CN114026427B - 诊断肾病的标志物以及诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及诊断肾病的标志物以及诊断方法。该方法包括以下步骤：测定及分析来自所述受试者的样品中的标志物的水平，以诊断所述受试者的肾病发展分期。其中，所述标志物包括选自琥珀酰腺苷、假尿苷、N,N,N‑三甲基‑L‑丙氨酰‑L‑脯氨酸甜菜碱、2‑(α‑D‑吡喃甘露糖基)‑L‑色氨酸、4‑乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5‑脱水‑D‑山梨糖醇组成的组中的至少一种，并配合肌酐成联合标志物，组成至少两个标志物的组合，以改善现时临床依赖肌酐估算GFR造成的误差以及尿白蛋白定量检测难测准的情况。

Description

诊断肾病的标志物以及诊断方法
技术领域
本公开涉及诊断肾病的标志物以及诊断方法，特别地涉及基于标志物诊断肾病的方法，该标志物用于诊断肾病的用途，测定该标志物水平的试剂用于诊断肾病的用途，以及测定该标志物水平的试剂制备用于诊断肾病的诊断试剂中的用途。
背景技术
肾病特别是慢性肾脏病(chronic kidney diseases，CKD)发病率不断增加，已成为全球性重大公共卫生问题。CKD是糖尿病的最主要并发症，随着糖尿病发病的不断增加，CKD在成年糖尿病人群的发病率，从2000至2007年逐年增加，并且中国糖尿病病人的CKD发生率(10.9％)显著高于全球平均发生率。美国糖尿病联盟(American DiabetesAssociation)指出20–40％的糖尿病病人将进展为CKD。一项来自中国住院病人的研究表明，CKD的发病率从2010年的19.5％攀升至2015年的24.3％。CKD尤其是中、重度阶段的患者，其用药、透析、肾脏移植，均给病人及家属以及社会造成严重的卫生及经济负担。此外，CKD还是心血管疾病及过早死亡的危险因素。而2型糖尿病合并CKD患者的死亡风险是单纯2型糖尿病或者单纯CKD患者的2倍多。
CKD的病程是渐进式的，进展过程包括肾小球高灌注，白蛋白尿渐进增加，持续恶化的肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)以及最终进展至终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)。CKD早期GFR的异常增加引起的肾小球高灌注状态，是肾脏功能持续恶化的独立危险因素。肾小球高灌注状态与糖尿病患者的高血糖密切相关，在2型糖尿病患者中，高灌注状态的发生率大于40％，但也有部分人呈现无症状。49％肾小球高灌注状态患者无白蛋白尿表现在CKD进展至三期后，疾病呈不可逆转，治疗仅能延缓其进展为ESRD的速度。为防止肾功能的进展，降低因ESRD造成的经济负担，早期干预，精确诊断尤为重要。精准的病情判断有助于准确制定治疗方案，并减少不必要的用药及相关副作用。
目前，CKD的诊断标准主要包括尿蛋白排泄率的持续增加和GFR的持续下降。肾脏排泄的过程主要包括如下4步，包括肾小球滤过，肾小管主动分泌，肾小管主动重吸收以及肾小管被动重吸收。GFR和尿液白蛋白与肌酐比值(urinary albumin to creatinineratio,UACR)是目前被认为诊断CKD最重要的诊断指标，但二者不能完全反应上述4种排泄过程。有研究表明，下降的GFR仅提示肾小球清除能力的下降。
另外，GFR可以通过同位素检测或者基于肌酐、胱抑素C的血清浓度进行计算评估。在临床中，大多使用血清肌酐指标估算GFR，但血清肌酐仅反映肾小球滤过效能，不能反映肾小管重吸收的能力，以及整个肾脏损伤的情况。血清肌酐浓度同样存在性别差异，并随着年龄增加、肌肉量增加、高蛋白饮食、药物使用等因素而增加。然而，单纯使用血清胱抑素C计算GFR与单纯使用肌酐相比较，GFR的准确性并没有显著提升。同时，基于胱抑素C计算GFR同样受到诸如年龄、性别、体重指数、吸烟、C反应蛋白水平等因素的影响。基于外源性的同位素标记物如125碘酞酸盐和碘海醇等检测GFR是一种侵入性的检查，也存在费用昂贵，操作复杂，不方便临床使用，对碘过敏患者禁用，有肾脏毒性等多种缺点。
UACR是另外一个评估CKD的指标，一般认为UACR异常是CKD最早的临床表现。但UACR在评估肾病时也有诸多局限。首先，不是所有CKD患者均出现UACR异常。在UKPDS研究中，51％的患者进展至第3-5期的中重度肾脏损伤(GFR<60mL/min/1.73m2)时﹐白蛋白尿检测呈阴性。DEMAND研究表明23％的存在GFR下降的2型糖尿病患者尿白蛋白均正常。其次，白蛋白尿受诸多身体条件因素影响，例如，高蛋白饮食、运动、发热、感染、高血糖、高血压、充血心衰。再次，目前尿蛋白的检测尚缺乏标准的检测方法，引起非常大的误差。最后，在ACCORD和UKPDS研究中均发现白蛋白尿的变化与肾病的变化之间存在不一致的情况。
以上不敏感、欠精确的临床指标难以满足精准诊断评估CKD病情的要求，相应给精准治疗带来困难。因此，寻找更可信赖、性价比高、非侵入性、方便的检测方法和标记物对于更精确地评估CKD的病情进展情况至关重要。
代谢组学(metabolomics)是一种分析机体内源性代谢状态、高通量的分析技术，包括靶向代谢组学和非靶向代谢组学。该技术在评估多因素代谢失常的状态下，鉴定新的标志物方面前景巨大。迄今为止，诸多代谢组学研究已经发表了一些新的肾病相关标志物，但此类研究多集中在预测CKD在GFR<60mL/min/1.73m2(3-5期)的中重度肾脏损伤的情况。由于CKD进入第3期，尤其是糖尿病肾脏损害，其病情多呈不可逆进展，治疗主要以延缓恶化为目标。再者，更早期的发现可以给患者提供逆转病情的机会。因此，筛选能预测更早期CKD病人标志物的意义，要远超过筛选预测中、重度CKD的意义。
本公开在现存临床指标基础上，尤其注重寻找诊断早期CKD相关代谢的代谢物，从而提升诊断CKD不同时期的准确性。本公开采用非靶向代谢组学技术寻找更敏感、更特异的潜在生物标志物，从而预测诊断CKD进展的不同阶段，包括早期的肾小球高灌注状态。
发明内容
本公开提供一种诊断受试者的肾病的方法，包括以下步骤：
-测定来自所述受试者的样品中的标志物的水平，以及
-分析来自所述受试者的样品中的标志物的水平，以诊断所述受试者的肾病，
其中，所述标志物包括选自由琥珀酰腺苷、假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱((L,L-TMAP)、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸、1,5-脱水-D-山梨糖醇组成的组中的至少一种。
本公开提供测定标志物的水平的试剂用于制备诊断受试者的肾病的诊断剂或试剂盒中的用途，
其中，所述标志物包括选自由琥珀酰腺苷、假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5-脱水-D-山梨糖醇组成的组中的至少一种。
本公开提供测定标志物的水平的试剂或试剂盒，用于诊断受试者的肾病中的用途，
其中，所述标志物包括选自由琥珀酰腺苷、假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5-脱水-D-山梨糖醇组成的组中的至少一种。
在一种或多种实施方式中，所述测定标志物的水平的试剂包括对照、标准品和/或检测试剂。
在一种或多种实施方式中，使用所述诊断受试者的肾病的诊断剂来诊断肾病的方法包括：
-使用所述诊断受试者的肾病的诊断剂测定来自所述受试者的样品中的标志物的水平，以及
-分析来自所述受试者的样品中的标志物的水平，以诊断所述受试者的肾病。
在一种或多种实施方式中，所述分析来自所述受试者的样品中的标志物的水平包括：
将来自所述受试者的样品中的标志物的水平与所述标志物的对应的参考水平进行比较；或者
由来自所述受试者的样品中的标志物的水平来估算GFR或UACR。
在一种或多种实施方式中，所述参考水平适用于所有性别的受试者。
在一种或多种实施方式中，所述参考水平为健康、非肾病受试者或非糖尿病受试者的样品中所述标志物的水平。
在一种或多种实施方式中，来自所述受试者的样品中的标志物的水平与所述标志物的对应的参考水平进行比较包括将来自所述受试者的样品中的标志物的水平中的每一个与对应的参考水平进行比较。
在一种或多种实施方式中，所述分析来自所述受试者的样品中的标志物的水平包括：
通过数学模型计算出来自所述受试者的样品中的标志物的综合评分，将所述综合评分与所述标志物的参考评分进行比较。
在一种或多种实施方式中，所述参考评分适用于所有性别的受试者。
在一种或多种实施方式中，所述标志物包括琥珀酰腺苷。
在一种或多种实施方式中，所述标志物还包括假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5-脱水-D-山梨糖醇中的至少一种。
在一种或多种实施方式中，所述标志物由琥珀酰腺苷和N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱组成。
在一种或多种实施方式中，所述标志物由琥珀酰腺苷、假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱和2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸组成。
在一种或多种实施方式中，所述标志物由4-乙酰氨基丁酸,琥珀酰腺苷,假尿苷,2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸,N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱和磺基酪氨酸组成。
在一种或多种实施方式中，所述标志物由琥珀酰腺苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸和假尿苷组成。
在一种或多种实施方式中，所述标志物由1,5-脱水-D-山梨糖醇组成。
在一种或多种实施方式中，所述标志物还包括由以下组成的组中的至少一种：
