CN101382537A

CN101382537A - 一种胃癌诊断方法

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Publication number: CN101382537A
Application number: CNA2008100438222A
Authority: CN
Inventors: 于颖彦; 陈闽军; 李作峰; 徐露; 王清; 文静然; 燕敏; 朱正纲
Original assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2008-10-07
Filing date: 2008-10-07
Publication date: 2009-03-11

Abstract

本发明涉及一种医学诊断技术领域，具体涉及一种胃癌诊断方法。一种胃癌诊断方法，包括下列步骤：收集受试者的尿液样品；检测尿液样品中目标分子含量，所述目标分子为异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸或甘氨酸中之1个或2个或3个或4个或5个或6个；分析目标分子含量数值：当受试者所述目标分子含量高于诊断实验临界点时，受试者即可认为是胃癌患者。本发明所述的胃癌诊断方法，具有很好的灵敏度和特异性，操作简单、耗时少，同时本发明所采用检测样品为尿液，避免采用组织、血液时带给患者肉体痛苦。因此，无论是从患者的依从性还是从检测结果的正确率看，本发明所述的胃癌诊断方法具有很好的临床应用价值。

Description

一种胃癌诊断方法

技术领域

本发明涉及一种医学诊断技术领域，具体涉及一种胃癌诊断方法。

背景技术

胃癌是世界上最常见和致死的恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一，占消化道恶性肿瘤死亡原因的第一位，有些地区占全部恶性肿瘤死亡原因的首位，且胃癌发病率一直居高不下。有资料显示，我国每年新发胃癌患者40万人，死亡人数30万人，且青年人患胃癌的比例在增加，15％患者为40岁以下年轻人。胃癌的早期诊断是困难的，在大多数西方国家，5年存活率低于20％。90％以上的胃癌是腺癌，通过Lauren分类可将它们分成肠型和弥漫型。

目前绝大多数医院主要依赖于X线，B型超声、内窥镜检查以及活组织病理学检查等对肿瘤进行诊断。以上检查有些对患者创伤较大，有些价格较为昂贵，对仪器设备要求高，难以用于大规模肿瘤检查或健康体检。

癌症的早期检测和治疗能显著提高癌症患者的存活。以胃癌为例，诊断为疾病早期的患者5年存活率为90％，而诊断为疾病晚期的患者5年存活率约为10％。然而，绝大多数胃癌患者诊断时通常处于疾病晚期。因此，开发胃癌早期诊断方法能够改善患者的预后。

在包括体液如血液、尿液、腹膜灌洗液和粪便提取物在内的生物标本中的特异性癌症相关标记物的鉴定能提供有价值的癌症早期诊断方法，以便早期治疗并改善预后。特异性癌症标记物还能提供用于监测疾病进展的方法，从而能跟踪外科手术、放射治疗和化学治疗的功效评价。

中国专利申请98803363.1通过检测患者样品中环加氧酶—2的表达以诊断恶化前期的胃癌的方法。

中国专利申请03824891.3描述了检测和诊断结肠直肠癌和胃癌的客观方法，该诊断方法包括测定结肠癌或胃癌相关基因的表达水平，该表达水平在结肠癌或胃癌细胞与正常细胞之间存在差别。

中国专利申请200480026675.8公开了GTM基因家族成员作为胃癌和其它类型癌症的标记物，用GTM检测和定量的方法和检测试剂盒来进行胃癌诊断。

然而，对于许多主要癌症，可利用的标记物缺乏足够的敏感性和特异性。例如，用于胃癌的最常用标记物CA199、CA724和癌胚抗原CEA仅检测到大约15～50％的任何阶段的胃肿瘤，对于疾病早期的检测则降至大约2～11％。因此，出现假阴性检测的频率非常高，这导致患者丧失了治疗时机，而且使用这些标记物可能对高达1/3的患有良性胃疾病个体给出假阳性信号，而导致误诊。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供一种新的灵敏度高、特异度好的胃癌诊断方法。

一种胃癌诊断方法，包括下列步骤：

a)收集受试者的尿液样品；

b)检测尿液样品中目标分子含量，所述目标分子为异亮氨酸(isoleucine)、苏氨酸(threonine)、脯氨酸(proline)、甲硫氨酸(methionine)、酪氨酸(tyrosine)或甘氨酸(glycine)中之1个或2个或3个或4个或5个或6个；

c)分析目标分子含量数值：当受试者所述目标分子含量高于诊断实验临界点时，受试者即可认为是胃癌患者。

所述各目标分子诊断实验临界点为胃癌患者群体中各目标分子含量的最大Youden指数所对应的变量值。

Youden指数＝灵敏度—假阳性率，根据Youden最大为原则确定最佳临界值，Youden指数可以综合反映灵敏度和特异性，具有较好的评价指标的判别能力。

在一些实施方式里，所述胃癌为早期胃癌或者早期以上的胃癌。

在一些实施方式里，所述检测方法可选用色谱法、质谱法、色谱—质谱法或毛细管电泳法，其中色谱法为气相色谱法或液相色谱法，优选色谱—质谱法。

在一些实施方式里，所述检测方法为质谱法或色谱—质谱法，以质荷比为单位，当受试者所述目标分子含量高于诊断实验临界点时，受试者即可认为是胃癌患者，所述诊断实验临界点分别为：异亮氨酸0.00812；苏氨酸0.00629；脯氨酸0.00343；甲硫氨酸0.00051；酪氨酸0.00026；甘氨酸0.00056。

