CN110320197A - 基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪 - Google Patents

Abstract

本发明保护一种基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪，集成了模块化设计的全息平场凹面光栅式Raman分光系统、高效能CCD传感器谱检测系统、专用样品测试探头和配套血液鉴别软件，用以实现不同类型血液样本的Raman光谱测试和光谱识别，达到血液种属和类型的高效辨识和鉴定功能。本发明具有检测灵敏度高，操作简单，耗时短，正确率高，具有便携性和实用性等优势，可实现血液种属及多种生化样本快速鉴别。

Description

基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪

技术领域

本发明公开基于光谱分析的血液种属鉴别仪，属于光谱分析和生化检测技术领域。

背景技术

血液及其制品中包含重要的遗传信息和基因资源，在进出口检验检疫、刑侦检测和医疗诊断等生化测试中，针对人和动物血液快速甄别、鉴别和分析尚缺少特异和专属的方法，研发血液样品快速无损甄别的仪器、技术和方法，对上述应用方面具有重要的战略意义和迫切的现实意义。

血液及其制品的甄别和鉴定主要有形态学鉴别、血清学检测、DNA 测定、多种光谱分析等技术，但这些技术均存在对血液样本造成不可逆转的破坏，难以达到进出口检验检疫、刑侦检测等特殊场景中对血液样本快速和无损检测的要求。拉曼光谱分析法以其无需样品与处理、不受水的干扰以及可直接在近似自然状态或活性状态下对生化样本进行快速无损测试的特性，成为血液及其制品鉴别和检测的首选和关注热点。

目前，国外小型拉曼光谱仪主要厂商有必达泰克公司、海洋光学公司、赛默飞世尔公司、史密斯检测公司等。必达泰克公司代表性产品iRaman拉曼光谱仪属通用性光谱仪，具有光谱范围较宽和具有光纤探头的优势，但在仪器的标准配置数据库图谱类型和量均较少，针对复杂基底的生化样本（如：血液和体液）分析难以获得有效甄别数据和结果；海洋光学公司Apex-785拉曼光谱仪的光谱范围不低于3800cm^-1，但其分辨率较低，缺乏专用光谱分析软件，存在上述同样的问题；英国史密斯检测技术公司研制的RespondeR RCI拉曼光谱分析仪，可专门用于来分析不明和危险性液体和固体，但其更多应用于简单的化学组分测试，无法用于复杂基底的生化样本（如：血液和体液）分析。总之，国外进口仪器虽然在性能指标通用性方面有一定优势，但针对进出口检验检疫、刑侦检测和医疗诊断等特殊场景中血液及其制品的样本检测需求，这些设备缺乏针对性且并不实用。同时，其还存在价格昂贵，售后维修周期长，并且由于知识产权等限制，进口仪器商对数据接口及数据处理程序不开源，使后续软件及数据库的应用造成困难。

国内部分企业也尝试研发便携式拉曼光谱仪，天津市托普仪器有限公司研制的教学和科研用LR-3型激光拉曼光谱仪，其可测量液体、固体等多种化学成分相对简单的样品。杭州普雷光电有限公司采购国外的激光器、探头和光谱仪，二次开发研制的模块化拉曼系统，配合操作软件和二次编程工具，但其对用户使用的要求较高，系统集成度低，应用并不广泛。中国海洋大学借助模块化拉曼系统研制出深海小型自容式原位激光拉曼光谱系统，实现了对深海和极端环境天然气水合物等目标物的快速检测。公开号CN 104568899 A的专利研发了一种便携式拉曼光谱仪，其核心是提高拉曼光谱检测的精确度，但在针对复杂基底的生化样本（如：血液和体液）分析方面未做考虑；公开号为 CN 106841166 A 的专利为了有效利用了有限的光谱仪空间，研发了基于凹面光栅的长方体便携式拉曼光谱仪，在仪器小型化方面有特色，但在仪器的专用性和实用化方面未做深入探究。综上所述，目前国内所研发的拉曼光谱仪多为教学和科研用，有一定的专用性，但性能指标方面与国外产品尚有一定差距，而针对在进出口检验检疫、刑侦检测和医疗诊断中复杂基底的生化样本（如：血液和体液）分析，尚无有效的专用仪器和相应的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对复杂基底的血液及其制品类生化样本分析检测需求，提供一个具有优化的波长范围及较高分辨率的基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪，结合偏最小二乘判别分析方法建立的数学模型，构建实现不同种属的血液快速检测与鉴别的系统。

