CN116019841A

CN116019841A - 治疗自闭症谱系障碍的方法和包含肠道菌群的多层滴丸

Info

Publication number: CN116019841A
Application number: CN202211326792.2A
Authority: CN
Inventors: 王仲荪; 林单; 刘峰
Original assignee: SHENZHEN WANHE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN WANHE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明涉及治疗自闭症谱系障碍的方法和包含肠道菌群的多层滴丸。一方面，涉及的多层滴丸包括呈同心圆状存在的内层、中层、外层的多层(例如2～5层)结构，其中：内层为活微生物例如益生菌或肠道菌群的菌粉和油性物质构成的均质混合物；中层为油性物质；外层为由包括高分子材料、增塑剂和水形成的胶液经滴制和干燥后形成的胶皮壳。本发明多层滴丸用于包裹生物活性物质，尤其是用于包裹活益生菌或者粪菌菌粉，可以通过口服的方式投递到肠道，能够大大降低消化道对菌群的影响，比之于用耐酸胶囊包裹能够显著提高活菌到肠率，相对于其他的药物递送技术手段，缓释滴丸能够大大改善服用便利性，提高患者依从性。

Description

治疗自闭症谱系障碍的方法和包含肠道菌群的多层滴丸

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种包裹生物活性微生物的多层滴丸，该生物活性微生物例如益生菌、肠道菌群、酶、多肽类等等，典型的肠道菌群是健康志人愿者提供的粪便经去杂冻干处理所得肠道菌群的菌粉。特别地，本发明的滴丸，尤其是包含肠道菌群的多层滴丸，可以有效地用于治疗某些精神疾病例如自闭症谱系障碍。本发明的滴丸尤其是包含肠道菌群的多层滴丸可以称为黄龙滴丸。

背景技术

目前，国内外对生物活性物(益生菌、肠道菌群)进行物理化学包埋缓控释的研究较多，大多数采用单层或两层水相体系进行包埋缓控释。如采用海藻酸钠、壳聚糖等多糖类，还有采用大豆蛋白、明胶等蛋白质类进行的包埋；也有采用油脂类物质的如蜂胶、虫胶、硬化油脂、动植物油脂类；再有采用两种或多种物质复配如多糖复配、蛋白质复配、多糖蛋白质复配、脂类与蛋白质复配等技术；另外，采用化学改性对多糖类、蛋白质类等亲水物质进行疏水改性，通过控制疏水改性程度来控制缓控释的速度等。这些技术大部分采用的亲水体系对生物活性物进行分散(如益生菌、肠道菌群)对其稳定性及活力有较大影响，大大影响效果和收率从而提高成本；还有一些技术工艺过程较为复杂，工序较多工业化难度较大；另外，大部分采用的单层单相，双层双相的水相分散体系很难保证生物活性物质(如益生菌)不被激活，从而影响其稳定性。再有，由于生物活性物质一般对胃酸较为敏感，工艺对活性物的保护作用有限。

滴丸剂是药剂学领域的一种高端剂型，由于其特殊结构而能够赋予药剂以特殊性能。滴丸剂是固体或液体药物与适当物质(一般称为基质)加热熔化混匀后，滴入不相混溶的冷凝液中、收缩冷凝而制成的小丸状制剂，主要供口服使用。从滴丸剂的组成、制法看，它具有如下一些特点：1、设备简单、操作方便、利于劳动保护，工艺周期短、生产率高；2、工艺条件易于控制，质量稳定，剂量准确，受热时间短，易氧化及具挥发性的药物溶于基质后，可增加其稳定性；3、基质容纳液态药物量大，故可使液态药物固化，如芸香油滴丸含油可达83.5％；4、用固体分散技术制备的滴丸具有吸收迅速、生物利用度高的特点，如灰黄霉素滴丸有效剂量是100目细粉的1/4、微粉(粒径5微米以下)的1/2；5、发展了耳、眼科用药新剂型，五官科制剂多为液态或半固态剂型，作用时间不持久，制成滴丸可起到延效作用。

滴丸剂具有“三效”的优势，三效是指速效、高效、长效。滴丸多为舌下含服，药物通过舌下黏膜直接吸收，进入血液循环，避免了吞服时引起的肝脏首过效应，以及药物在胃内的降解损失，使药物高浓度到达靶器官，迅速起效。一般含服5—15分钟就能起效，最多不超过30分钟。有的还加入了缓释剂，可明显延长药物的半衰期，达到长效的目的。需要时，口含即可。

当前滴丸剂主要有如下种类：速效高效滴丸剂：滴丸是利用固体分散体的技术进行制备。当基质溶解时，体内药物以微细结晶、无定形微粒或分子形式释出，所以溶解快、吸收快、作用快、生物利用度高。这类产品的典型实例是速效心痛滴丸剂。缓释控释滴丸：缓释是使滴丸中的药物在较长时间内缓慢溶出，而达长效；控释是使药物在滴丸中以恒定速度溶出，其作用可达数日以上，如氯霉素控释眼丸。溶液滴丸：片剂所用的润滑剂、崩解剂多为水不溶性，所以通常不能用片剂来配置澄明溶液。而滴丸可用水溶性基质来配置，在水中可崩解为澄明溶液，如洗比泰滴丸可用于饮水消毒。栓剂滴丸：滴丸同水溶性栓剂一样可用聚乙二醇等水溶性基质，用于腔道时由体液溶解产生作用。如氟哌酸耳用滴丸，甲硝唑牙用滴丸等。滴丸可同样用于直肠，也可由直肠吸收而直接作用于全身，具有生物利用度高、作用快的特点。硬胶囊滴丸：硬胶囊中可装入不同溶出度的滴丸，以组成所需溶出度的缓释小丸胶囊，如联苯双酯的硬胶囊滴丸。包衣滴丸：同片剂、丸剂一样需包糖衣、薄膜衣等，如联苯双酯滴丸。脂质体滴丸：脂质体为混悬液体，用聚乙二醇可制成固体剂型，是将脂质体在不断搅拌下加入熔融的聚乙二醇4000中形成混悬液，倾倒于模型中冷凝成型。肠溶衣滴丸：用在胃中不溶解的基质，如酒石酸锑钾滴丸是用明胶溶液作基质成丸后，用甲醛处理，使明胶的氨基在胃液中不溶解，在肠中溶解。干压包衣滴丸：以滴丸为中心，压上其他药物组成的衣层，融合了两种剂型的优点，如镇咳祛痰的咳必清氯化钾干压包衣片。前者为滴丸，后者为衣层。

经典的滴丸是不分层的，滴丸从里到外是均一的混合物，随着制剂发展的需要，多层滴丸(例如三层滴丸)的开发呈现强大的需求。这些多层滴丸例如双层滴丸的制备工艺区别于滴制法生产的软胶囊，因为软胶囊的内容物是液态的，而多层滴丸例如三层滴丸的内部组分在常温下基本上是呈固体的。因此，软胶囊生产设备/工艺是无法应用于多层滴丸(例如三层滴丸)的。

