KR20190127710A - 헌팅톤병 및 레트 증후군에서의 장 미생물총의 조정 - Google Patents

헌팅톤병 및 레트 증후군에서의 장 미생물총의 조정 Download PDF

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KR20190127710A
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알리 코쉬난
사키스 케이. 매즈매니언
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캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본원에서의 일부 실시양태는 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 방법, 조성물, 및/또는 용도에 관한 것이다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 미생물총의 조정이 레트 증후군 및 헌팅톤병의 증상에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다. 박테리아 및/또는 항생제를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물이 이러한 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키도록 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다.

Description

헌팅톤병 및 레트 증후군에서의 장 미생물총의 조정
참조로 포함된 임의의 특허 출원
본 출원과 함께 제출된 출원 데이터 시트에서 외국 또는 국내 우선권 주장이 확인되는 임의의 모든 출원이 이에 의해 37 CFR 1.57 하에 참조로 포함된다. 본 출원은 2017년 2월 7일에 출원된 미국 가출원 62/455,706을 우선권 주장하고, 이에 의해 상기 가출원은 전문이 참조로 포함된다.
정부 지원 R&D에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 NS074374 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
배경
분야
본원에서의 일부 실시양태는 헌팅톤병 및/또는 레트 증후군과 연관된 증상을 검출하고/거나, 상기 증상을 예방하고/거나, 상기 증상의 발병을 지연시키고/거나, 상기 증상을 호전시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이러한 방법 및 조성물은 박테리아 및/또는 항생제를 포함할 수 있다.
헌팅톤병 (HD)은 헌팅틴 (HTT) 단백질의 엑손-1 내의 폴리글루타민 (폴리Q)의 신장물로 번역되는 CAG 반복의 확장에 의해 야기되는, 유전적으로 유전되는 파괴적인 신경변성 장애이다. 단백질분해에 의해, 그리고 mRNA의 변경된 스플라이싱에 의해 생산된 돌연변이체 HTT의 엑손-1은 아밀로이드생성성이고, 신경독성이며, HD 병리의 주요 결정인자이다 (Bates et al., 2015). HD 환자는 쇠약화 운동 증상, 정신성 증상 및 인지 증상이 발달된다 (Paulson, 2011). 염증을 포함하는 환경 요인이 HD의 발병기전에 영향을 미칠 수 있다. 발현-전 HD 대상체는 운동 증상이 발병하기 수년 전에 혈행 및 뇌척수액 내에 활성화된 소교세포 및 상승된 수준의 IL-1β, IL-6, 및 TNF-α를 포함하는 염증유발성 시토카인이 있다 (Bjoerkqvist et al., 2008, Tai et al., 2007).
레트 증후군은 메틸-CpG 결합 단백질 2 (MeCP2)에서의 돌연변이에 의해 야기되는 X-연관 자폐-스펙트럼 장애 (ASD)이다. 레트 증후군에 걸린 소녀는 소두증, 정진 지체, 상동증, 불안, 호흡 및 언어 문제, 발작, 척추측만증, 및 파킨슨병 특색이 발달된다. 남성에서의 MeCP2 돌연변이는 치사성이고, 태어난 이는 일반적으로 1년 이내에 사망한다. MeCP2는 또한 자폐증 환자, 청소년기-발병 정신분열증, 및 MeCP2 중복 장애 중 일부에서 또한 연루된다 (Lombardi et al., 2015).
일부 실시양태는 악티노박테리아(Actinobacteria) 박테리아, 테네리쿠테스(Tenericutes) 박테리아, 또는 박테로이데스(Bacteroides) 박테리아 중 적어도 2종을 포함하는 단리된 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 단리된 악티노박테리아 박테리아 및 단리된 박테로이데스 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 단리된 악티노박테리아 박테리아를 포함하며, 여기서 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아(Bifidobacteria)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 단리된 박테로이데스 박테리아를 포함하고, 박테로이데스 박테리아는 비. 프라길리스(B. fragilis), 비. 오바투스(B. ovatus), 및 비. 테타이오타오미크론(B. thetaiotaomicron), 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 메소플라스마 엔토모필룸(Mesoplasma entomophilum), 락토바실루스 타이와넨시스(Lactobacillus taiwanensis), 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스(Pediococcus argentinicus), 비피도박테리움 코에리눔(Bifidobacterium choerinum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 박테리아를 포함하는 단리된 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아가 OUT의 참조 16S rRNA 서열에 적어도 97%, 예를 들어 적어도 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑된다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 106 cfu 이하, 예를 들어 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하의 피르미쿠테스(Firmicutes) 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 항생제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 리파마이신인 항생제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항생제는 리팍시민을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 항생제는 단리된 박테리아와 분리된 별개의 조성물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 박테리아는 단일 조성물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 박테리아는 서로 별개의 조성물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 생성물 조합물은 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태는 항생제, 및 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 단리된 악티노박테리아 박테리아를 포함하며, 여기서 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 106 cfu 이하, 예를 들어 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물의 항생제는 리파마이신이다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물의 항생제는 리팍시민을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 항생제는 단리된 박테리아와 분리된 별개의 조성물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 임의의 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 생성물 조합물은 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태는 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아, 또는 열거된 박테리아의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 대상체를 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 조성물을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내에 있는 것으로서 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 악티노박테리아 박테리아가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 박테로이데스 박테리아는 대상체에게 동시에 또는 별개로 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 테네리쿠테스 박테리아는 대상체에게 동시에 또는 별개로 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 박테로이데스 박테리아는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 비피도박테리움 코에리눔으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아가 OUT의 참조 16S rRNA 서열에 적어도 97%, 예를 들어 적어도 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑된다. 일부 실시양태에서, 104 cfu 이하, 예를 들어 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항생제는 리파마이신이다.
일부 실시양태는 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 대상체에게 항생제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 대상체를 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 조성물을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내의 대상체로서 선택하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항생제는 리파마이신이다. 일부 실시양태에서, 항생제는 리팍시민을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성이 감소되거나, 상기 증상의 발병이 지연되거나, 또는 상기 증상이 호전된다. 일부 실시양태에서, 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성이 감소되거나, 상기 증상의 발병이 지연되거나, 또는 상기 증상이 호전된다. 일부 실시양태에서, 항생제를 투여하는 것은 대상체 내의 장 박테리아의 양을 적어도 95%, 예를 들어 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% (열거된 값 중 임의의 2개 사이의 범위를 포함함)만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아, 또는 열거된 박테리아의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 박테리아는 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 비피도박테리움 코에리눔으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아가 OUT의 참조 16S rRNA 서열에 적어도 97%, 예를 들어 적어도 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아가 대상체에게 투여되며, 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여되며, 박테로이데스 박테리아는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론, 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단리된 박테리아는 항생제와 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 박테리아는 항생제와 상이한 시간에 투여된다. 일부 실시양태에서, (a) 항생제가 박테리아 전에 투여되거나; 또는 (b) 박테리아가 항생제 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 104 cfu 이하, 예를 들어 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아가 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태는 대상체의 샘플의 프로파일을 결정하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 (a) 테네리쿠테스, 악티노박테리아, 및 피르미쿠테스, 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 장 박테리아의 존재 및/또는 수준; (b) 콜린, 5-HT, 티로신, 도파민, 및 에피네프린, 또는 열거된 신경전달물질 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경전달물질의 혈청 수준, 또는 (c) Chrna2, Chrna7, Chrb4, Chrm1, Slc5a7, Chat, Ache, 및 Slc18a3, 또는 열거된 유전자 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 콜린성 유전자의 발현 수준 중 적어도 하나를 검출하는 것을 포함한다. 프로파일은 (a), (b), (c), (a) 및 (b), (a) 및 (c), (b) 및 (c), 또는 (a) 및 (b) 및 (c)의 검출된 존재 및/또는 수준을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로파일을 결정하는 것은 (a)를 결정하는 것을 포함하고, 샘플이 대상체의 장 및/또는 분변 물질을 포함하고, 레트 증후군의 존재 또는 위험 상승이 비-레트 대조군 샘플 내에 존재하는 수준에 비해 더 낮은 수준의 테네리쿠테스 또는 악티노박테리아, 또는 증가된 수준의 피르미쿠테스에 의해 지시된다. 일부 실시양태에서, 프로파일을 결정하는 것은 (b)를 결정하는 것을 포함하고, 샘플이 대상체의 혈청을 포함하고, 레트 증후군의 존재 또는 위험 상승이 대조군에 비교하여 더 높은 수준의 콜린, 티로신, 및/또는 도파민; 및/또는 비-레트 대조군 샘플 내에 존재하는 수준에 비해 더 낮은 수준의 5H-T 및/또는 에피네프린에 의해 지시된다. 일부 실시양태에서, 프로파일을 결정하는 것은 (c)를 결정하는 것을 포함하고, 샘플이 대상체의 핵산을 포함하고, 레트 증후군의 존재 또는 위험 상승이 비-레트 대조군 샘플 내에 존재하는 수준에 비해 더 낮은 발현 수준의 Chrna2, Chrna7, Chrb4, Chrm1, Slc5a7, Chat, Ache, Slc18a3, 또는 열거된 유전자 중 2종 이상에 의해 지시된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아는 비피도박테리아를 포함한다.
도 1a-d. 도 1a는 일부 실시양태의 드로소필라(Drosophila) 3령 유충 -/+ 리팍시민 (Rif)에서의 응집된 mHDx1의 면역조직화학을 도시하는 일련의 영상이다. 도 1b는 mHDx1 응집에 대해 검사된 상이한 뱃치 풀링 유충의 웨스턴 블롯 (WB)의 영상이다. 도 1c는 성체 파리가 도 1c에서 사용된 것을 제외하고는 도 1a와 유사한 면역조직화학을 도시하는 일련의 영상이다. 도 1d는 성체 파리가 도 1d에서 사용된 것을 제외하고는 도 1b와 유사한 WB를 도시한다. Gal4 유도 시스템 + UAS (상류 활성화 서열) 하류의 mHDx1 (120Q) 및 드로소필라 뉴런-특이적 프로모터 Elav 하류의 gal4 트랜스활성화제를 사용하여, 자손의 신경계에서의 mHDx1의 발현을 유도하였다. 도 1c에서, 중앙 뇌 영역이 제시된다.
도 2a-d는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 HD 파리에 박테리아를 공급하는 것의 효과를 도시하는 일련의 그래프이다. 도 2a는 이. 콜라이(E. coli)를 HD 파리에 공급하는 것이 운동 증상의 발달을 가속화한다는 것을 도시한다. 도 2b는 락토바실루스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) (LGG)를 HD 파리에 공급하는 것이 운동 증상에 영향을 미치지 않는다는 것을 도시한다. 도 2c는 항균 펩티드 mRNA가 HD 파리에서 상승된다는 것을 도시한다. 도 2d는 페니실린-스트렙토마이신에 의한 장 미생물의 제거가 HD 파리에서의 운동 결함을 호전시킨다는 것을 도시한다.
도 3a-d는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 HD 파리에서의 박테리아의 효과를 도시하는 일련의 영상이다. 도 3a는 올리고머를 인식하는 항-컬리(Curli) 항체 (백색 화살표)로 드로소필라 장의 면역조직화학을 도시하는 영상을 제시한다. 도 3b는 컬리+ 이. 콜라이가 콜로니화되는 것에서만 응집체를 인식하는 항체로 성체 586 HD 파리가 염색된 것을 도시힌다. 도 3c는 B에서와 유사한 파리들로부터의 풀링 샘플의 웨스턴 블롯 결과 (WB)를 도시하는 영상이다. 도 3d는 컬리+ 이. 콜라이가 콜로니화된 파리의 부동성을 제시하는 등반 검정법을 도시한다. Gal4 시스템 + UAS 하류의 돌연변이체 HTT의 586 AA (120Q) N-말단 단편 및 뉴런-특이적 프로모터 Elav 하류의 gal4 트랜스활성화제를 사용하여, 자손의 신경계에서의 발현을 유도하였다.
도 4a-b는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 WT 및 HD 드로소필라의 뇌 절편을 도시하는 영상 세트이다. 올리고머 특이적 항체 (PHP2)로의 WT (대조군) (도 4a) 및 HD (도 4b)의 뇌 절편의 EM 분석이 제시된다. 올리고머의 면역 금 표지화가 흑색 점으로서 제시된다.
도 5a-d는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 리팍시민 치료를 받은 또는 받지 않은 레트 마우스의 특성을 제시하는 일련의 영상 및 그래프이다. 도 5a는 레트 마우스 +/- 리팍시민의 둥지 만들기 능력을 도시한다. 도 5b는 리팍시민-치료 마우스가 허용된 2분 시간 내에 와이어-메시 실린더를 등반하려는 시도를 더 많이 한다는 것을 도시하는 그래프이다. 도 5c는 와이어 메시 매달리기 검정법에 의해 근육 강도를 테스트하는 것을 도시하는 그래프이다. 도 5d는 리팍시민의 존재 및 부재 하의 레트 마우스의 뒷다리 움켜쥐기를 도시하는 그래프이다. N=6. 채점 및 절차는 문헌 [Southwell et al., 2009]에 기술된 바와 같았다.
도 6a-b는 일부 실시양태의 레트 마우스의 더블코르틴 염색의 결과를 도시하는 일련의 영상 및 그래프이다. 도 6a는 비히클-치료 (상부 패널) 및 리팍시민-치료 레트 마우스 (하부 패널)에서의 양측 해마의 더블코르틴 염색을 도시한다. 도 6b는 4마리의 비히클-치료 동물 및 6마리의 리팍시민-치료 동물로부터의 양측 해마 (2개의 층)의 치아 이랑 (DG) 내의 더블코르틴 양성 세포의 정량화를 제시한다.
도 7은 일부 실시양태의 레트 마우스의 반-정량적 PCR의 결과를 도시하는 영상이다. 반-정량적 PCR은 수컷 레트 마우스에서의 테네리쿠테스(Ten)의 부재, 및 리팍시민(Rif) 치료 시의 상승을 제시한다 (하부 패널). 상부 패널은 양성 대조군으로서 사용된 유박테리아 증폭이다.
도 8a-b는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 MeCP2에 대한 면역조직화학을 제시하는 일련의 영상이다. 도 8a는 소장 상피에서의 MeCP2 발현을 제시하는 소장의 회장 부분의 면역조직화학을 도시한다 (좌측 패널). 우측 패널의 하부의 화살표는 움세포를 가리킨다. 도 8b는 고유판 세포, 뿐만 아니라 장 신경계 내의 장근 신경총 내의 MeCP2에 대한 염색을 도시한다 (상부 패널). 하부 패널은 레트 마우스 (T158A)로부터의 유사한 절편이다.
도 9a-f는 일부 실시양태의 WT 및 레트 마우스의 장의 분석을 제시하는 일련의 영상 및 그래프이다. 도 9a 및 9b는 WT 및 T158A 레트 마우스에서의 소장 및 대장 길이의 정량화를 도시하는 그래프이다. 각각의 점은 마우스를 나타낸다. 도 9c는 WT 및 레트 마우스의 대표적인 GI 관의 영상이다. 도 9d 및 9e는 장 길이의 변화가 어린 동물에서 최소임을 도시하는 그래프이다. 도 9f는 융모의 기저부의 움 내의 파네트 세포 (화살표)를 확인하기 위해 항-리소자임 항체로 염색된 WT (좌측) 및 T158A (우측) 레트 마우스의 회장의 대표적인 절편 쌍이다. 모든 세포를 표시하고 융모의 구조를 드러내도록 DAPI 염색을 사용하였다.
도 10은 일부 실시양태의 WT (좌측) 및 레트 (우측) 마우스의 장 상피 내의 브로모데옥시우리딘 (BrdU) 혼입을 도시하는 영상이다. 4주령 마우스에 BrdU를 주사하였다. 주사 24시간 후에 조직을 수확하고, 프로세싱하고, BrdU (도 10에서 화살표로 표시되지 않은 밝은 초점으로 나타남) 및 증식 세포의 마커인 ki67 (화살표)을 인식하는 항체로 염색하였다. 증폭 중인 전구세포가 BrdU로 표지된다.
도 11a-d는 WT 및 레트 마우스의 분변 펠릿 내의 박테리아 문의 분석을 제시하는 일련의 그래프 및 영상이다. 도 11a 및 11b는 16S RNA 시퀀싱에 의해 결정된 WT (도 11a) 및 T158A (도 11b) 마우스의 분변 펠릿 내에 존재하는 주요 박테리아 문의 백분율을 제시하는 그래프이다. 적색으로 지시된 것이 2개의 군 사이에서 상이하다. 상이한 우리에서 사육된 각각의 군에 대한 N=6이다. 도 11c는 수컷 레트 마우스에서의 비피도박테리아의 부재를 제시하는 반-정량적 PCR을 제시하는 영상이다. 도 11d는 4개월령 암컷 레트 마우스에서의 비피도박테리아의 감소를 지시하는 영상이다.
도 12a-d 일부 실시양태의 WT 및 레트 마우스의 특성을 도시하는 일련의 그래프 및 영상이다. 레트 마우스는 소장이 투명하고, 혈행 내의 지질다당류 (LPS) 수준이 상승되며 (도 12a-d 참조), 과도한 복부 지방이 축적된다 (도 12c-d 참조). 도 12e는 복부 지방이 결여된 대표적인 GF WT 및 레트 마우스를 제시하는 영상이다. 도 12f는 레트 마우스에서의 장 길이가 WT와 유사하다는 것을 제시하는 영상이다. 도 12b 및 12d의 경우, 각각의 군에 대해 N=6이다.
도 13은 일부 실시양태의 WT 및 레트 마우스의 소장의 회장 부분 내의 대식세포의 면역염색을 제시하는 일련의 영상이다. 대식세포 마커 Iba-1 (화살촉) 및 F4/80 (화살표)에 대한 항체로 면역염색을 수행하였다. 각각의 행은 각각의 군의 한 마리의 마우스로부터의 대표물이다.
도 14a-f는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 항생제 칵테일로 레트 마우스를 치료하는 것의 결과를 도시하는 일련의 영상 및 그래프이다. 도 14a는 항생제 칵테일 (ABX)로의 레트 마우스 치료가 소장 (SI) 길이를 개선한다는 것을 도시하는 그래프인 반면, 리팍시민 (Rif)은 결장 길이를 촉진한다 (도 14b-c). 도 14a에서, 각각의 점은 마우스를 나타낸다. 도 14c에서, 각각 N=6이다. 도 14d는 이형접합 암컷에서의 비만 정도를 제시한다. 도 14e-f는 암컷 레트 마우스를 리팍시민으로 치료하는 것에 의해 체중 증가 및 복부 지방 축적이 예방된다는 것을 제시한다. 도 14e 및 14f에 대해 N=6이다. 리팍시민은 WT 마우스의 체중에 대한 영향이 최소이다.
도 15a-b는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 비히클 또는 리팍시민으로 치료된 레트 마우스의 피질 영역으로부터의 뇌 절편의 염색을 도시하는 일련의 영상이다. 도 15a는 활성화된 성상세포 GFAP (중앙 칼럼) 및 GS (우측 칼럼)의 마커로의 염색을 도시한다; GFAP 및 GS의 오버레이가 좌측 칼럼에서 제시된다. 도 15b는 해마 영역에서의 소교세포 마커 Iba- 1 및 CD11로의 염색을 제시한다. Iba-1 및 CD11이 일반적으로 해마 영역 전반에 걸쳐 공동-국소화되었지만, Iba-1은 비히클-치료 군에서는 더 높은 수준으로 (예를 들어, 화살표 참조), 리팍시민-치료 군에서는 더 낮은 수준으로 발현되었다.
도 16a-d는 본원에서의 일부 실시양태에 다른 리팍시민의 존재 또는 부재 하에서의 레트 마우스의 행동을 제시하는 일련의 그래프 및 영상이다. 도 16a는 리팍시민의 존재 또는 부재 하의 레트 마우스의 우리 만들기 능력을 제시한다. 도 16b는 리팍시민-치료 마우스가 허용된 2분 시간 내에 와이어-메시 실린더를 등반하려는 시도를 더 많이 한다는 것을 제시한다. 도 16c는 와이어 메시 매달리기 검정법에 의해 근육 강도를 테스트하는 것을 제시한다. 도 16d는 리팍시민의 존재 및 부재 하의 레트 마우스의 뒷다리 움켜쥐기를 제시한다. N=6. 채점 및 절차는 문헌 [Southwell et al., 2009]에 기술된 바와 같았다.
도 17a-b는 일부 실시양태의 WT 및 레트 (T158A) 마우스의 양측 해마의 더블코르틴 염색을 제시하는 일련의 현미경 영상이다. 도 17a는 WT (상부 패널) 및 레트 (T158A) 마우스 (하부 패널)에서의 양측 해마의 더블코르틴 염색을 도시하는 일련의 영상이다. 도 17b는 GF WT (상부 패널) 및 T158A 수컷 마우스의 유사한 염색을 제시하는 일련의 영상이다.
도 18a-c는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 레트 마우스에서의 신경발생에 대한 미생물총의 효과를 도시하는 일련의 그래프 및 영상이다. 도 18a는 비히클-치료 (상부 패널) 및 리팍시민-치료 레트 마우스 (하부 패널)에서의 양측 해마의 더블코르틴 염색을 도시하는 일련의 영상이다. 도 18b는 4마리의 비히클-치료 동물 및 6마리의 리팍시민-치료 동물로부터의 양측 해마 (2개의 층)의 치아 이랑 내의 더블코르틴 양성 세포의 정량화를 제시하는 그래프이다. 도 18c는 비히클 (상부) 및 리팍시민-치료 레트 마우스의 SVZ (뇌실하대) 내의 ki67 양성 세포 (화살표)를 제시하는 일련의 영상이다. 박스 표시된 구역은 극적인 변화가 있는 영역을 강조한다 (상당히 더 많은 ki67-양성 세포가 리팍시민-치료 마우스에서 관찰된다). 전체적으로 뉴런 (NeuN)에 대한 NeuN 염색이 밝은 초점으로서 관찰된다.
도 19는 본원에서의 일부 실시양태에 따른 WT 및 레트 마우스에서의 반-정량적 PCR의 결과를 제시하는 영상이다. 반-정량적 PCR은 수컷 레트 마우스에서의 테네리쿠테스 (Ten)의 부재, 및 리팍시민 (Rif) 치료 시의 상승을 제시한다 (하부 패널). 상부 패널은 양성 대조군으로서 사용된 유박테리아 증폭이다.
도 20a는 일부 실시양태의 레트 마우스에서의 콜린성 유전자의 발현을 도시하는 그래프이다. 레트 마우스에서 콜린성 유전자의 발현이 감소되는 것으로 제시된다.
도 20b는 일부 실시양태의 레트 마우스의 혈청 내의 신경전달물질 수준을 도시하는 그래프이다.
