RU2780868C1 - Иммунобиологическое средство на основе бутирата и способ его использования для терапии воспалительных заболеваний кишечника - Google Patents
Иммунобиологическое средство на основе бутирата и способ его использования для терапии воспалительных заболеваний кишечника Download PDFInfo
- Publication number
- RU2780868C1 RU2780868C1 RU2021138495A RU2021138495A RU2780868C1 RU 2780868 C1 RU2780868 C1 RU 2780868C1 RU 2021138495 A RU2021138495 A RU 2021138495A RU 2021138495 A RU2021138495 A RU 2021138495A RU 2780868 C1 RU2780868 C1 RU 2780868C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- butyrate
- animals
- component
- plha
- inflammatory bowel
- Prior art date
Links
- 206010021972 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 title claims abstract description 35
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims abstract description 33
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 title description 27
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 54
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 48
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M Sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 45
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 35
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Natural products OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 abstract description 31
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 16
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 abstract description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 68
- 229920003045 dextran sodium sulfate Polymers 0.000 description 41
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 16
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 14
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 13
- 206010009887 Colitis Diseases 0.000 description 11
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 11
- 241000398180 Roseburia intestinalis Species 0.000 description 11
- 230000000968 intestinal Effects 0.000 description 11
- 239000002609 media Substances 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 229940015062 Campylobacter jejuni Drugs 0.000 description 10
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 10
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 10
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 10
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 229940100601 Interleukin-6 Drugs 0.000 description 9
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 9
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229960000633 Dextran Sulfate Drugs 0.000 description 8
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase family Proteins 0.000 description 8
- 230000003203 everyday Effects 0.000 description 8
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 7
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 7
- XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M sodium;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoate;3,5-diacetamido-2,4,6-triiodobenzoic acid;(2R,3R,4R,5S)-6-(methylamino)hexane-1,2,3,4,5-pentol Chemical compound [Na+].CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I XZNXVSDNACTASG-RZNNTOFGSA-M 0.000 description 7
- 201000006704 ulcerative colitis Diseases 0.000 description 7
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 6
- 210000002784 Stomach Anatomy 0.000 description 6
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 6
- 102000003984 Aryl hydrocarbon receptors Human genes 0.000 description 5
- 108090000448 Aryl hydrocarbon receptors Proteins 0.000 description 5
- 206010011401 Crohn's disease Diseases 0.000 description 5
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 5
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 5
- 230000002757 inflammatory Effects 0.000 description 5
- 229960004963 mesalazine Drugs 0.000 description 5
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004534 Cecum Anatomy 0.000 description 4
- KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N Mesalazine Chemical compound NC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 KBOPZPXVLCULAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 4
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 4
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 4
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 3
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 3
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 3
- 210000003608 Feces Anatomy 0.000 description 3
- 210000004347 Intestinal Mucosa Anatomy 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M Monopotassium phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000003097 Mucus Anatomy 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N acetic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 description 3
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 3
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 201000008243 diversion colitis Diseases 0.000 description 3
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 3
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 3
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 3
- 230000000529 probiotic Effects 0.000 description 3
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 3
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 3
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- OQANPHBRHBJGNZ-FYJGNVAPSA-N (3E)-6-oxo-3-[[4-(pyridin-2-ylsulfamoyl)phenyl]hydrazinylidene]cyclohexa-1,4-diene-1-carboxylic acid Chemical compound C1=CC(=O)C(C(=O)O)=C\C1=N\NC1=CC=C(S(=O)(=O)NC=2N=CC=CC=2)C=C1 OQANPHBRHBJGNZ-FYJGNVAPSA-N 0.000 description 2
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 2
- 208000007502 Anemia Diseases 0.000 description 2
- 206010051226 Campylobacter infection Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 229940079360 Enema for Constipation Drugs 0.000 description 2
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 2
- 210000002175 Goblet Cells Anatomy 0.000 description 2
- 206010019233 Headache Diseases 0.000 description 2
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 2
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 2
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 206010037844 Rash Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 description 2
- 229960001940 Sulfasalazine Drugs 0.000 description 2
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000000515 Tooth Anatomy 0.000 description 2
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal Effects 0.000 description 2
- 201000004384 alopecia Diseases 0.000 description 2
- 238000004164 analytical calibration Methods 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture media Substances 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000008286 diarrhea Diseases 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 2
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 2
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 2
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial Effects 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 235000021391 short chain fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 238000005429 turbidity Methods 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 206010003883 Azoospermia Diseases 0.000 description 1
- 206010003885 Azotaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100013894 BCL2 Human genes 0.000 description 1
- 108060000885 BCL2 Proteins 0.000 description 1
- 102100015655 BCL2L1 Human genes 0.000 description 1
- 101710032374 BCL2L1 Proteins 0.000 description 1
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 1
- 229940009291 Bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 1
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- 241000252983 Caecum Species 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 229940041514 Candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004162 Claudin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000600 Claudin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 1
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010013954 Dysphoria Diseases 0.000 description 1
- 229940095399 Enema Drugs 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 230000036826 Excretion Effects 0.000 description 1
- 210000003414 Extremities Anatomy 0.000 description 1
- 206010016256 Fatigue Diseases 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018987 Haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 210000001907 Heinz Bodies Anatomy 0.000 description 1
- 206010019372 Heinz body Diseases 0.000 description 1
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K Hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 1
- 229940025294 Hemin Drugs 0.000 description 1
- 208000007475 Hemolytic Anemia Diseases 0.000 description 1
- 102000015434 Humanized Monoclonal Antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108010064750 Humanized Monoclonal Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 229960003444 IMMUNOSUPPRESSANTS Drugs 0.000 description 1
- 108010000345 Immobilized Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 229940076144 Interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infection Diseases 0.000 description 1
- 231100000601 Intoxication Toxicity 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 1
- 241001424413 Lucia Species 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 102100006042 MUC17 Human genes 0.000 description 1
- 101700010570 MUC17 Proteins 0.000 description 1
- 101700036633 MUC2 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 1
- 229960000282 Metronidazole Drugs 0.000 description 1
- 206010067994 Mucosal atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 208000008634 Oligospermia Diseases 0.000 description 1
- QQBDLJCYGRGAKP-FOCLMDBBSA-N Olsalazine Chemical compound C1=C(O)C(C(=O)O)=CC(\N=N\C=2C=C(C(O)=CC=2)C(O)=O)=C1 QQBDLJCYGRGAKP-FOCLMDBBSA-N 0.000 description 1
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 206010037175 Psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 210000000664 Rectum Anatomy 0.000 description 1
- 229940116176 Remicade Drugs 0.000 description 1
- 210000003296 Saliva Anatomy 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 206010046736 Urticarias Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 210000002268 Wool Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic Effects 0.000 description 1
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000004927 campylobacteriosis Diseases 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006781 columbia blood agar Substances 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002354 daily Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals Protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric Effects 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000041 hydrogen chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppresant Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000004609 intestinal homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229940072739 mesalamine Drugs 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic Effects 0.000 description 1
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 1
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000020763 muscle atrophy Effects 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000002346 musculoskeletal system Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000036616 oligospermia Effects 0.000 description 1
- 231100000528 oligospermia Toxicity 0.000 description 1
- 229960004110 olsalazine Drugs 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000000770 pro-inflamatory Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000035812 respiration Effects 0.000 description 1
- 239000007267 rumen bacteria medium Substances 0.000 description 1
- 150000003873 salicylate salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing Effects 0.000 description 1
- 231100000197 serious side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 101710004799 sm-amp-x Proteins 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 102000003995 transcription factors Human genes 0.000 description 1
- 108090000464 transcription factors Proteins 0.000 description 1
- -1 triglyceride butyrate Chemical class 0.000 description 1
- 239000002452 tumor necrosis factor alpha inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 230000036318 urination frequency Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к иммунобиологическому средству для терапии воспалительных заболеваний кишечника, содержащему компонент 1, представляющий собой средство в виде бутирата натрия, упакованного внутрь частиц из сополимера молочной и гликолевой кислот, и компонент 2, представляющий собой средство в виде бутират-синтезирующих бактерий, а также относится к способу использования иммунобиологического средства для лечения воспалительных заболеваний кишечника путем перорального введения его компонентов в эффективном количестве. Группа изобретений обеспечивает безопасное иммунобиологическое средство для терапии воспалительных заболеваний кишечника на основе бутирата натрия, обеспечивающее доставку действующего вещества в кишечник, а также обеспечивающее пролонгированное действие. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 9 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к фармакологии и гастроэнтерологии и касается способа получения иммунобиологического средства на основе бутирата натрия и его применения для терапии воспалительных заболеваний кишечника.