目前多层滴丸剂的机械设备已相当成熟，例如中国专利申请号2016101875809涉及多层滴丸剂设备及其部件和多层滴丸剂的制备工艺，中国专利申请号2016108267433涉及改善多层滴丸结构的方法和其使用的设备，中国专利申请号2019101573963涉及制备高均匀度滴丸的方法和使用的设备，等等。这些多层滴丸剂设备为多层滴丸剂的生产提供了可能。

当前存在用于补充人和动物两者的营养的各种各样的组合物，可以提供这些补充物以改变、降低或提高个体的肠道内的微生物群，从而对消化产生期望的作用。理想地，补充可以基于改变人体的胃肠(GI)道内的特定细菌为个体(包括人)培养改进的微生物群。这种类型的补充可以通过使用益生菌进行，所述益生菌理解为存活的微生物，当以有效量给予时，其向宿主赋予健康或营养益处。益生菌可以向宿主提供各种各样的益处，例如保持健康的胃肠菌群，增强免疫力，防止腹泻、特应性皮炎和其他疾病等。胃肠道下部尤其是结肠部分的菌群在维持人体正常消化道功能方面发挥重要作用，然而菌群失调所引发的问题也是普遍的、严重的，例如可能由于菌群失调引发便秘、腹泻等。近年还有诸多文献报道菌群失调与某些精神疾病例如自闭症等有关。据信通过施用益生菌能够使胃肠道恢复正常的菌群，进而用于治疗自闭症谱系障碍(ASD)或自闭症，例如，参见Ning Li等文献(Li N,,etal.Fecal Microbiota Transplantation Relieves Gastrointestinal and AutismSymptoms by Improving the Gut Microbiota in an Open-Label Study.Front.Cell.Infect.Microbiol.11:759435.doi:10.3389/fcimb.2021.759435，以及参见Dae-Wook Kang等文献(Dae-Wook Kang,et al.Microbiota Transfer Therapy alters gut ecosystemand improves gastrointestinal and autism symptoms:an open-labelstudy.Microbiome(2017)5:10DOI 10.1186/s40168-016-0225-7)。

自闭症谱系障碍(ASD)是一种严重的发育障碍性疾病，包括社会交往障碍、言语和非言语交流障碍、狭隘兴趣和刻板的重复行为为特征的神经发育障碍性疾病。有报道称，在美国，儿童和青少年的ASD患病率为59人中的1人，甚至高达1％，且近年来呈增长趋势。迄今为止，ASD的病因仍不清，也没有好的治疗措施，仍以教育康复训练为主。近年来研究发现，ASD可能与肠道菌群失衡有关。肠道菌群失衡可以引起一系列胃肠道症状和异常行为，而采用粪菌移植可重建患者肠道菌群，缓解其胃肠道症状，改善部分行为问题，具有较好的治疗作用。粪菌移植是将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。传统粪菌移植主要有上消化道灌肠、下消化道灌肠、口服粪菌胶囊三种方式，但上、下消化道途径均操作复杂，需要在医院通过器械辅助，且有一定风险，不方便重复移植，相对来说，口服粪菌胶囊是较为方便、安全的移植方式。临床粪菌胶囊大多为双层羟丙甲基纤维素(HPMC)耐酸胶囊，最小的3号胶囊体长13.6mm，外径5.83mm，且虽然使用双层胶囊，但没有完全密封，且胶囊壳上会粘上粪菌，粪菌胶囊仍有明显臭味，口服顺应性较差。自闭症患儿大多起病于2-3岁，越早干预治疗疗效越好，但对于年龄大多较小的自闭症患儿，吞服粪菌胶囊有较大的难度。

将活微生物例如益生菌或肠道菌群投递到人体胃肠道是有非常强的现实需求的，改善人体消化道菌群，进而从整体上改善人体的胃肠道功能，是本领域技术人员迫切期待的。

发明内容

本申请的目的在于提供一种使活微生物例如益生菌或肠道菌群直接投递到胃肠道的方法，本发明另一目的是为实现此方法而制备一种多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)结构的滴丸剂。已经出人意料地发现，具有本申请结构特征的多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸能够有益地将预期量的活微生物例如益生菌或肠道菌群直接投递到胃肠道。本申请基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种使活微生物例如益生菌或肠道菌群直接投递到胃肠道的方法，该方法是通过给有需要的人服用包裹活益生菌的多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸。或者，本发明第一方面提供了多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸在制备用于使活微生物例如益生菌或肠道菌群直接投递到胃肠道的营养组合物中的用途。以下所述第一方面的方法亦涉及该用途。

根据本发明第一方面的方法，其中所述多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸包括呈同心圆状存在的(a)内层、(b)中层、(c)外层的多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)结构，其中：

(a)内层为活微生物例如益生菌或肠道菌群的菌粉和油性物质构成的均质混合物；

(b)中层为油性物质；

(c)外层为由包括高分子材料、增塑剂和水形成的胶液经滴制和干燥后形成的胶皮壳。

根据本发明第一方面的方法，其中所述活微生物例如益生菌或肠道菌群是对胃肠道有益的活微生物。

根据本发明第一方面的方法，其中所述活微生物例如益生菌或肠道菌群可以是以其商业化来源的形式或者可以是采自健康志愿者肠道菌群例如粪便经去杂处理的形式或者可以是经培养扩增过的形式。通常地，用于制备发明所述多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸的活微生物例如益生菌或肠道菌群是以粉末状态加入的。

根据本发明第一方面的方法，其中所述活益生菌选自双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串球菌属、丙酸杆菌属、片球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、克鲁维酵母属。

根据本发明第一方面的方法，其中所述活益生菌是选自下列双歧杆菌属的活益生菌：

青春双歧杆菌、动物双歧杆菌例如Bb-12、乳双歧杆菌例如HN019或Bi-07、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌例如M-16V、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌例如BB536。

根据本发明第一方面的方法，其中所述活益生菌是选自下列乳杆菌属的活益生菌：嗜酸乳杆菌例如NCFM、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、发酵乳杆菌例如CECT5716、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、清酒乳杆菌、弯曲乳杆菌。

根据本发明第一方面的方法，其中所述活益生菌是选自下列链球菌属、乳球菌属、明串球菌属、或丙酸杆菌属的活益生菌：嗜热链球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、费氏丙酸杆菌谢氏亚种、产丙酸丙酸杆菌。

根据本发明第一方面的方法，其中所述活益生菌是选自下列片球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、或克鲁维酵母属的活益生菌：乳酸片球菌、小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、凝结芽孢杆菌。

根据本发明第一方面的方法，其中内层：中层：外层三者的重量比为1：1.2～4：0.5～3。

根据本发明第一方面的方法，其中内层：中层：外层三者的重量比为1：1.5～3.5：1～2.5。

根据本发明第一方面的方法，其中内层：中层：外层三者的重量比为1：2.5～3.5：1～2。

根据本发明第一方面的方法，其中内层：中层：外层三者的重量比为1：3：1.5。

根据本发明第一方面的方法，其中外层中的高分子材料选自明胶、琼脂、结冷胶、卡拉胶、红藻胶、果胶、壳聚糖、海藻酸、凝胶多糖、淀粉、改性淀粉、普鲁兰多糖、甘露聚糖及其组合。在一个实施方案中，所述高分子材料是明胶。