헌팅톤병 (본원에서 "HD"로도 지칭됨) 또는 레트 증후군 (본원에서 "레트"로도 지칭됨)과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 방법, 조성물, 및 생성물 조합물이 본원에서 기술된다. HD의 드로소필라 모델에서, 미생물 플로라를 변경시키는 것이 HD의 증상을 악화시킬 수 있는 한편, 항생제를 사용하여 장 미생물을 제거하는 것이 HD의 증상을 개선시킨다는 것이 본원에서 관찰된다 (예를 들어, 실시예 2 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, HD와 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위해, 항생제 및/또는 박테리아를 포함하는 방법, 조성물, 및 생성물 조합물이 제공된다. 레트의 마우스 모델에서, 장 미생물총이 야생형 마우스에 비교하여 종 및/또는 문 수준에서 변경되고, 장 형태학도 그러하다는 것이 추가로 관찰된다 (예를 들어, 실시예 9-10 참조). 반면에, 이러한 마우스 모델에서 항생제를 사용하여 장 미생물을 제거하는 것은 레트 마우스에서 생리학적 및 행동적 증상을 호전시킨다 (예를 들어, 실시예 14-18 참조). 따라서, 본원에서의 일부 실시양태에서, 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위해, 항생제 및/또는 박테리아를 포함하는 방법, 용도, 조성물, 및/또는 생성물 조합물이 제공된다. 대상체의 샘플의 프로파일을 결정하기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공되고, 이는, 예를 들어, 레트 증후군의 위험 상승 및/또는 존재를 결정하는데 유용할 수 있다.
HD 환자는 위장 (GI) 합병증을 나타낸다. 그러나, HD에서의 GI 결함의 발병 및 중증도에 대한 연구는 드물다 (Andrich et al., 2009). 최근의 연구는 GI 관 및 이의 거주 미생물 (본원에서 "미생물총"으로 지칭될 수 있고, 이의 총괄적인 게놈은 "마이크로바이옴"으로 지칭될 수 있다)이 신경발달, 뉴로트로핀, 및 신경전달물질 생산, 및 행동에 영향을 미친다는 것을 실연한다 (Dinan et al., 2016, Sherwin et al., 2016). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 미생물총의 항상성이 HD의 발병기전에 기여할 수 있는 것으로 생각된다.
손상된 뇌 회로가 레트 증후군의 기저 원인이지만, 다른 기관에서의 결함 및 대사 이상이 역할을 할 수 있다. 레트 발병기전의 잠재적인 변형인자는 면역계 및 염증 경로, 콜레스테롤 및 지질 대사, 및 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1) 및 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 신호전달에서의 이상을 포함한다 (Tropea et al., 2009, Buchovecky et al., 2013, Cronk et al., 2015, Lombardi et al., 2015). 레트 환자는 중증 위장 (GI) 합병증을 나타낸다 (Motil et al., 2012). 최근의 연구는 GI 관 및 이의 거주 미생물이 신경발달, 뉴로트로핀 및 신경전달물질 생산에 영향, 및 행동에 영향을 미친다는 것을 실연한다 (Sherwin et al., 2016). 이론에 의해 제한되지 않으면서, GI 병리 및 장 미생물총의 항상성에서의 변화가 레트 증후군의 발병기전에 기여할 수 있는 것으로 생각된다.
조성물 및 생성물 조합물
본원에서의 다양한 실시양태에 따른 특정 박테리아 및/또는 항생제 (예를 들어, 리파마이신, 예를 들어 리팍시민; 항생제의 추가적인 예가 하기에 기술된다)를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는 조성물 및/또는 생성물 조합물은 헌팅톤병 또는 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키고/거나, 상기 증상의 발병을 지연시키고/거나, 상기 증상을 호전시키는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 언급된 조성물 중 임의의 것의 성분이 최종 조성물을 형성하도록 (예를 들어, 박테리아를 또 다른 박테리아 및/또는 하나 이상의 항생제와 혼합하여 박테리아 및/또는 항생제(들)의 혼합물을 포함하는 최종 조성물에 도달하도록) 조합될 수 있거나 또는 단일 조성물과 유사한 효과를 달성하도록 (예를 들어, 박테리아 및 하나 이상의 항생제를 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여하도록) 공동으로 사용될 수 있는 2종 이상의 전구체 조성물에서 성분들이 제공되는 "생성물 조합물"로서 개별적으로 제공될 수 있는 것을 주지한다. 따라서, 2종 이상의 성분을 포함하는 조성물이 본원에서 기술되는 어떤 경우에도, 조성물의 성분을 총괄적으로 함유하는 상응하는 "생성물 조합물" 또한 명백하게 구상된다. 조성물 및/또는 생성물 조합물 중 임의의 것이 본원에 기술된 바와 같은 헌팅톤병 (본원에서 "HD"로도 지칭됨) 또는 레트 증후군 (본원에서 "레트"로도 지칭됨)과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 용도 또는 방법에서 투여될 수 있다는 것이 추가로 구상된다.
이. 콜라이를 드로소필라 HD 모델에 투여함으로써 장 미생물총을 조정하는 것이 HD의 운동 증상을 악화시킬 수 있다는 것이 본원에서 관찰된다 (예를 들어, 실시예 2 및 3 참조). 반면에, 본원에서의 일부 실시양태에 따라 드로소필라 HD 모델을 (장 박테리아를 감소시키고/거나 제거하도록) 페니실린-스트렙토마이신 항생제로 치료하는 것이 중추 신경계 (CNS) 내의 헌팅틴 응집체의 축적을 감소시킬 수 있고, HD의 운동 증상을 호전시킬 수 있다 (예를 들어, 실시예 3 참조). 따라서, 본원에서의 일부 실시양태에 따른 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물이 HD와 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키고/거나, 상기 증상의 발병을 지연시키고/거나, 상기 증상을 호전시키는데 유용한 것으로 생각된다. 장 미생물총이 야생형 마우스와 레트 증후군의 마우스 유전자 모델 사이에서 상이하다는 것이 추가로 관찰된다 (실시예 9 참조). 특정 문 및 종이 야생형 마우스에 비교하여 레트 모델의 분변 샘플에서 상이하여, 일부 종 및/또는 문은 레트 증후군 마우스의 장에서 과다표현되는 한편, 다른 것들은 과소표현된다 (도 7, 11a-d). 특히, 레트 마우스에 대조군 (야생형) 마우스보다 유의하게 더 적은 테네리쿠테스 및 악티노박테리아 및 유의하게 더 많은 피르미쿠테스 박테리아가 있다는 것이 본원에서 보고된다 (실시예 8 및 도 11a-d 참조)). 비피도박테리아 (악티노박테리아 내의 속)가 ~ 6주령에 시작하여 레트 마우스의 GI 관으로부터 제거된다 (실시예 8, 도 7). 레트 마우스 및 야생형 (대조군) 마우스에서 상이하게 발현되는 박테리아가 하기 표 1에서 제시된다. 또한, 본원에서의 일부 실시양태에 따른 리팍시민을 포함하는 항생제로 레트 마우스를 치료하는 것이 전신 염증을 감소시켰고, 성상세포 및 소교세포를 포함하여 중추 신경계의 형태학에 영향을 미쳤으며, 레트 증후군 모델과 연관된 행동 결함, 예컨대 둥지 만들기, 등반, 및 근육 강도에서의 결함을 호전시켰다 (실시예 14-16 참조). 따라서, 본원에서의 일부 실시양태에 따른 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물이 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 치료하고/거나, 상기 증상의 발병을 지연시키고/거나, 상기 증상을 호전시키는데 유용한 것으로 생각된다.
표 1: 레트 마우스와 야생형 마우스에서 상이한 박테리아
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일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 박테리아로 이루어지거나, 또는 박테리아로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아 예컨대 비피도박테리움 코에리눔), 테네리쿠테스 박테리아 (예를 들어, 메소플라스마(Mesoplasma) 박테리아 예컨대 메소플라스마 엔토모필룸), 또는 박테로이데스 박테리아 (예를 들어, 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론) 중 적어도 2종을 포함하는 단리된 박테리아를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 악티노박테리아 및 박테로이데스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 비피도박테리아 및 박테로이데스를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 악티노박테리아 및 테네리쿠테스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 비피도박테리아 및 테네리쿠테스를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 테네리쿠테스 박테리아 및 박테로이데스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 비피도박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 생성물 조합물은 악티노박테리아 박테리아를 포함하며, 여기서 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 생성물 조합물은 박테로이데스 박테리아를 포함하고, 박테로이데스 박테리아 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론, 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물 (예를 들어, 비. 프라길리스 및 비. 오바투스; 비. 프라길리스 및 비. 테타이오타오미크론; 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론; 또는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 생성물 조합물은 테네리쿠테스 박테리아를 포함하고, 테네리쿠테스 박테리아는 메소플라스마 박테리아 예컨대 메소플라스마 엔토모필룸을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물의 박테리아는 함께 단일 조성물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 생성물 조합물의 박테리아는 2종 이상의 별개의 조성물 내에 있고, 임의적으로, 이들은 사용 전에 또는 사용 시에 혼합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 별개의 조성물은 별개로 사용될 (투여될) 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 것이다. 임의적으로, 조성물 또는 생성물 조합물은 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위해 조성물 (또는 생성물 조합물)을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내에 있는 것으로 선택된 대상체에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 대상체의 샘플의 프로파일이 레트 증후군 또는 헌팅톤병의 존재 또는 위험 상승, 및/또는 대상체가 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 사용하는 치료를 받을 수 있다는 것을 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나, 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나, 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 본원에 기술된 바와 같은 항생제 (예를 들어, 리파마이신, 예를 들어 리팍시민; 항생제의 추가적인 예가 하기에서 언급된다), 및 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아 예컨대 비피도박테리움 코에리눔), 테네리쿠테스 박테리아 (예를 들어, 메소플라스마 박테리아 예컨대 메소플라스마 엔토모필룸), 및 박테로이데스 박테리아 (예를 들어, 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론), 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 항생제 (예를 들어, 리파마이신, 예컨대 리팍시민; 항생제의 추가적인 예가 하기에서 언급된다) 및 2종 이상의 박테리아, 예를 들어, 악티노박테리아 및 박테로이데스 박테리아; 악티노박테리아 및 테네리쿠테스 박테리아; 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아; 또는 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 악티노박테리아 박테리아를 포함하며, 여기서 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 항생제 및 비피도박테리아 및 박테로이데스 (예를 들어, 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론)를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 임의적으로, 항생제는 리팍시민이다. 일부 실시양태의 생성물 조합물에서, 항생제는 단리된 박테리아와 분리된 별개의 조성물 내에 있다.
이론에 의해 제한되지 않으면서, 본원에 기술된 바와 같은 박테리아의 조합물이, 예를 들어, 레트 증후군 및/또는 HD의 증상을 호전시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상의 가능성을 감소시키도록, 상승작용성 프로바이오틱 효과가 있을 수 있는 것으로 생각된다. 2종의 비피도박테리아 (비피도박테리움 롱굼(Bifidobacterium longum) 및 비피도박테리움 아니말리스(Bifidobacterium animalis))가 비. 프라길리스가 발효가능한 기질로서 사용하는 엑소폴리사카라이드 (EPS)를 생산하는 것으로 보고되었다 (전문이 이에 의해 참고로 포함된 문헌 [Rios-Covian et al., 2016, BMC Microbiology 16: 150]).
일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 것이다. 조성물 또는 생성물 조합물은 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위해 조성물 (또는 생성물 조합물)을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내에 있는 것으로 선택된 대상체에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 대상체의 샘플의 프로파일이 레트 증후군 또는 헌팅톤병의 존재 또는 위험 상승을 지시할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 대상체의 샘플의 프로파일이 레트 증후군 또는 헌팅톤병의 존재 또는 위험 상승, 및/또는 대상체가 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 사용하는 치료를 받을 수 있다는 것을 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나, 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나, 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 생성물 조합물 중 임의의 것은 표 1에 제시된 바와 같은 레트 증후군에서 과소발현되는 1종 이상의 박테리아 (예를 들어, 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 및 비피도박테리움 코에리눔)를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 생성물 조합물 중 임의의 것은 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 및 비피도박테리움 코에리눔로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 1종 이상의 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 예를 들어, 조성물은 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 비피도박테리움 코에리눔 중 임의의 것에 맵핑되는 OTU에 각각 맵핑되는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 박테리아 (또는 열거된 값 중 임의의 2개 사이의 범위, 예를 들어 1-3, 1-5, 1-10, 2-3, 2-5, 2-10, 3-5, 또는 3-10)를 포함할 수 있다 (조성물 또는 생성물 조합물의 상이한 박테리아가 동일하거나 상이한 OTU에 맵핑될 수 있다는 것을 주지한다).
일부 실시양태에서, 박테리아가 OTU의 참조 16S rRNA 서열에 대한 동일성이 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑된다. 일부 실시양태에서, 박테리아가 OTU의 참조 16S rRNA 서열에 대한 동일성이 적어도 97%인 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 생성물 조합물, 용도 또는 방법 중 임의의 것의 박테리아는 단리된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단리된" 박테리아 (이러한 어근 용어의 변형을 포함함)는 본 개시내용의 관점에서 관련 분야의 기술자가 이해하는 바와 같은 이의 관례적이고 통상적인 의미를 갖는다. 이는 이들의 내인성 성장 환경에 있지 않고/않거나 이들이 내인성으로 성장하는 조성물 내에 있지 않은 박테리아를 지칭한다. "단리된" 박테리아가 모든 다른 물질이 없는 조성물 내에 있을 필요는 없다. 예를 들어, 이들의 내인성 성장 환경 외부에서 배양된 박테리아는 본 출원의 맥락에서 단리된 박테리아의 예이다. 예를 들어, 장의 외부에 있고 미가공 분변 샘플로부터 분리된 장 박테리아는 "단리된" 박테리아의 예이다. 반면에, 미가공 분변 또는 장 내용물 샘플 내에 있는 장 박테리아는 본 출원의 맥락에서 "단리된" 박테리아의 예가 아닌 것으로 이해된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단리된 박테리아 (예컨대 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및/또는 박테로이데스 박테리아)는 분변 샘플의 일부가 아니고, 장 내용물 샘플의 일부가 아니다.
일부 실시양태에서, 조성물, 생성물 조합물, 용도, 및/또는 방법은 마이크로바이옴 이식, 프로바이오틱 치료 또는 등가의 절차에 대한 표준 방식으로 투여되었을 때 인간 대상체의 장에서 콜로니 (예를 들어, 접종 후 적어도 1, 2, 3, 4주 이상 동안 지속되는 콜로니)를 확립하는데 충분한 양의 박테리아를 포함한다. 이같은 양의 박테리아는 본원에서 "접종원"으로서 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물, 생성물 조합물, 용도, 및/또는 방법에서의 박테리아의 양은 적어도 104 콜로니 형성 단위 (cfu), 예를 들어 적어도 104, 105, 106, 107, 108, 109 , 1010, 1011, 1012, 또는 1013 cfu (열거된 값 중 임의의 것 사이의 범위, 예를 들어 104 -　108 cfu, 104 -　109 cfu, 104 -　1010 cfu, 104 -　1011 cfu, 104 -　1012 cfu, 104 -　1012 cfu, 105 -　108 cfu, 105 -　109 cfu, 105 -　1010 cfu, 105 -　1011 cfu, 105 -　1012 cfu, 105 -　1012 cfu, 106 -　108 cfu, 106 -　109 cfu, 106 -　1010 cfu, 106 -　1011 cfu, 106 -　1012 cfu, 106 -　1012 cfu, 107 -　108 cfu, 107 -　109 cfu, 107 -　1010 cfu, 107 -　1011 cfu, 107 -　1012 cfu, 107 -　1012 cfu,-　109 cfu, 108 -　1010 cfu, 108 -　1011 cfu, 108 -　1012 cfu, 또는 108 -　1012 cfu를 포함함)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물, 생성물 조합물, 용도, 및/또는 방법은 대상체에게 투여하기 위한 (37℃에서) 로그 단계에 있는 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물, 생성물 조합물, 용도, 및/또는 방법은 방법은 대상체에게 투여하기 위한 (37℃에서) 정지 단계에 있는 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물, 생성물 조합물, 용도, 및/또는 방법의 박테리아는 단리된 박테리아이다.
피르미쿠테스 박테리아 (예를 들어, 락토바실루스(Lactobacillus), 예컨대 락토바실루스 하야키텐시스(Lactobacillus hayakitensis) 및 락토바실루스 인테스티날리스(Lactobacillus intestinalis))가 레트 증후군 마우스의 분변 샘플에서 유의하게 증가된다는 것이 주목된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 생성물 조합물, 용도, 및/또는 방법 중 임의의 것은 피르미쿠테스 박테리아 (예를 들어, 락토바실루스, 예컨대 락토바실루스 하야키텐시스 및 락토바실루스 인테스티날리스)가 없거나 또는 실질적으로 없다. 본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 없음" 및 이러한 어근 용어의 변형은 본 개시내용의 관점에서 관련 분야의 기술자가 이해하는 바와 같은 이의 관례적이고 통상적인 의미를 갖는다. 이는 조성물 및/또는 생성물 조합물 (본원에 기술된 바와 같은 용도 또는 방법을 위한 것일 수 있다)에 미량 이하의 물질 (예를 들어, 박테리아 예컨대 피르미쿠테스), 및/또는 대상체에 대한 인지할 수 있는 효과 (예를 들어, 행동 효과)가 없는 양의 물질 또는 이의 존재가 있다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 박테리아가 실질적으로 없는 조성물 및/또는 생성물 조합물은 약 106 cfu 이하의 이러한 박테리아, 예를 들어 106 cfu, 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아가 실질적으로 없는 조성물 및/또는 생성물 조합물은 약 106 cfu 이하의 이러한 박테리아, 예를 들어 106 cfu, 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아가 실질적으로 없는 조성물 및/또는 생성물 조합물은 약 104 cfu 이하의 이러한 박테리아를 포함한다. 따라서, 본원에서의 일부 실시양태의 조성물, 방법 및 용도에 따른 피르미쿠테스가 실질적으로 없는 조성물 및/또는 생성물 조합물은 미량의 피르미쿠테스, 및/또는 대상체에 대한 인지할 수 있는 행동 효과가 없는 양의 피르미쿠테스 또는 이의 존재를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 106 cfu, 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하의 피르미쿠테스를 포함할 때 피르미쿠테스가 실질적으로 없다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 생성물 조합물 중 임의의 것은 106 cfu, 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하의 피르미쿠테스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 또는 생성물 조합물 중 임의의 것은 106 cfu, 105 cfu, 104 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하의 락토바실루스 (피르미쿠테스 속), 예컨대 락토바실루스 하야키텐시스 및/또는 락토바실루스 인테스티날리스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 및/또는 생성물 조합물 (본원에 기술된 바와 같은 용도 및/또는 방법을 위한 것을 포함함) 중 임의의 것은 박테리아가 배양된 영양소 또는 배지, 또는 성공적으로 콜로니를 확립할 가능성을 증가시키는 추가적인 영양소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 및/또는 생성물 조합물 (본원에 기술된 바와 같은 용도 및/또는 방법을 위한 것을 포함함) 중 임의의 것은 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. "제약상 허용되는" 담체는 본 개시내용의 관점에서 관련 분야의 기술자가 이해할 바와 같은 이의 통상적이고 관례적인 의미를 갖고, 사용되는 투여량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에게 비독성인 것을 포함한다. 본원에서의 방법 및 용도 및 조성물 및 생성물 조합물에 따른 "제약상 허용되는" 담체의 예는 선택된 적용 양식 예컨대 경구 투여 또는 주사에 적절하고, 통상적인 제약 제제, 예컨대 고체 예컨대 정제, 과립, 분말, 캡슐, 및 액체 예컨대 용액, 에멀션, 현탁액 등의 형태로 투여되는 유기 또는 무기, 고체 또는 액체 부형제를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 종종, 생리학적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액 예컨대 포스페이트 완충제 또는 시트레이트 완충제이다. 생리학적으로 허용되는 담체는 하기 중 하나 이상을 또한 포함할 수 있다: 아스코르브산을 포함하는 항산화제, 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물, 킬레이팅제 예컨대 EDTA, 당 알콜 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 염-형성 카운터이온 예컨대 나트륨, 및 비이온성 계면활성제 예컨대 및 비이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™ 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 플루로닉스(PLURONICS)™ 계면활성제. 보조제, 안정화제, 유화제, 윤활제, 결합제, pH 조정제 제어제, 등장성 작용제 및 기타 통상적인 첨가물 또한 담체에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 경구 투여, 직장 투여, 또는 경구 및 직장 투여용으로 제형된다. 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 프로바이오틱을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 조성물 및/또는 생성물 조합물 중 임의의 것은 항생제, 예를 들어 리파마이신 (예를 들어, 리팍시민), 페니실린, 또는 스트렙토마이신을 포함한다 (항생제의 추가적인 예가 하기에서 기술된다). 일부 실시양태에서, 생성물 조합물의 항생제는 박테리아와 분리된 별개의 조성물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아 및 항생제는 함께 단일 조성물 내에 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 함께 단일 조성물 내에 있고, 항생제는 별개의 조성물 또는 조성물 세트 내에 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 2종 이상의 상이한 조성물 내에 있고, 항생제는 별개의 조성물 또는 조성물 세트 내에 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 리팍시민을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는 항생제를 포함한다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 리팍시민이 장-특이적 항생제 효과가 있는 것으로 제시된 바 있음을 주지한다. 또한, 인간 미생물총을 리팍시민으로 치료하는 것이 비피도박테리아를 포함하는 프로바이오틱 종의 증식을 촉진한다는 것이 보고되었고 (Maccafferii et al., 2010), 이는, 본원에서 제시된 바와 같이, 레트 마우스에서 감소된다 (실시예 8, 도 11c 참조). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 리팍시민이 다른 박테리아의 조성에서의 변화에 의해 비피도박테리아 상에서 이의 보호 효과를 발휘할 수 있는 것으로 생각된다 (실시예 18 참조). 추가적으로, 리팍시민이 레트 마우스에서 또한 감소되는 테네리쿠테스 문의 풍부도를 증가시켰다는 것이 본원에서 제시된다 (실시예 18 및 도 11 및 19). 따라서, 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 숙주에게 투여되었을 때 악티노박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아) 및/또는 테네리쿠테스 박테리아의 양을 증가시키는데 충분한 한편, 다른 박테리아에 대한 항박테리아 효과가 있는 양의 리팍시민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 숙주에게 투여되었을 때 악티노박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아) 및/또는 테네리쿠테스 박테리아의 양을 증가시키는데 충분한 한편, 다른 박테리아에 대한 항박테리아 효과가 있는 양의 항생제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 대상체에서 테네리쿠테스 박테리아의 성장을 강화하는데 충분한 양의 리팍시민을 포함한다. 조성물 또는 생성물 조합물은 이러한 양을 포함하는 단위 용량으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 대상체에서 비피도박테리아 박테리아의 성장을 강화하는데 충분한 양의 리팍시민을 포함한다. 조성물 또는 생성물 조합물은 이러한 양을 포함하는 단위 용량으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 대상체의 장 미생물총을 제거하거나 또는 실질적으로 제거하는데 충분한 양의 항생제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 대상체 내의 장 미생물의 전체적인 양을 적어도 80%, 예를 들어 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%만큼 감소시키는데 충분한 양의 항생제를 포함한다.