Предшествующий уровень техники
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) являются одной из актуальнейших проблем современного здравоохранения. В структуре заболеваний органов пищеварения ВЗК занимают ведущее место по частоте осложнений, тяжести течения, инвалидизации и летальности. При этом результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о постоянном росте заболеваемости данной патологией как в России, так и во всем мире.
Среди воспалительных заболеваний кишечника выделяют две основные клинические формы - язвенный колит и болезнь Крона. Язвенный колит характеризуется поражением толстого кишечника, тогда как болезнь Крона может поражать любой отдел желудочно-кишечного тракта. Сходство этих заболеваний заключается в том, что в их основе лежит хроническое разрушение слизистой оболочки; течение заболеваний носит фазный характер с периодами обострения и стадиями ремиссии. Этиология ВЗК до конца не ясна и, согласно современным представлениям, зависит от нескольких факторов, таких как, генетическая предрасположенность, факторы окружающей среды, иммунологический статус пациента и нарушение гомеостаза микробиоты.
Терапия ВЗК в настоящее время включает использование противовоспалительных препаратов на основе салицилатов (сульфасалазин, олсалазин и мезаламин) [Г.Адлер. Болезнь Крона и язвенный колит. Москва. «ГЭОТАР-МЕД». 2001. стр.285, 322]. Однако данные препараты имеют ряд побочных эффектов (наиболее часто встречаются - снижение аппетита, головная боль, тошнота, рвота, расстройства желудка, обратная олигоспермия и более редко - зуд, крапивница, сыпь, повышение температуры тела, анемия с тельцами Гейнца, гемолитическая анемия и цианоз). Если ремиссии у пациента в этой фазе лечения достичь не удается, то происходит «эскалация» терапии, заключающаяся в назначении глюкокортикостероидов и иммунодепрессантов. Данные препараты переносятся гораздо хуже за счет серьезных побочных эффектов, включающих повышение восприимчивости к инфекциям, потерю костной массы, диабет, мышечную атрофию и психиатрические нарушения.
По различным оценкам, у 10-20% пациентов с тяжелым течением заболевания, лекарственная терапия не дает эффекта и требуется хирургическое вмешательство.
Очевидно, что в настоящее время существует большая потребность в разработке новых средств, позволяющих расширить арсенал терапевтических препаратов против воспалительных заболеваний кишечника.
Известно изобретение по патенту № PCT / US2012 / 058574, которое предполагает использование для лечения и выявления воспалительных заболеваний кишечника молекулы, специфически связывающей изоформу ED-A фибронектина. При этом данная молекула может быть конъюгирована с иммунодепрессивной или противовоспалительной молекулой, такой как интерлейкин-10.
Известно несколько решений, в которых для профилактики и лечения воспалительных заболеваний кишечника используют пробиотики - штаммы Lactobacillus salivarius AH102, AH103, AH105, AH109 или AH110 (патент №2302458), штамм Lactobacillus brevis 47f (RU2675110C1), штамм Escherichia coli M-17 совместно с антибиотиком метронидазолом, к которому устойчив данный штамм (EP2040724B1).
Известна схема лечения согласно патенту № 2463055, которая предполагает на первом этапе пероральное введение пробиотика бифиформ (Enterococcus faecium и Bifidobacterium longum), а затем 4-5 кратное введение в слизистую оболочку измененных участков кишки препарата ремикейд (ингибитор ФНОα) и далее прием пробиотика бифиформ в течение 3х недель. Способ позволяет повысить эффективность лечения за счет усиления пролиферации эпителиальных клеток и усиления образования мелких фолликулов и увеличения количества бокаловидных клеток слизистой оболочки кишечника, нормализации структуры кишечных крипт.
Известно решение согласно патенту №2297835, где для лечения неинфекционных воспалительных болезней кишечника используется препарат, содержащий 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) или вещество, распадающееся в организме с образованием 5-АСК и лиофильно высушенную микробную массу живых бифидобактерий или лактобактерий или их смесь, где бактерии могут быть иммобилизованы на сорбенте. Компоненты препарата сгруппированы в две капсулы, при этом одна капсула содержит микробную массу живых бактерий, а другая - месалазин или сульфасалазин.
Известно решение согласно патенту EP 2114391 A1, в котором для терапии воспалительных заболеваний кишечника используется бутират натрия, защищенный триглициридной матрицей. Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Главными недостатками прототипа являются небольшая продолжительность действия и большое количество побочных эффектов.
Таким образом, в настоящее время существует потребность в разработке эффективного средства для терапии воспалительных заболеваний кишечника, лишенного указанных недостатков.
Осуществление изобретения
Технической задачей данного изобретения является создание безопасного средства для эффективного лечения воспалительных заболеваний кишечника.
Технический результат заключается в создании безопасного иммунобиологического средства для терапии воспалительных заболеваний кишечника на основе бутирата натрия, обеспечивающего доставку действующего вещества в кишечник, а также обеспечивающего пролонгированное действие.
Указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для терапии воспалительных заболеваний кишечника, содержащее компонент 1, представляющее собой средство в виде бутирата натрия, упакованного внутрь частиц из сополимера молочной и гликолевой кислот в буферном растворе, и компонент 2, представляющий собой средство в виде бутират-синтезирующих бактерий в буферном растворе.
Кроме того, технический результат достигается тем, что предложен способ использования разработанного иммунобиологического средства для лечения воспалительных заболеваний кишечника путем перорального введения его компонентов в эффективном количестве. При этом вводят компонент 1 с последующим введением компонента 2, или компоненты вводят одновременно.
