CN115491415B - 一种与hua合并慢性肾病相关的生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种与HUA合并慢性肾病相关的生物标志物及其应用，属于医学检测诊断技术领域。该生物标志物包括基因标志物：ALB基因、MYC基因、IL10基因、PLG基因、REN基因和FGA基因中的至少一种。上述生物标志物，可用于HUA合并慢性肾病的早期诊断中，对早期发现HUA引发的肾脏损害具有重大意义。

Description

一种与HUA合并慢性肾病相关的生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及医学检测诊断技术领域，特别是涉及一种与HUA合并慢性肾病相关的生物标志物及其应用。

背景技术

尿酸是嘌呤在肝脏内进行一系列代谢后的终产物，一般是由细胞代谢分解的核酸、嘌呤类化合物及食物中的嘌呤产生，最后经肾脏排出体外。尿酸在肾脏的排泄过程十分复杂，尿酸经肾小球滤过后，在近端肾小管发生一系列复杂的重吸收及再分泌的过程，机制至今并未完全清楚。尿酸曾被认为是一种没有任何生理价值的嘌呤代谢终产物，过高浓度的尿酸在肾脏及关节处沉积，可导致肾结石和痛风的发生，也可引起高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病。但随着现有观念的更新，有研究表明，尿酸是主要的内源性水溶性抗氧化剂之一，抗氧化作用类似维生素C，当机体尿酸水平增高时，可能是机体试图通过增加内源性抗氧化剂来清除自由基毒性作用，启动保护DNA及抗脂质过氧化等作用。

高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是指人体内嘌呤代谢异常而引起血尿酸升高的一种代谢综合征。国际上将HUA的诊断标准定义为血尿酸水平男＞420μmol/L(7mg/dl)，女＞357μmol/L(6mg/dl)。慢性肾脏病中合并无症状HUA的发生率逐年升高，高尿酸血症可继发于肾脏疾病，并可进一步加重肾脏疾病的发展，随着血尿酸水平的增高，慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)的患病率显著增加，生存率显著下降，HUA是急慢性肾功能衰竭发生及不良预后的强有力预测因素。目前肾脏功能评价主要包括尿液检查、血液检查、影像学检查和肾脏病理学检查等，HUA患者合并CKD，何时启动治疗十分重要，且存在争议。但HUA通常起病隐匿，我国存在着大量合并多种心血管危险因素或缺血性心脏病的无痛风症状HUA患者，临床医生对无症状HUA如何处理观点不一致，无症状HUA是否有治疗的必要性，治疗标准如何确定，是目前有待解决的问题。HUA患病率正在逐年升高，早期发现及有效防治HUA引发的肾脏损害对于改善患病人群后期生存质量具有重大意义。

近年来，有越来越多的学者利用拉曼光谱(Raman spectroscopy，RS)技术区分健康受试者和不同阶段CKD患者的生物标记物。拉曼光谱技术具有非侵入性及微量精细分辨能力、所需样本量小、不需要化学试剂、高度自动化和相对低的成本提供实时分子信息和高分辨率成像，在HUA合并CKD早期临床诊断方面表现出巨大潜力。尤其是尿液光谱的标记峰位反映了尿液主要成分(例如尿素、肌酐、肌酸、酮体等)的变化，对于快速评估HUA合并CKD患者肾脏功能具有良好的潜力。但是针对无症状HUA且合并CKD患者的尿液成分分析目前仍是空白。

同时，目前也并无CKD发生发展过程中的关键基因或用于判断HUA合并CKD的研究公开。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种与HUA合并慢性肾病相关的生物标志物，可用于HUA合并慢性肾病的早期诊断中，对早期发现HUA引发的肾脏损害具有重大意义。

一种与HUA合并慢性肾病相关的生物标志物，包括基因标志物，所述基因标志物包括：ALB基因、MYC基因、IL10基因、PLG基因、REN基因和FGA基因中的至少一种。

本发明人在前期工作经验基础上考虑到，对于无症状HUA患者，推测合并CKD的原因可能存在特殊的能量供应和信号传导特征，假设HUA患者疾病初期有依赖尿酸抗氧化作用维持身体内环境的作用，随着病程的进展，HUA患者艰难维持所处内环境稳定状态。

在上述理论指引下，发明人利用非弹性光散射过程的拉曼光谱技术捕获HUA患者尿液中的生物分子“指纹”，反映体内微环境中，尿素、肌酐、尿酸、蛋白质，氨基酸、酮体等物质表达变化。然后结合基因芯片数据技术，从GEO(Gene Expression Omnibus)数据库下载并整理有关CKD的生物信息分析微阵列数据，找到在CKD发生发展过程中的关键基因。把利用拉曼光谱技术得到的相关的生物学峰位结果，和关键基因提示的生物学作用靶点相结合，找到了ALB基因、MYC基因、IL10基因、PLG基因、REN基因和FGA基因与HUA合并慢性肾病相关，为探寻合并HUA的CKD患者尿液环境中信息分析打开思路，对阐明HUA导致CKD病理机理研究及早期诊断具有重要的意义。

在其中一个实施例中，所述基因标志物包括：ALB基因、MYC基因、IL10基因、PLG基因、REN基因和FGA基因。

在其中一个实施例中，所述基因标志物中，以ALB基因、IL10基因、PLG基因、REN基因表达下调提示与HUA合并慢性肾病相关，以MYC基因、FGA基因表达上调提示与HUA合并慢性肾病相关。