항생제
일부 실시양태에서, 임의의 본원에 기술된 바와 같은 조성물 및/또는 생성물 조합물 (레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 용도 및 방법을 위한 조성물 및/또는 생성물 조합물을 포함함)은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 항생제를 포함한다: 아목시실린, 아목시실린/클라불란산 (아목시실린 + 클라불란산), 앰피실린, 벤자틴 벤질페니실린, 벤질페니실린, 세팔렉신, 세파졸린, 세픽심, 세토탁심, 세프트리악손, 클록사실린, 페니실린, 페녹시메틸페니실린 (페니실린 V), 피페라실린/타조박탐, 프로카인 벤질페니실린, 세프타지딤α, 메로페넴α, 아즈트레오남α, 이미페넴/실라스타틴, 아미카신, 아지트로마이신[, 클로람페니콜, 시프로플록사신, 클라리트로마이신, 클린다마이신, 독시사이클린, 에리트로마이신, 젠타마이신, 메트로니다졸, 니트로푸란토인, 스펙티노마이신, 트리메토프림/술파메톡사졸, 트리메토프림, 반코마이신, 클로파지민, 다프손, 리팜피신, 에탐부톨/이소니아지드, 에탐부톨/이소니아지드/피라진아미드/리팜피신, 에탐부톨/이소니아지드/리팜피신, 이소니아지드, 이소니아지드/피라진아미드/리팜피신, 이소니아지드/리팜피신, 피라진아미드, 리파부틴, 리팜피신, 리파펜틴, 아미카신, 베다퀼린, 카프레오마이신, 클로파지민, 시클로세린, 델라마니드, 에티온아미드, 카나마이신, 레보플록사신, 리네졸리드, 목시플록사신, p-아미노살리실산, 리파부틴, 리파펜틴, 리팔라질, 리팍시민, 스트렙토마이신, 또는 이러한 항생제 중 2종 이상의 조합물. 일부 실시양태에서, 임의의 본원에 기술된 바와 같은 조성물 및/또는 생성물 조합물 (레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 용도 및 방법을 위한 조성물 및/또는 생성물 조합물을 포함함)은 리파마이신 클래스의 것인 항생제를 포함한다. 본원에서 기술된 바와 같은 조성물 및/또는 생성물 조합물 (레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 용도 및 방법을 위한 조성물 및/또는 생성물 조합물을 포함함)에 적절한 리파마이신 클래스의 항생제의 예는 리팜피신 (또는 리팜핀), 리파부틴, 리파펜틴, 리팔라질 및 리팍시민을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
박테리아를 투여하는 것을 포함하는, 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 방법
일부 실시양태는 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 방법을 포함한다. 방법은 본원에 기술된 바와 같은 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아 예컨대 비피도박테리움 코에리눔), 테네리쿠테스 박테리아 (예를 들어, 메소플라스마 박테리아 예컨대 메소플라스마 엔토모필룸), 및 박테로이데스 박테리아 (예를 들어, 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론), 또는 이들 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아 예컨대 비피도박테리움 코에리눔) 및 테네리쿠테스 박테리아 (예를 들어, 메소플라스마 박테리아 예컨대 메소플라스마 엔토모필룸)가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아 예컨대 비피도박테리움 코에리눔) 및 박테로이데스 박테리아 (예를 들어, 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론, 또는 이들 중 2종 이상의 조합물, 예를 들어, 비. 프라길리스 및 비. 오바투스; 비. 프라길리스 및 비. 테타이오타오미크론; 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론; 또는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론)가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 비피도박테리아 및 박테로이데스 박테리아 (예를 들어, 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론, 또는 이들 중 2종 이상의 조합물, 예를 들어, 비. 프라길리스 및 비. 오바투스; 비. 프라길리스 및 비. 테타이오타오미크론; 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론; 또는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론)가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기술된 바와 같은, 박테리아 및 항생제 (예를 들어, 임의의 본원에 기술된 바와 같은 항생제, 예를 들어, 리파마이신 예컨대 리팜피신 (또는 리팜핀), 리파부틴, 리파펜틴, 리팔라질 또는 리팍시민)를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 단일 조성물 내에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 생성물 조합물 내에서 투여되고, 생성물 조합물의 성분들은 동시에 또는 상이한 시간에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아는 생성물 조합물 내에서 투여되고, 생성물 조합물의 성분들은 함께 (예를 들어, 혼합물 내에서) 또는 별개로 투여될 수 있다 (별개의 투여는 동시에 또는 상이한 시간에 이루어질 수 있다). 일부 실시양태에서, 방법은 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상, 예를 들어, 손상된 운동 기능, 위장 합병증, 과도한 복부 지방, 혈행 내의 상승된 수준의 지질다당류 (LPS), 작은 뇌, 및/또는 감소된 수준의 뉴로트로핀의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 것이고, 방법은 해마 및/또는 뇌실하대에서 신경발생 및 수상돌기 분지를 강화하고/거나, 성상세포 및 소교세포 활성화를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시킨다. 가능성이 감소되거나, 발병이 지연되거나 또는 호전될 수 있는 헌팅톤병과 연관된 증상의 예는 손상된 운동 기능, 및/또는 CNS 내의 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 응집체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 헌팅톤병 환자에서 중추 신경계 (예를 들어, 해마 및/또는 뇌실하대)에서의 신경발생 및 수상돌기 분지를 강화하고/거나, 성상세포 및 소교세포 활성화를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 조성물 (또는 생성물 조합물)을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내에 있는 것으로서 선택하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 대상체의 샘플의 프로파일이 레트 증후군 또는 헌팅톤병의 존재 또는 위험 상승을 지시할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 조성물 (또는 생성물 조합물)을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내에 있는 것으로 선택하기 위해 (본원에 기술된 바와 같이) 대상체의 샘플의 프로파일을 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조성물 (또는 생성물 조합물)을 제공받아야 하는 레트 증후군에 걸렸거나 또는 이의 위험에 있는 개체들의 하위집합의 구성원으로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물 및/또는 생성물 조성물로의 치료를 받을 수 있는 레트 증후군에 걸린 대상체의 하위집단의 구성원이다. 확인은 대상체의 장 미생물총 조성 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 대상체의 샘플의 프로파일을 결정함으로써 측정될 수 있음)을 기초로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 조성물 (또는 생성물 조합물)을 제공받아야 하는 헌팅톤병에 걸렸거나 또는 이의 위험에 있는 개체들의 하위집합의 구성원으로서 확인된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물 및/또는 생성물 조성물로의 치료를 받을 수 있는 헌팅톤병에 걸린 대상체의 하위집단의 구성원이다. 확인은 대상체의 장 미생물총 조성 (예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 대상체의 샘플의 프로파일을 결정함으로써 측정될 수 있음)을 기초로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 박테로이데스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물이 대상체에게 투여된다. 박테로이데스 박테리아는 본원에 기술된 바와 같이 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론, 또는 이들 중 2종 이상의 조합물을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 본원에 기술된 바와 같은 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아, 예컨대 비피도박테리움 코에리눔)를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 악티노박테리아 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물이 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아, 예를 들어, 비피도박테리움 코에리눔을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 박테로이데스 박테리아 (예를 들어, 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론, 또는 이들 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 비. 프라길리스 및 비. 오바투스; 비. 프라길리스 및 비. 테타이오타오미크론; 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론; 또는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론)를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아 예컨대 비피도박테리움 코에리눔) 및 박테로이데스 박테리아 (예를 들어, 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및/또는 비. 테타이오타오미크론, 또는 이들 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 비. 프라길리스 및 비. 오바투스; 비. 프라길리스 및 비. 테타이오타오미크론; 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론; 또는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론)를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물이 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 비피도박테리아 및 박테로이데스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아) 및 박테로이데스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물이 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아는 대상체에게 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아는 대상체에게 별개로 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아는 대상체에게 동시에 또는 별개로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 박테로이데스 박테리아는 본원에 기술된 바와 같이 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론, 또는 이들 중 2종 이상의 조합물 (예를 들어, 비. 프라길리스 및 비. 오바투스; 비. 프라길리스 및 비. 테타이오타오미크론; 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론; 또는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 악티노박테리아 박테리아 (예를 들어, 비피도박테리아) 및 테네리쿠테스 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물이 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 테네리쿠테스 박테리아는 대상체에게 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 테네리쿠테스 박테리아는 대상체에게 상이한 시간에 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 테네리쿠테스 박테리아는 대상체에게 동시에 또는 상이한 시간에 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다.
방법의 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 또는 생성물 조합물은 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 비피도박테리움 코에리눔으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 박테리아를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어진다. 표 1에서 언급된 바와 같이, 이러한 열거된 박테리아 각각은 야생형 (대조군) 마우스에 비교하여 레트 증후군 마우스에서 과소발현된다. 일부 실시양태에서, 박테리아가 OTU의 참조 16S rRNA 서열에 적어도 97%, 예를 들어 적어도 97%, 98%, 또는 99% 동일한 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑된다.
방법의 일부 실시양태에서, 106 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 105 cfu, 105 cfu, 103 cfu, 102 cfu, 또는 10 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 조성물 또는 생성물 조합물은 피르미쿠테스 박테리아가 실질적으로 없거나 또는 없다. 실시예 8에서 언급된 바와 같이, 피르미쿠테스는 레트 증후군 마우스의 장에서 유의하게 증가되고, 따라서, 이론에 의해 제한되지 않으면서, 피르미쿠테스가 없거나 또는 실질적으로 없는 조성물이 장 미생물총을 레트 프로파일에서 멀어지게 하는 것을 도울 수 있을 것으로 생각된다.
다수의 투여 경로가 본원에 기술된 방법에 따른 조성물 및/또는 생성물 조합물에 구상된다. 방법의 일부 실시양태에서, 조성물 및/또는 생성물 조합물은 경구 투여, 직장 투여, 경피 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여 및/또는 흡입을 통해 대상체에게 투여된다.
항생제를 투여하는 것을 포함하는, 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 방법
항생제를 투여하는 것이 레트 증후군 (실시예 14-15 참조) 및 헌팅톤병 (실시예 1-2 참조)의 유전 모델의 증상을 호전시킬 수 있다는 것이 본원에서 보고된다. 특히, 치료된 동물이 와이어-메시 실린더를 등반하려는 시도를 더 많이 하고, 강화된 근육 강도를 나타내며, 움켜쥐기 표현형이 감소되는 바와 같이, 레트 마우스를 이유 후에 6주 동안 리팍시민으로 치료함으로써 장 미생물 종을 감소시키거나 제거하는 것이 레트 모델에서 운동 증상을 개선시키는 것으로 제시되어 있다 (실시예 16, 도 16b-d). 또한, 레트 마우스를 리팍시민으로 치료하는 것이 비히클-치료 코호트에 비교했을 때 바이오마커 예컨대 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 및 글루타민 신쎄타제 (GS)에 대한 염색을 감소시켰다 (실시예 15 및 도 15a). 또한, 이유 후의 레트 마우스를 리팍시민으로 6주 동안 치료하는 것이 선택적으로 결장을 신장시키고 장 비만을 방지한다 (실시예 14, 및 도 14 b-c). 헌팅톤병의 드로소필라 유전 모델을 항생제 (리팍시민을 포함함)으로 치료하는 것은 또한 유충 및 성체 파리의 CNS 내의 돌연변이체 헌팅틴 (mHDx1) 단백질의 응집을 저하시켰고, 헌팅톤병의 운동 증상을 개선시켰다 (실시예 3, 도 1). 유사한 운동 증상 개선이 페니실린-스트렙토마이신 항생제을 제공한 헌팅톤병 드로소필라에서 관찰되었다 (실시예 3, 도 2d). 반면에, 이. 콜라이를 드로소필라 모델에 투여하는 것은 HD의 운동 증상을 가속화하였다 (실시예 3, 도 2a). 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
따라서, 일부 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 항생제 (예를 들어, 임의의 본원에 기술된 바와 같은 항생제, 예를 들어, 리파마이신 예컨대 리팜피신 (또는 리팜핀), 리파부틴, 리파펜틴, 리팔라질 또는 리팍시민)를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항생제는 리팍시민을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 항생제는 본원에 기술된 바와 같은 항생제, 또는 2종 이상의 본원에 기술된 바와 같은 항생제의 조합물, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 방법은 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상, 예를 들어, 손상된 운동 기능, 위장 합병증, 과도한 복부 지방, 혈행 내의 상승된 수준의 지질다당류 (LPS), 작은 뇌, 및/또는 감소된 수준의 뉴로트로핀의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 것이고, 방법은 해마 및/또는 뇌실하대에서 신경발생 및 수상돌기 분지를 강화하고/거나, 성상세포 및 소교세포 활성화를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 방법은 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시킨다. 감소될 수 있는 헌팅톤병과 연관된 증상의 예는 손상된 운동 기능, 및/또는 CNS 내의 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 응집체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 조성물 또는 생성물 조합물을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내에 있는 것으로서 선택하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 방법은 본원에 기술된 바와 같이 대상체의 샘플의 프로파일을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 프로파일은 대상체가 레트 증후군 및 헌팅톤병에 걸렸거나 또는 이의 위험에 있는지 여부, 및 항생제를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 본질적으로 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물이 대상체에게 이로울 것인지 여부를 지시할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 이유 후의 아동이다.
일부 실시양태에서, 항생제를 투여하는 것은 대상체 내의 장 박테리아의 양을 적어도 80%, 예를 들어 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항생제를 투여하는 것은 장에 박테리아가 실질적으로 없게 한다. 일부 실시양태에서, 항생제를 투여하는 것은 대상체의 장 내의 비피도박테리아 및/또는 테네리쿠테스를 보호하거나 증가시키지만, 대상체 내의 전체적인 장 미생물을 적어도 80%, 예를 들어 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 85%, 86%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%만큼 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아, 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 본질적으로 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 조성물 또는 생성물 조합물은 본원에서 기술된 바와 같을 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 비피도박테리움 코에리눔 중 임의의 것에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 1종 이상의 박테리아를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 박테리아가 OTU의 참조 16S rRNA 서열에 적어도 97% 동일한 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 악티노박테리아 박테리아가 대상체에게 투여되며, 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여되며, 박테로이데스 박테리아는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론, 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 및 항생제는 함께 투여된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 및 항생제는 별개로 투여된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 및 항생제는 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 및 항생제는 동시에, 그리고 동일한 조성물 내에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 단리된 박테리아 및 항생제는 동시에, 그러나 별개의 조성물 내에서 투여된다. 일부 실시양태에서, 박테리아 및 항생제는 상이한 시간에 투여된다. 일부 실시양태에서, 항생제가 박테리아 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 박테리아가 항생제 전에 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물 또는 생성물 조합물은 피르미쿠테스 박테리아가 실질적으로 없다. 일부 실시양태에서, 106, 105, 104, 103, 102, 또는 10 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아가 대상체에게 투여된다.
대상체의 샘플의 프로파일을 결정하는 방법
일부 실시양태에서, 대상체의 샘플의 프로파일을 결정하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은
(a) 테네리쿠테스, 악티노박테리아, 및 피르미쿠테스, 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 장 박테리아의 존재 및/또는 수준;
(b) 콜린, 5-HT, 티로신, 도파민, 및 에피네프린, 또는 열거된 신경전달물질 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경전달물질의 혈청 수준, 또는
(c) Chrna2, Chrna7, Chrb4, Chrm1, Slc5a7, Chat, Ache, 및 Slc18a3, 또는 열거된 유전자 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 콜린성 유전자의 발현 수준
중 적어도 하나를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 프로파일은 (a); (b); (c); (a) 및 (b); (a) 및 (c); (b) 및 (c); 또는 (a) 및 (b) 및 (c)의 검출된 존재 및/또는 수준을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
(a)와 관련하여, 레트 증후군에 걸린 대상체의 결장 내용물에서, 대조군 (비-레트) 대상체에서의 수준에 비해, 테네리쿠테스 및 악티노박테리아의 수준이 감소되고, 피르미쿠테스가 증가된다는 것이 관찰된다 (실시예 8 참조). 또한, 비피도박테리아 (악티노박테리아 속)가 레트 증상이 전형적으로 나타나기 전의 나이인 6주령에서 시작하여 레트 마우스의 GI 관에 부재하였다 (도 11c 참조). 따라서, 일부 실시양태에서, 프로파일을 결정하는 방법은 (a)를 결정하는 것을 포함하고, 샘플은 대상체의 장 및/또는 분변 물질을 포함하고, 비-레트 (대조군) 샘플에 비해 더 높은 수준의 피르미쿠테스 또는 더 낮은 수준의 테네리쿠테스 및/또는 악티노박테리아를 포함하는 프로파일이 레트 증후군의 위험 상승을 지시한다. 이는 대상체가 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물 및/또는 생성물 조성물로의 치료를 받을 수 있는 레트 증후군에 걸린 대상체의 하위집단의 구성원이라는 것을 추가로 지시할 수 있다. 비-레트 대조군 샘플은 비-레트 개체의 장 및/또는 분변 물질을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-레트 대조군 샘플의 박테리아 문, 속 및/또는 종의 수준은 저장값, 예를 들어, 전자적으로 저장된 값으로서 제공된다.
방법의 일부 실시양태에서, 악티노박테리아는 비피도박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로파일을 결정하는 방법은 (a)를 결정하는 것을 포함하고, 대상체의 샘플은 대상체의 장 및/또는 분변 물질을 포함한다. 대상체의 샘플로부터의 비피도박테리아의 부재 또는 실질적인 부재 (예를 들어, 비-레트 대조군 샘플에서의 비피도박테리아의 양의 5% 미만)은 레트 증후군의 존재 또는 위험 상승을 지시한다. 이는 대상체가 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물 및/또는 생성물 조성물로의 치료를 받을 수 있는 레트 증후군에 걸린 대상체의 하위집단의 구성원이라는 것을 추가로 지시할 수 있다.
일부 실시양태에서, 테네리쿠테스, 악티노박테리아 및/또는 피르미쿠테스의 수준, 및/또는 비피도박테리아의 존재 또는 부재가 핵산 테스팅, 예를 들어 정성적 PCR, 반-정량적 또는 정량적 PCR, 핵산 시퀀싱, 마이크로어레이 분석 등에 의해 결정된다. 예를 들어, 비-레트 대조군 샘플에서 비피도박테리아를 검출함으로써 대상체의 장 및/또는 분변 샘플 내의 비피도박테리아의 부재 또는 실질적인 부재가 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 비-레트 대조군 샘플의 박테리아 문, 속 및/또는 종의 수준을 검출하는 것을 포함한다.
(b)와 관련하여, 특정 신경전달물질의 혈청 수준이 야생형 (비-레트) 대조군에 비교하여 레트 마우스에서 변경된다는 것이 관찰된다 (실시예 20 및 도 20a 참조). 특히, 콜린, 티로신, 도파민 및 에피네프린의 혈청 수준이 레트 마우스의 혈청에서 감소되는 것으로 관찰되었고, 세로토닌의 혈청 수준이 레트 마우스의 혈청에서 증가되는 것으로 관찰되었다 (도 20a). 일부 실시양태에서, 프로파일을 결정하는 방법은 (b)를 결정하는 것을 포함하고, 대상체의 샘플은 대상체의 혈청을 포함한다. 비-레트 (대조군) 샘플에 비교하여, 대상체 샘플 내의 더 높은 혈청 수준의 콜린, 티로신, 도파민 및/또는 에피네프린, 및/또는 더 낮은 혈청 수준의 세로토닌은 레트 증후군의 존재 또는 위험 상승을 지시할 수 있다. 이는 대상체가 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물 및/또는 생성물 조성물로의 치료를 받을 수 있는 레트 증후군에 걸린 대상체의 하위집단의 구성원이라는 것을 추가로 지시할 수 있다. 비-레트 대조군 샘플은 비-레트 개체의 혈청을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 본원에서의 일부 실시양태의 방법 및 용도에서, 콜린, 티로신, 도파민 및/또는 에피네프린의 혈청 수준은 다수의 적절한 기술, 예를 들어 면역검정법 예컨대 ELISA, 측면 유동, 및/또는 비-세정 검정법; 질량 분광법 예컨대 기체 크로마토그래피 질량 분광법 (GC-MS), 질량 분광법-질량 분광법 (MS/MS), 또는 MALDI (매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화); 또는 핵 자기 공명 (NMR)을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-레트 대조군 샘플에서 콜린, 티로신, 도파민 및/또는 에피네프린의 혈청 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, 비-레트 대조군 샘플의 콜린, 티로신, 도파민 및/또는 에피네프린의 혈청 수준은 저장값, 예를 들어, 전자적으로 저장된 값으로서 제공된다.
(c)와 관련하여, 특정 콜린성 유전자의 발현 수준이 야생형 (비-레트) 대조군에 비교하여 레트 마우스에서 변경된다는 것이 관찰된다 (실시예 20 및 도 20b 참조). 특히, Chrna2, Chrna7, Chrb4, Chrm1, Slc5a7, Chat, Ache, 및 Slc18a3의 발현 수준이 야생형 대조군에 비교하여 레트 마우스에서 감소된다 (실시예 20 및 도 20b). 일부 실시양태에서, 프로파일을 결정하는 방법은 (c)를 결정하는 것을 포함하고, 대상체의 샘플은 장 조직 예컨대 생검 또는 도말을 포함하며, 콜린성 유전자 발현의 수준이 측정된다. 비-레트 대조군에 비교된 바와 같은, 대상체 샘플 내의 더 낮은 수준의 Chrna2, Chrna7, Chrb4, Chrm1, Slc5a7, Chat, Ache, Slc18a3, 또는 임의의 열거된 유전자 중 2종 이상의 조합물은 레트 증후군의 위험 상승을 지시할 수 있다. 이는 대상체가 본원에 기술된 바와 같은 박테리아 및/또는 항생제를 포함하는 조성물 및/또는 생성물 조성물로의 치료를 받을 수 있는 레트 증후군에 걸린 대상체의 하위집단의 구성원이라는 것을 추가로 지시할 수 있다. 비-레트 대조군 샘플은 비-레트 개체의 장 조직을 포함할 수 있다. 다수의 기술, 예를 들어 핵산 검정법 예컨대 정량적 역전사효소 PCR, 마이크로어레이 분석 등을 사용하여 콜린성 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-레트 대조군 샘플에서 콜린성 유전자의 발현 수준이 측정된다. 일부 실시양태에서, 비-레트 대조군 샘플의 콜린성 유전자의 발현 수준은 저장값, 예를 들어, 전자적으로 저장된 값으로서 제공된다.