Краткое описание фигур.
На фиг. 1
представлен график зависимости активности люциферазы, экспрессируемой клетками линии HT29-AHR-lucia, от концентрации бутирата натрия, содержащегося в культуральной среде данных клеток.
Ось абсцисс - активность люциферазы (отн. ед).
Ось ординат - концентрация бутирата, мМоль/л.
На фиг. 2
представлена кинетика распределения рентгеноконтрастного вещества Тразограф в отделах желудочно-кишечного тракта после перорального введения в различных объемах. Черной стрелкой отмечен желудок. Серой стрелкой отмечена слепая кишка (cecum). В столбцах: 1 - контрольное (интактное) животное; 2 - животные, которым вводили Тразограф в объеме 300 мкл, 3 - животные, которым вводили Тразограф в объеме 500 мкл. В строках: А - сразу после введения вещества, В - через 20 минут после введения вещества, С - через 1 час после введения вещества.
На фиг. 3
представлена схема эксперимента по проверке эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели колита, индуцированного декстран сульфатом натрия.
На фиг. 4
представлен график изменения веса мышей с колитом, индуцированным введением декстран сульфата натрия. На графике представлены следующие экспериментальные группы животных:
Ось абсцисс - изменение веса животных, в % от начального веса.
Ось ординат - время с начала эксперимента (дни).
На фиг. 5
представлены результаты эксперимента по оценке выживаемости мышей с колитом, индуцированным введением декстран сульфата натрия. На графике представлены следующие экспериментальные группы животных:
Ось абсцисс - выживаемость животных, %.
Ось ординат - время с начала эксперимента (дни).
На фиг. 6
представлена схема эксперимента по оценке эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели хронического воспаления кишечника мышей, колонизированных Campylobacter jejuni, под воздействием декстран сульфата натрия
На фиг. 7
представлены результаты сравнительного анализа длины кишечника мышей, имеющих хроническое воспаление кишечника, которым вводили разработанное иммунобиологическое средство и контрольных групп.
Ось абсцисс - длина кишечника животных, см
Ось ординат - экспериментальные группы.
Группа 1: Интактные животные.
Группа 2: С. Jejuni;
Группа 3: С. Jejuni, DSS;
Группа 4: С. Jejuni, DSS, ПЛГА-бутират;
Группа 5: С. Jejuni, DSS, ПЛГА-бутират, бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis);
На фиг. 8
представлены результаты сравнительного анализа экспрессии ИЛ-6 в кишечнике мышей, колонизированых Campylobacter jejuni, которым вводили разработанное иммунобиологическое средство и контрольных групп.
Группа 1: С. Jejuni;
Группа 2: С. Jejuni, ПЛГА-бутират;
Группа 3: С. Jejuni, ПЛГА-бутират, бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis);
Реализация изобретения.
Воспалительные заболевания кишечника тесно связаны с изменением состава и функции кишечной микробиоты. Было показано, что у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника видовой состав микрофлоры кишечника значительно отличается от такового у здоровых людей, в том числе отмечено значительное снижение количества бактерий, продуцирующих короткоцепочечные жирные кислоты, в частности бутират.
Бутират является основным энергетическим субстратом для колоноцитов, и, кроме того, является важным регулятором гомеостаза кишечника. Было показано влияние бутирата на проницаемость кишечного барьера, которое заключается в увеличении секреции основного компонента слизи - муцина (muc2) и стимуляции экспрессии белков плотных контактов (TJ) клеток эпителия (Finnie IA. Colonic mucin synthesis is increased by sodium butyrate. Gut. 1995;36(1):93-9.; Wang HB, Butyrate enhances intestinal epithelial barrier function via up-regulation of tight junction protein Claudin-1 transcription. Dig Dis Sci. 2012 57(12):3126-35). Также бутират влияет на регенерацию эпителия, стимулируя дифференцировку энтероцитов.
Кроме того, показано влияние бутирата на формирование иммунного ответа в кишечнике. Он способствует повышению экспрессии антимикробных пептидов в просвет кишечника, а также оказывает противовоспалительное действие на слизистую оболочку за счет увеличения ацетилирования гистонов и уменьшения активации провоспалительного транскрипционного фактора NF-κB.
Было показано, что недостаток бутирата и других короткоцепочечных жирных кислот приводит к атрофии слизистой оболочки, а затем к питательному колиту. Следовательно, введение бутирата может оказывать благоприятное действие при различных воспалительных заболеваниях кишечника.
Известно использование бутирата в виде клизм для лечения экспериментального диверсионного колита крыс (R. Pacheco, Use of butyrate or glutamine in enema solution reduces inflammation and fibrosis in experimental diversion colitis World J Gastroenterol. 2012 18(32): 4278-4287). Обработка бутиратом приводила к значительному снижению колоноскопических и гистологических показателей, восстановлению плотности коллагеновых волокон в ткани и количества бокаловидных клеток, а также уменьшению скорости апоптоза в эпителии до нормальных значений. Высокие уровни цитокинов в толстой кишке крыс с диверсионным колитом после лечения бутиратом также снижались до нормальных значений.
Однако исследования на людях, в процессе которых проводилось ректальное орошение слизистой кишечника бутиратом, не продемонстрировали столь впечатляющих результатов (Breuer RI и др. Short chain fatty acid rectal irrigation for left-sided ulcerative colitis: a randomised, placebo controlled trial. Gut. 1997 Apr;40(4):485-91; Scheppach W. Treatment of distal ulcerative colitis with short-chain fatty acid enemas. A placebo-controlled trial. German-Austrian SCFA Study Group. Dig Dis Sci. 1996 Nov;41(11):2254-9). Оба исследования показали, что у пациентов, которым ректально вводили бутират, наблюдались тенденции к улучшению гистологических и колоноскопических показателей, однако статистически значимых улучшений клинических показателей достичь не удалось. Скорее всего, негативные результаты исследований связаны с тем, что ректальное орошение неспособно обеспечить длительного контакта бутирата со слизистой кишечника, достаточного для проявления терапевтического эффекта. Кроме того, при ректальном введении препарата человеку, воздействие в основном происходит на прямую кишку, тогда как в патогенез воспалительных заболеваний кишечника могут быть вовлечены вышестоящие отделы. При этом оральное применение бутирата ограничено тем, что он разрушается в процессе прохождения через желудочно-кишечный тракт и в толстом кишечнике не достигается терапевтическая концентрация.
В изобретении, взятом авторами патента за прототип, предлагается использование бутирата, защищенного триглицеридной матрицей. Однако, клинические исследования триглицерида бутирата показали, что данный препарат обладает значительным количеством побочных эффектов, включающих диарею, головную боль, спазмы в животе, тошноту, анемию, запор, азотемию, усталость, сыпь, алопецию, запах, дисфорию и потерю ориентации. Кроме того, было показано, что бутират не обнаруживается в плазме крови уже через 5 часов после введения.
