KR20220016481A - 패혈증 및 괴사성 장염 유도된 신경발달 결핍의 예방을 위한 프리바이오틱 제형 - Google Patents

패혈증 및 괴사성 장염 유도된 신경발달 결핍의 예방을 위한 프리바이오틱 제형 Download PDF

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게일 이. 베스너
마이클 베일리
스티븐 굿맨
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Abstract

본원에는 조성물을 사용하여 그것을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 신경 발달 결핍을 치료하거나 예방하기 위한 방법 및 프로바이오틱 조성물이 제공된다.

Description

패혈증 및 괴사성 장염 유도된 신경발달 결핍의 예방을 위한 프리바이오틱 제형
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 6월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 62/856,704호에 대한 35 U.S.C. § 119(e)에 의한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 본 개시에 참조로 포함된다.
정부 지원의 기재
본 발명은 미국 국립 일반 의학 연구소 (NIH/NIGMS)에 의해 부여된 승인 번호 1RO1GM123482091 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 가진다.
서열 목록
본 발명은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. 상기 ASCII 사본은 2020년 6월 3일에 생성되었고 본원에 첨부된다.
기술분야
본 개시는 유아, 신생아 및 태아 환자에서 질환 및 신경 발달 결핍을 치료 또는 예방하기 위한 신규한 프로바이오틱 제형 및 그것의 사용 방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 충분히 대량으로 섭취되었을 때 숙주에 건강상의 유익을 부여하는 살아있는 미생물이고 (Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization, "Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powdered Milk with Live Bacteria" (2001)), 장 질환을 치료하기 위한 실행 가능한 옵션으로서 주목받고 있다 (Hemarajata and Versalovic, (2013) Effects of Probiotics on Gut Microbiota: Mechanisms of Intestinal Immunomodulation and Neuromodulation, Therap Adv Gastroenterol, 6:39-51).
적절한 조건 하에서, 많은 프로바이오틱스가 직접적인 메커니즘 (예컨대, 항미생물 방어의 생성) 또는 간접적인 메커니즘 (예컨대, 숙주 방어의 자극)으로 인해 병원체 군집화를 효과적으로 방지할 수 있다. 소수의 프로바이오틱 종만이 병원체 군집화를 방지하고 과도한 염증 반응을 제한할 수 있다. 그러나, 이것은 결장 감염에 대한 반응으로 과도한 결장 염증이 장기간의 질병, 예컨대 감염후 과민성 장 증후군의 발생으로 이어질 수 있기 때문에 중요하다. 그러므로, 결장 병원체에 대한 과도한 면역 반응을 방지할 수 있는 한편, 여전히 항-박테리아 면역(anti-bacterial immunity)을 유지하는 프로바이오틱스의 발생이 장내 감염의 단기간 및 장기간 건강 효과를 둘 다 예방하는 능력을 가질 것이다. 본 개시는 이러한 충족되지 못한 필요성을 해결하고 또한 관련된 장점을 제공하는 제형을 제공한다.
본 기술의 측면 및 구체예들은 프로바이오틱 박테리아의 건강상의 유익을 프리바이오틱 물질과 조합하여, 프로바이오틱 종의 배타적인 성장을 자극하는 것을 돕고, 한 측면으로, 생체부합성 마이크로스피어 상에 생물막의 형태로 박테리아를 제공한다. 출원인은 마이크로스피어의 표면 상에서 및/또는 내부에서 생물막의 사용이, 한 측면으로, 다양한 요인에 의해 유발된 패혈증으로부터 유발된 신경발달 결핍을 감소시키기 위한 치료 반응의 향상된 효능 및 기간을 제공하는 것을 발견하였다. 프로바이오틱 생물막은 박테리아를 상처 부위에 도입하기 위한 수단으로서 표면 상에서 성장할 수 있고, 그곳에서 상처를 치료하기 위한 천연 젤라틴인 하이드로콜로이드를 기반으로 한 플라스터 또는 드레싱을 포함한 제형이 있는 것으로 나타났다 (즉, EP2450062). 그러나, 더 적은 프로바이오틱 용량 및 프로바이오틱 박테리아의 더 큰 효능 및 그것의 적절한 제형에 대한 충족되지 않은 필요성이 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 이런 충족되지 않은 필요성을 해결하기 위해 제공되고, 출원인이 알고 있기로, 지금까지 개시되지 않았던 것이다.
한 측면으로, 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는, 대상체에서 신경발달 결핍을 예방, 지연 또는 치료하거나 또는 신경 발달을 촉진하는 방법이 제공되며, 조성물은 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지고, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움에 대한 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 대상체는 NEC 또는 뇌에 유사한 영향을 나타내는 다른 병리 또는 상태, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있거나, 취약하거나, 또는 앓은 적이 있다.
또 다른 측면으로, 대상체에서 미세아교세포 활성화를 예방, 감소, 또는 지연시키는 방법이 제공되며, 방법은 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지고, 조성물은 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움에 대한 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 대상체는 NEC 또는 뇌에 유사한 영향을 나타내는 다른 병리 또는 상태, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있거나, 취약하거나, 또는 앓은 적이 있다.
또 다른 측면으로, 대상체에서 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)의 발현을 증가시키는 방법이 제공되며, 방법은 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지고, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움에 대한 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 대상체는 NEC 또는 뇌에 유사한 영향을 나타내는 다른 병리 또는 상태, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있거나, 취약하거나, 또는 앓은 적이 있다.
상기 방법의 측면들에서, 대상체는 유아, 신생아 또는 태아, 예컨대, 포유류 또는 인간 대상체이다.
일부 구체예에서, 패혈증 유발 상태는 괴사성 장염 (NEC) 또는 뇌 또는 신경 발달에 유사한 영향을 미치는 다른 병리 또는 상태를 포함한다.
이 용어는 또한 작용 부위에서 프로바이오틱 스트레인을 도입하는 효율 및 내구성을 향상시키는, 제형 방법을 제공한다. 그것은 구체적으로 생물막 형성의 속도 한정 단계를 우회한다. 이 용어는 위장관 건강 및 프로바이오틱 박테리아가 확립될 필요가 있는 임의의 측면, 예컨대, 위장관에 유용하다.
특히 위장 건강 및 일반적인 환경의 맥락에서, 프로바이오틱스는 장내 미생물총(microbiota)을 보호하고 건강한 상태로 복원시키는 자연적인 방법이다. 유감스럽게도, 최적의 조건 하에서도, 프로바이오틱 박테리아 (전형적으로 전달된)는 확립되거나, 충분히 지속적이지 못하여서, 그들의 건강에 미치는 영향의 규모 및 기간을 최소화시킨다. 속도 제한 단계 중 하나는 지속적인 생물막을 형성하는 도입된 박테리아의 능력이다. 박테리아가 플랑크톤 (자유로운 생활)과 반대로 이미 생물막 형태 (표면 부착된 군집체)로 있을 때, 그것들은 보다 쉽게 확립되고 지속된다. 프로바이오틱 박테리아의 긍정적 효과는 그것을 생물막 상태로 제공함으로써 향상될 수 있다; 이것은 박테리아를 생체 적합성 및 무독성 마이크로스피어의 표면 상에서 성장시키고 마이크로스피어의 표면 상의 생물막과 연관지음으로써 쉽게 확립될 수 있다. 생체 적합성 마이크로스피어는 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 금속, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 이 표면이 마이크로스피어의 형태로 있을 때, 프리바이오틱 및/또는 전생물막 물질은 프로바이오틱 박테리아 생물막의 확립 및 유지를 용이하게 하기 위한 운반물(cargo)로서 첨가될 수 있다.
한 측면으로, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움은 투여 전 또는 후에 생체 적합성 마이크로스피어의 표면에 부착되어 생물막을 생성한다. 또 다른 측면으로, 박테리움은 마이크로스피어의 코어 안에 로딩된 후 마이크로스피어의 코어로부터 표면으로 확산된다. 생체 적합성 마이크로스피어는 반-투과성이거나 다공성이며, 고체 또는 중공 코어를 가진다. 생체 적합성 마이크로스피어는 운반물로서 프로바이오틱 박테리움을 위한 프리바이오틱 및 임의의 영양 보충물을 운반할 수 있는 중공 코어를 가질 수 있음으로써 박테리움이 루멘으로부터 코어로의 확산을 통해 접근할 수 있다. 마이크로스피어 자체는 또한 프로바이오틱 박테리움에 필요한 프리바이오틱 및 임의의 영양 보충물을 함유할 수 있다. 마이크로스피어는 또한 한 측면으로 조성물 중의 건강-유도 박테리움과 경쟁할 수 있는, 병원체에 대해 선택적인 약물, 또는 화합물, 또는 작용제를 운반할 수 있다. 추가의 측면으로, 마이크로스피어는 화학적 환원물질 및/또는 (마이크로스피어의 코어에서 또는 표면에서) 흡착을 촉진하는 분자 및 또는 표면 및/또는 (마이크로스피어의 코어에서 또는 표면에서) 흡수를 촉진하는 분자 및/또는 표면을 운반할 수 있다. 생체 적합성 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 및 프리바이오틱 외에, 신규한 프로바이오틱 제형은 또한 생물막 형성 및/또는 내구성을 지지하는 물질인 전생물막(prebiofilmic)을 함유할 수 있고, 한 측면으로, 전생물막은 생물막 형성 및/또는 내구성을 지지하는 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그것들의 단편이다. 프리바이오틱은 중공 코어로부터 방출되어 박테리움에 부착된다. 이것은 마이크로스피어의 표면이 다공성이거나 반투과성이고, 프리바이오틱이 확산에 의해 방출되거나 또는 마이크로스피어가 서서히 분해되어 누출 및 다시 마이크로스피어로부터의 확산을 유발하기 때문에 일어난다. 중공 코어로부터 프리바이오틱의 방출은 마이크로스피어 크기를 다르게 함으로써 (더 작은 마이크로스피어가 더 빨리 방출됨), 및/또는 프리바이오틱의 점도를 변경시킴으로써 (즉, 점도가 높을수록 방출은 더 느려짐) 조절될 수 있다.
마이크로스피어는 프로바이오틱 박테리아 확립 및 생존을 촉진하는 것을 돕는 한편 병원성 박테리아 문제를 제한하는 확산성 프리바이오틱 (프로바이오틱 박테리아에 특이적인/독점적인 영양 보충물)을 이상적으로 제공하는 데 가치를 부가하였다. 적어도 프로바이오틱 박테리움 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)의 경우에, 생물막 상태는 플랑크톤 형태의 동일 박테리아보다 장에서 확립하는 데 유리하다. 나아가, 마우스에 생물막으로서 도입된 락토바실러스 루테리는 장내 병원성 박테리움인 시트로박터 로덴티움(Citrobacter rodentium)의 병인에 대해 플랑크톤 형태의 락토바실러스 루테리보다 더 활발하고 내구적인 예방 효과를 가지는 것으로 나타났다. 이들 결과를 토대로, 환자 순응성에 대한 필요성이 훨씬 감소된, 장내 병인을 예방 또는 심지어 치료하는, 장내 미생물 불균형(dysbiosis)에 대한 보다 크고 보다 많은 지속 효과를 제공하는 프로바이오틱스의 신규한 제형을 생산하는 고도로 통합된 예가 제공된다.
상기 장점의 관점에서, 본원에는 생체 적합성 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 조성물이 제공되며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 조성물은 담체, 예컨대 제약학적으로 허용되는 담체 또는 생체 적합성 스캐폴드를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 조성물은 생체내 또는 생체외 용도를 위해 제형화된다. 생체내 용도에 대해, 조성물은 장으로, 경구로, 비경구로, 질로, 코로 (흡입), 정맥내로 또는 근육내로 (주사 가능함), 국소적으로, 좌제로서, 스프레이로서 (에어로졸 투여), 토양에서의 혼합에 의한 건식 적용으로, 용질로서 (수성 환경과의 혼합믈 위해) 투여하기 위해 제형화된다. 한 측면으로, 그것들은 투여 형태로 제형화된다. 적합한 투여 형태로는, 한정하는 것은 아니지만, 장용 제형, 비경구용 제형, 좌제, 분말, 액체, 캡슐, 씹을 수 있는 정제, 삼킬 수 있는 정제, 협측 정제(buccal tablet), 트로키, 당의정, 연질 씹는 사탕, 용액, 현탁액, 스프레이, 팅크제, 탕약, 주입제, 및 이것들의 조합을 들 수 있다.
본 개시는 또한 상기 주지된 조성물의 제조 방법을 제공하며, 방법은 생체 적합성 마이크로스피어를 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움, 프리바이오틱과 혼합하는 단계, 및 한 측면으로 추가로 전생물막과 혼합하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 추가의 측면으로, 방법은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물, 병원체 또는 무척추동물에 대해 활성인 약물, 또는 화학적 환원물질 및/또는 (마이크로스피어의 코어에서 또는 표면에서) 흡착을 촉진하는 분자 및/또는 (마이크로스피어의 코어에서 또는 표면에서) 흡수를 촉진하는 분자 중 하나 이상의 유효량과 혼합하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 조성물의 치료적 용도를 제공한다.
한 측면으로, 괴사성 장염 (NEC) 또는 뇌에 유사한 영향을 미치는 다른 병리 또는 상태를 앓고 있거나, 취약하거나, 또는 앓은 적이 있는 유아, 태아, 또는 신생아 대상체에서 신경 발달을 촉진하거나 또는 신경발달 결핍, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 예방, 지연 또는 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지고, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 대상체는 NEC 또는 다른 병리 또는 상태이거나, 가지고 있거나 또는 의심되는 임의의 대상체, 예를 들어 포유류 또는 인간 환자일 수 있다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 마이크로스피어의 외면 상에 부분적인 또는 완전한 생물막 코팅을 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 금속으로 이루어지는 군으로부터 선택된 물질을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 여기서 마이크로스피어의 직경은 약 0.5 미크론 내지 약 1000 미크론이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 전생물막, 치료 약물 또는 치료제, 화학적 환원물질, 흡착을 촉진하는 분자, 및 흡수를 지지하는 분자 중 하나 이상을 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 전생물막은 생물막 형성 및 내구성을 지지하는 작용제를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그것의 각각의 동등물을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 프리바이오틱은 수용성 탄수화물, 이눌린, 올리고당류, 올리고프룩토스, 프룩토-올리고당, 갈락토-올리고당, 글루코스, 전분, 말토스, 말토덱스트린, 폴리덱스트로스, 아밀로스, 수크로스, 프룩토스, 락토스, 이소말툴로스, 폴리올, 글리세롤, 카보네이트, 티아민, 콜린, 히스티딘, 트레할로스, 질소, 질산 나트륨, 질산 암모늄, 인, 포스페이트 염, 하이드록시아파타이트, 칼륨, 칼리, 황, 호모단당류, 헤테로단당류, 셀룰로스, 키틴, 비타민, 및 그것들의 조합을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 또는 생체 적합성 스캐폴드를 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 프로바이오틱 박테리움은 락토바실러스 아시도필루스(L. acidophilus), 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 델브루에키 그룹(group L. delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 파라카세이(L. paracasei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus), 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 부흐네리(L. buchneri), 락토바실러스 퍼멘툼(L. fermentum), 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis), 비피도박테리움 안굴라티온(B. angulation), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 브레비(B. breve), 비피도박테리움 카테눌라툼(B. catenulatum), 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 락티스(B. lactis), 비피도박테리움 롱검(B. longum), 비피도박테리움 슈도카테눌라툼(B. pseudocatenulatum), 스트렙토코커스 써모필레스(S. thermophiles), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence), 슈도모나스 프로테겐스(P. protegens), 슈도모나스 브라시카세아룸(P. brassicacearum), 슈도모나스 에루기노사(P. aeruginosa); 아조스피릴럼 브라브라실렌스(Azospirillum. brabrasilense), 아조스피릴럼 립페럼(A. lipferum), 아조스피릴럼 할로프라에페렌스(A. halopraeferens), 아조스피릴럼 이라켄스(A. irakense); 아세토박터 디아조트로피커스(Acetobacter diazotrophicus); 헤르바스피릴럼 세로페디케(Herbaspirillum seropedicae); 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 스투트제리(Pseudomonas stutzeri), 플루오레센스(fluorescens), 슈도모나스 푸티다(P. putida), 슈도모나스 세파시안(P. cepacian), 슈도모나스 베시쿨라리스(P. vesicularis), 슈도모나스 파우시모빌리스(P. paucimobilis); 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 투링기엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 스페리쿠스(B. sphaericus); 슈와넬라 오나이덴시스(Shewanella oneidensis); 지오박터 베미지엔시스(Geobacter bemidjiensis), 지오박터 메탈리레듀센스(G. metallireducens), 지오박터 설퍼레듀센스(G. sulfurreducen), 지오박터 우라니레듀센스(G. uraniireducens), 지오박터 로블레이(G. lovleyi); 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 데설포비브리오 불가리스(Desulfovibrio vulgaris), 데설포비브리오 데설푸리칸스(D. desulfuricans), 데클로로모나스 아로마틱(Dechloromonas aromatic), 데이노코커스 라디오듀란스(Deinococcus radiodurans), 메틸리비움 페트롤레이필럼(Methylibium petroleiphilum), 알카니보락스 보르쿠멘시스(Alcanivorax borkumensis), 아르케글로부스 풀기두스(Archaeglobus fulgidus), 할로페락스 종(Haloferax sp.), 할로박테리움 종(Halobacterium sp.), 및 그것들의 조합 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 프로바이오틱 박테리움은 항-박테리아 면역의 지지, 장내 미생물 불균형 교정, 위장 장벽의 증강 또는 지지, 위장 운동성의 지지 또는 증강, 항생물질 조성물의 국지적 방출, 질환 관련 박테리아 감염에 대한 길항작용 중 하나 이상을 제공하거나, 또는 체력, 협응, 바로잡기 메커니즘, 청각 반사 테스트, 호기심, 학습 능력, 작업 기억, 단기 기억, 장기 기억, 시각적-공간적 추론(visual-spatial reasoning), 인지, 사물 인식, 및 세로토닌 중 하나 이상에서의 결핍을 방지한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 프로바이오틱 박테리움은 병원체 군집화를 방지하거나 및/또는 사이토카인 및 케모카인 생성의 하향 조절에 의해 과도한 염증 반응을 제한한다. 이것들이 달성되었는지를 측정하는 방법은 기술분야에 알려져 있고 본원에서 간단하게 기술된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 고체 코어 또는 중공 코어를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 프리바이오틱은 중공 코어 내에 캡슐화되거나 또는 마이크로스피어의 코어를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 병원체에 대해 선택적인 작용제를 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 보완제가 마이크로스피어의 표면 상에 코팅되거나 및/또는 코어 또는 중공 코어 내에 캡슐화된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 코발트, 크롬, 금, 니켈, 백금, 스테인레스 강, 티타늄, 탄탈룸, 니켈-티타늄, 합금, 및 그것들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된 금속을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 다음 중 하나 이상으로부터 선택된 생분해성 중합체를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다: 덱스트란; 덱스트라노머; 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA; 폴리카프로락톤 또는 PLC; 키토산; 젤라틴; DNA 수소; 아세탈화된 덱스트란; 폴리(락타이드); 폴리(글리콜라이드); 폴리(락타이드-코-글리콜라이드); 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(카프로락톤); 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(오르토에스테르); 폴리(포스파젠); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트; 폴리에스테라미드; 다가 무수물; 폴리(다이옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체; 폴리우레탄; 폴리(아미노산); 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; Sephadex® 공중합체 및/또는 그것들의 조합.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리(비닐 아세테이트), 실리콘 중합체, 폴리우레탄, 셀룰로스 중합체 및 셀룰로스 유도체와 같은 다당류, 아실 치환된 셀룰로스 아세테이트 및 그것의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(부틸렌 테레프탈레이트)의 공중합체, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설폰화된 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 그것들의 공중합체 및 혼합물 중 하나 이상으로부터 선택된 비-생분해성 중합체를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 다음으로부터 선택된 중합체를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다: 세파덱스, 세파덱스 G-25, 폴리(락트산-코-글리콜산)("PLGA"); 폴리카프로락톤 ("PLC"); 키토산; 젤라틴; DNA 수소; 아세탈화된 덱스트란; 폴리(락타이드); 폴리(글리콜라이드); 폴리(락타이드-코-글리콜라이드); 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(카프로락톤); 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(오르토에스테르); 폴리(포스파젠); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트; 폴리에스테라미드; 다가 무수물; 폴리(다이옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체; 폴리우레탄; 폴리(아미노산); 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 및 그것들의 조합.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리(비닐 아세테이트), 실리콘 중합체, 폴리우레탄, 셀룰로스 중합체 및 셀룰로스 유도체와 같은 다당류, 아실 치환된 셀룰로스 아세테이트 및 그것의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공중합체, 폴리(부틸렌 테레프탈레이트), 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설폰화된 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 그것들의 공중합체 및 혼합물 중 하나 이상으로부터 선택된 비-생분해성 중합체를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 프로바이오틱 박테리아는 락토바실러스 루테리를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지고 프리바이오틱은 말토스, 글리세롤, 또는 히스티딘을 포함한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 락토바실러스 루테리는 글루코실트랜스페라제 (GFT)를 생성한다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 덱스트란 또는 덱스트라노머를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 덱스트라노머를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지고, 프로바이오틱 박테리아는 락토바실러스 루테리를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 프리바이오틱은 말토스를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 덱스트라노머를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지고, 프로바이오틱 박테리아는 락토바실러스 루테리를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 프리바이오틱은 말토스를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 실질적으로 동일한 마이크로스피어들을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 서로 조성이 상이한 마이크로스피어들을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 마이크로스피어를 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱과, 선택적으로, 생물막을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 배양에서 혼합함으로써 제조된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 전생물막을 혼합하는 것을 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어졌거나, 또는 그것으로 이루어졌다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 전생물막, 치료 약물 또는 치료제, 화학적 환원물질, 흡착을 촉진하는 분자, 및 흡수를 지지하는 분자 중 하나 이상을 혼합함으로써 제조되었고 및/또는 여기서 전생물막은 생물막 형성 및 내구성을 지지하는 작용제를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 전생물막은 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그것의 각각의 동등물이다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움을 대상체 또는 대상체가 태아일 때 모체에게 제공하기 위해 투여된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 대상체의 탄생 후 약 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간 째에 투여된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 단일 용량으로 투여된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 공급관, 장으로, 비경구로, 좌제, 생체 적합성 스캐폴드 내로, 분말, 액체, 캡슐, 씹을 수 있는 정제, 삼킬 수 있는 정제, 협측 정제, 트로키, 당의정, 연질 씹을 수 있는, 용액, 현탁액, 스프레이, 팅크제, 탕약, 주입액, 비경구로, 및 그것들의 조합을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 군으로부터 선택된 투여 형태로 제형화된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 조성물은 PGLA 또는 덱스트라노머 생체 적합성 마이크로스피어, 적어도 락토바실러스 루테리 ("L. reuteri")를 포함하는 하나 이상의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움, 및 말토스, 수크로스, 글리세롤 또는 히스티딘 중 하나 이상을 프로바이오틱 박테리움의 성장을 지지하는 양으로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어지며, 여기서 마이크로스피어는 생물막으로 부분적으로 또는 전체적으로 코팅된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 약 0.5 마이크론 내지 75 마이크론 범위의 직경을 가진다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 프리바이오틱의 방출은 마이크로스피어 크기를 다르게 함으로써 (더 작은 마이크로스피어가 더 빠르게 방출됨) 또는 프리바이오틱의 점도를 변경시킴으로써 (즉 점도가 높을수록 방출은 더 느려짐) 조절된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 프리바이오틱을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 조성물, 및 패혈증 및/또는 패혈증을 유발하는 상태 (즉, 괴사성 장염 (NEC))가 취약하거나 그것을 앓고 있는 유아에서 신경발달 결핍을 예방하거나, 지연시키거나 또는 치료하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
본원에 기술된 방법의 일부 구체예에서, 대상체 (예컨대, 대상체는 자폐 스펙트럼이 있음)에서 신경 발달 결핍을 예방하거나 또는 신경 발달을 촉진하는 것, 이를테면 예를 들어 예방 또는 치료하는 것은 결핍의 부분적 예방을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 결핍의 부분적 예방은 대상체와 동일한 연령 및 동일한 종이지만 질환 또는 상태, 예컨대 다음으로부터 선택된 임의의 임상적으로 인정된 테스트 중 하나 이상에서 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태 점수를 갖지 않은 대조군 대상체의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%로 채점된 대상체를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다: 귀 열림(ear opening) 및 눈 뜨기(eye opening), 표면 바로잡기(surface righting), 공중 바로잡기(air righting), 앞다리 잡기, 청각 놀람(auditory startle), 표면 바로잡기, 음성 주지성(negative geotaxis), 오픈 필드 횡단(openfield traversal), 절벽 회피(cliff aversion), 반즈 미로(Barnes Maze), 고가 플러스 미로(elevated plus maze), 자마르 동력계(Jamar dynamometer), 휴대용 동력계, 도수 근력 검사(MMT), 등속성 동력계, 체간 안정성 검사(TST), 한쪽 고관절 지구력 검사(UHBE), 회내근 징후, 바레 징후, 자폐증(autism), 자폐증 스펙트럼 장애, 롬버그 검사(Romberg test), 란다 반사(Landau reflex), 입자 부유, 감각 반사 (바늘로 찌르기, 가벼운 터치, 포지션(position), 진동, 및 충전기), 반사 (이두근, 삼두근, 상완요골근, 슬개골, 및 발목), 모로 반사(Moro reflex), 긴장성 목 반응(tonic neck response), 빨기 반사(sucking reflex), 손바닥 및 발바닥 잡기 반사(palmer and planter grasp reflex), 낙하산 반응(parachute response), 신체에 대해 목을 바로잡는 반응(neck on body righting reaction, NOB), 신체에 대해 신체를 바로잡는 반응(body on body righting reaction, BOB), 귀를 여는 청각 반사(ear opening auditory reflex), 정적 순응도(static compliance), 외이도의 물리적 부피(physical volume of ear canal), 반대측 반사(contralateral reflex), 동측 반사(ipsilateral reflex), 고실 측정(tympanometry), Y-미로, 신규 물체 인식 과제(Novel Object Recognition Task), STPI (상태 특징 성격 목록), 5차원 호기심 척도(the Five Dimensional Curiosity Scale), 자기 호기심 태도 관심 척도(Self Curiosity Attitude Interests Scale), 호기심 및 탐색 목록-II, 상태 특징 성격 목록 (STPI), 감각 추구 척도의 하위척도 (SSS), 유아 발달의 베일리(Bayley) 척도 (BSID-III) (1-42개월), 조기 학습의 뮬렌(Mullen) 척도 (1-68개월), 유아 지능의 페이건(Fagan) 테스트 (FTII) (출생-12개월), 그리피스(Griffith)의 정신 발달 척도 I (0-2세), 바텔(Battelle) 발달 인벤토리 (BDI) (출생-8세), 및 빈란드(Vineland) 적응 행동 척도 (0-18세). 대상체에서 신경 발달의 촉진은 대상체와 동일한 연령 및 종이지만 질환 또는 상태, 예컨대, 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있지 않은 대조군 대상체의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%로 채점되는 대상체를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
개시된 방법의 일부 구체예에서, 대상체에서 신경 발달 결핍을 예방하거나 신경 발달을 촉진하는 것은 결핍의 하나 이상의 증상, 예컨대, 자폐증과 관련된 인지적 또는 사회적 발달의 악화를 완전히 예방하거나 또는 대상체에게 나타나는 시간의 지연을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 결핍의 완전한 예방은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 임의의 임상적으로 인지된 테스트에서 질환 또는 상태, 예컨대, 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태 (NEC)를 앓고 있지 않은, 동일한 연령 및 종의 대조군 대상체와 동일하게 채점되는 대상체를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다: 귀 열림 및 눈 뜨기, 표면 바로잡기, 공중 바로잡기, 앞다리 잡기, 청각 놀람, 표면 바로잡기, 음성 주지성, 오픈 필드 횡단, 절벽 회피, 반스 미로, 고가 플러스 미로, 자마르 동력계, 휴대용 동력계, 도수 근력 검사(MMT), 등속성 동력계, 체간 안정성 검사(TST), 한쪽 고관절 지구력 검사(UHBE), 회내근 징후, 자폐증, 자폐증 스펙트럼 장애, 바레 징후, 롬버그 검사, 란다 반사, 입자 부유, 감각 반사 (바늘로 찌르기, 가벼운 터치, 포지션, 진동, 및 충전기), 반사 (이두근, 삼두근, 상완요골근, 슬개골, 및 발목), 모로 반사, 긴장성 목 반응, 빨기 반사, 손바닥 및 발바닥 잡기 반사, 낙하산 반응, 신체에 대해 목을 바로잡는 반응 (NOB), 신체에 대해 신체를 바로잡는 반응 (BOB), 귀를 여는 청각 반사, 정적 순응도, 외이도의 물리적 부피, 반대측 반사, 동측 반사, 고실 측정, Y-미로, 신규 물체 인식 과제, STPI (상태 특징 성격 목록), 5차원 호기심 척도, 자기 호기심 태도 관심 척도, 호기심 및 탐색 목록-II, 상태 특징 성격 목록 (STPI), 감각 추구 척도의 하위척도 (SSS), 유아 발달의 베일리 척도 (BSID-III) (1-42개월), 조기 학습의 뮬렌 척도 (1-68개월), 유아 지능의 페이건 테스트 (FTII) (출생-12개월), 그리피스의 정신 발달 척도 I (0-2세), 바텔 발달 인벤토리 (BDI) (출생-8세), 및 빈란드 적응 행동 척도 (0-18세).
일부 구체예에서, 채점은 제약학적 조성물의 투여 후 0-1개월, 1-6개월, 6-12개월, 12-18개월, 18-24개월, 24개월 내지 3년 째에, 또는 3년 이상이 지난 후에 실시된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 태아가 출생하기 전 (즉, 출생전)에 치료를 필요로 하는 대상체의 태아에 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체를 임신한 모체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 0-1일, 1-6일, 6-12일, 12-18일, 18-24일, 24일 내지 100일, 또는 100일 이상으로부터 선택된 나이를 가진 대상체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 PGLA 또는 덱스트라노머 생체 적합성 마이크로스피어, 적어도 락토바실러스 루테리 ("L. reuteri")를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 하나 이상의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 말토스, 수크로스, 글리세롤 또는 히스티딘 중 하나 이상을 프로바이오틱 박테리움의 성장을 지지하는 양으로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어지며, 선택적으로 여기서 마이크로스피어는 생물막으로 부분적으로 또는 전체적으로 코팅된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 락토바실러스 루테리 ("L. reuteri")를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 덱스트라노머 생체 적합성 마이크로스피어 및 적어도 말토스 또는 적어도 말토스를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다. 일부 측면으로, 마이크로스피어 표면은 생물막으로 부분적으로 또는 완전하게 덮인다.
일부 구체예에서, 유아는 0-1개월, 1-6개월, 6-12개월, 12-18개월, 18-24개월, 24개월 내지 3세, 또는 3세 이상으로부터 선택된 나이를 가진다. 일부 구체예에서, 유아는 인간이다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 및 진단용으로, 산업적으로, 농업에서 또는 치료적으로 사용하기 위한 설명서를 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것들로 이루어지는, 또는 또한 그것들로 이루어지는 키트가 제공된다.
도 1A 및 1B는 락토바실러스 루테리 생물막 구조적 통합성이 DNABII 패밀리 단백질의 존재에 의존하는 것을 도시한다. LIVE/DEAD BacLight 박테리아 생존성 키트 (Molecular Probes)로 염색된 시험관내 락토바실러스 루테리 생물막의 공초점 현미경 이미지. 락토바실러스 루테리 생물막은 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 성장되었고, 이때 그것은 (도 1A) 토끼 나이브 혈청, (도 1B) 토끼 통합 방지 숙주 인자 폴리펩타이드 ("IHF"), 또는 아무 것도 첨가되지 않은 배지 (데이터 미도시) 중 어느 하나의 1:50 희석으로 16시간 동안 처리되었다. 항-IHF 처리는 최대 높이의 20% 감소, 평균 두께의 35% 감소, 및 생물막의 41% 감소를 초래하였다 (데이터 미도시).
도 2는 프리바이오틱 화합물이 프로바이오틱 생물막의 평균 두께 및 바이오매스를 증가시키는 것을 도시한다. 시딩할 때 10 μg/ml의 스트렙토코커스 뮤탄스(S. mutans) HU의 락토바실러스 루테리 생물막에의 첨가는 평균 두께 및 바이오매스를 각각 33%, 및 55% 증가시켰다. 10 μg/ml의 소 흉선 DNA의 첨가는 평균 두께를 44% 및 바이오매스를 68% 증가시켰다. 10 μg/ml의 HU 및 DNA를 함께 첨가하여 각각 단독과 비교하여 증가된 효과를 유발하였는데, 평균 두께는 53% 증가하였고 바이오매스는 78% 증가하였다.
도 3은 단일 경구 투여로의 락토바실러스 루테리 생체내 군집화 및 유지를 도시한다. 마우스 (n = 3마리/조건)에게 락토바실러스 루테리가 플랑크톤 배양물, 플랑크톤 + PLGA 배양물, 생물막 배양물, 및 생물막 + PLGA 배양물로서 경구 위관영양법을 통해 투여되었다. 7일 후, 마우스는 희생되었고 락토바실러스 루테리 16S rRNA 유전자가 마우스 결장으로부터 PCR 증폭되었다. 프로바이오틱이 플랑크톤 처리에서보다 생물막 배양물 또는 PLGA가 포함된 배양물로 처리된 마우스에서 더 높은 백분율로 발견되었다.
도 4는 PLGA 마이크로스피어 및 HU와 함께 성장된 락토바실러스 루테리 생물막이 시트로박터 로덴티움 비장 군집화를 생물막 및 플랑크톤성 락토바실러스 루테리보다 더 효과적으로 감소시킨 것을 도시한다. 마우스 (n = 6마리/조건)는 다음 형태 중 하나로 단일 경구 위관영양법의 락토바실러스 루테리로 처리되었다: 플랑크톤, 플랑크톤 + PLGA + HU, 생물막, 및 생물막 + PLGA + HU (0.115μg/ml PLGA, 10μg/ml HU). 12시간 후 마우스에게 시트로박터 로덴티움이 위관영양법으로 투여되었고, 주입 후 12일 후에 부검을 위해 희생되었다. 락토바실러스 루테리 생물막 + PLGA + HU만이 시트로박터 로덴티움 CFU/g의 통계적으로 유의한 감소를 보였다 (P=0.0343).
도 5A 및 5B는 본 개시의 조성물이 NEC의 동물 모델에서 박테리아 병원체의 염증 및 길항작용의 감소와 일치하는 것을 확립하는 연구 결과를 도시한다.
도 6A-6C는 락토바실러스 루테리가 덱스트라노머 마이크로스피어에 결합하는 것을 도시한다. DM에 부착된 락토바실러스 루테리의 공초점 레이저 주사 현미경 (CLSM). 락토바실러스 루테리와 함께 30분 동안 인큐베이션된 후 (도 6A) 물-충전 DM, (도 6B) 수크로스-충전 DM, (도 6C) 말토스-충전 DM은 DM에 부착된 락토바실러스 루테리가 DM 루멘 내에서 생물막-촉진 운반물을 통합하는 것이 향상될 수 있는 것을 보여주었다 (녹색: SYTO 9로 염색된 박테리아, 적색: 콩고 레드(Congo Red)로 염색된 DM).
도 7A-7C는 마이크로스피어 조성물 및 루멘 운반물이 affected 락토바실러스 루테리 부착력에 영향을 미쳤고, 락토바실러스 루테리가 GTFW-의존 방식으로 DM에 부착되었으며, GTF가 결핍된 박테리아는 DM에 결합하지 못한 것을 도시한다. 마이크로스피어에 대한 상대적인 박테리아 접착력을 평가하기 위하여 스핀 칼럼 검정이 수행되었다. 박테리아는 5분 동안 5 mg의 마이크로스피어와 함께 인큐베이션되고, 100 x g에서 원심분리되어 결합 및 미결합 박테리아가 분리된 후, 비부착 박테리아의 CFU가 스핀 칼럼의 관통 흐름액에서 정량화되었다. (도 7A) 가교된 덱스트란 (DM) 또는 가교된 셀룰로스 (CM) 중 어느 하나로 구성된 마이크로스피어가 물, 성장 배지, 또는 1 M 농도의 다양한 당으로 충전되어 어떤 유형의 마이크로스피어가 락토바실러스 루테리의 가장 큰 부착역을 지지하였는지 측정되었다. (도 7B) DM에 대한 상대적인 야생형 및 △gtfW 락토바실러스 루테리 부착은 락토바실러스 루테리가 GTF-의존 방식으로 DM에 부착된 것을 보여주었다. (도 7C) 비-GTF 발현 박테리아는 물-부하 및 수크로스-부하 DM과의 마이크로스피어 부착에 대해 유사하게 테스트되었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시된다: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.0005.
도 8은 시간 경과에 따른 마이크로스피어를 빠져나오는 운반물의 확산을 도시한다. 글리세롤 (점도를 증가시키기 위해 첨가됨)이 있거나 없이 크리스탈 바이올렛 (CV)-부하된 DM이 마이크로스피어로부터 확산되는 CV의 상대 속도를 측정하기 위해 검정되었따. 글리세롤이 첨가되지 않았을 때, CV는 40% 또는 80% 글리세롤을 함유한 DM과 비교하여 더 높은 속도로 확산되었다 (10시간 후 100% 확산됨). 출원인은 점도와 관계없이 16시간 후 DM으로부터 100% 확산을 관찰하였다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 글리세롤이 첨가되지 않은 DM으로부터의 통계적 유의성은 다음과 같이 표시된다: * P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001.
도 9는 히스타민이 DM을 통해 전달된 L-히스티딘으로부터 락토바실러스 루테리에 의해 생성될 수 있음을 도시한다. 정지상(stationary phase) WT 락토바실러스 루테리가 3% 말토스 또는 2% 글리세롤이 있거나 없는 식염수에서, 또는 3% 말토스 또는 2% 글리세롤이 있거나 없는 4 mg/ml L-히스티딘에서 2시간 동안 인큐베이션되었다. 히스타민 생성은 단지 4 mg/ml L-히스티딘 (검은색 막대 및 회색 막대 검은색 테두리) 비교하여 4 mg/ml L-히스티딘 용액에 3% 말토스가 첨가되었을 때 증가하였다 (흰색 막대 검은색 테두리). 4 mg/ml의 L-히스티딘이 DM을 통해 제동되었을 때 생성된 히스타민의 전체 수준은 아마도 박테리아에 대한 L-히스타민의 더 적은 즉시 이용률로 인해, 용액에 제공된 L-히스티딘 (좌측 4개 막대)과 비교하여 상당히 더 낮았다 (중간 3개 막대). 그러나, DM으로 부하된 L-히스티딘의 농도가 30 mg/ml로 증가하였을 때, DM을 벗어난 확산을 통해서만 이용할 수 있는 가능성으로 인해 L-히스티딘에 대한 더 느린 접근과 관련된 임의의 주의경고에도 불구하고 상당히 더 많은 히스타민이 생성되었다 (우측 3개 막대). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시된다: * P < 0.05, ** P < 0.01.
도 10은 위산 생존율을 도시한다. 운반물로서 물, 수크로스 (1M), 또는 말토스 (1M)를 함유한 5 mg의 DM, 또는 DM 없이 10 μl의 운반물 단독의 부재 또는 존재 하에 pH 2 합성 위산에서 4시간 후의 WT 및 △gtfW 락토바실러스 루테리 (107 CFU/ml) 생존율. 산에서의 상대적인 생존율은 DM 없이 전달된 동등한 부피의 동일한 운반물과 비교하여 WT 락토바실러스 루테리가 생물막으로서 수크로스 또는 말토스를 함유한 DM 상에 부착되었을 때 향상되었고, 이것은 낮은 pH에 노출되는 동안 생물막 표현형이 더 나은 생존율에 기여하는 것을 나타낸다. △gtfW는 DM 또는 당 단독의 존재 또는 부재와 무관하게, WT와 비교하여 감소된 내산성을 보였다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시된다: * P < 0.05, ** P < 0.01.
도 11A 및 11B는 생물막으로서 DM에 부착된 락토바실러스 루테리의 전달이 장 상피 세포에 대한 증가된 부착력을 지지한 것을 도시한다. (도 11A) 물, 수크로스 (1M), 또는 말토스 (1M)를 함유한 DM, 동등한 부피의 당 단독 (DM 없음) 상에 생물막으로서 부착된 락토바실러스 루테리 WT 및 △gtfW가, 60분 동안 인큐베이션된 후 인간 결장 DLD-1 세포에 대한 상대적 부착력에 대해 조사되었다. 수크로스 또는 말토스를 함유한 DM의 표면 상에 생물막으로서 전달되었을 때, 물-충전 DM 또는 동등한 부피의 당 단독과 비교하여 상당히 더 많은 WT가 DLD-1 세포에 부착되었다. 운반물에도 불구하고, 상당히 더 적은 △gtfW 돌연변이체 세포가 DLD-1 세포에 부착하였고, 이것은 GTFW 단백질이 락토바실러스 루테리 부착에 기여하는 것을 나타냈다. (도 11B) 60분 인큐베이션 후에 태아 소장 FHs 74 세포에 대한 WT의 부착은 운반물로서 수크로스 또는 말토스를 가진 생물막으로서 DM 표면 상에 부착하는 락토바실러스 루테리를 제공함으로써 장 세포에 대한 더 큰 부착력을 초래한 것을 보여주었다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시된다: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, **** P < 0.0001.
도 12A 및 12B는 락토바실러스 루테리가 DM에 부착된 생물막으로서 전달되었을 때 DLD-1 결장 상피 세포에 대한 증가된 부착이 관찰된 것을 도시한다. (도 12A) 시험관내 CLSM of DLD-1 상피 세포 (청색, DAPI), 락토바실러스 루테리 (녹색, CFSE), 및 DM (적색, 콩고 레드). WT 락토바실러스 루테리 (상부 4개 행)가 △gtfW 락토바실러스 루테리 (중간 4개 행) 및 락토바실러스 루테리 없음 (바닥 행)과 비교되었다. 박테리아 및 DM은 사전 염색되고, 1시간 동안 사전 염색된 DLD-1 상피 세포 상에서 인큐베이션되고, 3회 세척되고, CLSM 분석을 위해 고정되었다. (도 12B) WT 및 △gtfW 락토바실러스 루테리의 CLSM 이미지의 녹색 채널의 COMSTAT 분석을 통해 정량화된 박테리아 바이오매스의 비교. DM이 없는 WT (n = 10)은 WT + DM-수크로스 (n = 10) 또는 WT + DM-말토스 (n = 10)와 비교하여 더 적은 총 박테리아 신호를 초래하였다. △gtfW는 DM의 존재와 관계없이, DLD-1 세포에 부착된 박테리아의 상대적인 수에서 차이를 보이지 않았다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시된다: * P < 0.05, ** P < 0.01.
도 13A - 13F는 DM 운반물 부하, 여과, 및 박테리아 배양물에의 첨가를 도시한다. (도 13A) 탈수된 DM 및 원하는 운반물 (예컨대, 1 M 말토스)이 DM으로 용액이 확산되도록 함께 인큐베이션되었다. (도 13B) DM + 용액에 소용돌이를 일으키고 진공 여과 시스템에 피펫팅된다. (도 13C) 진공으로 과다 용액이 제거되어 운반물을 흡수한 DM만 남겨진다. (도 13D) DM-운반물 펠릿은 멸균 루프로 스크래핑함으로써 진공으로부터 제거될 수 있다. (도 13E) DM-운반물 펠릿이 박테리아 용액, 전형적으로 식염수에 재현탁된 박테리아에 전달된다. (도 13F) 최종 생성물은 용액에 함께 있는 박테리아 + DM-운반물로, 나중에 하류 적용 (예컨대, 검정, 경구 위관영양법, 등)에 사용될 수 있다.
도 14A 및 14B는 스핀 칼럼 DM 부착 검정을 도시한다. (도 14A) 박테리아 + DM-운반물 혼합물이 1.5 또는 2.0ml 마이크로원심분리 튜브 내에서 스핀 칼럼 필터의 상부에서 함께 인큐베이션된다. 원하는 인큐베이션 시간 (예컨대, 5분) 후에, 튜브 + 칼럼이 <100 x g에서 원심분리되어 DM에 부착된 및 비-부착된 박테리아가 분리된다. (도 14B) 원심분리 후에, 비-부착된 세포는 마이크로원심분리 튜브의 바닥을 통과하는 흐름에 있을 것이고, DM에 부착된 박테리아는 DM을 가진 필터 표면 상에 유지될 것이다 (필터 기공 크기는 DM 통과를 위해서는 너무 작지만, 박테리아 세포에는 충분히 작다). 흐름 관통액에 존재하는 세포는 연속 희석 플레이팅에 의해 열거된다. 박테리아 단독 (DM 없음) 대조군이 기준선으로서 사용되고, 모든 DM 실험은 기준선으로부터 제외된다.
도 15A 및 15B는 수크로스는 gtfW를 유도하지만, 말토스는 GTFW에 대한 기질인 것을 도시한다. (도 15A) 플라스미드 상의 gtfW 프로모터의 하류에 딱정벌레 루시페라제를 융합시키고, 그것을 락토바실러스 루테리 (스트레인 LMW 501)에 도입함으로써 gtfW 전사 리포터가 구성되었다. gtfW의 발현은 100 μl 분취액을 모든 시간에 제거하고, OD600nm을 측정함으로써 표시된 첨가가 있거나 없이, MRS에서의 성장 전반에 걸쳐 모니터링되었다. 추가의 80 μl 분취액이 제거되어 20 μl의 2 mM D-루시페린에 첨가되었고 실온에서 5분 동안 인큐베이션된 후, 발광 검출이 이어졌다. (도 15B) GTFW 효소 활성. 스트렙토코커스 뮤탄스, 락토바실러스 루테리 WT, 락토바실러스 루테리 △gtfW (스트레인 LMW 500), 및 유도성 플라스미드 (Ec) 상에 gtfW를 은닉한 대장균 (스트레인 LMW 502)으로부터 추출된 단백질에 SDS-PAGE와 이어서 PAS 염색을 수행하여 GTFW 효소 활성이 조사되었다. 5% 수크로스 또는 5% 말토스가 기질로서 사용되었다. 화살표는 GTFW 활성을 나타낸다.
