JP2020506968A - ハンチントン病およびレット症候群における腸内微生物叢の調節 - Google Patents

ハンチントン病およびレット症候群における腸内微生物叢の調節 Download PDF

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Abstract

本明細書に記載の実施形態のいくつかは、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための方法、組成物および／または使用に関する。特定の理論に制限されるものではないが、腸内微生物叢を調節することによって、レット症候群およびハンチントン病の症状に影響を及ぼすことができると考えられる。細菌および／もしくは抗生物質を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品を、該組成物または組み合わせ製品を必要とする対象に投与することによって、レット症候群またはハンチントン病の症状を発症する可能性を低減できるか、該症状の発症を遅延することができるか、または該症状を緩和することができる。

Description

優先出願の参照による引用
本願とともに出願された出願データシートにおいて外国優先権または国内優先権の主張が認められるあらゆる出願は、37 CFR 1.57の下、引用によって本願に援用される。本出願は、2017年2月7日に出願された米国仮出願62/455,706の利益を主張するものであり、この出願は引用によりその全体が本明細書に援用される。
連邦政府の助成による研究開発に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金第NS074374に基づく政府支援の下でなされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を保有する。
技術分野
本明細書に記載の実施形態のいくつかは、ハンチントン病および／またはレット症候群に伴う症状の検出、予防、遅延および／または緩和のための方法および組成物に関する。該方法および該組成物は、細菌および／または抗生物質を含むことができる。
ハンチントン病（HD）は、悲惨な遺伝性の神経変性疾患であり、ハンチンチン（HTT）タンパク質のエキソン１中のポリグルタミン（ポリＱ）配列に翻訳されるCAGリピートの伸長により引き起こされる。タンパク質分解およびmRNAスプライシングの変化によって生成される変異型HTTエキソン１はアミロイド原性かつ神経毒性であり、ハンチントン病変の主な決定因子である（Batesら、2015）。ハンチントン病患者は、消耗性の運動症状、精神症状および認知症状を発症する（Paulson、2011）。炎症などの環境要因は、ハンチントン病の発生機序に影響を及ぼすことがある。発症前のハンチントン病対象は、運動症状の発症の数年前に、ミクログリアの活性化と、循環系および脳脊髄液中においてIL-1β、IL-6、TNF-αなどの炎症誘発性サイトカインの上昇が見られる（Bjorkqvistら、2008、Taiら、2007）。
レット症候群は、メチル−CpG結合タンパク質２（MeCP2）における変異によって引き起こされるＸ連鎖性自閉スペクトラム症（ASD）である。レット症候群を有する女児は、小頭症、精神遅滞、常同症、不安、呼吸障害、発話障害、痙攣、側弯およびパーキンソン病様の特徴を呈する。男性でのMeCP2変異は致死的であり、通常、生後１年以内に死亡する。また、MeCP2は、自閉症患者、若年性統合失調症およびMeCP2重複障害の一部にも関与する（Lombardiら、2015）。
いくつかの実施形態は、アクチノバクテリア門（Actinobacteria）細菌、テネリクテス門（Tenericutes）細菌およびバクテロイデス属（Bacteroides）細菌のうちの少なくとも２種を含む単離された細菌を含む組成物または組み合わせ製品を含む。いくつかの実施形態において、該組成物または組み合わせ製品は、単離されたアクチノバクテリア門細菌および単離されたバクテロイデス属細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、単離されたアクチノバクテリア門細菌を含み、該アクチノバクテリア門細菌はビフィドバクテリウム属を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、Ｂ．フラジリス（B.fragilis）、Ｂ．オバツス（B.ovatus）、Ｂ．テタイオタオミクロン（B.thetaiotaomicron）およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される単離されたバクテロイデス属細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、アクチノバクテリア門細菌、テネリクテス門細菌およびバクテロイデス属細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumからなる群から選択される細菌にマッピングされたOTUにマッピングされる細菌を含む前記単離された細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記細菌は、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％（たとえば少なくとも９７％、９８％または９９％）の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に該OTUにマッピングされる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、１０６ｃｆｕ以下、たとえば１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のファーミキューテス門細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、薬学的に許容される添加剤を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は抗生物質を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、抗生物質を含み、該抗生物質はリファマイシン系抗生物質である。いくつかの実施形態において、前記抗生物質は、リファキシミン系抗生物質を含むか、実質的にリファキシミン系抗生物質からなるか、またはリファキシミン系抗生物質からなる。いくつかの実施形態において、前記抗生物質は、前記単離された細菌とは別個の組成物中に含まれている。いくつかの実施形態において、前記単離された細菌は単一の組成物中に含まれている。いくつかの実施形態において、前記単離された細菌は、別個の組成物中に含まれている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するためのものである。
いくつかの実施形態は、アクチノバクテリア門細菌、テネリクテス門細菌およびバクテロイデス属細菌からなる群から選択される単離された細菌と、抗生物質とを含む組成物または組み合わせ製品を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記単離されたアクチノバクテリア門細菌を含み、該アクチノバクテリア門細菌はビフィドバクテリウム属を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、１０６ｃｆｕ以下、たとえば１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のファーミキューテス門細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品に含まれる抗生物質はリファマイシン系抗生物質である。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、リファマイシン系抗生物質を含むか、実質的にリファマイシン系抗生物質からなるか、またはリファマイシン系抗生物質からなる。いくつかの実施形態において、前記抗生物質は、前記単離された細菌とは別個の組成物中に含まれている。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、薬学的に許容される添加剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するためのものである。
いくつかの実施形態は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和を必要とする対象において、該症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和する方法であって、アクチノバクテリア門細菌、テネリクテス門細菌、バクテロイデス属細菌およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の細菌を含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための組成物を投与すべき対象群に属するとして前記対象を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記方法において前記対象にバクテロイデス属細菌が投与され、ハンチントン病に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される。いくつかの実施形態において、前記方法において前記対象にアクチノバクテリア門細菌が投与され、ハンチントン病に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される。いくつかの実施形態において、前記方法において前記対象にアクチノバクテリア門細菌およびバクテロイデス属細菌が投与され、レット症候群に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される。いくつかの実施形態において、前記バクテロイデス属細菌は、同時または別々に前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、アクチノバクテリア門細菌およびテネリクテス門細菌は同時または別々に前記対象に投与される。いくつかの実施形態による前記組成物または組み合わせ製品において、アクチノバクテリア門細菌はビフィドバクテリウム属を含む。いくつかの実施形態による前記組成物または組み合わせ製品において、前記バクテロイデス属細菌は、Ｂ．フラジリス（B.fragilis）、Ｂ．オバツス（B.ovatus）およびＢ．テタイオタオミクロン（B.thetaiotaomicron）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記単離された細菌は、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumからなる群から選択される細菌にマッピングされたOTUにマッピングされる細菌を含む。いくつかの実施形態において、細菌は、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％（たとえば少なくとも９７％、９８％または９９％）の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に該OTUにマッピングされる。いくつかの実施形態において、１０４ｃｆｕ以下、たとえば１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のファーミキューテス門細菌を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記抗生物質はリファマイシン系抗生物質である。
いくつかの実施形態は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和を必要とする対象において、該症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和する方法を含む。該方法は、前記対象に抗生物質を投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための組成物を投与すべき対象群に属するとして前記対象を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記抗生物質はリファマイシン系抗生物質である。いくつかの実施形態において、前記抗生物質は、リファキシミン系抗生物質を含むか、実質的にリファキシミン系抗生物質からなるか、またはリファキシミン系抗生物質からなる。いくつかの実施形態において、レット症候群に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される。いくつかの実施形態において、ハンチントン病に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される。いくつかの実施形態において、前記抗生物質の投与によって、前記対象における腸内細菌の量が少なくとも９５％（たとえば少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％、またはこれらの数値のいずか２つの間にある範囲）減少する。いくつかの実施形態において、前記方法は、アクチノバクテリア門細菌、テネリクテス門細菌、バクテロイデス属細菌およびこれらの組み合わせからなる群から選択される単離された細菌を含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記単離された細菌は、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumからなる群から選択される細菌にマッピングされたOTUにマッピングされる細菌を含む。いくつかの実施形態において、細菌は、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％（たとえば少なくとも９７％、９８％または９９％）の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に該OTUにマッピングされる。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌および前記バクテロイデス属細菌は前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌は前記対象に投与され、該アクチノバクテリア門細菌はビフィドバクテリウム属を含む。いくつかの実施形態において、前記バクテロイデス属細菌は前記対象に投与され、該バクテロイデス属細菌は、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツス、Ｂ．テタイオタオミクロンおよびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記単離された細菌は抗生物質と同時に投与される。いくつかの実施形態において、前記単離された細菌は、前記抗生物質とは異なる時間に投与される。いくつかの実施形態において、（ａ）前記抗生物質は前記細菌の投与前に投与されるか、または（ｂ）前記細菌が前記抗生物質の投与前に投与される。いくつかの実施形態において、１０４ｃｆｕ以下、たとえば１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のファーミキューテス門細菌を前記対象に投与する。
いくつかの実施形態は、対象由来試料のプロファイルを決定する方法を含む。該方法は、（ａ）テネリクテス門細菌、アクチノバクテリア門細菌およびファーミキューテス門細菌およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される腸内細菌の存在および／もしくはその量；（ｂ）コリン、5-HT、チロシン、ドーパミン、エピネフリンおよびこれらの２種以上からなる群から選択される神経伝達物質の血清中濃度；または（ｃ）Chrna2、Chrna7、Chrb4、Chrm1、Slc5a7、Chat、Ache、Slc18a3およびこれらの２種以上からなる群から選択されるコリン作動性遺伝子の発現量のうちの少なくとも１つを検出することを含む。前記プロファイルは、検出された（ａ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｂ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｃ）の存在および／もしくはその量、検出された（ａ）と（ｂ）の存在および／もしくはその量、検出された（ａ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｂ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量、または検出された（ａ）と（ｂ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記プロファイルの決定は、（ａ）を測定することを含み、前記試料は、前記対象の腸材料および／または糞便材料を含み、非レット症候群コントロール試料中の量と比較して、テネリクテス門細菌もしくはアクチノバクテリア門の量が少ないか、またはファーミキューテス門細菌の量が多いことから、レット症候群に罹患していること、またはレット症候群のリスクが高いことが示される。いくつかの実施形態において、前記プロファイルの決定は、（ｂ）を測定することを含み、前記試料は、前記対象の血清を含み、非レット症候群コントロール試料中の濃度と比較して、コリン、チロシンおよび／もしくはドーパミンの濃度が高いか、ならびに／または5-HTおよび／もしくはエピネフリンの濃度が低いことから、レット症候群に罹患していること、またはレット症候群のリスクが高いことが示される。いくつかの実施形態において、前記プロファイルの決定は、（ｃ）を測定することを含み、前記試料は、前記対象の核酸を含み、非レット症候群コントロール試料中の発現量と比較して、Chrna2、Chrna7、Chrb4、Chrm1、Slc5a7、Chat、Ache、Slc18a3またはこれらの２種以上の遺伝子の発現量が低いことから、レット症候群に罹患していること、またはレット症候群のリスクが高いことが示される。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門は、ビフィドバクテリウム属を含む。
図１Ａは、いくつかの実施形態に従った、リファキシミン（Rif）の非存在下または存在下でのショウジョウバエの３齢幼虫におけるmHDx1の凝集の免疫組織化学分析の結果を示した一連の写真である。図１Ｂは、様々なバッチのプールした幼虫におけるmHDx1の凝集をウエスタンブロット（WB）で調査した結果を示す写真である。図１Ｃは、成虫ハエを使用したこと以外は図１Ａと同様にして免疫組織化学分析を行った結果を示した一連の写真である。図１Ｄは、成虫ハエを使用したこと以外は図１Ｂと同様にして行ったWBの結果を示す。UAS（上流活性化配列）の下流のmHDx1（120Q）およびショウジョウバエ神経特異的プロモーターElavの下流のgal4トランス活性化因子を用いたGal4誘導システムを使用して、子孫の神経系においてmHDx1の発現を誘導した。図１Ｃに中枢脳領域を示す。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従った、ハンチントン病（HD）ハエに細菌を摂取させたことによる効果を示した一連のグラフである。図２Ａは、HDハエに大腸菌を摂取させることによって運動症状の発症が促進されることを示す。図２Ｂは、HDハエにラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus（LGG））を摂取させても運動症状に影響が認められないことを示す。図２Ｃは、抗微生物ペプチドのmRNAがHDハエにおいて上昇することを示す。図２Ｄは、ペニシリン−ストレプトマイシンによる腸内微生物の除去によってHDハエにおける運動障害が緩和されることを示す。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従った、HDハエに対する細菌の効果を示した一連の写真である。図３Ａは、オリゴマー（白矢印）を認識する抗Curli抗体を用いた、ショウジョウバエの腸の免疫組織化学分析を示す写真を示す。図３Ｂは、Curli+大腸菌を定着させた場合の凝集体のみを認識する抗体を用いた成虫586HDハエの染色を示す。図３Ｃは、図３Ｂと同様のハエに由来する試料をプールして分析したウエスタンブロット（WB）の結果示す写真である。図３Ｄは、Curli+大腸菌を定着させたハエの不動性を示すクライミングアッセイを示す。UASの下流の変異型HTTの586個のアミノ酸（120Q）からなるN末端断片および神経特異的プロモーターElavの下流のgal4トランス活性化因子を用いたGal4システムを使用して、子孫の神経系において発現を誘導した。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従った、WTショウジョウバエおよびHDショウジョウバエの脳切片を示す一連の写真である。オリゴマー特異的抗体（PHP2）を用いた、WT（コントロール）（図４Ａ）およびHD（図４Ｂ）の脳切片の電子顕微鏡（EM）解析を示す。オリゴマーの免疫金標識を黒色の点で示す。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って、リファキシミンで処置したレット症候群マウスおよびリファキシミンによる処置を行わなかったレット症候群マウスの特徴を示す一連の写真およびグラフである。図５Ａは、リファキシミンの存在下または非存在下におけるレット症候群マウスの営巣能力を示す。図５Ｂは、2分間の制限時間内において、リファキシミン処置マウスの方が、金網製の円筒を登ろうと試みた回数が多かったことを示すグラフである。図５Ｃは、ワイヤハングアッセイによって筋力を試験したことを示すグラフである。図５Ｄは、リファキシミンの存在下および非存在下におけるレット症候群マウスの後肢抱擁反射を示すグラフである。N＝6。採点および手順は、Southwellら（2009）による報告に従った。
いくつかの実施形態によるレット症候群マウスのダブルコルチンを染色した結果を示した一連の写真およびグラフである。図６Ａは、溶媒で処置したレット症候群マウス（上段のパネル）およびリファキシミンで処置したレット症候群マウス（下段のパネル）の両側海馬のダブルコルチン染色を示す。図６Ｂは、４匹の溶媒処置マウスおよび６匹のリファキシミン処置マウスから得た両側海馬（二層）の歯状回（DG）におけるダブルコルチン陽性細胞の定量を示す。
いくつかの実施形態によるレット症候群マウスを半定量PCRで分析した結果を示す写真である。半定量PCRの結果、雄性レット症候群マウスがテネリクテス門（Ten）を有していないこと、およびリファキシミン（Rif）による処置によってテネリクテス門の数が増加すること（下段のパネル）が示された。上段のパネルは、ポジティブコントロールとして使用した真正細菌の増幅を示す。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従った、MeCP2の免疫組織化学分析の結果を示した一連の写真である。図８Ａは、腸上皮においてMeCP2が発現していることを示す小腸の回腸部分の免疫組織化学分析の結果を示す（左側のパネル）。右側のパネルの下方の矢印は、陰窩細胞を示す。図８Ｂは、粘膜固有層細胞および腸神経系の筋層間神経叢において染色されたMeCP2を示す（上段のパネル）。下段のパネルは、レット症候群マウス（T158A）由来の同様の切片である。
いくつかの実施形態によるWTマウスおよびレット症候群マウスの腸を分析した結果を示した一連の写真およびグラフである。図９Ａおよび図９Ｂは、WTマウスおよびT158Aレット症候群マウスにおける小腸および大腸の長さの定量を示すグラフである。各ドットは１匹のマウスを示す。図９Ｃは、WTマウスおよびレット症候群マウスの代表的な消化管の写真である。図９Ｄおよび図９Ｅは、腸の長さの変化が若いマウスにおいて最も少なかったことを示すグラフである。図９Ｆは、WTマウス（左）およびT158A（右）レット症候群マウスの回腸を抗リゾチーム抗体で染色し、絨毛の基部の陰窩においてパネート細胞（矢印）を特定した代表的な切片を示す一対の写真である。DAPI染色を使用してすべての細胞を染色し、絨毛の構造を示す。
いくつかの実施形態によるWTマウス（左）およびレット症候群マウス（右）の腸上皮におけるブロモデオキシウリジン（BrdU）の取り込みを示す写真である。4週齢のマウスにBrdUを注射した。注射の24時間後に組織を採取し、処理し、BrdUを認識する抗体で染色し（図１０中において矢印で示していない明るい点として見られる）、増殖細胞のマーカーであるki67（矢印）を認識する抗体で染色した。増殖中の前駆細胞はBrdUで標識される。
WTマウスおよびレット症候群マウスの糞粒中の細菌門を解析した結果を示した一連のグラフおよび写真である。図１１Ａおよび図１１Ｂは、16S RNA配列分析によって測定された、WTマウス（図１１Ａ）およびT158Aマウス（図１１Ｂ）の糞粒中に存在する主要な細菌門の割合（％）を示すグラフである。赤色で示した細菌門は、２つの群の間で異なる。各群N=6とし、別々のケージで飼育した。図１１Ｃは、雄性レット症候群マウスにはビフィドバクテリウム属が存在しないことを示した半定量PCRの結果を示す写真である。図１１Ｄは、4ヶ月齢の雌性レット症候群マウスにおけるビフィドバクテリウム属の減少を示す写真である。
いくつかの実施形態によるWTマウスおよびレット症候群マウスの特徴を示す一連のグラフおよび写真である。レット症候群マウスは、透過した小腸、循環系における高濃度のリポ多糖（LPS）（図１２Ａ〜Ｄ参照）、腹部脂肪の過剰な蓄積（図１２Ｃ〜Ｄ参照）を有する。図１２Ｅは、腹部脂肪が見られない無菌WTマウスおよび無菌レット症候群マウスを示した代表的な写真である。図１２Ｆは、レット症候群マウスの腸の長さがWTと同程度であることを示す写真である。図１２Ｂおよび図１２Ｄにおいて各群はN=6である。