根据本发明第一方面的方法，其中外层中的增塑剂选自甘油、山梨醇、及其组合。在一个实施方案中，所述增塑剂是甘油。

根据本发明第一方面的方法，其中用于滴制以形成胶皮壳外层的胶液中，高分子材料、增塑剂和水的重量比为1：0.05～0.2：2～4。

根据本发明第一方面的方法，其中用于滴制以形成胶皮壳外层的胶液中，高分子材料、增塑剂和水的重量比为1：0.05～0.15：2.5～3.5。在本发明中，当描述内层：中层：外层三者的重量比时，外层重量是指经干燥除水后的重量，滴制时可通过胶液配料比例换算外层在多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)中的重量比。

根据本发明第一方面的方法，其中用于滴制以形成胶皮壳外层的胶液中还包含蔗糖，其中高分子材料与蔗糖的重量比为1：0.1～0.5，例如1：0.1～0.3。

根据本发明第一方面的方法，其中用于滴制以形成胶皮壳外层的胶液中包含明胶、甘油、蔗糖、水。例如其重量比为1：0.05～0.2：0.1～0.5：2～4，例如为1：0.05～0.15：0.1～0.3：2.5～3.5。

根据本发明第一方面的方法，所述高分子材料是明胶，明胶冻力为160～200。

根据本发明第一方面的方法，其中(a)内层和(b)中层的油性物质各自独立地选自：硬化油脂(例如熔点39-43℃)、植物油脂(例如熔点37-42℃)、食用植物油脂，蔗糖脂肪酸酯(SAIB)，甘油脂肪酸酯，棕榈油的酯交换油脂，棕榈分级油的酯交换油脂，棕榈油分级而得到的棕榈硬脂精、棕榈油精、棕榈超级油精、棕榈双油精和棕榈中间级分，中链脂肪酸甘油酯，可可脂，代可可脂，以及它们的组合。如未另外说明，本文使用的这些通过酯交换工艺或者分级工艺获得的油脂为非氢化油酯。例如，所述食用植物油脂选自：棕榈油、椰子油、花生油、大豆油、芝麻油、橄榄油、葵花籽油、菜籽油、茶籽油、玉米油以及它们的组合。这些油性物质可以容易地从市售途径购得，例如可以从益海嘉里、中粮集团、印尼春金等商业渠道购得。

根据本发明第一方面的方法，其中(b)中层包含油性物质例如硬化油脂(例如熔点39-43℃)，还包含天然维生素E油和氯化钙。例如，在中层物料中，包含1-5％(例如1.5-3％)天然维生素E油、1-5％(例如2.5-4％)氯化钙和余量的硬化油脂。

根据本发明第一方面的方法，其中(a)内层的油性物质的熔点为35-55℃，例如熔点为35-50℃，例如熔点为35-45℃，例如熔点为37-42℃。

根据本发明第一方面的方法，其中(a)内层是由包括油性物质与粉末状态的活微生物例如益生菌或肠道菌群构成的混合物。在一个实施方案中，粉末状态的活微生物例如益生菌或肠道菌群占内层重量的10～40％，例如粉末状态的活微生物例如益生菌或肠道菌群占内层重量的20～30％。

根据本发明第一方面的方法，其中(a)内层包含：生物活性物质10～40％、天然维生素E油1-3％、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(1：5)0.5-2.5％、和余量的植物油脂(例如熔点37-42℃)；例如，(a)内层包含：生物活性物质20～30％、天然维生素E油1.8-2.2％、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(1：5)0.8-1.2％、和余量的植物油脂(例如熔点37-42℃)。

根据本发明第一方面的方法，其中(b)中层的油性物质的熔点为35-55℃，例如熔点为35-50℃，例如熔点为37-45℃，例如熔点为39-43℃。

根据本发明第一方面的方法，其所制得的多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸具有1～10mm的直径，例如具有1～8mm的直径，例如具有1～7mm的直径，例如具有2～5mm的直径。

根据本发明第一方面的方法，其中所述多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸是照包括如下步骤的方法制备得到的：

(1)制备内层物料：先将除活微生物例如益生菌或肠道菌群的菌粉以外的内层物料混合均匀，并在搅拌状态下缓缓加热至比该物料熔点高8～12℃的温度，搅拌直至物料完全熔化，接着在使物料维持于此温度的条件下添加粉末状的活微生物例如益生菌或肠道菌群的菌粉，继续搅拌使菌粉均匀混和，得到均质的内层物料，保温待滴制滴丸；

(2)制备中层物料：将物料混合均匀，并在搅拌状态下缓缓加热至比该物料熔点高10～15℃的温度，搅拌直至物料完全熔化，得到均质的中层物料，保温待滴制滴丸；

(3)制备外层物料：将高分子材料用适量水浸泡溶解，加入增塑剂(和蔗糖)使溶解，补加水至全量，得到外层物料，置于比中层物料熔点高15～20℃的温度处保温待滴制滴丸；

(4)在多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸设备上使内层物料、中层物料和外层物料分别从多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)结构滴头(例如使滴头温度高于60℃)的内、中、外多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴入18～20℃的冷却液(例如液体石蜡)中冷却形成多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)同心结构的无缝滴丸，然后使所得多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸在15℃～20℃下鼓风干燥10～12小时除去外层水分，得到多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸。

进一步的，本发明第二方面提供了一种多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸，其包括呈同心圆状存在的(a)内层、(b)中层、(c)外层的多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)结构，其中：

(b)中层为油性物质；

根据本发明第二方面的多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸，其各技术特征或技术特征组合如上文第一方面所述。

进一步的，本发明第三方面提供了制备本发明第二方面任一项所述多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸的方法，包括如下步骤：

进一步的，本发明第四方面提供了制备本发明第二方面任一项所述多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸在制备用于治疗某些精神疾病例如自闭症谱系障碍的药物中的用途。

或者，本发明第四方面提供了治疗某些精神疾病例如自闭症谱系障碍的方法，其包括给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明第二方面任一项所述多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸。

在本申请上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本申请全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本申请的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本申请任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

下面对本申请作进一步的描述。

本申请所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本申请不一致时，以本申请的表述为准。此外，本申请使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本申请仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本申请所表述的含义为准。

本文的术语“微生物”表示对宿主的健康发挥有益作用的具有低的或没有致病性的微生物。“活微生物”表示对宿主的健康发挥有益作用的存活或活性的微生物。

本文的术语“益生菌”表示对宿主的健康发挥有益作用的具有低的或没有致病性的微生物。“存活的益生菌”表示对宿主的健康发挥有益作用的存活或活性的微生物。

本文的术语“肠道菌群”表示对宿主的健康发挥有益作用的具有低的或没有致病性的微生物。“存活的肠道菌群”表示对宿主的健康发挥有益作用的存活或活性的微生物。优选的，所述肠道菌群的菌粉是取自或提供自健康志愿者的粪便经去杂干燥等方式处理后得到的菌粉。