도 16A-16D는 GTFW가 수크로스 또는 말토스가 보충된 성장 배지에서 조기 생물막 형성에 기여한 것을 도시한다. 락토바실러스 루테리 WT 및 △gtfW가 8-웰 붕규산 챔버 슬라이드에 시딩되어 37℃ 5% CO2에서 1, 3, 또는 6시간 동안 인큐베이션되었다. 지정된 시간 간격으로, 박테리아가 생존성에 대해 LIVE/DEAD 염색으로 염색되었고, 고정되고, 공초점 현미경 (CLSM)을 통해 가시화되고, 형광 신호가 COMSTAT 분석을 통해 정량화되었다. (도 16A) 1, 3, 및 6시간 째에 락토바실러스 루테리 생물막의 CLSM은, 녹색 형광 신호의 정량화에 의해 확인된 gtfW 돌연변이체 (좌측 칼럼)와 비교하여 1시간 째에 수크로스 또는 말토스가 포함된 조건에서 상당히 더 많은 박테리아의 존재 및 WT 박테리아의 증가된 응집을 보였다 (도 16B). 수크로스 또는 말토스가 존재하는 생물막에서의 GTF-의존성 증가는 3시간 후에 증가되었고 (도 16A - 중간 칼럼, 및 도 16C) 6시간 후에 추가로 증가되었다 (도 16A - 우측 칼럼, 및 도 16D). 생물막 형성을 위해 말토스를 활용할 없는 gtfW 돌연변이체는, 아마도 증가된 성장 속도로 인해 (데이터 미도시), 여전히 1시간 후에도 성장 배지에서 수크로스로부터 혜택을 얻는다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 통계적 유의성은 다음과 같이 표시된다: * P < 0.05, ** P < 0.01.
도 17은 락토바실러스 루테리가 글리세롤-부하된 마이크로스피어로부터 류테린(reuterin)을 생성할 수 있는 것을 도시한다. 실험 조건에서 글리세롤의 단독 공급원으로서 0-80% 글리세롤을 함유한 DM과 1시간 동안 인큐베이션된 락토바실러스 루테리가 상대적인 류테린 생성에 대해 측정되었다. 비교를 위해, 2% 글리세롤 용액에서 DM 없이 락토바실러스 루테리에 의해 생성된 류테린의 양이 대조군으로서 사용되었다 (점선). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 18은 DM을 통해 전달된 글리세롤 및 임의의 후속적으로 생성된 대사산물이 락토바실러스 루테리 생존율에 영향을 미치지 못한 것을 도시한다. WT 락토바실러스 루테리의 밤샘 배양물이 세척되었고 식염수 또는 MRS 배지에 재현탁되었다. 그런 후 5 mg의 DM-물 또는 DM-80% 글리세롤이 락토바실러스 루테리에 첨가되었고 37℃에서 인큐베이션되었다. 시간 간격을 두고 후속 연속 희석을 위해 분취액이 취해졌고 시각적 CFU를 위해 플레이팅되었다. 24시간 후 DM-물 또는 DM-80% 글리세롤을 포함한 동일한 배지 (식염수 또는 MRS)에서 인큐베이션된 배양물 사이에서 유의한 차이는 없었다.
도 19는 DM-제공된 글리세롤의 아크롤레인(acrolein)으로의 최대 전환이 독성 수준의 아크롤레인을 초래하지 못한 것을 도시한다. 세계 보건 기구 (WHO)는 1일당 7.5 μg/kg 체중 이하의 아크롤레인의 섭취를 권장한다. 락토바실러스 루테리에 의한, DM을 통해 제공된 이용 가능한 글리세롤의 아크롤레인으로의 전환율이 100%라고 가정한다면, 이 작업에서 이용된 락토바실러스 루테리 및 DM-글리세롤 (적색 화살표)의 투여량은 최대 6.24 μg의 아크롤레인이 생성되는 것을 초래하였다. 대시선 (50 μg 아크롤레인)은 70 kg의 인간의 경우 아크롤레인의 일일 허용량의 < 10%를 나타낸다.
도 20은 DM 상에 생물막으로서 전달된 락토바실러스 루테리가 뮤신에 대한 접착을 억제하지 못하는 것을 도시한다. 딱정벌레 루시페라제를 발현하는 락토바실러스 루테리 리포터가 플랑크톤으로 또는 생물막으로서 2% 뮤신 + 0.8% 아가 또는 0.8% 아가를 함유한 아가 플레이트 위의 DM 표면 상에 분배되었고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션된 후, 세척되어 비부착 락토바실러스 루테리가 제거되었다. D-루시페린 (0.4 mM)이 그런 후 플레이트에 첨가되고, 플레이트는 남아있는 부착된 박테리아로부터 기원한 발광 신호에 대해 이미지화되었다. 뮤신에만 부착된 박테리아의 양을 계산하기 위하여, 아가-단독 플레이트의 상대적인 광도(luminosity)를 뮤신 + 아가 플레이트의 상대적인 광도로부터 제하였다.
도 21A 및 21B는 DM에 부착된 락토바실러스 루테리 및 DLD-1 인간 결장 상피 세포의 표면에 부착된 락토바실러스 루테리를 도시한다. 락토바실러스 루테리 및 DLD-1 세포의 합류 단층 상의 DM의 시험관내 SEM. 박테리아 및 DM은 1시간 동안 DLD-1 상피 세포 상에서 인큐베이션되었고, 3회 세척되었으며, 고정되고 SEM 분석을 위해 준비되었다. 400X (도 21A) 및 2500X (도 21B) 배율로 DM에 부착된 락토바실러스 루테리 (황색 박스) 및 DLD-1의 표면에 부착된, DM이 없는 락토바실러스 루테리의 몇몇 클러스터 (흰색 화살표)가 도시된다.
도 22A 및 22B는 NEC의 발생률 및 중증도를 도시한다. 도 22A는 다음의 조직학적 손상 등급을 나타내는 H&E 염색된 장 조직 섹션이다: 등급 0, 가시적인 조직학적 융모 손상 없음; 등급 1, 원위 융모 장세포 분리; 등급 2, 장세포가 중간 융모 수준까지 박리됨; 등급 3, 크립트는 보존되면서 전체 융모의 상실; 및 등급 4, 경벽 괴사. 등급 2 손상 및 그 이상은 조직학적 NEC와 일치한다. 모든 이미지는 20x 배율이다. 도 22B는 래트 새끼가 조기에 출산되었고, 실험적인 NEC 프로토콜이 수행되었으며, 임상적 NEC의 신호가 발생한 때 또는 96시간이 지난 후에 희생된 것을 도시한다. 각각의 돗트는 조직학적 손상 점수가 표시된 단일 래트 새끼를 나타낸다. 각각의 실험 새끼 그룹에 대한 NEC 발생률이 표시된다. *p < 0.05.
도 23은 래트 새끼 생존율을 도시한다. 살아있고 종점 기준 (혼수(lethargy), 혈변, 고통스러운 호흡, 청색증)이 없는 새끼의 수가 96시간 실험적 NEC 프로토콜의 과정 동안 8시간 간격으로 각 실험 그룹에 대해 표시된다.
도 24는 실험적 NEC가 수행된 래트 새끼들의 장 투과도를 도시한다. 장 투과도는 FITC 덱스트란의 위 투여 후 4시간 후 FITC 덱스트란의 혈청 수준을 측정함으로써 측정되었고, 혈청 FITC 덱스트란의 더 큰 수준은 더 큰 장 투과도를 나타낸다. FITC, 플루오레세인 이소티오시아네이트. *p < 0.05.
도 25는 위장 관에서 Lr 지속성을 도시한다. Lr 의 생물발광 스트레인이 생성되었고 실험적 NEC 프로토콜의 48시간 후에 소장 및 대장에서 Lr 존재를 추적하기 위해 (발광된 빛의 양으로서) 사용되었다. RLU, 상대 조명 단위. *p < 0.05.
도 26A-26E는 염증 마커를 도시한다. 소장 시편이 수집되었고 포르말린에 고정되었다. RNA가 분리되었고 (도 26A) IL-6, (도 26B) IL-1β, (도 26C) CCL-2, (도 26D) CXCL-1, 및 (도 26E) IL-10의 발현에 대해 실시간 qPCR로 분석되었다. 결과는 이중으로 수행된, 7-10마리의 상이한 래트 새끼의 평균 ± SEM을 나타낸다. *p < 0.05.
도 27은 NEC의 발생률 및 중증도를 도시한다. 래트 새끼들은 조기에 출산되었고, 표시된 바와 같이 단일 장 처리가 제공되었으며, 그런 후 실험적 NEC 프로토콜이 수행되었다. 임상 NEC 신호가 발생한 때 또는 96시간이 지난 후 새끼들은 희생되었고, 장 조직이 수득되었으며, H&E 섹션이 등급화되어 장 손상의 정도가 측정되었다. 새끼들의 각 실험 그룹에 대한 NEC의 발생률이 도시된다. 각각의 처리 그룹에 대해 등급 2, 등급 3, 및 등급 4 손상을 가진 새끼들의 백분율이 표시된다. *p < 0.05.
도 28은 Y 미로 테스트가 수행된 래트의 독특한 트라이애드(Unique Triads)에 대한 결과를 도시한다. "모유 수유"는 대조군 래트를 나타내며, "NEC-스트레스"는 NEC가 있으며 락토바실러스 루테리 (Lr)를 받지 않은 래트를 나타내고, "NEC 스트레스 + Lr"은 NEC가 있으며 유리 형태의 Lr을 받은 래트를 나타내고, "NEC 스트레스 + Lr-DM-말토스"는 NEC가 있으며 생물막을 형성하기 위하여 Lr과 함께 인큐베이션된 말토스가 부하된 덱스트라노머 마이크로스피어 (DM)를 받은 래트를 나타낸다.
도 29는 신규 물체 인식 과제의 결과를 도시한다. 래트의 상이한 테스트 군은 도 28에서 표시된다.
도 30은 실험적 NEC의 신생 래트 모델을 도시한다. 신생 래트는 제왕절개를 통해 조기 출산되었다. NEC를 유도하기 위하여, 새끼들은 96시간 동안 반복된 고칼로리 사료 일화 및 저산소증/저체온증을 경험하였다.
도 31은 연구 시간표이다. 신생 래트는 E20.5에 제왕절개를 통해 조기 출산되었다. NEC를 유도하기 위하여, 새끼들은 고칼로리 사료 일화 및 저산소증/저체온증 x 96시간을 반복적으로 경험하였다. 생존한 새끼들은 위탁 댐(foster dams)으로 배치되었고 23일 동안 매일 발달 이정표 테스트를 받았다. 인지 기능 및 기억 테스트가 생후 4 내지 8주 사이에 수행되었다. 생후 2월령이 되었을 때 래트는 희생되었고 조직이 수집되었다.
도 32A - 32H는 실험적 NEC 후의 발달 이정표를 도시한다. 신생 래트는 제왕절개를 통해 조기 출산되었다. NEC를 유도하기 위하여, 새끼들은 고칼로리 사료 일화 및 저산소증/저체온증 x 96시간을 반복적으로 경험하였다. 생존한 새끼들은 위탁 댐으로 배치되었고 23일 동안 매일 발달 이정표가 측정되었다. (도 32A, 도 32B) 공중 바로잡기 테스트; (도 32C, 도 32D) 앞다리 잡기 테스트; (도 32E, 도 32F) 귀 열림; (도 32G, 도 32H) 청각 놀람. 오차 막대는 p ≤ 0.05 (일원 분산 분석)로서 정의된 통계적 유의성을 가진 SEM을 나타낸다.
도 33A - 33D는 실험적 NEC 후의 Y-미로 및 신규 물체 테스트를 도시한다. 래트 새끼들은 실험적 NEC를 경험하였다. 생존한 새끼들은 대리 댐(surrogate dams)으로 배치되었다. 이유 후, 래트의 행동 활동이 측정되었다. (도 33A, 도 33B) Y-미로 테스트; (도 33C, 도 33D) 신규 물체 테스트. 오차 막대는 p ≤ 0.05 (일원 분산 분석)로서 정의된 통계적 유의성을 가진 SEM을 나타낸다.
도 34A - 34C는 실험적 NEC 후의 반스 미로 테스트의 결과를 도시한다. 래트 새끼들은 실험적 NEC를 경험하였다. 생존한 새끼들은 대리 댐으로 배치되었다. 이유 후, 래트의 행동 활동이 측정되었다. (도 34A) 반즈 미로 환경; (도 34B) 테스트하는 날에 체크한 구멍의 수; 및 (도 34C) 탈출구 찾기 지연. 오차 막대는 p ≤ 0.05 (일원 분산 분석)로서 정의된 통계적 유의성을 가진 SEM을 나타낸다.
도 35A - 35C는 실험적 NEC 후의 고가 플러스 미로 테스트의 결과를 도시한다. 래트 새끼들은 실험적 NEC를 경험하였다. 생존한 새끼들은 대리 댐으로 배치되었다. 이유 후, 래트의 행동 활동이 측정되었다. (도 35A) 고가 플러스 미로 환경; (도 35B) 열린 팔 및 분기점에서의 시간; (도 35C) 닫힌 팔에서의 시간. 오차 막대는 p ≤ 0.05 (일원 분산 분석)로서 정의된 통계적 유의성을 가진 SEM을 나타낸다.
도 36A - 36C는 실험적 NEC 후 2개월 후의 뇌의 미세아교세포(microglia)를 도시한다. 래트 새끼들은 실험적 NEC를 경험하였고 생존한 새끼들은 대리 댐으로 배치되었다. 래트는 생후 21-23일에 젖을 떼었고 생후 2개월 째에 희생되었다. 뇌가 수득되어 4% PFA에 고정되었다. 냉동된 섹션은 Iba-1 항체 및 Alexa 488 콘쥬게이션된 이차 항체로 염색되었다. 섹션당 적어도 8개의 공초점 사진이 20X 대물렌즈를 사용하여 이미지화되었다. (도 36A) 뇌 전반에 걸친 대표적인 면역조직학적 이미지; (도 36B) 계수된 활성화된 및 아메바 모양의 미세아교세포의 수 / HPF; (도 36C) Iba-1+ 세포의 퍼센트 / Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화된 HPF. 오차 막대는 p ≤ 0.05 (일원 분산 분석)로서 정의된 통계적 유의성을 가진 SEM을 나타낸다.
도 37A - 37D는 실험적 NEC 후의 신경영양 유전자 발현을 도시한다. 래트 새끼들은 실험적 NEC를 경험하였고 생존한 새끼들은 대리 댐으로 배치되었다. 래트는 생후 2개월째에 희생되었고, 뇌가 수득되었으며, 전전두엽 피질 (PFC) 및 해마(hippocampus)가 수집되었다. (도 37A, 도 37B) BDNF 및 (도 37C, 도 37D) Grin2A에 대해 유전자 발현이 RT-qPCR에 의해 측정되었다. 독립적인 래트로부터의 상대적인 복사물 수가 도시된다. 오차 막대는 p ≤ 0.05 (일원 분산 분석)로서 정의된 통계적 유의성을 가진 SEM을 나타낸다.
도 38은 실험적 NEC 후의 래트 체중을 도시한다. 신생 래트는 E21에 제왕절개를 통해 조기에 출산되었다. NEC를 유도하기 위하여, 새끼들은 고칼로리 사료 일화 및 저산소증/저체온증 x 96시간을 반복적으로 경험하였다. 생존한 새끼들은 위탁 댐으로 배치되었고 21일 동안 매일 체중이 측정되었다. 생후 (DOL) 4, 10 15 및 21일 째의 새끼들의 체중이 도시된다. 오차 막대는 p ≤ 0.05 (일원 분산 분석)로서 정의된 통계적 유의성을 가진 SEM을 나타낸다.
도 39A - 39I는 실험적 NEC 후의 추가적인 발달 이정표를 도시한다. 신생 래트는 E21에 제왕절개를 통해 조기에 출산되었다. NEC를 유도하기 위하여, 새끼들은 고칼로리 사료 일화 및 저산소증/저체온증 x 96시간을 반복적으로 경험하였다. 생존한 새끼들은 위탁 댐으로 배치되었고 발달 이정표가 23일 동안 매일 측정되었다. (도 39A, 도 39B) 표면 바로잡기 테스트; (도 39C, 도 39D) 음성 주지성 테스트; (도 39E, 도 39F) 오픈 필드 테스트; (도 39G, 도 39H) 절벽 회피 테스트; 및 (도 39I) 눈을 뜨는 생후 일. 오차 막대는 p ≤ 0.05 (일원 분산 분석)로서 정의된 통계적 유의성을 가진 SEM을 나타낸다.
본 발명은 기술된 특정 구체예에 한정되지 않는 것이 이해되어야 하는데, 그러한 구체예들이 물론 달라질 수 있기 때문이다. 또한 본원에서 사용되는 용어는 특정 구체예만을 기술할 목적이며, 제한하려는 의도가 아닌 것이 이해되어야 하는데, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문이다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 교시에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질이 이제 기술된다. 본원에서 인용되는 모든 기술적인 및 특허 공보는 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. 본원의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 기술의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련된 지식 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA의 종래 기법들을 사용할 것이다. 참고, 예컨대, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology.
범위를 포함한 모든 수치 표시, 예컨대, pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 필요에 따라 1.0 또는 0.1의 증분, 또는 대안으로 +/- 15%, 또는 대안으로 10%, 또는 대안으로 5% 또는 대안으로 2% 만큼 (+)로 (-)로 달라지는 근사값이다. 또한, 비록 언제나 분명하게 기재되지는 않지만, 모든 수치 표시는 용어 "약"이 선행되는 것으로 이해되어야 한다. 또한 비록 언제나 분명하게 기재되지는 않지만, 본원에 기술된 시약은 단순히 예시적이며 그것의 동등물이 기술분야에 알려져 있는 것이 이해되어야 한다.
명세서 및 청구범위에서 사용되는 바, 단수를 나타내는 단어들은 맥락이 분명하게 다르게 지정하지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 예를 들어, 용어 "박테리움"은 혼합물을 포함한, 복수의 박테리아를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미한다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때 "본질적으로 이루어지는"은 의도된 용도를 위한 조합에 대해 임의의 본질적인 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 그러므로, 본원에서 정의된 요소로 본질적으로 이루어지는 조성물은 분리 및 정제 방법 및 제약학적으로 허용되는 담체로부터의 미량 오염물, 예컨대 인산염 완충 식염수, 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. "이루어지는"은 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 요소 이상을 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 이행 용어 각각에 의해 정의된 구체예는 본 발명의 범주 내에 있다.
"생물막"은 미생물이 분비 및/또는 방출하는, DNA와 같은 중합체와 함께, 유기물 또는 무기물일 수 있는 구조 표면에 때때로 부착할 수 있는 미생물의 얇은 층 또는 조직화된 군집체를 의미한다. 생물막은 미생물군(microbiotics) 및 항미생물제에 대해 매우 내성이다. 그것은 치은 조직, 치아, 및 수복물 상에 서식하며, 치주 플라크 질환으로도 알려진 충치 및 치주 질환을 유발한다. 그것은 또한 만성 중이 감염을 유발한다. 생물막은 또한 치아 임플란트, 스텐트, 카테터 선 및 콘택트 렌즈 표면 상에도 형성될 수 있다. 그것은 페이스메이커, 심장 판막 교체물, 인공 관절 및 기타 수술용 임플란트 상에서 성장한다. 미국 질병 관리 센터는 병원 (병원-획득) 감염의 65% 이상이 생물막에 의해 유발되는 것으로 추정한다. 진균 생물막은 또한 의료 장치를 빈번하게 오염시킨다. 그것은 만성 질 감염을 유발하고 습관성 면역 체계가 마비된 사람들에게서 생명을 위협하는 전신성 감염으로 이어진다. 생물막은 또한 수많은 질환에 관여한다. 예를 들어, 낭포성 섬유증 환자는 자주 항생물질 내성 생물막을 초래하는 슈도모나스 감염을 가진다.
"프리바이오틱"은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 의미한다. 프리바이오틱스는 대상체 (예컨대, 인간과 같은 포유류)가 소화시킬 수 없고, 하나 이상의 유익한 박테리아의 성장 또는 활성을 자극하거나 및/또는 하나 이상의 병원체 박테리아의 성장 또는 활성을 억제하는 식품 성분, 예를 들어, 올리고당류이다. 프리바이오틱은 대상체에서 하나 또는 제한된 수의 박테리아의 성장 및/또는 활성을 선택적으로 자극할 수 있다.
"전생물막"은 생물막 형성 및 내구성을 지지하는 물질을 의미하며, 예를 들어 전생물막은 eDNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 생물막의 세포외 매트릭스를 지지하는 물질 또는 대안으로 부착을 용이하게 하는 물질로 전환될 수 있는 기질, 예컨대, 수크로스일 수 있다.
"DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질"은 DNA-결합 도메인으로 구성되며 따라서 DNA에 대한 특정 또는 일반적 친화도를 가지는 DNA 결합 단백질 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 한 측면으로, 그것은 마이너 그루브에서 DNA에 결합한다. DNABII 단백질의 비제한적인 예는 대장균 스트레인 U93 (HU)으로부터의 통합 숙주 인자 (IHF) 단백질 및 히스톤-유사 단백질이며, 그것의 예는 첨부된 서열 목록에 제공되고 추가 스트레인 및 폴리펩타이드는 표 5에 제공된다. 또한 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 그것의 활성 단편의 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는 아미노산 변형을 가지는 폴리펩타이드 단편 및 동등한 폴리펩타이드가 의도된다. 활성 단편으로는, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드의 c-말단 절반 또는 c-말단 1/3을 들 수 있다. 생물막과 회합할 수 있는 다른 DNA 결합 단백질로는 DPS (Genbank 수탁 번호: CAA49169), H-NS (Genbank 수탁 번호: CAA47740), Hfq (Genbank 수탁 번호: ACE63256), CbpA (Genbank 수탁 번호: BAA03950) 및 CbpB (Genbank 수탁 번호: NP_418813), 뿐만 아니라 동등한 폴리펩타이드 및 그것의 활성 단편을 들 수 있다.
"마이크로스피어"는 인용된 특정 크기 범위 내의 다공성 및/또는 반투과성 생물막-운반 및/또는 화합물-운반 (예컨대, 약물-운반) 미립자 또는 과립형 물질을 의도한다. 본원에서 사용되는 바, 마이크로스피어는 직경이 50 밀리미터 이하, 및 직경이 약 1 미크론 이상인 (예컨대, 약 1 내지 약 100 또는 대안으로, 또는 대안으로, 약 1 내지 약 75 마이크론, 또는 대안으로 약 1 내지 약 50, 또는 대안으로 약 1 내지 약 25, 또는 대안으로 약 1 내지 약 10 마이크론, 또는 대안으로 약 0.5 내지 약 200 마이크론, 또는 대안으로 약 0.5 내지 약 700 마이크론, 또는 대안으로 약 1 내지 약 600 마이크론, 또는 대안으로 약 700 마이크론 미만, 또는 대안으로 약 600 마이크론 미만, 또는 대안으로 500 마이크론 미만, 또는 대안으로 약 400 마이크론 미만, 또는 대안으로 약 300 마이크론 미만, 또는 대안으로 약 200 마이크론 미만, 또는 대안으로 약 100 마이크론 미만) 입자로 이루어진다. 그러한 것의 비제한적인 예로는 다공성 및/또는 반투과성이고, 일부 측면으로, 제약 또는 약물을 함유할 수 있는 중공 마이크로스피어, 마이크로캡슐 (이 안에서 부형제는 운반물, 예컨대 약물, 화학적 환원물질, 또는 흡수성 또는 흡착성 분자를 둘러싸고 함유하는 피부 또는 쉘을 형성함), 및 미세입자를 들 수 있고, 이것들은 구형이거나 아니거나 간에, 이들 용어가 기술분야에서 전형적으로 사용되기 때문에, 인용된 크기 범위 내에서 임의의 입자에 대한 일반적인 용어로서 사용된다. 표 6은 상업적으로 이용 가능한 마이크로스피어의 비제한적인 예 및 그것들의 특징을 제공한다.
본원에서 사용되는 바, "한 측면으로 대상체"는 패혈증 또는 패혈증 유발 상태를 발생시키는 상태에 노출된, 또는 패혈증 또는 패혈증 유발 상태의 위험이 있는 패혈증 또는 패혈증 유발 상태 (즉, NEC)를 가진 대상체를 나타내며, 여기서 대상체는 발명에 따르는 조성물의 치료를 받는다. 대상체는 괴사성 장염을 앓고 있거나, 의심이 되거나, 또는 앓은 적이 있을 수 있다. 대상체는 유아, 태아 또는 신생아일 수 있다. 한 측면으로, 대상체는 0-1일, 1-6일, 6-12일, 12-18일, 18-24일, 24일 내지 100일, 또는 100일 이상으로부터 선택된 특정 연령의 유아 대상체이다.
"대조군 대상체"는 1) 질환 또는 상태, 예컨대, 유아 대상체와 동일한 패혈증 또는 패혈증 유발 상태 (즉, NEC) 또는 자폐증 또는 자폐증 스펙트럼 장애를 앓고 있거나, 취약하거나, 또는 앓은 적이 있지만 조성물이 투여되지 않았고 치료를 받은 대상체와 동이한 연령 및 종의 것인 대상체; 또는 2) 치료를 받았지만 질환 또는 상태를 앓지 않은 대상체와 동일한 연령 및 종의 대상체 중 어느 하나를 나타낸다.
"생분해성 중합체"는 생체 적합하고 생체내에서 신체 과정에 의해 신체에 의해 쉽게 버려질 수 있고 체내에 축적되지 않아야 하는 생성물로 분해될 수 있는 중합체를 의도한다.
"생체 적합성"은, 전달 체계의 구성요소가 조직 손상 또는 인간 생물학적 체계에 대한 손상을 유발하지 않을 것을 의미한다. 생체적합성을 부여하기 위하여, 인간에게서 안전 사용의 이력이 있거나 GRAS (일반적으로 안전한 것으로 인정됨) 상태인 중합체 및 부형제가 우선적으로 사용된다. 생체적합성이란, 조성물에 사용된 성분 및 부형제가 궁극적으로 신체에 어떠한 부작용 없이 "생체 흡수"되거나 신체에 의해 제거될 것을 의미한다. 조성물이 생체 적합성이 되기 위해서, 그리고 무독성으로 간주되기 위해서는, 세포에 대해 독성을 유발하지 않아야 한다. 유사하게, 용어 "생체 흡수성"은 환자에게서 장기간의 물질의 축적을 피할 수 있도록 일정 시간 동안 생체내에서 생체흡수되는 물질로부터 만들어진 마이크로스피어를 나타낸다. 생체 적합성 나노입자는 2년 미만, 바람직하게 1년 미만, 보다 더 바람직하게는 6개월 미만의 기간 동안 생체 흡수된다. 생체 흡수율은 입자의 크기, 사용되는 물질, 및 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있는 기타 인자들과 관련된다. 생체 흡수성, 생체 적합성 물질의 혼합물이 본 발명에 사용된 마이크로스피어를 형성하기 위해 사용될 수 있다.
"통합 숙주 인자" 또는 "IHF" 단백질은 박테리오파지에 의해 숙주 박테리아에 자신의 DNA를 통합시키기 위해 사용되는 박테리아 단백질이다. 이것들은 전사 및 번역 조절에서뿐만 아니라 유전자 재조합에서 기능하는 DNA 결합 단백질이다. 그것들은 또한 세포외 미생물 DNA에 결합한다. 대장균에서 IHF 단백질 하위유닛을 암호화하는 유전자는 himA (Genbank 수탁 번호: POA6X7.1) 및 himD (POA6Y1.1) 유전자이다. 그것의 비제한적인 예는 첨부된 서열 목록에 제공되며 표 5에서 주지된다.
"HU" 또는 "대장균 스트레인 U93으로부터의 히스톤-유사 단백질"은 전형적으로 대장균과 관련된 헤테로다이머 단백질의 부류를 나타낸다. HU 단백질은 DNA 접합부에 결합하는 것으로 알려져 있다. 관련된 단백질은 다른 미생물로부터 분리되었다. 대장균 HU의 완전한 아미노산 서열은 Laine 등에 의해 (1980) Eur. J. Biochem. 103(3):447-481에서 보고되었다. HU 단백질에 대한 항체는 Abcam사로부터 상업적으로 이용 가능하다. 그러한 것의 비제한적인 예는 첨부된 서열 목록에 제공된다.
용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용되며 용어의 가장 넓은 의미로 둘 이상의 하위유닛 아미노산의 화합물, 아미노산 유사체 또는 펩타이드 모방물을 나타낸다. 하위유닛은 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 하위유닛은 다른 결합, 예컨대, 에스테르, 에테르, 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대해 제한은 없다. 본원에서 사용되는 바 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체 둘 다, 아미노산 유사체 및 펩타이드 모방물을 포함한, 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 나타낸다.
"c-말단 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드의 c-말단 절반 또는 c-말단 1/3을 의도한다. 예로서, 90개 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드의 경우, c-말단 폴리펩타이드는 아미노산 46 내지 90 또는 아미노산 60 내지 90을 포함할 것이다. 또 다른 측면으로, 용어는 카르복시 말단으로부터 c-말단 20개 아미노산을 의도한다.
"n-말단 폴리펩타이드"는 폴리펩타이드의 n-말단 절반을 의도한다. 예로서, 90개 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드의 경우, c-말단 폴리펩타이드는 아미노산 1 내지 45를 포함할 것이다. 또 다른 측면으로, 용어는 아미노 말단으로부터 c-말단 20개 아미노산을 의도한다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 그것들의 유사체를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 삼차원 구조를 가질 수 있고 알려져 있거나 알려지지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, RNAi, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재한다면, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형이 폴리뉴클레오타이드의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후에, 예컨대 표지화 구성요소와의 콘쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중- 및 단일 가닥 분자를 모두 나타낸다. 다르게 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본 발명의 임의의 구체예는 두 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측된 두 상보하는 단일 가닥 형태의 각각을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드는 4개의 뉴클레오타이드 염기: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때 티민 대신 우라실 (U)의 특정 서열로 구성된다. 그러므로, 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳에 의한 표기이다. 이런 알파벳에 의한 표기는 중앙 처리 장치를 가진 컴퓨터의 데이터베이스에 입력되고 기능성 유전체학 및 상동성 연구와 같은 생물정보학 응용에 사용될 수 있다.
본원에서 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA와 관련하여 사용되는 용어 "분리된" 또는 "재조합"은 폴리펩타이드뿐만 아니라 거대분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 각각 분리된 분자를 나타낸다. 용어 "분리된 또는 재조합 핵산"은 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고 천연 상태에서 발견되지 않을 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "분리된"은 본원에서 또한 다른 세포 단백질로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체 및 단백질을 나타내기 위해 사용되고 정제된 및 재조합 폴리펩타이드를 모두 포함하는 것을 의미한다. 다른 구체예에서, 용어 "분리된 또는 재조합"은 구성성분, 세포 및 세포, 조직, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 그것들의 단편(들)이 정상적으로 자연에서 회합되어 있는 기타로부터 분리된 것을 의미한다. 예를 들어, 분리된 세포는 조직으로부터 분리된 세포 또는 유사한 표현형 또는 유전자형의 세포이다. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 그것의 천연 또는 자연적인 환경에서, 예컨대, 염색체 상에서 정상적으로 회합되는 3' 및 5' 연속 뉴클레오타이드로부터 분리된다. 기술분야에 숙련된 사람들에게 명백한 바, 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 그것들의 단편(들)은 그것의 자연적으로 발생하는 대응물로부터 구별하기 위해 "분리"를 필요로 하지 않는다.
글루코트랜스퍼라제는 글리코시드 결합을 확립하는 효소이다. GTF 단백질의 서열의 비제한적인 예는 DSM 20016에서 이용 가능하다. gtfW ABQ83597.1이 DSM 17938 gtfA WP _003671465에서 제공된다. 또한, Walter et al. (2008) Microbiology 154(Pt 1):72-80 참고.
명시적 인용 없이, 그리고 다르게 의도되지 않는 한, 본 발명이 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체에 관련된 경우, 그것의 동등물 또는 생물학적 동등물이 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도되는 것으로 유추될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "그것의 생물학적 동등물"은 참조 단백질, 항체, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 언급할 때 "그것의 동등물"과 동의어인 것으로 의도되며, 원하는 구조 또는 기능성을 유지하면서 최소한의 상동성을 가지는 것을 의도한다. 본원에서 구체적으로 인용되지 않는 한, 본원에서 언급된 임의의 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 또한 그것들의 동등물을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 동등물은 단백질 또는 그것의 특정 단편에 대해 적어도 약 70%, 또는 대안으로 80% 상동성 또는 동일성 및 대안으로, 적어도 약 85%, 또는 대안으로 적어도 약 90%, 또는 대안으로 적어도 약 95%, 또는 대안으로 98% 퍼센트 상동성 또는 동일성을 의도하며, 참조 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산에 대해 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다.
또 다른 서열에 대해 특정 백분율 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)의 "서열 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은, 정렬될 때, 염기 (또는 아미노산)의 백분율이 두 서열을 비교할 때 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 기술분야에 알려져 있는 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에 기재되어 있는 것을 사용하여 측정될 수 있다. 바람직하게, 디폴트 파라미터가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 다음의 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양 가닥; 컷오프 = 60; 기대값 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 기준 = 고득점; 데이터베이스 = 비중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 다음의 인터넷 주소에서 찾아볼 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 두 펩타이드 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 상동성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 측정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유된다면, 분자는 그 위치에서 상동한다. 서열간 상동성 정도는 서열들에 의해 공유된 매칭되는 또는 상동하는 위치의 수의 함수이다. "관련이 없는" 또는 "비상동성" 서열은 본 발명의 서열들 중 하나와 40% 미만, 또는 대안으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
본원에서 사용되는 바, "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 계속해서 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 나타낸다. 만약 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래된다면, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
용어 "암호화하는"은 폴리뉴클레오타이드에 적용될 때, 그것의 천연 상태에서 또는 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 조작될 때 폴리펩타이드 및/또는 그것의 단편에 대한 mRNA를 생성하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있다면, 폴리펩타이드를 "암호화하는"것으로 말할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 안티센스 가닥은 그러한 핵산의 상보물이며, 암호화 서열은 그것으로부터 추론될 수 있다.
진단 또는 치료의 "대상체" 또는 "환자"는 세포 또는 포유류 또는 인간과 같은 동물이다. 비인간 동물은 진단 또는 치료가 적용되고 감염 또는 동물 모델이 적용되는 것들, 예를 들어, 유인원, 쥐과, 예컨대, 래트, 마우스, 친칠라, 개과, 예컨대 개, 토끼과, 예컨대 토끼, 가축, 스포츠 동물 및 애완동물이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "치료하는", "치료" 등은 본원에서 원하는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미하도록 사용된다. 효과는 완전하게 또는 부분적으로 장애 또는 그것의 신호 또는 증상을 예방한다는 관점에서 예방적일 수 있거나 및/또는 장애 및/또는 장애에 기인하는 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다.
"방지"하는 것은 장애 또는 효과를 받기 쉬운 체계 또는 대상체에서 시험관내에서 또는 생체내에서 장애 또는 효과를 방지하는 것을 의도한다. 그러한 것의 예는 생물막을 생성하는 것으로 알려져 있는 미생물로 감염된 체계에서 생물막의 형성을 방지하는 것 또는 대안으로, 환자의 장의 건강한 상태를 지지함으로써 위장 장애를 방지하는 것이다.
용어 "배양"은 다양한 종류의 배지 상에서 또는 배지에서 세포 또는 유기체의 시험관내 증식을 나타낸다. 배양에서 성장된 세포의 후손은 부모 세포(parent cell)와 완전하게 동일하지 않을 수 있는 것 (즉, 형태학적으로, 유전자적으로, 또는 표현형적으로)이 이해된다. "팽창된"은 세포의 임의의 증식 또는 분하을 의미한다.
"제약학적으로 허용되는 담체"는 발명의 조성물에 사용될 수 있는 임의의 희석제, 부형제 또는 담체를 나타낸다. 제약학적으로 허용되는 담체로는 이온 교환 물질, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 수소 인산 이나트륨, 수소 인산 칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이드상 실리카, 삼규산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 들 수 있다. 적합한 제약학적 담체는 이 분야의 표준 참조 텍스트인 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company 출간)에서 기재된다. 그것들은 바람직하게 의도된 투여 형태, 즉, 경구용 정제, 캡슐, 엘릭시르, 시럽 등과 관련하여 종래의 제약 관행과 일치하게 선택된다.
"생체 적합성 스캐폴드"는 대상체에게 투여할 때 생물막 증식을 지지하는 능력이 있는 스캐폴드 또는 매트릭스를 나타낸다. 다른 구체예에서, 생체 적합성 스캐폴드는 숙주에 원하는 정도로 통합되고, 숙주에서 바람직하지 못한 국지적 또는 전신적 효과를 유도하지 않으면서 그것의 의도된 기능을 수행하는 능력을 가진 이식 가능한 장치에 대한 전구물질이다. 생체 적합성 스캐폴드는 미국 특허 제 6,638,369호 및 제 8,815,276호에 기재되어 있다. 한 측면으로, 본원에 기술된 마이크로스피어는 생체 적합성 스캐폴드이다.
"투여"는 동물 또는 인간과 같은 대상체에 대한 물질의 전달을 의도한다. 투여는 치료의 전 과정을 통해 한 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 실시될 수 있다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있고 치료법에 사용된 조성물, 치료법의 목적, 뿐만 아니라 치료되는 대상체의 나이, 건강 또는 성별에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여가 치료하는 의사 또는 애완동물 및 동물의 경우에 치료하는 수의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 적합한 투여 제형 및 작용제를 투여하는 방법은 기술분야에 알려져 있다. 투여 경로 또한 결정될 수 있고 가장 효과적인 투여 경로를 결정하는 방법은 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있고 치료에 사용된 조성물, 치료의 목적, 치료되는 대상체의 건강 상태 또는 질환 단계 및 표적 세포 또는 조직에 따라 달라질 것이다. 투여 경로의 비제한적인 예로는 장으로, 경구 투여, 질, 비강 투여 (흡입), 주사, 국소 적용 및 좌제에 의한 것을 들 수 있다.
용어 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과 또는 효과를 달성하기에 충분한 양을 나타낸다. 치료적 또는 예방적 적용의 맥락에서, 유효량은 문제가 되는 상태의 유형 및 중증도 및 개별 대상체의 특징, 예컨대 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중, 및 제약학적 조성물에 대한 내성에 따라 좌우될 것이다. 치료적 조성물의 맥락에서, 일부 구체예에서 유효량은 병원체에 대한 보호 반응을 초래하거나 또는 대안으로 건강한 상태를 지지하기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 양은 1) 병원체 제거; 2) 건강한 미생물총 회복; 3) 면역 체계를 조절; 4) 대사 및 대사 경로 유지; 5) 환경에 있는 독성 화합물 (물, 토양, 공기 중의 독성 화합물, 및 중금속 (예컨대, 크롬, 비소, 수은, 방사성 악티늄족, 우라늄, 플루토늄, 토륨, 다환 방향족 탄화수소 (PAH), 석유 탄화수소, 미정제 오일, 정유, 제초제 오염물 또는 살충제 오염물)과 같은 화합물) 감소; 및 6) 생물막 개선 중 하나 이상을 달성하기에 충분하다.
"체력"은 대상체가 기술분야에서 근력 생산으로도 알려져 있는 신체 작업을 수행하는 능력을 나타낸다. "협응"은 복잡한 신체 또는 활동의 상이한 요소들이 함께 효과적으로 작업할 수 있게 하기 위한 조직화를 나타낸다. 유아에서 체력 및/또는 협응은 기술분야에 숙련된 사람에게 알려져 있는 임상 테스트, 예를 들어, 자마르 동력계, 휴대용 동력계, 도수 근력 검사(MMT), 등속성 동력계, 체간 안정성 검사 (TST), 한쪽 고관절 지구력 검사 (UHBE), 회내근 징후, 바레 징후, 롬버그 검사, 란다 반사, 입자 부유, 감각 반사 (바늘로 찌르기, 가벼운 터치, 포지션, 진동, 및 충전기), 반사 (이두근, 삼두근, 상완요골근, 슬개골, 및 발목), 모로 반사, 긴장성 목 반응, 빨기 반사, 손바닥 및 발바닥 잡기 반사, 낙하산 반응에 의해 측정될 수 있다.
미로 바로잡기 반사로도 알려져 있는 "바로잡기 메커니즘" 또는 바로잡기 반사(righting reflex)는 신체의 정상적인 직립 자세에서 벗어났을 때 신체의 방향을 바로잡는 반사이다. 바로잡기 메커니즘은 숙련된 전문가에게 알려져 있는 하나 이상의 인지된 기법, 예를 들어, 신체에 대해 목을 바로잡는 반응 (NOB) 또는 신체에 대해 신체를 바로잡는 반응 (BOB)을 사용하여 임상적으로 측정될 수 있다.
"청각 반사"는 자극이 도입되었을 때 귀의 반사를 나타낸다. 청각 반사는 숙련된 전문가에게 알려져 있는 임상 기법, 예를 들어, 귀 열기 청각 반사, 정적 순응도, 외이도의 물리적 부피, 반대측 반사, 동측 반사, 및 고실 측정에 의해 측정될 수 있다.
"호기심"은 무언가, 자주 새로운 무언가를 배우거나 탐색하려는 열망을 나타낸다. 호기심은 기술분야에 알려져 있는 방법, 예를 들어, Y-미로, 신규 물체 인식 과제, STPI (상태 특징 성격 목록), 5차원 호기심 척도, 자기 호기심 태도 관심 척도, 호기심 및 탐색 목록-II, 상태 특징 성격 목록 (STPI), 및 감각 추구 척도의 하위척도 (SSS)를 사용하여 평가될 수 있다.
"학습 능력"은 이해하고; 경험을 이해하고 경험으로부터 이익을 얻는 능력을 나타낸다. "작업 기억"은 즉각적인 의식 지각 및 언어적 처리와 관련된 단기 기억의 일부를 나타낸다. "단기 기억"은 단기간 동안 활성의, 쉽게 이용 가능한 상태로 마음 속에 소량의 정보를 유지하지만 조작하지는 않는 능력을 나타낸다. "장기 기억"은 유익한 지식이 무기한으로 유지되는 Atkinson-Shiffrin 기억 모델의 단계이다. 그것은 약 18 내지 30초 동안만 지속되는 단기 및 작업 기억과는 대조적으로 정의된다. 장기 기억은 보통 외현기억(선언적 기억), 뿐만 아니라 일화성 기억, 의미 기억, 자서전적 기억, 및 암묵 기억(절차 기억)으로 분류된다. "인지"는 주의, 지식의 형성, 기억 및 작업 기억, 판단 및 평가, 추론 및 계산, 문제 해결 및 의사 결정, 이해 및 언어 생산과 같은 지적 기능과 과정의 많은 측면을 포함하는, 사고, 경험, 및 감각을 통해 지식과 이해를 획득하는 정신적 활동 또는 과정이다. "시각적-공간적 추론"은 물체 또는 공간 사이의 공간적 관계를 이해하고, 추론하며 기억하는 능력을 나타낸다. "물체 인식"은 전에 보였다가 후에 시선으로부터 제거된 후, 다시 보이는 물체를 기억하는 능력을 나타낸다. 이 단락에서 정의된 특성 중 어느 것이든지 유아에서 인지 능력을 측정하기 위해 숙련된 전문가에게 알려져 있는 임상 척도 또는 테스트, 예를 들어, 유아 발달의 베일리 척도 (BSID-III) (1-42개월), 조기 학습의 뮬렌 척도 (1-68개월), 유아 지능의 페이건 테스트 (FTII) (출생-12개월), 그리피스의 정신 발달 척도 I (0-2세), 바텔 발달 인벤토리 (BDI) (출생-8세), 및 빈란드 적응 행동 척도 (0-18세)를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "유아"는 매우 어린 인간 또는 동물을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 0-1개월, 1-6개월, 6-12개월, 12-18개월, 18-24개월, 24개월 내지 3세, 또는 3세 이상이다. 유아는 인간 뿐만 아니라, 예를 들어, 유인원, 소과 동물, 돼지과 동물, 쥐과 동물, 래트, 조류, 및 파충류 동물을 의미한다.
본원에서 사용되는 "패혈증"은 감염에 대한 신체 반응이 신체의 조직 및 장기에 대한 손상을 유발할 때 발생하는 생명을 위협하는 상태를 나타낸다. 이 초기 단계에는 면역 체계의 억제가 뒤따른다. 패혈증은 혈액 배양, 소변 배양, 기타 배양, 혈액 테스트, 요추 천자, x-선에 한정되지 않는, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에게 알려져 있는 도구를 사용하여 진단될 수 있다.
글루타메이트 [NMDA] 수용체 하위유닛 엡실론-1은 인간에서 본원에서 사용되는 GRIN2A　유전자 또는 "Grin2A"에 의해 암호화되는 단백질이다.
　"뇌-유래 신경영양 인자" (BDNF)는 인간에서, BDNF 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 나타낸다. BDNF는 중추신경계 및 말초신경계의 특정 뉴런 상에서 작용하여, 기존의 뉴런의 생존을 지지하는 것을 도우며, 새로운 뉴런 및 시냅스의 성장 및 분화를 촉진한다. 이 단백질의 발현의 변화는, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 웨스턴 블롯, 또는 질량 분광분석에 의해 측정될 수 있다.
"활성화된 미세아교세포"는 정상적으로 뉴런 손상에 대해 반응하고 식세포작용에 의해 손상된 세포를 제거하는, CNS에 거주하는 면역 세포에 의해 매개된 염증성 반응을 나타낸다. 미세아교세포의 활성화는 뇌 병리의 특징이다. 활성화된 미세아교세포는 J Neuroimmune Pharmacol. 2009 June; 4(2): 227-243 (개시내용은 참조로 본원에 포함됨)에서 기재된 것과 같은 양전자 방출 단층촬영 (PET)에 한정되지 않는 이미징 기법을 통해 확인될 수 있다.
