CN109765214A - 基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,包括以下步骤:第一步,收集正常人和不孕不育患者血清并将其分组;第二步,将血清样本和银纳米粒子充分震荡混匀并孵育反应30min;第三步,对孵育反应后的样本进行拉曼光谱扫面并采集400‑1800cm‑1处的光谱数据;第四步,对采集的拉曼数据进行预处理和归一化处理;第五步,对光谱数据进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS‑DA)。本方法采用SERS结合正交偏最小二乘判别分析方法,采用银纳米粒子作为活性增强基底,对比分析了不孕不育患者和正常人的血清,为临床不孕不育患者的快速诊断提供一种简单高效的备选新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医学和光谱检测技术领域,具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法。
背景技术
拉曼效应(Ramanscattering)于1928年由印度物理学家拉曼(C.V.Raman)首次提出,系指光波被散射后频率会发生变化。与入射光频率不同的散射光谱,即拉曼光谱,其表征的是分子的振动、转动信息,可用于对样品的化学成分和分子结构进行无损分析,提供其“分子指纹”。表面增强拉曼光谱(SERS)衍生于拉曼光谱,极大提高了其检测灵敏度并克服了后者信号弱的缺点。因SERS具有如快速、简单、无创、准确且不受水的干扰等优势,近年来被广泛用于生物医学领域。
受环境、激素和相关疾病等因素的影响,不孕不育人群日益增多,患者面临生物学、心理学及社会学等一系列复杂问题,焦虑增加,健康受到严重影响,相关问题困扰全球约10%-15%的人群。造成不孕症的原因多样,如内分泌失调、输卵管疾病、慢性盆腔炎、子宫内膜异位症、多囊卵巢、生殖器发育异常等。目前,SERS这一新技术正尝试应用于女性生殖医学分析领域,如乳腺癌,卵巢癌,多囊卵巢综合征,子宫内膜异位症等。相关研究正日趋成为热点。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题,本发明提供一种基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,为临床不孕不育患者的快速诊断提供一种简单、高效的备选新方法,具体的技术方案如下:
一种基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,按照先后顺序包括以下步骤:
(1)收集正常人和不孕不育患者血清并将其分组;
(2)将血清样本和银纳米粒子充分震荡混匀并孵育;
(3)对孵育反应后的样本进行拉曼光谱扫描并采集光谱数据;
(4)对采集的拉曼数据进行预处理和归一化处理;
(5)对光谱数据进行正交偏最小二乘法判别分析。
优选的是,步骤(1)中,将不孕不育患者血清按临床卵巢功能的评价标准分为A高低雌二醇组,B高低AMH组,C高低AFC组以及D疾病组,疾病组包括子宫内膜异位症组和慢性盆腔炎组。
在上述任一方案中优选的是,步骤(2)中,血清样本和银纳米粒子的反应比例为1:1,孵育反应30min后用移液枪取混合样品2.5μl点样至贴有锡纸的载玻片上,待其自然风干后用拉曼光谱仪采集数据。
在上述任一方案中优选的是,步骤(3)中,实验选用必达泰克Pro便携式拉曼仪检测,其激发波长为785nm,激发功率为60mW(激发功率为20%),积分时间为10000ms,平均次数为3次,所有样本均在相同条件下测量,每个样品在不同位点测量5次,然后取平均谱,以此代表该样本的拉曼信号。
在上述任一方案中优选的是,步骤(3)中,选用拉曼光谱扫面并采集400-1800cm-1处的光谱数据。
在上述任一方案中优选的是,步骤(4)中,光谱预处理选用必达泰克Pro便携式拉曼仪自带的Bwspec4软件对所有拉曼谱图进行背景扣除和光谱平滑,归一化处理为面积归一化处理。
在上述任一方案中优选的是,步骤(5)中,光谱数据用SIMCA14.1进行正交偏最小二乘法判别分析,受试者工作特征曲线用来评估该方法的准确性,置换检验验证模型的可靠性。
本发明应用SERS结合正交偏最小二乘判别分析方法,采用银纳米粒子作为活性增强基底,对比分析了不孕不育患者和正常人的血清,实验表明,采用合适的光谱条件、光谱预处理方法,血清SERS结合OPLS-DA模型可有效区分不孕不育患者和正常人,可用于不孕不育患者的快速筛查,SERS谱峰峰位归属分析表明:高低雌二醇组、高低血清AMH组、高低AFC组以及疾病和正常组之间,两两均有统计学差异(P<0.05),血清SERS图谱作为不孕不育早期诊断的一种辅助手段,值得进一步研究和探讨其临床应用价值。
附图说明
图1:高雌二醇组(n=78)和低雌二醇组(n=86)归一化后血清平均SERS光谱图;
图2:高雌二醇组(n=78)和低雌二醇组(n=86)血清样本得分图;
图3:高雌二醇组(n=78)和低雌二醇组(n=86)血清SERS进行OPLS-DA后ROC曲线图;
图4:高雌二醇组(n=78)和低雌二醇组(n=86)血清SERS进行OPLS-DA后置换检验图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的方案进行清楚完整的描述,但本发明并不受其限制,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,不是全部的实施例,可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。基于本发明的实施例,本领域技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明的保护范围;同样地,实施例的附图仅仅是本发明一部分实施例的附图,本领域技术人员根据这些附图所获得的其他附图,也都属于本发明的保护范围。