2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、对甲酚葡萄糖醛酸苷、高香草酸硫酸盐、O-己二酰基肉碱、阿拉伯糖异构体、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸、犬尿喹啉酸、N-乙酰肌肽、2-羟基乙磺酸盐、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、5-甲硫基-D-核糖、吲哚酚硫酸盐、羟基丁酰肉碱、对甲酚硫酸盐、苯酚硫酸盐、邻苯二酚硫酸盐、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱异构体、肌酐、尿素、马尿酸、琥珀酰肉碱、丁酰肉碱、吲哚-3-乳酸、2-辛烯酰肉碱、L-瓜氨酸、L-犬尿氨酸、戊酰肉碱、3-吲哚乙酸、L-谷氨酸、胆碱、9-癸烯酰肉碱、柠檬酸、L-苯丙氨酸、尿酸、皮质醇、L-谷氨酰胺、甜菜碱、L-酪氨酸、L-肉碱、L-色氨酸、胆红素、3-羟基癸酰基肉碱、γ-丁基甜菜碱、犬尿喹啉酸与犬尿氨酸的比值、犬尿氨酸与色氨酸的比值、假尿苷与尿苷的比值、L-瓜氨酸与精氨酸的比值、谷氨酸与谷氨酰胺的比值以及酪氨酸与苯丙氨酸的比值。
在一种或多种实施方式中，所述诊断受试者的肾病包括判断所述肾病的严重程度或肾病的阶段。
在一种或多种实施方式中，所述肾病为慢性肾病。
在一种或多种实施方式中，所述肾病为早期肾病，例如早期肾小球高灌注状态。
在一种或多种实施方式中，所述肾病为选自由以下组成的组中的至少一种：
原发性肾小球肾炎、继发性肾小球肾炎、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、CKD、遗传性肾病和肾小管间质病变。
在一种或多种实施方式中，所述原发性肾小球肾炎选自由急性肾小球肾炎、急进性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎和隐匿性肾小球肾炎、系膜增生性肾小球肾炎诸如IgA和非IgA系膜增生性肾小球肾炎、系膜毛细血管性肾小球肾炎、膜性肾病以及局灶性节段性肾小球硬化，硬化性肾病和新月体肾小球肾炎组成的组。
在一种或多种实施方式中，所述继发性肾小球肾炎选自由高血压肾小动脉硬化、糖尿病肾病、紫癜性肾炎、狼疮性肾病、血管炎性肾病、乙肝相关肾病、肥胖相关性肾病、尿酸性肾病、梗阻性肾病、药物性肾病、缺血性肾病、淀粉样变肾病和肿瘤相关肾病组成的组。
在一种或多种实施方式中，所述肾小管间质病变选自由急性间质性肾炎、慢性肾盂肾炎和肾小管酸中毒组成的组。
在一种或多种实施方式中，所述肾病为糖尿病肾病。
在一种或多种实施方式中，所述肾病为糖尿病慢性肾脏病。
在一种或多种实施方式中，所述肾病为早期糖尿病慢性肾脏病，优选地伴随早期肾小球高灌注状态的早期糖尿病慢性肾脏病。
在一种或多种实施方式中，所述肾病为GFR大于60的早期糖尿病肾病。
本公开还提供一种试剂盒，包括
检测以下代谢物的试剂中的至少两种：琥珀酰腺苷、假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5-脱水-D-山梨糖醇、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、对甲酚葡萄糖醛酸苷、高香草酸硫酸盐、O-己二酰基肉碱、阿拉伯糖异构体、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸、犬尿喹啉酸、N-乙酰肌肽、2-羟基乙磺酸盐、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、5-甲硫基-D-核糖、吲哚酚硫酸盐、羟基丁酰肉碱、对甲酚硫酸盐、苯酚硫酸盐、邻苯二酚硫酸盐、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱异构体、肌酐、尿素、马尿酸、琥珀酰肉碱、丁酰肉碱、吲哚-3-乳酸、2-辛烯酰肉碱、L-瓜氨酸、L-犬尿氨酸、戊酰肉碱、3-吲哚乙酸、L-谷氨酸、胆碱、9-癸烯酰肉碱、柠檬酸、L-苯丙氨酸、尿酸、皮质醇、L-谷氨酰胺、甜菜碱、L-酪氨酸、L-肉碱、L-色氨酸、胆红素、3-羟基癸酰基肉碱和γ-丁基甜菜碱。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒包括
i.检测琥珀酰腺苷的试剂，以及
ii.检测以下代谢物的试剂中的至少一种：假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5-脱水-D-山梨糖醇、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、对甲酚葡萄糖醛酸苷、高香草酸硫酸盐、O-己二酰基肉碱、阿拉伯糖异构体、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸、犬尿喹啉酸、N-乙酰肌肽、2-羟基乙磺酸盐、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、5-甲硫基-D-核糖、吲哚酚硫酸盐、羟基丁酰肉碱、对甲酚硫酸盐、苯酚硫酸盐、邻苯二酚硫酸盐、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱异构体、肌酐、尿素、马尿酸、琥珀酰肉碱、丁酰肉碱、吲哚-3-乳酸、2-辛烯酰肉碱、L-瓜氨酸、L-犬尿氨酸、戊酰肉碱、3-吲哚乙酸、L-谷氨酸、胆碱、9-癸烯酰肉碱、柠檬酸、L-苯丙氨酸、尿酸、皮质醇、L-谷氨酰胺、甜菜碱、L-酪氨酸、L-肉碱、L-色氨酸、胆红素、3-羟基癸酰基肉碱和γ-丁基甜菜碱。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒包括
i.检测N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱的试剂，以及
ii.检测以下代谢物的试剂中的至少一种：假尿苷、琥珀酰腺苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5-脱水-D-山梨糖醇、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、对甲酚葡萄糖醛酸苷、高香草酸硫酸盐、O-己二酰基肉碱、阿拉伯糖异构体、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸、犬尿喹啉酸、N-乙酰肌肽、2-羟基乙磺酸盐、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、5-甲硫基-D-核糖、吲哚酚硫酸盐、羟基丁酰肉碱、对甲酚硫酸盐、苯酚硫酸盐、邻苯二酚硫酸盐、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱异构体、肌酐、尿素、马尿酸、琥珀酰肉碱、丁酰肉碱、吲哚-3-乳酸、2-辛烯酰肉碱、L-瓜氨酸、L-犬尿氨酸、戊酰肉碱、3-吲哚乙酸、L-谷氨酸、胆碱、9-癸烯酰肉碱、柠檬酸、L-苯丙氨酸、尿酸、皮质醇、L-谷氨酰胺、甜菜碱、L-酪氨酸、L-肉碱、L-色氨酸、胆红素、3-羟基癸酰基肉碱和γ-丁基甜菜碱。
在一种或多种实施方式中，所述试剂盒包括
i.检测琥珀酰腺苷的试剂，以及
ii.检测以下代谢物的试剂中的至少一种：假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸和肌酐。
在一种或多种实施方式中，其中所述试剂盒包括
i.检测假尿苷的试剂，以及
ii.检测以下代谢物的试剂中的至少一种：琥珀酰腺苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸和肌酐。
在一种或多种实施方式中，其中所述试剂盒包括
i.检测2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸的试剂，以及
ii.检测以下代谢物的试剂中的至少一种：假尿苷、琥珀酰腺苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱和肌酐。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本公开的某些实施方式，因此，不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1显示了验证集中(A)健康对照组及各分期的糖尿病CKD病人左肾超声扫描图及(B)各组的BSA-肾体积和肾动脉阻力指数。
图2显示了从UPLC-Orbitrap-MS检测血清样品中2.89min加合物[M-H]-＝m/z382.1004峰与琥珀酰腺苷标准品的鉴定比较。
图3显示了从UPLC-Orbitrap-MS检测血清样品中log10[1,5-脱水-D-山梨糖醇]对糖化血红蛋白(hemoglobin A1c)的(A)CKD第0-4期和(B)CKD第1-3期线性回归结果
图4显示了在各组糖尿病CKD病人的筛选代谢物及肌酐、胱抑素C指标随疾病进展的变化箱线图。
图5显示了(A)糖尿病CKD病人肌酐、胱抑素C及筛选代谢物基于性别分组的散点图；(B)糖尿病CKD病人肌酐及筛选代谢物与GFR的线性回归分析。
图6显示了验证集CKD第1-4期患者中筛选代谢物、CKD相关的临床标记物与不同方程计算的GFR的相关系数矩阵图。
图7显示了模型L1、模型L8和模型L10多元线性回归。
图8显示了与CKD疾病进展相关的代谢物指标的筛选流程。
具体实施方式
为使本公开实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本公开实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施方式中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
定义和一般技术
除非本文另有定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下描述示例性方法和材料，但是与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中。
如本文所用，“标志物”、“生物标志物”和“代谢标志物”可以互换使用，是指其水平变化与疾病，特别是肾病的发生和发展具有相关性的化合物或代谢物。换句话说，疾病患者与健康者的样品中标志物水平存在差异，疾病患者在各分期至少有1期与前期之间存在差异，特别是显著差异。