본원에서 사용되는 "신경 발달 결핍"은 뇌 및/또는 중추신경계의 성장 및 발달의 신경 발달상의 손상을 나타낸다. 용어를 더 좁게 사용하면 개체가 발달하고 성장함에 따라 펼쳐지는 감정, 학습 능력, 자기 조절 및 기억에 영향을 미치는 뇌 기능의 장애를 나타낸다. 이런 정의의 범주에서 신경 발달 장애는, 한정하는 것은 아니지만 다음을 포함한다: 이전에는 정신 지체로 불렸던 지적 장애 (ID) 또는 지적 및 발달 장애 (IDD). 난독증(dyslexia) 또는 난산증(dyscalculia)과 같은 특정 학습 장애, 아스퍼거 증후군 또는 자폐 장애와 같은 자폐 스펙트럼 장애. 발달 협응 장애 및 고정관념적 운동 장애를 포함한 운동 장애. 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome)을 포함한 틱 장애. 외상상 뇌 손상 (뇌성 마비를 유발하는 것과 같은 선천적 손상을 포함함). 의사 소통 장애, 및 언어 장애. 유전적 장애, 예컨대 취약-X 증후군, 다운 증후군, 주의력 결핍 과잉행동 장애, 정신분열증, 분열형 장애, 성선기능저하성 성선기능저하 증후군. 수행 장애 등을 포함한 행동 장애. 주의력 결핍 과잉행동 장애. 신경발달 결핍은 본원에 기술되거나 기술분야에 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 테스트, 예컨대 귀 열림 및 눈 뜨기, 표면 바로잡기, 공중 바로잡기, 앞다리 잡기, 청각 놀람, 표면 바로잡기, 음성 주지성, 노천 횡단, 절벽 회피, 반스 미로, 고가 플러스 미로, 자마르 동력계, 휴대용 동력계, 도수 근력 검사(MMT), 등속성 동력계, 체간 안정성 검사 (TST), 한쪽 고관절 지구력 검사 (UHBE), 회내근 징후, 바레 징후, 롬버그 검사, 란다 반사, 입자 부유, 감각 반사 (바늘로 찌르기, 가벼운 터치, 포지션, 진동, 및 충전기), 반사 (이두근, 삼두근, 상완요골근, 슬개골, 및 발목), 모로 반사, 긴장성 목 반응, 빨기 반사, 손바닥 및 발바닥 잡기 반사, 낙하산 반응, 신체에 대해 목을 바로잡는 반응 (NOB), 신체에 대해 신체를 바로잡는 반응 (BOB), 귀를 여는 청각 반사, 정적 순응도, 외이도의 물리적 부피, 반대측 반사, 동측 반사, 고실 측정, Y-미로, 신규 물체 인식 과제, STPI (상태 특징 성격 목록), 5차원 호기심 척도, 자기 호기심 태도 관심 척도, 호기심 및 탐색 목록-II, 상태 특징 성격 목록 (STPI), 감각 추구 척도의 하위척도 (SSS), 유아 발달의 베일리 척도 (BSID-III) (1-42개월), 조기 학습의 뮬렌 척도 (1-68개월), 유아 지능의 페이건 테스트 (FTII) (출생-12개월), 그리피스의 정신 발달 척도 I (0-2세), 바텔 발달 인벤토리 (BDI) (출생-8세), 및 빈란드 적응 행동 척도 (0-18세)를 사용하여 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 평가 및 진단될 수 있다.
본원에서 사용되는 "감염"은 박테리아 감염, 바이러스 감염, 진균 감염, 또는 원생동물 감염을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 "패혈증 유발 상태"는 패혈증을 유발하거나 초래하는 대상체 또는 어머니 (산모)의 임의의 상태, 예를 들어, 괴사성 장염 (NEC), 대장균(E coli), 리스테리아, 스트렙토코커스, 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 　살모넬라(Salmonella),　헤모필루스 인플루엔자 타입 b(Haemophilus influenzae type b), 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 칸디다, 산모 양수의 박테리아 감염, 조산, 산모 양수 파열, 진균 감염, 바이러스 감염, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 원생동물 감염, 폐 감염, 뇌 감염, 요로 감염, 피부 감염, 유아 대상체의 요도관 삽입, 유아 대상체에서 주사 선의 정맥내 배치, 유아 대상체에서 염증 및/또는 면역 조절장애, 및 유아 대상체에 대한 수술로부터 유발되는 감염을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 "세포체(Cell body) 두께"는, 예를 들어, 투과 전자 현미경, 염료 현미경을 통한 투과, 액체 변위, Coulter 방법, 흡수, 형광, 빛 차단, 또는 공초점 스캐닝에 의해 측정되는 세포체의 두께를 나타낸다.
시험관내 또는 생체외 적용의 경우에, 일부 구체예에서 유효량은 문제의 적용의 크기 및 본질에 따라 달라질 것이다. 또한 그것은 시험관내 표적의 본질 및 민감성 및 사용 방법에 따라 달라질 것이다. 숙련된 전문가는 이들 및 기타 고려사항을 토대로 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 유효량은 구체예에 따라 조성물의 1회 이상의 투여를 포함할 수 있다.
작용제 및 조성물은 의약의 제조에 및, 예컨대 제약학적 조성물 중의 활성 성분과 같이, 종래 과정에 따른 투여에 의해 인간 및 다른 동물의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 작용제 또는 조성물은 임의의 적합한 투여 경로에 의해 치료를 위해 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 수령체의 상태 및 연령 및 치료되는 질환에 따라 달라질 것이 또한 인지될 것이다.
괴사성 장염 ("NEC")은 장의 부분이 괴사 (조직 사망)가 진행되는, 주로 미성숙 유아에서 볼 수 있는 의학적 상태이다. 그것은 출산 후에 발생하며 (즉, 사산아에서는 보이지 않음) 두 번째로 흔한 사망 원인이다. 모든 신생아 집중 관리실 입원의 7%가 NEC와 관련되어 있다. 사망률은 12%이다.
발명을 수행하기 위한 모드
마이크로스피어 조성물
본 개시는 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는, 본질적으로 그것들로 이루어지는, 또는 그것들로 이루어지는 조성물을 제공하며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 조성물은 생물막, 전생물막, 마이크로스피어 치료 약물 또는 치료제의 표면 상의 코팅, 화학적 환원물질, 흡착을 촉진하는 분자, 흡수를 지지하는 분자 중 하나 이상을 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다. 마이크로스피어는 고체 고처, 중공 코어를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 한 측면으로, 마이크로스피어는 프리바이오틱을 중공 코어 내에 캡슐화한다. 마이크로스피어는 생체 적합성 및/또는 반투과성일 수 있다. 한 측면으로, 마이크로스피어는 마이크로스피어의 외부 표면 상에 생물막 층 또는 코팅을 포함한다.
마이크로스피어 구성요소
한 측면으로, 생체 적합성 마이크로스피어는 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 금속으로 이루어지는 군으로부터 선택된 물질을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 마이크로스피어의 직경은 약 0.5 마이크론 내지 약 1000 마이크론이다. 추가적인 바람직한 범위는 본원에서 기술되며 본원에 참조로 포함된다. 마이크로스피어는 다공성 및/또는 반투과성일 수 있다.
생분해성 중합체의 비제한적인 예는 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: 덱스트란; 덱스트라노머; 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA; 폴리카프로락톤 또는 PLC; 키토산; 젤라틴; DNA 수소; 아세탈화된 덱스트란; 폴리(락타이드); 폴리(글리콜라이드); 폴리(락타이드-코-글리콜라이드); 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(카프로락톤); 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(오르토에스테르); 폴리(포스파젠); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트; 폴리에스테라미드; 다가 무수물; 폴리(다이옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체; 폴리우레탄; 폴리(아미노산); 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 세파덱스® 공중합체 및/또는 그것들의 조합.
비-생분해성 중합체의 비제한적인 예는 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리(비닐 아세테이트), 실리콘 중합체, 폴리우레탄, 셀룰로스 중합체 및 셀룰로스 유도체와 같은 다당류, 아실 치환된 셀룰로스 아세테이트 및 그것의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜)과 폴리(부틸렌 테레프탈레이트)의 공중합체, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설폰화된 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 그것들의 공중합체 및 혼합물 중 하나 이상으로부터 선택된다.
마이크로스피어를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 중합체의 비제한적인 예는: 세파덱스, 세파덱스 G-25, 폴리(락트산-코-글리콜산)("PLGA"), 폴리카프로락톤 ("PLC"), 키토산; 젤라틴, DNA 수소; 아세탈화된 덱스트란, 폴리(락타이드), 폴리(글리콜라이드), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(오르토에스테르), 폴리(포스파젠), 폴리(하이드록시부티레이트), 폴리(하이드록시부티레이트), 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트; 폴리에스테라미드; 다가 무수물, 폴리(다이옥사논), 폴리(알킬렌 알킬레이트), 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체, 폴리우레탄, 폴리(아미노산), 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 및 그것들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된다.
금속의 비제한적인 예로는 코발트, 크롬, 금, 니켈, 백금, 스테인레스 강, 티타늄, 탄탈룸, 니켈-티타늄, 합금, 및 그것들의 조합을 들 수 있다.
프리바이오틱
조성물의 프리바이오틱의 비제한적인 예는: 수용성 탄수화물, 이눌린, 올리고당류, 올리고프룩토스, 프룩토-올리고당, 갈락토-올리고당, 글루코스, 전분, 말토스, 말토덱스트린, 폴리덱스트로스, 아밀로스, 수크로스, 프룩토스, 락토스, 이소말툴로스, 폴리올, 글리세롤, 카보네이트, 티아민, 콜린, 히스티딘, 트레할로스, 질소, 질산 나트륨, 질산 암모늄, 인, 포스페이트 염, 하이드록시아파타이트, 칼륨, 칼리, 황, 호모단당류, 헤테로단당류, 셀룰로스, 키틴, 비타민, 및 그것들의 조합 중 하나 이상을 포함한다.
또 다른 측면으로, 프리바이오틱은 트레할로스; 질산 나트륨, 질산 암모늄에서와 같은 질소, 하이드록시아파타이드와 같은 인산염에서와 같은 인, 칼리에서와 같은 칼륨, 황, 올리고당, 호모단당류, 헤테로단당류, 셀룰로스, 키틴, 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 전분, 폴리덱스트로스, 아밀로스, 글리세롤, 카보네이트, 및 그것들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된다.
또 다른 추가의 측면으로, 조성물의 프리바이오틱은 미생물 성장을 자극하기 위한 비타민 혼합물, 질산 나트륨, 질산 암모늄에서와 같은 질소, 하이드록시아파타이드와 같은 인산염에서와 같은 인, 칼리에서와 같은 칼륨, 황, 올리고당, 호모단당류, 헤테로단당류 셀룰로스, 키틴; 글루코스, 프룩토스, 수크로스, 말토스, 전분, 폴리덱스트로스, 아밀로스, 글리세롤, 카보네이트, 및 그것들의 조합 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
프로바이오틱 박테리움
한 측면으로, 프로바이오틱 박테리움은 항-박테리아 면역의 지지, 대상체에서 건강한 상태의 증강 또는 지지, 위장 장벽의 증강 또는 지지, 또는 질환 관련 박테리아 감염에 대한 길항작용 중 하나 이상을 제공하기 위해 선택된다. 또 다른 측면으로, 프로바이오틱 박테리움은 병원체 군집화를 방지하거나 및/또는 병원체를 제한 및/또는 제거하거나, 및/또는 사이토카인 및 케모카인 생성을 하향 조절함으로써 과도한 염증 반응을 제한하기 위해 선택된다.
프로바이오틱 박테리움의 비제한적인 예는 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 델브루에키 그룹, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부흐네리, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 안굴라티온, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레비, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 스트렙토코커스 써모필레스, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 프로테겐스, 슈도모나스 브라시카세아룸, 슈도모나스 에루기노사; 아조스피릴럼 브라브라실렌스, 아조스피릴럼 립페럼, 아조스피릴럼 할로프라에페렌스, 아조스피릴럼 이라켄스; 아세토박터 디아조트로피커스; 헤르바스피릴럼 세로페디케; 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 스투트제리, 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 세파시안, 슈도모나스 베시쿨라리스, 슈도모나스 파우시모빌리스; 바실러스 세레우스, 바실러스 투링기엔시스, 바실러스 스페리쿠스; 슈와넬라 오나이덴시스; 지오박터 베미지엔시스, 지오박터 메탈리레듀센스, 지오박터 설퍼레듀센스, 지오박터 우라니레듀센스, 지오박터 로블레이; 세라티아 마르세센스, 데설포비브리오 불가리스, 데설포비브리오 데설푸리칸스, 데클로로모나스 아로마틱, 데이노코커스 라디오듀란스, 메틸리비움 페트롤레이필럼, 알카니보락스 보르쿠멘시스, 아르케글로부스 풀기두스, 할로페락스 종, 할로박테리움 종, 및 그것들의 조합 중 하나 이상이다.
또 다른 측면으로, 프로바이오틱은 GTF 단백질을 생성하거나 GTFW 유전자를 함유하는 락토바실러스 루테리이다 (ATCC 23272).
전생물막
다른 측면으로, 전생물막은 생물막 형성을 지지하는 작용제를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 그러한 것의 비제한적인 예로는 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 NABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그것의 각각의 동등물, 선택적으로, 첨부된 서열 목록 중 하나 이상, 또는 그것들의 각각의 생물학적 활성 단편 또는 동등물을 단독으로 또는 조합하여 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩타이드를 들 수 있다.
보완제
마이크로스피어 및 마이크로스피어를 함유하는 조성물은 추가로 작용제일 수 있고, 작용제는 프로바이오틱 유기체와 경쟁할 수 있는 병원체에 대해 선택적이다. 보완제는 마이크로스피어를 함유하는 조성물에서 마이크로스피어의 코어에, 표면 상에 있을 수 있다. 그러한 것의 비제한적인 예로는 화학적 환원물질; (마이크로스피어의 코어에서 또는 표면 상에서) 흡착을 촉진하는 분자 및/또는 표면; (마이크로스피어의 코어에서 또는 표면 상에서) 흡수를 촉진하는 분자 및/또는 표면을 들 수 있다. 한 측면으로, 화학적 환원물질 및 흡수를 촉진하는 분자 및/또는 표면은 마이크로스피어의 표면 상에 코팅된다.
생물막 층
한 측면으로, 마이크로스피어 조성물은 미세입자의 외부 표면 상에 생물막 층을 추가로 포함한다. 층은 약 0.5 마이크론 내지 약 1 밀리미터 깊이일 수 있고, 예컨대, 약 1 마이크론 내지 약 500 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 250 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 200 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 40 마이크론, 및 약 5 마이크론 내지 약 30 마이크론의 범위이다.
조성물
본 개시는 또한 담체, 예컨대, 제약학적으로 허용되는 담체 또는 생체 적합성 스캐폴드와 함께 본원에 기술된 하나 또는 복수의 마이크로스피어 조성물을 제공한다. 제약학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예로는 개시의 조성물에 사용될 수 있는 희석제, 부형제 또는 담체를 들 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체로는 이온 교환 물질, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대 인산염, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 수소 인산 이나트륨, 수소 인산 칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이드상 실리카, 삼규산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소디움 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모 지방을 들 수 있다.
생체 적합성 스캐폴드의 비제한적인 예로는 치료될 대상체 또는 환경에 투여될 때 생물막 증식을 지지하는 능력을 가진 스캐폴드 또는 매트릭스를 들 수 있다.
한 측면으로, 조성물은 서로 동일하거나 상이한, 예컨대 동일하거나 상이한 직경, 동일하거나 상이한 마이크로스피어 구성요소, 동일하거나 상이한 프로바이오틱스, 동일하거나 상이한 보완제, 동일하거나 상이한 전생물막, 및 중공 및/또는 고체 코어를 가진 복수의 마이크로스피어를 포함한다.
조성물은 예컨대, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움의 투여 형태로, 또는 최종 사용을 위해 유효량, 예컨대, 약 1 x 105 내지 1 x 1011 CFU/ml, 또는 대안으로 약 1 x 105 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 108 CFU/ml의 마이크로스피어 조성물을 제공하기 위해 제형화될 수 있다.
조성물은 용이한 투여, 보관 및 적용을 위해 제형화되거나 가공될 수 있는데, 예컨대, 냉동되거나, 동결건조되거나, 현탁되거나 (현탁 제형) 또는 분말화될 수 있고; 좌제, 정제, 용액, 현탁액, 환, 캡슐, 사방성 제형으로서 가공될 수 있다.
적용 및 용도
마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신경발달 결핍을 앓고 있거나, 취약하거나, 또는 앓은 적이 있는 대상체에서 신경발달 결핍을 방지, 지연 또는 치료하거나 또는 신경 발달을 촉진하기 위한 방법이 제공되며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함한다. 한 측면으로, 대상체는 NEC 또는 뇌에 대해 유사한 영향을 나타내는 다른 병리, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있다.
또한 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 미세아교세포 활성화를 방지, 감소, 또는 지연시키는 방법이 제공되며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함한다. 한 측면으로, 대상체는 NEC 또는 뇌에 대해 유사한 영향을 나타내는 다른 병리, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있다. 한 측면으로, 미세아교세포의 세포체 두께는 대조군 대상체에 비해 치료 대상체에서 감소된다. 또 다른 측면으로, 미세아교세포의 수지상 돌기는 대조군 대상체에 비해 대상체에서 얇아진다.
추가로 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)의 발현을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함한다. 한 측면으로, 대상체는 NEC 또는 뇌에 대해 유사한 영향을 나타내는 다른 병리, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있다.
상기 방법에서, 증가는 대조군 대상체에 관련한 것이다. 한 측면으로, BDNF의 증가된 발현은 대상체의 해마에서 일어난다.
추가로 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Grin2A의 발현을 증가시키는 방법이 제공되며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함한다. 한 측면으로, 대상체는 NEC 또는 뇌에 대해 유사한 영향을 나타내는 다른 병리, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있다. 한 측면으로, 증가는 대조군 대상체에 관련한 것이다. 또 다른 측면으로, Grin2A의 증가된 발현은 치료 대상체의 전전두엽 피질에서 일어난다.
본 개시의 방법의 측면에서, 마이크로스피어는 마이크로스피어의 외부 표면 상에 부분적인 또는 완전한 생물막 코팅을 추가로 포함한다. 추가의 측면으로, 박테리움 및/또는 프리바이오틱은 마이크로스피어의 내부로부터 마이크로스피어의 표면으로 확산된다.
일반적으로, 본 개시의 조성물은 치료 용도에서 사용되며, 조성물 및 담체의 구성요소 및 추가 작용제가 명시된 용도를 위해 선택된다.
한 측면으로, 조성물은 항-박테리아 면역의 지지, 위장 장벽의 증강 또는 지지, 또는 질환 관련 박테리아 감염에 대한 길항작용 중 하나 이상을 제공한다. 또 다른 측면으로, 조성물은 병원체 군집화를 방지하거나 및/또는 사이토카인 및 케모카인 생성의 하향 조절에 의해 과도한 염증 반응을 제한한다.
한 측면으로, 조성물은 인간; 유인원, 쥐과, 예컨대, 래트, 마우스, 친칠라, 개과, 예컨대 개, 토끼과, 예컨대 토끼, 가축, 스포츠 동물 및 애완동물과 같은 포유류의 치료에 유용하다.
적응증 및 용도는 환경에 따라 달라진다. 조성물은 질환, 예컨대, 심리적 장애, 예컨대 우울증 또는 불안증, 장 감염 질환, 감염 유도 대장염, 여행자 설사, 염증성 장 질환 (IBD), 대장염, 설사병, 질염, 상처, 화상, 건선, 피부염, 충치, 치주염, 부비동염, 또는 항-박테리아 면역을 지지하기 위한, 위장 장벽을 증강 또는 지지하는, 장내 세균총 이상 (및 질환이 없는 경우에도), 장 기능장애를 포함하는 질환 또는 장애를 교정 또는 지지하는, 위장 장벽을 증강 또는 지지하는, 또는 질환 관련 박테리아 감염에 길항하는, 건강한 박테리아를 대체하는 병원성 박테리아 또는 괴사성 장염 (NEC)에 의해 유발된 임의의 만성 및/또는 재발성 질환; 질염; 대장염 또는 여행자 설사, 복막염, 수술 후 장 폐색, 과민성 장 증후군 (IBS), 장 가성-폐쇄, 및/또는 변비의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 한 측면으로, 치료는 방지를 포함한다.
그러므로, 한 측면으로, 본 개시는 그것을 필요로 하는 대상체에서 생물막에 의해 적합하게 치료된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 본원에서 제공한다. 방법은 대상체에게 특정 치료법을 위해 선택된 구성요소를 가지는 본원에 개시된 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 질환의 비제한적인 예로는 심리적 장애, 예컨대 우울증 또는 불안증, 장 감염 질환, 자폐증, 자폐증 스펙트럼 장애, 감염 유도 대장염, 여행자 설사, 염증성 장 질환 (IBD), 대장염, 설사병, 질염, 상처, 화상, 건선, 피부염, 충치, 치주염, 부비동염, 또는 항-박테리아 면역을 지지하기 위한, 위장 장벽을 증강 또는 지지하는, 장내 세균총 이상 (및 질환이 없는 경우에도), 장 기능장애를 포함하는 질환 또는 장애를 교정 또는 지지하는, 위장 장벽을 증강 또는 지지하는, 또는 질환 관련 박테리아 감염에 길항하는, 건강한 박테리아를 대체하는 병원성 박테리아 또는 괴사성 장염 (NEC)에 의해 유발된 임의의 만성 및/또는 재발성 질환; 질염; 대장염 또는 여행자 설사, 복막염, 수술 후 장 폐색, 과민성 장 증후군 (IBS), 장 가성-폐쇄, 및/또는 변비를 들 수 있다. 추가적으로, 조성물은 건강을 촉진하고 및/또는 장 항상성을 유지하기에 유용하다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 조성물의 용량을 대상체에게 투여하고, 그로써 프로바이오틱을 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는, 프로바이오틱을 전달하는 방법을 제공한다.
조성물의 투여량 및 구성요소는 대셍체 및 치료법의 목적에 따라 달라질 것이다. 한 측면으로, 조성물은 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움을 제공하기 위해 투여된다. 조성물은 예컨대, 투여 형태로, 또는 최종 사용을 위해 유효량, 예컨대, 약 1 x 105 내지 1 x 1011 CFU/ml, 또는 대안으로 약 1 x 105 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 108 CFU/ml의 마이크로스피어 조성물을 제공하기 위해 제형화될 수 있다.
조성물은 약 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간 째에 투여되거나, 또는 단일 용량으로 투여될 수 있다.
조성물은 경구로, 질로, 국소적으로, 흡입에 의해, 정맥내로, 근육내로, 또는 좌제에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 임의의 적합한 제형으로 투여될 수 있다.
조성물의 양 및 구성요소는 치료의 목적에 따라 및 단일 또는 다중 용량으로 달라질 것이다. 한 측면으로, 조성물은 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움을 제공하기 위해 투여된다. 조성물은 예컨대, 투여 형태로, 또는 최종 사용을 위해 유효량, 예컨대, 약 1 x 105 내지 1 x 1011 CFU/ml, 또는 대안으로 약 1 x 105 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 108 CFU/ml의 마이크로스피어 조성물을 제공하기 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 다중 용량으로, 예컨대, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간마다 전달되거나, 또는 단일 용량으로 투여될 수 있다.
본 개시의 방법에서, 투여될 조성물은 담체, 예컨대, 제약학적으로 허용되는 담체 또는 생체 적합성 스캐폴드와 함께 본원에 기술된 하나 또는 복수의 마이크로스피어 조성물을 포함할 수 있다. 제약학적으로 허용되는 담체의 비제한적인 예로는 개시의 조성물에 사용될 수 있는 희석제, 부형제 또는 담체를 들 수 있다.
추가의 측면으로, 마이크로스피어는 마이크로스피어를 부분적으로 또는 완전하게 둘러싸고 있는 생물막 층을 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
한 측면으로, 조성물은 서로 동일하거나 상이한, 예컨대, 동일하거나 상이한 직경, 동일하거나 상이한 마이크로스피어 구성요소, 동일하거나 상이한 프로바이오틱스, 동일하거나 상이한 보완제, 동일하거나 상이한 전생물막, 동일하거나 상이한 생물막 층, 및 중공 및/또는 고체 코어를 가진 복수의 마이크로스피어를 포함한다.
조성물은 예컨대, 생물막-생성 프로바이오틱 박테리움의 투여 형태로, 또는 최종 사용을 위해 유효량, 예컨대, 약 1 x 105 내지 1 x 1011 CFU/ml, 또는 대안으로 약 1 x 105 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 108 CFU/ml의 마이크로스피어 조성물을 제공하기 위해 제형화될 수 있다.
의학적, 영양학적 또는 치료적 용도
본 개시는 영양학적 또는 의학적 용도를 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어지며, 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 조성물은 전생물막, 생물막 층, 치료 약물 또는 치료제를 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 마이크로스피어는 고체 코어, 중공 코어를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 한 측면으로, 마이크로스피어는 프리바이오틱을 중공 코어 내에 캡슐화한다.
한 측면으로, 마이크로스피어는: 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 또는 금속의 군으로부터 선택된 물질을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 여기서 마이크로스피어의 직경은 약 0.5 마이크론 내지 약 1000 마이크론, 또는 대안으로 약 0.5 마이크론 내지 약 100 마이크론, 또는 대안으로 100 마이크론 미만이다.
의학적 용도를 위한 생분해성 중합체의 비제한적인 예는 덱스트란, 덱스트라노머, 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리카프로락톤 또는 PLC, 키토산, 젤라틴, DNA 수소, 아세탈화된 덱스트란, 폴리(락타이드), 폴리(글리콜라이드), 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체, 폴리(오르토에스테르), 폴리(포스파젠), 폴리(하이드록시부티레이트), 폴리(하이드록시부티레이트), 폴리(락타이드-코-카프로락톤), 폴리카보네이트, 폴리에스테라미드; 다가 무수물, 폴리(다이옥사논), 폴리(알킬렌 알킬레이트), 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체, 폴리우레탄, 폴리(아미노산), 폴리에테르에스테르, 폴리아세탈, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체, 세파덱스® 공중합체 및/또는 그것들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된다.
의학적 용도를 위한 비-생분해성 중합체의 비제한적인 예는 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리(비닐 아세테이트), 실리콘 중합체, 폴리우레탄, 셀룰로스 중합체 및 셀룰로스 유도체와 같은 다당류, 아실 치환된 셀룰로스 아세테이트 및 그것의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜)과 폴리(부틸렌 테레프탈레이트)의 공중합체, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설폰화된 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 그것들의 공중합체 및 혼합물 중 하나 이상으로부터 선택된다.
금속의 비제한적인 예로는 코발트, 크롬, 금, 니켈, 백금, 스테인레스 강, 티타늄, 탄탈룸, 니켈-티타늄, 합금, 및 그것들의 조합을 들 수 있다.
의학적 용도를 위한 조성물의 프리바이오틱의 비제한적인 예는 수용성 탄수화물, 이눌린, 올리고프룩토스, 프룩토-올리고당, 갈락토-올리고당, 글루코스, 말토스, 말토덱스트린, 폴리덱스트로스, 수크로스, 프룩토스, 락토스, 이소말툴로스, 폴리올, 글리세롤, 티아민, 콜린, 히스티딘, 및 그것들의 조합 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다.
프로바이오틱 박테리움의 비제한적인 예는 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 델브루에키 그룹, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부흐네리, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 안굴라티온, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레비, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 스트렙토코커스 써모필레스, 및 그것들의 조합 중 하나 이상이다.
전생물막의 비제한적인 예는 생물막 형성 및 내구성을 지지하는 작용제를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 그러한 것의 비제한적인 예로는 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그것의 각각의 동등물, 선택적으로, 첨부된 서열 목록 중 하나 이상, 또는 그것들의 각각의 생물학적 활성 단편 또는 동등물을 단독으로 또는 조합하여 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 폴리펩타이드를 들 수 있다.
마이크로스피어 및 마이크로스피어를 함유하는 조성물은 추가로 작용제일 수 있고, 작용제는 프로바이오틱 유기체와 경쟁할 수 있는 병원체에 대해 선택적이다. 보완제는 마이크로스피어를 함유하는 조성물에서 마이크로스피어의 코어에, 또는 표면 상에 있을 수 있다.
추가의 측면으로, 마이크로스피어는 마이크로스피어를 부분적으로 또는 완전하게 둘러싸는 생물막 층을 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
의학적 용도를 위한 조성물은 담체, 예컨대, 제약학적으로 허용되는 담체 또는 생체 적합성 스캐폴드와 함께 본원에 기술된 하나 또는 복수의 마이크로스피어 조성물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 조성물로서 제공될 수 있다.
한 측면으로, 조성물은 서로 동일하거나 상이한, 예컨대, 동일하거나 상이한 직경, 동일하거나 상이한 마이크로스피어 구성요소, 동일하거나 상이한 생물막 층, 동일하거나 상이한 프로바이오틱스, 동일하거나 상이한 보완제s, 동일하거나 상이한 전생물막, 및 중공 및/또는 고체 코어를 가지는 복수의 마이크로스피어를 포함한다.
조성물은 예컨대, 생물막-생성 프로바이오틱 박테리움의 투여 형태로, 또는 최종 사용을 위해 유효량, 예컨대, 약 1 x 105 내지 1 x 1011 CFU/ml, 또는 대안으로 약 1 x 105 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU/ml, 또는 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml, 또는 약 1 x 108 CFU/ml의 마이크로스피어 조성물을 제공하기 위해 제형화될 수 있다.
조성물은 용이한 투여, 보관 및 적용을 위해 제형화되거나 가공될 수 있는데, 예컨대, 냉동되거나, 동결건조되거나, 현탁되거나 (현탁 제형) 또는 분말화될 수 있고; 좌제, 정제, 용액, 현탁액, 환, 캡슐, 사방성 제형으로서 가공될 수 있다.
조성물은 인간, 유인원, 쥐과, 예컨대, 래트, 마우스, 친칠라, 개과, 예컨대 개, 토끼과, 예컨대 토끼, 가축, 스포츠 동물 및 애완동물과 같은 포유류의 치료에 유용하다.
조성물은 질환, 예컨대, 심리적 장애, 예컨대 우울증 또는 불안증, 장 감염 질환, 감염 유도 대장염, 여행자 설사, 염증성 장 질환 (IBD), 대장염, 설사병, 질염, 상처, 화상, 건선, 피부염, 충치, 치주염, 부비동염, 또는 항-박테리아 면역을 지지하기 위한, 위장 장벽을 증강 또는 지지하는, 장내 세균총 이상 (및 질환이 없는 경우에도), 장 기능장애를 포함하는 질환 또는 장애를 교정 또는 지지하는, 위장 장벽을 증강 또는 지지하는, 또는 질환 관련 박테리아 감염에 길항하는, 건강한 박테리아를 대체하는 병원성 박테리아 또는 괴사성 장염 (NEC)에 의해 유발된 임의의 만성 및/또는 재발성 질환; 질염; 대장염 또는 여행자 설사, 복막염, 수술 후 장 폐색, 과민성 장 증후군 (IBS), 장 가성-폐쇄, 및/또는 변비의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
그러므로, 한 측면으로, 본 개시는 그것을 필요로 하는 대상체에서 건강한 박테리아 및/또는 생물막에 의해 적합하게 치료된 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 방법은 특정 치료법을 위해 선택된 구성요소를 가지는, 본원에 개시된 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 질환의 비제한적인 예로는 상기 확인된 (및 본원에 참조로 포함된) 것들을 들 수 있고 심리적 장애, 예컨대 우울증 또는 불안증, 장 감염 질환, 감염 유도 대장염, 여행자 설사, 염증성 장 질환 (IBD), 대장염, 설사병, 질염, 상처, 화상, 건선, 피부염, 충치, 치주염, 부비동염, 또는 항-박테리아 면역을 지지하기 위한, 위장 장벽을 증강 또는 지지하는, 또는 질환 관련 박테리아 감염에 길항하는, 건강한 박테리아를 대체하는 병원성 박테리아 또는 괴사성 장염 (NEC)에 의해 유발된 임의의 만성 및/또는 재발성 질환; 질염; 대장염 또는 여행자 설사, 복막염, 수술 후 장 폐색, 과민성 장 증후군, 장 가성-폐쇄, 변비 중 하나 이상을 들 수 있다.
그러므로, 본 개시는 그것을 필요로 하는 대상체, 예컨대, 본원에 개시된 질환 또는 상태를 앓고 있는 대상체에게, 본원에 개시된 적절한 또는 질환 관련 또는 건강 촉직 조성물의 유효량을 투여함으로써 프로바이오틱 제형을 전달하는 방법을 제공한다. 조성물은 임의의 적합한 투여 방법에 의해, 예컨대, 경구로, 질로, 흡입에 의해, 주사에 의해, 국소적으로 또는 좌제에 의해 투여된다.
당업자는 질환 증상, 사이토카인 생성의 감소에 대해 모니터링함으로써 및/또는 대상체에서 프로바이오틱 배양의 존재를 검정함을써 치료가 성공적인지를 측정할 수 있다.
영양 보충물
개시된 조성물은 또한 일반적인 건강 및 웰빙을 촉진하고 장 건강 및/또는 항상성을 유지하기 위한 영양 보충물로서 유용하다. 그러므로, 한 측면으로, 본 개시는 또한 그것을 필요로 하는 대상체에서 건강을 촉진하고 및/또는 장 항상성을 유지하는 방법을 제공하며, 방법은 대상체에게 본원에 기술된 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지며, 선택적으로 마이크로스피어의 표면은 다공성 및/또는 반투과성이고 프리바이오틱은 확산에 의해 방출되거나 또는 마이크로스피어는 서서히 분해되어 마이크로부터의 누출 및 확산이 유발된다. 기술분야에 숙련된 사람은 장 불편이 감소되었거나 완화되었는지를 측정함으로써, 보다 나은 건강, 뿐만 아니라 장 항상성이 달성되었는지를 측정할 수 있다.
설사병 및 GI-관련 장애
설사병은 년간 대략 약 40억명에게서 발생하며 전세계적으로 2백만 건 이상의 사망을 유발한다. 유아 및 어린 아동에게서 가장 중요한 박테리아성 원인 중에 부착 및 소멸(attaching 및 effacing, A/E) 병원체가 있는데, 이것은 군집화시 염증성 사이토카인의 증가 및 결장 조직에 대한 구조적 변화와 관련된 설사병을 유발한다. 이런 급성 감염은 장 건강에 지속적인 영향을 미칠 수 있고, A/E 병원체로의 감염 및 과도한 염증 반응은 감염 후 과민성 장 증후군의 발생에 대한 알려진 위험 인자이다.
프로바이오틱스는 장내 미생물총을 보호하고 건강한 상태로 복원시키는 자연적인 방법이며 군집화 부위에서 먼 곳의 건강을 촉진하는 것으로 알려져 있다. Mackos et al. (2013) Infection and Immunity 81, No. 9 (3253-3263) 참고. 유감스럽게도, 최적의 조건 하에서도, 프로바이오틱 박테리아는 확립되지 못하거나 충분하게 지속적이지 못하여, 그것의 건강에 좋은 효과의 크기 및 기간을 최소화시킨다. 속도 제한 단계 중 하나는 도입된 박테리아의 지속적인 생물막을 형성하는 용량이다. 박테리아가 플랑크톤 (자유롭게 살아감)과 반대로 이미 생물막 (표면 부착된 군집체) 형태로 있을 때, 그것들은 보다 쉽게 확립되고 지속된다. 프로바이오틱 박테리아의 긍정적인 효과는 생물막 상태에 그것을 제공함으로써 향상될 수 있다; 이것은 박테리아를 생체 적합성 및 무독성 마이크로스피어의 표면에서 성장시킴으로써 쉽게 달성될 수 있다. 생체 적합성 마이크로스피어는 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 금속, 또는 그것들의 조합일 수 있다. 이 표면이 마이크로스피어의 형태로 있을 때, 프로바이오틱 박테리아 생물막의 확립 및 유지를 용이하게 하기 위해 프리바이오틱 및/또는 전생물막 물질이 운반물로서 첨가될 수 있다.
마이크로스피어는 프로바이오틱 박테리아 확립 및 생존을 촉진하는 것을 도울 수 있는 한편 병원성 박테리아 도전을 제한하는 확산성 프리바이오틱 (프로바이오틱 박테리아에 특이적/배타적인 영양 보충물)을 이상적으로 제공하는 데 부가 가치를 가진다. 적어도 프로바이오틱 박테리움 락토바실러스 루테리의 경우, 생물막 상태는 플랑크톤 형태의 동일한 박테리아보다 쥐과 장에서 확립하는 데 유리하다.
나아가, 마우스에 생물막으로서 도입된 락토바실러스 루테리는 플랑크톤 형태의 락토바실러스 루테리보다 장병원성 박테리움인 시트로박터 로덴티움의 발병에 대해 보다 강력하고 지속적인 효과를 가진다. 이들 결과를 토대로, 장내 미생물 불균형에 대해 더 크고 더 지속적인 효과를 제공하여 환자의 순응도에 대한 필요성을 훨씬 줄이면서 장의 병인을 예방하거나 심지어 치료하는 프로바이오틱스의 신규한 제형을 생성하는 3개의 고도로 통합된 예가 개발된다.
생물막 생성 프로바이오틱 박테리움은 생체 적합성 마이크로스피어의 표면에 부착하여 생물막을 생성한다. 생체 적합성 마이크로스피어는 고체 또는 중공 코어를 가진다. 생체 적합성 마이크로스피어가 중공 코어를 가질 때, 그것은 프리바이오틱 및 프로바이오틱 박테리움을 위한 임의의 영양 보충물을 운반물로서 운반할 수 있다. 한 측면으로, 중공 코어를 가진 마이크로스피어의 경우, 스피어 표면은 운반물이 높은 국지적 농도에서 결합된 박테리아로 확산하는 것을 허용하기 위해 반투과성일 수 있거나 또는 그것은 불투과성이지만 서서히 분해하여 내용물이 방출될 수 있게 한다. 프리바이오틱은 중공 코어 내에 캡슐화될 수 있다. 마이크로스피어는 또한 병원체의 성장 또는 증식에 대해 선택적인 약물, 또는 화합물, 또는 작용제를 운반할 수 있다. 생체 적합성 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 및 프리바이오틱 외에, 신규한 프로바이오틱 제형이 또한 생물막 형성 및 내구성을 지지하는 물질인 전생물막을 함유할 수 있고, 구체적으로, 전생물막은 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질, 그것들의 각각의 단편 및/또는 동등물이다. 그러한 것의 비제한적인 예는 첨부된 서열 목록에서 제공된다. 하나 이상의 약물, 화합물 또는 작용제뿐만 아니라 하나 이상의 전생물막이 단일 마이크로스피어 내에 있을 수 있다.
프리바이오틱은 생물막 생성 박테리아를 포함한, 임의의 프로바이오틱 박테리아의 성장을 지지할 수 있다. 프리바이오틱은 일반적으로 수용성 탄수화물, 예컨대, 이눌린, 올리고프룩토스, 프룩토-올리고당, 갈락토-올리고당, 글루코스, 말토스, 말토덱스트린, 폴리덱스트로스, 수크로스, 프룩토스, 락토스, 이소말툴로스, 폴리올, 및 글리세롤 중 하나 이상이다. 다양한 프리바이오틱스의 조합이 프로바이오틱스의 성장을 지지하기 위해 사용될 수 있다.
프로바이오틱스는 건상상의 유익을 가진 임의의 유형의 미생물이다. 프로바이오틱스는 또한 일반적으로, 예컨대 요구르트, 콩 요구르트에서, 또는 다이어트 보충물로서 특수하게 첨가된 활성 생 배양물이 포함된 발효 식품의 일부로서 소비된다. 프로바이오틱스는 또한 좌제로서도 취해질 수 있다. 프로바이오틱스의 일부 제한적인 예는 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 델브루에키 그룹, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부흐네리, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 안굴라티온, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레비, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 및 스트렙토코커스 써모필레스이다. 한 측면으로, 프로바이오틱은 GTF 단백질을 발현하는 락토바실러스 루테리이다. 락토바실러스 루테리의 모든 스트레인은, 비록 스트레인간에 다를 수는 있지만 적어도 하나의 GTF 단백질을 가지며, 예컨대, DSM20016에서, GTF는 GTFW이고 말토스를 그것의 단독 기질로서 사용하는 한편, DSM 17938에서 GTF는 GTFA이고, 그것은 그것의 단독 기질로서 수크로스를 사용한다.
프로바이오틱스는 병원체 군집화를 방지하고 및/또는 과도한 염증 반응을 제한함으로써 항-박테리아 면역을 지지한다. 이론에 얽매이지 않지만, 프로바이오틱스는 사이토카인 및 케모카인 생성을 하향 조절한다.
생체 적합성 마이크로스피어는 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 금속, 또는 그것들의 혼합물 중 하나 이상일 수 있다. 생분해성 중합체는, 한정하는 것은 아니지만: 덱스트란; 덱스트라노머; 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA; 폴리카프로락톤 또는 PLC; 키토산; 젤라틴; DNA 수소; 아세탈화된 덱스트란; 폴리(락타이드); 폴리(글리콜라이드); 폴리(락타이드-코-글리콜라이드); 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(카프로락톤); 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(오르토에스테르); 폴리(포스파젠); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트; 폴리에스테라미드; 다가 무수물; 폴리(다이옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체; 폴리우레탄; 폴리(아미노산); 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 세파덱스® 공중합체 (에피클로롤하이드린과 가교된 덱스트란으로부터 만들어짐, Sigma-Aldrich 사로부터 입수 가능하고 Koo and Wankat (1988) Korean Biochem. J. 21(1)에서 언급됨) 및/또는 그것들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 비-생분해성 중합체는, 한정하는 것은 아니지만, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리(비닐 아세테이트), 실리콘 중합체, 폴리우레탄, 셀룰로스 중합체 및 셀룰로스 유도체와 같은 다당류, 아실 치환된 셀룰로스 아세테이트 및 그것의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜)과 폴리(부틸렌 테레프탈레이트)의 공중합체, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설폰화된 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 그것들의 공중합체 및 혼합물로부터 선택될 수 있다. 금속은, 한정하는 것은 아니지만, 코발트, 크롬, 금, 니켈, 백금, 스테인레스 강, 티타늄, 탄탈룸, 니켈-티타늄, 및 합금 및 그것들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
프로바이오틱 생물막의 내구력과 견고함을 촉진하기 위해 선택되는 마이크로스피어가 확인되고 특성화된다. 생분해성 (및 FDA 승인된) 표면, 폴리 (락트산-코-글리콜산) (PLGA) 상에 형성된 프로바이오틱 생물막은 상피 장벽을 통해 위치를 변경하는 병원체를 방지하는 데 월등한 것으로 나타났다. 생물막을 성장시키기 위해 표면을 생성하는 데 사용될 수 있는 다른 FDA 승인 또는 일반적으로 안전한 것으로 간주되는 (GRAS) 물질이 또한 조사된다. 동물 모델에서 생물학적 유효성 및 내구성 및 베이스 기준으로서 유통 기한을 사용하는 결과가 우선시된다. 마지막으로, 프로바이오틱 생물막의 도입 및 유지의 유효성을 추가로 개선하기 위하여, 마이크로스피어 내의 확산성 운반물에 의해 프리바이오틱 물질이 프로바이오틱 생물막 표면에 제공된다.
추가의 측면으로, 마이크로스피어는 생물막 층에 의해 부분적으로 또는 전체적으로 코팅된다. 층은 깊이가 약 0.5 마이크론 내지 약 1 밀리미터일 수 있고, 예컨대, 약 1 마이크론 내지 약 500 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 250 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 200 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 1 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 2 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 40 마이크론, 약 3 마이크론 내지 약 30 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 100 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 50 마이크론, 약 5 마이크론 내지 약 40 마이크론, 및 약 5 마이크론 내지 약 30 마이크론의 범위이다.
설사 및 기타 GI-관련 장애의 치료를 위한 조성물
본 개시는 생체 적합성 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 조성물을 제공하며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움의 배양 및/또는 성장을 위한 영양 식품원 또는 보충물을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 조성물은 전생물막을 추가로 포함할 수 있다. 전생물막은 생물막 형성 및 내구성을 지지하는 물질을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 구체적으로; 전생물막은 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다. 한 측면으로, 조성물은 냉동되는데, 예를 들어 급속 냉동된다. 또 다른 측면으로, 조성물은 동결건조되거나 분말 형태로 건조된다. 추가의 측면으로, 그것은 투여를 위해 좌제로서 또는 섭취 가능한 형태 (예컨대, 정제)로 제형화된다. 조성물은 상기 주지된 마이크로스피어의 혼합물, 예컨대, 둘 이상의 프로바이오틱 박테리움 및/또는 둘 이상의 전생물막 및/또는 프로바이오틱 박테리움의 배양 및/또는 성장을 지지하기 위한 둘 이상의 영양소 및/또는 보충물을 함유하는 혼합물을 추가로 포함할 수 있따.
일부 구체예에서, 프리바이오틱은, 한정하는 것은 아니지만, 이눌린, 올리고프룩토스, 프룩토-올리고당, 갈락토-올리고당, 글루코스, 말토스, 말토덱스트린, 폴리덱스트로스, 수크로스, 프룩토스, 락토스, 이소말툴로스, 폴리올, 글리세롤, 및 그것들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된 수용성 탄수화물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 조성물은 고체 또는 액체 담체, 예컨대 제약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
기술분야에 숙련된 사람들에게 분명한 것과 같이, 프리바이오틱 및 전생물막은 프로바이오틱 박테리움의 성장을 구체적으로 지지하기 위하여 각각의 조성물에서 선택된다. 단지 예를 들면, 프로바이오틱 박테리움이 락토바실러스 루테리를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 경우, 조성물은 대상체 ㄸ는 환자에게 투여될 때 프로바이오틱의 성장 및 유지를 지지하기 위하여 유효량의 수크로스, 글리세롤 및 선택적으로 HU 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다. 전생물막 조성물의 비제한적인 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 첨부된 서열 목록에 제공된 하나 이상의 폴리펩타이드, 그것의 c-말단 단편, 또는 그것의 n-말단 단편, 또는 그것들의 추가의 스트레인 및 폴리펩타이드 및 단편, 예컨대 표 5에 제공된 것들의 전장 또는 c-말단 단편 또는 n-말단 단편, 및 그것들의 각각의 동등물을 들 수 있다. 다른 프로바이오틱 박테리움의 지지를 위한 추가 영양 보충물은 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9th Ed, Ed. Holt et al.,Williams Wilkins (1994)에서 개시된다.
조성물에 사용하기 위한 프로바이오틱 박테리움의 비제한적인 예로는, 제한 없이, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 델브루에키 그룹, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부흐네리, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 안굴라티온, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레비, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 스트렙토코커스 써모필레스, 또는 그것들의 조합 중 하나 이상을 들 수 있다. 기술분야에 숙련된 사람들에게 분명한 것과 같이, 하나 이상의 박테리움이 단일 조성물에서 조합될 수 있다. 일부 구체예에서, 프로바이오틱 박테리움은 추가의 측면에서 GTF 단백질을 발현하는 락토바실러스 루테리이다. 다른 측면으로 그것은 GTFA 단백질을 발현한다. 박테리아는 상업적 공급처, 예컨대 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC)으로부터 입수 가능하다. 한 측면으로, 조성물 중의 하나 이상의 프로바이오틱 박테리움은 항-박테리아 면역을 지지한다. 다른 측면으로, 조성물 중의 하나 이상의 프로바이오틱 박테리움은 병원체 군집화를 방지하거나 및/또는 사이토카인 및 케모카인 생성을 하향 조절함으로써 과도한 염증 반응을 제한한다. 일부 구체예에서, 조성물은 작용제를 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 작용제는 병원체, 예컨대 경쟁하는 병원체에 대해 선택적이다.
생체 적합성 마이크로스피어는 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 금속, 또는 그것들의 조합 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 고체 코어를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 마이크로스피어는 중공 코어를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 프리바이오틱은 마이크로스피어의 중공 코어 내에 캡슐화되고 마이크로스피어의 반투과성 성질로 인해 또는 마이크로스피어의 점차적인 분해를 통해 바로 부착된 프로바이오틱으로 고농도로 방출될 수 있다.