在其中一个实施例中，该生物标志物还包括生化标志物，所述生化标志物包括具有以下拉曼光谱峰位特征的指标成分：1643cm^-1。

在其中一个实施例中，所述生化标志物还包括具有以下拉曼光谱峰位特征的指标成分：640cm^-1、642cm^-1、828cm^-1、1556cm^-1、1706cm^-1。

在其中一个实施例中，所述生化标志物还包括具有以下拉曼光谱峰位特征的指标成分：1585cm^-1、1587cm^-1、1596cm^-1、1603cm^-1、1608cm^-1、1615cm^-1。

本发明还公开了上述的生物标志物的试剂在制备用于诊断HUA合并慢性肾病的试剂中的应用。

本发明还公开了一种用于诊断HUA合并慢性肾病的试剂组合，包括用于检测上述的基因标志物表达量的试剂。

在其中一个实施例中，该试剂组合还包括用于检测上述的生化标志物含量的试剂。

在其中一个实施例中，所述拉曼光谱的检测条件为：设备为共聚焦拉曼光谱仪，激发光波长为785nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种与HUA合并慢性肾病相关的生物标志物，是利用拉曼光谱技术分析尿液标本，同时基于生物信息学筛选CKD关键差异表达基因，初步分析关键表达基因的生物学功能及其调控通路，与HUA尿液成分异质性的关系后得到，为探寻合并HUA的CKD患者尿液环境中信息分析打开思路，对阐明HUA导致CKD病理机理研究及早期诊断具有重要的意义。

附图说明

图1为合并HUA的不同CKD分期和对照组的平均光谱数据图形；

图2为合并HUA的不同CKD分期和对照组的平均尿液拉曼光谱和标准偏差图形；

图3为合并HUA的不同CKD分期和对照组的多参数(排列、聚类和ROC图形)分析图形；

图4-7为合并HUA的不同CKD分期和对照组的多参数(Hotelling’s T2椭圆得分图、载荷图和V+S图)分析图形；

图8为筛选的有统计学意义的拉曼光谱峰位图；

图9为筛选的有统计学意义的肾功能临床评价指标琴图；

图10为合并高尿酸血症的不同CKD分期和对照组临床数据比较的琴图；

图11为对照组和HUA合并CKD亚组之间差异基因的生物过程、细胞成分、分子功能、KEGG途径富集分析的前5位数据；

图12为绘制得到的基因功能和调节信号通路图；

图13为对照组和HUA合并CKD亚组之间富集分析的气泡图；

图14为前十名基因表达值。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

以下实施例所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。

实施例

一、研究基本情况

1.研究对象

本研究招募2021年9月28至2021年10月12日在天津医科大学总医院保健医疗部(老年病科)查体中心体检人群为研究对象，依据当日查体血清尿酸检测结果，随机选取血清化验尿酸水平正常样本10例设为对照组，选取符合无症状高尿酸血症诊断样本31例设为试验组。其中男35例，女6例，年龄最小35岁，最大97岁。

对照组血清尿酸水平133-415umol/L，试验组血清尿酸水平424-595umol/L。

试验组依据CKD-EPI两级种族方程(CKD-EPI two-level race equation)计算适合中国人群的改良eGFR(KONG X,MA Y,CHEN J,et al.Evaluation of the ChronicKidney Disease Epidemiology Collaboration equation for estimating glomerularfiltration rate in the Chinese population[J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(3):641-51)。根据肾脏疾病结果质量倡议(Kidney Disease Outcome QualityInitiatives，K/DOQI)临床实践指南进行诊断和分期，将eGFR大于等于90(mL/min/1.73m2)定义为CKD1期，共15例；将eGFR介于60-89(mL/min/1.73m2)之间定义为CKD2期，共10例；将eGFR小于60(mL/min/1.73m2)定义为CKD3期，共6例。

本研究经天津医科大学总医院伦理委员会批准，排除对象为正在服用影响尿酸代谢药物(如阿司匹林等)、既往有原发性肾脏疾病病史(如肾小球肾炎等)、合并急性肾损伤、接受任何肾脏替代治疗、尿路结石、痛风关节炎、严重水肿、胸腔积液或腹水、酮症酸中毒的患者。

2.一般临床资料采集

所有受检对象测身高、体重，空腹10h后留取血清，采用全自动生化分析仪测定外周血临床和生化指标，同时留取新鲜尿液标本测定相关指标。

其中尿液指标包括：尿微量白蛋白肌酐比值(Urinary microalbumin creatinineratio，ACR)、尿肌酐(urine creatinine，uCr)、尿微量白蛋白(Urine microalbumin，M-ALB)、尿酸碱度(PH)、尿比重(urine specific gravity，SG)。肾功能相关指标包括：尿酸(uric acid，URIC)，尿素(urea，UREA)、肌酐(creatinine，CREA)。其他生化指标包括总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLO)、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)、直接胆红素(directbilirubin，DBIL)、葡萄糖(glucose，GLU)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白(low-density lipoproteincholesterol，LDL-C)、甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)。血常规指标包括红细胞(red blood cell，RBC)、血红蛋白(Hemoglobin，HGB)、红细胞比容(hematocrit，HCT)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume，MCV)、平均红细胞血红蛋白浓度(mean red blood cell hemoglobin concentration，MCHC)、平均红细胞血红蛋白含量(mean red blood cell hemoglobin content，MCH)、红细胞体积分布宽-CV(red blood cell-CV，RBC-CV)、红细胞体积分布宽-SD(red blood cell-SD，RBC-SD)、白细胞(white blood cell，WBC)、中性淋巴细胞百分比(neutrophil granulocyte，NEU％)、中性粒细胞绝对值(neutrophil absolute value，NEU#)、淋巴细胞百分比(lymphocyte percentage，LYMPH％)、淋巴细胞绝对值(lymphocyte absolute value，LYM#)、单核细胞百分比(monocytes percentage，MON％)、单核细胞绝对值(monocytesabsolute value，MON#)、嗜酸性粒细胞百分比(eosinophilic granulocyte percentage，EOS％)、嗜酸性粒细胞绝对值(eosinophilic granulocyte absolute value，EOS#)、嗜碱性粒细胞百分比(basophils percentage，BAS％)、嗜碱性粒细胞绝对值(basophilsabsolute value，BAS#)、血小板计数(platelet，PLT)、血小板体积分布宽度(plateletdistribution width，PDW)、血小板平均体积(mean platelet volume，fl)、血小板压积(platelet crit，PCT)、大血小板比例(platelet-large cell ratio，P-LCR)。