例如，肾病患者的样品中的代谢物水平与健康或非肾病患者的样品中的代谢物水平相比，升高至少5％、至少7.5％、至少10％、至少12.5％、至少15％、至少17.5％、至少20％、至少22.5％、至少25％、27.5％、至少30％、至少32.5％、至少35％、至少37.5％、至少40％、至少42.5％、至少45％、至少47.5％、至少50％、至少52.5％、至少55％、至少57.5％、至少60％、至少62.5％、至少65％、至少67.5％、至少70％、至少72.5％、至少75％、至少77.5％、至少80％、至少82.5％、至少85％、至少87.5％、至少90％、至少92.5％、至少95％、至少97.5％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更高。
替代地，例如，肾病患者的样品中的代谢物水平与健康或非肾病患者的样品中的代谢物水平相比，降低至少5％、至少7.5％、至少10％、至少12.5％、至少15％、至少17.5％、至少20％、至少22.5％、至少25％、27.5％、至少30％、至少32.5％、至少35％、至少37.5％、至少40％、42.5％、至少45％、至少47.5％、至少50％、至少52.5％、至少55％、至少57.5％、至少60％、至少62.5％、至少65％、至少67.5％、至少70％、至少72.5％、至少75％、至少77.5％、至少80％、至少82.5％、至少85％、至少87.5％、至少90％、至少92.5％、至少95％、至少97.5％或至少100％。
替代地，疾病患者与健康或非肾病患者的样品中标志物水平之间存在统计学显著差异(例如，由p值≤0.05来指示)，如使用T检验(Student’s t-test)、曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)和方差分析测定的。
标志物的“水平”意指样品中测量的标志物的绝对量或浓度或者相对量或浓度。
如本文所用，受试者的“样品”是指从受试者分离的生物材料。生物样品是含有所希望的标志物的适于检测的任何生物材料，并且包括例如受试者的细胞材料和/或非细胞材料。样品可以分离自生物组织或流体，例如肾组织、血液、血浆、血清、尿液或脑脊液。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可以互换使用，是指脊椎动物，优选地是哺乳动物，最优选地是人类。哺乳类动物包括但不限于鼠类、猿类、人类、家畜、竞技动物和宠物。在体内获得的或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其子代也包括在内。
如本文所用，术语“诊断”或“医学诊断”是指从医学角度对人们的精神和体质状态作出的判断。具体来说是一种确定哪种疾病或病症可以解释受试者的症状和体征的过程。例如，通过测定本文所公开的标志物来确定受试者中肾病的存在，对肾病分期，判断肾病的严重程度，确定肾病的具体类型和阶段(例如早期糖尿病肾病)。
“肾小球滤过率”(GFR)是单位时间内(每分钟)两侧肾生成的超滤液量，即每单位时间两侧肾脏所有肾单位从肾小球毛细血管过滤进包曼氏囊的流体的总体积。GFR是肾脏的排泄功能的度量，GFR处于某一阈值范围指示正常的肾功能。GFR低于该阈值指示肾功能削弱或受损。GFR高于该阈值提示肾小球的高滤过、高灌注、高压力状态，见于部分疾病的早期，提示机体呈代偿性做功增加，后续有发生肾脏损伤风险。
如本文所用，术语“测定标志物的水平的试剂”是指在任何可以检测标志物的水平的方法或步骤中使用的试剂，包括但不限于，对照物，标准品和检测试剂。一般来说，标准品是达到一定纯度要求的标志物制品，例如纯度至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％的制品。标准品也可以是多种标志物以精确比例配置的混合物。对照物一般是指不含标志物或者标志物处于正常水平(健康受试者样品中的标志物的水平范围)的样品，其可以用于确定受试者样品中标志物的水平的相对值。检测试剂一般是指能够在测定方法中具有与标志物结合、使标志物分离或富集、指示标志物的存在等功能的具有一定选择性和灵敏度的物质、化合物和/或混合物。
如本文所用，标记物的“参考水平”意指指示具有或不具有特定疾病状态、类型和/或发展阶段的标记物的绝对水平或相对水平，或由特定计算模型得到的多个标志物的综合得分值。例如，标志物的“阳性”参考水平意指指示特定疾病状态或类型的水平。标志物的“阴性”参考水平意指指示缺乏特定疾病状态或类型的水平。例如，标志物的“CKD-阳性参考水平”意指在受试者体内指示CKD阳性诊断的标志物水平，并且标志物的“CKD-阴性参考水平”意指在受试者体内指示CKD阴性诊断的标志物水平(即正常的肾功能，未患有CKD)。例如，对于糖尿病肾病的阴性参考水平可以是健康个体或者糖尿病但不伴随肾病的患者的标志物水平。“肾功能参考水平”可以指示存在于受试者体内的肾功能水平。例如，标志物的“正常肾功能参考水平”意指在受试者体内指示正常肾功能的标志物水平，标志物的“中度降低的肾功能参考水平”意指指示中度降低的肾功能的标志物水平，并且标志物的“严重降低的肾功能参考水平”意指在受试者体内指示严重降低的肾功能的标志物水平。
“估计的肾小球滤过率”(eGFR)是指肾小球滤过率的计算估计值。通常，低的eGFR值与降低的肾功能相关。
“MDRD GFR(Modification of Diet in Renal Disease GFR)”和”CKD-EPI(Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration)”肌酐公式是用于计算GFR的方程，是临床上广泛使用的GFR计算公式。
如本文中所采用的，CKD包括损害肾脏的以下病症：导致肾脏清除来自身体的废物的能力下降，导致体内高水平的废物以及导致患病和患上并发症(如高血压、贫血、营养健康不良及神经损害)的风险增加。具有至少三个月肾脏损害的患者可以被诊断患有CKD。由CKD造成的肾脏损害是永久的。
如本文中所采用的，糖尿病肾病是糖尿病微血管病变的严重并发症,是当前ESRD的主要原因。糖尿病肾病是由在肾脏肾小球的毛细血管病所引起的渐进性肾脏病变。它的特点是有肾病症候群(nephrotic syndrome)，系膜扩张，基底膜增厚，细胞外基质大量沉积，逐步进展至弥漫性肾小球硬化(diffuse glomerulosclerosis)。本病因长期的糖尿病所造成，且透析、肾移植等替代疗法是在许多发达国家中的主要疗法。其被分类为糖尿病微血管并发症。
在一种或多种实施方式中，可以使用任何本领域的技术手段测定标志物的水平。例如，使用色谱法，例如与质谱联用的色谱法，来测定标志物。色谱法包括但不限于液相色谱和气相色谱。液相色谱包括但不限于高效液相色谱(HPLC)和超高效液相色谱(Ultra-Performance Liquid Chromatography，UPLC)。特别是UPLC与质谱联用，可以用于测定标志物。
在一种或多种实施方式中，用于测定标志物的水平的试剂包括但不限于对照物，标准品和检测试剂。
例如在用于测定标志物的色谱法中，检测试剂包括但不限于流动相、洗脱剂、平衡剂、色谱柱填料。
例如在用于测定标志物的免疫测定法中，检测试剂包括但不限于能够与标志物免疫结合的结合分子，诸如抗体，以及能够在免疫结合后指示结合的试剂，例如酶标记物与酶标记物的底物，胶体金等等。
在一种或多种实施方式中，用于测定标志物的水平的试剂还包括在采集样品的过程中使用的试剂，例如保存液、稀释液等。
用于测定标志物的水平的试剂包括但不限于：乙腈、甲醇(HPLC级别)购自Duksan公司(ANSAN-SI,South Korea)、纯水(例如，Milli-Q水净化系统(Millipore,Bedford,MA,USA)的净化水设备制得)、甲酸、顺式-10-十九碳烯酸(C19:1n9c)标准品(例如，购自SigmaAldrich公司(St.Louis,MO,USA))、胆酸-2,2,4,4-D4、左旋色氨酸(indole-D5)(例如，购自Cambridge Isotope Laboratories公司(Tewksbury,MA,USA))、胆碱、肌酐、肌苷、马尿酸、胆红素(例如，购自Acros Organics公司)、高香草酸硫酸盐、戊酰肉碱、硫酸脱氢表雄酮(例如，购自Cayman Chemical公司)、L-肉碱、L-乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、p-对甲酚硫酸盐、L-辛酰肉碱、十二酰肉碱、硬脂酰肉碱(例如，购自CIL公司)、4-乙酰氨基丁酸(例如，购自Matrix Scientific公司)，阿拉伯糖异构体、N-乙酰肌肽、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、己酰肉碱、吲哚-3-乳酸(例如，购自Santa Cruz公司)、磺基酪氨酸、L-鸟氨酸、L-谷氨酰胺、L-瓜氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、甜菜碱、2-羟基乙磺酸盐、L-脯氨酸、L-缬氨酸、尿酸、L-蛋氨酸、柠檬酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸、2-羟基丁酸、L-犬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚酚硫酸盐、3-吲哚乙酸、皮质醇、癸酰肉碱、L-精氨酸(例如，购自Sigma Aldrich公司)、假尿苷、琥珀酰肉碱、O-己二酰基肉碱(例如，购自Supelco公司)、琥珀酰腺苷、γ-丁基甜菜碱、1,5-脱水-D-山梨糖醇、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸(例如，购自TRC公司)、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱(例如，购自ChemPartner公司)、D-葡萄糖(例如，购自International laboratory公司)、尿嘧啶和/或尿苷(例如，购自Wako公司)。