本文的术语“缓释”指的是通过本发明方法制得的滴丸，可以调节滴丸向胃肠道特定部位释放生物活性物质，例如定向释放到肠部。

本发明提供的多层缓释滴丸用于包裹生物活性物质，尤其是用于包裹活益生菌或者粪菌菌粉(此时可称为黄龙滴丸)，可以通过口服的方式投递到肠道，能够大大降低消化道对菌群的影响，比之于用耐酸胶囊包裹能够显著提高活菌到肠率，相对于其他的药物递送技术手段，缓释滴丸能够大大改善服用便利性，提高患者依从性。本发明提供的粪菌多层滴丸，可将粪菌与内层壁材混合微囊化后包埋，其外由可隔水的中层基质及可隔氧的外层基质保护，成品为粒径可以为1-10mm的近球形滴丸，并通过添加食用色素与香精，改变粪菌本身的色、味，易于吞服，且顺应性较好。

附图说明

图1：三层滴丸的一般制备方法流程图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本申请进行进一步的描述，然而，本申请的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本申请的精神和范围的前提下，可以对本申请进行各种变化和修饰。本申请对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本申请目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本申请仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本申请，而不是限制本申请。在以下具体实例中，所述配方以重量份的比例表示，在进行组合物制备时，每批投料量总计不少于500g。

物料的一般配制方法：

在本发明中，如未特别说明，各种物料结合其性质采用常规操作进行配制。

例如，对于三层滴丸的内层，先将除生物活性物质以外的内层物料混合均匀，并在搅拌状态下缓缓加热至比该物料熔点高8～12℃的温度，搅拌直至物料完全熔化，接着在使物料维持于此温度的条件下添加粉末状的生物活性物质，继续搅拌使菌粉均匀混和，得到均质的内层物料，保温待滴制滴丸。

又例如，对于三层滴丸的中层，将物料混合均匀，并在搅拌状态下缓缓加热至比该物料熔点高10～15℃的温度，搅拌直至物料完全熔化，得到均质的中层物料，保温待滴制滴丸。

再例如，对于三层滴丸的外层，将高分子材料用适量水浸泡溶解，加入其它材料使溶解，补加水至全量，得到外层物料，置于比中层物料熔点高15～20℃的温度处保温待滴制滴丸。

三层滴丸的一般滴制方法：

使用现有的三层滴丸设备(例如中国专利申请号2016101875809、中国专利申请号2016108267433、中国专利申请号2019101573963等文献中公开的)，使内层物料、中层物料和外层物料从中国专利申请号2019101573963所记载的图1结构的滴头(使滴头温度为65℃)滴入18～20℃的冷却液(液体石蜡)中冷却形成三层同心结构的无缝滴丸(为方便起见，使用适宜尺寸的滴头滴制直径1～10mm三层丸)，然后使所得三层滴丸在15℃～20℃下鼓风干燥10～12小时，得到三层滴丸，密封，置2～8℃温度暗处保存。三层滴丸的一般制备方法流程图参见图1。

制备肠道菌群菌粉即粪菌菌粉的方法

(1)供体筛选：生理指标主要依赖科学测量与实验室检测完成。①年龄18-30周岁，体重指数(body mass index，BMI)18.5-23.9kg/m2；②血液学检测：血常规、肝肾功能、电解质、C反应蛋白正常，肝炎病毒、HIV、梅毒、EB病毒、巨细胞病毒、COVID-19抗体、线虫、阿米巴等病原检测阴性；③粪便检测：粪便常规检查正常，隐血实验阴性，艰难梭菌、弯曲菌、沙门菌、志贺菌、产志贺毒素大肠杆菌及虫卵、囊泡、寄生虫、阪崎肠细菌、小肠结肠耶尔森菌、致病性弧菌(副溶血弧菌、霍乱弧菌)、气单胞菌、阿米巴、孢子、诺如病毒、轮状病毒和新型冠状病毒(COVID-19)等病原学检测阴性，多重耐药基因(超广谱β内酰胺酶、碳青霉烯酶和耐药万古霉素等)检测阴性，粪便幽门螺旋杆菌抗原阴性。心理指标主要依赖访谈与量表完成。①心理科医师或心理咨询师访谈认定心理状态良好；②抑郁自评量表(self-ratingdepression scale，SDS)、焦虑自评量表(self-rating anxiety scale，SAS)、匹兹堡睡眠质量指数(Pittsburgh sleep quality index，PSQI)等评分正常。个人情况：主要依赖访谈与问卷完成。①既往史：近2周未出现胃肠道不适，近3个月内未使用抗生素、抑酸剂、免疫抑制剂、化疗药、输血史等，无慢性疼痛症状，无消化系统手术史，无传染病史及传染病接触史，无过敏性疾病、自身免疫疾病、代谢性疾病、心脑血管疾病、神经系统或精神疾病史，无恶性肿瘤病史，未接受过生长激素、胰岛素、凝血因子等静脉注射；②个人史：作息规律，饮食健康，家庭和睦，无不良性交，无吸烟、饮酒、吸毒等嗜好，无药物成瘾，近6个月未接种过疫苗或参加药物试验，近6个月未接受纹身或出现皮肤破损，近6个月无热带地区旅居史；③家族史：无胃肠道病变家族史，无恶性肿瘤家族史，无传染病家族史；④其他：非孕期，非经期。遗传学指标通过基因谱检测完成。应剔除单基因遗传性疾病(尤其注意隐性遗传)致病基因阳性的供体。

(2)粪菌菌粉制备：使用无菌容器采集，每次采集的粪便重量不少于100g，性状为Bristol评分标准中3-5分方为合格，立即进入菌液制作流程，或立即密封后2-8℃保存；将粪便与无菌生理盐水以1∶3比例混合，充分搅拌混匀后过滤，从粪便排出体外至菌液制作完成应保证在2小时以内，整个处理过程应在无菌环境下操作；将菌液放入冻干机内，冻干48h后分装，置于4℃冷藏，在某一供者符合条件的情况下连续收集、制备粪菌菌粉并混合，以用于滴丸的制备。

实施例1：包埋高生物活性物的三层滴丸

1、外层基质

外层基质配方：明胶(冻力180)23％、甘油2％、蔗糖5％、水加至100％。外层基质配制：将明胶用适量水浸泡(过夜)溶解，加入甘油和蔗糖，搅拌溶解，加水至全量，即得。

2、中层基质

中层基质配方：硬化油脂(熔点39-43℃，实测41℃)95％、天然维生素E油2％、氯化钙3％。中层基质配制：使各物料混合均匀并在60℃熔化，用5000r/min均质机均质，即得。

3、内层囊材

内层囊材配方：生物活性物质(如益生菌、肠道菌群、酶、多肽类，添加量为10-30％；本实施例为健康志愿者A提供的粪便经去杂冻干处理所得肠道菌群的菌粉，添加量25％)、天然维生素E油2％、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(1：5)1％、植物油脂(熔点37-42℃，实测39℃)加至100％(添加量60-80％，依据生物活性物质的添加量而调整)。内层囊材配制：将植物油脂熔化，加入天然维生素E油以及微粉化的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，混匀，接着加入生物活性物质，用5000r/min均质机匀化，保温并搅拌待用以避免沉积。