Таким образом, задачей данного изобретения была разработка эффективного и безопасного средства на основе бутирата для лечения воспалительных заболеваний кишечника пролонгированного действия. Данная задача была решена путем создания двухкомпонентного иммунобиологического средства.
Компонент 1 представляет собой средство в виде бутирата натрия, инкапсулированного в частицы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГА-бутират) в буферном растворе.
Проведенные исследования показали, что частицы ПЛГА-бутират способны эффективно доставлять действующее вещество в толстый кишечник и обеспечивают достижение концентраций, необходимых для реализации терапевтического эффекта.
Компонент 2 представляет средство в виде бутират-синтезирующих бактерий в буферном растворе. Компонент 1 разработанного средства оказывает опосредованное бактериостатическое действие на многие патогенные бактерии, при этом он не действует на представителей нормофлоры. Таким образом, введение компонента 1 позволяет освободить экологические ниши для заселения бутират-синтезирующими комменсальными бактериями. Далее, терапевтический эффект будет поддерживаться за счет синтеза бутирата бутират-синтезирующими бактериями. Таким образом, введение компонента 2 позволит пролонгировать полученный терапевтический эффект.
Пример 1. Получение компонента 1 разработанного иммунобиологического средства.
Целью данной работы является получение частиц сополимера молочной и гликолевой кислот, внутри которых находится бутират натрия, (ПЛГА-бутират) которые являются компонентом 1 иммунобиологического средства.
Для этого водный раствор бутирата натрия (1,6 мг/мл) смешивали с раствором сополимера молочной и гликолевой кислот 50:50 (2мг/мл) в этилацетате в соотношении 1:10 с образованием эмульсии типа «вода/масло». Эмульгирование проводили с помощью источника ультразвука (30 секунд при амплитуде 45-50% и времени озвучивания/покоя 2/2 секунд). Первичную эмульсию затем приливали к внешней водной фазе, которая содержала стабилизатор поливиниловый спирт (ПВС) (4мг/мл), и гомогенизировали с помощью источника ультразвука (1 минуту 45-50% и времени озвучивания/покоя 2/2 секунд). Реакционную смесь выдерживали на льду в течение 12 ч при непрерывном перемешивании для дальнейшего удаления растворителя и затвердевания частиц. Далее суспензию центрифугировали 1000xg в течение 10 мин. Супернатант отбирали в новую пробирку, разбавляли деионизированной водой до 40 мл и центрифугировали 16000xg 1,5 часа. Затем супернатант удаляли, а образовавшийся осадок растворяли в 5 мл деионизированной воде с помощью ультразвуковой бани. Далее суспензию 5 раз отмывали от избыточного ПВС, путем разбавления водой и ультрацентрифугирования и далее сушили методом лиофилизации.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены частицы сополимера молочной и гликолевой кислот, внутри которых находится бутират натрия (ПЛГА-бутират), которые являются компонентом 1 в разработанном иммунобиологическом средстве.
Пример 2. Получение компонента 2 иммунобиологического средства.
Компонент 2 иммунобиологического средства представляет собой бутират-синтезирующие бактерии в буферном растворе, обеспечивающем их выживаемость.
В качестве бутират-синтезирующих бактерий использовали Faecaliabacterium prausnitzii (DSM 17677), Roseburia intestinalis (DSM 14610) или смесь данных бактерий в фосфатно-солевом буфере. Бутират-синтезирующие бактерии заселяют кишечник и синтезируют бутират, оказывающий терапевтический эффект на ЖКТ, тем самым пролонгируя действие компонента 1 (ПЛГА-бутират). Поэтому вместо вышеперечисленных видов бактерий можно использовать любые бутират-синтезирующие бактерии. В качестве буферного раствора может быть использован любой раствор, обеспечивающий жизнеспособность бактерий и не токсичный для млекопитающих.
Faecaliabacterium prausnitzii культивировали при 37°C в среде LYHBHI [сердечно-мозговой бульон (Himedia M210) с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта и 5 мг / л гемина] с добавлением целлобиозы (1 мг / мл), мальтозы (1 мг / л) и цистеина (0,5 мг / мл) в анаэробной камере. Ночная культура бактерий была лиофильно высушена. Roseburia intestinalis культивировали в среде Rumen bacteria medium (DSMZ Medium 330) при 37°C без перемешивания в анаэробном шкафу в атмосфере 85% N2 /10% H2 /5% CO2. Ночная культура бактерий была лиофильно высушена.
Таким образом, был получен компонент 2 разработанного иммунобиологического средства, представляющий собой бутират-синтезирующие бактерии Faecaliabacterium prausnitzii и Roseburia intestinalis.
Пример 3. Изучение стабильности компонента 1 (ПЛГА-бутират) в средах кислым рН.
Для обеспечения эффективной доставки действующего вещества (бутирата натрия) в толстый кишечник, частицы ПЛГА-бутират (компонент 1) должны быть устойчивы к кислой среде пищеварительного тракта и не разрушаться длительное время.
Целью данного исследования являлось изучение стабильности частиц ПЛГА-бутират (компонент 1) в средах кислым рН.
Для этого готовили буферные растворы с различным рН (Государственная Фармакопея РФ):
1) Фосфатный буферный раствор рН3,5: 68,0 г калия дигидрофосфата растворяют в воде, доводят рН до 3,5 потенциометрически с помощью фосфорной кислоты концентрированной. Доводят объём раствора водой до 1000,0 мл.
2) 0,05М Фосфатный буферный раствор рН4,5: 6,80 г калия дигидрофосфата растворяют в 1000,0 мл воды.
3) Фосфатный буферный раствор рН5,5: готовят раствор I. Для этого 13,61 г калия дигидрофосфата растворяют в воде и доводят объём раствора водой до 1000,0 мл; также готовят раствор II.Для этого 35,81 г динатрия гидрофосфата растворяют в воде и доводят объём раствора водой до 1000,0 мл. Смешивают 96,4 мл раствора I и 3,6 мл раствора II.
Далее в пробирку помещали 1 мл одного из перечисленных буферных растворов и добавляли 1 мг ПЛГА-бутират (компонент 1). Далее оценивали размер частиц на Malvern ZetaSizer Nano S сразу (0 часов) или через 3, 6 часов. Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1. Размер частиц ПЛГА-бутират (компонент 1) после выдержки в буферных растворах с различным рН. | |||
Время, часы | |||
0 | 3 | 6 | |
рН 3,5 | 256,6 | 271,6 | 276,6 |
pH4,5 | 189,6 | 191,3 | 196,8 |
pH 5,5 | 241,6 | 186,8 | 249,6 |
Результаты эксперимента показали, что кислая среда не ускоряет разложение частиц ПЛГА. Время прохождения пищи через желудок у человека в среднем занимает до 6 часов. Как видно из представленных данных, за это время размер частиц ПЛГА-бутират (компонент 1) в кислой среде практически не меняется. Это позволяет предположить, что частицы могут успешно преодолеть желудок.
Таким образом, полученные результаты показывают, что частицы ПЛГА бутират не разрушаются в кислой среде в течение 6 часов и. следовательно, позволяют доставлять действующее вещество в кишечник.