在一种或多种实施方式中，本公开的标志物由琥珀酰腺苷(succinyladenosine)、假尿苷(pseudouridine)、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱(N,N,N-trimethyl-L-alanyl-L-proline betaine，L,L-TMAP)和2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸(2-(α-D-mannopyranosyl)-L-tryptophan)组成或者包括琥珀酰腺苷、假尿苷、L,L-TMAP和2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸(2-(α-D-Mannopyranosyl)-L-tryptophan)中的一种或多种。本公开的一种或多种实施方式中的标志物，以由琥珀酰腺苷,假尿苷,L,L-TMAP和2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸中的每个作为标志物或者其组合作为标志物，在诊断和评估肾病肾功能，尤其在早期肾病，特别是早期糖尿病肾病中，表现出比传统的肌酐和胱抑素C更高的精度，准确性，敏感性和特异性；并且在预测GFR方面，表现出比传统的肌酐和胱抑素C更高的敏感性。上述4种标志物(代谢物)不仅能从GFR的角度反映肾功能的变化，还可以反映UACR、尿β2微球蛋白(urinaryβ2-microglobulin)、肾动脉阻力指数和BSA-肾体积这些层面肾脏损伤的情况，即可以兼顾评估肾小球及肾小管的双方面的损伤情况，较传统的肌酐、胱抑素C指标更全面地反应肾脏功能异常的情况。因此，相比于肌酐、胱抑素C，这4种标志物可更全面地评估肾脏损伤，具有成为更优评估肾损伤的能力。
在一种或多种实施方式中，本公开的标志物由4-乙酰氨基丁酸、琥珀酰腺苷、假尿苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、L,L-TMAP和磺基酪氨酸组成，或者包括4-乙酰氨基丁酸、琥珀酰腺苷、假尿苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、L,L-TMAP和磺基酪氨酸中的一种或多种在预测以UACR<30mg/g Cr、30-300mg/g Cr、>300mg/g Cr为阈值范围的各轻中重的白蛋白尿中具有高精确度和灵敏度。发明人发现，磺基酪氨酸与琥珀酰腺苷、假尿苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸，在区分以UACR<30mg/g Cr与UACR＝30-300mg/g Cr两组的白蛋白尿具有高的精确度和灵敏度，因此可以更有效地预测白蛋白尿的严重程度。
在一种或多种实施方式中，本公开的标志物由琥珀酰腺苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸和假尿苷组成。在一种或多种实施方式中，本公开的标志物包括琥珀酰腺苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸和假尿苷中的一种或多种。发明人发现，本公开的一种或多种实施方式中的标志物与肾病之间的相关性并不依赖于性别。也就是说，男性和女性肾病患者中的这些标志物具有一致性。这对于受试者肾病的诊断具有重要意义。本领域已知估算GFR来诊断肾病的标志物，通常是血清肌酐或胱抑素C，但是在临床中这两种标志物都存在性别差异，这就造成估算和诊断的复杂性，从而可能会带来诊断不准确，费时费力，容易产生诊断事故等问题。而本公开的一种或多种实施方式中的标志物，如上所述，解决了该问题。
在一种或多种实施方式中，本公开的标志物是1,5-脱水-D-山梨糖醇或者包括1,5-脱水-D-山梨糖醇。发明人发现在糖尿病肾脏早、中期肾小管损伤的患者血清中的1,5-脱水-D-山梨糖醇水平与健康者相比非常显著地降低，并且，第1-3期患者的log10[1,5-脱水-D-山梨糖醇]与糖化血红蛋白有明显的相关性，其可以更早期地预警和诊断糖尿病肾小管损伤。
标志物筛选方法
本公开基于健康人、糖尿病、糖尿病CKD人群的横断面研究，运用非靶向代谢组学分析方法，从7249个代谢特征中筛选出与糖尿病肾脏功能进展密切相关的72个代谢物和8个代谢物比值。通过比较测试集和验证集代谢变化的趋势及倍数情况，我们筛选出49个代谢物，6个代谢物比值与肾功能异常有关。筛选出的代谢物分别属于硫酸盐代谢物，氨基酸和有机酸，酰基肉碱，嘌呤衍生物，单糖及其衍生物，类固醇等6类。逐步优选，并最终筛选出4个最显著的代谢物。通过数据建模，分析与CKD肾小球滤过降低状态、尿白蛋白增加状态相关的代谢物，评估代谢物模型对CKD病情评估的预测价值。肾小球滤过降低状态的程度，参照CKD分期标准分别以GFR＝120、90、60、30为界限分组。CKD尿白蛋白/肌酐比值(UACR)增加状态主要分为轻、中、重度尿白蛋白的增加，分别以UACR等于30和300为界限。通过评价代谢物在评估CKD疾病严重程度分期的相关性和预测准确性，进而为慢性肾脏病的病情评估提供新指标和新靶点。
本公开中评估肾脏功能的标志物组合、预测模型可以实现更准确地评估肾脏功能分期及计算GFR数值。在CKD高灌注状态，提供更丰富的代谢标志物评估指标。补充既往肌酐指标在GFR大于60mL/min 173m2情况下，计算不准确的缺陷。为临床评估肾脏功能病情，提供无创、简洁、快速的评估方法。这对于CKD患者的尽早干预、疗效评价有着非常重要的意义。
筛选出的标志物
预测CKD分期以及估算GFR的标记物
在预测CKD分期以及估算GFR的标记物方面，本公开筛选出的标记物(或指标)包括：2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸(2-[3-(sulfooxy)phenyl]acetic acid)、对甲酚葡萄糖醛酸苷(p-Cresol glucuronide)、高香草酸硫酸盐(Homovanillic acid sulfate)、O-己二酰基肉碱(O-Adipoylcarnitine)、阿拉伯糖异构体(Arabinose isomer)、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸(L-β-aspartyl-L-leucine)、犬尿喹啉酸(Kynurenic acid)、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸(2-(α-D-Mannopyranosyl)-L-tryptophan)、N-乙酰肌肽(N-Acetylcarnosine)、2-羟基乙磺酸盐(2-Hydroxyethanesulfonate)、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺(α-N-Phenylacetyl-L-glutamine)、5-甲硫基-D-核糖(5-Methylthio-D-ribose)、4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutanoic acid)、吲哚酚硫酸盐(Indoxyl sulfate)、琥珀酰腺苷(succinyladenosine)、羟基丁酰肉碱(Hydroxybutyrylcarnitine)、对甲酚硫酸盐(p-Cresol sulfate)、磺基酪氨酸(Sulfotyrosine)、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱(N,N,N-trimethyl-L-alanyl-L-proline betaine,L,L-TMAP)、苯酚硫酸盐(Phenolsulfate)、邻苯二酚硫酸盐(Pyrocatechol sulfate)、假尿苷(Pseudouridine)、L,L-TMAP异构体、肌酐(Creatinine)、尿素(Urea)、马尿酸(Hippuric acid)、琥珀酰肉碱(Succinylcarnitine)、丁酰肉碱(Butyrylcarnitine)、吲哚-3-乳酸(Indole-3-lacticacid)、2-辛烯酰肉碱(2-Octenoylcarnitine)、L-瓜氨酸(L-Citrulline)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、戊酰肉碱(Valerylcarnitine)、3-吲哚乙酸(3-Indoleacetic acid)、L-谷氨酸(L-Glutamic acid)、胆碱(Choline)、9-癸烯酰肉碱(9-Decenoylcarnitine)、柠檬酸(Citric acid)、L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine)、尿酸(Uric acid)、皮质醇(Cortisol)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、甜菜碱(Betaine)、L-酪氨酸(L-Tyrosine)、L-肉碱(L-Carnitine)、L-色氨酸(L-Tryptophan)、胆红素(Bilirubin)、1,5-脱水-D-山梨糖醇(1,5-Anhydro-D-glucitol)、3-羟基癸酰基肉碱(3-Hydroxydecanoyl carnitine)、γ-丁基甜菜碱(γ-Butyrobetaine)、犬尿喹啉酸与犬尿氨酸的比值(Ratio of kynurenic acid tokynurenine)、犬尿氨酸与色氨酸的比值(Ratio of kynurenine to tryptophan)、假尿苷与尿苷的比值(Ratio of pseudouridine to uridine)、L-瓜氨酸与精氨酸的比值(Ratioof L-citrulline to arginine)、谷氨酸与谷氨酰胺的比值(Ratio of glutamic acid toglutamine)以及酪氨酸与苯丙氨酸的比值(Ratio of tyrosine to phenylalanine)的一种或几种组合。
优选的假尿苷、L,L-TMAP、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、L,L-TMAP异构体、5-甲硫基-D-核糖、肌酐、琥珀酰腺苷、磺基酪氨酸、2-羟基乙磺酸盐、琥珀酰肉碱、4-乙酰氨基丁酸、O-己二酰基肉碱、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、犬尿喹啉酸、L-犬尿氨酸、吲哚-3-乳酸、阿拉伯糖异构体、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸、丁酰肉碱、吲哚酚硫酸盐、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、N-乙酰肌肽、L-色氨酸、L-瓜氨酸、L-酪氨酸、高香草酸硫酸盐、对甲酚葡萄糖醛酸苷、苯酚硫酸盐、胆红素、L-肉碱、对甲酚硫酸盐、3-羟基癸酰基肉碱、9-癸烯酰肉碱、3-吲哚乙酸、戊酰肉碱、γ-丁基甜菜碱、假尿苷与尿苷的比值、犬尿氨酸与色氨酸的比值、酪氨酸与苯丙氨酸的比值、犬尿喹啉酸与犬尿氨酸的比值的一种或几种组合。