在一些实施方式里，所述检测方法为质谱法或色谱—质谱法，以质荷比为单位，当受试者所述目标分子含量高于诊断实验临界点时，受试者即可认为是早期胃癌患者，所述诊断实验临界点分别为：异亮氨酸0.01215；苏氨酸0.00584；脯氨酸0.00387；甲硫氨酸0.00055；酪氨酸0.00028；甘氨酸0.00338。

需要指出的，本领域的技术人员完全可以通过公知常识，将本发明以质核比值所标识的所述各目标分子诊断实验临界点值转换其他单位如但不限于ng/ml、pg/ml所标识的诊断实验临界点值。

在一些实施方式里，所述受试者为肝肾功能正常的人，以减少因肝肾功能异常导致尿液目标分子含量波动，影响结果。

在一些实施方式里，所述尿液样品取自清晨空腹中段尿液，以有利于检测。

在一些实施方式里，所述目标分子为异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸。

本发明所述的胃癌诊断方法，具有很好的灵敏度和特异性，操作简单、耗时少，同时本发明所采用检测样品为尿液，避免采用组织、血液样品时带给患者肉体痛苦。因此，无论是从患者的依从性还是从检测结果的正确率看，本发明所述的胃癌诊断方法具有很好的临床应用价值。

附图说明

图1.尿液中异亮氨酸诊断中晚期胃癌的ROC曲线。

图2.尿液中苏氨酸诊断中晚期胃癌的ROC曲线。

图3.尿液中脯氨酸诊断中晚期胃癌的ROC曲线。

图4.尿液中甲硫氨酸诊断中晚期胃癌的ROC曲线。

图5.尿液中酪氨酸诊断中晚期胃癌的ROC曲线。

图6.尿液中甘氨酸诊断中晚期胃癌的ROC曲线。

图7.尿液中异亮氨酸诊断早期胃癌的ROC曲线。

图8.尿液中苏氨酸诊断早期胃癌的ROC曲线。

图9.尿液中脯氨酸诊断早期胃癌的ROC曲线。

图10.尿液中甲硫氨酸诊断早期胃癌的ROC曲线。

图11.尿液中酪氨酸诊断早期胃癌的ROC曲线。

图12.尿液中甘氨酸诊断早癌胃癌的ROC曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。

试剂与仪器：L-2-氯苯丙氨酸、氯甲酸乙酯、吡啶、无水乙醇、氢氧化钠、氯仿、无水硫酸钠(以上试剂均为分析纯，由上海化学试剂公司生产)。KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产)。LD5-2A型台式离心机(北京京立离心机有限公司)。气相色谱质谱仪TurboMass(由美国PerkinElmer公司生产)自带NIST98谱库和Willey谱库等软件工作站。

随机采集尿样94份，其中48份为健康人，46份为因患胃癌要求手术治疗的入院患者(其中13为早期胃癌患者)。所有受试者肝肾功能均正常，尿样均取自清晨空腹中段尿液。胃癌受试者均经电子胃镜检查或手术切除病理检查证实。

将样本由低温冰箱取出自然升至室温后，进行10000rpmX20min，离心。吸取上清样品300ml，加蒸馏水300ml、内标物(0.1mg/mL L-2-氯苯丙氨酸)100ml、无水乙醇40ml、吡啶100ml，加盖子进行酯化羧基反应。加氯甲酸乙酯(ECF)50ml，加盖振荡10S，进行氨基反应。超声加速反应1min，加入氯仿300ml提取。振荡30S后3000rpm X 5min，离心。加入100ml 7mol/L的NaOH，调节pH＝9～10，再加入氯甲酸乙酯(ECF)50ml，加盖、振荡10S，超声加速反应1min，进行二次反应。振荡30S后，3000rpm X10min，离心。吸去上层水层，氯仿层加入少量无水硫酸钠用于脱水，可上机检测。

