质细胞的直径。图9C-图9F示出相比未处理的GF-ASO动物，SCFA-ASO小鼠在几项运动任务中表现出显著受损的性能，包括梁跨越、沿杆下降和后肢反射方面受损(将GF-ASO小鼠与SCFA-ASO小鼠进行比较)。图9C示出跨越梁器械的时间。图9D示出沿杆下降的时间。图9E示出去除鼻粘合剂的时间。图9F示出后肢抓握反射得分。图9G和图9H示出在SCFA处理的转基因动物中也观察到GI缺陷。图9G示出在15分钟内在新环境中粪便输出的经时过程。图9H示出在15分钟内产生的总粪球。
图10A-图10M示出SCFA不直接改变αSyn聚集(与图9A-图9H相关)。在12-13周龄时测试动物。N＝6-12；误差棒代表来自每只动物3次试验的平均值和标准误差。数据由2个独立定群编译而来，并且为清楚起见用来自图7A-图7I的对照绘制。*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。缩写：SPF＝无特定病原体；GF＝无菌；HK＝热灭活细菌处理；WT＝野生型；ASO＝Thy1-α-突触核蛋白基因型。图10A-图10G示出无论单独的SCFA还是混合物形式的SCFA在一定浓度范围内在体外均不促进人αSyn的聚集。图10A-图10C示出如通过存在所示浓度的(图10A)乙酸钠、(图10B)丙酸钠或(图10C)丁酸钠的情况下的ThT荧光所测量的αSyn聚集动力学。图10D和图10E示出如通过存在独立的SCFA混合物的情况下的ThT荧光所测量的αSyn聚集动力学。图10D：SCFA Mix 1-29.6mM乙酸盐、11mM丙酸盐和18.5mM丁酸盐；SCFA Mix 2-88.8mM丙酸盐、33mM丙酸盐和55.5mM丁酸盐；图10E：SCFA Mix 3-0.4mM乙酸盐、0.15mM丙酸盐和0.24mM丁酸盐；SCFA Mix 4-0.8mM乙酸盐、0.3mM丙酸盐和0.47mM丁酸盐；SCFA Mix 5-2.0mM乙酸盐、0.74mM丙酸盐和1.18mM丁酸盐。图10F和图10G分别示出单独的SCFA处理或SCFA混合物的到达半最大荧光强度的时间。N＝3，棒代表平均值和标准误差。图10H和图10I示出无论单独的SCFA还是混合物形式的SCFA在一定浓度范围内均不会改变αSyn淀粉样原纤维的总体结构。图10H和图10I分别示出在不存在SCFA或存在SCFA Mix 1的情况下来自上述αSyn聚集测定的终产物的代表性原子力显微镜结果。图10J-图10M示出用热灭活细菌口服处理GF动物不会诱发运动缺陷，表明细菌需要具有代谢活性。图10J示出跨越梁的时间。图10K示出沿杆下降的时间。图10L示出去除鼻粘合剂的时间。图10M示出后肢反射得分。
图11A-图11H示出米诺环素降低SCFA诱导的αSyn运动缺陷和病理(与图9A-图9H相关)。在12-13周龄时测试动物。N＝6-12；误差棒代表来自每只动物3次试验的平均值和标准误差。数据由2个独立定群编译而来。0.05<p<0.1；*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。缩写：SPF＝无特定病原体；GF＝无菌；WT＝野生型；ASO＝Thy1-α-突触核蛋白基因型。图11A-图11H示出用抗炎化合物米诺环素口服处理SCFA喂养的动物足以降低TNF-α产生、降低αSyn聚集并提高运动功能，而不改变转基因表达。图11A示出存在于尾壳核(CP)和下中脑(Mid)中的TNFα的ELISA分析。图11B示出就聚集特异性αSyn而言的CP、下中脑(Mid)匀浆物的斑点印迹图像。图11C示出来自CP和下中脑(Mid)的斑点印迹的光密度法定量。图11D示出全脑匀浆物中的人snca表达的qPCR分析。图11E示出跨越梁器械的时间。图11F示出沿杆下降的时间。图11G示出去除鼻粘合剂的时间。图11H示出后肢抓握反射得分。
图12A-图12E示出在移植至无菌小鼠中后PD患者样品的微生物组失调。N＝3-6，定殖后超过3个时间点。误差棒代表平均值和标准误差。***p≤0.001，999个置换(permutations)。缩写：HC，用来自健康对照的粪便微生物定殖的无菌小鼠；PD，用来自帕金森氏病患者的粪便微生物定殖的无菌小鼠；WT，野生型；ASO，Thy1-α-突触核蛋白基因型。还参见图13A-图13E。图12A和图12B示出在基于PCoA的未加权UniFrac中受体动物组最类似于它们各自的人类供体的谱。图12A示出人类供体(大圆圈)和受体小鼠(小圆圈)的微生物群落的未加权UniFrac主坐标分析。每个供体和受体样品通过阴影匹配。图12B示出基于供体身份的受体动物中微生物群落的未加权和加权UniFrac分析。图12C和图12D示出相比由健康供体移植而来的群落，由PD供体而来的人源化小鼠组彼此更为显著相似，这种趋势在通过遗传背景分层时仍持续。相比WT受体，ASO背景中的健康和PD供体之间存在显著差异，表明基因型对微生物群落构造的影响。图12C示出基于小鼠基因型的受体动物中微生物群落的未加权和加权UniFrac分析。图12D示出受体动物中微生物群落的未加权和加权UniFrac分析的比较。图12E示出鉴定了相比健康对照而言在用源自PD供体的微生物群定殖的动物中发生改变的若干属。在PD和健康供体之间改变的各个属随受体小鼠基因型而变化的分类学水平分析。左栏表示观察到显著差异的百分比；右栏表示PD与健康供体之间的倍数变化。“*”表示非统计学显著差异。
图13A-图13E示出微生物代谢通路在人源化动物中改变(与图12A-图12E相关)。N＝3-6，对于KEGG分析定殖后超过3个时间点；对于SCFA丰度N＝21-24。误差棒代表平均值和标准误差。*p：<0.05；**p：<0.01；***p：<0.001。图13A示出人源化组之间的Bray-Curtis距离比较。图13B和图13C分别示出相同供体与不同供体之间或野生型(WT)与Thy1-α-突触核蛋白(ASO)基因型之间的Bray-Curtis平均距离比较。图13D示出参与SCFA生产的特定KEGG家族的PICRUSt分析，浅色圈＝源自健康对照的微生物；深色圈＝源自PD的微生物。图13E示出来自人源化动物的乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的粪便浓度以及相对丰度，归一化到可溶性化学需氧量。由6个独立供体对编译而来；HC＝健康对照；PD＝帕金森氏病。
图14A-图14G示出来自PD患者的微生物群诱导提高的αSyn介导的运动缺陷。在12-13周龄时测试动物。N＝3-6，误差棒代表来自每只动物3次试验的平均值和标准误差。#0.05<p<0.1；*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001；****p≤0.0001。缩写：HC，用来自健康对照的粪便微生物定殖的无菌小鼠；PD，用来自帕金森氏病患者的粪便微生物定殖的无菌小鼠；WT，野生型；ASO，Thy1-α-突触核蛋白基因型。还参见图15A-图15G和表2。图14A-图14F示出6对中的4对(对#1、3、4和5)之间的一致性，来自患有PD的个体的微生物群促进提高的αSyn介导的运动功能障碍。图14A-图14F示出用来自PD患者或匹配的健康对照的微生物群人源化的小鼠的跨越梁的时间、沿杆下降的时间、去除鼻粘合剂的时间和后肢抓握反射得分。图14G示出来自所有组的性能数据的编译揭示了在本研究所使用的4种测试的3种之中，相比来自健康对照的微生物，来自PD患者的微生物群在ASO动物中诱导增加的运动损伤。每个运动任务中所有独立定群的编译：梁跨越、沿杆下降、粘合剂去除和后肢抓握反射得分，按照粪便供体的健康状况进行分组。
图15A-图15G示出人源化动物的体重和粪便输出(与图14A-图14G相关)。在12-13周龄时测试动物。N＝3-6，误差棒代表来自每只动物3次试验的平均值和标准误差。0.05<p<0.1；*p≤0.05；**p≤0.01。缩写：HC＝用来自健康对照的粪便微生物定殖的无菌小鼠；PD＝用来自帕金森氏病患者的粪便微生物定殖的无菌小鼠；WT＝野生型；ASO＝Thy1-α-突触核蛋白基因型。图15A-图15F示出如通过粪便输出所测量的，受体动物在体重和GI功能方面几乎未表现出改变。对于每个PD和HC人源化对，在新环境中15分钟后的体重和粪便输出。(图15A)对#1；(图15B)对#2；(图15C)对#3；(图15D)对#4；(图15E)对#5；(图15F)对#6。图15G示出人源化动物之间编译的运动功能的主成分分析。图15G通过PCoA描绘的所有运动功能显示了用来自PD供体的微生物群定殖的动物之间相比用源自健康个体的肠细菌定殖的动物而言醒目的全局差异。
具体实施方式
在以下详细描述中参考了附图，附图形成本文的一部分。在附图中，除非上下文另有说明，否则类似的符号通常标识类似的组件。在具体实施方式、附图和权利要求中描述的说明性实施方式不意味着是限制性的。在不脱离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以利用其它实施方式并且可以进行其它改变。容易理解的是，如本文一般描述的并且在附图中示出的本公开的方面可以通过各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都是本文所明确设想的。
定义
除非另有定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见例如Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor，NY 1989)。出于本公开的目的，将以下术语定义如下。
如本文所使用的术语“受试者”是动物，例如脊椎动物，优选哺乳动物。术语“哺乳动物”定义为属于哺乳动物纲的个体，包括但不限于人、家养动物和农场动物以及动物园动物、竞技动物(sports animals)或宠物动物，例如绵羊、狗、马、猫或奶牛。在一些实施方式中，受试者是小鼠或大鼠。在一些实施方式中，受试者是人。
如本文所使用的术语“治疗”是指响应于患者(特别是患有神经退行性疾病(例如帕金森氏病)的患者)所表现出的疾病、病症或生理状况而进行的干预(例如临床干预)。治疗目的可以包括但不限于以下中的一种或多种：症状的减轻或预防；减缓或停止疾病、病症或状况的进展或恶化；以及疾病、病症或状况的缓解。在一些实施方式中，“治疗”是指治疗性治疗以及预防性或防护性措施这两者。需要治疗的受试者包括已经受疾病或病症或不期望的生理状况影响的受试者以及其中要预防疾病或病症或不期望的生理状况的受试者。例如，在一些实施方式中，治疗可以减少、减轻或根除疾病的症状。如本文所使用的术语“预防”是指减少后来表现出帕金森症症状的个体负担的任何活动。这可以在一级、二级和/或三级预防水平下进行，其中：a)一级预防避免症状/病症/状况的发展；b)二级预防活动针对状况/病症/症状治疗的早期阶段，从而增加防止状况/病症/症状进展和症状出现的干预机会；以及c)三级预防通过例如恢复功能和/或减少任何状况/病症/症状或相关并发症来减少已经建立的状况/病症/症状的负面影响。
“药学上可接受的”载体是对于在所用剂量和浓度下暴露于该载体的细胞或哺乳动物而言无毒的载体。“药学上可接受的”载体可以是但不限于有机或无机赋形剂、固体或液体赋形剂，所述载体适合于所选择的施用模式(例如口服施用或注射)，并以常规药物制剂的形式(例如固体，如片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂；以及液体，如溶液剂、乳剂、混悬剂等)给予。生理学上可接受的载体通常是水性pH缓冲液，如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。生理学上可接受的载体还可以包含以下中的一种或多种：抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽、蛋白，如血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反离子(counterions)，如钠；以及非离子表面活性剂，如吐温TM、聚乙二醇(PEG)和PluronicsTM。也可以将辅料(auxiliary)、稳定剂、乳化剂、润滑剂、粘合剂、pH调节控制剂、等渗剂和其它常规添加剂添加到载体中。
药学上可接受的或适当的载体可以包括已知对胃肠道受损情况有益的其它化合物(例如抗氧化剂，如维生素C、维生素E、硒或锌)；或食品组合物。食品组合物可以是但不限于乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、基于发酵谷物的产品、基于乳的粉末、婴儿配方食品、片剂、液体细菌混悬剂、干口服补充剂或湿口服补充剂。
治疗剂或预防剂可包括“药物”。如本文所使用的“药物”是指治疗剂或诊断剂，包括除食品之外的用于预防、诊断、减轻、治疗或治愈疾病的任何物质。Stedman's MedicalDictionary，第25版(1990)。药物可包括以下出版物中的至少一者中公开的任何物质：TheMerck Index，第12版(1996)；Pei-Show Juo，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology(1996)；U.S.Pharmacopeia Dictionary，2000版；以及Physician'sDesk Reference，2001版。在一些实施方式中，治疗剂是本文所述的组合物的实施方式之一。在一些实施方式中，在治疗系统中使用的药物被放置、包埋、包封或以其它方式掺入到递送基质中。