한 측면으로, 개시는 PGLA-생체 적합성 마이크로스피어, 하나 이상의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움, 및 프로바이오틱 박테리움의 성장을 지지하는 양으로 수크로스 또는 글리세롤 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 영양 보충물을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것들로 이루어지는, 또는 또한 추가로 그것들로 이루어지는 조성물을 개시한다. 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움은 선택적으로 GTF 단백질을 발현할 수 있는 락토바실러스 루테리 ("L. reuteri")를 포함할 수 있다. 조성물은 유효량의 IHF 또는 HU 폴리펩타이드 또는 단백질을 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어질 수 있다. 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 또는 생체 적합성 스캐폴드를 추가로 포함할 수 있고 선택적으로 좌제로서 제형화된다.
마이크로스피어의 크기는 약 0.5 마이크론 내지 약 100 마이크론의 범위일 수 있다. 특정 구체예에서, 마이크로스피어는 직경이 약 100 마이크론 미만이다. 다른 구체예에서, 마이크로스피어는 직경이 약 50 마이크론 미만, 또는 약 40 마이크론 미만, 또는 약 30 마이크론 미만, 약 20 마이크론 미만, 약 10 마이크론 미만, 또는 약 5 마이크론 미만, 또는 3 마이크론 미만 내지 0.5 마이크론이다. 추가의 구체예에서, 마이크로스피어는 직경이 약 0.5 마이크론 내지 약 90 마이크론, 또는 내지 약 80 마이크론, 또는 내지 약 70 마이크론, 또는 내지 약 60 마이크론, 또는 내지 약 50 마이크론, 또는 내지 약 40 마이크론, 또는 내지 약 30 마이크론, 또는 내지 약 20 마이크론, 또는 약 10 마이크론, 또는 약 5 마이크론, 또는 약 3 마이크론, 또는 약 2 마이크론, 또는 약 1 마이크론이다. 대안으로, 직경은 약 1 내지 약 100, 또는 대안으로 약 1 내지 약 75, 또는 대안으로 약 1 내지 약 50, 또는 대안으로 약 1 내지 약 25, 또는 대안으로 약 1 내지 약 15, 또는 대안으로 약 1 내지 약 10 마이크론 직경이다.
일부 구체예에서, 마이크로스피어는 생분해성 중합체이며, 그것의 비제한적인 예로는: 덱스트란, 덱스트라노머; 폴리(락트산-코-글리콜산)("PLGA"); 폴리카프로락톤 ("PLC"); 키토산; 젤라틴; DNA 수소; 아세탈화된 덱스트란; 폴리(락타이드); 폴리(글리콜라이드); 폴리(락타이드-코-글리콜라이드); 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(카프로락톤); 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(오르토에스테르); 폴리(포스파젠); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트; 폴리에스테라미드; 다가 무수물; 폴리(다이옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체; 폴리우레탄; 폴리(아미노산); 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 및 그것들의 조합을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 생분해성 중합체는 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA이다.
일부 구체예에서, 마이크로스피어는 비-생분해성 중합체를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 비-생분해성 중합체의 비제한적인 예로는, 제한 없이, 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리(비닐 아세테이트), 실리콘 중합체, 폴리우레탄, 셀룰로스 중합체 및 셀룰로스 유도체와 같은 다당류, 아실 치환된 셀룰로스 아세테이트 및 그것의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜)과 폴리(부틸렌 테레프탈레이트)의 공중합체, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설폰화된 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 그것들의 공중합체 및 혼합물 중 하나 이상을 들 수 있다.
일부 구체예에서, 마이크로스피어는 금속을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 금속은, 한정하는 것은 아니지만, 코발트, 크롬, 금, 니켈, 백금, 스테인레스 강, 티타늄, 탄탈룸, 니켁-티타늄, 및 합금 및 그것들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다.
제약학적 조성물
조성물은 보관 및/또는 운송을 위해 냉동된 조성물, 예컨대, 급속 냉동된, 건조된 또는 동결건조된 것으로 제형화될 수 있다. 더불어, 조성물은 단독으로 또는 담체, 예컨대 제약학적으로 허용되는 담체 또는 생체 적합성 스캐폴드와 함께 투여될 수 있다. 발명의 조성물은 좌제로서, 장으로, 비경구로, 주사에 의해, 예를 들어, 정맥내로, 피하로, 또는 근육내로 관례적으로 투여될 수 있다. 다른 투여 방식에 적합한 추가 제형으로는 경구 제형을 들 수 있다. 경구 제형은 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등과 같은 그러한 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 좌제, 현탁액, 정제, 환, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말의 형태를 취하며 약 10% 내지 약 95%, 바람직하게 약 25% 내지 약 70%의 활성 성분을 함유한다.
전형적으로, 조성물은 투여 제형과 부합하는 방식으로, 및 치료될 질환 또는 상태에 치료적으로 효과적인 그러한 양으로 투여된다. 투여되는 양은 치료될 대상체에 따라 달라진다. 투여될 조성물의 정확한 양은 전문가의 판단에 따라 달라진다. 초기 투여 및 부스터에 대한 적합한 처방이 또한 가변적이지만, 초기 투여에 후속 투여가 이어지는 것이 전형적이다.
많은 경우에, 약, 최대한 약 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 또는 그 이상 동안 조성물의 다중 투여가 바람직할 것이다. 투여는 일반적으로 2일 내지 12주 간격, 보다 일반적으로 1 내지 2주 간격의 범위로 이루어질 것이다. 0.5 내지 5년, 보통 2년 간격의 주기적인 부스터가 면역 체계의 상태를 유지하기에 바람직할 수 있다.
일부 구체예에서, 추가적인 제약학적 조성물이 본원에 기술된 조성물을 지지하거나 증대시키기 위해 대상체에게 투여된다. 본 발명의 상이한 측면은 유효량의 조성무을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 추가적으로, 그러한 조성물은 면역 체계의 변형제와 함께 투여될 수 있다. 그러한 조성물은 일반적으로 제약학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산될 것이다.
구절 "제약학적으로 허용되는" 또는 "약물학적으로 허용되는"은 동물, 또는 인간에게 투여되었을 때 부작용, 알레르기 반응, 또는 다른 유해 반응을 유발하지 않는 분자 실체 및 조성물을 나타낸다. 본원에서 사용되는 바, "제약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 등을 포함한다. 제약학적 활성 물질에 대한 그러한 매질 및 작용제의 사용은 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 종래 매질 또는 작용제가 활성 성분과 부합할 수 없는 경우를 제외하고, 면역원성 및 치료 조성물에서의 그것의 사용이 고려된다.
담체는 용매 또는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리(에틸렌 글리콜), 등), 그것들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 바람직하지 못한 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살, 등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어, 당 또는 염화 나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아르산 알루미늄 및 젤라틴의 조성물에의 사용에 의해 유발될 수 있다.
치료 조성물의 유효량은 의도된 목표를 토대로 결정된다. 용어 "단위 용량" 또는 "투여량"은 대상체에서 사용하기에 적합한 물리적으로 별개의 단위를 나타내며, 각 단위는 그것의 투여, 즉, 적절한 경로 및 처방과 관련하여 상기에서 논의된 바람직한 반응을 생성하기 위해 계산된 미리 정해진 양의 조성물을 함유한다. 치료 횟수 및 단위 용량 둘 다에 따라, 투여될 양은 원하는 결과 및/또는 보호에 따라 달라진다. 조성물의 정확한 양은 또한 전문가의 판단에 따라 달라지며 각 개인에게 고유하다. 용량에 영향을 미치는 인자로는 대상체의 신체적 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도된 치료 목표 (증상의 완화 대비 치유), 및 특정 조성물의 효능, 안정성, 및 독성을 들 수 있다. 제형화시, 용액이 투여 제형과 부합하는 방식으로 및 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 그러한 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여 형태, 예컨대 상기에서 기술된 주사 가능한 용액의 유형으로 쉽게 투여된다.
조성물의 제조 방법
본 개시는 또한 생체 적합성 마이크로스피어를 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱과 혼합하거나, 접촉시키거나 또는 함께 배양하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 본원에 기술된 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 한 측면으로, 방법은 박테리움에 의해 생물막의 형성 및 성장을 지지하는 전생물막을 첨가하거가 혼합시키는 단계를 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 그러한 것의 비제한적 예로는 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 중 하나 이상을 들 수 있다. 추가의 측면으로, 마이크로스피어는 생물막과 접촉되거나 또는 마이크로스피어 표면 상에서 생물막의 성장을 지지하는 배양물에 배치된다. 본원에서 개시된 추가적인 구성요소가 추가로 마이크로스피어 등과 혼합될 수 있다.
결장 및 GI 건강을 위한 치료 방법
설사병은 전세계적으로 이환율 및 사망률의 주된 원인이며, 아동 사망의 대략 15%를 차지한다. 장출혈성 대장균 (EHEC) 및 장병원성 대장균 (EPEC)은 소아 설사의 2가지 주요 박테리아 원인이다. 이들 병원체가 설사병을 유발하는 메커니즘은 아직 완전하게 이해되지 않지만, 병원체가 장 상피를 군집화할 때 시작된다 (Nataro and Kaper (1998) Diarrheagenic Escherichia Coli, Clin Microbiol Rev. 11:142-201).
밀접하게 관련된 병원체, 즉 시트로박터 로덴티움은, 마우스가 EPEC 및 EHEC 둘 다에 대해 비교적 내성이기 때문에, 인간 EPEC 및 EHEC 감염을 모델화하기 위해 광범위하게 사용되는 쥐과 병원체이다. 마우스에서, 시트로박터 로덴티움은 인간에서 EPEC 및 EHEC에 의해 유발된 것과 거의 구별할 수 없는 결장 병리를 초래한다 (Borenshtein, M. et al. (2008) Utility of the Citrobacter rodentium Infection Model in Laboratory Mice, Curr Opin Gastroenterol, 24:32-7; Luperchio and Schauer (2001) Molecular Pathogenesis of Citrobacter rodentium and Transmissible Murine Colonic Hyperplasia, Microbes Infect, 3:333-40; Mundy, T.T. et al. (2005) Citrobacter rodentium of Mice and Man, Cell Microbiol 7:1697-706). 이것은 놀라운 것이 아닐 수 있는데, 왜냐하면 시트로박터 로덴티움이 부착 및 소멸 (A/E) 병변의 발생에 필요한 효과 또는 단백질을 암호화하는 EPEC 및 EHEC에 의해 운반된 장세포 소실 (LEE) 병원성 섬의 유전자좌의 상동체를 갖고 있기 때문이다. 이들 병변에는 결장 과증식, 및 상피 결핍 및 백혈구 침윤에 의해 표시되는 병리적 대장염의 발생이 수반된다 (Luperchio and Schauer (2001) Molecular Pathogenesis of Citrobacter rodentium and Transmissible Murine Colonic Hyperplasia, Microbes Infect. 3:333-40).
장 상피는 장 병원체에 대해 강력한 장벽을 제공한다. 질환을 유발하기 위하여, 장 병원체는 숙주 상피 세포에 부착하거나 침투/침입해야 한다. 그러므로, 상피 세포와의 상호작용이 모든 장 병원체의 경우 병원성의 첫 번째 단계이며, 이 단계는 결장 군집화 및 결과적으로 생성된 병리를 평가함으로써 A/E 병원체의 사용을 통해 연구될 수 있다.
결장에서 A/E 병원체의 군집화는 장 미생물총의 조성에 따라 좌우된다. 결장의 미생물총 내에서 항생물질을 투여함으로써 (Wlodarska, B. et al. (2011) Antibiotic Treatment Alters the Colonic Mucus Layer and Predisposes the Host to Exacerbated Citrobacter rodentium-Induced Colitis, Infect Immun, 79:1536-45) 또는 염증 반응을 유도함으로써 (Lupp, M.L. et al. (2007) Host-Mediated Inflammation Disrupts the Intestinal Microbiota and Promotes the Overgrowth of Enterobacteriaceae, Cell Host Microbe, 2:119-29) 장내 미생물 불균형 (유익한 박테리아의 천연 집단의 파괴)을 유도하는 것은 병원체 군집화를 크게 향상시키는 것으로 나타났다.
결장의 장내 미생물 불균형은 결장 병원체에 대한 염증 반응을 추가로 악화시킬 수 있지만 (Wlodarska, B. et al. (2011) Antibiotic Treatment Alters the Colonic Mucus Layer and Predisposes the Host to Exacerbated Citrobacter rodentium-Induced Colitis, Infect Immun. 79:1536-45), 병원체 감염이 없는 경우에도, 장내 미생물 불균형은, 염증성 장 질환 환자 (Machiels et al. (2013) A Decrease of the Butyrate-Producing Species Roseburia hominis and Faecalibacterium prausnitzii Defines Dysbiosis in Patients with Ulcerative Colitis, Gut, published online first September 10, 2013; Morgan et al. (2012) Dysfunction of the Intestinal Microbiome in Inflammatory Bowel Disease and Treatment, Genome Biol., 13:R79) 또는 과민성 장 증후군 환자 (Carroll et al. (2012) Alterations in Composition and Diversity of the Intestinal Microbiota in Patients with Diarrhea-Predominant Irritable Bowel Syndrome, Neurogastroenterol Motil. 24:521-30, e248; Chassard, M. et al. (2012) Functional Dysbiosis within the Gut Microbiota of Patients with Constipated-Irritable Bowel Syndrome, Aliment Pharmacol Ther. 35:828-38)에서 장내 미생물 불균형의 발견에 의해 입증되는 바와 같이, 유전적으로 취약한 개체에서 염증 반응을 전파할 수 있다.
일부 구체예에서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 기술된 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는, 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 본원에서 사용되는 바, "대상체"는 동물 (예컨대, 쥐과, 소과, 개과, 고양이과, 또는 유인원) 또는 인간을 의도한다. 치료된 질환의 비제한적인 예로는, 한정하는 것은 아니지만 상기 열거된 (및 본원에 참조로 포함된) 질환 및 장애, 예컨대 심리적 장애, 예컨대 우울증 또는 불안증, 장 감염 질환, 감염 유도 대장염, 여행자 설사, 염증성 장 질환 (IBD), 대장염, 설사병, 질염, 상처, 화상, 건선, 피부염, 충치, 치주염, 부비동염, 또는 건강한 박테리아를 대체하는 병원성 박테리아 또는 괴사성 장염 (NEC)에 의해 유발된 임의의 만성 및/또는 재발성 질환을 들 수 있다. 더불어, 조성물은 항-박테리아 면역을 지지하거나, 위장 장벽을 증강 또는 지지하거나, 또는 질환 관련 박테리아 감염을 길항하기 위해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 질환은 질염이다. 일부 구체예에서, 질환은 대장염 또는 여행자 설사이다. 숙련된 전문가에게 분명한 것과 같이, 조성물은 치료될 질환에 대해 특별히 선택된다. 일부 구체예에서, 조성물은 전생물막을 추가로 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 전생물막은 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대, IHF 또는 HU, 그것들의 단편 및/또는 그것들의 각각의 동등물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 조성물은 좌제로서 투여된다.
일부 구체예에서, 방법의 조성물은 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움을 제공하기 위해 투여된다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간 째에 투여된다. 일부 구체예에서, 단일 용량으로 투여된다.
일부 구체예에서, 생체 적합성 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움, 프리바이오틱, 및 전생물막을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 그것들로 이루어지는, 또는 그것들로 이루어지는 상기 기술된 조성물의 용량을 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는, 프로바이오틱을 투여하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법의 조성물은 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움을 제공하기 위해 투여된다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간 째에 투여된다. 일부 구체예에서, 단일 용량으로 투여된다.
키트
또한 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물, 및 그것을 필요로 하는 대상체에서 본원에 기술된 방법에서, 예컨대 신경 발달을 촉진하거나 신경 발단 장애를 치료 또는 방지하기 위해 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함한다.
추가로 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물, 및 대상체에서 BDNF를 증가시키기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함한다.
또한 추가로 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물, 및 대상체에서 Grin2A를 증가시키기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공되며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함한다.
NEC-유도된 신경발달 결핍의 치료를 위한 치료 방법
괴사성 장염 (NEC)은 주로 미숙아에게 영향을 미치는 파괴적인 의학적인 상태이며, 외과적 치료 후 전체 사망률은 30%만큼이나 높고, 출생시 극도로 저체중인 유아의 경우 50%에 가깝다. 현재, 질환에 대해 알려진 치료법이 없다. NEC에도 살아남은 사람들 중에, 절반 이상이 계속해서 어느 정도의 인지 장애 및 신경 발달 결핍을 나타낸다.
괴사성 장염 (NEC)을 앓고 있거나, 취약하거나, 또는 앓은 적이 있는 유아 대상체에서 신경발달 결핍을 예방하거나, 지연시키거나 치료하는 방법이 제공되며, 방법은 대상체에게 본원에 개시된 유효량의 임의의 제약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로 방법은 치료를 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어진다. 또 다른 측면으로, 방법은 예방을 포함하거나, 또는 본질적으로 그것으로 이루어지거나 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 한 측면으로, 투여는 자궁에서 이루어진다. 또 다른 측면으로 그것은 출산 후에 이루어진다. 추가의 측면으로, 투여는 장에서 이루어진다.
일부 구체예에서, 신경발달 결핍은 체력, 협응, 사회적 참여, 바로잡기 메커니즘, 청각 반사 테스트, 호기심, 학습 능력, 작업 기억, 단기 기억, 장기 기억, 시공간 추론, 인지, 사물 인식, 및 세로토닌 중 하나 이상에서의 결핍을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다.
일부 구체예에서, 신경 발달 결핍을 예방하는 것은 결핍의 부분적 예방을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 결핍의 부분적 예방은 동일한 연령 및 종이지만 다음으로부터 선택된 임의의 임상적으로 인정된 테스트 중 하나 이상에서 NEC를 앓고 있지 않은 대조군 대상체의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%로 채점되는 대상체를 포함할 수 있다: 자마르 동력계, 휴대용 동력계, 도수 근력 검사(MMT), 등속성 동력계, 체간 안정성 검사 (TST), 한쪽 고관절 지구력 검사 (UHBE), 회내근 징후, 바레 징후, 롬버그 검사, 란다 반사, 입자 부유, 감각 반사 (바늘로 찌르기, 가벼운 터치, 포지션, 진동, 및 충전기), 반사 (이두근, 삼두근, 상완요골근, 슬개골, 및 발목), 모로 반사, 긴장성 목 반응, 빨기 반사, 손바닥 및 발바닥 잡기 반사, 낙하산 반응, 신체에 대해 목을 바로잡는 반응 (NOB), 신체에 대해 신체를 바로잡는 반응 (BOB), 귀를 여는 청각 반사, 정적 순응도, 외이도의 물리적 부피, 반대측 반사, 동측 반사, 고실 측정, Y-미로, 신규 물체 인식 과제, STPI (상태 특징 성격 목록), 5차원 호기심 척도, 자기 호기심 태도 관심 척도, 호기심 및 탐색 목록-II, 상태 특징 성격 목록 (STPI), 감각 추구 척도의 하위척도 (SSS), 유아 발달의 베일리 척도 (BSID-III) (1-42개월), 조기 학습의 뮬렌 척도 (1-68개월), 유아 지능의 페이건 테스트 (FTII) (출생-12개월), 그리피스의 정신 발달 척도 I (0-2세), 바텔 발달 인벤토리 (BDI) (출생-8세), 및 빈란드 적응 행동 척도 (0-18세).
일부 구체예에서, 신경 발달 결핍을 예방하는 것은 결핍의 하나 이상의 증상을 나타내는 대상체에 대한 완전한 예방 또는 지연된 시간을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 결핍의 완전한 예방은 동일한 연령 및 종이지만 다음으로부터 선택된 임의의 임상적으로 인정된 테스트 중 하나 이상에서 NEC를 앓고 있지 않은 대조군 대상체로 채점되는 대상체를 포함할 수 있다: 자마르 동력계, 휴대용 동력계, 도수 근력 검사(MMT), 등속성 동력계, 체간 안정성 검사 (TST), 한쪽 고관절 지구력 검사 (UHBE), 회내근 징후, 바레 징후, 롬버그 검사, 란다 반사, 입자 부유, 감각 반사 (바늘로 찌르기, 가벼운 터치, 포지션, 진동, 및 충전기), 반사 (이두근, 삼두근, 상완요골근, 슬개골, 및 발목), 모로 반사, 긴장성 목 반응, 빨기 반사, 손바닥 및 발바닥 잡기 반사, 낙하산 반응, 신체에 대해 목을 바로잡는 반응 (NOB), 신체에 대해 신체를 바로잡는 반응 (BOB), 귀를 여는 청각 반사, 정적 순응도, 외이도의 물리적 부피, 반대측 반사, 동측 반사, 고실 측정, Y-미로, 신규 물체 인식 과제, STPI (상태 특징 성격 목록), 5차원 호기심 척도, 자기 호기심 태도 관심 척도, 호기심 및 탐색 목록-II, 상태 특징 성격 목록 (STPI), 감각 추구 척도의 하위척도 (SSS), 유아 발달의 베일리 척도 (BSID-III) (1-42개월), 조기 학습의 뮬렌 척도 (1-68개월), 유아 지능의 페이건 테스트 (FTII) (출생-12개월), 그리피스의 정신 발달 척도 I (0-2세), 바텔 발달 인벤토리 (BDI) (출생-8세), 및 빈란드 적응 행동 척도 (0-18세).
일부 구체예에서, 채점은 제약학적 조성물의 투여 후 0-1개월, 1-6개월, 6-12개월, 12-18개월, 18-24개월, 24개월 내지 3년 째에, 또는 3년 이상이 지난 후에 실시된다.
일부 구체예에서 투여는 장으로, 경구, 코, 혀밑, 볼, 직장, 질, 정맥내, 동맥내, 피내, 복강내, 척수강내, 근육내, 경막외, 뇌내, 뇌실내, 경피, 또는 그것들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 태아가 출생하기 전 (즉, 출산전)에 치료를 필요로 하는 대상체의 태아에 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체를 임신한 모체에게 투여된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 0-1일, 1-6일, 6-12일, 12-18일, 18-24일, 24일 내지 100일, 또는 100일 이상으로부터 선택된 나이의 대상체에게 투여된다.
일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 PGLA 또는 덱스트라노머 생체 적합성 마이크로스피어, 적어도 락토바실러스 루테리 ("L. reuteri")를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 하나 이상의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움, 및 프로바이오틱 박테리움의 성장을 지지하는 양으로 말토스, 수크로스, 글리세롤 또는 히스티딘 중 하나 이상을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지며, 선택적으로 여기서 마이크로스피어는 부분적으로 또는 전체적으로 생물막으로 코팅된다. 일부 구체예에서, 제약학적 조성물은 락토바실러스 루테리 ("L. reuteri")를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 덱스트라노머 생체 적합성 마이크로스피어 및 적어도 말토스 또는 적어도 말토스를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는 영양 보충물을 포함하거나, 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어진다. 일부 측면으로, 마이크로스피어 표면은 부분적으로 또는 완전하게 생물막으로 덮힌다.
일부 구체예에서, 마이크로스피어는 약 0.5 마이크론 내지 75 마이크론 범위의 직경을 가진다.
일부 구체예에서, 유아는 0-1개월, 1-6개월, 6-12개월, 12-18개월, 18-24개월, 24개월 내지 3세, 또는 3세 이상으로부터 선택된 나이이다. 일부 구체예에서, 유아는 인간이다.
일부 구체예에서, 방법의 조성물은 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움을 제공하기 위해 투여된다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간 째에 투여된다. 일부 구체예에서, 단일 용량으로 투여된다.
일부 구체예에서, 생체 적합성 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움, 프리바이오틱, 및 전생물막을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것들로 이루어지거나, 또는 그것들로 이루어지는 상기 기술된 조성물의 용량을 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어지는, 프로바이오틱을 투여하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 방법의 조성물은 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움을 제공하기 위해 투여된다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간 째에 투여된다. 일부 구체예에서, 단일 용량으로 투여된다.
실험예
실시예 1
생물막 상태의 락토바실러스 루테리가 쥐과 장에서의 확립을 위해 플랑크톤 박테리아보다 월등한지를 측정하기 위하여, 락토바실러스 루테리를 플랑크톤 박테리아의 유지를 위해 전형적으로 필요한 위관영양법을 매일 반복하는 대신, 경구 위관영양법을 통해 도입하고 유익한 효과 15, 41을 위해 락토바실러스 루테리의 단일 투여를 제공하였다. 락토바실러스 루테리를 생물막 배양 또는 20-300μm 범위의 직경을 가지는 폴리(락트산-코-글리콜산) 마이크로스피어, 예컨대 PLGA, 또는 다른 FDA 승인되고 생분해성인 마이크로스피어 (락트산 및 글리콜산으로 가수분해됨) 상에서 성장된 생물막에서 성장시켰다 (Beer, et al., (1998) Poly(Lactic-Glycolic) Acid Copolymer Encapsulation of Recombinant Adenovirus Reduces Immunogenicity in Vivo, Gene Ther, 5: 740-6; Kumari, et al., (2010) Biodegradable Polymeric Nanoparticles Based Drug Delivery Systems, Colloids Surf B Biointerfaces, 75:1-18).
플랑크톤 박테리아의 유사한 제제를 제조하되 위관영양법 직전에 PLGA 마이크로스피어 및 전생물막을 첨가하였다. 도 3에서 나타낸 것과 같이, 7일 후 락토바실러스 루테리가 쥐과 결장에서 검출된 마우스의 수는 플랑크톤-성장 세포에 대비하여 생물막으로서 도입되었을 때 증가하였다. PLGA의 존재는 또한 박테리아가 플랑크톤이거나 생물막 상태로 있는지와 관계 없이 존재하지 않는 경우의 조건과 비교하여 락토바실러스 루테리에 대해 양성인 마우스의 수를 증가시켰다; 이것은 락토바실러스 루테리가 이런 간단한 상호작용 (<30분) 중에도 생물막 형성의 서막인 PLGA에 대한 부착을 시작할 수 있음을 나타낼 수 있다. 위에서, 모든 마우스가 락토바실러스 루테리를 유지하는 유일한 조건은 PLGA가 첨가된 생물막-성장 세포였다. 그러므로, PLGA의 존재 하에 생물막에서 락토바실러스 루테리를 성장시키는 것은 플랑크톤-성장 세포와 비교하여 위 및 결장 내에서 군집화 및 지속성을 향상시키는 것이 분명하다.
실시예 2: 시험관내 락토바실러스 루테리 대비 시트로박터 로덴티움
시험관내에서 락토바실러스 루테리가 생물막으로서 또는 플랑크톤 상태로 있을 때 시트로박터 로덴티움과 더 잘 경쟁하는 능력이 있는지를 측정하기 위하여, 경쟁 검정을 개발하였다. 여기서 유리 챔버 슬라이드 (LB 배지, 24시간, 37℃, 5% CO2)에서 시트로박터 로덴티움 생물막을 수행하였다. 그런 후 락토바실러스 루테리 (108 콜로니 형성 단위(CFU))를 처리로서 두 유기체와 부합하는 배지 중에 플랑크톤으로서 또는 3개의 생물막 형태 (생물막, PLGA 생물막, PLGA+HU 생물막; 도 3에서와 같은 제제) 중 하나로 첨가하였다. 16시간 후, 챔버 슬라이드의 생물막 내용물을 제거하고 분취액을 락토바실러스 루테리 (MRS) 및 시트로박터 로덴티움 (LB)에 대해 선택적인 배지 상에 플레이팅하였다. 락토바실러스 루테리 생물막으로 처리된 시트로박터 로덴티움은 미처리와 비교하여, 도입된 락토바실러스 루테리의 상태와 관계없이, CFU/ml에서 2배가 넘는 감소를 보였다 (표 1). 보다 흥미롭게도, 모든 락토바실러스 루테리가 16시간의 도전 동안 증식된 한편, 생물막의 형태로 도입된 락토바실러스 루테리는 플랑크톤 형태로 첨가되었을 때보다 10배를 초과하는 더 많은 CFU를 유발하였다.
Figure pct00001
역 실험으로, 락토바실러스 루테리 생물막을 먼저 도입한 후 플랑크톤 및 생물막 형태의 시트로박터 로덴티움 (108 CFU)으로 처리하였다. 이전 실험과 대조적으로, 락토바실러스 루테리는 시트로박터 로덴티움의 존재와 관계 없이 CFU에서 >10배만큼 증가하여 (조건 간에 <2배의 차이가 있음) 여전히 증식할 수 있었지만, 시트로박터 로덴티움은 16시간 도전 중에 증식하지 못하였고 플랑크톤으로 도입되었을 때 CFU가 실제로 감소하였다. 이들 시험관내 결과는 시트로박터 로덴티움 생물막이 락토바실러스 루테리로 효과적으로 도전될 수 있고 생물막 상태로 도입되었을 때, 락토바실러스 루테리가 플랑크톤 세포보다 더 잘 지속되는 것을 보여준다. 더욱이, 미리 형성된 락토바실러스 루테리 생물막은 확립하기 위한 플랑크톤 시트로박터 로덴티움에 의한 도전에 대해 빈약한 환경을 생성한다.
실시예 3: 생체내 락토바실러스 루테리 대비 시트로박터 로덴티움
생체내에서 락토바실러스 루테리가 생물막으로서 또는 플랑크톤 상태로 있을 때 시트로박터 로덴티움과 더 잘 경쟁하는 능력이 있는지를 측정하기 위하여, 공개된 경쟁 검정 버전을 활용하였다 (Mackos, et al., (2013) Probiotic Lactobacillus reuteri Attenuates the Stressor-Enhanced Severity of Citrobacter Rodentium Infection, Infect Immun, 81:3253-63). 간단히 설명하면, 락토바실러스 루테리를 상기 기술한 것과 같이 경구 위관영양법에 의해 마우스에 도입하였다 (생체 내 락토바실러스 루테리 플랑크톤 대비 생물막). 12시간 후에, 동등한 수의 플랑크톤 시트로박터 로덴티움을 또한 위관영양법에 의해 첨가하였다. 12일 후에, 모든 마우스를 검시를 위해 희생시켰다. 브러시 보더(brush border) 상피의 시트로박터 로덴티움 침투 및 비장으로의 증식이 플랑크톤 락토바실러스 루테리의 매일 용량에 의해 좌절될 수 있음을 보여주는 공개된 작업과 달리 (Mackos, et al., (2013) Probiotic Lactobacillus reuteri Attenuates the Stressor-Enhanced Severity of Citrobacter rodentium Infection, Infect Immun, 81:3253-63), 단일 용량으로 전생물막 처리된 락토바실러스 루테리 생물막에서 비장으로의 시트로박터 로덴티움의 침투에서 통계적으로 유의한 10배 강하가 있었다 (도 4). 이 결과는 생체내에서 더 내구성인 표현형을 가지는 전생물막 처리된 프로바이오틱 생물막의 크기 및 견고함과 일치한다.
실시예 4: 내구성 및 견고성에 대한 프로바이오틱 치료 생물막의 특성화
이 실시예는 생물막 상태의 프로바이오틱스가 플랑크톤으로 성장한 박테리아보다 월등한 제형을 제공하는 강력한 증거를 제공하였다. 또한 투약 빈도를 포함하여 이들 생물막을 제조하는 방법의 한 예를 제공한다. 더불어, 실시예는 생물막 자체의 성질을 조사하여 이런 상태가 플랑크톤 박테리아를 수행하는 이유를 측정하기 시작한다. 마지막으로, 실시예는 인간 숙주에서 실시하기 위한 감소에 대한 서막으로서 제제의 수명을 조사한다. 이것들을 조합하여, 이 실시예는 프로바이오틱 생물막 제제의 조건 및 구성을 확인하고 특성화한다.
실시예 4.1: 성장 단계의 영향
락토바실러스 루테리는 시험관내에서 견고한 생물막을 형성하고 락토바실러스 루테리가 24시간 내에 마우스 장에서 잘 확립되는 것을 볼 수 있었다. 이 실시예는 생물막 확립을 위한 최적 연령을 측정하기 위하여 생물막의 연령을 변화시킨다.
생체내 락토바실러스 루테리 생물막. 락토바실러스 루테리는 표면에 노출되었을 때 거의 즉시 부착하기 시작한다. 6시간 후 볼 수 있고 고전적 생물막 구조를 형성하는 것을 시작하기에 충분한 바이오매스가 생성되었다 (예컨대, 버섯, Abee and Kuipers, (2011) Understanding Microbial Behavior within and Outside the Host to Improve Food Functionality and Safety, Curr Opin Biotechnol, 22:133-5). 락토바실러스 루테리 생물막을 약 6, 12, 18, 24, 36, 48 및 72시간 째에 분리하고, HU 및 소 흉선 DNA가 있는 PGLA 마이크로스피어 상에서 성장시키고 (상기 기술된 것과 같음) CFU에 대해 표준화하고 (108) 위관영양법에 의해 마우스에 도입하였다 (삼중 실험으로부터 시점당 9마리). 각 마우스를 12일 동안 매일 대변 샘플 중의 총 락토바실러스 수준을 카운팅함으로써 평가한다 (MRS 아가 상에서 배양함).
더불어, 이 실시예는 락토바실러스 속 (프라이머 특이성으로의 어려움으로 인해 와이셀라(Weisella), 페디오코커스(Pediococcus), 및 류코노스톡(Leuconostoc)의 일부 종을 포함함)에 대하여 및 특이적으로 락토바실러스 루테리에 대해 16S rRNA 유전사 서열 복사수를 평가하기 위하여 실시간 PCR 방법을 사용한다. 16S rRNA 유전자 복사수는 12일 동안 매일 대변에서뿐만 아니라, 결장, 맹장, 소장 (회장(ileum), 공장(jejunum), 및 십이지장 포함), 및 위 (전위(forestomach) 포함)에서 경구 접종 후 1, 3, 6, 및 12일에 실시간 PCR을 사용하여 측정한다. 플랑크톤 세포가 있거나 없는 모의 마우스(sham mice)가 대조군으로서 작용한다. 모의 또는 플랑크톤-처리된 마우스와 비교하여 생물막-성장 락토바실러스 루테리로 처리된 마우스에서 락토바실러스 루테리 수준의 유의한 증가는 내구성 및 견고성의 지표이다.
실시예 4.2: 성장 조건의 영향
현재까지 한 세트의 성장 조건을 사용하였고, 37℃에서 MRS 배지에서 배양하였다 (Jones, and Versalovic, (2009) Probiotic Lactobacillus reuteri Biofilms Produce Antimicrobial and Anti-Inflammatory Factors, BMC Microbiol, 9:35). 완전한 목록은 아니지만, 여기서 이 실시예는 배지, 전생물막뿐만 아니라 pH 및 호기성을 변화시킨다.
시험관내 다양한 성장 조건. 이 실시예에서, 락토바실러스 루테리가 각각 다양한 정도로 성장하기 때문에 LB, THYE (효모 추출물을 포함한 THB), mTSB (변형된 트립신 소이 브로스)를 포함한 MRS 대신 생물막을 성장시키기 위한 다른 배지를 사용한다. 더불어, 실시예는 또한 락토바실러스 루테리 성장이 보다 산성인 조건 하에서 유리하기 때문에 출발 pH를 약 5.5, 6, 6.5 또는 7로 변화시킨다. 락토바실러스 루테리는 5% CO2 하에서 미세호기성으로 성장할 수 있는 한편, 스트레스가 많은 시간 조건은 생물막 성장이 유리하다 (Flemming, and Wingender, (2010) The Biofilm Matrix, Nat Rev Microbiol, 8:623-33); 여기서 락토바실러스 루테리 생물막은 또한 공기 중에서 또는 산소 부재 하에서 (혐기성 챔버) 성장한다. 마지막으로, 실시예는 HU (약 0.1, 1, 10, 100 μg/ml) 및 소 흉선 DNA (약 0.1, 1, 10, 100 μg/ml)의 전생물막을 변화시킨다. 상기 언급된 생물막을 모두 견고한 성장의 지표로서 높이, 평균 두께 및 바이오매스에 대해 삼중으로 LIVE/DEAD® 염색을 사용한 CSLM에 의해 평가한다.
생체내 다양한 성장 조건. 생물막 성장에 대한 최적의 조건을 초기 표준 조건뿐만 아니라 가장 빈약한 생물막 (대조군)을 생성하는 조건 둘 다에 대해 비교한다. 생물막을 실시예 4.1에서 최적화된 조건 하에 각 실험에 대해 경구 위관영양법에 의해 9마리 마우스 (삼중 실험으로부터의)에 도입한다. 플랑크톤 세포가 DtRJ나없는 모의 마우스는 대조군으로서 작용한다. 락토바실러스 루테리 수준을 실시예 4.1에서와 같이, 도전 후 1, 3, 6, 및 12일 후에 평가한다.
실시예 4.3: 박테리아 투약의 영향
락토바실러스 루테리의 투약; 빈도 및 크기. 투약의 Rhe 빈도 및 또는 크기는 락토바실러스 루테리의 도입의 내구성 및 견고성을 개선시키는 것을 측정한다. 락토바실러스 루테리 생물막을 24시간 동안 HU 및 소 흉선 DNA가 첨가된 PLGA 마이크로스피어 상에서 (또는 실시예 4.1 및 4.2에서 측정된 것과 같은 노화 조건) 성장시킨다. 락토바실러스 루테리 생물막을 용량 (107, 108 및 109 CFU)뿐만 아니라 빈도 (단일 용량, 또는 최대 3일까지 일일 용량)를 변화시키는 매트릭스를 생성하여 9가지 상이한 조건을 생성하는 경구 위관영양법에 의해 마우스에 도입한다. 락토바실러스 루테리 수준을 실시예 4.1에서 개관한 것과 같이 위관영양법 후 1, 3, 6, 및 12일에 생체내에서 평가한다. 각 시점에서 각 조건에 대해 9마리 마우스 (삼중 실험으로부터)를 사용한다. 플랑크톤 세포가 있거나 없는 모의 마우스를 대조군으로서 사용한다.
실시예 4.4: 분산된 생물막 박테리아 테스트
생물막으로부터 분산된 락토바실러스 루테리 테스트. 마우스에서 분산된 박테리아를 그것의 내구성 및 견고성에 대해 조사한다. 락토바실러스 루테리 생물막을 DNABII 과 구성원(family member) (예컨대, 대장균 IHF)에 대한 항혈청에 의해 분산시킬 수 있다. 여기서 이 실시예는 항-IHF 처리로 인하여 방출된 (분산되) 박테리아를 테스트한다. 24시간 동안 챔버 슬라이드에서 성장시킨 락토바실러스 루테리 생물막 (분산을 용이하게 하기 위해 PLGA, HU 또는 DNA가 첨가되지 않음)을 항-IHF로 처리한다. 분산의 피크가 처리 후 약 8 내지 12시간이기 때문에 (Goodman, et al. (2011) Biofilms Can Be Dispersed by Focusing the Immune System on a Common Family of Bacterial Nucleoid-Associated Proteins, Mucosal Immunol, 4:625-37), 항체 처리 후 12시간 후 분산된 락토바실러스 루테리를 함유한 조건부 배지를 사용하여 경구 위관영양법에 의해 마우스에 도입한다. 락토바실러스 루테리 수준을 실시예 4.1에서 개관한 것과 같이 도전 후 1,3, 6, 및 12일에 생체내에서 매일 평가한다. (삼중 실험으로부터) 각 시점에 대해 플랑크톤 박테리아 및 최적화된 생물막 박테리아를 사용하는 대조군 (실시예 4.1 내지 4.3)에 대해 유사한 수를 가진 9마리의 마우스를 사용한다.
생물막은 장에서 프로바이오틱 박테리아의 확립, 지속성 및 지속 기간에 대해 우수한 것으로 나타난다. 플랑크톤 박테리아에 비해 우수한 특징을 가지는 것은 생물막 자체만이 아니라 생물막으로부터 분산된 박테리아이다. 사실상, 생물막은 분산된 박테리아 발생기로서 작용할 것이다. 실제로, 실험실에서 성장한 플랑크톤 박테리아와 비교하여 분산된 박테리아에서 (예컨대 항생물질 민감도에서) 생리적 차이가 관찰되었다.
실시예 4.5: 유통 기한
실시하기 위한 감소 및 사용의 용이함을 위해, 락토바실러스 루테리 제제는 충분히 안정적인 형태로 있을 필요가 있다.
냉동. 락토바실러스 루테리 생물막을 급속 냉동시켰고 CFU 및 최소 억제 농도 또는 MIC가 감소하지 않는 것으로 나타났으며 (>2 mg/ml 암피실린; 플랑크톤 락토바실러스 루테리에 대한 MIC <4 μg/ml), 이것은 락토바실러스 루테리가 그것의 생물막 상태의 적어도 하나의 특성인, 향상된 MIC를 유지하는 것을 시사한다. 글리세롤 (동결 보호제; 실시예 2 참고)이 있거나 없이 -20℃ 내지 -80℃로의 주변 공기 냉동뿐만 아니라 80℃로의 급속 냉동 (신선한 박테리아 현탁액이 들어 있는 보관 튜브를 드라이 아이스-에탄올에 넣음)에 대해 최적화된 락토바실러스 루테리 생물막 (실시예 4.1. 내지 4.3)을 조사한다.
배지를 먼저 제거하고 결과적으로 남아 있는 생물막을 긁어내고 냉동 처리한다. 박테리아를 이들 온도에서 1일, 1주 또는 1개월 동안 보관한 후 주변 실온에서 해동하여 경구 위관영양법에 의해 마우스에 도입하기 위해 사용한다. 삼중 실험으로부터 플랑크톤 박테리아 및 최적화된 생물막 박테리아를 사용하는 대조군 (실시예 4.1 내지 4.3)에 대해 유사한 수를 가진 9마리의 마우스를 사용한다. 각 마우스를 실시예 4.1에서와 같이 평가한다.
건조. 실시예 4.5에서 최적화된 기법을 사용하여 냉동한 후 동결건조를 통해 최적화된 락토바실러스 루테리 생물막 (실시예 4.1 내지 4.3)을 조사한다. 건조된 박테리아를 약 1일, 1주 또는 1개월 동안 실온에서 보관한 후 원래의 생물막 부피의 멸균 증류수로 주변 실온에서 재수화하여 위관영양법에 의해 마우스에 도입하기 위해 사용한다. 삼중 실험으로부터 플랑크톤 박테리아 및 최적화된 생물막 박테리아를 사용하는 대조군 (실시예 4.1 내지 4.3)에 대해 유사한 수를 가진 9마리의 마우스를 사용한다. 각 마우스를 실시예 4.1에서와 같이 평가한다.
마지막으로, 락토바실러스 루테리 스트레인 (ATCC23272)을 이용한다. 락토바실러스 루테리의 추가적인 스트레인 (예컨대 스트레인 100-23, ATCCPTA6475, ATCC55730)을 또한 조사하여 스트레인 차이를 평가한다. 추가 대조군으로서, 상업적으로 입수 가능한 락토바실러스 루테리 스트레인 (Fleet® Pedia-LaxTM 프로바이오틱 YumsTM ~ 100million CFU/정제, 락토바실러스 루테리 Protectis®DSM 17938 및 Gerber® Soothe Colic Drops ~ 10 x 107 CFU/서빙 (5 방울, 약 200 ul), 락토바실러스 루테리 Protectis®DSM 17938)을 조사한다. 이 실시예는 각각의 생성물을 물에 용해시키고 그것을 직접 시트로박터 로덴티움과의 시험관내 경쟁 실험에 사용함으로써 각각의 생성물이 플랑크톤 형태의 락토바실러스 루테리 스트레인보다 더 나은 것이 없는 것으로 나타난 것을 발견하였다.
실시예 5: 프로바이오틱 생물막의 내구성 및 견고성을 용이하게 하기 위한 생분해성 표면 및 프리바이오틱 물질의 식별 및 특성화
프로바이오틱 성장을 용이하게 하거나 병원체를 억제하는 다른 유형의 마이크로스피어뿐만 아니라 고유한 운반물을 탐색한다.
실시예 5.1: 빈 마이크로스피어 테스트
시험관내 빈 마이크로스피어, DNA, 젤라틴, 폴리락트산, 폴리-α-카프로락톤, 키토산 및 아세탈화된 덱스트란을 이 실시예에서 조사한다.
PLGA 마이크로스피어를 생물막을 성장시키기 위한 표면으로서 활용하지만, 목표에 유리한 것으로 증명될 수 있는 다른 FDA 승인 또는 GRAS 생분해성 마이크로스피어도 있다. 표 2에서 나타낸 것과 같이, 5개의 추가 유형의 마이크로스피어를 조사한다 (Chellat, F. et al. (2000) In vitro and in Vivo Biocompatibility of Chitosan-Xanthan Polyionic Complex, J Biomed Mater Res., 51:107-16; Costa, D. et al. (2012) Swelling Behavior of a New Biocompatibility Plasmid DNA Hydrogel, Colloids Surf B Biointerfaces 92:106-12; Kauffman et al. (2012) Synthesis and Characterization of Acetalated Dextran Polymer and Microparticles with Ethanol as a Degradation Product, ACS Appl Mater Interfaces, 4:4149-55; Kumari et al. (2010) Biodegradable Polymeric Nanoparticles Based Drug Delivery Systems, Colloids Surf B Biointerfaces, 75:1-18; Sinha et al. (2004) Poly-Epsilon-Caprolactone Microspheres and Nanospheres: An Overview, Int J Pharm. 278:1-23; Topuz and Okay (2009) Formation of Hydrogels by Simultaneous Denaturation and Cross-Linking of DNA, Biomacromolecules 10:2652-61). 그러므로, DNA는 그것이 생물막에 대한 EPS의 기초이기 때문에 마이크로스피어 물질로서 사용할 수 있다.
이것은 실시예 4로부터 시험관내 및 생체내 최적화 전략의 예이다. 표 2 및 반복 실시예 4.1-4.5의 물질로부터 마이크로스피어를 구성한다. 초기 메트릭스로서, 높이, 두께 및 바이오매스를 사용하여 시험관내 견고한 생물막 성장을 지지하지 못한 마이크로스피어를 더 이상 고려하지 않는다. 마찬가지로 후속적으로 플랑크톤 박테리아에 비해 생체내에서 메트릭스를 뛰어넘지 못하는 그런 마이크로스피어 유형도 더 이상 고려하지 않는다. 박테리아가 있거나 없을 때의 유통 기한, 낮은 pH (위 조건)에서의 안정성을 또한 고려한다.
Figure pct00002
a. Kumari A, 2010, Colloid Surface B, 상기 동일.
b. Beer SJ, 1998, Gene Ther ., 상기 동일.
c. Sinha VR, 2004, Int J Pharm., 상기 동일.
d. Chellat F, 2000, J Biomed Mater Res., 상기 동일.
e. Costa D, 2012, Colloid Surface B., 상기 동일.
f. Topuz F, 2009, Biomacromolecules., 상기 동일.
g. Kauffman KJ, 2012, App Mater Interfac., 상기 동일.
실시예 5.2: 프로바이오틱스를 운반물로서 선호하는 프리바이오틱 영양소 및 첨가물 테스트
PLGA의 운반물은 마이크로스피어 가수분해의 속도에 비해 느리게 확산하거나 전혀 확산하지 않는다 (Fredenberg, et al. (2011) The Mechanisms of Drug Release in Poly(Lactic-Co-Glycolic Acid)-Based Drug Delivery Systems--a Review, Int J Pharm, 415:34-52). 여기서 프리바이오틱 운반물을 가진 마이크로스피어를 합성하였고 마우스 모델에서 시험관내 및 생체내에서 락토바실러스 루테리 성장을 지지하는 능력에 대해 평가하였다.