4、制丸

外层/中层/内层三者的重量比为1：3：1.5。在三层滴丸设备上使内层物料、中层物料和外层物料分别从三层结构滴头(使滴头温度为65℃)的内、中、外三层滴入18～20℃的冷却液(液体石蜡)中冷却形成三层同心结构的无缝滴丸(得到的滴丸直径2.5mm)，然后使所得三层滴丸在15℃～20℃下鼓风干燥10～12小时除去外层水分，得到三层滴丸，密封，将所得三层滴丸用普通的明胶空心胶囊装填，每粒400mg，置2～8℃温度暗处保存。

经测定，所得滴丸包裹活好氧菌5.7×10⁷cfu/g、活厌氧菌11.3×10⁷cfu/g、活双歧杆菌数4.1×10⁷cfu/g丸(依据投料量和菌粉活菌数折算)。

取实施例1的滴丸样品，照“试验例1：溶出度测定方法”，在模拟胃液和模拟肠液中进行(每个溶出杯投置3粒胶囊)，定时取样，然后照“试验例2：肠道菌群培养检测方法”的方法，测定样品在经胃液或肠液处理之后微生物的存活率。结果如下表1。

表1：

滴丸样品为实施例1样品；耐酸胶囊为肠道菌群菌粉用耐酸空心胶囊(羟丙甲基纤维素胶囊，苏州胶囊有限公司产)密封，装量与滴丸胶囊保持一致。

接着，参照实施例1补充制备以下3种滴丸并考察其性能。实施例1a：使用来自同一供者的肠道菌群菌粉，参照实施例1的配方和制法，不同的仅是外层基质中不添加蔗糖，得到三层滴丸#1a。实施例1b：使用来自同一供者的肠道菌群菌粉，参照实施例1的配方和制法，不同的仅是中层基质中不添加氯化钙，得到三层滴丸#1b。实施例1c：使用来自同一供者的肠道菌群菌粉，参照实施例1的配方和制法，不同的仅是外层基质中不添加蔗糖且中层基质中不添加氯化钙，得到三层滴丸#1c。参考实施例1之表1结果的测定方法，测定3种补充制备的滴丸中不同菌类在不同介质中的微生物存活率，结果见以下表2。

表2：

实施例2：包埋高生物活性物的三层滴丸

1、外层基质

外层基质配方：明胶(冻力160)25％、甘油1.5％、蔗糖4％、水加至100％。外层基质配制：将明胶用适量水浸泡(过夜)溶解，加入甘油和蔗糖，搅拌溶解，加水至全量，即得。

2、中层基质

中层基质配方：硬化油脂(熔点39-43℃，实测43℃)93％、天然维生素E油3％、氯化钙4％。中层基质配制：使各物料混合均匀并在60℃熔化，用5000r/min均质机均质，即得。

3、内层囊材

内层囊材配方：生物活性物质(如益生菌、肠道菌群、酶、多肽类，添加量为10-30％；本实施例为健康志愿者B提供的粪便经去杂冻干处理所得肠道菌群的菌粉，添加量20％)、天然维生素E油1.8％、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(1：5)1.2％、植物油脂(熔点37-42℃，实测38℃)加至100％(添加量60-80％，依据生物活性物质的添加量而调整)。内层囊材配制：将植物油脂熔化，加入天然维生素E油以及微粉化的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，混匀，接着加入生物活性物质，用5000r/min均质机匀化，保温并搅拌待用以避免沉积。

4、制丸

经测定，所得滴丸包裹活好氧菌7.1×10⁷cfu/g、活厌氧菌9.7×10⁷cfu/g、活双歧杆菌数3.8×10⁷cfu/g丸(依据投料量和菌粉活菌数折算)。

参考实施例1之表1结果的测定方法，测定本实施例所得三层滴丸中不同菌类在不同介质中的微生物存活率，结果：

好氧菌，胃液2h的滴丸存活率72.4％、耐酸胶囊存活率14.7％，肠液4h的滴丸存活率27.2％、耐酸胶囊存活率8.4％；厌氧菌，胃液2h的滴丸存活率64.3％、耐酸胶囊存活率10.7％，肠液4h的滴丸存活率29.8％、耐酸胶囊存活率6.4％；双歧杆菌，胃液2h的滴丸存活率69.7％、耐酸胶囊存活率20.4％，肠液4h的滴丸存活率36.4％、耐酸胶囊存活率14.7％。

上述结果与实施例1结果虽然稍有差异但不明显，这种差异可能是由于道菌群菌粉供者不同和/或配方细微差异造成的。

接着，参照实施例2补充制备以下3种滴丸并考察其性能。实施例2a：使用来自同一供者的肠道菌群菌粉，参照实施例2的配方和制法，不同的仅是外层基质中不添加蔗糖，得到三层滴丸#2a。实施例2b：使用来自同一供者的肠道菌群菌粉，参照实施例2的配方和制法，不同的仅是中层基质中不添加氯化钙，得到三层滴丸#2b。实施例2c：使用来自同一供者的肠道菌群菌粉，参照实施例2的配方和制法，不同的仅是外层基质中不添加蔗糖且中层基质中不添加氯化钙，得到三层滴丸#2c。参考实施例1之表1结果的测定方法，测定3种补充制备的滴丸中不同菌类在不同介质中的微生物存活率，结果见以下表3。

表3：

实施例3：包埋高生物活性物的三层滴丸

1、外层基质

外层基质配方：明胶(冻力200)21％、甘油2.5％、蔗糖6％、水加至100％。外层基质配制：将明胶用适量水浸泡(过夜)溶解，加入甘油和蔗糖，搅拌溶解，加水至全量，即得。

2、中层基质

中层基质配方：硬化油脂(熔点39-43℃，实测39℃)96％、天然维生素E油1.5％、氯化钙2.5％。中层基质配制：使各物料混合均匀并在60℃熔化，用5000r/min均质机均质，即得。

3、内层囊材

内层囊材配方：生物活性物质(如益生菌、肠道菌群、酶、多肽类，添加量为10-30％；本实施例为市售所得益生菌即双歧杆菌的菌粉，添加量30％)、天然维生素E油2.2％、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(1：5)0.8％、植物油脂(熔点37-42℃，实测41℃)加至100％(添加量60-80％，依据生物活性物质的添加量而调整)。内层囊材配制：将植物油脂熔化，加入天然维生素E油以及微粉化的磷酸氢二钾-磷酸二氢钾，混匀，接着加入生物活性物质，用5000r/min均质机匀化，保温并搅拌待用以避免沉积。

4、制丸

经测定，所得滴丸包裹活益生菌数8.6亿cfu/g丸(依据投料量和菌粉活菌数折算)。

取实施例3的滴丸样品，照“试验例1：溶出度测定方法”，在模拟胃液和模拟肠液中进行(每个溶出杯投置3粒胶囊)，定时取样，然后照“试验例3：益生菌活菌数检测方法”的方法，测定样品在经胃液或肠液处理之后微生物的存活率。结果如下表4。