如本文所使用的术语“营养医学(nutraceutical)”是指提供健康益处的食品物质(作为强化食品或膳食补充剂)。营养医学食品不受与药物相同的测试和法规的约束。
如本文所使用的术语“益生菌”是指当以足够的量给予时赋予宿主健康益处的活微生物。益生菌可以在食品和膳食补充剂(例如但不限于胶囊剂、片剂和散剂)中获得。含有益生菌的食品的非限制性实例包括乳制品如酸奶、发酵和未发酵乳、冰沙、黄油、奶油、鹰嘴豆泥(hummus)、康普茶(kombucha)、沙拉调料、味噌(miso)、豆豉(tempeh)、营养棒以及一些果汁和大豆饮料。
如本文所使用的术语“代谢物”指的是参与代谢的任何分子。代谢物可以是代谢过程中的产物、底物或中间体。例如，代谢物可以是初级代谢物、次级代谢物、有机代谢物或无机代谢物。代谢物包括但不限于脂肪酸、氨基酸、肽、酰基肉碱、单糖、寡糖、脂质和磷脂、前列腺素、羟基二十碳四烯酸、羟基十八碳二烯酸、类固醇、胆汁酸、糖脂和磷脂。在一些实施方式中，代谢物是微生物代谢物，其是由微生物产生以例如调节其自身生长和发育、促进与其它生物的有益相互作用以及抑制对其有害的生物的代谢物。微生物代谢物可以是例如小分子定量合物(<2,500Da)。在一些实施方式中，代谢物是微生物代谢物的类似物。在一些实施方式中，微生物代谢物及其类似物包括短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸和长链脂肪酸以及短链脂肪酸、中链脂肪酸和长链脂肪酸的盐和酯。脂肪酸的非限制性实例包括SCFA乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。
如本文所使用的术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、双抗体(diabodies)以及单链分子和抗体片段(例如Fab或F(ab')2和Fv)。关于不同类别抗体的结构和性质参见例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties，AbbaI.Terr和Tristram G.Parsolw(编)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页和第6章。
神经退行性病症
神经功能障碍是许多人类疾病的基础。行为性病症、精神病性病症和神经退行性病症通常在中枢神经系统(CNS)内显示出标志性神经病理学。一种神经病理学，即淀粉样变性，是由破坏许多细胞功能的特定神经元蛋白的异常聚集引起的。受影响的组织通常含有显示出改变的构象的不溶性蛋白聚集体，认为这一特征导致估计50种不同的人类疾病。包括阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和帕金森氏病(PD)在内的神经退行性淀粉样病症与淀粉样蛋白有关。PD是美国第二常见的神经退行性疾病，影响了估计100万人和1％的超过60岁的美国人口。在全世界范围内，大约300万患者和护理人员受PD常使人衰弱的症状所累，其涉及运动缺陷，包括震颤、肌肉僵硬、运动迟缓和步态受损。这是一种具有强烈环境成分的多因素病症，因为不到10％的病例是遗传性的。认为α-突触核蛋白(αSyn)的聚集在称为突触核蛋白病的疾病家族中是致病性的，该疾病家族包括PD、多系统萎缩和路易体病。αSyn聚集是一个渐进的过程，导致寡聚物质和在神经元内积累的非瞬时原纤维。黑质致密部(SNpc)的多巴胺能神经元似乎特别容易受到αSyn聚集体的影响。多巴胺调节剂是PD中的一线治疗剂；然而，治疗可能带来严重副作用并且往往会失去效果。需要发现安全且有效的治疗方法，以解决人口老龄化中日益严重的PD负担。
外周影响(Peripheral influences)已牵连到影响脑的疾病的发作和/或进展中(Dinan和Cryan，2015)。已提议了焦虑、抑郁、伤害感受和自闭症谱系障碍(ASD)中肠和脑之间的双向交流(Mayer等，2014；Schroeder和Backhed，2016；Sharon等，2016)。胃肠(GI)生理和运动性受到肠内局部产生的信号和来自CNS的信号的影响。肠内产生的神经递质、免疫信号、激素和神经肽可能转而影响脑(Selkrig等，2014；Wall等，2014)。
人体在几乎所有暴露于环境的表面上被微生物永久定殖，其中大多数驻留在胃肠道内。微生物群可对神经发育和CNS产生深远影响。无菌(GF)小鼠和抗生素处理的无特定病原体(SPF)小鼠的海马神经发生出现改变，导致受损的空间识别和物体识别。微生物群调节5-羟色胺受体(5-HT1A)、脑源神经营养因子(BDNF)和NMDA受体亚基2(NR2A)的表达。GF小鼠具有改变的皮质髓鞘形成和受损的血脑屏障功能。此外，微生物群促进小鼠肠和循环羟色胺产生，并影响焦虑、活动过度和认知。粪便和粘膜相关的肠微生物在患有PD的个体和健康对照之间是不同的。
肠细菌可以控制肠、外周和脑中的免疫细胞的分化和功能。患有PD的受试者表现出肠炎和GI异常，如在运动缺陷之前通常便秘多年。Braak设想假定异常αSyn积累在肠中开始，并以朊病毒样方式通过迷走神经传播到脑。这一观点得到了病理生理学证据的支持：αSyn包涵体在肠神经系统(ENS)以及舌咽神经和迷走神经中较早出现，并且切断迷走神经的个体患PD的风险降低。此外，将αSyn原纤维注射到健康啮齿动物的肠组织中足以诱导迷走神经和脑干内的病理。
神经退行性病症的治疗
如本文中所公开的，在有需要的受试者中调整肠微生物群的组成(例如通过减少/耗尽受试者肠微生物群中的PD增强性微生物、引入健康微生物群，或这两者)可以在受试者中延迟PD进展方面提供益处。
本文公开的内容包括：用于在有需要的受试者(例如具有神经退行性病症的患者)中治疗神经退行性病症的方法、延迟或降低神经退行性病症发作可能性的方法、改善运动缺陷的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在受试者中调整肠微生物群的组成。在一些实施方式中，所述方法还改善受试者中的一种或多种身体损伤。所述方法可以例如改善受试者的一种或多种GI功能、缓解受试者的便秘。运动缺陷的非限制性实例包括震颤、肌肉僵硬、运动迟缓、步态受损及它们的任何组合。在一些实施方式中，神经退行性病症是突触核蛋白病，其包括但不限于原发性或特发性帕金森症、继发性或获得性帕金森症、遗传性帕金森症、帕金森叠加综合征或多系统变性，及它们的任何组合。
在一些实施方式中，所述方法包括鉴定有需要的受试者，其中，所述有需要的受试者是具有异常水平的α-突触核蛋白(αSyn)聚集(例如异常高水平的αSyn聚集)的受试者。在一些实施方式中，所述方法包括测量受试者中(例如受试者脑中)αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者中(例如受试者脑中)不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。测量受试者中(例如受试者脑中)αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者中(例如受试者脑中)不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平或它们的组合可以在不同时间点进行，例如在调整受试者肠微生物群的组成之前、期间和/或之后。
本文还提供了用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞活化的方法、用于在有需要的受试者中减少α-突触核蛋白(αSyn)聚集体的方法以及用于在有需要的受试者中减少神经炎症的方法。在一些实施方式中，有需要的受试者患有神经退行性疾病，例如突触核蛋白病(例如帕金森氏病、伴路易体病的痴呆、多系统萎缩或它们的任何组合)。在一些实施方式中，受试者患有PD。在一些实施方式中，所述方法包括在受试者中调整肠微生物群的组成。所述方法可以例如促进不溶性αSyn蛋白聚集体的清除(例如清除速度、清除量或这两者)、降低αSyn蛋白的聚集(例如聚集速度、聚集量或这两者)或这两者。在一些实施方式中，所述方法包括测量受试者中(例如受试者脑中)αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者中(例如受试者脑中)不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。测量受试者中(例如受试者脑中)αSyn聚集的速度和/或水平、测量受试者中(例如受试者脑中)不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平或它们的组合可以在不同时间点进行，例如在调整受试者肠微生物群的组成之前、之后和/或之后。
有需要的受试者可以是患有神经退行性病症或有发展为神经退行性病症的风险的受试者，例如神经退行性淀粉样病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病或它们的任何组合。在一些实施方式中，有需要的受试者是患有突触核蛋白病或有发展为突触核蛋白病的风险的受试者，例如帕金森氏病、伴路易体病的痴呆、多系统萎缩，或它们的任何组合。在一些实施方式中，有需要的受试者是患有帕金森氏病或有发展为帕金森氏病的风险的受试者。神经退行性病症的非限制性实例包括原发性或特发性帕金森症、继发性或获得性帕金森症、遗传性帕金森症、帕金森叠加综合征或多系统变性，及它们的任何组合。
如本文所述的，在本文公开的方法的一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成之后，受试者中肠微生物群的组成恢复到正常水平。如本文所使用的肠微生物群的组成的“正常水平”是指非PD受试者(例如健康受试者)中肠微生物群的组成水平。本领域技术人员将理解的是，非PD(例如健康)个体之间可存在肠微生物群组成的可变性，并且可建立正常水平作为非PD群体或健康受试者群体中肠微生物群的组成的代表以用于比较。可以使用各种标准来确定参考群体中特定受试者的纳入和/或排除，包括但不限于受试者的年龄(例如，参考受试者可以与需要治疗的受试者在同一年龄组内)和受试者的性别(例如，参考受试者可以与需要治疗的受试者为相同的性别)。
如本文所述的，在受试者中调整肠微生物群的组成可以通过各种方法实现，包括但不限于粪便移植、微生物群常规化、微生物定殖、肠微生物群重建、益生菌处理、抗生素处理或它们的组合。
在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括向受试者给予一种或多种抗生素。一种或多种抗生素中的至少一种可以是例如氨苄青霉素、万古霉素、新霉素、庆大霉素、红霉素或它们的任何组合。在一些实施方式中，抗生素处理不包括向受试者给予利福平和/或米诺环素。在受试者中调整肠微生物群的组成也可以通过例如向受试者给予PD增强性微生物代谢物的抑制剂来实现。PD增强性微生物代谢物的抑制剂的实例包括但不限于针对一种或多种PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的底物的抗体以及参与体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的一种或多种酶的抑制剂。
如本文所使用的术语“PD增强性微生物代谢物”是指相比未患有PD或未患有具有一种或多种帕金森症症状的任何病理状况的受试者(例如健康受试者)，在患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的任何病理状况的受试者中水平增加的微生物代谢物。例如，相比非PD受试者，患有PD的受试者的循环中微生物代谢物的水平可以改变。微生物代谢物的水平可以在例如PD受试者的血液、粪便、血清、血浆、体液(例如脑脊髓液、胸膜液、羊水、精液或唾液)和/或尿液中改变。PD增强性微生物代谢物的非限制性实例包括一种或多种脂肪酸、其盐或酯或它们的任何组合。脂肪酸可以是例如短链脂肪酸、中链脂肪酸或长链脂肪酸。在一些实施方式中，PD增强性微生物代谢物包含一种或多种短链脂肪酸(SCFA)、其盐或酯或它们的任何组合。在一些实施方式中，PD增强性微生物代谢物包含SCFA乙酸盐、SCFA丙酸盐、SCFA丁酸盐或它们的任何组合。
在受试者中调整肠微生物群的组成可以包括例如提高受试者中一种或多种PD防护性细菌种类的水平。在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括向受试者给予包含一种或多种PD防护性细菌种类的组合物。如本文所使用的术语“PD防护性细菌种类”是指存在于受试者肠微生物群中的可以保护受试者免于发展为PD或发展为具有一种或多种帕金森症症状的病理状况、减缓患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者中的疾病进展、减轻PD或具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的状况、缓解PD的至少一种症状或它们的组合的细菌种类。在一些实施方式中，PD防护性细菌种类仅存在于非PD受试者中(例如受试者肠中)，但不存在于患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者中。在一些实施方式中，相比非PD受试者(例如健康受试者)，PD防护性细菌种类以显著较低的水平(例如不超过50％、不超过25％、不超过10％、或不超过5％或更少)存在于患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者中(例如受试者肠中)。PD防护性细菌种类的非限制性实例包括属于毛螺菌科、理研菌科、消化链球菌科、梭菌科、肠球菌属、梭菌属、拟杆菌属或丁酸梭菌属家族的种类。在一些实施方式中，组合物是益生菌组合物、营养医学组合物、药物组合物或它们的任何组合。