いくつかの実施形態によるWTマウスおよびレット症候群マウスの小腸の回腸部分におけるマクロファージの免疫染色を示す一連の写真である。マクロファージのマーカーであるIba-1（矢尻）およびF4/80（矢印）に対する抗体で免疫染色を行った。各列の写真は、各群の1匹のマウスに由来する代表的な写真である。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って、抗生物質カクテルでレット症候群マウスを処置した結果を示した一連の写真およびグラフである。図１４Ａは、抗生物質カクテル（ABX）でレット症候群マウスを処置すると、小腸（SI）の長さが改善され、これに対して、リファキシミン（Rif）で処置すると、結腸の長さが増加することを示すグラフである（図１４Ｂ〜Ｃ）。図１４Ａにおいて、各ドットは一匹のマウスを示す。図１４Ｃにおいて各群はN=6である。図１４Ｄは、ヘテロ接合型の雌性マウスにおける肥満の程度を示す。図１４Ｅ〜Ｆは、リファキシミンで雌性レット症候群マウスを処置したところ、体重の増加および腹部脂肪の蓄積が予防されたことを示す。図１４Ｅおよび図１４Ｆにおいて各群はN=6である。リファキシミンは、WTマウスの体重に対してわずかな効果しか示さない。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って、溶媒またはリファキシミンで処置したレット症候群マウスの皮質領域の脳切片の染色を示す一連の写真である。図１５Ａは、活性化アストロサイトのマーカーであるGFAP（中央の列）およびGS（右側の列）の染色を示し、GFAPとGSを重ね合わせたものを左側の列に示す。図１５Ｂは、海馬領域におけるミクログリアマーカーIba-1およびCD11の染色を示す。Iba-1およびCD11は、通常、海馬領域全体において共局在しているが、Iba-1は溶媒処置群において高発現されており（たとえば矢印参照）、リファキシミン処置群では低発現していた。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って、リファキシミンの存在下または非存在下におけるレット症候群マウスの行動を示した一連のグラフおよび写真である。図１６Ａは、リファキシミンの存在下または非存在下におけるレット症候群マウスの営巣能力を示す。図１６Ｂは、2分間の制限時間内において、リファキシミン処置マウスの方が、金網製の円筒を登ろうと試みた回数が多かったことを示す。図１６Ｃは、ワイヤハングアッセイによって筋力を試験したことを示す。図１６Ｄは、リファキシミンの存在下および非存在下におけるレット症候群マウスの後肢抱擁反射を示す。N=6。採点および手順は、Southwellら（2009）による報告に従った。
いくつかの実施形態によるWTマウスおよびレット症候群（T158A）マウスの両側海馬のダブルコルチン染色を示す一連の顕微鏡写真である。図１７Ａは、WTマウス（上段のパネル）およびレット症候群（T158A）マウス（下段のパネル）の両側海馬のダブルコルチン染色を示す一連の写真である。図１７Ｂは、雄性無菌WTマウス（上段のパネル）および雄性無菌T158Aマウスの同様の染色を示す一連の写真である。
本明細書に記載の実施形態のいくつかによるレット症候群マウスにおける神経新生に対する微生物叢の効果を示した一連のグラフおよび写真である。図１８Ａは、溶媒で処置したレット症候群マウス（上段のパネル）およびリファキシミンで処置したレット症候群マウス（下段のパネル）の両側海馬のダブルコルチン染色を示す一連の写真である。図１８Ｂは、4匹の溶媒処置マウスおよび6匹のリファキシミン処置マウスから得た両側海馬（二層）の歯状回におけるダブルコルチン陽性細胞の定量を示すグラフである。図１８Ｃは、溶媒で処置したレット症候群マウス（上段）およびリファキシミンで処置したレット症候群マウスのSVZ（脳室下帯）におけるki67陽性細胞（矢印）を示す一連の写真である。枠で囲まれた範囲は、劇的な変化のあった領域を示している（リファキシミン処置マウスにおいて大幅に多いki67陽性細胞が観察される）。ニューロンのNeuN染色（NeuN）が、明るい焦点として全体に観察される。
本明細書に記載の実施形態のいくつかによるWTマウスおよびレット症候群マウスにおける半定量PCRの結果を示す写真である。半定量PCRの結果、雄性レット症候群マウスがテネリクテス門（Ten）を有していないこと、およびリファキシミン（Rif）による処置によってテネリクテス門の数が増加すること（下段のパネル）が示された。上段のパネルは、ポジティブコントロールとして使用した真正細菌の増幅を示す。
いくつかの実施形態によるレット症候群マウスにおけるコリン作動性遺伝子の発現を示すグラフである。レット症候群マウスはコリン作動性遺伝子の発現が低下していることが示されている。
いくつかの実施形態によるレット症候群マウスの神経伝達物質の血清中濃度を示したグラフである。
本明細書において、ハンチントン病（本明細書において「HD」とも呼ぶ）またはレット症候群（本明細書において「レット」とも呼ぶ）に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための方法、組成物および組み合わせ製品について述べる。HDのショウジョウバエモデルにおいて微生物相を変化させるとHDの症状が悪化することがあるが、抗生物質を使用して腸内微生物を除去するとHDの症状が改善することが本明細書において観察される（たとえば実施例２参照）。これを踏まえ、いくつかの実施形態では、抗生物質および／または細菌を含む方法、組成物および組み合わせ製品を、HDに伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延、または該症状の緩和を目的として提供する。さらに、レット症候群マウスモデルの腸内微生物叢は、野生型マウスと比較して細菌種レベルおよび／または細菌門レベルで変化しており、かつ腸の形態も変化していることが観察される（たとえば実施例９および実施例１０参照）。一方、このマウスモデルに抗生物質を使用して腸内微生物を除去することによって、レット症候群マウスにおける生理学的症状および行動症状が緩和される（たとえば実施例１４〜１８参照）。したがって、本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、抗生物質および／または細菌を含む方法、使用、組成物および／または組み合わせ製品は、レット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延、または該症状の緩和を目的として提供される。また、対象由来試料のプロファイルを決定するための方法および組成物が提供され、この方法および組成物は、たとえば、レット症候群のリスクの上昇および／または存在を決定するのに有用である場合がある。
HD患者は消化管（GI）合併症を示す。しかしながら、HDにおける消化管障害の発症およびその重症度に関する研究は少ない（Andrichら、2009）。最近の研究では、消化管およびそこに生息する微生物（本明細書において「微生物叢」とも呼び、それらの集合的なゲノムは「マイクロバイオーム」とも呼ぶ）が、神経の発達、ニューロトロフィンおよび神経伝達物質の産生、ならびに挙動に影響を及ぼすことが実証されている（Dinanら、2016、Sherwinら、2016）。特定の理論に制限されるものではないが、本明細書において、腸内微生物叢の恒常性はHDの発症機序に寄与している可能性があると考えられる。
脳回路の障害はレット症候群の根本的な原因であるが、その他の臓器における障害および代謝異常が一定の役割を果たしている場合がある。レット症候群の発症機序における修飾因子として、免疫系および炎症経路における異常、コレステロール代謝および脂質代謝における異常、ならびにインスリン様成長因子１（IGF-1）および脳由来神経栄養因子（BDNF）によるシグナル伝達における異常が関わっている可能性がある（Tropeaら、2009、Buchoveckyら、2013、Cronkら、2015、Lombardiら、2015）。レット症候群患者は重篤な消化管（GI）合併症を示す（Motilら、2012）。最近の研究では、消化管およびそこに生息する微生物が、神経の発達、ニューロトロフィンおよび神経伝達物質の産生、ならびに挙動に影響を及ぼすことが実証されている（Sherwinら、2016）。特定の理論に制限されるものではないが、本明細書において消化管病変および腸内微生物叢の恒常性の変化は、レット症候群の発症機序に寄与している可能性があると考えられる。
組成物および組み合わせ製品
本明細書の様々な実施形態による、特定の細菌および／または抗生物質（たとえば、リファマイシン系抗生物質、たとえばリファキシミン；抗生物質のさらなる例示は後述する）を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物および／または組み合わせ製品は、ハンチントン病またはレット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延および／または該症状の緩和に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物に含まれる各成分は、「組み合わせ製品」として別個に提供することができる。この組み合わせ製品では、各成分が２つ以上の前駆組成物として提供され、これらの前駆組成物を組み合わせて最終組成物を形成してもよいし（たとえば、特定の細菌と別の細菌および／または１種以上の抗生物質とを混合して、細菌および／または抗生物質の混合物を含む最終組成物とする）、あるいは前駆組成物を併用することによって単一の組成物と類似の効果を達成してもよい（たとえば、細菌と１種以上の抗生物質とを対象に同時または連続して投与する）。したがって、２種以上の成分を含む組成物が本明細書に記載されている場合、集合的に組成物の各成分を含む対応する「組み合わせ製品」も明確に意図される。さらに、本明細書において述べるように、前記組成物および／または組み合わせ製品は、ハンチントン病（本明細書において「HD」とも呼ぶ）もしくはレット症候群（本明細書において「レット」とも呼ぶ）に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延もしくは該症状の緩和のための使用において投与することができ、またはハンチントン病もしくはレット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性を低減するか、該症状の発症を遅延させるか、もしくは該症状の緩和する方法において投与することができる。
ショウジョウバエHDモデルへの大腸菌の投与により腸内微生物叢を調節することによって、HDの運動症状が悪化しうることが本明細書において観察される（たとえば実施例２および実施例３参照）。一方、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って、（腸内細菌の低減および／または除去のために）抗生物質であるペニシリン−ストレプトマイシンでショウジョウバエHDモデルを処置すると、中枢神経系（CNS）においてハンチンチン凝集体の蓄積が減少し、HDの運動症状が緩和されうる（たとえば実施例３参照）。したがって、本明細書に記載の実施形態のいくつかによる細菌および／または抗生物質を含む組成物は、HDに伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延および／または該症状の緩和に有用であると考えられる。また、腸内微生物叢は野生型マウスとレット症候群の遺伝マウスモデルとの間で異なることが観察される（実施例９参照）。さらに、糞便試料中の特定の細菌門および細菌種は、野生型マウスとレット症候群モデルとで異なり、一部の種および／または門はレット症候群マウスの腸内に過剰に含まれるが、その他の種および／または門は通常よりも少ない（図７、図１１Ａ〜Ｄ）。特に、レット症候群マウスにおいて、テネリクテス門（Tenericutes）細菌およびアクチノバクテリア門（Actinobacteria）細菌は、コントロール（野生型）マウスよりも有意に少なく、ファーミキューテス門（Firmicutes）細菌はコントロール（野生型）マウスよりも有意に多いことが本明細書において報告されている（実施例８および図１１Ａ〜Ｄ参照）。また、レット症候群マウスの消化管において、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）（アクチノバクテリア門に含まれる細菌属）は約６週齢から排除され始める（実施例８、図７）。レット症候群マウスと野生型（コントロール）マウスとで差次的な発現が認められた細菌を以下の表１に示す。さらに、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って、リファキシミンを含む抗生物質でレット症候群マウスを処置すると、全身性炎症が低下し、アストロサイトおよびミクログリアを含む中枢神経系の形態に影響が見られ、レット症候群モデルに伴う行動障害（たとえば、営巣、登攀および筋力における障害）が緩和された（実施例１４〜１６参照）。したがって、本明細書に記載の実施形態のいくつかによる、細菌および／または抗生物質を含む組成物は、レット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の治療、該症状の発症の遅延および／または該症状の緩和に有用である。
いくつかの実施形態において、組成物または組み合わせ製品は細菌を含むか、実質的に細菌からなるか、または細菌からなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、アクチノバクテリア門細菌（たとえば、Bifidobacterium choerinumなどのビフィドバクテリウム属）、テネリクテス門細菌（たとえば、Mesoplasma entomophilumなどのMesoplasma属細菌）およびバクテロイデス属細菌（たとえば、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／またはＢ．テタイオタオミクロン）のうちの少なくとも２種を含む単離された細菌を含む。たとえば、いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、アクチノバクテリア門細菌およびバクテロイデス属細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、ビフィドバクテリウム属およびバクテロイデス属を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、アクチノバクテリア門細菌およびテネリクテス門細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、ビフィドバクテリウム属およびテネリクテス門を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、テネリクテス門細菌およびバクテロイデス属細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、アクチノバクテリア門細菌、テネリクテス門細菌およびバクテロイデス属細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、ビフィドバクテリウム属細菌、テネリクテス門細菌およびバクテロイデス属細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、アクチノバクテリア門細菌を含み、該アクチノバクテリア門細菌はビフィドバクテリウム属を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、バクテロイデス属細菌を含み、該バクテロイデス属細菌は、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツス、Ｂ．テタイオタオミクロンおよびこれらの２種以上の組み合わせ（たとえば、Ｂ．フラジリスとＢ．オバツスの組み合わせ；Ｂ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；Ｂ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；またはＢ．フラジリスとＢ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、テネリクテス門細菌を含み、該テネリクテス門細菌は、Mesoplasma属細菌（Mesoplasma entomophilumなど）を含むか、実質的にMesoplasma属細菌からなるか、またはMesoplasma属細菌からなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品に含まれる細菌は、単一の組成物中に一緒に含まれている。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品に含まれる細菌は、２つ以上の別個の組成物に含まれており、これらの組成物は、任意で、使用前または使用時に混合することができる。いくつかの実施形態において、別個の組成物は別々に使用（投与）することができる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するためのものである。任意で、前記組成物または組み合わせ製品は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための前記組成物（または組み合わせ製品）を投与すべき対象群に属するとして選択された対象において使用することもできる。たとえば、本明細書に記載されているような、対象由来試料のプロファイルは、レット症候群もしくはハンチントン病が存在していること、もしくはレット症候群もしくはハンチントン病のリスクが高いことを示すことができ、かつ／または本明細書に記載の細菌および／もしくは抗生物質を含む組成物もしくは組み合わせ製品を使用した治療によって対象を改善可能であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するためのものである。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、ハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するためのものである。
いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、本明細書に記載の抗生物質（たとえばリファマイシン系抗生物質（たとえばリファキシミン）など；抗生物質のさらなる例示は後述する）と、アクチノバクテリア門細菌（たとえば、Bifidobacterium choerinumなどのビフィドバクテリウム属）、テネリクテス門細菌（たとえば、Mesoplasma entomophilumなどのMesoplasma属細菌）、バクテロイデス属細菌（たとえばＢ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／またはＢ．テタイオタオミクロン）およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される単離された細菌とを含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記抗生物質（たとえば、リファキシミンなどのリファマイシン系抗生物質；抗生物質のさらなる例示は後述する）と、２種以上の細菌（たとえば、アクチノバクテリア門細菌とバクテロイデス属細菌の組み合わせ；アクチノバクテリア門細菌とテネリクテス門細菌の組み合わせ；テネリクテス門細菌とバクテロイデス属細菌の組み合わせ；またはアクチノバクテリア門細菌とテネリクテス門細菌とバクテロイデス属細菌の組み合わせ）を含むか、または実質的にこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、アクチノバクテリア門細菌を含み、該アクチノバクテリア門細菌は、ビフィドバクテリウム属を含むか、実質的にビフィドバクテリウム属からなるか、またはビフィドバクテリウム属からなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記抗生物質とビフィドバクテリウム属とバクテロイデス属（たとえばＢ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／またはＢ．テタイオタオミクロン）を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。前記抗生物質はリファキシミンであってもよい。いくつかの実施形態における組み合わせ製品において、前記抗生物質は、前記単離された細菌とは別個の組成物中に含まれている。
特定の理論に制限されるものではないが、本明細書に記載の細菌の組み合わせは相乗的なプロバイオティクス効果を発揮して、たとえば、レット症候群および／またはハンチントン病の症状を緩和したり、これらの症状の発症を遅延させたり、これらの症状の発症の可能性を低減したりすることができると考えられる。ビフィドバクテリウム属に属する２種の細菌（Bifidobacterium longumおよびBifidobacterium animalis）は、Ｂ．フラジリスにより発酵基質として使用されるエキソポリサッカライド（EPS）を産生することが報告されている（Rios-Covian et al., 2016, BMC Microbiology 16: 150、この文献は参照によってその全体が本明細書に援用される）。
いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するためのものである。前記組成物または組み合わせ製品は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための前記組成物（または組み合わせ製品）を投与すべき対象群に属するとして選択された対象において使用することもできる。たとえば、本明細書に記載されているような、対象由来試料のプロファイルは、レット症候群もしくはハンチントン病が存在していること、またはレット症候群もしくはハンチントン病のリスクが高いことを示すことができる。たとえば、本明細書に記載されているような、対象由来試料のプロファイルは、レット症候群もしくはハンチントン病が存在していること、もしくはレット症候群もしくはハンチントン病のリスクが高いことを示すことができ、かつ／または本明細書に記載の細菌および／もしくは抗生物質を含む組成物もしくは組み合わせ製品を使用した治療によって対象を改善可能であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、レット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するためのものである。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、ハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するためのものである。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、表１に示すレット症候群において発現が低下している１種以上の細菌（たとえばMesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinum）を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumからなる群から選択される細菌にマッピングされたOTUにマッピングされる１種以上の細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。たとえば、前記組成物は、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumのいずれかにマッピングされたOTUにマッピングされる少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種または１０種（またはこれらの数値のいずれか２つの間にある範囲（たとえば、１〜３種、１〜５種、１〜１０種、２〜３種、２〜５種、２〜１０種、３〜５種または３〜１０種））の細菌を含むことができる（前記組成物または組み合わせ製品に含まれる複数種の細菌は、同じまたは異なるOTUにマッピングされてもよいことには留意されたい）。
いくつかの実施形態において、細菌は、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に該OTUにマッピングされる。いくつかの実施形態において、細菌は、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に該OTUにマッピングされる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物もしくは組み合わせ製品、使用または方法に含まれる細菌は単離された細菌である。本明細書において、「単離された」細菌という用語は、この用語の派生元の用語の変化形を含み、本開示に基づく当業者に公知の従来の通常の意味を有する。「単離された」細菌とは、この細菌が本来生息する生育環境から切り離され、かつ／またはこの細菌が本来生息する割合では存在しない細菌を指す。「単離された」細菌は、その他の物質を全く含まない組成物に含まれている必要はない。たとえば、本出願における単離された細菌の一例として、本来生息する生育環境外で培養された細菌が挙げられる。また、たとえば、「単離された」細菌の別の一例として、消化管外に存在し、かつ未処理の糞便試料からも分離された腸内細菌が挙げられる。一方、未処理の糞便試料または腸内容物試料中の腸内細菌は、本出願における「単離された」細菌の一例ではない。したがって、いくつかの実施形態において、単離された細菌（たとえば、アクチノバクテリア門細菌、テネリクテス門細菌および／またはバクテロイデス属細菌）は、糞便試料の一部を構成せず、腸内容物試料の一部でもない。
いくつかの実施形態において、前記組成物、前記組み合わせ製品、前記使用および／または前記方法は、マイクロバイオーム移植、プロバイオティクス治療または同等の処置のための標準的な方法で投与された場合に、ヒト対象の腸内でコロニー（たとえば、接種後少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間またはこれ以上にわたって持続するコロニー）を確立するのに十分な量の細菌を含む。このような量の細菌は、本明細書において「接種物」と呼ぶこともある。いくつかの実施形態において、前記組成物、前記組み合わせ製品、前記使用または前記方法における細菌の量としては、少なくとも１０４コロニー形成単位（ｃｆｕ）が挙げられ、たとえば、少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕ、１０８ｃｆｕ、１０９ｃｆｕ、１０１０ｃｆｕ、１０１１ｃｆｕ、１０１２ｃｆｕ、１０１３ｃｆｕ、またはこれらの数値のいずれかの間にある範囲の量であり、たとえば、１０４〜１０８ｃｆｕ、１０４〜１０９ｃｆｕ、１０４〜１０１０ｃｆｕ、１０４〜１０１１ｃｆｕ、１０４〜１０１２ｃｆｕ、１０４〜１０１２ｃｆｕ、１０５〜１０８ｃｆｕ、１０５〜１０９ｃｆｕ、１０５〜１０１０ｃｆｕ、１０５〜１０１１ｃｆｕ、１０５〜１０１２ｃｆｕ、１０５〜１０１２ｃｆｕ、１０６〜１０８ｃｆｕ、１０６〜１０９ｃｆｕ、１０６〜１０１０ｃｆｕ、１０６〜１０１１ｃｆｕ、１０６〜１０１２ｃｆｕ、１０６〜１０１２ｃｆｕ、１０７〜１０８ｃｆｕ、１０７〜１０９ｃｆｕ、１０７〜１０１０ｃｆｕ、１０７〜１０１１ｃｆｕ、１０７〜１０１２ｃｆｕ、１０７〜１０１２ｃｆｕ、〜１０９ｃｆｕ、１０８〜１０１０ｃｆｕ、１０８〜１０１１ｃｆｕ、１０８〜１０１２ｃｆｕまたは１０８〜１０１２ｃｆｕが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記組成物、前記組み合わせ製品、前記使用および／または前記方法は、前記対象に投与するための対数増殖期（３７℃）の細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物、前記組み合わせ製品、前記使用および／または前記方法は、前記対象に投与するための静止期（３７℃）の細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物、前記組み合わせ製品、前記使用および／または前記方法の細菌は、単離された細菌である。
