CN110824171B - 一组代谢标志物在代谢综合征患者的冠心病事件早期诊断中的应用 - Google Patents

一组代谢标志物在代谢综合征患者的冠心病事件早期诊断中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组代谢标志物在代谢综合征患者的冠心病事件早期诊断中的应用。代谢综合征是冠心病的高危因素，代谢综合征患者罹患冠心病的风险较高。本发明发现了一组包括组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤的代谢标志物可以用于诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者，进而可以用于制备早期诊断代谢综合征患者发生冠心病事件的试剂盒。

Description

一组代谢标志物在代谢综合征患者的冠心病事件早期诊断中 的应用
技术领域
本发明属于疾病检测诊断领域，涉及疾病诊断标志物的发现与应用，具体涉及一组代谢标志物在代谢综合征患者的冠心病事件早期诊断中的应用。
背景技术
代谢综合征是一组包含腹部肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常和血压升高在内的症候群。根据中华医学会糖尿病学分会建议的诊断标准，具备如下4项中3项以上即可确诊为代谢综合征：1.超重或肥胖(BMI≥25)；2.空腹血糖(FPG≥6.1mmol/L)和(或)已确诊为糖尿病并治疗者；3.高血压收缩压/舒张压≥140/90mmHg和(或)已确诊为糖尿病并治疗者；4.血脂紊乱空腹甘油三脂≥1.7mmol/L和(或)空腹血HDL-C＜0.9mmol/L(男)或1.0mmol/L(女)。
冠心病亦称为缺血性心脏病，涉及供应心肌血液的动脉发生粥样硬化，即冠状动脉粥样硬化病变引起血管腔狭窄或斑块形成甚至破裂、完全堵塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致心脏缺血性疾病，从而引起临床上心绞痛、心肌梗死等一系列严重的心血管事件。冠心病是人类健康的主要杀手，具发病率高、致残率高、复发率高、病死率高、并发症多等特点，已经成为威胁我国人民健康的主要疾病。
代谢综合征是冠心病的高危因素。一项长达13年的调查报告显示，代谢综合征患者罹患冠心病的年龄调整相对风险高达2.54(男性)和1.54(女性)。
但是，因为目前缺少代谢综合征与冠心病之间的组学差异研究，所以还没有成熟的组学标志物用于诊断区分代谢综合征与冠心病，也就无法通过组学方法对代谢综合征患者的冠心病事件进行早期诊断。这种不足影响了代谢综合征患者冠心病事件的发现和早期介入治疗。
代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定量分析并寻找代谢物与生理病理变化相对关系的一种研究方式，是系统生物学的组成部分，涉及生命科学，分析科学及统计学等多学科，目前在新药研发、药物毒理研究和安全性评价疾病早期诊断和个体化治疗等多个领域都有极为重要的作用，并取得了大量的科研成果。其中，血清代谢组学又以简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛使用。
基于上述现有技术的不足，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一组代谢标志物在代谢综合征患者的冠心病事件早期诊断中的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一组代谢标志物在诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者中的应用，所述代谢标志物包括组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤。
一组代谢标志物在制备早期诊断代谢综合征患者发生冠心病事件的试剂盒方面的应用，所述代谢标志物包括组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤。
进一步地，所述诊断试剂盒中含有所述代谢标志物的标准品。
更进一步地，还含有内标化合物的标准品。
有益效果：
代谢综合征是冠心病的高危因素，代谢综合征患者罹患冠心病的风险较高。本发明发现了一组包括组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤的代谢标志物可以用于诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者，进而可以用于制备早期诊断代谢综合征患者发生冠心病事件的试剂盒。
附图说明
图1为组氨酸单独诊断区分代谢综合征和冠心病的ROC曲线；
图2为磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)单独诊断区分代谢综合征和冠心病的ROC曲线；
图3为溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)单独诊断区分代谢综合征和冠心病的ROC曲线；
图4为次黄嘌呤单独诊断区分代谢综合征和冠心病的ROC曲线；
图5为组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤联合诊断区分代谢综合征和冠心病的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：目标代谢物诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者的诊断效能