二、拉曼光谱分析

1.拉曼光谱技术检测尿液中尿素、肌酐、尿酸、蛋白质/氨基酸、酮体等物质表达。

1.1方法

将招募人群的尿液样本统一收集后，冷冻于-18摄氏度冰箱保存，根据血尿酸水平，选取研究对象统一进行拉曼光谱分析。方法如下：将冷冻尿液标本常温解冻后，留取5μL尿液滴在石英玻片上，选用共聚焦拉曼光谱仪XploRA Raman microscope测定量。选取785nm激光作为激发光，输出功率为40mW，物镜选取40倍，标本固定在XYZ三维平台上。拍摄过程使用×40 0.75NA尼康镜头，样品上约2×2μm的光斑大小范围接收输出功率为40mW的激光束照射，单次积分时间为250s，积分次数为一次，测量范围600-1800cm^-1，每组测量5-10个位点，分辨率为1cm^-1。同时测定石英玻片拉曼光谱作为本底。应用Labspec6软件进行平滑、去背景和基线校正等数据处理，全部光谱以各自的1650cm^-1拉曼峰为内标完成了强度归一化。

1.2结果

本研究共拍摄尿液拉曼光谱数据258份(每例样本重复拍摄拉曼光谱数据为6-7份)，其中对照组数据65份，合并HUA的1期CKD数据93份，合并HUA的2期CKD数据62份，合并HUA的3期CKD数据38份。

结果如图1所示，其中，图1A-1B分别显示了在600-1800cm^-1的范围内对照组和CKD组、对照组和CKD亚组的尿液拉曼光谱，相关尿液拉曼光谱的峰位归属见表下表。

表1筛选的有统计学意义的潜在生物标志物峰位(cm^-1)的结果

注：符合正态分布数据采用均值±标准差表示，不符合正态分布数据采用M(Q1-Q3)表示。

表2筛选的有统计学意义的潜在生物标志物峰位的结果

图1A给出了对照组和CKD三组样品的拉曼光谱图。图中虚竖线分别表示与尿酸(640cm^-1)，蛋白质、氨基酸(642、1556、1585、1587、1596、1603、1615cm^-1)，酮体类(828、1643cm^-1)和尿素、肌酐(1608、1706cm^-1)相关的峰位。图1A由下而上分别为对照组和CKD亚组的平均尿液光谱图，图中的虚线代表尿酸(640cm^-1)峰位、蛋白质/氨基酸(642、1556、1585、1587、1596、1603和1615cm^-1)峰位、酮体(828和1643cm^-1)峰位、尿素/肌酐(1608和1706cm^-1)峰位。

图1B给出了对照组，合并HUA的1期CKD，合并HUA的2期CKD，和合并HUA的3期CKD的拉曼光谱图，从下往上依次为对照组、合并HUA的1期CKD组、合并HUA的2期CKD组和合并HUA的3期CKD组平均尿液光谱图，光谱图形呈现出相似的形态。

图2显示了CKD多样本平均光谱的标准偏差，其中，图2A为对照组的平均尿液拉曼光谱和标准偏差图形；图2B为HUA合并CKD组的平均尿液拉曼光谱标准偏差图形；图2C为合并HUA的1期CKD组的平均尿液拉曼光谱和标准偏差图形；图2D为合并HUA的2期CKD组的平均尿液拉曼光谱和标准偏差图形；图2E合并HUA的3期CKD组的平均尿液拉曼光谱和标准偏差图形。结果表明，该分析方法的标准偏差较低，能够反映样本的实际情况。

然而，依据图1光谱图形和峰位难以鉴别CKD患者组和对照组的尿液物质的差异，需要结合统计学分析和OPLS-DA方法建立的分类模型，进一步筛选出能有效鉴别对照组和CKD亚组的峰位作为潜在的生物标志物。

2.基于拉曼光谱数据分析的OPLS-DA多变量统计方法建立识别模型

2.1方法

采用SIMCA14.1软件对高尿酸合并CKD不同分期患者和对照组的尿液拉曼光谱数据进行有监督的正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least-squaresdiscrimination analysis，OPLS-DA)。使用拟合优度参数R2和Q2分别对OPLS模型的性能进行评价。在零假设条件下，通过y矩阵的随机变化对模型进行200次重采样，进行模型验证。为寻找分类模型中的统计学上具有显著差异的拉曼峰位作为潜在生物学标志物，使用了聚类分析和V+S分析。在综合考虑相关系数、载荷、在V+S图中与中心的距离等参数的基础上，使用Origin软件进行相关数据处理，Variable Importance(VIP)>1.0的峰位被认为该变量对模型有较大影响。