本发明提出的微小型拉曼血液专用分析仪主要依靠全息平场凹面光栅的便携式Raman光谱仪对血液样本进行采集Raman光谱，利用血液专用鉴别软件所建立的模型进行对血液样本的种属鉴别。本发明是通过以下技术方案来实现：

基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪是基于光纤光谱模块的微小型便携式仪器，其包括激光光源、探头、分光系统、光谱探测系统和鉴别软件系统几部分。

所述探头，采用拉曼探头作为单一模块，通过入射和收集光纤分别与激光光源和分光系统连接。

所述分光系统，采用全息平场凹面光栅式分光系统；

所述光谱探测系统，采用拉曼光谱CCD信号采集与处理系统，将CCD传感器采集的光谱信号转换成电信号，并对信号进行处理后传送给鉴别软件系统；

所述鉴别软件系统，为血液Raman鉴别软件系统，其执行控制测试条件、光谱预处理、建立统计学数学模型和血液鉴别功能。该鉴别软件系统是本发明的核心，其由离线分析单元和在线鉴别单元两部分组成。

所述离线分析单元用于对Raman光谱数据进行分析、预处理，并建立Raman光谱与人和动物类别之间的校正模型，其包括：

数据管理模块，用于光谱数据的导入导出，以及样本集的分割；

数据预处理模块，用于消除光谱的干扰噪声，基线矫正、导数和散射矫正；

模型建立模块，采用偏最小二乘判别分析建立人和动物分类模型；

模型验证模块，用外部验证或者交叉验证以确定最佳模型参数；

所述在线鉴别单元则利用已建立的校正模型，根据血液及其制品的Raman光谱，对其进行实时在线鉴别，其包括：

加载模型文件模块，用于加载离线分析单元所导出的分类模型文件；

数据预处理模块，用于消除光谱的干扰噪声，基线矫正、导数和散射矫正；

在线鉴别模块，用于采集未知样品的光谱，代入模型预测分类结果。

另外，本发明的采用的全息平场凹面光栅式分光系统也具有特色，是根据血液及其制品的拉曼光谱的特征频移范围，利用光线追迹算法，采用出全息平场凹面光栅光线追迹软件，设计出满足光学系统要求的全息平场凹面光栅，基于模拟得出的光路参数，进行分光系统封装结构设计，优化输入光纤、凹面光栅水平相对位置、探测器位置三者的位置和角度，提高分光系统分辨率。采用结构设计Solidworks软件，进行三维模型设计和动态模拟分析，实现分光及谱探测系统关键零部件结构设计、加工和系统装调。

本发明采用拉曼探头作为单一模块，通过入射和收集光纤分别与激光器和分光系统连接。探头包括依次沿光路布置的聚焦透镜、带通滤波片、反射镜、二向色镜、聚焦透镜、长波通滤波片、聚集透镜和收集光纤。其工作原理为：入射激光经透镜、带通滤波片、反射镜、二向色镜和聚焦透镜，照射在样品上；激光与样品作用，激发出的拉曼散射光经聚焦透镜、二向色镜、长波通滤波片和聚集透镜后，进入收集光纤，送入到分光系统。