Пример 4. Определение количества бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутират (компонент 1).
Различные партии частиц ПЛГА-бутират могут незначительно отличаться по содержанию бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц.
Целью данного эксперимента является определение количества бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутирата из 3-х партий.
Для достижения данной цели использовали культуру клеток HT29-AHR-Lucia (Invivogen). Это клеточная линия на основе клеток аденокарциномы толстой кишки человека НТ29, содержащая секретируемый репортерный ген люциферазы Lucia, экспрессия которой зависит от активности транскрипционного фактора, называемого арилуглеводородный рецептор (AhR). Известно, что бутират способен активировать AhR и экспрессию AhR-зависимых генов (Ludovica Marinelli, Camille Martin-Gallausiaux, Jean-Marie Bourhis, Fabienne Béguet-Crespel, Hervé M. Blottière, Nicolas Lapaque. Identification of the novel role of butyrate as AhR ligand in human intestinal epithelial cells. Sci Rep. 2019; 9: 643.Published online 2019 Jan 24. doi: 10.1038/s41598-018-37019-2). Таким образом, добавление бутирата натрия в культуральную среду клеток в итоге приводит к экспрессии клетками люциферазы, которая накапливается в культуральной среде.
Для проведения данного эксперимента клетки помещали на 96 луночный планшет для культур клеток и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2мМ глутамина и смеси антибиотиков, в СО2 инкубаторе при температуре 37°С и влажности 5% в течение суток. Далее к клеткам добавляли бутират натрия до конечной концентрации 0,2 mM, 2mM, 20mM. ПЛГА-бутират из трех различных партий предварительно лизировали в 0,1н NaOH 30 мин при температуре 37С на ультразвуковой бане, далее суспензию нейтрализовали добавлением HCl и добавляли к клеткам до конечной концентрации 20mM.
Через 8 часов оценивали активность люциферазы в культуральной среде клеток согласно рекомендации производителя. Используя полученные результаты строили калибровочную кривую (фиг. 1). Полученная кривая может быть описана формулой y=832,65ln(х)+2292,8, где у - это активность люциферазы, а х - концентрация бутирата натрия в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia.
Таким образом, концентрация бутирата натрия в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia после добавления частиц ПЛГА-бутират определяли по формуле: x=e((y-2292,8)/832,65), где у - это активность люциферазы, а х - концентрация бутирата натрия в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia. Соотношение между количеством частиц ПЛГА-бутират и количеством бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутират определялось путем деления концентрации частиц ПЛГА-бутират в клеточной среде (20mM) на концентрацию бутирата натрия (х), полученную в результате расчетов. Результаты расчетов представлены в таблице 2
Таблица 2. Количество бутирата натрия инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутират. | |||
Номер партии частиц ПЛГА-бутират | Активность люциферазы в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia после добавления частиц ПЛГА-бутират до концентрации 20 mM, отн. ед. | Концентрация бутирата натрия в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia после добавления ПЛГА-бутират до концентрации 20 mM (mM) | Соотношение между количеством частиц ПЛГА-бутират и количеством бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутират |
0123 | 2900 | 2,07 | 9,66 |
0124 | 3018 | 2,39 | 8,37 |
0127 | 2813 | 1,87 | 10,70 |
Как видно из полученных результатов, количество бутирата натрия в частицах ПЛГА-бутират (компонент 1), полученных в различных партиях, может незначительно отличаться. Поэтому в дальнейших экспериментах все растворы, содержащие частицы ПЛГА-бутират (компонент 1), были нормализованы по содержанию инкапсулированного бутирата натрия.
Пример 5. Определение оптимального объема средства для перорального введения.
Целью данного исследования является определение оптимального объема компонентов средства для перорального введения животным.
Для проведения эксперимента самкам мышей линии C57BLV5 (18-20 г.) перорально, используя гаважную иглу, проводилось введение рентгеноконтрастного вещества Тразограф 76% ("Unique Pharmaceutical Laboratories", Индия) в различных объемах: 300 мкл и 500мкл. Оценка распределения рентгеноконтрастного вещества проводилась непосредственно сразу после перорального введения рентгеноконтрастного вещества, а также через 20 и 60 минут. В качестве контроля использовались интактные животные, которым не проводилось введение рентгеноконтрастного вещества. Для оценки распределения рентгеноконтрастного вещества по отделам желудочно-кишечного тракта животные обездвиживались инъекционным ксилазин-золетиловым наркозом ("Interchemie werken "De Adelaar" B.V", Нидерланды и Virbac, Франция, соответственно), после чего животные помещались в систему для визуализации с источником рентгеновых волн Kodak in vivo FX Pro, США. Время экспозиции составляло 3 минуты. Результаты эксперимента представлены на Фиг. 2.
Согласно полученным изображениям непосредственно сразу после перорального введения 300 и 500 мкл Тразографа вещество присутствует в желудке всех животных (обозначено красной стрелкой). При этом только у животных получивших 500 мкл Тразографа непосредственно после введения отмечается контрастирование верхних отделов кишечника. Через 20 минут после перорального введения рентгеноконтрастного вещества у животных получивших 300 мкл препарата контрастирование наблюдается только верхних отделов кишечника. При этом количество препарата в желудке резко падает. В группе животных получивших 500 мкл Тразографа через 20 минут рентгеноконтрастное вещество наблюдается не только в желудке, но и на протяжении всего тонкого и толстого кишечника. Отчетливо видно заполнение слепого отростка (cecum) препаратом (обозначено синей стрелкой). Через 60 минут после перорального введения вещество во всех группах находится в кишечнике, отличия между группами стираются из-за процессов всасывания препарата через стенку кишечника. На основании полученных результатов, для введения частиц ПЛГА была выбран объем 300 мкл, а для введения бутират-синтезирующих бактерий был выбран объем 500 мкл.
Пример 6. Проверка эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели колита, индуцированного декстран сульфатом натрия.
Целью данного эксперимента является проверка способности разработанного средства оказывать благоприятный терапевтический эффект на колит, индуцированный декстран сульфатом натрия у мышей.
Схема эксперимента представлена на фиг. 3. Для данного эксперимента использовали SPF мышей линии С57/Bl6 18-20г. Все животные были разделены на 5 групп по 10 мышей:
1) DSS; ПЛГА с бутиратом натрия;
2) DSS; ПЛГА с бутиратом натрия, бутират-синтезирующие бактерии (Faecaliabacterium prausnitzii);
3) DSS; бутират-синтезирующие бактерии (Faecaliabacterium prausnitzii);
4) DSS;ФСБ 500 мкл;
5) Интактные животные.
Животным в группах 1-4 питьевую воду заменяли на 2% раствор декстран сульфата натрия (DSS) (Affymetrix, США, молекулярный вес 40-50 кДа) в стерильной воде. Контрольным животным (группа 5) оставляли стерильную питьевую воду. Поилки заполняли из расчета 200 мл жидкости/группу. Поилки заменяли каждые два дня. Животным обеспечивали неограниченный доступ к воде и корму.