이것은 시험관내에서 영양소를 조사한다. 초기 테스트로서 운반물을 (마이크로스피어의 내부에 캡슐화하기 위해) PLGA 마이크로스피어 안에 그것의 합성 중에 로딩한다. 이들 운반물로는, 한정하는 것은 아니지만, 이눌린, 프룩토-올리고당류, 및 갈락토-올리고당류를 들 수 있는데, 그것들이 락토바실러스 성장을 지지하기 때문이다. 더불어, 마이크로스피어 with MRS 배지 및/또는 글리세롤이 있는 마이크로스피어를 만들었는데, 전자는 일부가 병원체인 그람-음성 박테리아에 대해 제한적이고 후자는 류테린 생성 (락토바실러스 루테리가 결쟁하는 박테리아에 대해 이점을 제공하는 것으로 여겨지는 항미생물 분자)을 자극하기 때문이다. 이들 마이크로스피어 상에서 락토바실러스 루테리 생물막 성장을 실시예 4 (또는 변이된 마이크로스피어를 사용하는 실시예 5.1)에서 관찰된 조건에 대해 수행하고 높이, 두께 및 바이오매스에 대해 CSLM에 의해 판정한다.
이 실시예는 시험관내에서 전생물막을 테스트한다. 실시예 4.2에서와 같이, 시험관내 생물막 성장을 지지하는 PLGA 마이크로스피어 (및 실시예 5.1로부터의 마이크로스피어 유형)에서의 운반물로서의 전생물막 (HU 및 DNA)의 능력을 조사하였다. 각각의 경우에, 생물막을 HU 및/또는 DNA의 존재 하에 합성된 마이크로스피어를 사용하여 실시예 4에서 관찰된 조건 하에서 성장시키고 (마이크로스피어의 내부에 캡슐화하기 위함) 높이, 두께 및 바이오매스에 대해 CSLM에 의해 판정한다.
이 실시예는 시험관내에서 프리바이오틱스와 전생물막의 조합을 테스트한다. 여기서 2개의 프로바이오틱 및 2개의 전생물막 운반물의 조합의 매트릭스를 생성하여 (2개의 조합 전부 16개, 3개의 조합 전부 4개, 및 4개 전부의 단일 조합, 총 21개의 조합) 적합한 프리바이오틱스 또는 전생물막을 찾는다. 각각의 경우에, 생물막을 운반물의 존재 하에 합성된 PLGA 마이크로스피어 (및 실시예 5.1로부터의 마이크로스피어 유형)를 사용하여 실시예 1에서 관찰된 조건 하에서 성장시키고 높이, 두께 및 바이오매스에 대해 CSLM에 의해 판정한다.
이 실시예는 생체내에서 최적화된 구성요소를 테스트한다. 생물막을 생성한 실시예 5.2로부터의 조건을 생체내 실험에 사용한다. PLGA 마이크로스피어 운반물에 대해 4개의 가장 유망한 조건 (또는 2개의 가장 유망한 PLGA 및 실시예 5.1로부터의 2개의 가장 유망한 다른 유형의 마이크로스피어)을 삼중 실험으로부터 각각 유래된 9마리 마우스에 대해 테스트한다. 각각의 마우스를 락토바실러스 루테리 도입 후 1, 3, 6, 및 12일에 실시예 4.1에서와 같이 평가한다. 모의 마우스 (박테리아 없음) 및 플랑크톤 박테리아가 대조군으로서 작용한다.
실시예 5.3: 병원체를 방해하는 프리바이오틱 영양소
다양한 프로바이오틱 운반물을 함유한 마이크로스피어를, 그것이 병원체 생물막 성장을 지지하는지를 측정하기 위하여 조사한다. 전생물막을 함유한 마이크로스피어를 병원체 (즉, 시트로박터 로덴티움 스트레인 DBS120 (pCRP1::Tn5))뿐만 아니라 프로바이오틱과 접촉시킨다.
이 실시예는 시험관내에서 병원체 방해 영양소를 테스트한다. 실시예 5.2로부터의 동일한 프리바이오틱 및 전생물막 물질을 운반물로서 사용하여 시험관내에서 생물막을 성장시킨다. 시트로박터 로덴티움을 LB 배지에서 성장시켜서 PLGA 및 상기 언급한 운반물을 가진 생물막을 시딩하기 위해 사용한다. 생물을 빈 PLGA 마이크로스피어와 비교하여 높이, 두께 및 바이오매스에 대해 CSLM에 의해 판정한다.
이 실시예는 생체내에서 병원체 방해 영양소를 테스트한다. 실시예 5.3에서의 시험관내 생물막 데이터로부터의 결과를 함께 고려하여, 시트로박터 로덴티움 생물막 성장 및 마우스 모델에서의 생체내 용도에 대해 4개의 운반물을 조사한다. (삼중 실험으로부터) 각 시점강 각각의 조건에 대해 9마리의 마우스를 사용하고 플랑크톤 시트로박터 로덴티움 및 모의 (박테리아 없음)를 대고준으로서 사용한다. 대변에서의 시트로박터 로덴티움 수준을 경구 시트로박터 로덴티움 투여 후 모든 날에 배양을 통해 측정한다. 경구 시트로박터 로덴티움 투여 후 1, 6, 12 및 24일에, 결장을 제거하고 세로 방향으로 절개하여 염증성 사이토카인 (예컨대, TNF-α), 염증성 매개체 (예컨대, 유도성 질산 산화물 합성효소 (iNOS)), 및 케모카인 (예컨대, CCL2)을 실시간 RT-PCR을 통해 결장의 절반에서 평가할 수 있다. 조직의 두 번째 절반에서, 면역조직화학을 사용하여 결장으로의 백혈구 침윤을 평가한다 (예컨대, F4/80+ 대식세포; 미엘로페록시다제 (MPO)+ 다형핵 세포). 상기 언급한 면역 구성요소가 시트로박터 로덴티움에 대한 보호 면역에 필요한 한편, 과잉으로 생성되었을 때, 그것은 조직-손상 대장염으로 이어질 수 있다. 그러므로, 결장 병리는 조직의 두 번째 절반에 대해 H&E 염색을 통해 평가한다.
그러므로, 마이크로스피어 생물막 제제는 마이크로스피어의 대체 유형 및 다양한 운반물을 포함할 수 있다. 생물막 (표면과 관계 없이)은 생체내에서 프로바이오틱 군집화를 시딩할 때 플랑크톤 박테리아보다 우수하다는 것이 출원인의 신념이다.
운반물의 비제한적인 예로는, 제한 없이, 장내 미생물 불균형으로 이어지는 과정의 일부인, 염증을 감소시키는 선천적 면역의 특정 이펙터를 들 수 있다. 예를 들어, 마이크로스피어는 락토바실러스 루테리로부터의 조건부 배지를 그러한 물질을 생성하는 락토바실러스 루테리로서 포함할 수 있다. 마찬가지로 다른 박테리아, 예컨대, 시트로박터 로덴티움 및 락토바실러스 루테리도 장내 미생물 불균형으로 인한 병리에 대해 본 개시의 범주 내에 있다.
실시예 6: 쥐과 장의 장병원성 박테리움 시트로박터 로덴티움을 제한하거나 대체하는 락토바실러스 루테리의 능력의 특성화
이전 실시예는 쥐과의 장에서 양호한 내구성 및 견고성을 가진 락토바실러스 루테리 생물막을 생성하는 수단을 확인하고 특성화한 한편, 또한 이들 조간이 쥐과의 장병원성 시트로박터 로덴티움에 어떻게 영향을 미칠 수 있을지를 조사하였다. 이 실시예에서, 락토바실러스 루테리 생물막의 제형을 그것이 시트로박터 로덴티움의 효과를 감소시킬 수 있는지, 또는 도입된 또는 남아 있는 병원체를 부분적으로라도 제거할 수 있는지를 측정하기 위하여 조사한다.
실시예 6.1: 시트로박터 로덴티움 도전에서 최적화된 락토바실러스 루테리 생물막 성장 조건 테스트; 락토바실러스 루테리의 제조
시트로박터 로덴티움으로의 락토바실러스 루테리의 시험관내 도전. 이 실시예는 어떤 조건이 시트로박터 로덴티움 도전에 대해 락토바실러스 루테리 에방을 개선시키는지를 체계적으로 측정한다. 표 3에서 나타낸 것과 같이, 실시예는 락토바실러스 루테리를 생물막에서 성장시키고 (다양한 나이를 반영하기 위하여 약 12, 24, 및 48시간 생물막) 그런 후 다양한 양의 플랑크톤 시트로박터 로덴티움 (107, 108 및 109 CFU)으로 처리하는 시험관내 실험을 체계적으로 수행한다. 실시예 4.2 (예컨대, 도전을 위한 배지로서 전생물막의 경우 적어도 두 박테라 종의 성장을 용이하게 하는 것이 필요함)뿐만 아니라 2.1, 2.2 및 2.3으로부터의 락토바실러스 루테리 생물막 성장 조건을 조사한다. 혼합된 생물막을 처리 후 12 또는 24시간 후에 CSLM에 의해 및 선택적 배지 상에서의 플레이트 계수에 의해 평가하여 어떤 종의 구조 및 수가 각 조건 하에서 우세한지를 측정한다. 대조군은 각각의 조건 하에서 다른 것이 없는 각각의 박테리아 종을 포함한다 (예컨대, 각각의 챔버 슬라이드에서 락토바실러스 루테리가 없는 PLGA 마이크로스피어에 첨가된 시트로박터 로덴티움의 첨가). 모든 실험은 삼중으로 실시한다.
락토바실러스 루테리 대비 시트로박터 로덴티움 도전에 대한 최적 조건
조건 시험관내 생체내
실시예 1
L. 루테리 6, 12, 18, 24, 36, 47, 72시간 생물막 X X
상이한 배지 (MRS, LB, THYE, mTSB)에서 성장한 L. 루테리 X
0.1, 1, 10, 100 μg/ml에서 L. 루테리 + HU X
0.1, 2, 10, 50 μg/ml에서 L. 루테리 + DNA X
달라지는 pH (5.5, 6, 6.5, 7)에서 성장한 L. 루테리 X
최적 성장 조건 X X
L. 루테리 용량 CFU/ml (107, 108, 109) X X
L. 루테리 투여 빈도 (1, 2, 3일) X X
분산된 L. 루테리 박테리아 X X
L. 루테리 생물막 제제의 유통 기한 (냉동, 건조) X
실시예 2
L. 루테리 + PLGA, PCL, 키토산, 젤라틴, DMA, 아세탈화된 덱스트란 마이크로스피어 X
L. 루테리 + 영영소/전생물막/영양소-전생물막 마이크로스피어 X
L. 루테리 + 부하된 마이크로스피어의 4가지 가장 유망한 조건 X X
병원체를 방해하는 프리바이오틱 영양소 X X
실시예 3
C. 로덴티움 플랑크톤성 107, 108, 109 CFU의 L. 루테리 12, 24, 48시간 생물막 도전 X X
L. 루테리로의 처리 후 12, 24, 36시간 째에 L. 루테리의 C. 로덴티움 도전 X
107, 108, 109 CFU의 최상 3가지 조건으로 L. 루테리에 의해 도전된 확립된 C. 로덴티움 감염 X X
시트로박터 로덴티움으로의 락토바실러스 루테리의 생체내 도전. 동물에 도입하기 위한 락토바실러스 루테리 생물막 제조를 관찰된 락토바실러스 루테리의 최대 보유 또는 우위를 토대로 우선권을 정한다. 더불어, 락토바실러스 루테리를 실시예 4.1, 4.4 및 4.5로부터 유래된 임의의 성공을 토대로 제조한다. 일반적으로, 락토바실러스 루테리 생물막을 시트로박터 로덴티움으로 경구 도전하기 전 12시간 전에 도입한다. 삼중 실험을 각 조건 및 도전 후 1, 6, 12 및 24일 후에 평가되는 시점에 대해 9마리 마우스의 최종 샘플 크기에 대해 수행한다 (피크 시트로박터 로덴티움 감염은 약 12일에 일어남). 대변의 시트로박터 로덴티움 수준을 평가하고 병원체-유도 대장염을 실시예 5.3에서와 같이 평가한다. 락토바실러스 루테리 수준을 또한 실시예 4.1에서와 같이 평가한다. 모든 경우에, 대조군은 락토바실러스 루테리가 없는 시트로박터 로덴티움 및 시트로박터 로덴티움 도전 플러스 플랑크톤 락토바실러스 루테리를 포함한다.
실시예 6.2: 도전 조건의 투약 테스트
생체내에서 시트로박터 로덴티움에 의해 도전된 락토바실러스 루테리의 투약 빈도 및 타이밍. 이 실시예는 여기서 락토바실러스 루테리의 투약이 시트로박터 로덴티움 도전에 대해 예방제로서 작용하는 능력에 어떻게 영향을 미치는지를 테스트한다. 실시예는 실시예 4.3으로부터 유래된 가장 강력하고 내구성 있는 결과를 반영하기 위해 상위 3개의 락토바실러스 루테리 투약 조건의 우선순위를 정한다. 그런 후 실시예는 이들 조건을 사용하여 시트로박터 로덴티움으로 처리딘 이들 락토바실러스 루테리를 도전시킨다 (최종 락토바실러스 루테리 처리 후 약 12, 24 또는 36시간 후). 각 조건 및 시점에 대해 9마리 마우스 (삼중 실험으로부터)를 사용한다. 시트로박터 로덴티움 및 단일 플랑크톤 락토바실러스 루테리로 감염된 비히클 마우스가 대조군으로서 작용한다. 시트로박터 로덴티움 수준 및 병원체-유도된 대장염을 실시예 5.3에서와 같이 도전 후 1, 6, 12 및 24일에 평가하고, 락토바실러스 루테리 수준을 실시예 4.1에서와 같이 평가한다.
실시예 6.3 실시예 6.1 및 6.2의 결과를 바탕으로 한 병원체 처리 후 치료적 프로바이오틱 도전 테스트
실시예 6.1 및 6.2에서, 시트로박터 로덴티움에 의해 유발된 병리에 대한 예방으로서 락토바실러스 루테리를 사용하기 위한 조건을 최적화하였다. 여기서 시트로박터 로덴티움을 락토바실러스 루테리보다 먼저 도입하여 락토바실러스 루테리로의 도전이 남아 있는 시트로박터 로덴티움 발병에 대해 어떤 효과를 나타내는지를 측정하였다.
시험관내에서 락토바실러스 루테리 생물막에 의한 시트로박터 로덴티움의 도전. 이 실시예는 락토바실러스 루테리 생물막이 플랑크톤 락토바실러스 루테리보다 더 효과적으로 시트로박터 로덴티움 생물막에 효과적으로 도전한 것을 보여준다. 여기서 실시예 6.1로부터의 3가지 조건 후에 패턴화된 조건 하에서 생물막 형태의 락토바실러스 루테리를 사용한다. 간단히 설명하면, 시트로박터 로덴티움 생물막 (12, 24 또는 36시간)을 락토바실러스 루테리 생물막 (107, 108 및 109 CFU)으로 도전시킨다. 혼합된 생물막을 12 또는 24시간 after 시트로박터 로덴티움 생물막의 락토바실러스 루테리 도전 후 12 또는 24시간 후에 CSLM에 의해 및 선택적 배지 상에서의 플레이트 계수에 의해 평가하여 어떤 종의 구조 및 수가 각각의 조건 하에서 우세한지를 각각 측정한다. 대조군은 각각의 조건 하에서 다른 것이 없는 각각의 박테리아 종을 포함한다 (예컨대, 외부 시트로박터 로덴티움 없이 챔버 슬라이드에 락토바실러스 루테리의 첨가). 모든 실험을 삼중으로 실시한다.
생체내에서 락토바실러스 루테리 생물막에 의한 시트로박터 로덴티움의 도전. 여기서 이 실시예는 락토바실러스 루테리 생물막이 쥐과 모델에서 시트로박터 로덴티움 감염 전에 도전할 수 있는지를 측정한다. 락토바실러스 루테리로의 도전 전에 3가지 상이한 시트로박터 로덴티움 조건 (단일 위관영양법 12, 24 또는 36시간)을 조사하였다. 투약 (실시예 6.2)을 포함한 4가지 락토바실러스 루테리 생물막 조건을 사용하여 시트로박터 로덴티움에 도전하였다. 이들 조건 중 적어도 2가지는 실시예 6.1으로부터 유래한 것이다. 삼중 실험으로부터 9마리 마우스를 사용하여 이들 12가지 조건의 각각을 테스트한다. 병원체-유도된 대장염을 실시예 5.3에서와 같이 평가하고, 락토바실러스 루테리 수준을 실시예 4.1에서와 같이 평가한다.
여기서, 이 실시예는 생물막 형태로 도입된 락토바실러스 루테리가 시트로박터 로덴티움 도전에 대해 예방적이고 외부 시트로박터 로덴티움 감염에 대한 치료로서 얼마나 효과적인지를 측정한다. 지금까지, 조건 하의 락토바실러스 루테리는 시트로박터 로덴티움과 같은 병원체를 제거하지 못하여서, 프로바이오틱이 장병원성 감염을 예방할 수 있거나 심지어 치료할 수 있는 조건을 찾을 수 있는지가 특히 중요하다. 여기서 결과는 미래의 프로바이오틱 접근법에 대한 근거를 제공한다.
마지막으로, 시험관내 검정을 미래의 생체내 실험에 대한 서막으로서 다른 병원체에 대해 수행한다. 시험관내 조사에 포함된 병원체는 상이한 감염 모드를 가진 장 병원체, 이를테면 침습성 병원체 (예컨대, 살모넬라 잘 하위종 타이피뮤리움(Typhimurium) 및 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)), 추가적인 A/E 병원체 (예컨대, 장출혈성 대장균 O157:H7; 및 장병원성 대장균), 및 독소-생성 병원체 (예컨대, 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) 및 장내독소발생 대장균)이다; 이들 실험에서 속도 제한 단계는 생체내 상태를 충분히 모방하는 공동 배양 조건을 발견하는 것이다.
실시예 7: 통계적 분석 및 샘플 크기의 측정
대부분의 실험은 다중 파라미터 및 그룹을 포함한다. 그러므로, 변량의 2, 3, 또는 4개의 인자 분석 (ANOVA)을 주로 사용한다. 통계적 접근법의 한 예로서, 실시예 4.1에서, 대상간 ANOVA를 대상간 변수로서 프로바이오틱 (즉, 프로바이오틱 대비 비히클 대조군), 상태 (즉, 생물막 대비 플랑크톤), 및 배양 시간 (즉, 6, 12, 18, 24, 또는 36시간)과 함께 사용한다. 상이한 마우스 그룹을 경구 접종 후 1, 3, 6, 및 12일에 수득하기 때문에, 수득일이 또한 대상간 변수로서 사용된다.
유의미한 4-방향 상호작용을 다중 비교를 위해 적용된 변형된 본페로니 보정 계수로 사후 독립 샘플 t-테스트를 사용하여 먼저 해석한다. 그런 후, 3-방향 및 2-방향 상호작용을 사후 테스트를 통해 해석한 후, 주요 효과를 해석한다. 이런 일반적 접근법은 시험관내 및 생체내 실험 전부에 적용된다.
생체내 실험의 고유한 가변성으로 인해, 그룹간의 통계적으로 유의한 차이를 확인하기 위해 필요할 수 있는 상당한 시간이 샘플 크기를 측정하는 데 소모되었다. 6개의 상이한 그룹 (예비 샘플 크기는 6임), 3.95의 집단 평균, 및 .75의 집단 변량으로 락토바실러스 루테리 투여 후의 시트로박터 로덴티움 수준을 조사하는 예비 데이터를 사용하여 수행한 전력 분석은 α=.05로 통계적 유의성을 얻는 한편, 전력을 0.8로 유지하면서 시점당 조건당 n=9의 샘플 크기가 필요할 것을 나타냈다. 이것은 각각 치료 및 시점당 n=3마리 마우스를 함유한 삼중 실험으로부터의 데이터를 조합함으로써 달성된다.
프로바이오틱스는 소화기의 건상상의 유익을 위해 광범위하게 사용되어 왔지만, 몇 개는 실제로 병원체 군집화를 방지하고 염증 반응을 감소시킨다. 프로바이오틱 박테리아의 효과는 그것들이 숙주에 도입되는 방식에 의해; 구체적으로 생물막 형태로 그것을 성장시킴으로써 상당히 개선될 수 있다. 데이터는 생체내에서 프로바이오틱 락토바실러스 루테리에 의한 군집화가 플랑크톤-성장 세포와 비교하여 생물막으로서 성장되었을 때 크게 향상되는 것을 시사한다. 더불어, 락토바실러스 루테리가 생분해성 표면 (PLGA)의 존재 하에 성장될 때, 군집화는 또한 증가하였고 이것은 숙주 내에서 락토바실러스 루테리 확립의 관점에서 최대의 개선을 허용한 조건이 최적화된 것을 나타낸다.
예상치 못하게, 그리고 놀랍게도, 출원인은 시험관내 및 생체내에서 모두 박테리아 도전 시트로박터 로덴티움으로의 도전 전에 PLGA의 존재 하에 생물막으로서 락토바실러스 루테리의 처리가 플랑크톤 락토바실러스 루테리 처리와 비교하여 시트로박터 로덴티움의 수에서 상당한 감소를 유발한 것을 입증하였다. 이들 데이터는 프로바이오틱이 생물막으로서 제공될 때 더 잘 군집화할 수 있고, 이것은 박테리아가 도입되는 방식이 질환의 결과를 크게 반영할 수 있음을 나타낸다.
실시예 8
프로바이오틱 미생물은 또한 그렇지 않으면 건강한 인간 및 실험실 동물에서 불안 및 우울증을 감소시키는 것으로 나타났다. 30일 동안 매일 투여된 락토바실러스 헬비티쿠스(Lactobacillus helviticus)와 비피도박테리움 롱검의 조합은 건강한 인간 지원자 및 건강한 래트에서 불안 및 우울증을 감소시키는 것으로 나타났다 (Messoudi et al. (2011) Beneficial psychological effects of a probiotic formulation (Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175) in healthy human volunteers. Br J Nutri, 105:755-764).
이 실험은 락토바실러스 루테리 제제가 감염성 대장염-유도 질병, 불안-유사, 및 우울증-유사 행동을 감소시키는데 월등한지를 감염성 대장염 자체에 대한 효과를 평가하는 상기 주지된 연구와 동일한 실험 설계를 약간만 변형시켜 사용하여 테스트한다. 주요 차이는 동물 행동이 평가될 뿐만 아니라, 순환하는 사이토카인, 순환하는 호르몬, 및 뇌에서의 신경 활성화가 평가될 것이라는 것이다.
예방적 락토바실러스 루테리가 시트로박터 로덴티움-유도 질병, 예컨대 불안-유사 및 우울증-유사 행동을 예방할 수 있는지를 측정하기 위하여, 락토바실러스 루테리 생물막으로의 예방적 치료를 평가하여 시트로박터 로덴티움이 박테리움-유도 질병, 불안-, 및 우울증-유사 행동을 방지할 것인지를 측정한다. 시험관내 검정에서 월등한 것으로 나타난 락토바실러스 루테리 생물막의 제제를 시트로박터 로덴티움으로의 도전 전 12시간 전에 경구 위관영양법을 통해 마우스에게 투여한다. 삼중 실험을 각 조건 및 시점에 대해 9마리 마우스의 최종 샘플 크기에 대해 수행하고 도전 후 1, 6, 12, 및 24일에 평가한다 (피크 시트로박터 로덴티움 감염은 약 12일에 일어남). 각 시점에서, 동물 행동을 운동 활동 (예컨대 오픈 필드 테스트에서), 불안-유사 행동 (예컨대 명:암 선호도 테스트 및 고가 플러스 미로에서), 우울증-유사 행동 (예컨대 꼬리 매달기 테스트 및 Porsolt 강제 수영 과제에서), 및 질병 행동 (예컨대 수크로스 선호도 테스트로)에 대해 평가한다. 감정 및 질병 행동과 관련된 혈액 혈청 사이토카인 (예컨대, IL-1α/β 및 IL-6)을 각각의 날에 평가한다. 순환하는 코르티코스테론 수준이 또한 평가될 것이다. 뇌, 특히 시상하부의 방실핵에서의 신경 활성화를 c-Fos 면역반응성을 사용하여 평가한다.
락토바실러스 루테리가 시트로박터 로덴티움-유도 질병, 불안-유사, 및 우울증-유사 행동을 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있는지를 또한 평가한다. 예를 들어, 조성물을 테스트하여 확립된 시트로박터 로덴티움 감염을 치료하는 것이 질병, 불안-, 및 우울증-유사 행동을 감소시킬 것인지를 측정한다. 시험관내 검정에서 월등한 것으로 나타난 락토바실러스 루테리의 제제를 시트로박터 로덴티움으로의 경구 도전 후 12, 24, 및/또는 36시간 후에 경구 위관영양법을 통해 마우스에게 투여한다. 시트로박터 로덴티움 도전 후 1, 6, 12, 및 24일에, 동물 행동을 운동 활동 (예컨대 오픈 필드 테스트에서), 불안-유사 행동 (예컨대 명:암 선호도 테스트 및 고가 플러스 미로에서), 우울증-유사 행동 (예컨대 꼬리 매달기 테스트 및 Porsolt 강제 수영 과제에서), 및 질병 행동 (예컨대 수크로스 선호도 테스트로)에 대해 평가한다. 감정 및 질병 행동과 관련된 혈액 혈청 사이토카인 (예컨대, IL-1α/β 및 IL-6)을 각각의 날에 평가한다. 순환하는 코르티코스테론 수준을 또한 평가한다. 뇌, 특히 시상하부의 방실핵에서의 신경 활성화를 c-Fos 면역반응성을 사용하여 평가한다.
이들 실시예는 보다 견고하고 장기간 지속되는 프로바이오틱을 생성하기 위하여 조건을 변형하는 것을 허용하며, 일단 확립된 후에는, 본 발명자들이 이들 조건을 궁극적으로 박테리아 감염 및 인간 질환에 대한 치료를 반영할 수 있는 생체내 모델에서 테스트할 수 있게 한다.
실시예 9: NEC
프로바이오틱 투여는 NEC의 예방에 유익할 수 있다. 그러나, 프로바이오틱스는 유익한 효과를 달성하기 위하여 매일 투여되어야 한다. 출원인은 여기서 프로바이오틱이 프리바이오틱-부하된 생체 적합성 마이크로스피어의 표면에서 생물막으로서 성장하여, 단일 처리만으로도 향상되고 보다 내구성이 있는 효능을 허용하는 신규한 프로바이오틱 전달 시스템을 기술한다.
제왕절개 분만 후, 신생 래트에게 실험적 NEC [저산소증/저체온증/고장성 사료 (스트레스)]를 적용하였다. 1일차에, 새끼들에게 무작위로 단일 장 용량의 다음을 주었다: (1) 비히클 단독 (100 μL 멸균수) (N=32마리); (2) 1x109 CFU/mL 락토바실러스 루테리 (N=9마리); (3) 프리바이오틱-부하된 생체 적합성 마이크로스피어 (N=12마리); 또는 (4) 프리바이오틱-부하된 생체 적합성 마이크로스피어와 결합된 1x109 CFU/mL 락토바실러스 루테리 (N=33마리). 대조군 새끼드른 스트레스를 주지 않았다 (N=10마리). 새끼들을 NEC의 임상적 징후가 발생하거나 출산 후 96시간이 되었을 때 희생시켰다. 검증된 조직학적 NEC 손상 등급 시스템을 사용하여 NEC의 발생률 및 중증도를 측정하고, 등급 2 이상의 손상을 NEC와 일치하는 것으로 간주하였다.
도 5A에서 그래프로 도시한 것과 같이, 미처리된 스트레스를 받은 새끼 중 69%에서 NEC가 발생되었다. 미처리된 스트레스를 받은 새끼와 비교하여, 락토바실러스 루테리로 처리된 새끼의 67% (p=0.329), 프리바이오틱-부하된 마이크로스피어로 처리된 새끼의 50% (p=0.364), 및 프리바이오틱-부하된 마이크로스피어와 결합된 락토바실러스 루테리로 처리된 새끼의 33% (p=0.003)에서 NEC가 발생하였다. 스트레스를 받지 않은 새끼들에서는 NEC를 발생하지 않았다. 도 5B에서 도시된 것과 같이, 락토바실러스 루테리 및 프리바이오틱-부하된 마이크로스피어를 둘 다 투여하는 것이 락토바실러스 루테리 (> 108) 및 프리바이오틱 마이크로스피어 (> 5 mg)의 충분한 수가 NEC의 최적 예방에 필요한 것을 보여주었다.
프리바이오틱-부하된 생체 적합성 마이크로스피어와 결합된 단일 용량의 락토바실러스 생물막은 NEC의 발생률을 감소시키며 따라서 효과적인 치료이다. 이론에 매이지는 않지만, 본원에서 개시된 조성물은 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에서 그것의 사용에 예방적이다.
실시예 10: 건조 내성 검정
출원인의 발명의 또 다른 장점은 프로바이오틱 박테리아의 개선된 장기간 생존율이다. 건조 내성 검정(dessication tolerance assay)을 사용하여 마이크로스피어와 조합된 박테리아의 안정성 및 생존성을 테스트하였다. 검정은 일반적으로 다음 단계를 수행함으로써 실시할 수 있다. 박테리아 배양을 성장시키기 위하여, 1 ml을 마이크로원심분리 튜브 (테스트할 시간 주기당 조건당 1개 튜브)에 1.5 ml의 배양에 옮긴다. 약 10 μl의 수화된 마이크로스피어, 트레할로스를 튜브에 첨가하거나, 아무것도 첨가하지 않는다. 튜브를 30분 동안 인큐베이션한 후 원심분리를 통해 세포를 펠릿화한다. 상층액을 제거하고 펠릿을 멸균 식염수로 2회 세척한다. 그런 후, 펠릿으로부터 모든 액체를 제거한다. 개방된 튜브를 동보된 용기 내의 드라이라이트(Drierite) 상단에 놓고 용기를 40℃의 인큐베이터에 넣는다. 7일 후, 튜브를 제거하여 재수화하고, 펠릿을 1 ml의 성장 배지에 5분 동안 현탁시킨다. 그런 후, 연속적으로 희석하고 생존성 콜로니 형성 단위를 위해 플레이팅한다. 마지막으로, 재수화 및 플레이팅을 30일 및 90일 째에 반복한다.
P. 플루오레센스 및 등록된 아조스피릴룸(Azospirillum) 종을 40℃에서 90일 동안 인큐베이션한 후, 강력한 건조제인 드라이라이트의 상단에 놓은 후, 재수화하여 생존성에 대해 테스트하였다. 마이크로스피어가 없는 P. 플루오레센스는 이들 조건에서 단 1주일 후에도 콜로니 형성 단위 (CFU)를 완전히 손실된 것으로 나타난 반면, 셀룰로스 마이크로스피어와 함께 인큐베이션되었을 때, 이들 조건에서 90일 후에 105 생존성 세포가 있었다. 아조스피릴룸 종은 마이크로스피어 제형이 없이 성장했을 때 30일 후에 상당한 CFU의 손실을 보이며 90일 후에는 완전히 상실하였다; 그러나, 마이크로스피어와 함께 엄격한 조건에서 보관될 때, 106 CFU/ml의 아조스피릴룸 종이 90일 후에도 생존한다.
실시예 11: 내산성 프로토콜 (48-웰 플레이트)
운반물로서 락토바실러스 루테리 성장 배지로 충전된 마이크로스피어를 활용하여 낮은 pH에서 생존성을 향상시키는 생물막의 형성을 위해 박테리아로 완충 영양소를 누출하는 표면을 제공하였다. 마이크로스피어를 가진 박테리아 세포는 pH 2의 위산에 4시간 동안 정착된 후 마이크로스피어가 없는 세포와 비교하여 생존성 콜로니 형성 단위에서 2 log를 넘는 증가를 보여준다. 추가로, 마이크로스피어를 가진 락토바실러스 루테리는 마우스 결장 세포에 대한 부착의 증가를 보여주는데, 이것은 경구 투여된 박테리아의 빈약한 군집화 및 지속성의 문제를 해결해준다. 함께 취하면, 신규한 마이크로스피어 제형은 낮은 pH에서 생존성을 증가시킬뿐만 아니라, 장에서 유익균의 군집화에 기여하여, 락토바실러스 루테리를 보다 효율적인 프로바이오틱으로 만들어준다.
산 내성 프로토콜 검정, 예컨대 상기 정보를 생성하기 위해 사용된 것은 일반적으로 다음 단계를 수행함으로써 실시될 수 있다. 먼저, 5 ml의 배양을 밤새 37℃ (5% CO2 또는 혐기적으로)에서 성장시킨 후 신선한 배지로 배양을 1:2500으로 희석한다. 테스트할 시간 주기당 조건당 500 ml을 48-웰 플레이트에 옮긴다. 약 10 ul의 수화된 마이크로스피어를 웰에 넣거나 아무것도 넣지 않는다. 그런 후, 37℃ 5% CO2 (또는 혐기적으로)에서 20시간 동안 밤새 인큐베이션한다. 20시간 째에, 사용한 배지를 생물막으로부터 제거하고 pH 2 위산으로 교체한다. 2 및 4시간 후에, 생물막으로부터 산을 제거하고 세포를 성장 배지에서 피펫으로 혼합함으로써 현탁한다. 마지막으로, 연속적으로 희석하고 세포를 플레이팅한다.
실시예 12: 세포 부착 검정
운반물로서 락토바실러스 루테리 성장 배지로 충전된 마이크로스피어를 활용하여 낮은 pH에서 생존성을 향상시키는 생물막의 형성을 위해 박테리아로 완충 영양소를 누출하는 표면을 제공하였다. 마이크로스피어를 가진 박테리아 세포는 pH 2의 위산에 4시간 동안 정착된 후 마이크로스피어가 없는 세포와 비교하여 생존성 콜로니 형성 단위에서 2 log를 넘는 증가를 보여준다. 추가로, 마이크로스피어를 가진 락토바실러스 루테리는 마우스 결장 세포에 대한 부착의 증가를 보여주는데, 이것은 경구 투여된 박테리아의 빈약한 군집화 및 지속성의 문제를 해결해준다. 함께 취하면, 신규한 마이크로스피어 제형은 낮은 pH에서 생존성을 증가시킬뿐만 아니라, 장에서 유익균의 군집화에 기여하여, 락토바실러스 루테리를 보다 효율적인 프로바이오틱으로 만들어준다.
세포 부착 검정, 예컨대 상기 정보를 생성하기 위해 사용한 것은 일반적으로 다음 단계를 수행함으로써 실시될 수 있다. 먼저, 포유류 세포 배양주를 성장시키고 약 106 세포/ml로 희석한다. 500 ul의 희석된 포유류 세포주를 48-웰 플레이트에 넣는다. 그런 후, 합류까지 성장시키고 (시간은 다양함, 적어도 16시간) 박테리아 배양을 밤새 성장시킨다. 그런 후, 500 ul의 박테리아 배양을 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브 (시간 주기 당 조건 단 1개 튜브)에 넣는다. 박테리아 세포를 원심분리를 통해 펠릿화하고 펠릿을 2-3회 세척하여 모든 성장 배지를 제거한다. 펠릿화된 박테리아를 세포주 배양 배지에 재현탁한다. 현탁된 박테리아에, 세포주 배양 배지에 수화된 마이크로스피어, MRS에 수화된 마이크로스피어를 첨가하거나, 또는 아무것도 첨가하지 않는다.
합류 포유류 세포 배양 웰로부터 성장 배지를 제거한다. 세포주 성장 배지가 들어 있는 박테리아 조건을 포유류 세포 배양 웰에 흡인한다. 37℃ 5% CO2에서 인큐베이션한다. 1시간 후, 각 웰로부터 상층액 사용한 배지를 제거하고 세포를 멸균된 PBS로 2회 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거한다. 각 웰에 500 ul 트립신을 첨가하여 부탁된 포유류 세포를 플라스틱으로부터 분리시키고 37℃에서 5-10분 동안 인큐베이션한다. 각 웰에서 액체를 철저하게 혼합하여 포유류 세포를 재현탁한다. 그런 후, 연속적으로 희석하고 플레이팅하여 포유류 세포에 부착된 채로 남아 있는 박테리아의 수를 계산한다. 4시간 및 8시간 째에, 상층액 사용한 배지를 각 웰로부터 제거하고 세포를 멸균된 PBS로 2회 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거한다. 각 웰에 500 ul 트립신을 첨가하여 부탁된 포유류 세포를 플라스틱으로부터 분리시키고 37℃에서 5-10분 동안 인큐베이션한다. 각 웰에서 액체를 철저하게 혼합하여 포유류 세포를 재현탁한다. 그런 후, 연속적으로 희석하고 플레이팅하여 포유류 세포에 부착된 채로 남아 있는 박테리아의 수를 계산한다.
실시예 13: 향상된 프로바이오틱 잠재력
한 측면으로, 프로바이오틱 제형은 이 연구에서 사용한 락토바실러스 루테리의 스트레인 (DSM 20016, gtfW에 의해 암호화된 GTFW 함유) (Leemhuis et al., 2013; Bai et al., 2015)에서 단독 공지 기질인 말토스로부터 글루코스의 엑소다당류 (글루칸)의 형성을 촉매하는 락토바실러스 루테리의 세포외 글루코실트랜스페라제 (GTF) 단백질을 포함한다. 배경으로, GTF 단백질은 전형적으로 그것의 자체 생산된 엑소다당을 인식하는 글루칸 도메인을 가진다 (Monchois et al., 1999; Kralj et al., 2004). GTF 단백질, 그것의 기질, 및 결과적으로 생성된 글루칸 생성물은 락토바실러스 루테리에서 고도로 스트레인-특이적이다; 일부는 덱스트란 (주로 α-1,6 결합), 뮤탄 (주로 α-1,3 결합), 또는 적절하게 명명된 로이트란(reuteran) (주로 α-1,4 결합)을 생성하는 것으로 특성화된다 (Kralj et al., 2002; Kralj et al., 2004). 새포 응집, 생물막 형성, 및 장 군집화는 락토바실러스 루테리 스트레인 TMW1.106에서 GTFA의 활성에 직접 연결된다; gtfA를 비활성화시키는 것은 락토바실러스 루테리의 생체내에서의 응집, 생물막 형성, 및 GI 트랙에서의 군집화 능력을 상당히 감소시킨다 (Walter et al., 2008).
출원인의 신규한 접근법은 생체 적합성 표면으로서 덱스트라노머 마이크로스피어 [크기 배제 크로마토그래피를 위해 상업적으로 판매되는 마크로스코픽 다공성 마이크로스피어 (Porath and Flodin, 1959)]의 선택을 포함하는데 이 가교된 덱스트란에 결합하는 락토바실러스 루테리의 GTFW 천연 능력의 장점을 취하기 위해서이다 (Tieking et al., 2005; Schwab et al., 2007; Walter et al., 2008). 락토바실러스 루테리의 DM에 대한 GTFW-의존적 결합은 다음의 결과를 초래한다: 하나, DM에 대한 결합의 선택성 및 그 결과로서 결장 상피 세포에 대한 락토바실러스 루테리의 더 나은 결합; 둘, 낮은 pH에 대한 보호 및 셋, 락토바실러스 루테리의 프로바이오틱 효과를 향상시키기 위해 충분히 높은 농도에서 DM의 루멘 내용물을 획득하는 락토바실러스 루테리의 능력.
실시예 13.1: 스트레인 및 배양 조건
사용한 박테리아 스트레인, 플라스미드 및 올리고뉴클레오타이드를 표 4에 열거한다. 락토바실러스 루테리 (ATCC 23272) 및 락토바실러스 람노서스 GG (ATCC 53103)를 MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) 배지 (De Man et al., 1960) (BD, Franklin Lakes, NJ)에서 16시간 동안 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 살모넬라 타이피 (스트레인 JSG698) 및 시트로박터 로덴티움 (ATCC 51459)을 Lysogeny 브로스 (LB, #63)에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. 클로스트리디움 디피실 (스트레인 R20291)을 탈기된 뇌-심장 주입 (BHI) 배지 (BD, Franklin Lakes, NJ)에서 5% H2, 85% N2, 및 10% CO2의 분위기로 확립된 혐기 챔버에서 37℃에서 성장시켰다 (Thermo Forma Scientific, 1025 Anaerobic System, Hampton, NJ). DLD-1 (ATCC CCL-221) 인간 결장 세포를 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 배지에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. FHs 74 Int (ATCC CCL-241) 인간 태아 소장 세포를 30 ng/ml의 상피 성장 인자 (EGF) 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 Hybri-Care 배지 (ATCC 46-X)에서 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. gtfW 결실 스트레인 (LMW500)을 이전에 기술된 것과 같이 (Mashburn-Warren et al., 2012) 클로르암페니콜 내성 카세트 (Venereau et al.)를 gtfW 오픈 리딩 프레임에 대립유전자 교환에 의해 삽입함으로써 구성하였다. 간단히 설명하면, gtfW의 상류 및 하류의 1 kb 단편을 올리고 oSG1082-1083 및 oSG1084-1085를 사용한 PCR, 이어서 NotI/SalI 및 SalI/XhoI 제한 부위를 각각 사용하는 pFED760 (Mashburn-Warren et al., 2012)에의 삽입에 의해 증폭시켰다. cat 카세트를 pEVP3 (Mashburn-Warren et al., 2012)으로부터 올리고 LMW34-35를 사용하여 증폭시킨 후, gtfW의 상류 및 하류 단편을 함유한 pFED760에 SalI 제한 부위를 사용하여 클로닝하였다. 결과적으로 생성된 gtfW 녹아웃 구성물 플라스미드 (pWAR500)를 그런 후 전기천공에 의해 락토바실러스 루테리 ATCC 23272에 도입하였다. 락토바실러스 루테리 전기경합 세포를 5 ml의 배양을 MRS에서 37℃ 및 5% CO2에서 OD600nm 이 약 1.0이 될 때까지 성장시킴으로써 제조하였다. 그런 후 세포를 펠릿화하고 10 ml의 멸균된 저온 0.5 M 수크로스 및 10% 글리세롤에 2회 재현탁한 후, 100 μl의 멸균된 저온 0.5 M 수크로스 및 10% 글리세롤에 최종적으로 재현탁하였다. 이 재현탁액에 1 μg의 pWAR500을 첨가하고 세포/DNA 혼합물을 빙냉 2 mm 전기천공 큐벳 (BioRad, Hercules, CA)에 넣었다. 세포를 2500V, 25 μF 및 400 Ω에서 BioRad Gene Pulser Xcell (BioRad, Hercules, CA)을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 직후에, 세포를 1 mL의 MRS에 재현탁하고 30℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 연속적으로 희석하여 5 μg/ml 클로르암페니콜을 함유한 MRS 아가 상에 플레이팅하고 30℃에서 인큐베이션하였다. 돌연변이체를 선택하고 이전에 기술된 것과 같이 확인하였다 (Chang et al., 2011).
이 연구에 사용한 박테리아 스트레인, 세포주, 플라스미드, 및 올리고.
박테리아 스트레인 설명 공급처/참조
락토바실러스 루테리 ATCC 23272 야생형 (GTFW) 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션
LMW500 락토바실러스 루테리 23272 △gtfW; CmR 이 연구
LMW501 락토바실러스 루테리 23272 + pWAR501 CmR 이 연구
LMW502 대장균 ER2566 + pWAR502 이 연구
LMW503 락토바실러스 루테리 23272 + pWAR503 CmR 이 연구
락토바실러스 람노서스 GG ATCC 53102 야생형 (GTF를 형성하는 비덱스트란) G. Rajashekara
살모넬라 엔테리카 세로바르타이피 TY2 ATCC 700931 야생형 (GTF를 형성하는 비덱스트란) J.S. Gunn
시트로박터 로덴티움 ATCC 51459 야생형 (GTF를 형성하는 비덱스트란) 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션
클로스트리디움 디피실 R20291 (BI/NAP1/027) 야생형 (GTF를 형성하는 비덱스트란) J.K. Spinler
인간 세포주 설명 공급처/참조
DLD-1 ATCC CCL-221 인간 결장 상피 세포 (대장 선암종) G.E. Besner
FHs 74 Int ATCC CCL-241 인간 태아 소장 상피 세포 G.E. Besner
플라스미드 설명 공급처/참조
pWAR500 삽입 돌연변이체를 생성하기 위해 gtfW 측면에 cat 및 DNA 단편을 함유한 pFED760 (Mashburn-Warren et al., 2012) 유도체; 물질 및 방법 참고; CmR, ErmR 이 연구
pWAR501 딱정벌레 루시페라제의 상류에 gtfW의 프로모터 영역을 함유한 pJC136 (Mashburn-Warren et al., 2012) 유도체; 물질 및 방법 참고; CmR 이 연구
pWAR502 gtfW (중단 코돈과 함께)를 함유한 pTXB1 유도체; 물질 및 방법 참고, AmpR
pWAR503 딱정벌레 루시페라제의 상류에 신장 인자 Tu (EF-Tu)의 프로모터 영역을 함유한 pJC156 (Mashburn-Warren et al., 2012) 유도체; 물질 및 방법 참고; CmR 이 연구
올리고 설명 공급처/참조
oSG1082 GCGTGGCGGCCGCCATTATTTTCATGTAGTGTATTT
(SEQ ID NO. 9)		 이 연구
oSG1083 gcgtggtcgaccttttttatgtccataatctatt (SEQ ID NO. 10) 이 연구
oSG1084 gcgtggtcgacgaaaatatttaatatgaaaatga (SEQ ID NO. 11) 이 연구
oSG1085 gcgtgctcgagccaagcactatttcacgagaat (sEQ ID NO. 12) 이 연구
LMW34 gcgtggtcgacgatgaaaatttgtttgattt (SEQ ID NO. 13) Mashburn-Warren et al., 2012
LMW35 gcgtggtcgacttataaaagccagtcattag (SEQ ID NO. 14) Mashburn-Warren et al., 2012
oSG1102 gcgtgctcgagcaacaagagtatcagggtaaagc (SEQ ID NO. 15) 이 연구
oSG1103 gcgtggtcgactccttcccaatagatgattgatt (SEQ ID NO. 16) 이 연구
0SG1067 gcgtggtcgacatggtaaaacgtgaaaaaaatgt (SEQ ID NO. 17) 이 연구
oSG1068 gcggccgctccgccagctttttctaataact (SEQ ID NO. 18) 이 연구
oSG1120 gcgtggctagcatgaacctgccaacaattcctaa (SEQ ID NO. 19) 이 연구
oSG1126 gcgtggctcttccgcattaaatattttcttggttt (SEQ ID NO. 20) 이 연구
oSG1069 GCGTGCTCGAGCGCAAGAAATACAGTTTCTAATA (SEQ ID NO. 21) 이 연구
oSG1070 GCGTGGTCGACAAACCTCCTGATAATTTACAAGT (SEQ ID NO. 22) 이 연구
CmR: 클로르암페니콜 내성; ErmR: 에리트로마이신 내성; AmpR: 암피실린 내성
*진한 서열은 제한 효소 서열을 나타낸다.
gtfW 프로모터 (P gtfW )로부터의 전사를 추정하기 위하여, P gtfW -CBluc 리포터 플라스미드를 gtfW 출발 코돈의 상류로 350 bp에서 (천연 리보솜 결합 부위를 포함함) 올리고 oSG1102-1103을 사용하는 PCR에 의해 프로모터 영역을 증폭시킴으로써 구성하였다. 결과적으로 생성된 DNA 단편을 XhoI/SalI 제한 부위를 사용하여 pJC156에 삽입하였다. 딱정벌레 루시페라제 (CBluc) 유전자를 스트렙토코커스 뮤탄스 스트레인 ldhCBGSm (Merritt et al., 2016)으로부터 올리고 oSG1067-1068을 사용하여 증폭시키고 pJC156의 gtfW 프로모터 영역의 하류에 SalI/NotI 제한 부위를 사용하여 삽입하였다. 결과적으로 생성된 리포터 플라스미드 pWAR501을 상기 기술한 것과 같이 락토바실러스 루테리 23272에 형질전환하여 리포터 스트레인 LMW501을 생성하였다.