일부 실시양태에서, 프로파일이 결정되고, 프로파일이 레트 증후군의 위험 상승을 지시하면, 대상체에게 치료가 권장된다. 치료는 대상체에게 본원에 기술된 바와 같은 박테리아, 항생제, 또는 박테리아 및 항생제를 포함하는 조성물 및/또는 생성물 조합물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
추가 실시양태
인간 장 미생물총은 약 100조개의 박테리아 세포를 함유하고, 이는 생애 첫 2-3년 동안 성숙되고, 건강 및 면역 발달에 결정적이다 (Round et al., 2009, Goyal et al., 2015). 장 미생물총의 항상성에서의 변화 (디스바이오시스(dysbiosis))가 암, 비만, 영양실조, 비정상적인 장 및 면역계 발달, 염증성 장 질환 (IBD), 당뇨병, 신경발달성 및 신경정신병 장애, 다발경화증 (MS), 파킨슨병 (PD), 및 알츠하이머병 (AD)에서 연루된다 (Scheperjans, et al., 2015, Blanton et al., 2016, Marchesi et al., 2016, Minter et al., 2016, Sherwin et al., 2016). 장 미생물총을 CNS 기능에 연결하는 신호전달 경로는 잘 정의되어 있지 않다. 장 박테리아에 의해 생산된 분자가 미주 신경을 통해 CNS와 통신하는 장 신경계 (ENS)의 생물학에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 미생물 대사산물은 또한 혈행을 통해 뇌에 도달할 수 있거나 또는 면역계와의 통신을 통해 CNS에 영향을 미칠 수 있다 (Goyal et al., 2015, Sherwin et al., 2016). 무균 (GF) 마우스가 장 미생물이 뇌 발달에 미치는 영향을 연구하는데 도움이 되었다. 행동 연구는 GF 동물이 과다활동적이고, 불안 감소를 나타낸다는 것을 실연한다. GF 마우스는 시냅스형성에 필수적인 신경전달물질 및 단백질 예컨대 BDNF의 발현이 변화되면서 뇌 화학이 변경되었고, 해마 신경발생이 강화되었다 (Ogbonnaya et al. 2015, Luczynski et al. 2016). 최근의 발견은 GF PD 마우스가 통상적으로 사육된 한배새끼에 비교하여 뇌 병리 및 운동 증상이 감소되었음을 시사한다. GF 마우스는 더 적은 불용성 α-시누클레인, 더 적은 활성화된 소교세포, 및 더 낮은 수준의 염증성 바이오마커를 축적한다. PD 환자의 미생물총이 PD 마우스에서 운동 증상의 진행을 가속화된다는 것이 관찰되었고, 이는 잠재적으로 병원성인 박테리아의 존재를 시사한다 (Sampson and Mazmanian et al., 2016). AD 마우스를 항생제 칵테일로 치료하는 것은 베타-아밀로이드 형성 및 신경염증을 감소시킨다 (Minter et al., 2016). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 미생물총이 신경변성 장애에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다.
장 디스바이오시스를 정상화하는 것은 뇌 발달에 양성으로 영향을 미치고 비정상적인 행동을 호전시키는 치료 전략을 제공한다. 인간 장의 공생 박테리아인 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)의 콜로니화는 자폐증의 환경적 마우스 모델에서 CNS-관련 증상을 개선한다 (Hsiao et al., 2013). 유사하게, 별개의 비피도박테리아의 경구 투여는 신경정신병 장애의 동물 모델에서 보호적이다 (Savignac et al., 2015). 항생제로 치료된 PD 마우스는 소교세포 활성화 및 CNS 병리가 감소되었다 (Sampson et al., 2016). 항생제는 또한 레보도파의 치료 효과를 강화하고, HD 환자의 임상 증상을 개선시킨다 (Hashim et al., 2014). 비-흡수성 항생제로 간성 뇌병증 (HE) 환자의 장 미생물총을 변화시키는 것은 인지 결함, 기분 장애 및 운동 증상을 포함하는 비정상적인 행동을 호전시킨다 (Bajaj et al., 2013). HE는 장 디스바이오시스가 간을 중독시켜 뇌 병리에 이르는 장-간-뇌 축 질환의 모델이다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 이러한 연구들은 뇌 기능에 대한 건강한 장 미생물총의 중요성을 강조하고, 장 미생물총을 변경시키는 것이 뇌 장애를 치료하기 위한 안전하고 비침습적인 전략일 수 있다는 개념을 지지한다. CNS 병리에 더하여, HD 환자는 체중 감소/근육 위축, 대사 및 면역 이상, 및 GI 합병증을 앓는다 (Carrol et al., 2015). 미생물총과 유사 증상의 출현 사이의 연관이 PD를 포함하는 다른 뇌 장애 모델에서 확립되었다 (Scheperjans, et al., 2015, Blanton et al., 2016, Dinan et al., 2016). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 미생물총이 HD 병리를 조절할 수 있는 것으로 생각된다.
HD 연구 분야는 치료 표적을 찾기 위해 종종 "CNScentric" 접근법에 의해 접근된다. 그러나, HD를 포함하는 대부분의 신경변성 장애는 증상성이며, 이는 다양한 기관 및 경로에서의 결함을 수반할 수 있다 (Carrol et al., 2015, Titova et al. 2016). 미생물총-뇌 상호작용의 발견은 장 환경이 신경변성에 영향을 미치는지 여부에 대한 흥미로운 질문을 질문을 제기하였다. 유전적 원인이 공지되어 있는 HD는 장 플로라가 단백질 응집 및 CNS-관련 증상의 진행에 미치는 영향을 세밀히 분석하기 위한 훌륭한 모델이다. 본원에서 보고된 드로소필라 HD 모델로부터의 결과 (실시예 3 참조)는 돌연변이체 HTT 응집체가 장관 부근의 뉴런에서 먼저 나타난다는 것을 실연한다. 또한, 임상적으로 유용한 항생제인 리팍시민으로 장 미생물총을 제거하는 것이 돌연변이체 HTT 엑손-1 (mHDx1)의 올리고머화를 저하시킨다. 반대로, 기능성 박테리아 아밀로이드를 생산하는 이. 콜라이 균주를 HD 파리에 콜로니화시키는 것은 N-말단 586 단편의 올리머화를 가속화하고, 운동 증상을 악화시킨다. 마우스 모델에서 미생물총이 돌연변이체 HTT 응집 및 HD 발병기전에 미치는 영향이 또한 구상된다. 한 접근법은 무균 콜로니를 발달시켜 장 미생물총이 돌연변이체 HTT의 올리고머화 및 HD 증상의 진행에 영향을 미치는지 여부를 검사하는 것이다. 운동 및 인지 손상을 나타내는 레트 증후군 마우스 모델에서, 리팍시민이 해마 신경발생 및 수상돌기 분지를 촉진하고, 운동 증상의 중증도를 감소시킨다는 것이 본원에서 관찰된다 (실시예 6, 도 3 및 5 참조).
추가적으로, BDNF 수준, 시냅스형성, 및 신경발생에서의 변화가 레트 증상의 진행에 기여한다 (Ramocki et al., 2008, Lombardi et al., 2015).
장 디스바이오시스를 정상화하는 것은 본원에서의 일부 실시양태에 따라 뇌 발달에 양성으로 영향을 미치고 비정상적인 행동을 호전시키는 치료 전략을 제공한다. 인간 장의 공생 박테리아인 박테로이데스 프라길리스의 콜로니화는 자폐증의 환경적 마우스 모델에서 CNS-관련 증상을 개선한다 (Hsiao et al., 2013). 유사하게, 별개의 비피도박테리아의 경구 투여는 신경정신병 장애의 동물 모델에서 보호적이다 (Savignac et al., 2015). 비-흡수성 항생제로 간성 뇌병증 (HE) 환자의 장 미생물총을 변화시키는 것은 인지 결함, 기분 장애 및 운동 증상을 포함하는 비정상적인 행동을 호전시킨다 (Bajaj et al., 2013). HE는 장 디스바이오시스가 간을 중독시켜 뇌 병리에 이르는 장-간-뇌 축 질환의 모델이다. 이러한 연구들은 최적의 뇌 기능에 대한 건강한 장 미생물총의 중요성을 강조하고, 디스바이오시스를 수정하는 것이 다양한 뇌 장애를 치료하기 위한 안전하고 비침습적인 전략일 수 있다는 개념을 지지한다.
레트 증후군은 미생물총이 뇌 발달에 미치는 영향을 연구하기 위한 유전 모델을 제공하는데, 이는 병리 예컨대 작은 뇌, 손상된 신경발생 및 시냅스 형성, 감소된 수준의 뉴로트로핀, 및 운동 증상이 잘 규정된 파라미터이기 때문이다. 레트 마우스 모델은 환자가 나타내는 대부분의 증상이 발달되고, 따라서 임의의 치료 전략을 인간으로 전환시키는 것을 용이하게 한다. 마지막으로, 레트 증후군은 파킨슨병 증상, 불안 장애, 발작, 및 지능 장애가 있는 자폐 스펙트럼 장애로서 기술될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 지식 및 치료 전략은 신경학적 질환에 대한 추가적인 데이터, 예를 들어 본원에 기술된 데이터와 추가로 일관된다.
MeCP2는 여러 기관에서 발현되는 다기능성 단백질이다. DNA 결합 전사 인자로서, MeCP2는 신경발달 및 면역 세포 기능에 연루되는 수백개의 유전자의 발현에 영향을 미친다 (Cronk et al., 2015, Lombardi et al., 2015). 그러나, MeCP2는 게놈의 조절 도메인 내의 메틸화 및 히드록시-메틸화 DNA를 인식하는 전반적인 후성 조절인자로서 가장 잘 알려져 있다 (Mellen et al., 2012). MeCP2 활성 및 DNA 결합은 번역후 변형 예컨대 인산화에 의해 조절된다 (Ebert et al., 2013). MeCP2의 이러한 성질은 수많은 뉴런 회로의 기능화, 성장 인자 생산, 및 신호-유도 시냅스형성에 결정적이다 (Lombardi et al., 2015). CNS에서 MeCP2가 광범위하게 연구되었다. MeCP2는 간에서의 지질 및 콜레스테롤의 항상성을 유지시킨다. 이러한 관찰과 일관되게, 콜레스테롤 저하 화합물 예컨대 스타틴이 레트 마우스에서 증상의 중증도를 감소시키는 것으로 보고되었다 (Buchovecky et al., 2013, Kyle et al., 2016). 일부 레트 환자는 비정상적인 지질 및 콜레스테롤 프로파일을 나타낸다. 따라서, (예를 들어, 본원에서의 일부 실시양태에 따라 장 미생물총을 변경시킴으로써) 대사 경로를 조작하는 것이 일부 레트 환자에게 유리할 수 있는 것으로 본원에서 생각된다. MeCP2가, 레트에서의 다른 잠재적인 동반이환 인자와 같이, 면역 발달 및 염증성 시토카인의 생산을 조절할 수 있다는 것이 또한 보고되었다 (Li et al., 2014, Jiang et al., 2014, Cronk et al., 2015, O'Driscoll et al., 2015). 염증은 마우스 모델에서 자폐 증상의 발달에 기여하고, 공생 프로바이오틱인 박테로이데스 프라길리스로의 치료는 염증성 시토카인의 생산을 감소시키고 비정상적인 행동을 호전시킨다 (Hsiao et al., 2013, Mayer et al., 214).
MeCP2 활성이 염색질을 변형시키는 세린/트레오닌 키나제 IKKα (IκB 키나제 α)에 의해 조절되고, 이는 또한 염증 경로 및 면역 발달을 조정하는 멀티-서브유닛 IKK 복합체의 성분이라는 것이 보고되었다 (Chariot, 2009). IKKα는 MeCP2를 인산화시키고, 이와 CREB (cAMP 반응 요소-결합 단백질) 전사 인자의 상호작용을 촉진하며, 이어서 ~ 300개의 뉴런 유전자 예컨대 BDNF 및 시냅스-연관 단백질 PSD-95의 발현에 영향을 미친다 (Khoshnan et al., 2012). 신경면역 경로를 연구하기 위해, WT 면역계가 있는 레트 마우스 모델이 Cre-lox 기술을 사용하여 조작되었다. 그러나, 레트 마우스의 면역계에서의 MeCP2의 발현이 증상 진행에 영향을 미치지 않았다는 것이 본원에서 보고된다 (미공개 데이터). 여러 다른 실험실이 골수 이식 또는 선천성 면역 세포에서 MeCP2를 선택적으로 재활성화시키는 것이 레트 증상을 호전시키지 않는다는 것을 실연하는 유사한 결론에 도달하였다 (Wang et al., 2015). IKKβ가 선택적으로 녹다운 (KD)된 레트 마우스 모델이 또한 조작되었고, 이는 면역계 및 다른 기관에서 대다수의 염증성 시토카인의 NF-κB-의존적 생산을 유도하는 탁월한 염증유발성 키나제이다 (Chariot, 2009). 그러나, IKKβ의 KD가 레트 증상을 악화하였고 근육 소모를 촉진하였음이 본원에서 보고된다 (문헌 [Khoshnan et al.], 미공개 데이터). 그러나, 최근의 연구는 IKKβ의 하류인 NF-κB 활성이 레트 마우스의 CNS에서 상승되고, NF-κB 의 유전적 감소가 뇌 병리, 비정상적인 행동을 호전시키며, 수명을 연장한다는 것을 가리킨다 (Kishi et al., 2016).
대다수의 레트 환자는 GI 합병증 예컨대 변비, 복통, 팽만감, 및 배변 곤란을 앓는다 (Motil et al., 2012). 또한, 최근의 연구는 레트 환자가 장 미생물총이 변경되었음을 시사한다 (Strati et al., 2016). MeCP2가 장 발달에서 수반되는 전구세포를 포함하는 장 상피에서 발현된다는 것이 본원에서 보고된다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 레트 환자의 장 상피에서의 MeCP2 결핍이 장 생리상태 및 미생물 항상성을 변경시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 가설을 지지하여, 레트 마우스가 "누출성 장"으로 알려진 장벽 투과성의 GI 병리, 및 항균 펩티드의 생산에 결정적인 장 세포의 개수 감소를 나타내는 것이 관찰된다. 또한 레트 마우스는 특정한 건강-촉진 박테리아 종의 결여로 예시되는 디스바이오시스를 나타낸다. GI 염증 및 대사 변화 예컨대 과도한 복부 지방 및 혈행 내의 상승된 수준의 박테리아 지질다당류 (LPS)는 레트 마우스에서의 다른 주목할만한 병리이다. 특히, GI 및 대사 결함이 무균 레트 마우스에서 부재하거나 또는 통상적으로 사육된 코호트의 장 미생물총을 변화시키는 것에 의해 감소된다. 소장에서의 해로운 박테리아의 과다성장을 감소시키는 비-흡수성 항생제 리팍시민으로의 치료는 레트 마우스에서 이로운 생화학적 및 행동적 변화를 유도한다. 흥미롭게, 리팍시민은 해마 및 뇌실하대에서 신경발생 및 수상돌기 분지를 강화하고, 성상세포 및 소교세포 활성화를 감소시키며, 운동 기능을 개선한다 (실시예 6, 도 3 및 5 참조).
MeCP2가 장 상피에서 발현된다는 발견은 이것이 장 생리상태에 중요할 수 있다는 것을 시시한다. 레트 마우스에서의 디스바이오시스, GI 병리, 및 대사 변화가 이러한 개념과 일관된다. 장-단독 MeCP2 마우스 모델을 조작하는 것은 레트 증후군과 관련된 미생물총-장-뇌 네트워크에서의 장 MeCP2의 역할을 조사하는 것을 용이하게 할 것이다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 레트 마우스의 장 상피에서의 MeCP2의 재활성화가 장-미생물총 통신을 유의하게 복원시킬 수 있고, 따라서 디스바이오틱 종의 증식을 감소시키고, 건강-촉진 생물의 콜로니화를 강화시키는 것으로 생각된다. 장 항상성을 매개하는 가능한 후보는 MeCP2에 의해 조절될 수 있는, 항균 펩티드 및 성장 인자의 생산을 포함한다. 대안적으로, MeCP2는 면역 및 상피 세포의 염증 반응을 둔화시킬 수 있고, 따라서 병리를 감소시킬 수 있다. 건강한 장 환경은 CNS에 축적되어 신경염증을 야기할 수 있는 미생물 생성물 및 대사산물 예컨대 LPS가 혈행 내에 누출되는 것에 의해 야기되는 것을 포함하는 대사 및 전신 변화를 또한 호전시킬 수 있다. 장 생리상태를 수정하는 것 또한 동물의 전체적인 웰빙을 강화할 수 있고, 잠재적으로 일부 CNS 병리를 감소시킬 수 있다. 이러한 연구들의 양성적인 결과는 레트 환자의 장 환경을 수정하고 증상의 중증도를 저하시키는데 필수적인 지식일 것이다. 음성적인 결과는 레트에서의 CNS-매개 GI 병리, 대사 변화, 및 디스바이오시스를 지지할 것이다.
이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 상피에서의 MeCP2 발현 및 활성의 조절이 장-미생물총 항상성을 유지하는데 결정적인 것으로 생각된다. 장에서의 MeCP2 결핍은 디스바이오시스 및 GI 병리에 이르고, 이는 장-면역 및 장-뇌 통신을 파괴할 수 있고, 뇌 화학을 변경시킬 수 있으며, 레트-관련 증상의 진행을 악화시킬 수 있다.
이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 미생물총이 레트 마우스에서 GI 병리, 대사 및 면역 이상, 및 비정상적인 행동에 기여하는 것으로 생각된다. 본원에 기술된 확립된 GF 레트 마우스 콜로니가 이러한 표현형에서 미생물총의 역할을 해명하는데 유용할 수 있다. GF 마우스는 MeCP2의 표적인 CNS 유전자 예컨대 BDNF의 발현 변경을 나타낸다 (Bercik et al., 2011, Chahrour et al., 2008). 또한, 미생물총의 성분이 MeCP2 활성에 영향을 미칠 수 있다 (Bie et al., 2013). 따라서, 이론에 의해 제한되지 않으면서, 본원에 기술된 실험이 GF와 통상적으로 사육된 동물 사이에 상이한 MeCP2-의존적 유전자 및 경로를 추가로 확인할 수 있는 것으로 생각된다. GF 마우스에 관한 기존 지식을 기초로, 그러나 이론에 의해 제한되지 않으면서, 레트 마우스의 운동 및 정동 행동이 통상적인 모델과 GF 모델 사이에서 상이할 것으로 생각된다 (Luczynski et al. 2016). 독특한 행동을 수정하기 위한 관련된 프로바이오틱 박테리아를 테스트하는데 GF 레트 마우스가 사용될 수 있다. 비. 프라길리스의 신경보호 및 장-면역 조정 성질이 레트 마우스에서 일부 병리를 수정할 수 있는 것으로 추가로 생각된다. 그러나, 장기적으로, 본 발명자들은 레트 마우스 내의 장 미생물총의 더 양호한 그림을 얻으면 다른 공생 박테리아를 테스트할 수 있다. 일부 GI 병리, 대사 변화 및 잠재적으로 CNS 증상을 수정하는 것에 대한 리팍시민의 영향이 고무적이다. 덜 엄격한 규제로 환자에서 테스트될 수 있기 때문에 기존의 전략을 테스트하는 것이 유리하였다. 리팍시민은 인간에서 미생물총-매개 GI 및 CNS 병리를 치료하는 것에 대한 안전성 및 효능에 대한 기록이 입증되어 있다. 마우스 모델에서 이의 성질을 테스트하는 본원에 기술된 실험은 레트 환자에 대한 이의 적용가능성을 강하게 지지한다.
본원에 기술된 일부 실험은 장-해마 상호작용에 대한 상당한 지식을 제공할 수 있고, 미생물총-MeCP2 상호작용이 영향을 미치는 연관된 경로 및 뉴런 유전자를 확인할 수 있다. 최근의 연구는 장 미생물총을 항생제 칵테일로 제거하는 것이 WT 마우스에서 해마 신경발생 및 인지 작업을 손상시킨다는 것을 지지하여, 장-해마 네트워크를 추가로 지지한다 (Moehl et al., 2016). 그러나, 이러한 실험에서의 일부 항생제는 독성이고, 혈행에 진입한다. 리팍시민은 장-특이적이고, 콜로니화 생물의 비를 변화시키는 미생물총의 변형제로서 행동하기 때문에 다르다 (Maccafferii et al., 2010, Ponziani et al., 2016). 도 19의 데이터 또한 이러한 개념과 일관된다. HE 환자에서의 인지 및 작업 기억에 대한 리팍시민의 입증된 이로운 효과 (Ahluwalia et al., 2014)가 레트에서의 이러한 화합물의 추후 평가를 위한 신뢰 및 낙관을 부가한다. 레트 증후군에 지능 장애가 존재하는 것을 고려하여, 이러한 실험의 양성적인 결과는 근래에 이러한 쇠약화 증상을 다루는 전략을 산출할 수 있다. 리팍시민-치료 레트 마우스의 미생물총을 프로빙하는 것은 해마 신경발생을 조절할 수 있고 인지에 영향을 미칠 수 있는 공생 박테리아를 또한 확인할 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 성공적인 경우, 손상된 신경발생이 자폐증, 유약-X 증후군, 알츠하이머병 및 외상성 뇌 손상을 포함하는 여러 뇌 장애에 존재하기 때문에 이같은 전략은 레트 증후군을 넘어서는 치료적 의미가 있을 수 있다.
실시예
실시예 1: HD의 드로소필라 모델에서의 리팍시민의 효과
이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 미생물총이 장 신경 줄기 (ENS) 내의 돌연변이체 HTT의 응집에 기여하는 것으로 생각된다. HD의 드로소필라 모델 (Barbaro et al., 2015)에서, 신경계에서 돌연변이체 HTT 엑손-1 단편 (mHDx1)의 발현을 유도하는 것이 장 근처에서 유충의 ENS에서의 응집을 촉진하였다 (도 1a 및 1b). 따라서 유충 ENS에서의 응집체의 초기 출현이 관찰된다.
성체 HD 파리의 박테리아 함량이 대조군에 비교하여 극적으로 증가된다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 이는 뉴런 돌연변이체 HTT가 장 미생물총의 조성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 장-특이적 항생제인 리팍시민의 존재 하에 생성된 유충이 mHDx1의 응집을 저하시킨다는 것이 관찰된다 (도 1a 및 1b). 리팍시민은 또한 성체 파리의 CNS에서의 mHDx1의 응집을 감소시킨다 (도 1c 및 1d). 따라서, 본원에서의 일부 실시양태에 따른 항생제로의 치료가 돌연변이체 헌팅틴 단백질의 응집체를 감소시킨다는 것이 본원에서 관찰된다.
실시예 2: HD의 드로소필라 모델에서의 박테리아 성분의 효과
박테리아 성분이 돌연변이체 HTT의 올리고머화에 영향을 미치는지 여부를 연구하였다. 돌연변이체 HTT의 최초의 586개의 N-말단 아미노산 (586 HD (120Q))을 발현하는 HD 파리 (돌연변이체 인간 헌팅틴 단백질을 발현함)는 어떠한 운동 증상도 나타내지 않는다 (Barbaro et al., 2015). 586 HD 장에 기능성 박테리아 아밀로이드 컬리를 생산하는 이. 콜라이 균주가 콜로니화되는 것 (도 3a 우측 패널)은 N-586 돌연변이체 HTT의 응집을 가속화한다 (도 3b-c). 또한, 컬리+ 박테리아는 586 파리의 운동 증상을 악화시키는데, 이들이 실린더형 바이알을 등반하는 능력을 상실하기 때문이다 (도 3d). 따라서, 박테리아에 의해 발현된 장 내의 컬리가 HD에서 운동 증상의 발달을 가속화할 수 있다.