更优的假尿苷、L,L-TMAP、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、L,L-TMAP异构体、5-甲硫基-D-核糖、肌酐、琥珀酰腺苷、磺基酪氨酸、2-羟基乙磺酸盐、琥珀酰肉碱、4-乙酰氨基丁酸、O-己二酰基肉碱、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、假尿苷与尿苷的比值、犬尿氨酸与色氨酸的比值的一种或几种组合。
最优的琥珀酰腺苷、假尿苷、L,L-TMAP、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸的一种或几种组合。
代谢物琥珀酰腺苷、假尿苷、L,L-TMAP,2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸与目前临床使用的肾功能评估指标血清肌酐比较，以上代谢物与MDRD GFR之间的相关性更高，随病情变化反应更灵敏。单变量线性回归分析准确性大于80％(R2>0.86,均方根误差RMSE<0.13)。多元线性回归基于琥珀酰腺苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸和假尿苷预测糖尿病人的MDRD GFR中，性别没有影响力。L,L-TMAP预测MDRD GFR的性别作用，明显较质谱检测的肌酐要低。逐步多元线性回归分析(stepwise multivariate linear regression)提示log[MDRD GFR]＝-0.6083log[质谱检测的肌酐]-0.4803log[假尿苷]-0.1403log[L,L-TMAP]+0.0934性别(女性＝1，男性＝2)+1.4315(图7)，为预测log[MDRD GFR]的最佳回归方程，可改善肌酐的预测准确性。
本研究首次探索代谢物在诊断评估全病程糖尿病CKD的效能，尤其注重肾脏早期损伤的效能(第1-2期，包括肾小球高灌注状态下)，代谢物预测CKD严重程度较单纯使用肌酐指标更精准，更敏感。在GFR的线性回归模型中(图5)，4个代谢物的线性斜率(slope)分别为-1.155至-0.9136之间，绝对值明显高于血清肌酐的(斜率＝-0.7926)，提示4个代谢物在预测GFR时均较传统的临床指标肌酐、胱抑素C指标更敏感。
本研究首次报道了L,L-TMAP和琥珀酰腺苷指标在GFR大于60的早期糖尿病病人的肾损伤评估预测效能，以及首次探讨了琥珀酰腺苷在预测GFR时无性别差异的特点。该特点将促使基于代谢物计算的GFR方法更方便，更准确。
通过随机森林算法计算得到的接收者操作特征(receiver operatingcharacteristic,ROC)曲线下的面积(area under curve,AUC)表明，联合指标可以显著提升CKD诊断的准确度、灵敏度和特异度。
在GFR>60的2型糖尿病CKD人群中筛选出高灌注患者(GFR>120)的结果提示模型1(质谱检测的血清肌酐+假尿苷)、模型2(质谱检测的血清肌酐+琥珀酰腺苷)、模型3(琥珀酰腺苷+假尿苷)、模型4(假尿苷+L,L-TMAP)、模型5(模型1+2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸)、模型6(模型1+琥珀酰腺苷)及模型7(模型1+L,L-TMAP)的预测效能(AUC＝0.811-0.909)高于单纯肌酐模型(AUC＝0.754-0.763)。在60<GFR<90的2型糖尿病患者中，筛选出GFR轻度下降的人群结果表明上述的模型l-7的预测效能(AUC＝0.776-0.986)高于单纯肌酐的结果(AUC＝0.600-0.680)。此外，筛选的4种代谢物还与UACR、尿β2微球蛋白和肾动脉阻力指数呈显著正相关，与BSA-肾体积呈负相关。该相关程度较血清肌酐和胱抑素C相近或更强。如表9所示4种标志物与UACR的相关性系数(R＝0.710-0.774)高于质谱检测的肌酐的相关系数(R＝0.669)以及胱抑素C的相关系数(R＝0.676)；4种标志物与尿β2微球蛋白的相关系数(R＝0.6755-0.7415)优于或近似质谱检测的肌酐的相关系数(R＝0.676)以及胱抑素C的相关系数(R＝0.675)；4种标志物与肾动脉阻力指数的相关系数(R＝0.517-0.588)，高于质谱检测的肌酐的相关系数(R＝0.459)；4种标志物与BSA-肾体积的相关系数(R＝0.596-0.615)，显著高于质谱检测的肌酐的相关系数(R＝0.473)。这一结果提示筛选出的代谢物不仅能从GFR的角度反映肾功能的变化，还可以反映UACR、尿β2微球蛋白、肾动脉阻力指数、BSA-肾体积层面肾脏损伤的情况，提示4种代谢物能综合反映肾小球、肾小管的层面肾脏损伤情况，较肌酐、胱抑素C具有更全面的评估效能，具有成为更优评估肾损伤的能力。
预测评估UACR异常的代谢物
在预测评估UACR异常方面，筛选得到的标记物包括：4-乙酰氨基丁酸、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、琥珀酰腺苷、假尿苷、5-甲硫基-D-核糖、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、L,L-TMAP、L,L-TMAP异构体、磺基酪氨酸、2-羟基乙磺酸盐、O-己二酰基肉碱、肌酐、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸,琥珀酰肉碱、阿拉伯糖异构体、L-犬尿氨酸、吲哚乙酸、犬尿喹啉酸、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、L-酪氨酸、高香草酸硫酸盐、L-色氨酸、L-瓜氨酸、丁酰肉碱、胆红素、N-乙酰肌肽、吲哚酚硫酸盐、对甲酚葡萄糖醛酸苷、苯酚硫酸盐、犬尿氨酸与色氨酸的比值、酪氨酸与苯丙氨酸的比值、假尿苷与尿苷的比值的一种或几种组合。
优选的4-乙酰氨基丁酸、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、琥珀酰腺苷、假尿苷、5-甲硫基-D-核糖、2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、L,L-TMAP、L,L-TMAP异构体、磺酪氨酸、2-羟基乙磺酸盐、O-己二酰基肉碱、MS-检测的肌酐、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸、犬尿氨酸与色氨酸的比值、假尿苷与尿苷的比值、酪氨酸与苯丙氨酸的比值的一种或几种组合。
最优的7个代谢物--4-乙酰氨基丁酸、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、琥珀酰腺苷、假尿苷、L,L-TMAP、磺基酪氨酸及质谱检测的肌酐的一种或几种组合。
对于研究发现筛选出的代谢物，7个单一代谢物(琥珀酰腺苷、假尿苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、L,L-TMAP、L,L-TMAP异构体、4-乙酰氨基丁酸和磺基酪氨酸)评估预测糖尿病CKD患者是否存在UACR异常(正常UACR<30vs异常UACR≥30mg/g Cr AUC＝0.667-0.837)的准确性都与单纯质谱检测-肌酐的结果(AUC＝0.677–0.774)接近，具可比性。
从UACR异常患者中预测是否存在较严重的微量白蛋白尿(UACR＝30-300vs>300mg/g Cr,AUC＝0.841–0.948)的ROC曲线分析表明，这7个单一代谢物(AUC＝0.893-0.957)都较质谱检测-肌酐(AUC＝0.820–0.880)更优(表14)。而且，预测是否存在大量白蛋白尿(UACR>300vs≤300mg/g Cr)的ROC曲线分析也表明，这7个单一代谢物(AUC＝0.893-0.957)都较质谱检测-肌酐(AUC＝0.857-0.889)更优(表14)。
联合指标有助于进一步提升白蛋白尿诊断的准确度、灵敏度和特异度。磺基酪氨酸分别与质谱检测-肌酐、假尿苷、2-(α-D-2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、琥珀酰腺苷或4-乙酰氨基丁酸指标组合形成的4个双代谢物预测模型(表15)在区分正常白蛋白尿(UACR<30mg/g Cr)与微量白蛋白尿(UACR＝30-300mg/g Cr)患者之间的AUC有所提升(测试集AUC＝0.668-0.706，验证集AUC＝0.559-0.619)，较单纯质谱检测-肌酐的结果更准确(测试集AUC＝0.665，验证集AUC＝0.444)。另外，磺基酪氨酸分别与L,L-TMAP(测试集AUC＝0.653，验证集AUC＝0.597)或4-乙酰氨基丁酸组合(测试集AUC＝0.660，验证集AUC＝0.606)的两个双代谢物预测模型的准确性都与单纯质谱检测-肌酐(测试集AUC＝0.665，验证集AUC＝0.444)的测试集结果相近，而两个模型的验证集AUC更有所提升。
作为糖尿病肾脏早、中期肾小管损伤的预警指标的代谢物
在糖尿病肾脏早、中期肾小管损伤的预警方面，本研究发现糖尿病CKD病人的血清1,5-脱水-D-山梨糖醇较健康者显著降低[差异倍数(fold change)＝-26.5–-2.60]，其降低幅度明显大于其他代谢物，且以疾病早期变化幅度最大，高灌注期CKD病人的血清1,5-脱水-D-山梨糖醇较健康者下降最为明显(差异倍数＝-26.50–-17.75)(表6)。进一步分析发现，在CKD第1-3期，1,5-脱水-D-山梨糖醇与临床指标中的空腹血糖、糖化血红蛋白高度相关，log[1,5-脱水-D-山梨糖醇]与糖化血红蛋白的Pearson R＝-0.95--0.64；与空腹血糖的Pearson R＝-0.87--0.42(表10)，但在健康人和4期CKD患者的相关性不显著。1,5-脱水-D-山梨糖醇是一种可被葡萄糖竞争抑制的，在近端肾小管重吸收的代谢物，糖尿病状态下，机体血糖超过肾糖阈，葡萄糖竞争性抑制(1,5-脱水-D-山梨糖醇)在近端肾小球的重吸收，1,5-脱水-D-山梨糖醇大量排泄，致使血清1,5-脱水-D-山梨糖醇浓度明显降低，该表现在早期肾脏损伤时尤为明显。因此，其可以预警早期的因血糖异常引起的肾小管损伤。