为了验证在OPLS-DA多维度的计算中找到的差异峰位，是否在单维度的统计上具有显著性差异，将OPLS-DA模型得到的VIP值>1.0的峰位，使用IBM SPSS Statistics 26统计软件包处理数据。符合正态分布数据采用均值±标准差表示,组间均数比较用单因素方差分析，方差齐组间两两比较用LSD法，方差不齐组间两两比较用Tamhane’s T2法。不符合正态分布数据采用M(Q1-Q3)表示，组间比较使用Kruskal-Wallis检验，P<0.05有统计学意义。临床资料验证中，频数资料组间比较采用卡方检验，均使用Graphpad Prism 9绘制统计相关图形。

2.2结果

从非高尿酸血症的对照组、合并HUA的1期CKD、合并HUA的2期CKD和合并HUA的3期CKD四种尿液拉曼光谱结果中随机抽取24张特征光谱(每类6张)，构成四组数据资料，分别对样本数据应用有监督的OPLS-DA展开详细分析比照。

序列(Permutation)分析结果如图3所示，其中，3A为OPLS判别的对照组与合并HUA的CKD亚组的排列、聚类和ROC图形；3B为OPLS判别的对照组与合并HUA的1期CKD组的排列、聚类和ROC图形；3C为OPLS判别的对照组与合并HUA的2期CKD组的排列、聚类和ROC图形；3D为OPLS判别的对照组与合并HUA的3期CKD组的排列、聚类和ROC图形。

结果显示，Q2在Y轴的截距为负值，表示OPLS-DA模型成立，且未过度拟合。OPLS-DA模型下聚类分析以91.7％的正确率将对照组(正确5张，不正确1张)与CKD亚组(合并HUA的1期CKD正确6张，不正确0张、合并HUA的2期CKD正确5张，不正确1张、合并HUA的3期3CKD正确6张，不正确0张)尿液样本拉曼光谱进行区分。ROC曲线提示判别分析结果准确性高。对照组与CKD亚组的两两组合模型结果显示，模型未过度拟合。OPLS-DA模型下聚类分析以100％的正确率将对照组与合并HUA的1期CKD、合并HUA的2期CKD和合并HUA的3期CKD尿液样本拉曼光谱分别进行区分。ROC曲线提示判别分析结果准确性高。

合并高尿酸血症的不同CKD分期和对照组的多参数分析图形如图4-7所示，其中，图4为对照组与三组不同分期CKD组构建OPLS-DA模型，绘制的95％置信区的Hotelling’sT2椭圆得分图(图4A)、载荷图(图4B)和V+S图(图4C)；对照组组中代表尿酸(640cm^-1)、蛋白质/氨基酸(642、828、1556、1585、1587、1603、1615cm^-1)、尿素/肌酐(1608、1706cm^-1)、酮体(828、1643cm^-1)的峰位强度高于CKD亚组。图5为对照组与1期CKD组构建OPLS-DA模型，绘制的95％置信区的Hotelling’s T2椭圆得分图(图5A)、载荷图(图5B)和V+S图(图5C)；合并HUA的1期CKD患者，尿酸(640cm-1)、尿素/肌酐(1608、1706cm^-1)、蛋白质/氨基酸(642、828、1556、1585、1587、1596、1603、1615cm^-1)和酮体(828、1643cm^-1)的峰位强度低于对照组。图6为对照组与2期CKD组构建OPLS-DA模型，绘制的95％置信区的Hotelling’s T2椭圆得分图(图6A)、载荷图(图6B)和V+S图(图6C)；合并HUA的2期CKD患者，尿酸(640cm^-1)、尿素/肌酐(1608、1706cm^-1)、蛋白质/氨基酸(642、828、1556、1585、1587、1596、1603、1615cm^-1)和酮体(828、1643cm^-1)的峰位强度低于对照组。图7为对照组与3期CKD组构建OPLS-DA模型，绘制的95％置信区的Hotelling’s T2椭圆得分图(图7A)、载荷图(图7B)和V+S图(图7C)；合并HUA的3期CKD患者，尿酸(640cm^-1)、尿素/肌酐(1608、1706cm^-1)、蛋白质/氨基酸(642、828、1556、1585、1587、1603、1615cm^-1)和酮体(828、1643cm^-1)的峰位强度低于对照组。合并HUA的3期CKD患者，蛋白质/氨基酸(1596cm^-1)的峰位强度高于对照组。

结果显示，在OPLS-DA得分图(图4A)提示四组样本分群明显，对照组、合并HUA的2期CKD组和合并HUA的3期CKD组位于X正半轴，合并HUA的1期CKD组位于X负半轴，对照组组位于Y轴的负半轴，合并HUA的2期CKD组和合并HUA的3期CKD组位于Y轴的正半轴，反映出对照组组与CKD亚组得到了区分。这一区分结果表明OPLS-DA可以很好地甄别对照组、合并HUA的1期CKD、合并HUA的2期CKD和合并HUA的3期CKD患者的尿液光谱数据，为分析四个群体的物质特征提供了条件。

OPLS-DA得分图(图5A、图6A和图7A)中，对照组散点位于X轴的负半轴，CKD亚组散点位于X轴的正半轴，样本分群明显，反映了该模型成功将样本判别分类。

OPLS-DA载荷图(图4B，5B，6B和7B)进一步筛选对对照组和CKD亚组鉴别模型有贡献的拉曼峰位。图中数字分别与蛋白质/氨基酸(642、1556、1585、1587、1596、1603和1615cm^-1)、尿素/肌酐(1608和1706cm^-1)、酮体(828和1643cm^-1)和尿酸(640cm^-1)有关，这些特征峰位在四组样本的鉴别中起到关键作用。