ファーミキューテス門細菌（たとえば、Lactobacillus hayakitensisやLactobacillus intestinalisなどのラクトバチルス属）は、レット症候群マウスの糞便試料において有意に増加していることに注目されたい。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品、使用および／または方法は、ファーミキューテス門細菌（たとえば、Lactobacillus hayakitensisやLactobacillus intestinalisなどのラクトバチルス属）を含まないか、またはファーミキューテス門細菌を実質的に含んでいない。本明細書において「実質的に含んでいない」という用語は、この用語の派生元の用語の変化形を含み、本開示に基づく当業者に公知の従来の通常の意味を有する。「実質的に含んでいない」とは、微量以下の物質（たとえばファーミキューテス門などの細菌）を含む組成物および／もしくは組み合わせ製品（本明細書に記載の使用または方法のための組成物および／もしくは組み合わせ製品であってもよい）、ならびに／または対象に対して効果（たとえば、行動に対する効果）が認められない量の物質もしくはその存在を指す。たとえば、いくつかの実施形態において、特定の細菌を実質的に含んでいない組成物および／または組み合わせ製品は、約１０６ｃｆｕ以下、たとえば、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下の細菌しか実質的に含んでいない。いくつかの実施形態において、細菌を実質的に含んでいない組成物および／または組み合わせ製品は、約１０６ｃｆｕ以下、たとえば、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下の細菌しか含んでいない。いくつかの実施形態において、特定の細菌を実質的に含んでいない組成物および／または組み合わせ製品は、約１０４ｃｆｕ以下の細菌しか含んでいない。したがって、本明細書に記載の実施形態のいくつかによる組成物、方法および使用による、ファーミキューテス門を実質的に含んでいない組成物および／または組み合わせ製品は、微量のファーミキューテス門を含んでいてもよく、かつ／または対象の行動に対して効果が認められない量のファーミキューテス門を含んでいてもよく、そのような量でファーミキューテス門が存在していてもよい。たとえば、いくつかの実施形態において、組成物または組み合わせ製品が、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のファーミキューテス門しか含んでいない場合、該組成物または組み合わせ製品はファーミキューテス門を実質的に含んでいない。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のファーミキューテス門を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のラクトバチルス属（ファーミキューテス門に含まれる細菌属）、たとえば、Lactobacillus hayakitensisおよび／またはLactobacillus intestinalisを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および／または組み合わせ製品（本明細書に記載の使用および／または方法のため組成物および／または組み合わせ製品を含む）は、栄養素もしくは細菌を培養する培地、またはコロニーの確立に成功する確率を高めるさらなる栄養素を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および／または組み合わせ製品（本明細書に記載の使用および／または方法のための組成物および／または組み合わせ製品を含む）は、薬学的に許容される担体または添加剤を含む。「薬学的に許容される」担体は、本開示に基づく当業者に公知の従来の通常の意味を有し、細胞または哺乳動物に使用される用量および濃度で細胞または哺乳動物に対して毒性を示さない担体を含む。本明細書に記載の方法、使用、組成物および組み合わせ製品における「薬学的に許容される」担体としては、経口適用または注射などの選択した使用方法に適した有機もしくは無機の固体または液体の添加剤が挙げられるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される」担体は、慣用の医薬製剤の形態で投与され、慣用の医薬製剤としては、錠剤、粒剤、散剤、カプセル剤などの固体製剤、および液剤、乳剤、懸濁剤などの液体製剤が挙げられる。多くの場合、生理学的に許容される担体は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などのpH緩衝水溶液である。また、生理学的に許容される担体は、アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子（残基数約１０未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリンなどの糖類；EDTAなどのキレート剤；マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；およびTweenTM界面活性剤、ポリエチレングリコール（PEG）、PluronicTM界面活性剤などの非イオン性界面活性剤のうち１つ以上を含んでいてもよい。また、助剤、安定化剤、乳化剤、滑沢剤、結合剤、pH調整・制御剤、等張化剤などの慣用の添加剤を前記担体に添加してもよい。いくつかの実施形態において、前記組成物は、経口投与、直腸投与、または経口投与と直腸投与の両方を目的として製剤化される。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、プロバイオティクスを含むか、実質的にプロバイオティクスからなるか、またはプロバイオティクスからなる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および／または組み合わせ製品は、抗生物質、たとえば、リファマイシン系抗生物質（たとえばリファキシミン）、ペニシリンまたはストレプトマイシン（さらなる抗生物質の例は後述する）を含む。いくつかの実施形態において、前記組み合わせ製品に含まれる抗生物質は、前記細菌とは別個の組成物中に含まれている。いくつかの実施形態において、前記細菌および抗生物質は、単一の組成物中に一緒に含まれている。いくつかの実施形態において、前記細菌は単一の組成物中に一緒に含まれており、前記抗生物質は別個の組成物または別個の一連の組成物中に含まれている。いくつかの実施形態において、前記細菌は２つ以上の異なる組成物中に含まれており、前記抗生物質は別個の組成物または別個の一連の組成物中に含まれている。いくつかの実施形態において、前記組成物および／または組み合わせ製品は抗生物質を含み、該抗生物質はリファキシミンを含むか、実質的にリファキシミンからなるか、またはリファキシミンからなる。特定の理論に制限されるものではないが、リファキシミンは腸特異的な抗菌作用を発揮することが示されていることに注目されたい。さらに、リファキシミンを使用してヒト微生物叢を処置することによって、本明細書で述べているように、レット症候群マウスにおいて減少しているビフィドバクテリウム属など（実施例８、図１１Ｃ参照）のプロバイオティクス種の増殖が促進されることが報告されている（Maccafferiiら、2010）。特定の理論に制限されるものではないが、リファキシミンは、その他の細菌の組成を変化させることによってビフィドバクテリウム属に対する保護作用を発揮する場合があると考えられる（実施例１８参照）。さらに、リファキシミンは、レット症候群マウスにおいて減少しているテネリクテス門の存在量を増加させたことが本明細書において示されている（実施例１８ならびに図１１および図１９）。したがって、いくつかの実施形態において、前記組成物および／または組み合わせ製品は、宿主に投与した場合に、その他の細菌に対しては抗菌作用を発揮するとともに、アクチノバクテリア門細菌（たとえばビフィドバクテリウム属）および／またはテネリクテス門細菌の量を増加させるのに十分な量のリファキシミンを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物および／または組み合わせ製品は、宿主に投与した場合に、その他の細菌に対する抗菌作用を発揮するとともに、アクチノバクテリア門細菌（たとえばビフィドバクテリウム属）および／またはテネリクテス門細菌の量を増加させるのに十分な量の抗生物質を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物および／または組み合わせ製品は、前記対象においてテネリクテス門細菌の増殖を促進するのに十分な量のリファキシミンを含む。前記組成物または組み合わせ製品は、このような量を含む単位用量で提供することができる。いくつかの実施形態において、前記組成物および／または組み合わせ製品は、前記対象においてビフィドバクテリウム属細菌の増殖を促進するのに十分な量のリファキシミンを含む。前記組成物または組み合わせ製品は、このような量を含む単位用量で提供することができる。いくつかの実施形態において、前記組成物および／または組み合わせ製品は、対象の腸内微生物叢を除去または実質的に除去するのに十分な量の抗生物質を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物および／または組み合わせ製品は、前記対象における腸内微生物の総量を少なくとも８０％、たとえば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％減少させるのに十分な量の抗生物質を含む。
抗生物質
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および／または組み合わせ製品（レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための使用および方法のための組成物および／または組み合わせ製品を含む）は、抗生物質を含み、該抗生物質は、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラン酸（アモキシシリン＋クラブラン酸）、アンピシリン、ベンザチンベンジルペニシリン、ベンジルペニシリン、セファレキシン、セファゾリン、セフィキシム、セフォタキシム、セフトリアキソン、クロキサシリン、ペニシリン、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、ピペラシリン／タゾバクタム、プロカインベンジルペニシリン、セフタジジムα、メロペネムα、アズトレオナムα、イミペネム／シラスタチン、アミカシン、アジスロマイシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、メトロニダゾール、ニトロフラントイン、スペクチノマイシン、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、トリメトプリム、バンコマイシン、クロファジミン、ダプソン、リファンピシン、エタンブトール／イソニアジド、エタンブトール／イソニアジド／ピラジナミド／リファンピシン、エタンブトール／イソニアジド／リファンピシン、イソニアジド、イソニアジド／ピラジナミド／リファンピシン、イソニアジド／リファンピシン、ピラジナミド、リファブチン、リファンピシン、リファペンチン、アミカシン、ベダキリン、カプレオマイシン、クロファジミン、シクロセリン、デラマニド、エチオナミド、カナマイシン、レボフロキサシン、リネゾリド、モキシフロキサシン、ｐ−アミノサリチル酸、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、リファキシミン、ストレプトマイシン、およびこれらの抗生物質の２種以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および／または組み合わせ製品（レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための使用および方法のための組成物および／または組み合わせ製品を含む）は、リファマイシン系抗生物質を含む。本明細書に記載の組成物および／または組み合わせ製品（レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための使用および方法のための組成物および／または組み合わせ製品を含む）に好適なリファマイシン系抗生物質の例としては、リファンピシン（またはリファンピン）、リファブチン、リファペンチン、リファラジルおよびリファキシミンが挙げられるが、これらに限定されない。
細菌を投与することを含む、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性を低減するか、該症状の発症を遅延するか、または該症状を緩和する方法
いくつかの実施形態は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和を必要とする対象において、該症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和する方法を含む。該方法は、本明細書に記載の、細菌を含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、アクチノバクテリア門細菌（たとえば、Bifidobacterium choerinumなどのビフィドバクテリウム属）、テネリクテス門細菌（たとえば、Mesoplasma entomophilumなどのMesoplasma属細菌）、バクテロイデス属細菌（たとえばＢ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／またはＢ．テタイオタオミクロン）およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される１種以上の細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、アクチノバクテリア門細菌（たとえば、Bifidobacterium choerinumなどのビフィドバクテリウム属）とテネリクテス門細菌（たとえば、Mesoplasma entomophilumなどのMesoplasma属細菌）を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、アクチノバクテリア門細菌（たとえば、Bifidobacterium choerinumなどのビフィドバクテリウム属）と、バクテロイデス属細菌（たとえば、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／もしくはＢ．テタイオタオミクロン、またはこれらの２種以上の組み合わせ、たとえば、Ｂ．フラジリスとＢ．オバツスの組み合わせ；Ｂ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；Ｂ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；またはＢ．フラジリスとＢ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ）とを前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、バクテロイデス属細菌（たとえば、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／もしくはＢ．テタイオタオミクロン、またはこれらの２種以上の組み合わせ、たとえば、Ｂ．フラジリスとＢ．オバツスの組み合わせ；Ｂ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；Ｂ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；またはＢ．フラジリスとＢ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ）とビフィドバクテリウム属とを前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の細菌および抗生物質（たとえば、本明細書に記載の抗生物質、たとえば、リファンピシン（またはリファンピン）、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、リファキシミンなどのリファマイシン系抗生物質）を含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記細菌は単一の組成物の形態で投与される。いくつかの実施形態において、前記細菌は組み合わせ製品の形態で投与され、この組み合わせ製品中に含まれる各成分は、同時または異なる時間に投与することができる。いくつかの実施形態において、前記細菌は組み合わせ製品の形態で投与され、この組み合わせ製品に含まれる各成分は、（たとえば混合物として）一緒に投与することができ、または（同時にまたは異なる時間において）別々に投与することができる。いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和させ、レット症候群に伴う１つ以上の症状としては、たとえば、運動機能障害、消化管合併症、過剰な腹部脂肪、循環系におけるリポ多糖（LPS）量の増加、脳の縮小および／またはニューロトロフィン量の減少が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和させるための方法であり、海馬および／もしくは脳室下帯の神経新生および樹状突起の分枝を促進し、かつ／またはアストロサイトおよびミクログリアの活性化を低減させる。いくつかの実施形態において、前記方法は、ハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和する。前記方法によって発症する可能性を低減することができるか、発症を遅延することができるか、または緩和することができるハンチントン病に伴う症状の例としては、運動機能障害、および／またはCNSにおける変異型ハンチンチンタンパク質の凝集が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記方法は、中枢神経系（たとえば海馬および／または脳室下帯）において神経新生および樹状突起の分枝を促進し、かつ／またはハンチントン病患者においてアストロサイトおよびミクログリアの活性化を低減させる。いくつかの実施形態において、前記対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための前記組成物（または組み合わせ製品）を投与すべき対象群に属するとして前記対象を選択することをさらに含む。たとえば、本明細書に記載されているような、対象由来試料のプロファイルは、レット症候群もしくはハンチントン病が存在していること、またはレット症候群もしくはハンチントン病のリスクが高いことを示すことができる。したがって、いくつかの実施形態において、前記方法は、前記組成物（または組み合わせ製品）を投与すべき対象群に属するとして対象を選択するために、（本明細書に記載の）対象由来試料のプロファイルを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、前記組成物（または組み合わせ製品）を投与すべきレット症候群に罹患しているか、またはそのリスクがある個体集団サブセットのメンバーであるとして特定される。いくつかの実施形態において、前記対象は、本明細書に記載の細菌および／または抗生物質を含む組成物および／または製品組成物を使用した処置に感受性を示すレット症候群を有する対象の亜集団のメンバーである。前記特定は、前記対象の腸内微生物叢の組成に基づいて行うことができる（たとえば、本明細書において述べるように対象由来試料のプロファイルを決定することにより測定することができる）。いくつかの実施形態において、前記対象は、前記組成物（または組み合わせ製品）を投与すべきハンチントン病に罹患しているか、またはそのリスクがある個体集団サブセットのメンバーとして特定される。いくつかの実施形態において、前記対象は、本明細書に記載の細菌および／または抗生物質を含む組成物および／または製品組成物を使用した処置に感受性を示すハンチントン病を有する対象の亜集団のメンバーである。前記特定は、前記対象の腸内微生物叢の組成に基づいて行うことができる（たとえば、本明細書において述べるように対象由来試料のプロファイルを決定することにより測定することができる）。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ハンチントン病に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和し、バクテロイデス属細菌を含むか、実質的にバクテロイデス属細菌からなるか、またはバクテロイデス属細菌からなる組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与する。前記バクテロイデス属細菌は、本明細書で述べるように、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／もしくはＢ．テタイオタオミクロンまたはこれらの２種以上の組み合わせを含んでいてもよいか、実質的にこれらからなっていてもよいか、またはこれらからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、本明細書に記載のアクチノバクテリア門細菌（たとえば、Bifidobacterium choerinumなどのビフィドバクテリウム属）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ハンチントン病に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和し、アクチノバクテリア門を含むか、実質的にアクチノバクテリア門からなるか、またはアクチノバクテリア門からなる組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌は、ビフィドバクテリウム属（たとえばBifidobacterium choerinum）を含むか、実質的にビフィドバクテリウム属からなるか、またはビフィドバクテリウム属からなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品はバクテロイデス属細菌（たとえば、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／もしくはＢ．テタイオタオミクロン、またはこれらの２種以上の組み合わせ、たとえば、Ｂ．フラジリスとＢ．オバツスの組み合わせ；Ｂ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；Ｂ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；またはＢ．フラジリスとＢ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和し、アクチノバクテリア門細菌（たとえば、Bifidobacterium choerinumなどのビフィドバクテリウム属）と、バクテロイデス属細菌（たとえば、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツスおよび／もしくはＢ．テタイオタオミクロン、またはこれらの２種以上の組み合わせ、たとえば、Ｂ．フラジリスとＢ．オバツスの組み合わせ；Ｂ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；Ｂ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；またはＢ．フラジリスとＢ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ）とを含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらなる組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、ビフィドバクテリウム属細菌およびバクテロイデス属細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。
前記方法の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に記載の、アクチノバクテリア門細菌（たとえばビフィドバクテリウム属）とバクテロイデス属細菌とを含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌および前記バクテロイデス属細菌を同時に前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌および前記バクテロイデス属細菌を別々に前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌および前記バクテロイデス属細菌は同時または別々に前記対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌は、ビフィドバクテリウム属を含むか、実質的にビフィドバクテリウム属からなるか、またはビフィドバクテリウム属からなる。いくつかの実施形態において、前記バクテロイド属細菌は、本明細書で述べるように、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツス、Ｂ．テタイオタオミクロンおよびこれらの２種以上の組み合わせ（たとえば、Ｂ．フラジリスとＢ．オバツスの組み合わせ；Ｂ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；Ｂ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ；またはＢ．フラジリスとＢ．オバツスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせ）からなる群から選択される。