试剂盒
在一种或多种实施方式中，如本文所述的用于制备诊断受试者的肾病的诊断剂中的用途的试剂盒或用于诊断受试者的肾病的试剂盒包括用于测定本文所述的一种或多种标志物水平的试剂，例如对照、标准品和/或检测试剂。
在一种或多种实施方式中，试剂盒或其一部分包括用于从受试者采集样品或纯化目的标志物的试剂或材料。例如，试剂盒包括至少一个过滤材料(例如过滤膜)和/或装置以离析、积聚和/或纯化(例如通过液相色谱)样品或样品中的标志物。例如，试剂盒包括至少一种用于在过滤材料上洗涤已离析的、已积聚的和/或已纯化的的洗涤试剂，诸如洗涤缓冲剂。在一种或多种实施方式中，试剂盒是一种或多种试剂或材料的组合。
在一种或多种实施方式中，试剂盒具有实体形态。例如，试剂盒可以是具有一个或多个空间的容器，该一个或多个空间用于容纳上述对照、标准品、检测试剂、材料和/或装置。例如，试剂盒具有外壳，例如由塑料制成的外壳。
在一种或多种实施方式中，试剂盒包括使用说明书，用于指示的标签或和/包装插页。
在一种或多种实施方式中，试剂盒包括代谢物标准品，例如4-乙酰氨基丁酸、琥珀酰腺苷、假尿苷、L,L-TMAP、磺基酪氨酸、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸和肌酐。在一种或多种实施方式中，试剂盒包括提取溶剂，例如甲醇。在一种或多种实施方式中，试剂盒包括溶解溶剂(例如用于溶解代谢物提取物)，诸如乙腈和纯水。在一种或多种实施方式中，试剂盒包括流动相，例如用于液相色谱或液相色谱和质谱联用的流动相，包括但不限于甲酸、纯水和乙腈。
在一种或多种实施方式中，试剂盒由用于测定琥珀酰腺苷的试剂和用于测定L,L-TMAP的试剂组成。
实施例
糖尿病、糖尿病肾病患者与健康人之间血清差异代谢物的筛选表征
一、研究设计和方法
主要试剂研究材料
血清代谢物提取溶剂:甲醇(HPLC级别)(购自韩国Duksan)，加入內标。
血清代谢物提取物重溶液溶剂:乙腈、甲醇(HPLC级别)(购自韩国Duksan公司)及纯水(美国Millipore Milli-Q水净化系统设备制得)。
內标包含顺式-10-十九碳烯酸(C19:1n9c)(购自Sigma Aldrich公司(St.Louis,MO,USA))、胆酸-2,2,4,4-D4及左旋色氨酸(indole-D5)(购自Cambridge IsotopeLaboratories公司(Tewksbury,MA,USA)。
用于鉴定代谢物的标准品在表5中均有列出。标准品包括胆碱、肌酐、肌苷、马尿酸、胆红素(购自美国Acros Organics公司)、高香草酸硫酸盐、戊酰肉碱、硫酸脱氢表雄酮(购自美国Cayman Chemical)、L-肉碱、L-乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、p-对甲酚硫酸盐、L-辛酰肉碱、十二酰肉碱、硬脂酰肉碱(购自美国Cambridge Isotope Laboratories)、4-乙酰氨基丁酸(购自美国Matrix Scientific)、阿拉伯糖、N-乙酰肌肽、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、己酰肉碱、吲哚-3-乳酸(购自美国Santa Cruz)、L-鸟氨酸、L-谷氨酰胺、L-瓜氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、甜菜碱、2-羟基乙磺酸盐、L-脯氨酸、L-缬氨酸、尿酸、L-蛋氨酸、柠檬酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸、2-羟基丁酸、L-犬氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、犬尿喹啉酸、吲哚酚硫酸盐、3-吲哚乙酸、皮质醇、癸酰肉碱、L-精氨酸(购自美国Sigma Aldrich)、假尿苷、琥珀酰肉碱、O-己二酰基肉碱(购自美国Supelco)、琥珀酰腺苷、γ-丁基甜菜碱、1,5-脱水-D-山梨糖醇、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸(购自加拿大Toronto Research Chemicals)、尿嘧啶、尿苷(购自日本Wako Pure Chemical Industries)、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱(购自中国ChemPartner)、D-葡萄糖(购自美国International laboratory)。
液相质谱流动相溶剂包括0.1％甲酸水(v/v)为溶剂A，0.1％甲酸乙腈(v/v)为溶剂B。甲酸购自美国Sigma Aldrich。
研究对象
该研究采集的样本包括测试集(discovery set)和验证集(validation set)两部分，采集和生化分析的时间都是分开独立的。
测试集人群样本为2016年10月至2017年10月于深圳市中医院就诊的110例2型糖尿病住院患者和20例体检科查体的健康人，年龄在40-70岁之间。在临床招募阶段，每例志愿者均接受招募者详细的临床检查和评估。研究患者的纳入标准：符合糖尿病诊断标准或糖尿病肾病诊断标准；既往有糖尿病、糖尿病肾病诊断史，并可以提供相关就诊病历资料；年龄40-70岁；自愿并签署知情同意书。研究的排除标准：包括急性肾衰；快速进展的白蛋白尿或者肾病综合征；难治性高血压；重症感染；其他系统性疾病；肾小管酸中毒；1型糖尿病；肝脏疾病患者或肝功能异常患者，ALT或AST高于正常值2倍以上；严重心脑血管疾病患者或高血压不能有效控制患者；恶性肿瘤患者；严重感染性疾病患者；严重电解质紊乱、严重酸中毒患者；精神及认知障碍患者；酒精及药物滥用史患者；月经、妊娠或哺乳期妇女；不能配合完成临床试验患者；研究人员认为不适合参与试验者。健康对照组纳入标准：年龄在40-70岁，性别不限；最近两个月未使用过抗生素、激素或益生菌治疗；最近1周未出现感冒、咳嗽、咳痰、发热、腹泻等症状；身体健康，未患有慢性胃炎、胃溃疡等消化道疾病(既往有消化道出血病史的患者不在排除之列)，未患有高血脂、糖尿病、甲状腺疾病等代谢性疾病；未患有关节炎疾病。血常规、尿常规、肝功能、肾功能、空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白、电解质、体液免疫等检查无明显异常。
糖尿病、糖尿病肾病诊断及疾病分期标准参考KDIGO 2012临床实践指南。所有的糖尿病病人根据估计的GFR和UACR判定的疾病严重程度进行分组。测试集中110例2型糖尿病伴随不同程度肾脏损害的患者根据CKD阶段的GFR数值分为4组，第1期组GFR≥90ml/min/1.73m2；第2期组GFR 60-89mL/min/1.73m2；第3期组GFR 30-59mL/min/1.73m2；第4期组GFR<30mL/min/1.73m2。并且第1期组中分设两个亚组，分别为第1a期组GFR>120mL/min/1.73m2，也称肾小球高滤过状态(glomerular hyperfiltration)和第1b期组GFR＝90-120mL/min/1.73m2。20例健康人群GFR＝90-120mL/min/1.73m2被设定为0期组或健康对照组。健康对照组与疾病组病人年龄、性别指标相匹配。
UACR(mg/g Cr)指尿蛋白浓度/尿肌酐浓度比值，持续增加的尿蛋白(至少三个月内2次以上检测呈阳性)提示肾脏损伤的存在。该研究依据KDIGO指南将纳入研究的参与者尿液中的白蛋白异常分为3个阶段：正常白蛋白尿(正常或轻度增加，UACR<30mg/g Cr)、微量白蛋白尿(中度增加，UACR 30-300mg/g Cr)、大量白蛋白尿(重度增加，UACR>300mg/gCr)。白蛋白尿类型分组情况见下表1。
表1参与者CKD分期及白蛋白尿异常分组情况
验证数据集(validation set)是一组独立的人群，在2017年10月至2018年4月于深圳市中医院招募，包括56名2型糖尿病门诊病人及10名健康人。在这批验证集人群中，我们还检测了他们的经体表面积矫正肾脏体积(BSV-肾体积)、肾动脉阻力指数，以及血清胱抑素C(cystatin C)。
样本采集
血清及尿液样本均于晨起空腹状态下进行，具体要求如下：
血清样本收集：(1)采血前一晚清淡饮食，禁服非必须药物，保证至少8小时未摄入热量。采血前保持平稳的状态，若有剧烈活动，应当稳定半小时后再采血；(2)早晨餐前使用统一的采血针、无菌消毒后，采血管取血，取血量为3mL。(3)采血后4℃静置15min待血清析出后4℃离心，离心转速3000rpm，时间15min；(4)离心结束后吸取上层血清，置0.5mL离心管分装，并置于-80℃冰箱内保存。
尿液样本收集：(1)留尿前一晚清淡饮食，禁服非必须药物，保证至少8小时未摄入热量；(2)早晨餐前使用统一尿杯留取中段尿液15mL；(3)将尿液倒入15mL离心管中，4℃离心，离心转速13000rpm，时间10min；(4)离心后吸取上清液，1.5mL离心管分装10份，每份250μL，并放置于-80℃冰箱内保存。
GFR计算公式的选择及筛选
该研究采用了临床上广泛使用的简易MDRD GFR计算公式计算GFR进而用于CKD阶段分组。MDRD GFR公式与目前已经发表的其他3种GFR计算公式，CKD-EPI肌酐公式、CKD-EPI胱抑素公式以及CKD-EPI肌酐-胱抑素C公式所计算的GFR数值进行了相关性分析比较(表2)。
表2GFR计算公式及本研究中MDRD GFR与其他方程计算所得GFR的相关关系情况
GFR单位:mL/min/体表面积1.73m2；血清肌酐单位:mg/dL；血清胱抑素C单位:mg/L
体表面积矫正的肾脏体积(BSA-肾体积)计算公式及肾动脉阻力指数计算公式
体表面积(body surface area,BSA,m2)＝体重0.425×身高0.725×71.84
肾脏体积(renal volume,mL)(超声检测)＝长×宽×厚×0.523
BSA-肾体积(BSA related-renal volume,mL/m2)＝肾脏体积/体表面积。
肾动脉阻力指数(renal resistive index,RRI)＝(收缩末期血流速-舒张末期血流速)/收缩末期血流速.