本发明的拉曼光谱CCD信号采集与处理系统包括CCD探测器、主控平台和通讯接口。

本发明针对血液拉曼光谱的特征频移范围和测试分辨率要求，依据莱奎斯特采样定理选择适宜的CCD探测器。

所述主控平台包括模数转换单元和主控制器，CCD探测器的信号经模数转换单元转换后送入主控制器；

所述主控制器包括CCD探测器控制模块、有效数据完整帧捕捉模块、信号模数转换控制模块、光谱信号处理模块以及USB通信控制模块

所述CCD探测器控制模块用于控制CCD按照给定的时序进行工作；

所述有效数据完整帧捕捉模块用于准确捕捉到一帧完整的血液拉曼光谱信号；

所述信号模数转换控制模块用于控制AD转换器按照设定的时序，完成拉曼光谱信号的模数转换；

所述光谱信号处理模块用于实现拉曼光谱的信号平均、噪声抑制；

所述USB通信控制模块用于控制USB通信接口按照设定的时序，将拉曼光谱信号上传至上位机。

本发明的优点如下：

1、血液专用鉴别软件系统：该系统分为两个离线分析模块和在线鉴别模块，离线分析模块主要对Raman光谱数据进行分析、预处理，并建立Raman光谱与血液种属之间的校正模型。主要包括，数据导入导出、数据展示、数据预处理、模型建立、模型验证、模型展示、模型导出、模型传递等子模块。在线鉴别模块利用已建立的校正模型，根据血液的Raman光谱，对血液物种进行实时在线鉴别。离线分析软件中数据预处理包括去噪、基线校正、导数、散射矫正模块，去噪有滑动窗口和Savitzky-Golay算法，基线校正有加权最小二乘算法等。模型建立模块包括线性判别分析、偏最小二乘判别分析、支撑向量机分类、簇类独立软模式法等，模型验证模块包括外部验证和交叉验证。在线鉴别软件包含调节血液样本拉曼测试参数功能，加载由离线分析软件导出的模型文件功能和利用该模型实时鉴别血液种属的功能。

2、集成模块化设计的全息平场凹面光栅式Raman分光系统、高效能CCD传感器谱检测系统、专用样品测试探头的光谱分析和采集系统，形成基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪。其突破系统光路及分光核心元件设计与制造，有效提高了拉曼光谱分辨力，降低了系统杂散光、减小了荧光背景，并提高系统信噪比和检测灵敏度。

3. 具有复杂基底的血液及其制品样本的专用测试方法：针对常用的血液样本容器采血管和血清SERS芯片，设计了专用的样品固定夹具。考虑了采血管的固定方式、光轴对准、工作距可调等因素，设计中心对准光轴的竖直U形卡槽固定血液抗凝管，在检测移动平台上安装两个弹性夹片用于夹住血清SERS芯片和U型通道采血芯片，结合一维调节平台调节物镜与血液样本的焦距对血液样本进行测试。

综上，微小型拉曼血液专用分析仪集成了模块化设计的全息平场凹面光栅式Raman分光系统、高效能CCD传感器谱检测系统、专用样品测试探头的光谱分析和采集系统，血液种属鉴别软件。突破了血液及其制品的光谱预处理、血液面试统计模型以及特征峰辨识等关键技术，有效实现血液及其制品种属的快速辨别。

附图说明

图1 基于Raman光谱分析的便携式血液种属鉴别仪原理示意图；

图2 分光系统光路图；

图3探头光路图；

图4 离线分析软件结构图；

图5在线鉴别软件结构图。

具体实施方式

以下结合附图进一步详细说明本发明的技术内容：

参见图1，本发明提出的基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪，包括激光光源、探头、分光系统、光谱探测系统和鉴别软件系统几部分。

参见图3，探头采用拉曼探头作为单一模块，通过入射和收集光纤分别与激光光源和分光系统连接。探头包括依次沿光路布置的聚焦透镜、带通滤波片、反射镜、二向色镜、聚焦透镜、长波通滤波片、聚焦透镜和收集光纤；入射激光经聚焦透镜、带通滤波片、反射镜、二向色镜和聚焦透镜，照射在样品上，激光与样品作用，激发出的拉曼散射光经会聚焦透镜、二向色镜、长波通滤波片和聚焦透镜后，进入收集光纤，送入到分光系统。

参见图2，分光系统采用全息平场凹面光栅式分光系统，采用全息平场凹面光栅光线追迹软件设计出的全息平场凹面光栅，其主要性能指标为：凹面光栅口径60mm，凹面半径200mm，物距192mm，光谱范围660-710nm，光谱展宽24.4mm，成像空间位置坐标见图2。

本发明的光谱探测系统，采用拉曼光谱CCD信号采集与处理系统，将CCD传感器采集的光谱信号转换成电信号，并对信号进行处理后传送给鉴别软件系统。

本微小型拉曼血液专用分析仪采用的激发光源为632.8nm，探测器为2048位像元CCD探测器，其型号为S10141-1107SDEP。在系统结构设计中将凹面光栅和探测器设计为可调，通过装调机构精确调整二者的旋转角度、倾角等位置参数，特别针对光栅调节，设计了x\y\z小角度倾斜和z轴平动与旋转等多维调节装置，从而保证装配精度。

在便携性设计方面，采用新型的轻铝合金作为结构件材料。采用结构设计软件Solidworks，进行三维模型设计和动态模拟分析，完成了分光及谱探测系统关键零部件结构优化设计与加工，用Zemax软件对探头光路进行了设计和优化，采用序列模式仿真获得了拉曼激发焦平面、收集光纤端面等关键位置的光场分布，进而确定了各光学元件的参数，采用非序列模式仿真获得了光路中杂散光的分布，最终完成系统装调。

本微小型拉曼血液专用分析仪采用的鉴别软件系统，为血液Raman鉴别软件系统，其进行测试条件控制、光谱预处理、建立统计学数学模型和血液鉴别，其包括离线分析单元和在线鉴别单元两部分。

参见图4，所述离线分析单元用于对Raman光谱数据进行分析、预处理，并建立Raman光谱与人和动物类别之间的校正模型，其包括：

数据管理模块，用于光谱数据的导入导出，以及样本集的分割，采用Duplex和Kennard-Stone分割方法；

数据预处理模块，用滑动平均消除光谱的干扰噪声，加权最小二乘做基线矫正；

模型建立模块，采用PLS-DA方法建立人和动物分类模型；

模型验证模块，用交叉验证根据分类正确率确定最佳模型参数。

参见图5，所述在线鉴别单元则利用已建立的校正模型，根据血液及其制品的Raman光谱，对其进行实时在线鉴别，其包括：

加载模型文件模块，用于加载离线分析单元所导出的分类模型文件；

数据预处理模块，用滑动平均消除光谱的干扰噪声，加权最小二乘做基线矫正；

在线鉴别模块，用于采集未知样品的光谱，代入模型计算分类结果。

实施例2

本发明针对常用的血液样本容器采血管和血清SERS芯片，进行样品固定夹具的设计。考虑了采血管的固定方式、光轴对准、工作距可调等因素，设计一维调节台调节物镜与采血管的焦距，在调节台上方设计竖直的检测支架，在支架上方制作半开口圆环形卡槽用于固定采血管，其中心与光轴对准；在支架两侧安装弹性夹片，用于固定U型采血芯片和SERS芯片。将盛装人血的EDTA-K2抗凝剂的抗凝管置于检测区，优化调节测试参数，包括积分时间，平均次数，焦距等，优化得到测试条件为积分时间为10s，平均次数为5次，焦距为1mm。

实施例3

本发明采用EDTA-K2抗凝剂的抗凝管分别采集115例健康志愿者、119例比格犬、92例新西兰兔2mL全血，依次置于仪器检测区，分别进行测试，测试条件为激光激发波长为632.8nm，积分时间10s，平均次数5次，物镜与采血管的焦距为1mm，得到样本光谱数据集M。将数据集M带入离线分析软件，采用S-G平滑去噪处理，四次多项式基线校正，计算得出主成分个数为6，选择主成分个数参数为6进行偏最小二乘判别分析，得到人与动物鉴别正确率为97.85%模型，并导出该模型。

实施例4

以EDTA-K2抗凝管（江苏宇力医疗器械有限公司生产）作为血液容器，针对来自医院检验科、实验动物中心等不同来源的全血样本2mL，共计 50例，采用本发明研制的微小型拉曼血液专用分析仪及血液专用鉴别软件系统，分别进行Raman测试和鉴别，测试条件为：积分时间10s，平均次数5次。统计结果正确个数为m，则仪器的识别准确率按下式进行计算：A3=m3/50ⅹ100%，测试结果显示：正确个数为48例，误判2例，便携式拉曼血液鉴别仪的样本测试平均时间为50s，识别准确率为96%。

Claims (4)

1.基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪，包括激光光源、探头、分光系统、光谱探测系统和鉴别软件系统几部分；

所述探头，采用拉曼探头作为单一模块，通过入射和收集光纤分别与激光光源和分光系统连接；

所述分光系统，采用全息平场凹面光栅式分光系统；

所述光谱探测系统，采用拉曼光谱CCD信号采集与处理系统，将CCD传感器采集的光谱信号转换成电信号，并对信号进行处理后传送给鉴别软件系统；

所述鉴别软件系统，为血液Raman鉴别软件系统，其进行测试条件控制、光谱预处理、建立统计学数学模型和血液鉴别；其包括离线分析单元和在线鉴别单元两部分；

所述离线分析单元用于对Raman光谱数据进行分析、预处理，并建立Raman光谱与人和动物类别之间的校正模型，其包括：

数据管理模块，用于光谱数据的导入导出，以及样本集的分割，采用Duplex和Kennard-Stone分割方法；

数据预处理模块，用滑动平均消除光谱的干扰噪声，加权最小二乘做基线矫正；

模型建立模块，采用偏最小二乘判别分析方法、线性判别分析、支撑向量机分类、簇类独立软模式法等建立人和动物分类模型；

模型验证模块，用交叉验证根据分类正确率确定最佳模型参数；

所述在线鉴别单元则利用已建立的校正模型，根据血液及其制品的Raman光谱，对其进行实时在线鉴别，其包括：

加载模型文件模块，用于加载离线分析单元所导出的分类模型文件；

数据预处理模块，用滑动平均消除光谱的干扰噪声，加权最小二乘做基线矫正；

在线鉴别模块，用于采集未知样品的光谱，代入模型计算分类结果。

2.根据权利要求1所述的基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪，其特征在于：所述探头包括依次沿光路布置的聚焦透镜、带通滤波片、反射镜、二向色镜、聚焦透镜、长波通滤波片、聚焦透镜和收集光纤；入射激光经聚焦透镜、带通滤波片、反射镜、二向色镜和聚焦透镜，照射在样品上，激光与样品作用，激发出的拉曼散射光经会聚焦透镜、二向色镜、长波通滤波片和聚焦透镜后，进入收集光纤，送入到分光系统。

3.根据权利要求1所述的基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪，其特征在于：所述全息平场凹面光栅式分光系统采用全息平场凹面光栅，凹面光栅口径60mm，凹面半径200mm，物距192mm，光谱范围660-710nm，光谱展宽24.4mm；

在分光系统的外壳内表面设计消光槽，使二级谱和仪器内表面反光在消光槽内多次反射，从而减小杂散光。

4.根据权利要求1所述的基于Raman光谱分析的微小型拉曼血液专用分析仪，其特征在于：所述拉曼光谱CCD信号采集与处理系统包括CCD探测器、主控平台和通讯接口；

所述主控平台包括模数转换单元和主控制器，CCD探测器的信号经模数转换单元转换后送入主控制器；

所述主控制器包括CCD探测器控制模块、有效数据完整帧捕捉模块、信号模数转换控制模块、光谱信号处理模块以及USB通信控制模块

所述CCD探测器控制模块用于控制CCD按照给定的时序进行工作；

所述有效数据完整帧捕捉模块用于准确捕捉到一帧完整的血液拉曼光谱信号；

所述信号模数转换控制模块用于控制AD转换器按照设定的时序，完成拉曼光谱信号的模数转换；

所述光谱信号处理模块用于实现拉曼光谱的信号平均、噪声抑制；

所述USB通信控制模块用于控制USB通信接口按照设定的时序，将拉曼光谱信号上传至上位机。