表4：

检测项目	滴丸存活率	耐酸胶囊存活率
			0h	100％	100％
模拟胃液2h	74.1％	1.4％
			模拟肠液4h	21.5％	0.31％

滴丸样品为实施例3样品；耐酸胶囊为双歧杆菌粉用耐酸空心胶囊密封，装量与滴丸胶囊保持一致。

接着，参照实施例3补充制备以下3种滴丸并考察其性能。实施例3a：使用来自同一批双歧杆菌菌粉，参照实施例3的配方和制法，不同的仅是外层基质中不添加蔗糖，得到三层滴丸#3a。实施例3b：使用来自同一批双歧杆菌菌粉，参照实施例3的配方和制法，不同的仅是中层基质中不添加氯化钙，得到三层滴丸#3b。实施例3c：使用来自同一批双歧杆菌菌粉，参照实施例3的配方和制法，不同的仅是外层基质中不添加蔗糖且中层基质中不添加氯化钙，得到三层滴丸#3c。参考实施例3之表4结果的测定方法，测定3种补充制备的滴丸中双歧杆菌在不同介质中的微生物存活率，结果见表5。

表5：

根据上述实施例1～3滴丸的结果，表明外层基质添加蔗糖且中层基质添加氯化钙是有益的。

实施例4：包埋高生物活性物的三层滴丸

参照实施例1，制备以下3种滴丸并考察其性能。实施例4x：使用来自健康志愿者X提供的粪便经去杂冻干处理所得肠道菌群的菌粉，参照实施例1的配方和制法，得到三层滴丸#4x。实施例4y：使用来自健康志愿者Y提供的粪便经去杂冻干处理所得肠道菌群的菌粉，参照实施例1的配方和制法，得到三层滴丸#4y。实施例4z：使用来自健康志愿者Z提供的粪便经去杂冻干处理所得肠道菌群的菌粉，参照实施例1的配方和制法，得到三层滴丸#4z。

经测定，所得3种滴丸包裹活好氧菌4.6～8.7×10⁷cfu/g、活厌氧菌7.3～13.4×10⁷cfu/g、活双歧杆菌数2.6～5.4×10⁷cfu/g丸(依据投料量和菌粉活菌数折算)。

参考实施例1之表1结果的测定方法，测定3种补充制备的滴丸中不同菌类在不同介质中的微生物存活率，结果见以下表6。

表6：

通过对比多层包裹的益生菌和肠道菌群滴丸与双层耐酸胶囊在人工胃液2h与人工肠液4h中活菌存活率，可以看出，多层包裹的滴丸明显优于双层耐酸胶囊。另外，通过数据分析，多层包裹的滴丸可有效防止胃酸对生物活性物的损伤，起到明显的保护作用。

试验例1：溶出度测定方法

使用中国药典2020年版四部“0931溶出度与释放度测定法”之第三法(小杯法)，以200ml溶出介质进行溶出度测试，转速50rpm，模拟胃液进行2h后或模拟肠液进行4h后采样，照“试验例3：益生菌活菌数检测方法”的方法，测定供试样品在经溶出度处理之后微生物的存活率(以不进行溶出处理即0h微生物存活率为100％计算的相对存活率，以6个溶出杯的均值表示)。

溶出介质模拟胃液配制方法为：取盐酸3.84ml，加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀，加水稀释成1000ml，即得。溶出介质模拟肠液配制方法为：取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，即得。

试验例2：肠道菌群培养检测方法

1.缓冲液：含0.05％tween-80的0.9％NaCl溶液(提前灭菌)。

2.培养基：①平板计数琼脂(PCA)(HB0101，海博生物技术有限公司)；②Wilkins-Chalgren琼脂(WCA)(HB0261，海博生物技术有限公司)；③MRS培养基(027315，广东环凯微生物科技有限公司)，需按说明书添加配套试剂SR0370莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸。

3.肠菌滴丸溶液制备：0.5g滴丸加入到49.5g灭过菌的缓冲液中，18000rpm均质80s；

4.肠菌滴丸检测：(测定滴丸中的活菌数时)将制备的黄龙滴丸溶液用缓冲液梯度稀释到合适浓度后涂布：PCA用来培养总好氧菌，涂布后37℃培养；WCA用来培养总厌氧菌，涂布后37℃厌氧培养；MRA用来培养双歧杆菌，涂布后37℃厌氧培养。48h后进行平板计数。

对于溶出度检测，溶出液直接涂布、培养。

5.结果计算

A.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值除以相应稀释梯度，作为每克样品中菌落总数结果。

B.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式①计算：

式中：N为样品中菌落数；∑C为平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n₁为第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n₂为第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d为稀释因子(第一稀释度)。

试验例3：益生菌活菌数检测方法

1、准备198mL的厌氧稀释液，进行121℃灭菌15分钟，降至室温备用。

2、在超净工作台中用灭菌后的量筒取无菌的厌氧稀释液198mL，倒入无菌三角烧瓶中，然后进行37℃保温。

3、(测定滴丸中的活菌数时)随机抽取2g样品，放入含有198ml稀释液的三角烧瓶中，然后进行37℃保温7min。

4、18000rpm的转速，均质7min，使滴丸内益生菌充分释放出来。

5、超净工作台中用1ml无菌移液器迅速取1ml均质后样品，加入到9ml的厌氧稀释液中，用涡旋混合器进行混合，制得1×10^-1稀释液。

6、另取1mL无菌移液器头，按步骤5的方法进行10倍递增稀释，每递增稀释一次，即更换1次无菌枪头。

7、将适宜梯度稀释液吸取1mL加入灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48℃的RCM琼脂培养基倾注平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。36℃±1℃厌氧培养48h±2h24h±2h。从样品稀释到平板倾注要求在15min内完成。

对于溶出度检测，溶出液直接吸取1mL加入灭菌平皿内，同法进行测定。

8、活菌计数方法按照GB4789.35中6.3执行。培养完成后，选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

9、结果计算

(1)若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值除以相应稀释梯度，作为每克样品中菌落总数结果。

(2)若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式①计算：

厌氧稀释液配方：磷酸氢二钠6.0g、磷酸二氢钾4.5g、0.8g吐温80、半胱氨酸0.5g、营养琼脂0.5g、纯化水1000ml。完全溶解后，进行121℃灭菌15分钟。

RCM培养基配方：琼脂15.0g、蛋白胨10.0g、牛肉粉10.0g、葡萄糖5.0g、氯化钠5.0g、酵母粉3.0g、醋酸钠3.0g、可溶性淀粉1.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、纯化水1000mL。完全溶解后，进行121℃灭菌15分钟。

如上文所述，鉴于人们已经知晓通过施用健康志愿者肠道菌群可以有效地用于治疗某些精神疾病例如自闭症谱系障碍(Autism spectrum disorder，ASD，通常简称为自闭症)，因此，本发明制备的滴丸完全可以用于此类治疗用途。

试验例4：自闭症小鼠模型试验

自闭症小鼠模型试验是本领域公知的，本试验例借鉴相关文献并结合本发明研究的实际情况进行相应试验。

试验采用自闭症小鼠模型BTBR T+tf/J小鼠，7～8周龄，体重25-30g。对照小鼠采用C57BL/6小鼠，7～8周龄，体重22～28g。所有实验动物饲养于陆军军医大学实验动物中心标准清洁动物房，昼夜交替，温度恒定(18-22℃)，保证自由充分取食及饮水。