OPLS-DA V+S图(图4C，5C，6C和7C)为确定对照组和CKD亚组模型中的潜在生物标志物提供了主要依据。针对筛选出的模型判别拉曼峰位，进行显著性检验，VIP值>1.0的峰位被确定为有效鉴别对照组和CKD亚组的潜在生物标志物。代表酮体/蛋白质/氨基酸的828cm^-1峰位，和蛋白质/氨基酸(1556、1585、1587cm^-1)特征峰位，是对模型最具影响的、有生物学意义的峰位，在CKD样本的鉴别中起到重要作用，反映了非高尿酸血症人群尿液的酮体、某些蛋白质/氨基酸含量高于合并HUA的CKD亚组(图4-图7)。

如图8所示，经统计学分析提示，CKD亚组尿液中尿酸(640cm^-1)峰位强度均低于对照组(P＝0.009)；CKD亚组尿液中尿素、肌酐(1608、1706cm^-1)峰位强度均低于对照组(P＝0.004，P＝0.002，respectively)；CKD亚组尿液中蛋白质/氨基酸(642、1556、1585、1587、1603、1615cm^-1)峰位强度均低于对照组(P＝0.014，P＝0.001，P＝0.011，P＝0.009，P＝0.012，P＝0.010，P＝0.005，respectively)；1期和2期CKD患者尿液中腺嘌呤/丝氨酸(1596cm^-1)峰位强度低于对照组(P＝0.007and P＝0.008，respectively)；CKD亚组尿液中酮体(1643cm^-1)峰位强度均低于对照组(P＝0.000)。

2.合并HUA的不同CKD分期和对照组临床资料的统计结果

各组外周血有关肾功能指标比较，对照组血尿酸水平259.0±88.6umol/L(范围133-415)，合并HUA的1期CKD组血尿酸水平486.3±50.3umol/L(范围425-557)，合并HUA的2期CKD组血尿酸水平486.0±45.5umol/L(范围429-573)，合并HUA的3期CKD组血尿酸水平484.2±67.4umol/L(范围424-595)，不同程度CKD分期各组血尿酸水平明显高于对照组(P＝0.000)。

合并HUA的1期CKD患者的血尿素、尿微量白蛋白肌酐比值、尿微量白蛋白水平低于对照组(P＝0.005，和P＝0.008)、尿肌酐水平高于对照组(P＝0.010)，eGFR、血肌酐、和尿酸碱度水平差异无统计学意义(P>0.05)。合并HUA的2期CKD患者的血肌酐水平高于对照组(P＝0.013)，eGFR、尿素、尿微量白蛋白肌酐比值、尿肌酐、尿微量白蛋白和尿酸碱度水平差异无统计学意义(P>0.05)。合并HUA的3期CKD患者的eGFR、肌酐水平明显高于对照组(P＝0.003和P＝0.000)，尿酸碱度明显低于对照组(P＝0.002)，血尿素、尿微量白蛋白肌酐比值、尿肌酐、尿微量白蛋白差异无统计学意义(P>0.05)。

合并HUA的1期CKD患者的eGFR明显高于2期CKD(P＝0.000)，血尿酸、尿素、血肌酐、尿微量白蛋白肌酐比值、尿肌酐、尿微量白蛋白和尿酸碱度差异无统计学意义(P>0.05)。合并HUA的1期CKD患者的eGFR高于3期CKD(P＝0.000)，血尿素、血肌酐、尿微量白蛋白肌酐比值和尿微量白蛋白明显低于3期CKD(P＝0.002，P＝0.003，P＝0.004和P＝0.008)，血尿酸、尿肌酐和尿酸碱度差异无统计学意义(P>0.05)。合并HUA的2期CKD患者的eGFR高于3期CKD患者(P＝0.000)，血尿素、尿微量白蛋白低于3期CKD患者(P＝0.030和P＝0.046)，血肌酐、尿微量白蛋白肌酐比值、尿肌酐和尿酸碱度差异无统计学意义(P>0.05)。见图9A-9B和下表3，其中，图9A为合并HUA的不同CKD分期和对照组尿液肾功能评价指标(ACR、uCr、M-ALB、PH)比较的琴图；图9B为合并HUA的不同CKD分期和对照组外周血肾功能评价指标(URIC、eGFR、UREA、CREA)比较的琴图；琴图中实线为中位数，虚线为上下四分位数。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

表3合并高尿酸血症的不同CKD分期和对照组临床数据资料比较

注：符合正态分布数据采用均值±标准差表示，不符合正态分布数据采用M(Q1-Q3)表示

表4合并高尿酸血症的不同CKD分期和对照组临床数据资料组间两两比较

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注：BMI、尿比重、谷丙转氨酶、甘油三酯、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞血红蛋白含量、白细胞计数、嗜酸性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞绝对值数据不符合正态分布，经非参数检验的总体检验未检测出样本间存在显著差异，因此未执行多重比较。

其他临床资料比较，年龄、性别、总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、葡萄糖、总胆固醇、低密度脂蛋白、甲胎蛋白、癌胚抗原、红细胞计数、血红蛋白、红细胞比容、红细胞分布宽度变异系数、红细胞分布宽度标准差、中性粒细胞百分比、中性粒细胞绝对值、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、单核细胞绝对值、嗜酸性粒细胞绝对值的组间或组内多重比较差异有显著统计学意义(P<0.05)，见图10和表3-4，其中10A为合并HUA的不同CKD分期和对照组肝功能评价指标(TP、ALB、GLO、TBIL)比较的琴图；10B为合并HUA的不同CKD分期和对照组外周血相关糖脂代谢评价指标(GLU、LDL-C)和肿瘤标记物指标(AFP、CEA)比较的琴图；10C为合并HUA的不同CKD分期和对照组外周血常规指标(RBC、HGB、RBC-CV、RBC-SD、HCT、LYMPH％、MON％、NEU％)比较的琴图。琴图中实线为中位数，虚线为上下四分位数。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