대장균 gtfW 과다발현 스트레인 (LMW 502)을 락토바실러스 루테리 gtfW 오픈 리딩 프레임 (중단 코돈을 포함함)을 프라이머 oSG1120-1126을 사용하여 증폭시킴으로써 생성하였다. 결과적으로 생성된 DNA 단편을 NheI/SapI 제한 부위를 사용하여 pTXB1 (New England BioLabs, Ipswich, MA)에 삽입하였다. 결과적으로 생성된 플라스미드, pWAR502를 그런 후 대장균 발현 스트레인 ER2566 (New England BioLabs, Ipswich, MA)에 형질전환하고 100 μg/ml 암피실린을 함유한 Luria-Bertani 아가 상에서 선택하고 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 이 스트레인은 태그 없는 GTFW 단백질의 과다발현을 허용한다.
딱정벌레 루시페라제를 본래적으로 발현하는 락토바실러스 루테리 스트레인을 제조하기 위하여, 리포터 플라스미드를 올리고 oSG1069-1070을 사용하는 PCR에 의해 신장 인자 Tu (EF-Tu) 출발 코돈 (천연 리보솜 결합 부위를 포함함)의 상류로 250 bp에서 프로모터 영역을 증폭시킴으로써 구성하였다. 결과적으로 생성된 DNA 단편을 XhoI/SalI 제한 부위를 사용하여 pJC156에 삽입하였다. 딱정벌레 루시페라제 (CBluc) 유전자를 스트렙토코커스 뮤탄스 스트레인 ldhCBGSm (Merritt et al., 2016)으로부터 올리고 oSG1067-1068을 사용하여 증폭시키고 SalI/NotI 제한 부위를 사용하여 pJC156의 EF-Tu 프로모터 영역의 하류에 삽입하였다. 결과적으로 생성된 리포터 플라스미드 pWAR503을 상기 기술한 것과 같이 락토바실러스 루테리 23272에 형질전환하여 LMW503을 생성하였다.
실시예 13.2: 마이크로스피어 제조 및 적용
무수성 덱스트라노머 마이크로스피어 (DM; 세파덱스® G-25 Superfine)를 GE Healthcare Life Sciences사 (Pittsburgh, PA)로부터 구입하였다. 무수 셀룰로스 마이크로스피어 (CMs; Cellulobeads D50)를 Kobo Products, Inc. (South Plainfield, NJ)로부터 얻었다. 무수 마이크로스피어를 성장 배지 또는 물에 50 mg/ml로 수화시킨 후 20분 동안 오토클레이빙하였다. 말토스, 수크로스, 프룩토스, 또는 글루코스 단독을 함유한 마이크로스피어를 포함한 조건에 대해, 이전에 물에서 오토클레이빙한 마이크로스피어를 진공 필터 장치 상에서 용액으로부터 제거하고 대략 50 mg을 멸균된 루프를 통해 1 ml의 필터-멸균된 1 M 당 용액에 수집하였다 (도 13 참고). 그런 후 마이크로스피어 혼합물을 격렬하게 와류 혼합하고 24시간 동안 실온에서 평형에 도달하도록 인큐베이션하였다.
락토바실러스 루테리와의 적용을 위해, 물, 1 M 말토스, 1 M 수크로스, 1 M 글루코스, 또는 1 M 프룩토스가 부하된 마이크로스피어를 진공 필터 장치 상에서 용액으로부터 제거하고 10 μl 멸균 루프를 통해 수집하였다. 그런 후 대략 5 mg의 수화된 마이크로스피어를 3220 x g에서 10분 동안 원심분리에 의해 이전에 펠릿화되어 있는, 밤샘 배양으로부터의 1 ml의 2 x 109 CFU 락토바실러스 루테리에 첨가하고, 멸균된 0.9% 식염수로 2회 세척하고, 1 ml의 멸균 식염수에 재현탁하였다. 진핵 세포주를 포함한 실험의 경우, 2 x 109 CFU의 박테리아를 식염수 대신 1 ml RPMI에 재현탁하였다. 마이크로스피어는 없지만 동등한 부피의 운반물을 사용하는 실험의 경우, 10 μl의 운반물을 멸균 식염수 또는 RPMI 중 어느 하나 중의 1 ml의 박테리아에 첨가하였다. 모든 실험에 대해, 박테리아 및 마이크로스피어 혼합물을 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 (다르게 진술되지 않는 한) 검정에 사용하기 전 마이크로스피어 표면 상에서 박테리아 부착 및 생물막 형성을 용이하게 하였다.
실시예 13.3: 마이크로스피어 부착 검정
락토바실러스 루테리 배양을 상기 기술한 것과 같이 성장시키고 제조하여 물, 1 M 말토스, 1 M 수크로스, 1 M 프룩토스, 또는 1 M 글루코스 중 어느 하나로 충전된 마이크로스피어와 함께 인큐베이션하였다. 마이크로스피어에 대한 박테리아 부착을 조사하기 위하여, 멸균 식염수 중의 300 μl의 박테리아 (약 2 x 109 CFU를 함유한 밤샘 배양으로부터의) 및 5 mg의 마이크로스피어를 조합하여 Micro Bio-스핀 칼럼 (BioRad, Hercules, CA)에서 5분 동안 인큐베이션하였다 (도 14 참고). 그런 후 칼럼을 1분 동안 원심분리하였다 (100 x g). 관통 흐름을 연속적으로 희석하고 플레이팅하여 비부착 박테리아의 총 수를 계산하였고, 이 값을 출발 박테리아의 총 수로부터 제하여서 부착된 박테리아의 총 수를 유추하였다. 모든 실험에 대해, 마이크로스피어를 포함하지 않은 박테리아로 구성된 대조군 제제를 사용하였다.
실시예 13.4: 리포터 검정
리포터 스트레인 LMW501을 MRS 또는 3% 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 또는 말토스를 함유한 MRS에서 37℃에서 5% CO2에서 성장시키고 배양의 광학 밀도 (OD600nm)를 Epoch Microplate 분광광도계 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT)를 사용하여 전체 성장을 통해 측정하였다. 표시된 시간에, 박테리아 배양의 80 μl 분취액을 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 6.0 중의 20 μl의 2 mM D-루시페린과 혼합하여 Falcon 백색 평평-바닥 96-웰 플레이트 (Becton, Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)에 넣은 후, Veritas Microplate 발광계 (Turner BioSystems Inc., Sunnyvale, CA)를 사용하여 발광을 검출하였다.
실시예 13.5: GTF 효소 검정
스트렙토코커스 뮤탄스를 Todd Hewitt 브로스에서 37℃에서 5% CO2에서 초기 로그 단계 (OD600nm 약 0.3)까지 성장시키고, 락토바실러스 루테리 WT 및 △gtfW 돌연변이체를 최적 gtf 발현을 위해 MRS에서 37℃ 및 5% CO2에서 후기 로그 단계 (OD600nm 약 1.0)까지 성장시켰고, 대장균 gtfW 과다발현 스트레인을 Luria-Bertani 브로스에서 37℃에서 진동 (200 rpm)하면서 중간 로그 단계 (OD600nm 약 0.4) 까지 성장시킨 후 1 mM IPTG를 첨가하여 gtfW 발현을 유도한 후 37℃ 진동에서 추가로 2시간 동안 성장시켰다. 스트렙토코커스 뮤탄스, 락토바실러스 루테리 WT, 락토바실러스 루테리 △gtfW, 및 대장균 gtfW 과다발현 스트레인의 전체 세포를 이전에 기술된 것과 같이 SDS-PAGE 겔의 과요오드산-쉬프 염기 염색을 사용하여 GTF 활성에 대해 검정하였다 (Bai et al., 2015).
실시예 13.6: 운반물 확산 검정
마이크로스피어를 벗어난 운반물 확산 속도를 소분자량 염료 (407.979 g/mol)인 크리스탈 바이올렛을 추적함으로써 측정하였다 (Fisher Scientific, Hampton, NJ). 20 mg의 마이크로스피어를 1 ml의 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액에 글리세롤 (40% 또는 80% 부피/부피)을 첨가하거나 또는 첨가하지 않고 밤새 인큐베이션함으로써 마이크로스피어를 크리스탈 바이올렛의 0.1% 용액으로 부하시켜서 점도 증가에 의해 확산 속도를 감소시켰다. 16시간 후에, 과잉 크리스탈 바이올렛 용액을 상기에서 기술한 것과 같이 진공 필터 장치를 사용하여 마이크로스피어로부터 제거하였다. 크리스탈 바이올렛-부하된 마이크로스피어를 그런 후 1 ml의 물에 넣고, 물의 분취액을 제거하여 Epoch Microplate 분광광도계 (BioTek, Winooski, VT)를 사용하여 OD590nm에서 16시간 동안 매시간마다 크리스탈 바이올렛의 용액으로의 확산을 분석하였다. 퍼센트 확산을 물 중의 마이크로스피어 (10 μl) 내의 동등한 양의 크리스탈 바이올렛을 100% 운반물 확산에 동등한 대조군으로서 사용하여 계산하였다.
실시예 13.7: 류테린 검정
락토바실러스 루테리에 의한 류테린의 생성을 정량적 열량측정 검정을 통해 측정하였다 (Cadieux et al., 2008). 이 검정은 유사한 알데하이드 생성물 사이를 식별하지 못하였기 때문에, 측정은 3-HPA 및 임의의 잠재적인 유도체, 예컨대 아크롤레인 및 3-HPA 수화물을 포함하였다. 락토바실러스 루테리를 상기에서 기술한 것과 같이 MRS에서 밤새 성장시켰고, 2 x 109 CFU의 1 ml 분취액을 3220 x g에서 10분 동안 펠릿화하고, 멸균 식염수로 2회 세척하고, 1 ml의 멸균 식염수 또는 2% 부피/부피 글리세롤을 함유한 1 ml의 멸균 식염수에 재현탁하였다. 0%, 2%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 글리세롤을 함유한 DM을 상기에서 다른 운반물에 대해 기술한 것과 같이 제조하고, (류테린 생성을 위해 이용 가능한 글리세롤의 공급원만이 마이크로스피어 운반물을 통과하도록) 식염수에 재현탁된 락토바실러스 루테리에 1시간 동안 37℃에서 첨가하였다. 그런 후 세포를 다시 펠릿화하고 류테린-함유 상층액을 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하고, Cadieux et al., 2008에서 기술한 것과 같이 변용하지 않고 류테린에 대해 검정하였다. 공지 농도의 류테린을 사용한 표준 곡선을 사용하여 DM-글리세롤 및 2% 부피/부피 글리세롤 대조군 실험 조건으로부터 박테리아-생성된 류테린 농도를 외삽하였다.
실시예 13.8: DM-80% 글리세롤을 사용한 락토바실러스 루테리 생존
WT 락토바실러스 루테리의 밤샘 배양을 마이크로원심분리 튜브에 분취하고, 원심분리하고, 멸균 식염수로 2회 세척하고, 1 ml의 식염수 또는 1 ml의 MRS 배지에 재현탁하였다. 그런 후 5 mg의 DM-물 또는 DM-80% 글리세롤을 튜브에 첨가하고 37℃에서 인큐베이션하였다. 매시간 간격으로 튜브를 철저하게 혼합하고 후속 연속 희석을 위해 분취액을 취하여 박테리아의 생존할 수 있는 CFU에 대해 플레이팅하였다.
실시예 13.9: 히스타민 검정
L-히스티딘으로부터 락토바실러스 루테리에 의한 히스타민의 생성을 ELISA를 통해 측정하였다 (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY). 락토바실러스 루테리를 상기에서 기술한 것과 같이 MRS에서 밤새 성장시키고, 2 x 109 CFU의 1 ml 분취액을 3220 x g에서 10분 동안 펠릿화하고, 멸균 식염수로 2회 세척하고, 다음 조건 중 하나에 재현탁하였다: 멸균 식염수, 3% 말토스를 포함한 식염수, 2% 부피/부피 글리세롤, 4 mg/ml L-히스티딘 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 3% 말토스를 포함한 4 mg/ml L-히스티딘, 또는 2% 부피/부피 글리세롤을 포함한 4mg/ml L-히스티딘. 4 mg/ml 또는 30mg/ml L-히스티딘을 함유한 5 mg의 DM을 L-히스티딘이 없는 배지에 첨가하여, 락토바실러스 루테리에 대한 L-히스티딘의 유일한 공급원이 DM을 벗어나 확산되는 운반물이 되도록 하였다. 그런 후 각 조건을 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 내용물을 펠릿화하고 상층액을 제조사의 설명서를 따라 변형 없이 히스타민 ELISA 키트 (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY)를 통한 히스타민 정제를 위해 제거하였다. 모든 조건을 적어도 삼중으로 실시하였다.
실시예 13.10: pH 생존성 검정
박테리아를 pH 2에서 생존율을 측정하기 위해 합성 위산에 노출시켰다. 위산 동등물은 0.1 M HCl, 0.1 M NaCl, 및 0.01 M KCl로 구성되고, 0.1 M NaOH를 사용하여 pH를 2로 조정한 합성 위액 (Cotter et al., 2001)의 변형된 버전이다. 검정을 위해, 신선한 밤샘 배양으로부터 1 ml의 2 x 109 CFU의 락토바실러스 루테리를 3220 x g에서 10분 동안 펠릿화하고, 멸균 식염수로 2회 세척하고, 1 ml의 0.9% 멸균 식염수에 재현탁하였다. 세포를 상기에서 기술한 것과 같이 30분 동안 대략 5 mg의 부하된 또는 부하되지 않은 마이크로스피어와 함께 인큐베이션하고, 박테리아-마이크로스피어 혼합물을 1:100으로 직접 위산 동등물에 희석하였다. 접종된 산 용액의 분취액을 혼합하고, 연속적으로 희석하고, 4시간 동안 시간 간격으로 시점마다 플레이팅하여 생존할 수 있는 박테리아의 수를 측정하였다. 마이크로스피어가 없는 박테리아를 대조군으로서 사용하였다.
실시예 13.11: 장 상피 세포에 대한 부착
DLD-1 결장 세포 및 FHs 74 소장 세포를 상기 기술한 것과 같이 배양하였다. 부착 상피 세포가 합류에 도달했을 때, 성장 배지를 제거하고, 세포를 멸균 포스페이트 완충 식염수 (PBS)로 2회 세척하고, 트립신-EDTA (0.25%)를 10분 동안 37℃에서 첨가하여 배양 플라스크 표면으로부터 세포를 분리시켰다. 총 상피 세포를 혈구계산기 (Hausser Scientific, Horsham, PA)를 사용하여 계수하였다. 그런 후 세포를 5 x 105 세포/ml의 농도로 희석하고 웰당 1 ml을 24-웰 플레이트에 시딩하고 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 48시간 (DLD-1 세포의 경우) 또는 120시간 (FHs 74 세포의 경우) 성장시킨 후, 사용한 배지를 제거하고 2 x 109 CFU의 락토바실러스 루테리 단독, 5 mg의 물-충전 DM과 함께 락토바실러스 루테리, 5 mg 수크로스-충전 DM과 함께 락토바실러스 루테리, 또는 5 mg 말토스-충전 DM과 함께 락토바실러스 루테리를 함유한 1 ml의 RPMI 또는 Hybri-Care 배지로 교체하였다. 1시간 인큐베이션한 후에, 사용한 배지를 제거하고 웰을 1 ml의 멸균 PBS로 3회 세척하여 비부착 박테리아를 제거하였다. 그런 후 박테리아가 부착되어 있는 남아 있는 상피 세포를 상기 기술된 것과 같이 트립신 처리하고, 연속적으로 희석하고, 고체 MRS 배지 위에 플레이팅하여 총 부착 박테리아를 계수하였다. DLD-1을 사용한 공초점 현미경 실험의 경우, 24-웰 플레이트 대신 Nunc Lab-Tek 8-웰 붕규산염 챔버 슬라이드 (Fisher Scientific, Hampton, NJ)를 사용하였다. 챔버 슬라이드를 다음 프로토콜을 사용하여 콜라겐으로 처리한 후 DLD-1을 시딩하여 세포 부착을 개선시켰다: 100 μl의 7.5% BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 50 μl의 3.79 mg/ml 콜라겐 (Millipore, Temecula, CA), 100 μl의 1 mg/ml 래트 피브로넥틴 (Biomedical Technologies, Stoughton, MA), 및 9.75 ml의 PBS의 혼합물을 제조하고, 챔버 슬라이드 웰당 200 μl의 이 용액을 첨가하였다. 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 용액을 웰로부터 제거하고, 상피 세포를 시딩하고 상기 기술된 것과 같이 성장시켰다.
실시예 13.12: 뮤신 부착 검정
뮤신 아가 플레이트를 돼지 위 뮤신 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 사용하여 생성하였다. 뮤신 아가 플레이트는 생체내에서 발견되는 점액층의 일관성을 시뮬레이션하기 위해 2% 뮤신 및 0.8% 아가를 함유하였다 (Macfarlane et al., 2005; Van den Abbeele et al., 2009). 락토바실러스 루테리의 뮤신에 결합하는 능력을 평가하기 위하여, 플랑크톤 상태의 또는 5 mg DM-물, DM-수크로스, 또는 DM-말토스에 결합된, 딱정벌레 루시페라제 효소의 발현을 암호화하는 플라스미드를 함유한 2 x 109 CFU의 락토바실러스 루테리를 뮤신 아가 및 뮤신이 없는 아가에서 모두 실온에서 고정하여 인큐베이션하였다. 60분 후, 플레이트를 멸균 식염수로 2회 세척함으로써 비부착 락토바실러스 루테리를 제거하였다. 그런 후 루시페라제 기질인 D-루시페린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 플레이트에 0.4 mM의 농도로 첨가하여 남아 있는 부착 박테리아를 시각화하였다. 플레이트 상에서 박테리아로부터 생성된 상대적 광도를 20분 노출 세팅을 포함한 FluorChem E 시스템 (ProteinSimple, San Jose, CA)을 사용하여 측정하였다. 플레이트 내에서 뮤신에 결합된 박테리아의 수 (플레이트 내에서 아가에 대해 일어날 수 있는 임의의 배경 결합이 아닌)를 평가하기 위하여, 아가-단독 플레이트로부터의 발광 신호의 양을 뮤신 아가 플레이트로부터 뺐다.
실시예 13.13: 공초점 현미경검사
모든 공초점 레이저 주사 현미경검사 (CLSM)를 Zeiss LSM 510 공초점 현미경 (Ziess AG, Oberkochen, Germany)을 사용하여 수행하였다. 형광 주사를 위해, 덱스트라노머 및 셀룰로스 마이크로스피어를 운반물 (예컨대 수크로스)과의 인큐베이션 및 박테리아로의 실험 전에 콩고 레드 (Fisher Scientific, Hampton, NJ)로 사전 염색하였다. 락토바실러스 루테리를 SYTO 9 (Life Technologies, Carlsbad, CA)로 염색하였다. 차등 형광 시각화(Differential fluorescent visualization)를 다음 세팅을 사용하여 수행하였다: 콩고 레드 여기 554nm / 방출 568nm, 및 SYTO 9 여기 490nm / 방출 525nm. 샘플을 1.5% 파라포름알데하이드, 0.025% 글루타르알데하이드, 4.0% 아세트산, 및 0.1 M 포스페이트 완충액, pH 7.4 (Devaraj et al., 2015)를 함유한 맞춤형 생물막 고정제를 사용하여 고정하였다. 모든 현미경검사를 Nunc Lab-Tek 8-웰 붕규산염 챔버 슬라이드 (Fisher Scientific, Hampton, NJ)에서 샘플에 대해 수행하였다. DLD-1 상피 세포를 사용한 CLSM 실험의 경우, DLD-1을 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, Life Technologies, Carlsbad, CA)로 염색하고, 락토바실러스 루테리를 카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르 (CFSE, Life Technologies, Carlsbad, CA)로 염색하였다. AxioVision 소프트웨어 (Ziess AG, Oberkochen, Germany) 및 ICY (de Chaumont et al., 2012)를 사용하여 이미지를 분석하고 CLSM 이미지로부터 도면을 생성한다. COMSTAT (Heydorn et al., 2000) 소프트웨어를 사용하여 CLSM 이미지에서 박테리아 바이오매스를 정량화한다.
시험관내 생물막 검정의 경우, WT 및 △gtfW 락토바실러스 루테리의 밤샘 배양을 신선한 MRS 성장 배지로 0.01 OD600nm로 희석하고, 37℃ 5% CO2에서 2.5시간 동안 0.65 OD600nm에 도달할 때까지 인큐베이션하고, MRS, MRS + 3% 수크로스, 또는 MRS + 3% 말토스에 1:2500으로 희석하고, 8-웰 붕규산염 챔버 슬라이드에 시딩하고 1, 3, 또는 6시간 동안 37℃ 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 지정된 시간 간격으로, 박테리아를 생존성에 대해 LIVE/DEAD 염색으로 염색하고, 고정하고, 공초점 현미경검사에 의해 시각화하고, 형광 신호의 COMSTAT 분석을 통해 정량화하였다.
실시예 13.14: 주사 전자 현미경검사
모든 주사 전자 현미경검사 (SEM)를 Hitachi S-4800 필드 방출 SEM (Hitachi, Tokyo, Japan)을 사용하여 수행하였다. DLD-1 인간 결장 상피 세포를 12-웰 플레이트의 웰 내에 놓인 15 mm 직경의 써마녹스 커버슬립 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) 상에서 성장시킨 것을 제외하고, 샘플을 "결장 세포에 대한 부착"에서 기술한 것과 같이 제조하였다. DLD-1 세포의 샘플 및 부착된 박테리아를 4℃에서 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.2) 중의 2.5% 글루타르알데하이드 용액에서 밤새 고정시켰다. 그런 후 샘플을 이중 증류수로 세척하고 0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 7.2) 중의 오스뮴 테트록사이드 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 1% 용액으로 1시간 동안 염색하고, 5분 동안 세척하고, 추가로 1% 오스뮴 테트록사이드로 30분 동안 염색하였다. 그런 후 샘플을 등급이 매겨진 일련의 에탄올을 사용하여 탈수하였다: 15분 동안 25% 에탄올, 15분 동안 50% 에탄올, 30분 동안 70% 에탄올, 15분 동안 95% 에탄올 (2회), 100% 에탄올 (2회), 100분 동안 100% 에탄올 대 100% 헥사메틸다이실라잔 (HMDS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 1:1 혼합물, 15분 동안 100% HMDS, 및 최종적으로 100% HMDS에 침지한 후 밤새 공기 건조하였다. 탈수된 샘플 커버슬립을 그런 후 콜로이드상 은 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)을 사용하여 15 mm 직경의 금속 SEM 시편 토막 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) 상에 장착하였다. 그런 후 토막과 커버슬립이 만나는 곳인 외부 가장자리를 콜로이드상 은의 가벼운 층으로 코팅하고, 밤새 건조시켰다. 샘플을 금 및 팔라듐으로 2분 동안 25 mA에서 Emitech K550X 스퍼터 코팅기 (Quorum Technologies Ltd., Laughton, United Kingdom)를 사용하여 스퍼터 코팅하였다.
실시예 13.15: 통계적 분석
모든 실험을 최소 3회 수행하였고 통계적 분석을 0.05 미만의 P-값을 유의한 것으로 인정한 GraphPad Prism 소프트웨어 (GraphPad 소프트웨어, Inc., La Jolla, CA)를 사용하여 학생 t-테스트를 통해 수행하였다.
결과
실시예 13.16: DM의 루멘 내의 말토스 또는 수크로스는 GTF-의존적 방식으로 DM에 대한 락토바실러스 루테리 부착을 개선하였다
덱스트라노머 마이크로스피어 (DM)를 콩고 레드로 차등적으로 염색하고 락토바실러스 루테리를 SYTO 9로 차등적으로 염색하여, 공초점 레이저 주사 현미경검사 (CLSM)를 통해 결합을 조사하여 프로바이오틱 박테리아가 이중호환성 표면에 부착하고 생물막 형성을 유도할 것인지를 측정하였다. 도 6A-6C에서 나타낸 것과 같이, 박테리아의 응집체는 수많은 DM의 표면과 결부되었고 이것은 락토바실러스 루테리가 할당된 시간 내에 DM 표면에 부착할 수 있었음을 나타냈다. DM이 락토바실러스 루테리에 의해 생성된 천연 류테란과 유사한 가교된 글루칸이기 때문에, 이론에 매이지는 않으면서, 출원인은 응집 및 생물막 형성을 자극하기 위한 GTFW의 증가 (DM에 대한 향상된 결합의 경우) 또는 글루칸의 생성이 락토바실러스 루테리의 부착된 상태를 촉진할 것이라고 가설을 세웠다. 이 목적을 위해, 수크로스 (gtfW 발현의 유도제이지만 GTFW에 대한 기질은 아님; 도 15A 및 15B 참고) 또는 말토스 (GTFW의 단독 기질)의 루멘 운반물을 함유한 DM에 대한 락토바실러스 루테리의 부착을 비교하였다. 도 6B 및 6C에서 나타낸 것과 같이, 루멘 내에 물만을 함유한 DM (도 6A)과 비교하여 운반물로서 어느 당을 사용하든 락토바실러스 루테리의 더 많은 수가 DM에 부착하였다.
락토바실러스 루테리의의 DM에 결합하는 능력을 추가로 조사하기 위하여, 다른 DM 루멘 화합물을, 물질이 GTFW 단백질 매개된 결합에 영향을 미치지 않아야 하고 그로써 DM에 대한 증가된 부착을 지지할 가능성이 없다는 이론에 따라 테스트하였다. 이 검정을 위해, 말토스 및 수크로스의 단당 하위단위 (예컨대, 말토스의 경우 글루코스, 수크로스의 경우 글루코스 및 프룩토스)를, GTF 효소가 글루칸 중합체를 촉매하기 위해 그것들을 사용할 수 없기 때문에 선택하였다. 흥미롭게도, 프룩토스 (및 글루코스가 아닌)가 수크로스와 유사한 속도로 gtfW 발현을 유도하는 것으로 나타났지만, 수크로스로 발견된 것처럼 DM에 대한 향상된 결합을 초래하지는 못하였다 (도 15A, 도 7A).
이런 GTFW-의존적 결합이 DM의 글리코실 결합에 특이적인지를 측정하기 위하여, 셀룰로스 마이크로스피어 (CM)가 글루코스 단위들 사이에서 β-결합을 가진 한편 (Updegraff, 1969; Kralj et al., 2002) DM은 α-결합을 가진 글루코스의 중합체로 구성되기 때문에, CM에 대한 락토바실러스 루테리 결합과 비교하였다. 도 7A에서 나타낸 것과 같이, 약 10%의 락토바실러스 루테리만이 루멘 내용물과 관계 없이 CM에 부착하였다. 종합적으로 도 7A-7C의 데이터는 락토바실러스 루테리가 CM에 부착하지 않으며, DM에 대한 결합은 GTFW-의존적이고, 추가로 말토스 또는 수크로스의 포함이 락토바실러스 루테리의 DM에 대한 결합을 상당히 향상시켰음을 나타냈다. 출원인은 GTFW의 예측된 글루칸 도메인이 락토바실러스 루테리의 DM에 대한 결합 능력의 필요한 구성요소라고 가설을 세웠다. DM에 대한 부착이 GTF-의존적인지를 추가로 테스트하기 위하여, 락토바실러스 루테리의 돌연변이 스트레인 (LMW500)을 gtfW 유전자 대신 클로르암페니콜 내성 유전자를 사용하여 생성하였다. 도 7B에서 나타낸 것과 같이, △gtfW 스트레인은 DM 루멘 내의 운반물과 관계 없이, 스핀 칼럼 검정에서 야생형 (WT)처럼 효과적으로 DM에 결합할 수 없었다. WT와 △gtfW 사이의 차이를 추가로 입증하기 위하여, 출원인은 수크로스 또는 말토스가 보충된 배지에서 유리 챔버 슬라이드 상에서의 생물막 형성을 조사하였다 (도 16A-16D). 1시간 인큐베이션 후, 수크로스 또는 말토스를 성장 배지에 첨가했을 때 WT가 더 많이 존재하는 박테리아 및 특히 더 많은 박테리아 응집을 가졌다 (도 16A 및 16B). 수크로스 또는 말토스 보충된 배지와 함께 3 및 6시간 후 WT는 모든 조건 하에서 gtfW 돌연변이체와 비교하여 더 큰 바이오매스를 가진 상당히 더 견고한 생물막을 나타냈고, 수크로스 또는 말토스가 성정 배지에 있었을 때 상당히 더 많은 세포가 존재하였다 (도 16A, 16C 및 16D).
출원인은 다음으로 유사한 GTF를 발현하지 않는 박테리아가 도 7A 및 7B에서 도시된 부착 표현형이 결핍되었는지를 테스트하였다. 이것을 조사하기 위하여, 출원인은 또 다른 프로바이오틱 박테리움 및 락토바실러스 루테리가 위장관 내에서 만날 가능성이 있을 3개의 장 병원체를 사용하여 개시된 DM 부착 검정을 수행하였다: 비뇨생식기에서 일반적으로 발견되고 프로바이오틱으로서 상업적으로 판매되는 그람-양성 박테리움인 락토바실러스 람노서스 GG; 인간에서 장티푸스의 원인이 되는 그람-음성 박테리움인 살모넬라 타이피; 설치류에서 대장염을 유발하는 그람-음성 박테리움인 시트로박터 로덴티움; 및 인간에서 중증의 대장염 및 재발하는 감염을 유발할 수 있는 그람-양성 포자 형성 박테리움인 클로스트리디움 디피실. 도 7C에서 나타낸 것과 같이, 비-GTF 발현 박테리아는 전부, DM 루멘 내에 존재하는 운반물과 관계없이, DM에 대한 최소 부착을 나타냈다.
실시예 13.17: DM으로부터 운반물의 확산
DM에 대한 박테리아의 초기 결합은 마이크로스피어 조성물에 필요하다. 그러나 동등하게 중요한 것은 위장관을 통한 DM의 통과 동안 부착 박테리아에 의해 필요한 유익한 루멘 운반물을 공동 전달하는 능력이다. 시간 경과에 따른 DM을 벗어나 직접 프로바이오틱 박테리움으로의 확산을 통한 말토스 (또는 임의의 다른 유익한 화합물)의 표적화된 전달이 이 시스템의 바람직한 특징이다. 그러나, 운반물 전달 방법이 그것의 분해가 아닌 마이크로스피어의 다공성 표면을 통한 확산일 것이기 때문에, 예컨대 폴리(락틱-코-글리콜릭)산 (PLGA) 마이크로스피어에서 일어나기 때문에 (Danhier et al., 2012), 확산 속도는 마이크로스피어의 크기, 용질의 질량, 및 희석제의 점도에 따라 달라진다.
DM을 소분자량 (407.979 g/mol) 염색인 크리스탈 바이올렛으로 충전하고, DM을 벗어난 염료의 확산 속도를 DM 루멘의 용액의 점도를 변화시키거나 변화시키지 않고 테스트하였다. 도 8에서 나타낸 것과 같이, 크리스탈 바이올렛은 약 6시간의 반감기로 DM 루멘을 벗어나 확산되었다. 40% 글리세롤을 첨가함으로써 점도를 증가시켰을 때, 방출의 반감기는 약 8시간으로 증가하였다. 80% 글리세롤에서 크리스탈 바이올렛 방출의 반감기는 추가로 12시간으로 향상되었다. 16시간째에 모든 크리스탈 바이올렛의 >95%가 모든 테스트 조건 하에서 방출되었다.
실시예 13.18: 락토바실러스 루테리는 글리세롤-부하된 마이크로스피어로부터 류테린을 생성하였다
프로바이오틱 박테리움으로서 락토바실러스 루테리 기능의 중요한 특징은 잠재적으로 세포외 류테린과 같은 항생물질의 생성을 통해 숙주 내에서 병원성 박테리아와 경합하는 능력이다 (Cleusix et al., 2007; Spinler et al., 2008). 제한된 글리세롤 이용률로 인해, GI 관에서 글리세롤의 차선적인 내인성 농도는 적당한 류테린 생성을 제한할 가능성이 있다. 락토바실러스 루테리의 최적 필요성을 만족시키기 위해 고수준의 글리세롤을 제공할 필요성을 제거하기 위하여, 출원인은 DM 표면에 부착된 박테리아에 직접 글리세롤의 표적화된 전달을 제공하였다. 이것을 시험관내에서 테스트하기 위하여, 류테린 생성에 대한 열량측정 검정 (Cadieux et al., 2008)을 활용하였다. 도 17에서 나타낸 것과 같이, 10-80% 범위의 농도의 글리세롤로 충전된 DM은 류테린 생성을 유도할 수 있었다. 2% 글리세롤 용액 대조군과 비교하여, 80% 글리세롤로 충전된 DM은 1시간 내에 평균 53% 더 많은 류테린을 생성하였다 (생성된 류테린의 평균 농도: 2% 글리세롤 = 40 mM, DM-80% 글리세롤 = 61 mM). 80% 글리세롤 또는 결과적으로 생성된 류테린/락토바실러스 루테리에 의해 생성된 글리세롤 발효의 하류 대사산물이 락토바실러스 루테리에 대해 독성인지를 측정하기 위하여, 출원인은 멸균 식염수 또는 MRS 성장 배지에서 DM-물 또는 DM-80% 글리세롤과 함께 인큐베이션된 락토바실러스 루테리의 시간에 따른 콜로니 형성 단위 (CFU)를 비교하였다. 도 18에서 나타낸 것과 같이, 락토바실러스 루테리가 MRS에서 인큐베이션되었을 때 DM 운반물에도 불구하고 CFU의 손실이 없었다. 식염수에서 락토바실러스 루테리를 인큐베이션하는 것은 시간에 따른 생존할 수 있는 CFU의 꾸준한 손실을 초래하지 못하였지만, 이 시간 동안 DM-물 및 DM-80% 글리세롤 사이에 생존성의 차이는 없었고, 이것은 CFU의 손실이 글릴세롤 발효로부터의 임의의 잠재적으로 독성인 화합물, 예컨대 류테린 또는 아크롤레인으로 인한 것이 아닌 것을 시사한다 (도 18). 특히 아크롤레인은 인간에게 독성이고 류테린 생성의 부산물인 것으로 알려져 있기 때문에, 출원인은 다음으로 모든 이용 가능한 글리세롤이 아크롤레인으로 1:1로 전환된 것으로 가정하고, 락토바실러스 루테리의 투여량 및 제형 중에 DM을 통해 제공된 글리세롤의 부피로부터 생성될 수 있는 아크롤레인의 최대 가능한 양을 계산하였다. 도 19에서 나타낸 것과 같이, 이 제형을 통해 가능하게 생성될 수 있을 아크롤레인의 양은 명목상 약 6 μg이다 (참조로, 세계 보건 기구는 1일당 7.5 μg 미만/kg 체중을 권장함) (Gomes et al., 2002). 이들 결과 및 도 8에 제시한 데이터로부터, 출원인은 글리세롤이 부하된 DM이 생체내에서 2가지 유익한 효과, 즉 유익한 운반물의 방출을 둔화시키는 것과 류테린 생성을 위한 기질을 제공하는 효과를 가지는 것을 시사한다.
실시예 13.19: 락토바실러스 루테리는 L-히스티딘-부하된 마이크로스피어로부터 히스타민을 생성하였다
락토바실러스 루테리에 의해 생성된 히스타민은 이전에 H2 수용체를 통해 TNF와 같은 전염증성 사이토카인을 억제하고 동물 모델에서 대장염을 감소시키는 것으로 나타났다 (Thomas et al., 2012; Gao et al., 2015). 본원에 기술된 마이크로스피어 제형은 히스타민 전구체 기질 L-히스티딘을 락토바실러스 루테리에 전달하기 위한 특유한 방법을 제공한다. 이것을 시험관내에서 테스트하기 위하여, DM을 30 mg/ml 및 4 mg/ml L-히스티딘으로 충전하고 L-히스티틴의 공급원만이 DM을 벗어나 확산을 통했을 때 박테리아에 의해 생성된 히스타민의 양을 측정하였다. 도 9에서 나타낸 것과 같이, DM-L-히스티딘 (4 mg/ml)은 박테리아가 DM 없이 4 mg/ml L-히스티딘 용액에서 인큐베이션되었을 때 생성된 것보다 약간만 더 낮은 히스타민 수준을 초래하였다. DM을 고농도의 L-히스티딘으로 부하시켰을 때, 생성된 히스타민의 양은 더 낮은 4 mg/ml 농도보다 6-7배 더 컸고, 이것은 DM-L-히스티딘 (4 mg/ml)보다 약 7배 더 많은 L-히스티딘을 제공하는 DM-L-히스티딘 (30 mg/ml)과 일치한다 (도 9). 더불어, DM 운반물 기질과 관련된 다른 운반물, 예컨대 말토스 및 글리세롤이 히스타민 생성에 부정적으로 영향을 미칠 것인지를 또한 테스트하였다. 글리세롤의 첨가는 L-히스티딘이 용액에 있거나 DM을 통해 제공되는 것과 상관 없이 감소된 히스타민 생성을 초래하지 못하였다 (도 9). 말토스의 첨가로는, L-히스티딘이 용액으로 제공되었을 때 히스타민 생성은 실제로 증가되었지만, L-히스티딘이 DM을 통해 제공되었을 때에는 통계적으로 변화하지 않았다 (도 9).
실시예 13.20: 수크로스 또는 말토스로 충전된 마이크로스피어는 낮은 pH에서 락토바실러스 루테리 생존율을 개선시켰다
경구적으로 소비된 프로바이오틱스는 위가 공복일 때 pH 값이 1.5로 낮은 위에 도달할 때 상당한 pH 도전에 직면한다 (Dressman et al., 1990). 생존할 수 있는 락토바실러스 루테리의 최대 수를 결장에 전달하는 능력을 향상시키는 것이 프로바이오틱스로서의 지속성 및 유효성에 중요하다. 생물막 형태로 DM의 표면에 결합된 락토바실러스 루테리는 산에 노출시 생존율을 증가시켜야 하며, 수크로스 또는 말토스로 충전된 DM은 GTFW-의존적 방식으로 더 큰 생존율을 초래할 수 있어야 한다. 도 10에서 나타낸 것과 같이, DM이 없는 0.1% 미만의 WT 락토바실러스 루테리는 생존할 수 있는 프로바이오틱의 거의 3 로그 손실을 초래하는 pH 2에서 4시간 후에 합성 위산에서 생존하였다. 물-충전 DM의 첨가는 위산에서 WT 락토바실러스 루테리의 생존율을 유의하게 변경시키지 못하였다; 그러나, DM-수크로스 또는 DM-말토스가 WT와 함께 전달되었을 대, 산 스트레스에 거의 1 로그가 더 생존하였다 (도 10). 보호 효과가 DM 루멘 내의 운반물이 아닌 마이크로스피어에 좌우되는 것을 보이기 위하여, 락토바실러스 루테리를 DM이 없이 동등한 양의 확산성 운반물과 함께 인큐베이션하였다. 운반물만의 존재 하에서 산 생존율은 락토바실러스 루테리 단독과 다르지 않았고 (도 10), 이것은 관찰된 보호 효과에 대해 DM 전달 시스템 상의 박테리아 생물막의 중요성을 강력하게 나타냈다.
이런 현상이 GTFW-의존적인지를 조사하기 위하여, 합성 산 생존율을 락토바실러스 루테리의 △gtfW 스트레인을 사용하여 테스트하였고 DM-수크로스 및 DM-말토스의 유익한 효과가 상실된 것을 발견하였다 (도 10). 흥미롭게도, 돌연변이체가 또한 WT와 비교하여 DM이 없이 산 생존의 결핍을 보였고, 이것은 세포 응집 및 생물막 형성에서의 GTFW의 역할 (도 16A-16D)이 합성 위산에서의 생존율에 상당히 기여할 수 있음을 나타냈다.
실시예 13.21: 마이크로스피어은 인간 장 상피 세포에 대한 락토바실러스 루테리 부착을 촉진한다
이 실시예는 DM, DM 루멘 운반물 및 gtfW 유전자의 생성물이, 플랑크톤 세포로서 또는 DM 상의 생물막으로서 시험관내에서 인간 장 세포주 DLD-1 (성인 인간 결장 상피 세포) 및 FHs 74 Int (3-4개월 임신, 소장 상피 세포)에 전달되었을 때 락토바실러스 루테리의 상대적인 부착에 대해 어떤 영향을 미치는지를 조사하였다. 도 11A에서 나타낸 것과 같이, DLD-1 세포 상에서 1시간 인큐베이션 후에, DM이 있거나 없는 △gtfW와 비교하여 상당히 더 많은 WT 락토바실러스 루테리 (DM 없음)가 결장 세포에 부착하였고, 이것은 GTFW가 숙주 세포 부착에 기여한 것을 나타냈다. 수크로스 또는 말토스를 함유한 DM에 부착된 락토바실러스 루테리가 결장 세포에 첨가되었을 때, WT 락토바실러스 루테리의 결장 세포에의 상대적인 부착은 수크로스를 함유한 DM의 경우 4.7배 증가하였고 말토스를 함유한 DM의 경의 5.2배 증가하였다 (도 11A). 비록 전체적으로는 DLD-1 세포보다 더 적은 WT 락토바실러스 루테리가 FHs 74 세포에 부착하였지만, DM-수크로스 또는 DM-말토스와 함께 박테리아를 전달하는 것은 DM이 없는 WT 박테리아에 비교하여 1.8배 (DM-수크로스) 또는 2.7배 (DM-말토스) 더 많이 부착된 박테리아를 초래하였다 (도 11B).
추가로 말토스 및 수크로스의 DM 루멘 운반물이 시험관내에서 상피 세포에 대한 락토바실러스 루테리의 상대적 부착을 개선시킨 것을 보여주기 위하여, 출원인은 DLD-1 세포 상에서 1시간 인큐베이션 후에 WT 및 △gtfW 락토바실러스 루테리 부착을, CSLM을 사용하여 시각적으로 분석하였다 (도 12A 및 12B). 도 11A 및 11B에 제시한 CFU 데이터와 같이, 말토스 또는 수크로스-부하된 DM 상의 생물막으로서 WT 락토바실러스 루테리의 전달은, 육안 검사에 의해 (도 12A), 그리고 CSLM 이미지의 COMSTAT 분석을 사용하여 박테리아 바이오매스를 정량화함으로서 분석되었을 때 (도 12B) 물-부하된 DM 상으로 또는 DM 없이 전달된 것보다 DLD-1 세포에 대해 더 큰 부착력을 지지하였다. 관찰된 부착은 야생형과 비교하여 △gtfW 돌연변이체에서 상당히 감소하였고, 이것은 측정된 CFU와 일치한다 (도 11A).
마지막으로, DM 부착된 WT 락토바실러스 루테리의 뮤신에 결합하는 능력의 효과를 테스트하였다. While cellular binding of 프로바이오틱스의 세포 결합이 군집화에서 역할을 할 가능성이 있는 한편, 건강한 GI 관은 상피 세포의 정점 표면 상에 주요 구성요소가 뮤신인 점액층을 가진다 (Turner, 2009). 실제로, 건강한 공생은 주로 이 층 내에서 발견되므로 제형이 뮤신의 존재 하에 그것의 향상된 프로바이오틱 효과를 유지하는 것이 바람직하다고 여겨진다. 뮤신 부착이 GTF -의존적이 아니지만, 오히려 특이적 뮤신-결합 단백질에 의해 제어되기 때문에 (Miyoshi et al., 2006; Lukic et al., 2012), DM에 결합되는 것이 락토바실러스 루테리의 뮤신에의 부착 능력에 영향을 미치지 못할 것으로 예상되었다. 도 20에서 나타낸 것과 같이, 뮤신 아가 플레이트 상에서 60분 인큐베이션 후 플랑크톤 박테리아 현탁액으로서 또는 DM에 부착된 생물막으로서 전달되었을 때 WT 락토바실러스 루테리의 뮤신에의 상대적 부착에 유의한 차이가 없다.
실시예 13.22: 논의
DM에 부착된 생물막으로서 전달된 단일 용량의 락토바실러스 루테리가 래트 새끼 모델에서 괴사성 장염 (NEC)의 발생률을 50% 감소시키는 것으로 나타났다 (Olson et al., 2016). 실시예 13은 적절한 루멘 운반물과 함께 DM에 결합된 락토바실러스 루테리가 낮은 pH에서 상당히 증간된 생존율을 촉진하였고 시험관내에서 인간 상피 세포에 대한 증가된 부착을 지지한 것을 보여준다. 중요하게 락토바실러스 루테리 및 DM은 FDA에 의해 "일반적으로 안전한 것으로 인정된" 것으로 간주된다 (Grasser et al.). 실제로, DM은 오랫동안 (수년) 아픈 영향 없이 신체에 남겨지는 의료 제품, 예컨대 반흔 상처 드레싱 (Jacobsson et al., 1976)인 Debrisan®, 아동에서 방광요관 역류(vesicoureteral reflux, VUR)를 치료하기 위해 (Stenberg and Lackgren, 1995) 사용된 벌크화 겔인 Deflux®, 및 변 실금(fecal incontinence)을 치료하기 위해 (Hoy, 2012) 항문관에 점막하로 주입된 벌크화 겔인 SolestaTM에 사용되어 왔다. 본원에서 기술되는 결과는 락토바실러스 루테리에 의해 활용되기 위해 DM 루멘에 배치될 수 있는 가능한 유익한 운반물의 작은 하위세트를 보여주며, 많은 적용의 경우 당업자는 루멘 운반물 전구체를 원하는 락토바실러스 루테리-생성 효과에 매칭할 수 있다 (예컨대 류테린 및 히스타민). 더욱이, 이 제형은 현재 FDA에 의해 승인되지 않은 접근법인 프로바이오틱스의 재조합 버전을 제거한다 (Venugopalan et al., 2010).