为避免产仔数的影响，实验均使用雄性小鼠，利用随机数字表法将小鼠分为3组(每组10只)：C57对照组、BTBR模型组、BTBR干预组。BTBR干预组小鼠均予黄龙滴丸灌胃给药，每只动物每日一次灌胃给予实施例1制得的滴丸0.15g，共计7d；对照组灌胃给予参照实施例1但未添加粪菌制得的空白滴丸(等重量)。

1、旷场试验(OFT)

在50×50cm²白色有机玻璃舞台上进行，使用顶置摄像头记录，并对小鼠行为进行跟踪和分析。在测试之前，均使用75％酒精对场地进行清洁和消毒，并空置至少5分钟使气味消散。然后将小鼠引入竞技场并允许在跟踪的同时探索10分钟。分析小鼠总运动距离、在30×30cm²中心区域的运动距离。结果见下表7。

表7：

组别	总运动距离/cm	中央区运动距离/cm	中央区运动距离占总运动距离比例Rd
				C57对照组	<![CDATA[2895.4±263.6<sup>*</sup>]]>	647.4±81.20	<![CDATA[0.22±0.04<sup>*</sup>]]>
BTBR模型组	3714.2±203.6	651±114.6	0.17±0.03
				BTBR干预组	<![CDATA[3141.2±269.7<sup>*</sup>]]>	640.5±77.79	<![CDATA[0.20±0.03<sup>*</sup>]]>

注：*代表p＜0.05，与BTBR模型组比较。

旷场试验测试结果显示，BTBR模型组总运动距离显著大于C57对照组，BTBR+黄龙滴丸干预组与BTBR模型组相比有显著改善。中央区运动距离占总运动距离比例BTBR模型组显著低于C57对照组，BTBR+黄龙滴丸干预组与BTBR模型组相比显著提高，且与C57对照组无显著差异。结果表明，BTBR模型组焦虑行为更为严重，且黄龙滴丸干预可改善BTBR小鼠的焦虑程度。

2、三室社交试验

将受测小鼠放入长方形透明社交箱中(40cm×60cm×22cm)，任其在3个连通的箱室中自由活动，适应10min。取出受测小鼠，并在左右两侧箱室中随机分别放入空笼子和带有同种同年龄段的陌生小鼠1的笼子。轻轻将之前适应好的受测小鼠由中间的箱室中背对试验者放入使其在内活动10min，视频记录受测小鼠分别与空笼子和陌生小鼠1发生互动行为的时间(T_E和T_S)，结束后轻轻取出受测小鼠。向空笼子内放入另一只同种同年龄段的陌生小鼠2，然后再次将受测小鼠轻轻放入中间的箱室内。记录接下来的10min内，受测小鼠与之前的陌生小鼠和新的陌生小鼠发生互动行为的时间(T_S1和T_S2)。三室社交试验结果见下表8。

表8：

组别	C57对照组	BTBR模型组	BTBR+黄龙滴丸干预组
				<![CDATA[T<sub>E</sub>/s]]>	80.64±11.3	88.81±9.55	82.93±7.28
<![CDATA[T<sub>S</sub>/s]]>	<![CDATA[116.92±14.1<sup>*</sup>]]>	79.98±9.03*	87.33±7.53
				<![CDATA[T<sub>S1</sub>/s]]>	88.51±5.45	78.21±5.63	82.26±5.61
<![CDATA[T<sub>S2</sub>/s]]>	<![CDATA[112.28±9.61<sup>△</sup>]]>	<![CDATA[75.96±4.29<sup>△</sup>]]>	<![CDATA[87.59±6.26<sup>△</sup>]]>

注：*代表p＜0.05，与T_E比较；△代表p＜0.05，与T_S1比较。

从三室社交试验结果可知，C57对照组T_S显著大于T_E，T_S2显著大于T_S1，说明C57对照组小鼠的社交能力与社交新颖性能力正常。BTBR模型组，T_S小于T_E，T_S2≈T_S1，说明BTBR模型组小鼠存在社交能力障碍以及社交新颖性能力缺陷。BTBR+黄龙滴丸干预组T_S大于T_E，T_S2显著大于T_S1，说明黄龙滴丸干预有效改善了BTBR小鼠的社交障碍。

3、埋珠试验：在正常笼中进行，地板填充3-4厘米新鲜、高压灭菌的木片床上用品。老鼠首先在笼子里适应了10分钟，然后转移到另一个笼子里，同时平整床上用品，并在上面放置20个玻璃弹珠(4×5)。然后将小鼠放回自己的笼子并在10分钟后取出，然后记录并拍照以供参考。每只老鼠都更换了床上用品，在两次测试之间将玻璃珠浸泡在75％乙醇中并在床上用品中干燥。当实验者对治疗或组不知情时，埋藏弹珠的数量由第二个不知道治疗/组的实验者从第二个10分钟后拍摄的俯视图像中评分。结果见下表9。

表9：埋珠试验

组别	埋珠数量
		C57对照组	<![CDATA[9.1±1.91<sup>*</sup>]]>
BTBR模型组	15.4±1.71
		BTBR+黄龙滴丸干预组	<![CDATA[12.8±1.81<sup>*</sup>]]>

注：*代表p＜0.05，与BTBR组比较。

埋珠试验结果显示，BTBR组与C57对照组相比有显著差异(p＜0.01)，且与BTBR+黄龙滴丸干预组有改善(p＜0.05)，提示黄龙滴丸治疗可改善成年期BTBR小鼠异常重复刻板行为。

4、理毛行为观察试验

将测试鼠置于50cm×50cm×45cm测试箱适应10min后，测试10min，两位测试者同时记录测试鼠梳理身上任何一处毛发的次数和总时间。第三记录者统计结果，若两记录结果理毛次数差值≤5且理毛时间差值≤15s，则采用记录测试结果，反之第三测试者重新测试后取均值。测试区保持环境安静，避免人员走动，更换动物时用75％酒精擦拭测试箱内壁和底面。理毛行为观察试验结果见下表10。

表10：

组别	理毛次数	理毛总时间/s
			C57对照组	14.7±3.40*	<![CDATA[40.65±3.58<sup>*</sup>]]>
BTBR模型组	29.2±5.57	83.71±8.09
			BTBR+黄龙滴丸干预组	<![CDATA[22.9±4.06<sup>*</sup>]]>	<![CDATA[76.44±9.76<sup>*</sup>]]>

注：*代表p＜0.05，与BTBR组比较。

理毛实验中理毛次数与理毛总时间结果显示BTBR组与C57对照组相比有显著差异(p＜0.01)，且与BTBR+黄龙滴丸干预组有改善趋势(p＜0.05)，提示黄龙滴丸治疗对成年期BTBR小鼠异常重复刻板行为有显著改善作用。