临床资料中BMI、尿比重、谷丙转氨酶、直接胆红素、糖化血红蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度、平均红细胞血红蛋白含量、白细胞计数、淋巴细胞绝对值、嗜碱性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞绝对值、血小板计数、血小板体积分布宽度、血小板平均体积、血小板比积和大血小板比例，组间和组内多重比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3-4。

三、基因芯片筛选CKD发生发展过程中的关键表达基因

1.筛选分析方法

1.1数据来源：

数据来自于NCBI.GEO(Gene Expression Omnibus，GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库，数据系列号为GSE66494(物种：Homo sapiens，数据包含53个CKD患者的肾活检样本数据和8个健康对照的肾活检样本数据，均为表达谱数据，样本全部采用GPL6480.Agilent-014850Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F平台检测)。

1.2关键表达基因分析：

应用GEO数据库的在线分析工具GEO2R进行分析，GEO2R采用了R语言中GEOquery以及limma程序包，再以P<0.05，|logFC|>2为筛选条件，挑选CKD发生发展过程中的关键表达基因。

1.3关键表达基因的功能分析：

使用DAVID(the Database for Annotation，Visualization and IntegrationDiscovery)在线分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)对关键基因开展GO功能注释和KEGG信号通路富集分析。GO功能主要包括三个方面，分别是生物学过程(biologicalprocess，BP)，细胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。

1.4蛋白质互作网络与关键基因分析：

通过蛋白质相互作用数据库STRING11.0(https://sring-db.org/)探索差异基因间编码的蛋白质间的关系，并建立它们间蛋白质互作网络(protein protein interactionnetwork，PPI)。并将PPI结果在Cytoscape软件中打开编辑，利用网络拓扑性质指标Degree.Centrality来分析节点在网络中的得分，节点得分越高越有可能是关键节点。我们以PPI网络节点前10名的蛋白(degree.TOP10)所对应的基因为网络中有较高连接度的Hub基因。

2.CKD发生发展过程中关键表达基因的生信分析结果

2.1差异基因：

根据差异基因的筛选条件，在GSE66494芯片数据中共得到差异表达基因581个，其中显著上调的差异表达基因432个(表5)，显著下调的差异表达基因149个(表6)。

表5基因芯片GSE66494中确定上调的差异表达基因

表6基因芯片GSE66494中确定下调的差异表达基因

2.2使用DAVID进行常见DEG的基因本体论和途径富集分析：

差异表达基因显著富集了16个KEGG通路，显著富集到103个GO-BP，35个GO-CC，43个GO-MF结果。按照P值从小到大排列，取前五GO功能结果绘图，如图11所示。

结合TOP10基因的筛选，生物过程(BP)中主要过程为氧气运输和蛋白质水解；细胞成分(CC)主要存在于胞外间隙、胞外区域、胞外外泌体和血液微粒；分子功能(MF)主要涉及发挥细胞外基质结构成分和氧气结功能；在KEGG分析中，调控的信号主要为非洲锥虫病信号通路，肾素-血管紧张素系统信号通路，疟疾信号通路(如下表7-10所示)。

表7 CKD差异基因的生物过程富集分析前5位数据

2.3PPI网络和差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)鉴定关键候选基因：PPI网络中共有376个节点，2044个互作关系对。拓扑得分高，可视作网络关键节点，通过cytohubba插件确认Hub基因。

结果如图11-13所示。图11为对照组和HUA合并CKD亚组之间差异基因的生物过程、细胞成分、分子功能、KEGG途径富集分析的前5位数据；筛选PPI网络度值前10位的CKD差异基因，结合GO功能注释和KEGG通路分析发现，对CKD发生发展的关键差异基因可能是ALB、MYC、IL10、PLG、REN、FGA基因，绘制基因的功能和调节信号通路图如图12表示。图13为对照组和HUA合并CKD亚组之间富集分析的气泡图，气泡越大，在这一功能途径中富集的基因越多，气泡的颜色越接近PValue0颜色，表明意义越大。

结果显示，Hub基因分别为ALB、MYC、IL10、FOS、TOP2A、PLG、REN、FGA、CCNA2和BUB1，数据显示它们之间可能存在较强的相互作用。GO功能提示在前10名的基因中，MYC基因参与了氧气运输oxygen transport，PLG和REN基因参与了蛋白质水解proteolysis过程；ALB、IL10、PLG、REN、FGA基因主要存在于胞外间隙和胞外区域，ALB、PLG、FGA基因存在于胞外外泌体和血液微粒；FGA基因主要发挥细胞外基质结构成分功能，ALB基因主要发挥氧气结合功能；IL10基因参与非洲锥虫病信号和疟疾信号通路，REN基因参与了肾素-血管紧张素系统信号通路(详见图11-13，表7-11)。

表8 CKD差异基因的细胞成分富集分析前5位数据

表9 CKD差异基因的分子功能富集分析前5位数据

表10 CKD差异基因的KEGG途径富集分析前5位数据

表11 PPI网络度值前10位的CKD差异基因列表

前十名基因的强度值来源于数据库中53个CKD人群数据和8个正常人群数据，具体基因表达值见图14，上调基因是ALB、IL10、FOS、PLG、REN，下调基因是MYC、TOP2A、FGA、CCNA2、BUB1(见表5、6、11)。