Терапию начинали со 2 дня после начала эксперимента. В группе 1 каждый день в течение 7 дней вводили ПЛГА-бутират (компонент 1) в дозе 3,86 мг/мышь (что соответствует дозе 0,4 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь). Для этого лиофилизированные частицы ПЛГА-бутират (компонент 1) растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе и вводили в объеме 300 мкл. В группе 2 начиная со 2 дня после начала эксперимента каждый день, в течение 7 дней, вводили ПЛГА-бутират (компонент 1) в дозе 3,86 мг/мышь (что соответствует 400 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь). Для этого лиофилизированные частицы ПЛГА-бутират (компонент 1) растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе и вводили в объеме 300 мкл. Также животным этой группы со 2 дня после начала эксперимента каждый день, в течение 7 дней, перорально вводили бутират-синтезирующие бактерии вида Faecaliabacterium prausnitzii (компонент 2). Лиофилизированные бактерии растворяли в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и вводили в объеме 500 мкл. В группе 3 начиная со 2 дня после начала эксперимента каждый день в течение 7 дней вводили бутират-синтезирующие бактерии вида Faecaliabacterium prausnitzii (компонент 2). Лиофилизированные бактерии растворяли в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и вводили в объеме 500 мкл. Группа 4 и 5 использовались в качестве контроля. В группе 4 были животные, которые получали DSS и не получали терапии. В группе 5 были интактные животные, которые не получали DSS.
В течение всего срока эксперимента оценивали вес и выживаемость животных. Полученные данные представлены на фиг. 4-5. Как видно из представленных данных, животные, которые получали DSS, теряли в весе из-за воспаления в ЖКТ и затем погибали. Терапия компонентом 1 разработанного средства (ПЛГА с бутиратом натрия) привела к улучшению состояния животных, вследствие чего их вес стал расти. Однако после отмены терапии, животные снова начали терять вес и погибли. Вследствие чего можно сделать вывод, что ПЛГА с бутиратом натрия эффективно защищают животных от DSS-индуцированного колита, однако эффект не сохраняется после отмены препарата. В группах животных, которым вводили ПЛГА с бутиратом натрия и бутират-синтезирующие бактерии также наблюдался положительный терапевтический эффект, который сохранялся и после отмены препарата, что говорит о пролонгированном действии. Введение мышам с индуцированным колитом только бутират-синтезирующих бактерий не приводило к значимому улучшению состояния животных.
Таким образом, по результатам проведенного исследования можно сделать вывод, что разработанное иммунобиологическое средство обладает благоприятным терапевтическим эффектом для лечения колита, индуцированного декстран сульфатом натрия.
Пример 7. Проверка эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели хронического воспаления кишечника мышей, колонизированных Campylobacter jejuni, под воздействием декстран сульфата натрия.
Воспалительные заболевания кишечника часто связаны с дисрегуляцией иммунного ответа на бактериальную микрофлору у восприимчивых людей. Campylobacter jejuni признана одной из ведущих причин инфекционных бактериальных кишечных инфекций во всем мире (S.Mousavi, S. Bereswill, M.Heimesaat. Novel Clinical Campylobacter jejuni Infection Models Based on Sensitization of Mice to Lipooligosaccharide, a Major Bacterial Factor Triggering Innate Immune Responses in Human Campylobacteriosis. Microorganisms. 2020 Apr; 8(4): 482. Published online 2020 Mar 28. doi: 10.3390/microorganisms8040482). У большинства пациентов с диареей Campylobacter есть какой-либо компонент сегментарного колита, который обычно начинается в тонкой кишке и прогрессирует дистально к слепой и толстой кишке (Siegal D, Syed F, Hamid N, Cunha BA. Campylobacter jejuni pancolitis mimicking idiopathic ulcerative colitis. Heart Lung. 2005 Jul-Aug;34(4):288-90. doi: 10.1016/j.hrtlng.2004.10.003. PMID: 16027651). Авторами патента была разработана модель хронического (не летального) воспаления кишечника мышей, индуцированного Campylobacter jejuni.
Целью данного эксперимента являлась оценка эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели хронического воспаления кишечника мышей, колонизированных Campylobacter jejuni, под воздействием декстран сульфата натрия.
Для данного эксперимента были использованы мыши гнотобионты (свободные от микрофлоры) линии C57/B6NTac. Моноколонизация кишечника мышей гнотобионтов Campylobacter jejuni в предварительном эксперименте не приводила к развитию воспалительной патологии кишечника. Поэтому животным дополнительно добавляли в воду декстран сульфат натрия (DSS). Выбор DSS основан на его способности удалять слой слизи кишечника, тем самым обеспечивая прямой контакт микроорганизмов с эпителиальными клетками кишечника. Обработка DSS способна имитировать дефицит слизистого слоя, который наблюдается у пациентов с генетическими дефектами в генах муцинов. В свою очередь мутации в генах муцинов ассоциированы с развитием хронических заболеваний кишечника, таких как болезнь Крона (Boltin D., Perets T.T., Vilkin A., Niv Y. Mucin function in inflammatory bowel disease: an update. // J Clin Gastroenterol. - 2013. V. 47. № - 2. P. - 106-11 5), язвенный колит (Senapati S., Ho S.B., Sharma P., Das S., Chakraborty S., Kaur S., Niehans G., Batra S.K. Expression of intestinal MUC17 membrane-bound mucin in inflammatory and neoplastic diseases of the colon. // J Clin Pathol. - 2010. V. - 63. № - 8. P. - 702-707).
Схема эксперимента представлена на фиг. 6
Были образованы следующие группы животных:
1) Интактные животные;
2) С. Jejuni;
3) С. Jejuni, DSS;
4) С. Jejuni, DSS, ПЛГА-бутират (компонент 1);
5) С. Jejuni, DSS, ПЛГА-бутират (компонент 1), бутират-синтезирующие бактерии Roseburia intestinalis (компонент 2).
Колонизацию кишечника животных С. jejuni осуществляли путем перорального введения суспензии микроорганизмов в объеме 500 мкл. Для культивирования клеток С. jejuni использовали колумбийский кровяной агар (BD, США). Бактерии культивировали при температуре 37°С, в газовой среде N2:C02:02 (17:2:1), время роста составляло 24-48 часов. Далее бактериальную суспензию центрифугировали при скорости 6000 об/мин. Осадок растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе. Концентрацию бактерий в суспензии рассчитывали по стандарту мутности. Фактическая концентрация бактерий определялась путем высева дозы суспензии на специфические среды. Расчетная концентрация бактерий составила 2*108 КОЕ/мл. Фактическая концентрация, вводимая животным, составила 8*108 КОЕ/мл.