본 발명자들의 신규한 제형의 흥미로운 특징은 유익한 화합물을 생물막으로서 DM 표면에 부착된 프로바이오틱 박테리아에 직접 전달하는 능력이다 (도 22B). 성장을 자극하기 위해 유익한 화합물 (프리바이오틱스)을 유익한 박테리아와 조합하는 것은 프로바이오틱 연구 및 상업적 응용에서 잘 확립된 개념이다 (Collins and Gibson, 1999; de Vrese and Schrezenmeir, 2008). 프로바이오틱스와 프리바이오틱스 사이의 시너지 효과가 프로바이오틱 박테리아의 전체적인 집단을 효과적으로 증가시키고 (de Vrese and Schrezenmeir, 2008; van Zanten et al., 2014) 염증성 장 질환 (Geier et al., 2007) 및 괴사성 장염 (Asmerom et al., 2015)과 같은 질환의 효과적인 치료를 촉진하는 것을 보여주는 유의한 증거가 있다. 그러나 전통적인 프리바이오틱스의 주요 결점은 그것이 전형적으로 장에서 프로바이오틱 박테리아에 대한 충분한 이용률을 보장하기 위해 숙주에 의해 소화되지 않거나 흡수될 수 없는 탄수화물에 제한된다는 것이다. 개시된 조성물은 프로바이오틱 박테리움 락토바실러스 루테리가 이제: (1) 그것이 더 큰 수로 부착하는 DM과 결합하여; (2) 제거에 대한 저항성을 부여하는 생물막의 형태로; (3) 박테리아 성장을 촉진하는 영양소의 운반물과 함께; (4) 항미생물 류테린 또는 히스타민의 생성을 촉진하는 운반물과 함께; (5) 산-매개된 사멸에 내성임으로써 산성 위를 통해 전달되는 중에 개선된 생존율을 촉진하는 형식으로; 및 (6) 장 상피 세포에 대한 부착을 더 잘 지지하고 그로써 장에서의 지속성을 촉진할 가능성이 있는 것으로 나타난 방식으로 전달된다는 점에서 효과적으로 이런 문제를 해결한다. 숙주에 잠재적으로 유익한 물질의 락토바실러스 루테리-유도된 방출과 관련하여, 류테린은 다른 장내 세균총에 의한 경합을 억제하는 것으로 제시되었고, 히스타민은 항염증 효과를 가지는 것으로 나타났다. 비록 류테린 (예컨대 아크롤레인) 및 히스타민을 생성하기 위해 글리세롤 대사로부터 생성된 이차 대사산물이 고수준의 부작용을 초래할 수 있지만, 본 발명의 제형으로 생성된 최대 양은 아크롤레인 (도 19) 및 히스타민에 대해 각각, 인간에서 문제가 될 것으로 여겨지는 것보다 적은 < 1% 및 < 40%이다 (Maintz and Novak, 2007; Thomas et al., 2012; Engels et al., 2016).
말토스를 운반물로서 사용하는 것은 여러 가지 이유로 특히 가치가 있다; 그것은 락토바실러스 루테리의 글루코실트랜스페라제 (GTFW)의 이 스트레인 (Leemhuis et al., 2013; Bai et al., 2015)이 GTF-의존적 방식으로 락토바실러스 루테리가 응집하는 것을 유도하고 (Walter et al., 2008), 락토바실러스 루테리가 상당히 더 빠르고 높은 세포 밀도 (CFU/ml)로 성장하는 것을 유발하기 위한 기질이다. 이 실험에서 말토스 및 수크로스가 둘 다 락토바실러스 루테리의 마이크로스피어에의 부착에 대해 긍정적인 영향을 나타내며, 락토바실러스 루테리의 인간 장 상피 세포에의 부착을 촉진하고, 위산에서 박테리아 생존율을 개선하는 것으로 나타난다 (도 6A-6C, 7A-7C, 11A 및 11B, 12A 및 12B, 및 13). 스트렙토코커스 뮤탄스 및 락토바실러스 루테리 GTF 단백질은 서열 및 구조가 매우 유사하다. 수크로스는 스트렙토코커스 뮤탄스 및 대부분의 락토바실러스 루테리 GTF 단백질에 대한 단독 기질이며 (Tieking et al., 2005; Walter et al., 2008), 수크로스는 이전에 락토바실러스 루테리 배양이 GTF-의존적 방식으로 빠르게 응집하도록 유발하는 (Walter et al., 2008) 것으로 이전에 나타났다. GTFW 의존적 부착을 유도하는 수크로스의 긍정적 영향은 (글루칸 도메인을 통한) DM에 대한 부착으로서 작용하는 GTFW 및 gtfW 발현을 유도하는 수크로스의 능력으로 인한 가능성이 있다 (도 15A). 실제로, 수크로스가 CM (변이된 글리코시드 결합을 가지는 가교된 글루칸)에 대한 락토바실러스 루테리 부착에 영향을 미치지 못하는 것은 이 개념을 지지한다. 수크로스-의존적 생물막 형성은 이전에 락토바실러스 루테리의 설치류 스트레인 100-23에서 2-구성요소 조절 시스템에 연결되었다 (Frese et al., 2011; Su and Ganzle, 2014); 그러나, 이런 현상에 필요한 유전자는 이 연구에서 사용된 락토바실러스 루테리의 인간-유래 스트레인 (23272 / DSM 20016)에는 없는 것으로 나타난다. 수크로스가 그것의 수크로스 포스포릴라제 매개된 대사를 통해 이 연구에서 사용된 락토바실러스 루테리의 바람직한 탄소원이기 때문에 (Ganzle and Follador, 2012), 수크로스가 생물막 형성 및 증가된 DM에의 부착에 긍정적인 영향을 미쳤고 수크로스의 존재 하에 락토바실러스 루테리의 증가된 배가 시간으로 인한 것일 수 있다는 것은 놀라운 것이 아니었다. 글루코스 (탄소원이지만 gtfW 유도제 또는 GTFW 기질이 아님) 및 프룩토스 (gtfW의 유도제이지만, 탄소원 (도 15A 및 15B) 또는 GTFW에 대한 기질이 아님)가 DM에 대한 부착을 향상시키지 못한 것은 박테리아 생리를 이해하는 것이 유익한 루멘 운반물을 선택하는 데 중요할 것임을 시사한다.
숙주 내에서의 락토바실러스 루테리의 생존성 및 지속성에 중요한 많은 파라미터는 유익한 운반물을 함유한 DM의 표면 상의 생물막으로서 락토바실러스 루테리를 전달함으로써 개선될 수 있다. 낮은 pH 도전 후 이용 가능하고 장 상피 세포에의 증가된 부착을 지지하는 더 많은 생존할 수 있는 박테리아를 사용하여, 숙주 내에서 이용 가능한 프로바이오틱 박테리아의 결과적인 팽창은 증가된 잠재적으로 유익한 효과를 가져야 한다. 추가로, 표적화된 영양소 및 기질은 DM 표면 상에 부착된 박테리아에 직접 전달될 수 있고, 이것은 지금까지 숙주에 의해 소화될 수 없는 탄수화물로 제한되어 있던 경구로 소비된 락토바실러스 루테리와 공동으로 전달될 수 있는 화합물 유형에 대해 광범위한 영향을 미친다.
실시예 14: 래트에서 괴사성 장염으로부터의 보호
NEC 발생률 및 생존율을 측정하기 위하여, 래트 새끼를 조기에 분만시키고, 단일 장 Lr 치료를 받게 하고, 실험적 NEC (고칼로리 사료/저산소증/저체온증)를 적용하였다. 새끼를 분만 후 96시간 후 또는 임상적 NEC가 발생하였을 때 희생시켰다. 조직학적 평가 및 염증 마커의 측정을 위해 조직을 수득하였다. 장 점막 잘벽 통합성을 장으로 투여된 FITC-덱스트란의 혈청 수준에 의해 평가하였다. Lr의 생물발광 스트레인을 구성하여 GI 관에서의 지속성을 평가하였다. Lr의 GtfW-결핍 스트레인을 발생시켜서 생물막 형성의 역할을 평가하였다. 수크로스- 또는 말토스-부하된 DM에 부착된 Lr은 부하되지 않은 DM에 부착된 Lr과 비교하여 실험적 NEC를 상당히 감소시켰다. 수크로스- 또는 말토스-부하된 DM에 부착된 Lr은 생존율을 개선시켰고, 장 투과도를 감소시켰으며, 장 염증을 감소시켰다.
실험적 NEC의 신생 래트 모델. 모든 동물 연구를 더 리서치 인스티튜트 앳 네이션와이드 칠드런스 하스피탈의 IACUC에 의해 승인된 프로토콜 #AR15-00012에 따라 수행하였다. 임신 연령 20.5일의 스프라그-다울리 래트 새끼를 CO2 마취 하에 제왕 절개를 통해 예정된 임신 댐(timed-pregnant dams) (Envigo, Indianapolis, IN)에서 분만시켰다. 분만 직후에, 새끼를 무작위로 실험군으로 나누어 위의 위관영양법을 통해 단일 장 Lr 또는 대조군 처리를 받게 하였다. 그런 후 새끼를 1974년에 Barlow 등에 의해 처음 도입된 NEC를 유도하기 위한 스트레스 프로토콜 (Freire et al., 2011; Frese et al., 2011)을 변형시킨 본 발명자들의 잘 확립된 실험적 NEC 모델 (Dressman et al., 1990; Freire et al., 2016)을 적용하였다. 간단히 설명하면, 새끼를 다음의 반복된 에피소드를 겪게 하였다: 1) 구강위 위관영양법을 통해 매일 5회 75 mL의 Esbilac (Pet-Ag, New Hampshire, IL) 중의 5 g Similac 60/40 (Abbott Nutrition, Columbus, Ohio)으로 조합하여 836.8 kJ/kg/일을 제공하는 고장성, 고칼로리식 사료; 2) 각각의 날에 저산소증 및 저체온증을 3회 (90초 동안 FiO2 < 1.5%로 보정된 N2 가스 챔버에 직접 배치한 후 4℃ 환경에 10분 동안 배치함); 및 3) 출생 후 첫째 말에 2 mg/kg 리포다당 (LPS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)의 위를 통한 위관영양법. 이들 각각의 에피소드의 사이에, 새끼를 35℃의 인큐베이터에 하우징하였다. 모유수유 대조군 새끼를 제왕절개 분만 직후 대리 댐에 배치하였고 실험적 스트레스에 노출시키지 않았다.
Lr 생물막 제제 및 투여. 인간 대변-유래 락토바실러스 루테리 23272를 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC, Manassas, VA)로부터 구입하여 de Man, Rogosa, 및 Sharpe (MRS) 브로스 (Fisher Scientific, Pittsburg, PA)35에서 밤새 37℃에서 5% CO2 하에 성장시켰다. 플랑크톤 Lr 투여를 위해, Lr을 펠릿화하고 멸균 0.9% 식염수에 재현탁하고 위 위관영양법을 통해 신생 새끼에게 2x108 CFU/새끼의 용량 (다른 공개된 연구와 일치하는 용량)으로 투여하였다 (Gao et al, 2015). 생물막 상태로 투여된 Lr의 경우, Lr을 앞서 기술된 것과 같이 투여 전에 DM에 도입하였다 (Eaton et al., 2011). 간단히 말하면, 멸균된, 건조한 DM (세파덱스 G-25 Superfine, GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA)을 물에 50 mg/mL로 수화시킨 후 20분 동안 오토클레이빙하였다. 수크로스 또는 말토스를 함유한 처리 그룹의 경우, DM을 용액으로부터 제거하고 멸균된 1 mL의 당 용액에 수집하였다. 용액을 와류 혼합하고 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후 DM을 진공 필터를 사용하여 용액으로부터 제거하고 재현탁된 박테리아를 함유하고 있는 튜브로 멸균 루프를 사용하여 무규적으로 스크래핑하였다. Lr을 DM과 30분 동안 실온에서 일큐베이션하여 결합 및 생물막 형성을 촉진하였다. 그런 후 새끼에게 최종 용량이 2x108 CFU/새끼가 되도록 100 μL의 박테리아-DMA 용액으로 위관영양시켰다.
실험적 NEC의 발생률 및 중증도. 분만 직후 새끼를 1 내지 7개의 실험 그룹으로 무작위로 나누어서 위 위관영양법을 통해 다음 처리 중 하나를 받게 하였다: 1) 100 μL 멸균수 (비히클 대조군) (n=49마리); 2) DM-Sucr (n=44마리); 3) 2x108 CFU Lr (n=46마리); 4) 2x108 CFU Lr + DM (n=43마리); 5) 2x108 CFU Lr + DM-Sucr (n=50마리); 또는 6) 2x108 CFU Lr + DM-Malt (n=47마리). 추가 그룹의 새끼는 대리 댐으로 복귀시키고 모유 수유 미스트레스 대조군으로서 삼았다. 단일 처리 용량을 받은 후, 새끼들에게 앞서 기술된 실험적 NEC를 적용하였다. NEC 징후가 발생되었을 때 (혈변, 중증의 복부 팽만, 혼수, 호흡 곤란, 청색증) 새끼를 희생시켰다. 모든 나머지 새끼를 분만 후 96시간 후 희생시켰다. 희생시, 장 조직을 수득하여 10% 포르말린에 24시간 동안 고정시켰다. 고정된 조직을 파라핀-삽입한 후 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)-염색된 횡단면을 제조하였다. 2명의 독립적인 관찰자가 각각의 단면을 맹검 방식으로 Caplan 등에 의해 처음에 확립된 조직학적 손상 등급 척도 (Dressman et al., 1990; Freire et al., 2016; Geier et al., 2007)를 사용하여 등급을 매겼다. 조직학적 손상을 다음과 같이 분류하였다: 등급 0, 시각적으로 조직학적 융모 손상이 없음; 등급 1, 원위 융모 장세포 박리; 등급 2, 중간 융모 수준으로 장세포의 박리; 등급 3, 크립트가 보존되는 전체 융모의 손실; 및 등급 4, 경벽 괴사 (도 22A). 실험적 NEC를 등급 2 이상의 손상 점수로서 정의하였다.
장 투과도. 분만 직후 새끼를 무작위로 다음 중 하나를 받게 하였다: 1) 100 μL 멸균수 (비히클 대조군) (n=20마리); 2) 2x108 CFU Lr (n=20마리); 3) 2x108 CFU Lr + DM-Sucr (18마리); 또는 4) 2x108 CFU Lr + DM-Malt (n=15마리). 추가 그룹의 새끼는 대리 댐으로 복귀시키고 모유 수유 미스트레스 대조군으로서 삼았다. 그런 후 새끼에게 실험적 NEC 프로토콜을 48시간 동안 적용하였고, 그 때 각각은 멸균 PBS에 현탁된 1500 mg/kg의 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 표지된 덱스트란 (FD70, 분자량 70,000) (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO)을 구강위 위관영양법을 통해 받았다. 새끼를 4시간 후에 희생시키고 혈청을 BD 마이크로테이너 SST 튜브 (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ)에 수집하였다. 혈청을 추출하고 형광을 형광 플레이트 판독기 (SpectraMax M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 492/518 nm 필터 세트를 사용하여 측정하였다. 그런 후 각 새끼에 대해 FD70의 혈장 농도를 공지의 ED70 농도의 1:2 연속 희석으로부터 생성된 표준 곡선을 사용하여 외삽하였다.
제왕절개 분만 후에, 새끼를 무작위로 나누어 다음 2가지 장 처리 중 하나를 받게 하였다: 1) 2x108 CFU Lr-Luc (n=6마리); 또는 2) 2x108 CFU Lr-Luc + DM-Sucr (n=6마리). 그런 후 새끼에게 실험적 NEC를 적용하였다. 48시간 후 모든 새끼를 희생시키고 그들의 GI 관을 수득하였다. 소장 및 맹장/결장의 내용물을 분리하고 0.7 mm 비드를 사용하는 비드-치기에 의해 2.5분 동안 균등화하였다. 2 mM D-루시페린 (루시페라제 기질)을 각 조직 균등물에 첨가하고 생물발광을 Xenogen IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (PerkinElmer, Inc, Waltham, MA)을 사용하여 측정하였다.
통계적 분석. 모든 데이터를 평균 ± SEM으로서 표시한다. 일원 변량 분석과, 이어서 쌍 비교를 GraphPad Prism 7 (La Jolla, CA) 및 SAS 9.4 소프트웨어 (SAS Institute, Inc., Cary, NC)를 사용하여 수행하였다. 동물 생존율에 대해, 로그-순위 테스트를 수행하였다. RNA 발현에 대해, IQR 방법을 사용하여 아웃라이너를 확인하였다. 통계적 유의성을 p ≤0.05로서 정의한다.
결과
NEC 발생률 및 중증도에 미치는 Lr 생물막 형성의 영향. 실험적 프로토콜을 적용하지 않은 미처리 새끼의 거의 2/3이 NEC를 발생하였다 (도 22B). NEC의 발생률은 DM-Sucr 단독 (p=0.343) 또는 플랑크톤 Lr 단독 (p=0.334)을 받은 새끼의 경우 통계적으로 변하지 않았다. 대조적으로, 미처리 새끼와 비교하여, Lr + DM을 받은 새끼는 NEC 발생률에서 상당한 감소를 나타냈다 (p<0.001). 마지막으로, 단일 용량의 Lr + DM-Sucr 또는 Lr-DM-Malt는 NEC 발생률에서 각각 14% (p<0.001) 및 15% (p<0.001)로 추가의 감소를 초래하였다. 중요하게, Lr + DM과 비교하여, Lr + DM-Sucr 및 Lr + DM-Malt는 둘 다 NEC 중증도에서 상당한 감소를 초래하였다 (각각 p=0.045 및 p=0.022). 모우 수유 새끼는 NEC를 발생시키지 않았다.
생존율에 미치는 Lr 생물막 형성의 영향. 모든 모유 수유 새끼는 전체 96시간 프로토콜에 생존하였다 (도 23). 대조적으로, 프로토콜을 적용한 미처리 새끼의 20.4%만이 살아남았고 96시간 후 종점 기준 (혼수, 혈변, 고통스러운 호흡, 청색증)이 없었다. DM-Sucr (18.2%), Lr (23.9%), 또는 Lr + DM (25.6%)으로 처리된 새끼는 생존율에 개선이 없었다. 그러나, 단일 용량의 Lr + DM-Sucr 또는 Lr + DM-Malt로 처리된 새끼는 미처리 새끼와 비교하여 생존율이 상당히 개선되었다. Lr + DM-Sucr로 처리된 새끼는 58.0%의 생존율을 나타낸 한편 (95% CI 1.57-4.37로 2.62의 위험 비율), Lr + DM-Malt로 처리된 새끼는 55.3%의 생존율을 나타냈다 (1.72-4.84의 95% CI로 2.88의 위험 비율).
장 점막 투과도에 미치는 Lr 생물막 형성의 형향. 실험적 NEC 프로토콜의 48시간 후에, 미처리 새끼는 장에 FD-70 투여 후 4시간 후에 FD-70의 상당히 높은 혈청 수준에 의해 입증되는 바, 모유 수유한 대조군 새끼와 비교하여 상당히 증가된 장 투과도를 나타냈다 (31.99 ± 6.5 μg/mL 대비 2.22 ± 0.3 μg/mL; p=0.003) (도 24). 비록 플랑크톤 Lr 단독으로 처리된 새끼가 혈청 FD-70에서 약간의 증가를 보였지만 (17.32 ± 5.0 μg/mL; p=0.083), 단일 용량의 Lr + DM-Sucr 또는 Lr + DM-Malt로 처리된 새끼는 혈청 FD-70에서 상당한 감소를 나타냈다 (10.83 ± 1.2 μg/mL; p=0.004, 및 8.98 ± 3.2 μg/mL; p=0.007).
GI 관에서 Lr 지속성에 미치는 Lr 생물막 형성의 영향. 실험적 NEC 프로토콜의 48시간 후에, 단일 용량의 플랑크톤 Lr을 받은 새끼의 소장에서 검출된 발광의 양은 6.2 x 103 ± 1.2 x 103 RLU/mg 조직이었고, 그것은 Lr + DM-Sucr를 받은 새끼에서, 비록 유의한 것은 아니지만 (p = 0.322) 1.1 x 104 ± 4.8 x 103 RLU/mg 조직으로 증가하였다 (도 25). 대조적으로, 대장에서 Lr 단독을 받은 새끼와 비교하여 Lr + DM-Sucr를 받은 새끼에서 상당히 더 많은 발광이 검출되었다 (6.4 x 104 ± 1.7 x 104 대비 2.3 x 104 ± 4.2 x 103 RLU/mg 조직, p = 0.038).
염증의 마커에 미치는 Lr 생물막 형성의 영향. 실험적 NEC를 적용한 미처리 새끼뿐만 아니라, 단일 용량의 Lr로 처리된 새끼는 IL-6, IL 1-β, CCL-2, CXCL-1, 및 IL-10의 상당한 상승을 나타냈다 (도 26A-26E). 그러나, 이들 사이토카인의 각각의 발현은 새끼가 단일 용량의 Lr + DM-Sucr 또는 Lr + DM-Malt로 처리되었을 때 실질적으로 감소하였다. 플랑크톤 Lr로 처리된 새끼와 비교하여, Lr + DM-Sucr 또는 Lr + DM-Malt의 투여는 IL-6, IL-1β, CCL-2, 및 IL-10의 발현의 통계적으로 유의한 감소로 이어졌다. CXCL-1 발현은 Lr + DM-Sucr가 아닌 Lr + DM-Malt의 투여로 상당히 감소하였다.
NEC 발생률 및 중증도에 미치는 변경된 생물막 형성의 영향. 이 실험에서, 물 단독을 받은 대조군 새끼는 65%의 NEC 발생률을 나타냈다 (도 27). 대조적으로, Lr-DM-Sucr 또는 Lr-DM-Malt를 받은 새끼는 각각 21% (p < 0.001) 및 22% (p = 0.002)의 상당히 감소된 NEC 발생률을 나타냈다. 그러나, 이들 보호 효과는 DM-결핍 처리 Lr-Sucr 및 Lr-Malt의 투여로 상실되었고, 각각 52% (p = 0.014) 및 51% (p = 0.018)의 NEC 발생률을 보였다 (도 27). 유사하게, Lr의 보호 효과는 GtfW-결핍 처리 △GtfW-DM-Sucr 및 △GtfW-DM-Malt의 투여로 상실되었고, 각각 50% (p = 0.044) 및 41% (p = 0.035)의 NEC 발생률을 보였다 (도 27). 모유 수유된 새끼는 NEC를 발생시키지 않았다.
논의
Lr은 원래 인간 모유로부터 분리되었고 (Ghouri et al., 2014) 건강한 인간의 장에 존재한다 (Gomes et al., 2002; Gustave et al., 2013). 인간-유래 Lr 스트레인은 2가지 구별되는 계통군인 계통군 II 및 계통군 VI에 속하며 (다중 유전자좌 서열분석을 토대로 함), 계통군 II 스트레인만이 항염증성 및 항미생물 능력을 모두 가지고 있다. 본 발명자들의 현재 연구를 위해 사용된 Lr의 스트레인은 계통군 II Lr ATCC23272 (DSM 20016으로도 알려져 있음)였고, 원래 건강한 인간의 대변으로부터 분리되었다 (Hall-Stoodley et al., 2004). ATCC23272를 포함한, Lr의 일부 계통군 II 스트레인은 시트로박터 로덴티움으로 자극된 결장 상피 세포에 의해 사이토카인 및 케모카인 생성을 모두 하향 조절할 수 있다 (Heydorn et al., 2000; Higgins et al., 1999). Lr은 또한 청소년 및 성인 동물에서 모두 장 염증을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (Hoy, 2012; Ito et al., 2008). 나아가, Lr의 계통군 II 스트레인은 항미생물 화합물을 생성하며, 그 중 기질인 글리세롤로부터 유래되는 류테린이 가장 잘 특성화되어 있다 (Jacobsson et al., 1976). 류테린은 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 진균, 및 원생동물과 같은 수많은 병원성 미생물의 성장을 억제하는 강력한 항미생물 화합물이다 (Johnston et al., 2012). 중요하게, 계통군 II 스트레인은 표면에 부착된 박테리아의 군집체 구조인 생물막을 쉽게 형성하고, 그곳에서 박테리아는 세포외 중합체 물질 (EPS)의 자체 생산된 매트릭스에 둘러싸인다. 더불어, Lr은 DM의 가교된 덱스트란에 대해 큰 친화도를 가지고 있어서, 우수한 결합 및 후속되는 생물막 형성을 초래한다 (Eaton et al., 2011). 이들 이유로, Lr이 복통 (Justice et al, 2012), 설사 (Kailasapathy, 2014), IgE-매개된 습진 (Kralj et al., 2004), 및 NEC (Kralj et al., 2002)와 같은 인간 질환에 유익하다는 출적된 증거와 함께, Lr을 현재 실험에 사용하기 위해 선택하였다.
이 연구에서, 출원인은 생물막 상태로 DM에 부착된 단일 용량의 Lr의 투여가 실험적 NEC의 방지를 위해 Lr의 단일 용량의 플랑크톤 투여보다 우수한 것을 보였다. 중요하게, Lr 생물막의 유익한 효과는 수크로스 또는 말토스의 DM 루멘에의 첨가로 상당히 향상될 수 있다. NEC 발생률을 감소시키는 것 외에, Lr + DM-Sucr 및 Lr + DM-Malt는 생존율을 증가시켰다. 이들 처리는 실험적 NEC 중에 장 투과도를 감소시킴으로써, 장 장벽 기능을 보존하였고, 장관에서 Lr의 지속성을 촉진하였다. 중요하게, 이런 프로바이오틱 투여 전략은 또한 NEC의 특징인 과도한 염증을 감소시켰다.
DM은 생분해성이며, 비면역원성이고, 돌연벼이를 생성하지 않으며, 알레르기를 유발하지 않고, FDA에 의해 일반적으로 안전한 것 (GRAS)으로 인정된다. 그것은 지금까지, 변 실금의 치료를 위해 항문관에 점막하로 주입된 벌크화 겔 (Lebeis et al., 2008)인 SolestaTM, 반흔 상처 드레싱 (Leemhuis et al., 2013)인 Debrisan®, 방광요관 역류를 치료하기 위해 사용된 벌크화 겔 (Lin et al., 2008)인 Deflux®을 포함한 수많은 FDA-승인 의료 제품에 사용되어 왔다. 이들 DM의 장기간 사용은 인간 투여에서 안전성에 대한 증거를 제공한다. 추가로, DM 루멘은 Lr에 유용하지만 생체내로 제한되는 화합물로 충전될 수 있고, 그것은 시간이 지남에 따라 장 투여 후 GI 관을 이동함에 따라 DM에 부착된 Lr (Lr + DM)로 직접 확산된다.
프로테오박테리아 (일반적으로 관찰되는 많은 그람 음성 병원체를 포함함)2의 증가하는 유병률과 같은 미생물 군집체의 변화는 유아에서 NEC의 개시에 선행하는 것으로 보고되었다 (Lukic et al., 2012). 한 대규모 관찰적 전향적 연구는 대조군 유아에 비교하여 NEC가 발병된 유아에서 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria)의 증가된 비율 및 네거티비큐트(Negativicutes)의 감소된 비율을 보였다 (Cleusix et al., 2007). 별도의 체계적 리뷰는 조산아에서 NEC에 앞서 프로테오박테리아의 증가 및 후벽균(Firmicutes) 및 의간균류(Bacteroidetes)의 감소를 입증하는 유사한 발견을 제공하였다 (Collins and Gibson, 1999). 일부 경우에 병원체 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)는 NEC 발병과 결정적으로 결부되어 있다 (Macfarlane et al., 2007; Macfarlane et al., 2005). 이들 발견은 장내 미생물 불균형이 NEC의 중심 발달이라는 추가 증거를 제공한다.
실시예 15: 래트에서 괴사성 장염에 의해 유도된 신경발달 결핍으로부터의 보호
출원인은 말토스가 부하된 덱스트라노머 마이크로스피어 (Lr-DM-말토스)와의 인큐베이션에 의해 생물막을 형성하도록 유도된 Lr이 NEC의 발생을 감소시키고 NEC의 동물 모델에서 염증성 사이토카인 생성을 감소시킬 수 있음을 보였다. 기술분야에는 NEC에 살아남은 신생아에서, 절반 이상이 어느 정도의 인지 장애 및 신경 발달 결핍을 나타내는 것이 알려져 있다. 본 연구는 생물막-코팅된 마이크로스피어, 예컨대, Lr-DM-말토스 마이크로스피어가 설치류 모델에서 NEC-유발 신경발달 결핍의 발생을 약화시키거나 제거할 수 있는 것을 다양한 테스트를 사용하여 보여준다. Y 미로 테스트 및 신규 물체 인식 과제를 사용하였고, 하기에서 보다 상세하게 기술한다.
NEC에 노출된 새끼는 체력, 협응, 바로잡기 메커니즘, 귀 열림 및 청각 반사 테스트를 포함한 발달 이정표에 상당히 더 느리게 도달하였다 (모유 수유 미손상 새끼와 비교하여 p<0.05). NEC-노출된 새끼의 Lr-DM-말토스로의 처리는 이들 발달 상의 NEC-유도된 지연을 없앴다. 나아가, 행동 테스트 Y-미로, 신규 물체 및 고가 플러스 미로를 사용하여, NEC에 노출된 래트는 탐색 및 학습에 대해 감소된 호기심을 나타낸 한편 (BF 미손상 새끼와 비교하여 p<0.05), Lr-DM-말토스 처리는 학습 능력을 개선시켰다 (미처리 NEC 새끼와 비교하여 p<0.05). NEC에 대한 노출은 Y-미로 및 신규 물체 인식 과제에서의 행동에 의해 입증되는 바 작업 및 단기 기억에 부정적 영향을 미쳤다 (BF 미손상 새끼와 비교하여 p<0.05). NEC의 부정적 영향은 Lr-DM-말토스에 의해 약화되었다 (NEC-노출된 래트 또는 플랑크톤 Lr-처리된 래트와 비교하여 p<0.05). NEC-노출된 래트는 고가 플러스 미로 상에서 불안-유사 행동을 보였고, 그것은 Lr-DM-말토스에 의해 완화되었다 (NEC-노출된 래트 또는 플랑크톤 Lr-처리된 래트와 비교하여 p<0.05). 마지막으로, Lr-DM-말토스는 반즈 미로 테스트 상에서 기억 및 공간 학습 능력을 개선시켰다 (미처리 NEC 새끼와 비교하여 p<0.05).
괴사성 장염 (NEC)은 미숙아에서 이병률과 사망률의 선두 요인이다. NEC의 생존자들이 나중에 인지 장애를 나타낸다는 것 점점 더 인식되고 있다. 여기서 출원인은 래트 새끼가 실험적 NEC에 노출된 후 생물막 상태로 투여된 프로바이오틱 락토바실러스 루테리 (Lr)가 개선된 새끼 발달, 인지, 기억, 및 학습 능력을 H이어지는 것을 입증하였다.
실시예 15.1: - Y 미로 테스트
Y 미로 테스트: Y 미로는 단기 작업 기억의 테스트이다. 설치류는 새로운 환경을 탐색하는 것을 선호하며, Y형 미로에 놓였을 때 (도 33A 참조, A, B, 및 C로 표지된 팔이 있음), 건강한 설치류는 연속적으로 2회 미로의 동일한 팔을 참색하는 것을 피한다. 예를 들어, 팔 A를 탐색한 후, 동물은 B 또는 C에 들어갈 수 있다. B 또는 C를 탐색한 후에는 동물은 전형적으로 팔 A에 다시 들어가지 않는다; 그들은 새로운 팔을 선호한다. 작업 기억에 결함이 있는 동물은 이런 선호도의 감소를 보인다. 그러므로, 독특한 트라이애드의 수 (미로의 새로운 팔을 탐색할 발생률을 나타냄)를 8분 테스트 중에 정량화할 때, 독특한 트라이애드의 감소는 작업 기억의 감소를 반영한다.
래트 그룹의 제조: Lr을 말토스가 부하된 덱스트라노머 마이크로스피어와의 인큐베이션에 의해 생물막을 형성하도록 유도하였다 (Lr-DM-말토스). 래트 새끼를 실험적 NEC를 유도하도록 생후 처음 4일 동안 저산소증/저체온증/고칼로리 사료의 반복된 에피소드에 노출시켰다. 새끼를 무작위로 처리 없음 (도 29에서 "NEC-스트레스"), 플랑크톤 Lr (자유롭게 삼) (0.1 ml의 1x108 CFU/새끼) (도 29에서 "NEC 스트레스 + Lr"), 또는 Lr-DM-말토스 (생물막 상태) (0.1 ml의 1x108 CFU 및 2 mg의 DM/새끼) (도 29에서 "NEC 스트레스 + Lr-DM-말토스") 중 어느 하나를 받게 하였다. 이들 래트를 NEC 유도 조건에 생후 처음 4일 동안 노출시키고, 그런 후 생존한 새끼를 대리 댐에 의해 양육하였고 4주령이 되었을 때 Y 미로 행동 테스트를 받을 때까지 방해받지 않은 상태로 두었다. 대조군 새끼를 모유 수유하였고 (BF) 손상되지 않았다 (도 29에서 "모유 수유"). 새끼로서 NEC 패러다임에 노출된 래트는 Y 미로 상에서 독특한 트라이애드의 상당한 감소를 보였다. 이것은 플랑크톤 Lr을 받은 래트에서는 방지되지 않았지만, Lr-말토스가 제공된 래트에서는, Y 미로 상에서 독특한 트라이애드의 수에 감소가 없었다. 이것은 Lr-DM-Malt가 작업 기억에서 NEC-유도된 감소를 방지히는 것을 나타낸다.
실시예 15.2: - 신규 물체 인식 과제
신규 물체 인식 과제: 설치류는 친숙한 물체에 비교하여 신규한 물체를 탐색하는 것을 선호한다. 그러나, 이런 선호도가 분명해지기 위해서는, 설치류는 친숙한 물체를 인식하고 기억할 필요가 있다. 신규 물체 인식 과제에서, 래트를 2개의 병 뚜껑이 있는 케이지에 10분 동안 넣어둔다. 10분이 끝났을 때, 래트를 케이지 밖으로 꺼내어 홈 케이지에 3시간 동안 넣어둔다. 다음에, 래트를 병 뚜겅 (친숙한 물체) 및 페트리 접시 (신규 물체)가 들어있는 케이지에 5분 동안 넣어둔다. 건강한 동물은 친숙한 물체에 비교하여 신규 물체를 조사하는 데 더 많은 시간을 보내는 것을 선호한다 - 이것을 도 30에서 도시된 선호도 지수 (신규 물체를 조사하는 데 보내는 시간의 양/친숙한 물체를 조사하는 데 보내는 시간의 양)를 계산함으로써 정량화한다.
이 실험에서, 래트를 생후 처음 4일 동안 실시예 15.1에서 논의한 NEC 패러다임에 노출시켰다. 그런 후 래트를 대리 댐에 의해 양육하고 4주령이 되었을 때 행동 테스트를 할 때까지 방해받지 않은 상태로 두었다. 대조군 래트는 모유 수유하였고 그들의 댐에 의해 양육하였다. 새끼로서 실험적 NEC를 유도하기 위해 저산소증/저체온증/고칼로리 사료의 NEC 패러다임에 노출된 래트는 신규 물체에 대한 선호도에서 유의한 감소를 보였다 (도 30). 이것은 플랑크톤 Lr이 제공된 (태어난 날에 단일 경구 투여) 래트에서는 방지되지 않았지만, Lr-DM-말토스가 제공된 (태어난 날에 단일 경구 투여) 래트에서는, 신규 물체 선호도 지수가 감소하지 않았다. 이것은 Lr-DM-Malt가 물체 인식 및 기억에서 NEC-유도된 감소를 방지하는 것을 나타낸다.
실시예 16: 실험적 괴사성 장염 후 신경 발달을 촉진하는 신규한 프로바이오틱 전달 시스템
16.1 생물막 상태의 락토바실러스 루테리의 생성
생물막 상태의 락토바실러스 루테리 (Lr)의 제조를 이전에 기술된 것과 같이 수행하였다 (Olson et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 2018;315(3):G408-G19; Olson et al., Journal of pediatric surgery., 2016;51(6):936-41). 간단히 설명하면, 락토바실러스 루테리 23272를 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (ATCC, Manassas, VA)으로부터 얻어서 de Man Rogosa and Sharpe (MRS) 브로스 (Fisher Scientific, Hampton, NH)에서 37℃에서 5% CO2에서 배양하였다. 플랑크톤 Lr (자유롭게 살아감)을 펠릿화하고 멸균된 0.9% 식염수에 재현탁하였다 (1x109 CFU/ml). Lr을 생물막을 형성하도록 말토스가 사전 부하된 멸균 덱스트라노머 마이크로스피어 (DM, 50 mg/ml, 세파덱스 G-25 Superfine, GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 유도하여 Lr-DM-말토스 (생물막 상태)를 형성하여, 1x109 CFU 및 20 mg DM/ml을 초래하였다. 플랑크톤 및 생물막 상태의 프로바이오틱스뿐만 아니라, 대조군 처리를 호박색 에펜도르프 튜브에 보관하여 결합을 유지하였고, 위 위관영양법에 의해 맹검으로 래트 새끼에 투여하였다. 가림 해제에 대한 핵심은 단지 모든 실험 결과를 측정한 후에 드러냈다.
16.2 실험적 NEC의 신생 래트 모델.
예정된 임신기 스프라그-다울리 댐 (Envigo, Indianapolis, IN)으로부터 신생 래트 새끼를 E20.5에서 제왕절개를 통해 조기 분만시켰다. 새끼를 무작위로 PBS 대조군 (NEC), 0.1 ml의 플랑크톤 Lr (1x108 CFU/새끼) 또는 0.1 ml의 Lr-DM-말토스 ((Lr (생물막), 1x108 CFU 및 2 mg DM/새끼) 중 어느 하나를 위 위관영양법을 통해 받게 하였다. NEC를 유도하기 위하여, 래트 새끼를 96시간 주기 동안 저산소증, 저체온증, 및 고칼로리 사료의 반복된 에피소드에 노출시켰다 (도 31). 고칼로리 사료는 836.8 kJ·kg-1·일-1의 조합된 칼로리를 제공하는 75 mL의 Esbilac (Pet-Ag, New Hampshire, IL) 중에 15 g Similac 60/40 (Abbott Nutrition, Columbus, OH)을 함유하는 증가하는 부피의 처방의 매일 5회 위관영양법 급식으로 이루어졌다. 매일 고칼로리 급식을 저산소증 (90초 동안 <1.5%의 산소) 및 저체온증 (10분 동안 4℃ 환경)의 3회 에피소드와 조합하였다. 새끼에게 생후 첫째 날에 2 mg/kg의 리포다당 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 위 위관영양법으로 제공하였다. 새끼를 온도 (35℃) 및 습도 제어된 Bistos 아기 인큐베이터 (BT-500, Medical device depot, MD)에 하우징하였다. 96시간 주기의 스트레스에 생존한 새끼를 생후 5일 째에 강화 댐에 넣었다. 추가적인 대조군 동물은 실험적 NEC에 노출되지 않은 모유 수유한 (BF) 미손상 새끼였다.
16.3 래트 새끼에서 발달 이정표의 평가
실험적 NEC의 스트레스에서 생존한 새끼를 생후 5일 째에 나이를 매칭시킨 BF 대조군 새끼와 함께 강화 댐에 배치하였다. 23일 동안 새끼의 체중을 매일 측정하고 발달 이정표 (눈 및 귀 열림, 표명 및 공중 바로잡기 반사, 앞다리 잡기의 강도, 청각 놀람, 음성 주지성, 절벽 회피, 및 오픈 필드 횡단)를 평가하였다. NEC 후의 출산 후 발달을 도 32에 도시한 시각표를 따라 조사하였다. 발달 이정표를 측정하였다. 모든 테스트를 세포 배양 후드에서 새끼가 받은 치료에 대해 맹검인 조사자들에 의해 수행하였다.
16.3.1 공중 바로잡기
공중 바로잡기 테스트는 미로(labyrinthine), 신체 바로잡기 및 협응을 측정한다. 이 테스트를 위해, 4겹으로 접은 수건을 가열 패드 상에 배치하였다. 래트 새끼를 대략 10인치의 높이에서 부드럽게 거꾸로 잡고 있다가 아래의 수건 위로 놓아주었다 (도 33A). 통과 등급은 새끼가 우회전하여 패드 위에 네 발 모두로 착지한 경우 주었다. 새끼가 2일 연속으로 네 발 모두로 착지할 때까지 테스트를 매일 반복하였다. 두 번째 연속일에 테스트를 통과한 생후 일을 기록하고 테스트 통과로 표시하였다.
16.3.2 앞다리 잡기
앞다리 잡기 테스트는 힘의 척도이다. 이 테스트를 위해, Q-팁 스틱을 4겹으로 접은 수건 및 그 밑에 가열 패드가 들어 있는 박스의 상부에 매달아 두었다. 새끼를 앞다리가 스틱에 올려져 있는 상태로 붙잡고 있다가 풀어주었다 (도 33C). 새끼가 스틱을 붙잡고 있는 시간의 길이를 측정하였다. 만약 새끼가 즉시 떨어지면, 새끼를 다시 테스트하지 않았다. 통과 등급은 새끼가 적어도 2초 동안 스틱 위에 붙들고 있는 경우 주었다. 새끼가 2일 연속으로 테스트를 통과할 때까지 테스트를 매일 반복하였다. 연속적으로 두 번째 통과한 생후 일을 기록하였다.
16.3.3. 귀 열림 및 눈 뜨기
래트 새끼를 매일 조사하여 귀 (도 33E) 및 눈이 모두 열리는 첫번째 날을 측정하였다.
16.3.4. 청각 놀람
청각 놀람 테스트는 청각 반사를 평가한다. 이 테스트에서, 래트 새끼를 후드 송풍기가 꺼진 세포 배양 후드에서 밑에 가열 패드가 있는 패드 위에 부드럽게 놓았다. 조사자는 새끼에게서 10cm 떨어진 곳에서 손뼉을 5번 쳤다 (도 33G). 통과 표시는 손뼉에 대한 반응으로 새끼가 놀라는 경우에 주었다. 청각 놀람을 새끼가 2일 연속으로 테스트를 통과할 때까지 매일 1회 테스트하였다. 연속적으로 두 번째 통과한 생후 일을 기록하였다.
16.3.5 표면 바로잡기
표면 바로잡기는 래트 새끼의 미로 및 신체 바로잡기 메커니즘, 힘, 및 협응을 테스트한다. 새끼를 가열 패드가 밑에 있는 수건 위에 바로 누운 자세로 배치하였다. 엎드린 자세에 도달하기까지의 시간을 각 새끼마다 기록하였다 (도 40A). 통과 점수는 새끼가 30초 이내에 뒤집을 수 있는 경우에 주었다. 표면 바로잡기를 래트 새끼가 연속적으로 2일 동안 통과 점수를 달성할 때까지 매일 1회 측정하였다. 연속적으로 두 번째 통과한 생후 일을 기록하였다.
16.3.6 음성 주지성
음성 주지성 테스트 또한 미로 및 신체 바로잡기 메커니즘, 힘, 및 협응을 평가한다. 음성 주지성을 테스트하기 위하여, 마우스 케이지 뚜껑을 침구 위에 35°-45°각도로 배치하였다. 래트 새끼를 머리를 아래로 향하게 배치하고 새끼가 "머리를 위로"한 자세로 180° 회전하는 데 걸리는 시간을 기록하였다 (도 40C). 만약 새끼가 발을 헛디디고 뚜껑의 바닥으로 미끄러지면, 테스트를 한 번 반복하였다. 통과 점수를 새끼가 스스로 180° 회전할 수 있고 30초 내에 올라오기 시작하는 경우에 주었다. 음성 주지성을 래트 새끼가 연속적으로 2일 동안 30초 내에 스스로를 바로잡을 수 있을 때까지 매일 1회 측정하였다. 연속적으로 두 번째 통과한 생후 일을 기록하였다.
16.3.7 오픈 필드 횡단
이 테스트는 동물의 운동 및 선회 행동의 소멸을 측정한다. 래트 새끼를 패드의 중앙에 배치하고 5인치 반경의 원에서 기어 나오는 데 필요한 시간을 기록하였다 (도 40E). 통과 표시는 래트 새끼가 30초 내에 원을 빠져나오는 경우에 주었다. 오픈 필드 횡단을 래트 새끼가 연속적으로 2일 동안 30초 내에 원을 빠져나올 수 있을 때까지 매일 1회 테스트하였다. 연속적으로 두 번째 통과한 생후 일을 기록하였다.
16.3.8 절벽 회피
절벽 회피 테스트는 래트 새끼의 미로 반사, 힘, 및 협응을 평가한다. 래트 새끼를 앞발과 주둥이가 아래 패드 상의 상자 가장자리 위에 매달려 있는 뒤집힌 피펫 상자에 배치하였다. 만약 새끼가 박스에서 떨어지면, 테스트를 반복하지 않았다. 통과 점수를 새끼가 30초 내에 돌아서거나 가장자리로부터 기어나오는 경우에 주었다. 절벽 회피 테스트를 래트 새끼가 연속적으로 2일 동안 통과 점수를 달성할 때까지 매일 1회 측정하였다. 연속적으로 두 번째 통과한 생후 일을 기록하고 테스트 통과로 표시하였다.
16.4 어린 래트에서 신경 발달, 학습, 및 기억의 평가
이유 후, 래트를 생후 4 내지 8주 사이에 발달 이정표뿐만 아니라, 인지 및 불안-유사 행동을 평가하기 위한 일련의 테스트를 제외하고 방해받지 않은 상태로 두었다 (도 32). 이들 테스트를 래트가 받은 처리에 대해 맹검인 조사자들에 의해 수행하였다. 행동 장비를 잔류 냄새 단서를 제거하기 위하여 테스트 사이에 Process NPD (Steris Corporation, Mentor, OH)로 정화하였다.
16.4.1 Y-미로 테스트
Y-미로는 동물의 공간 학습 및 기억을 평가한다. 장치는 "Y"자 모양의 길이가 같은 3개의 개방된 팔로 이루어지며, 각각의 팔은 A, B, 및 C로 표시된다 (도 34A). 생후 4.5 - 5.5주령의 래트를 Y 미로의 중앙에 배치하고 8분 동안 미로를 자유롭게 탐색하도록 둔다. 각 래트에 대해 팔에 진입하는 순서를 전체 8분 동안 Sony Handycam HDR-CX405 카메라 (Sony, Japan)로 기록하고 처리 그룹에 대해 맹검인 2명의 독립적인 연구자에 의해 점수를 매긴다. 래트의 네 발 전부가 팔에 진입하였을 때 팔 진입을 기록하였다. 행동을 연속적으로 3개의 상이한 팔 선택으로 이루어진 독특한 트라이애드를 사용하여 트라이어드로 채점하였다 (예컨대 ABC, BCA, ACB 등). 특유한 및 특유하지 않은 트라이애드를 기록된 총 트라이애드의 수의 백분율로서 기록하였다. 총 트라이애드의 수 및 독특한 트라이애드의 %를 기록하였다.