반면에, 이. 콜라이 (야생형 및 컬리-발현 MC4100 둘 다)를 HD 파리에 공급하는 것은 운동계의 발달을 가속화한다. 특히, 이. 콜라이 (5 × 107 CFU/ml)를 야생형 ("WT") 파리 및 돌연변이된 인간 헌팅틴을 발현하는 돌연변이체 ("Mut") 파리의 제1일의 파리 먹이에 첨가하였다. 제1일, 제5일, 제10일, 및 제15일에 등반 행동을 평가하였다. 이. 콜라이가 HD 파리의 비정상적인 운동 행동을 악화시켜, 제10일 및 제15일에 이들이 이. 콜라이를 제공하지 않은 HD 파리보다 더욱 중증의 운동 증상을 나타냈다 (도 2a 참조). 컬리-발현 이. 콜라이 및 컬리가 결여된 이. 콜라이 돌연변이체는 유사한 효과를 가졌다. 따라서, 장 내의 이. 콜라이 (컬리-발현 또는 컬리-비발현)가 HD에서 운동 증상을 악화시킬 수 있다.
락토바실루스 람노수스를 HD 파리에 공급하는 것은 운동 증상에 영향을 미치지 않았다. 5×107 CFU/ml의 엘. 람노수스(L. rhamnosus)를 야생형 ("WT") 파리 및 돌연변이된 인간 헌팅틴을 발현하는 돌연변이체 ("Mut") 파리의 우화 후 제1일의 파리 먹이에 첨가하였다. 제1일, 제5일 및 제10일에 등반 검정법을 수행하였다. 엘. 람노수스는 등반 검정법에 의해 측정된 바와 같이 운동 증상에 대한 인지할 수 있는 효과가 없었다 (도 2b 참조).
전체적으로, 이러한 발견들은 본원에서의 일부 실시양태에 따른 장 환경의 조정이 생체 내 HD 모델의 운동 증상을 조정할 수 있다는 것을 실연한다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 박테리아가 신경계 내의 돌연변이체 HTT의 응집에 영향을 미칠 수 있고, 잠재적으로 하류 병리에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다.
추가로 HD 파리 (돌연변이된 인간 헌팅틴을 발현함)는 항균 펩티드 (AMP)인 드로소신(Drosocin) 및 드로소마이신(Drosomycin)을 코딩하는 mRNA를 상승된 수준으로 나타냈다 (도 2c 참조). TR-qPCR에 의해 mRNA를 정량화하고, 박테리아가 없는 WT 파리에 대해 조정하였다. 파리에 이. 콜라이를 공급하지 않거나, 컬리를 발현하는 MC4100 이. 콜라이 또는 컬리가 결실된 돌연변이체 동계 이. 콜라이를 공급하였다. 이. 콜라이를 야생형 ("WT") 파리에 공급하는 것은 항균 펩티드인 드로소신 및 드로소마이신의 발현을 유도하였다. 그러나, 이. 콜라이를 제공하지 않은 돌연변이된 인간 헌팅틴 ("Mut")을 발현하는 HD 파리에서 드로소신 및 드로소마이신이 상승되었고, 이. 콜라이 첨가가 드로소신 및 드로소마이신 mRNA 수준에 대한 인지할 수 있는 효과가 없었다. 또한, 컬리를 발현하였는지 여부와 관계 없이, 이. 콜라이의 효과가 유사하였다 (도 2c 참조).
페니실린-스트렙토마이신을 공급함으로써 장 미생물을 제거하는 것이 HD 파리에서 운동 증상을 호전시켰다. 페니실린-스트렙토마이신을 우화 후 제1일에 파리 먹이에 첨가하였다. 제15일에 등반 검정법을 수행하였다. 페니실린-스트렙토마이신을 제공한 HD 파리가 페니실린-스트렙토마이신을 제공하지 않은 HD 파리에 비교하여 유의하게 더 우수한 등반 능력을 나타냈다 (도 2d 참조). 따라서, 본원에서의 일부 실시양태에 따른 (예를 들어, 장 미생물을 감소시키거나 제거하기 위한) 항생제로의 치료가 HD에서 운동 증상 결함을 호전시킬 수 있는 것으로 결론지어진다.
실시예 3: HD의 마우스 모델에서의 미생물의 효과
HD 마우스 모델.
돌연변이체 HTT 엑손-1 (mHDx1) 단편을 발현하는 R6/2 HD 마우스 혈통은 대중적인 모델이고, 운동 및 인지 손상을 포함하는 HD의 강건한 증상을 나타낸다. 증상은 생후 ~ 6-8주에 출현한다 (Mangiarini et al., 1996). 또한, HD 환자와 유사하게, R 6/2 마우스는 체중이 감소되고, 면역 세포 이상을 제시한다. R6/2 마우스 또한 GI 결함 예컨대 손상된 장 운동성, 설사, 및 영양소 흡수장애를 나타낸다는 것이 관련된다 (van der Burg, et al., 2011). 대다수의 이러한 표현형은 다른 질환 모델에서 장 미생물총의 항상성의 파괴와 연관된다. 따라서, R6/2가 HD에서의 장 미생물총의 영향을 탐구하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 장 마이크로바이옴 (전체 박테리아 게놈)의 RNA 시퀀싱이 R6/2 마우스에서 수행되고, HD 마우스에서의 장 미생물총에 대한 효과가 관찰된다.
무균 (GF) 마우스는 질환 모델에서 장-뇌 상호작용을 세밀히 분석하기 위한 도구이다. R6/2 모델의 GF 콜로니가 생성된다. 호기성 및 혐기성 조건 하에서의 배양 및 PCR에 의해 미생물의 존재에 대해 마우스를 일상적으로 테스트한다.
콜로니가 확립되면, 도 1 및 2에서 사용된 것과 유사한 다양한 항-응집체/올리고머-특이적 항체를 사용하여, 생후 제0일 (P0)에 시작하여 6주 (P42)까지의 위장 (GI) 관 절편의 장기적 면역조직화학 연구를 수행한다. 나이가 같은 동물의 뇌 절편을 또한 염색하고, 응집체가 출현할 때의 시기이므로, ENS 및/또는 CNS 내의 mHDx1의 응집을 검출한다. 이러한 모델에서의 GI 관에 대한 HD의 효과가 관찰될 것으로 예상된다.
연구는 장 미생물총이 PD 마우스 모델에서 운동 행동에 영향을 미칠 수 있음을 추가로 시사한다 (Sampson & Mazmanian et al., 2016). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 미생물총이 HD 파리에서 운동 증상에 또한 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각된다 (도 2d 참조). 따라서, 통상적 및 GF HD 마우스의 운동 성능이 WT 한배새끼에 비교하여 관찰된다. 로타로드, 빔 건너기, 및 움켜쥐기를 기존에 HD 마우스에 대해 기술된 바와 같이 수행한다 (Southwell et al., 2009). 이러한 테스트들의 설명이 실시예 19에서 제공된다.
해마 신경발생은 포유동물에서 학습 및 기억에 연루되고, 장 미생물총에 의해 영향을 받을 수 있다 (Christian et al., 2014, Ogbonnaya, et al. 2015). 통상적인 레트 증후군 마우스에서의 손상된 해마 신경발생이 GF 코호트에서 호전된다는 것이 본원에서 관찰되고, 이는 장 미생물총과 인지 사이의 연관을 시사한다 (예를 들어, 실시예 6, 17 참조). 해마 신경발생이 R6/2 HD 마우스에서 또한 손상된다 (Fedele et al., 2011). BrdU 표지화를 사용하여, 통상적 및 GF WT 및 HD 마우스 내의 새롭게 생성된 뉴런을 검사하고, 생존 시간 및 뇌 회로 내로의 통합을 관찰한다. 뇌 절편을 증식 마커 (ki67) 및 더블코르틴에 대한 항체로 염색하고, 이는 새롭게 생성된 뉴런을 염색한다. 행동 예컨대 신규 물체 인식 및 반즈 미로(Barnes Maze)를 테스트하고, GF HD의 학습 및 기억에 대한 효과를 통상적인 코호트에 비교한다. 이러한 연구들은 HD 마우스 내의 장 미생물총이 손상된 해마 신경발생 및 인지 작업에 기여하는지 여부를 해명한다.
기술된 바와 같은 표준 절차에 의해 로타로드, 빔 건너기, 움켜지기, 오픈 필드, 신규 물체, 및 반즈 미로가 수행된다 (Dawood et al., 2004, Southwell et al., 2009, Hsiao et al., 2013).
실시예 4: 수초화에 대한 미생물총의 효과
이론에 의해 제한되지 않으면서, 미생물총이 수초화에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다. 수초화는 CNS 기능에 결정적이고, HD 환자에서의 증상 발병 전에 초기에 발생할 수 있다 (Bartzokis et al., 2007). 돌연변이체 HTT 올리고머가 말이집 내로 축적되고, 이는 핍지교세포 내로 가로질러, 미엘린 생산 및 말이집 기능을 손상시킬 수 있다는 것이 본원에서 관찰된다 (도 4). 따라서, 미생물총이 수초화에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다.
GF 마우스는 미엘린이 더 두껍고, 미엘린-관련 유전자의 발현이 상승된다 (Gacias et al., 2016, Hoban et al., 2016). 미생물총이 HD 마우스에서 이러한 이벤트에 또한 영향을 미칠 수 있다. 따라서, GF 및 통상적 HD 마우스에서의 수초화를 전자 현미경에서 비교한다. 미엘린 발현 수준을 웨스턴 블롯 및 QRT-qPCR에 의해 정량화하고, HTT 응집체가 대조군 HD 마우스에서보다 GF HD 마우스에서 감소될 것으로 예상된다.
돌연변이체 HTT의 올리고머화는 다양한 모델에서 신경독성 및 HD 병리의 결정인자이고, HD 연구에서 탁월한 바이오마커로서의 역할을 한다 (Bates et al., 2015). HD 파리에서의 발견 (도 1 및 2)을 기초로, ENS 내의 돌연변이체 HTT 응집체의 수준을 확증적 연구에서 GF HD 마우스에서 측정하고, HTT 응집체가 대조군 HD 마우스에서보다 GF HD 마우스에서 감소될 것으로 예상된다.
이론에 의해 제한되지 않으면서, 응집은 형성된 형상을 기초로 보호성 또는 신경독성일 수 있다 (Arrasate et al., 2012). 미생물-매개 돌연변이체 HTT 응집이 HD 파리에서의 운동 증상의 발달과 부합할 수 있는 것으로 관찰된다 (도 2b-d). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 본원에서의 일부 실시양태에 따라 GF HD 마우스에서 응집이 감소 또는 지연되면, 운동 결함의 중증도 또한 영향을 받을 수 있는 것으로 생각된다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 미생물총과 해마 신경발생과 인지 작업 사이의 연계가 구상된다. 이러한 연계는 GF 레트 마우스가 해마 신경발생이 강화된다는 본원에서 보고된 발견을 기초로 한다 (실시예 6, 17 참조). 또한, 미생물총이 영향을 미친 CNS 유전자의 약 15%가 수초화가 관련된다 (Hoban et al., 2016).
실시예 5: 레트 증상의 진행에 대한 리팍시민의 효과
장 미생물총의 항상성을 조절하는 화합물 및/또는 프리바이오틱/프로바이오틱으로의 치료는 본원에서의 일부 실시양태에 따라 CNS 증상 예컨대 레트 증후군에서의 것을 변경시키는 유용한 전략을 제공할 수 있다. 리팍시민은 혈행에서 불량하게 흡수되는 장-특이적 항생제이다. 임상 연구에서, 리팍시민은 박테리아 부하를 감소시키고, 누출성 장을 수정하며, 간성 뇌병증 (HE) 환자에서 불안, 과민성, 우울, 운동 증상, 및 인지 손상을 포함하는 여러 비정상적인 행동의 중증도를 감소시킨다 (Bajaj et al., 2013, Kok et al., 2013). HE는 손상된 미생물총-간-뇌 축의 모델이다 (Bajaj, 2013). 파일럿 연구에서, 리팍시민은 파킨슨병 환자에서 운동 기능을 또한 개선시켰다. 이의 효과를 상세하게 테스트하기 위한 임상 시험이 진행 중이다 (clinicaltrials.gov의 월드와이드웹에서 입수가능함, 문헌 [Fasano et al., 2013]).
중증 GI 및 대사 이상, 운동 증상, 및 인지 손상을 나타내는 레트 증후군 마우스 모델에서 리팍시민을 테스트하였다. 실시예 19에 기술된 바와 같이 리팍시민을 레트 마우스에 투여하였다. 리팍시민이 레트 마우스의 GI 및 대사 증상을 제거하였다 (예를 들어, 실시예 14 참조). 또한, 리팍시민-치료 레트 마우스가 우리 환경에서 더욱 활성이고, 더 많은 둥지를 만든다 (도 5a). 둥지 만들기는 설치류의 웰빙, 일상 활동, 긍정적인 동기부여 상태, 및 건강한 뇌 기능의 지표이다 (Jirkof, 2014). 리팍시민-치료 레트 마우스는 또한 등반 및 와이어-메시 매달리기 검정법에서 더 양호하게 수행하고, 움켜쥐기 표현형이 유의하게 감소된다 (도 5 b-d).
근육 강도의 지표인 이러한 검정법들은 본원에서의 일부 실시양태에 따라 리팍시민을 사용하여 레트 증후군 장 환경을 변화시키는 것이 레트 증후군에서의 운동 행동에 영향을 미칠 수 있고, 운동 기능, 뿐만 아니라 웰빙, 일상 활동, 긍정적인 동기부여 상태, 및 건강한 뇌 기능을 개선시킬 수 있다는 것을 실연한다.
실시예 6: HD에서의 해마 신경발생 및 인지 작업에 대한 리팍시민의 효과
리팍시민이 드로소필라 신경계에서 mHDx1의 응집을 감소시킨다는 것이 본원에서 관찰되었다 (실시예 1, 도 1a-d). 따라서, 리팍시민이 HD 마우스의 병리 및 행동에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다. 추가적으로, 레트 마우스 (본원에서 테스트된 바와 같음; 예를 들어, 실시예 5, 17 참조)는 R6/2 HD 마우스와 유사한 운동 증상이 발달된다. 따라서, 리팍시민의 효과를 HD 마우스의 운동 표현형 상에서 테스트할 수 있는 것으로 생각된다.
따라서, 리팍시민을 실시예 19에 기술된 방법을 사용하여 R6/2 HD 마우스에 투여한다. 이유 후에 ~4주 동안 HD 자손을 리팍시민으로 치료한다. 비히클 및 리팍시민 치료 동물의 장 및 뇌 절편을 응집체-특이적 항체에 의해 검사하고, 정량화한다. 레트 증후군 마우스를 사용하는 리팍시민 전달을 위한 조건이 하기에서 기술된다.
로타로드, 빔 건너기, 및 오픈 필드에서의 이동을 실시예 19에 기술된 방법을 사용하여 비히클- 및 HD-치료 R6/2 HD 마우스 상에서 테스트한다. HD 마우스의 운동 표현형에 대한 리팍시민의 효과를 관찰한다.
리팍시민-치료 및 비히클-치료 R6/2 HD 마우스의 둥지 만들기 행동에 대한 리팍시민의 효과를 실시예 19에 기술된 프로토콜을 사용하여 관찰한다. HD 마우스의 인지 표현형에 대한 리팍시민의 효과를 관찰한다.
추가적으로, HD 환자는 인지 작업을 앓고, 치매가 발달된다 (Paulsen, 2011). R6/2 HD 마우스는 감소된 신경발생 및 손상된 학습 및 기억을 나타낸다 (Fedele, et al., 2011). 리팍시민이 레트 증후군 마우스에서 해마 신경발생 및 수상돌기 분지를 촉진한다는 것이 본원에서 보고된다 (실시예 17 및 도 3 및 5 참조). 이러한 연구들은 장 환경이 해마 생화학에 영향을 미칠 수 있고, 잠재적으로는 인지에 영향을 줄 수 있다는 개념을 지지한다. 따라서, R6/2 마우스에서의 해마 신경발생에 대한 리팍시민의 효과를 연구한다. 증식 및 발달 중인 뉴런의 마커 (ki67, 더블코르틴)에 대한 항체로의 면역조직화학 및 BrdU 표지화를 사용하여, 새롭게 생성된 뉴런의 개수를 정량화하고, 생존 결정을 포함하여, 이들의 운명을 경시적으로 추적한다. HD 마우스에서의 해마 신경발생에 대한 리팍시민의 효과를 관찰한다.
학습 및 기억에 대한 리팍시민의 효과
행동 예컨대 신규 물체 인식 및 반즈 미로를, 비히클-치료 대조군과 함께, 리팍시민으로 치료된 R6/2 HD 마우스 상에서 수행하여, HD 마우스의 인지 작업에 대한 리팍시민의 효과를 관찰한다
리팍시민이 영향을 미치는 미생물 군집의 확인.
리팍시민은 건강한 장 환경의 지표인 비피도박테리아 및 락토바실루스를 포함하는 프로바이오틱 종의 증식을 촉진한다 (Maccafferii et al., 2010, Ponziani et al., 2016). 문 수준에서, 리팍시민이 레트 마우스에서 감소되는 테네리쿠테스의 성장을 강화한다는 것이 본원에서 보고된다 (도 7).
따라서, 비히클 및 리팍시민-치료 WT 및 R6/2 HD 마우스의 장 미생물총에서 16S RNA 시퀀싱을 수행한다. 리팍시민에 의해 유도된 미생물 변화를 관찰한다.
이러한 목적의 연구는 리팍시민에 의해 장 환경을 변화시키는 것이 HD 증상의 진행에 영향을 미치는지 여부에 대한 지식을 제공한다. 리팍시민은 HD 파리에서 돌연변이체 HTT의 응집을 감소시킨다 (도 1). 따라서, 이론에 의해 제한되지 않으면서, 리팍시민이 HD 마우스의 ENS에서 유사한 효과가 가질 수 있는 것으로 본원에서 생각된다. 본원에 기술된 레트 증후군 마우스 모델의 데이터의 관점에서, 리팍시민이 HD 마우스의 운동 증상을 감소시킬 수 있는 것으로 또한 생각된다. 인지 및 작업 기억에 대한 리팍시민의 입증된 이로운 효과가 HE 환자에서 보고되었다 (Ahluwalia et al., 2014). 미생물 성장을 억제하는 것에 더하여, 리팍시민은 또한 해독 신호전달 경로 예컨대 장 상피의 통합성을 유지시키고 장 내의 염증성 상태를 감소시키는 프레그난 X 수용체 (PXR)의 발현을 유도하고 이를 활성화시킨다 (Mencarelli et al., 2010). 리팍시민은 다양한 미생물-매개 장애에 대해 임상 사용 중이고, 부작용이 최소이다.
따라서, 리팍시민을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 용도, 방법, 조성물, 및 생성물 조합물이 HD의 인지 증상을 치료하는데 유용할 수 있는 것으로 생각된다.
실시예 7: 장 생물학 및 장 미생물총 항상성에서의 MeCP2의 역할
이러한 실시예에서 기술된 연구는 트레오닌 158을 알라닌으로 변화시키는 점 돌연변이 (T158A)를 보유하는 MeCP2 (T158A) 레트 마우스 모델에서 수행되었다. T158A 돌연변이는 MeCP2가 DNA에 결합하는 것을 방지하고, 이의 전환을 증가시킨다. 이러한 계통은 유니버시티 오브 펜실베이니아(University of Pennsylvania)의 자올란 (조) 주(Zhaolan (Joe) Zhou) 박사의 실험실에 의해 생산되었고, 레트 커뮤니티용으로 잭슨스 래버러토리(Jackson's laboratory)에 기탁되었다. T158A 레트 마우스의 표현형은 발달 퇴행, 운동 기능장애, 상동증, 호흡 불규칙, 및 학습 및 기억 결핍을 포함한다 (Goffin et al., 2011). 증상의 중증도는 MeCP2-무효 마우스가 나타내는 것에 필적한다. 수컷 마우스는 생후 ~ 2개월에 증상이 발달되고, 점차적으로 사망한다. 반면에, 암컷은 ~ 8-9개월령일 때 증상을 나타내게 된다. 흥미롭게도, 암컷 레트 마우스는 ~ 4개월령에 체중이 증가하기 시작하고, 점진적으로 비만이게 된다. 이러한 대사 변화의 원인은 여전히 미지이다. 그러나, 장 디스바이오시스가 역할을 할 수 있고, 후속 섹션에서 추가로 지지된다. 다양한 검정법을 수행하기 위한 상세사항이 물질 및 방법 섹션에서 제공된다.
레트 마우스의 장 상피에서의 MeCP2 발현이 GI 생리상태를 변경시키는지 여부를 결정한다.
가장 큰 기관 중의 하나로서, 성인의 GI 관은 길이가 ~ 22 피트이고, 면적이 250 m2이다. 장의 표면은 장 상피에 의해 보호되고, 이는 영양소를 흡수하는 것, 성장 인자 및 항균 펩티드를 생산하는 것, 해로운 박테리아의 콜로니화를 방지하는 것, 및 장 내용물이 혈행 내로 누출되는 것을 방지하는 장벽을 형성하는 것과 같은 다수의 기능을 수행한다. 면역조직화학에 의해 장 상피에서 MeCP2를 검출하기 위한 조건이 확립되었다 (도 8a-b). 특히, MeCP2는 장 상피의 재생을 위한 전구체인 움세포에서 발현된다 (도 8a, 우측 하부 패널의 화살표). MeCP2는 장근 신경총 (장 신경계), 및 고유판에 침투하는 면역 세포에 풍부하다 (도 8b, 상부 패널의 화살표). MeCP2 염색의 강도가 소장의 융모 (장 상피의 손가락같은 융기) 사이에서 가변적이라는 것이 관찰되고, 이는 이의 수준이 조절될 수 있다는 것을 시사한다 (도 8a, 상부 및 하부 좌측 패널). 박테리아 LPS가 CNS에서의 MeCP2의 발현 및 활성을 유도하고, 인지에 연루되는 시냅스-연관 단백질의 생산을 변경시킨다 (Bie et al., 2013).
이론에 의해 제한되지 않으면서, 이러한 발견 및 소장의 상이한 영역들에서의 가변적인 수준의 MeCP2는 MeCP2가 미생물 신호전달의 표적일 수 있다는 개념을 지지한다. 또한, 이러한 연구들은 레트 증후군의 맥락에서의 장 생리상태에서의 MeCP2의 역할을 지시한다.