非靶向代谢组学检测分析
1.液相质谱样本制备
60μL血清加240μL冷冻甲醇[含內标:0.5ppm左旋色氨酸(吲哚-D5)、0.5ppm胆酸-2,2,4,4-D4、50ppm顺式-10-十九碳烯酸]；将混合物涡旋1min，-20℃保存过夜，保障充分去蛋白。混合物18700×g离心20min。采集250μL上清液，用氮气吹干成冻干粉，-80℃冻存备用。冻干粉用5％乙腈水重溶，涡旋30s后，18700×g离心20min。将上清液转移至玻璃进样瓶，以备液质联用设备(UPLC-Orbitrap-MS)检测。
从每个样品中取20μL混合制备QC样本，每6个样本注射1支QC以监测设备运行过程中的稳定性。
2.液相质谱数据采集
UPLC条件
3μL进样至Waters ACQUITY UPLC系统。UPLC分离使用Waters ACQUITY UPLC HSST3色谱柱(2.1mm x 100mm,1.8μm)配合HSS T3保护柱(2.1mm x 5mm,1.8μm,WatersCorporation,Milford,MA)。流动相包括溶剂A(0.1％甲酸水，v/v)，溶剂B(0.1％甲酸乙腈,v/v)，流速为0.3mL/min，液体梯度为0-1.5min,5％B；2min,35％B；4min,50％B；8min,55％B；11-14min,95％B。然后用3min平衡柱子再进样。柱温及进样室温度分别为40℃和4℃。样本的进样顺序是随机化的。
质谱条件
质谱检测采用Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱，配备加热电喷雾电离(H-ESI)源(Thermo Fisher,Waltham,MA,USA)。质谱参数设定如下:负离子和正离子模式的喷雾电压分别为2300V和3500V；离子转移管及喷雾器温度300℃。氮气作为护套气体和辅助气体流速分别为25L/min和10L/min。分析器采用数据依赖式采集模式，对质量数在质荷比(m/z)90-1000，采用全扫描探测(Orbitrap的分辨率为120000)，设定最大采集目标特征20000个，最大注射时间为100ms。
3.数据前处理及初始变量筛选
首先，删除任何组內缺失数据(missing value)多于40％样本的变量。剩余的缺失值以每组的中位数加上基于原始离子丰度(raw ion abundance)变化的随机误差(randomerror)插补。通过对QC样品进样次序进行平滑处理，使用三次样条插值法(cubic splineinterpolation)作基线校正，进行信号校正。然后，对已校正信号的QC样本中变异系数(coefficient of variation,CV％)>30％的代谢特征予以剔除。再对所有代谢特征与MDRDGFR和UACR进行Spearman秩相关分析，剔除与两者不相关的特征(p>0.05)。将代谢特征用log10转换，通过t检验及方差分析，提取组间差异显著的代谢特征进行代谢物鉴定。
4.代谢物鉴定
代谢物首先基于母离子和子离子碎片的质量数在Progenesis QI数据库2.3(Chemspider,Lipidmaps)、在线的数据库Human Metabolome Database(http://www.hmdb.ca/)、Metlin(http://metlin.scripps.edu)、MassBank(https://massbank.eu/MassBank/)以及文献资料中进行比对鉴定。后续再使用可采购的参照标准品进行检测比对确认(表5)。
5.使用验证集对测试集验证
测试集中筛选及成功被鉴定的代谢物在验证集中被重新经过测试集一样的检测，使用相同的筛选及鉴定方法，对验证集中与测试集变化趋势一致及同样具统计学意义的代谢物予以提取及进一步分析，不一致则不予保留。
6.数据分析方法
所有数据均表示为均数(标准差，SD)或中位数(四分位间距，IQR)，频次(n)。所有非正态分布的数据均采用log10转换。使用IBM SPSS Statistics version 25(Chicago,IL,USA)进行统计分析、单变量方差分析以及LSD post-hoc检验。p≤0.05被视为具有显著性差异。差异倍数基于中位数的比值计算，以减少离群值效应(outlier effect)。Spearman秩相关分析用于筛选可以更精准预测评估病情的代谢物指标。代谢物与空腹血糖、糖化血红蛋白、BSA-肾体积、肾动脉阻力指数，GFR、UACR、血清肌酐、胱抑素C、尿β2微球蛋白等指标的相关系数均使用Spearman秩相关分析进行计算。相关系数>0.4的代谢物被列出。
为了评估筛选出的代谢物在区分CKD疾病阶段的效能，通过随机森林模型计算预测的AUC。将数据集随机分层抽样分为训练集50％，测试集50％分别用于模型的构建及预测，为了避免模型过拟合，每轮抽样100次，计算100次AUC的均值±标准差、灵敏度的均值±标准差、特异度的均值±标准差。随机森林的模型采用Python实现(https://www.python.org/)。
二、结果
参与者的一般临床特征
测试集(表3)和验证集(表4)样本在临床基线特征方面具备较好的可比性。测试集及验证集的参与者共计194例，其中糖尿病合并肾脏损伤[164人，平均年龄55.3(7.1)]，健康人[30人，平均年龄49.9(6.3)]。疾病组患者的GFR较健康对照组显著降低，UACR、SBP、血清肌酐、胱抑素C以及尿β2微球蛋白随病情进展，不断增加，测试集中对所有参与者的肾脏大小进行超声检测，发现在第1a期患者的肾脏体积显著增大，并随着疾病进展肾脏体积呈逐步缩小(图1)。在第1a期中，患者的左肾[92(84-125)mL/m2]，右肾[96(88-108)mL/m2]，双肾体积和[189(177-220)mL/m2]。4期中，患者的左肾[55(41-72)mL/m2]，右肾[66(47-75)mL/m2]，双肾体积和[124(95-136)mL/m2]。并且在第4期，患者的肾动脉阻力指数显著增高[0.75(11)](图1)。
与CKD进展相关的代谢物筛选及鉴定
代谢特征提取方面，经过数据预处理[数据矫正及提取QC样品中CV≤30％的代谢特征]，我们在测试集中分别在正离子模式和负离子模式提取4316个峰和3164个峰；在验证集部分分别在正离子和负离子模式提取7249个峰和10279个峰。测试集和验证集的QC样品中的内标在正负模式下的系数变化(CV％)均低于5％，但仅以负模式检测到的C19:1n9c的测试集和验证集的CV％为分别为15.27％和11.37％。血清样品中质谱检测到的尿酸、肌酐和葡萄糖信号相对于其相应的临床测量浓度具有高的线性相关(R2＝0.80-0.99)。这些表明仪器的测量结果可重复且可靠，并且线性动态范围(linear dynamic range)大。通过鉴定代谢物(鉴定例可见于图2)，及计算代谢物随疾病进展变化倍数的差异以及与MDRD GFR相关系数的大小对代谢物进行排序(表8)。鉴定代谢物在多重比较以及测试集、验证集统计结果的一致性方面，进一步计算FDR值(false discovery rate，错误发生率<0.1)对p值进行校正。我们发现疾病状态较健康对照存在显著代谢差异，与CKD分期显著相关的差异代谢物有49个以及6个代谢物比值。其中38个代谢物经参照物标准品鉴定，11个通过数据库及文献资料推测鉴定(表5)。图8归纳以上代谢物指标筛选过程。
代谢物的组间差异情况
与健康对照組比较，疾病中后期代谢物较早期阶段的变化数量明显增多，变化幅度增大，4期有47个代谢物显著异常，3期(31个代谢物)，2期(15个代谢物)，1a期(9个代谢物)，1b期(6个代谢物)(表6)。随着CKD进展，异常血清代谢物水平均较前1期代谢物呈现明显增多(表7)，且浓度变化幅度增大。显著变化的代谢物主要分为6类：硫酸盐代谢物，氨基酸、有机酸、酰基肉碱、嘌呤衍生物、单糖及其衍生物以及激素类代谢物。诸多异常代谢物中，发现疾病组的1,5-脱水-D-山梨糖醇较健康对照组显著降低(差异倍数＝-26.5—-2.60)(表6)。其与临床指标中的空腹血糖、糖化血红蛋白高度相关(1-3期疾病阶段，其与糖化血红蛋白的相关系数Spearman R＝-0.95—-0.64；与空腹血糖的相关系数Spearman R＝-0.87—-0.42)，且与糖化血红蛋白的相关更显著(图3)。然而，糖化血红蛋白、空腹血糖与MDRD GFR之间的相关性不高(p>0.05)(表10)。
代谢物与MDRD GFR及UACR等临床指标的相关、回归分析
应用代谢物与MDRD GFR的相关及回归分析，筛选与肾脏功能显著相关的代谢物。发现4个代谢物琥珀酰腺苷(2.89min，[M-H]-＝m/z 382.1005)(图2)、假尿苷(0.93min，[M-H]-＝m/z 243.0622)、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸([M-H]-＝367.1497at 2.21min)和L,L-TMAP(1.06min，[M+H]+＝m/z 229.1546)，随肾功能恶化进展的变化显著(图4)。4个代谢物与MDRD GFR相关系数Spearman R在-0.95—-0.90之间(表8)，将代谢物峰面积log 10转化后计算代谢物与MDRD GFR的线性回归方程提示R2值在0.84-0.95之间(图5B)。将性别、年龄、收缩压以及UACR作为混杂因素控制后，计算4个代谢物与MDRD GFR的偏相关系数(partial correlation coefficient)发现R值在-0.95—-0.84之间(表9)。并且在疾病早期评估1-2期阶段，4个代谢物与MDRD GFR的相关系数Spearman R在-0.85—-0.71之间，偏相关系数R在-0.76—-0.53之间。
与其他临床指标的相关性分析表明(图5-6，表9)，4个代谢物与肾功能相关的UACR(Spearman R＝0.68-0.80)、尿β2微球蛋白(Spearman R＝0.67—0.79)、肾动脉阻力指数(Spearman R＝0.52to 0.56)呈正相关，与BSA-肾体积呈负相关(Spearman R＝-0.62—-0.60)。并且，其相关关系均较血清肌酐显著。其中琥珀酰腺苷与如上肾功能相关指标的相关关系均较胱抑素C显著(表9)。
基于随机森林算法(random forest classification)评估代谢物的预测效能
应用随机森林分类模型，依据4个代谢物中单个指标预测病人的肾功能分期情况，发现4个代谢物单指标预测不仅能筛选出中、末阶段的肾病患者，在早期阶段，单个指标的预测效能也十分理想。4个代谢物的单个指标模型可以从全病程2型糖尿病CKD人群中筛选出存在高灌注状态的病人以及正常GFR范围人群；以及从GFR>60的2型糖尿病人群中筛选出高灌注状态病人以及正常GFR范围人群。其预测能力均不差于肌酐指标(表11)。
筛选出7个联合指标预测模型可以显著提升预测的灵敏度和特异度，其预测效能显著优于单个肌酐指标模型(表12)。7个联合指标模型分别为模型l(质谱检测的肌酐+假尿苷)、模型2(质谱检测的肌酐+琥珀酰腺苷)、模型3(琥珀酰腺苷+假尿苷)、模型4(假尿苷+L,L-TMAP)、模型5(模型1+2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸)、模型6(模型1+琥珀酰腺苷)及模型7(模型1+L,L-TMAP)。在预测GFR>60的2型糖尿病人群中筛选出高灌注患者的结果提示模型1-7预测效能为AUC＝0.811-0.909，而单纯质谱检测肌酐模型的预测效能为AUC＝0.754-0.760。在GFR>60的2型糖尿病患者中，筛选出GFR正常范围的人群结果表明模型1-7预测效能为AUC＝0.776-0.986，较单纯质谱检测-肌酐的结果(AUC＝0.600-0.680)更优。