Через 7 дней после перорального введения культур бактерий проводили оценку эффективности колонизации кишечника животных. С этой целью проводили высев фекалий всех животных на твердые питательные среды и затем производили учет титров бактерий. Через 7 дней после перорального введения бактерий у всех животных в фекалиях определялись бактерии С.jejuni в титре не менее 5x108 КОЕ на 1 грамм фекалий. Ни одно животное до добавления 2% декастрана сульфата в воду не теряло в весе и не характеризовалось каким-либо отклонением в поведении или внешнем виде от контрольных интактных животных. После получения информации, подтверждающей успешную колонизацию кишечника животных, на 14-й день эксперимента, у животных в группах 1-4 питьевую воду заменяли на 2% раствор декстран сульфата натрия (DSS) (Affymetrix, США, молекулярный вес 40-50 кДа) в стерильной воде. DSS продолжали давать до конца эксперимента независимо от проводимой терапии. Контрольные группы животных продолжали получать стерильную воду.
Через сутки после введения DSS, начинали терапию заболевания. Все вещества вводились перорально в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ). В группе 4 животным вводили ПЛГА-бутират (компонент 1) в дозе 3,35 мг/мышь (что соответствует 400 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь), в объеме 300 мкл, средство вводили каждый день в течение 7 дней. В группе 5 животным вводили ПЛГА-бутират (компонент 1) в дозе 3,35 мг/мышь (что соответствует 400 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь), в объеме 300 мкл, средство вводили каждый день в течение 7 дней. Далее через сутки после прекращения введения бутирата начинали терапию бутират-синтезирующими бактериями (компонент 2), которые вводили в дозе 2*108 КОЕ/мышь в объеме 500 мкл каждый день в течение 7 дней. Остальные группы животных были контрольными. В этих группах животным не проводили терапию воспалительных заболеваний кишечника.
На 30 день была проведена эвтаназия животных для определения тяжести воспалительной патологии кишечника. По сравнению с животными не получавшими терапию (группа 2) структура кишечников мышей подвергшихся терапии одним (группа 3) или двумя компонентами разработанного средства (группа 4) характеризовалась меньшей интенсивностью геморагий. При этом наибольший терапевтический эффект наблюдался в группе животных, которым вводили оба компонента разработанного иммунобиологического средства. Количественная оценка эффективности проведенной терапии была проведена измерением длины толстого кишечника животных и веса самих животных до и после проведенной терапии. Результаты эксперимента представлены на фиг. 7. Согласно полученным данным длина кишечника в группе животных, подвергшихся терапии одним или двумя компонентами разработанного средства, была статистически больше длины кишечника животных без терапии. На основании полученных данных, можно сделать вывод о том, что терапия разработанным иммунобиологическим средством способна обеспечивать терапевтический эффект в отношении воспалительной патологии кишечника мышей колонизированных С.jejuni с сочетанным воздействием декстрана сульфата.
Пример 8. Определение концентрации IL6 в тканях кишечника животных после введения разработанного иммунобиологического средства.
Интерлейкин 6 (ИЛ-6) является одним из важнейших медиаторов воспаления в кишечнике. Было показано, что повышение экспрессии ИЛ-6 в кишечнике приводит к индукции антиапоптотических факторов bcl-2 и bcl-xl и формированию пула Т-клеток, устойчивых к апоптозу, что приводит к хроническому воспалению. При этом блокировании передачи сигналов ИЛ-6 с помощью моноклональных антител (mAb) к рецептору ИЛ-6 устраняет устойчивость к апоптозу Т-клеток собственной пластинки кишечника. Клинические исследования гуманизированных моноклональных антител к рецептору ИЛ-6 показали, что введение данных антител пациентам с болезнью Крона приводит к хорошему терапевтическому эффекту, что также подтверждает важную роль ИЛ-6 в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника.
Целью данного исследования являлась оценка способности разработанного средства влиять на повышенную экспрессию ИЛ-6 в кишечнике мышей, индуцированную инфекцией Campylobacter jejuni.
Для данного эксперимента были использованы мыши гнотобионты (свободные от микрофлоры) линии C57/B6NTac. Колонизацию кишечника животных Campylobacter jejuni осуществляли путем перорального введения суспензии микроорганизмов в объеме 500 мкл. Концентрацию бактерий в суспензии рассчитывали по стандарту мутности. Фактическая концентрация бактерий определялась путем высева дозы суспензии на специфические среды. Расчетная концентрация бактерий составила 2*108 КОЕ/мл. Фактическая концентрация, вводимая животным, составила 2,8*108 КОЕ/мл. На 14-й день эксперимента, у животных питьевую воду заменяли на 2% раствор декстран сульфата натрия (DSS) (Affymetrix, США, молекулярный вес 40-50 кДа) в стерильной воде. DSS продолжали давать до конца эксперимента независимо от проводимой терапии. Контрольная группа животных продолжала получать стерильную воду. Терапию начинали на 15-й день эксперимента и продолжали каждый день в течение 1 недели. ПЛГА-бутират (компонент 1) вводили в дозе 4,28 мг/мышь (что соответствует 400 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь), в объеме 300 мкл. Бутират-синтезирующие бактерии (компонент 2): смесь Faecaliabacterium prausnitzii 108КОЕ/мышь и Roseburia intestinalis 108КОЕ/мышь) в объеме 500 мкл вводили в группе 3 одновременно с компонентом 1.
Были образованы следующие группы животных (по 3 мыши/группу):
1) С. Jejuni; DSS;
2) С. Jejuni; DSS; ПЛГА-бутират (компонент 1);
3) С. Jejuni; DSS; ПЛГА-бутират (компонент 1) и одновременно бутират-синтезирующие бактерии (компонент 2): смесь Faecaliabacterium prausnitzii 108КОЕ/мышь и Roseburia intestinalis 108КОЕ/мышь);
На 21-й день эксперимента производили отбор образов кишечника (примерно 1 см в длину) у всех животных в одних и тех же отделах. Образцы после извлечения сразу помещались в центрифужные пробирки, содержащие 1мл фосфатно-солевого буфера, частицы для гомогенизации тканей (Omni International, США), а также однократный раствор ингибиторов протеаз (Sigma, США). Пробирки с образцами помещали в гомогенизатор и проводили разрушение ткани в течение 60 сек (МР Biomedicals, США). Полученные гомогенаты кишечника были нормализованы по концентрации белка. Концентрацию белка измеряли методом Бредфорда (Sigma, США) согласно протоколу производителя. Определение цитокинов и хемокинов проводили с использованием набора магнитных шариков с иммобилизованными антителами (BioRad, США) согласно протоколу производителя. Флуорисцентномеченные магнитные шарики (Magnetic beads), с сорбироваными антителами, вносили в лунки 96-луночного планшета и дважды промывали 100 мкл промывочным буфером (Wash buffer). Все этапы промывки производились с использованием магнитной подложки. В лунки планшета к шарикам вносили разбавленную в два раза буфером (Sample buffer) гомогенаты кишечника (по 500мкг на пробу) по 50 мкл, отрицательный контроль (буфер для образца) и контрольные образцы для построения калибровочной кривой. Затем, планшет инкубировали в течение 30 минут в орбитальном шейкере при комнатной температуре и 300 об/мин. Планшет трижды промывали 100 мкл промывочного буфера, после чего добавляли по 25 мкл вторичных антител, конъюгированных с биотином. Затем, инкубировали в течение 30 минут в орбитальном шейкере при комнатной температуре и 300 об/мин. Планшет трижды промывали 100 мкл промывочного буфера. В лунки планшета вносили по 50 мкл стрептовидинна, конъюгированного со фикоэритрином (РЕ) и инкубировали в течение 15 минут, после чего промывали трижды промывочным буфером. Затем в лунки планшета вносили по 120 мкл буфера (Assay buffer). Учет результатов производили на приборе 32 MAGPIX (Luminex, США). Расчет концентрации цитокинов проводили, используя программное обеспечение прибора.