前記方法の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に記載の、アクチノバクテリア門細菌（たとえばビフィドバクテリウム属）とテネリクテス門細菌とを含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌および前記テネリクテス門細菌を同時に前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌および前記テネリクテス門細菌を異なる時間に前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌および前記テネリクテス門細菌を同時にまたは異なる時間に前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記アクチノバクテリア門細菌は、ビフィドバクテリウム属を含むか、実質的にビフィドバクテリウム属からなるか、またはビフィドバクテリウム属からなる。
前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記対象に投与される組成物または組み合わせ製品は、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumからなる群から選択される細菌にマッピングされたOTUにマッピングされる細菌を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。表１に示したように、表に示した各細菌は、野生型（コントロール）マウスと比較して、レット症候群マウスにおいて低発現されている。いくつかの実施形態において、細菌は、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％の同一性（たとえば、少なくとも９７％、９８％または９９％の同一性）を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に該OTUにマッピングされる。
いくつかの実施形態において、１０６ｃｆｕ以下のファーミキューテス門細菌を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、１０５ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のファーミキューテス門細菌を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、前記対象に投与される前記組成物または組み合わせ製品は、ファーミキューテス門細菌を実質的に含まないか、またはファーミキューテス門細菌を全く含まない。実施例８で述べたように、レット症候群マウスの腸においてファーミキューテス門は有意に増加しており、したがって、特定の理論に制限されるものではないが、ファーミキューテス門を全く含まないか、またはファーミキューテス門を実質的に含まない組成物は、腸内微生物叢のプロファイルをレット症候群に見られるものとは異なるように改変するのに有用だと考えられる。
本明細書に記載の方法において使用される組成物および／または組み合わせ製品の投与経路として様々な経路が考えられる。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記組成物および／または組み合わせ製品は、経口投与、直腸投与、経皮投与、鼻腔内投与、静脈内投与、皮下投与および／または吸入によって前記対象に投与される。
抗生物質を投与することを含む、レット症候群またはハンチントン病に伴う1つ以上の症状を発症する可能性を低減するか、該症状の発症を遅延するか、または該症状を緩和する方法
抗生物質の投与によって、レット症候群の遺伝モデルの症状（実施例１４および実施例１５参照）およびハンチントン病の遺伝モデルの症状（実施例１および実施例２参照）を緩和できることが本明細書において報告されている。特に、離乳後のレット症候群マウスをリファキシミンで６週間処置することにより腸内微生物を低減または除去したところ、このマウスは、金網製の円筒を登ろうと試みた回数がより多く、筋力がより強く、かつ抱擁反射の表現型が減少していることから（実施例１６、図１６Ｂ〜Ｄ）、レット症候群モデルの運動症状を改善できることが示された。また、レット症候群マウスをリファキシミンで処置することによって、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）やグルタミン合成酵素（GS）などのバイオマーカーの染色が、溶媒処置コホートと比較して低下した（実施例１５および図１５Ａ）。さらに、離乳後のレット症候群マウスをリファキシミンで６週間処置することによって、結腸が選択的に伸長され、消化管肥満が予防される（実施例１４および図１４Ｂ〜Ｃ）。ハンチントン病ショウジョウバエの遺伝モデルを抗生物質（リファキシミンなど）で処置した場合でも、幼虫および生体ハエのCNSにおいて変異型ハンチンチン（mHDx1）タンパク質の凝集が減少し、ハンチントン病の運動症状が改善された（実施例３、図１）。また、ハンチントン病ショウジョウバエに抗生物質としてペニシリン−ストレプトマイシンを投与すると、運動症状が同様に改善されたことが観察された（実施例３、図２Ｄ）。一方、ショウジョウバエモデルに大腸菌を投与したところ、ハンチントン病の運動症状が悪化した（実施例３、図２Ａ）。いくつかの実施形態において、前記対象はヒトである。
したがって、いくつかの実施形態は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和を必要とする対象において、該症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和する方法であって、本明細書に記載の抗生物質（たとえば、本明細書に記載の抗生物質、たとえば、リファンピシン（またはリファンピン）、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、リファキシミンなどのリファマイシン系抗生物質）を前記対象に投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態において、前記抗生物質は、リファキシミンを含むか、リファキシミンからなるか、または実質的にリファキシミンからなる。いくつかの実施形態において、前記抗生物質は、本明細書に記載の抗生物質または本明細書に記載の２種以上の抗生物質の組み合わせ（たとえばペニシリンとストレプトマイシンの組み合わせ）を含むか、これらからなるか、または実質的にこれらからなる。いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和させ、レット症候群に伴う１つ以上の症状としては、たとえば、運動機能障害、消化管合併症、過剰な腹部脂肪、循環系におけるリポ多糖（LPS）量の増加、脳の縮小および／またはニューロトロフィン量の減少が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群に伴う１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和させるための方法であり、海馬および／もしくは脳室下帯の神経新生および樹状突起の分枝を促進し、かつ／またはアストロサイトおよびミクログリアの活性化を低減させる。いくつかの実施形態において、前記方法は、ハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和する。前記方法によって低減することができるハンチントン病に伴う症状の例としては、運動機能障害、および／またはCNSにおける変異型ハンチンチンタンパク質の凝集が挙げられる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための前記組成物または組み合わせ製品を投与すべき対象群に属するとして前記対象を選択することをさらに含む。たとえば、前記方法は、本明細書で述べるように、前記対象由来の試料のプロファイルを決定することを含んでいてもよい。このプロファイルに基づいて、前記対象がレット症候群および／またはハンチントン病に罹患しているかどうか、これらを発症するリスクがあるかどうか、または抗生物質を含むか、抗生物質からなるか、もしくは実質的に抗生物質からなる組成物または組み合わせ製品のベネフィットを前記対象が享受できるかどうかを示すことができる。いくつかの実施形態において、前記対象は離乳後の幼児である。
いくつかの実施形態において、前記抗生物質を投与することによって、対象における腸内細菌の量が少なくとも８０％減少し、たとえば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％減少する。いくつかの実施形態において、前記抗生物質を投与することによって、腸内から細菌を実質的に除去する。いくつかの実施形態において、前記抗生物質を投与することによって、前記対象の腸においてビフィドバクテリウム属および／またはテネリクテス門が保護されるか、または増加するが、前記対象の腸内微生物の総量は、少なくとも８０％減少し、たとえば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８５％、８６％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％，９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％減少する。
いくつかの実施形態において、前記方法は、アクチノバクテリア門細菌、テネリクテス門細菌、バクテロイデス属細菌およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される細菌を含むか、これらからなるか、または実質的にこれらからなる組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することをさらに含む。前記組成物または組み合わせ製品は、本明細書で述べた通りであってもよい。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumのいずれかにマッピングされたOTUにマッピングされる１種以上の細菌を含む。前述したように、いくつかの実施形態において、細菌は、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に該OTUにマッピングされる。いくつかの実施形態において、アクチノバクテリア門細菌およびバクテロイデス属細菌を前記対象に投与する。いくつかの実施形態において、アクチノバクテリア門細菌が前記対象に投与され、該アクチノバクテリア門細菌はビフィドバクテリウム属を含む。いくつかの実施形態において、バクテロイデス属細菌が前記対象に投与され、該バクテロイデス属細菌は、Ｂ．フラジリス、Ｂ．オバツス、Ｂ．テタイオタオミクロンおよびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記細菌および前記抗生物質は一緒に投与される。いくつかの実施形態において、前記細菌および前記抗生物質は別々に投与される。いくつかの実施形態において、前記細菌および前記抗生物質は同時に投与される。いくつかの実施形態において、前記細菌および前記抗生物質は同一の組成物の形態で同時に投与される。いくつかの実施形態において、前記単離された細菌および前記抗生物質は別々の組成物の形態で同時に投与される。いくつかの実施形態において、前記細菌および前記抗生物質は異なる時間に投与される。いくつかの実施形態において、前記抗生物質は、前記細菌の投与前に投与される。いくつかの実施形態において、前記細菌は、前記抗生物質の投与前に投与される。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、ファーミキューテス門細菌を実質的に含んでいない。いくつかの実施形態において、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のファーミキューテス門細菌を前記対象に投与する。
対象由来試料のプロファイルを決定する方法
いくつかの実施形態において、対象由来試料のプロファイルを決定する方法を提供する。該方法は、
（ａ）テネリクテス門細菌、アクチノバクテリア門細菌およびファーミキューテス門細菌およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される腸内細菌の存在および／もしくはその量；
（ｂ）コリン、5-HT、チロシン、ドーパミン、エピネフリンおよびこれらの２種以上からなる群から選択される神経伝達物質の血清中濃度；または
（ｃ）Chrna2、Chrna7、Chrb4、Chrm1、Slc5a7、Chat、Ache、Slc18a3およびこれらの２種以上からなる群から選択されるコリン作動性遺伝子の発現量
のうちの少なくとも１つを検出することを含んでいてもよい。
前記プロファイルは、検出された（ａ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｂ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｃ）の存在および／もしくはその量、検出された（ａ）と（ｂ）の存在および／もしくはその量、検出された（ａ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｂ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量、または検出された（ａ）と（ｂ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記対象はヒトである。
（ａ）に関しては、レット症候群を有する対象の結腸内容物において、テネリクテス門の量およびアクチノバクテリア門の量がコントロール（非レット症候群）対象よりも減少していること、およびファーミキューテス門がコントロール対象よりも増加していることが観察される（実施例８参照）。さらに、ビフィドバクテリウム属（アクチノバクテリア門に属する細菌属）は、レット症候群の症状が通常発症するよりも以前の週齢である６週齢からレット症候群マウスの消化管から排除され始めるため、レット症候群マウスの消化管に存在しないことが観察された（図１１Ｃ参照）。したがって、いくつかの実施形態において、前記プロファイルを決定する前記方法は、（ａ）を測定することを含み、前記試料は、前記対象由来の腸材料および／または糞便材料を含み、前記プロファイルが、ファーミキューテス門の量が非レット症候群（コントロール）試料よりも多いこと、またはテネリクテス門の量および／もしくはアクチノバクテリア門の量が少ないことを含むことから、レット症候群のリスクが高いことが示される。このことから、さらに、前記対象が、本明細書に記載の細菌および／または抗生物質を含む組成物および／または製品組成物を使用した処置に感受性を示すレット症候群を有する対象の亜集団のメンバーであることが示されてもよい。非レット症候群コントロール試料は、レット症候群に罹患していない個体の腸材料および／もしくは糞便材料を含んでいてもよく、実質的にこれらからなっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。いくつかの実施形態において、非レット症候群コントロール試料における細菌門、細菌属および／または細菌種の量は、保存された数値、たとえば電子的に保存された数値として提供される。
前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記アクチノバクテリア門はビフィドバクテリウム属を含む。いくつかの実施形態において、前記プロファイルを決定する前記方法は、（ａ）を測定することを含み、前記対象由来の試料は、該対象の腸材料および／または糞便材料を含む。前記対象由来の試料中にビフィドバクテリウム属が存在しないこと、またはビフィドバクテリウム属が実質的に存在しないこと（たとえば、非レット症候群コントロール試料におけるビフィドバクテリウム属の量の５％未満）から、レット症候群に罹患していること、またはレット症候群のリスクが高いことが示される。このことから、さらに、前記対象が、本明細書に記載の細菌および／または抗生物質を含む組成物および／または製品組成物を使用した処置に感受性を示すレット症候群を有する対象の亜集団のメンバーであることが示されてもよい。
いくつかの実施形態において、テネリクテス門、アクチノバクテリア門および／もしくはファーミキューテス門の量ならびに／またはビフィドバクテリウム属の有無は、核酸試験、たとえば、定性PCR、半定量PCRまたは定量PCR、核酸配列分析、マイクロアレイ解析などによって測定する。たとえば、前記対象由来の腸試料および／または糞便試料中にビフィドバクテリウム属が存在しないこと、またはビフィドバクテリウム属が実質的に存在しないことは、非レット症候群コントロール試料中のビフィドバクテリウム属を検出することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、前記方法は、非レット症候群コントロール試料中の細菌門、細菌属および／または細菌種の量を検出することを含む。
（ｂ）に関しては、レット症候群マウスにおいて特定の神経伝達物質の血清中濃度が、野生型（非レット症候群）コントロールと比較して変化していることが観察される（実施例２０および図２０Ａ参照）。特に、レット症候群マウスの血清中において、コリン、チロシン、ドーパミンおよびエピネフリンの血清中濃度は低下することが観察され、セロトニンの血清中濃度は上昇することが観察された（図２０Ａ)。いくつかの実施形態において、前記プロファイルを決定する前記方法は、（ｂ）を測定することを含み、前記対象由来試料は、前記対象の血清を含む。前記対象由来の試料において、コリン、チロシン、ドーパミンおよび／もしくはエピネフリンの血清中濃度が非レット症候群（コントロール）試料と比較して高いこと、ならびに／またはセロトニンの血清中濃度が非レット症候群（コントロール）試料と比較して低いことから、レット症候群に罹患していること、またはレット症候群のリスクが高いことを示すことができる。このことから、さらに、前記対象が、本明細書に記載の細菌および／または抗生物質を含む組成物および／または製品組成物を使用した処置に感受性を示すレット症候群を有する対象の亜集団のメンバーであることが示されてもよい。非レット症候群コントロール試料は、レット症候群に罹患していない個体の血清を含んでいてもよく、実質的に該血清からなっていてもよく、または該血清からなっていてもよい。本明細書に記載の実施形態のいくつかによる方法および使用において、コリン、チロシン、ドーパミンおよび／またはエピネフリンの血清中濃度は、様々な好適な技術を使用して測定することができ、好適な技術として、たとえば、ELISA、ラテラルフローアッセイおよび／もしくは非洗浄アッセイなどのイムノアッセイ；ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）、タンデム質量分析（MS/MS）もしくはMALDI（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法）などの質量分析；または核磁気共鳴（NMR）が挙げられる。いくつかの実施形態において、コリン、チロシン、ドーパミンおよび／またはエピネフリンの血清中濃度を、非レット症候群コントロール試料において測定する。いくつかの実施形態において、非レット症候群コントロール試料におけるコリン、チロシン、ドーパミンおよび／またはエピネフリンの血清中濃度は、保存された数値、たとえば電子的に保存された数値として提供される。
（ｃ）に関しては、レット症候群マウスにおいて特定のコリン作動性遺伝子の発現量が、野生型（非レット症候群）コントロールと比較して、変化していることが観察される（実施例２０および図２０Ｂ参照）。特に、レット症候群マウスにおけるChrna2、Chrna7、Chrb4、Chrm1、Slc5a7、Chat、AcheおよびSlc18a3の発現量は、野生型コントロールよりも低下している（実施例２０および図２０Ｂ)。いくつかの実施形態において、前記プロファイルを決定する前記方法は、（ｃ）を測定することを含み、前記対象由来の試料は、生検またはスワブなどの腸組織を含み、コリン作動性遺伝子の発現量が測定される。前記対象由来試料におけるChrna2、Chrna7、Chrb4、Chrm1、Slc5a7、Chat、Ache、Slc18a3およびこれらの遺伝子のいずれか２種以上の組み合わせの発現量が、非レット症候群コントロールよりも低いことから、レット症候群のリスクが高いことを示すことができる。このことから、さらに、前記対象が、本明細書に記載の細菌および／または抗生物質を含む組成物および／または製品組成物を使用した処置に感受性を示すレット症候群を有する対象の亜集団のメンバーであることが示されてもよい。非レット症候群コントロール試料は、レット症候群に罹患していない個体の腸組織を含んでいてもよい。コリン作動性遺伝子の発現量は、様々な技術を使用して測定することができ、このような技術として、たとえば、逆転写酵素定量PCRやマイクロアレイ解析などの核酸アッセイが挙げられる。いくつかの実施形態において、コリン作動性遺伝子の発現量を、非レット症候群コントロール試料において測定する。いくつかの実施形態において、非レット症候群コントロール試料におけるコリン作動性遺伝子の発現量は、保存された数値、たとえば電子的に保存された数値として提供される。
いくつかの実施形態において、前記プロファイルが決定され、前記プロファイルからレット症候群のリスクが高いことが示された場合、前記対象に処置を行うことが推奨される。この処置は、本明細書に記載の細菌、抗生物質、または細菌と抗生物質を含む組成物および／または組み合わせ製品を対象に投与することを含んでいてもよい。
さらなる実施形態
ヒトの腸内微生物叢は約１００兆個の細菌細胞を含み、これらの細菌細胞は、生後２〜３年で成熟し、健康および免疫発達に極めて重要である（Roundら、2009、Goyalら、2015）。腸内微生物叢の恒常性の変化（ディスバイオシス）は、がん、肥満、栄養失調、腸の発達異常および免疫系発達異常、炎症性腸疾患（IBD）、糖尿病、神経発達障害、神経精神障害、多発性硬化症（MS）、パーキンソン病（PD）およびアルツハイマー病（AD）に関与する（Scheperjansら、2015、Blantonら、2016、Marchesiら、2016、Minterら、2016、Sherwinら、2016）。腸内微生物叢とCNSの機能を結び付けているシグナル伝達経路は、いまだ十分に定義されていない。腸内細菌により産生される分子は、腸神経系（ENS）の生物学的機能に直接影響を及ぼしている可能性があり、ENSは迷走神経を介してCNSと連絡している。また、微生物代謝物も循環系を介して脳に到達している可能性があり、あるいは免疫系と連絡してCNSに影響を与えている可能性がある（Goyalら、2015、Sherwinら、2016）。無菌（GF）マウスは、脳の発達に対する腸内微生物の影響の研究において有用に使用されてきた。行動研究からは、無菌マウスは多動性であり、不安が低減されていることが実証されている。無菌マウスは、神経伝達物質の発現およびBDNFなどのシナプス形成に必須のタンパク質の発現が変化した脳化学的変化を示し、海馬神経新生が亢進している（Ogbonnayaら、2015、Luczynskiら、2016）。近年の知見から、無菌PDマウスは、従来通りに飼育された同腹仔と比較して、脳病変が減少しており、運動症状が低減していることが示唆されている。無菌マウスは、不溶性α−シヌクレインの蓄積が少なく、活性化ミクログリアが少なく、炎症性バイオマーカーの量が少ない。PDマウスにおいてPD患者由来の微生物叢が運動症状の進行を加速させることが観察されたことから、病原性細菌が存在している可能性が示唆されている（SampsonおよびMazmanianら、2016）。抗生物質カクテルでADマウスを処置すると、βアミロイドの形成および神経炎症が減少する（Minterら、2016）。特定の理論に制限されるものではないが、腸内微生物叢は神経変性障害に影響を及ぼしている可能性があると考えられる。
腸におけるディスバイオシスの正常化は治療戦略として利用できる。腸におけるディスバイオシスを正常化することによる治療戦略は、脳の発達に好ましい影響を与え、異常行動を緩和する。ヒトの腸の共生細菌であるバクテロイデス・フラジリスを自閉症の環境マウスモデルに定着させると、CNS関連症状が改善する（Hsiaoら、2013）。同様に、特定のビフィドバクテリウム属を神経精神障害の動物モデルに経口投与すると、保護作用が発揮される（Savignacら、2015）。また、抗生物質を用いて処置したPDマウスでは、ミクログリアの活性化およびCNS病変が減少する（Sampsonら、2016）。さらに、抗生物質は、レボドパの治療効果を増強し、ハンチントン病患者の臨床症状を改善する（Hashimら、2014）。非吸収性抗生物質を用いて肝性脳症（HE）患者の腸内微生物叢を変化させると、認知障害、気分障害および運動症状などの異常行動が緩和される（Bajajら、2013）。肝性脳症は腸−肝臓−脳軸疾患のモデルであり、腸におけるディスバイオシスが肝臓に毒性を及ぼし、脳病変を引き起こす。特定の理論に制限されるものではないが、これらの研究では、健康な腸内微生物叢が脳の機能にとって重要であることが強調されており、腸内微生物叢を変化させることによって安全かつ非侵襲的に脳障害を治療することが可能であるという概念が支持されている。ハンチントン病患者は、CNS病変に加えて、体重減少／筋萎縮、代謝異常、免疫異常および消化管合併症を患う（Carrolら、2015）。微生物叢と類似の症状の出現との関連性は、PDなどのその他の脳障害モデルにおいて確立されてきた（Scheperjansら、2015、Blantonら、2016、Dinanら、2016）。特定の理論に制限されるものではないが、腸内微生物叢はハンチントン病における病的変化を制御している可能性があると考えられる。
ハンチントン病の研究分野では、治療標的を見出すために「CNS中心」のアプローチが取られることが多い。しかしながら、ハンチントン病を含む神経変性障害のほとんどは症候群として生じ、様々な臓器および経路における障害を伴うことがある（Carrolら、2015、Titovaら、2016）。微生物叢−脳相互作用が見出されたことから、腸環境が神経変性に影響を及ぼすかどうかという興味深い疑問が提起された。既知の遺伝的要因によるハンチントン病は、タンパク質の凝集およびCNS関連症状の進行に対する腸内微生物相の影響を詳しく検討するための優れたモデルである。本明細書において報告されるショウジョウバエのハンチントン病モデルから得られた結果（実施例３参照）から、変異型HTT凝集体が腸管近傍のニューロンに最初に出現することが実証された。さらに、臨床的に有用な抗生物質であるリファキシミンを用いて腸内微生物叢を除去すると、変異型HTTエキソン１断片（mHDx1）のオリゴマー化が減少する。これとは逆に、細菌機能性アミロイドを産生する大腸菌株をハンチントン病ハエに定着させると、Ｎ末端の586残基からなる断片のオリゴマー化が促進され、運動症状が悪化する。マウスモデルにおける変異型HTTの凝集およびハンチントン病の発症機序に対して微生物叢が影響を及ぼしていることも考えられる。１つのアプローチとして、腸内微生物叢が変異型HTTのオリゴマー化およびハンチントン病症状の進行に影響を及ぼすかどうかということを調べるために、無菌マウスコロニーを構築することが挙げられる。運動障害および認知障害を示すレット症候群マウスモデルにおいて、リファキシミンが海馬神経新生と樹状突起の分枝を促進させ、運動症状の重症度を低減させることが本明細書において観察されている（実施例６、図３および図５参照）。