基于随机森林算法的ROC曲线分析表明，除了以上4个代谢物，额外增多3个代谢物，即共7个单一代谢物(琥珀酰腺苷、假尿苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、L,L-TMAP、L,L-TMAP异构体、4-乙酰氨基丁酸和磺基酪氨酸)评估预测糖尿病CKD患者是否存在UACR异常(UACR<30vs≥30mg/g Cr AUC＝0.667-0.837)的准确性都与单纯质谱检测-肌酐的结果(UACR<30vs≥30mg/g Cr，AUC＝0.677–0.774)相近。从UACR异常患者中预测是否存在较严重的微量白蛋白尿(UACR＝30-300vs>300mg/g Cr，AUC＝0.841–0.948)的ROC曲线分析表明，这7个单一代谢物(AUC＝0.893-0.957)都较质谱检测-肌酐(AUC＝0.820–0.880)更优(表14)。而且，预测是否存在大量白蛋白尿(UACR>300vs≤300mg/g Cr)的ROC曲线分析也表明，这7个单一代谢物(AUC＝0.893-0.957)都较质谱检测-肌酐(AUC＝0.857-0.889)更优(表14)。
磺基酪氨酸分别与质谱检测-肌酐、假尿苷、2-(α-D-2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、琥珀酰腺苷或4-乙酰氨基丁酸指标组合形成的4个双代谢物预测模型(表15)在区分正常白蛋白尿(UACR<30mg/g Cr)与微量白蛋白尿(UACR＝30-300mg/g Cr)患者之间的AUC有提升(测试集AUC＝0.668-0.706，验证集AUC＝0.559-0.619)，较单纯质谱检测-肌酐的结果(测试集AUC＝0.665，验证集AUC＝0.444)要高。磺基酪氨酸分别与L,L-TMAP(测试集AUC＝0.653，验证集AUC＝0.597)或4-乙酰氨基丁酸组合(测试集AUC＝0.660，验证集AUC＝0.606)的两个双代谢物预测模型的准确性都与单纯质谱检测-肌酐的结果相若。
本研究筛选出的4个代谢物—琥珀酰腺苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、假尿苷和L,L-TMAP，在男和女之间的血清水平无统计学差异(Mann-Whitney U,p>0.07)(图5A)，在预测GFR的多元线性回归模型中，在多元线性回归中，加入性别作为协变量，其p>0.1，表明性别不影响对琥珀酰腺苷、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、假尿苷与MDRD GFR的相关关系和推算。至于L,L-TMAP与MDRD GFR的线性回归模型中性别影响力(β＝0.0627，p＝0.0009)明显较log[质谱检测的肌酐]的模型要低(β＝0.1584，p＝9.76E-18)(表13)。这4个代谢物的低性別差异性特点有显著优势。因目前使用的肌酐和胱抑素C存在明显的性别差异，导致在计算GFR时均要考虑性别因素。在这4个代谢物与GFR的线性回归模型中，4个代谢物的线性斜率分别为-1.155—-0.9136之间，而血清肌酐的斜率为-0.8663(图5B)，表示它们随GFR变化的差异更明显，提示4个代谢物在预测GFR时均较肌酐指标敏感。
逐步多元线性回归分析选定最少变量的组合模型((log[质谱检测-肌酐]、log[假尿苷]、log[L,L-TMAP]加上性别)分析测试集预测log[MDRD GFR]的最佳回归方程:预测predicted log[MDRD GFR]＝-0.6083log[质谱检测-肌酐]-0.4803log[假尿苷]-0.1403log[L,L-TMAP]+0.0934性别(女＝1；男＝2)+1.4315(图7，模型L10)。其调整后R2＝0.978，均方根误差(RMSE)＝0.055，基于该方程预测验证集的log[MDRD GFR]，R2＝0.988；经unlog转换后的预测验证集MDRD GFR，R2＝0.964(图7，模型L10)。
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表6CKD不同分期代谢物较健康对照组变化情况
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P值<0.05提示经log10转换代谢物进行Student’s t-test具有显著差异。
表7CKD不同分期较前一期代谢物的变化差异情况
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表8测试集、验证集CKD不同分期代谢物与MDRD GFR相关系数(R>0.40).
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表9临床生化血清肌酐、胱抑素C、质谱检测-肌酐、4种标志物与MDRD GFR及其他肾损伤指标相关情况
/>
表10log10[1,5-脱水-D-山梨糖醇]与糖化血红蛋白、空腹血糖以及MDRD GFR在每个CKD期數的相关性。
ns,无统计学意义(p>0.05)；其他具统计学意义(p≤0.05)。
/>
/>
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表13单变量和多元线性回归分析测试集中log[代谢物]与log[MDRD GFR]的线性关系和预测能力
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性别，女性＝1男性＝2.测试集，n＝106；验证集，n＝56.
*基于测试集建立模型方程式，使用测试集数据计算预测log[MDRD GFR]vs实际log[MDRD GFR]的R2。
基于测试集建立模型方程式，使用验证集数据计算预测log[MDRD GFR]vs实际log[MDRD GFR]的R2。
逐步方法，为选择最少变量的组合以达到最高拟合度。/>
表15双代谢物模型以随机森林模型预测糖尿病UACR不同阶段ROC曲线结果
所有数据集均随机抽样100次后，计算AUC、灵敏度、特异度的均值±标准差。
以上所述仅为本公开的优选实施方式而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
工业实用性
本公开一种或多种实施方式所述的标志物，其测定试剂以及基于其的诊断方法在诊断肾病，特别地慢性肾病，特别地糖尿病肾病，特别地早期糖尿病肾病方面具有高的准确性和灵敏度。本公开一种或多种实施方式所述的标志物可以用于估算GFR和UACR。本公开一种或多种实施方式所述的标志物在雄性和雌性受试者之间具备一致性。

Claims (20)

1.测定标志物的水平的试剂用于制备诊断受试者的糖尿病肾脏疾病的诊断剂或试剂盒中的用途，
其中，所述标志物包括琥珀酰腺苷、假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱和2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述标志物还包括选自由4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5-脱水-D-山梨糖醇组成的组中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述测定标志物的水平的试剂包括对照、标准品和/或检测试剂。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中，使用所述诊断受试者的肾病的诊断剂来诊断肾病的方法包括：
- 使用所述诊断受试者的肾病的诊断剂测定来自所述受试者的样品中的标志物的水平，以及
- 分析来自所述受试者的样品中的标志物的水平，以诊断所述受试者的肾病。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述分析来自所述受试者的样品中的标志物的水平包括：
将来自所述受试者的样品中的标志物的水平与所述标志物的对应的参考水平进行比较；或者
由来自所述受试者的样品中的标志物的水平来估算GFR和/或尿UACR。
6.根据权利要求5所述的用途，所述参考水平适用于所有性别的受试者。
7.根据权利要求5所述的用途，其中所述参考水平为健康或非肾病受试者的样品中所述标志物的水平。
8.根据权利要求7所述的用途，其中来自所述受试者的样品中的标志物的水平与所述标志物的对应的参考水平进行比较包括将来自所述受试者的样品中的标志物的水平中的每一个与对应的参考水平进行比较。
9.根据权利要求5所述的用途，其中，所述分析来自所述受试者的样品中的标志物的水平包括：
通过数学模型计算出来自所述受试者的样品中的标志物的综合评分，将所述综合评分与所述标志物的参考评分进行比较。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述参考评分适用于所有性别的受试者。
11.根据权利要求1所述的用途，
所述标志物由琥珀酰腺苷、假尿苷、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱和2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸组成；或
所述标志物由4-乙酰氨基丁酸、琥珀酰腺苷、假尿苷 、2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱和磺基酪氨酸组成。
12.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述标志物还包括由以下组成的组中的至少一种：
2-[3-(磺氧基)苯基]乙酸、对甲酚葡萄糖醛酸苷、高香草酸硫酸盐、O-己二酰基肉碱、阿拉伯糖异构体、L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸、犬尿喹啉酸、N-乙酰肌肽、2-羟基乙磺酸盐、α-N-苯基乙酰基-L-谷氨酰胺、5-甲硫基-D-核糖、吲哚酚硫酸盐、羟基丁酰肉碱、对甲酚硫酸盐、苯酚硫酸盐、邻苯二酚硫酸盐、N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱异构体、肌酐、尿素、马尿酸、琥珀酰肉碱、丁酰肉碱、吲哚-3-乳酸、2-辛烯酰肉碱、L-瓜氨酸、L-犬尿氨酸、戊酰肉碱、3-吲哚乙酸、L-谷氨酸、胆碱、9-癸烯酰肉碱、柠檬酸、L-苯丙氨酸、尿酸、皮质醇、L-谷氨酰胺、甜菜碱、L-酪氨酸、L-肉碱、L-色氨酸、胆红素、3-羟基癸酰基肉碱、γ-丁基甜菜碱、犬尿喹啉酸与犬尿氨酸的比值、犬尿氨酸与色氨酸的比值、假尿苷与尿苷的比值、L-瓜氨酸与精氨酸的比值、谷氨酸与谷氨酰胺的比值、和酪氨酸与苯丙氨酸的比值。
13.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述诊断受试者的肾病包括判断所述肾病的严重程度或肾病的阶段。
14.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述肾病为早期肾病。
15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述肾病为早期肾小球高灌注状态。
16.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述肾病为早期糖尿病肾脏疾病。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述肾病为伴随早期肾小球高灌注状态的早期糖尿病肾脏疾病。
18.根据权利要求17所述的用途，其中，所述肾病为GFR大于60的早期糖尿病肾脏疾病。
19.一种诊断糖尿病肾脏疾病的试剂盒，包括检测标志物水平的试剂，所述标志物由以下组成：
琥珀酰腺苷；
假尿苷；
N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱；和
2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸。
20.一种诊断糖尿病肾脏疾病的试剂盒，包括检测标志物水平的试剂，所述标志物由以下组成：
琥珀酰腺苷；
假尿苷；
N,N,N-三甲基-L-丙氨酰-L-脯氨酸甜菜碱；
2-(α-D-吡喃甘露糖基)-L-色氨酸；和
选自由4-乙酰氨基丁酸、磺基酪氨酸和1,5-脱水-D-山梨糖醇组成的组中的至少一种。
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