16.4.2 신규 물체 인식 테스트
신규 물체 인식 테스트를 사용하여 비공간 작업 기억 및 인식 기억을 측정한다. 이 테스트에서, 각각의 래트를 케이지의 반대 쪽에 2개의 동일한 물체 (1 L 넓은 입구 유리병으로부터의 오토클레이빙 캡)가 들어 있는 테스트 케이지에 10분 동안 배치한 후, 홈 케이지로 복귀시켰다. 래트를 그들의 홈 케이지에 3시간 동안 두었다가 하나의 원래 물체가 유사한 크기지만 상이한 모양의 신규 물체 (25 ml 세포 배양 플라스크)로 교체되어 있는 테스트 케이지로 복귀시켰다. 래트의 행동을 10분 동안 기록하였다 (도 34C). 비디오를 두 명의 독립적인 연구자에 의해 맹검 방식으로 채점하였고 래트가 신규 물체 대비 원래 물체를 탐색하는 데 소비한 시간을 기록하였다. 신규 물체 선호도를 ((신규 물체에 소비한 시간 - 원래 물체에 소비한 시간)/(신규 물체에 소비한 시간 + 원래 물체에 소비한 시간)) x 100으로서 계산하였다.
16.4.3 반즈 미로 테스트
반즈 미로를 사용하여 공간 학습 및 기억을 평가한다. 반즈 미로 플랫폼을 Harvard Apparatus (Halliston, MA)로부터 얻었고 땅에서 120 cm 올라온 원형 (122 cm 직경) 플랫폼으로 이루어진다. 플랫폼은 가장자리 주변에 10 cm 직경의 구멍을 18개 포함한다. 미로는 밝게 빛나고 플랫폼 주변 영역에는 약 20 cm2 크기의 3가지 상이한 모양의 말단 시각 신호가 있다. 구멍 중 하나는 미로 아래에 밀폐된, 숨겨진 탈출 구획으로 연결된다 (도 35A). 설치류는 야행성이며 밝게 빛나는 열린 공간과 높이를 자연적으로 두려워하기 때문에, 그들은 미로의 밀폐된 구획을 찾고 선호할 것이다. 래트는 연속적으로 3일 동안 하루에 4회 훈련 시도를 받았다. 훈련 시도 중에, 래트를 먼저 미로의 중앙에 플라스틱 컵 아래에 15초 동안 배치하였다. 컵을 제거한 후, 래트를 미로를 탐색하도록 허용하고, 탈출 구멍을 찾기 위한 대기 시간과 올바른 구멍을 찾기 전에 확인된 잘못된 구멍의 수를 포함한, 그들의 과제 학습 능력을 평가하기 위하여 여러 파라미터를 기록하였다. 만약 래트가 1분 내에 탈출 구멍을 찾지 못하면, 래트에게 탈출 구멍을 안내하고 15초 동안 구멍에 머무르도록 한 후에 제거하였다. 이것을 x 시간 후에 반복하였다. 최종 훈련 회기 후 2일 후에, 래트는 탈출 터널이 미로로부터 제거되는 1분 프로브 시도를 받았다. 래트가 이전에 탈출 구멍이 있었던 장소를 기억하는 능력을 평가하기 위하여, 이전의 탈출 구멍을 찾는 대기 시간 및 구멍을 찾기 전 이동한 거리를, 올바른 구멍에 가까운 곳에서 래트가 소비하는 시간의 양과 함께 기록하였다. 편향을 피하기 위하여, 독립적인 연구자가 테스트 당일에 수행된 3가지 시도 전부에 대해 시간을 재고 결과를 기록하였다.
16.4.4 고가 플러스 미로 테스트
고가 플러스 미로는 설치류가 새로운 지역을 탐색하려는 의지와 밝게 빛나는 열린 지역의 혐오성을 결합시킨 불안-유사 행동에 대한 검증된 테스트이다. 미로는 지면으로부터 70 cm 떨어져 있는 2개의 열린 팔과 2개의 닫힌 팔로 이루어진다. 닫힌 팔 면적은 35 cm x 7.5 cm x 20 cm이다 (도 36A). 고가 플러스 미로는 자동 추적 장치 및 소프트웨어 Med-PC IV (Med Associations, Inc, St Albans, VT)와 연결된다. 각각의 래트를 고가 플러스 미로의 중간에 놓고 총 10분 동안 추적 소프트웨어에 의해 래트의 움직임을 기록하였다.
16.5 래트 뇌의 면역형광 염색
래트를 안락사시키고 뇌를 수득하였다. 절반의 뇌 또는 뇌의 해마 부분을 새롭게 만든 4% 파라포름알데하이드에 8-20시간 동안 실온에서 고정시킨 후 15% 수크로스에 12-18시간 동안 그리고 다음에 30% 수크로스에서 12-18시간 동안 한랭보호하였다. 그런 후 조직을 OCT 섹션화 배지 (Fisher Scientific, Hampton, NH)에 삽입하고 드라이아이스 상에서 냉동시켰다. 냉동된 조직을 섹션화하고 (5μm 두께) 조직 섹션을 PBS 세척 완충액에 재수화하고 2% 당나귀 혈청, 0.1% 트리톤, 0.05% 트윈 20을 함유한 완충액에서 1시간 동안 실온에서 차단시켰다. 샘플을 Iba-1 (Wako Chemical 1:1000) 일차 항체와 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 Fluor488-콘쥬게이션된 당나귀 항-토끼 IgG 다중클론 이차 항체 (Thermo Fisher 1:1000)와 인큐베이션하고 DAPI가 들어 있는 Vectashield 장착 배지로 장착시켰다. Zen 3.0 소프트웨어가 장착된 Zeiss 800 현미경 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena Germany)을 사용하여 슬라이드당 전체 뇌를 가로질러 무작위로 최소 8개의 공초점 사진을 취하였다. 각 이미지로부터 미세아교세포를 수동으로 계수하고 이미지를 Image J 소프트웨어 (1.47v NIH, USA)를 사용하여 분석하였다. 사진을 3명의 상이한 조사자에 의해 맹검 방식으로 평가하였고 모든 래트를 대상으로 독립적인 채점으로부터의 평균 수가 제시된다.
16.6 RNA 분리 및 실시간 PCR 분석
래트를 안락사시키고 뇌를 수득하였다. 뇌의 전전두엽 피질 및 해마 섹션을 RNAlater (Thermo Fisher, Waltham, MA)에 보관하였다. 다음으로, 조직 (100 mg)을 1.0 mm 지르코니아 비드 (Biospec Products, Bartlesville, OK)로 TissueLyser II (Qiagen, Germantown, MD) 30Hz에서 30초 동안 3회 파괴하였다. 총 RNA를 Purelink RNA 미니 키트 (Thermo Fisher)를 제조사의 설명서를 따라 사용하여 분리하였다. 게놈 DNA를 제거하기 위하여 ezDNase Enzyme (Thermo Fisher, Waltham, MA)와 함께 Superscript IV VILO cDNA 합성 키트를 사용하여 cDNA를 1 μg RNA로부터 생성하였다. 정량적 실시간 (qRT)-PCR을 래트 BDNF 및 Grin2A에 대한 프라이머 (Qiagen), 및 파워 업 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (Thermo Fisher)를 사용하여 마스터 사이클러 realplex2 (Eppendorf) 상에서 이중으로 수행하였다. 표적 유전자 발현을 GAPDH 및 β-액틴 내인성 대조군의 평균에 대해 표준화하고 2(-△△Ct)를 사용하여 상대적 복사수 (RCN)로서 표시하였다. 이들 테스트를 래트가 받았던 처리에 대해 맹검인 조사자들에 의해 수행하였다.
16.7 통계적 분석
데이터를 맹검 방식으로 수집하여 GraphPad Prism 8.2.0 (GraphPad 소프트웨어, Inc. La Jolla, CA)로 일원 분산 분석을 사용하여 분석하였다. 오차 막대는 SEM을 나타내고 통계적 유의성은 p≤0.05로서 정의한다.
16a.1 Lr (생물막) 처리는 발달 이정표의 NEC-유도된 지연을 약화시킨다.
공중 바로잡기 테스트: 실험적 NEC에 노출된 래트 새끼는 공중 바로잡기 테스트에서 감소된 미로, 신체 바로잡기 및 협응을 나타냈다 (BF 새끼와 비교하여 p < 0.001) (도 33B). NEC-노출된 새끼의 플랑크톤 Lr로의 처리는 개선을 초래하지 못하였다 (p<0.001 대비 BF 새끼). 그러나, Lr (생물막)로의 처리는 발달의 이 NEC-유도 지연을 약화시켰다 (p = 0.004 대비 NEC+ PBS 새끼; p = 0.004 대비 플랑크톤 Lr 새끼).
앞다리 잡기 테스트: 실험적 NEC에 대한 노출은 새끼의 전체 힘을 감소시켰다 (p<0.0001 대비 BF 새끼) (도 33D). 비록 Lr (생물막) 처리가 BF 수준으로 힘을 회복시키지는 못했지만, 플랑크톤 Lr 그룹 (p = 0.0056)과 비교하여 힘을 상당히 개선시켰다.
귀 열림 테스트: 귀 열림 테스트에서, 실험적 NEC에 노출된 새끼는 이 발달 이정표에 더 느리게 도달하였다 (p < 0.05 대비 BF 새끼) (도 33F). Lr (생물막) 처리는 NEC 효과를 약화시켰지만 (p = 0.00372 대비 NEC 새끼), 귀 열림은 여전히 BF에 비교하면 지연되었다.
청각 반사 테스트: 실험적 NEC에 대한 노출은 청각 반사의 지연을 초래하였다 (p < 0.0001 대비 BF 새끼). 플랑크톤 Lr 및 Lr (생물막) 처리는 둘 다 청각 반사 지연을 방지하였다 (각각 p = 0.0297 및 p = 0.0004 대비 NEC) (도 32H).
체중 및 추가적인 발달 테스트: 프로바이오틱 처리는 테스트된 발달 이정표의 모든 측면을 개선시키지 못하였다. 실험적 NEC에 노출된 새끼는 모두 생후 21일까지 BF 새끼에 비교하여 체중이 감소하였고, 이것은 플랑크톤 Lr 또는 Lr (생물막)의 투여로 개선되지 않았다 (도 39). 표면 바로잡기 (미로 및 신체 바로잡기 메커니즘, 힘, 및 협응), 음성 주지성 (미로 및 신체 바로잡기 메커니즘, 힘, 및 협응), 오픈 필드 횡단 (운동 및 회전 행동의 소멸), 절벽 회피 (미로 반사, 힘, 및 협응) 및 눈 뜨기 테스트는 프로바이오틱 투여로 상당한 개선을 나타내지 못하였다 (도 40A - 40E). 전체적으로, 출원인은 일부 발달 이정표 테스트에서는 가벼운 개선을 관찰하였다.
16a.2 Lr (생물막) 처리는 NEC에 노출된 새끼에서 단기 작업 기억을 촉진한다.
학습, 기억, 위험 과제, 및 탐색 행동은 뇌가 성숙함에 따라 래트 새끼에서 증가한다. 그러므로, 출원인은 실험적 NEC에 대한 노출 후에 인증된 학습 및 기억 테스트를 사용하여 신경인지 기능을 테스트하였다.
Y-미로 테스트: 대리 댐으로부터 이유 후에, 모든 새끼를 1.5주 동안 방해받지 않도록 놓아두었다. 그런 후 출원인은 학습 및 공간 기억 행동을 4.5 내지 5.5주 사이에 Y-미로 테스트로 평가하였다. 설치류는 전형적으로 신규 환경을 찾으며, 따라서 Y-미로에서 이전에 방문했던 팔로 되돌아가기보다는 새로운 팔을 조사하는 것을 선호한다. NEC에 노출된 래트는 상당히 더 낮은 %의 탐색된 독특한 트라이애드를 가졌다 (p = 0.0035 대비 BF 래트) (도 34B). 플랑크톤 Lr 처리는 독특한 트라이애드의 %를 향상시키지 못했던 반면, Lr (생물막)으로의 처리는 독특한 트라이애드의 %에 미치는 NEC의 영향을 방지하였다 (p = 0.0038 대비 NEC + PBS 래트 및 p < 0.001 대비 플랑크톤 Lr).
신규 물체 인식 테스트: 이 테스트를 설치류 비-공간성 작업 기억 및 인지 기억을 측정하기 위해 4.5 내지 5.5주에 수행하였다. 신규 물체 선호도 지수는 NEC에 노출된 래트가 BF 래트에 비해 신규 물체를 탐색하는 데 더 적은 시간을 소비한 것을 나타냈다 (p = 0.0043 대비 BF 래트) (도 34D). 플랑크톤 Lr은 아무런 영향을 나타내지 않은 반면, Lr (생물막)은 단기 기억 및 호기심을 상당히 향상시켰다 (p = 0.0075 대비 NEC + PBS 및 p = 0.0289 대비 플랑크톤 Lr).
반즈 미로 테스트: 이 테스트를 공간 학습 및 기억 능력을 추가로 조사하기 위하여 5-8주 사이에 수행하였다 (도 35B, 도 35C). NEC는 훈련 시도 중에 탈출 구멍의 위치를 학습하는 래트의 능력에 유의하게 영향을 미치지 못하였다 (데이터 미도시). 그러나, 실험적 NEC에 대한 노출은 구멍의 위치를 기억하는 래트의 능력을 상당히 감소시켰다. NEC 래트는 더 많은 구멍을 확인하였고 (p = 0.00257 대비 BF 래트) 탈출 구멍을 찾기 위해 더 긴 시간을 필요로 하였다 (p = 0.0466 대비 BF 래트) (도 35B). 반면 플랑크톤 Lr은 유의한 효과를 나타내지 않았고, Lr (생물막)은 확인된 구멍 수에 미치는 NEC의 영향 (p = 0.0147 대비 NEC 및 p=0.05 대비 플랑크톤 Lr) (도 35B) 및 탈출 구멍을 찾는데 걸린 대기 시간에 미치는 NEC의 영향 (p = 0.0258 대비 NEC 및 p = 0.05 대비 플랑크톤 Lr)을 방지하였다 (도 35C). 이들 결과를 함께 취하면, 생물막 상태의 Lr은 실험적 NEC에 대한 노출 후에 공간성 및 비공간성 단기 작업 기억 및 학습 능력을 향상시키는 것을 나타낸다.
16a.3 Lr 처리는 NEC에 노출된 새끼에서 불안을 감소시킨다.
Lr (생물막)이 NEC-유도된 기억의 감소를 방지하였기 때문에, 출원인은 다음으로 프로바이오틱 처리 후 불안-유사 행동을 조사하였다.
고가 플러스 미로 테스트: 이 테스트에서, 래트는 열린 및 닫힌 팔을 모두 탐색하겠지만, 닫힌 팔의 상대적인 보안성을 선호한다. 닫힌 팔에 대한 증가된 선호도는 불안-유사 행동을 반영한다. NEC에 대한 노출 후에, 래트는 열린 팔/접합부에서 더 적은 시간을 보내며 닫힌 팔에서 더 많은 시간을 보낸다 (p<0.0001 대비 BF 래트) (도 36B, 도 36C). 플랑크톤 Lr 및 Lr (생물막)은 모두 이들 불안-유사 행동에 미치는 NEC의 영향을 방지하였고 열린 팔/접합부에서 더 많은 시간을 보낸다 (NEC + PBS 대비 NEC + Lr의 경우 p=0.0037 및 NEC 대비 NEC + Lr (생물막)의 경우 p = 0.0043).
16a.4 Lr (생물막)은 NEC에 노출된 새끼에서 Iba-1+ 미세아교세포 활성화를 감소시킨다.
뇌에서 NEC-유도된 손상으로 이어지는 경로를 설명하기 위하여, 출원인은 먼저 미세아교세포 활성화를 조사하였다. 출원인은 래트 뇌의 시상 섹션을 미세아교세포 마커인 칼슘-결합 어댑터 분자 1 (Iba-1) 항체로 면역염색하였다. Iba-1 단백질은 모든 미세아교세포에서 특이적으로 및 구성적으로 발현되며 감시 (분지된) 및 활성화된 (탈분지된 및 미분지된) 미세아교세포 둘 다에 대한 마커로서 광범위하게 인지된다 (Verdonk et al., J Neuroinflammation., 2016;13(1):153). 출원인은 미세아교세포의 총 수뿐만 아니라 활성화된 형태 (즉, 증가된 세포체 두께, 감소된/두꺼워진 수지상 돌기, 및/또는 아메바 모양)를 가진 미세아교세포의 수를 계수하였다 (도 37). 실험적 NEC에 노출된 후 2개월 후에, 더 많은 수의 활성화된 미세아교세포가 존재하였다 (p < 0.0001 대비 BF 래트). 플랑크톤 Lr이 아닌 Lr (생물막)이 뇌에서 활성화된 미세아교세포의 수에서 NEC-유도 증가를 방지하였다 (p < 0.0001 대비 NEC + PBS 및 p = 0.0075 대비 플랑크톤 Lr) (도 37B). 유사하게, 생후 2개월령 래트는 실험적 NEC 후에 더 많은 Iba-1+ 미세아교세포를 가졌다 (p = 0.0003 대비 BF 래트) (도 37C). Lr (생물막)은 Iba-1+ 미세아교세포의 %를 반전시켰다 (p = 0.0125 대비 NEC + PBS 및 p = 0.0203 대비 플랑크톤 Lr). 이들 데이터는 생물막 상태의 Lr이 활성화된 미세아교세포의 수를 감소시키고 그것이 NEC에 의해 유발된 유해한 신경학적 효과의 반전에 기여할 수 있음을 입증한다.
16a.5 Lr (생물막)은 NEC에 노출된 새끼에서 BDNF 및 Grin2A 유전자 발현을 증가시킨다.
출원인은 실험적 NEC에 노출된 후 뇌에서의 유전자 발현의 변화를 평가하였다. 뇌의 전전두엽 피질 (PFC)은 감쇠 및 단기 작업 기억에 중요한 역할을 하며, 해마는 기억 획득, 형성, 및 유지에 능동적으로 관여한다 (Dupret et al., PLoS One., 2008;3(4):e1959). 이것을 토대로, 출원인은 PFC 및 해마로부터 RNA를 분리하여 여러 기억- 및 학습-관련 유전자의 유전자 발현을 측정하였다.
뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)
BDNF는 공간적 및 비공간적 기억 둘 다의 획득 (Miranda et al., Neurobiol Learn Mem., 2018;155:337-43) 외에도 뇌 성장, 신경 발달, 시냅스 리모델링, 및 스트레스 및 손상에 대한 반응에서 중요한 역할을 한다 (Kowianski et al., Cell Mol Neurobiol., 2018;38(3):579-93.; Rao et al., Pediatr Res., 2009;65(5):548-52.). 실험적 NEC에 노출된 후 2개월 후에, 전전두엽 피질 (p < 0.001 대비 BF 래트) 및 해마 (p = 0.02 대비 BF 래트)에서 모두 BDNF 유전자 발현이 감소하였다. 전전두엽 피질에서는 BDNF 발현의 NEC-유도 감소를 약화시키기 위해 (p = 0.06 NEC + PBS 대비 NEC + Lr; p = 0.06 NEC 대비 NEC+ Lr (생물막)) 프로바이오틱스로 처리하려는 경향이 있었다 (도 38A). 이 효과는 해마에서 더 뚜렷하였고, Lr (생물막)은 BDNF에서의 NEC-유도 감소를 방지하였다 (p = 0.01 대비 NEC + PBS) (도 38B).
NMDA 수용체 하위유닛 2A (Grin2A)
출원인은 다음으로 래트에서 뇌 NMDA 수용체 하위유닛 2A (Grin2A) 유전자 발현에 미치는 실험적 NEC의 영향을 테스트하였다. Grin2A는 신경 세포에서 발견되는 글루타메이트 수용체 및 이온 채널 단백질이다. NMDA 수용체를 통한 Ca2+ 플럭스는 학습 및 기억에 대한 세포 메커니즘인 시냅스 가소성에 중요한 것으로 여겨진다 (Baez et al., Neural Plast., 2018;2018:5093048). 실험적 NEC에 노출된 후 2개월 후에, 전전두엽 피질 (p = 0.0024 대비 BF 래트) 및 해마 (p=0.0341 대비 BF 래트)에서 모두 Grin2A 유전자 발현이 감소하였다. 플랑크톤 Lr 또는 Lr (생물막)으로의 처리는 모두 전전두엽 피질에서 Grin2A 발현에 미치는 NEC의 영향을 방지하였지만 (p = 0.004 NEC + Lr 대비 NEC; p = 0.0187 NEC + Lr (생물막) 대비 NEC) (도 38C), 해마에서는 그렇지 않았다 (도 38B).
출원인은 신경 발달의 다중 구성요소가 출원인의 실험적 NEC 패러다임에서 생존한 래트에서 상당히 지연되는 것을 보였다. 중요하게, 생물막 상태로 투여된 프로바이오틱 Lr로의 장 처리는 신경 발달 이정표뿐만 아니라 인지 및 불안-유사 행동에 미치는 NEC의 유해한 영향 중 많은 것을 방지하였다. 신경 발달에 미치는 Lr (생물막)의 유익한 효과는 초기에 새끼 발달 (즉, 1-2주령)에 분명하였고 청소년기 새끼 (즉, 1-2월령)에도 지속되었다. 더욱이, 출원인은 NEC에 노출된 새끼가 증가된 미세아교세포 활성화 및 감소된 BDNF 및 Grin2A 유전자 발현을 보인 한편, 생물막 상태의 Lr의 투여는 이들 효과를 방지한 것을 입증하였다.
인간 유아의 메타 분석은 벨 단계 2 또는 3 NEC를 가진 유아가 20개월의 중간 연령에서 신경 발달 손상을 앓을 가능성이 상당히 더 많았고 (Rees et al., Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed., 2007;92(3):F193-8.; Hintz et al., Pediatrics., 2005;115(3):696-703), 그것은 아동기에도 지속된 것 (Shah et al., J Pediatr. 2008;153(2):170-5, 5 e1.)을 나타냈다. 더불어, 수술을 필요로 하는 환자는 NEC를 의학적으로 치료한 환자에 비교하여 뇌성 마비 및 정신운동 장애를 발생시킬 기회가 상당히 증가되었다. 출원인의 실험적 래트 NEC 모델에서, 래트의 약 60-70%에서 NEC가 발생한다 (Besner, J Pediatr Surg., 2015;50(1):23-9.; Radulescu et al., Pediatr Res., 2009;65(4):437-42). 생존하는 새끼를 수양 모와 함께 배치되어 현재 연구에서 조사하였다. 이들 생존한 새끼는 진전된 단계의 NEC를 경험하지 않았을 수 있고, 더 중증의 외과적 NEC와 반대로 의학적 NEC를 앓고 있는 인간 아기와 더 비슷할 가능성이 있다. Lr (생물막)의 효과가 더 중증의 경우의 NEC에 더 현저한지에 대해서는 아직 알려진 것이 없다. 이런 한계에도 불구하고, 이 연구에서 모든 래트는, 모유 수유한 대조군 래트를 제외하고, 신생아때 고칼로리 사료, 저산소증 및 고열의 스트레스를 견뎠고 모든 자손은 BF와 비교하여 저체중을 가졌으며, 그로써 비록 새끼가 생존하였어도 여전히 NEC 패러다임에 의해 영향을 받았음을 입증하엿다. 중요하게, 출원인은 출원인의 실험적 NEC의 모델에서, 성숙기에 도달하면 공간적 작업 기억 (Y-미로 테스트) 및 비공간적 기억 (신규 물체 테스트)이 감소된 것을 입증하였다. 출원인의 스트레스를 받은 래트에서 나타난 신경인지 이상은 NEC에서 생존한 인간 유아 (Shah et al., J Pediatr. 2008;153(2):170-5, 5 e1.) 및 NEC의 마우스 모델 (Nino et al., Sci Transl Med., 2018;10(471))에서 보고된 학습 및 기억 무능력과 유사하다.
이 실험 래트 모델에서, 출원인은 프로바이오틱스를 제왕절개 직후에 투여하였고 그런 후 나중에 생활에서 행동을 테스트하였다. 출원인은 초기 인생에서 프로바이오틱스로의 처리가 나중에 인생에서 실험적 NEC에 의해 유발된 인지 장애를 반전시킬 수 잇는 것을 발견하였다. 현재 연구에서 출원인은 실험적 NEC의 유도 전에 생물막 상태로 투여된 단일 용량의 Lr이 생후 2개월에 기억을 상당히 개선시키는 것을 보여준다.
이 실험적 NEC의 래트 모델에서 중요한 관찰은 수 개월 후에 연장된 미세아교세포 활성화였다. 흥미롭게도, 출원인은 신생기에서 신규한 프로바이오틱 제형의 투여가 아동에서의 학령기와 동등한 나이인 생후 2개월에, 반응성/활성 형태를 가진 뇌의 미세아교세포의 수에 미치는 NEC의 영향을 방지한 것을 발견하였다. 이들 결과는 뇌 미세아교세포에 미치는 NEC의 영향이 초기 장 공격을 지나 훨씬 더 지속되고 이런 신규한 프로바이오틱 전달 시스템이 미세아교세포 및 인지적 결과에 미치는 NEC의 유해한 영향을 방지할 수 있는 것을 입증한다. 미세아교세포 반응성/활성의 평가가 추가적인 활성화 검정 (생체내에서 또는 생체외에서)에 대한 필요성으로 인해 기술적으로 도전이 되고 있는 것을 주지하는 것이 중요하다. 그러나, 세포 형태는 미세아교세포 활성화 상태와 관련이 있다. 출원인의 연구에서, 출원인은 활성화에 대한 대리 마커로서 탈분지된, 분지된, 또는 아메바 모양의 형태를 가진 세포를 구체적으로 특성화한다.
초기 생애 역경, 예컨대 장기간 모성 분리 또는 쇼크는 생리적 및 행동적 측정에 대한 변화를 촉진하는, 전 생애를 통해 계속되는 유전자 전사의 변화를 유도하는 것으로 나타났다 (Meaney, Annu Rev Neurosci., 2001;24:1161-92). BDNF는 신경 발달, 신경 보호, 시냅스 조절, 학습 및 기억과 관련된 신경영양 인자이다 (Kowianski et al., Cell Mol Neurobiol., 2018;38(3):579-93).
이들 실험에서, NEC에 대한 노출은 전전두엽 피질 및 해마에서 모두 감소된 BDNF 발현으로 이어졌다. 플랑크톤 Lr이 아닌, 생물막 상태로의 Lr로의 처리는 해마에서 BDNF mRNA 발현의 NEC-유도된 감소를 방지하였다. 더불어, BDNF는 NMDA 수용체 하위유닛 2A (래트에서 Grin2A)의 인산화를 촉진하고 NMDA 수용체 활성을 향상시키며, 그러므로 BDNF 및 NMDA 수용체는 해마에서 공간적 기억에 대해 동일한 세포 네트워크의 일부이다 (Miranda et al., Neurobiol Learn Mem., 2018;155:337-43). 출원인의 연구에서, NEC에 대한 노출은 전전두엽 피질 및 해마에서 모두 Grin2A 발현을 감소시켰다. 플랑크톤 Lr 및 생물막 상태의 Lr은 모두 전전두엽 피질에서 Grin2A의 발현에 미치는 NEC의 영향을 방지하였지만 해마에서는 그렇지 않았고, 이것은 출원인의 신규한 프로바이오틱 제형이 뇌의 상이한 장소에서 기능할 수 있음을 시사한다.
장 염증은 뇌를 포함한 신체의 모든 곳에서 영향을 미칠 수 있고, 출원인의 연구는 실험적 NEC에서 생존한 래트가 신경 발달의 상당한 지연 및 성숙기까지 지속되는 인지 및 불안-유사 행동의 파괴를 나타내는 것을 보여준다.
동등물
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Seq. ID NO. 3: 전장 wt R2846 헤모필루스 인플루엔자 IhfA, Genbank 수탁 번호: ADO96375, 마지막 접속 2011년 3월 21일:
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Seq. ID NO. 4: 전장 wt 대장균 K12 IhfA; Genbank 수탁 번호: AAC74782.1, 마지막 접속 2011년 3월 21일:
Figure pct00010
Seq. ID NO. 5: 전장 wt 슈도모나스 에루기노사 PA 01 IhfA; Genbank 수탁 번호: AAG06126.1, 마지막 접속 2011년 3월 21일:
Figure pct00011
Seq. ID NO. 6: 전장 wt Rd 헤모필루스 인플루엔자 IhfA; Genbank 수탁 번호: AAC22959.1, 마지막 접속 2011년 3월 21일:
Figure pct00012
SEQ ID NO. 7: 대장균 hupA, Genbank 수탁 번호: AP_003818, 마지막 접속 2011년 3월 21일:
Figure pct00013
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Figure pct00014
Seq. ID NO. 6 전장 야생형 (wt) 86-028NP 헤모필루스 인플루엔자 IhfA; Genbank acce Seq. ID NO. 6 전장 야생형 (wt) 86-028NP 헤모필루스 인플루엔자 IhfA; Genbank 수탁 번호: AAX88425.1, 마지막 접속 2011년 3월 21일:
Figure pct00015
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<213> Escherichia coli <400> 8 Met Asn Lys Ser Gln Leu Ile Asp Lys Ile Ala Ala Gly Ala Asp Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ala Ala Ala Gly Arg Ala Leu Asp Ala Ile Ile Ala Ser Val 20 25 30 Thr Glu Ser Leu Lys Glu Gly Asp Asp Val Ala Leu Val Gly Phe Gly 35 40 45 Thr Phe Ala Val Lys Glu Arg Ala Ala Arg Thr Gly Arg Asn Pro Gln 50 55 60 Thr Gly Lys Glu Ile Thr Ile Ala Ala Ala Lys Val Pro Ser Phe Arg 65 70 75 80 Ala Gly Lys Ala Leu Lys Asp Ala Val Asn 85 90 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 9 gcgtggcggc cgccattatt ttcatgtagt gtattt 36 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 10 gcgtggtcga ccttttttat gtccataatc tatt 34 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 11 gcgtggtcga cgaaaatatt taatatgaaa atga 34 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 12 gcgtgctcga gccaagcact atttcacgag aat 33 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 13 gcgtggtcga cgatgaaaat ttgtttgatt t 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 14 gcgtggtcga cttataaaag ccagtcatta g 31 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 15 gcgtgctcga gcaacaagag tatcagggta aagc 34 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 16 gcgtggtcga ctccttccca atagatgatt gatt 34 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 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Claims (59)

  1. 신경발달 결핍을 앓고 있거나, 취약하거나, 또는 앓은 적이 있는 대상체에서 신경 발달 결핍을 예방, 지연 또는 치료하거나 신경 발달을 촉진하는 방법으로서, 대상체에게 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하고 선택적으로 대상체는 NEC 또는 뇌에 대해 유사한 영향을 나타내는 다른 병리, 또는 패혈증 및/또는 패혈증 유발 상태를 앓고 있는, 방법.
  2. 대상체에서 미세아교세포 활성화를 예방, 감소, 또는 지연시키는 방법으로서, 대상체에게 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 미세아교세포의 세포체 두께는 대조군 대상체에 비해 대상체에서 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미세아교세포의 수지상 돌기는 대조군 대상체에 비해 대상체에서 얇아지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 대상체에서 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF)의 발현을 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 증가는 대조군 대상체에 상대적인 것임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, BDNF의 증가된 발현은 대상체에 해마에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 대상체에서 Grin2A의 발현을 증가시키는 방법으로서, 대상체에게 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 증가는 대조군 대상체에 상대적인 것임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, Grin2A의 증가된 발현은 대상체의 전전두엽 피질에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 마이크로스피어의 외부 표면에 부분적인 또는 완전한 생물막 코팅을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리움 및 프리바이오틱은 마이크로스피어의 내부로부터 마이크로스피어의 표면으로 확산되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 생분해성 중합체, 비-생분해성 중합체, 금속으로 이루어지는 군으로부터 선택된 물질을 포함하고, 마이크로스피어의 직경은 약 0.5 마이크론 내지 약 1000 마이크론인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 전생물막, 치료 약물 또는 치료제, 화학적 환원물질, 흡착을 촉진하는 분자, 및 흡수를 지지하는 분자 중 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 전생물막은 생물막 형성 및 내구성을 지지하는 작용제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 전생물막은 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그것의 각각의 동등물인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 프리바이오틱은 수용성 탄수화물, 이눌린, 올리고당류, 올리고프룩토스, 프룩토-올리고당, 갈락토-올리고당, 글루코스, 전분, 말토스, 말토덱스트린, 폴리덱스트로스, 아밀로스, 수크로스, 프룩토스, 락토스, 이소말툴로스, 폴리올, 글리세롤, 카보네이트, 티아민, 콜린, 히스티딘, 트레할로스, 질소, 질산 나트륨, 질산 암모늄, 인, 포스페이트 염, 하이드록시아파타이트, 칼륨, 칼리, 황, 호모단당류, 헤테로단당류, 셀룰로스, 키틴, 비타민, 및 그것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체 또는 생체 적합성 스캐폴드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 프로바이오틱 박테리움은 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 크리스파투스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 델브루에키 그룹, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 파라카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 부흐네리, 락토바실러스 퍼멘툼, 락토바실러스 람노서스, 비피도박테리움 아돌레센티스, 비피도박테리움 안굴라티온, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 브레비, 비피도박테리움 카테눌라툼, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 락티스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 슈도카테눌라툼, 스트렙토코커스 써모필레스, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 프로테겐스, 슈도모나스 브라시카세아룸, 슈도모나스 에루기노사; 아조스피릴럼 브라브라실렌스, 아조스피릴럼 립페럼, 아조스피릴럼 할로프라에페렌스, 아조스피릴럼 이라켄스; 아세토박터 디아조트로피커스; 헤르바스피릴럼 세로페디케; 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 스투트제리, 플루오레센스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 세파시안, 슈도모나스 베시쿨라리스, 슈도모나스 파우시모빌리스; 바실러스 세레우스, 바실러스 투링기엔시스, 바실러스 스페리쿠스; 슈와넬라 오나이덴시스; 지오박터 베미지엔시스, 지오박터 메탈리레듀센스, 지오박터 설퍼레듀센스, 지오박터 우라니레듀센스, 지오박터 로블레이; 세라티아 마르세센스, 데설포비브리오 불가리스, 데설포비브리오 데설푸리칸스, 데클로로모나스 아로마틱, 데이노코커스 라디오듀란스, 메틸리비움 페트롤레이필럼, 알카니보락스 보르쿠멘시스, 아르케글로부스 풀기두스, 할로페락스 종, 할로박테리움 종, 및 그것들의 조합 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 프로바이오틱 박테리움은 항-박테리아 면역의 지지, 장내 미생물 불균형의 교정, 위장 장벽의 향상 또는 지지, 위장 운동성의 지지 또는 향상, 항생물질 조성물의 국지화된 방출, 질환-괄년 박테리아 감염에 대한 길항작용 중 하나 이상을 제공하거나, 또는 체력, 협응, 바로잡기 메커니즘, 청각 반사 테스트, 호기심, 학습 능력, 인지 능력, 사회적 상호작용, 작업 기억, 단기 기억, 장기 기억, 시공간 추론, 인지, 사물 인식, 및 세로토닌 중 하나 이상에서의 결핍을 방지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 프로바이오틱 박테리움은 병원체 군집화를 방지하거나 및/또는 사이토카인 및 케모카인 생성을 하향 조절함으로써 과도한 염증 반응을 제한하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 고체 코어 또는 중공 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 프리바이오틱은 중공 코어 내에 캡슐화되거나 또는 마이크로스피어의 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 작용제를 추가로 포함하고, 작용제는 병원체에 대해 선택적인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 보완제는 마이크로스피어의 표면 상에 코팅되거나 및/또는 코어 또는 중공 코어 내에 캡슐화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 코발트, 크롬, 금, 니켈, 백금, 스테인레스 강, 티타늄, 탄탈룸, 니켈-티타늄, 합금, 및 그것들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된 금속을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 덱스트란; 덱스트라노머; 폴리(락트산-코-글리콜산) 또는 PLGA; 폴리카프로락톤 또는 PLC; 키토산; 젤라틴; DNA 수소; 아세탈화된 덱스트란; 폴리(락타이드); 폴리(글리콜라이드); 폴리(락타이드-코-글리콜라이드); 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(카프로락톤); 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(오르토에스테르); 폴리(포스파젠); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트; 폴리에스테라미드; 다가 무수물; 폴리(다이옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체; 폴리우레탄; 폴리(아미노산); 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 세파덱스® 공중합체 및/또는 그것들의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된 생분해성 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리(비닐 아세테이트), 실리콘 중합체, 폴리우레탄, 셀룰로스 중합체 및 셀룰로스 유도체와 같은 다당류, 아실 치환된 셀룰로스 아세테이트 및 그것의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜)과 폴리(부틸렌 테레프탈레이트)의 공중합체, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설폰화된 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 그것들의 공중합체 및 혼합물 중 하나 이상으로부터 선택된 비-생분해성 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 세파덱스, 세파덱스 G-25, 폴리(락트산-코-글리콜산)(" PLGA"); 폴리카프로락톤 ("PLC"); 키토산; 젤라틴; DNA 수소; 아세탈화된 덱스트란; 폴리(락타이드); 폴리(글리콜라이드); 폴리(락타이드-코-글리콜라이드); 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 폴리(락트산-코-글리콜산); 폴리(락타이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락타이드-코-글리콜라이드)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(락트산-코-글리콜산)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(카프로락톤); 폴리(카프로락톤)/폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체; 폴리(오르토에스테르); 폴리(포스파젠); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(하이드록시부티레이트); 폴리(락타이드-코-카프로락톤); 폴리카보네이트; 폴리에스테라미드; 다가 무수물; 폴리(다이옥사논); 폴리(알킬렌 알킬레이트); 폴리에틸렌 글리콜/폴리오르토에스테르 공중합체; 폴리우레탄; 폴리(아미노산); 폴리에테르에스테르; 폴리아세탈; 폴리시아노아크릴레이트; 폴리(옥시에틸렌)/폴리(옥시프로필렌) 공중합체; 및 그것들의 조합으로부터 선택된 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 폴리(에틸렌 비닐 아세테이트), 폴리(비닐 아세테이트), 실리콘 중합체, 폴리우레탄, 셀룰로스 중합체 및 셀룰로스 유도체와 같은 다당류, 아실 치환된 셀룰로스 아세테이트 및 그것의 유도체, 폴리(에틸렌 글리콜)의 공중합체, 폴리(부틸렌 테레프탈레이트), 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 플루오라이드, 폴리(비닐 이미다졸), 클로로설폰화된 폴리올레핀, 폴리에틸렌 옥사이드, 및 그것들의 공중합체 및 혼합물 중 하나 이상으로부터 선택된 비-생분해성 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 프로바이오틱 박테리아는 락토바실러스 루테리를 포함하고 프리바이오틱은 말토스, 글리세롤, or 히스티딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 락토바실러스 루테리는 글루코실트랜스페라제 (GFT)를 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 덱스트란 or 덱스트라노머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 덱스트라노머를 포함하고, 프로바이오틱 박테리아는 락토바실러스 루테리를 포함하며, 프리바이오틱은 말토스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 마이크로스피어는 본질적으로 덱스트라노머로 이루어지고, 프로바이오틱 박테리아는 본질적으로 락토바실러스 루테리로 이루어지며, 프리바이오틱은 본질적으로 말토스로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 실질적으로 동일한 마이크로스피어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 서로 조성이 상이한 마이크로스피어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 마이크로스피어를 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱과, 선택적으로 생물막을 포함하는 배양에서 혼합함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 조성물을 제조하는 것은 전생물막과 혼합하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 전생물막, 치료 약물 또는 치료제, 화학적 환원물질, 흡착을 촉진하는 분자, 및 흡수를 지지하는 분자 중 하나 이상을 혼합함으로써 제조되거나 및/또는 전생물막은 생물막 형성 및 내구성을 지지하는 작용제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 전생물막은 DNA 결합 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 DNABII 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그것의 각각의 동등물인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 대상체에게 약 1 x 107 내지 약 1 x 109 CFU/ml의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움을 제공하기 위해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 대상체의 출생 후 약 6, 12, 18, 24, 36, 48, 및 72시간 째에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 단일 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 공급 튜브, 장으로, 좌제, 생체 적합성 스캐폴드 내, 분말, 액체, 캡슐, 씹을 수 있는 정제, 팽윤할 수 있는 정제, 협측 정제, 트로키, 당의정, 연질 씹을 수 있는, 용액, 현탁액, 스프레이, 팅크제, 탕약, 주입액, 비경구로, 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 투여 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 PGLA 또는 덱스트라노머 생체 적합성 마이크로스피어, 적어도 락토바실러스 루테리 ("L. reuteri")를 포함하는 하나 이상의 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움, 및 프로바이오틱 박테리움의 성장을 지지하는 양으로 말토스, 수크로스, 글리세롤 or 히스티딘 중 하나 이상을 포함하는 영양 보충물을 포함하고, 선택적으로 마이크로스피어는 생물막으로 부분적으로 또는 전체적으로 코팅되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 마이크로스피어는 약 0.5 마이크론 내지 75 마이크론 범위의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 프리바이오틱의 방출은 마이크로스피어 크기를 다르게 하거나 (더 작은 마이크로스피어가 더 빠르게 방출됨) 또는 프리바이오틱의 점도를 변경시킴 (즉 점도가 높을수록 방출은 더 느려짐)으로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 발달 결핍을 예방하거나 신경 발달을 촉진하는 것은 대상체와 동일한 연령 및 동일한 종이지만 다음 중 하나 이상에서 상태 점수를 겪지 않는 대조군 대상체의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%로 채점된 대상체를 포함하는 결핍의 부분적 예방을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 귀 열림 및 눈 뜨기, 표면 바로잡기, 공중 바로잡기, 앞다리 잡기, 청각 놀람, 표면 바로잡기, 음성 주지성, 오픈 필드 횡단, 절벽 회피, 반스 미로, 고가 플러스 미로, 자마르 동력계, 휴대용 동력계, 도수 근력 검사(MMT), 등속성 동력계, 체간 안정성 검사 (TST), 한쪽 고관절 지구력 검사 (UHBE), 회내근 징후, 바레 징후, 롬버그 검사, 란다 반사, 입자 부유, 감각 반사 (바늘로 찌르기, 가벼운 터치, 포지션, 진동, 및 충전기), 반사 (이두근, 삼두근, 상완요골근, 슬개골, 및 발목), 모로 반사, 긴장성 목 반응, 빨기 반사, 손바닥 및 발바닥 잡기 반사, 낙하산 반응, 신체에 대해 목을 바로잡는 반응 (NOB), 신체에 대해 신체를 바로잡는 반응 (BOB), 귀를 여는 청각 반사, 정적 순응도, 외이도의 물리적 부피, 반대측 반사, 동측 반사, 고실 측정, Y-미로, 신규 물체 인식 과제, STPI (상태 특징 성격 목록), 5차원 호기심 척도, 자기 호기심 태도 관심 척도, 호기심 및 탐색 목록-II, 상태 특징 성격 목록 (STPI), 감각 추구 척도의 하위척도 (SSS), 유아 발달의 베일리 척도 (BSID-III) (1-42개월), 조기 학습의 뮬렌 척도 (1-68개월), 유아 지능의 페이건 테스트 (FTII) (출생-12개월), 그리피스의 정신 발달 척도 I (0-2세), 바텔 발달 인벤토리 (BDI) (출생-8세), 및 빈란드 적응 행동 척도 (0-18세).
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 신경 발달 결핍을 예방하거나 신경 발달을 촉진하는 것은 결핍의 하나 이상의 증상의 완전한 예방 또는 대상체에게 나타나는 시간의 지연을 포함하며, 결핍의 완전한 예방은 다음으로부터 선택된 임의의 임상적으로 인지된 테스트 중 하나 이상에서, 처리를 받았지만 결핍증 또는 질환 또는 상태를 앓고 있지 않은 동일한 연령 및 종의 대조군 대상체와 동일하게 채점되는 대상체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: 귀 열림 및 눈 뜨기, 표면 바로잡기, 공중 바로잡기, 앞다리 잡기, 청각 놀람, 표면 바로잡기, 음성 주지성, 오픈 필드 횡단, 절벽 회피, 반스 미로, 고가 플러스 미로, 자마르 동력계, 휴대용 동력계, 도수 근력 검사(MMT), 등속성 동력계, 체간 안정성 검사 (TST), 한쪽 고관절 지구력 검사 (UHBE), 회내근 징후, 바레 징후, 롬버그 검사, 란다 반사, 입자 부유, 감각 반사 (바늘로 찌르기, 가벼운 터치, 포지션, 진동, 및 충전기), 반사 (이두근, 삼두근, 상완요골근, 슬개골, 및 발목), 모로 반사, 긴장성 목 반응, 빨기 반사, 손바닥 및 발바닥 잡기 반사, 낙하산 반응, 신체에 대해 목을 바로잡는 반응 (NOB), 신체에 대해 신체를 바로잡는 반응 (BOB), 귀를 여는 청각 반사, 정적 순응도, 외이도의 물리적 부피, 반대측 반사, 동측 반사, 고실 측정, Y-미로, 신규 물체 인식 과제, STPI (상태 특징 성격 목록), 5차원 호기심 척도, 자기 호기심 태도 관심 척도, 호기심 및 탐색 목록-II, 상태 특징 성격 목록 (STPI), 감각 추구 척도의 하위척도 (SSS), 유아 발달의 베일리 척도 (BSID-III) (1-42개월), 조기 학습의 뮬렌 척도 (1-68개월), 유아 지능의 페이건 테스트 (FTII) (출생-12개월), 그리피스의 정신 발달 척도 I (0-2세), 바텔 발달 인벤토리 (BDI) (출생-8세), 및 빈란드 적응 행동 척도 (0-18세).
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 채점은 조성물의 투여 후 0-1개월, 1-6개월, 6-12개월, 12-18개월, 18-24개월, 24개월 내지 3년 째에, 또는 3년 이상 지났을 때 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 태아가 출생하기 전 (즉, 출산전)에 치료를 필요로 하는 대상체의 태아에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체를 임신한 모체에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 0-1일, 1-6일, 6-12일, 12-18일, 18-24일, 24일 내지 100일, 또는 100일 이상으로부터 선택된 나이의 대상체에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 유아, 태아 또는 신생아인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유류 또는 인간 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물, 및 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트로서, 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하는, 키트.
  58. 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물, 및 대상체에서 BDNF를 증가시키기 위한 설명서를 포함하는 키트로서, 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하는, 키트.
  59. 마이크로스피어, 생물막 생성 프로바이오틱 박테리움 및 프리바이오틱을 포함하는 조성물, 및 대상체에서 Grin2A를 증가시키기 위한 설명서를 포함하는 키트로서, 프리바이오틱은 프로바이오틱 박테리움을 위한 영양 보충물을 포함하는, 키트.
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