在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括减少受试者中一种或多种PD增强性细菌种类的水平。如本文所使用的术语“PD增强性细菌种类”是指存在于(单独或与一种或多种另外的细菌种类组合)受试者肠微生物群中的可以增加受试者发展为PD或发展为具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的可能性、加速PD或具有一种或多种帕金森症症状的病理状况发作、增加PD或具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的状况的严重程度、使PD的至少一种症状恶化或它们的组合的细菌种类。在一些实施方式中，PD增强性细菌种类仅存在于患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者中(例如受试者肠中)，但不存在于非PD受试者(例如健康受试者)中。在一些实施方式中，相比患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者，PD增强性细菌种类以显著较低的水平(例如不超过50％、不超过25％、不超过10％、或不超过5％或更少)存在于非PD受试者中(例如受试者肠中)。在一些实施方式中，PD增强性细菌种类是属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、Pseudoramibacter Eubacterium或韦荣球菌科的细菌种类。在一些实施方式中，PD增强性细菌种类是产SCFA细菌，例如属于KEGG家族K00929、K01034或K01035的产SCFA细菌。
在一些实施方式中，在受试者中调整肠微生物群的组成包括将来自健康受试者的肠微生物群引入待治疗的受试者。
一些实施方式提供了用于在受试者中治疗神经退行性病症的方法，该方法包括以下中的一种或多种：向受试者给予抗生素；以及向受试者给予PD增强性微生物代谢物的抑制剂。一些实施方式提供了用于在受试者中延迟或降低神经退行性病症发作可能性的方法，该方法包括以下中的一种或多种：向受试者给予抗生素；以及向受试者给予PD增强性微生物代谢物的抑制剂。一些实施方式提供了在有需要的受试者中改善帕金森症症状的方法，该方法包括以下中的一种或多种：向受试者给予抗生素；向受试者给予抗炎剂；以及向受试者给予一种或多种PD增强性微生物代谢物的抑制剂。抗生素可以不是利福平或米诺环素。神经退行性病症可以是例如神经退行性淀粉样病症，包括但不限于阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病或它们的任何组合。在一些实施方式中，神经退行性病症是突触核蛋白病，例如帕金森氏病、伴路易体病的痴呆、多系统萎缩或它们的任何组合。
如本文所述的，在一些实施方式中，抗炎剂可以是合成的非类固醇抗炎药(NSAID)，例如乙酰水杨酸、双氯芬酸(dichlophenac)、吲哚美辛、oxamethacin、布洛芬、吲哚洛芬、萘普生、酮洛芬、甲芬那酸(mefamanic acid)、安乃近(metamizole)、吡罗昔康和塞来昔布。在一些实施方式中，抗炎剂是调节炎症过程的激素原，包括但不限于激素原转化酶1、阿黑皮素原(proopiomelanocortin)、激素原B型利尿钠肽、SMR1激素原等。在一些实施方式中，抗炎剂是具有抗炎作用的酶，包括但不限于菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、serrapeptidase和蛋白水解酶，例如胰液素(一种胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的混合物)。在一些实施方式中，抗炎剂是具有抗炎作用的肽，包括但不限于磷脂酶A2的抑制剂，例如抗炎素-1(对应于脂皮质素的氨基酸残基246-254的肽)；抗炎素-2(对应于子宫珠蛋白的氨基酸残基39-47的肽)；S7肽(其抑制白介素6和白介素6受体之间的相互作用)；RP1(一种异戊二烯基蛋白抑制剂)；以及类似的肽。在一些实施方式中，抗炎肽是皮质抑素(cortistatin)(一种与生长抑素相关的环状神经肽)；或对应于SV-IV蛋白N末端片段，E-选择素、L-选择素和P-选择素保守区的肽等。抗炎剂的其它非限制性实例包括胶原水解产物和乳微量营养素浓缩物(例如可从Stolle Milk Biologics，Inc.，Cincinnati，Ohio获得的MicroLactin.RTM.)、乳蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物和植物蛋白水解产物。在一些实施方式中、抗炎剂是具有抗炎特性的植物提取物，包括但不限于以下植物的提取物：蓝莓、boswella、黑儿茶(black catechu)和中国黄芩(Chinese skullcap)、芹菜籽、洋甘菊、樱桃、爪钩草(devils claw)、桉树、月见草、姜、山楂果、马尾草、刺楸(Kalopanax pictu)树皮、甘草根、姜黄、白柳、柳树皮和丝兰(yucca)。
在一些实施方式中，抗炎剂和抗菌素不是米诺环素。帕金森症症状的非限制性实例包括运动功能受损、αSyn聚集增强、小胶质细胞活化异常、震颤、运动迟缓、肌肉僵硬、姿态和平衡受损、自发运动丧失、语言障碍、书写障碍及它们的任何组合。
PD增强性微生物代谢物的抑制剂可以是例如针对一种或多种PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的底物的抗体、或参与体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的酶的抑制剂。
在本文所述的方法中，在受试者中调整肠微生物群的组成和/或向受试者给予PD增强性微生物的抑制剂可以单独进行或与一种或多种其它疗法(例如抗生素疗法和抗炎疗法)组合进行；或单独进行以达到疗效。例如，在本文公开的方法的一些实施方式中，受试者或有需要的受试者未接受抗生素治疗和/或抗炎治疗。在一些实施方式中，该方法不包括向受试者或有需要的受试者给予任何抗生素和/或抗炎剂。在一些实施方式中，受试者或有需要的受试者未用利福平和/或米诺环素治疗。在一些实施方式中，受试者或有需要的受试者在调整肠微生物群的组成或其它治疗(例如给予一种或多种PD增强性微生物代谢物的抑制剂)之前至少1小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少5天、至少10天或至少20天未接受任何抗生素治疗和/或抗炎剂治疗。在一些实施方式中，受试者或有需要的受试者在调整肠微生物群的组成或其它治疗(例如给予一种或多种PD增强性微生物代谢物的抑制剂)之后至少1小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少5天、至少10天或至少20天不接受任何抗生素治疗和/或抗炎剂治疗。
在本文公开的方法的一些实施方式中，该方法还包括确定受试者中一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平，以鉴定需要治疗的受试者。
PD的诊断
如本文公开的，在受试者中鉴定特定的PD相关肠微生物可以在严重运动症状发作之前提供PD诊断和/或作为疾病进展严重程度的标志物。
提供了在受试者中诊断帕金森症的方法。在一些实施方式中，所述方法包括确定受试者中一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平，由此一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或异常水平表明受试者具有发展为帕金森症症状的风险或患有帕金森症症状。在一些实施方式中，确定受试者肠中一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平。
如本文所使用的术语“PD相关细菌种类”是相比非PD受试者或未患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者(例如健康受试者)，在患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者的肠微生物群中水平改变的细菌种类。在一些实施方式中，相比非PD受试者或未患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者(例如健康受试者)，PD相关细菌种类的水平在患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者的肠微生物群中提高。在一些实施方式中，相比非PD受试者或未患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者(例如健康受试者)，PD相关细菌种类的水平在患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者的肠微生物群中降低。在一些实施方式中，PD相关细菌种类仅存在于患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者中(例如受试者肠中)，但不存在于非PD受试者(例如健康受试者)中。在一些实施方式中，相比患有PD或患有具有一种或多种帕金森症症状的病理状况的受试者，PD相关细菌种类以显著较低的水平(例如不超过50％、不超过25％或不超过10％)存在于非PD受试者中(例如受试者肠中)。在一些实施方式中，PD相关细菌种类是属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、Pseudoramibacter Eubacterium或韦荣球菌科的细菌种类。在一些实施方式中，PD相关细菌种类是产SCFA细菌，例如属于KEGG家族K00929、K01034或K01035的产SCFA细菌。
一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或异常水平可以表明受试者具有发展为帕金森症的风险或受试者患有帕金森症。帕金森症可以是例如原发性或特发性帕金森症、继发性或获得性帕金森症、遗传性帕金森症、帕金森叠加综合征或多系统变性，或它们的任何组合。在一些实施方式中，帕金森症是帕金森氏病。在一些实施方式中，受试者是成人。
组合物
本文公开的内容包括包含一种或多种PD防护性细菌种类的组合物。PD防护性细菌种类的非限制性实例包括属于毛螺菌科、理研菌科、消化链球菌科、梭菌科、肠球菌属、梭菌属、拟杆菌属或丁酸梭菌属家族的细菌种类。在一些实施方式中，组合物不包含PD增强性细菌种类。例如，在一些实施方式中，组合物不包含属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、Pseudoramibacter Eubacterium和韦荣球菌科中的至少一种的细菌种类。在一些实施方式中，组合物不包含属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、PseudoramibacterEubacterium和韦荣球菌科的细菌种类。
组合物的类型可以改变，例如，组合物可以是益生菌组合物、营养医学组合物、药物组合物或它们的任何组合。在一些实施方式中，组合物是食品、饮料或食品补充剂。在一些实施方式中，组合物是包含一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物包含酸抑制剂(acid suppressant)、抗酸剂(antacid)、H2拮抗剂、质子泵抑制剂或它们的组合。组合物可以处于各种形式，例如，组合物可以处于冻干制剂、粉碎(pulverized)制剂或粉末化(powdered)制剂中；处于混悬剂(例如细菌悬浮于其中的混悬剂)中；液体培养物，或冻干、粉碎或粉末化；或作为溶解在例如盐水中的药物组合物。
组合物可以处于以下形式：胶囊剂、片剂、slush或散剂，或它们的组合。组合物可以包括例如乳制品如酸奶、发酵和未发酵乳、冰沙、黄油、奶油、鹰嘴豆泥、康普茶、沙拉调料、味噌、豆豉、营养棒以及一些果汁和大豆饮料。在一些实施方式中，将组合物配制成肠溶包衣胶囊、肠溶包衣微胶囊、适于复水的粉末、鼻十二指肠输注剂(nasoduodenalinfusion)，或者用于以灌肠剂或结肠镜输注剂的形式递送；或者作为添加至食品、食品添加剂、基于乳制品的产品、基于大豆的产品或它们的衍生物、果冻或酸奶中的药物组合物。