结合生物过程、细胞成分、分子功能、KEGG途径富集分析的数据，筛选出对CKD发生发展的关键差异基因可能是ALB、MYC、IL10、PLG、REN、FGA基因，ALB、IL10、PLG、REN基因在CKD人群中的表达水平明显低于对照组，MYC和FGA基因在CKD人群中的表达水平明显高于对照组。

四、结论

高尿酸血症是由嘌呤代谢障碍引起的全身代谢性疾患，肾脏是排泄尿酸最主要的器官。人体每日产生尿酸的2/3由肾脏排泄，剩余的1/3由小肠排泄。随着CKD的进展，消化道排泄的尿酸大大增加以保持血尿酸水平的正常。另外，通过反馈抑制作用，尿酸的合成量也相应减少。

本研究发现，合并HUA的1期和2期CKD患者尿液中代表嘌呤的1596cm^-1峰位强度明显低于对照组(见图8、表1-2)。尿液拉曼光谱分析尿酸代表峰位640cm^-1，CKD各组均较对照组明显较少，但三组之间无明显差异。此结果提示，尿酸是人体嘌呤代谢的终产物，主要经尿液排出，HUA患者尿液中尿酸排除减少，与血尿酸水平升高有关。但是，HUA患者体内嘌呤代谢异常，可能出现在明显的肾功能损害之前，尿液中1596cm^-1峰位强度分析，也许能够为HUA患者何时启动药物治疗，提供参考。

CKD的病因在西方国家以继发性因素为主，糖尿病和高血压为两大首位因素。在中国仍以IgA肾病为主的原发性肾小球肾炎最为多见，其次为糖尿病肾病、高血压肾病、狼疮性肾炎、梗阻性肾病以及多囊肾等。本研究利用国际公认的eGFR标准，对合并HUA的患者进行分期，对照组血尿酸水平显著低于试验组，试验组不同CKD分期患者的血尿酸水平无明显差异；我们发现常规的临床肾功能评价指标(血尿素、血肌酐)、尿液临床数据(尿微量白蛋白肌酐比值、尿肌酐、尿微量白蛋白和尿酸碱度)，并不能够将CKD患者很好的区分。肾脏具有强大的储备代偿能力，CKD是一个缓慢而渐进的过程，虽然病因不同，随着年龄的增加，肾脏的解剖结构和生理代谢方面都发生了不同程度的退行性变化，老年患者GFR呈进行性下降的趋势。

本研究提示，非HUA患者尿液pH明显高于HUA组，代谢性酸中毒可伴随于CKD的整个过程，本研究中合并HUA的CKD3期患者尿液pH明显低于CKD的1、2期患者和对照组。尿酸在尿中的溶解度要比血中高很多。尿液pH值影响尿酸向尿酸盐的转化率，也影响尿酸盐在尿中的溶解度。尿液拉曼光谱检测中640cm^-1是代表尿酸的峰位，CKD合并HUA患者尿液中尿酸水平明显低于对照组，提示HUA患者存在尿酸排泄异常。

尿液拉曼光谱检测中1608cm^-1是代表尿素的峰位，尿液中CKD1期和CKD2期患者的尿素水平低于对照组，而CKD3期患者尿液中尿素水平与对照组比较无明显差异，这与各组间外周血液的尿素水平相一致。1706cm^-1是代表肌酐的峰位，尿液中CKD1、2和3期患者的尿液肌酐峰位水平均低于对照组，与尿肌酐水平相一致，与各组间外周血液的肌酐水平相反。

高尿酸血症患者常合并血脂异常，尤其是甘油三酯(triacylglycerol，TG)异常，甚至在健康人群中也发现血尿酸水平与甘油三酯和胆固醇水平呈正相关关系。高甘油三酯血症伴高尿酸血症者存在载脂蛋白E2等位基因，介导肾脏对尿酸分泌减少，而升高的脂蛋白酶可能导致血尿酸的清除减少，推测甘油三酯可能是高尿酸血症常见的代谢影响因子。高甘油三酯是细胞能量代谢受损的一个标志物。由于受损的细胞燃烧糖的能力变差，我们的身体就必须保持血液中的甘油三酯处于一个高水平状态，作为无法燃烧糖分的细胞的食物。本研究中对照组和CKD亚组间，外周血胆固醇、甘油三酯和糖化血红蛋白水平无明显差异(见表4-5)。但通过尿液拉曼光谱分析，我们发现合并HUA的1期CKD患者，尿液中β-羟基丁酸强度显著低于2期和3期CKD患者，差异存在明显统计学意义(P<0.01，见表2)。且合并HUA的1期CKD患者尿液中β-羟基丁酸强度也显著低于本研究对照组，差异存在显著统计学意义(P＝0.000，见表2)。β-羟基丁酸是酮体中主要成分，尿液代表峰位是1643cm^-1，生酮饮食产生的β-羟基丁酸不仅可以用作供能燃料，还可以产生细胞信号，此细胞信号可能有助于促进动物的抗氧化应激，这是延缓衰老的途径之一。酮体可竞争性抑制肾脏近曲小管分泌尿酸的功能，因此能量代谢途径异常，对尿酸水平可产生影响。我们猜测，在未出现明显肾功能损害的合并HUA的1期CKD患者人群，存在能量代谢异常，此时HUA患者体内的β-羟基丁酸含量较高，这个时期的HUA是机体自我保护的信号，但随着CKD的进展，体内微环境出现紊乱，HUA对机体的保护调节作用消失，反而加重肾脏的损害。