さらに、脳由来神経栄養因子（BDNF）の量の変化、シナプス形成および神経新生は、レット症候群の症状の進行に寄与する（Ramockiら、2008、Lombardiら、2015）。
本明細書に記載の実施形態のいくつかに従った、腸におけるディスバイオシスを正常化することによる治療戦略は、脳の発達に好ましい影響を与え、異常行動を緩和する。ヒトの腸の共生細菌であるバクテロイデス・フラジリスを自閉症の環境マウスモデルに定着させると、CNS関連症状が改善する（Hsiaoら、2013）。同様に、特定のビフィドバクテリウム属を神経精神障害の動物モデルに経口投与すると、保護作用が発揮される（Savignacら、2015）。非吸収性抗生物質を用いて肝性脳症（HE）患者の腸内微生物叢を変化させると、認知障害、気分障害および運動症状などの異常行動が緩和される（Bajajら、2013）。肝性脳症は腸−肝臓−脳軸疾患のモデルであり、腸におけるディスバイオシスが肝臓に毒性を及ぼし、脳病変を引き起こす。これらの研究では、健康な腸内微生物叢が最適な脳機能にとって重要であることが強調されており、ディスバイオシスを是正することによって様々な脳障害を安全かつ非侵襲的に治療することが可能であるという概念が支持されている。
レット症候群は、脳の縮小、神経新生障害、シナプス形成障害、ニューロトロフィン量の減少、運動症状などの病的変化がパラメータとして詳しく定義されていることから、脳の発達に対する微生物叢の影響を研究するための遺伝モデルとして利用することができる。レット症候群マウスモデルは、患者が示す症状の大部分を発症することから、治療戦略をヒトへと移行することが容易である。さらに、レット症候群は、パーキンソン病様症状、不安障害、発作および知的障害を伴う自閉スペクラム症として説明することができる。したがって、本開示の知見および治療戦略は、神経学的疾患に関するさらなるデータ、たとえば本明細書に記載のデータとも合致する。
MeCP2は、いくつかの臓器で発現される多機能性タンパク質である。MeCP2はDNA結合転写因子として、神経の発達および免疫細胞の機能に関与する数百もの遺伝子の発現に影響を及ぼしている（Cronkら、2015、Lombardiら、2015）。しかしながら、MeCP2は、ゲノム中の制御ドメインにおいてメチル化DNAおよびヒドロキシメチル化DNAを認識するエピジェネティックな包括的制御因子として最もよく知られている（Mellenら、2012）。MeCP2の活性およびDNAへの結合は、リン酸化などの翻訳後修飾により制御される（Ebertら、2013）。このようなMeCP2の特性は、多数の神経回路の適切な機能の発揮、成長因子の産生およびシグナル誘導性のシナプス形成に極めて重要である（Lombardiら、2015）。MeCP2は、CNSにおいて広範に研究されてきた。MeCP2は、肝臓において脂質およびコレステロールの恒常性を維持する。この観察結果と一致して、スタチンなどの、コレステロールを低下させる化合物は、レット症候群マウスにおいて症状の重症度を低減することが報告されている（Buchoveckyら、2013、Kyleら、2016）。一部のレット症候群患者では、異常な脂質プロファイルおよび異常なコレステロールプロファイルを示す。したがって、本明細書において、（たとえば、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って腸内微生物叢を変化させることにより）代謝経路を操作することによって、一部のレット症候群患者がベネフィットを享受できると考えられる。MeCP2は、レット症候群におけるその他の潜在的な共存因子として免疫発達および炎症性サイトカインの産生を制御できることも報告されている（Liら、2014、Jiangら、2014、Cronkら、2015、O’Driscollら、2015）。炎症は、マウスモデルにおいて自閉症状の発症に寄与し、共生細菌であるバクテロイデス・フラジリスをプロバイオティクスとして用いた処置によって、炎症性サイトカインの産生が低下し、異常行動が緩和される（Hsiaoら、2013、Mayerら、2014）。
MeCP2の活性は、クロマチンを修飾するセリン／スレオニンキナーゼであるIKKα（IκBキナーゼα）により制御されることが報告されており、IKKαは、炎症経路および免疫発達を調節するマルチサブユニットIKK複合体の構成成分である（Chariot、2009）。IKKαはMeCP2をリン酸化し、MeCP2とCREB（cAMP応答エレメント結合性タンパク質）転写因子の相互作用を促進し、それによって、脳由来神経栄養因子（BDNF）やシナプス関連タンパク質PSD-95などの約３００個の神経細胞遺伝子の発現に影響を及ぼしている（Khoshnanら、2012）。神経免疫経路について研究するため、Cre-lox技術を使用してWTの免疫系を有するレット症候群マウスモデルを構築した。しかしながら、レット症候群マウスの免疫系におけるMeCP2の発現は、症状の進行に影響を及ぼさなかったことが本明細書において報告されている（未発表データ）。いくつかの他の研究室でも類似の結論に達しており、骨髄移植または自然免疫細胞におけるMeCP2の選択的な再活性化では、レット症候群の症状が緩和されないことが実証されている（Wangら、2015）。また、免疫系およびその他の臓器において大部分の炎症性サイトカインのNF-κB依存的産生を誘導する重要な炎症誘発性キナーゼであるIKKβを選択的にノックダウン（KD）させたレット症候群マウスモデルを構築した（Chariot、2009）。しかしながら、IKKβのノックダウンによってレット症候群の症状が悪化し、筋肉の消耗が促進されたことが本明細書において報告されている（Khoshnanら、未発表データ）。しかしながら、最近の研究では、IKKβの下流にあるNF-κBの活性がレット症候群マウスのCNSにおいて上昇しており、NF-κB遺伝子の発現低下は脳病変および異常行動を緩和させ、寿命を延長することが示されている（Kishiら、2016）。
レット症候群患者の大部分は、便秘、腹痛、膨満感および排便困難などの消化管合併症を患う（Motilら、2012）。さらに、最近の研究では、レット症候群患者の腸内微生物叢は変化していることが示唆されている（Stratiら、2016）。MeCP2は、腸の発達に関与する前駆細胞を含む腸上皮において発現されることが本明細書において報告されている。特定の理論に制限されるものではないが、レット症候群患者の腸上皮におけるMeCP2の欠損は、腸の生理機能および微生物の恒常性を変化させる可能性があると考えられる。この仮説を支持するものとして、レット症候群マウスは、「リーキーガット」として知られている腸壁透過性の亢進による消化管病変を示し、抗菌性ペプチドの産生に不可欠な腸細胞数の減少を示すことが観察されている。また、レット症候群マウスは、特定の健康促進細菌種の欠如が典型的に見られるディスバイオシスを呈する。さらに、レット症候群マウスが示すその他の顕著な病的変化として、消化管の炎症ならびに過剰な腹部脂肪や循環系の細菌リポ多糖（LPS）量の増加などの代謝変化が挙げられる。特に、消化管障害および代謝障害は、無菌のレット症候群マウスでは見られず、従来通りに飼育したコホートでは、腸内微生物叢を変化させることによって消化管障害および代謝障害が低減される。小腸において有害な細菌の過剰増殖を低減させる非吸収性抗生物質であるリファキシミンを用いてレット症候群マウスを処置すると、有益な生化学的変化および行動の変化が誘導される。興味深いことに、リファキシミンは、海馬および脳室下帯において神経新生および樹状突起の分枝を増強し、アストロサイトおよびミクログリアの活性化を低下させ、運動機能を改善させる（実施例６、図３および図５参照）。
腸上皮においてMeCP2が発現されるという知見から、MeCP2が腸の生理機能に重要である可能性が示唆される。レット症候群マウスにおけるディスバイオシス、消化管病変および代謝変化はこの概念と一致している。腸のみにおいてMeCP2を発現するマウスモデルを構築することによって、レット症候群に関与する微生物叢−腸−脳ネットワークにおけるMeCP2の役割を調査することが容易になる。特定の理論に制限されるものではないが、レット症候群マウスの腸上皮においてMeCP2を再活性化させると、腸と微生物叢の連絡を有意に回復させることができ、これによって腸内菌共生バランスを失調させる細菌種の増殖を抑え、健康促進微生物の定着を増強することができると考えられる。腸の恒常性に関与しうる候補としては、抗菌性ペプチドおよび成長因子の産生が挙げられ、これらはMeCP2による制御を受けている可能性がある。あるいは、MeCP2は、免疫細胞および上皮細胞の炎症応答を弱めて病的変化を低減させているとも考えられる。また、健康な腸環境は、代謝変化および全身性変化を緩和させている可能性があり、このような代謝変化および全身性変化としては、CNSに蓄積して神経炎症を引き起こしうる循環系のLPSなどの微生物産物および微生物代謝物の漏出により引き起こされるものが挙げられる。腸の生理機能を是正することによって、動物の全体的な健康を向上し、CNSの病的変化の一部を低減させることができると考えられる。これらの研究における肯定的な結果は、レット症候群患者の腸環境を是正し、症状の重症度を低下させるための知識として必須である。否定的な結果からは、レット症候群におけるCNS介在性の消化管病変、代謝変化およびディスバイオシスが支持される。
特定の理論に制限されるものではないが、腸上皮におけるMeCP2の発現およびその活性の制御は、腸−微生物叢の恒常性の維持に極めて重要であると考えられる。腸においてMeCP2が欠損していると、ディスバイオシスおよび消化管病変が起こり、これによって、腸−免疫系および腸−脳の連絡が破綻して脳化学的機能が変化し、レット症候群に関連する症状の進行が悪化しうる。
特定の理論に制限されるものではないが、腸内微生物叢はレット症候群マウスにおける消化管病変、代謝異常、免疫異常および異常行動に寄与すると考えられる。本明細書において樹立された無菌のレット症候群マウスコロニーは、これらの表現型における微生物叢の役割の解明に有用であると考えられる。無菌マウスは、MeCP2の標的であるBDNFなどのCNS遺伝子の発現の変化を示す（Bercikら、2011、Chahrourら、2008）。さらに、微生物叢の組成は、MeCP2の活性に影響を及ぼしうる（Bieら、2013）。したがって、特定の理論に制限されるものではないが、本明細書に記載の実験によって、無菌マウスと従来通りに飼育させたマウスとの間で差異が見られるMeCP2依存性遺伝子およびMeCP2依存性経路をさらに特定できると考えられる。特定の理論に制限されるものではないが、無菌マウスに関する既存の知識に基づくと、レット症候群マウスの運動行動および情動行動は、従来通りに飼育したレット症候群マウスモデルと無菌のレット症候群マウスモデルとで異なると考えられる（Luczynskiら、2016）。無菌のレット症候群マウスは、特徴的な挙動を是正することを目的として、関与するプロバイオティクス細菌を試験するために使用することができる。Ｂ．フラジリスの神経保護特性および腸−免疫調節特性によって、レット症候群マウスにおける病変の一部が是正されうると考えられる。しかしながら、長期的には、レット症候群マウスの腸内微生物叢について良好な見解が得られれば、その他の共生細菌を試験することが可能であると考えられる。消化管病変および代謝変化、さらには可能性としてCNS症状の是正に対してリファキシミンが一定の効果を有することから、展望は明るい。既存の治療薬はそれほど厳密でない条件下で患者への試験に使用できることから、既存の治療薬を試験に使用すると有利である。リファキシミンは、ヒトにおける微生物叢を介した消化管病変およびCNS病変の治療において安全性および有効性が証明されている。マウスモデルにおいてリファキシミンの特性を試験した本明細書に記載の実験は、レット症候群患者に対してリファキシミンが適用可能であることを強く支持している。
本明細書に記載の実験のいくつかから、腸−海馬相互作用に関する重要な知識が得られる可能性があり、また、微生物叢−MeCP2相互作用が影響を及ぼす関連経路および神経細胞遺伝子を特定することができると考えられる。最近の研究では、抗生物質カクテルを用いて腸内微生物叢を除去すると、WTマウスにおける海馬神経新生および認知タスクが損なわれることが示唆されており、このことからも腸−海馬ネットワークが支持されている（Mohlら、2016）。しかしながら、これらの実験において使用されている抗生物質の一部は毒性を有しており、循環系へと移行する。リファキシミンは、腸特異的であり、定着した微生物の比率を変化させる微生物叢修飾因子として機能するという点において上記抗生物質とは異なる（Maccafferiiら、2010、Ponzianiら、2016）。図１９に示したデータもこの概念に合致する。肝性脳症（HE）患者における認知および作業記憶に対してリファキシミンが有益な効果を発揮することが実証されていることから（Ahluwaliaら、2014）、将来的にレット症候群においてリファキシミンを評価することには信頼性および楽観性がある。レット症候群において知的障害が見られることを考慮すると、これらの実験の肯定的な結果から、近い将来、この消耗性症状を克服するための治療法が開発できる可能性がある。また、リファキシミンで処置したレット症候群マウスの微生物叢を精査することによって、海馬神経新生を制御し、認知に影響を及ぼしうる共生細菌を特定することができると考えられる。特定の理論に制限されるものではないが、神経新生の障害は、自閉症、脆弱Ｘ症候群、アルツハイマー病、外傷性脳損傷などのいくつかの脳障害において見られることから、このような戦略が成功を収めることができれば、レット症候群以外の疾患に対する治療法を開発できる可能性がある。
実施例１：ハンチントン病（HD）ショウジョウバエモデルに対するリファキシミンの効果
特定の理論に制限されるものではないが、腸内微生物叢は、腸神経系（ENS）における変異型ハンチンチン（HTT）の凝集に寄与していると考えられる。ハンチントン病（HD）ショウジョウバエモデル（Barbaroら、2015）の神経系において、変異型HTTエキソン1断片（mHDx1）の発現を誘導したところ、幼虫の腸管周囲のENSにおいて凝集が促進された（図１Ａおよび図１Ｂ）。幼虫のENSにおける凝集体の最初の出現は、このようにして観察される。
成虫HDハエの細菌含有量は、コントロールと比較して劇的に増大している。特定の理論に制限されるものではないが、このような事実から、神経系における変異型HTTが腸内微生物叢の組成に大きな影響を与えている可能性が示唆される。さらに、腸特異的抗生物質であるリファキシミンの存在下で発生させた幼虫ではmHDx1の凝集が低下することが観察される（図１Ａおよび図１Ｂ）。また、リファキシミンは、成虫ハエのCNSにおけるmHDx1の凝集を減少させる（図１Ｃおよび図１Ｄ）。したがって、本研究では、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従った抗生物質による処置によって、変異型ハンチンチンタンパク質の凝集体が減少することが観察される。
実施例２：ハンチントン病（HD）ショウジョウバエモデルに対する細菌成分の効果
細菌成分が変異型HTTのオリゴマー化に影響を与えるかどうかを調べた。変異型HTTの最初の586個のN末端アミノ酸（586HD（120Q））を発現しているHDハエ（変異型ヒトハンチンチンタンパク質を発現）は、運動症状を全く呈さない（Barbaroら、2015）。586HDを発現しているハエの腸において、細菌機能性アミロイドCurliを産生する大腸菌株を定着させると（図３Ａの右側パネル）、N-586変異型HTT断片の凝集が促進される（図３Ｂ〜Ｃ）。さらに、586HD発現ハエの円筒形バイアルの側面を登る能力が消失することから、Curli+細菌によって586HD発現ハエの運動症状が悪化することが示される（図３Ｄ）。したがって、ハエの腸内において細菌により発現されたCurliは、HDの運動症状の発症を促進しうる。
一方、HDハエに大腸菌（野生型またはCurli発現MC4100）を摂取させることによって、いずれの場合でも運動症状の発症が促進される。特に、変異型ヒトハンチンチンを発現している変異型（「Mut」）ハエおよび野生型（「WT」）ハエに、大腸菌（5×107CFU/ml）を添加したハエの餌を1日目に与えた。1日目、5日目、10日目および15日目に登攀行動を評価した。大腸菌の摂取によってHDハエの異常な運動行動が悪化し、10日目および15日目に、大腸菌を摂取していないHDハエよりも重度の運動症状を示した（図２Ａ参照）。Curli発現大腸菌およびCurli欠損変異型大腸菌のいずれでも同様の効果が示された。したがって、腸内大腸菌（Curli発現大腸菌または非Curli発現大腸菌）によって、HDにおける運動症状が悪化しうる。
HDハエにラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）を摂取させても運動症状に影響は見られなかった。変異型ヒトハンチンチンを発現している変異型（「Mut」）ハエおよび野生型（「WT」）ハエに、5×107CFU/mlのＬ．ラムノサスを添加したハエの餌を羽化後1日目に与えた。1日目、5日目および10日目にクライミングアッセイを行った。クライミングアッセイによる測定の結果、運動症状に対するＬ．ラムノサスの効果は認められなかった（図２Ｂ参照）。
総括すると、これらの知見から、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って腸内環境を調節することによって、インビボHDモデルの運動症状を調節できることが示された。特定の理論に制限されるものではないが、腸内細菌は神経系における変異型HTTの凝集に影響を及ぼし、下流の病変に影響を及ぼす可能性があると考えられる。
さらに、HDハエ（変異型ヒトハンチンチンを発現）は、抗菌性ペプチド（AMP）であるドロソシンをコードするmRNAの量の上昇と、別の抗菌性ペプチド（AMP）であるドロソマイシンをコードするmRNAの量の上昇を示した（図２Ｃ参照）。TR-qPCRによってmRNAを定量し、細菌を持たないWTハエを基準とした。ハエに大腸菌を摂取させないか、Curli発現MC4100大腸菌を摂取させるか、またはCurli欠失変異型同質遺伝子系大腸菌を摂取させた。野生型（「WT」）ハエに大腸菌を摂取させることによって、抗微生物ペプチドであるドロソシンおよびドロソマイシンの発現が誘導された。しかし、大腸菌を摂取させていない変異型ヒトハンチンチン発現HD（「Mut」）ハエにおいてドロソシンおよびドロソマイシンが上昇し、大腸菌を添加してもドロソシンおよびドロソマイシンのmRNA量に対する効果は認められなかった。さらに、Curliの発現の有無に拘わらず、大腸菌は同程度の効果を発揮した（図２Ｃ参照）。
ペニシリン−ストレプトマイシンを摂取させて腸内微生物を除去すると、HDハエにおける運動症状の障害が緩和された。ペニシリン−ストレプトマイシンをハエの餌に添加し、羽化後1日目に摂取させた。15日目にクライミングアッセイを行った。ペニシリン−ストレプトマイシンを摂取させたHDハエは、ペニシリン−ストレプトマイシンを摂取させていないHDハエよりも有意に優れた登攀能力を示した（図２Ｄ参照）。したがって、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って抗生物質による処置を行うと（これにより、たとえば腸内微生物を減少させたり、除去したりすることによって）、HDにおける運動症状の障害を緩和することができると結論付けられる。
実施例３：HDマウスモデルに対する微生物の効果
HDマウスモデル
変異型HTTエキソン1（mHDx1）断片を発現するR6/2 HDマウス系統は、一般的に使用されているモデルであり、運動障害および認知障害などの強いHDの症状を呈する。症状は生後6〜8週間ごろに現れる（Mangiariniら、1996）。また、R6/2マウスは、HD患者と同様に体重減少および免疫細胞異常を示す。さらに、R6/2マウスは、腸の運動不全、下痢および栄養物の吸収不良などの消化管障害を呈することには大きな意義がある（van der Burgら、2011）。これらの表現型の大部分は、その他の疾患モデルにおける腸内微生物叢の恒常性の崩壊と関連している。したがって、R6/2マウスをモデルとして使用して、HDにおいて腸内細菌叢が与える影響を調査することができる。R6/2マウスの腸内微生物叢（総細菌ゲノム）のRNA配列分析を行い、HDマウスの腸内細菌叢に対する効果を観察する。
無菌（GF）マウスは、疾患モデルにおいて脳腸相関を分析するためのツールである。R6/2モデルの無菌マウスコロニーを作製する。好気条件および嫌気条件における微生物の培養、ならびにPCRによって、微生物の存在についてマウスを常法に従い試験する。
無菌マウスコロニーを樹立した後、図１および図２において使用したものと同様の様々な抗凝集体抗体／オリゴマー特異的抗体を使用して、生後0日目（P0）から6週間（P42）にわたって消化管（GI）切片の免疫組織化学的縦断研究を行う。さらに、同齢のマウスの脳切片の染色も行い、凝集体が現れる時点でENSおよび／またはCNSにおけるmHDx1の凝集を検出する。このモデルにおいて消化管に対するHDの影響が観察されると予想される。
さらに、過去の研究から、PDマウスモデルにおいて腸内微生物叢が運動行動に影響を与えている可能性が示唆されている（SampsonおよびMazmanianら、2016）。特定の理論に制限されるものではないが、微生物叢は、HDハエにおける運動症状にも大きな影響を及ぼしていると考えられる（図２Ｄ参照）。したがって、従来のHDマウスおよび無菌HDマウスの運動行為を観察し、WT同腹子と比較する。HDマウスを使用して過去に実施された実験と同様にして、ロータロッド試験、ビームバランス試験および抱擁反射試験を行う（Southwellら、2009）。これらの試験の詳細は実施例１９で説明する。
哺乳動物において、海馬の神経新生は学習および記憶を行うために起こり、腸内細菌叢の影響を受けている可能性がある（Christianら、2014、Ogbonnayaら、2015）。本研究において、従来のレット症候群マウスの海馬における神経新生障害は、無菌コホートにおいて緩和されることが観察されていることから、腸内細菌叢と認知機能の関連性が示唆されている（たとえば、実施例６および実施例１７参照）。また、R6/2 HDマウスにおいても海馬の神経新生障害が認められる（Fedeleら、2011）。BrdU標識法を使用して、従来のWTマウス、無菌WTマウス、従来のHDマウスおよび無菌HDマウスにおいて新生ニューロンを調べ、生存期間および脳回路への組み込みを観察する。新生ニューロンにおいて染色されるダブルコルチンに対する抗体と、増殖マーカー（ki67）に対する抗体とを使用して脳切片を染色する。また、新奇物体認識試験およびバーンズ迷路試験などの行動試験を実施し、無菌のHDマウスの学習および記憶に対する効果を従来のコホートと比較する。これらの研究から、HDマウスにおいて腸内微生物叢が海馬の神経新生障害および認知タスクに寄与するかどうかを明らかにする。
過去に報告されている標準的な手順（Dawoodら、2004、Southwellら、2009、Hsiaoら、2013）に従って、ロータロッド試験、ビームバランス試験、抱擁反射試験、オープンフィールド試験、新奇物体試験およびバーンズ迷路試験を行う。
実施例４：髄鞘化に対する微生物叢の効果
特定の理論に制限されるものではないが、微生物叢は髄鞘化に影響を及ぼす可能性があると考えられる。髄鞘化はCNSの機能に極めて重要であり、HD患者では症状を発症するよりも早くに起こりうる（Bartzokisら、2007）。本研究において、変異型HTTオリゴマーがミエリン鞘に蓄積し、これが乏突起膠細胞へと輸送されミエリンの形成およびミエリン鞘の機能を損なう可能性が観察されている（図４）。したがって、微生物叢は髄鞘化に大きな影響を与えうると考えられる。
無菌マウスにおいて、ミエリンはより厚く、ミエリン関連遺伝子の発現が上昇している（Gaciasら、2016、Hobanら、2016）。微生物叢はHDマウスにおけるこれらのミエリン関連事象に影響を与えている可能性がある。これを踏まえ、無菌HDマウスおよび従来のHDマウスにおける髄鞘化を電子顕微鏡法によって比較する。ミエリンの発現量をウエスタンブロットおよびQRT-qPCRによって定量する。無菌HDマウスにおけるHTT凝集体はコントロールHDマウスよりも減少していると予想される。
変異型HTTのオリゴマー化は、様々なモデルにおける神経毒性およびHD病変の決定因子であり、HD研究において重要なバイオマーカーとして利用できる（Batesら、2015）。HDハエにおける知見に基づき（図１および図２）、確認試験において無菌HDマウスのENS中の変異型HTT凝集体の量を測定する。無菌HDマウスにおけるHTT凝集体はコントロールHDマウスよりも減少していると予想される。
特定の理論に制限されるものではないが、凝集は、形成された立体構造に依存して保護作用を発揮することもあれば、神経毒性を発揮することもある（Arrasateら、2012）。微生物を介した変異型HTTの凝集は、HDハエにおける運動症状の発症と一致する場合があることが観察されている（図２Ｂ〜Ｄ）。特定の理論に制限されるものではないが、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って無菌HDマウスにおける凝集が低減または遅延された場合、運動障害の重症度にも影響を及ぼすことがあると考えられる。特定の理論に制限されるものではないが、腸内微生物叢と海馬神経新生と認知タスクとの間で関連性が見られると考えられる。このような関連性は、レット症候群を有する無菌マウスにおいて海馬神経新生が促進されるという本研究で報告された知見に基づくものである（実施例６、実施例１７参照）。さらに、微生物叢の影響を受けるCNS遺伝子のおよそ15％が髄鞘化に関係している（Hobanら、2016）。
実施例５：レット症候群の症状の進行に対するリファキシミンの効果
本明細書に記載の実施形態のいくつかによれば、腸内微生物叢の恒常性を調節する化合物および／またはプレバイオティクス／プロバイオティクスによる処置は、レット症候群の症状などのCNS症状を変化させるのに有用な戦略となりうる。リファキシミンは、腸特異的抗生物質であり、循環系に吸収されにくい。リファキシミンは、臨床試験において、肝性脳症（HE）患者において細菌負荷を減少させ、リーキーガットを是正し、不安、易刺激性、抑うつ状態、運動症状、認知障害などのいくつかの異常行動の重症度を低減することが示されている（Bajajら、2013、Kokら、2013）。肝性脳症（HE）は、微生物叢−肝−脳軸の障害モデルである（Bajajら、2013）。また、リファキシミンは、予備試験において、パーキンソン病患者の運動機能を向上させることが示された。リファキシミンの効果の詳細については、臨床試験で検討中である（インターネット経由でClinicalTrials.govより入手可能である；Fasanoら、2013）。