本文公开的内容还包括包含PD增强性微生物代谢物的抑制剂的药物组合物。PD增强性微生物代谢物可以是例如脂肪酸、或其盐或酯。在一些实施方式中，PD增强性微生物代谢物是短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸、长链脂肪酸、短链脂肪酸的盐或酯、中链脂肪酸的盐或酯、或长链脂肪酸的盐或酯。抑制剂可以是例如针对PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、针对用于体内合成PD增强性微生物代谢物的底物的抗体、或参与体内合成PD增强性微生物代谢物的酶的抑制剂。药物组合物可以包含例如一种或多种药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以用于治疗各种病症/疾病，包括但不限于神经退行性病症(如帕金森氏病)。
还提供了药物组合物的药学上可接受的前药以及采用这样的药学上可接受的前药的治疗方法。术语“前药”是指指定化合物的前体，该前体在给予受试者后通过化学或生理过程(例如溶剂分解或酶促切割)或在生理条件下(例如在被带至生理pH时转化为药剂的前药)体内产生该化合物。“药学上可接受的前药”是无毒且生物学上可耐受的前药，并且在生物学上适于给予受试者。用于选择和制备合适的前药衍生物的说明性方法描述于例如Bundgaard，Design of Prodrugs(Elsevier Press，1985)中。
还提供了药物组合物的药学上的活性代谢物以及这样的代谢物在本发明的方法中的用途。“药学上的活性代谢物”是指化合物或其盐在体内代谢的药理学上的活性产物。化合物的前药和活性代谢物可使用本领域已知或可获得的常规技术确定。参见例如Bertolini等,J.Med.Chem.1997,40,2011-2016；Shan等,J.Pharm.Sci.1997,86(7),765-767；Bagshawe,Drug Dev.Res.1995,34,220-230；Bodor,Adv.Drug Res.1984,13,255-331；Bundgaard,Design of Prodrugs(Elsevier Press,1985)；以及Larsen,Design andApplication of Prodrugs,Drug Design and Development(Krogsgaard-Larsen等,eds.,Harwood Academic Publishers,1991)。
可以制备本文所述化合物的任何合适的制剂。总体参见Remington'sPharmaceutical Sciences,(2000)Hoover,J.E.editor,第20版,Lippincott Williamsand Wilkins Publishing Company,Easton,Pa.,780-857页。将制剂选择为适于合适的给药途径。一些给药途径是口服给药、胃肠外给药、通过吸入给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、口腔给药、阴道给药、通过植入储库(implanted reservoir)给药或其它药物给药方法。在化合物具有足够碱性或酸性来形成稳定的无毒酸盐或碱盐的情况下，以盐形式给予化合物可能是合适的。药学上可接受的盐的实例是与形成生理学上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐以及α-甘油磷酸盐。还可以形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。使用本领域熟知的标准方法获得药学上可接受的盐，例如通过足够碱性的化合物(如胺)与合适的酸(提供生理学上可接受的阴离子)。还可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。
当所考虑的化合物在药物组合物中给予时，考虑在内的是可以将该化合物与药学上可接受的赋形剂和/或载体一起配制在混合物中。例如，所考虑的化合物可以作为中性化合物或作为药学上可接受的盐口服给药，或者在生理盐水溶液中静脉内给药。常规缓冲剂(如磷酸盐、碳酸氢盐或柠檬酸盐)可用于此目的。本领域技术人员可以在说明书教导的范围内改变制剂以提供用于特定给药途径的多种制剂。特别地，可以对所考虑的化合物进行改性以使它们更易溶于水或其它媒介物，这例如可以通过本领域技术人员能力范围之内的微小改性(盐形成、酯化等)容易地完成。修改特定化合物的给药途径和给药方案来管理本发明化合物的药代动力学以在患者中获得最大有益效果也在本领域技术人员能力范围之内。
如本文所述的药物组合物可以是在有机溶剂(如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、甘油、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜或它们的任何组合)中可溶的。在一些实施方式中，通过将药剂与药学上可接受的载体混合来制备制剂。在一些实施方式中，可使用包括以下步骤的方法来制备制剂：a)将所述药剂溶解在水溶性有机溶剂、非离子溶剂、水溶性脂质、环糊精、维生素(如生育酚)、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂或它们的组合中，以提供溶液；b)加入含1-10％碳水化合物溶液的盐水或缓冲液。碳水化合物可以包括例如右旋糖。使用本发明方法获得的药物组合物是稳定的并且可用于动物和临床应用。
在本发明方法中使用的水溶性有机溶剂的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、醇类、乙腈、N-甲基-2-吡咯烷酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜或它们的组合。醇类的实例包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇、甘油或丙二醇。
在本发明方法中使用的水溶性非离子表面活性剂的非限制性实例包括但不限于EL、聚乙二醇改性(聚乙二醇甘油三蓖麻醇酸酯35(polyoxyethyleneglyceroltriricinoleat 35))、氢化RH40、氢化RH60、PEG-琥珀酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、HS(聚乙二醇660 12-羟基硬脂酸酯)、失水山梨醇单油酸酯、泊洛沙姆、(乙氧基化杏仁油(persic oil))、(capryl-caproyl聚乙二醇-8-甘油酯)、(甘油酯)、(PEG 6辛酸甘油酯)、甘油、甘油-聚山梨醇酯，或它们的组合。
在本发明方法中使用的水溶性脂质的非限制性实例包括但不限于菜油(vegetable oils)、甘油三酯、植物油或它们的组合。脂质油的实例包括但不限于蓖麻油、聚氧乙烯(polyoxy)蓖麻油、玉米油、橄榄油、棉籽油、花生油、薄荷油、红花油、芝麻油、大豆油、氢化菜油、氢化大豆油、椰子油的甘油三酯、棕榈籽油及它们的氢化形式或它们的组合。
在本发明方法中使用的脂肪酸和脂肪酸酯的非限制性实例包括但不限于油酸、甘油单酯、甘油二酯、PEG的单或二脂肪酸酯或它们的组合。
在本发明方法中使用的环糊精的非限制性实例包括但不限于α-环糊精、β-环糊精、羟丙基-β-环糊精或磺丁基醚-β-环糊精。
在本发明方法中使用的磷脂的非限制性实例包括但不限于大豆磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰甘油及它们的氢化形式或它们的组合。
本领域技术人员可以在说明书教导的范围内改变制剂以提供用于特定给药途径的多种制剂。例如，可以对化合物进行改性以使它们更易溶于水或其它媒介物。修改特定化合物的给药途径和给药方案来管理本发明化合物的药代动力学以在患者中获得最大有益效果也在本领域技术人员能力范围之内。
本文公开的药物组合物可以口服给药、胃肠外给药、通过吸入给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、口腔给药、阴道给药、通过植入储库给药或通过其它药物给药方法给药。如本文所使用的术语“胃肠外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。
无菌可注射组合物(如无菌可注射水性或油性混悬剂)可使用适当的分散剂或湿润剂和悬浮剂根据本领域已知的技术来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂或混悬剂。可用的可接受的媒介物和溶剂包括甘露醇、水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。合适的载体和其它药物组合物组分通常是无菌的。
此外，将无菌的固定油(fixed oils)常规地用作溶剂或悬浮介质(如合成的甘油单酯或甘油二酯)。脂肪酸(如油酸及其甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，正如药学上可接受的油(如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式)。这些油溶液剂或混悬剂也可含有长链醇稀释剂或分散剂、或羧甲基纤维素或类似分散剂。常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的各种乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。
用于口服给药的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、乳剂和水性混悬剂、分散剂和溶液剂。在用于口服使用的片剂的情况下，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。还可加入润滑剂(如硬脂酸镁)。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服给予水性混悬剂或乳剂时，可将活性成分悬浮或溶解在与乳化剂或悬浮剂混合的油相中。如果需要，可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。鼻气雾剂或吸入组合物可根据药物制剂领域熟知的技术制备，并可使用合适的防腐剂(例如苯甲醇)、用于提高生物利用度的吸收促进剂和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂制成例如盐水中的溶液。
实施例
在以下实施例中更详细地公开上文讨论的实施方式的一些方面，这些实施例不以任何方式限制本公开的范围。
实验材料和方法
以下实验材料和方法用于下文所述的实施例1-实施例8。
表1.试剂和资源
小鼠
使就X染色体上的Thy1-α-突触核蛋白转基因而言杂合的雌性BDF1背景的Thy1-αSyn动物与野生型雄性BDF1小鼠繁殖，以产生研究中使用的雄性ASO和WT同窝动物。通过将雌性C57BL/6与雄性DBA/2(Charles River，Hollister，CA)杂交来繁殖雄性BDF1。每6个月用转基因雌性和新生成的BDF1雄性来补充繁殖对(breeding pairs)。通过剖腹产和每6个月新生成的雄性来生成无菌(GF)Thy1-αSyn繁殖对。继手术切除子宫和幼仔分娩后，由GFSwiss-Webster母亲(dams)来抚育微生物学上的无菌动物。将SPF动物、抗生素处理的动物和Ex-GF动物饲养在经高压灭菌的通风的微型隔离笼中。将GF和SCFA处理的动物饲养在具有柔性膜隔离件的无顶(open-top)笼中并保持为微生物学上无菌。微生物学上无菌以每两周一次的基础通过如下来确认：
来自源于粪便的DNA的16s rRNA PCR以及将粪球在厌氧条件下铺板在布鲁氏菌(Brucella)血琼脂培养基上和在需氧条件下铺板在胰蛋白酶大豆血琼脂(tryptic soyblood agar)上。不论定殖状态，将接受经高压灭菌的食物(LabDiet LaboratoryAutoclavable Diet 5010，St Louis，MO)和水(自由采食)的所有动物维持在相同的12小时光-暗周期下并饲养于相同的设施内。从5-6周龄开始直至12-13周龄在饮用水中向抗生素处理的动物提供氨苄青霉素(1g/L；Sigma Aldrich，St.Louis，MO)、万古霉素(0.5g/L；Sagent Pharmaceuticals，Schaumburg，IL)、新霉素(0.5g/L；Fisher Scientific)、庆大霉素(100mg/L；Sigma Aldrich)和红霉素(10mg/L；Sigma Aldrich)。通过在口服强饲(oralgavage)前用重悬于碳酸氢钠缓冲液中的来自3只野生型BDF1雄性的盲肠内容物定殖5-6周龄GF动物来生成Ex-GF动物。从5-6周龄开始直至12-13周龄向SCFA处理的动物提供含有乙酸钠(67.5mM；Sigma Aldrich)、丙酸钠(25mM；Sigma Aldrich)和丁酸钠(40mM；SigmaAldrich)的饮水。从5-6周龄直至12-13周龄以2g/L在饮用水(自由采食)中提供米诺环素(Arcos Organics)处理，同时伴有SCFA。在饮用水(自由采食)中向用热灭活细菌处理的GF动物提供～5×108CFU/mL溶原肉汤(LB)中生长的大肠杆菌(Escherichia coli)MC4100(来自Matthew Chapman，U.of Michigan)(在磷酸盐缓冲盐水中洗涤两次，并煮沸45分钟)。