随着人类基因组学研究的进展，越来越多的转运子或调节尿酸转运子功能的蛋白被逐渐发现，肾脏受损时，即使不影响肾小球滤过功能，肾小管间质的损伤也可导致尿酸排泄分数的改变，最终影响血尿酸的水平。我们通过生信分析查找CKD发生发展的关键基因，对差异基因进行GO功能注释和KEGG通路分析发现，推论差异基因主要是ALB、MYC、IL10、PLG、REN、FGA基因。ALB(albumin，白蛋白)，是哺乳动物肝脏细胞合成的一种蛋白质，作为人体血浆中最主要的蛋白质，具有维持血浆渗透压稳定、参与物质运输等重要生理功能。ALB基因表达具有组织特异性，即白蛋白只能由肝细胞合成，而其他组织的ALB基因处于不表达状态。白蛋白可能是氧化应激的主要靶点，地塞米松的抗炎和肾脏保护作用，就是通过增加ALB基因转录起始位点两种增强子来实现的。IL-10(白细胞介素10)，是一种具有抗炎特性的细胞因子，IL-10的失调与多种肾脏疾病相关，IL-10减少会加重炎症活动，损害巨噬细胞代谢，使清除有缺陷的巨噬细胞及巨噬细胞吞噬能力下降。纤溶酶原(PLG)基因，编码纤溶酶原，是一种由肝脏分泌的酶原，其在与血块结合时由多种酶转化为纤溶酶。PLG在生长发育、炎症、身体损伤和癌变过程中的组织重塑中起着重要作用，其可以帮助降解细胞外基质及其他基质金属蛋白酶。REN肾素(renin，REN)基因主要的表达部位是肾脏的球旁细胞，构成肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，作为体内一种升压调节体系，其中血管紧张素II结合血管、肾上腺、心脏、中枢神经系统和其他组织中的血管紧张素II 1型受体(AGTR1)，在血管收缩、醛固酮分泌、炎症和钠潴留中发挥作用。REN基因突变可导致异常蛋白在细胞内积聚，导致肾素产生细胞凋亡。在CKD患者中，上述ALB、IL10、PLG、REN基因的表达较对照组明显减少，根据基因功能分析，我们推测CKD的发生发展可能与氧化应激、炎症因子、血栓形成、血管扩张和渗出有关。MYC是一种原癌基因，作为细胞增殖的关键调节器，MYC通过调控细胞增殖参与肾脏损伤修复过程。FGA基因纤维蛋白原由三条链组成，纤维蛋白作为血块的主要成分之一在止血中起着重要作用，FGA基因的突变与肾脏淀粉样变性有关。在CKD患者中，MYC和FGA基因的上调，是加重肾脏损害的原因之一，根据基因功能分析，我们推测CKD的发生发展可能与自我修复缺陷和淀粉样变性有关。

通过生信分析结果提示，CKD的进展与氧化应激、炎症反应和血栓形成密切相关，体内的嘌呤也参与了能量物质形成和信号传导，以及参与物质代谢的作用，因此会对肾脏疾病的进程起到关键作用。本研究首先利用OPLS-DA建立模型，通过多维度的计算找到的可能的差异峰位，后利用单维度的统计学进一步验证，发现代表谷胱甘肽/色氨酸的828cm^-1峰位，代表色氨酸的1556cm^-1峰位，代表碳碳烯键连接的1585cm^-1峰位、代表酪氨酸的1587cm^-1特征峰位在CKD样本的鉴别中起到重要作用。谷胱甘肽是人体内最重要的抗氧化剂，碳碳双键被氧化后发生双键断裂，色氨酸和酪氨酸是与身体能量代谢有关的生糖生酮氨基酸。尽管合并HUA的CKD亚型患者之间比较无明显统计学差异，但合并HUA的3期CKD患者尿液与抗氧化和能量代谢相关的峰位有增高趋势，提示3期CKD患者体内的可能存在能量转化不良和抗氧化能力减弱(见表1-3)。

综上所述，HUA患者可能存在能量代谢异常，应用拉曼光谱技术解读HUA患者尿液内环境的异质性，探讨β-羟基丁酸、嘌呤、谷胱甘肽、色氨酸和酪氨酸峰位强度，可为判定合并HUA的CKD患者肾功能损伤程度提供帮助，为寻找合理的尿酸干预时机提供参考。尿液标本的留取简便易行，利用拉曼光谱技术监测合并HUA的CKD患者尿液微环境的变化，可以为早期发现人体内环境变化提供帮助，干预内环境和能量代谢异常信号水平可能是延缓HUA患者肾脏损伤的潜在方式。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种生化标志物组合作为检测靶标在制备HUA合并慢性肾病诊断产品中的用途，其特征在于，所述生化标志物组合由具有以下拉曼光谱峰位特征的指标成分组成：1643cm^-1、640cm^-1、642cm^-1、828cm^-1、1556cm^-1、1706cm^-1、1585cm^-1、1587cm^-1、1596cm^-1、1603cm^-1、1608cm^-1、1615cm^-1，所述诊断通过拉曼光谱检测获得尿液样本中所述生化标志物组合的上述拉曼光谱峰位强度数据，进行OPLS-DA分析，以鉴别HUA合并慢性肾病组样本；

所述拉曼光谱检测的条件为：设备为共聚焦拉曼光谱仪，激发光波长为785nm。