リファキシミンは、レット症候群マウスモデルにおいて試験されており、このマウスモデルは、重篤な消化管障害、重篤な代謝異常、運動症状および認知障害を呈する。実施例１９で説明するように、レット症候群マウスにリファキシミンを投与した。リファキシミンによって、レット症候群マウスの消化管症状および代謝症状が解消された（たとえば、実施例１４を参照されたい）。また、リファキシミンで処置したレット症候群マウスは、ケージ環境において活動性がより高く、巣作りもより良好である（図５Ａ）。巣作りは、げっ歯類の良好な健康状態、日中活動、積極的な意欲状態および健康な脳機能を示す（Jirkof、2014）。さらに、リファキシミンで処置したレット症候群マウスは、登攀試験およびワイヤハング試験においても良好な成績を示し、抱擁反射表現型が有意に減少している（図５Ｂ〜Ｄ）。
筋力を示す前記試験の結果、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従い、リファキシミンを使用してレット症候群の腸内環境を変化させることによって、レット症候群における運動行動に影響を与えることができ、運動機能を改善し、かつ健康状態、日常活動、積極的な意欲状態および健康な脳機能を改善できることが実証された。
実施例６：HDにおける海馬神経新生および認知タスクに対するリファキシミンの効果
リファキシミンがショウジョウバエの神経系においてmHDx1の凝集を減少させることが本研究で観察されている（実施例１、図１Ａ〜Ｄ）。したがって、リファキシミンはHDマウスの病変および行動に影響を与えうると考えられる。また、レット症候群マウス（本研究において試験したようなレット症候群マウス；たとえば実施例５、実施例１７参照）は、R6/2 HDマウスと類似の運動症状を発症する。したがって、HDマウスの運動表現型に対してリファキシミンの効果を試験することができると考えられる。
上記を踏まえ、実施例１９で述べる方法を使用して、R6/2 HDマウスにリファキシミンを投与する。離乳したHD仔マウスをリファキシミンで約4週間処置する。溶媒またはリファキシミンで処置したマウスの腸切片および脳切片を凝集体特異的抗体で評価し、定量する。レット症候群マウスを使用したリファキシミンの送達における条件は後述する。
実施例１９で述べる方法を使用して、溶媒処置R6/2 HDマウスおよびリファキシミン処置R6/2 HDマウスをロータロッド試験、ビームバランス試験およびオープンフィールド運動試験で評価する。HDマウスの運動表現型に対するリファキシミンの効果を観察する。
さらに、実施例１９で述べるプロトコルを使用して、リファキシミン処置R6/2 HDマウスおよび溶媒処置R6/2 HDマウスの営巣行動に対するリファキシミンの効果を観察する。HDマウスの認知表現型に対するリファキシミンの効果を観察する。
また、HD患者は認知タスクの成績が不良であり、認知症を発症する（Paulsen、2011）。R6/2 HDマウスは、神経新生の減少、学習障害および記憶障害を呈する（Fedeleら、2011）。リファキシミンがレット症候群マウスの海馬神経新生と樹状突起の分枝を促進することが本研究において報告されている（実施例１７ならびに図３および図５参照）。これらの研究から、腸内環境が海馬の生化学機能に影響を与える可能性があり、認知機能に大きな影響を与えうるという概念が支持される。これを踏まえて、R6/2マウスにおける海馬神経新生に対するリファキシミンの効果を評価する。増殖中のニューロンのマーカーおよび成長中のニューロンのマーカー（ki67およびダブルコルチン）に対する抗体を使用した免疫組織化学分析とBrdU標識法を使用して、新生ニューロンの数を定量し、生存が決定づけられるかどうかを含めた新生ニューロンの運命を経時的に追跡する。HDマウスにおける海馬神経新生に対するリファキシミンの効果を観察する。
学習および記憶に対するリファキシミンの効果
リファキシミンで処置したR6/2 HDマウスおよび溶媒処置コントロールに対して新奇物体認識試験やバーンズ迷路試験などの行動解析を実施し、HDマウスの認知タスクに対するリファキシミンの効果を観察する。
リファキシミンの影響を受ける微生物コミュニティの特定
リファキシミンは、腸内環境が健康であることを示すビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属などのプロバイオティクス種の増殖を促進する（Maccafferiiら、2010、Ponzianiら、2016）。細菌門レベルでは、リファキシミンは、レット症候群マウスにおいて減少が見られるテネリクテス門の増殖を促進することが本研究で報告されている（図７）。
上記を踏まえ、溶媒処置WTマウス、リファキシミン処置WTマウス、溶媒処置R6/2 HDマウスおよびリファキシミン処置R6/2 HDマウスにおいて腸内微生物叢の16S RNA配列分析を実施し、リファキシミンによって誘導される微生物の変化を観察する。
上記を目的とした研究から、リファキシミンを使用して腸内環境を変化させることによってHD症状の進行が影響を受けるかどうかを知ることができる。リファキシミンは、HDハエにおける変異型HTTの凝集を減少させる（図１）。したがって、特定の理論に制限されるものではないが、本研究において、リファキシミンはHDマウスのENSにおいて同様の効果を発揮する可能性があると考えられる。また、本研究で報告したレット症候群マウスのデータを考慮すると、リファキシミンはHDマウスの運動症状を減少させる可能性があると考えられる。認知および作業記憶に対してリファキシミンが有益な効果を有することは、HE患者において実証されている（Ahluwaliaら、2014）。リファキシミンは、微生物の増殖を抑制する以外にも、腸上皮の完全性を維持して腸内の炎症状態を低下させるプレグナンX受容体（PXR）などの解毒シグナル伝達経路の発現を誘導し活性化させるという機能を有する（Mencarelliら、2010）。リファキシミンは、様々な微生物媒介性障害に臨床適用でき、副作用も最小限しか認められない。
したがって、リファキシミンを含むか、実質的にリファキシミンからなるか、またはリファキシミンからなる使用、方法、組成物および組み合わせ製品は、HDの認知症状の治療に有用でありうると考えられる。
実施例７：腸内微生物相および腸内微生物叢の恒常性におけるMeCP2の役割
本実施例で述べる研究は、158番目のスレオニンがアラニンに置換された点突然変異（T158A）を有するMeCP2（T158A）レット症候群マウスモデルにおいて行った。T158A変異は、DNAへのMeCP2の結合を阻止し、そのターンオーバーを増大させる。このマウス系統は、ペンシルバニア大学のZhaolan（Joe）Zhou博士の研究室において作製されたものであり、レット症候群支援団体のためにJackson Laboratoryに寄託されている。T158Aレット症候群マウスの表現型としては、発達退行、運動障害、常同症、呼吸異常、学習障害および記憶障害が挙げられる（Goffinら、2011）。症状の重症度は、MeCP2 nullマウスに見られるものに匹敵する。雄性マウスは生後2ヶ月程度で症状を発症し、徐々に死亡する。一方、雌性マウスは約8〜9ヶ月齢で症状を示し始める。興味深いことに、雌性レット症候群マウスは約4ヶ月齢から体重が増加し始め、次第に肥満となる。これらの代謝変化の原因は未だ解明されていない。しかし、腸におけるディスバイオシスが一定の役割を果たしていると見られ、これについては後述の節で説明する。様々なアッセイの実施についての詳細は、「材料および方法」の節で説明する。
レット症候群マウスの腸上皮におけるMeCP2発現が消化管病変を変化させるかどうかの検討
成人の消化管は、最も大きい臓器の一つであり、その長さは約22フィートであり、250m2の表面積を有する。腸の表面は腸上皮によって保護されており、腸上皮は、栄養の吸収、成長因子および抗微生物ペプチドの産生、有害な細菌の定着の阻止、循環系への腸内容物の漏出を防ぐバリアの形成などの様々な機能を果たしている。免疫組織化学分析によって腸上皮のMeCP2を検出する条件を確立した（図８Ａ〜Ｂ）。特に、腸上皮の再生において前駆体として機能する陰窩細胞においてMeCP2が発現している（図８Ａ、右下のパネルの矢印）。MeCP2は、筋層間神経叢（腸神経系）に豊富に見られるとともに、粘膜固有層に浸潤している免疫細胞においても豊富に存在する（図８Ｂ、上段のパネルの矢印）。MeCP2染色の強度は小腸の絨毛（腸上皮の指状の突起）によって様々に変動することが観察され、MeCP2の量が制御されている可能性が示唆された（図８Ａ、左側の上段および下段のパネル）。細菌性LPSは、CNSにおけるMeCP2の発現および活性を誘導し、認知に関与するシナプス関連タンパク質の産生を変化させる（Bieら、2013）。
特定の理論に制限されるものではないが、これらの知見、および小腸では部位によってMeCP2の量が変化するという知見から、MeCP2が微生物のシグナル伝達の標的である可能性があるという概念が支持される。さらに、これらの研究から、レット症候群に関連した腸の生理機能においてMeCP2が一定の役割を果たしていることが示される。
実施例８：レット症候群マウスの消化管における解剖学的変化
全般的な解剖学的変化についてレット症候群マウスの消化管を調べた。レット症候群マウスの小腸および結腸は、WT同腹子のものよりも短いことが観察される（図９Ａ〜Ｃ）。これらの変化は、体重とも体の大きさとも無関係であった。興味深いことに、腸の長さは離乳の時点では有意に異ならず、加齢および／または環境要因がレット症候群マウスの消化管異常の発症に寄与している可能性が示唆される（図９Ｄ〜Ｅ）。組織学的には、陰窩（腸上皮で見られるような、パネート細胞が含まれることのある細胞構造）のパネート細胞は、抗微生物ペプチドであるリゾチームを認識する抗体を使用した染色によって特定されるが、レット症候群マウスでは、陰窩においてパネート細胞の数が局所的に減少している（図９Ｆ）。パネート細胞は腸上皮の継続的な再生に関与し、宿主−微生物叢の恒常性に対して最も強力な効果を発揮する抗微生物ペプチドのいくつかを産生する（Cleversら、2013a）。小腸の回腸部分から単離されたmRNAの調査では、レット症候群マウスでは、デフェンシンやリゾチームなどの抗微生物物質の発現が有意に減少することが示唆されている（データ示さず）。
特定の理論に制限されるものではないが、パネート細胞が局所的に減少することによって腸内微生物叢の恒常性の崩壊が始まり、これによって有害な細菌が過剰に増殖し、正常なニッチから遊離して消化管の他の部位に拡散するという仮説が立てられる。さらに、MeCP2が存在しないことによって引き起こされた「乱れた周辺環境」からなるこのような病巣は免疫細胞を動員し、過剰な炎症メディエーターの放出によって消化管病変をさらに悪化させうる。特定の理論に制限されるものではないが、レット症候群マウスの腸上皮においてMeCP2を発現させることによって、MeCP2が腸内微生物叢の恒常性を正常化して、観察される表現型のいくつかを緩和するかどうかを検討することができると考えられる。
MeCP2Flox-STOPマウスはMeCP2を発現しないが、loxPに挟まれた終止コドンを含み、これはCreリコンビナーゼを有する系統と交配することによって除去することができ、このようにしてMeCP2の発現を再活性化することができる。MeCP2Flox-STOP系統は、エディンバラ大学のAdrian Bird博士のグループによって作製されたものであり、レット症候群支援団体のためにJackson Laboratoryに寄託されている（Guyら、2007）。本発明者らは過去に、この系統とvav-Cre系統とを交配することによって、免疫系においてMeCP2を再活性化することに成功を収めた（Khoshnanら、未発表データ）。MeCP2Flox-STOPヘテロ接合型の雌性マウスをWT villin-Cre雄性マウスと交配させて、腸上皮において選択的にMeCP2を再活性化することができる。villin-Creマウスは、腸幹細胞コンパートメントおよび上皮の適切な再生に関与する他の細胞、ならびに有糸分裂後の小腸および大腸の上皮内層において、Creリコンビナーゼを発現する（Cleversら、2013b）。上述のようにして新たに作製した系統をMeCP2vil-Cre+と呼ぶ。MeCP2の発現は、図８と同様の手順を使用して免疫組織化学分析により確認することができる。MeCP2vil-Cre+系統を樹立した後、腸の長さの変化および腸の病変の変化、パネート細胞の数、腸の再生について仔マウスを調べる。また、BrdU標識法を使用して、腸上皮細胞（IEC）の発生および成熟をモニタリングする。さらに、陰窩細胞、増殖中の前駆細胞および腸上皮細胞（IEC）におけるBrdUの取り込みを、細胞特異的バイオマーカーを使用して各子孫を染色することによって測定する。標準的な統計ソフトウエアでデータを評価する（Hsiaoら、2013）。また、パネート細胞の数に対するMeCP2の効果を観察する。さらに、これらのfloxedマウスの腸のmRNAをRT-qPCRで測定することによって、公知の抗微生物ペプチドの量について調べる（Cleversら、2013a）。特定の理論に制限されるものではないが、これらの研究から、腸上皮の発達および抗微生物ペプチドの産生を制御するというMeCP2の新たな機能を特定することができると考えられる。4週齢のマウスの腸においてBrdU標識を調べるための条件を図１０に示す。
腸内微生物叢の恒常性におけるMeCP2の役割の調査
腸内細菌のメタゲノム配列分析において、レット症候群マウスはWTコホートと比較して、変化した微生物叢を有することが示される。大部分を占める細菌門であるファーミキューテス門の割合は約10％増加している。また、レット症候群マウスでは、テネリクテス門およびアクチノバクテリア門の量は有意に少ない（図１１Ａおよび図１１Ｂ；色で明示している）。アクチノバクテリア門には、腸内微生物叢の恒常性に大きく関与するビフィドバクテリウム属が含まれる。ビフィドバクテリウム属は、約6週齢からレット症候群マウスの消化管から排除され始め、この後にレット関連症状が出現する（図１１Ｃ；Goffinら、2011）。4ヶ月齢の雌性レット症候群マウスの微生物叢は最近になって配列分析されており、ディスバイオシスが特定された。雄性マウスと雌性マウスのマイクロバイオームでは差異が見られるが、ビフィドバクテリウム属の量が減少しているという表現型は共通している。これらの知見は、半定量PCRで確認された（図１１Ｄ）。腸内のビフィドバクテリウム属は加齢とともにその量が減少し、ビフィドバクテリウム属の減少はIBD患者、肥満患者、アレルギー患者および一部の自閉症患者においてより顕著であることには大きな意義がある（Riviereら、2016）。また、ビフィドバクテリウム属は、幼児の腸内で最初に定着する最も重要な細菌種の一つであり、ビフィドバクテリウム属が腸内に存在することによって、免疫発達のための代謝産物を生成し、病原性細菌の増殖を制限するという健康な環境が形成される（Arboleyaら、2016）。さらに、最近の報告では、レット症候群患者において腸のディスバイオシスが示されている（Stratiら、2016）。本研究で報告された結果から、哺乳動物における腸内微生物叢の恒常性にMeCP2が顕著に関与するという概念が支持される。
上述の知見を踏まえ、WTマウス、親MeCP2 nullマウスおよびMeCP2 vil-Cre+マウスにおいて腸内マイクロバイオーム（集合的な細菌DNA）を16S RNA配列分析によってプロファイリングし、腸内MeCP2の再活性化がディスバイオシスを正常化するかどうかを検討する。雄性マウスおよび雌性マウスの両方において細菌DNAの配列を分析する。本研究で示されたデータから雌性レット症候群マウスにおけるディスバイオシスは約4ヶ月齢で起こり、これに対して雄性レット症候群マウスでは生後約6週間でディスバイオシスが起こることが示唆されたことから、新たな腸内細菌のプロファイリングは同様の時点において行うこととする。配列分析、データの収集およびコンピューター解析を行う。ビフィドバクテリウム属の定着は、微生物叢の変化を長期的にモニタリングする際にも有用である。特に、ビフィドバクテリウム属は、腸内のその他の細菌種、特に免疫系および脳機能に影響を与える小分子を産生する細菌種の増殖を支持する（Arboleyaら、2016）。したがって、これらの実験は、ビフィドバクテリウム属の変化を特定することを含む。
実施例１０：リーキーガットおよび代謝障害におけるMeCP2の役割
腸上皮の完全性は、全身の健康状態および適切な腸−微生物叢相互作用に関与する。レット症候群マウスの消化管は、一部の領域が透過して炎症を起こしており、気泡で満たされている（図１２Ａ）。また、レット症候群マウスは、WTマウスよりも血清中LPSの濃度が高く、「リーキーガット」表現型であることが分かる（図１２Ｂ）。LPSは容易にCNSに移行し、これによって神経炎症が引き起こされ、海馬神経新生などの様々な生物学的プロセスが破綻しうる（Trottaら、2014）。さらに、レット症候群マウスでは、腹部の脂肪組織が多量に蓄積している（図５Ｃ〜Ｄ）。過去の報告によれば、MeCP2は脂質代謝に関与することが示されており、生物における脂肪酸の産生に関与する酵素の発現を制御していることが報告されている（Kyleら、2016）。無菌（GF）のレット症候群マウスが顕著な腹部脂肪を有さず、腸の長さが正常であることは注目に値する。これらの知見から、腸内MeCP2と微生物叢の間の相互作用が腸内生理機能およびこれに関連する代謝経路に影響を与えうることが示唆される（図１２Ｅ〜Ｆ）。
MeCP2が腸透過性を制御するかどうかを検討するため、WTマウス、レット症候群マウス（MeCP2 Flox-STOP）および腸内のみでMeCP2を発現するマウス（MeCP2 vil-Cre）の血清中のLPS濃度を定量し、比較する。また、蛍光色素FITC標識デキストラン硫酸の循環系への流入を測定することによってリーキーガットを調べる。これらの実験プロトコルは、Hsiaoら（2013）による報告に従った。さらに、マウスの腹部における脂肪の蓄積を調べることにより、腸内脂質代謝における腸内MeCP2の役割を調査する。無菌のレット症候群マウスについてもリーキーガットを調べる。特定の理論に制限されるものではないが、これらの実験によって、腸内生理機能におけるMeCP2の役割を知ることができ、レット症候群マウスにおけるMeCP2の欠損が消化管異常および代謝異常をどのように促進しているのかを知ることができる。
実施例１１：レット症候群マウスの免疫機能障害の調査
腸内微生物叢の恒常性は、免疫系の適切な発達に大きく関与する。レット症候群マウスは免疫機能障害を示し、たとえば、ミクログリアおよびマクロファージの数ならびにそれらの機能に障害が見られ、サイトカイン／ケモカインの産生が増加している（Cronkら、2015）。また、ゼブラフィッシュの腸上皮において、メチル化によるエピジェネティックな抑制が欠失すると、サイトカイン誘導性のIBDが促進されることには大きな意義がある（Marjoramら、2015）。本発明者らは、腸上皮においてMeCP2が欠失すると、腸−免疫相互作用が損なわれると推測する。本研究における観察結果から、レット症候群マウスの絨毛においてマクロファージが濃縮されて「アポトーシス」を起こしたと見られることから、マクロファージが機能障害を起こした可能性があることが示唆される（図１３）。しかし、この表現型は散発性であり、局所的な「ディスバイオシス病巣」によって腸内免疫細胞の活性が局所的に変化したことが示唆される。これらの知見と一致して、腸内マクロファージの数は、症候性MeCP2 nullマウスにおいて減少している（Cronkら、2015）。
さらに、実験を繰り返してこれらの結果を定量することにより、MeCP2の再活性化によって免疫細胞の「アポトーシス性」の表現型が是正されるのかどうかを検討する。また、WTマウス、レット症候群マウス（MeCP2Flox-STOP）および腸内において選択的にMeCP2を発現するマウス（MeCP2vil-Cre+）の小腸の粘膜固有層からマクロファージ／単核細胞を単離し、マルチカラーフローサイトメトリーを実施して、活性化細胞表面マーカーの発現に基づいて表現型を定量および測定する。LPSはMeCP2を調節することから（Bieら、2013）、Luminexアッセイを使用して非刺激条件下またはLPS刺激条件下で腸内の単球／マクロファージのサイトカインプロファイルを測定する（プロトコルについてはHsaioら（2013）を参照されたい）。同様にして、実験に供したすべてのマウスの血清中サイトカインについても調査を行い、定量する。プロファイルの変化を観察し、RT-qPCRによって確認する。これらの研究から、自然免疫細胞の発達およびその活性に対する腸内MeCP2の関与を確認することができる。
実施例１２：MeCP2vil-Cre+マウスの行動解析
本明細書で説明した、腸上皮においてMeCP2が再活性化しているマウスにおいて、（実施例１９の記載に従って）行動解析を行うことによって、腸内環境の正常化がレット症候群マウスの異常行動に及ぼす効果を測定する。運動症状の測定では、ロータロッド試験、ビームバランス試験および抱擁反射アッセイを使用する。不安関連障害の測定は、オープンフィールド試験、明暗箱試験およびビー玉埋め試験を使用する。レット症候群では呼吸異常がよく見られるため、腸においてMeCP2を発現させることにより、全身性炎症を低減し、かつ／または保護作用を有する微生物産物の産生を促進させ、これによって呼吸に影響を及ぼすことが可能であるかどうかを全身プレチスモグラフィーにより検討する。腸においてMeCP2を発現させた場合のこれらのパラメータに対する効果を観察する。
実施例１３：レット症候群の発症機序における腸のディスバイオシスおよびMeCP2の評価
無菌マウスは、宿主に対する微生物叢の効果を調査するための強力なツールとなる。本発明者らは、MeCP2の活性に対して腸内微生物叢が与える影響を検証するのに有用に使用できる可能性のある無菌のレット症候群マウスコロニーを構築し、異常行動に対する腸内環境の効果を測定し、プロバイオティクスを定着させることによってレット症候群の症状の重症度を低減することができるかどうかを調査した。
無菌のレット症候群マウスの行動解析
無菌WTマウスは、運動活性が増大しており、不安が減少しており、脳由来神経栄養因子（BDNF）の量が多いが、これらの特徴は従来のレット症候群マウスおよびレット症候群患者において報告されている特徴とは対照的である（Lombardiら、2015、Luczynskiら、2016）。したがって、無菌WTマウス、無菌のレット症候群マウスおよび通常の条件下で飼育したコホートにおける異常行動を調査することによって、これらのマウス群に差異があるのかどうかを決定することができる。一例として、無菌マウスにおいて、運動機能、反復行動、不安、ならびに学習および記憶を調べることができる。さらに、無菌環境が必要とされなくなった場合、呼吸異常を調べることもできる。特定の理論に制限されるものではないが、これらの研究によって、レット症候群における腸のディスバイオシスとCNS症状の進行とが関連付けられる可能性があると考えられる。
無菌のレット症候群マウスの転写プロファイリング
腸内微生物叢がどのようにしてレット症候群における行動を制御しているのかという分子機構を解明することによって、新たな病原経路および治療標的を特定することが可能であると考えられる。無菌マウスと従来のレット症候群マウスとの間での行動の差異が見出されれば、mRNAを配列分析し、すべての実験群の腸組織および脳組織からmRNAを単離し、微生物叢−MeCP2相互作用によって制御されている可能性のある遺伝子を特定することができる。RT-qPCRによって、選択された目的の標的を検証し、定量することができる。
無菌のレット症候群マウスの腸におけるプロバイオティクスの定着
共生細菌であるバクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）は、有望なプロバイオティクスの１種であり、ヒトの腸に定着する（Mazmanianら、2005）。神経発達障害の環境マウスモデルをＢ．フラジリスで処置することによって、腸内微生物叢が変化して抗炎症環境が促進され、自閉症様行動の重症度が低下する（Hsiaoら、2013）。また、Ｂ．フラジリスの定着は、多発性硬化症やIBDなどのその他の疾患モデルにおいても保護作用を発揮する（Chuら、2013）。これらの知見から、自閉症の小児およびIBDの患者におけるＢ．フラジリスの臨床試験が進められている。
レット症候群に対してもこの治療法を実施可能であるかどうかを調査するため、無菌のレット症候群マウスにＢ．フラジリスを定着させ、本明細書の記載（たとえば実施例１９）に従って異常行動および異常病変に対する効果を調べる。ヒト患者におけるＢ．フラジリスの使用を検証するため、健常ヒトドナー由来の糞便材料においてＢ．フラジリスを濃縮し、上記と同様にして無菌のレット症候群マウスに定着させ、その効果を調べる。メタゲノム16S RNA配列分析および培養を実施して、細菌の定着、細菌負荷および細菌の多様性を確認する。Ｂ．フラジリスは、レット症候群に伴う症状を緩和し、該症状を発症する可能性を低減し、かつ／または該症状の発症を遅延すると予想される。
実施例１４：レット症候群マウスに対するリファキシミンの効果
レット症候群マウスの腸内微生物叢を除去することによって消化管病変が変化するかどうかを調べた。注目すべきことに、抗生物質カクテルによる処置を行ったところ、小腸の長さが有意に増加し、腹部脂肪の蓄積が減少した（図１４Ａ、追加データ示さず）。しかし、抗生物質カクテルに含まれる抗生物質の一部は毒性を有している可能性があることから、データ解析およびさらなる評価が煩雑となる。これを踏まえ、臨床的に有用な抗生物質が同様の効果を発揮しうるかどうかを調査した。リファキシミンは、腸特異的抗生物質であり、安全で、ヒトにおける忍容性が高い（Bajaj、2013）。リファキシミンは、臨床試験において、肝性脳症（HE）患者において細菌負荷を減少させ、リーキーガットを是正し、不安、易刺激性、抑うつ状態、運動症状、認知障害などのいくつかの異常行動の重症度を低減することが示されている（Bajajら、2013、Kokら、2013）。肝性脳症（HE）は、腸のディスバイオシスと強い関連性を有する腸−肝−脳軸の障害モデルである（Bajaj、2013）。また、リファキシミンは、予備試験において、パーキンソン病患者の運動機能を向上させることが示された。リファキシミンの効果の詳細については、臨床試験で検討中である（インターネット経由でClinicalTrials.govより入手可能である；Fasanoら、2013）。
離乳後のレット症候群マウスをリファキシミンで6週間処置することによって結腸が選択的に伸長され、消化管肥満が予防されることが観察された（図１４Ｂ〜Ｃ、データ示さず）。雌性レット症候群マウスも肥満を呈し、過剰な脂肪組織が蓄積されるが、これらの代謝変化を発症する前にリファキシミンで処置すると、このような代謝変化は起こらない（図１４Ｄ〜Ｆ）。一部のレット症候群患者において体重増加は問題視されない場合があるが、上記の結果からは、MeCP2が存在しないことによって微生物の誘導による代謝変化が引き起こされ、この代謝変化は微生物叢を改変することによって正常化することができることが示唆される。しかし、レット症候群患者の特定のサブセットは、体重が増加し、脂質代謝異常を示す（Kyleら、2016）。