실시예 8: 레트 마우스의 GI 관에서의 해부학적 변화
레트 마우스의 GI 관을 총체적인 해부학적 변화에 대해 검사하였다. 레트 마우스의 소장 및 결장이 WT 한배새끼의 것보다 더 짧다는 것이 관찰된다 (도 9a-c). 이러한 변화는 체중 또는 크기와 무관하였다. 흥미롭게도, 이유 시에 장 길이가 유의하게 상이하지 않고, 이는 레트 마우스에서 노화 및/또는 환경 요인이 비정상적인 장 발달에 기여할 수 있다는 것을 시사한다 (도 9d-e). 조직학적으로, 레트 마우스는 움 (파네트 세포를 함유할 수 있고, 예컨대 장 상피에서 발견될 수 있는 세포 구조) 내의 파네트 세포의 개수가 국소적으로 감소된 것을 나타내고, 이는 항균 펩티드 리소자임을 인식하는 항체로 염색함으로써 확인된다 (도 9f). 파네트 세포는 장 상피의 지속적인 재생에서 수반되고, 숙주-미생물총 항상성을 위한 가장 강력한 항균 펩티드 중 일부를 생산한다 (Clevers, et al., 2013a). 소장의 회장 부분으로부터 단리된 mRNA의 검사는 항균제 예컨대 디펜신 및 리소자임의 발현이 레트 마우스에서 유의하게 감소된다는 것을 시사한다 (데이터는 제시되지 않음).
이론에 의해 제한되지 않으면서, 파네트 세포의 국소적인 감소가 장-미생물총 항상성의 파괴가 해로운 박테리아의 과다성장을 허용하는 출발점일 수 있고, 이들이 정상적인 적소를 벗어나 GI 관 내의 다른 부위로 확산될 수 있는 것으로 가설된다. MeCP2의 부재에 의해 유도된 이러한 "방해된 이웃" 병소는 또한 면역 세포를 동원할 수 있고, 과도한 염증 매개물질의 방출에 의해 GI 병리를 추가로 악화시킬 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, MeCP2가 장-미생물총 항상성을 정상화시키고 관찰된 표현형 중 일부를 호전시키는지 여부를 결정하기 위해 레트 마우스의 장 상피에서 MeCP2를 발현하는 것이 구상된다.
MeCP2플록스-스톱(Flox-STOP) 마우스는 MeCP2를 발현하지 않지만, 플록스드(floxed) 정지 코돈을 함유하고, 이는 Cre 리컴비나제를 보유하는 계통과의 교배 시 제거될 수 있어 MeCP2 발현을 재활성화시킨다. 이러한 계통은 유니버시티 오브 에든버러(University of Edinburgh)의 아드리안 버드(Adrian Bird) 박사의 그룹에 의해 조작되었고, 레트 커뮤니티용으로 잭슨스 래버러토리에 기탁되었다 (Guy et al., 2007). 본 발명자들은 기존에 이러한 계통을 사용하였고, vav-Cre 계통과 교배함으로써 성공적으로 면역계에서 MeCP2를 재활성화시켰다 (Khoshnan et al., 미공개 데이터). MeCP2플록스-스톱 이형접합 암컷을 WT 빌린-Cre 수컷 마우스와 교배시켜 장 상피에서 선택적으로 MeCP2를 재활성화시킬 수 있다. 빌린-Cre 마우스는 Cre 리컴비나제를 장 줄기 세포 구획 및 상피의 올바른 재생에서 수반되는 다른 세포에서, 그리고 또한 소장 및 대장의 유사분열 후의 상피 내층에서 발현한다 (Clevers, et al., 2013b). 새롭게 생성된 계통을 MeCP2vil-Cre+로 지칭한다. 도 8에서와 유사한 절차를 사용하여 면역조직화학에 의해 MeCP2 발현을 확증할 수 있다. 계통이 확립되었으면, 장 길이 및 병리, 파네트 세포 개수, 및 장 재생에서의 변화에 대해 자손을 검사한다. BrdU 표지화를 수행하고, 장 상피 세포 (IEC)의 발달 및 성숙을 모니터링한다. 움세포, 증폭 중인 전구체 및 IEC에서의 BrdU 혼입을 각각의 자손을 세포-특이적 바이오마커로 염색함으로써 결정한다. 표준 통계 소프트웨어에 의해 데이터를 평가한다 (Hsiao et al., 2013). 파네트 세포 개수에 대한 MeCP2의 효과를 관찰한다. 추가적으로, 이러한 플록스드 마우스의 장 mRNA를 RT-qPCR에 의해 공지된 항균 펩티드의 수준에 대해 (Clevers, et al., 2013a). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 이러한 연구들은 장 상피의 발달 및 항균 펩티드의 생산을 조절하는 MeCP2에 대한 신규 기능을 확인할 수 있다. 4주령 마우스의 장에서의 BrdU 표지화를 검사하기 위한 조건은 도 10에서 제시된 바와 같다.
장-미생물총 항상성에서의 MeCP2의 역할을 조사한다
장 박테리아의 메타게놈 시퀀싱은 레트 마우스가 WT 코호트에 비교했을 때 미생물총이 변경된다는 것을 가리킨다. 주요 박테리아 문인 피르미쿠테스의 비율이 ~10%만큼 증가된다. 레트 마우스는 또한 테네리쿠테스 및 악티노박테리아가 유의하게 더 적다 (도 11a 및 11b, 표시됨). 비피도박테리아는 악티노박테리아 문 내의 속이며, 이는 장 미생물총의 항상성에서 현저하게 수반된다. 비피도박테리아는 레트-연관 증상의 출현에 선행하는 ~ 6주령에 시작하여 레트 마우스의 GI 관에서 제거된다 (도 11c, 문헌 [Goffin et al., 2011]). 4개월령 암컷 레트 마우스의 미생물총이 최근에 시퀀싱되었고, 디스바이오시스가 확인되었다. 수컷 및 암컷의 마이크로바이옴에 차이가 있지만, 이들은 비피도박테리아 수준이 감소되는 공통적인 표현형을 공유한다. 이러한 발견이 반-정량적 PCR에 의해 확증되었다 (도 11d). 장 내의 비피도박테리아의 풍부도가 나이가 들면 감소되고, 이러한 상실이 IBD, 비만, 알레르기 환자 및 일부 자폐증 환자에서 더욱 현저하다는 것이 관련된다 (Riviere et al., 2016). 비피도박테리아는 또한 유아의 장에 콜로니화하는 최초이자 가장 현저한 종 중 하나이고, 이의 존재는 면역 발달을 위한 대사물질을 생산하고 병원성 박테리아의 성장을 제한하는 건강한 환경의 홀마크이다 (Arboleya et al., 2016). 또한, 최근의 보고서는 레트 환자에서의 장 디스바이오시스를 제시한다 (Strati et al., 2016). 본원에서 보고된 결과는 MeCP2가 포유동물에서 장 미생물총의 항상성에서 현저하게 수반된다는 개념을 지지한다.
상기의 관점에서, 장 마이크로바이옴 (총괄적 박테리아 DNA)를 WT, 모체 MeCP2-무효 마우스, 및 MeCP2 vil-Cre+에서 16S RNA 시퀀싱에 의해 프로파일링하여, 장 MeCP2의 재활성화가 디스바이오시스를 정상화하는지 여부를 결정한다. 수컷 및 암컷 둘 다로부터 박테리아 DNA를 시퀀싱한다. 본원에서 제시된 데이터가 암컷 레트 마우스에서의 디스바이오시스는 ~ 4개월령에 발생하는 반면, 수컷에서는 생후 ~ 6주에 명백하다는 것을 시사하기 때문에, 유사한 시점이 새로운 계통의 장 박테리아를 프로파일링하는데 사용된다. 시퀀싱, 컴파일링 및 데이터의 컴퓨터 분석을 수행한다. 비피도박테리아의 콜로니화는 또한 미생물총에서의 변화를 장기적으로 모니터링하기 위한 유용한 검정법이다. 특히, 비피도박테리아는 장 내의 다른 종, 특히 면역계 및 뇌 기능에 영향을 미치는 소형 분자를 생산하는 것의 증식을 지지한다 (Arboleya et al., 2016). 따라서, 이러한 실험들은 비피도박테리아에서의 변화를 확인하는 것을 포함한다.
실시예 10: 누출성 장 및 대사 결함에서의 MeCP2의 역할
장 상피의 온전성이 전반적인 건강 및 올바른 장-미생물총 상호작용에서 수반된다. 일부 면적이 투명하고 기포로 채워지면서 레트 마우스의 GI 관은 염증이 있는 것으로 보인다 (도 12a). WT에 비교하여, 레트 마우스는 또한 혈청 내의 LPS의 수준이 상승되어 "누출성 장" 표현형에 대한 지지를 부여한다 (도 12b). LPS는 쉽게 CNS에 진입하는데, 이는 신경염증을 야기할 수 있고, 해마 신경발생을 포함하는 다수의 생물학적 프로세스를 파괴할 수 있다 (Trotta et al., 2014). 또한, 레트 마우스는 상승된 수준의 복부 지방 조직이 축적된다 (도 5c-d). MeCP2는 기존에 지질 대사에 연루되었고, 여기에서 지방산의 생합성에서 수반되는 효소의 발현을 조절한다 (Kyle et al., 2016). 무균 (GF) 레트 마우스는 유의한 복부 지방이 없고, 장 길이가 정상인 것으로 보인다는 것이 주목할 만하다. 이러한 발견들은 장 MeCP2와 미생물총 사이의 상호작용이 장 생리상태 및 연관된 대사 경로에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다 (도 12 e-f).
MeCP2가 장 투과성을 조절하는지 여부를 결정하기 위해, WT, 레트 (MeCP2 플록스-스톱), 및 장에서만 MeCP2를 발현하는 것 (MeCP2 vil-Cre)의 혈청 내의 LPS의 수준을 정량화하고, 비교한다. 혈행 내로의 형광 FITC-표지 덱스트란 술페이트의 흐름을 측정함으로써 누출성 장을 또한 조사한다. 이러한 프로토콜들은 문헌 [Hsiao et al., 2013]에 기술된 바와 같다. 또한, 마우스를 복부 지방의 축적에 대해 검사하여, 장 내의 지질 대사에서의 장 MeCP2의 역할을 결정한다. GF 레트 마우스 또한 누출성 장에 대해 검사한다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 이러한 실험들은 장 생리상태에서의 MeCP2의 역할 및 어떻게 레트에서의 이의 부재가 GI 및 대사 이상을 촉진할 수 있는지를 확립한다.
실시예 11: 면역 기능장애에 대한 레트 마우스의 검사
장 미생물총의 항상성이 면역계의 올바른 발달에서 현저하게 수반된다. 레트 마우스는 손상된 면역 예컨대 소교세포 및 대식세포의 개수 및 기능에서의 결함을 나타내고, 상승된 수준의 시토카인/케모카인을 생산한다 (Cronk et al., 2015). 지브라피쉬의 장 상피에서의 메틸화-매개 후성적 억제가 시토카인-유도 IBD를 촉진한다는 것이 관련된다 (Marjoram et al., 2015). 본 발명자들은 장 상피 내의 MeCP2의 부재가 장-면역 상호작용을 손상시키는 것으로 추측한다. 본원에서의 관찰은 레트 마우스의 융모 내의 대식세포가 응축되고 "아폽토시스성"인 것으로 보이기 때문에 기능장애일 수 있다는 것을 시사한다 (도 13). 그러나, 이러한 표현형은 산발적이고, 이는 국소적인 "디스바이오틱 병소"가 또한 장 면역 세포의 활성을 국부적으로 변경시킬 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 발견들과 일관되게, 장 대식세포의 개수가 증상성 MeCP2-무효 마우스에서 감소된다 (Cronk et al., 2015).
MeCP2의 재활성화가 면역 세포의 "아폽토시스성" 표현형을 수정할 수 있는지 여부를 추가로 결정하기 위해 이러한 결과들이 반복되고 정량화된다. 또한, 본 발명자들은 대식세포/단핵구 세포를 WT, 레트 (MeCP2플록스-스톱) 및 MeCP2를 장에서 선택적으로 발현하는 것 (MeCP2vil-Cre+)의 소장의 고유판에서 단리하고, 다색 유동 세포측정법을 수행하여, 활성화의 세포 표면 마커의 발현을 정량화하고 이를 기초로 표현형을 결정한다. LPS가 MeCP2를 조절하기 때문에 (Bie et al., 2013), 루미넥스(Luminex) 검정법을 사용하여 휴식 및 LPS-자극 조건 하에 장 단핵구/대식세포의 시토카인 프로파일을 또한 결정한다 (프로토콜에 대해 문헌 [Hsaio et al., 2013] 참조). 모든 실험 동물로부터의 혈청을 시토카인에 대해 검사하고, 유사하게 정량화한다. 프로파일에서의 변화를 관찰하고, RT-qPCR에 의해 확인한다. 이러한 연구들은 선천성 면역 세포의 발달 및 활성에 대한 장 MeCP2의 수반을 확증할 것이다.
실시예 12: MeCP2vil-Cre+ 마우스의 행동 분석
본원에 기술된 바와 같이 장 상피에서 MeCP2가 재활성화된 마우스에서, 실시예 19에 기술된 바와 같이) 행동 분석을 수행하여, 레트 마우스의 임의의 비정상적인 행동에 대한 장 환경을 정상화하는 것의 효과를 결정한다. 운동 증상의 경우, 로타로드, 빔 건너기, 및 움켜쥐기 검정법이 사용된다. 오픈 필드, 명암 박스, 구슬 묻기가 불안 관련 장애에 대해 사용된다. 호흡 이상이 레트에서 통상적이기 때문에, 전신 체적변동기록을 사용하여, 장에서 MeCP2를 발현하는 것이 전신 염증을 저하시키고/거나 보호성 미생물 생성물의 생산을 강화하는 것을 통해 잠재적으로 호흡에 영향을 미치는지 여부를 결정한다. 이러한 파라미터들에 대한 장에서 MeCP2를 발현하는 것의 효과를 관찰한다.
실시예 13: 레트 발병기전에서의 장 디스바이오시스 및 MeCP2의 평가
GF 마우스는 숙주에 대한 미생물총의 효과를 조사하기 위한 강력한 도구이다. 본 발명자들은 MeCP2의 활성에 대한 장 미생물총의 영향을 해명하고, 비정상적인 행동에 대한 장 환경의 효과를 결정하며, 프로바이오틱스의 콜로니화가 임의의 레트 증상의 중증도를 저하시킬 수 있는지 여부를 탐구하는데 유용할 수 있는 GF 레트 마우스 콜로니를 발달시켰다.
GF 레트 마우스의 행동 분석. WT GF 마우스는 운동 활성이 증가되고, 불안이 감소되며, BDNF 수준이 상승되고, 이는 통상적인 레트 마우스 및 환자에서 보고된 것과 대조적이다 (Lombardi, et al., 2015, Luczynski et al. 2016). 따라서, 정상적인 조건 하에 사육된 GF WT 및 레트 마우스 및 코호트의 비정상적인 행동을 조사하여, 차이가 있는지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 운동 기능, 반복 행동, 불안, 및 학습 및 기억을 GF 마우스에서 검사할 수 있다. 마지막에는, GF 환경이 더 이상 필요하지 않으면 호흡 이상을 또한 검사할 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 이러한 연구들이 장 디스바이오시스를 레트에서의 CNS 증상의 진행에 연결시킬 수 있는 것으로 생각된다.
GF 레트 마우스의 전사 프로파일링. 어떻게 장 미생물총이 레트에서 행동을 제어하는지의 분자적 메카니즘을 이해하는 것은 새로운 병원성 경로 및 치료 표적을 확인할 수 있다. GF 레트 마우스와 통상적인 레트 마우스 사이의 행동 차이가 발견되면, mRNA를 시퀀싱할 수 있고, 모든 실험 군의 장 및 뇌 조직으로부터 단리할 수 있으며, 미생물총-MeCP2 상호작용에 의해 조절될 수 있는 유전자를 확인할 수 있다. 선택된 관심 표적을 RT-qPCR에 의해 확인하고 정량화할 수 있다.
GF 레트 마우스의 프로바이오틱스로의 장 콜로니화. 유망한 프로바이오틱 중 하나는 공생 박테리아인 박테로이데스 프라길리스 (비. 프라길리스)이며, 이는 인간 장에 콜로니화한다 (Mazmanian et al., 2005). 비. 프라길리스 치료는 항염증 환경에 유리하게 장 미생물총을 변화시키고, 신경발달 장애의 환경적 마우스 모델에서 자폐증-유사 행동의 중증도를 감소시킨다 (Hsiao et al., 2013). 비. 프라길리스 콜로니화는 다발경화증 및 IBD를 포함하는 다른 질환 모델에서 또한 보호적이다 (Chu et al., 2013). 이러한 발견들은 자폐아 및 IBD 환자에서의 비. 프라길리스의 임상 시험을 촉진하였다.
레트에 대한 이러한 요법을 탐구하기 위해, GF 레트 마우스에 비. 프라길리스를 콜로니화시키고, 비정상적인 행동 및 병리에 대한 효과를 본원에 (예를 들어, 실시예 19에서) 기술된 바와 같이 검사한다. 인간 환자에서의 사용에 대해 비. 프라길리스를 검증하기 위해, 건강한 인간 공여자의 분변 물질에 비. 프라길리스를 강화시키고, 유사하게 GF 레트 마우스에 콜로니화시키고, 효과를 검사한다. 메타게놈 16S RNA 시퀀싱 및 배양을 사용하여 콜로니화, 박테리아 부하, 및 다양성을 확증한다. 비. 프라길리스가 레트 증후군과 연관된 증상을 경감시키고/거나, 상기 증상의 가능성을 감소시키고/거나, 상기 증상의 발병을 지연시킬 것으로 예상된다.
실시예 14: 레트 마우스에 대한 리팍시민의 효과
레트 마우스의 장 미생물총을 제거하는 것이 GI 병리를 변경시키는지 여부를 검사하였다. 특히, 항생제 칵테일로의 치료가 소장의 길이를 유의하게 증가시키고, 복부 지방의 축적을 감소시켰다 (도 14a, 추가적인 데이터는 제시되지 않음). 그러나, 칵테일 내의 일부 항생제는 독성일 수 있고, 이는 데이터 분석 및 추가 분석을 복잡하게 한다. 따라서, 임상적으로 유용한 항생제가 유사한 효과를 가질 수 있는지 여부를 연구하였다. 리팍시민은 안전하고 인간이 잘 허용하는 장-특이적 항생제이다 (Bajaj, 2013). 임상 연구에서, 리팍시민은 박테리아 부하를 감소시키고, 누출성 장을 수정하며, 간성 뇌병증 (HE) 환자에서 불안, 과민성, 우울, 운동 증상 및 인지 손상을 포함하는 여러 비정상적인 행동의 중증도를 감소시킨다 (Bajaj et al., 2013, Kok et al., 2013). HE는 장 디스바이오시스에 강력하게 연계된 손상된 장-간-뇌 축의 모델이다 (Bajaj, 2013). 파일럿 연구에서, 리팍시민은 파킨슨병 환자에서 운동 기능을 또한 개선시켰다. 이의 효과를 상세하게 테스트하기 위한 임상 시험이 진행 중이다 (clinicaltrials.gov의 월드와이드웹에서 입수가능함, 문헌 [Fasano et al., 2013]).
이유 후 레트 마우스를 리팍시민으로 6개월 동안 치료하는 것이 선택적으로 결장을 신장시키고 장 비만을 방지하는 것으로 관찰되었다 (도 14 b-c, 데이터는 제시되지 않음). 암컷 레트 마우스 또한 비만이 되고, 과도한 지방 조직을 축적하지만, 이러한 대사 변화가 발달되기 전에 리팍시민으로 치료되었을 때는 그렇지 않다 (도 14. d-f). 일부 레트 환자에서는 체중 증가가 문제가 아닐 수 있지만, 이러한 결과들은 MeCP2의 부재가 미생물-유도 대사 변화를 유도하고, 이는 미생물총을 변형시킴으로써 정상화될 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 일부 레트 환자는 체중이 증가되고, 비정상적인 지질 대사가 있다 (Kyle et al., 2016).
이러한 데이터는 레트 증후군 마우스를 임상적으로 유용한 항생제인 리팍시민으로 치료하는 것이 장 형태학을 유의하게 개선시키고 복부 지방의 축적을 감소시킨다는 것을 제시한다.
실시예 15: 레트에서의 성상세포 및 소교세포에 대한 리팍시민의 효과
성상세포는 레트 마우스에서 비정상이고, 성상세포에서의 MeCP2의 재활성화는 이동 및 불안과 같은 비정상적인 행동을 수정하고, 수명을 증가시키며, 호흡 이상을 정상화한다 (Lioy et al., 2011).
일부 리팍시민-치료 레트 마우스의 피질 영역으로부터의 뇌 절편이 비히클-치료 코호트에 비교했을 때 바이오마커 예컨대 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 및 글루타민 신쎄타제 (GS)에 대한 염색이 감소된다는 것이 관찰되었다 (도 15a). 통계 분석을 위해 이러한 발견을 재확증하고 정량화할 수 있다. GFAP 및 GS의 상승은 성상세포 활성화 및 염증에 연결된다. 성상세포는 신경염증, 신경변성, 및 신경정신병 장애에 대한 치료 표적으로 인식된다. 일부 장 미생물은 CNS에 도달하고, 성상세포 활성화를 저하시키며, 이어서 염증성 시토카인의 생산을 감소시키는 분자를 생산한다 (Rothhammer et al., 2016). 장 박테리아는 또한 CNS 면역 세포인 소교세포의 발달에 크게 영향을 미친다 (Erny et al., 2015). 레트 마우스의 뇌 절편을 소교세포 바이오마커로 염색하였고, 일부 리팍시민-치료 동물에서 개수가 감소되었음이 발견되었다 (도 15b).
따라서, 이러한 데이터는 레트의 리팍시민-치료가 성상세포 활성화 및 염증에 연결된 바이오마커에 대한 염색을 감소시켰음을 제시한다.
이러한 데이터에서, 리팍시민은 음용수에서 전달되었고, 이는 각각의 동물이 상이한 투여량을 섭취하는 것을 초래할 수 있어, 투여량 곡선을 생성시키기 위해 추가적인 연구를 사용할 수 있다. 예를 들어, 동물에게 기지량의 리팍시민을 위관으로 공급하여 동일한 전달을 보장할 수 있다. 성상세포 및 소교세포를 비히클 및 리팍시민-치료 마우스로부터 단리할 수 있고, mRNA 시퀀싱을 수행하여 리팍시민 치료에 의해 조절되는 유전자 생성물을 확인할 수 있다.
실시예 16: 레트 행동에 대한 리팍시민의 효과
리팍시민-치료 레트 마우스는 서식 우리에서 더욱 활동적이고, 더 양호한 둥지를 만든다 (도 16a). 둥지 만들기는 설치류의 웰빙, 일상 활동, 긍정적인 동기부여 상태, 및 건강한 뇌 기능의 지표이다 (Jirkof, 2014). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 리팍시민이 레트 마우스의 운동 증상을 또한 도울 수 있는 것으로 생각되는데, 치료된 동물이 와이어-메시 실린더를 등반하려는 시도를 더 많이 하고, 강화된 근육 강도를 나타내며, 근육긴장이상 및 근육 협동 상실의 징후인 움켜쥐기 표현형이 감소되기 때문이다 (도 16b-d). 리팍시민이 HE 및 PD 환자의 파킨슨병 증상을 호전시킨다는 것이 주목된다 (Fasano et al., 2013, Kok et al., 2013). 이는 본원에서 관찰된 레트 마우스의 개선된 운동성과 일관된다. 로타로드, 빔 건너기, 및 오픈 필드를 포함하는 추가적인 행동 테스트로 본원에서의 데이터가 확증될 수 있다. 이러한 연구들은 레트 증후군에서의 CNS 병리 및/또는 비정상적인 행동에 대한 리팍시민 요법의 이점을 확인할 수 있다. 임의적으로, 리팍시민이 영향을 미치는 장 박테리아가 실시예 17의 일부에 기술된 바와 같이 확증될 수 있다.