一、实验样本、仪器和试剂
训练集样本：收集郑州大学第一附属医院，按照严格的纳入和排除标准经过年龄与性别匹配的40例代谢综合征患者和249例冠心病患者；
验证集样本：收集郑州大学第五附属医院，按照严格的纳入和排除标准经过年龄与性别匹配的16例代谢综合征患者和23例冠心病患者。
代谢综合征患者和冠心病患者的入组标准如下：
代谢综合征患者：根据中华医学会糖尿病学分会建议的诊断标准(2004年)，具备如下4项中的3项或全部即确诊为代谢综合征患者：1、超重和(或)肥胖BMI≥25；2、高血糖空腹血糖(FPG)≥6.1mmol/L(110mg/dl)和(或)2hPG≥7.8mmol/L(140mg/dl)，和(或)已确诊糖尿病并治疗者；3、高血压收缩压/舒张压≥140/90mmHg，和(或)已确诊高血压并治疗者；4、血脂紊乱空腹血甘油三酯≥1.7mmol/L(150mg/dl)，和(或)空腹血HDL-C<0.9mmol/L(35mg/dl)(男)，<1.0mmol/L(39mg/dl)(女)。
冠心病患者：符合冠心病诊断，经冠脉造影证实；临床表现为无症状型心绞痛、稳定型心绞痛、急性冠脉综合征超过1个月病情稳定者。
代谢综合征患者的年龄、性别与冠心病患者相匹配。
主要实验仪器和试剂：
Ultimate 3000超高效液相色谱系统(Dionex公司，美国)串联Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；色谱柱采用WatersACQUITY UPLC BEH C18(50×2.1mm，1.7μm)；Heraeus Fresco 17离心机(Thermo FisherScientific)。
HPLC级别乙腈、甲醇、甲酸购自美国Thermo Fisher公司；实验用水为娃哈哈纯净水；酮洛芬标准品购自SigmaAldrich公司。
二、实验方法
1、血清样本的采集及储存
所有血样采集于患者清晨空腹状态下，每个研究对象采集静脉血3mL置于真空采血管(促凝剂+分离胶)中，采集后于4℃条件下2500r/min离心10min，吸取上清(血清)，分装后立即于-80℃冰箱内冷冻保存。
2、血清中目标代谢物相对含量的测定
色谱分离采用超高效液相色谱(UPLC，Waters Ultimate 3000，USA)，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(50×2.1mm，1.7μm)，柱温40℃。流动相组成是A相为乙腈，B相为0.1％甲酸水溶液。梯度洗脱条件：0～0.5min，5％A；0.5～1.0min，5％～60％A；1.0～7.0min，60％～80％A；7.0～9.0min，80％～100％A；9.0～11.0min，100％A；11.0～13.0min，5％A；流速0.2mL/min，柱后流出液不分流直接入质谱进行检测。
质谱条件质谱分析采用Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱，离子源为可加热的电喷雾离子源(HESI)。辅助气温度300℃，离子源温度350℃，毛细管温度320℃，辅助气流速为10μL/min，质谱分辨率为17500，质谱分析扫描模式：full scan/ddms2，扫描范围m/z80.00～1200.00。碰撞能梯度为20、30和40e V。采用负离子模式检测，喷雾电压3.50kV，鞘气流速40μL/min。所有样本随机进样，每检测10个样本插入一针空白，以避免交叉污染。
血清样本处理：血清样品取出后放置于冰上解冻，涡旋混匀后吸取100μL血清样品于1.5mL离心管中，加入150μL含内标的甲醇溶液(含酮洛芬500ng/mL)，涡旋30秒混匀，13000rpm离心10min(4℃)，吸取上清于进样小瓶，即得。
质控(QC)样品：从所有血清样本中分别吸取10μL涡旋混匀，按照上述同样方法进行QC样品前处理，即得。为了保证数据的可靠性，QC样本分析穿插在所有样本代谢组学数据采集过程中，在样本分析前，连续检测10个QC样品，待仪器稳定后开始分析样本，每隔10个样本检测一次QC溶液。
以各血清样本中目标代谢物组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤的峰面积与内标峰面积的比值作为该目标代谢物的相对含量。
3、数据处理和分析
训练集中，采用正交偏最小二乘辨别法(OPLS-DA)来比较目标代谢物的相对含量在代谢综合征患者和冠心病患者的血清是否存在差异，以VIP>1及p<0.05为差异有统计学意义，并建立单个目标代谢物的ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)及95％可信区间；对于多个目标代谢物，运用Logistic回归建立回归方程，产生一组新变量logit[p]，对该新变量进行ROC曲线分析。验证集中，以ROC曲线得到的最佳cut-off值为阈值计算单个目标代谢物或其联合对代谢综合征患者和冠心病患者的诊断准确度。
三、实验结果
1、目标代谢物在代谢综合征患者和冠心病患者血清中的水平差异
如表1所示，与代谢综合征患者相比，目标代谢物组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤在冠心病患者血清中的相对含量显著上调。
表1目标代谢物在代谢综合征患者和冠心病患者血清中的水平差异
Figure BDA0002283454990000041
2、目标代谢物单独诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者的ROC曲线
ROC曲线评价法的原理：