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述。
实施例:
基于表面拉曼增强拉曼光谱(SERS)结合正交偏最小二乘判别分析方法检测高低不同雌二醇组血清的方法。具体步骤如下:
第一步,收集高低雌二醇组含高雌二醇78例,低雌二醇86例;
第二步,取10μl样品与10μl银纳米颗粒混合于新的0.2mlPCR管中,于涡旋器中充分震荡混匀,并让血清和胶体银孵育反应30min,后用移液枪取混合样品2.5μl点样至贴有锡纸的载玻片上,待其自然风干;
第三步,实验采用必达泰克Pro便携式拉曼仪检测,其激发波长为785nm,激发功率为60mW(激发功率为20%),积分时间为10000ms,收集的拉曼光谱范围为400-1800cm-1。平均次数为3次,以减少宇宙射线的影响。所有样本均在相同条件下测量,每个样品在不同位点测量5次,然后取平均谱,以此代表该样本的拉曼信号;
第四步,为了获得较好的实验结果,实验中所测得的所有表面增强拉曼信号均需要进行一定的预处理,从而降低噪声,提高信噪比,以消除激光功率波动,减少光谱强度差异带来的影响,本实验使用Bwspec4(B&WTek)软件对所有拉曼谱图进行背景扣除和光谱平滑,并进行面积归一化处理,用于下一步分析。
第五步,光谱数据用SIMCA14.1进行正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA);受试者工作特征曲线(ROC)用来评估该方法的准确性;置换检验验证模型的可靠性,IMBSPSS25对波谱数据进行t检验,验证是否具有统计学差异。
本实验采用的背景扣除方法是自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法,是一种逐步逼近的背景拟合算法,引入调节曲线平滑度和保真度的参数,从而得到减去背景的光谱,从而达到背景扣除的目的。该算法主要包括以下几个方面:
假设X是光谱分析信号,Z是拟合向量,长度均为m。Z和X的精确度可以用它们的误差平方差的和来表示,式子如下:
向量Z的粗糙度可用其相邻的两项平方差之和来表示,式子如下:
在保真度和粗糙度之间的平衡,可用保真度的项加上粗糙项惩罚后的项,如下式表示:
Q=F+λR=||x-z||2+λ||Dz||2
式中DZ数值为ΔZ;D——差分矩阵。
对上式求导并令其为零,得到一个比较容易求解的线性系统方程为:
(I+λD′D)z=x
上式为利用惩罚最小二乘处理光谱平滑的方法,同时设置峰段处的对应位置为零,总体方差整理为:
式中w——权重系数向量。
引入权重系数可以得到
(W+λD′D)z=Wx
式中W——wi在对角线上的对角矩阵。
解得为
z=(W+λD′D)-1Wx
airPLS算法对峰位置检测(背景扣除前)的问题进行了解决,加权惩罚最小二乘问题为:
每步迭代可通过上式来获得:
在整个airPLS算法当中是可以不断的执行迭代和重加权,进而可以自动逐渐地消除峰位置中的数据点,从而完成背景的拟合。最终,当完成上式所示的标准时,自适应重加权的整个过程就会完成,进而终止。
|dt|<0.001×|x|
本实验采用的光谱平滑的方法是Savitzky-Golay法,Savitzky-Golay光谱平滑算法的主要思想是对第i个量测定xi左侧和右侧的各m个数据测点,并且包括xi的N=2m+1个点利用多项式对其进行最小二乘拟合,同时利用此方法确定其多项式的相关系数,最后利用多项式公式计算第i个点的新数值。其中多项式为:
式中i——计算的数据点;
j——在i个点左右的相关数据点;
N——窗口(一般设置成3,5,…,25);
k——多项式的阶级数。
本文中窗口尺寸大小选取5作为其光谱平滑的数据点,这种平滑方法比较常用,不容易导致光谱失真和影响光谱的分辨率,可以很好地保持可用信息。其中,N=5,m=2,k=2,则有j=-2,-1,0,1,2,通过5个点的测量值可以得到5个对应的表达式为:
其中,a0,a1,a2为多项式系数。
上式化简为:
上式用矢量和矩阵表示为:
由最小二乘法解得a的估计值为:
其中,M为系数矩阵。
最小二乘拟合计算中心点的值为:
式中A——归一化常数;
w——权重系数向量。
最小二乘拟合计算中心点的值,式子也可表示为:
把式带入到式得到式子为:
归一化法具体原则:以每组拉曼图谱的中指纹区域的面积作为该组所有数据归一化的参照,将经背景扣除和平滑后的拉曼曲线采用归一化公式进行处理,获得用于下一步统计分析的数据。归一化的公式如下:
其中,Si为测定样品中各位移原始位移强度值,S为参照值,S′i为归一化后的值。
实验结果与分析:
1.血清样本平均拉曼谱图的比较:
基于高低不同水平雌二醇(E2)组的血清平均SERS光谱图见图一。对比78例高雌二醇组和86例低雌二醇组归一化后的血清平均SERS光谱图发现两组血清的平均拉曼光谱形态和谱峰基本相似,均在480cm-1,554cm-1,641cm-1,679cm-1,725cm-1,755cm-1,813cm-1,913cm-1,960cm-1,1004cm-1,1026cm-1,1128cm-1,1219cm-1,1319cm-1,1338cm-1,1445cm-1,1580cm-1,1643cm-1处有拉曼峰,在1781cm-1处只有高雌二醇组有峰且在641cm-1,679cm-1,913cm-1,1004cm-1,1319cm-1处高雌二醇组比低雌二醇组峰强强,但在480cm-1,1128cm-1,1219cm-1,1445cm-1,1643cm-1处低雌二醇组峰强较强,在低雌二醇组854cm-1处有峰,但在高雌二醇组裂解为850cm-1和871cm-1峰。除554cm-1,755cm-1,1026cm-1,1338cm-1,1580cm-1峰外,其余谱峰组间比较均有P<0.05,差异具有统计学意义。