人类供体和标准
从Rush大学运动失调门诊所见的患者中选择人类供体。PD根据UK脑库标准来诊断。PD受试者的排除标准：非典型或继发性帕金森症；在样本收集前三个月内使用益生菌或抗生素；使用NSAID；原发性胃肠病理；慢性GI病史(包括IBD和乳糜泻)；不稳定的内科(medical)病、神经病或精神病；低血小板计数(<80k)；不可补救的延长的PT(>15秒)；或者阻碍活检的出血史。通过乙状结肠镜检查以及通过H&E组织学检查，所有患者在直肠和乙状结肠中均具有正常的粘膜。健康对照尽可能密切地与PD患者匹配。健康受试者的纳入标准：正常的体检和血液检查；无消化不良(digestive complaints)、症状或病史；无神经退行性疾病；在样本收集前至少三个月不使用益生菌、抗生素、NSAID或处方药。
运动功能和胃肠测试
除人源化动物之外，所有运动功能评估均在相同的限菌(gnotobiotic)动物设施中进行。人源化动物在相同设施内的层流生物安全柜中进行测试。在光阶段的第7-9小时之间测试所有动物的运动功能。所有测试均以类似于在Fleming等，2004，Early andprogressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type humanalpha-synuclein，J.Neurosci.24，9434-9440(将其内容整体并入本文)中描述的研究的方式进行。首先进行梁跨越，然后让动物休息约1小时并测试沿杆下降。第二天进行粘合剂去除和后肢评分。粪便输出在3天内并且在组织收集之前立即进行。
梁跨越
将1米的有机玻璃梁(Stark’s Plastics，Forest Park，OH)构建为长度0.25μm的4段。各段具有变窄的宽度(3.5cm、2.5cm、1.5cm和0.5cm)，在梁表面下方1cm处放置有1cm的悬垂部分。最宽的段充当动物的装载平台，而最窄的一端放入饲养笼中。在测试之前，使动物进行2天训练以跨越梁的长度。在训练第1天，动物接受1次试验，其中，将饲养笼放置于靠近装载平台的位置，并引导动物沿着变窄的梁向前。动物接受另外2次试验，其中，在鼓励在梁上向前移动和稳定方面提供有限的帮助或没有帮助。在训练第2天，动物进行3次跨越梁的试验，通常在向前移动方面不需要帮助。在第3天，在3次试验中对动物从装载平台跨越到饲养笼进行计时。当动物将它们的前肢放置在2.5cm的段上时开始计时，并在1个前肢到达饲养笼时结束计时。
沿杆下降
将用非粘性货架衬垫(shelf liner)包裹以促进动物抓力的直径1cm、长0.5m的杆放入饲养笼。动物接受2天训练以从杆顶部下降到饲养笼中。在训练第1天，动物接受3次试验。第1次试验，将动物头向下地置于地板上方1/3的距离处；第2次试验，2/3的距离处；第3次试验，将动物置于顶部。在训练第2天，给予动物3次试验来头向下地从杆顶部下降。在测试日，将动物头向下地置于杆顶部并对下降回饲养笼计时。当实验者释放动物时开始计时，并在1个后肢到达饲养笼底部时结束计时。
粘合剂去除
将1/4”圆形粘性标签(Avery，Glendale，CA)放置于鼻孔和前额之间的鼻梁上。将动物放入它们的饲养笼中(移除合笼动物(cage mates))并对完全除去贴纸计时。在3次试验中对动物进行记录。
后肢抓握反射评分
类似于在Zhang等，2014，Motor impairments,striatal degeneration,andaltered dopamine-glutamate interplay in mice lacking PSD-95.J.Neurogenet.28，98-111(将Zhang等的内容整体并入本文)中所描述的，借助尾部中段将动物轻轻向上提起并观察约5-10秒。基于后肢向内抓握的程度为动物指定0、1、2、3的分数。将0(表示无抓握)给予自由移动所有肢体并将其向外伸展的动物。将分数1指定给在约束期间向内抓握1个后肢或者如果双腿表现出部分向内抓握的动物。如果在大多数观察中双腿向内抓握但仍然表现出一定灵活性，则给出分数2。如果动物表现出立即向内抓握的完全瘫痪的后肢并且没有表现出灵活性迹象，则指定分数3。
倒置栅格
将动物置于具有1cm宽网眼的30cm×30cm筛网的中心。将筛网头尾倒置并放置在具有深垫层的开放笼上方约40cm处的支撑物上。对动物进行计时，直到它们脱手或保持60秒。
粪便输出
将动物从其饲养笼中取出并置于12cm×25cm半透明圆筒中。每5分钟计数粪球，累计超过15分钟。使用MATLAB软件(MathWorks)利用从执行至少3个任务的受试者收集的行为数据进行所有运动功能的主成分分析。在运行pca函数之前将数据集中(centered)并标准化(s＝1)。使用每个受试者相应的因子负荷仅绘制PC1和PC2(占方差的70.5％)。
免疫染色和小胶质细胞重建
将动物用戊巴比妥镇静并用磷酸盐缓冲盐水充分灌注，将脑解剖并将半球固定在4％(w/w)多聚甲醛中。通过振动切片机产生50mm纵切片(sagittal sections)。自由浮动切片用抗聚集/原纤维αSyn MJFR1(1:1000；兔；AbCam，Cambridge UK)、抗磷酸Ser129αSyn(1:1000；小鼠；Biolegend，San Diego，CA)和Neurotrace(Life Technologies，Carlsbad，CA)染色，或用抗Iba1(1:1000；兔；Wako，Richmond，YA)染色，随后用抗小鼠IgG-AF488和抗兔IgG-AF546(1:1000；Life Technologies)染色。用ProFade Diamond(Life Technologies)安装切片，并在Zeiss LSM800共聚焦显微镜上用10X物镜成像。每只动物每个区域对2-3个视野进行成像，并在ImageJ软件中进行编译以用于分析。对于小胶质细胞重建，如在Erny等，2015，Host microbiota constantly control maturation and function ofmicroglia in the CNS.Nat.Neurosci.18，965-977(将Erny等的内容整体并入本文)中所描述的，以1mm的步幅(steps)对Z堆叠进行成像，随后使用Imaris软件进行分析。进行小胶质细胞细胞体的半自动化重建和处理，由此实验者指定各个细胞体并且软件定量直径、树突长度以及来自各给定细胞体的分支点。每只动物每个区域分析20-60个细胞。
CD11b富集和qPCR分析
经由通过100mm的筛网过滤器使经灌注的全脑在PBS中均质化，根据制造商的说明，利用髓鞘(Myelin)去除珠(Miltenyi Biotec，San Diego CA)使用磁性分离来除去髓鞘碎片。根据制造商的说明，利用小胶质细胞微珠(Miltenyi Biotec，SanDiego，CA)使用磁性富集来类似地进行CD11b富集。通常，大于90％的富集细胞通过免疫荧光显微术为CD11b染色阳性。对于RNA分析，解剖组织(额叶皮质、尾壳核、下中脑和小脑)或将富集CD11b的细胞沉淀在Trizol中裂解以进行DirectZol RNA提取(Zymo Research，Irvine，CA)。通过iScript cDNA合成试剂盒(BioRad，Hercules，CA)产生cDNA。使用SybrGreen master mix(Applied Biosystems，Foster City，CA)在AB 7900ht仪器上使用来自PrimerBank的针对指明靶基因的引物进行qRT-PCR，并相对于gapdh定量为DDCT(上表1中列出的引物)。细胞因子和αSyn ELISA以及蛋白印迹
在含有蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher，Pittsburgh，PA)的RIPA缓冲液中制备组织匀浆物并稀释到PBS中。根据制造商的说明进行TNF-α和IL-6ELISA(eBioscience，SanDiego，CA)及αSyn ELISA(Thermo Fisher)。对于αSyn原纤维的斑点印迹定量，将1mg来自指定区域的组织匀浆物点样在1mL体积的小份试样中置于0.45mm硝酸纤维素膜上。对于Triton X可溶性与不溶性馏分的蛋白印迹，将脑半球在含1％Triton X-100的RIPA缓冲液中均质化，在15k×g下于4℃离心60分钟，以使不溶性蛋白从Triton可溶性上清液中沉淀。如先前在Klucken等(2006，Clinical and biochemical correlates of insolublealpha-synuclein in dementia with Lewy bodies.Acta Neuropathol.111，101-108，将其内容整体并入本文)中所述的，将不溶性部分溶解在10％十二烷基硫酸钠中。将5mg各馏分通过4％-20％SDS-PAGE(ThermoFisher)分离，印迹到PVDF膜上。所有膜都在含0.1％吐温20的Tris缓冲盐水中用5％脱脂奶粉封闭。将抗聚集αSyn抗体(1:2000；兔；Abcam)或抗αSyn(1:1000；小鼠；BD)在脱脂乳中稀释，并在4℃孵育过夜。用抗兔或抗小鼠IgG HRP(1:1000；Cell Signaling Technology)对膜进行探测。在BioRad GelDoc XR上用Clarity化学发光底物(BioRad)检测所有印迹。使用ImageJ软件进行光密度法。
αSyn聚集测定
对于体外聚集动力学，如在Chorell等，2015，Bacterial chaperones CsgE andCsgC differentially modulate human a-synuclein amyloid formation viatransient contacts.PLoS ONE 10，e0140194(将Chorell等的内容整体并入本文)中所述的，将70mMαSyn纯化，并在存在12mM硫代黄素T(ThT；Sigma Aldrich)和浓度增加的SCFA的情况下在磷酸盐缓冲盐水溶液(0.01M磷酸盐缓冲液、0.0027M氯化钾、0.137M氯化钠，pH7.4)中孵育。对于每个实验使用具有一半区域的非结合96孔板(Corning#3881)，并将直径2mm的玻璃珠加入每个孔中以加速聚集。使用酶标仪(Fluostar OPTIMA酶标仪，BMGLabtech)利用440±10nm的激发滤光片和490±10nm的发射滤光片在间歇振荡的条件下于37℃记录ThT荧光信号。动力学曲线归一化至荧光最大值和达到所定量的半最大强度的时间。对于原子力显微镜(AFM)成像，将样品用超纯水稀释至～3mM总蛋白浓度，并将50ml移液到新切割的云母上并使其干燥。用模块化扫描探针显微镜NTEGRA Prima(NT-MDT)在空气中以间歇接触模式使用金涂覆的单晶硅悬臂(弹簧常数为约5.1N/m)以约150kHz的共振频率对样品进行成像。AFM图像使用Gwyddion开源软件进行处理。
SCFA提取和分析
从12周龄的动物收集粪便样品。将各粪球与1mL无菌18U去离子水混合。通过在3200rpm下混合5分钟将粪球-水混合物均质化，并在4℃下以13,000rpm离心15分钟。使用Acrodisc LC 13mm无菌注射器式滤器用0.2mm PVDF膜(Pall Life Sciences)过滤上清液。将滤液用于高效液相色谱(HPLC)分析。使用配备有碳水化合物柱(Aminex HPX-87H柱，Biorad)和光电二极管阵列检测器(PDA，Shimadzu)的HPLC(LC-20AT，Shimadzu)分析短链脂肪酸(SCFA)。洗脱液为5mM H2SO4，以0.6mL/min的流速进料，柱温为50℃。运行时间是60分钟。通过将10mM挥发性脂肪酸标准溶液(乙酸、丁酸、甲酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸和庚酸)稀释至50nM-5000nM来产生标准曲线。将SCFA的浓度归一化至可溶性化学需氧量。如制造商所推荐的，使用高范围(20-1500mg/L)Hach COD消化管(Hach Company，Loveland)来测量粪便上清液中的sCOD值。用Hach分光光度计测量COD所使用的波长为620nm。
微生物组性质分析