5、新物体识别试验

受试小鼠适应测试房间1h，再将受试小鼠放入旷场箱(箱内无物体)内适应20min。第2天(适应24h后)，受试小鼠适应测试房间1h，再将受试小鼠放入旷场箱内适应至少5min，再将受试小鼠从旷场箱中取出，放置在干净的临时保持笼中约2min。再在旷场箱内同侧左右两端放置两个大小、颜色和质地完全相同的塑料三角形作为熟悉物体，再将受试小鼠背朝所述熟悉物体放入箱内，允许其自由探索10min。熟悉期30min后，先随机将旷场箱内的一个熟悉物体换为大小相近颜色不同的塑料五角形作为新奇物体，再将小鼠背朝物体放入箱内，记录5min内小鼠对新奇物体的探索时间(Tn)和熟悉物体的探索时间(Tf)，计时标准为小鼠鼻或口距离物体2cm范围内探究的时间。结果见下表11。

表11：

组别	C57对照组	BTBR模型组	BTBR+黄龙滴丸干预组
				Tf/s	12.26±1.24	16.46±1.79	15.84±1.17
Tn/s	<![CDATA[17.21±1.058<sup>*</sup>]]>	17.71±1.580	18.82±1.026

注：*代表p＜0.05，与Tf组比较。

新物体识别试验中C57对照组Tn显著大于Tf，说明C57对照组记忆正常，BTBR模型组Tn与Tf无显著差异，说明小鼠存在记忆障碍，BTBR+黄龙滴丸干预组Tf与Tn无显著差异，说明小鼠仍存在记忆障碍，改善不明显。

以上所述实施例仅是为充分说明本申请而所举的较佳的实施例，本申请的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本申请基础上所作的等同替代或变换，均在本申请的保护范围之内。本申请的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种多层滴丸，其包括呈同心圆状存在的(a)内层、(b)中层、(c)外层的多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)结构，其中：

(b)中层为油性物质；

2.根据权利要求1的多层滴丸，其中所述活微生物例如益生菌或肠道菌群是对胃肠道有益的活微生物。

3.根据权利要求1的多层滴丸，其中所述活微生物例如益生菌或肠道菌群可以是以其商业化来源的形式或者可以是采自健康志愿者肠道菌群例如粪便经去杂处理的形式或者可以是经培养扩增过的形式；例如，用于制备发明所述多层(例如2～5层例如2～4层例如3层)滴丸的活微生物例如益生菌或肠道菌群是以粉末状态加入的。

4.根据权利要求1的多层滴丸，其中：

所述活益生菌选自双歧杆菌属、乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属、明串球菌属、丙酸杆菌属、片球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、克鲁维酵母属；

所述双歧杆菌属选自：青春双歧杆菌、动物双歧杆菌例如Bb-12、乳双歧杆菌例如HN019或Bi-07、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌例如M-16V、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌例如BB536；

所述乳杆菌属选自：嗜酸乳杆菌例如NCFM、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、发酵乳杆菌例如CECT5716、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、清酒乳杆菌、弯曲乳杆菌；

链球菌属、乳球菌属、明串球菌属、或丙酸杆菌属选自：嗜热链球菌、乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种、肠膜明串珠菌肠膜亚种、费氏丙酸杆菌谢氏亚种、产丙酸丙酸杆菌；和/或

片球菌属、葡萄球菌属、芽孢杆菌属、或克鲁维酵母属选自：乳酸片球菌、小牛葡萄球菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、凝结芽孢杆菌。

5.根据权利要求1的多层滴丸，其中，内层：中层：外层三者的重量比为1：1.2～4：0.5～3，例如为1：1.5～3.5：1～2.5，例如为1：2.5～3.5：1～2，例如为1：3：1.5。

6.根据权利要求1的多层滴丸，其中，

外层中的高分子材料选自明胶、琼脂、结冷胶、卡拉胶、红藻胶、果胶、壳聚糖、海藻酸、凝胶多糖、淀粉、改性淀粉、普鲁兰多糖、甘露聚糖及其组合；

高分子材料是明胶；

外层中的增塑剂选自甘油、山梨醇、及其组合；

用于滴制以形成胶皮壳外层的胶液中，高分子材料、增塑剂和水的重量比为1：0.05～0.2：2～4；

用于滴制以形成胶皮壳外层的胶液中，高分子材料、增塑剂和水的重量比为1：0.05～0.15：2.5～3.5；

用于滴制以形成胶皮壳外层的胶液中还包含蔗糖，其中高分子材料与蔗糖的重量比为1：0.1～0.5，例如1：0.1～0.3；

用于滴制以形成胶皮壳外层的胶液中包含明胶、甘油、蔗糖、水；其重量比为1：0.05～0.2：0.1～0.5：2～4，例如为1：0.05～0.15：0.1～0.3：2.5～3.5；

高分子材料是明胶，明胶冻力为160～200；

内层和中层的油性物质各自独立地选自：硬化油脂(例如熔点39-43℃)、植物油脂(例如熔点37-42℃)、食用植物油脂，蔗糖脂肪酸酯(SAIB)，甘油脂肪酸酯，棕榈油的酯交换油脂，棕榈分级油的酯交换油脂，棕榈油分级而得到的棕榈硬脂精、棕榈油精、棕榈超级油精、棕榈双油精和棕榈中间级分，中链脂肪酸甘油酯，可可脂，代可可脂，以及它们的组合；

中层包含油性物质例如硬化油脂(例如熔点39-43℃)，还包含天然维生素E油和氯化钙；

在中层物料中，包含1-5％(例如1.5-3％)天然维生素E油、1-5％(例如2.5-4％)氯化钙和余量的硬化油脂；

内层的油性物质的熔点为35-55℃，例如熔点为35-50℃，例如熔点为35-45℃，例如熔点为37-42℃

内层是由包括油性物质与粉末状态的活微生物例如益生菌或肠道菌群构成的混合物；

粉末状态的活微生物例如益生菌或肠道菌群占内层重量的10～40％，例如粉末状态的活微生物例如益生菌或肠道菌群占内层重量的20～30％；

内层包含：生物活性物质10～40％、天然维生素E油1-3％、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(1：5)0.5-2.5％、和余量的植物油脂(例如熔点37-42℃)；

内层包含：生物活性物质20～30％、天然维生素E油1.8-2.2％、磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(1：5)0.8-1.2％、和余量的植物油脂(例如熔点37-42℃)；和/或

中层的油性物质的熔点为35-55℃，例如熔点为35-50℃，例如熔点为37-45℃，例如熔点为39-43℃。

7.根据权利要求1的多层滴丸，其具有1～10mm的直径，例如具有1～8mm的直径，例如具有1～7mm的直径，例如具有2～5mm的直径。

8.根据权利要求1的多层滴丸，其是照包括如下步骤的方法制备得到的：

(3)制备外层物料：将高分子材料用适量水浸泡溶解，加入增塑剂(和蔗糖)使溶解，补加水至全量，得到外层物料，置于比中层物料熔点高15～20℃的温度处保温待滴制滴丸；和/或

9.制备权利要求1-8任一项所述滴丸的方法，包括如下步骤：

10.权利要求1-8任一项所述滴丸在制备用于治疗某些精神疾病例如自闭症谱系障碍的药物中的用途。