Результаты эксперимента представлены на Фиг. 8. Как видно из представленных результатов, у животных, колонизированных Campylobacter jejuni под воздействием, декстран сульфата натрия, возникает хроническое воспаление кишечника, которое характеризуется повышением уровня ИЛ-6. Введение мышам разработанного средства позволяет достоверно снизить уровень ИЛ-6, а, следовательно снизить воспаление в кишечнике животных.
Таким образом, приведенные примеры подтверждают достижение технического результата: создание безопасного иммунобиологического средства для терапии воспалительных заболеваний кишечника на основе бутирата натрия, обеспечивающего доставку действующего вещества в кишечник, а также обеспечивающего пролонгированное действие.
Пример 9. Исследование токсичности разработанного средства на мышах при пероральном введении.
Целью данного эксперимента являлось исследование токсичности разработанного средства при пероральном введении.
В исследовании были использованы аутбредные мыши, самцы, массой 18-20 грамм, возрастом 7-8 недель.
Были сформированы следующие экспериментальные группы животных:
1) Компонент 1: ПЛГА-бутират в дозе 3,86 мг/мышь (0,4 мг инкапсулированного бутирата натрия), 20 мышей;
2) мг/мышь (4 мг инкапсулированного бутирата натрия), 20 мышей;
3) Компонент 1: ПЛГА-бутират в дозе 19,3 мг/мышь (2 мг инкапсулированного бутирата натрия), 20 мышей;
4) Компонент 1: ПЛГА-бутират в дозе 38,64 мг/мышь (4 мг инкапсулированного бутирата натрия), 20 мышей;
5) Компонент 2: бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis) в дозе 108КОЕ/мышь, 20 мышей;
6) Компонент 2: бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis) в дозе 109КОЕ/мышь, 20 мышей;
7) Компонент 2: бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis) в дозе 1010КОЕ/мышь, 20 мышей;
8) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Статистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Все приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной технической задачи, а именно создание безопасного средства для эффективного лечения воспалительных заболеваний кишечника.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность иммунобиологического средства для терапии воспалительных заболеваний кишечника и промышленную применимость.
Claims (4)
1. Иммунобиологическое средство для терапии воспалительных заболеваний кишечника, содержащее компонент 1, представляющее собой средство в виде бутирата натрия, упакованного внутрь частиц из сополимера молочной и гликолевой кислот, и компонент 2, представляющий собой средство в виде бутират-синтезирующих бактерий.
2. Способ использования иммунобиологического средства по п.1 для лечения воспалительных заболеваний кишечника путем перорального введения его компонентов в эффективном количестве.
3. Способ использования иммунобиологического средства по п.2, при котором вводят компонент 1 с последующим введением компонента 2.
4. Способ использования иммунобиологического средства по п.2, при котором компонент 1 и компонент 2 вводятся одновременно.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2780868C1 true RU2780868C1 (ru) | 2022-10-04 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008091170A1 (en) * | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Biolek Sp. Z O.O. | A preparation containing sodium butyrate and the application of a preparation containing sodium butyrate |
US20160000838A1 (en) * | 2013-03-05 | 2016-01-07 | Rijksuniversiteit Groningen | Use of Faecalibacterium Prausnitzii Htf-f (DSM 26943) to Suppress Inflammation |
RU2754367C2 (ru) * | 2015-10-28 | 2021-09-01 | Метабоген Аб | Faecalibacterium prausnitzii и desulfovibrio piger для применения при лечении или предупреждении диабета и заболеваний кишечника |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008091170A1 (en) * | 2007-01-25 | 2008-07-31 | Biolek Sp. Z O.O. | A preparation containing sodium butyrate and the application of a preparation containing sodium butyrate |
US20160000838A1 (en) * | 2013-03-05 | 2016-01-07 | Rijksuniversiteit Groningen | Use of Faecalibacterium Prausnitzii Htf-f (DSM 26943) to Suppress Inflammation |
RU2754367C2 (ru) * | 2015-10-28 | 2021-09-01 | Метабоген Аб | Faecalibacterium prausnitzii и desulfovibrio piger для применения при лечении или предупреждении диабета и заболеваний кишечника |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Sonia Facchin et al., Microbiota changes induced by microencapsulated sodium butyrate in patients with inflammatory bowel disease / Neurogastroenterology & Motility, 2020, pp.1-13. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6441536B2 (ja) | 細菌株を含む組成物 | |
ES2578081T5 (es) | Composiciones bacterianas para profilaxis y tratamiento de enfermedades degenerativas | |
JP5392672B2 (ja) | 新規の乳酸桿菌株及びその使用 | |
Kaur et al. | Probiotics: delineation of prophylactic and therapeutic benefits | |
CN105120847B (zh) | 益生生物和/或治疗剂的靶向胃肠道递送 | |
US20220257673A1 (en) | Methods and products for treatment of gastrointestinal disorders | |
Lee et al. | Evaluation of probiotic treatment in a neonatal animal model | |
JP2020503862A (ja) | Cd8+ t細胞の誘導のための組成物および方法 | |
US8092793B2 (en) | Treating inflammatory bowel disease with live bacteria | |
AU2019201644A1 (en) | Probiotic formulations and methods for use | |
ES2683190T3 (es) | Probiótico para el llanto infantil excesivo | |
ES2331650T3 (es) | Utilizacion de bacterias probioticas en el tratamiento de una infeccion. | |
JP5779762B2 (ja) | 経口送達のための生細胞の配合物 | |
WO2021097288A1 (en) | Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases | |
RU2780868C1 (ru) | Иммунобиологическое средство на основе бутирата и способ его использования для терапии воспалительных заболеваний кишечника | |
MXPA05010696A (es) | Cepa de lactobacillus fermentum y usos de la misma. | |
WO2017020783A1 (zh) | 脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用 | |
JP2001158743A (ja) | 乳酸菌含有組成物、医薬及び食品 | |
Lyasota et al. | Effect of a complex prebiotic preparation on the preservation, growth intensity and microflora in rabbits’ intestine | |
KR20220016481A (ko) | 패혈증 및 괴사성 장염 유도된 신경발달 결핍의 예방을 위한 프리바이오틱 제형 | |
CN115671067B (zh) | 黄龙滴丸治疗和预防肠易激综合征的用途 | |
JP2010180146A (ja) | 腸管出血性大腸菌による感染死を抑制するための組成物及び方法 | |
BG67244B1 (bg) | Имуномодулиращ синбиотичен състав | |
RU2149008C1 (ru) | Способ получения биопрепарата | |
CN116019841A (zh) | 治疗自闭症谱系障碍的方法和包含肠道菌群的多层滴丸 |