在粪便移植后第7、14、21和49天从基于基因型和供体而饲养在1-3组中的动物收集粪球。如Gilbert等，2014，The Earth Microbiome project：successes andaspirations.BMC Biol.12，69(将Gilbert等的内容整体并入本文)中所述的，根据地球微生物组计划方案对样品进行测序。简言之，使用MoBio Power soil试剂盒(Carlsbad，CA)提取DNA，并使用Walters等，2015中描述的条形码引物扩增16S rRNA基因的V4区。使用Illumina MiSeq进行测序。针对QIIME 1.9(在Caporaso等，2010中描述)中于2013年8月发布的Greengenes(在McDonald等，2012中描述)使用SortMeRNA 2.0(在Kopylova等，2012中描述)将操作分类单元(OTU)选择为封闭式参考。对于α和β多样性计算，将该表精选为每个样品7500个序列。对经过滤以排除具有少于7500个序列的样品的表进行差异丰度。在QIIME1.9中计算加权和未加权UniFrac(在Lozupone和Knight，2005中描述)距离。使用Emperor0.9.4(在Vazquez-Baeza等，2013中描述)将主坐标分析(PCoA)预测形象化。使用PICRUSt1.0(在Langille等，2013中描述)推断功能；使用Bray Curtis距离比较预测的功能总集(functional repertoires)。使用scikit-bio 0.4.2中的permanova和QIIME 1.9中的置换t检验进行显著性检验，二者中每个检验均有999个置换。使用属水平分类单元和基于KEGG的相对丰度(所有计数被1抵消，all counts offset by one)进行差异丰度计算。使用scikit-bio 0.4.2中的ANCOM(在Mandal等，2015中描述)利用单因素ANOVA检验(用Bonferroni校正α为0.1作为拒绝阈值)进行检验。在BDF1或Thy1-αSyn遗传背景中比较用来自健康供体或PD供体的样品定殖的小鼠。在两组之间比较显著不同的分类单元，并分类为：在两者中均显著；仅在Thy1-αSyn背景中显著；或在BDF1背景中显著。使用Seaborn 0.7.0生成图。
定量和统计学分析
微生物组群统计学在上文详细描述。排除这些，在GraphPad Prism 6软件中分析数据集。用双尾t检验生成成对比较。用单因素ANOVA生成组比较。P值、n值、集中和分散测量(center and dispersion measurements)的定义在每个图的相关图例中指示。
数据和软件可用性
16s测序数据和元数据可以利用研究访问(study accession)号#10483通过QIITA网站(https://qiita.ucsd.edu/)以及利用研究访问号#ERP019564通过EMBL ENA数据库(http://www.ebi.ac.uk/ena)在线获得。
实施例1
肠微生物促进运动和GI功能障碍
该实施例使用带有复合微生物群的ASO动物和野生型动物表明肠微生物促进运动和GI功能障碍。
Thy1-αSyn(过表达α-突触核蛋白[ASO])小鼠显示出精细和粗大运动功能方面的进行性缺陷以及肠运动性缺陷。证据已将人中不受调控的αSyn表达关联至较高的PD风险，为Thy1-αSyn小鼠模型提供了流行病学基础。协调运动任务中的缺陷在12周龄时就变得明显。如先前在该模型中所验证的，通过四个测试来测量运动功能：梁跨越、沿杆下降、鼻粘合剂去除和后肢抓握反射(如在Fleming等，2004，Early and progressive sensorimotoranomalies in mice overexpressing wild-type human alpha-synuclein.J.Neurosci.24，9434-9440中所述的，将其内容整体并入本文)。
相比野生型同窝动物(SPF-WT)，12-13周龄的带有复合微生物群的ASO动物(SPF-ASO)需要显著更多的时间来跨越挑战性梁，并且还显示出沿杆下降的时间增加，这是粗大运动功能的2种量度(图2A和图2B)。相比SPF-WT小鼠，从鼻梁去除粘合剂(这是精细运动控制的测试)在SPF-ASO小鼠中受损(图2C)。后肢抓握反射(这是纹状体功能障碍的量度)在SPF-ASO小鼠中有缺陷(图2D)。
为了评估肠细菌的贡献，在无菌条件下重新获得ASO小鼠(GF-ASO)和野生型小鼠(GF-WT)。出乎意料地，12-13周龄的GF-ASO动物在梁跨越、沿杆下降、粘合剂去除和后肢抓握中呈现出减少的缺陷(图2A-图2D)。事实上，由GF-ASO小鼠执行的运动功能任务在许多情况下都类似于WT动物的性能水平。相比SPF-ASO动物，GF-ASO小鼠在体重方面没有表现出差异(图3A)，而SPF-ASO和GF-ASO动物在倒置栅格测定中均显示出缺陷(这是肢体强度的量度)(图3B)。因此，运动测试的结果并不取决于体重或体力。
在较晚的年龄(24-25周龄)，SPF-ASO动物表现出运动功能的进行性下降(图3C-图3G)，这在GF-ASO动物中显著延迟(图3C-图3G)。未在GF-WT和SPF-WT动物中观察到运动任务中的一致差异，为基因-微生物组相互作用提供了证据。因为在PD中，该小鼠模型中的运动功能障碍与降低的GI功能和便秘共同出现。
在12-13周龄和24-25周龄时，在SPF-ASO动物中均观察到粪球总输出明显减少，而在GF-ASO动物中粪便输出未改变(图2E、图2F、图3H和图3I)。此外，相比GF-ASO小鼠，SPF-ASO小鼠产生的粪球包含降低的含水量(图3J)，一起揭示了GF动物中GI缺陷减少。事实上，将所有运动表型编译至主成分分析(PCoA)中显示出SPF-ASO组的很醒目的偏离，而GF-ASO动物聚类更类似于WT小鼠(图3K)。
实施例1中呈现的数据证明肠微生物的存在促进PD临床前模型中的标志性运动和肠功能障碍。
实施例2
αSyn病理需要肠微生物群
该实施例表明αSyn病理在带有肠微生物群的小鼠中增加。
PD中的运动缺陷与αSyn聚集相吻合。利用仅识别构象特异性αSyn聚集体和原纤维的抗体，进行免疫荧光显微术来可视化小鼠脑中的αSyn包涵体。在SPF条件下，观察到ASO动物的尾壳核(CP)和黑质(SN)中αSyn的明显聚集(图4A和图4B)，这是在小鼠模型和人PD中都受影响的黑质纹状体通路的脑区域。令人惊讶地，GF-ASO小鼠显示出明显更少的αSyn聚集体(图4A和图4B)。为了定量αSyn聚集，进行脑提取物的蛋白印迹(图4C)。在GF-ASO动物的脑中观察到显著较少的不溶性αSyn(图4C-图4E)。为了进一步确认这些发现，对CP和下中脑(SN位于此处)中的聚集αSyn进行斑点印迹分析。观察到GF-ASO动物中αSyn聚集的类似减少(图5A-图5C)。
观察到αSyn聚集的区域特异性：在额叶皮质(FC)中，GF-ASO动物相比SPF动物带有较少的αSyn聚集；而在小脑(CB)中，在SPF和GF小鼠中观察到几乎等量的αSyn(图5D-图5H)。为了确保这些发现不反映转基因表达中的差异，确定了在SPF-ASO和GF-ASO动物之间下中脑和CP中的αSyn转录物和蛋白的水平是相似的(图4F和图4G)。
总之，这些数据表明微生物群调节促进αSyn聚集和/或防止不溶性蛋白聚集体清除的通路。
实施例3
由微生物群进行αSyn依赖性小胶质细胞活化
该实施例证实了由微生物群进行αSyn依赖性小胶质细胞活化。
微生物群调节CNS中的免疫发育，并且αSyn聚集体活化免疫细胞，包括脑驻留小胶质细胞。小胶质细胞在活化后经历重大形态变化，从具有多个分支延伸的细长细胞体转变为具有较少分支的圆形变形虫样细胞。来自共聚焦荧光显微镜的个别小胶质细胞的原位3D重建揭示了野生型GF动物带有不同于SPF动物的小胶质细胞。在CP和SN中，相比SPF-WT动物，GF-WT小鼠中的小胶质细胞显示出增加的数量以及小胶质细胞总分支长度(图6A-图6C)。这些形态学特征表明GF动物中小胶质细胞成熟停滞和/或活化状态降低，证实了肠细菌影响脑中免疫细胞的最新报道。
将这些观察结果扩展到疾病模型，相比GF-ASO小鼠，来自SPF-ASO小鼠的小胶质细胞显示出细胞体直径显著增加并具有较短长度的较少突起(图6A-图6C)。相比GF-ASO小鼠，来自SPF-ASO小鼠的CP和下中脑的组织匀浆物包含明显增加的促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)(图6D和图6E)。两种细胞因子在PD患者脑中都升高。来自富集的CD11b+细胞(主要是小胶质细胞)的RNA的基因表达分析揭示出在SPF-ASO动物中Tnfα和Il6表达增加，而这在GF动物中几乎不存在(图6F)。如在例如Erny等，2015；Matcovitch-Natan等，2016中描述的先前研究中观察到的，神经保护性Bdnf和细胞周期标志物Ddit4水平在GF动物中上调(图5I)。神经炎性应答是区域特异性的，FC中的小胶质细胞直径和TNF-α产生增加，而CB中不增加(图6G和图6H)。
总之，这些发现支持这一假设：肠微生物促进参与疾病的特定脑区域中的小胶质细胞的αSyn依赖性活化。
实施例4
出生后的微生物信号调节αSyn依赖性病理生理
该实施例证明出生后的微生物信号调控αSyn依赖性病理生理。
微生物群在妊娠期间以及在成体中经由活性肠-至-脑信号影响神经学结果。为了区分这些机制，用抗生素混合物处理SPF动物以在出生后耗尽微生物群(图7A)。相反地，用来自SPF-WT动物的复合微生物群定殖5-6周龄的GF小鼠组(图7A)。值得注意的是，抗生素处理(Abx)的动物显示出极少的αSyn依赖性运动功能障碍，非常类似于GF条件下出生的小鼠(图7B-图7E)。先前GF动物的出生后定殖(Ex-GF)重述了在SPF小鼠中观察到的基因型效应，过表达αSyn的小鼠显示出显著的运动功能障碍(图7B-图7E)。
GI功能(如通过粪便输出所测量的)在Abx处理的动物中也显著改善，而Ex-GF小鼠在总粪便输出方面表现出αSyn依赖性降低(图7F和图7G)。此外，在转基因ASO系中，来自Ex-GF动物的小胶质细胞的细胞体直径增加，堪比SPF小鼠中的情况(图7H和图7I)。然而Abx-ASO动物带有直径与GF动物类似的小胶质细胞(图7H和图7I)。
总之，这些数据表明，尽管没有排除出生前神经发育期间小胶质细胞的作用，成年期小胶质细胞活化的调制有助于αSyn介导的运动功能障碍和神经炎症，表明由微生物群进行的活性肠-脑信号。
实施例5
SCFA足以促进αSyn介导的神经炎症
该实施例表明SCFA足以促进αSyn介导的神经炎症。
肠细菌可以通过产生微生物代谢物(即短链脂肪酸，SCFA)在病毒感染期间调节小胶质细胞活化。如图8A所示，相比SPF小鼠，在GF和Abx处理的动物中观察到较低的粪便SCFA浓度。为了观察SCFA是否影响PD小鼠模型中的神经免疫应答，用SCFA乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐的混合物处理GF-ASO和GF-WT动物(同时，动物保持微生物学上无菌)并显著恢复粪便SCFA浓度(图8A)。在受影响的脑区域(即CP和SN)内，相比未处理的小鼠，给予SCFA的动物中的小胶质细胞显示出指示活化提高的形态，类似于来自Ex-GF和SPF小鼠的细胞(图9A、图9B、图8B和图8C；还参见图6A-图6H和图7A-图7I)。相比用SCFA处理的GF-WT动物(SCFA-WT)，来自喂食SCFA的GF-ASO小鼠(SCFA-ASO)的小胶质细胞的直径显著更大，并伴随分支长度和总数量减少。然而，Abx处理的动物显示出类似于GF动物的小胶质细胞形态(图9B、图8B和图8C；还参见图6A-图6H和图7A-图7I)。在FC中也观察到小胶质细胞直径改变，但在CB中未观察到，表明这是区域特异性应答(图8D和图8E)。
对应于小胶质细胞形态，相比未处理的和Abx处理的小鼠，αSyn在给予SCFA的小鼠中聚集，类似于Ex-GF动物(图8F-图8I)。引人注目的是，观察到由微生物而来的出生后信号在CP和SN中诱导αSyn聚集增加(图8F和图8G)，而在FC和CB中没有可观察到的差异(图8H和图8I)，这由定量和蛋白印迹确认(图8J-图8O)。无论单独的SCFA还是混合物形式的SCFA在一定浓度范围内在体外均不促进人αSyn的聚集(图10A-图10G)，也不改变αSyn淀粉样原纤维的总体结构(图10H和图10I)。
总之，这些数据表明，虽然独立于直接分子相互作用，SCFA促进体内αSyn聚集。
实施例6
SCFA足以促进运动缺陷
该实施例证明SCFA促进αSyn刺激的小胶质细胞活化和运动功能障碍。
为了探索Thy1-αSyn模型中微生物代谢物和运动症状之间的联系，在5-6周龄开始用SCFA混合物处理GF动物，并在12-13周龄评估运动功能。相比未处理的GF-ASO动物，SCFA-ASO小鼠在几项运动任务中表现出显著受损的性能(图9C-图9F)，包括梁跨越、沿杆下降和后肢反射方面受损(将GF-ASO小鼠与SCFA-ASO小鼠进行比较)。由SCFA带来的所有效果对于Thy1-αSyn小鼠而言都是基因型特异性的。在SCFA处理的转基因动物中也观察到GI缺陷(图9G和图9H)。用热灭活细菌口服处理GF动物不会诱发运动缺陷(图10J-图10M)，表明细菌需要具有代谢活性。此外，用抗炎化合物米诺环素口服处理SCFA喂养的动物足以降低TNF-α产生、降低αSyn聚集并提高运动功能，而不改变转基因表达(图11A-图11H)。
总之，这些数据表明微生物群主动产生代谢物(如SCFA)，这是小胶质细胞活化和αSyn聚集所需的，在PD临床前模型中有助于运动功能障碍。
实施例7
PD微生物组的失调
该实施例表明PD微生物组的失调。
已发现PD患者显示出改变的微生物组。在该实施例中，收集来自诊断为PD的6个人类受试者以及6个匹配的健康对照的粪便样品(表2)，以确定当转移到GF小鼠中时人肠微生物是否影响疾病结果。为了限制混杂(confounding)影响，除相关纳入和排除标准外，只选择了具有健康肠组织学的新发作的未经治疗(treatment-naive)的PD患者(表2)。