실시예 17. 레트에서의 장 미생물총과 해마 신경발생 사이의 연계를 조사한다
레트 증후군의 통상적인 특색은 지능 장애이다. 해마 신경발생에서의 결함이 레트 증후군에서의 인지 손상에 연결된다 (Ramocki et al., 2008). 성체 레트 마우스는 감소된 해마 신경발생을 나타내고 (도 17a, 하부 패널), 이는 인지를 손상시킬 수 있고, 불안 및 우울을 유도할 수 있다. 통상적인 어린 레트 마우스에서는 신경발생이 정상이다. 또한, GF 레트 마우스는 새롭게 생성된 해마 뉴런의 개수의 어떠한 감소도 제시하지 않는다 (도 17b). BrdU 혼입을 사용하여 이러한 발견을 추가로 확증하고 정량화할 수 있다. WT GF 마우스는 해마 신경발생이 증가된 것으로 보이고 (Ogbonnaya et al., 2015), 이는 GF 레트 마우스에서 관찰된 결과를 설명할 수 있다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 레트 마우스에서 깊은 뇌 자극이 해마 신경발생을 촉진하고, 학습 및 기억을 강화하며, 이는 레트에서의 인지 결합이 CNS 환경을 변화시킴으로써 치료가능할 수 있다는 것을 시사한다 (Hao et al., 2015). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 본원에서의 일부 실시양태에 따른 장 생리상태의 조작이 레트 마우스에서 해마 신경발생을 유도할 수 있고 인지를 강화할 수 있는 것으로 생각된다.
레트 마우스에서의 신경발생에 대한 미생물총의 효과를 결정한다.
리팍시민이 HE 환자의 인지 작업을 개선하기 때문에 (Ahluwalia et al., 2014), 리팍시민이 레트 마우스에서 신경발생에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 테스트하였다. 데이터는 비히클에 비교하여, 리팍시민-치료 레트 마우스가 강화된 해마 신경발생 및 수상돌기 분지를 나타낸다는 것을 가리킨다 (도 18a-b).
CNS 신경발생에 대한 또 다른 적소인 뇌실하대 (SVZ)에서의 강화된 세포 증식이 리팍시민-치료 마우스에서 또한 관찰된다 (도 18c). 이론에 의해 제한되지 않으면서, 이러한 데이터는 리팍시민이 레트 마우스의 신경화학에 광범위한 효과가 있을 수 있다는 것을 가리킨다.
이러한 연구들은 본원에서의 일부 실시양태에 따라 장 환경을 변화시키는 것이 레트 마우스의 뇌를 변형시킬 수 있다는 것을 가리킨다. BrdU 표지화를 사용하여, 새롭게 생성된 뉴런이 경시적으로 생존하는지 및 뇌 회로 내로 통합되는지 여부를 추가로 결정할 수 있다.
리팍시민이 영향을 미치는 해마 유전자 표적의 확인
GF 레트 마우스는 손상된 신경발생의 어떠한 징후도 제시하지 않는다 (도 17b).
따라서, 이론에 의해 제한되지 않으면서, 선택된 유전자의 수준이 통상적인 리팍시민-치료 레트 마우스와 및 GF 레트 마우스 사이에서 유사할 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 유전자의 연구는 MeCP2-미생물총 상호작용에 의해 조절되는 해마 신경발생 경로를 확인할 수 있다.
학습 및 기억에 대한 리팍시민의 효과를 결정한다. 행동 예컨대 신규 물체 인식 및 반즈 미로를 수행하여 레트 마우스의 인지 작업에 대한 리팍시민 치료의 효과를 결정한다. GF WT 및 레트 마우스를 이러한 행동에 대해 또한 테스트하고, 결과를 리팍시민-치료 코호트와 비교한다. 레트 마우스에서의 인지 작업에 대한 장 미생물총 및 리팍시민 치료의 영향을 관찰한다. 학습 및 기억이 리팍시민-치료 레트 마우스에서 개선될 것으로 예상된다.
추가적으로, 신경발생에 대한 리팍시민의 임의의 관찰된 효과에 대해, 수반되는 분자 표적을 확인한다. 비히클- 및 리팍시민-치료 WT 및 레트 코호트의 해마에서의 mRNA 시퀀싱을 수행한다. 결과를 RT-qPCR에 의해 확인하고, GF 레트 마우스에서 추가로 확인한다.
따라서, 리팍시민이 본원에서의 일부 실시양태에 따른 지능 장애의 치료를 위한 후보로서 구상된다.
실시예 18: 리팍시민이 영향을 미치는 미생물 군집의 확인
인간 미생물총을 리팍시민으로 치료하는 것은 레트 마우스에서 감소되는 비피도박테리아를 포함하는 프로바이오틱 종의 증식을 촉진한다 (문헌 [Maccafferii et al.], 2010, 도 4c). 놀랍게도, 리팍시민은 레트 마우스의 GI 관에서 비피도박테리아의 풍부도를 증가시키지 않았고, 이는 이의 보호 효과가 다른 박테리아의 조성의 변화에 기인할 수 있다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, 리팍시민은 레트 마우스에서 또한 감소되는 테네리쿠테스 문의 풍부도를 증가시켰다 (도 7, 11, 및 19). 인간 건강에서의 테네리쿠테스의 역할에 관해서는 덜 알려져 있다. 그러나, 동물에서, 테네리쿠테스의 존재는 조섬유의 소화와 상호관련된다 (Niu et al., 2015). 그럼에도 불구하고, 이러한 데이터는 리팍시민이 미생물총의 조성을 변경시키고, 이는 신경발생 미생물의 콜로니화를 유리하게 할 수 있다는 것을 시사한다.
추가 연구를 위해, 비히클 및 리팍시민 치료 WT 및 레트 마우스의 16S RNA 시퀀싱을 수행한다. 이러한 실험들이 MeCP2의 존재 및 부해 하에 리팍시민에 의해 유도되는 미생물 변화를 확인할 것으로 예상된다. 강화된 임의의 배양가능한 박테리아 종에 대해, 해마 신경발생 및 인지 관련 행동에 영향을 미치는 최상의 후보를 레트 마우스의 콜로니화에 사용할 수 있다.
이론에 의해 제한되지 않으면서, 리팍시민이 신경발생을 손상시킬 수 있는 성장 특이적 박테리아 종을 감소시킬 수 있는 것으로 추가로 생각된다. 이같은 종의 역할을 GF 레트 마우스에서의 콜로니화를 통해 추가로 확증할 수 있다. 해마 내의 새롭게 생성된 뉴런의 개수의 감소, 면역조직화학에 의한 검사, 및 행동 분석으로 신경발생을 손상시키는 것에서의 이같은 박테리아 종의 역할을 확인할 수 있다.
실시예 19: 물질 및 방법
동물 모델
모든 동물 실험은 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 칼텍 동물 지침(Caltech Animal Guidelines)에 따라 수행된다. MeCP2-무효 (MeCP2플록스-스톱) 및 MeCP2 (T158A)가 대부분의 실험에 사용된다. MeCP2플록스-스톱 및 빌린-Cre를 교배시킴으로써 MeCP2vill-cre+가 생성된다. 비용을 감소시키고 신속하게 결론에 도달하기 위해, 수컷이 짧은 시간 내에 강건한 표현형을 생산하기 때문에 수컷을 먼저 검사할 것이다. 임의의 실험의 결과가 양성이면, 이를 암컷에서 검증할 수 있다. 다수의 행동 분석에 대해, <0.1-0.5 유의성의 P 값으로 차이를 달성하기 위해 각각의 실험 군에 대해 ~ 15-20마리의 마우스가 요구될 것으로 추정된다. 이는 일반적으로 각각의 군에 대해 약 5-6마리의 임신한 암컷을 필요로 한다. 조직학적 및 생화학적 검사, 및 유전자 연구를 위해, 약 6마리의 마우스가 각각의 군에서 사용된다. 이러한 프로젝트를 위한 동물 사용에 대한 기관 규제 검토가 완료되었고, 칼텍(Caltech) IACUC가 제안된 연구 (프로토콜 #1726)의 완료에 요구되는 실험 절차를 승인하였다.
GF 레트 마우스의 유도 및 검사.
칼텍의 무균동물학 센터에서 확립된 절차에 의해 GF 레트 마우스 (T158A)가 생성된다. 호기성 및 혐기성 조건 하에서의 배양 및 PCR에 의해 미생물의 존재에 대해 마우스가 일상적으로 테스트될 것이다. 이러한 콜로니가 확립되어 있고, 다양한 실험을 위해 현재 확장되고 있다.
리팍시민 치료
리팍시민 치료는 일반적으로 동물이 ~ 4-5주령일 때 시작되고, 6주 동안 치료가 계속된다. 이는 수컷 마우스가 ~ 10주령일 때 증상을 나타내기 시작한다는 관찰을 기초로 한다. 제시된 예비 결과에 대해, 리팍시민은 음용수에서 제공되었고, 이는 비침습성이다. 결과의 변동성이 크면, 각각의 동물이 동일한 양의 리팍시민을 제공받는 것을 보장하기 위해 동물에게 위관 공급할 것이다 (Hsiao et al., 2013).
조직학, 면역조직화학, 및 면역형광
레트 마우스가 GI 결함을 나타내는지 여부를 테스트하기 위해, 이들을 도 9에 제시된 바와 같이 전반적인 해부학 및 길이 측정에 대해 검사할 것이다. 또한 이들을 다양한 레트 모델에서 장 줄기 세포의 분화에 대해서 또한 검사할 것인데, MeCP2가 이의 생산에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 장 줄기 세포는 자가-재생되고, 내분비 세포, 장세포, 술잔세포, 및 파네트 세포로 분화한다 (Yin et al., 2014). 면역조직화학에 의해 확인될 수 있는 특이적 마커의 발현에 의해 각각의 세포 유형이 확인된다. 장 줄기 세포는 마커 예컨대 Lgr5/GPR49를 발현한다. 장세포는 다수의 독특한 마커 예컨대 E-카드헤린, 알칼리성 포스파타제 및 렉틴 결합 단백질이 있다 (도 8). 술잔세포는 뮤신 (MUC2)의 선택적 발현에 의해 확인될 수 있고, 파네트 세포는 리소자임과 같은 마커의 특이적 발현에 의해 확인된다 (Yin et al., 2014, 도 9f). 이러한 마커에 대한 항체가 시판되고, 유사한 연구에서 사용되었다. 각각의 세포 마커에 대해 선택적인 항체가 MeCP2의 존재 또는 부재가 장 줄기 세포의 분화에 영향을 미칠 것인지 및 장 내의 상이한 장 세포들의 비를 변경시킬 것인지 여부를 지시하는데 사용될 것이다.
BrdU 표지화
이론에 의해 제한되지 않으면서, 장 줄기 세포의 비정상적인 증식이 더 짧은 장 길이를 담당할 수 있는 것으로 예상되는데, 이는 MeCP2가 장 줄기 세포 및 장 상피의 재생을 지지하는 것들에서 발현되기 때문이다 (도 8). 이를 추가로 테스트하기 위해, BrdU (50 ㎍/체중 그램)를 주사하고, 장 상피를 재생하는데 걸리는 시간인 3-4일에 걸쳐 혼입을 추적함으로써 성체 WT 및 레트 마우스의 장 줄기 세포를 표지한다. 주사 후 다양한 시점에 마우스를 희생시키고, 고정하고, 면역조직화학에 의해 검사한다. 장 상피의 BrdU 표지화의 대표적인 도면이 도 10에서 제시된다.
누출성 장의 검사
레트 마우스가 누출성 장을 나타내는지 여부를 테스트하기 위해, 수컷 및 암컷 WT 및 레트 마우스를 철야로 금식시키고, 다음날 FITC-덱스트란 (시그마(Sigma), 4K)을 (위관 영양을 통해) 경구로 공급하였다. 기존 연구에서, 0.6 mg/kg이 사용되었다 (Hsiao et al., 2013). 유사한 절차 및 농도를 본 실험에서 사용한다. 혈장 샘플을 위관 영양 4시간 후에 수집하고, 분광광도계 (여기 485 nm/방출, 535 nm)를 사용하여 형광 강도를 측정한다. 각각의 실험에 대해, 6마리의 증상성 수컷 마우스 및 6마리의 암컷 + 연령-매칭 WT가 사용된다. 수컷 레트 마우스에서 증상이 더 빨리 발달되기 때문에, 실험이 상이한 나이에서 행해진다 (수컷의 경우 ~3개월, 암컷의 경우 ~ 8개월). 누출성 장이 레트 마우스에 존재하면, 누출성 장이 증상 발달에 선행하는지 여부를 결정하기 위해 증상-전 동물의 코호트가 검사될 것이다. 양성 결과는 누출성 장이 레트-연관 증상 중 일부에 기여할 수 있는 발달 결함일 수 있다는 것을 가리킬 것이다. 도 12b에 제시된 바와 같이 LPS의 수준을 정량화함으로써 누출성 장이 측정된다. 레트 마우스가 누출성 장을 나타낼 수 있을 것으로 예상된다.
대식세포, 소교세포 및 성상세포의 단리
장 대식세포가 공개된 프로토콜에 따라 강화된다 (Harusato et al., 2016). 간략하게, 동물의 소장을 표준 절차로 해부하고, 콜라게나제 용액에서 소화시킨다. 단일 세포 현탁액을 단리하고, 단핵구/대식세포 세포 표면 마커로 염색하고, 유동 세포측정법으로 정량화한다. 칼텍의 유동 설비가 이러한 실험에 사용된다. 유사한 절차를 사용하여 CNS로부터 소교세포 및 성상세포를 단리한다. 밀테닐 바이오텍(Miltenyl Biotec)으로부터의 시판되는 키트를 이용하여 각각의 세포 유형에 대해 강화한다 (캘리포니아주 샌디에고).
혈청 시토카인 및 케모카인의 분석
다수의 시토카인 및 케모카인을 동시에 측정하도록 설계된 루미넥스 검정법을 사용하여, WT 및 레트 마우스 (증상-전 및 증상성)의 장 대식세포/단핵구를 LPS 자극에 반응하여 염증성 시토카인을 생산하는 것에 대해 검사한다. 이러한 검정법에 대한 절차가 확립되어 있다 (Hsiao et al., 2013). 통계적 유의성을 얻기 위해, 6마리의 마우스가 실행 당 WT 및 돌연변이체에 대해 각각 사용된다. 변경된 표적의 발현을 휴식 및 LPS-자극 대식세포로부터 단리된 mRNA의 RTqPCR 분석에 의해 확증한다. 변경된 표적이 관찰될 것으로 예상된다.
미생물총 시퀀싱
레트 마우스가 장 디스바이오시스를 나타내는지 여부를 더 잘 이해하기 위해, 장 샘플의 미생물 프로파일을 16S RNA 시퀀싱에 의해 결정한다 (도 11). 레트 마우스의 장 마이크로바이옴을 상세하게 파악하기 위해, 본 발명자들은 수컷 및 암컷 둘 다로부터의 분변 샘플을 시퀀싱할 것이다. 각각의 군 (WT 및 레트 마우스), 및 3주령, 2개월령 및 4개월령으로부터의 6개의 샘플을 수집하고, 시퀀싱을 위해 DNA를 추출한다. 이러한 절차는 ~ 90% 정확도로 단리물에 대한 속 및 종 확인을 제공한다. 칼텍 게놈 설비(Caltech Genomic Facility)가 시퀀싱 및 생물정보학 분석에 사용된다. mRNA 시퀀싱. mRNA 발현 연구를 위해, 장 단편 또는 뇌 영역을 표준 절차에 의해 단리한다. 전체 RNA를 트리졸(TriZol)에 의해 추출하고, RNA 정제 칼럼에 의해 추가로 정제한다. 칼텍 게놈 설비를 사용하여, mRNA 시퀀싱을 수행하고, 데이터의 컴퓨터 분석을 수행하며, 미생물총에 의해 영향을 받을 수 있는 표적을 확인한다. 선택된 표적을 표준 절차를 사용하여 RT-qPCR에 의해 검증한다. 상이하게 발현된 미생물 장 프로파일이 레트 마우스에서 관찰될 것으로 예상된다.
레트 마우스의 생물요법
비. 프라길리스 치료는 자폐증의 환경적 및 유전적 마우스 모델에서 보호적이다 (Hsiao et al., 2013). GF 레트 마우스에서의 이의 효과를 탐구하기 위해, 1x1010 CFU (콜로니 형성 단위)의 신선하게 성장된 비. 프라길리스를 1 ml의 1.5% 중탄산나트륨에 현탁시키고, 4 ml 무당 애플 소스와 혼합하고, 4개의 표준 사료 펠릿에 바른다. 본 발명자들은 비. 프라길리스 콜로니 형성 단위의 42%가 투여 48시간 후에 애플 소스 접종원으로부터 회수된다는 것을 발견하였고, 이는 생육성 및 비-생육성 비. 프라길리스 둘 다가 치료 동안 섭취된다는 것을 시사한다 (Hsiao et al., 2013). 비히클 치료의 경우, 동물에 사료 펠릿 위의 애플 소스 내의 1.5% 중탄산나트륨을 공급한다. 이전의 연구는 각각의 동물이 단독으로 거주할 때 마우스가 매우 신속하게 애플 소스 및 펠릿을 완전히 소비한다는 것을 가리킨다 (따라서, 본 발명자들은 우리 효과를 극복할 것이다). 이러한 치료를 1주일 내에 3X 반복하여, 비. 프라길리스의 충분한 섭취를 보장한다. 무증상성 및 증상성 수컷 및 암컷 마우스 둘 다를 치료한다. 각각의 실험은 각각 6마리의 마우스를 사용한다 (WT 및 레트, 증상-전, 증상성). 치료 6주 후에, 행동 분석을 수행하고, 다른 표현형, 예컨대 체중 증가 및 수명에 대한 효과를 테스트하여, 비. 프라길리스에 임의의 보호 효과가 있는지 여부를 분석한다. 치료 목적을 위해, 본 발명자들은 또한 건강한 인간 공여자의 분변 물질에 비. 프라길리스를 강화하고, 유사하게 검사할 것이다. 이러한 연구들은 장 미생물에서의 변화가 레트 증상의 진행에 기여할 수 있고, 프로바이오틱으로 마이크로바이옴 디스바이오시스를 복원하는 것이 잠재적인 요법일 수 있다는 개념을 지지할 것으로 예상된다. 비. 프라길리스 치료가 본원에서의 일부 실시양태에 따라 레트와 연관된 증상을 호전시키고/거나, 상기 증상의 가능성을 감소시키고/거나, 상기 증상을 예방할 것으로 예상된다.
치료된 마우스의 행동 분석
로타로드
마우스를 최초의 테스트 전에 연속 2일 동안 훈련시킨다. 5 rpm에서 시작하여 240초에 걸쳐 40 rpm으로 가속되는 로타로드로부터 떨어질 때까지의 잠복기를 기록한다. 마우스는 최대 300초 동안 로타로드에 머무르도록 허용된다. 훈련일마다 10분의 시험간 간격 (ITI)으로 2회의 시험을 수행한다. 2회의 시험은 10분 ITI만큼 분리되어 수행된다.
빔 건너기
1 m 빔의 가운데 80 cm를 건너는 시간을 기록한다. 본 발명자들은 상이한 폭 (28, 12, 및 6 mm)의 직사각형 빔을 사용한다. 기둥 (테이블 윗면에서 50 cm 위)에 빔이 장착되고, 이때 시작점에 밝은 빛이 있고, 반대쪽에 동물의 서식 우리 둥지 물질을 함유하는 어두운 박스가 있다. 빔에서 떨어지는 마우스의 부상을 지하기 위해 테이블 윗면에서 7.5 cm 위의 나일론 해먹을 사용한다. 마우스를 밝은 빛이 있는 빔의 끝부분에 놓고, 마우스의 전신이 막대의 가운데 80 cm 부분에 진입하는 때부터 마우스의 코가 이러한 가운데에서 나가는 시간까지의 시간을 적외선 중단 센서를 사용하여 측정한다. 문헌 [Southwell et al., 2009]에 기술된 바와 같이 데이터를 분석한다. 로타로드 및 빔 건너기 둘 다는 운동 증상을 평가할 것이다.
움켜쥐기
뒷다리 움켜쥐기는 레트 증후군 및 운동 결함이 있는 기타 질환에서의 질환 진행의 마커이다. 이러한 검정법에서, 동물을 1분 동안 꼬리에 의해 테이블 윗면에서 ~30 cm 위에 현수시키고, 비디오 카메라로 기록한다. 움켜쥐기 없음은 0점으로 채점하고, 주기적 움켜쥐기 및 신전은 1점으로 채점하며, 전체 뒷다리 움켜쥐기+ 간헐적 신전은 2점으로 채점한다. 중증 움켜쥐기는 3점으로 채점한다.
오픈 필드
형광 천장 조명에 의해 밝게 밝혀진 방에서 16 cm 슬라이드가 있는 50 × 50 cm 개방형 백색 플렉시글라스(Plexiglas) 박스의 좌측 하단 코너에 마우스를 놓는다. 천장에 장착된 비디오 카메라로 10분 동안 오픈 필드 활성을 기록한다. 중앙 진입 및 중앙에서 보낸 시간을 기록한다. 중앙 진입은 불안-유사 행동을 검사할 것이다. 보고된 바와 같이 데이터를 분석한다 (Hsiao et al., 2013).
구슬 묻기
이것은 자폐증 및 레트의 홀마크인 반복적 및 상동 행동에 대한 테스트이다. 이러한 테스트에서, 마우스를 깔개 표면 상에 놓인 구슬을 함유하는 테스트 우리 내에 놓고, 10분 기간 내에 묻힌 구슬 (> 50% 구슬이 깔개 물질로 덮힘)의 개수를 기록한다 (Malkova et al., 2012).
체적변동기록 측정
전신 체적변동기록을 사용하여 레트 마우스에서의 호흡 불규칙을 측정한다. 이러한 표현형은 레트 환자에서 통상적이다 (Lombardi et al., 2015). 축적된 문헌이 호흡 조절에서의 미주 신경의 잠재적인 중요성을 지지한다. 본 발명자들은 레트에서의 장 디스바이오시스가 미주 신경 활성을 손상시키고 호흡 이상을 악화시키는 것으로 예측한다. 또한, 본 발명자들은 리팍시민 또는 비. 프라길리스 치료가 레트 마우스에서의 미주 신경 결함 중 일부를 수정할 수 있고, 이어서 호흡 결함 중 일부를 호전시킬 수 있는 것으로 예측한다. 데이터 사이언스 인터내셔널(Data Sciences International) (DSI; 미네소타주 세인트 폴)의 벅스코 파인 포인트 언리스트레인드 호울 바디 플레티스모그래프(Buxco Fine Pointe Unrestrained Whole Body Plethysmograph) 시스템이 이러한 측정에서 사용된다.