上記データから、臨床的に有用な抗生物質であるリファキシミンでレット症候群マウスを処置することによって腸の形態学的特徴が有意に改善され、腹部脂肪の蓄積が減少することが示された。
実施例１５：レット症候群におけるアストロサイトおよびミクログリアに対するリファキシミンの効果
レット症候群マウスにおいてアストロサイトは異常を示し、アストロサイトにおいてMeCP2が再活性化されることによって、歩行運動や不安などの異常行動が是正され、寿命が延長され、呼吸異常が正常化される（Lioyら、2011）。
リファキシミンで処置した一部のレット症候群マウスの皮質領域の脳切片において、グリア線維酸性タンパク質（GFAP）やグルタミン合成酵素（GS）などのバイオマーカーの染色が、溶媒処置コホートよりも低下したことが観察された（図１５Ａ）。この知見は再確認することができ、定量して統計解析を行うことができる。GFAPおよびGSの増加は、アストロサイトの活性化および炎症と関連性がある。アストロサイトは、神経炎症、神経変性および神経精神障害の治療標的として認識されている。腸内微生物のいくつかのサブセットは分子を産生し、これがCNSに到達し、アストロサイトの活性を低下させ、炎症性サイトカインの産生を減少させる（Rothhammerら、2016）。さらに、腸内細菌は、CNSの免疫細胞であるミクログリアの発達に大きな影響を与える（Ernyら、2015）。レット症候群マウスの脳切片をミクログリアのバイオマーカーで染色したところ、ミクログリアの数が一部のリファキシミン処置マウスで減少していたことが分かった（図１５Ｂ）。
したがって、これらのデータから、レット症候群をリファキシミンで処置することによって、アストロサイトの活性化および炎症に関連するバイオマーカー染色が低下したことが示された。
上記データでは、リファキシミンを飲料水に加えて送達したため、各マウスが摂取した用量が異なっている可能性があった。このため、用量曲線を作製するための追加の研究を行うことができる。たとえば、動物に既知の量のリファキシミンを強制経口投与することによって、確実に同じ量を送達することができる。アストロサイトおよびミクログリアを溶媒処置マウスおよびリファキシミン処置マウスから単離することができ、mRNA配列分析を行ってリファキシミン処置によって制御される遺伝子産物を特定することができる。
実施例１６：レット症候群の行動に対するリファキシミンの効果
リファキシミンで処置したレット症候群マウスは、ホームケージ環境において活動性がより高く、巣作りもより良好である（図１６Ａ）。巣作りは、げっ歯類の良好な健康状態、日中活動、積極的な意欲状態および健康な脳機能を示す（Jirkof、2014）。特定の理論に制限されるものではないが、リファキシミンで処置された動物の方が金網製の円筒を登ろうと試みた回数がより多く、筋力がより強く、ジストニアおよび筋協調の喪失の徴候を示す抱擁反射の表現型が減少していることから、リファキシミンは、レット症候群マウスの運動症状も改善すると考えられる（図１６Ｂ〜Ｄ）。また、リファキシミンがHE患者およびPD患者においてパーキンソン病様症状を緩和することが認められる（Fasanoら、2013、Kokら、2013）。これは、本研究で観察されたレット症候群マウスにおける運動性の改善と一致する。本研究におけるデータは、ロータロッド試験、ビームバランス試験、オープンフィールド試験などのさらなる行動試験で確認することができる。これらの研究から、レット症候群におけるCNS病変および／または異常行動に対するリファキシミン療法のベネフィットを確認することができる。任意で、実施例１７の一部で説明するように、リファキシミンの影響を受ける腸内細菌を特定することができる。
実施例１７：レット症候群における腸内微生物叢と海馬神経新生の関連性の調査
レット症候群の共通点は知的障害である。海馬神経新生における障害は、レット症候群における認知障害と関連性がある（Ramockiら、2008）。成体のレット症候群マウスは、海馬神経新生の低下を呈し（図１７Ａ、下段のパネル）、これによって認知が損なわれ、不安および抑うつ状態が誘導されると考えられる。若い従来のレット症候群マウスでは神経新生は正常である。さらに、無菌のレット症候群マウスでは、新生される海馬ニューロンの数に減少は全く見られない（図１７Ｂ）。この知見は、BrdU取り込みを用いてさらに確認および定量することができる。無菌WTマウスでは、海馬神経新生が増加すると見られ（Ogbonnayaら、2015）、このことから、無菌のレット症候群マウスで観察された結果を説明することができる。特定の理論に制限されるものではないが、レット症候群マウスに脳深部刺激を与えることによって海馬神経新生が促進され、学習および記憶が向上することから、CNS環境を変化させることによってレット症候群における認知障害が治療可能である可能性が示唆される（Haoら、2015）。特定の理論に制限されるものではないが、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って腸内生理機能を操作することによって、レット症候群マウスにおいて海馬神経新生が誘導され、認知を向上することができると考えられる。
レット症候群マウスにおける神経新生に対する微生物叢の効果の決定
リファキシミンによってHE患者の認知タスクが改善することから（Ahluwaliaら、2014）、リファキシミンがレット症候群マウスにおける神経新生に影響を与えうるかどうかを試験した。リファキシミンで処置したレット症候群マウスは、溶媒処置レット症候群マウスと比較して、海馬神経新生が向上しており、樹状突起の分枝が増加することがデータから示される（図１８Ａ〜Ｂ）。
リファキシミン処置マウスでは、CNS神経新生の別のニッチである脳室下帯（SVZ）において細胞増殖の増強も観察された（図１８Ｃ）。特定の理論に制限されるものではないが、このデータから、リファキシミンがレット症候群マウスの神経化学的機能に対して幅広い効果を発揮する可能性が示される。
上記の研究から、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って腸内環境を変化させることによって、レット症候群マウスの脳を改変することができることが示された。さらに、BrdU標識法を使用することによって、新たに生じたニューロンが長期にわたって生存し、脳回路に組み込まれるかどうかを検討することができる。
リファキシミンの影響を受ける海馬遺伝子標的の特定
無菌のレット症候群マウスは神経新生障害の徴候を全く示さない（図１７Ｂ）。
したがって、特定の理論に制限されるものではないが、選択される遺伝子の発現量は、リファキシミンで処置した従来のレット症候群マウスと無菌のレット症候群マウスの間で同程度である可能性があると考えられる。このような遺伝子の研究によって、MeCP2−微生物叢相互作用によって制御される海馬神経新生経路を特定することができる。
学習および記憶に対するリファキシミンの効果を決定する。新奇物体認識試験およびバーンズ迷路試験などの行動試験を実施して、レット症候群マウスの認知タスクに対するリファキシミン処置の効果を決定する。無菌WTマウスおよびレット症候群マウスについても、これらの行動試験を行い、結果をリファキシミン処置コホートと比較する。レット症候群マウスの認知タスクに対する腸内微生物叢の効果およびリファキシミン処置の効果を観察する。リファキシミンで処置したレット症候群マウスにおいて学習および記憶が改善されると予想される。
したがって、神経新生に対して観察されたリファキシミンの効果に関与する分子標的を特定する。溶媒処置WTコホート、リファキシミン処置WTコホート、溶媒処置レット症候群コホートおよびリファキシミン処置レット症候群コホートの海馬においてmRNA配列分析を行う。RT-qPCRによって結果を検証し、さらに無菌のレット症候群マウスにおいても結果の検証を行う。
したがって、リファキシミンは、本明細書に記載の実施形態のいくつかよる知的障害の治療薬候補として考えられる。
実施例１８：リファキシミンの影響を受ける微生物コミュニティの特定
リファキシミンを使用してヒト微生物叢を処置することによって、レット症候群マウスにおいて減少が観察されるビフィドバクテリウム属などのプロバイオティクス種の増殖が促進される（Maccafferiiら、2010、図４Ｃ）。驚くべきことに、リファキシミンは、レット症候群マウスの消化管においてビフィドバクテリウム属の存在量を増加させず、リファキシミンの保護作用はその他の細菌の組成の変化によってもたらされることが示唆された。興味深いことに、リファキシミンによって、レット症候群マウスにおいて減少が見られる別の細菌であるテネリクテス門の存在量が増加した（図７、図１１および図１９）。ヒトの健康状態におけるテネリクテス門の役割はあまり知られていない。しかしながら、動物では、テネリクテス門の存在と粗繊維の消化の間には相関関係がある（Niuら、2015）。この事実とは関係なく、上記のデータから、リファキシミンは、微生物叢の組成を変化させ、この変化は神経新生を促す微生物の定着に有利に働く場合があることが示唆される。
さらなる研究では、溶媒処置WTマウス、リファキシミン処置WTマウス、溶媒処置レット症候群マウスおよびリファキシミン処置レット症候群マウスの16S RNA配列分析を行う。この実験によって、MeCP2の存在下または非存在下においてリファキシミンによって誘導される微生物組成の変化が特定できると予想される。割合が増加した培養可能な細菌種のうち、第一候補をレット症候群マウスに定着させて、海馬神経新生および認知関連行動に影響を与えることができる。
また、特定の理論に制限されるものではないが、リファキシミンは、神経新生に悪影響を与えうる特定の細菌種の増殖を抑制させうると考えられる。さらに、このような細菌種を無菌のレット症候群マウスに定着させて、その役割を確認することができる。さらに、海馬における新生ニューロン数の減少、免疫組織化学分析および行動解析から、神経新生への悪影響におけるこのような細菌種の役割を特定することができる。
実施例１９：材料および方法
動物モデル
動物実験はいずれも、動物実験委員会およびカリフォルニア工科大学の動物ガイドラインに従って行う。実験の大部分では、MeCP2-null（MeCP2Flox-stop）およびMeCP2（T158A）を使用する。MeCP2Flox-stopとvillin-Creを交配することによって、MeCP2vill-cre+を作製する。雄性マウスは短期間で表現型が強く発現されることから、コストを削減し、迅速に結論を得るために、最初に雄性マウスを調査する。特定の実験において結果が陽性であった場合に、この結果を雌性マウスにおいて検証することができる。行動解析の多くでは、P値<0.1〜0.5の有意差を得るために各実験群につき約15〜20匹のマウスが必要と推定される。これには、通常、各群につき約5〜6匹の妊娠中の雌性マウスが必要である。組織学的分析、生化学的分析および遺伝子研究においては、各群につき約6匹のマウスを使用する。このプロジェクトのための動物の使用については規制委員会の調査が完了しており、提案した研究（プロトコルNo.1726）を完了するのに必要な実験手順は、カリフォルニア工科大学のIACUCによる承認を受けている。
無菌のレット症候群マウスの作製および調査
カリフォルニア工科大学のノトバイオート施設において確立された手順によって無菌のレット症候群マウス（T158A）を作製する。好気条件下および嫌気条件下での培養ならびにPCRによって、マウスにおける微生物の存在を常法で試験する。このマウスコロニーを樹立し、現在、様々な実験において使用するために繁殖させている。
リファキシミンによる処置
リファキシミンによる処置は、通常、約4〜5週齢において開始され、6週間にわたって継続する。これは、雄性マウスが約10週齢において症状を呈し始めるという観察結果に基づく。予備試験の結果は、リファキシミンを飲料水に添加して、非侵襲的な方法で投与することによって得た。結果の変動が大きい場合、マウスに強制経口投与することによって、各マウスに確実に同じ量のリファキシミンが投与されるようにする（Hsiaoら、2013）。
組織学的分析、免疫組織化学的分析および免疫蛍光分析
レット症候群マウスが消化管障害を呈するかどうかを試験するために、肉眼解剖分析によりレット症候群マウスを調べ、図９に示すように消化管の長さを測定する。MeCP2は腸幹細胞の形成に影響を与える可能性があることから、様々なレット症候群モデルにおける腸幹細胞の分化についても調べる。腸幹細胞は自己複製し、内分泌細胞、腸細胞、杯細胞およびパネート細胞に分化する（Yinら、2014）。各細胞型は、免疫化学分析によって特定可能な特異的なマーカーの発現によって特定される。腸幹細胞は、Lgr5/GPR49などのマーカーを発現する。腸細胞は、E-カドヘリン、アルカリホスファターゼおよびレクチン結合タンパク質などの識別可能なマーカーを数多く有する（図８）。また、杯細胞は、ムチン（MUC2）の選択的発現によって特定することができ、パネート細胞はリゾチームなどのマーカーの特異的発現によって特定される（Yinら、2014、図９Ｆ）。これらのマーカーに対する抗体は市販されており、同様の研究に使用されている。各細胞マーカーに選択的な抗体を使用して、MeCP2の有無が腸幹細胞の分化に影響を与えるのかどうか、および消化管における様々な腸細胞の割合を変化させるのかどうかを調べる。
BrdU標識法
特定の理論に制限されるものではないが、MeCP2は腸幹細胞に発現されるとともに、腸上皮の再生を支持する細胞においても発現されていることから、腸幹細胞の異常増殖は、腸の長さが短くなることの一因であると予想される（図８）。これについて詳しく試験するため、成体WTマウスおよび成体レット症候群マウスにBrdU（50μg/g体重）を注射して腸幹細胞を標識し、腸上皮の再生に要する時間である3〜4日間にわたってBrdUの取り込みを追跡する。注射後、様々な時点でマウスを屠殺し、固定し、免疫組織化学分析によって調べる。腸上皮をBrdU標識した代表的な写真を図１０に示す。
リーキーガットの調査
レット症候群マウスがリーキーガットを呈するかどうかを試験するため、雄性および雌性のWTマウスおよびレット症候群マウスを一晩絶食させ、翌日、FITC−デキストラン（シグマ、4K）を（強制経口投与によって）経口摂取させる。過去の研究では、0.6mg/kgの用量が使用されている（Hsiaoら、2013）。本実験では、同様の手順および濃度を使用する。強制経口投与の4時間後に血漿試料を採取し、分光光度計（励起光：485 nm／発光：535 nm）を使用して蛍光強度を測定する。各実験では、症候性の雄性マウス6匹および症候性の雌性マウス6匹に加えて、同齢のWTマウスを使用する。雄性レット症候群マウスはより早くに症状を発症するため、様々な月齢において実験を行う（約3ヶ月齢の雄性マウスおよび約8ヶ月齢の雌性マウス）。レット症候群マウスがリーキーガットを有している場合、症状を発症する前の動物コホートを調べて、リーキーガットが症状の発症よりも以前に見られるかどうかを検討する。陽性の結果が得られた場合、リーキーガットがレット関連症状の一部に寄与しうる形成異常である可能性が示される。リーキーガットは、図１２Ｂに示すように、LPSの濃度を定量することによって測定される。レット症候群マウスはリーキーガットを呈すると予想される。
マクロファージ、ミクログリアおよびアストロサイトの単離
過去に報告されているプロトコルに従って、腸管マクロファージを濃縮する（Harusatoら、2016）。簡潔に述べると、標準的な手順によって動物の小腸を切開し、コラゲナーゼ溶液で消化する。単細胞懸濁液を単離し、単球／マクロファージ細胞表面マーカーで染色し、フローサイトメトリーで定量する。この実験は、カリフォルニア工科大学のフローサイトメトリー施設を利用して行う。同様の手順を使用して、CNSからミクログリアおよびアストロサイトを単離する。ミルテニーバイオテク社（カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されているキットを利用して、各細胞型を濃縮する。
血清中のサイトカインおよびケモカインの分析
複数種のサイトカインおよびケモカインを同時測定できるよう設計されたLuminexアッセイを使用して、LPS刺激に応答した炎症性サイトカインの産生について、WTマウスおよび（症状発症前または症候性の）レット症候群マウスの腸管マクロファージ／単球を調べる。これらのアッセイの手順は確立されている（Hsiaoら、2013）。統計学的有意性を得るために、WTおよび変異体を一回の試験あたり各6匹使用する。非刺激マクロファージおよびLPS刺激マクロファージから単離されたmRNAをRT-qPCR解析することによって、標的の発現の変化を確認する。標的の変化が観察されると予想される。
微生物叢の配列分析
レット症候群マウスが腸のディスバイオシスを呈するかどうかをより詳しく理解するため、16S RNA配列分析によって腸試料の微生物プロファイルを測定する（図１１）。レット症候群マウスの腸内マイクロバイオームを詳しく調べるため、雄性マウスおよび雌性マウスから得た糞便試料を使用して配列を分析する。各群（WTマウスおよびレット症候群マウス）ならびに3週齢マウス、2ヶ月齢マウスおよび4ヶ月齢マウスから6つの試料を採取し、DNAを抽出して配列分析を行う。これらの手順を踏むことによって、単離された細菌の属および種を約90％の精度で特定することができる。配列分析およびバイオインフォマティクス解析は、カリフォルニア工科大学のゲノム施設を利用して行う。
mRNA配列分析
mRNAの発現を調査するため、標準的な手順によって腸断片または脳領域を単離する。TriZolを使用してトータルRNAを抽出し、RNA精製カラムでさらに精製する。カリフォルニア工科大学のゲノム施設を利用して、mRNA配列分析を行い、データをコンピューター解析して、微生物叢の影響を受ける可能性のある標的を特定する。選択された標的を、標準的な手順を使用したRT-qPCRによって検証する。レット症候群マウスでは、腸における微生物プロファイルの発現が異なることが予想される。
レット症候群マウスの生物学的治療法
Ｂ．フラジリスによる処置は、自閉症の環境マウスモデルおよび遺伝マウスモデルにおいて保護作用を発揮する（Hsiaoら、2013）。無菌のレット症候群マウスにおけるＢ．フラジリスの効果を調査するため、1×1010CFU（コロニー形成単位）の新たに増殖させたＢ．フラジリスを1.5％炭酸水素ナトリウム溶液1ml中に懸濁し、無糖アップルソース4mlと混合し、標準的な４個の餌ペレット全体にかける。投与の48時間後において、アップルソース接種物からＢ．フラジリスのコロニー形成単位の42％が回収されることを見出したことから、生存可能なＢ．フラジリスおよび死滅したＢ．フラジリスの両方が処置を介して摂取されることが示唆される（Hsiaoら、2013）。溶媒処置では、アップルソース中に溶解した1.5％炭酸水素ナトリウムを餌ペレット全体にかけてマウスに与える。過去の研究から、各マウスを単体でケージに収容した場合（これによってケージへの収容方法による影響を回避する）、アップルソースおよびペレットは、非常に迅速かつ完全に消費されることが示されている。この処置を１週間あたり３回繰り返して、Ｂ．フラジリスを十分に摂取させる。無症候性の雄性マウスおよび雌性マウス、ならびに症候性の雄性マウスおよび雌性マウスに対して処置を行う。実験ごとに各群6匹のマウス（WTマウスおよびレット症候群マウス、症状の発症前または症状の発症後）を使用する。処置の６週間後に行動解析を実施するとともに、体重の増加および寿命に対する効果などのその他の表現型を試験して、Ｂ．フラジリスが保護作用を有するかどうかを分析する。さらに、治療を目的として、健常ヒトドナー由来糞便材料のＢ．フラジリスを濃縮し、同様に調査を行う。これらの研究から、腸内微生物の変化がレット症候群の進行に寄与している可能性があり、プロバイオティクスを使用してマイクロバイオームのディスバイオシスを回復させることによって治療が可能であるという概念が支持されると予想される。本明細書に記載の実施形態のいくつかによれば、Ｂ．フラジリスを使用した処置によってレット症候群に伴う症状が緩和され、該症状を発症する可能性が低減され、かつ／または該症状の発症が予防されると予想される。
処置マウスの行動解析
ロータロッド試験
初回の試験を行う前に、２日連続してマウスを訓練する。ロータロッドの回転を5rpmから開始し、240秒かけて40 rpmまで加速させ、ロータロッドから落下するまでの時間を採点する。ロータロッド上のマウスの滞在時間は最長で300秒とする。試行間間隔（ITI）を10分間とし、訓練日１日あたり２回の試行を行う。次いで、試行間間隔（ITI）を10分間として、２回の試験を行う。
ビームバランス試験
1mの長さの棒の中央部80cmをつたわって移動する時間を採点する。幅の異なる（28mm、12mmおよび6mm）正方形断面の棒を複数本使用する。ポールに棒を載せ（テーブルの上面から50cmの高さ）、始点となる一端に明るい光源を配置し、離れた他端に、マウスのホームケージ用の営巣材料を含む暗箱を設置する。テーブルの上面から7.5 cmの高さにナイロン製のハンモックを設置し、棒から落下したマウスの損傷を防ぐ。明るい光源を配置した棒の一端にマウスを置き、マウスの体全体が棒の中央の80cmの長さの部分に入ってから、マウスの鼻が中央部分から出るまでの時間を、赤外線遮断センサーを使用して測定する。Southwellら（2009）による報告に従ってデータを解析する。ロータロッド試験およびビームバランス試験の両方から運動症状を評価する。
抱擁反射試験
後肢抱擁反射は、レット症候群および運動障害を有するその他の疾患において疾患の進行を評価するマーカーである。このアッセイでは、マウスの尾をつまんで空中にぶら下げ、テーブルの上面からの約30cmの高さで１分間維持し、ビデオカメラで撮影した。抱擁反射が見られなかった場合はゼロとして採点し、周期的に抱擁反射を示し、肢を伸長させた場合に１として採点し、後肢を完全に抱擁し、肢を時折伸長させた場合を２として採点する。重度の抱擁反射を３として採点する。
オープンフィールド試験
上面が開放され、16cmの高さの側面を有する50×50cmの大きさの白色プレキシガラス製の箱を、天井蛍光灯で明るく照らした部屋に置き、マウスをこの箱の左下角に置く。オープンフィールドにおける活動を、天井に設置したビデオカメラで10分間撮影する。中心への進入および中心での滞在時間を採点する。中心への進入によって不安様行動を調べる。過去の報告（Hsiaoら、2013）に従ってデータを解析する。
ビー玉埋め試験
この試験は、自閉症およびレット症候群の特徴である反復行動および常同行動を調べる試験である。この試験では、試験ケージに床敷きを敷き詰め、その上にビー玉を置き、マウスをこの試験ケージに入れ、10分間にマウスが床敷きの中に埋めたビー玉の数（ビー玉の50％超が床敷き材料で覆われた状態）を記録する（Malkovaら、2012）。
プレチスモグラフィー測定
全身プレチスモグラフィーを使用して、レット症候群マウスの不規則な呼吸を測定する。この表現型はレット症候群患者によく見られる（Lombardiら、2015）。これまでに蓄積された研究から、迷走神経が呼吸の調節において重要である可能性が支持されている。本発明者らは、レット症候群における腸のディスバイオシスが迷走神経活動を損ない、呼吸異常を悪化させていると予測している。さらに、本発明者らは、リファキシミンまたはＢ．フラジリスを用いた処置によってレット症候群マウスにおける迷走神経障害を部分的に是正することができ、これによって呼吸障害が部分的に緩和される可能性があると予測している。呼吸の測定には、Data Sciences International（DSI）社（ミネソタ州セントポール）より入手可能なBuxco社製のFine Pointe Unrestrained Whole Body Plethysmographシステムを使用する。
新奇物体認識試験
新奇物体認識試験は、レット症候群マウスの学習および記憶に対するリファキシミンまたはプロバイオティクスの効果を調べるのに有用な試験である。本発明者らは、過去に自閉症の環境マウスモデルにおいてこの試験を使用した経験がある（Hsiaoら、2013）。通常、げっ歯類は、馴染みのある物体よりも新奇な物体の探索に長い時間を費やす。新奇物体を選択する能力から、学習および認知記憶が示される。２種の物体を置いたオープンフィールドアリーナにおいて、新奇物体認識タスクを実施する。これらの物体は、通常、高さと体積は同じであるが、形状と外見が異なる。馴化の際に、何も置いていないアリーナをマウスに探索させる。馴化の24時間後に、慣れさせたアリーナに２つの同一の物体を等距離で配置し、マウスにアリーナを探索させる。翌日、馴染物体および新奇物体を配置してマウスにオープンフィールドを探索させ、長期認知記憶を試験する。各物体を探索するのに要した時間および弁別指数（％）を記録する。その他の実験とともにこの試験を使用して、溶媒処置レット症候群マウス、リファキシミン処置レット症候群マウスおよび無菌コホートの認知能力を評価し、結果を定量して比較する。
バーンズ迷路試験
バーンズ迷路は、海馬依存的な空間記憶タスクに対するプロバイオティクスまたはリファキシミンの効果を解析するのに非常に適している。この試験において、マウスは、迷路の明るく照らされた開けた場所から逃避するための穴の位置を学習する。この試験は、確立された標準的なプロトコルに従って行った（Dawoodら、2004）。簡潔に述べると、大きな円形の開けたプラットフォームで構成され、規定の数の穴を外周に備えたバーンズ迷路を用意し、上面の明るく照らされた環境にマウスを配置する。この開かれた環境において、マウスは自然と暗い囲まれた環境を捜し始める。この迷路において暗い囲まれた環境は、プラットフォームの外周に備えられた円形の穴のうちの１つの下に暗箱（ゴールボックス）として設置されている。マウスが逃避穴を特定できるように繰り返し訓練する。この試験を使用して、溶媒処置レット症候群マウス、リファキシミン処置レット症候群マウスおよび無菌コホートの認知能力を評価し、結果を定量し比較する。データ収集のため、マウスが迷路の外周を取り囲む視覚空間的な手掛かりを利用してゴールボックスの位置を突き止めるまでに要した時間を測定する。逃避穴を見出す際にマウスが起こした間違いの数を記録する。訓練、実験準備およびデータ収集はいずれもDawoodら（2004）の報告に従って行う。
実施例２０：レット症候群マウスにおける神経伝達物質濃度およびコリン作動性遺伝子の発現
逆転写酵素定量PCRによって、レット症候群マウスおよび（非レット症候群）野生型コントロールマウスから得た腸試料におけるコリン作動性遺伝子の濃度を測定した。レット症候群マウスは、（非レット症候群）野生型コントロールマウスよりもコリン作動性遺伝子の濃度が低下していた（図２０Ａ参照）。レット症候群マウスにおいて低下していたコリン作動性遺伝子は、Chrna2、Chrna7、Chrb4、Chrm1、Slc5a7、Char、AcheおよびSlcl8a3であった。
ガスクロマトグラフィー質量分析によって、レット症候群マウスおよび（非レット症候群）野生型コントロールマウスにおいて神経伝達物質の血清中濃度を測定した。レット症候群マウスは、（非レット症候群）野生型コントロールと比較して、コリン、チロシン、ドーパミンおよびエピネフリンの濃度が増加していた。レット症候群マウスにおけるセロトニン（5-HT）の濃度は、（非レット症候群）野生型コントロールよりも低下していた。図２０Ｂを参照されたい。
実施例２１：レット症候群の腸におけるMeCP2の再活性化
レット症候群マウスの腸においてMeCP2が発現されると、消化管病変が緩和される可能性があるとともに、腸内微生物叢の恒常性が正常化される可能性があると考えられる。これらの可能性を研究するため、villin-Creマウス系統をMeCP2Flox-STOP floxedマウスと交配して、腸上皮においてMeCP2の発現を選択的に再活性化させた。この遺伝子操作系統の仔マウスにおいて、腸管壁透過性、代謝の変化、ディスバイオシス、およびMeCP2 nullマウスにおいて見られる異常行動を含む消化管病変について調べる。MeCP2は腸−微生物叢相互作用に重要であり、レット症候群における消化管病変とCNS病変の進行とを関連付けるものであると予想される。
実施例２２：Ｂ．フラジリスおよび／またはリファキシミンを使用して定着させた無菌のレット症候群マウスに対する行動解析
消化管のディスバイオシスは、レット症候群の発症機序を変化させうると考えられる。レット症候群患者およびレット症候群マウスモデルの腸内微生物叢は変化している。ディスバイオシスとCNSにおける症状とを関連付けるため、無菌のレット症候群マウスの行動解析を行い、従来法で飼育したコホートが呈する異常行動と比較する。差異が検出された場合、すべての実験群の腸および脳から抽出されたmRNAを配列分析して、MeCP2−微生物叢相互作用によって制御されている可能性のある標的遺伝子および標的経路を特定することができる。消化管に基づく治療法を試験するため、無菌のレット症候群マウスにプロバイオティクスであるバクテロイデス・フラジリスを単独で定着させるか、または無菌のレット症候群マウスに健常ヒトドナー由来の糞便材料を移植する。バクテロイデス・フラジリスは、一部の消化管病変および／またはCNS病変を緩和し、異常行動の重症度を低下させると考えられる。
さらに、リファキシミンを使用したレット症候群マウスの腸内微生物叢の調節を研究することができる。リファキシミンを使用して、IBDおよび脳腸疾患患者を治療する。リファキシミンによる処置によってディスバイオシスが正常化され、消化管症状およびCNS症状が減少する可能性があると予想される。
実施例２３：レット症候群においてリファキシミン処置後に新生されたニューロンの生存
特定の理論に制限されるものではないが、レット症候群において腸内微生物叢と海馬神経新生の間で関連性が見られると考えられる。レット症候群患者において知的障害はよく見られ、これは海馬回路における障害を伴うことがある。本研究では、レット症候群マウスをリファキシミンで処置することによって海馬神経新生および樹状突起の分枝が促進されることが報告されている。さらに、新生ニューロンの生存を試験することができ、ニューロンが生存を維持して認知タスクを向上させるのかどうかも試験することができる。新生ニューロンは生存を維持し中枢神経系に組み込まれると予想される。コントロールコホートとリファキシミン処置コホートのマイクロバイオームを配列分析し、その結果を比較することによって、割合が増加しうる細菌種または排除されうる細菌種を特定することができる。従来とは異なる培養可能なプロバイオティクス種をレット症候群マウスに定着させることができ、神経新生および認知関連行動に対する効果を調べることができる。
実施例２４：炎症マーカーに対するリファキシミン処置の効果
リファキシミンは、微生物叢の組成を変化させて健康を増進する細菌の繁殖に有利なものとすることによって、IBDの症状を減少させる（Xuら、2014、Sartor、2016）。さらに、リファキシミンの治療効果として、全身性炎症の低下、ならびにレット症候群マウスの循環系および免疫細胞において上昇するIL-6やTNF-αなどのサイトカイン濃度の低下が挙げられる（Cronkら、2015、Kangら、2016）。リファキシミンは、レット症候群マウスの消化管における炎症性の外観を減少させることから、免疫細胞にも影響を与える可能性があると見られる。実施例２１において提案した方法と同様にして、リファキシミンが免疫細胞の炎症性の表現型を変化させるのかどうか、および循環系における炎症性サイトカインの濃度を変化させるかどうかを検討する。炎症性の表現型および／または炎症性サイトカイン濃度の変化を観察することができる。
引用文献
以下の引用文献はそれぞれ参照によってその全体が本明細書に援用される。
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前述の実施形態の少なくともいくつかにおいて、これらの実施形態において使用された１つ以上の構成要素は、技術的に不可能な場合を除き、別の実施形態の構成要素と入れ替えて使用することができる。請求項に記載された主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法、組成物、キットおよび使用にその他の様々な省略、付加および改変を行ってもよいことは、当業者であれば容易に理解できるであろう。このような改変や変更はいずれも、添付の請求項で定義されている本発明の主題の範囲内にあると見なされる。
本明細書で使用されている実質的に複数形および／または単数形の用語は、当業者であれば、本明細書の記載および／または用途に適するように、複数形の用語を単数のものとして、かつ／または単数形の用語を複数のものとして解釈することができる。本発明を明確なものとするために、様々な単数形／複数形の用語が意図的に使い分けられている。
当業者であれば、本明細書に記載の用語、特に添付の請求項（たとえば添付の請求項の本体部）に記載の用語は、通常、「オープンエンドな」用語であることを理解できるであろう（たとえば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（include）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、特定の数が請求項に記載されている場合、前述のような意図も請求項に明確に記載されており、特定の数が記載されていない場合はそのような意図も存在しないことも、当業者であれば理解できるであろう。具体的に説明をすれば、たとえば、後述の特許請求の範囲では、請求項を定義するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが記載されているからといって、不定冠詞「１つ（aまたはan）」を使用して構成要素が記載された請求項を、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「１つ（aまたはan）」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではない（たとえば、「１つ（aおよび／またはan）」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈すべきである）。これは、定冠詞を使用して記載された請求項でも同じである。また、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、「少なくとも」記載されたその数であるということを当業者であれば理解するであろう（たとえば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を意味する）。さらに、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。また、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、記載された用語のうちの１つ、記載された用語のいずれか、または記載された用語の両方を含む場合があると当業者であれば理解するであろう。たとえば「ＡまたはＢ」という表現は、「ＡまたはＢ」または「ＡおよびＢ」を含む場合がある。
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された各メンバーまたはそれらからなるサブグループについても記載されていると理解できるであろう。
詳細な説明の提供などの何らかの目的で本明細書に記載された範囲はいずれも、あらゆる可能な部分範囲およびその組み合わせも包含することを、当業者であれば理解できるであろう。前記範囲はいずれも、同じ範囲を少なくとも等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分割したものも十分に記載されており、このような分割された範囲で本発明を実施可能であることを容易に理解できるであろう。たとえば、本明細書に記載の範囲はいずれも、容易に、低域、中域、高域といった３等分などにすることができるが、これに限定されない。また、「以下」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「未満」といった用語はいずれも、記載された数値を含むとともに、前述したように、部分範囲に分割可能な範囲も指すことを当業者であれば理解できるであろう。さらに、当業者であれば、本明細書に記載の範囲は各メンバーを含むことを理解できるであろう。したがって、たとえば、１〜３つのメンバーからなる群は、１つのメンバーからなる群、２つのメンバーからなる群または３つのメンバーからなる群を指す。同様に、１〜５つのメンバーからなる群は、１つのメンバーからなる群、２つのメンバーからなる群、３つのメンバーからなる群、４つのメンバーからなる群、または５つのメンバーからなる群などを指す。
組成物または組み合わせ製品（細菌および／もしくは抗生物質を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品）を使用する方法が本明細書に開示されている場合、この方法において使用される対応する組成物も本明細書中に明確に記載されているものとする。たとえば、選択された対象におけるハンチントン病の症状を低減または予防する方法であって、殺菌剤を含む組成物の一定量を該対象に投与することを含む方法が開示されている場合、この方法において使用される、ハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するための、殺菌剤を含む対応する組成物も記載されているものとする。
本明細書において様々な態様および実施形態を述べてきたが、当業者であればその他の態様および実施形態も容易に理解できるであろう。本明細書において開示された様々な態様および実施形態は本発明を説明することを目的としたものであり、本発明をなんら限定するものではなく、本発明の範囲および要旨は以下の請求項によって示される。

Claims (55)

  1. アクチノバクテリア門（Actinobacteria）細菌、テネリクテス門（Tenericutes）細菌およびバクテロイデス属（Bacteroides）細菌のうちの少なくとも２種を含む単離された細菌を含む組成物または組み合わせ製品。
  2. 単離されたアクチノバクテリア門細菌および単離されたバクテロイデス属細菌を含む、請求項１に記載の組成物または組み合わせ製品。
  3. 単離されたアクチノバクテリア門細菌を含み、該アクチノバクテリア門細菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）を含む、請求項１または２に記載の組成物または組み合わせ製品。
  4. Ｂ．フラジリス（B.fragilis）、Ｂ．オバツス（B.ovatus）、Ｂ．テタイオタオミクロン（B.thetaiotaomicron）およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される単離されたバクテロイデス属細菌を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  5. アクチノバクテリア門細菌、テネリクテス門細菌およびバクテロイデス属細菌を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  6. 前記単離された細菌が、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumからなる群から選択される細菌にマッピングされたOTUにマッピングされる細菌を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  7. 前記細菌が、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に、該細菌が該OTUにマッピングされる、請求項６に記載の組成物または組み合わせ製品。
  8. １０４ｃｆｕ以下のファーミキューテス門（Firmicutes）細菌を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  9. 薬学的に許容される添加剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  10. 抗生物質をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  11. 前記抗生物質がリファキシミンを含む、請求項１０に記載の組成物または組み合わせ製品。
  12. 前記抗生物質が、前記単離された細菌とは別個の組成物中に含まれている、請求項１０または１１に記載の組成物または組み合わせ製品。
  13. 前記単離された細菌が単一の組成物中に含まれている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  14. 前記単離された細菌が別個の組成物中に含まれている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  15. レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  16. アクチノバクテリア門（Actinobacteria）細菌、テネリクテス門（Tenericutes）細菌およびバクテロイデス属（Bacteroides）細菌からなる群から選択される単離された細菌と、抗生物質とを含む組成物または組み合わせ製品。
  17. 単離されたアクチノバクテリア門細菌を含み、該アクチノバクテリア門細菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）を含む、請求項１６に記載の組成物または組み合わせ製品。
  18. １０４ｃｆｕ以下のファーミキューテス門（Firmicutes）細菌を含む、請求項１６または１７に記載の組成物または組み合わせ製品。
  19. 前記抗生物質がリファキシミンを含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  20. 前記抗生物質が、前記単離された細菌とは別個の組成物中に含まれている、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  21. 薬学的に許容される添加剤を含む、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  22. レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するための、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
  23. レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和を必要とする対象において、該症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和する方法であって、
    アクチノバクテリア門（Actinobacteria）細菌、テネリクテス門（Tenericutes）細菌、バクテロイデス属（Bacteroides）細菌およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の細菌を含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することを含む方法。
  24. レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための組成物を投与すべき対象群に属するとして前記対象を選択することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記対象にバクテロイデス属細菌が投与され、前記方法によって、ハンチントン病に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記対象にアクチノバクテリア門細菌が投与され、前記方法によって、ハンチントン病に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記対象にアクチノバクテリア門細菌およびバクテロイデス属細菌が投与され、前記方法によって、レット症候群に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される、請求項２３に記載の方法。
  28. 前記対象にアクチノバクテリア門細菌およびバクテロイデス属細菌が同時または別々に投与される、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記対象にアクチノバクテリア門細菌およびテネリクテス門細菌が同時または別々に投与される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記アクチノバクテリア門細菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）を含む、請求項２３〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記バクテロイデス属細菌が、Ｂ．フラジリス（B.fragilis）、Ｂ．オバツス（B.ovatus）およびＢ．テタイオタオミクロン（B.thetaiotaomicron）からなる群から選択される、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記細菌が、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumからなる群から選択される細菌にマッピングされたOTUにマッピングされる細菌を含む、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  33. 細菌が、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に、該細菌が該OTUにマッピングされる、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記対象に、１０４ｃｆｕ以下のファーミキューテス門（Firmicutes）細菌が投与される、請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和を必要とする対象において、該症状を発症する可能性を低減させるか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状を緩和する方法であって、
    前記対象に抗生物質を投与することを含む方法。
  36. レット症候群またはハンチントン病に伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和のための組成物を投与すべき対象群に属するとして前記対象を選択することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記抗生物質がリファキシミンを含む、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. レット症候群に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. ハンチントン病に伴う前記１つ以上の症状を発症する可能性が低減されるか、該症状の発症が遅延するか、または該症状が緩和される、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記抗生物質の投与によって、前記対象における腸内細菌の量が少なくとも９５％減少する、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. アクチノバクテリア門（Actinobacteria）細菌、テネリクテス門（Tenericutes）細菌、バクテロイデス属（Bacteroides）細菌およびこれらの組み合わせからなる群から選択される単離された細菌を含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記単離された細菌が、Mesoplasma entomophilum、Lactobacillus taiwanensis、Pediococcus argentinicusおよびBifidobacterium choerinumからなる群から選択される細菌にマッピングされたOTUにマッピングされる細菌を含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 細菌が、OTUのリファレンス16S rRNA配列と少なくとも９７％の同一性を有する少なくとも１００ヌクレオチド長の16S rRNA配列を含む場合に、該細菌が該OTUにマッピングされる、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記対象にアクチノバクテリア門細菌およびバクテロイデス属細菌が投与される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記対象にアクチノバクテリア門細菌が投与され、該アクチノバクテリア門細菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）を含む、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記対象にバクテロイデス属細菌が投与され、該バクテロイデス属細菌が、Ｂ．フラジリス（B.fragilis）、Ｂ．オバツス（B.ovatus）、Ｂ．テタイオタオミクロン（B.thetaiotaomicron）およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記単離された細菌が、前記抗生物質と同時に投与される、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記単離された細菌が、前記抗生物質とは異なる時間に投与される、請求項４７の方法。
  49. （ａ）前記抗生物質が、前記細菌の投与前に投与されるか、または
    （ｂ）前記細菌が、前記抗生物質の投与前に投与される、
    請求項４８に記載の方法。
  50. 前記対象に、１０４ｃｆｕ以下のファーミキューテス門（Firmicutes）細菌が投与される、請求項３５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 対象由来試料のプロファイルを決定する方法であって、
    （ａ）テネリクテス門（Tenericutes）細菌、アクチノバクテリア門（Actinobacteria）細菌、ファーミキューテス門（Firmicutes）細菌およびこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される腸内細菌の存在および／もしくはその量；
    （ｂ）コリン、5-HT、チロシン、ドーパミン、エピネフリンおよびこれらの２種以上からなる群から選択される神経伝達物質の血清中濃度；または
    （ｃ）Chrna2、Chrna7、Chrb4、Chrm1、Slc5a7、Chat、Ache、Slc18a3およびこれらの２種以上からなる群から選択されるコリン作動性遺伝子の発現量
    のうちの少なくとも１つを検出することを含み、
    前記プロファイルが、検出された（ａ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｂ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｃ）の存在および／もしくはその量、検出された（ａ）と（ｂ）の存在および／もしくはその量、検出された（ａ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量、検出された（ｂ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量、または検出された（ａ）と（ｂ）と（ｃ）の存在および／もしくはその量を含む、
    方法。
  52. 前記プロファイルの決定が、（ａ）を測定することを含み、
    前記試料が、前記対象の腸材料および／または糞便材料を含み、
    非レット症候群コントロール試料中の量と比較して、テネリクテス門細菌もしくはアクチノバクテリア門の量が少ないか、またはファーミキューテス門細菌の量が多いことから、レット症候群に罹患していること、またはレット症候群のリスクが高いことが示される、
    請求項５１に記載の方法。
  53. 前記プロファイルの決定が、（ｂ）を測定することを含み、
    前記試料が、前記対象の血清を含み、
    非レット症候群コントロール試料中の濃度と比較して、コリン、チロシンおよび／もしくはドーパミンの濃度が高いか、ならびに／または5-HTおよび／もしくはエピネフリンの濃度が低いことから、レット症候群に罹患していること、またはレット症候群のリスクが高いことが示される、
    請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 前記プロファイルの決定が、（ｃ）を測定することを含み、
    前記試料が、前記対象の核酸を含み、
    非レット症候群コントロール試料中の発現量と比較して、Chrna2、Chrna7、Chrb4、Chrm1、Slc5a7、Chat、Ache、Slc18a3またはこれらの２種以上の遺伝子の発現量が低いことから、レット症候群に罹患していること、またはレット症候群のリスクが高いことが示される、
    請求項５１または５２に記載の方法。
  55. 前記アクチノバクテリア門細菌がビフィドバクテリウム属（Bifidobacteria）を含む、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
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