表2.人类供体(PD和健康对照)的人口统计学特征(与图12A-图12E和图14A-图14G相关)。每个PD和健康供体对的粪便供体的人口统计学数据。UPDRS＝统一的帕金森氏病评定量表；HY阶段＝Hoehn和Yahr量表；BMI＝体重指数。
将来自PD患者或对照的粪便微生物群通过口服强饲法移植到GF受体动物的各个组中。从“人源化”小鼠收集粪球，提取细菌DNA，并进行16S rRNA测序。使用针对Greengenes数据库的封闭参考选择将序列注释为操作分类单元(OTU)，并通过PICRUSt预测宏基因组功能。在基于PCoA的未加权UniFrac(Lozupone和Knight，2005)中受体动物组最类似于它们各自的人类供体的谱(图12A和图12B)。引人注目的是，供体的疾病状态对受体小鼠内的微生物群落具有强烈影响。相比由健康供体移植而来的群落，由PD供体而来的人源化小鼠组彼此更为显著相似，这种趋势在通过遗传背景分层时仍持续(图12C和图12D)。此外，相比野生型(WT)受体，ASO背景中的健康和PD供体之间存在显著差异，表明基因型对微生物群落构造的影响(图12C和图12D)。
鉴定了相比健康对照而言在用源自PD供体的微生物群定殖的动物中发生改变的若干属(图12E)以及由Bray-Curtis距离所指示的这些组之间改变的KEGG通路(图13A-图13C)。在具有PD微生物组的小鼠中丰度增加的OTU包括变形杆菌属、嗜胆菌属和罗斯氏菌属，伴随着毛螺菌科、理研菌科和消化链球菌科以及丁酸梭菌属家族成员的丧失(图13E)。有趣的是，某些分类单元仅在ASO动物中改变(例如变形杆菌属、嗜胆菌属和毛螺菌科)，而其它显示出独立于小鼠基因型的显著变化(例如罗斯氏菌属、理研菌科和肠球菌属)(图13E)。有趣的是，三种产SCFA的KEGG家族(K00929，丁酸激酶；以及K01034和K01035，乙酸CoA/乙酰乙酸CoA转移酶α和β)的丰度在接受来自PD供体的粪便微生物的小鼠中增加(图13D)。此外，相比用来自健康对照的微生物定殖的动物，接受源自PD供体的微生物群的动物显示出显著改变的SCFA谱，具有较低浓度的乙酸盐以及较高相对丰度的丙酸盐和丁酸盐(图13E)。
总之，这些数据表明，PD患者和对照之间的粪便微生物群落中的差异在转移到小鼠中后可以保持。此外，αSyn过表达在移植后引起肠微生物组特征的明显改变。
实施例8
源自PD的肠微生物群促进运动功能障碍
该实施例证明源自PD的肠微生物群促进运动功能障碍。
为了评估微生物群功能，对由各供体对而来的人源化动物组的运动功能进行测试。6对中的4对(对#1、3、4和5)之间具有一致性，来自患有PD的个体的微生物群促进提高的αSyn介导的运动功能障碍(图14A-图14F)。相比带有来自健康对照的肠细菌的基因型匹配的受体小鼠，用PD微生物群定殖的ASO动物中的梁跨越、沿杆下降和鼻粘合剂去除显著受损。另一方面，后肢反射得分在各供体之间通常没有差异。有趣的是，来自一对样品的微生物群不诱导梁跨越和沿杆下降任务中的显著基因型效应(对#2，图14B)，反映了需要通过有力的定群研究来解决群体中的潜在异质性。未观察到用来自任一供体组的微生物群定殖的WT受体动物在运动功能方面的明显效应(图14A-图14F)。临床前小鼠模型中的该发现表明PD微生物群在遗传易感宿主中有助于疾病症状。此外，如通过粪便输出所测量的，受体动物在体重和GI功能方面几乎未表现出改变(图15A-图15F)。来自所有组的性能数据的编译揭示了在本研究所使用的4种测试的3种之中，相比来自健康对照的微生物，来自PD患者的微生物群在ASO动物中诱导增加的运动损伤(图14G)。实际上，通过PCoA描绘的所有运动功能显示了用来自PD供体的微生物群定殖的动物之间相比用源自健康个体的肠细菌定殖的动物而言醒目的全局差异(图15G)。
总之，这些数据(相比健康对照，来自PD患者的肠细菌提高小鼠模型中的运动缺陷)提供了微生物群对突触核蛋白病的功能贡献的证据。
如本文所述的，肠微生物群影响神经发育、调节行为并促进神经病症。不受任何特定理论的束缚，认为肠细菌和神经退行性疾病之间存在的功能联系仍有待探索。突触核蛋白病的特征在于蛋白α-突触核蛋白(αSyn)的聚集，其通常导致运动功能障碍，例如帕金森氏病(PD)。如实施例1-实施例8中所示的，使用过表达αSyn的小鼠，发现肠微生物群是运动缺陷、小胶质细胞活化和αSyn病理所需的。抗生素治疗减轻成年动物的病理生理，而微生物再定殖促进成年动物的病理生理，表明肠和脑之间的出生后信号对疾病进行调节。向无菌小鼠口服给予特定微生物代谢物促进神经炎症和运动症状。此外，相比来自健康人类供体的微生物群移植物，用来自受PD影响的患者的微生物群定殖过表达αSyn的小鼠增强身体损伤。这些发现表明，肠细菌调节小鼠的运动障碍，而人类微生物组中的改变代表PD的风险因素。
实施例9
帕金森氏病(PD)的治疗
该实施例说明对患有PD的患者进行的治疗。
确定受试者中α-Syn的聚集速度或α-Syn的聚集水平(例如α-Syn聚集体的量)或这两者。受试者中α-Syn的异常聚集速度或α-Syn的异常聚集水平(例如α-Syn聚集体的量)或这两者表示受试者患有PD。在受试者中调整肠微生物群的组成。预期在受试者中调整肠微生物群的组成将在受试者中缓解PD的一种或多种症状，如改善一种或多种运动缺陷。
在至少一些先前描述的实施方式中，一个实施方式中使用的一个或多个元件可以互换地用于另一个实施方式中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其它省略、添加和修改。所有这些修改和变化都旨在落入由所附权利要求限定的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以在适合于上下文和/或应用的情况下从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数排列。
本领域技术人员将理解，通常，本文中使用的术语、特别是所附权利要求(例如所附权利要求的正文)中使用的术语通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”；术语“具有”应解释为“至少具有”；术语“包含”应解释为“包含但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图详述特定数量的介绍性权利要求引述(introduced claim recitation)，这种意图将在该权利要求中明确引述，而缺乏这种引述时就不存在这种意图。例如，为了帮助理解，所附权利要求可以包含使用介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”以介绍权利要求引述。然而，这些短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词“一”或“一个”介绍的权利要求引述将包含这种介绍性权利要求引述的任何特定权利要求限制于仅包含一个这样的引述的实施方式，即使当相同的权利要求包含介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”以及诸如“一”或“一个”的不定冠词(例如，“一”和/或“一个”应被解释为表示“至少一个”或“一个或多个”)；对于使用用于介绍权利要求引述的定冠词的情况也是如此。另外，即使明确引述了特定数量的介绍性权利要求引述，本领域技术人员将认识到，这种引述应被解释为至少表示所引述的数字(例如，仅有“两个引述”而没有其它修饰语的引述表示至少两个引述或两个以上引述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常，这样的结构意图在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A的系统、仅具有B的系统、仅具有C的系统、A和B一起的系统、A和C一起的系统、B和C一起的系统和/或A、B和C一起的系统等)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯例的情况下，通常，这样的结构意图在本领域技术人员将理解该惯例的意义上(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A的系统、仅具有B的系统、仅具有C的系统、A和B一起的系统、A和C一起的系统、B和C一起的系统和/或A、B和C一起的系统等)。本领域技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求或附图中，实际上任何呈现两个或更多个供选择的术语的转折词和/或短语都应被理解为考虑包括这些术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，在本公开的特征或方面以马库什组的方式来进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此以马库什组的任何单独成员或成员亚组的方式来进行描述。
如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，如以提供书面描述的方式，本文公开的所有范围还包括该范围的任何及所有可能的子范围以及子范围的组合。任何列出的范围都可以被容易地认为是充分描述了被分成相等的至少两等分、三等分、四等分、五等分、十等分等的相同范围并使得被分成相等的至少两等分、三等分、四等分、五等分、十等分等的相同范围能够有效。作为非限制性实例，本文讨论的各范围可以被容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有语言包括所引述的数字并且涉及随后可以如上面所讨论地分成子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等。
尽管本文已经公开了各种方面和实施方式，其它方面和实施方式对于本领域技术人员将是显而易见的。本文公开的各种方面和实施方式是出于说明目的而不是限制性的，真正的范围和精神由所附权利要求指示。

Claims (80)

1.一种用于在受试者中治疗突触核蛋白病的方法，所述方法包括在有需要的受试者中调整肠微生物群的组成，其中，所述受试者患有突触核蛋白病。
2.一种用于在受试者中延迟或降低突触核蛋白病发作可能性的方法，所述方法包括在有需要的受试者中调整肠微生物群的组成，其中，所述受试者具有发展为突触核蛋白病的风险。
3.一种用于在受试者中改善运动缺陷的方法，所述方法包括在需要改善运动缺陷的受试者中调整肠微生物群的组成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法包括鉴定有需要的受试者，其中，所述有需要的受试者具有异常水平的α-突触核蛋白(αSyn)聚集。
5.如权利要求4所述的方法，其中，鉴定所述有需要的受试者包括测量所述受试者中αSyn聚集的速度和/或水平、测量所述受试者中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。
6.如权利要求5所述的方法，其中，测量所述受试者脑中αSyn聚集的速度和/或水平、测量所述受试者脑中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述受试者中调整肠微生物群的组成后测量所述受试者中αSyn聚集的速度和/或水平、测量所述受试者中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法改善所述受试者中的一种或多种身体损伤。
9.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法改善所述受试者的一种或多种GI功能。
10.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述方法减轻所述受试者的便秘。
11.如权利要求3-10中任一项所述的方法，其中，所述运动缺陷是震颤、肌肉僵硬、运动迟缓、步态受损或它们的任何组合。
12.一种用于在有需要的受试者中减少小胶质细胞活化的方法，所述方法包括在所述受试者中调整肠微生物群的组成。
13.一种用于在需要的受试者中减少α-突触核蛋白(αSyn)聚集体的方法，所述方法包括在所述受试者中调整肠微生物群的组成。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述方法促进不溶性αSyn蛋白聚集体的清除、减少αSyn蛋白的聚集，或这两者。
15.如权利要求13所述的方法，所述方法包括测量所述受试者中αSyn聚集的速度和/或水平、测量所述受试者中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。
16.如权利要求13所述的方法，其中，测量所述受试者脑中αSyn聚集的速度和/或水平、所述受试者脑中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。
17.如权利要求13-16中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述受试者中调整肠微生物群的组成后测量所述受试者中αSyn聚集的速度和/或水平、测量所述受试者中不溶性αSyn蛋白聚集体的清除速度和/或水平，或它们的组合。