신규 물체 인식
신규 물체 인식은 레트 마우스에서 학습 및 기억에 대한 리팍시민 또는 프로바이오틱스의 효과를 검사하기 위한 유용한 테스트이다. 본 발명자들은 기존에 자폐증의 환경적 마우스 모델에서 이러한 테스트를 사용하였다 (Hsiao et al., 2013). 일반적으로 설치류는 친숙한 것보다 신규 물체를 탐색하는데 더 많은 시간을 소비한다. 신규 물체를 선택하는 능력은 학습 및 인식 기억의 지표이다. 신규 물체 인식 작업은 2개의 상이한 종류의 물체가 있는 오픈 필드 무대에서 수행된다. 양쪽 물체는 일반적으로 높이 및 부피 면에서 일치하지만, 형상 및 외관 면에서 상이하다. 습관화 동안, 동물은 빈 무대를 탐색하도록 허용된다. 습관화 24시간 후, 동물을 동일한 거리에 놓인 2개의 동일한 물체가 있는 친숙한 무대에 노출시킨다. 다음날, 마우스를 친숙한 물체 및 신규 물체의 존재 하에 오픈 필드를 탐색하도록 허용하여 장기 인식 기억을 테스트한다. 각각의 물체를 탐색하는데 소요된 시간 및 분별 지수 백분율을 기록한다. 이러한 테스트는, 다른 실험도 있지만 그중에서도, 비히클- 및 리팍시민-치료 레트 마우스, 뿐만 아니라 GF 코호트의 인지 능력을 평가하고, 결과를 정량화 및 비교하는데 사용된다.
반즈 미로
반즈 미로는 해마 의존적 공간 기억 작업에 대한 프로바이오틱스 또는 리팍시민의 효과를 분석하는데 고도로 적절하다. 이러한 테스트에서, 마우스는 미로의 밝게 밝혀진 개방형 표면을 탈출하기 위해 구멍의 위치를 학습한다. 이러한 테스트를 위해 확립된 표준 프로토콜을 따른다 (Dawood et al., 2004). 간략하게, 동물을 고정된 개수의 주변 구멍이 제공된 커다란 둥근 개방형 플랫폼으로 이루어진 반즈 미로의 상부에서 밝게 밝혀진 환경 내에 놓는다. 이같은 개방형 환경에서, 자연스럽게 마우스는 어두운 밀폐 환경을 찾고, 이는 플랫폼의 외곽 주변의 둥근 구멍 중 하나의 아래에서 어두운 박스 (목표 박스)의 형태로 제공된다. 마우스는 반복적으로 탈출 구멍을 확인하도록 훈련된다. 이러한 테스트는 비히클- 및 리팍시민-치료 레트 마우스, 뿐만 아니라 GF 코호트의 인지 능력을 평가하고, 결과를 정량화 및 비교하는데 사용된다. 데이터 획득을 위해, 동물이 미로 외곽을 둘러싸는 시공간 단서를 사용하여 목표 박스의 위치를 알아내는데 필요한 시간의 양을 측정한다. 탈출 구멍을 찾기 위해 마우스가 행한 오류의 수를 기록한다. 모든 훈련, 실험 설정 및 데이터 획득은 문헌 [Dawood et al., (2004)]에 따른 것이다.
실시예 20: 레트 마우스에서의 신경전달물질 수준 및 콜린성 유전자의 발현
콜린성 유전자의 수준을 레트 마우스 및 야생형 (비-레트) 대조군 마우스의 장 샘플에서 정량적 역전사효소 PCR에 의해 측정하였다. 야생형 (비-레트) 대조군 마우스에 비교하여, 레트 마우스는 감소된 수준의 콜린성 유전자를 나타냈다 (도 20a 참조). 레트 마우스에서 감소된 콜린성 유전자는 Chrna2, Chrna7, Chrb4, Chrm1, Slc5a7, Char, Ache, 및 Slc18a3을 포함하였다.
신경전달물질의 혈청 수준을 레트 마우스 및 야생형 (비-레트) 대조군 마우스에서 기체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 측정하였다. 콜린, 티로신, 도파민, 및 에피네프린의 수준이 야생형 (비-레트) 대조군에 비교하여 레트 마우스에서 증가되었다. 세레토닌 (5-HT)의 수준이 야생형 (비-레트) 대조군에 비교하여 레트 마우스에서 감소되었다. 도 20b 참조.
실시예 21: 레트 장에서의 MeCP2의 재활성화
레트 마우스의 장에서의 MeCP2 발현이 GI 병리를 호전시킬 수 있고 장-미생물총 항상성을 정상화시킬 수 있는 것으로 생각된다. 이를 연구하기 위해, MeCP2 발현을 장 상피에서 선택적으로 재활성화시키기 위해 빌린-Cre 마우스 계통을 플록스드 MeCP2플록스-스톱 마우스와 교배시킨다. 조작된 계통의 자손을 장벽 투과성을 포함하는 장 병리, 대사 변화, 디스바이오시스, 및 MeCP2-무효 마우스에서 발견되는 비정상적인 행동에 대해 검사한다. MeCP2가 장-미생물총 상호작용에 중요하고, 레트 증후군에서 장 병리를 CNS 병리의 진행에 연결시킬 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 22: 비. 프라길리스가 콜로니화된 GF 레트 마우스 및/또는 리팍시민 상에서 행동 분석이 수행된다
장 디스바이오시스가 레트 발병기전의 변형제일 수 있는 것으로 생각된다. 레트 환자 및 레트의 마우스 모델은 장 미생물총이 변경된다. 디스바이오시스를 CNS 증상에 연결시키기 위해, 행동 분석을 GF 레트 마우스에서 수행하고, 통상적으로 사육된 코호트가 나타내는 비정상적인 행동에 비교한다. 차이가 검출되면, MeCP2-미생물총 상호작용에 의해 조절될 수 있는 잠재적인 유전자 표적 및 경로를 확인하기 위해 모든 실험 군의 장 및 뇌로부터 추출된 mRNA를 시퀀싱할 수 있다. GI-기반 요법을 테스트하기 위해, GF 레트 마우스에 단독이거나 또는 건강한 인간 공여자의 분변 물질 내로 혼입된 프로바이오틱 박테로이데스 프라길리스를 콜로니화시킨다. 박테로이데스 프라길리스가 GI 및/또는 CNS 병리 중 일부를 호전시키고, 비정상적인 행동의 중증도를 감소시키는 것으로 생각된다.
또한, 레트 마우스의 장 미생물총을 리팍시민으로 변형시키는 것을 연구할 수 있다. 리팍시민은 IBD, 및 장-뇌 장애가 있는 환자를 치료하는데 사용된다. 리팍시민 치료가 디스바이오시스를 정상화시키고 GI 및 CNS 증상을 감소시킬 수 있는 것으로 예상된다.
실시예 23: 레트에서의 리팍시민 치료 후의 새롭게 생성된 뉴런의 생존
이론에 의해 제한되지 않으면서, 레트에서의 장 미생물총과 및 해마 신경발생 사이의 연결이 구상된다. 해마 회로에서의 결함을 수반할 수 있는 지능 장애가 레트 환자에서 만연한다. 리팍시민 치료가 레트 마우스에서 해마 신경발생 및 수상돌기 분지를 촉진한다는 것이 본원에서 보고된다. 새롭게 생성된 뉴런의 생존을 추가로 테스트할 수 있고, 뉴런이 생존하고 인지 작업을 강화하는지 여부를 또한 테스트할 수 있다. 새롭게 생성된 뉴런이 생존하고 중추 신경계 내로 통합될 것으로 예상된다. 대조군 및 리팍시민-치료 코호트의 마이크로바이옴을 시퀀싱하고 비교하여, 강화 또는 제거될 수 있는 박테리아 종을 확인할 수 있다. 상이한 배양가능한 프로바이오틱 종이 레트 마우스에서 콜로니화될 수 있고, 신경발생 및 인지-관련 행동에 대한 효과를 검사할 수 있다.
실시예 24: 염증성 마커에 대한 리팍시민 치료의 효과
리팍시민은 건강-촉진 박테리아의 증식에 유리하게 미생물총의 조성을 변경시킴으로서 IBD의 증상을 감소시킨다 (Xu et al., 2014, Sartor, 2016). 리팍시민의 치료 이점은 전신 염증 및 레트 마우스의 혈행 및 면역 세포에서 상승되는 시토카인 예컨대 IL-6 및 TNF-α의 수준을 감소시키는 것을 또한 포함한다 (Cronket al., 2015, Kang et al., 2016). 리팍시민은 레트 마우스에서 GI 관의 염증성 외관을 감소시켜, 면역 세포에 또한 영향을 미칠 가능성을 상승시킨다. 실시예 21에서 제안된 것과 유사하게, 리팍시민이 면역 세포의 염증성 표현형, 및 혈행 내의 염증성 시토카인의 수준을 변화시키는지 여부가 결정된다. 염증성 표현형 및/또는 염증성 시토카인 수준의 변화를 관찰할 수 있다.
참고문헌
각각의 하기 문헌이 이에 의해 전문이 참고로 포함된다:
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
이전에 기술된 실시양태 중 적어도 일부에서, 교체가 기술적으로 실현가능하지 않는 한, 한 실시양태에서 사용된 하나 이상의 요소가 또 다른 실시양태에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 청구된 주제의 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 다른 생략, 추가 및 변형이 본원에 기술된 방법, 조성물, 키트 및 용도에 이루어질 수 있다는 것을 관련 분야의 기술자는 이해할 것이다. 모든 이같은 변형 및 변화는 첨부된 청구항에 의해 정의되는 바와 같은 주제의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
본원에서의 실질적으로 임의의 복수형 및/또는 단수형 용어의 사용과 관련하여, 관련 분야의 기술자는 문맥 및/또는 용도에 적합한 바와 같이 복수형에서 단수형으로 및/또는 단수형에서 복수형으로 전환할 수 있다. 다양한 단수형/복수형 변경이 명확성을 위해 본원에서 명시적으로 기재될 수 있다.
관련 분야의 기술자는, 일반적으로, 본원에서, 특히 첨부된 청구항 (예를 들어, 첨부된 청구항의 본문)에서 사용된 용어가 일반적으로 "개방형" 용어로 의도된다는 것을 이해할 것이다 (예를 들어, 용어 "~를 포함하는"는 "~를 포함하나 이에 제한되지 않음"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 ~를 갖는"으로 해석되어야 하며, 용어 "~를 포함하다"는 "~를 포함하나 이에 제한되지는 않는다"로 해석되어야 하는 것 등이다). 관련 분야의 기술자는 특정 개수의 도입된 청구항 상술이 의도되는 경우, 이같은 의도가 청구항에 명시적으로 상술될 것이고, 이같은 상술의 부재 시에는 이같은 의도가 존재하지 않는다는 것을 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 하기의 첨부된 청구항은 청구항 상술을 도입하기 위해 도입 문구 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 함유할 수 있다. 그러나, 이같은 문구의 사용은 단수형에 의한 청구항 상술의 도입이 이같은 도입된 청구항 상술을 함유하는 임의의 특정 청구항을, 동일한 청구항이 도입 문구 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 단수형 (예를 들어, 단수형은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다)을 포함하는 경우에도, 오직 하나의 이같은 상술을 함유하는 실시양태에 제한한다고 의미하는 것으로 해석되지 않아야 한다; 청구항 상술을 도입하기 위해 사용된 정관사의 사용에 대해서도 마찬가지이다. 추가적으로, 특정 개수의 도입된 청구항 상술이 명시적으로 상술되는 경우에도, 관련 분야의 기술자는 이같은 상술이 적어도 상술된 개수를 의미하는 것으로 해석되어야 한다는 것을 인식할 것이다 (예를 들어, 다른 수식구 없이 "2개의 상술"을 기본적으로 상술하는 것은 적어도 2개의 상술, 또는 2개 이상의 상술을 의미한다). 또한, "A, B, 및 C 중 하나 이상 등"과 유사한 관례가 사용되는 경우, 일반적으로 이같은 구조는 관련 분야의 기술자가 이러한 관례를 이해할 것이라는 의미로 의도된다 (예를 들어, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A를 단독으로, B를 단독으로, C를 단독으로, A 및 B를 함께, A 및 C를 함께, B 및 C를 함께, 및/또는 A, B, 및 C를 함께 등으로 갖는 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않을 것이다). "A, B, 또는 C 중 하나 이상 등"과 유사한 관례가 사용되는 경우, 일반적으로 이같은 구조는 관련 분야의 기술자가 이러한 관례를 이해할 것이라는 의미로 의도된다 (예를 들어, "A, B, 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A를 단독으로, B를 단독으로, C를 단독으로, A 및 B를 함께, A 및 C를 함께, B 및 C를 함께, 및/또는 A, B, 및 C를 함께 등으로 갖는 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않을 것이다). 관련 분야의 기술자는 설명에서든, 청구항에서든, 또는 도면에서든, 2개 이상의 대안적인 용어를 나타내는 사실상 임의의 이접적 단어 및/또는 구절은 용어 중 하나, 용어 중 어느 하나, 또는 둘 다의 용어를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것을 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 구절 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
추가적으로, 본 개시내용의 특색 또는 측면이 마쿠시 군의 관점에서 기술되는 경우, 관련 분야의 기술자는 본 개시내용이 이에 의해 마쿠시 군의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원 하위군의 관점에서 또한 기술된다는 것을 인지할 것이다.
관련 분야의 기술자가 이해할 바와 같이, 임의의 모든 목적을 위해, 예컨대 서면 설명을 제공하는 관점에서, 본원에 개시된 모든 범위는 임의의 모든 가능한 이의 하위 범위 및 하위 범위 조합을 또한 포함한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위가 적어도 동일한 절반, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 분해되는 것을 충분히 기술하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에서 논의된 각각의 범위는 아래 1/3, 중간 1/3 및 위 1/3 등으로 쉽게 분해될 수 있다. 관련 분야의 기술자가 또한 이해할 바와 같이, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 상술된 숫자를 포함하고, 후속하여 상기 논의된 바와 같이 하위 범위로 분해될 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 관련 분야의 기술자가 이해할 바와 같이, 범위는 각각의 개별적인 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 1-3개의 항목이 있는 군은 1개, 2개 또는 3개의 항목이 있는 군을 지칭한다. 유사하게, 1-5개의 항목이 있는 군은 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 항목이 있는 군을 지칭하는 식이다.
조성물 또는 생성물 조합물 (예를 들어, 박테리아 및/또는 항생제를 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지는 조성물 또는 생성물 조합물)을 사용하는 방법이 본원에서 개시될 때마다, 사용하기 위한 상응하는 조성물이 또한 명백하게 구상된다. 예를 들어, 박테로이데스를 포함하는 소정의 양의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 선택된 대상체에서 HD의 증상을 감소시키거나 예방하는 방법의 개시를 위해, HD와 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 것에서 사용하기 위한 박테로이데스를 포함하는 상응하는 조성물이 또한 구상된다.
다양한 측면 및 실시양태가 본원에서 개시되었지만, 다른 측면 및 실시양태가 관련 분야의 기술자에게 명백할 것이다. 본원에 개시된 다양한 측면 및 실시양태는 예시를 목적으로 하고, 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 진정한 범주 및 취지는 하기 청구항에 의해 지시된다.

Claims (55)

  1. 악티노박테리아(Actinobacteria) 박테리아, 테네리쿠테스(Tenericutes) 박테리아, 또는 박테로이데스(Bacteroides) 박테리아 중 적어도 2종을 포함하는 단리된 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물.
  2. 제1항에 있어서, 단리된 악티노박테리아 박테리아 및 단리된 박테로이데스 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단리된 악티노박테리아 박테리아를 포함하며, 여기서 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아(Bifidobacteria)를 포함하는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 박테로이데스 박테리아를 포함하며, 여기서 박테로이데스 박테리아는 비. 프라길리스(B. fragilis), 비. 오바투스(B. ovatus), 및 비. 테타이오타오미크론(B. thetaiotaomicron), 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 박테리아가 메소플라스마 엔토모필룸(Mesoplasma entomophilum), 락토바실루스 타이와넨시스(Lactobacillus taiwanensis), 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스(Pediococcus argentinicus), 비피도박테리움 코에리눔(Bifidobacterium choerinum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 박테리아를 포함하는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  7. 제6항에 있어서, 박테리아가 OTU의 참조 16S rRNA 서열에 적어도 97% 동일한 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑되는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 104 cfu 이하의 피르미쿠테스(Firmicutes) 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제를 추가로 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물.
  11. 제10항에 있어서, 항생제가 리팍시민을 포함하는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 항생제가 단리된 박테리아와 분리된 별개의 조성물 내에 있는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 박테리아가 단일 조성물 내에 있는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 박테리아가 서로 별개의 조성물 내에 있는 조성물 또는 생성물 조합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 조성물 또는 생성물 조합물.
  16. 하기를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물:
    항생제; 및
    악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 박테리아.
  17. 제16항에 있어서, 단리된 악티노박테리아 박테리아를 포함하며, 여기서 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함하는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 조성물이 104 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아를 포함하는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제가 리팍시민을 포함하는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제가 단리된 박테리아와 분리된 별개의 조성물 내에 있는 것인 조성물 또는 생성물 조합물.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는데 사용하기 위한 조성물 또는 생성물 조합물.
  23. 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아, 또는 열거된 박테리아의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 대상체를 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 조성물을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내에 있는 것으로서 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 방법이 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 악티노박테리아 박테리아가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  27. 제23항에 있어서, 방법이 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키며, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 동시에 또는 별개로 투여되는 것인 방법.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아 박테리아 및 테네리쿠테스 박테리아가 대상체에게 동시에 또는 별개로 투여되는 것인 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아 박테리아가 비피도박테리아를 포함하는 것인 방법.
  31. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 박테로이데스 박테리아가 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 비피도박테리움 코에리눔으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 박테리아를 포함하는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 박테리아가 OTU의 참조 16S rRNA 서열에 적어도 97% 동일한 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑되는 것인 방법.
  34. 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 104 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  35. 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 것을 필요로 하는 대상체에게 항생제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 대상체를 레트 증후군 또는 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성을 감소시키거나, 상기 증상의 발병을 지연시키거나 또는 상기 증상을 호전시키기 위한 조성물을 제공받아야 하는 대상체의 클래스 내의 대상체로서 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 항생제가 리팍시민을 포함하는 것인 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 레트 증후군과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성이 감소되거나, 상기 증상의 발병이 지연되거나, 또는 상기 증상이 호전되는 것인 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 헌팅톤병과 연관된 하나 이상의 증상의 가능성이 감소되거나, 상기 증상의 발병이 지연되거나, 또는 상기 증상이 호전되는 것인 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제를 투여하는 것이 대상체 내의 장 박테리아의 양을 적어도 95%만큼 감소시키는 것인 방법.
  41. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아 박테리아, 테네리쿠테스 박테리아, 및 박테로이데스 박테리아, 또는 열거된 박테리아의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 단리된 박테리아를 포함하는 조성물 또는 생성물 조합물을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 단리된 박테리아가 메소플라스마 엔토모필룸, 락토바실루스 타이와넨시스, 페디오코쿠스 아르겐티니쿠스, 비피도박테리움 코에리눔으로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 맵핑되는 OTU에 맵핑되는 박테리아를 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 박테리아가 OTU의 참조 16S rRNA 서열에 적어도 97% 동일한 적어도 100개의 뉴클레오티드의 16S rRNA 서열을 포함할 때 박테리아가 OTU에 맵핑되는 것인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아 박테리아 및 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여되는 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아 박테리아가 대상체에게 투여되며, 여기서 악티노박테리아 박테리아는 비피도박테리아를 포함하는 것인 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 박테로이데스 박테리아가 대상체에게 투여되며, 여기서 박테로이데스 박테리아는 비. 프라길리스, 비. 오바투스, 및 비. 테타이오타오미크론, 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 박테리아가 항생제와 동시에 투여되는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 단리된 박테리아가 항생제와 상이한 시간에 투여되는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, (a) 항생제가 박테리아 전에 투여되거나; 또는 (b) 박테리아가 항생제 전에 투여되는 것인 방법.
  50. 제35항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 104 cfu 이하의 피르미쿠테스 박테리아가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  51. (a) 테네리쿠테스, 악티노박테리아, 및 피르미쿠테스, 또는 열거된 박테리아 중 2종 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 장 박테리아의 존재 및/또는 수준;
    (b) 콜린, 5-HT, 티로신, 도파민, 및 에피네프린, 또는 열거된 신경전달물질 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경전달물질의 혈청 수준, 또는
    (c) Chrna2, Chrna7, Chrb4, Chrm1, Slc5a7, Chat, Ache, 및 Slc18a3, 또는 열거된 유전자 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 콜린성 유전자의 발현 수준
    중 적어도 하나를 검출하는 것을 포함하는, 대상체의 샘플의 프로파일을 결정하는 방법이며,
    여기서 프로파일은 (a), (b), (c), (a) 및 (b), (a) 및 (c), (b) 및 (c), 또는 (a) 및 (b) 및 (c)의 검출된 존재 및/또는 수준을 포함하는 것인
    방법.
  52. 제51항에 있어서, 프로파일을 결정하는 것이 (a)를 결정하는 것을 포함하고, 샘플이 대상체의 장 및/또는 분변 물질을 포함하고, 레트 증후군의 존재 또는 위험 상승이 비-레트 대조군 샘플 내에 존재하는 수준에 비해 더 낮은 수준의 테네리쿠테스 또는 악티노박테리아, 또는 증가된 수준의 피르미쿠테스에 의해 지시되는 것인 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 프로파일을 결정하는 것이 (b)를 결정하는 것을 포함하고, 샘플이 대상체의 혈청을 포함하고, 레트 증후군의 존재 또는 위험 상승이 하기에 의해 지시되는 것인 방법:
    대조군에 비교하여 더 높은 수준의 콜린, 티로신, 및/또는 도파민; 및/또는
    비-레트 대조군 샘플 내에 존재하는 수준에 비해 더 낮은 수준의 5H-T 및/또는 에피네프린.
  54. 제51항 또는 제52항에 있어서, 프로파일을 결정하는 것이 (c)를 결정하는 것을 포함하고, 샘플이 대상체의 핵산을 포함하고, 레트 증후군의 존재 또는 위험 상승이 비-레트 대조군 샘플 내에 존재하는 수준에 비해 더 낮은 발현 수준의 Chrna2, Chrna7, Chrb4, Chrm1, Slc5a7, Chat, Ache, Slc18a3, 또는 열거된 유전자 중 2종 이상에 의해 지시되는 것인 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 악티노박테리아가 비피도박테리아를 포함하는 것인 방법.
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