2.统计学分析
OPLS-DA是一种有监督的判别分析统计方法。模型中R^2X和R^2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率,Q2表示模型的预测能力,理论上R^2、Q^2数值越接近1说明模型越好,越低说明模型的拟合准确性越差,通常情况下,R^2、Q^2高于0.5(50%)较好,高于0.4即可接受,且两者差值不应过大(0.2-0.3),R2和Q2之间的较大差异表明过度拟合。
基于高低不同水平雌二醇(E2)组的OPLS-DA模型见图2,高雌二醇组(n=78)和低雌二醇组(n=86)血清SERS进行OPLS-DA后ROC曲线图见图三。高雌二醇组(n=78)和低雌二醇组(n=86)血清SERS进行OPLS-DA后置换检验图见图4。
由图2可以看出E2的高低两组不同水平有着明显的聚类趋势,横坐标为主成分1的得分值,纵坐标为主成分2的得分值,椭圆代表整个样本分析结果95%的置信区间。该组的OPLS-DA模型的参数为R2X(cum)=0.716,R2Y(cum)=0.778,Q2(cum)=0.687;R2X(cum)=0.716表示拟合得出的主成分涵盖了所有观测信息的71.6%,R2Y(cum)=0.778表示拟合得出的主成分可以解释样本所有变量的77.8%,Q2(cum)=0.687表示该模型的预测能力为68.7%。ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标,曲线下面积(AUC)越大,诊断准确性越高。该模型组的曲线下面积AUC(H)=0.996273,AUC(L)=0.996273,其AUC值接近1,表明该模型的分类效果较好(如图3)。置换检验是用来检验模型的有效性及是否存在算法的过拟合。本实验使用SIMCA对数据进行200次置换检验,如图4所示,得到R2截距为0.239,Q2的截距为-0.319,一般认为R2<0.3~0.4;Q2<0.05可认为模型较好,且该模型R2和Q2值都比随机数据产生的值大,表明该模型有效。
本领域技术人员不难理解,本发明的基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分以及附图所示出的各部分的任意组合,限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案一一描述。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,按照先后顺序包括以下步骤:
(1)收集正常人和不孕不育患者血清并将其分组;
(2)将血清样本和银纳米粒子充分震荡混匀并孵育;
(3)对孵育反应后的样本进行拉曼光谱扫描并采集光谱数据;
(4)对采集的拉曼数据进行预处理和归一化处理;
(5)对光谱数据进行正交偏最小二乘法判别分析。
2.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,其特征在于,步骤(1)中,将不孕不育患者血清按临床卵巢功能的评价标准分为A高低雌二醇组,B高低AMH组,C高低AFC组以及D疾病组,疾病组包括子宫内膜异位症组和慢性盆腔炎组。
3.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,其特征在于,步骤(2)中,血清样本和银纳米粒子的反应比例为1:1,孵育反应30min后用移液枪取混合样品2.5μl点样至贴有锡纸的载玻片上,待其自然风干后用拉曼光谱仪采集数据。
4.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,其特征在于,步骤(3)中,实验选用必达泰克i-Pro便携式拉曼仪检测,其激发波长为785nm,激发功率为60mW(激发功率为20%),积分时间为10000ms,平均次数为3次,所有样本均在相同条件下测量,每个样品在不同位点测量5次,然后取平均谱,以此代表该样本的拉曼信号。
5.根据权利要求4所述的基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,其特征在于,步骤(3)中,选用拉曼光谱扫面并采集400-1800cm-1处的光谱数据。
6.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,其特征在于,步骤(4)中,光谱预处理选用必达泰克i-Pro便携式拉曼仪自带的Bwspec4软件对所有拉曼谱图进行背景扣除和光谱平滑,归一化处理为面积归一化处理。
7.根据权利要求1所述的基于表面增强拉曼光谱的不孕不育患者血清的检测方法,其特征在于,步骤(5)中,光谱数据用SIMCA14.1进行正交偏最小二乘法判别分析,受试者工作特征曲线用来评估该方法的准确性,置换检验验证模型的可靠性。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190517 |
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