诊断试验的基本评价指标有敏感度、特异性等，综合评价指标有Youden指数、ROC、AUC等。对于诊断试验的评价，首先需要通过金标准知道待测样本的真实组别。对于按金标准确定的疾病组别，采用诊断试验检测的结果可以分为如下情况：
阳性(True Positive,TP)；诊断试验检测为阳性(与金标准结果一致)；
阴性(True Negative,TN)；诊断试验检测为阴性(与金标准结果一致)；
假阳性(False Positive,FP)：诊断试验检测为阳性(与金标准结果不一致)；
假阴性(False Negative,FN)：诊断试验检测为阴性(与金标准结果不一致)。
可以用下表表示：
Figure BDA0002283454990000051
诊断试验的敏感度＝A/(A+C)；诊断试验的特异性＝D/(B+D)。通过敏感度和特异性可以得出诊断试验相对于金标准的诊断灵敏程度和特异程度。敏感度高代表将疾病例诊断为阴性的个数少，漏诊率低；特异性高代表将健康例诊断为阳性的个数少，误诊率低。
ROC曲线正是基于上述敏感度和特异性绘制出的曲线。以诊断试验中可能的诊断界值作为诊断点，根据上述表格计算出相应的敏感度和特异性。然后，以敏感度为纵坐标，1-特异性为横坐标，将各诊断点时各点的敏感度和特异性点在坐标图中标出，连接坐标点得到平滑曲线，该曲线即为ROC曲线。诊断点设置的越多越密，得到的ROC曲线就越平滑。
ROC曲线是以每一个检测结果作为可能的诊断界值，其曲线下面积AUC的大小表明了诊断试验准确度的大小。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC越高代表诊断准确性越高。
目标代谢物组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤单独诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者的ROC曲线如图1～4所示，AUC分别为0.660、0.523、0.566和0.633，诊断准确性较低。
3、多个目标代谢物联合区分代谢综合征患者和冠心病患者的ROC曲线
在SPSS软件中，以训练集样本中组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤的相对含量作为自变量(设X1＝组氨酸相对含量，X2＝磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)相对含量，X3＝溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)相对含量，X4＝次黄嘌呤相对含量)，以组别(即代谢综合征患者和冠心病患者)作为应变量，对组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤在代谢综合征患者和冠心病患者血清样本中的相对含量进行二元逻辑回归，SPSS软件即可得到二元逻辑回归方程；再将各血清样本中组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤的相对含量代入该回归方程，即可得到各个血清样本的回归值logit[p]，以可能的回归值logit[p]作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图5)，AUC为0.829，准确性显著高于各目标代谢物单独诊断准确性。根据ROC曲线的坐标计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值时对应的logit[p]值为能进行诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者的最佳cut-off值0.540。
4、验证多个目标代谢物联合区分代谢综合征患者和冠心病患者的准确度
在验证集中，将代谢综合征患者和冠心病患者血清样本中四个目标代谢物的相对含量代入四个目标代谢物联合区分代谢综合征患者和冠心病患者的二元逻辑回归方程，计算得到每个样本的回归值logit[p]，以上述四个目标代谢物诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者的最佳cut-off值为诊断阈值，logit[p]高于该诊断阈值的预测为冠心病患者，低于该诊断阈值的预测为代谢综合征患者，以预测正确的样本数除以总样本数即为四个目标代谢物联合区分代谢综合征患者和冠心病患者的准确度，准确度为82.1％。
综上可知，虽然组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)、次黄嘌呤单独用于诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者的诊断价值较低，但是其联合诊断区分代谢综合征患者和冠心病患者的诊断价值非常高，验证集样本中的诊断准确度高达82.1％，因而这四种目标代谢物可以作为标志物用于代谢综合征患者发生冠心病事件的早期诊断。
实施例2：代谢综合征患者发生冠心病事件的早期诊断试剂盒
一种代谢综合征患者发生冠心病事件的早期诊断试剂盒，含有诊断标志物的标准品，该诊断标志物为组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (1)

1.组氨酸、磷脂酰胆碱PC(16:0/16:0)、溶血磷脂酰胆碱LysoPC(17:0)和次黄嘌呤联合用于制备早期诊断代谢综合征患者发生冠心病事件的血清检测试剂盒的用途。
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