样品首先在气相色谱毛细管柱(Agilent J&W DB-5MS，30m×0.25mm×0.25μm)上分离。并采用程序升温气相色谱技术，起始温度为80℃，以10℃/min速率升至140℃，再以4℃/min速率升至280℃，并保持2min。分离过程中逐渐增加柱温，使所有组分都能在各自的最佳温度下洗脱。质谱仪电子轰击能量为70eV，离子源温度为200℃，进样口温度为260℃，载体气为氦气，柱流速为1ml/min。所有数据在质荷比30—550m/z下收集。每次进样扫描停留时间为100ms，溶剂延迟时间为2.5min。检测到的样品中物质使用NIST98和Willey谱库进行检索定性。样品中物质的浓度使用内标法和归一化法定量。

结果：样品中M55(异亮氨酸)、M56(苏氨酸)、M61(脯氨酸)、M81(甲硫氨酸)、M120(酪氨酸)、M125(甘氨酸)。6种氨基酸在胃癌组(包括早期胃癌组与中晚期胃癌组)与对照组(健康组)中的平均值与标准差见表1、表2。

表1.早期胃癌组与健康人的尿液的6种关键氨基酸检测

表2.中晚期胃癌组与健康人尿液的6种关键氨基酸检测

利用ROC曲线分析以及曲线下面积(AUC)算法分别求出样品中6种氨基酸单个变量在鉴别胃癌与非癌，特别是早期胃癌与健康受试者的ROC曲线，见图1-12，M55(异亮氨酸)、M56(苏氨酸)、M61(脯氨酸)、M81(甲硫氨酸)、M120(酪氨酸)、M125(甘氨酸)在鉴别早期胃癌与健康受试者时的AUC值分别为0.788，0.61，0.825，0.697，0.819，1.00。M55(异亮氨酸)、M56(苏氨酸)、M61(脯氨酸)、M81(甲硫氨酸)、M120(酪氨酸)、M125(甘氨酸)在鉴别总胃癌组与健康受试者时的AUC值分别为0.813，0.822，0.827，0.702，0.712，0.743。

评价一种新诊断方法的优劣，除了灵敏度、特异度指标外、Youden指数是另一个常用的诊断试验评价指标，Youden指数的取值范围在(-1，+1)之间，其值越接近于+1，诊断准确性越好。受试者检测数值大于等于诊断界点者判为阳性，小于该值者判为阴性。本实验中根据ROC曲线计算数值表计算出获得最大Youden指数(Youden指数＝灵敏度—假阳性率)。计算获得的最大Youden指数所对应的变量值即为诊断临界点，并可得到对应的诊断灵敏度和特异度。本发明6种关键氨基酸在早期胃癌组与总胃癌组的Youden指数、诊断临界点数值以及对应的敏感性与特异性见表3与表4。

上述结果表明本发明所述方法，通过检测尿液的6种关键氨基酸，不但具有鉴别胃癌与非癌的功效，还能区分开早期胃癌与健康受试者，具有很好的灵敏度和特异性。

表3.早期胃癌6种关键氨基酸的最大Youden指数与诊断临界点

表4.胃癌组(不分早晚期)6种关键氨基酸的最大Youden指数与诊断临界点

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims

1.一种胃癌诊断方法，包括下列步骤：

a)收集受试者的尿液样品；

b)检测尿液样品中目标分子含量，所述目标分子为异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸或甘氨酸中之1个或2个或3个或4个或5个或6个；

2.根据权利要求1所述的胃癌诊断方法，其特征在于所述胃癌为早期胃癌或者早期以上的胃癌。

3.根据权利要求1所述的胃癌诊断方法，其特征在于所述检测方法可选用色谱法、质谱法、色谱—质谱法或毛细管电泳法。

4.根据权利要求2所述的胃癌诊断方法，其特征在于所述检测方法为色谱—质谱法。

5.根据权利要求1所述的胃癌诊断方法，其特征在于所述检测方法为质谱法或色谱—质谱法，以质荷比为单位，当受试者所述目标分子含量高于诊断实验临界点时，受试者即可认为是胃癌患者，其中所述诊断实验临界点分别为：异亮氨酸0.00812；苏氨酸0.00629；脯氨酸0.00343；甲硫氨酸0.00051；酪氨酸0.00026；甘氨酸0.00056。

6.根据权利要求1所述的胃癌诊断方法，其特征在于所述检测方法为质谱法或色谱—质谱法，以质荷比为单位，当受试者所述目标分子含量高于诊断实验临界点时，受试者即可认为是早期胃癌患者，其中所述诊断实验临界点分别为：异亮氨酸0.01215；苏氨酸0.00584；脯氨酸0.00387；甲硫氨酸0.00055；酪氨酸0.00028；甘氨酸0.00338。

7.根据权利要求1所述的胃癌诊断方法，其特征在于所述受试者为肝肾功能正常的人。

8.根据权利要求1所述的胃癌诊断方法，其特征在于所述尿液样品取自清晨空腹中段尿液。

9.根据权利要求1所述的胃癌诊断方法，其特征在于所述目标分子为异亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸。