CN112230003B - 三种血清脂质联合用于糖尿病肾病诊断的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了三种血清脂质联合用于糖尿病肾病诊断的用途。本发明提供的血清脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)可以联合诊断区分健康人和糖尿病肾病患者，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断健康人罹患糖尿病肾病的试剂盒的前景。本发明提供的诊断指标为血清脂质，只需要采取少量血液即可检测，基本无创。

Description

三种血清脂质联合用于糖尿病肾病诊断的用途
技术领域
本发明属于疾病诊断领域，涉及疾病诊断标志物的发现和应用，具体涉及三种血清脂质联合用于糖尿病肾病诊断的用途。
背景技术
根据《糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)》，肾脏病理诊断是糖尿病肾病诊断的金标准。但是，肾脏病理诊断对于患者的机体损伤较大，对患者并不友好。
生物标志物可以作为反映生物体结构和功能发生改变的信号指标，用于检测复杂疾病的发生和进展。近年来“组学”领域的生物标志物作为辅助手段用于预先、准确、灵敏地判断出疾病发生情况，取得了较好的效果。多个生物标志物联合诊断可以区分疾病的类型以及疾病所处的阶段，辅助临床治疗。而且以血清标志物为例，该方法具有简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用，对患者非常友好。
为了开发糖尿病肾病诊断的血清标志物或其组合物，特提出本发明。
发明内容
本发明旨在克服现有技术不足，提供三种血清脂质联合用于糖尿病肾病诊断的用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
三种血清脂质联合用于制备诊断健康人罹患糖尿病肾病的试剂盒的用途，所述三种血清脂质为PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)。
一种诊断健康人罹患糖尿病肾病的试剂盒，其特征在于：含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)的检测试剂。
有益效果：
1、本发明提供的诊断指标为血清脂质，只需要采取少量血液即可检测，基本无创；
2、本发明提供的血清脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)可以联合诊断区分健康人和糖尿病肾病患者，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断健康人罹患糖尿病肾病的试剂盒的前景。
附图说明
图1为目标血清脂质在健康受试者和糖尿病肾病患者血清中含量水平的比较；
图2为目标脂质联合区分健康受试者vs糖尿病肾病的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：血清脂质对糖尿病肾病的诊断效能
一、实验样本和试剂
收集江苏省中医院169例健康受试者和238例2型糖尿病并发糖尿病肾病患者。健康受试者为体检健康的正常人，2型糖尿病并发糖尿病肾病患者根据《2015美国糖尿病指南》和肾脏病理确诊。各组患者的年龄、性别和体重指数匹配，无显著性差异。按表1将各组受试者或患者随机分为训练集样本和验证集样本。
表1训练集样本和验证集样本样本数量
健康受试者 糖尿病肾病患者
训练集 112 158
验证集 57 80
总样本数 169 238
排除标准：①明确诊断的原发性肾脏疾病；②可引起脂质尿的其他系统性疾病；③近1个月内有糖尿病急性并发症及泌尿系感染；④合并有心脑血管、肝、肾脏和造血系统等严重原发性疾病；⑤患有精神疾病不能合作者；⑥妊娠或哺乳期妇女，或准备妊娠者；⑦近1个月内参加其它临床试验者；⑧不愿接受本研究者。
主要实验试剂：甲醇，MTBE，异丙醇，乙腈，醋酸铵，氢氧化铵。
二、实验方法
1、血清样本的采集及储存
采集患者清晨空腹外周血并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-60min，待血液凝固，以2000rpm速度离心10min，小心吸取上层清亮血清液体于无菌冻干管中，标记后放入-80℃冰箱储存备用。
2、UHPLC技术测定血清中目标脂质的含量水平
检测仪器：UHPLC system(Shimazu Nexera X2 LC-30AD,Japan)，ESI-triplequadrupole mass spectrometer(SCIEX Triple Quad 5500+,Singapore)；
色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(100mm×2.1mm I.D.,1.7μm；Waters,Milford,MA,USA)。柱温为35℃，流速为500μl/min。注射体积为5μl。流动相的组成有两个溶剂:A相含10mM醋酸铵(NH4OAc)的水:乙腈(5:95,v/v)溶液，B相含10mM醋酸铵(NH4OAc)的水:乙腈(50:50,v/v,氢氧化铵调整pH 8.2)。梯度洗脱：0-10.0min，0.1％-20％B；10.0-11.0min，20％-98％B；11.0-13.0min，98％B；13.0-13.1min，98％-0.1％B；13.1-16.0min，0.1％B；
质谱条件：该质谱仪在电喷雾电压(毛细管电压)为4500/-4500V的正负电离模式下工作。典型源条件如下:幕气设置为35。离子源温度调至500℃。离子气源1(GS1)和离子气源2(GS2)均设置为50和60。减垢电位设置为80/-80伏。在正、负模式下，碰撞出口电位设置为9/-11v；
样本处理：将40μl血清与225μl冰甲醇混合。然后将每个样品涡旋10秒后加入750μl的冷MTBE，将混合物涡流10秒，在4℃轨道混合器中振荡10分钟。加入室温LC/MS级水188μl，涡旋20秒后4℃，14000rcf离心2min。上层液体被转移到干净管子,然后SpeedVac样本集中器中45℃挥干2h。用100μl的异丙醇/乙腈/水(30:65:5,v/v/v)混合物溶解干油脂,样本涡旋10秒钟,然后4℃，14000rcf离心10分钟。
以各样本中各目标脂质的检测峰面积表示其含量水平。
3、数据处理方法
基于SPSS 25.0软件处理。训练集中，运用Logistic回归建立三个目标血清脂质含量水平的回归方程，产生新变量logit[P]，对该新变量进行ROC曲线分析，并根据ROC曲线得到最佳cut-off值；验证集中，以该最佳cut-off值为诊断阈值，计算目标血清脂质的诊断准确率。
三、实验结果
1、目标血清脂质在健康受试者和糖尿病肾病患者血清中含量水平的差异
训练集中，脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)在健康受试者和糖尿病肾病患者血清中的含量水平存在明显差异，如图1所示。
2、目标血清脂质对健康受试者vs糖尿病肾病的诊断区分效能
2.1训练集构建二元逻辑回归方程
在训练集中，以各样本的血清脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)含量水平为三个自变量，以组别(健康受试者、糖尿病肾病)为应变量，构建得到二元逻辑回归方程logit[p]＝-4.380+1.277X2+0.153X3，其中：X1为PE(16:0/18:1)的含量水平，X2为PE(16:0/20:2)的含量水平，X3为PE(18:0/18:1)的含量水平。
2.2训练集确定最佳鉴别阈值
在训练集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)含量水平代入上述二元逻辑回归方程，即可得到训练集中各个样本的回归值logit[p]，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图2所示)，AUC高达0.961(显著高于PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)、PE(18:0/18:1)单独诊断区分健康受试者vs糖尿病肾病的ROC曲线下面积0.848、0.850、0.850)，具有较高的准确性。根据ROC曲线计算Youden指数，Youden指数最大值时对应的logit[p]值为能进行诊断区分健康受试者和糖尿病肾病患者的最佳cut-off值0.674。
2.3验证集验证诊断准确率
在验证集中，将各样本的血清脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)含量水平代入上述二元逻辑回归方程，即可得到验证集中各个样本的回归值logit[p]，并与最佳cut-off值比较，以预测正确的样本数除以总样本数即为目标脂质区分健康受试者vs糖尿病肾病的准确率89.8％(123/137)。
综上可见：
1、本发明提供的诊断指标为血清脂质，只需要采取少量血液即可检测，基本无创；
2、本发明提供的血清脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)可以联合诊断区分健康人和糖尿病肾病患者，诊断准确率高，因而具有开发制备成诊断健康人罹患糖尿病肾病的试剂盒的前景。
实施例2：诊断试剂盒
一种诊断健康人罹患糖尿病肾病的试剂盒，含有用于检测血清脂质PE(16:0/18:1)、PE(16:0/20:2)和PE(18:0/18:1)的检测试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (1)

1.血清脂质PE(16:0/18:1)的检测试剂、血清脂质PE(16:0/20:2)的检测试剂和血清脂质PE(18:0/18:1)的检测试剂联合用于制备诊断健康人罹患糖尿病肾病的试剂盒的用途；其中，所述糖尿病肾病为2型糖尿病并发糖尿病肾病。
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