18.一种用于在有需要的受试者中减少神经炎症的方法，所述方法包括在所述受试者中调整肠微生物群的组成。
19.如权利要求3-18中任一项所述的方法，其中，所述有需要的受试者是患有突触核蛋白病的受试者。
20.如权利要求1、2和19中任一项所述的方法，其中，所述突触核蛋白病是帕金森氏病、伴路易体病的痴呆、多系统萎缩或它们的任何组合。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述突触核蛋白病是帕金森氏病。
22.如权利要求20所述的方法，其中，所述突触核蛋白病是原发性或特发性帕金森症、继发性或获得性帕金森症、遗传性帕金森症、帕金森叠加综合征或多系统变性，或它们的任何组合。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中，所述受试者中肠微生物群的组成恢复至正常水平。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括向所述受试者给予一种或多种抗生素。
25.如权利要求24所述的方法，所述一种或多种抗生素包括氨苄青霉素、万古霉素、新霉素、庆大霉素、红霉素或它们的任何组合。
26.如权利要求24所述的方法，所述一种或多种抗生素不包括利福平和/或米诺环素。
27.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括向所述受试者给予一种或多种PD增强性微生物代谢物的抑制剂。
28.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括向所述受试者给予针对一种或多种PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、或针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的底物的抗体。
29.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括向所述受试者给予参与体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的酶的抑制剂。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中，所述一种或多种PD增强性微生物代谢物包括一种或多种脂肪酸、其盐或酯，或它们的任何组合。
31.如权利要求28或29所述的方法，其中，所述一种或多种PD增强性微生物代谢物包括一种或多种短链脂肪酸(SCFA)、其盐或酯，或它们的任何组合。
32.如权利要求28或29所述的方法，其中，所述一种或多种PD增强性微生物代谢物包括一种或多种中链脂肪酸、一种或多种长链脂肪酸、中链脂肪酸的盐或酯、长链脂肪酸的盐或酯，或它们的任何组合。
33.如权利要求28或29所述的方法，其中，所述一种或多种PD增强性微生物代谢物包括SCFA乙酸盐、SCFA丙酸盐、SCFA丁酸盐，或它们的任何组合。
34.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括增强所述受试者中一种或多种PD防护性细菌种类的水平。
35.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括向所述受试者给予包含一种或多种PD防护性细菌种类的组合物。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述一种或多种PD防护性细菌种类中的至少一种属于毛螺菌科(Lachnospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、肠球菌属(Enterococcus)、梭菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)或丁酸梭菌属(Butyricicoccus sp.)家族。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中，所述组合物是益生菌组合物、营养医学组合物、药物组合物或它们的任何组合。
38.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括粪便移植、微生物群常规化、微生物定殖、肠微生物群重建、益生菌处理或它们的组合。
39.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括降低所述受试者中一种或多种PD增强性细菌种类的水平。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述一种或多种PD增强性细菌种类中的至少一种属于变形杆菌属(Proteus sp.)、嗜胆菌属(Bilophila sp.)、罗斯氏菌属(Roseburiasp.)、Pseudoramibacter Eubacterium或韦荣球菌科(Veillonellaceae family)。
41.如权利要求39所述的方法，其中，所述一种或多种PD增强性细菌种类中的至少一种是产SCFA细菌。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述产SCFA细菌属于KEGG家族K00929、K01034或K01035。
43.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中，在所述受试者中调整肠微生物群的组成包括将来自健康受试者的肠微生物群引入待治疗的受试者。
44.一种用于在受试者中治疗突触核蛋白病的方法，所述方法包括以下中的一种或多种：
向所述受试者给予抗生素；以及
向所述受试者给予PD增强性微生物代谢物的抑制剂。
45.一种用于在受试者中延迟或降低突触核蛋白病发作可能性的方法，所述方法包括以下中的一种或多种：
向所述受试者给予抗生素；以及
向所述受试者给予PD增强性微生物代谢物的抑制剂。
46.如权利要求44或45的方法，其中，所述抗生素不是利福平或米诺环素。
47.如权利要求44或45所述的方法，其中，所述突触核蛋白病是帕金森氏病、伴路易体病的痴呆、多系统萎缩或它们的任何组合。
48.一种在有需要的受试者中改善帕金森症症状的方法，所述方法包括以下中的一种或多种：
向所述受试者给予抗生素；
向所述受试者给予抗炎剂；以及
向所述受试者给予一种或多种PD增强性微生物代谢物的抑制剂。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述抗炎剂和所述抗生素不是米诺环素。
50.如权利要求48或49所述的方法，其中，所述帕金森症症状包括运动功能受损、α-突触核蛋白(αSyn)聚集增强、小胶质细胞活化异常或它们的任何组合。
51.如权利要求48或49所述的方法，其中，所述帕金森症症状包括震颤、运动迟缓、肌肉僵硬、姿态和平衡受损、自发运动丧失、语言障碍、书写障碍或它们的任何组合。
52.如权利要求44-51中任一项所述的方法，其中，所述PD增强性微生物代谢物的抑制剂是针对一种或多种PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、针对用于体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的底物的抗体、参与体内合成一种或多种PD增强性微生物代谢物的酶的抑制剂，或它们的组合。
53.如权利要求1-23和27-52中任一项所述的方法，其中，所述受试者或所述有需要的受试者未接受抗生素治疗。
54.如权利要求1-23和27-52中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括向所述受试者或所述有需要的受试者给予任何抗生素。
55.如权利要求1-23和27-52中任一项所述的方法，其中，所述受试者或所述有需要的受试者未用利福平和/或米诺环素治疗。
56.如权利要求1-23和27-52中任一项所述的方法，其中，所述受试者或所述有需要的受试者在调整肠微生物群的组成或其它治疗之前至少12小时、1天、5天、10天或20天未接受任何抗生素治疗。
57.如权利要求1-23和27-52中任一项所述的方法，其中，所述受试者或所述有需要的受试者在调整肠微生物群的组成或其它治疗之后至少12小时、1天、5天、10天或20天不接受任何抗生素治疗。
58.如权利要求1-57中任一项所述的方法，所述方法还包括：
确定所述受试者中一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平，以鉴定有需要的受试者。
59.一种在受试者中诊断帕金森症的方法，所述方法包括：
确定所述受试者中一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平，由此所述一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或异常水平表明所述受试者具有发展为帕金森症症状的风险或患有帕金森症症状。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述一种或多种PD相关细菌种类中的至少一种属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、Pseudoramibacter Eubacterium或韦荣球菌科。
61.如权利要求59或60所述的方法，其中，确定所述受试者肠中所述一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或水平。
62.如权利要求59-61中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或异常水平表明所述受试者具有发展为帕金森症的风险。
63.如权利要求59-61中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种PD相关细菌种类的存在和/或异常水平表明所述受试者患有帕金森症。
64.如权利要求59-63中任一项所述的方法，其中，所述帕金森症是原发性或特发性帕金森症、继发性或获得性帕金森症、遗传性帕金森症、帕金森叠加综合征或多系统变性，或它们的任何组合。
65.如权利要求64所述的方法，其中，所述帕金森症是帕金森氏病。
66.如权利要求1-65中任一项所述的方法，其中，所述受试者是成人。
67.包含一种或多种PD防护性细菌种类的组合物。
68.如权利要求67所述的组合物，其中，所述一种或多种PD防护性细菌种类中的至少一种属于毛螺菌科、理研菌科、消化链球菌科、梭菌科、肠球菌属、梭菌属、拟杆菌属或丁酸梭菌属家族。
69.如权利要求67或68所述的组合物，其中，所述组合物不包含PD增强性细菌种类。
70.如权利要求67或68所述的组合物，其中，所述组合物不包含属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、Pseudoramibacter Eubacterium和韦荣球菌科中的至少一种的细菌种类。
71.如权利要求67或68所述的组合物，其中，所述组合物不包含属于变形杆菌属、嗜胆菌属、罗斯氏菌属、Pseudoramibacter Eubacterium和韦荣球菌科的细菌种类。
72.如权利要求67-71中任一项所述的组合物，其中，所述组合物不包含致病性梭菌属细菌。
73.如权利要求67-72中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种PD防护性细菌种类中的至少一种是活细菌。
74.如权利要求67-72中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种PD防护性细菌种类是活细菌。
75.如权利要求67-71中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是益生菌组合物、营养医学组合物、药物组合物或它们的任何组合。
76.如权利要求67-71中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是包含一种或多种药学上可接受的载体的药物组合物。
77.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
PD增强性微生物代谢物的抑制剂；以及
一种或多种药学上可接受的载体。
78.如权利要求77所述的药物组合物，其中，所述PD增强性微生物代谢物是脂肪酸或其盐或酯。
79.如权利要求77所述的药物组合物，其中，所述PD增强性微生物代谢物是短链脂肪酸(SCFA)、中链脂肪酸、长链脂肪酸、短链脂肪酸的盐或酯、中链脂肪酸的盐或酯、或长链脂肪酸的盐或酯。
80.如权利要求77-79中任一项所述的药物组合物，其中，所述抑制剂是针对PD增强性微生物代谢物的抗体、针对用于体内合成PD增强性微生物代谢物的中间体的抗体、针对用于体内合成PD增强性微生物代谢物的底物的抗体、参与体内合成PD增强性微生物代谢物的酶的抑制剂，或它们的组合。
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